JP2005509609A - Ｐｅｇ化およびジグリコシル化されたエリスロポエチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ａｓｎ３８においてＮ−グリコシル化されるがＡｓｎ２４においてＮ−グリコシル化されないことを特徴とする、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボの生物学的活性を有する、エリスロポエチンムテインを提供する。そのようなムテインは医薬的特性を向上させた。

Description

本発明は、ジグリコシル化されたエリスロポエチンの新規変異体、その生成方法、使用および製剤組成物に関する。
赤血球形成は、細胞破壊を相殺するために起こる赤血球の産生である。赤血球形成は、充分な赤血球を適切な組織酸素化に利用可能にすることができる制御された生理学的機構である。天然産ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）は、腎臓において生成されると共に赤血球産生を刺激する体液性血漿因子である、１６５個のアミノ酸を含む糖蛋白である。ヒトＥＰＯは、骨髄中での委任赤血球前駆細胞の分裂および分化を刺激する。ヒトＥＰＯは、赤血球前駆体上の受容体に結合することによりその生物学的活性を発現する。天然産ヒトエリスロポエチンは、老化により失われる赤血球の交換を刺激するために血漿中に低濃度で存在する酸性糖蛋白である。
エリスロポエチンは、組換えＤＮＡ技術（Egrie,J.C.ら、Immunobiol. 第７２巻（１９８６年）２１３〜２２４頁）を用いて生合成的に製造され、そしてチャイニーズハムスターの卵巣組織細胞（ＣＨＯ細胞）中に挿入されて発現されたクローンヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。天然産ヒトＥＰＯは、まず、アルギニン１６６と共にポリペプチド鎖を含む１６６個のアミノ酸に翻訳される。翻訳後修飾においてアルギニン１６６は、カルボキシペプチダーゼにより開裂される。ヒトＥＰＯ（１６５個のアミノ酸および１６６個のアミノ酸）の一次構造を、配列番号１および配列番号２に示す。Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ１６１とＣｙｓ２９−Ｃｙｓ３３との間に２つのジスルフィド橋がある。糖部分を含まないヒトＥＰＯのポリペプチド鎖の分子量は１８２３６Ｄａである。無傷のＥＰＯ分子において、分子量の約４０％が、炭水化物基による（Sasaki,H.ら、J.Biol.Chem.第２６２巻（１９８７年）１２０５９〜１２０７６頁）。
エリスロポエチンは赤血球形成において必須であるので、そのホルモンは赤血球産生の低下または不全を特徴とする血液疾患の処置において有用である。臨床的には、ＥＰＯは、例えば、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者および化学療法を受けているＡＩＤＳおよび癌患者における貧血の治療に用いられる（Danna,R.P.ら、MB,Garnick編、Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective.ニューヨーク、ニューヨーク州：Marcel Dekker；１９９０年、３０１〜３２４頁）。しかしながら、ＥＰＯのような現在利用できるタンパク質治療剤の生物学的利用性は、その短い血漿半減期およびプロテアーゼ分解に対する感受性より制限される。これらの欠点は、最大の臨床的性能を得ることを妨げる。
ＥＰＯのアミノ酸配列の修飾が、米国特許第４，８３５，２６０号；ＷＯ９４／２５０５５；ＷＯ９４／２４１６０；ＷＯ９４／０２６１１；ＷＯ９５／０５４６５；および当該技術水準の多くの他の刊行物において提案されている。
ヒト尿由来エリスロポエチンおよび組換えエリスロポエチン（哺乳動物細胞中で発現）の両方が、３つのＮ−結合および１つのＯ−結合オリゴ糖鎖を含み、これらは一緒になって、糖蛋白の合計分子量の約４０％を占める。２４、３８および８３の位置にあるアスパラギン残基においてＮ−結合グリコシル化が起こり、１２６の位置にあるセリン残基においてＯ−結合グリコシル化が起こる（Laiら、J.Biol.Chem.第２６１巻（１９８６年）３１１６頁；Broudy,V.C.ら、Arch.Biochem.Biophys.第２６５巻（１９８８年）３２９頁）。オリゴ糖鎖が、末端シアル酸残基で修飾されることが示された。全てのシアル酸残基を除去するためにグリコシル化エリスロポエチンを酵素的に処理すると、インビボ活性が失われるが、インビトロ活性に影響を与えない（Lowyら、Nature第１８５巻（１９６０年）１０２頁；Goldwasser,E.ら、J.Biol.Chem.第２４９巻（１９７４年）４２０２〜４２０６頁）。この挙動は、肝アシアログリコプロテイン結合性タンパク質との相互反応により循環からアシアロエリスロポエチンが迅速に取り除かれることにより説明された（Morrellら、J.Biol.Chem.第２４３巻（１９６８年）１５５頁；Briggs,D.W.ら、Am.J.Physiol.第２２７巻（１９７４年）１３８５〜１３８８頁；Ashwell,GおよびKawasaki,T.、Methods Enzymol.第５０巻（１９７８年）２８７〜２８８頁）。すなわち、肝結合性タンパク質による結合を避けるためにシアル化された場合のみに、エリスロポエチンがインビボ生物学的活性を有する。
