NO325096B1

NO325096B1 - OB-fusjonsprotein, nukleinsyresekvens, vektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av proteinet, farmasoytisk preparat samt anvendelse av proteinet for fremstilling av et terapeutisk preparat.

Info

Publication number: NO325096B1
Application number: NO20071415A
Authority: NO
Inventors: Michael Benjamin Mann; Randy Ira Hecht
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2008-02-04
Also published as: EA004790B1; CN1195858C; AR009436A1; SK287578B6; CN1246154A; DK0954588T3; EP0954588A1; HUP0000302A3; NO20071415L; RS49927B; NZ514145A; ES2280083T3; BG64288B1; EP0954588B1; IL130396A; JP4659068B2; EP1835030A1; WO1998028427A1; HK1021388A1; EA199900575A1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder Fc-OBfusjonsproteinpreparater, fremgangsmåter for fremstilling av slike preparater og anvendelser derav. Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse et genetisk eller kjemisk fusjonsprotein som omfatter Fc-immunglobulinområdet eller et derivat eller en analog av dette, koblet til den N-terminale del av OB-proteinet eller et derivat eller en analog av dette.

Description

O ppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse omfatter OB-fusjonsprotein, nukleinsyresekvens, vektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av proteinet, farmasøytisk preparat samt anvendelse av proteinet for fremstilling av et terapeutisk preparat.

O ppfinnelsens bakgrunn

Selv om det molekylære grunnlag for fedme stort sett er ukjent, har identifisering av "OB-genet" og det kodede protein ("OB-protein" eller "leptin") kastet noe lys over mekanismene kroppen benytter for å regulere deponering av kroppsfett. Se PCT-publikasjon WO 96/05309 (22. desember 1996), Friedman et al.; Zhang et al., Nature, 372:425-432 (1994); se også korreksjonen i Nature, 374:419 (1995). OB-proteinet er aktivt in vivo både i mutante ob/ob-mus (mus som er fete grunnet en defekt i fremstillingen av ob-genproduktet) så vel som i normale mus av villtype. Den biologiske aktivitet manifesterer seg blant annet i vekttap. Se generelt Barrinaga, "Obese" Protein Slims Mice, Science, 259:475-456 (1995). OB-proteinet, derivater av dette og anvendelser derav som modulatorer av vektkontroll og fedme hos dyr, heriblant pattedyr og mennesker, er beskrevet mer detaljert i PCT-publikasjon WO 96/05309 (22. desember 1996), som inkorporeres heri ved referanse, innbefattet figurene.

De andre biologiske virkninger av OB-proteinet er ikke godt karakterisert. Det er f.eks. kjent at tilførsel av OB-protein til mutante ob/ob-mus fører til reduksjon av insulinnivået og glukosenivået i serum. Det er også kjent at tilførsel av OB-protein fører til reduksjon av kroppsfettet. Dette ble observert både i mutante ob/ob-mus så vel som i ikke-fete, normale mus, Pelleymounter et al., Science, 259:540-543 (1995); Halaas et al., Science, 259:543-546 (1995). Se også Campfield et al., Science, 259:546-549 (1995). (Perifer og sentral tilførsel av mikrogramdoser av OB-protein førte til redusert forinntak og kroppsvekt hos ob/ob-mus og mus med diettindusert fedme, men ikke hos fete db/db-mus.) Toksisitet er ikke blitt observert i noen av disse rapporter, selv ikke ved de høyeste doser.

Trass i forhåpningene om klinisk anvendelse av OB-proteinet er OB-proteinets virkningsmåte in vivo ikke klart utledet. Når det gjelder informasjon vedrørende OB-reseptoren, er høyaffinitetsbinding av OB-proteinet påvist i hypo-talamus hos rotte, noe som tyder på at OB-reseptoren er lokalisert her, Stephens et al., Nature, 577:530-532. db/db-musen viser samme fenotype som ob/ob-musen, det vil si ekstrem fedme og type II-diabetes; denne fenotype antas å skyldes en defekt OB-reseptor, særlig siden db/db-mus ikke responderer på tilførsel av OB-protein. Se Stephens et al., supra.

Med fremskrittene innen rekombinant DNA-teknologi har tilgjengeligheten av rekombinante proteiner for terapeutisk anvendelse ført til fremskritt vedrørende proteinutforming og kjemisk modifisering. Ett mål med slik modifisering er beskyttelse av proteinet og redusert degradering. Fusjonsproteiner og kjemisk modifisering kan effektivt blokkere et proteolytisk enzym fra fysisk kontakt med selve proteinryggraden og således forhindre degradering. Ytterligere fordeler omfatter under visse omstendigheter økt stabilitet, halveringstid i sirkulasjonen og biologisk aktivitet av det terapeutiske protein. En oversiktsartikkel som beskriver proteinmodifisering og fusjonsproteiner er Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (mai 1992) (publisert av Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).

Én slik modifikasjon er anvendelse av immunglobulinenes Fc-område. Antistoffer omfatter to funksjonelt uavhengige deler: et variabelt domene betegnet "Fab", som binder antigen, og et konstant domene betegnet "Fc", som tilveiebringer koblingen til effektor funksjoner som komplement og fagocyterende celler. Et immunglobulins Fc-del har lang halveringstid i plasma, mens Fab er kortlivet, Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989).

Terapeutiske proteinprodukter er blitt konstruert ved anvendelse av Fc-domenet for å forlenge halveringstiden eller for å innføre funksjoner som Fc-reseptorbinding, protein A-binding, komplementfiksering og overføring til placenta, som alle ligger i immunglobulinenes Fc-del. For eksempel er Fc-området fra et IgG-1-antistoff blitt koblet til aminoenden av CD30-L, et molekyl som bindes til CD30-reseptorer som uttrykkes på tumorceller fra Hodgkins sykdom, anaplastiske lymfomceller, T-celleleukemiceller og andre maligne celletyper. Se US patentskrift nr. 5 480 981. IL-10, et antiinflammatorisk middel og antirejeksjonsmiddel, er blitt koblet til Fc-y2a fra mus for å forlenge cytokinets korte halveringstid i sirkulasjonen, Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 754:5590-5600 (1995). Undersøkelser har også evaluert anvendelse av tumornekrosefaktorreseptor koblet til Fc-proteinet fra humant IgG-1 for behandling av pasienter med septisk sjokk, Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334:1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 755:2221-2230 (1996). Fc er også blitt koblet til CD4-reseptoren for fremstilling av et terapeutisk protein for behandling av AIDS. Se Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989). I tillegg er aminoenden av interleukin 2 også blitt koblet til Fc-delen av IgG-1 eller IgG-3 for å forbedre den korte halveringstid for interleukin 2 og redusere dets systemiske toksisitet. Se Harvill et al., Immunotechnology, 7:95-105 (1995).

Grunnet identifiseringen av OB-proteinet som et lovende terapeutisk protein foreligger det et behov for utvikling av OB-analogpreparater for klinisk anvendelse sammen med eller i stedet for OB-proteintilførsel. En slik utvikling ville omfatte OB-analogpreparater hvor proteinutforming og kjemisk modifisering gir redusert proteindegradering, økt stabilitet og forlenget halveringstid i sirkulasjonen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike preparater.

O ppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter et protein med en formel utvalgt fra gruppen bestående av: R\ - R2 og Ri - L - R2, kjennetegnet ved at Ri er et Fc-protein, R2 er et OB-protein og L er en linker, og hvori OB-proteinet er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 3 eller SEKV.

ID. NR.: 6,

(b) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 6 med en

lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74,

(c) aminosyresekvensen fra undergruppe (b) som har en forskjellig aminosyre substituert i én eller flere av de følgende posisjoner (ved anvendelse av nummerering ifølge SEKV. ID. NR.: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105,

106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145,

(d) aminosyresekvensen av undergruppe (a), (b) eller (c) som om ønskelig

mangler en glutaminylrest i posisjon 28,

(e) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b), (c) eller (d) med en

metionylrest i den N-terminale ende,

(f) et avkortet OB-protein utvalgt blant: (anvendelse av nummerering i SEKV. ID. NR.: 6 med en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74):

(i) aminosyrene 98-146

(ii) aminosyrene 1-32

(iii) aminosyrene 40-116

(iv) aminosyrene 1-99 og 112-146

(v) aminosyrene 1-99 og 112-146 med én eller flere av aminosyrene 100-111 plassert etter hverandre mellom aminosyre 99 og 112, og (vi) det avkortede OB-protein av undergruppe (f) (i) med én eller flere av aminosyrene 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145 substituert med en annen aminosyre, (vii) det avkortede protein av undergruppe (f) (ii) med én eller flere av aminosyrene 4, 8 og 32 substituert med en annen aminosyre, (viii) det avkortede protein av undergruppe (f) (iii) med én eller flere av aminosyrene 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89,

97, 100,102,105, 106, 107,108, 111 og 112 erstattet med en annen aminosyre,

(ix) det avkortede protein av undergruppe (f) (iv) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre,

(x) det avkortede protein av undergruppe (f) (v) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66,67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,100,102,105,106,107,108,111,112, 118, 136, 138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre,

(xi) det avkortede protein av undergruppene (f) (i)-(x) med en N-terminal metionylrest,

(g) OB-proteinet eller en analog av enhver av undergruppene (a) til (f)

omfattende en kjemisk rest forbundet til proteinresten, hvori nevnte,

kjemiske rest er en vannløselig polymerrest,

(h) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymerrest er

polyetylenglykol,

(i) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymer er en

polyaminosyrerest, og

(j) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymerrest er bundet kun i den N-terminale ende av nevnte proteinrest.

Oppfinnelsen omfatter også en nukleinsyresekvens som koder for et protein som har en formel utvalgt fra gruppen bestående av: Ri - R2 og R| - L - R2,, kjennetegnet ved at Ri er et Fc-protein, R2 er et OB-protein og L er en linker, og hvori OB-proteinet er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) aminosyresekvensen 1-46 som vist i SEKV. ID. NR.: 3 eller SEKV.

ID. NR.: 6,

(b) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 6 med en

lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74,

(c) aminosyresekvensen av undergruppe (b) som har en forskjellig aminosyre substituert i én eller flere av følgende posisjoner (ved anvendelse av nummereringen ifølge SEKV. ID. NR.: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105,

106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145,

(d) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b) eller (c) som om

ønskelig mangler en glutaminylrest i posisjon 28,

(e) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b), (c) eller (d) som har en metionylrest i den N-terminale ende, og (f) et avkortet OB-protein utvalgt blant: (anvendelse av nummereringen i SEKV. ID. NR.: 6 med en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74):

(i) aminosyrene 98-146,

(ii) aminosyrene 1-32,

(iii) aminosyrene 40-116,

(iv) aminosyrene 1-99 og 112-146,

(v) aminosyrene 1-99 og 112-146 med én eller flere av aminosyrene 100-111 etter hverandre plassert mellom aminosyrene 99 og 112, og (vi) det avkortede OB-protein av undergruppe (f) (i) med én eller flere av aminosyrene 100, 102,105, 106, 107, 108,111, 112, 118, 136,138, 142 og 145 substituert med en annen aminosyre, (vii) det avkortede protein av undergruppe (f) (ii) med én eller flere av aminosyrene 4, 8 og 32 substituert med en annen aminosyre, (viii) det avkortede protein av undergruppe (f) (iii) med én eller flere av aminosyrene 50, 53, 60, 64, 66, 67,68,71, 74,77, 78, 89, 97, 100,102,105, 106, 107 108, 111 og 112 erstattet med en annen aminosyre,

(ix) det avkortede protein av undergruppe (f) (iv) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35,48, 50, 53,60,64,66, 67,68, 71, 74,77, 78, 89, 97, 112,118, 136,138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre,

(x) det avkortede protein av undergruppe (f) (v) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71,74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105,'106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre, og

(xi) det avkortede protein av undergruppene (f) (i)-(x) med en N-terminal metionylrest.

Også omfattet av oppfinnelsen en vektor, kjennetegnet ved at den inneholder en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også en prokaryot eller eukaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den inneholder vektoren ifølge oppfinnelsen.

