HU227088B1

HU227088B1 - Ob fusion protein compositions and process for producing thereof

Info

Publication number: HU227088B1
Application number: HU0000302A
Authority: HU
Inventors: Randy Ira Hecht; Michael Benjamin Mann
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2010-06-28
Also published as: KR20000069617A; SK287578B6; PT954588E; EP0954588A1; HUP0000302A3; CA2275183A1; NO992779L; BR9713755A; JP4659068B2; NO325096B1; AR059907A2; NO992779D0; JP2001512417A; BG64288B1; CZ9902036A3; JP2008289487A; PL194159B1; HUP0000302A2; KR100937550B1; NO20071415L

Description

A találmány területe

A jelen találmány F_C-OB fúziós proteinkészítményekkel és előállítási eljárásukkal, valamint a fúziós proteinek alkalmazásával kapcsolatos.

A találmány háttere

Bár az elhízottság molekuláris alapjai széleskörűen ismertek, az „OB gének” és a kódolt proteinek („OB protein” vagy „leptin”) azonosítása némi fényt derített arra a mechanizmusra, amit a test használ a testzsír raktárainak szabályozására. Lásd a WO 96/05309 (96/12/22) számú PCT közzétételt, Friedman et al.; Zhang et al., Natúré 372:425-432 (1994); lásd még a Nature-ben megjelent helyesbítést 374:479 (1995). Az OB protein aktív in vivő ob/ob mutáns egerekben (az OB géntermék termelésében bekövetkezett defekt miatt elhízott egerek), valamint normál vad típusú egerekben is. A biológiai aktivitás többek között a súlyvesztésben manifesztálódik. Lásd általánosságban Barrinaga, „Obese Protein Slims Mice, Science 269:475-456 (1995). Az OB protein és származékok, valamint ezen állatok, ideértve az embert is, esetében való testsúly és túlzott elhízás szabályozó modulátorokként való használata, nagyobb részletességgel került leírásra a WO 96/05309 (96/12/22) számú PCT közzétételben, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak, ideértve az ábrákat is.

Az OB protein egyéb biológiai hatásait még nem jellemezték túl jól. Ismert például, hogy ob/ob egerekben az OB protein alkalmazása széruminzulinszint- és szérumglükózszint-csökkenést okoz. Az is ismert, hogy az OB protein alkalmazása testzsírcsökkenést eredményez. Ezt megfigyelték ob/ob mutáns egerekben, valamint nem elhízott, normál egerekben is. Pelleymunter et al., Science 269:540-543, (1995); Halaas et al., Science 269:543-546 (1995). Lásd még Campfield et al., Science 269:546-549 (1995). (Az OB protein mikrogramm mennyiségeinek perifériás és központi alkalmazása csökkentette a táplálékbevitelt és a testsúlyt ob/ob és étrend indukálta elhízott egerekben db/db egerekben azonban nem.) Ezen beszámolók egyikében sem számoltak be arról, hogy toxicitást figyeltek volna meg, akár a legmagasabb dózisokban.

Az OB protein klinikai alkalmazásának ígéretei ellenére, az OB protein működési módja in vivő még mindig nem világos. Az OB receptorral kapcsolatos adatok azt mutatják, hogy az OB protein erős kötési affinitást mutat, amit patkányhipotalamuszban detektáltak, mely OB receptor elhelyezkedést jelez. Stephens et al., Natúré 377:530-532. A db/db egér az ob/ob egér fenotípusával azonos fenotípust mutat, azaz rendkívüli elhízást és ll-es típusú diabéteszt; ez a fenotípus a hibás OB receptornak köszönhető az elképzelések szerint, különösen miután a db/db egerek nem reagálnak az OB protein alkalmazásra. Lásd Stephens et al., lásd fent.

