JP2002531089A - 赤血球産生性化合物 - Google Patents

赤血球産生性化合物

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JP2002531089A JP2000585403A JP2000585403A JP2002531089A JP 2002531089 A JP2002531089 A JP 2002531089A JP 2000585403 A JP2000585403 A JP 2000585403A JP 2000585403 A JP2000585403 A JP 2000585403A JP 2002531089 A JP2002531089 A JP 2002531089A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インビボで安定性と生物活性を示す、ポリマー誘導型非グリコシル化赤血球産生性化合物を提供することにより貧血を処置するためのより良い製剤に対する必要性に関する。本発明はさらに、リンカーを有さないアルデヒド修飾方法を使用することに関する、これらの誘導体型タンパク質の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ヒト用医薬品の分野、特に貧血のような赤血球産生を刺激すること
により処置可能である病態の処置の分野に属する。より具体的には、本発明は、
患者に投与した際に血中ヘマトクリットの上昇を引き起こすポリマー誘導体化非
グリコシル化タンパク質に関する。
【０００２】 貧血は、血液中の赤血球（red blood cells、erythrocyteとも称される）の体
積または数が正常な状態よりも低くなることにより特徴付けられる病態である。
血液中の赤血球の体積の尺度の１つは、ヘマトクリット測定である。血中ヘマト
クリットは、試料体積全体に対する試料中に存在する細胞体積の割合であり、一
般的にパーセントであらわされている。正常なヘマトクリットレベルの範囲は、
36％〜53％の間である。通常、36％未満の血中ヘマトクリットが貧血の目安であ
る。
【０００３】 貧血は社会全体に広まっており、とりわけ、腎不全、β−サラセミア、妊娠、
月経障害、脊髄損傷、急激な失血、低酸素症、加齢、AZT治療を伴うHIV感染、お
よび異常な赤血球産生が生じる分化した腫瘍疾患状態のような病態にしばしば関
連している。
【０００４】 赤血球は体内で連続的に産生され、そして破壊されている。貧血は、赤血球の
破壊および損失に赤血球の形成が追いつかない場合に生じる。貧血の治療は、赤
血球の破壊および損失を低下させる、赤血球の形成を代替するまたは上昇させる
、あるいはこれらの両方を行うことのいずれかに関連する。本発明の目的は、赤
血球の形成を上昇させることである。
【０００５】 赤血球の形成は、赤血球産生として知られている複雑なプロセスを介して生じ
る。この、骨髄で生じるプロセスは、原始多発性赤血球産生幹細胞の一部が赤血
球細胞系統に分化（committed to）した場合に始まる。幹細胞は、最初に赤芽球
バスト形成細胞(BFU-E)、続いて赤芽球コロニー形成細胞(CFU-E)、正赤芽球、赤
芽球、網赤血球を形成し、最終的に成熟した赤血球を形成する。その複雑さおよ
び不可欠性のため、赤血球産生を正確に調節するために多数の制御系が必要とさ
れる。エリスロポイエチンはこのような制御系のうちの１つである。
【０００６】 エリスロポイエチン（EPO）は、赤血球産生を刺激するホルモンである。EPOは
腎臓で産生され、血流中へと分泌されて骨髄中の前駆細胞の赤血球への分化を刺
激する。EPOが赤血球産生を刺激する原因となるメカニズムは、EPOの特定の細胞
表面レセプターへの結合に関連している。EPOレセプターの活性化は、レセプタ
ーのリン酸化、続くJAK-STAT、RASおよびPI3キナーゼ経路の活性化を含む細胞内
シグナル伝達事象の引きがねとなる。これらのシグナル伝達経路は、細胞増殖お
よび細胞分化の引きがねとなり、そしてアポトーシスを阻害する。
【０００７】 EPOは、タンパク質部分と炭水化物部分とを有する糖タンパク質である。ヒトE
POの優性対立遺伝子変異体のタンパク質部分は166個のアミノ酸から構成されて
おり、そしてその配列は公知である。EPOは組換えDNA技術により作製されている
（rHuEPO）。Chinese Hamster Ovary (CHO) 細胞および他の細胞株の中で産生し
た組換えヒトEPOは、165個のアミノ酸しか有していないが、これは166位のアル
ギニンを欠損しているためである [L. Owers-Narhiら、J. of Biol. Chem. 266:
23022-23026 (1991)]。
【０００８】 ヒトEPOは、見かけ上およそ30.4 kDaの分子量を有する。EPOのみかけの分子量
のほぼ40％が炭水化物に起因する。EPOは、成熟タンパク質の24位、38位および8
3位のアミノ酸に３本のＮ結合型オリゴ糖鎖、そして126位にＯ結合型糖鎖を有す
る。各Ｎ結合型グリコシル化部位とその間の両方に、分岐とシアル酸含量におい
て高い程度の不均一性が観察されている。
【０００９】 炭水化物の役割は複雑である。特定の部位の正確なグリコシル化がEPOの正確
な生合成および分泌に重要であることが、研究により示されている。これは、タ
ンパク質発現の間の正確なフォールディングを促進するため、ならびに生合成、
分泌および循環の間の分解から、EPOおよび組換えグリコシル化赤血球産生性タ
ンパク質を保護するためであると考えられている。
【００１０】 分子の炭水化物部分はまた、インビボ活性に大きな影響を与えている。EPOお
よび組換えグリコシル化赤血球産生性タンパク質を循環から取り除く特定のプロ
セスは、EPOに結合した炭水化物の構造の影響を受ける。種々の研究により、EPO
から末端シアル酸を取り除くことによりインビボ活性が破壊されることが示され
ている。このことは、脱シアル型EPOは完全にシアル化されたEPOよりも非常に早
く循環から排泄されるということに、一部、起因する。他方、脱シアル化するこ
とによりEPOのインビトロ活性は事実上、上昇する。おそらくこれは、レセプタ
ーに対する親和性が増加するためである。
【００１１】 いくつかの製薬製品は、組換えグリコシル化赤血球産生性タンパク質を含む。
これらのタンパク質は、いずれも、ヒトEPOと正確に同一のアミノ酸構造または
炭水化物構造を有しているわけではないが、構造的にはヒトEPOとほとんど異な
らず、そして特定の貧血の処置に治療上有効であることが見出されている。しか
し、これらの組換えグリコシル化赤血球産生性タンパク質は、治療用物質として
最適化されていない。
【００１２】 例えば、これらのタンパク質は赤血球産生の刺激を維持するためにはかなり頻
繁な間隔で静脈内投与するか、または皮下投与しなければならない。組換え分子
の天然の性質は、薬物の作用を伝統的な薬物送達系に限定する。より少ない投与
回数での、場合により代替となる投与経路による投与が可能であり、そして長期
保存を可能にするためにより安定である薬剤を提供することは、貧血の処置に有
益であり、公知の組換えグリコシル化赤血球産生性タンパク質における不便さや
不都合を減少するであろう。長期作用によるさらなる利点としては、より自然な
薬物動態プロフィール、最大補償（maximal reimbursement）ヘマトクリットレ
ベル（36）を超える長期効力および高血圧症のような副作用の減少の可能性であ
ろう。従って、赤血球産生を刺激し、作用期間がより適切であり、そして製薬上
より安定である薬剤を開発する必要性が存在する。
【００１３】 １つのアプローチは、組換えグリコシル化赤血球産生性タンパク質（例えば、
新規な赤血球産生刺激タンパク質（NESP））の炭水化物含量または構造を変化さ
せることであった。さらなるグリコシル化部位を追加することにより、インビボ
でのEPOの安定性の上昇、および循環中での半減期の延長が期待される。しかし
ながら、さらなるグリコシル化は全ての場合において必ずしも良いアプローチ方
法ではない。なぜならば、EPOレセプターに対してより結合し難く、またはおそ
らく糖タンパク質排泄機構により循環中から取り除かれる、赤血球産生の刺激に
より適していない分子が生じる可能性があるからである。さらなる懸念は、EPO
のグリコシル化を増強することにより送達したタンパク質のバイオアベイラビリ
ティに好ましくない影響を与えるかもしれないことである。
【００１４】 しばしば、タンパク質は、非経口、経肺、経口、経鼻または経真皮的な方法を
用いて投与される。結果として、物質の投与量を、バイオアベイラビリティの減
少、薬物動態の変化、および薬力学の変化に関連する複雑さを埋め合わせるため
に変化させる必要性がある。さらに、外来性投与（exogenous administrating）
の需要は、必ずしも天然のタンパク質が本来有していないタンパク質特性（例え
ば10倍以上の程度でインビボ濃度を増大させる可溶性）を必要とする。最後に、
インビボ応答の誘発に必須である外来的に投与される治療用タンパク質の製剤需
要は、高分子の毒物学的影響に不都合な影響を与える可能性がある。
【００１５】 これらの問題を回避するため、そして貧血を処置するためのより良い製剤への
必要性に取り組むために、ポリエチレングリコールで誘導体化した非グリコシル
化赤血球産生性タンパク質を発明した。驚くべきことに、この分子は、EPOのヘ
マトクリットレベルをインビボで上昇させる能力を保持していることが見出され
た。
【００１６】 Francisらによる論文は、本発明の方法により、低い生物活性を有するEPO分子
が生じることを示唆している（Intl. J. Hem. (1998) 68: 1-18）。この著者ら
は、活性型ポリマーとしてPEG-アセトアルデヒドを用い、本発明方法で野生型EP
Oを修飾した場合に活性保持時間が非常に乏しくなると記載している。しかし、F
rancisらは、トレシルモノメトキシ（tresylmonomethoxy）−ポリエチレングリ
コール（TMPEG）をPEG化GM-CSFおよび非グリコシル化野生型ヒトエリスロポイエ
チンに使用しうることを示唆している。しかし、インビボ生物活性を保持し、同
時にPEG化を促進するために必要な特定の条件に関連する方法は提示されていな
い。この著者らはまた、産生した非グリコシル化PEG化EPOタンパク質のいずれの
特徴づけも行っていないし、また、本発明で特許請求する非グリコシル化アナロ
グのいずれに関する議論も行っていない。この参考文献は、非グリコシル化PEG
化EPOからインビトロ活性を維持することが可能であることのみを記載している
。さらに、以下に十分議論するように、特定のPEG化タンパク質がインビトロ活
性を有するかどうかは、そのタンパク質がインビボで機能することができるかど
うかとは本質的に無関係である。
【００１７】 しかし、Francisらの教示とは反対に、本発明は、リンカーレスアルデヒド修
飾方法を使用して作製することができ、そしてインビボで安定性と生物活性とを
示すポリマー誘導型非グリコシル化赤血球産生性化合物を提供する。
【００１８】 １つの局面において、本発明は式（Ｉ）：
【化１】 ［式中、-2位のXaaは存在しないか、またはMetであり； -1位のXaaは存在しないか、またはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、L
eu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrであり； 24位のXaaはAsn、LysまたはGluであり； 38位のXaaはAsn、LysまたはGluであり； 76位のXaaはArgまたはGluであり； 83位のXaaはAsn、LysまたはGluであり； 88位のXaaはTrp、Lys、ProまたはArgであり； 126位のXaaはSer、Thr、LysまたはGluであり； 139位のXaaはArgまたはGluであり； 154位のXaaはLysまたはGluであり；および 166位のXaaはArg、存在しないかまたは任意の他のアミノ酸である］ で示される非グリコシル化タンパク質を含む。 非グリコシル化エリスロポイエチンアナログとしては、a) NGE；b)NGE [5E]；
c) MR-NGE；d) MR-NGE-88E；e) MR-NGE-88K；f) MR-NGE-88P；g) MR-NGE-88S；h
) MR-NGE [4E]；i) MR-NGE [5E]；j) MR-NGE [5K]；k) MR-NGE [W5E]；および1)
MR-NGE[W5K]からなる群から選択されるタンパク質が挙げられる。これらの非グ
リコシル化エリスロポイエチンアナログは、166に任意のアミノ酸を有し得るか
、または166位のアミノ酸を欠失していてもよい。
【００１９】 これらの非グリコシル化EPOアナログは、それ自体はヘマトクリットの顕著な
増加を引き起こさないが、一旦ポリエチレングリコールポリマーで適切に誘導体
化されるとそのような特性を獲得する。それゆえ、これらは、本発明の他の組成
物を製造するための開始物質として、産業上有用である。
【００２０】 本発明はさらに、式Ｉのアナログをコードする単離された核酸、ならびにこれ
らの核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。この式ＩのEPOアナログを
発現し得る宿主細胞を含む、トランスジェニックまたはキメラの、非ヒト動物ま
たは植物もまた、本発明の範囲内にある。
【００２１】 別の局面において、本発明は、タンパク質部分とポリマー部分とを有する赤血
球産生性化合物であって、該タンパク質部分は非グリコシル化ヒトエリスロポイ
エチンおよび非グリコシル化エリスロポイエチンアナログからなる群から選択さ
れ、該ポリマー部分は式：R-O-(CH２CH２-O)Ｘ-(CH２)Ｙ-NH（式中、RはHまたは
C１〜C４アルキルであり、Xは約70〜約1200の数であり、そしてYは1〜4の数であ
る）ポリマー鎖１〜５個からなり、該ポリマー鎖は二級アミン結合によりタンパ
ク質部分に共有結合している化合物、またはその製薬上許容される塩を提供する
。
【００２２】 本発明はさらに、ポリマー誘導体化非グリコシル化赤血球産生性化合物を製造
する方法であって、ａ）非グリコシル化エリスロポイエチンのアミノ基とポリエ
チレングリコールアルデヒドポリマーのアルデヒド基との間にイミン結合が形成
される条件下で、上記ポリマーを、上記タンパク質を含む溶液に添加する工程、
ならびにｂ）還元剤を添加してイミン結合を二級アミン結合に還元する工程を含
む方法を提供する。
【００２３】 本発明はまた、治療上有効な量のポリマー誘導体化非グリコシル化赤血球産生
性化合物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物体内のヘマトクリットレベ
ルを上昇させる方法を提供する。
【００２４】 本発明の修飾したアナログは結合した炭水化物基を有していないので、天然の
グリコシル化を媒介するプロセスで循環から排泄される可能性が低い。ポリエチ
レンポリマーをいくつかの異なるタンパク質に付加することにより、それらの製
薬特性が改善されることが示されてきた。それにもかかわらず、治療剤として認
可されているポリマー修飾型タンパク質はほとんど存在しない。ポリエチレング
リコール基をタンパク質に付加することは、カップリング／活性化工程が生物活
性の実質的な損失を引き起こし得るという点が問題であった。さらに、カップリ
ング反応を制御することができないため、立体障害およびタンパク質−レセプタ
ー結合の妨害を引き起こす位置へのポリマーの付加が生じていた。
【００２５】 しかし、本発明は、インビボでの安定性および生物活性を示すポリエチレング
リコール誘導体化非グリコシル化EPOアナログを提供する。EPOに結合した炭水化
物鎖がタンパク質の安定性、可溶性およびインビボ活性に影響を与えることが示
されてきたので、安定な非グリコシル化EPOアナログを生産し、そして改善され
た治療品質を示すように修飾できたことは驚くべきことである。
【００２６】 さらに、非グリコシル化EPO（NGE）およびNGEアナログ上の正に荷電した残基
を修飾して長期作用型治療剤を産生することは、リガンドとレセプターの間の想
定されている相互作用を鑑みると問題が多く、そして驚くべきこと（nontrivial
）である。具体的には、EPOレセプターは、EPO上の負に荷電した（酸性の）残基
と相互作用するrHuEPO上の正に荷電した（塩基性の）残基により媒介されると考
えられてきた［S. Elliottら、(1997) Mapping the active site of recombinan
t human erythropoietin、Blood 89：493-502］。従って、EPOおよびEPOアナロ
グ上の正に荷電した残基を修飾することによりインビボ活性が上昇するという知
見は、直感に反したものであり、驚くべきものであり、そして予想し得ないもの
である。
【００２７】 本明細書中に開示され、そして特許請求されている本発明の目的から、以下の
用語および略語を定義する。本明細書中で使用する用語および略語は、特に記載
しない限り通常の意味を有する。例えば、「℃」は、単位セルシウス度を意味し
；「mmol」は、ミリモルを意味し；「mg」は、ミリグラムを意味し；「μｇ」は