Også omfattet av oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking under egnede betingelser av vertscellen ifølge oppfinnelsen, og isolering av det fremstilte protein.

Oppfinnelsen omfatter også et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det inneholder en effektiv mengde av et protein ifølge oppfinnelsen i et farmasøytisk aksepterbart fortynningsmiddel, en adjuvans eller et bærerstoff.

Til slutt omfatter oppfinnelsen anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av proteinet ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av et terapeutisk preparat for behandling av en forstyrrelse utvalgt fra gruppen bestående av overvekt, diabetes, høyt lipidnivå i blodet, arteriosklerose, arterieplakk, reduksjon eller forebyggelse av gallestendannelse, utilstrekkelig ikke-fettvevsmasse, utilstrekkelig følsomhet overfor insulin, og slag.

Foreliggende oppfinnelse gjelder Fc-OB-fusjonsproteinprepareter, fremgangsmåte for fremstilling av slike preparater og anvendelse av dem. Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse et genetisk fusjonsprotein som omfatter immunglobuliners Fc-område eller analoger av dette, koblet til den aminoterminale del av OB-proteinet eller analoger av dette. Fc-OB-fusjonsproteinet kan dimerisere via cysteinrestene i Fc-området. Uventet nok gir genetisk fusjonsmodifisering med Fc i aminoenden av OB-proteinet fordeler når det gjelder stabilitet, "clearance"-hastighet og redusert degradering som ikke observeres for OB-protein eller ved kobling av Fc til OB-proteinets karboksyende. Det er overraskende og av stor viktighet at aminoendemodifiseringen gir en uventet beskyttelse av proteinet mot degradering, øker halveringstiden i sirkulasjonen og stabiliteten, sammenlignet med OB-proteinet eller Fc-modifisering av OB-proteinets karboksyende. Slike uventede fordeler fra Fc-modifiseringen av OB-proteinet vil være fordelaktige for OB-proteinbrukere, siden disse endringer bidrar til at dosene kan reduseres eller tilføres mindre hyppig. Således, som beskrevet mer detaljert nedenfor, har foreliggende oppfinnelse en rekke aspekter vedrørende genetisk modifisering av proteiner ved fusjon av Fc-området til OB-proteinet (eller analoger av dette), så vel som spesifikke modifikasjoner, fremstillingsfremgangsmåter og fremgangsmåter for anvendelse derav.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i én utførelse et Fc-OB-fusjonsprotein hvori Fc er genetisk koblet til aminoenden av OB-proteinet (eller analoger av dette). I tillegg kan Fc-delen også være koblet til aminoenden av OB-proteinet (eller analoger av dette) via peptidlinkere eller kjemiske linkere, som kjent innen faget. Som bemerket ovenfor og beskrevet mer detaljert nedenfor, har Fc-OB-fusjonsproteinet en uventet beskyttelse mot degradering og forlenget sirkulasjonstid og stabilitet, sammenlignet med OB-proteinet eller fusjonsproteiner hvor Fc er koblet til OB-proteinets karboksyende. Ytterligere utførelser av foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig ikke bare Fc-OB-fusjonsproteinpreparater, men også DNA-sekvenser som koder for slike proteiner, beslektede vektorer og vertsceller som inneholder slike vektorer, som begge er anvendbare for fremstilling av fusjonsproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av Fc-OB-fusjonsproteinet. Slike fremgangsmåter omfatter rekombinant DNA-teknikker for fremstilling av rekombinante proteiner. Videre omfatter slike utførelser fremgangsmåter for fermentering og rensing.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av proteinet for fremstilling av et preparat for behandling av overflødig vekt hos et individ eller dyr, som omfatter modulering av og/eller fettdeponering ved tilførsel av Fc-OB-fusjonsproteiner. Grunnet Fc-OB-fusjonsproteinets egenskaper omfattes fremgangsmåter som reduserer mengde og doseringshyppighet av OB-protein ved benyttelse av vektreduksjonsmidlet Fc-OB.

I nok en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av proteinet for fremstilling av et preparat for behandling av sykdommer forbundet med fedme, f.eks. diabetes, dyslipidemi eller hyperlipidemi, arteriosklerose, arterieplakk, reduksjon eller forebyggelse av gallestendannelse og slag, så vel som økt insulinsensitivitet og/eller en økning av massen av ikke-fettvev.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også beslektede farmasøytiske preparater av Fc-OB-proteinene, analoger og derivater av disse, for anvendelse i behandlingsformene beskrevet ovenfor.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1: DNA-sekvens (dobbelttrådet) (SEKV.ID. NR. 1 og 2) og aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 3) av rekombinant metOB fra mus. Figur 2: DNA-sekvens (dobbelttrådet) (SEKV.ID. NR. 4 og 5) og aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 6) av rekombinant, human metOB-analog. Figur 3 (A-C): DNA-sekvens (dobbelttrådet) SEKV.ID. NR. 7 og 8) og aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 9) av rekombinant, human metFc-OB. Figur 4 (A-C): DNA-sekvens (dobbelttrådet) SEKV.ID. NR. 10 og 11) og aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 12) av rekombinant, human metFc-OB-variant. Figur 5 (A-C): DNA-sekvens (dobbelttrådet) SEKV.ID. NR. 13 og 14) og aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 15) av rekombinant, human metFc-OB-variant. Figur 6 (A-C): DNA-sekvens (dobbelttrådet) SEKV.ID. NR. 16 og 17) og aminosyresekvens (SEKV.ID. NR. 18) av rekombinant, human metFc-OB-variant.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse gjelder Fc-OB-fusjonsproteinpreparater, fremgangsmåter for fremstilling av slike preparater og anvendelser av dem. Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse genetisk eller kjemisk kobling av immunglobuliners Fc-område til OB-proteinets N-terminale del. Uventet nok gir fusjon av Fc til OB-proteinets aminoende fordeler som ikke observeres med OB-protein eller ved fusjon av Fc til OB-proteinets karboksyende. Overraskende nok gir det N-terminalt modifiserte Fc-OB-protein uventet beskyttelse av proteinet mot degradering, forlenget halveringstid i sirkulasjonen og forhøyet stabilitet. Følgelig beskrives Fc-OB-fusjonsproteinet og analoger eller derivater av dette, så vel som beslektede fremgangsmåter for anvendelse og fremstilling av disse, mer detaljert nedenfor.

Preparater

Fc-sekvensen i sekvensen til rekombinant, human Fc-OB, beskrevet i SEKV.ID. NR. 9 (se figur 3), kan utvelges fra tungkjeden til det humane immunglobulin IgG-1, se Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res., 70:4071-4079

(1982), eller enhver annen Fc-sekvens kjent innen faget (f.eks. fra andre IgG-klasser, heriblant, men ikke begrenset til, IgG-2, IgG-3 og IgG-4, eller andre immunglobuliner). Varianter, analoger eller derivater av Fc-delen kan f.eks. konstrueres ved å utføre forskjellige aminosyrerestsubstitusjoner eller sekvens-substitusjoner. Cysteinrester kan deleres eller erstattes med andre aminosyrer for å forhindre dannelse av disulfidkryssbindinger mellom Fc-sekvensene. Nærmere bestemt er aminosyren i posisjon 5 i SEKV.ID. NR. 9 en cysteinrest. Den rekombinante Fc-OB-sekvens i SEKV.ID. NR. 9 er et Fc-OB-protein på 378 aminosyrer (ikke medregnet metioninresten). Den første aminosyreposisjon i det rekombinante Fc-OB-protein i figur 3 betegnes +1, mens metioninet ligger i -1-posisjonen. Man kan fjerne cysteinresten i posisjon 5 eller erstatte den med én eller flere andre aminosyrer. En alaninrest kan innsettes i stedet for cysteinresten i posisjon 6, noe som gir aminosyresekvensvarianten ifølge figur 4 SEKV.ID. NR. 12). Det rekombinante Fc-OB-protein i figur 4 er et Fc-OB-protein på 378 aminosyrer (ikke medregnet metioninresten). Den første aminosyreposisjon i det rekombinante Fc-OB-protein i figur 4 betegnes +1, mens metioninet ligger i -1-posisjonen. Likeså kan cysteinet i posisjon 5 i SEKV.ID. NR. 9 erstattes med en serinrest eller en annen aminosyrerest, eller deleres. En variant eller analog kan også fremstilles ved delering av aminosyrene i posisjon 1, 2, 3, 4 og 5, som i varianten i SEKV.ID. NR. 15 (se figur 5). Substitusjoner i disse posisjoner kan også utføres, og ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område. Det rekombinante Fc-OB-protein i figur 5 er et Fc-OB-protein på 373 aminosyrer (ikke medregnet metioninresten). Den første aminosyreposisjon i det rekombinante Fc-OB-protein i figur 5 betegnes +1, mens metioninet ligger i -1-posisjonen. Modifikasjoner kan også utføres for å innføre fire aminosyresubstitusjoner for å fjerne Fc-reseptorbindingssetet og komplement(Clq)-bindingssetet. Disse variantmodifikasjoner fra SEKV.ID. NR. 15 vil omfatte erstatning av leucin i posisjon 15 med glutamat, erstatning av glutamat i posisjon 98 med alanin og erstatning av ly sin i posisjoner 100 og 102 med alanin (se figur 6 og SEKV.ID. NR. 18). Det rekombinante Fc-OB-protein i figur 6 er et Fc-OB-protein på 373 aminosyrer (ikke medregnet metioninresten). Den første aminosyreposisjon i det rekombinante Fc-OB-protein i figur 6 betegnes +1, mens metioninet ligger i -1-posisjonen. Likeså kan én eller flere tyrosinrester erstattes med fenylalaninrester. I tillegg omfattes også andre varianter av aminosyreinnsettinger, delesjoner og/eller substitusjoner, og ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område. Videre kan endringer være i form av endrede aminosyrer, f.eks. peptidetterlignere eller D-aminosyrer. Fc-proteinet kan også være koblet til OB-proteinene i Fc-OB-proteinet ved "linker"-grupper, enten kjemiske grupper eller aminosyrer av varierende lengde. Slike kjemiske linkere er velkjente innen faget. Aminosyrelinkersekvenser kan omfatte, men er ikke begrenset til: (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; (d) gly, gly; (e) gly, gly, gly; (f) gly, gly, gly, gly, gly; (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly; (h) gly-pro-gly;

(i) gly, gly, pro, gly, gly; og

(j) enhver kombinasjon av undergruppene (a)-(i).

OB-delen av Fc-OB-fusjonsproteinet kan være utvalgt blant det rekombinante museprotein beskrevet i SEKV.ID. NR. 3 (se figur 1) og det rekombinante, humane protein, som beskrevet av Zhang et al., Nature, supra (som inkorporeres heri ved referanse), eller proteiner som mangler en glutaminylrest i posisjon 28. (Se Zhang et al., Nature, supra, s. 428.) Man kan også benytte den rekombinante, humane OB-proteinanalog beskrevet i SEKV.ID. NR. 6 (se figur 2), som omfatter: (1) et arginin i stedet for lysin i posisjon 35, og (2) et leucin i stedet for isoleucin i posisjon 74. (En forkortet betegnelse på denne analog er rekombinant, human R-»L<35>,1-»L<74>.) Aminosyresekvensen for det rekombinante, humane protein og det rekombinante museprotein, eller analoger med eller uten Fe-delen koblet til OB-proteinets aminoende, beskrives nedenfor med en metionylrest i -1-posisjonen; imidlertid kan, som for ethvert av de foreliggende OB-proteiner og - analoger, metionylresten være fjernet.

Museproteinet er i det vesentlige homologt med det humane protein, særlig som modent protein, og spesielt i aminoenden. Man kan fremstille en analog av det rekombinante, humane protein ved å endre de aminosyrer som avviker fra musesekvensen, f.eks. ved aminosyresubstitusjoner. Siden det rekombinante, humane protein har biologisk aktivitet i mus, ville en slik analog sannsynligvis være aktiv i mennesker. Ved f.eks. å benytte et humant protein med lysin i posisjon 35 og isoleucin i posisjon 74 ifølge nummereringen i SEKV.ID. NR. 6, hvori den første aminosyre er valin og aminosyren i posisjon 146 er cystein, kan man erstatte med en annen aminosyre én eller flere av aminosyrene i posisjonene 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111,118, 136, 138, 142 og 145. Man kan erstatte med aminosyren i den tilsvarende posisjon i museproteinet (SEKV.ID. NR.