A rekombináns DNS technológiák előnyeivel a rekombináns proteinek terápiás használathoz való elérhetősége előnyt jelent a proteinképződésben és a kémiai módosításban. Az ilyen módosítás egyik célja a protein védelme és csökkent lebontása. A fúziós proteinek és a kémiai kapcsolódások hatékonyan blokkolhatnak egy proteolitikus enzimet a protein gerinccel való fizikai kontaktusban és így megakadályozhatják a lebomlást. Az egyéb előnyök közé tartoznak bizonyos körülmények között a stabilitás fokozódása, a keringési idő növekedése és a terápiás protein biológiai aktivitásának fokozódása. Áttekintő ismertetést ad a proteinmódosításról és a fúziós proteinekről Francis, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992, május) (a Mediscript adta ki, Mountview Court, Friern Barnet lane, London N20, OLD, UK).

Egy ilyen módosítást jelent az immunoglobulinok F_crégiójának használata. Az antitestek két funkcionálisan független részből állnak, egy változó doménből, mely „Fab”-ként ismert, ez az antigént köti és egy állandó doménből, mely „F_c”-ként ismert és mely a kapcsolatot biztosítja az „effector” funkciókhoz, mint például a komplement vagy fagocita sejtekhez. Egy immunoglobulin F_c része hosszú plazmafelezési idővel rendelkezik, míg a Fab rövid életű. Capon et al., Natúré 337:525-531 (1989).

Terápiás protein termékeket hoztak létre F_c dómén felhasználásával a hosszabb felezési idő biztosítása céljából vagy olyan funkciók beépítéséhez, mint például az F_c receptor kötődés, az A protein kötés, a komplement rögzítés és a placentatranszferálás, melyek mind az immunoglobulin F_c proteinjének köszönhetők. Például, az lgG1 F_c régióját a CD30-L N-terminális végéhez fuzionáltatták (ez egy olyan molekula, mely a Hodgkin-betegség tumorsejtjein, az anaplasztikus limfómasejteken, a T-sejt leukémia sejteken és más rosszindulatú sejttípusokon expresszálódó CD30 receptorokat köti). Lásd az 5480981 számú US szabadalmi bejelentést. Az IL-10-et, egy gyulladás elleni és kilökődés elleni anyag, a patkány/egér (murine) F_c/2a-hoz fuzionáltatták, hogy fokozzák a citokin rövid keringő felezési idejét. Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154:5590-5600 (1995). A jelentésekben értékelik a tumor nekrózis faktor receptor használatát, mely a humán lgG1 F_c proteinjéhez kapcsolódik, a szeptikus sokkot szenvedett betegek kezelésében. Fisher, C., et al., N. Engl. J. Med. 334:1697-1702 (1996); Van Zee, K., et al., The Journal of Immunology 156:2221-2230 (1996). Az F_c-t fuzionáltatták CD4 receptorral is, hogy egy az AIDS kezelésére való terápiás proteint hozzanak létre. Lásd Capon et. al., Natúré, 337:525-531 (1989). Ezenkívül, az interleukin 2 N-terminusát is fuzionáltatták az IgG 1 vagy lgG3 F_c részéhez, hogy legyőzzék az interleukin 2 rövid felezési idejét és szisztémás toxicitását. Lásd, Harvill et al., Immunotechnology, 1:95-105 (1995).

Az OB protein, mint ígéretes terápiás protein azonosításának köszönhetően igény van OB analóg készítmények klinikai alkalmazásokhoz való kifejlesztésére az OB protein alkalmazással együtt vagy helyett. Egy ilyen fejlesztés magában foglalná az OB analóg készítményeket, ahol a proteinkészítmények és kémiai módosítások proteinlebontás-csökkentést, fokozott stabilitást és fokozott keringési időt eredményeznének. A jelen találmány ilyen készítményeket biztosít.