マイクログラムを意味し；「ml」または「mL」は、ミリリットルを意味し；「μ
l」または「μL」は、マイクロリットルを意味する。
【００２８】 アミノ酸の略語は、37 C. F. R.§1.822 (b) (2) (1994)に記載されている。
【００２９】 「エリスロポイエチン」は、ヒトエリスロポイエチンを意味し、本明細書中に
おいて「EPO」または「huEPO」と略称する。EPOは、ヒト腎臓から分泌され、ヒ
トの血中で見出される糖タンパク質ホルモンであり、これはヒト骨髄中での赤血
球の形成（赤血球産生または生成）を刺激する。エリスロポイエチンのタンパク
質部分の優性（predominant）対立遺伝子変異体のアミノ酸配列は公知である。E
POは166個のアミノ酸から構成されており、約40重量％が炭水化物から構成され
、総分子量約30.4kDaを有する。EPOの炭水化物構造は不均一であるが、優性ヒト
対立遺伝子変異体のアミノ酸配列はそうではない。従って、これらの用語は、EP
OまたはhuEPO分子の不均一な群を意味する。
【００３０】 「非グリコシル化エリスロポイエチン」とは、結合グリコシル鎖を欠損したヒ
トエリスロポイエチンを意味し、「NGE」と略す。NGEはEPOのアミノ酸配列を有
しているが、24位、38位および83位のＮ結合型グリコシル鎖、ならびに126位の
Ｏ結合型グリコシル鎖を欠損している（配列番号：４）。さらに、NGEは166位の
アミノ酸を欠損していることがあり、または166位にArgを有していることもある
。
【００３１】 非グリコシル化EPOは、翻訳後にタンパク質にグリコシル部分を結合させる能
力を欠損した細胞型の中で従来どおりに発現させてもよいし、またはEPOから酵
素によりグリコシル鎖を取り除くことにより作製してもよい。
【００３２】 「エリスロポイエチンアナログ」とは、EPOとほぼ同じアミノ酸配列を有し、
そして適切に哺乳動物に投与した場合にヘマトクリットを上昇させる能力を有す
るが、１つ以上のアミノ酸修飾を有するという点でEPOとは異なっている、グリ
コシル化タンパク質を意味する。アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸の挿入、
欠失、置換または逆位でありうる。グリコシル化EPOアナログを、「GEA」と略す
。
【００３３】 「非グリコシル化エリスロポイエチンアナログ」とは、EPOとほぼ同じアミノ
酸配列を有するが、１つ以上のアミノ酸修飾を有するという点でEPOとはアミノ
酸配列が異なっている、非グリコシル化エリスロポイエチンを意味する。非グリ
コシル化EPOアナログを、「NGEA」と略す。NGEAには、166位のアミノ酸が欠失し
ている非グリコシル化EPOが挙げられる。さらに、NGEAとして、166位のアミノ酸
が任意のアミノ酸であるEPOが挙げられる。
【００３４】 「NGE-166Δ」とは、NGEと同一の配列を有するが、166位のArgが欠失している
非グリコシル化タンパク質を意味する。
【００３５】 「NGE-24E,38E,83E,88E,126E」および「NGE［5E］」とは、24位、38位および8
3位のAsn、88位のTrp、ならびに126位のSerがGluで置換されており、そして166
位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他のアミノ酸であること
を除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパク質を意味する。「N
GE-24E,38E,83E,88E,126E,166Δ」および「NGE［5E］166Δ」は、「NGE-24E,38E
,83E,88E,126E」および「NGE［5E］」と同一の配列を有するが、166位のArgを欠
失している。NGE［5E］およびNGE［5E］166Δは、NGEAである。
【００３６】 「MR-NGE」とは、Met-Argリーダー配列を有し、そして166位のArgが存在しな
いか、存在しているかまたは任意の他のアミノ酸であることを除いて、NGEと同
一の配列を有する非グリコシル化タンパク質を意味する。MR-NGE-166Δは、MR-N
GEと同一の配列を有するが、166位のArgを欠失している。MR-NGEおよびMR-NGE-1
66ΔはNGEAである。
【００３７】 「MR-NGE-88E」とは、Met-Argリーダー配列を有し、88位のTrpがGluで置換さ
れており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他の
アミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパ
ク質を意味する。「MR-NGE-88E,166Δ」は、「MR-NGE-88E」と同一の配列を有す
るが、166位のArgを欠失している。MR-NGE-88EおよびMR-NGE88E,166Δは、NGEA
である。
【００３８】 「MR-NGE-88K」とは、Met-Argリーダー配列を有し、88位のTrpがLysで置換さ
れており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他の
アミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパ
ク質を意味する。MR-NGE-88K,166Δは、MR-NGE-88Kと同一の配列を有するが、16
6位のArgを欠失している。MR-NGE-88KおよびMR-NGE-88K,166ΔはNGEAである。
【００３９】 「MR-NGE-88P」とは、Met-Argリーダー配列を有し、88位のTrpがProで置換さ
れており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他の
アミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパ
ク質を意味する。「MR-NGE-88P,166Δ」は、MR-NGE-88Pと同一の配列を有するが
、166位のArgを欠失している。MR-NGE-88PおよびMR-NGE-88P,166ΔはNGEAである
。
【００４０】 「MR-NGE-88S」とは、Met-Argリーダー配列を有し、88位のTrpがSerで置換さ
れており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他の
アミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパ
ク質を意味する。「MR-NGE-88S,166Δ」は、MR-NGE-88Sと同一の配列を有するが
、166位のArgを欠失している。MR-NGE-88SおよびMR-NGE-88S,166ΔはNGEAである
。
【００４１】 「MR-NGE-76E,88E,139E,154E」および「MR-NGE［4E］」とは、Met-Argリーダ
ー配列を有し、76位のArg、88位のTrp、139位のArgおよび154位のLysがGluで置
換されており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の
他のアミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タ
ンパク質を意味する。「MR-NGE-76E,88E,139E,154E,166Δ」または「MR-NGE［4E
］166Δ」は、「MR-NGE-76E,88E,139E,154E」および「MR-NGE［4E］」と同一の
配列を有するが、166位のArgを欠失している。MR-NGE［4E］およびMR-NGE［4E］
166Δは、NGEAである。
【００４２】 「MR-NGE-24E,38E,83E,88E,126E」または「MR-NGE［5E］」とは、Met-Argリー
ダー配列を有し、24位、38位および83位のAsn、88位のTrp、ならびに126位のSer
がGluで置換されており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかま
たは任意の他のアミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリ
コシル化タンパク質を意味する。「MR-NGE-24E,38E,83E,88E,126E,166Δ」また
は「MR-NGE［5E］166Δ」は、「MR-NGE-24E,38E,83E,88E,126E」または「MR-NGE
［5E］」と同一の配列を有するが、166位のArgを欠失している。MR-NGE［5E］お
よびMR-NGE［5E］166Δは、NGEAである。
【００４３】 「MR-NGE-24K,38K,83K,88K,126K,166Δ」または「MR-NGE［5K］」とは、Met-A
rgリーダー配列を有し、24位、38位および83位のAsn、88位のTrp、ならびに126
位のSerがLysで置換されており、そして166位のArgが存在しないか、存在してい
るかまたは任意の他のアミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する
非グリコシル化タンパク質を意味する。
【００４４】 「MR-NGE-24K,38K,83K,88K,126K,166Δ」または「MR-NGE［5K］166Δ」は、MR
-NGE-24K,38K,83K,88K,126KまたはMR-NGE［5K］と同一の配列を有するが、166位
のArgを欠失している。MR-NGE［5K］およびMR-NGE［5K］166Δは、NGEAである。
【００４５】 「MR-NGE-24E,38E,83E,126E」または「MR-NGE［W5E］」とは、Met-Argリーダ
ー配列を有し、24位、38位および83位のAsn、ならびに126位のSerがGluで置換さ
れており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他の
アミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパ
ク質を意味する。「MR-NGE-24E,38E,83E,126E,166Δ」または「MR-NGE［W5E］16
6Δ」は、「MR-NGE-24E,38E,83E,126E」または「MR-NGE［W5E］」と同一のアミ
ノ酸配列を有するが、166位のArgを欠失している。MR-NGE［W5E］およびMR-NGE
［W5E］166Δは、NGEAである。
【００４６】 「MR-NGE-24K,38K,83K,126K」または「MR-NGE［W5K］」とは、Met-Argリーダ
ー配列を有し、24位、38位および83位のAsn、ならびに126位のSerがLysで置換さ
れており、そして166位のArgが存在しないか、存在しているかまたは任意の他の
アミノ酸であることを除いて、NGEと同一の配列を有する非グリコシル化タンパ
ク質を意味する。「MR-NGE-24K,38K,83K,126K,166Δ」または「MR-NGE［W5K］16
6Δ」は、「MR-NGE-24K,38K,83K,126K」または「MR-NGE［W5K］」と同一の配列
を有するが、166位のArgを欠失している。MR-NGE［W5E］およびMR-NGE［W5E］16
6Δは、NGEAである。
【００４７】 本明細書中に記載のクローニング方法、発現方法および精製方法を用いて製造
したNGEA化合物のリストを表Ｉに掲げる。一文字表記は、式Ｉの特定の位置のア
ミノ酸を表す。
【００４８】
【表１】
【００４９】 「赤血球産生（生成）活性」とは、化合物の赤血球産生を刺激する能力を意味
する。赤血球産生活性は、インビトロならびにインビボで評価することができる
。赤血球産生活性とは、一般に、化合物を有効な用量で許容される投与経路で投
与した場合に、確立された基準値からのヘマトクリットレベルの上昇を引き起こ
す能力を意味する。インビトロ活性は、実施例４に概説する方法により測定する
ことができ、そしてインビボ活性は実施例５に概説する方法により決定すること
ができる。
【００５０】 「赤血球産生（生成）性化合物」とは、赤血球産生活性を有する非グリコシル
化ポリマー誘導型タンパク質を意味する。
【００５１】 「ポリエチレングリコール」または「PEG」とは、式： HO(CH２CH２O)ｘCH２CH２-OH ［式中、xは約70〜約1200、好ましくは約450〜約1200、さらにより好ましくは、
約450〜約700の数である］ で表される親水性ポリマーを意味する。
【００５２】 「PEG-アルデヒド」とは、式： CH３O-(CH２CH２O)ｘCH２CH２O-(CH２)Ｙ-CHO ［式中、Ｙは１〜４の数であり、xは約70〜約1200、好ましくは約450〜約1200、
さらにより好ましくは、約450〜約700の数である］ で表される親水性ポリマーを意味する。
【００５３】 「PEG-プロピオンアルデヒド」とは、式： CH３O-(CH２CH２O)ｘCH２CH２O-CH２CH２-CHO ［式中、xは約70〜約1200、好ましくは約450〜約1200、さらにより好ましくは、
約450〜約700の数である］ で表されるPEG-アルデヒド親水性ポリマーを意味する。
【００５４】 「PEG化タンパク質」とは、式： R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)ＹNH ［式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約450〜約1200、さらにより好ましくは、約450〜約700の数であり、Ｙは１〜
４の数である] で表されるポリマー鎖を１個〜５個有するタンパク質を意味し、このポリマー鎖
は第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している。
【００５５】 「PEG化NGE」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表されるポリマー鎖を１個〜５個有する上記の非グリコシル化EPOを意味し、
このポリマー鎖は第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している。
【００５６】 「PEG化NGEA」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表される、第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している１〜５種類の
ポリマー鎖を有する上記の非グリコシル化EPOアナログを意味する。
【００５７】 「モノPEG化NGEA」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表される、第二アミン結合によりタンパク質に共有結合しているただ１つのポ
リマー鎖に結合している上記の非グリコシル化EPOアナログを意味する。
【００５８】 「ジPEG化NGEA」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表される、第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している２個のポリマ
ー鎖に共有結合している上記の非グリコシル化EPOアナログを意味する。
【００５９】 「トリPEG化NGEA」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表される、第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している３個のポリマ
ー鎖に共有結合している上記の非グリコシル化EPOアナログを意味する。
【００６０】 「テトラPEG化NGEA」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表される、第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している４個のポリマ
ー鎖に共有結合している上記の非グリコシル化EPOアナログを意味する。
【００６１】 「マルチPEG化NGEA」とは、式： ［R-O-(CH２CH２-O)Ｘ(CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約225〜約1200、さらにより好ましくは約340〜約1200、さらにより好ましくは
約450〜約1200、さらにより好ましくは約450〜約700の数であり、Ｙは１〜４の
数である） で表される、第二アミン結合によりタンパク質に共有結合している４個以上のポ
リマー鎖に共有結合している上記の非グリコシル化EPOアナログを意味する。
【００６２】 「Lys_C」とは、リジン残基に対しＣ末端でペプチドおよびタンパク質を特異
的に切断するエンドプロテアーゼを意味する。
【００６３】 特に記載しない限り、全ヌクレオチド配列は５’末端から３’末端への方向で
記載する（しばしば、これは「５’−３’」と称する）。
【００６４】 特に記載しない限り、全アミノ酸配列またはタンパク質配列はアミノ末端（「
Ｎ−末端」）から始まり、カルボキシ末端（「Ｃ−末端」）で終結する。
【００６５】 本明細書中で使用する「塩基対」すなわち「ｂｐ」とは、DNAまたはRNAを意味
する。略語Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、それぞれがDNA分子中に存在する場合にはデ