3) eller med en annen aminosyre.

Man kan videre fremstille "konsensus"-molekyler basert på OB-proteinsekvensen fra rotte, Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 209:944-952 (1995), som inkorporeres heri ved referanse. OB-proteinet fra rotte avviker fra humant OB-protein i følgende posisjoner (ved benyttelse av nummereringen i SEKV.ID. NR. 6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 11,74, 77, 78, 89,97, 100, 101, 102,105,106, 107,108, ili, H8,136,138 og 145. Én eller flere av aminosyrene i disse avvikende posisjoner kan erstattes med en annen aminosyre. De understrekede posisjoner er posisjoner hvor både muse-OB-proteinet og rotte-OB-proteinet avviker fra det humane OB-protein, og som således er spesielt godt egnet for endring. I én eller flere av disse posisjoner kan den foreliggende aminosyre erstattes med en aminosyre fra det tilsvarende rotte-OB-protein eller med en annen aminosyre.

Posisjonene hvor OB-proteinet fra rotte og proteinet fra mus begge avviker fra det modne humane OB-protein, er: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68,71,74, 77, 78, 89,97, 100, 102,105, 106,107, 108, 111, 118,136, 138,142 og 145. Et OB-protein ifølge SEKV.ID. NR. 6, hvor én eller flere av aminosyrene ovenfor er erstattet med andre aminosyrer, f.eks. aminosyren som finnes i den tilsvarende rotte- eller musesekvens, kan også være effektivt.

I tillegg er aminosyrene som foreligger i OB-protein fra rhesusaper, som avviker fra det modne humane OB-protein (med aminosyrenes identitet angitt i parentes i enbokstavforkortelse): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) og 118 (L). Siden det rekombinante, humane OB-protein er aktivt i cynomolgusaper, kan et humant OB-protein ifølge SEKV.ID. NR. 6 (med lysin i posisjon 35 og isoleucin i posisjon 74), hvor én eller flere av de aminosyrer som avviker fra sekvensen fra rhesusaper er erstattet med en annen aminosyre, f.eks. aminosyren angitt i parentes, være effektivt. Det bør bemerkes at visse aminosyrer som avviker i rhesussekvensen er de samme som foreligger i musetypene nevnt ovenfor (posisjonene 35, 68, 89, 100 og 112). Således kan man fremstille et muserhesus-/menneskekonsensusmolekyl med (ved benyttelse av nummereringen i SEKV.ID. NR. 6, som har lysin i posisjon 35 og isoleucin i posisjon 74) én eller flere av aminosyrene i posisjonene nedenfor erstattet med en annen aminosyre: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,100.102,105,106,107,108, 111,112,118,136,138,142 og 145.

Andre analoger kan fremstilles ved å delere en del av proteinets aminosyresekvens. For eksempel mangler det modne protein en ledersekvens (-22 til -1). Man kan fremstille følgende avkortede former av humane OB-proteinmolekyler (ved benyttelse av nummereringen i SEKV.ID. NR. 6):

(a) aminosyrene 98-146

(b) aminosyrene 1-32

(c) aminosyrene 40-116

(d) aminosyrene 1 -99 og (koblet til) 112-146

(e) aminosyrene 1-99 og (koblet til) 112-146, hvor én eller flere av aminosyrene 100-111 er plassert mellom aminosyre 99 og aminosyre 112.

I tillegg kan de avkortede former også ha endret én eller flere av aminosyrene som avviker (i OB-proteinet fra rotte, mus eller rhesusape) fra det humane OB-protein. Videre kan enhver endring være i form av endrede aminosyrer, f.eks. peptidetterlignere eller D-aminosyrer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter således et Fc-OB-fusjonsprotein hvori OB-proteinet er utvalgt blant: (a) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 3 eller SEKV.

ID. NR.: 6,

(b) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 6 med en

lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74,

(c) aminosyresekvensen fra undergruppe (b) som har en forskjellig aminosyre substituert i én eller flere av de følgende posisjoner (ved anvendelse av nummerering ifølge SEKV. ID. NR.: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66, 67,68, 71,74, 77, 78, 89, 97, 100,102,105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145, (d) aminosyresekvensen av undergruppe (a), (b) eller (c) som om ønskelig mangler en glutaminylrest i posisjon 28, (e) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b), (c) eller (d) med en

metionylrest i den N-terminale ende,

(i) aminosyrene 98-146

(ii) aminosyrene 1-32

(iii) aminosyrene 40-116

(iv) aminosyrene 1-99 og 112-146

(v) aminosyrene 1-99 og 112-146 med én eller flere av aminosyrene 100-111 plassert etter hverandre mellom aminosyre 99 og 112, og (vi) det avkortede OB-protein av undergruppe (f) (i) med én eller flere av aminosyrene 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138,142 og 145 substituert med en annen aminosyre, (vii) det avkortede protein av undergruppe (f) (ii) med én eller flere av aminosyrene 4, 8 og 32 substituert med en annen aminosyre, (viii) det avkortede protein av undergruppe (f) (iii) med én eller flere av aminosyrene 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102,105, 106, 107, 108, 111 og 112 erstattet med en annen aminosyre,

(ix) det avkortede protein av undergruppe (f) (iv) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64,66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136,138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre,

(x) det avkortede protein av undergruppe (f) (v) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118,136, 138,142 og 145 erstattet med en annen aminosyre,

(g) OB-proteinet eller en analog av enhver av undergruppene (a) til (f)

omfattende en kjemisk rest forbundet til proteinresten, hvori nevnte,

kjemiske rest er en vannløselig polymerrest,

(h) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymerrest er

polyetylenglykol,

(i) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymer er en polyaminosyrerest, og

(j) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymerrest er

bundet kun i den N-terminale ende av nevnte proteinrest.

Derivater

De foreliggende Fc-OB-fusjonsproteiner (begrepet "protein" benyttes heri til å omfatte "peptid", Fc, OB eller analoger, f.eks. dem angitt ovenfor, dersom ikke annet er angitt) derivatiseres ved tilkobling av én eller flere kjemiske grupper til Fc-OB-fusjonsproteindelen. Disse kjemisk modifiserte derivater kan videre utformes for intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulær, subkutan, intravenøs, oral, nasal, pulmonal og topisk tilførsel, så vel som andre tilførselsveier, som diskutert nedenfor. Kjemisk modifisering av biologisk aktive proteiner er vist å gi ytterligere fordeler under visse omstendigheter, f.eks. forhøyet stabilitet og forlenget halveringstid i sirkulasjonen av det terapeutiske protein, og redusert immunogenisitet. Se US patentskrift nr. 4 179 337, Davis et al., tildelt 18. desember 1979. For en oversikt se Abuchowski et al., i Enzymes as Drugs (J.S. Holcerberg og J. Roberts, red., s. 367-383 (1981)); Francis et al., supra.

De kjemiske grupper som er egnet for slik derivatisering, kan utvelges blant forskjellige vannløselige polymerer. Den valgte polymer bør være vannløselig, slik at proteinet den er festet til ikke utfelles i vandig miljø, f.eks. i fysiologisk miljø. For terapeutisk anvendelse av sluttproduktpreparatet vil polymeren fortrinnsvis være farmasøytisk aksepterbar. En fagmann vil kunne utvelge den ønskede polymer basert på betraktninger som hvorvidt poly-mer-/proteinkonjugatet skal benyttes terapeutisk, og dersom dette er tilfellet, den ønskede dose, halveringstid i sirkulasjonen, proteolyseresistens og andre betraktninger. For de foreliggende proteiner og peptider kan effektiviteten av derivatiseringen bekreftes ved å tilføre derivatet i den ønskede form (det vil si med osmotisk pumpe eller, mer foretrukket, ved injeksjon eller infusjon, eller videre utformet for f.eks. oral, pulmonal eller nasal tilførsel) og observere de biologiske virkninger, som beskrevet heri.

Den vannløselige polymer kan utvelges blant gruppen som f.eks. består av polyetylenglykol, kopolymerer av etylenglykol/propylenglykol, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioksolan, poly-1,3,6-trioksan, etylen-/maleinsyreanhydridkopolymer, polyaminosyrer (enten homopolymerer eller randomiserte kopolymerer) og dekstran eller poly(n-vinylpyrrolidon)polyetylenglykol, propylenglykolhomopolymerer, polypropylen-oksid-/etylenoksidkopolymerer, polyoksyetylerte polyoler og polyvinylalkohol. Polyetylenglykol-propionaldehyd kan ha fordeler ved fremstillingen grunnet dets stabilitet i vann. Suksinat og styren kan også benyttes.

OB- eller Fc-proteinene som benyttes for utforming av Fc-OB-fusjonsproteinet, kan fremstilles ved å koble polyaminosyrer eller aminosyrer med et forgreningspunkt til Fc- eller OB-proteinet (eller analoger av disse). For eksempel kan polyaminosyren være et ytterligere bærerprotein som i likhet med Fc koblet til OB-proteinet eller OB-analogen ifølge foreliggende oppfinnelse bidrar til å øke proteinets halveringstid i sirkulasjonen, i tillegg til fordelene som åpnes ved Fc-OB-fusjonsproteinet ovenfor. For de foreliggende terapeutiske eller kosmetiske formål med foreliggende oppfinnelse bør disse polyaminosyrene være slike som har eller ikke utløser nøytraliserende antigenrespons eller andre uønskede responser. Slike polyaminosyrer kan utvelges fra gruppen bestående av serumalbumin (f.eks. humant serumalbumin), nok et antistoff eller en del av et slikt (f.eks. Fc-området) eller andre polyaminosyrer, f.eks. lysiner. Som antydet nedenfor, kan plasseringen for tilkobling av polyaminosyren være i aminoenden av Fc-OB-proteingruppen eller i karboksyenden, eller andre steder mellom disse, og den kan også tilkobles via en kjemisk "linker"-gruppe til Fc-OB-proteinet.

Polymeren kan ha enhver molekylvekt og være forgrenet eller uforgrenet. For polyetylenglykol ligger den foretrukne molekylvekt mellom tilnærmet 2 kDa og tilnærmet 100 kDa (begrepet "tilnærmet" viser til at det i polyetylenglykolpreparater vil være noen molekyler som veier mer og noen mindre enn den angitte molekylvekt) for enkel håndtering og fremstilling. Andre størrelser kan benyttes, avhengig av den ønskede terapeutiske profil (f.eks. den ønskede varighet av den vedvarende frigjørelse, virkningene, om noen, på den biologiske aktivitet, enkel håndtering, grad av antigenisitet eller mangel på dette, og andre kjente virkninger av polyetylenglykol på et terapeutisk protein eller en analog).

Antall polymermolekyler som tilkobles på denne måte, kan variere, og en fagmann vil kunne fastslå virkningen på funksjonen. Man kan monoderivatisere eller sørge for di-, tri-, tetra- eller en kombinasjon av derivatisering med de samme eller forskjellige kjemiske grupper (f.eks. polymerer, f.eks. polyetylenglykoler med forskjellig vekt). Forholdet mellom polymermolekyler og protein(eller peptid)molekyler vil variere, likeså konsentrasjonen av disse i reaksjonsblandingen. Generelt vil det optimale forhold (når det gjelder reaksjonens effektivitet ved at det ikke foreligger overskudd av ikke-reagert protein eller polymer) bestemmes av faktorer som den ønskede derivatiseringsgrad (f.eks. mono-, di-, tri- osv.), molekylvekten av den valgte polymer, hvorvidt polymeren er forgrenet eller uforgrenet og reaksjonsbetingelsene.