エリスロポエチンのオリゴ糖鎖における他の成分の役割は、あまり明確にされていない。部分的に脱グリコシル化されたエリスロポエチンが、グリコシル化型と比べてインビボ活性が大幅に低下しているが、インビトロ活性は保持していることが示された（Dordal,M.S.ら、Endocrinology第１１６巻（１９８５年）２２９３〜２２９９頁）。しかしながら、別の研究において、Ｎ−結合またはＯ−結合オリゴ糖鎖の除去単独で、またはグリコシル化部位であるアスパラギンまたはセリン残基の変異誘発を伴うと、哺乳動物細胞中で産生される変化したエリスロポエチンのインビトロ活性が急激に低下した（Dube,S.ら、J.Biol.Chem.第２６３巻（１９８８年）１７５１６〜１７５２１頁）。
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、グリコシル化のための特異的部位を欠くＥＰＯの構造変異体が調製された（Yamaguchi,K.ら、J.Biol.Chem.第２６６巻（１９９１年）２０４３４〜２０４３９頁；およびHiguchi,M.ら、J.Biol.Chem.第２６７巻（１９９２年）７７０３〜７７０９頁）。大腸菌における非グリコシル化ＥＰＯのクローニングおよび発現が、Lee-Huang,S.によるProc.Natl.Acad.Sci.USA ６１（１９８４年）２７０８〜２７１２頁および米国特許第５，６４１，６６３号に記載されている。
ＥＰ０６４０６１９は、少なくとも１つの付加的なグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を含むヒトエリスロポエチンの類似体に関する。グリコシル化のために付加された部位は、ヒトエリスロポエチンよりも、多数の炭水化物鎖および高いシアル酸含量となる。少なくとも１つのグリコシル化用部位の再配列を含むアミノ酸配列を含むエリスロポエチン類似体も提供されている。エリスロポエチンのカルボキシ末端に１つ以上のアミノ酸が付加され、その付加により少なくとも１つのグリコシル化部位が提供される類似体も含まれる。
グリコシル化ＥＰＯのＰＥＧ化がＷＯ０１／０２０１７に記載されている。そのような分子は、向上した生物学的活性を示す。ＷＯ００／３２７７２およびFrancis,G.E.らのInt.J.Hem.第６８巻（１９８８年）１〜１８頁は、ポリエチレングリコール修飾非グリコシル化ＥＰＯを記載している。ＷＯ００／３２７７２の分子は、さらに、１６６位において修飾されている。そのような分子は、ヘマトクリットの著しい増加を引き起こさないと記載されている。ＰＥＧポリマー部分は、１〜５個のポリマー鎖からなる。ＷＯ００／３２７７２は、ｐＨを低下させ、ＰＥＧ：アミン比を減少させることによりＰＥＧ化の程度および部位を制御することを提案している。ｐＨ７にてＰＥＧアルデヒド：アミン基のモル比１．５：１で反応を進め、好ましくはＮ末端αアミノ基と反応させる。
ＥＰＯについて知られている多くの修飾にも拘わらず、修飾された特性を有する、特に修飾されたクリアランスを有するさらなるＥＰＯムテイン、およびその簡便な再現性のある製造方法がなお求められている。
本発明は、新規クラスのＥＰＯムテインを提供する。本発明によるＥＰＯムテインは、骨髄細胞に、網状赤血球および赤血球細胞の産生を増加させるインビボの生物学的活性を有する。
本発明は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３において潜在的Ｎ−グリコシル化部位を保持し、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３においてＮ−グリコシル化されているがＡｓｎ２４においてＮ−グリコシル化されておらず、そして、好ましくは、Ｎ−末端アミノ基および／またはＬｙｓ２０のε−アミノ基においてポリ（エチレングリコール）基（ＰＥＧ）、好ましくはアルコキシポリ（エチレングリコール）基、より好ましくは低級メトキシポリ（エチレングリコール）基に結合している、エリスロポエチンムテインを提供する。
本発明のムテインは、ＥＰＯと同じ用途を有する。特に、本発明のムテインは、骨髄中の委任赤血球前駆細胞（committed erythroid progenitor）の分裂および分化を刺激することにより患者を処置するのに有用である。同様にＥＰＯは患者を処置するために使用される。
本発明は、ヒトにおける貧血を治療するための方法、および好ましくはそのような治療のための薬剤の製造のためのムテインの使用も含む。
本発明は、アミノ酸２６〜１６５からなるグリコシル化ＥＰＯ断片（ＥＰＯ２６〜１６５）を製造し、その後に、前記断片を、アミノ酸１〜２８からなるグリコシル化されていないが好ましくはＰＥＧ化されているＥＰＯ断片と融合させることを含む、本発明によるエリスロポエチンムテインを製造するための方法も含む。
「エリスロポエチン」（ＥＰＯ）という用語は、配列番号１または配列番号２の配列を有するタンパク質、またはこれに実質的に相同性であるタンパク質またはポリペプチドを意味し、その生物学的特性は、赤血球産生の刺激ならびに骨髄中の委任赤血球前駆細胞の分裂および分化の刺激に関わる。
「実質的に相同性」という用語は、特定の対象配列が、例えば変異体配列が、対照配列と１〜５個の置換、欠失または付加により異なり、その正味の効果は、対照配列と対象配列との間の逆機能的非類似性（adverse functional dissimilarity）とならないことを意味する。しかしながら、前述のように、潜在的グリコシル化部位Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３は保持される。