オキシリボヌクレオシド［（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）シチジン、（
デオキシ）グアノシンおよびチミジン］の５’−１リン酸化形態に対応する。略
語Ｕ、Ｃ、ＧおよびＡは、それぞれがRNA分子中に存在する場合にはリボヌクレ
オチド［ウリジン、シチジン、グアノシンおよびアデノシン］の５’−１リン酸
化形態に対応する。二本鎖DNA中では、塩基対とはＡとＴ、またはＣとＧの対合
を意味するであろう。DNA/RNA中では、ヘテロ２重らせん塩基対は、ＡとＵ、ま
たはＣとＧとの対合を意味するであろう（以下の「相補的」の定義を参照のこと
）。
【００６６】 DNAの「消化」または「制限」とは、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵
素（「配列特異的エンドヌクレアーゼ」）を用いてDNAを触媒的に切断すること
を意味する。本明細書中で使用する種々の制限酵素は市販されており、当業者に
公知の反応条件、補因子および他の必要条件で使用した。特定の制限酵素に対す
る適切な緩衝液および基質の量は、製造業者により記載されているか、または文
献中に容易に見出すことができる。
【００６７】 「ライゲーション」とは、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエス
テル結合を形成する工程を意味する。特に記載しない限り、T4 DNAリガーゼのよ
うなDNAリガーゼとともに、既知の緩衝液および条件を用いてライゲーションを
行うことができる。
【００６８】 「プラスミド」とは、（通常）染色体外の自己複製遺伝因子を意味する。一般
に、プラスミドは、小文字の「ｐ」とその後の文字および／または数字により表
される。本明細書中の開始プラスミドは市販されているか、非制限的な供給源か
ら公に入手可能なものか、または入手したプラスミドから刊行されている方法に
従って構築することのできるもののいずれかである。さらに、記載されているプ
ラスミドに相当するプラスミドは当該分野において公知であり、当業者に明らか
である。
【００６９】 本明細書中で使用する「組換えDNAクローニングベクター」とは、自律複製因
子を意味し、これには１つ以上のさらなるDNAセグメントを追加することができ
るかまたは追加されているDNA分子を含むプラスミドおよびファージを含むが、
決してこれらに限定されない。
【００７０】 本明細書中で使用する「組換えDNA発現ベクター」とは、挿入したDNAの転写を
施御するプロモーターが組み込まれている任意の組換えDNAクローニングベクタ
ーを意味する。
【００７１】 「転写」とは、その工程によりDNAのヌクレオチド配列に含まれている情報が
相補的RNA配列に移されることを意味する。
【００７２】 「トランスフェクション」とは、何らかのコード配列が実際に発現されるかど
うかには関係なく宿主細胞により発現ベクターが取り込まれることを意味する。
多数のトランスフェクション方法（例えば、リン酸カルシウム共沈法およびエレ
クトロポレーション）が当業者に公知である。一般に、このベクターの作動を示
すなんらかの徴候が宿主細胞内で生じた場合に、トランスフェクションが成功し
たとみなされる。
【００７３】 「形質転換」とは、染色体外因子としてか、または染色体組込みによるかのい
ずれかで、DNAが複製可能であるように生物内にDNAが取り込まれることを意味す
る。細菌および真核生物宿主の形質転換方法は当該分野において周知であり、核
注入、プロトプラスト融合法または塩化カルシウムを用いるカルシウム処理のよ
うなこれらの方法の多くは、J. Sambrook,ら、Molecular Cloning：A Laborator
y Manual、(1989)にまとめられている。一般に、DNAを酵母に導入する場合には
、用語、形質転換には用語トランスフェクションに対立するものとして使用され
る。
【００７４】 本明細書中で使用される「翻訳」とは、それによりメッセンジャーRNA (mRNA)
の遺伝情報が使用されてポリペプチド鎖の合成に特に向けられるプロセスを意味
する。
【００７５】 「ベクター」は、遺伝子操作の際に細胞のトランスフェクションおよび／また
は形質転換のために使用される核酸化合物であって、適切な制御配列と組み合わ
せた場合にトランスフェクトした、および／または形質転換した宿主細胞に特定
の性質を付与する、適切なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド配列を保
有する核酸化合物を、意味する。プラスミド、ウィルスおよびバクテリオファー
ジは適切なベクターである。制限酵素およびリガーゼを使用して、異なる供給源
からDNA分子を切断し、そして連結させて人工ベクターを構築する。本明細書中
で使用する用語「ベクター」としては、組換えDNAクローニングベクターおよび
組換えDNA発現ベクターが挙げられる。
【００７６】 本明細書中で使用する「相補的」、または「相補性」とは、二本鎖核酸におい
て水素結合を介して会合する塩基（プリンおよびピリミジン）の対合を意味する
。以下の塩基対は相補的である：グアニンおよびシトシン；アデニンおよびチミ
ジン；およびアデニンおよびウラシル。
【００７７】 本明細書中で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対形
成を介して相補鎖と結合する工程を意味する。同一ではないが非常に類似してい
る２本の相補的核酸のハイブリダイゼーションで使用する条件は、２つの鎖の相
補性の程度および鎖の長さに応じて変化する。このような技術および条件は当業
者に周知である。
【００７８】 「単離したアミノ酸配列」とは、天然に存在する配列とは位置が異なる、構築
したかまたは合成したアミノ酸配列を意味する。
【００７９】 「単離したDNA化合物」とは、ゲノム上の位置が天然のものとは異なる、構築
したかまたは合成したDNA配列を意味する。
【００８０】 「単離した核酸化合物」とは、天然の位置とは異なる位置にある、構築したか
または合成した、任意のRNAまたはDNA配列を意味する。
【００８１】 「プライマー」とは、酵素的伸長または合成的伸長のための開始基質として機
能する核酸フラグメントを意味する。
【００８２】 「プロモーター」とは、DNAのRNAへの転写を指令するDNA配列を意味する。
【００８３】 「プローブ」とは、別の核酸化合物とハイブリダイズする核酸化合物またはそ
のフラグメントを意味する。
【００８４】 「ストリンジェンシー」とは、他の核酸に対する核酸の親和性の程度を変化さ
せるために変化させうるハイブリダイゼーション条件のセットを意味する。
【００８５】 「PCR」とは、熱安定性DNAポリメラーゼを用いる広く知られたポリメラーゼ連
鎖反応を意味する。
【００８６】 「リーダー配列」とは、目的の所望のポリペプチドを作製するために酵素的ま
たは化学的に取り除かれうるＮ−末端配列のアミノ酸を意味する。
【００８７】 「分泌シグナル配列」とは、一般的に、長いポリペプチドのN-末端領域に存在
する、そのポリペプチドと細胞膜との会合と、そのポリペプチドの細胞膜を介し
た分泌とを開始するように機能するアミノ酸の配列を意味する。
【００８８】 本発明は、非グリコシル化EPOの誘導体および非グリコシル化EPOアナログの誘
導体を提供し、これらはグリコシル化EPOタンパク質と比較して改善された治療
特性を有している。本発明のNGEおよびNGEA誘導体は、組換え系での発現、続い
てポリエチレングリコール（PEG）での修飾により作製される。
【００８９】 本発明の非誘導体型非グリコシル化EPOタンパク質は、実際にはインビボ活性
を有していない。[Linら、米国特許第4,703,008号；K. Yamaguchiら、(1991) Ef
fects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythro
poietin on its production and biological properties, J. of Biol. Chem. 2
66：20434-20439］。しかしながら、非グリコシル化EPOおよび特定の非グリコシ
ル化EPOアナログをPEG化することにより、グリコシル化したエリスロポイエチン
およびNGEと比較して、血漿半減期の上昇、免疫原性および抗原性の減少、可溶
性の改善、タンパク質分解感受性の低下（reduced proteolytic susceptibility
）、バイオアベイラビリティの改善、毒性の減少、血清結合タンパク質に対する
親和性の減少、熱および物理的安定性の改善、ならびにデポー製剤との適合性の
改善のような特性を付与する。
【００９０】 従って、本発明の目的は、EPOと比較して改善した特性を有する、ポリマー誘
導体化非グリコシル化赤血球産生性化合物を製造し、それによりEPOの炭水化物
含量の増加に伴う既存の問題を回避することである。これらの問題としては、バ
イオアベイラビリティの減少および好ましくない薬物動態が挙げられる。
【００９１】NGEおよびNGEAの製造 本発明の化合物は、組換えDNA技術、あるいは溶液もしくは固相ペプチド合成
または、従来的な溶液法で結合させたタンパク質フラグメントを用いて開始する
溶液中での半合成法のような、周知の化学合成法を含む種々の方法により、製造
することができる。
【００９２】 ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、単離した核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操
作した宿主細胞、および組換え技術によるNGEまたはNGEAの製造に関する。 場合により、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチドを、宿主中での増
幅のために選択マーカーを含むベクターに連結してもよい。哺乳動物細胞宿主に
関しては、一般的に、プラスミドベクターを沈殿物（例えば、リン酸カルシウム
沈殿物）中または荷電脂質との錯体中で、あるいは当業者に周知の他の方法によ
り、導入する。ベクターがウィルス性ベクターである場合、直接哺乳動物宿主細
胞に導入することもできるし、または適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでのパッケージングにより作製したウィルス性の上清を用いて導入するこ
ともできる。細菌ウィルスベクター（バクテリオファージ）である場合もまた、
市販のパッケージング細胞抽出物を用いてインビトロでパッケージングし、次い
で宿主細菌細胞をトランスフェクトすることができる。
【００９３】 DNAインサートは適切なプロモーター（例えば、少し名前を挙げると、ファー
ジラムダPLプロモーター、E.coli lac、trpおよびtacプロモーター、SV40極初期
および後期プロモーター、ならびにレトロウィルス、LTRのプロモーター、なら
びにグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびアルコールオ
キシダーゼ（AOX）プロモーター）に作動可能に連結されているべきである。他
の適切なプロモーターは、当業者に公知であろう。発現構築物はさらに、転写開
始部位、終結部位および転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有す
る。好ましくは、構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳され
るmRNAの始まりに翻訳開始コドン、および末端に適切に配置された終結コドン（
例えば、UAA、UGAまたはUAG）を含む。
【００９４】 好ましくは、発現ベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含有する。この
ようなマーカーとしては、例えば、哺乳動物細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダ
クターゼまたはネオマイシン耐性、酵母用のネオマイシン耐性または栄養要求性
マーカーの補充物、ならびにイー・コリ（E.coli）および他の細菌の培養のため
のテトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコール
耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、イー・コリ、ストレプ
トマイセス（Streptomyces）およびサルモネラ・チフムリウム（Salmonella typ
himurium）細胞のような細菌細胞；アスパルギルス・ニゲル（Aspergillus nige
r）のような真菌細胞；ピッチア・パストリス（Pichia pastoris）およびサッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母細胞；ドロ
ソフィア（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞のような
昆虫細胞；CHO、COS、AV12、HEK293およびBowes黒色腫細胞のような動物細胞；
ならびにタバコ、トウモロコシおよび大豆のような植物細胞が挙げられるが、決
してこれらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件
は、当該分野において公知である。細菌での使用に好ましいベクターとしては、
Qiagenから入手できるpQE70、pQE60およびpQE-9；Stratageneから入手できるpBS
ベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A
、pNH46A；Novagenから入手できるpET30ベクター、ならびにPharmacia から入手
できるptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5が挙げられる。好ましい真
核生物用ベクターとしては、Stratageneから入手できるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44
、pXTlおよびpSG；Invitrogen,Inc.から入手できるpcDNA3、pRcRSVおよびpRcCMV
；ならびにPharmaciaから入手できるpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLが挙げられる
。Pichia pastorisでの発現に好ましいベクターとしては、Invitrogen,Incから
市販されているpPICベクターが挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容
易に明らかであろう。
【００９５】 ベクター構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクシ
ョン、形質転換または他の方法により達成することができる。このような方法は
、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing
, NY, NY (1987-1998) およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory M
anual、第２版、Cold Spring Harbor, NY (1989)のような多数の標準的な実験室
マニュアルに記載されている。
【００９６】 本発明のタンパク質は、融合タンパク質のような修飾型で発現することができ
、そしてこれらは分泌シグナルだけではなく、さらなる外来性の機能領域をも含
み得る。例えば、さらなるアミノ酸領域をアナログのＮ末端に追加して、宿主細
胞中、精製中または続いての取り扱いおよび保存の間の安定性および保存性を改
善することができる。また、ペプチド部分を追加して精製を容易にすることがで
きる。このような領域は、活性型タンパク質の最終的な製造の前に取り除くこと
ができる。このような方法は、例えば、Sambrook（前出）17.29-17.42章、およ
び18.1-18.74章；Ausubel（前出）16章、17章および18章のような多数の実験室
マニュアルに記載されている。
【００９７】 具体的には、MR-NGE-166Δをコードする遺伝子を、ヒトエリスロポイエチンcD
NAの＋鎖由来の６オーバーラップオリゴヌクレオチドのセットを、６相補的オリ
ゴヌクレオチド（−鎖）とインビトロでハイブリダイゼーションさせることによ
り合成的に構築した。合成MR-NGE-166Δ遺伝子に対するコドン使用頻度（codon
usage）は、E. coliコドン使用頻度に対して100％最適化した（Wisconsin Packa
ge、v. 8）が、５’末端のGC含量は低いままであるようにした。ハイブリダイズ
したオリゴヌクレオチドをT4 DNAリガーゼを用いて連結し、そしてライゲーショ
ン産物をPCRによりPfuターボ（turbo）DNAポリメラーゼを用いて増幅した（Stra
tegene）。
【００９８】 PCRにより、２個の制限エンドヌクレアーゼ切断部位（5'NdeI部位および3'Bam