De kjemiske grupper bør kobles til proteinet på en måte som tar hensyn til virkninger på funksjonelle eller antigene domener i proteinet. Det finnes en rekke fremgangsmåter for tilkobling som er tilgjengelige for fagfolk, f.eks. EP

0 401 384, som inkorporeres heri ved referanse (kobling av PEG til G-CSF), se også

Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (som rapporterer pegylering av GM-CSF med tresylklorid). Polyetylenglykol kan f.eks. bindes kovalent via aminosyrerester med en reaktiv gruppe, f.eks. en fri amino- eller karboksylgruppe. Reaktive grupper er slike som et aktivert polyetylenglykolmolekyl kan bindes til. Aminosyrerestene med en fri aminogruppe kan omfatte lysinrester og den N-terminale aminosyrerest. Aminosyrer med en fri karboksylgruppe kan omfatte asparaginsyrerester, glutaminsyrerester og den C-terminale aminosyrerest. Sulfhydrylgrupper kan også benyttes som reaktive grupper for tilkobling av polyetylenglykolmolekylet eller -molekylene. For terapeutiske formål foretrekkes tilkobling til en aminogruppe, f.eks. tilkobling til N-terminalen eller en lysingruppe. Tilkobling til aminosyrerester som er viktige for reseptorbinding, bør unngås dersom reseptorbinding er ønskelig.

Man kan spesifikt ønske N-terminalt, kjemisk modifisert Fc-OB-fusjonsprotein. Med polyetylenglykol som en illustrasjon av de foreliggende preparater kan man velge blant en rekke polyetylenglykolmolekyler (som varierer når det gjelder molekylvekt, forgrening osv.), forholdet mellom polyetylenglykolmolekyler og protein(eller peptid)molekyler i reaksjonsblandingen, type pegyleringsreaksjon som skal utføres og fremgangsmåten for erholdelse av det ønskede N-terminalt pegylerte protein. Fremgangsmåten for erholdelse av det N-terminalt pegylerte preparat (det vil si å skille denne gruppe fra andre monopegylerte grupper om nødvendig) kan være ved rensing av det N-terminalt pegylerte materialet fra en populasjon av pegylerte proteinmolekyler. Selektiv kjemisk modifisering av N-terminalen kan oppnås ved reduktiv alkylering, som utnytter forskjellen i reaktivitet mellom forskjellige typer primære aminogrupper (aminogrupper i lysin sammenlignet med den N-terminale aminogruppe) som er tilgjengelige for derivatisering i et gitt protein. Under egnede reaksjonsbetingelser oppnås i det vesentlige selektiv derivatisering av proteinet i N-terminalen med en polymer som inneholder en karbonylgruppe. For eksempel kan man selektivt pegylere proteinet N-terminalt ved å utføre reaksjonen ved en pH som tillater en å dra fordel av pKa-forskjellene mellom lysinrestenes e-aminogruppe og a-aminogruppen i proteinets N-terminale aminosyrerest. Ved slik selektiv derivatisering kontrolleres tilkobling av en vannløselig polymer til et protein: konjugeringen med polymeren finner hovedsakelig sted ved proteinets N-terminal, og ingen vesentlig modifisering av andre reaktive grupper, f.eks. aminogruppene i lysinrestenes sidekjeder, forekommer. Ved benyttelse av reduktiv alkylering kan den vannløselige polymer være av samme type som beskrevet ovenfor, og den bør ha en enkelt reaktiv aldehydgruppe for kobling til proteinet. Polyetylenglykol-propionaldehyd, som inneholder en enkelt reaktiv aldehydgruppe, kan benyttes.

Et N-terminalt, monopegylert derivat foretrekkes for enkel fremstilling av et terapeutisk middel. N-terminal pegylering sikrer et homogent produkt, siden karakterisering av produktet forenkles sammenlignet med di-, tri- og andre multipegylerte produkter. Anvendelse av den reduktive alkyleringsprosess nevnt ovenfor for fremstilling av et N-terminalt produkt foretrekkes grunnet enkel kommersiell fremstilling.

Komplekser

Fc-OB-fusjonsproteinet, -analogen eller -derivatet kan tilføres i kompleks med et bindende preparat. Et slikt bindende preparat kan bidra til å forlenge halveringstiden i sirkulasjonen ytterligere enn det som oppnås med Fc-OB-fusjonsproteinet, -analogen eller -derivatet. Et slikt preparat kan være et protein (eller synonymt et peptid). Et eksempel på et bindende protein er OB-proteinreseptoren eller en del av denne, f.eks. en løselig del av denne. Andre bindende proteiner kan identifiseres ved å undersøke OB-protein eller Fc-OB-protein i serum, eller ved empirisk leting etter en slik binding. Bindende proteiner som benyttes, vil typisk ikke interferere med evnen til OB-proteinet, Fc-OB-fusjonsproteinene eller analogene eller derivatene av disse til å bindes til endogen OB-proteinreseptor og/eller føre til signaltransduksjon.

Farmasøytiske preparater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for anvendelse av farmasøytiske preparater av Fc-OB-fusjonsproteinene og deres derivater. Slike farmasøytiske preparater kan være for tilførsel ved injeksjon eller for oral, pulmonal, nasal, transdermal eller andre former for tilførsel. Generelt omfattet av oppfinnelsen er farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av protein- eller derivatprodukter ifølge oppfinnelsen, sammen med farmasøytisk aksepterbare fortynningsmidler, konserveringsmidler, løselig-hetsfremmende midler, emulsjonsmidler, adjuvanser og/eller bærerstoffer. Slike preparater omfatter fortynningsmidler med varierende bufferinnhold (f.eks. Tris-HC1, acetat, fosfat), pH og ionestyrke, tilsetningsstoffer, slik som detergenter, og løselighetsfremmende midler (f.eks. Tween 80, Polysorbat 80), antioksidanter (f.eks. askorbinsyre, natriummetabisulfitt), konserveringsmidler (f.eks. Thimersol, benzylalkohol) og massegivende substanser (f.eks. laktose, mannitol), innføring av materialet i partikulære preparater av polymere forbindelser, f.eks. polymelkesyre, polyglykolsyre osv., eller i liposomer. Hyaluronsyre kan også benyttes, og dette kan bidra til å fremme forlenget stabilitet i sirkulasjonen. Slike preparater kan påvirke den fysiske tilstand, stabiliteten, hastigheten for frigjørelse in vivo og hastigheten for clearance in vivo av de foreliggende proteiner og derivater. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), s. 1435-1712, som inkorporeres heri ved referanse. Preparatene kan fremstilles i flytende form eller foreligge som tørket pulver, f.eks. i frysetørket form. Implanterbare preparater for vedvarende frigivelse omfattes også, likeså transdermale preparater.

Omfattet for anvendelse heri er orale, faste doseringsformer, som beskrives generelt i Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), i kapittel 89, som inkorporeres heri ved referanse. Faste doseringsformer omfatter tabletter, kapsler, piller, pastiller eller sugetabletter, pulverfylte kapsler eller pastiller. Videre kan liposomal eller proteinoid innkapsling benyttes for utforming av de foreliggende preparater (f.eks. proteinoide mikrokuler rapportert i US patentskrift nr. 4 925 673). Liposomal innkapsling kan benyttes, og liposomene kan derivatiseres med forskjellige polymerer (se f.eks. US patentskrift nr. 5 013 556). En beskrivelse av mulige faste doseringsformer for det terapeutiske middel gis av Marshall, K. i Modern Pharmaceutics, redigert av G.S. Banker og C.T. Rhodes, kapittel 10,1979, som inkorporeres heri ved referanse. Generelt vil preparatet omfatte Fc-OB-fusjonsproteinet (eller analogen eller derivatet av dette) og inerte bestanddeler som gir beskyttelse mot miljøet i magen og sikrer frigivelse av det biologisk aktive materialet i tarmen.

Også spesifikt omfattet er orale doseringsformer av de ovenfor beskrevne derivatiserte proteiner. Fc-OB-fusjonsprotein kan modifiseres kjemisk, slik at den orale tilførsel av derivatet er effektiv. Generelt er den kjemiske modifisering som omfattes, tilkobling av minst én gruppe til proteinmolekylet (eller peptidmolekylet) selv, hvor gruppen gir (a) inhibering av proteolyse, og (b) opptak i blodbanen fra mage eller tarm. Også ønskelig er forhøyet generell stabilitet av proteinet og forlenget sirkulasjonstid i kroppen. Eksempler på slike grupper omfatter: polyetylenglykol, kopolymerer av etylenglykol og propylenglykol, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon og poly-prolin. Abuchowski og Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, i "Enzymes as Drugs", Hocenberg og Roberts, red., Wiley-Interscience, New York, NY (1981), s. 367-383; Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Andre polymerer som kunne benyttes, er poly-l,3-dioksolan og poly-l,3,6-trioksan. For farmasøytisk anvendelse foretrekkes, som angitt ovenfor, polyetylenglykolgrupper.

For Fc-OB-fusjonsproteinet eller analogen eller

derivatet av dette kan frigivelsessetet være magen, tynntarmen (f.eks. tolvfingertarmen, jejunum eller ileum) eller tykktarmen. En fagmann har tilgjengelige preparater som ikke vil oppløses i magen, men som likevel vil frigjøre materialet i tolvfingertarmen eller andre steder i tarmen. Generelt vil frigivelsen unngå de skadelige virkninger av miljøet i magen, enten ved beskyttelse av Fc-OB-

fusjonsproteinet, analogen eller derivatet, eller ved frigivelse av det biologisk aktive materialet etter at det har passert magen, f.eks. i tarmen.

For å sikre full motstandskraft i magen er et belegg som er impermeabelt ned til minst pH 5,0 essensielt. Eksempler på de vanligere inerte bestanddeler som benyttes som enteriske belegg, er celluloseacetattrimellitat (CAT), hydroksypropylmetylcelluloseftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinylacetatftalat (PV AP), Eudragit L30D, Aquateric, celluloseacetatftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S og skjellak. Disse belegg kan benyttes som blandede filmer.

Et belegg eller en blanding av belegg som ikke er ment å beskytte mot magemiljøet, kan også benyttes på tabletter. Belegget kan omfatte sukkerbelegg eller belegg som gjør tabletten enklere å svelge. Kapsler kan bestå av et hardt skall (f.eks. gelatin) for tilførsel av et tørt terapeutisk middel, det vil si et pulver; for flytende former kan et mykt gelatinskall benyttes. Skallmaterialet i kapsler kan være tykk stivelse eller annet spiselig papir. For piller, sugetabletter, utformede tabletter eller tablettriturater kan teknikker for fuktig masse benyttes.

Det terapeutiske middel kan inngå i preparatet som fine multipartikler i form av granulat eller kuler med partikkelstørrelse på tilnærmet 1 mm. Utformingen av materialet for kapseltilførsel kan også være som et pulver, lett sammenpressede plugger eller til og med som tabletter. Det terapeutiske middel kan fremstilles ved sammenpressing.

Fargestoffer og smaksmidler kan også inngå. For eksempel kan proteinet (eller derivatet) være utformet (f.eks. ved innkapsling i liposomer eller mikrokuler) og deretter videre innføres i et spiselig produkt, f.eks. en avkjølt drikk som inneholder fargestoffer og smaksmidler.

Man kan fortynne eller øke volumet av det terapeutiske middel med et inert materiale. Disse fortynningsmidler kan omfatte karbohydrater, særlig mannitol, a-laktose, vannfri laktose, cellulose, sukrose, modifiserte dekstraner og stivelse. Visse uorganiske salter kan også benyttes som fyllstoffer, heriblant kalsiumtrifosfat, magnesiumkarbonat og natriumklorid. Noen kommersielt tilgjengelige fortynningsmidler er Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress og Avicell.

Desintegreringsmidler kan inngå ved utforming av det terapeutiske middel til en fast doseringsform. Materialer som benyttes som desintegreringsmidler, omfatter, men er ikke begrenset til, stivelse, heriblant Explotab, et kommersielt desintegreringsmiddel basert på stivelse. Natriumstivelsesglykolat, Amberlite, natriumkarboksymetylcellulose, ultra-myelopektin, natriumalginat, gelatin, appelsinskall, sur karboksymetylcellulose, naturlig svamp og bentonitt kan alle benyttes. En annen form for desintegreringsmidler er uløselige kationbytterresiner. Pulveriserte gummier kan benyttes som desintegreringsmiddel og bindemiddel, og disse kan omfatte pulveriserte gummier som agar, karaya eller tragant. Algininsyre og natriumsaltet av denne er også anvendbare som desintegreringsmidler.