ヒトＥＰＯは１つのｏ−グリコシル化部位（配列番号１のＳｅｒ１２６において）および３つのＮ−グリコシル化部位（配列番号１のＡｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３において）を有する。これらの部位におけるグリコシル残基はシアル化され、生体内半減期およびその後のＥＰＯの効果に重要である。グリコシル化部位Ａｓｎ２４を除去すると、向上したインビボ効果を有するＥＰＯムテインが得られる。しかしながら、そのようなＥＰＯムテインは、グリコシル化することができない別のアミノ酸によりＡｓｎ２４を置き換えることにより当該技術水準によって生成することしかできない。したがって、これらのムテインは、配列の感受性部位において修飾されたアミノ酸を有することにより天然産ＥＰＯと異なる。そのような、修飾アミノ酸配列および修飾グリコシル化を有するＥＰＯムテインが、例えば、Nimtz,M.ら、Eur.J.Biochem.第２１３巻（１９９３年）３９〜５６頁；Sasaki,H.ら、Biochemistry第２７巻（１９８８年）８６１８〜８６２６頁；Delorme,C.ら、Biochemistry第３１巻（１９９２年）９８７１〜９８７６頁；Fibi,M.R.ら、Blood第８５巻（１９９５年）１２２９〜１２３６頁；およびＷＯ９９／１１７８１（ＥＰ０４１１６７８；Takeuchi,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第８６巻（１９８９年）７８１９〜７８２２頁；ＥＰ０４２７１８９；ＥＰ０４０９１１３；Dube,S.ら、J.Biol.Chem.第２６３巻（１９８８年）１７５１６〜１７５２１頁；Yamaguchi,K.ら、J.Biol.Chem.第２６６巻（１９９１年）２０４３４〜２０４３９頁；ＥＰ０６４０６１９；およびFibi,M.R.ら、Applied Microbiol.Biotechnol第３５巻（１９９１年）６２２〜６３０頁も参照）に記載されている。
したがって、当該技術水準によれば、Ａｓｎ２４に対するグリコシル化は、このアミノ酸の欠失、修飾または置換によってしか防止することができない。アミノ酸Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３を保持するがＡｓｎ３８およびＡｓｎ８３においてのみグリコシル化されＡｓｎ２４においてはグリコシル化されていないエリスロポエチンムテインは、当該技術水準において記載されておらず、そのような分子をいかに製造するかの指図はない。
本発明は、Ｃｙｓ２９で始まる分子のＣ末端部分においてグリコシル化、好ましくは自然なグリコシル化を保持し、Ｇｌｙ２８までのＮ末端部分においてグリコシル化しておらず、それにより、所望であれば、さらに前記Ｎ末端部分を非常に容易に、広い範囲で修飾できる、ＥＰＯムテインを製造するための簡単な方法を提供する。そのような修飾は例えばポリエチレングリコールなどの側鎖の再現性のある明確な付着である。
「Ｎ末端ＥＰＯ断片」または「ＥＰＯ１−２８」という用語は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１−２８から本質的になるＥＰＯ断片を意味する。前述のように、この用語は、結合した分子中のＥＰＯの薬学的特性が悪影響を受けない限り、そして断片の配列のＣ末端においてＡｓｎ２４が保持されＧｌｙ２８が保持される限りは、アミノ酸配列中の僅かな修飾（約２個までの交換、付加、欠失）を有する断片も含む。
「Ｃ末端ＥＰＯ断片」または「ＥＰＯ２９−１６５」という用語は、配列番号１のアミノ酸２９−１６５または配列番号２のアミノ酸２９−１６６から本質的になるＥＰＯ断片を意味する。前述のように、この用語は、結合した分子中のＥＰＯの薬学的特性が本質的に影響されない限り、そして前記断片のＮ末端アミノ酸としてＡｓｎ３８およびＡｓｎ８３が保持されＣｙｓ２９が保持される限りは、アミノ酸配列中の僅かな修飾（約３個までの交換、付加、欠失）を有する断片も含む。
本発明によれば、Ｃｙｓ２９で始まるエリスロポエチンのＣ末端部分は、真核生物細胞中で組換えにより製造され、それによりＡｓｎ３８およびＡｓｎ８３がグリコシル化されるが、先頭部からＧｌｙ２８までのＮ末端部分はインビトロで化学反応により合成される。
したがって、本発明は、保持されたＡｓｎ２４およびＧｌｙ２８を有するＥＰＯのアミノ酸１〜２８からなるＮ−末端ＥＰＯ断片と、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３においてグリコシル化されると共に保持されたＣｙｓ２９を有するＥＰＯのアミノ酸２９〜１６５または１６６からなるＣ−末端ＥＰＯ断片とを、Ｇｌｙ２８とＣｙｓ２９との間の化学的結合により結合させ、そしてＥＰＯムテインを単離することを特徴とする、ＥＰＯ変異体を製造する方法を提供する。
組換えＣ末端ＥＰＯ断片を、真核生物細胞中、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫまたはＨｅＬａ細胞系において組換えＤＮＡ技術または内因性遺伝子活性化により発現させることにより調製してもよく、すなわち、エリスロポエチン糖タンパク質が内因性遺伝子活性化により発現される。本発明による好ましいエリスロポエチンムテインは、ヒトＥＰＯの配列に基づく。より好ましくは、ヒトＥＰＯは、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、最も好ましくは、ヒトＥＰＯは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