HI部位）を合成MR-NGE-166Δ遺伝子に導入した。次いで、MR-NGE-166ΔPCR産物
を、市販の発現ベクター、pET30a (Novagen) のNdeIおよびBamH I部位にクロー
ニングしてpET30aMR_NGE-166Δ（図１）を作製した。市販の発現株BL21（DE3）
（Novagen）を用いてタンパク質の発現を行った。Nelson, R., M.およびLong, G
., L., (1989)、Anal. Biochem.180：147-151に記載の手順に従いPCRを用いて異
なる位置に点変異を導入することにより、非グリコシル化エリスロポイエチンア
ナログをコードする遺伝子を製造した。
【００９９】 宿主細胞中でのタンパク質の発現 本発明の核酸を使用して、組換え操作した細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫ま
たは哺乳動物細胞）中で、本発明のタンパク質を発現することができる。意図さ
れる人為的介入により遺伝子操作して変化させているので、細胞は天然の場合と
は異なる状態（例えば、量、組成、局在および／または時間）でタンパク質を生
産する。
【０１００】 当業者は本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用しうる多数の発現
系に精通していることが予想される。原核生物または真核生物中でのタンパク質
の発現のための、公知である種々の方法については詳述しない。
【０１０１】 簡単にまとめると、代表的に、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸
の発現は、例えば、DNAまたはcDNAを（構成性または誘導性のいずれかである）
プロモーターに作動可能に連結し、次いで発現ベクターに組み込むことにより達
成することができる。ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかでの複製
および組込みに適切なものでありうる。代表的な発現ベクターは、本発明のタン
パク質をコードするDNAの発現の調節に有用である転写および翻訳ターミネータ
ー開始配列ならびにプロモーターを含む。クローニングした遺伝子の高レベルで
の発現を得るため、少なくとも、転写を指令する強力なプロモーター、翻訳開始
のためのリボソーム結合部位および転写／翻訳ターミネーターを含む発現ベクタ
ーを構築することが望ましい。
【０１０２】 あるいは、本発明の核酸を誘導性プロモーターの下流に融合させてもよい。次
いで、誘導性プロモーターの下流に融合させた目的の遺伝子を含む宿主細胞を特
定の転写インデューサーに曝すことにより、遺伝子発現を誘発させる。このよう
な方法は、例えば、米国特許第5,580,734号、同第5,641,670号、同第5,733,746
号および同第5,733,761号（これらの全てを本明細書中に引用して組み込む）に
記載されるように、当該分野において周知である。
【０１０３】 原核生物での発現 原核細胞を発現用の宿主として使用してもよい。最も使用頻度の高い原核生物
は種々のE. coliにより代表されるが、他の微生物株もまた、使用し得る。転写
開始のためのプロモーターを含むと本明細書中に定義した一般的に使用される原
核生物制御配列、場合によってはオペレーターを、リボソーム結合部位配列と共
に含む、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース(lac)プロモー
ター系（Changら、Nature 198：1056 (1977)）、トリプトファン(trp)プロモー
ター系 (Goeddelら、Nucleic Acids Res. 8：4057 (1980))、バクテリオファー
ジ（bacteriaphage）T7プロモーターおよびRNAポリメラーゼ、ならびにλバクテ
リオファージ由来のPLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位（Shimat
akeら、Nature 292：128 (1981)）のような一般的に使用されているプロモータ
ーが挙げられる。E. coli中にトランスフェクトしたDNAベクターに選択マーカー
を含ませることも有用である。このようなマーカーの例としては、アンピシリン
、テトラサイクリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を
示す遺伝子が挙げられる。
【０１０４】 ベクターは、適切な宿主細胞への導入が可能であるように選択する。細菌ベク
ターは、プラスミドまたはファージ起源のものが代表的である。適切な細菌細胞
をファージベクター粒子で感染させるか、またはファージベクターDNAをそのま
ま用いてトランスフェクトする。プラスミドベクターを使用する場合には、細菌
細胞をプラスミドベクターDNAで形質転換する。本発明のタンパク質を発現する
ための発現系は、バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）およびサルモネラ
（Salmonella） (Palvaら、Gene 22：229-235 (1983)；Mosbachら、Nature 302
：543-545 (1983)）を使用して利用することができる。
【０１０５】 例えば、pET30a＿MR-NGE-166Δを市販の発現株であるBL21 (DE3) (Novagen)に
トランスフェクトした （図１）。代表的には、対数増殖期の細胞を37℃でOD600 ＝0.9まで増殖させ、MR-NGE-166Δを発現するように1 mM IPTGで誘導をし、誘導
の３時間後に回収した。上記の発酵条件により、MR-NGE-166Δの高レベルの発現
( ＞100 mg/L）を得、これは封入体で蓄積した。
【０１０６】 真核生物での発現 酵母、昆虫細胞株、植物および哺乳動物細胞のような種々の真核生物発現系が
当業者に公知である。以下に簡単に説明するように、本発明の核酸はこれらの真
核生物系で発現することができる。
【０１０７】 酵母中での外来性タンパク質の合成は周知である。F. Shermanら、Methods in
Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)は、酵母中でタンパ
ク質を産生するために利用可能である種々の方法を記載する、広く認識されてい
る業績である。真核生物タンパク質を産生するために広く利用されている酵母系
は、サッカロマイセス・セレビシエおよびピッチア・パストリスである。サッカ
ロマイセスおよびピッチア中での発現のためのベクター、株およびプロトコール
は、当該分野において公知であり、そして市販の業者（例えば、Invitrogen）か
ら入手可能である。通常、適切なベクターは、所望ならば、プロモーター（３−
ホスホグリセリン酸キナーゼまたはアルコールオキシダーゼを含む）および複製
起点、終結配列などの発現制御配列を有する。
【０１０８】 また、例えば、哺乳動物、昆虫または植物起源の細胞培養物をトランスフェク
トさせる際に使用するための種々の発現ベクターに本発明のタンパク質をコード
する配列を連結することもできる。ペプチドの産生に有用である細胞培養物の例
は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば、細胞単層の形態である
が、哺乳動物細胞懸濁物も使用することができる。完全なタンパク質を発現する
ことができる、多数の適切な宿主細胞株が当該分野において開発されており、こ
れにはHEK293、BHK21、AV-12およびCHO細胞株が挙げられる。これらの細胞に対
する発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター（例えば
、CMVプロモーター、HSV tkプロモーターまたはpgk（ホスホグリセリン酸キナー
ゼ）プロモーター）、エンハンサー（Queenら、Immunol. Rev. 89：49 (1986)）
、ならびに、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部
位（例えば、SV40ラージT AgポリA付加部位またはウシ成長ホルモンポリA付加部
位）ならびに転写終結配列のようなプロセシング情報部位）を含有してもよい。
本発明のタンパク質の産生に有用な他の動物細胞は、例えば、細胞系統およびハ
イブリドーマのアメリカンタイプカルチャーコレクションカタログから入手可能
である（第７版、1992）。
【０１０９】 本発明のタンパク質を昆虫細胞で発現するための適切なベクターは、通常、Ｓ
Ｆ９バキュロウィルス由来のものである。適切な昆虫細胞株としては、ボウフラ
（mosquito larvae）、カイコ、アワヨトウ、ガおよびDrosophila細胞株（例え
ば、Schneider細胞株)(Schneider,J.Embryol.Exp.Morphol.27：353〜365(1987)
を参照のこと）が挙げられる。
【０１１０】 酵母を用いる場合と同様に、より高等な動物または植物宿主細胞を用いる場合
、代表的には、ポリアデニル化または転写終結配列をベクター中に組み込む。終
結配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写
物の正確なスプライシングのための配列もまた、含ませることができる。スプラ
イシング配列の例は、SV40由来のVP1イントロンである（Spragueら、J.Virol.45
：773〜781(1983))。さらに、宿主細胞中での複製を制御するための遺伝子配列
を、ウシパピローマウィルス型ベクター中に見出されるベクターに組み込むこと
もできる。M.Saveria-Campo、Bovine Papilloma Virus DNA、a Eukaryotic Clon
ing Vector in DNA Cloning、第II巻、a Practical Approach,D.M.Glover編、IR
L Press、Arlington、VA、213〜238頁（1985）。
【０１１１】 シグナルペプチド： 原核生物環境下および真核生物環境下の両方において、タンパク質の細胞外へ
の放出を容易にするためにシグナルペプチドを使用することができる。外来性シ
グナルペプチドを正常な細胞質タンパク質に付加することにより、正常な細胞タ
ンパク質の細胞外輸送を生じることができる。別のシグナルペプチド配列も外来
性のコード配列と共に機能することができる。 27アミノ酸ヒトEPO分泌シグナル配列のようなシグナルペプチド、α因子ペプ
チドまたはヒト血清アルブミンシグナルペプチドを本発明の修飾型EPOタンパク
質に組み込んで細胞外輸送（extracellular translocation）または細胞内局在
（intracellular destination）を容易にすることができる。
【０１１２】 リーダー配列： 本発明は、成熟タンパク質のN-末端に縮合した種々のアミノ酸配列を有するリ
ーダー配列を意図する。リーダー配列がDAPまたはカテプシンのような他のアミ
ノペプチドプチダーゼにより切断されることを可能にする溶媒に、このリーダ配
列を曝すことが好ましい。リーダー配列の溶媒への露出を容易にし、続いてのDA
Pによる除去を可能にするアミノ酸から構成されるリーダー配列が好ましい。好
ましいリーダー配列は、セリンプロテアーゼまたはDAP酵素のような特定の酵素
により切断され得る、偶数の２〜20個の親水性アミノ酸を含有する。より好まし
いリーダー配列は、本発明のNGEAのN-末端アミノ酸に縮合した、配列Met-Argで
ある（表Ｉを参照のこと）。
【０１１３】 タンパク質のフォールディング： 標準的な方法を用いて、本発明のNGEまたはNGEAをコードする遺伝子を保有す
る発現ベクターを適切な宿主細胞に一旦トランスフェクトすると、このベクター
を含有する細胞は組換えアナログタンパク質の発現に適した条件下で増殖する。
例えば、組換え遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に配置されている場合、適
切な増殖条件は適当なインデューサーが組み込まれている。この組換え的に産生
されたタンパク質は、任意の適切な手段により形質転換細胞の細胞性抽出物から
精製することができる。E. coli-由来封入体を、好ましくは尿素または塩酸グア
ニジン（guanadine hydrochoride）を含む変性溶液を用いて可溶化し、そしてま
ずタンパク質を、その精製するタンパク質のpIに従ってカチオンまたはアニオン
交換クロマトグラフィーにより精製することが好ましい。好ましくは、溶出した
タンパク質を再生溶液で過度に透析するか、または溶液を含むタンパク質を再生
緩衝液に滴下して無限に希釈することにより再フォールディングすることができ
る。次いで、再フォールディングしたタンパク質を、濃縮器を介するS3Y10スパ
イラルカートリッジ（spiral cartridge）Amicon Flowを備えたタンジェンシャ
ルフローフィルトレーションシステム（tangential flow filtration system）
、または透析バッグ中でのPEG-誘導性脱水のいずれかを使用して濃縮することが
できる。
【０１１４】 タンパク質精製： 本発明のNGEおよびNGEAは、組換え細胞培養物から周知の手段（硫酸アンモニ
ウムまたはエタノールでの沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含
む）により精製することができる。アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフ
ィー、ホスホセルロースクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィ
ーを使用することがもっとも好ましい。 さらに、本発明の非グリコシル化EPOタンパク質を数個のヒスチジン残基のN-
末端またはC-末端に縮合してもよい。この「ヒスチジン-タグ（tag）」により、
「固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（immobilized metal io
n affinity chromatography）」 (IMAC)と称されている１工程タンパク質精製方
法が可能となる［この方法は、本質的には、米国特許第4,569,794号（この全て
を本明細書中に引用して組み込む）に記載されている］。IMAC方法により、上記
のように組換えタンパク質を発現している細胞の粗抽出物から開始する、実質的
に純粋なタンパク質の迅速な単離が可能となる。
【０１１５】 リーダー配列の切断： N-末端リーダー配列を含む非グリコシル化EPOタンパク質を、細菌、酵母また
は高等真核生物細胞中で発現させた後に、このタンパク質をモノ−またはジ−ア
ミノペプチドプチダーゼのようなアミノペプチドプチダーゼ、トリプシンのよう
なセリンプロテアーゼあるいは臭化シアンによる切断のような化学的切断法で消
化してもよい。Watsonら、(1976) Methods Microb. 9：1-14は、E. coliを含む
異なる細菌中に存在する異なるアミノペプチドプチダーゼを記載している（その
全てを本明細書中に引用して組み込む）。
【０１１６】 ジペプチジルアミノペプチダーゼ（DAP）は、最後から２番目のアミノ末端ペ
プチド結合を加水分解してアミノ末端が保護されていないペプチドおよびタンパ
ク質からジペプチドを遊離させる酵素である。現在、４つのクラスのジペプチジ
ルアミノペプチダーゼ（DAP-I、DAP-II、DAP-IIIおよびDAP-IVと命名されている
）が存在し、これらは物理的特性および基質との反応速度に基づいて差が認めら
れる。DAP-Iは、比較的非特異的なDAPであり、これはペプチドおよびタンパク質
の保護されていないアミノ末端からの多数のジペプチドの組み合わせの遊離を触
媒する。生じるジペプチドがPro-XまたはX-Pro（式中、Xは任意のアミノ酸であ
る）である場合には、DAP-Iはほとんど活性を示さないか、または全く活性を示
さない。DAP-IIは、Arg-XまたはLys-X、そして程度は落ちるがX-Proで始まるア
ミノ末端ジペプチド配列に選択性（preference）を示す。DAP-IIは、他のジペプ
チドの組み合わせのほとんどに対して顕著に低い反応速度を示す。DAP-IIIは、A
rg-ArgおよびLys-Lysの形態のアミノ末端ジペプチド配列に嗜好性（propensity
）を示すようである。DAP-IVは、X-Proの形態のジペプチド配列に対して最も早
い速度の加水分解活性を示す。DAP酵素、特にDAP-IおよびDAP-IVは、タンパク質
の処理の際に有用であることが示されている。
【０１１７】 ウシジペプチジルアミノペプチダーゼでのリーダー配列を含む前駆体ポリペプ
チドの処理は、Beckerら、米国特許第5,126,249号に開示されている（その全て
を本明細書中に引用して組み込む）。前駆体ポリペプチドを処理するために一般
的に使用されているDAPのうちの１つのDAPは、粘菌Dictyostelium discoidium由
来のものである。このプロテアーゼ（しばしば、dDAPと略される）の合成、精製
および使用は、欧州特許公報第595,476号（1994年、５月４日発行）ならびに米
国特許第出願第08/301,519号（1994年９月７日出願）および同第08/445,308号（