HU 227 088 Β1

A találmány összefoglalása

A jelen találmány F_C-OB fúziós proteinkészítményekkel, az ilyen készítmények előállítási módszereivel és ezek használatával kapcsolatos. Részletesen a jelen találmány egy genetikai fúziós proteinnel kapcsolatos, mely immunoglobulinok F_c régióját vagy analógjait tartalmazzák az OB protein vagy analógok N-terminális részéhez fuzionálva. Az F_C-OB fúziós protein képes dimerizálálódni az F_c régió ciszteinmaradékain keresztül. Váratlan módon, az F_c-vel való genetikai fúziós módosítás az OB protein-N-terminális végén előnyt mutat a stabilitásban, a kiürülési arányban és a csökkent lebontásban, melyek nem tapasztalhatók az OB proteinnel kapcsolatban vagy az OB protein C-terminusához fuzionált F_c-vel kapcsolatban. Meglepő módon, nagyon fontos, hogy az N-terminális módosítás váratlan proteinvédelmet biztosít a lebontással szemben, megnöveli a keringési időt, fokozza a stabilitást, amikor összehasonlítjuk az OB proteinnel, vagy az OB protein C-terminusán végrehajtott F_c módosításokkal. Az OB protein F_c módosításának ilyen váratlan tulajdonságai előnyt jelentenek az OB fogyasztóknak olyan szempontból, hogy ezek a változások kisebb dózisszükségletet vagy kevésbé gyakori alkalmazást eredményeznek. így ahogy azt a későbbiekben részletesebben leírtuk, a jelen találmány számos aspektussal rendelkezik, melyek a protein genetikai módosításával kapcsolatosak az OB proteinhez (vagy ennek analógjaihoz) való F_c régió fúzióján keresztül, valamint a specifikus módosításokkal, ezek előállításával és alkalmazási módszereivel.

Ennek megfelelően az egyik aspektusban a jelen találmány egy F_C-OB fúziós proteint biztosít, melyben az F_c genetikailag fuzionált az OB protein (vagy analógjainak) N-terminusához. Ezenkívül, az F_c rész kapcsolható az OB protein (vagy analógjainak) N-terminusához is peptid vagy kémiai linkereken keresztül, amint az a tudomány e területén ismert. Amint fent említettük és a későbbiekben részletesen leírjuk, az F_C-OB fúziós protein váratlan védelmet biztosít a lebontással szemben és fokozza a keringési időt és a stabilitást ha az OB proteinhez vagya C-terminális OB-F_C fúziós proteinekhez hasonlítjuk. A jelen találmány további aspektusai ezért magukban foglalják nem csupán az F_C-OB fúziós proteinkészítményeket, hanem az ilyen proteineket kódoló DNS-szekvenciákat is, a rokon vektorokat és az ilyen vektorokat tartalmazó gazdasejteket, melyek mindegyike a jelen találmány fúziós proteinjeinek ellőállításában használhatók.

Egy második aspektusban a jelen találmány az F_C-OB fúziós protein előállítását biztosítja. Az ilyen módszerek közé tartoznak a rekombináns proteinek előállítására szolgáló rekombináns DNS-technikák. Ezenkívül, az ilyen aspektusok közé tartoznak a fermentációs módszerek, valamint a tisztítás.

Egy másik aspektusban a jelen találmány humán alany vagy állat esetében a súlyfelesleg kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására szolgáló módszert biztosít, ideértve a zsírraktározás módosítását F_C-OB fúziós proteinek alkalmazásával. Az F_C-OB fúziós protein tulajdonságainak köszönhetően olyan gyógyszereket tervezünk, melyek csökkentik az OB protein dózisainak mennyiségét és/vagy alkalmazásának gyakoriságát azáltal, hogy F_C-OB tömegcsökkentő anyagot használunk.

Egy megint más aspektusban a jelen találmány a túlzott kövérséggel kapcsolatos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítását célozza. Ezek közé tartoznak az olyan betegségek mint a diabétesz, a disz- vagy hiperlipidémia, az artériás szklerózis, az artériás plakk, az epekőképződés csökkenése vagy megakadályozása, a stroke, valamint az inzulinérzékenységben bekövetkező növekedés és/vagy a sovány szövet mennyiségének növekedése.

Egy másik aspektusban a jelen találmány ide vonatkozó, F_C-OB fúziós proteinekből, ezek analógjaiból és származékaiból álló gyógyszerészeti készítményeket is biztosít a fent említett terápiákhoz.

A rajzok rövid leírása

1. ábra: A rekombináns patkány/egér (murine) metOB (kétszálú) DNS (1. és 2. számú szekvencia) és aminosavszekvencia (3. számú szekvencia).