Ｃ末端ＥＰＯ断片は、好ましくは、全長ＥＰＯを製造するのと同様の方法でＣＨＯ細胞中において製造されるか、または好ましくは、ＷＯ９９／０５２６８およびＥＰ１０３７８２１によるヒト細胞の内因性遺伝子活性化によっても製造される。
Ｎ末端ＥＰＯ断片は、段階的固相法を用いて合成され、樹脂から開裂され、脱保護されることができる。これは、クロマトグラフィーにより、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより精製することができ、例えば、Schnoelzer,M.ら、Int.J.Pept.Protein Res.第４０巻（１９９２年）１８０〜１９３頁；Dawson,P.E.ら、Science第２６６巻（１９９４年）７７６〜７７９頁；およびSchnoelzerら、G.G.Fields（編）、Solid Phase Peptide Synthesis,Methods Enzymology第２８９巻（１９７７年）（全巻参照）に記載のようにイオンスプレー質量分析により特徴付けられる。Ｃ末端において、この断片は、好ましくは、Ｃ末端断片のＣｙｓ２９に結合するためのチオカルボキシエステルを含む。
Ｎ末端ＥＰＯ断片とＣ末端ＥＰＯ断片との結合は、Ｃ末端断片が、好ましくはＣｙｓ２９であるアミノ末端システイン残基を有する限り、簡単な方法で自然化学的結合により行うことができる（Dawson,P.E.ら、Science第２６６巻（１９９４年）７７６〜７７９頁）。この原理によれば、Ｎ末端断片は、α−カルボキシ基においてチオエステルを含み、Ｃ末端断片のアミノ末端のＣｙｓ残基の側鎖により求核攻撃を受ける。最初のチオエステル結合生成物は、迅速な分子内反応を受け、結合部位において天然ペプチド結合を有する生成物を提供する。そのようなペプチドの化学的結合方法が、Dawson,P.E.およびKent,S.B.H.、Annual Review of Biochemistry第６９巻（２０００年）９２３〜９６０頁において検討されている。
Ｎ末端ＥＰＯ断片およびＣ末端ＥＰＯ断片を、好ましくは、Dawson,P.E.ら、Science第２６６巻（１９９４年）７７６〜７７９頁またはDawson,P.E.ら、J.Am.Chem.Soc.第１１９巻（１９９７年）４３２５〜４３２９頁に従って、グアニジン塩酸塩または尿素などの変性溶液中での結合中に可溶化させ、結合させた。
結合したＥＰＯムテインの精製は、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどの慣用の方法により行われる。
「ＰＥＧ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端および／またはリシン２０における（ポリエチレン）グリコール残基の共有結合を意味する。タンパク質のＰＥＧ化は、当該技術水準において広く知られており、例えば、Veronese,F.M.、Biomaterials第２２巻（２００１年）４０５〜４１７頁に検討されている。ＰＥＧは、異なる官能基および異なる分子量のポリエチレングリコール、線状および分岐ＰＥＧ、ならびに異なる結合性基を用いて結合することができる（Francis,G.E.ら、Int.J.Hematol.第６８巻（１９９８年）１〜１８頁；Delgado,C.ら、Crit.Rev.Ther.、Drug Carrier Systems第９巻（１９９２年）２４９〜３０４頁も参照）。
Ｎ末端断片のＰＥＧ化は、例えばＷＯ００／４４７８５に記載のように、好ましくは分子量が５〜４０ｋＤａのＮＨＳ活性化線状または分岐ＰＥＧ分子を用いて、水性溶液中でＰＥＧ化試薬を用いて行うことができる。ＰＥＧ化は、Lu,Y.ら、Reactive Polymers第２２巻（１９９４年）２２１〜２２９頁に従って固相で行うこともできる。
そのような方法により、Ｌｙｓ２０のε−アミノ基および／またはＮ−末端アミノ基においてＰＥＧ化されるＮ末端ＥＰＯ断片が得られる。Ｎ末端アミノ酸における選択的ＰＥＧ化は、Felix,A.M.ら、ACS Symp.Ser.第６８０巻（ポリ（エチレングリコール））（１９９７年）２１８〜２３８頁に従って行うことができる。選択的Ｎ末端ＰＥＧ化は、Ｎα−ＰＥＧ化アミノ酸誘導体をペプチド鎖のＮ−１末端アミノ酸にカップリングすることにより固相合成中に達成することができる。側鎖ＰＥＧ化は、Ｎe−ＰＥＧ化リシン誘導体を成長している鎖にカップリングすることにより固相合成中に行うことができる。Ｎ末端および側鎖の同時ＰＥＧ化は、前述のように固相合成中に、またはアミノ脱保護ペプチドに活性化ＰＥＧ試薬を適用することによる溶液相合成により実行できる。
適切なＰＥＧ誘導体は、平均分子量が好ましくは約５〜約４０ｋＤａ、より好ましくは約２０〜約４０ｋＤａ、最も好ましくは約３０ｋＤａである活性化されたＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は、線状または分岐ＰＥＧであることができる。ＰＥＧタンパク質およびＰＥＧペプチド複合体の調製に好適に用いられる種々のＰＥＧ誘導体を、Shearwater Polymersから得ることができる（ハンツビル、アラバマ州、アメリカ；www.swpolymers.com）。
活性化ＰＥＧ誘導体は当該分野において知られており、例えば、ＰＥＧビニルスルホンについてMorpurgo,M.ら、J.Bioconj.Chem.第７巻（１９９６年）３６３〜３６８頁に記載されている。線状鎖および分岐鎖ＰＥＧ種は、ＰＥＧ化断片の調製に適している。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧおよびメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホン：