1995年５月19日出願）に記載されている（これらの全てを本明細書中に引用して
組み込む）。
【０１１８】 一般的に、pHを約2.0〜約6.5とし、そして維持するように適切に緩衝化されて
いる水性媒体中でdDAPの反応は行われる。好ましくは、この媒体のpHは、約3.0
〜約4.5にわたり、そして最も好ましくは約3.0〜約3.5にわたる。しかし、dDAP
反応は尿素存在下において6.5より高いpHで行うこともできる。
【０１１９】非グリコシル化EPOアナログの特徴付け： インビボでの赤血球産生活性を有する非グリコシル化タンパク質の開発は、天
然の糖鎖を有さないタンパク質の溶解性と安定性が制限されていることに起因し
て困難なものであった［Owers-Narhiら、(1991) The effect of carbohydrate o
n the structure and stability of erythropoietin、J. Biol. Chem. 266：230
22〜23026］。しかしながら、本発明のNGEおよびNGEAは、それを首尾よくクロー
ニングし、E. coli封入体で発現させ、再ホールディングさせて精製することが
できた。
【０１２０】 一般に、NGEおよびNGEAは、グリコシル化ヒトEPOに匹敵するインビトロ活性を
有する。しかしながら、上に簡単に述べたように、NGEおよびNGEAのインビボ活
性は検出できない。すなわち、２週間の間、４回注射/日で0.2μg/マウス/注射
で投薬した６週齢B6C3F1マウスでは、ヘマトクリットの上昇は観察されなかった
。この、インビボ活性の欠落は、おそらく分子の迅速なクリアランスに起因して
いるだろう。この迅速なクリアランスは、レセプターに基づく機構、および／ま
たは腎クリアランス機構のいずれかに関連していると仮定される。しかし、細胞
表面グリコサミノグリカンに対する表面分配（surface partitioning）または循
環結合タンパク質に対する結合を排除することはできない。非グリコシル化EPO
の迅速なクリアランスは、NGEA (例えば、MR-NGE-166Δ）の静脈内投与の30分以
内に観察される血清レベルが150分の1に減少することで証明されている（図2）
。皮下投与は、血漿レベルの同様の減少を示した（図２）。
【０１２１】 それゆえ、ある化合物がインビボで赤血球産生を刺激するかどうかを、インビ
トロ活性のみに基づいて正確に推定することはできない。NGEおよびNGEAは、イ
ンビトロで非常に活性が高いが、インビボではほとんど活性を示さないか、また
は活性を示さない。さらに、PEG化EPOアナログ種は減少したインビトロ活性を有
するが、インビボ活性は上昇している。しかしながら、インビトロ活性は分子が
レセプターに結合し、反応を誘発する能力の一般的な指標として有用である。そ
れゆえ、インビトロ活性は、ある変異が活性に対して正の影響を有するか負の影
響を有するかに関するいくらかの情報を提供する。多数のNGEA誘導体（例えば、
モノ-およびジ-PEG化NGEA）は、市販のGEAと同様にインビトロ活性を有する。し
かし、これらの分子は市販のGEAと比較して種々の程度のインビボ活性を示す。
【０１２２】 さらに、薬物動態力学の結果は、ポリマーのサイズがバイオアベイラビリティ
に重要であることを示した。驚くべきことに、20kDa PEGで誘導体化したNGEAは
、５ｋDa PEGで誘導体化したものよりも高い皮下バイオアベイラビリティーを有
した。これは非常に予想外のことであった。
【０１２３】 処置用製剤としては、物理的安定性も必要である。NGEおよびNGEAの物理的安
定性は、他の可能性のある因子の中でも、立体構造安定性、１つ以上のグリコシ
ル化部位での荷電残基、イオン強度、pH、タンパク質濃度およびグリセロール濃
度に依存する。MR-NGE 5E、MR-NGE [5K]、MR NGE [W5E]およびMR-NGE W5Kは、円
偏光２色性による非フォールディング実験および90°光散乱測定による凝集研究
で測定した場合、それぞれ、20 mM TRIS、0.5 M NaCl、1 mM EDTA、pH 7.4（37
℃）中、0.1 mg/mLタンパク質で、NGEに対して同等または改善された立体構造安
定性および物理的安定性を有する。これらのタンパク質の物理的安定性はイオン
強度およびグリセロールにより調整されうることもまた、明らかにされている。
驚くべきことに、本発明の非グリコシル化EPOアナログは、150mM〜1Mに亘るNaCl
で物理的安定性の上昇を示す。さらに、タンパク質の物理的安定性は、グリセロ
ール量の上昇（0〜35％）に伴って増加する。これらの非グリコシル化分子の可
溶性および物理的安定性の改善は、精製および誘導体化の間において有益である
。
【０１２４】 安定性の研究により、88位のみの点変異は、その部位に導入された電荷にかか
わらず物理的安定性に有害な影響を有することが示された。しかしながら、この
物理的安定性の減少は、グリコシル化部位に負または正の荷電を導入することに
より緩和することができる。物理的安定性および立体構造研究により、これらの
アナログにおける安定性の改善は立体構造安定性および表面電荷の影響を含む螺
旋構造の影響（a convolution of effects）に起因していることが示されている
。しかしながら、88位での単独の点変異により作製した、物理的に不安定なアゴ
ニストを誘導体化して実際の治療に必要とされるインビボ活性および物理的安定
性を示す分子を作製することができることが示されている。
【０１２５】非グリコシル化EPOおよび非グリコシル化EPOアナログのPEG化： 一旦、本発明の非グリコシル化EPOタンパク質を適切に発現させ、（用いた発
現系に応じて）再ホールディングさせ、そして精製した後に、それらを修飾する
ことができる。合成または天然の巨大分子をタンパク質の表面に共有結合させる
ことによりタンパク質を修飾することができる。しかしながら、ポリマーを結合
させることにより、機能の損失を引き起こすことなくデリケートなタンパク質に
新規な適切な性質を付与することは困難であった。
【０１２６】 本発明は、ポリエチレングリコールにより修飾されている特定のNGEおよびNGE
A誘導体を提供する。ポリエチレングリコール（PEG）により修飾されたタンパク
質を製造するために広範な種々の方法が開発されている。タンパク質をPEG化す
ることにより、治療剤としてタンパク質を用いることに伴う薬理学的問題および
毒性学的問題の多数を克服することができる。しかし、個々のタンパク質につい
ては、ポリアルキレン基での修飾が生物活性に顕著な減少を引き起こすかどうか
ははっきりしていない。
【０１２７】 ポリマー修飾型タンパク質の生物活性は、i) ポリマーのサイズ；ii)特定の結
合部位；iii) 修飾の程度；iv) 不都合な結合条件；v) 結合のためにリンカーを
使用するかどうか、またはポリマーを直接結合させるかどうか；vi) 有害な副産
物の産生；vii) 活性型ポリマーにより与えられた損傷；またはviii) 電荷の保
持のような因子により影響を受けるかもしれない。用いる結合反応に依存して、
特に、サイトカインのポリマー修飾は生物活性の劇的な減少を生じた。Francis,
G. E.ら、(1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins a
nd peptides：the importance of biological optimization of coupling techn
iques, Intl.J.Hem.68：1-18。
【０１２８】 本発明は、ポリエチレングリコールポリマーが共有結合した非グリコシル化EP
Oおよび非グリコシル化EPOアナログを提供する。本発明の方法を使用して、種々
のサイズのポリマーを直接結合させる。さらに、NGEタンパク質誘導体の生物活
性な集団を治療用に精製することができるように、ポリマーの付加を制御する。
【０１２９】 ポリアルキレンポリマーをタンパク質に直接結合させる多数の方法が存在する
。例えば、Inadaらは、塩化シアヌル、2,4,6-トリクロロ-s-トリアジンおよびモ
ノメトキシポリエチレングリコールを用いる方法を記載している。Inadaら、(19
86) Engineering physicochemical and biological properties of protein by
chemical modification、Trends, Biotech. ３月：68-73。しかしながら、本発
明のNGEタンパク質誘導体を製造するための好ましい方法は、ポリエチレングリ
コールプロピオンアルデヒド（PEG-プロピオンアルデヒド）またはポリエチレン
グリコール-アセトアルデヒド（PEG-アセトアルデヒド）を使用してエチレング
リコール基をアミノ基に直接結合させることに関する。アミノ基としては、N-末
端残基およびリジン残基が挙げられる。
【０１３０】 本発明のPEG化方法は、還元的アルキル化を介した安定なリンカーを用いない
アルデヒド修飾方法を利用する。この方法により、リンカーの存在に起因する免
疫応答を最小にすることができる。PEG-プロピオンアルデヒドまたはPEG-アセト
アルデヒドのようなPEG-アルデヒドを使用することにより、タンパク質上に存在
する一級アミンを介してイミンを形成させる。次いで、このイミンをシアノ水素
化ホウ素（cyanoborohydride）ナトリウムまたは水素化ホウ素（borohydride）
ナトリウムを用いて還元し、イミンを第二アミンに変換することができる。
【０１３１】 この方法では、タンパク質上に存在するアミンの数と比較してモル過剰のPEG-
アルデヒドを使用することが好ましい。好ましい比は、0.08〜24であり、より好
ましい比は１〜10である。好ましくは、pH 7.0〜9.0の間で、4℃で15〜40時間の
間、反応を行う。しかしながら、低いpH(pH 5.0〜7.0)値ではN-末端標識が制限
され、より高いpH(pH 9.0〜10.0)ではリジン残基上のε-アミノ基の標識化が増
加することが認められている。非グリコシル化EPOおよびEPOアナログのPEG化に
必要な、特定の条件を実施例１に記載する。
【０１３２】 式：［R-O-（CH２CH２-O)Ｘ- (CH２)Ｙ-NH］ （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200、好ましく
は約450〜約1200そしてより好ましくは約450〜約700の数であり、そしてＹは１
〜４の数である） で表されるPEG-アルデヒドを用いてPEG化を行うことができる。
【０１３３】 イミン結合の形成を可能にする条件下でPEG化反応を行った。具体的には、溶
液のpHは７〜９の範囲にわたり、そしてメトキシ-PEG-プロピオンアルデヒド濃
度の範囲はアミン濃度の１〜24モル過剰の範囲にわたる。通常、PEG化反応を４
℃で行い、他の化学的および物理的分解プロセスによるタンパク質の分解を最小
とする。異なる非グリコシル化EPO誘導体をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC
）を用いて単離した（図３および４）。
【０１３４】PEG化非グリコシル化EPOアナログの特徴づけ 例示を目的として、PEG (5 kDa)-アルデヒドまたはPEG (20 kDa)-アルデヒド
のいずれかを用いたPEG化MR-NGE-[W5K]-166ΔおよびMR-NGE-166Δの特徴付けに
ついて議論する（実施例３）。MR-NGE-[W5K]-166ΔおよびMR-NGE-166Δは、それ
ぞれ、13個および９個の１級アミンを含有する。結果として、これらの化合物を
5 kDaまたは20 kDa のメトキシ-PEG-プロピオンアルデヒドポリマー(それぞれ、
PEG (5 kDa)アルデヒドおよびPEG (20 kDa)-アルデヒド）のいずれかを用いてPE
G化することにより、インビボ活性およびインビトロ活性の両方を示す種々の修
飾種を得た。
【０１３５】 種々の程度にPEG化した種を流体力学的サイズの差に基づいて分離し、そして
濃縮した。これらの画分を分析用HPLC-SEC、SDS-PAGEおよびMALDI-Tof質量分析
を用いて特徴づけを行った。例えば、MR-NGE[W5K]-166Δを5 kDa PEGで修飾する
ことにより、PEG化の程度の上昇に伴い３個の異なる画分の修飾物を得た。各々
別個に特徴付けた画分を１文字で表す。化合物Ｂの画分は、主に5 kDa トリ-お
よびテトラ-PEG化された種の混合物からなる。化合物Ｃの画分は、主に5 kDa ジ
-PEG化した種からなり、そして化合物Ｄの画分は主に5 kDa モノ-PEG化した種か
らなる。化合物Ｅは修飾していないMR-NGE[W5K]-166Δである。
【０１３６】 MR-NGE[W5K]-166ΔをPEG (20 kDa) で修飾することにより、PEG化の程度が上
昇するに伴っていくつかの異なる画分を得た。化合物Ｆの画分は、主に、(ジ-PE
G化より多く）20 kDa PEG化された種からなり、そして化合物Ｇの画分は20 kDa
モノ-、ジ-およびトリ-PEG化された種のブレンドからなる。さらにまた、MR-NGE
-166ΔのPEG (20 kDa) 修飾により、PEG化の程度が上昇するに伴っていくつかの
異なる画分を得た。例えば、反応混合物から化合物AHを単離すると、これは主に
20 kDaのトリ-PEG化された種から構成されていた。
【０１３７】 PEG化の程度およびPEG化の部位は、pHを低下させ、そしてPEG：アミン比を減
少させることにより、主に、N-末端に対して制御することができる。pH７で、そ
して1.5：1のモル比のPEG-アルデヒド：アミン基で反応を行うことにより、N-末
端α−アミノ基と選択的に反応させる（実施例１ｇ）。このことは、主に20 kDa
モノ-PEG化MR-NGE-166Δ種からなる化合物Ｚの画分のLys_Ｃ酵素消化により例示
される（実施例３）。化合物ＺをLys_Ｃで酵素消化することにより、消化により
遊離したN-末端ペプチドのみが変化した保持時間を有することが示された。
【０１３８】 PEG化非グリコシル化EPOアナログの活性： また、これら種々のPEG化種を、脾細胞における３H-チミジン取り込みアッセ
イを用いてインビトロ活性について試験した（実施例４を参照のこと）。一般的
に、5 kDa PEGでのモノ-PEG化はインビトロ活性に対してほんの少しの影響しか
与えない；しかしながら、続いて各々5 kDa PEGを付加することにより（例えば
、ジ-、トリ-およびテトラ-PEG化）することにより、インビトロ活性は0.55（±
0.04) logの減少を生じる（図9A）。20 kDa PEG部分を付加することによるイン
ビトロ活性への影響は、わずかに大きかった。すなわち、結合した20 kDa PEG部
分１個あたり0.63 (±0.09) logのインビトロ活性の減少である（図９Ｂ）。
【０１３９】 また、非グリコシル化PEG化EPOアナログ誘導体を、インビボ活性について試験
した。種々のPEG化種を10、20、50または100μg/マウス/注射のいずれかの用量
で単回投与した５〜８週齢のB6C3F1 or CD-1マウスのヘマトクリットレベルをア
ッセイすることによりインビボの結果をモニターした（図10、12および13；表V-
VII；実施例５）。20μg/kgの投薬について、PBS/BSA対照と比較してヘマトクリ
ットが明らかに上昇するという結果が示された。比較のため、グリコシル化EPO
についても試験を行った。
【０１４０】 結果は、血漿から迅速に排泄されるために反応を示さない非グリコシル化EPO
とは異なり、PEG化非グリコシル化試料が造血応答を誘発するに十分な血漿半減
期を有することを、示した（図２）。さらに、20kDa トリ-PEG化NGE（化合物AM
）、グリコシル化EPOまたはPBSを単回投与した後、７日目、10日目および14日目
のインビボ活性を比較すると、トリ-PEG化NGEのみが７日間以上反応を誘発した
。この結果は、この化合物が野生型グリコシル化EPOと比較して上昇した半減期
を有することを示す（図13）。
【０１４１】 さらに、PEG化の程度およびPEG部分のサイズはインビボ活性に対して影響する
。一般的に、PEG化の程度が大きければ大きいほど、および／またはPEG化部分の
サイズが大きければ大きいほど、インビボ活性も大きくなる（図10、表Ｖ）。＞
５kDaのサイズ（表Ｖ）のPEG部分および平均約３PEG部分で修飾したタンパク質
の場合に最適なインビボ活性を観察した（図12）。
【０１４２】 PEG化タンパク質のインビトロおよびインビボ活性は負に相関していることに
留意することが重要である（図11）。化合物のインビトロ活性が低ければ低いほ
どインビボ活性は高くなる。本発明を支持するために示したデータは、インビト
ロ活性の単なる測定がインビボ性能の推測に必須ではないことを示唆している。
【０１４３】 興味深いことに、MR NGE[W5K]-166ΔのPEG化した画分を示す化合物ＣおよびＧ
（上記）の、非グリコシル化MR-NGE-166Δ（図２）と比較してのバイオアベイラ
ビリティの推定は、それぞれ、4.5％および60％であった（図14、表VIII）。驚
くべきことに、これらの結果は２つの化合物の流体力学的サイズに基づく予想と
は反対である。TSK3000カラムでのSECでは、化合物Ｃは約121 kDa分子量のタン