Bindemidler kan benyttes for å holde det terapeutiske middel sammen, slik at det dannes en hard tablett, og omfatter materialer fra naturprodukter som akasie, tragant, stivelse og gelatin. Andre omfatter metylcellulose (MC), etylcellulose (EC) og karboksymetylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) og hydroksypropylmetylcellulose (HPMC) kan begge benyttes i alkoholiske løsninger for granulering av det terapeutiske middel.

Et antifriksjonsmiddel kan inngå i preparatet av det terapeutiske middel for å forhindre klebing under utformingsprosessen. Smøremidler kan benyttes som et lag mellom det terapeutiske middel og støpeveggen, og disse kan omfatte, men er ikke begrenset til, stearinsyre, innbefattet magnesium- og kalsiumsaltet, polytetrafluoretylen (PTFE), flytende parafin, vegetabilske oljer og vokser. Løselige smøremidler kan også benyttes, f.eks. natriumlaurylsulfat, magnesiumlaurylsulfat, polyetylenglykol av forskjellig molekylvekt, Carbowax 4000 og 6000.

Glidemidler som kan forbedre flytegenskapene til medikamentet under utformingen og fremme rearrangering under sammenpressingen, kan tilsettes. Disse glidemidler kan omfatte stivelse, talkum, pyrogenkiselgel og hydrert kiselaluminat.

For å lette oppløsning av det terapeutiske middel i det vandige miljø kan et overflateaktivt middel tilsettes som fuktemiddel. Overflateaktive stoffer kan omfatte anioniske detergenter som natriumlaurylsulfat, dioktylnatriumsulfosuksinat og dioktylnatriumsulfonat. Kationiske detergenter kan benyttes, og kan omfatte benzalkoniumklorid eller benzetoniumklorid. Listen over mulige ikke-ioniske detergenter som kunne inngå i preparatet som overflateaktive stoffer, er lauromakrogel 400, polyoksyl 40-stearat, polyoksyetylenhydrogenert lakserolje 10, 50 og 60, glyserolmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 og 80, sukrosefettsyreester, metylcellulose og karboksymetylcellulose. Disse overflateaktive stoffer kan foreligge i preparatet av proteinet eller derivatet, enten alene eller som en blanding i forskjellige forhold.

Tilsetningsstoffer som kan fremme opptak av proteinet (eller derivatet) er f.eks. fettsyrene oleinsyre, linolsyre og linolensyre.

Det kan være ønskelig med preparater for kontrollert frigivelse. Medikamentet kan være innført i en inert matriks som tillater frigivelse, enten ved diffusjon eller ved utvaskingsmekanismer, f.eks. gummier. Støttemidler som langsomt nedbrytes, kan også innføres i preparatet, f.eks. alginater og polysakkarider. En annen form for kontrollert frigivelse av dette terapeutiske middel er ved en fremgangsmåte basert på det terapeutiske system Oros (Alza Corp.), det vil si at medikamentet er innelukket i en semipermeabel membran som tillater vann å komme inn og dytte medikamentet ut gjennom en enkelt liten åpning, grunnet osmotiske effekter. Noen enteriske belegg gir også forsinket frigivelse.

Andre belegg kan benyttes for preparatet. Disse omfatter en rekke sukkere som kan påføres i en beleggingskjele. Det terapeutiske middel kan også tilføres i en tablett med belegg, og materialene som benyttes i dette tilfellet, inndeles i to grupper. De første er de ikke-enteriske materialer og omfatter metylcellulose, etylcellulose, hydroksyetylcellulose, metylhydroksyetylcellulose, hydroksy-propylcelulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose, providon og polyetylenglykolene. Den andre gruppen består av de enteriske materialer, som vanligvis er estere av ftalsyre.

En blanding av materialer kan benyttes for å tilveiebringe det optimale belegg. Beleggingen kan utføres i en beleggingskjele eller i et fluidisert sjikt, eller ved kompresjonsbelegging.

Videre omfattet heri er pulmonal tilførsel av det foreliggende protein (eller derivater av dette). Proteinet (eller derivatet) tilføres til lungene hos et pattedyr mens dette inhalerer, og vandrer over lungens epitelbelegg til blodstrømmen. (Andre rapporter vedrørende dette omfatter Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7:565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5): s. 143-146 (1989)

(endotelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 5:206-212 (1989) (al-antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (a-1-proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, mars 1990 (rekombinant, humant veksthormon); Debs et al., The Journal of Immunology, 740:3482-3488

(1988) (interferon-y og tumornekrosefaktor a) og Platz et al., US patentskrift

nr. 5 284 656 (granulocyttkolonistimulerende faktor.)

Omfattet for anvendelse ved utførelse av foreliggende oppfinnelse er et bredt spekter av mekaniske innretninger utformet for pulmonal tilførsel av terapeutiske produkter, heriblant, men ikke begrenset til, forstøvere, doseinhalatorer med måler og pulverinhalatorer, som alle er velkjente blant fagfolk.

Noen spesifikke eksempler på kommersielt tilgjengelige innretninger som er egnet for utførelse av foreliggende oppfinnelse, er Ultravent-forstøveren, fremstilt av Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; Acorn II-forstøveren, fremstilt av Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin-doseinhalator med måler, fremstilt av Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; og Spinhaler-pulverinhalator, fremstilt av Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Alle slike innretninger krever anvendelse av preparater som er egnet for finfordeling av protein (eller analog eller derivat). Typisk er hvert preparat spesifikt for typen innretning som benyttes, og kan omfatte anvendelse av egnede drivmaterialer i tillegg til fortynningsmidler, adjuvanser og/eller bærerstoffer som er anvendbare ved terapeutisk behandling.

Proteinet (eller derivatet) bør mest fordelaktig være fremstilt i partikkelform med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på mindre enn 10 um (eller mikron), mest foretrukket 0,5-5 urn, for mest effektiv tilførsel til de distale deler av lungen.

Bærerstoffer omfatter karbohydrater som trehalose, mannitol, xylitol, sukrose, laktose og sorbitol. Andre bestanddeler for anvendelse i preparatene kan omfatte DPPC, DOPE, DSPC og DOPC. Naturlige eller syntetiske overflateaktive stoffer kan benyttes. Polyetylenglykol kan benyttes (også bortsett fra dets anvendelse ved derivatisering av proteinet eller analogen). Dekstraner, f.eks. syklodekstran, kan benyttes. Gallesalter og andre beslektede forsterkningsmidler kan benyttes. Cellulose og cellulosederivater kan benyttes. Aminosyrer kan benyttes, f.eks. anvendt i et bufferpreparat.

Videre omfattes anvendelse av liposomer, mikrokapsler eller mikrokuler, inklusjonskomplekser og andre typer bærerstoffer.

Preparater som er egnet for anvendelse med en forstøver, enten en dyseforstøver eller en ultralydforstøver, vil typisk omfatte Fc-OB-protein, analoger eller derivater av dette løst i vann i en konsentrasjon på tilnærmet 0,1-25 mg biologisk aktivt protein pr. ml løsning. Preparatet kan også omfatte en buffer og et enkelt sukker (f.eks. for proteinstabilisering og regulering av osmotisk trykk). Forstøvingspreparatet kan også inneholde et overflateaktiyt middel for å redusere eller forebygge overflateindusert proteinaggregering som en følge av forstøvingen av løsningen når aerosolen dannes.

Preparater for anvendelse med en inhalator med dosemåler vil generelt omfatte et finfordelt pulver som inneholder proteinet (eller derivatet) suspendert i et drivmiddel ved hjelp av et overflateaktivt stoff. Drivmidlet kan være et ethvert konvensjonelt materiale som benyttes for dette formål, f.eks. et klorfluorkarbon, et hydroklorfluorkarbon, et hydrofluorkarbon eller et hydrokarbon, heriblant triklorfluormetan, diklordifluormetan, diklortetrafluoretanol og 1,1,1,2-tetrafluoretan, eller kombinasjoner av disse. Egnede overflateaktive stoffer omfatter sorbitantrioleat og soyalecitin. Oleinsyre er også anvendbar som overflateaktivt middel.

Preparater for dosering fra en pulverinhalatorinnretning vil omfatte et finfordelt, tørt pulver som inneholder protein (eller derivat), og som også kan omfatte et massegivende middel, f.eks. laktose, sorbitol, sukrose, mannitol, trehalose eller xylitol, i mengder som letter dosering av pulveret fra innretningen, f.eks. 50-90 % (vekt/vekt) av preparatet.

Nasal tilførsel av proteinet (eller analogen eller derivatet) omfattes også. Nasal tilførsel tillater passasje av proteinet til blodstrømmen direkte etter tilførsel av det terapeutiske produkt til nesen, uten behov for deponering av produktet i lungen. Preparater for nasal tilførsel omfatter preparater som inneholder dekstran eller syklodekstran. Tilførsel ved transport over andre slimhinner omfattes også.

Dosering

En fagman vil kunne fastsette effektive doser ved tilførsel og observasjon av den ønskede terapeutiske virkning. Grunnet den N-terminale modifisering av OB-proteinet tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en uventet beskyttelse av proteinet mot degradering, forlenget halveringstid i sirkulasjonen og økt stabilitet, sammenlignet med OB-protein eller OB-protein modifisert i C-terminalen. En fagmann vil derfor kunne fastslå fra disse endringer at en effektiv dose kan kreve lavere doser eller mindre hyppig dosering.

Fortrinnsvis vil utformingen av molekylet være slik at mellom tilnærmet 0,10 |ig/kg/dag og 10 mg/kg/dag vil gi den ønskede terapeutiske virkning. De effektive doser kan bestemmes ved benyttelse av diagnostiske hjelpemidler over tid. For eksempel kan et diagnostisk middel for måling av mengden OB-protein eller Fc-OB-fusjonsprotein i blodet (eller i plasma eller serum) først benyttes for å bestemme det endogene proteinnivå. Slike diagnostiske midler kan foreligge i form av en antistoffanalyse, f.eks. en "sandwich"-antistoffanalyse. Mengden endogent OB-protein kvantifiseres først, og en grunnlinje bestemmes. De terapeutiske doser bestemmes etter hvert som måling av endogent og eksogent OB-protein eller Fc-OB-fusjonsprotein (det vil si protein, analog eller derivat som påvises i kroppen, enten selvprodusert eller tilført) fortsettes gjennom behandlingsforløpet. Dosene kan følgelig variere gjennom behandlingen, slik at en relativt høy dose benyttes i utgangspunktet inntil terapeutisk nytte observeres og lavere doser anvendes for å bibeholde de terapeutiske fordeler.

Ideelt vil, i situasjoner hvor det kun er ønskelig med en reduksjon av lipidnivået i blodet, hvor bevarelse av en reduksjon av lipidnivået i blodet er ønskelig eller en økning av kroppens ikke-fettvev er ønskelig, dosen være utilstrekkelig til å føre til vekttap. I den innledende fase av en behandling av en fet person kan således doser tilføres hvorved vekttap og samtidig reduksjon av lipidnivået i blodet eller samtidig reduksjon av fettvev/økning av ikke-fettvev oppnås. Når først et tilstrekkelig vekttap er oppnådd, kan en dose som er tilstrekkelig til å forebygge gjenvinning av vekten, men likevel tilstrekkelig til å opprettholde det ønskede lipidnivå i blodet eller økning av ikke-fettvevsmassen (eller forebyggelse av reduksjon av ikke-fettvevsmassen), tilføres. Disse doser kan bestemmes empirisk, siden virkningene av OB- eller Fc-OB-protein er reversible (se f.eks. Campfield et al., Science, 259:546-549 (1995) s. 547). Dersom en dose som fører til vekttap observeres når vekttap ikke er ønskelig, vil man således tilføre en lavere dose for å oppnå det ønskede lipidnivå i blodet eller den ønskede økning av ikke-fettvevsmassen, samtidig som den ønskede vekt opprettholdes.