Figure 2005509609
（ｍは好ましくは、約４５０〜約９００の整数であり、Ｒは１〜６個の炭素原子を有する線状または分岐状の低級アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル等であるが、メチルが好ましい）である。
これらのヨード活性化物質の使用は、当該分野において知られており、例えば、Hermanson,G.T.、Bioconjugate Techniques、Academic Press、サン・ディエゴ（１９９６年）１４７〜１４８頁に記載されている。
最も好ましくは、ＰＥＧ種は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
Figure 2005509609
により、（メトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（分子量３００００；Shearwater Polymers,Inc.）などのアルコキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を用いて活性化される（ここで、Ｒおよびｍは上述のとおり定義される）。
「アルコキシ」という用語は、アルキルエーテル基（ここで、「アルキル」という用語は最大４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する）、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ等を意味し、メトキシが好ましい。
モノまたはジＰＥＧ化種の分離を含むＰＥＧ化Ｎ末端断片のさらなる精製は、当該分野で知られている方法、例えば、カラムクロマトグラフィーにより行ってもよい。
さらに、本発明は、上記のＥＰＯムテインまたは組成物と緩衝剤等の薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、水性組成物および医薬組成物に関し、また慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血およびＡＩＤＳに関する疾患の治療または予防用ならびに化学療法を受けている癌患者の治療用薬剤を調製するための、上記ＥＰＯムテインまたは組成物の使用に関する。さらに、本発明は、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳおよび化学療法を受けている患者の癌を含む疾患の予防および／または治療方法であって、上記の組成物を治療有効量で患者に投与する段階を含む方法に関する。
「治療有効量」という用語は、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボの生物学的活性に必要な本発明のエリスロポエチンムテインの量である。エリスロポエチンムテインの正確な量は、処置される症状の正確なタイプ、処置される患者の症状、および組成物中の他の成分等の要因に左右される選択事項である。エリスロポエチンムテインを含む医薬組成物は、赤血球産生の低下または欠損により特徴付けられる血液疾患を患っているヒト患者に種々の手段により投与するために効果的な力価で製剤化される。エリスロポエチン糖タンパク質生産物の平均治療有効量は、変化してよく、特に、資格のある医師の推奨および処方に基づくべきである。
さらに、本発明は、上記方法により調製された上記ＥＰＯムテインおよび組成物、ならびに慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血、ＡＩＤＳおよび化学療法を受けている癌患者に関する疾患の処置のための上記ＥＰＯムテインおよび組成物に関する。
本発明のＥＰＯ断片およびＥＰＯムテインは、当該技術水準に従って精製することができる。
ＥＰ−Ａ０２６７６７８には、ＥＰＯの精製のために、Ｓ−セファロース上のイオン交換クロマトグラフィー、Ｃ８カラム上の分取逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマトグラフィーが記載されている。これに関して、ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、Ｓ−セファロースファーストフロー上のイオン交換クロマトグラフィーに置き換えることができる。イオン交換クロマトグラフィーの前にブルートリスアクリル（Blue Trisacryl）カラム上の色素クロマトグラフィーを行うことも提案されている。組換えＥＰＯの精製方法も、Nobuo,I.ら、J.Biochem.第１０７巻（１９９０年）３５２〜３５９頁に記載されている。しかしながら、この方法において、ＥＰＯは、精製工程前に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、フッ化フェニルメチルスルホニル、エチルマレイミド、ペプスタチンＡ、硫酸銅およびオキサミド酸の溶液で処理される。
本発明によるＥＰＯまたはＥＰＯムテインの特異的活性を、当該分野で知られている種々のアッセイにより測定することができる。本発明の精製ＥＰＯタンパク質の生物学的活性とは、ＥＰＯタンパク質をヒト患者に注射することにより投与すると、非注射または対照被験者群と比べて骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増加させるようなことである。本発明により得られ精製されたＥＰＯムテインまたはその断片の生物学的活性は、Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio １９９７（２）による方法によって試験することができる。