パク質で観察されたメインピーク保持時間と類似するメインピーク保持時間を有
し、そして化合物Ｇは約466 kDa分子量のタンパク質で観察されたメインピーク
保持時間と類似するメインピーク保持時間を有する。結果として、バイオアベイ
ラビリティが、主にタンパク質の流体力学サイズにより決定されると仮定すると
、化合物Ｃのバイオアベイラビリティは化合物Ｇのバイオアベイラビリティを超
えると予想される。従って、これらのPEG化化合物のバイオアベイラビリティは
、流体力学的サイズ以外のなにかによって制御されている。この結果は、血清半
減期が延長され、そしてバイオアベイラビリティが改善されていることから、非
グリコシル化エリスロポイエチンの20 kDa PEG化種が5 kDa PEG修飾よりも好ま
しいことを、はっきりと示している（図14；表VIII）。
【０１４４】 従って、PEG化は、非グリコシル化エリスロポイエチンのクリアランス速度を
減少させることにより血漿半減期を延長させる手段として、グリコシル化の代わ
りとすることができる。さらに、PEG化種の血漿半減期は天然のグリコシル化に
より達成される半減期よりも長い。これは、一部は、EPOのPEG化種が炭水化物構
造体に関するクリアランス機構に感受性がないことが原因である。
【０１４５】 非グリコシル化EPOアナログ誘導体の可溶性および安定性： 本発明は、より長期作用のエリスポイエチン活性を有する修飾型タンパク質を
提供するのみならず、別の送達方法および製剤開発に特に有用であるかもしれな
い、改善された可溶性および/または安定性の特性を有するEPOアナログをも提供
する。従って、本発明の修飾型EPOアナログの製剤特性により、患者に対してよ
り便利でより効果的な製剤を開発することが可能となる。
【０１４６】 例えば、主に20 kDaモノ-PEG化MR-NGE-166Δ種からなると特徴付けられている
化合物Ｚの物理的安定性を、安定化高イオン強度条件（stabilizing high ionic
strength condition）（20mM TRIS、500mM NaCl、1mM EDTA、pH 7.4）、生理的
イオン強度条件（20mM TRIS、150mM NaCl、1mM EDTA、pH 7.4）および「複数回
使用製剤（multi-use formulation）」条件 (20mM TRIS、150mM NaCl、1mM EDTA
、3.0 mg/mL m-クレゾール、pH 7.4）で研究した。これらの研究により、ただ１
つの20 kDa PEG部分をN-末端に付加することにより、非グリコシル化EPOの物理
的安定性が顕著に改善されることが示された（実施例３、表IIIを参照のこと）
。
【０１４７】 それゆえ、本発明は、改善された生物物理特性を有するように修飾されたエリ
スロポイエチンの非グリコシル化改変体を提供する。PEG化は、非グリコシル化
エリスロポイエチンのクリアランス速度を低下させることにより血漿半減期を延
長する手段としてグリコシル化の代わりとなり得る。この期間延長は、PEG化種
のタンパク質が炭水化物構造に関連するクリアランス機構に感受性がないので、
天然のグリコシル化によってもたらされうるものよりも長い。好ましくは、より
長い血漿半減期、そして驚くべきことに上昇したバイオアベイラビリティを有す
るので、20 kDa PEG-修飾型NGEAが望ましい。さらに、本発明の誘導体型アナロ
グは改善された可溶性および／または安定性を示し、これは製造条件下で有用で
ある。最後に、本発明に関連する知見により、患者にとってより便利で効果的な
製剤を開発することができる。さらに、哺乳動物細胞由来の供給源とは反対にイ
ー・コリ由来の供給源を利用することにより、製造費用を減少し、そして消費者
に対する製品代を減少することができる。
【０１４８】 本発明をさらに記載するために以下の実施例を提供する。本発明の範囲は、以
下の実施例のみから構成されるものではない。当業者であれば、記載した特定の
試薬、装置および方法が単なる例示であり、いかなる点においても本発明を限定
するものではないことを認識するであろう。
【０１４９】 実施例１：EPOアナログのPEG化 非グリコシル化EPOおよびEPOアナログのPEG-プロピオンアルデヒド修飾： EPOアナログを5 kDaおよび20 kDaポリエチレングリコール-アルデヒド（PEG-
アルデヒド）と反応させてエチレン基に共有結合したアナログを製造した。次い
で、PEG化アナログをPEG化の程度に基づいて各集団に分離し、次いでインビボお
よびインビトロ活性を決定するために種々の集団を試験した。当業者であれば、
例示した化合物が166位に存在するアミノ酸を有する化合物または有さない化合
物を製造することができることを理解するであろう。
【０１５０】 １a：5 kDa PEGに共有結合したMR-NGE[W5K]-166Δ： Ａ MR-NGE[W5K]166Δの溶液（2.36 mg/mL）のアリコート（1.75 mL）を用い
てメトキシ-PEG (5kDa)-アルデヒド(Lot# PT-037-36、Shearwater Polymers, In
c. Huntsville, Alabamaから購入) (PEG：NH２基の比は4.3：１) （35.70 mg）
を溶解した。NaCNBH３溶液（7.5 mg/mL、100μL） を添加して、アルデヒドと一
級アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。50mMホウ
酸塩、150mM NaCl（pH 9.0）中で、４℃で約40時間の間、反応を行った。次いで
、PEG化種を精製し、特徴付けを行い、活性について試験した（以下の実施例を
参照のこと）。
【０１５１】 １b：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE[W5K]-166Δ： MR NGE[W5K]-166Δの溶液（2.36mg/mＬ）のアリコート（1.75mL）を用いてメ
トキシ-PEG (20 kDa)-アルデヒド(Lot#PT-087-01、Shearwater Polymers, Inc.
、Huntsville, Alabamaから購入) （134.6 mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は
4.1：1）。NaCNBH３（7.5 mg/mL）を含む溶液（100μL）を添加して、アルデヒ
ドと一級アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。50
mMホウ酸塩、150mM NaCl（pH 9.0）中で、４℃で約40時間の間、反応を行った。
次いで、PEG化種を精製し、特徴付けを行い、活性について試験した（以下の実
施例を参照のこと）。
【０１５２】 １c：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δ溶液（1.6 mg/mL）のアリコート（3.7 mL）を用いてメトキシ-PE
G (20 kDa)-アルデヒド（86.3 mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は1.5：１）。
NaCNBH３（7.5 mg/mL）を含む溶液（36.2μL）を添加して、アルデヒドと一級ア
ミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。リン酸緩衝化
生理食塩水（pH7.0）中で4℃で約40時間の間、反応を行った。PEG化産物を以下
のように精製し、特徴付けを行った。
【０１５３】 １d：5 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE166Δの溶液（0.94 mg/mL）のアリコート（7.4 mL）を用いてメトキシ-
PEG (５kDa)-アルデヒド（236.6mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は14：１）。
NaCNBH３（7.5 mg/mL）を含む溶液（396.4μL）を添加して、アルデヒドと一級
アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。50mMホウ酸
塩、リン酸緩衝化生理食塩水（pH9.0）中で4℃で約40時間の間、反応を行った。
【０１５４】 １e：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δ溶液（0.5 mg/mL）のアリコート（0.25 mL）を用いてメトキシ-P
EG (20kDa)-アルデヒド（1.6mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は1.3：１）。Na
CNBH３溶液（7.5 mg/mL）のアリコート（0.7μL）を添加して、アルデヒドと一
級アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をpH
9.0で、4℃で約40時間の間、行った。
【０１５５】 １f：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δ溶液（1.54mg/mL）のアリコート（0.25 mL）を用いてメトキシ-P
EG (20kDa)-アルデヒド（25.3mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は6.8：１）。N
aCNBH３溶液（7.5 mg/mL）のアリコート（10.6μL）を添加して、アルデヒドと
一級アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応を
pH9.0で、4℃で約40時間の間、行った。
【０１５６】 １g：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δ溶液（1.72mg/mL）のアリコート（0.25 mL）を用いてメトキシ-P
EG (20kDa)アルデヒド（6.1mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は1.5：１）。NaC
NBH３（7.5 mg/mL）を含む溶液のアリコート（2.6μL）を添加して、アルデヒド
と一級アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応
をpH7.0で、4℃で約40時間の間、行った。
【０１５７】 １h：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δの溶液（0.5mg/mL）のアリコート（0.25 mL）を用いてメトキシ-
PEG (20kDa)アルデヒド（4.8mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は４：１）。NaC
NBH３溶液（7.5 mg/mL）のアリコート（2.0μL）を添加して、アルデヒドと一級
アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をpH7.
0で、4℃で約40時間の間、行った。
【０１５８】 １j：20 kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： Met-Arg-EPO溶液（1.33mg/mL）のアリコート（0.25 mL）を用いてメトキシ-PE
G (20kDa)-アルデヒド（9.2mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は3.6：１）。NaC
NBH３溶液（7.5 mg/mL）のアリコート（3.9μL）を添加して、アルデヒドと一級
アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をpH8.
0で、4℃で約40時間の間、行った。
【０１５９】 1k：20 kDa PEG に共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δ溶液（1.33mg/mL）のアリコート（0.25 mL）を用いてメトキシ-P
EG (20kDa)-アルデヒド（9.4mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は2.9：１）。Na
CNBH３溶液（7.5 mg/mL）のアリコート（3.9μL）を添加して、アルデヒドと一
級アミンとの反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をpH
8.0で、4℃で約40時間の間、行った。
【０１６０】 1l：5 kDa PEG に共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE166Δ溶液（1.07mg/mL）のアリコート（1.8mL）を用いてメトキシ-PEG
(５kDa)アルデヒド（4.7mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は１：１）。NaCNBH
３（7.5 mg/mL）の溶液（7.8μL）を添加して、アルデヒドと一級アミンとの反
応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をPBS（pH7.0）中で
、4℃で約90時間の間、行った。
【０１６１】 1m：５kDa PEG に共有結合したMR-NGE[W5E]-166Δ： MR-NGE[W5E]166Δの溶液（1.27mg/mL）のアリコート（1.8mL）を用いてメトキ
シ-PEG (５kDa)-アルデヒド（5.7mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は１：１）
。NaCNBH３溶液（7.5 mg/mL、9.3μL）を添加して、アルデヒドと一級アミンと
の反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をPBS（pH7.0）
中で、4℃で約90時間の間、行った。
【０１６２】 1n：５kDa PEGに共有結合したMR-NGE[W5K]-166Δ： MR-NGE[W5K]-166Δの溶液（0.82mg/mL）のアリコート（1.8mL）を用いてメト
キシ-PEG (５kDa)-アルデヒド（3.7mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は0.7：１
）。NaCNBH３溶液（7.5 mg/mL、6.0μL）を添加して、アルデヒドと一級アミン
との反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をPBS（pH7.0
）中で、4℃で約90時間の間、行った。
【０１６３】 1o：20kDa PEGに共有結合したMR-NGE[W5E]-166Δ： MR-NGE[W5E]166Δの溶液（1.27mg/mL）のアリコート（1.8mL）を用いてメトキ
シ-PEG (20kDa)-アルデヒド（22.2mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は１：１）
。NaCNBH３溶液（7.5 mg/mL、9.3μL）を添加して、アルデヒドと一級アミンと
の反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をPBS（pH7.0）
中で、4℃で約90時間の間、行った。
【０１６４】 lp：20kDa PEGに共有結合したMR-NGE[W5K]-166Δ： MR-NGE[W5K]-166Δ溶液（0.82mg/mL）のアリコート（1.8mL）を用いてメトキ
シ-PEG (５kDa)アルデヒド（14.2mg）を溶解した（PEG：NH２基の比は0.6：１）
。NaCNBH３溶液（7.5 mg/mL、6.0μL）を添加して、アルデヒドと一級アミンと
の反応の際に生じたシッフ塩基を還元的にアルキル化した。反応をPBS（pH7.0）
中で、4℃で約90時間の間、行った。
【０１６５】 lq：20kDa PEGに共有結合したMR-NGE-166Δ： MR-NGE-166Δの溶液（0.87mg/mL）のアリコート（2.8mL）を用いてメトキシ-P
EG (20kDA)-SPA（メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸のN-ヒドロ
キシスクシンイミジルエステル（MW 20000）；Shearwater Polymer）（36.7mg）
を、７回の等量のアリコートに分けて、2.5時間かけて４℃で溶解した。これは
、PEG：NH２基の比は1.5：１であることを示す。反応をPBS（pH7.0）中で、4℃
で約19時間の間、行った。物質をTSKフェニル-5PWカラム（7.5mm×7.5cm）の疎
水性相互作用クロマトグラフィーで、25mMリン酸ナトリウムおよび硫酸アンモニ
ウムの減少勾配からなる移動相（700mM硫酸アンモニウム（pH 7.2）でロード）
を用いて精製した。回収した物質をTSK 3000カラムでのサイズ排除クロマトグラ
フィーによりさらに精製した。最も大きいサイズで溶出した物質を回収し、そし
て化合物AHと分類した。
【０１６６】 実施例２ 非グリコシル化EPOおよびEPOアナログの精製およびフォールディン グ IPTGでの誘導に続いて、PET30＿NGE構築物で形質転換した宿主細胞を含む細菌