2. ábra: A rekombináns humán metOB analóg (kétszálú) DNS (4. és 5. számú szekvenciák) és aminosavszekvencia (6. számú szekvencia).

3A-3C. ábra: A rekombináns humán metF_c-OB (kétszálú) DNS (7. és 8. számú szekvenciák) és aminosavszekvencia (9. számú szekvencia).

4A-4C. ábra: A rekombináns humán metF_c-OB variáns (kétszálú) DNS (10. és 11. számú szekvenciák) és aminosavszekvencia (12. számú szekvencia).

5A-5C. ábra: A rekombináns humán metF_c-OB variáns (kétszálú) DNS (13. és 14. számú szekvenciák) és aminosavszekvencia (15. számú szekvencia).

6A-6C. ábra: A rekombináns humán metF_c-OB variáns (kétszálú) DNS (16. és 17. számú szekvenciák) és aminosavszekvencia (18. számú szekvencia).

A találmány részletes leírása A jelen találmány F_C-OB fúziós proteinkészítményekkel kapcsolatos, az ilyen készítmények előállítási módszereivel, valamint azok használatával. Részletesebben, a jelen találmány az immunoglobulinok F_c régiójának OB protein-N-terminális részéhez való genetikai vagy kémiai fúziójával kapcsolatos. Váratlan módon, az F_c OB protein N-terminusához való fúziója olyan előnyöket demonstrál, melyek az OB protein vagy az OB protein C-terminális részéhez kapcsolt F_cfúzió esetében nem tapasztalhatók. Meglepő módon, az N-terminálisan módosított F_C-OB fúziós protein váratlan proteinvédelmet biztosít a lebontással szemben, növeli a keringési időt és fokozza a stabilitást. Ennek megfelelően, az F_C-OB fúziós protein, ezek analógjai

HU 227 088 Β1 vagy származékai, valamint az ezekkel kapcsolatos alkalmazási és előállítási módszerek az alábbiakban kerülnek részletesen leírásra.

Készítmények

A 9. számú szekvenciáben megadott (lásd a 3. ábrát) rekombináns humán F_C-OB szekvencia F_c szekvenciája szelektálható a humán immunoglobulin lgG-1 nehéz láncból (lásd Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Rés. 10:4071 -4079 (1982), vagy bármely más, a tudomány e területén ismert F_c szekvenciából (például más IgG osztályokból, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül az lgG-2-t, az lgG-3-at és az lgG-4-et, vagy más immunoglobulinokat). Az F_c rész variánsa, analógjai vagy származékai megszerkeszthetők például maradékok vagy szekvenciák különböző helyettesítéseivel.

A ciszteinmaradékok kihagyhatók vagy más aminosavakkal helyettesíthetők az F_c szekvenciák diszulfid keresztkötéseinek megakadályozása céljából. Nevezetesen, a 9. számú szekvencia 5 pozíciójában levő aminosav egy ciszteinmaradék. A 9. számú szekvencia rekombináns F_C-OB szekvenciája egy 378 aminosavból álló F_C-OB protein (nem számoljuk a metioninmaradékot). A 3. ábra rekombináns F_C-OB proteinjéhez való első aminosavszekvenciára +1 -ként hivatkozunk a metioninnal a -1 pozícióban.

Az 5. pozícióban levő ciszteinmaradék eltávolítható vagy egy vagy több aminosavval helyettesíthető. Egy alaninmaradék helyezhető a 6. pozícióban levő ciszteinmaradék helyére, ez adja a 4. ábra variáns aminosavszekvenciáját (12. számú szekvencia). A 4. ábra rekombináns F_C-OB proteinje egy 378 aminosavból álló F_C-OB protein (nem számoljuk a metioninmaradékot). A 4. ábra rekombináns F_C-OB proteinjéhez való első aminosavszekvenciára +1-ként hivatkozunk a metioninnal a -1 pozícióban.