ＥＰＯの活性を測定するためのもう一つの生物学的アッセイである正赤血球性（normocythaemic）マウスアッセイを実施例５に記載している。
本発明により調製されるエリスロポエチンムテインは、当該分野で知られている方法により、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と共に注射するのに適した医薬組成物中に調製してもよい。例えば、適切な組成物がＷＯ９７／０９９９６、ＷＯ９７／４０８５０、ＷＯ９８／５８６６０およびＷＯ９９／０７４０１に記載されている。本発明の生産物を調製するための好ましい薬学的に許容され得る担体には、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物は、等張剤、例えば、１３２ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７の１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中に製剤化される。任意に医薬組成物は防腐剤を含んでよい。医薬組成物は、異なる量の、例えば、１０〜１０００μｇ／ｍｌ、例えば、５０μｇまたは４００μｇのエリスロポエチンを含んでよい。
本発明のエリスロポエチン糖タンパク質生産物を投与すると、ヒトにおいて赤血球が形成される。したがって、エリスロポエチン糖タンパク質生産物を投与すると、赤血球の生成において重要であるこのＥＰＯタンパク質が補給される。エリスロポエチン糖タンパク質生産物を含む医薬組成物は、赤血球産生の低下または欠損により特徴付けられる血液疾患を単独でまたは症状もしくは疾患の一部として患っているヒト患者に種々の手段により投与するために効果的な力価で調製されてもよい。医薬組成物は、皮下または静脈内注射等の注射により投与してもよい。エリスロポエチン糖タンパク質生産物の平均量は、変化してよく、特に、資格のある医師の推奨および処方に基づくべきである。複合剤の正確な量は、治療される症状の正確なタイプ、治療される患者の症状および組成物中の他の成分等の要因に左右される選択事項である。例えば、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１０μｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１μｇを、例えば、週１回投与してもよい。
本出願全体において、種々の公報を参照にした。これらの公報の開示を、当該技術水準をより充分に説明するために本明細書に引用して援用する。
以下の実施例、参考例および配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の請求の範囲に示す。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順において修正が施され得ることが理解される。
ＰＥＧ化ＥＰＯ（１−２８）の生成：Ｎα−ＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｌｙｓ（ＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ）２０］−ＥＰＯ（１−２８）αＣＯＳＢｚｌの合成およびモノＰＥＧ化フラクションの単離
ペプチドを段階的固相法を用いて合成し、樹脂から開裂し、脱保護し、高性能液体クロマトグラフィーにより精製し、文献（Schnolzer,M.ら、Int.J.Pept.Protein Res.第４０巻（１９９２年）１８０頁；Schnolzer,P.M.ら、G.G.Fields(編)、Solid Phase Peptide Synthesis,Meth.Enzymol.第２８９巻（１９７７年）全巻を参照）に記載のイオンスプレー質量分析により特徴付けするが、ここでＣ末端ベンジルチオエステルの形成について、Lu,W.ら、J.Am.Chem.Soc.第１１８巻（１９９６年）８５１８〜８５２３頁の経路に従った。
１．１ ＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳの合成
ｍＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（ＣＨ３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ）を、Lu,Y.A.著、Int.J.Pept.Protein Res.第４３巻（１９９４年）１２７〜１３８頁に記載のとおりにＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化した。エチレンオキシド繰り返し単位数ｎは、１１０〔分子量は５０００（ＰＥＧ５０００）を与える〕、４４０（ＰＥＧ２０ｋ）、８８０（ＰＥＧ４０ｋ）の範囲にあった。
１．２ ＥＰＯ（１−２８）αＣＯＳＢｚｌの合成
Ｎ末端ペプチドを、Lu,W.ら、J.Am.Chem.Soc.第１１８巻（１９９６年）８５１８〜８５２３頁に従って段階的固相合成により調製した。アミノ酸の段階的付着のために、ＢＯＣ−Ｇｌｙ−（チオエステルリンカー）−アミノメチル樹脂を用いた。得られたペプチドを脱保護し樹脂から開裂させた。