培養物（４リットル）をスピンダウンして細菌ペレットを得た。この細菌ペレッ
トを50 mM Tris/HCl（pH 8.0、180 mL）中に再懸濁した。再懸濁したペレットに
、（リゾチーム（Boehringer Mannheim、Lot番号84093121) （80 mg）、1M MgCl ２ （0.9 mL）、DNAse I （80μL）(20 mM Tris、50 mM NaCl、50％グリセロール
（pH 7.4）中１mg/mL）を添加した。この混合物を室温で30分間攪拌し、次いでC
ole Parma Ultrasonic Homogenizer中で、100％調和（tune）および65％振幅（a
mplitude）の設定で、５秒間のオンパルスおよび２秒間のオフパルスで８分間超
音波処理した。可溶化した材料をSorvallローター中で13,000rpmで20分間、スピ
ンダウンした。ペレットを、Fisher ScientificのPowerGen 700 Homogenizerを
用いて、0.1％ Triton X-100、５mM EDTA（120mL）中に再懸濁した。この物質を
Sorvallローター中で20分間、13,000rpmでスピンダウンした。このペレットを、
先に記載したように0.1％ Triton X-100、5 mM EDTA（60mL）および0.5M KC1（6
0mL）中に再懸濁し、次いで13,000rpmでスピンダウンした。次いでペレットを蒸
留水120mLで洗浄し、そしてSorvallローターで13,000rpmで遠心分離した。これ
らの精製した封入体は、即座に使用するか、または-20℃で凍結した。
【０１６７】 誘導した細菌培養物（２リットル）からの封入体を開始物質として使用した。
これらの封入体を10mM Tris、5mMシステイン、7Mウレア（pH7.0）（150ｍL）中
に可溶化した。これらの条件下で多数の変異体を可溶化した。しかし、これらの
条件下で変異体が濁ったままであれば、可溶化混合物のpHを、30分間、pH９また
は10に調節し、次いでpHを7.0から7.4の間に再調節した。この精製における最初
の工程は、Waters 650E Advanced Protein Purification Systemを用いて行った
。次いで、この物質を、精製すべきタンパク質のpIに従いQ Sepharose Fast Flo
w樹脂またはSP Sepharose Fast Flow樹脂（Pharmacia）のいずれかの180mLカラ
ムに配置した。イオン交換カラムを10 mM Tris、5 mMシステイン、7Mウレア（pH
7.0）で平衡化した。流速は10 mL/分であった。タンパク質を、０〜１Ｍ NaCl
の線型勾配を用いて55分かけてカラムから溶出した。タンパク質の溶出を280nm
でのUV吸光度でモニターした。目的のタンパク質を含む画分を再ホールディング
のために回収した。
【０１６８】 ２つの異なる方法により非グリコシル化EPOアナログの再ホールディングを首
尾よく達成した。第１の方法は、イオン交換から回収した画分を採用し、このタ
ンパク質濃度を0.1mg/mLに調整する工程を含む。次いで、この物質を20mM Tris
、0.5M NaCl（pH 7.4）に対して４℃で過度に透析した（36時間に亘りおよそ1/1
0,000希釈）。他の方法（無限希釈法）は、イオン交換カラムからプールした画
分を採用し、このタンパク質を含む溶液を、４℃で、20mM Tris、500mM NaCl、3
5％グリセロール（pH7.4）を含む緩衝液中に滴らせる工程を含む。この滴らせる
速度は、およそ、７分あたり１mLであり、再フォールデング緩衝液中での最終的
なタンパク質濃度は0.1mg/mLであった。再フォールディングのための第２の方法
のほうが、わずかにより正確に折り畳まれたタンパク質を生じた。次いで、再フ
ォールデングしたタンパク質を、S3Y10スパイラルカートリッジを備えたMillipo
re ProFlux M12 Tangential Flow Filtration Systemを用いて濃縮する。一旦、
物質を300mL〜400mLまで濃縮し、YM10メンブレンを用いる2.5 L Amicon攪拌セル
（stir cell）に配置して40mL〜80mLまで濃縮する。
【０１６９】 NGEAの精製の最終工程は、分取サイズ排除クロマトグラフィーの工程を含む。
濃縮した再ホフォールデングしたタンパク質（40mL〜80mL）を、20mM Tris、1mM
EDTA、0.5M NaCl（pH7.4）で平衡化した分取Pharmacia Superdex 75 (60/600)
カラムに配置した。流速は10mL/分であった。タンパク質の溶出を280nmでのUV吸
光度によりモニターした。精製したタンパク質を含む画分をSDS-PAGEで確認し、
回収し、そして-80℃で保存した。
【０１７０】 実施例３ PEG化EPOアナログの精製および特徴付け 分取サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）: 非グリコシル化EPOおよび非グリコシル化EPOアナログの種々のPEG化種の精製
を、Waters 650E Advanced Protein Purification Systemでのサイズ排除クロマ
トグラフィーにより達成した。プロトコルは、20mM TRIS、0.5M NaCl、１mM EDT
A（pH 7.4）中で平衡化したSuperdex 200(PC3.2/300)カラムを利用した。典型的
に、装填体積は2.5mL以下である。流速は１mL/分であり、そして画分（1mL）を
回収した。カラムは室温で実施した。タンパク質の溶出を、UV検出器（280nm）
によりモニターした（図3Aおよび4A）。
【０１７１】 分析用サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SEC-HPLC）： PEG修飾によりタンパク質の流体力学半径が顕著な影響をうけるので、非グリ
コシル化EPOアナログのPEG化をSEC-HPLCによりモニターする。全ての分析用アッ
セイをHP1100 HPLC (Hewlett-Packard)で行った。修飾を２つのSEC-HPLCプロト
コルのいずれかでモニターした。
【０１７２】 第１のプロトコルは、20mM TRIS、0.5M NaCl、1mM EDTA（pH7.4）で平衡化し
たSuperdex 200 (PC3.2/300)カラムを利用した。流速は50μL/分であり、典型的
にはタンパク質20μｇを注入した。カラムを室温で実行した；しかし、試料は自
動インジェクター中に４℃で維持した。タンパク質の溶出を214nmのUV検出器で
モニターした。
【０１７３】 第２のプロトコルは、20mM TRIS、0.5M NaCl、1mM EDTA（pH 7.4）で平衡化し
たTosoHaas G3000SWXL（7.8mm×30cm）カラムを利用した（図３Ｂおよび４Ｂ）
。流速は0.5 mL/分であり、典型的にはタンパク質20μgを注入した。カラムを室
温で実行した；しかし、試料は自動インジェクター中に４℃で維持した。タンパ
ク質の溶出をUV検出器（214nm）でモニターした。
【０１７４】 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）： 類似する程度のPEG化を伴う種の貯蔵を容易にし、ならびに最終的にプールし
た産物を特徴付けるためにSDS-PAGEを用いて分取SEC画分を分析した（図５）。S
DS-PAGE分析は全て、Novex 16％ Tris Glycineを用いてNovex Powerease 500シ
ステムで行った。Novex Tris-グリシンSDSランニングバッファーを用いて成形済
みゲルを泳動した。染色溶液は0.05％クマシーブリリアントブルー（R250）、30
％メタノールおよび10％酢酸から構成した。脱色溶液は30％メタノールおよび10
％酢酸であった。通常、Novex Mark 12 Wide Range Protein Standardsを分子量
標準として用いた。試料がゲル中に入るまでは125Ｖでゲルを泳動し、その後に
電圧を200Ｖに調整した。
【０１７５】 マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF
MS）：実験は全て、時間遅れ鮮鋭化エレクトロニクス（Time Lag Focusing elec
tronics）、リフレクトロン（Reflectron）および加速後検出器（Post Accelera
tion Detector）（または高質量検出に使用するためのP. A. D.）を取り付けたM
icromass TofSpec-2E質量分析計で行った。装置の有効経路長は、線形型モード
では1.2メートルであり、リフレクトロン型モードでは2.3メートルである。
【０１７６】 線形型モードおよびレフレクトロン型モードでの検出のために、２個のマイク
ロ素子プレート検出器を取り付けた。用いるレーザーは、337nmで、１秒あたり1
0レーザーショットで作動するLaser Science Inc. VSL-337i窒素レーザーである
。（イオンシグナルを増加させる必要があるならば）加速後検出器を使用して、
500 Mhz、８ビットトランジェントレコーダを使用して全てのデータを得、そし
て100回までのレーザーショットを１スペクトルあたりで平均化した。
【０１７７】 マイクロ素子プレートまたは電子倍増管の検出効率は、イオン質量が増加する
に伴い減少する。これらのデバイスの動作は、表面のイオン衝撃からの二次電子
の産生に依存し、これはイオン衝突速度が減少すればするほど効率が悪くなる。
より大きい質量のイオンは、同じエネルギーを有するより小さい質量のイオンよ
りも速度が遅い。それゆえ、生じる二次イオンの量が少ないか、またはほとんど
二次イオンを生じない。高質量イオンの検出を高めるため、これまでの研究は、
イオン経路中のダイノード表面空間から従来的な電子倍増管へ二次イオン種が加
速され得ることを示してきた。イオンからイオンへの（ion-to-ion）変換ダイノ
ードが標準マイクロ素子プレート検出器の正面の位置の内外に動くことができる
ように、TofSpec-2Eは改良されている。
【０１７８】 このイオンからイオンへの変換ダイノードを組み込むことによる正味の効果は
、単独の質量ピーク幅のわずかな増加であり、このようなダイノードをイオン経
路から移動させる能力により、検出効率がすでに高い場合にも、低質量域での分
離は犠牲とする必要がなくなる。
【０１７９】 観察される全ての質量が10kDaを超える場合は、イオン化マトリックスとして
シナピン酸を使用した。分析したサンプルについての正確な質量測定を得るため
の内部校正および外部校正ファイルに関しては、適切な質量参照タンパク質を使
用した。試料は、全て、１：２の試料対マトリックス希釈を使用して分析した。
PEG化試料は非常に不均一なので、プレート上にスポットする場合は、常にでき
る限り最も高い濃度となるように調製した。
【０１８０】 PEG化試料について、最初に以下の線形高質量検出器条件で装置を設定した：
【化２】
【０１８１】 次いで、（必要であれば）これらの設定を変更して最もよいシグナル／ノイズ
比および最も高い解像度を得る。MALTI-Tof MS分析の例を図６および７に示す。
【０１８２】 PEG（５kDa）-アルデヒドまたはPEG（20kDa）-アルデヒドのいずれかで修飾し
た、MR-NGE[W5K]-166ΔおよびMR-NGE-166Δの異なる非グリコシル化EPO誘導体の
特性を表IIに示す（実施例1a、1bおよび1g）。太文字で大文字に印刷した文字に
より、SDS-PAGEおよびMALDI-Tof分析を用いて量的に主要な種を示す。分析用HPL
C-SECにより示されるピークは、PEG化の程度と保持時間との間の連続的な相関に
基づいて割り当てた。また、この割り当てはSDS-PAGEおよびMALDI-Tof分析によ
り観察される種に相関した。平均のPEG化の程度は、分析用HPLC-SECに基づく割
合-重量平均である。特定の程度以上に修飾された種に関しては、最も小さい整
数の値を計算に使用した。
【０１８３】
【表２】 ａAHを除く全ての化合物を、プロピオンアルデヒド誘導体型メトキシ-PEG試薬
を用いてPEG化した。化合物AHを、メトキシ（methodxy）-PEGプロピオン酸のス
クシンイミジル誘導体を用いてPEG化した（実施例1qを参照のこと）。
【０１８４】 PEG化種の酵素消化： エンドプロテイナーゼLys_Cは、C-末端側のリジン残基を特異的に切断するセ
リンプロテイナーゼである。典型的には、タンパク質試料（200μg/mL）を、Lys
_C（Promega）（10μg/ml）を含む1M塩酸グアニジン、20mM Tris、1mM EDTA（pH
8.0）の溶液中で、37℃で３時間、消化した。10mM DTTを添加（10分間、37℃）
し、次いで１％TFA溶液を10％（v/v）添加することによりクエンチし、消化した
タンパク質を還元した。得られたペプチド断片を、TFA/ACN移動相（Ａ-緩衝液：
0.1％TFA、Ｂ-緩衝液：80％ACN中0.1％TFA、1mL/分）を用いるZorbax-SB C8カラ
ムでの逆相HPLCにより分離した。ペプチド混合物を、10％Ｂで平衡化したカラム
に注入し、5分後、勾配を１分あたり１％Ｂ増加で、55分かけて増加させた。HPL
CのピークはMALDI-Tof、LC-MSおよび／またはN-末端分析により同定した。
【０１８５】 図８に例示するように、Ｎ−末端修飾タンパク質を特徴付けるためにペプチド
マップを使用した。化合物Ｚのペプチドマップは、ペプチドＬ１がPEG化プロセ
スにより修飾されていること、そしてこれらが後半で、不均一な20K PEG部分で
共有結合で修飾されたペプチドを表す広いプロフィールで溶出することを示す。
PEG (20kDa)-Llペプチドは、MR-HIPのＮ末端断片、すなわち、PEG (20K)-Met-Ar
g-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Gl
u-Ala-Lysであると同定されていることに留意すること。
【０１８６】 物理的安定性研究： 種々のタンパク質の物理的安定性を、タンパク質凝集をサイズの関数としてモ
ニターするためにDynamic Light Scattering (DLS）アッセイを用いて研究した
。タンパク質溶液を、a) 20mM Tris、500mM NaCl、1mM EDTA （処理条件を模倣
）、b) 20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA （生理学的条件を模倣）、または c)
0.1 mg/mLタンパク質を含有する20mM Tris、150mM NaCl、3 mg/mL m-クレゾー
ル、1mM EDTA（製剤条件を模倣）のいずれかに希釈した。溶液のpHを、HCl/NaOH
を用いて7.4（±0.05）に調整し、そしてMillex-GVフィルター（4 mm、0.2μ）
を介して6×50mmボラシリカ（borasilica）Ｉ型ガラス試験管にろ過した。90°
でのゴニオメーター、デジタル校正器および488nm線に調整したLexelモデル3500
アルゴンイオンレーザーからなるBrookhaven BI900 Instrumentで、光散乱強度
加重平均粒子サイズを回収した。実験的に測定した自動校正関数Ｃ(t)を、キュ
ムラント法により分析して重量平均化流体力学直径を得た。流体力学直径対37℃
でのインキュベーション時間のプロットにより、指数関数様曲線を得た。粒子サ
イズが顕著に変化する前、すなわち遅延時間を、成長前および成長相データ点に
直線を適合させることにより決定した。交点を遅延時間と定義した。
【０１８７】 MR-NGE-166ΔおよびＮ−末端20kDaモノ-PEG化MR-NGE-166Δの物理的安定性を
、高イオン強度、生理学的イオン強度、および製剤条件下で流体力学的光散乱で
モニターした。実験のpHおよび温度は、それぞれ、7.4および37℃であった。結
果を表IIIに示す。自動校正機能に合てはめた二次関数から決定したサイズの変
化により、凝集を評価した。表IIIのデータは、20 kDa部分でのMR-NGE-166ΔのN
-末端PEG化が凝集が始まる前の遅延時間を劇的に増加させ、そして凝集が始まっ
た後の成長速度を遅延させることを示している。
【０１８８】
【表３】
【０１８９】 実施例４ PEG化を受けている非グリコシル化EPOアナログと、PEG化を受けて
いない非グリコシル化EPOアナログのインビトロ活性
【０１９０】 インビトロアッセイ： Krystal[17]の方法を用いて生物活性を測定した。簡単に説明すると、B6CF1マ
ウスにフェニルヒドラジン（60mg/kg）を２日続けて毎日注射した。フェニルヒ
ドラジンでの処置により脾臓サイズが10倍に増加し、器官中のEPO応答細胞が増
加した。３日目に脾臓を取り出して、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌク
レオシドを含まないαMEM中に細断して入れた。次いで細胞懸濁物を200ゲージの
ナイロンメッシュを介してろ化し、細胞密度を測定し、脾細胞混合物を調製した
。脾細胞混合物は、４×10６細胞/mL脾細胞、20％ウシ胎仔血清（FCS）およびO.