Hasonlóképpen, a 9. számú szekvencia 5. pozíciójában levő cisztein szerinnel vagy más aminosavmaradékkal helyettesíthető vagy deléciónak vethető alá. Egy variáns vagy analóg hozható létre az 1., 2., 3., 4. és 5. pozíciókban levő aminosavak deléciójával, amilyen például a 15. számú szekvenciában bemutatott variáns (lásd az 5. ábrát). Szubsztitúciók is alkalmazhatók ezeknél a pozícióknál és ezek is részét képezik a találmánynak. Az 5. ábra rekombináns F_C-OB proteinje egy 373 aminosavból álló F_C-OB protein (nem számoljuk a metioninmaradékot). Az 5. ábra rekombináns F_C-OB proteinjéhez való első aminosavszekvenciára +1 -ként hivatkozunk a metioninnal a -1 pozícióban.

A módosítások megvalósíthatók úgy is, hogy 4 aminosav helyettesítést alkalmazunk az F_c receptor kötő hely és a komplementer (C1 q) kötő hely eltávolítására. A 15. számú szekvencia ezen variáns módosításai magukban foglalnák a 15. pozícióban glutaminnal helyettesített leucint, a 98. pozícióban alaninnal helyettesített glutamint, és a 100. és 102. pozíciókban alaninnal helyettesített lizínt (lásd a 6. ábrát, 18. számú szekvencia). A 6. ábra rekombináns F_C-OB proteinje egy 373 aminosavból álló F_C-OB protein (nem számoljuk a metioninmaradékot). A 6. ábra rekombináns F_C-OB proteinjéhez való első aminosavszekvenciára +1-ként hivatkozunk a metioninnal a -1 pozícióban.

Hasonlóképpen, egy vagy több tirozinmaradék helyettesíthető fenil-alanin-maradékokkal. Ezenkívül, más variáns aminosav inzertációk, deléciók és/vagy szubsztitúciók is tervezhetők, és ezek is a jelen találmány körébe tartoznak. Ezenkívül, a változások lehetnek megváltozott aminosavak formájában, mint például peptidomimetikus vagy D-aminosavak formájában. Az F_c protein kapcsolható az F_C-OB protein OB proteinjéhez „kötő” egységekkel (linkerekkel) akár kémiai módon, akár különböző hosszúságú aminosavakkal. Az ilyen kémiai linkerek jól ismertek a tudomány e területén. Az aminosav kötő szekvenciák az ezekre való korlátozás nélkül magukban foglalhatják a következőket:

(a) ala, ala, ala;

(b) ala, ala, ala, ala;

(c) ala, ala, ala, ala, ala;

(d) gly, gly;

(e) gly, gly, gly;

(f) giy, giy, giy, gly, gly;

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly;

(h) gly-pro-gly;

(I) gly, gly, pro, gly, gly;

(j) az (a)-(i) alrészek bármilyen kombinációját

Az F_C-OB fúziós protein OB része szelektálható a 3. számú szekvenciában bemutatott rekombináns patkány/egér (murine) szekvenciából, vagy rekombináns humán proteinből, amint azt Zhang et al., bemutatták (Natúré, lásd fent, a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak) vagy melyekből hiányzik a 28. pozícióban levő glutaminil (lásd Zhang et al., Natúré, lásd fent, page:428). Használható a rekombináns humán OB protein analóg is, amit a 6. számú szekvenciában mutatunk be (lásd a 2. ábrát), mely tartalmaz: (1) a 35. pozícióban levő lizin helyett egy arginint; és (2) a 74. pozícióban levő izoleucin helyett egy leucint. (Ezen analóg rövidített leírása az R->L³⁵, l->L³⁵). A rekombináns humán és rekombináns patkány/egér (murine) proteinek vagy analógok aminosavszekvenciái az OB protein N-terminusához fuzionált F_c-vel vagy F_c nélkül az alábbiakban kerül bemutatásra egy metionilmaradékkal a -1-es pozícióban; azonban, mint bármely jelen OB protein és analóg esetében a metionilmaradék hiányozhat is.