臭化ベンジルを添加してチオエステルを調製し、次に、これをＨＰＬＣにより精製した。チオエステルを含むフラクションをプールし、ＨＰＬＣにより精製した。
１．３ ＥＰＯ（１〜２８）αＣＯＳＢｚｌのＰＥＧ化
ＰＥＧ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳを添加して、Ｎ末端アラニンのα−ＮＨ２および２０位におけるリシンのε−ＮＨ２において、ペプチドをＮ−アシル化した。モノおよびジＰＥＧ化ＥＰＯ（１−２８）チオエステルを分離し、ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。
二官能試薬によるＥＰＯ（１−２８）のＰＥＧ化
ａ）チオール基の共有結合
この実施例は、チオール基を断片に共有結合させるための反応条件の決定を開示している。条件を決めるために、ブロックされたチオール基を含む異なる量の試薬、ここではＳＡＴＡ（スクシンイミジルアセチルチオアセテート）またはＳＡＴＰ（スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート）（１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解）を、断片ＥＰＯ（１−２８）αＣＯＳＢｚｌの溶液に、ここでは１０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３中の５ｍｇ／ｍｌ断片の１ｍｌに添加した。反応液を約３０分間攪拌（２５℃）し、１Ｍリシン溶液を１０ｍＭで添加して停止させた。過剰量のＳＡＴＡおよびＳＡＴＰを、１０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ６．２に対して透析することにより除去した。保護性アセチル基をヒドロキシルアミンで除去した後、断片に共有結合しているチオール基の数を、Grasetti,D.R.およびMurray,J.F.著、J.Appl.Biochem.Biotechnol.第１１９巻（１９６７年）４１〜４９頁により記載された方法に従って、ジチオジピリジンを用いて光度計により測定した。
ｂ）活性化ＥＰＯ（１−２８）のＰＥＧ化
メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（分子量３００００；Shearwater Polymers,Inc.,ハンツビル（アラバマ州、合衆国））３８０ｍｇを、活性化ＥＰＯ９５ｍｇを含む溶液（１０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．２中に４．５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。得られた溶液中の活性化断片とメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの分子比は１：４であった。１Ｍヒドロキシルアミン水溶液を３０ｍＭ、ｐＨ６．２で上記溶液に添加することにより、活性化断片の共有結合ブロックチオール基を脱ブロックした。溶液の反応混合物中の得られた活性化断片は、遊離チオール（−ＳＨ）基を含んでいた。チオール基の脱ブロックに続いて、直ちに、遊離チオール（−ＳＨ）基を含む活性化断片とメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの間のカップリング反応を９０分間行った（攪拌、２５℃）。カップリング反応は、反応混合物に、０．２Ｍシステイン水溶液を２ｍＭで添加することにより停止させた。３０分後、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドと反応しなかった活性化断片の過剰の遊離チオール基を、ＤＭＳＯ中の０．５Ｍ Ｎ−メチルマレイミド溶液を添加して５ｍＭの濃度にし、ブロックした。３０分後、得られたＰＥＧ化断片を含む反応混合物を、イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５に対して１５時間以上透析した。
ＥＰＯ（２９−１６５）の組換体の製造
ＥＰＯ（２９−１６５）を、ＷＯ９９／０５２６８の実施例１に従って調製した。
収穫および細胞分離：
バッチ再供給プロセスを用いた。すなわち、所望の細胞密度に達したとき、培地の約８０％を収集した。残りの培地に、新鮮培養培地を補給し、次の収集まで培養した。１回の生産工程は、最大１０回の後に続く収集：９回の部分的収集と発酵終了時における１回の全収集とからなる。収集は３〜４日毎に行う。
測定した収集容量を、冷却した容器中に移した。細胞を遠心分離または濾過により除去し廃棄した。遠心分離段階の断片を含む上澄みを、インライン濾過し、第２の冷却された容器中に集めた。各収集物は精製中に別々に処理する。
結合および単離
実施例１および２に従って調製したＰＥＧ−ＥＰＯ（１−２８）ＣＯＳＢｚｌおよびＥＰＯ（２９−１６５）の両方の等モル量を、０．１Ｍリン酸緩衝液、６ＭグアニジンＨＣｌ中、ｐＨ７．５で約６ｍｇ／ｍｌの割合で可溶化した。３％チオフェノールおよび１％ベンジルメルカプタン（容量％）を添加し、同様に過剰のＤＴＴをタンパク質の還元を維持するために添加し、約３６時間完了するまで結合させた。次に、過剰の試薬を、イオン交換クロマトグラフィーにより除去した。６ＭグアニジンＨＣｌで緩衝液およびｐＨを約１ｍｇ／ｍｌ蛋白濃度に調節し、約０．２ｍｇ／ｍｌに希釈することによりタンパク質の再折りたたみを達成した。結合生成物を、ＷＯ０１／０２０１７の実施例１に従って精製した。
正赤血球性マウスアッセイにより測定されたＰＥＧ化ＥＰＯのインビボ活性