lmM b-メルカプトエタノール(BME)を、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌ
クレオシドを含まないa-MEM（a-N）中に含有した。脾細胞混合物を、0.05mL/ウ
ェルの容量でマイクロタイタープレートに配置した。NEG、NEGA、PEG化NGE、PEG
化NEGAおよびEPOGEN（登録商標）試験試料を各ウェルに添加した。
【０１９１】 各試験試料を、78％α-MEM、20％熱非働化FCS、1％BMEおよび1％ペニシリン／
ストレプトマイシン／ファンギゾンを含有するバイオアッセイ培地に希釈し、そ
して１ウェル毎に0.05mLを添加した。試料の希釈範囲は、10１〜10９の範囲であ
る。培養物を、37℃で5％C0２、95％の空気の湿潤化した雰囲気内で22時間イン
キュベートした。この最初のインキュベーションの後に、a-N中に約50μCi/mLを
含む３H-チミジンストック20μLを各ウェルに添加した。次いで、培養物を37℃
でさらに２時間インキュベートした。次いで、シンチラント（scintillant）を
浸潤させたガラス繊維フィルターを用いてろ過することにより細胞内容物を回収
した。細胞性保持物を蒸留水で洗浄し、そしてフィルターをメタノールで乾燥さ
せる。NEG、NEGA、PEG化NGE、PEG化NEGAおよびEPOGEN（登録商標）試験試料で刺
激した場合のDNAへの３H-チミジンの取り込みの程度を、Beckman LS3801液体シ
ンチレーションカウンターで測定した。World Health Organization SecondInte
rnational Reference Preparationに対して検量線を校正した。
【０１９２】 MR-NGE[W5K]-166ΔおよびMR-NGE-166ΔのPEG化により、インビボおよびインビ
トロ活性の両方を示す種々の修飾種を得た。非グリコシル化EPOアナログを実施
例１に記載するように修飾し、そしてPEG化の程度に基づいて種々の種の画分に
分離した。実施例３に記載するようにサイズ排除クロマトグラフィーを用いてPE
G化種を分離した。上記の３H-チミジンアッセイについて得たインビトロでの結
果を、表IVおよび図９に示す。
【０１９３】 表IV：脾細胞での３H-チミジン取り込みアッセイによりモニターした、種々の化
合物のインビトロ活性
【０１９４】
【表４−１】
【０１９５】
【表４−２】
【０１９６】
【表４−３】
【０１９７】
【表４−４】 ａAH、AIおよびAJを除く全ての化合物を、プロピオンアルデヒド誘導体型メト
キシPEG試薬を用いてPEG化した。化合物AH、AIおよびAJは、メトキシ−PEGプロ
ピオン酸のスクシンイミジル誘導体を用いてPEG化した。
【０１９８】 実施例５：PEG化しているかまたはPEG化していない非グリコシル化EPOアナロ
グのインビボ試験：
【０１９９】 インビボアッセイ： ５週齢〜８週齢の４匹〜６匹の雌性B6CF1、C57BL/6JまたはCD-1マウスの群を
用いて、インビボ活性を評価した。ヘマトクリットレベルの変化を、インビボ活
性の指標として用いた。投薬の前にベースラインを設定するために、マウスに麻
酔をかけ、二本のへパリン処理したヘマトクリット管に後眼窩静脈叢からの血液
を充填することにより基準値ヘマトクリットを設定した。各動物を秤量して実験
の間中の識別のために印をつけた。これらのマウスには、PEG化NGE、PEG化NEGA
またはEPOGEN（登録商標）のいずれかを週に一回、単回で皮下注射した。PEG化N
GE、PEG化NEGAおよびEPOGEN（登録商標）を、10、20、50または100μg/kgのいず
れかで投薬した。ヘマトクリットレベルを0日目、7日目、10日目および14日目に
測定した。対照動物には2.5％ BSAを含むPBSを注射した。
【０２００】 MR-NGE［W5K］-166ΔおよびMR-NGE-166ΔをPEG化することにより、インビボお
よびインビトロ活性の両方を示す種々の修飾種を得た。非グリコシル化EPOアナ
ログを実施例１に記載したように修飾し、PEG化の程度に基づき種々の種の画分
に分離した。実施例３に記載するように、サイズ排除クロマトグラフィーを用い
てPEG化種を分離した。インビボでの結果を、上記のようにヘマトクリットレベ
ルによりモニターし、そして表Ｖ、VIおよびVIIに示す。
【０２０１】 表Ｖ：０日目に化合物を１回S.C.投与で投薬した後のヘマトクリットの変化。ヘ
マトクリットの測定を０日目と７日目に行った。７日目と０日目との差異は、こ
の表の中にΔ（デルタ）として報告する。
【０２０２】
【表５】
【０２０３】 表VI：０日目に化合物を１回皮下投与で投薬した後のヘマトクリットの変化。ヘ
マトクリットの測定を０日目、７日目および10日目に行った。10日目と０日目と
の差異は、この表の中にΔとして報告する。
【０２０４】
【表６】
【０２０５】 表VII：０日目に化合物を１回S.C.投与で投薬した後のヘマトクリットの変化。
ヘマトクリットの測定を０日目、７日目、10日目および14日目に行った。14日目
と０日目との差異を、この表の中にデルタとして報告する。
【０２０６】
【表７】
【０２０７】 薬物動態アッセイ：化合物Ｃおよび化合物Ｇを、静脈内注射および皮下注射の
いずれかにより投与した。Fischer334雄性ラットに10μg/kgレベルで投薬した。
１化合物の１回の時点あたり、３匹の動物を使用した。静脈投与の後、15分、30
分、１時間、３時間、５時間、８時間、24時間および48時間の時点で血液試料を
回収した。皮下投与の後、０時間、2時間、５時間、８時間、24時間、48時間、7
2時間、96時間および120時間の時点で血液試料を回収した。
【０２０８】 サンドイッチELISAアッセイを用いて、血漿中でのエリスロポイエチン様免疫
反応活性の濃度を測定した。以下のレベルについてこのアッセイを確認した：
【０２０９】 化合物Ｃ：量的上限600pg/mL。量的下限25pg/mL。 化合物Ｇ：量的上限1200pg/mL。量的下限100pg/mL。
【０２１０】 薬物動力学的結果を表VIIIおよび図14に示す。類似のプロトコルを用いて図2
に示すデータを回収した。
【０２１１】 表VIII：化合物ＣおよびＧ（表II）のIV投与またはSQ投与の後での、雄性Fics
her344ラットでのエリスロポイエチン様免疫反応活性の薬物動力学的パラメータ
ー。
【０２１２】
【表８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 NGEおよびNGEAの発現ベクター。
【図２】 MR-NGE-166Δまたは市販のグリコシル化EPOのいずれかを皮下ま
たは静脈内に単回投与（１μg/kg）した後のマウス体内における免疫反応性物質
の血中濃度。
【図３】 （A）PEG（５kDa）−アルデヒド/MR-NGE-24K、38K、83K、126K、
166Δの合成系からの反応混合物の、分取サイズ排除クロマトグラフ（SEC）。回
収した画分を文字で示す。（Ｂ）回収した画分の分析HPLCサイズ排除クロマトグ
ラフ。
【図４】 PEG（20 kDa）−アルデヒド/ MR-NGE-24K、38K、83K、126K、166
Δの合成系からの反応混合物の、分取サイズ排除クロマトグラフ（SEC）。回収
した画分を文字で示す。（Ｂ）回収した画分の分析HPLCサイズ排除クロマトグラ
フを示す。
【図５】 最終回収産物のSDS-PAGE分析（図３および４を参照のこと）。
【図６】 回収画分のマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型
質量分析法（MALDI-TOF-MS）分析：（Ａ）化合物Ｂ；（Ｂ）化合物Ｃ；（Ｃ）化
合物Ｄ；（Ｄ）MR-NGE-24K、38K、83K、126K。
【図７】 回収した画分のMALDI-TOF-MS分析：（Ａ）化合物Ｆ；（Ｂ）化合
物Ｇ。
【図８】 20 kDaモノPEG化MR-NGE-166Δ（化合物Ｚ）（実施例１ｅ）およ
びMR-NGE166ΔのLys_Ｃ酵素消化。
【図９】 ５kDa PEG（パネルＡ）または20kDa PEG（パネルＢ）のいずれか
でのPEG化の程度と、インビトロ活性の程度との相関関係。
【図１０】 PEG化の程度とPEG部分のサイズとの関数としてのインビボ活性
。デルタは、ヘマトクリットの規定値からの差異を示す。
【図１１】 インビトロ活性とインビボ活性との投与量の関数としての逆相
関を示す。デルタはヘマトクリットの基準値からの差異を示す。log［比活性U/m
g］＝5.22およびデルタ（７日目−０日目）＝−1.4 での値は、MR-NGE-166Δの
測定インビトロ活性とPBS/BSA対照の測定インビボ活性を用いて計算した。
【図１２】 注射した化合物の、20kDaのPEG化の程度の関数としてのインビ
ボ活性。デルタはヘマトクリットの基準値からの差異である。
【図１３】 単回皮下投与（50μg/kg）の後の、７日目、10日目および14日
目での実験化合物と対照とのインビボ活性の比較。
【図１４】 単回静脈内投与（黒丸）、または単回皮下投与（白丸）した（
10μg/kg）、雄性Fischer 344ラットとでの化合物Ｃ（パネルＡ）と化合物Ｇ（
パネルＢ）との薬物動態を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボルフガング・グレスナー アメリカ合衆国46254インディアナ州イン ディアナポリス、フィールドストーン・コ ート7512番 (72)発明者 ラドミラ・ミカノビック アメリカ合衆国46236インディアナ州イン ディアナポリス、ホワイト・オーク・トレ イル7126番 (72)発明者 ローン・リー・ミリカン・ジュニア アメリカ合衆国46254インディアナ州イン ディアナポリス、ディア・クリーク・アベ ニュー5319番 (72)発明者 デリク・ライアン・ウィッチャー アメリカ合衆国46038インディアナ州フィ ッシャーズ、パロット・コート10898番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 DA06 GA11 HA01 4B064 AG18 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA16X AA90X AB01 AC14 AC15 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 DB56 NA05 NA11 NA15 ZA55 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA57 CA40 DA13 EA24 FA72 FA73 FA74 GA01 GA10 GA22 GA23

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 a) NGE； b) NGE [5E]； c) MR-NGE； d) MR-NGE-88E； e) MR-NGE-88K； f) MR-NGE-88P； g) MR-NGE-88S； h) MR-NGE [4E]； i) MR-NGE [5E]； j) MR-NGE [5K]； k) MR-NGE [W5E]；および 1) MR-NGE [W5K]からなる群から選択されるタンパク質。
  2. 【請求項２】 a) NGE-166Δ； b) NGE［5E］-166Δ； c) MR-NGE-166Δ； d) MR-NGE-88E-166Δ； e) MR-NGE-88K-166Δ； f) MR-NGE-88P-166Δ； g) MR-NGE-88S-166Δ； h) MR-NGE［4E］-166Δ； i) MR-NGE［5E］-166Δ； j) MR-NGE［5K］-166Δ； k) MR-NGE［W5E］-166Δ；および 1) MR-NGE［W5K］-166Δからなる群から選択されるタンパク質。
  3. 【請求項３】 前記タンパク質がMR-NGE-166Δである、請求項２に記載のタ
    ンパク質。
  4. 【請求項４】 前記タンパク質がMR-NGE[W5K]-166Δである、請求項２に記
    載のタンパク質。
  5. 【請求項５】 前記タンパク質がMR-NGE[W5E]-166Δである、請求項２に記
    載のタンパク質。
  6. 【請求項６】 タンパク質部分が非グリコシル化ヒトエリスロポイエチンお
    よび非グリコシル化エリスロポイエチンアナログからなる群から選択され、ポリ
    マー部分が式： [R-O-(CH２CH２-O)Ｘ-(CH２)Ｙ-NH] （式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｘは約70〜約1200の数であり
    、Ｙは１〜４の数である） で表されるポリマー鎖１〜５個からなり、 そして該ポリマー鎖は該タンパク質部分に二級アミン結合により共有結合してい
    る、該タンパク質部分と該ポリマー部分とを有する赤血球産生性化合物。
  7. 【請求項７】 前記Ｘが約225〜約1200の数である、請求項６に記載の赤血
    球産生性化合物。
  8. 【請求項８】 前記Ｘが約340〜約1200の数である、請求項７に記載の赤血
    球産生性化合物。
  9. 【請求項９】 前記Ｘが約450〜約1200の数である、請求項８に記載の赤血
    球産生性化合物。
  10. 【請求項１０】 前記Ｘが約450〜約700の数である、請求項９に記載の赤血
    球産生性化合物。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質部分が非グリコシル化エリスロポイエチン
    アナログであり、前記ポリマー部分が該タンパク質のＮ−末端で該タンパク質に
    結合している、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の赤血球産生性化合物。
  12. 【請求項１２】 前記タンパク質部分が請求項１に記載のタンパク質である
    、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の赤血球産生性化合物。
  13. 【請求項１３】 前記タンパク質部分が請求項２に記載のタンパク質である
    、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の赤血球産生性化合物。
  14. 【請求項１４】 請求項１または２に記載のタンパク質の少なくとも１つを
    コードするDNA配列を含む外来性DNA配列の、宿主細胞中での発現産物である、タ
    ンパク質。
  15. 【請求項１５】 ａ）非グリコシル化赤血球産生性タンパク質のアミノ基と
    、ポリエチレングリコール−アルデヒドポリマーのアルデヒド基との間にイミン
    結合を形成させる条件下で、該ポリマーを該タンパク質の溶液に添加する工程、 ｂ）還元剤を添加して該イミン結合を二級アミン結合に還元する工程を含む方
    法により作製される請求項６〜１０のいずれか１項に記載の赤血球産生性化合物
    。
  16. 【請求項１６】 請求項１または請求項２に記載のタンパク質をコードする
    ポリヌクレオチドを含有する、単離された核酸配列。
  17. 【請求項１７】 配列番号２であるポリヌクレオチドを含む、単離された核
    酸配列。
  18. 【請求項１８】 請求項１６または１７に記載の核酸配列を含むベクター。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
  20. 【請求項２０】 請求項１または２に記載のタンパク質の少なくとも１つを
    発現する宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 前記宿主細胞がイー・コリである、請求項１９または２０
    に記載の宿主細胞。
  22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の宿主細胞の少なくとも１つを含むトラ
    ンスジェニックまたはキメラ非ヒト動物。
  23. 【請求項２３】 検出可能な量でタンパク質が発現される条件下で、請求項
    １６または１７に記載の単離された核酸を転写および翻訳する工程を包含する、
    タンパク質の生産方法。
  24. 【請求項２４】 ａ）非グリコシル化赤血球産生性タンパク質のアミノ基と
    、ポリエチレングリコール−アルデヒドポリマーのアルデヒド基との間にイミン
    結合を形成させる条件下で、該ポリマーを該タンパク質の溶液に添加する工程；
    および ｂ）還元剤を添加して該イミン結合を二級アミン結合に還元する工程を含む、
    ポリマー誘導体化非グリコシル化赤血球産生性化合物の製造方法。
  25. 【請求項２５】 前記溶液中に、前記アルデヒドポリマーと前記タンパク質
    とが、モルタンパク質あたりのモルポリマーの割合で表したとき、0.08〜24の比
    で存在する、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記アルデヒドポリマーのタンパク質に対する比が、１〜
    １０である、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記溶液が緩衝化されており、前記添加する還元剤が、シ
    アノ水素化ホウ素（cyanoborohydride）ナトリウムおよび水素化ホウ素（borohy
    dride）ナトリウムからなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか１
    項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記溶液がホウ酸塩−リン酸塩でpHが７から９の間に緩衝
    化されており、そして前記還元剤がシアノ水素化ホウ素ナトリウムである、請求
    項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項６〜１０のいずれか１項に記載の赤血球産生性化合
    物を治療上有効な量で投与することを含む、哺乳動物におけるヘマトクリットレ
    ベルを上昇させる方法。
  30. 【請求項３０】 不充分なヘマトクリットレベルを有する患者の処置のため
    の医薬の製造用の、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の赤血球産生性化合物
    の使用。
  31. 【請求項３１】 請求項６〜１０のいずれか１項に記載の血管形成性化合物
    を含む、不充分なヘマトクリットレベルを有する患者の処置のために適合されて
    いる、製薬製剤。
  32. 【請求項３２】 実施例のいずれか１つに関して以下に記載されている、赤
    血球産生性化合物。
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