A patkány/egér (murine) protein lényegében homológ a humán proteinnel, különösen az érett protein, és ezenkívül, különösen az N-terminusnál. Készíthető úgy rekombináns humán proteinanalóg, hogy megváltoztatjuk (például aminosavmaradékok helyettesítésével) a rekombináns humán szekvenciában, azokat az aminosavakat, melyek a patkány/egér (murine) szekvenciából származnak. Mivel a rekombináns humán protein biológiailag aktív egerekben is, egy ilyen analóg valószínűleg emberekben is aktív lenne. Például, egy olyan humán proteint használva, melyben a 35. pozícióban egy lizinmaradék és a 74-es pozícióban egy izoleucinmaradék van a 6. számú szekvencia számozásának megfelelően, melyben az első aminosav a valin, és a 146. pozícióban levő aminosav cisztein, a 32., 35., 50.,

64., 68., 71., 74., 77., 89., 97., 100., 105., 106., 107.,

HU 227 088 Β1

108., 111., 118., 136., 138., 142., és 145. pozíciókban egy vagy több aminosav más aminosavra cserélhető. Szelektálható a patkány/egér (murine) protein megfelelő pozíciójában levő aminosav (3. számú szekvencia), vagy más aminosav.

Előállíthatok „konszenzus molekulák is, melyek a patkány OB proteinszekvenciára alapulnak. [Murakami et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 209:944-952 (1995), mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak]. A patkány OB protein a humán OB proteintől a következő pozíciókban tér el: (a 6. számú szekvenciában használt számozás szerint) 4., 32., 33., 35, 50, 68., 71-, 74-, 77., 78., 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, és 145. Ezekben az eltérő pozíciókban levő aminosavakban egy vagy több aminosav más aminosavakra cserélhető. Az aláhúzott pozíciók azok, melyekben a patkány/egér (murine) OB protein, valamint a patkány OB protein eltér a humán OB proteintől és így különösen alkalmas a megváltoztatáshoz. Egy vagy több pozícióban kicserélhető egy aminosav a megfelelő patkány OB proteinből vagy egy másik aminosavból.

A patkány és a patkány/egér (murine) OB protein azon pozíciói, melyek eltérnek az érett humán OB protein pozícióitól a következők: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106,

107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, és 145. A 6. számú szekvenciának megfelelően egy olyan OB protein, melyben a fenti aminosavak közül egyet vagy többet másik aminosawal helyettesítettünk, mint például a megfelelő patkány vagy patkány/egér (murine) szekvenciában talált aminosawal, szintén hatékony lehet.

Ezenkívül, a rhesusmajom OB proteinjében talált aminosavak közül az alábbiak térnek el az érett humán OB protein aminosavjaitól (az aminosavat a zárójelben egy betűs aminosavjelöléssel adjuk meg): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D), és 118 (L). Mivel a rekombináns humán OB protein aktív a cynomolgus majmokban is egy humán OB protein, a 6. számú szekvenciának megfelelően (a 35. pozícióban egy lizin és a 74. pozícióban egy izoleucin van), melyben a rhesusmajom eltérő aminosava közül egyet vagy többet más aminosavakkal helyettesítünk, mint például a zárójelben levő aminosavakkal, hatékony lehet. Meg kell jegyezni, hogy bizonyos rhesusmajom eltérő aminosavak szintén megtalálhatók a fenti patkány/egér (murine) fajokban (35, 68, 89, 100 és 112 pozíciók). így előállítható egy patkány/egér (murine)/rhesus/humán konszenzus molekula, melyben (6. számú szekvencia számozását használva, melyben a 35. pozícióban egy lizin és a 74. pozícióban egy izoleucin van) a következőkben megadott pozíciókban levő aminosavak közül egyet vagy többet más aminosavakkal helyettesítünk: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107,

108, 111,112, 118, 136, 138, 142, és 145.

Más analógok is előállíthatok oly módon, hogy az aminosavszekvencia egy részét delécióval eltávolítjuk. Például, az érett proteinből hiányzik egy vezető szekvencia (-22—1). Előállíthatok a következő csonkított humán OB proteinmolekulák is (a 6. számú szekvencia számozását használva):

(a) 98-146 aminosavak (b) 1-32 aminosavak (c) 40-116 aminosavak (d) 1-99 és (csatlakozva) 112-146 aminosavak (e) 1-99 és (csatlakozva) 112-146 aminosavak, melyek a 100-111 aminosavak közül egyet vagy többet tartalmaznak, egymás után a 99 és 112 aminosavak után helyezve.