ＰＥＧ−ＥＰＯ、非修飾ＥＰＯおよび緩衝溶液をマウスに投与した。その結果から、マウスに対する同じ投与量での網状赤血球の量の有意な増加および最大網状赤血球数の変化により表される、非修飾ＥＰＯに対するＰＥＧ化ＥＰＯ種の優れた活性および半減期の延長が示された。
正赤血球性マウスバイオアッセイは当該分野において知られている（Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio １９９７（２））。試料はＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した。７〜１５週齢の正常健康マウスに、実施例４に記載のとおりのＰＥＧ化ＥＰＯ ０．２ｍｌを皮下投与した。投与後７２時間目から開始して４日目まで、尾静脈の穿刺により採血し、０．１５μｍｏｌアクリジンオレンジ染色溶液１ｍｌ中に血液１μｌが存在するように希釈した。染色時間は３〜１０分である。網状赤血球の計数を、赤色蛍光ヒストグラムを分析することによりフローサイトメーターにおいてマイクロ蛍光測定により行う（分析した３００００個の血球当たり）。各検査群は、１日当たりマウス５匹とし、マウスは１回のみ採血した。
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【配列表】
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Claims (15)

  1. 骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボの生物学的活性を有するエリスロポエチンムテインであって、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３においてＮ−グリコシル化されているがＡｓｎ２４においてＮ−グリコシル化されていないことを特徴とする、エリスロポエチンムテイン。
  2. Ｎ−末端アミノ基および／またはＬｙｓ２０のε−アミノ基において低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基に結合することを特徴とする、請求項１に記載のエリスロポエチンムテイン。
  3. 各ポリ（エチレングリコール）部分の平均分子量が約５キロダルトン〜約４０キロダルトンである、請求項２に記載のエリスロポエチンムテイン。
  4. 各ポリ（エチレングリコール）部分の平均分子量が約３０キロダルトンである、請求項２に記載のエリスロポエチンムテイン。
  5. ポリ（エチレングリコール）部分がメトキシによりキャップされている、請求項２〜４のいずれか１項に記載のエリスロポエチンムテイン。
  6. 配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のエリスロポエチンムテイン。
  7. 骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボの生物学的活性を有するエリスロポエチンムテインであって、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ７４においてＮ−グリコシル化されているがＡｓｎ２４においてＮ−グリコシル化されていないことを特徴とするエリスロポエチンムテインと、薬学的に許容され得る緩衝剤とを含む、水性組成物。
  8. 前記エリスロポエチンムテインがＮ−末端アミノ基および／またはＬｙｓ２０のε−アミノ基において低級アルコキシポリ（エチレングリコール）基に結合することを特徴とする、請求項７に記載の水性組成物。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のムテインまたは組成物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物。
  10. 慢性腎不全（ＣＲＦ）患者における貧血およびＡＩＤＳに関する疾患の治療または予防用の、ならびに化学療法を受けている癌患者の治療用の、薬剤を調製するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のムテインまたは組成物の使用。
  11. エリスロポエチンムテインの製造方法であって、保持されたＡｓｎ２４およびＧｌｙ２８を有するエリスロポエチンのアミノ酸１〜２８からなるＮ−末端エリスロポエチン断片と、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３においてグリコシル化されると共に保持されたＣｙｓ２９を有するエリスロポエチンのアミノ酸２９〜１６５または１６６からなるＣ−末端エリスロポエチン断片とを、Ｇｌｙ２８とＣｙｓ２９との間の化学的結合により結合させ、そしてエリスロポエチンムテインを単離することを特徴とする方法。
  12. 前記Ｎ−末端断片がエリスロポエチン配列のＮ−末端および／またはリシン２０においてＰＥＧ化される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記Ｎ−末端断片が化学的合成により製造される、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記Ｃ−末端断片が組換え遺伝子発現により製造される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. ここに定義される発明。
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