For å øke et individs insulinfølsomhet kan tilsvarende overveielser vedrørende doseringen tas i betraktning. Oppnåelse av økt ikke-fettvevsmasse uten vekttap kan være tilstrekkelig til å redusere mengden av insulin (eller muligens amylin, tiazolidindioner eller andre mulige midler for behandling av diabetes) som et individ må tilføres for behandling av diabetes.

For å øke den generelle styrke kan lignende doseringsbetraktninger benyttes. Økning av ikke-fettvevsmassen med samtidig økning av den generelle styrke kan oppnås med doser som ikke er tilstrekkelige til å føre til vekttap. Andre fordeler, f.eks. økt antall røde blodceller (og oksygenering av blodet) og redusert benresorpsjon eller osteoporose, kan også oppnås uten vekttap.

Kombinasjoner

De foreliggende fremgangsmåter kan benyttes sammen med andre medikamenter, f.eks. slike som er anvendbare for behandling av diabetes (f.eks. insulin, muligens tiazolidindioner, amylin eller antagonister av disse), kolesterol og blodtrykksreduserende medikamenter (f.eks. slike som reduserer lipidnivået i blodet eller andre kardiovaskulære medikamenter) og aktivitetsøkende medikamenter (f.eks. amfetaminer). Appetittundertrykkere kan også benyttes (f.eks. slike som påvirker nivået av serotonin eller neuropeptid Y). Slik tilførsel kan foregå samtidig eller etter hverandre.

I tillegg kan de foreliggende fremgangsmåter benyttes sammen med kirurgiske fremgangsmåter, f.eks. kosmetisk kirurgi beregnet på å endre kroppens generelle utseende (f.eks. fettsuging eller laserkirurgi beregnet på reduksjon av kroppsmassen). Helsefordelene ved hjertekirurgi, f.eks. bypass-kirurgi eller andre typer kirurgi beregnet på å forbedre en skadelig tilstand forårsaket av blodkarblokkering av fettdepoter, f.eks. arteriell plakk, kan forhøyes ved samtidig anvendelse av de foreliggende preparater og fremgangsmåter. Fremgangsmåter for fjerning av gallestener, f.eks. ultralydbehandling og laserfremgangsmåter, kan også benyttes enten før, under eller etter en kur med de foreliggende terapeutiske fremgangsmåter. Videre kan de foreliggende fremgangsmåter benyttes som et tilskudd til kirurgi eller terapeutisk behandling av benbrudd, muskelskader og andre behandlingsformer som kan forbedres ved en økning av ikke-fettvevsmassen.

De påfølgende eksempler gis for å gi en mer omfattende illustrasjon av oppfinnelsen, men må ikke betraktes som begrensende for dens område.

Eksempel 1

Anvendelse av Fc- OB- protein fra mus ved subkutan injeksjon

Dette eksemplet viser at subkutan injeksjon av Fc-OB-protein fra mus fører til vekttap hos normale mus. Normale (ikke-fete) CD 1-mus ble tilført muse-Fc-OB-protein ved subkutane injeksjoner over et tidsrom på 22 dager. En dose på 10 mg protein/kg kroppsvekt/dag førte til 14 % (+/-1,1 %) reduksjon av grunnlinjevekten på den 22. injeksjonsdag. En dose med PBS førte til 3,9 % (+/- 3,3 %) tap av grunnlinjevekten på den 22. injeksjonsdag. Vekttapet ved anvendelse av 10 mg protein/kg kroppsvekt/dag av Fc-OB-protein i fete CD 1-mus førte til 10 %

(+/- 4,3 %) tap av grunnlinjevekten, mens tilførsel av PBS førte til 8,7 % (+/- 1,3 %) tap av grunnlinjevekten, begge målt på den 22. injeksjonsdag.

Presentert nedenfor er prosentforskjellene relativt til grunnlinjevekten hos CD 1-mus (8 uker gamle):

Som tabellen viser, mistet dyr som ble tilført Fc-OB-protein over 14,1 % av kroppsvekten for magre dyr og 10 % av kroppsvekten for fete dyr etter 22 dagers subkutan tilførsel, sammenlignet med dyr som kun ble tilført bærerstoffet PBS og sammenlignet med grunnlinjen.

Overraskende nok fortsatte dyr som ble gitt Fc-OB-protein i 22 dager å miste vekt i opptil 28 dager, 4 dager etter siste injeksjon. For normale (ikke-fete) CD 1-mus førte tilførsel av 10 mg protein/kg kroppsvekt/dag av muse-Fc-OB-protein ved subkutane injeksjoner avsluttet på dag 22, til 21 % tap av grunnlinjevekten på dag 28, sammenlignet med 14 % tap på dag 22. For fete mus førte likeså tilførsel av 10 mg protein/kg kroppsvekt/dag av muse-Fc-OB-protein avsluttet på dag 22, til 13 % tap av grunnlinjevekten på dag 28, sammenlignet med 10 % tap på dag 22. På dag 34 var vekttapet stabilt på 10 % tap hos fete mus, mens magre mus gjenvant seg til 5 % tap. Kontrollene i hvert system fra dag 22 til dag 34 ga gjennomsnittsverdier på 4 % hos fete mus og 7 % økning hos magre mus.

Eksempel 2

Anvendelse av humant Fc- OB- protein ved subkutan injeksjon hos C57- mus

Dette eksemplet viser at subkutan injeksjon av humant Fc-OB-protein fører til vekttap hos normale mus. Normale (ikke-fete) C57-mus ble tilført humant Fc-OB-protein ved subkutane injeksjoner over et tidsrom på 7 dager. En dose på 10 mg protein/kg kroppsvekt/dag førte til 12 % (+/- 1,3 %) tap av grunnlinjevekten på den 7. injeksjonsdag. En dose på 1 mg protein/kg kroppsvekt/dag førte til 8,9 %

(+/-1,5 %) tap av grunnlinjevekten på den 7. injeksjonsdag. Vekttapet ved anvendelse av 10 mg protein/kg kroppsvekt/dag av humant Fc-OB-protein i fete C57-mus førte til 1,1 % (+/- 0,99 %) tap av grunnlinjevekten, mens en dose på 1 mg protein/kg kroppsvekt/dag førte til 2,5 % (+/- 1,1 %) tap av grunnlinjevekten, begge målt på den 7. injeksjonsdag.

Resultater

Presentert nedenfor er prosent (%) forskjeller fra grunnlinjevekten hos C57-mus (8 uker gamle):

Som tabellen viser, hadde dyr som mottok Fc-OB-proteinet, økt kroppsvekten med 8 % mot slutten av dag 17, etter 7 dagers subkutan tilførsel av 10 mg/kg/dag. Dyr som ble gitt doser på 1 mg/kg/dag, hadde en økning på 6,4 % av kroppsvekten etter 12 dager, etter 7 dagers subkutan tilførsel.

Disse undersøkelser viser også at gjenvinningen av kroppsvekt er langsommere hos Fc-OB-behandlede C57-mus enn hos OB-behandlede mus under gjenvinningsperioden fra dag 7 til dag 22, etter den siste injeksjon på dag 7. Dette tyder på at Fc-OB-proteinet ikke fjernes fra kroppen så hurtig som OB-protein, noe som forårsaker den forlengede vekttapsvirkning.

Eksempel 3

Doserespons av CF7- mus behandlet med Fc- OB- fusionsprotein

Ytterligere en undersøkelse viste at det var en doserespons på kontinuerlig tilførsel av Fc-OB-protein. I denne undersøkelsen ble fete CF7-mus som veide 35-40 g, tilført rekombinant, humant Fc-OB-protein ved benyttelse av fremgangsmåter som tilsvarte dem i eksemplet ovenfor. Resultatene er beskrevet i tabell 3 nedenfor (med % tap av kroppsvekt sammenlignet med grunnlinjen, målt som ovenfor):

Som tabellen viser, førte en økning av dosen fra 0,25 mg/kg/dag til 1 mg/kg/dag til at vekttapet økte fra 4 % til 16 %. Det er også bemerkelsesverdig at dosen på 1 mg/kg/dag førte til en 16 % reduksjon av kroppsvekten på dag 5. Disse undersøkelser viste også langsom gjenvinning av vekten til 0 %, noe som tyder på at Fc-OB-proteinet ikke fjernes hurtig, noe som forårsaker den forlengede vekttapsvirkning.

Eksempel 4

Fafmkokinetikk av rekombinant, humant Fc- OB hos CD 1- mus og hunder

Denne undersøkelsen viste de farmakokinetiske egenskaper ved rekombinant, humant met-Fc-OB-protein hos CD-1-mus og hunder. Etter intravenøse eller subkutane doser på 1 mg/kg/dag ble serumkonsentrasjonen av rekombinant, humant met-Fc-OB-protein og humant met-OB-protein bestemt ved en enzymkoblet immunsorbentanalyse (ELISA).

I begge dyrearter ble en høyere eksponering kvantifisert ved høyere toppkonsentrasjoner i serum og større arealer under serumkonsentrasjonskurven (AUC) observert, sammenlignet med rekombinant, humant met-OB-protein. Fc-OB har en lavere systemisk clearance enn rekombinant, humant met-OB-protein. Dette kan ses av den lavere clearance og lengre halveringstid for Fc-OB, sammenlignet med OB-protein. Økningen i størrelse gir ikke bare økt proteinstabilitet, men også redusert utskillelse fra nyrene. Som et resultat av dette fjernes Fc-OB langsommere fra den systemiske sirkulasjon. Økningen i topptid, toppkonsentrasjon i serum og AUC for Fc-OB-protein er i samsvar med en lavere clearance. Fc-OB-protein vil gi vesentlig høyere systemisk eksponering sammenlignet med OB-protein. Resultatene er vist i tabell 4 nedenfor:

Eksempel 5

Dette eksemplet viser at tilførsel av humant, rekombinant Fc-OB-protein til normalmus som ikke er fete og som ikke har forhøyet lipidnivå i blodet, fører til reduksjon av kolesterolnivået, glukosenivået og triglyseridnivået. I tillegg viser dette eksemplet at disse nivåer forblir lave over en gjenvinningsperiode på 3 dager.

Normale CD 1-mus ble tilført rekombinant, humant Fc-OB-protein ved subkutane injeksjoner. Blodprøver ble tatt 24 timer etter dag 23, den siste injeksjonsdag. Som diskutert ovenfor, mistet dyrene vekt ved de tilførte doser. Som vist i tabell 5, hadde musene en vesentlig reduksjon av serumkolesterol, glukose og triglyserider på en doseavhengig måte, sammenlignet med kontrolldyr:

Disse verdier viser at Fc-OB-proteinet eller analoger eller derivater av dette er effektive blodlipidreduserende midler.

Eksempel 6

En fet menneskelig pasient tilføres humant Fc-OB-protein eller analog eller derivat for å oppnå vektreduksjon. Den fete pasient har også forhøyet nivå av blodlipider, heriblant forhøyet kolesterolnivå, over 200 mg/100 ml. Pasienten oppnår en tilfredsstillende vektreduksjon i løpet av Fc-OB-behandlingen. En vedlikeholdsdose av Fc-OB-protein eller analog eller derivat tilføres til den ikke-fete pasient for å opprettholde det reduserte lipidnivå i blodet, heriblant det reduserte kolesterolnivå, under 200 mg/100 ml. Den tilførte dose er ikke tilstrekkelig til å gi ytterligere vekttap. Tilførselen er kronisk. Nivået av sirkulerende Fc-OB-protein eller analog eller derivat kan følges ved benyttelse av et diagnostisk sett, f.eks. en antistoffanalyse mot OB-proteinet (eller en annen antigenkilde etter behov).

Eksempel 7

En ikke-fet human pasient gjennomgår koronar bypass-kirurgi eller annen invasiv behandling for å lette et fremskredet stadium av arterieplakkdannelse. Etter den kirurgiske behandling tilføres pasienten en vedlikeholdsdose av Fc-OB-protein eller analog eller derivat for å forhindre gjendannelse av arterieplakk. Dosen som tilføres, er ikke tilstrekkelig til å føre til vekttap. Tilførselen er kronisk. Nivået av sirkulerende Fc-OB-protein eller analog eller derivat kan følges ved å benytte et diagnostisk sett, f.eks. en antistoffanalyse mot OB-proteinet (eller en annen antigenkilde etter behov).

Eksempel 8

En ikke-fet human pasient opplever hypertensjon grunnet redusert blodstrøm fra tette arterier. Pasienten tilføres en dose av Fc-OB-protein eller en analog eller et derivat av dette, som er tilstrekkelig til å redusere arterieplakk som fører til tette arterier. Deretter kontrolleres pasienten jevnlig for ytterligere arterieplakkdannelse og hypertensjon. Dersom tilstanden dukker opp på ny, tilføres pasienten igjen en effektiv mengde Fc-OB-protein, analog eller derivat som er tilstrekkelig til å gjenopprette blodstrømmen, men samtidig ikke tilstrekkelig til å føre til vekttap. Nivået av sirkulerende Fc-OB-protein eller analog eller derivat kan følges ved benyttelse av et diagnostisk sett, f.eks. en antistoffanalyse mot Fc-OB-proteinet (eller en annen antigenkilde etter behov).

Eksempel 9

En menneskelig pasient får gallesten. Enten er det slik at gallestenene ikke fjernes og dannelse av nye gallestener søkes unngått eller gallestenene fjernes, men galleblæren forblir (som f.eks. ved bruk av laserkirurgi eller ultralydkirurgi), og dannelse av ytterligere gallestener søkes unngått. Pasienten tilføres en effektiv mengde Fc-OB-protein eller en analog eller et derivat av dette for å forhindre akkumulering av ytterligere gallestener eller gjenakkumulering av gallestener. Nivået aV sirkulerende Fc-OB-protein eller analog eller derivat kan følges ved benyttelse av et diagnostisk sett, f.eks. en antistoffanalyse mot Fc-OB-proteinet (eller en annen antigenkilde etter behov).

Eksempel 10

En diabetisk human pasient ønsker å benytte reduserte insulindoser for behandling av diabetes. Pasienten tilføres en effektiv mengde Fc-OB-protein eller en analog eller et derivat av dette, som fører til økt ikke-fettvevsmasse. Pasientens insulinfølsomhet øker, og insulindosen som er nødvendig for å lette diabetessymptomene, reduseres, enten som en reduksjon av antall enheter insulin som trengs eller som en reduksjon av antall injeksjoner av insulin som behøves pr. dag. Nivået av sirkulerende Fc-OB-protein eller analog eller derivat kan følges ved benyttelse av et diagnostisk sett, f.eks. en antistoffanalyse mot OB-proteinet (eller en annen antigenkilde etter behov).

Eksempel 11

En ikke-fet human pasient ønsker økt ikke-fettvevsmasse av terapeutiske grunner, f.eks. gjenvinning fra en sykdom som har ført til redusert ikke-fettvevsmasse. Pasienten tilføres en effektiv mengde Fc-OB-protein eller en analog eller et derivat av dette, som fører til den ønskede økning i ikke-fettvevsmasse. Økningen i ikke-fettvevsmasse følges ved DEXA-skanning. Nivået av sirkulerende Fc-OB-protein eller analog eller derivat kan følges ved benyttelse av et diagnostisk sett, f.eks. en antistoffanalyse mot OB-proteinet (eller en annen antigenkilde etter behov).

Materialer og fremgangsmåter

Dyr. Villtype-CDl-mus og (+/+)C57B16-mus ble benyttet i eksemplene ovenfor. Musenes alder ved forsøksstart var 8 uker, og dyrene hadde stabil vekt.

Forin<g> og veiing. Dyrene ble foret med oppmalt gnagerfor (PMI Feeds, Inc.) i forinnretninger for pulverisert for (Allentown Caging and Equipment), noe som tillot mer nøyaktig og følsom måling enn anvendelse av regulære forblokker. Vekten ble målt på samme tidspunkt hver dag (1400) i det ønskede tidsrom. Kroppsvekten på dagen før injeksjonen ble definert som grunnlinjevekten. De benyttede mus veide 18-22 g.

Bur. Det ble benyttet én mus pr. bur, og musene ble holdt under humane betingelser.

Tilførsel av protein eller bærerstoff. Protein (som beskrevet nedenfor) eller bærerstoff (fosfatbufret saltvann, pH 7,4) ble tilført ved subkutane injeksjoner eller intravenøst.

Kontroller. Kontrolldyrene ble injisert med bærerstoff alene, uten Fc-OB-fusjonsprotein eller OB-protein tilsatt til bærerstoffet.

Protein. SEKV.ID. NR. 1, 2 og 3 beskriver rekombinant OB-DNA og - protein fra mus (figur 1), mens SEKV.ID. NR. 4, 5 og 6 beskriver et analogt rekombinant, humant OB-DNA og -protein (figur 2). Som bemerket ovenfor, har rekombinant, humant OB-protein som i SEKV .ID. NR. 6 en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74. Videre er det rekombinante, humane protein beskrevet av Zhang et al., Nature, supra, og PCT-publikasjon WO 96/05309 (22. desember 1996) (som begge inkorporeres heri ved referanse, inklusive figurene) og de analoge rekombinante proteiner fra mus og menneske i figurene 1 og 2 illustrerende for OB-proteinet som kan benyttes ved utforming av Fc-OB-fusjonsproteinet for de foreliggende fremgangsmåter for behandling og fremstilling av et medikament. Andre OB- eller Fc-proteiner eller analoger eller derivater av disse kan også benyttes for dannelse av Fc-OB-fusjonsproteinet.

Den første aminosyren i aminosyresekvensen for rekombinant OB-protein betegnes heri som +1 og er valin, og aminosyren i posisjon -1 er metionin. Den C-terminale aminosyren er nr. 146 (cystein) (se figurene 1 og 2). Den første aminosyren i sekvensen for rekombinant, humant Fc-OB-protein i figur 3 betegnes +1 og er glutamat, og aminosyren i posisjon -1 er metionin. Den C-terminale aminosyren er nr. 378 (cystein). Den første aminosyren i sekvensen for den rekombinante, humane Fc-OB-proteinvariant i figur 4 betegnes som +1 og er glutamat, og aminosyren i posisjon -1 er metionin. Den C-terminale aminosyren er nr. 378 (cystein). Den første aminosyren i sekvensen for den rekombinante, humane Fc-OB-proteinvariant i figur 5 betegnes +1 og er asparaginsyre, og aminosyren i posisjon -1 er metionin. Den C-terminale aminosyren er nr. 373 (cystein). Den første aminosyren i sekvensen for rekombinant, human Fc-OB-proteinvariant ifølge figur 6 betegnes +1 og er asparaginsyre, og aminosyren i posisjon -1 er metionin. Den C-terminale aminosyren er nr. 373 (cystein).

Ekspresjonsvektor og vertsstamme

Den benyttede plasmidekspresjonsvektor er pAMG21 (ATCC-aksesjonsnr. 98113), som er et derivat av pCFM1656 (ATCC-aksesjonsnr. 69576) og inneholder egnede restriksjonsseter for innsetting av gener nedstrøms for /ux-PR-promoteren (se US patentskrift nr. 5 169 318 for en beskrivelse av lux-ekspresjonssystemet). Fc-OB-DNA, beskrevet nedenfor og vist i figurene 3-6, ble fremstilt og ligert inn i ekspresjonsvektor pAMG21 linearisert med restriksjonsendonukleasene Ndel og BamHI, og transformert inn i E. coli-vertsstammen FM5. E. cø/i-FM5-celler ble avledet hos Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, fra E. co/i-stamme K-12 (Bachmann et al., Bacterial. Rev., 40:116-167

(1976)) og inneholder det integrerte lambdafagrepressorgen <cl>857 (Sussman et al., CR. Acad. Sei., 254:1517-1579 (1962)). Vektorfremstilling, celletransformering og koloniseleksjon ble utført ved standard fremgangsmåter (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Vertscellene ble dyrket i LB-medium.

Fc- OB- DNA- konstruks j on

Plasmid pFc-A3 (beskrevet nedenfor) var kilden for sekvensen for tungkjede fra det humane immunglobulin IgG-1 fra aminosyre nr. 99 (Glu) til den naturlige karboksylende. Den humane IgG-1-sekvens kan erholdes fra Genebank (PO 1857).

Den humane OB-sekvens er beskrevet ovenfor og av Zhang et al., Nature, supra, og PCT-publikasjon WO 96/05309, som begge inkorporeres heri ved referanse, innbefattet figurene. OB-DNA ble ligert inn i ekspresjonsvektoren pCFM1656 linearisert med restriksjonsendonukleasene Xbal og BamHI ved benyttelse av standard kloningsprosedyrer, se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Plasmid pCFM1656 inneholdende OB-DNA-sekvensen fungerte som sekvenskilde for det rekombinante, humane OB-gen.

Den genetiske sammenkobling mellom disse to sekvenser ble utført ved PCR-overlappsforlengelsesfremgangsmåten (Ho, S.N. et al., Site Directed Mutagenesis By Overlap Extension Using The Polymerase Chain Reaction, Gene, 77:51-59 (1989)). PCR-produktet ble kuttet med restriksjonsendonukleasen Ndel, slik at det ble dannet en 5' klebrig ende, og med restriksjonsendonukleasen BamHI for dannelse av en 3' klebrig ende. Vektoren pAMG21 ble kuttet på tilsvarende måte. En ligering ble utført mellom fusjonsfragmentet og den lineariserte vektor. Ligert DNA ble transformert ved elektroforering inn i E. co//-vertsstammen. Kloner som overlevde på agarplater for kanamycinseleksjon (50 |ig/ml) ble kontrollert for ekspresjon av protein av Fc-OB-størrelse. Plasmid fra enkeltkloner ble isolert og sekvensen av det kodende området bekreftet.

Dersom ytterligere modifikasjoner av Fc-OB-genet var ønsket, ble PCR-teknikken igjen benyttet for utforming av endringene. To sett med endringer ble utført i aminoenden av Fc-delen av fusjonsproteinet (SEKV.ID. NR. 9) for dannelse av variantene SEKV.ID. NR. 12 og 15. En annen variant ble konstruert for innføring av fire aminosyreendringer som fjerner Fc-reseptorbindingssetet (leucin i posisjon 15 erstattet med glutamat) og komplement(Clq)bindingssetet (glutamat i posisjon 98 erstattet med alanin, lysin i posisjon 100 erstattet med alanin og lysin i posisjon 102 erstattet med alanin (se Xin Xiao Zheng et al., J. Immunol., 754:5590-5600 (1995)). Templatet for denne konstruksjon var SEKV.ID. NR. 15, og den resulterende variant var SEKV.ID. NR. 18.

pFc- A3- vektorkonstruksjon

Et plasmid, pFc-A3, som inneholdt området som koder for Fc-delen av tungkjeden i humant immunglobulin IgG-1 (se Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res., 70:4071-4079 (1982)) fra den første aminosyre Glu-99 i hengseldomenet til karboksylendenpluss et 5'-NotI-fusjonssete og 3-SalI- ogXbal-seter ble fremstilt ved PCR-amplifisering av det humane milt-cDNA-bibliotek. PCR-reaksjonene var i et sluttvolum på 100 fil og benyttet 2 enheter Vent-DNA-polymerase i 20 mM Tris-HC1 (pH 8,8), 10 mM KC1,10 mM (NH4)2S04,2 mM MgS04,0,1 % Triton X-100 med 400 ul av hvert dNTP og 1 ng av cDNA-biblioteket som skulle amplifiseres, sammen med 1 uM av hver primer. Reaksjonene ble startet med en denaturering ved 95 °C i 2 minutter, fulgt av 30 sykluser bestående av 95 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 73 °C i 2 minutter. 5'-primeren innførte et Notl-sete like 5' for den første aminosyrerest (Glu-99) i hengseldomenet i IgG-1. 3-primeren innførte Sall-og Xbal-seter. PCR-produktet på 717 basepar ble kuttet med Noti og Sali, det resulterende DNA-fragment ble isolert ved elektroforese i 1 % agarose, renset og klonet inn i Noti- og Sall-kuttet pBluescript II KS-vektor (Stratagene). Innskuddet i det resulterende plasmid, pFc-A3, ble sekvensert for å bekrefte PCR-reaksjonens nøyaktighet.

Fremgangsmåter for fremstilling

Fremgangsmåtene nedenfor for fremstilling er blitt benyttet for

fremstilling av biologisk aktivt, rekombinant metionyl-OB-protein fra mus eller det analoge humane OB-protein, samt Fc-OB-fusjonsproteiner. Tilsvarende fremgangsmåter kan benyttes for fremstilling av biologisk aktivt humant metionyl-OB-protein.

Fermenteringsprosess

En "batch"-fermenteringsprosess ble benyttet. Sammensetningen av mediene beskrives nedenfor.

En porsjon av mediet som hovedsakelig besto av nitrogenkilder, ble sterilisert (ved å heve temperaturen til 120-123 °C i 25-30 minutter) i fermenteringskammeret. Etter avkjøling ble karbonkilder, magnesiumkilder, fosfatkilder og spormetallkilder tilsatt aseptisk. En over natt-kultur på 500 ml (dyrket i LB-brygg) av den ovenfor beskrevne bakterie som produserer rekombinant museprotein, ble tilsatt til fermentoren. Da kulturens optiske tetthet (målt ved 600 nm som et mål på celletetthet) nådde 15-25 absorpsjonsenheter, ble en autoinduserløsning (0,5 mg/ml homoserinlakton) tilsatt (1 ml/l) til kulturen for induksjon av rekombinant genekspresjon. Fermenteringsprosessen fikk fortsette i ytterligere 10-16 timer, fulgt av høsting av brygget ved sentrifugering.

Mediumsammensetning:

Rensingsprosess for humant Fc- OB- fusjonsprotein

Rensing av humant Fc-OB-fusjonsprotein ble oppnådd ved trinnene nedenfor (dersom ikke annet er angitt, ble de påfølgende trinn utført ved 4 °C). Rensing av OB-protein fra mus og menneske er beskrevet i PCT-publikasjon WO 96/05309, supra, som inkorporeres heri ved referanse. 1. Cellegrøt. E. cø/i-cellegrøt ble suspendert i et fem gangers volum av destillert vann. Cellene i vannet ble ytterligere oppbrutt ved to gangers passasje gjennom en mikrofluidisator. De knuste cellene ble sentrifugert ved 4200 rpm i 1 time i en Beckman JB-6-sentrifuge med en J5-4.2-rotor. 2. Vask av inklusjonslegemer. Supernatanten fra trinnet ovenfor ble fjernet, og nedsentrifugert materiale ble resuspendert i 5 volumer destillert vann. Blandingen ble sentrifugert som i trinn 1. 3. Solubilisering. Nedsentrifugert materiale ble solubilisert med 10 volumer 50 mM tris, pH 8,5, 8 M guanidinhydroklorid, 10 mM ditiotreitol og omrørt i 1 time ved romtemperatur. Løsningen ble justert til 40 mM cystamindihydroklorid og omrørt i 1 time. 4. Løsningen fra trinn 3 tilsettes til 20-30 volumer av følgende gjenfoldingsløsning: 50 mM Tris, pH 8,5, 0,8 M arginin, 2 M urea og 4 mM cystein. Gjenfoldingsblandingen omrøres i 16 timer ved 8 °C. 5. Bufferutbyttingi Løsningen fra trinn 4 konsentreres og diafiltreres over i 10 mM Tris, pH 8,5. 6. Syreutfelling. Løsningen fra trinn 5 justeres til pH 4,75 med 50 % iseddik og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur. Løsningen filtreres. 7. Kationbytterkromatografi. Løsningen fra trinn 6 justeres til pH 7,0 og påsettes en CM-Sepharose Fast Flow-kolonne ved 10 °C. En gradient på 20 kolonnevolumer benyttes i 10 mM fosfat, pH 7,0, og fra 0 til 0,1 M NaCl. 8. Anionbytterkromatografi. Porsjonen eluert fra CM-søylen i trinn 7 fortynnes fem ganger med 5 mM Tris, pH 7,5, og påsettes en Q-Sepharose Fast Flow-kolonne ved 10 °C. En gradient på 20 kolonnevolumer benyttes i 10 mM Tris, pH 7,5, og fra 0 til 0,2 M NaCl. 9. Hydrofob interåksjonskromatografi. Porsjonen fra Q-Sepharose justeres til 0,75 M ammoniumsulfat og påsettes en metyl-Macroprep-hydrofob interaksjonskolonne ved romtemperatur. En gradient på 20 kolonnevolumer benyttes i 10 mM fosfat, pH 7,0, og fra 0,75 M til 0 M ammoniumsulfat. 10. Bufferutbytting. Porsjonen fra trinn 9 konsentreres etter behov og dialyseres mot PBS-buffer.

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet ut fra foretrukne utførelser, bør det forstås at varianter og modifikasjoner vil være åpenbare for fagfolk. Det er derfor ment at de vedlagte krav skal dekke alle slike ekvivalente variasjoner som ligger innenfor oppfinnelsens område ifølge kravene.

Claims

1. Protein med en formel utvalgt fra gruppen bestående av: Rj - R2 og Rj -L-R2, karakterisert ved at Ri er et Fc-protein, R2 er et OB-protein og L er en linker, og hvori OB-proteinet er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 3 eller SEKV. ID. NR.: 6, (b) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 6 med en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74, (c) aminosyresekvensen fra undergruppe (b) som har en forskjellig aminosyre substituert i én eller flere av de følgende posisjoner (ved anvendelse av nummerering ifølge SEKV. ID. NR.: 6): 4, 8,32, 33, 35,48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100,102,105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145, (d) aminosyresekvensen av undergruppe (a), (b) eller (c) som om ønskelig mangler en glutaminylrest i posisjon 28, (e) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b), (c) eller (d) med en metionylrest i den N-terminale ende, (f) et avkortet OB-protein utvalgt blant: (anvendelse av nummerering i SEKV. ID. NR.: 6 med en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74): (i) aminosyrene 98-146 (ii) aminosyrene 1-32 (iii) aminosyrene 40-116 (iv) aminosyrene 1-99 og 112-146 (v) aminosyrene 1-99 og 112-146 med én eller flere av aminosyrene 100-111 plassert etter hverandre mellom aminosyre 99 og 112, og (vi) det avkortede OB-protein av undergruppe (f) (i) med én eller flere av aminosyrene 100, 102, 105,106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145 substituert med en annen aminosyre, (vii) det avkortede protein av undergruppe (f) (ii) med én eller flere av aminosyrene 4, 8 og 32 substituert med en annen aminosyre, (viii) det avkortede protein av undergruppe (f) (iii) med én eller flere av aminosyrene 50, 53, 60,64,66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 og 112 erstattet med en annen aminosyre, (ix) det avkortede protein av undergruppe (f) (iv) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35,48, 50, 53,60, 64, 66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre, (x) det avkortede protein av undergruppe (f) (v) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136,138,142 og 145 erstattet med en annen aminosyre, (xi) det avkortede protein av undergruppene (f) (i)-(x) med en N-terminal metionylrest, (g) OB-proteinet eller en analog av enhver av undergruppene (a) til (f) omfattende en kjemisk rest forbundet til proteinresten, hvori nevnte, kjemiske rest er en vannløselig polymerrest, (h) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymerrest er polyetylenglykol, (i) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymer er en polyaminosyrerest, og (j) et derivat av undergruppe (g) hvori nevnte, vannløselige polymerrest er bundet kun i den N-terminale ende av nevnte proteinrest.

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at linkeren er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) ala-ala-ala; (b) ala-ala-ala-ala; (c) ala-ala-ala-ala-ala; (d) gly-gly; (e) gly-giy-gly; (f) gly-gly-gly-gly-gly; (g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly-gly-pro-gly-gly, og (j) enhver kombinasjon av undergruppene (a)-(i).

3. Nukleinsyresekvens som koder for et protein som har en formel utvalgt fra gruppen bestående av: R] - R2 og Ri - L - R2, karakterisert ved at Ri er et Fc-protein, R2 er et OB-protein og L er en linker, og hvori OB-proteinet er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) aminosyresekvensen 1-46 som vist i SEKV. ID. NR.: 3 eller SEKV. ID. NR.: 6, (b) aminosyresekvensen 1-146 som vist i SEKV. ID. NR.: 6 med en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74, (c) aminosyresekvensen av undergruppe (b) som har en forskjellig aminosyre substituert i én eller flere av følgende posisjoner (ved anvendelse av nummereringen ifølge SEKV. ID. NR.: 6): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66,67, 68, 71, 74, 77,78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107,108,111,112,118,136,138, 142 og 145, (d) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b) eller (c) som om ønskelig mangler en glutaminylrest i posisjon 28, (e) aminosyresekvensen av undergruppene (a), (b), (c) eller (d) som har en metionylrest i den N-terminale ende, og (f) et avkortet OB-protein utvalgt blant: (anvendelse av nummereringen i SEKV. ID. NR.: 6 med en lysinrest i posisjon 35 og en isoleucinrest i posisjon 74): (i) aminosyrene 98-146, (ii) aminosyrene 1-32, (iii) aminosyrene 40-116, (iv) aminosyrene 1-99 og 112-146, (v) aminosyrene 1-99 og 112-146 med én eller flere av aminosyrene 100-111 etter hverandre plassert mellom aminosyrene 99 og 112, og (vi) det avkortede OB-protein av undergruppe (f) (i) med én eller flere av aminosyrene 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118,136,138,142 og 145 substituert med en annen aminosyre, (vii) det avkortede protein av undergruppe (f) (ii) med én eller flere av aminosyrene 4, 8 og 32 substituert med en annen aminosyre, (viii) det avkortede protein av undergruppe (f) (iii) med én eller flere av aminosyrene 50, 53,60, 64, 66, 67, 68, 71, 74,77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107 108, 111 og 112 erstattet med en annen aminosyre, (ix) det avkortede protein av undergruppe (f) (iv) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71,74, 77, 78, 89, 97,112,118, 136, 138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre, (x) det avkortede protein av undergruppe (f) (v) med én eller flere av aminosyrene 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64,66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 og 145 erstattet med en annen aminosyre, og (xi) det avkortede protein av undergruppene (f) (i)-(x) med en N-terminal metionylrest.

4. Nukleinsyresekvens ifølge krav 3, karakterisert ved at den koder for et protein med en linker utvalgt fra gruppen bestående av: (a) ala-ala-ala; (b) ala-ala-ala-ala; (c) ala-ala-ala-ala-ala; (d) gly-gly; (e) gly-giy-gly; (f) gly-gly-gly-gly-gly; (g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-giy; (h) gly-pro-gly; (i) gly-gly-pro-gly-gly; og (j) enhver kombinasjon av undergruppene (a)-(i).

5. Vektor, karakterisert ved at den inneholder en nukleinsyresekvens ifølge krav 3.

6. Vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at vektoren er p AMG21, og at nukleinsyresekvensen er ifølge krav 3.

7. Prokaryot eller eukaryot vertscelle, karakterisert ved at den inneholder vektoren ifølge krav 5.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter dyrking under egnede betingelser av vertscellen ifølge krav 7, og isolering av det fremstilte protein.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den videre omfatter rensing av det fremstilte protein.

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder en effektiv mengde av et protein ifølge krav 1 i et farmasøytisk aksepterbart fortynningsmiddel, en adjuvans eller et bærerstoff.

11. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av proteinet ifølge krav 1, for fremstilling av et terapeutisk preparat for behandling av en forstyrrelse utvalgt fra gruppen bestående av overvekt, diabetes, høyt lipidnivå i blodet, arteriosklerose, arterieplakk, reduksjon eller forebyggelse av gallestendannelse, utilstrekkelig ikke-fettvevsmasse, utilstrekkelig følsomhet overfor insulin, og slag.