Ezenkívül, a csonkított formák tartalmazhatnak egy vagy több megváltoztatott aminosavat, melyek eltérnek [a patkány, a patkány/egér (murine) vagy a rhesus OB proteinben] a humán OB proteintől. Ezenkívül bármely változások lehetnek megváltoztatott aminosavak formájában, mint például peptidiomimetikus vagy D-aminosav formájában.

Ennek megfelelően, a jelen találmány magában foglalja az olyan F_C-OB fúziós proteint is, melyben az OB proteint a következőkből szelektáljuk:

(a) az alábbiakban a 3. vagy a 6. számú szekvenciában bemutatott 1-146 aminosavszekvencia;

(b) a 6. szekvenciában bemutatott 1-146 aminosavszekvencia, melyben a 35. pozícióban egy lizinmaradék, a 74. pozícióban egy izoleucinmaradék található;

(c) A (b) alrész aminosavszekvenciája, melyben egy eltérő aminosavat helyettesítünk a következő pozíciókban (a 6. szekvenciában bemutatott számozás szerint, és akkor is megtartjuk ugyanazt a számozást, ha hiányzik egy glutaminilmaradék a 28. pozícióban): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71,74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 és 145;

(d) az (a), (b) vagy (c) alrészek aminosavszekvenciájából tetszés szerint hiányzik egy glutaminilmaradék a 28. pozícióban;

(e) az (a), (b), (c) vagy (d) alrészek aminosavszekvenciájában egy metionilmaradék van az N-terminusnál;

(f) egy csonkított OB proteinanalógot szelektálunk az alábbiak közül (a 6. számú szekvenciában megadott számozást használva):

(i) 98-146 aminosavak (ii) 1-32 aminosavak (iii) 40-116 aminosavak (iv) 1-99 és 112-146 aminosavak (v) 1-99 és 112-146 aminosavak, melyek a 100-111 aminosavak közül egyet vagy többet tartalmaznak, egymás után a 99 és 112 aminosavak után helyezve; és (vi) az (i) alrész csonkított OB analógja, melyben a 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 és 145 aminosavak közül egyet vagy többet egy másik aminosawal helyettesítünk;

(vii) a (ii) alrész csonkított analógja, melyben a 4, 8. és 32 aminosavak közül egyet vagy többet egy másik aminosawal helyettesítünk;

HU 227 088 Β1 (viii) a (iii) alrész csonkított analógja, melyben az

50., 53., 60., 64., 66., 67., 68., 71., 74., 77., 78.,

89., 97., 100., 102., 105., 106., 107., 108., 111 és 112 aminosavak közül egyet vagy többet egy másik aminosavval helyettesítünk;

(ix) a (iv) alrész csonkított analógja, melyben a 4.,

8., 32., 33., 35., 48., 50., 53., 60., 64., 66., 67.,

68., 71., 74., 77., 78., 89., 97., 112., 118., 136.,

138., 142 és 145 aminosavak közül egyet vagy többet egy másik aminosavval helyettesítünk;

(x) az (v) alrész csonkított analógja, melyben a 4.,

32., 33., 35., 50., 64., 68., 71., 74., 77., 78., 89.,

97., 100., 102., 105., 106., 107., 108., 111.,

118., 136., 138., 142 és 145 aminosavak közül egyet vagy többet egy másik aminosavval helyettesítünk;

(xi) az (i)-(x) alrész csonkított analógja, egy N-terminális metionilmaradékot tartalmaz;

(g) az (a)-(f) alrészek bármelyikének OB proteinje vagy analóg származéka egy a protein egységhez kapcsolódó kémiai egységet tartalmaz;

(h) a (g) alrész származéka, melyben az említett kémiai egység egy vízoldható polimer egységet jelent;

(i) a (h) alrész származéka, melyben az említett vízoldható polimer egység polietilénglikolt jelent;

(j) a (h) alrész származéka, melyben az említett vízoldható polimer egység egy poliaminosav egységet jelent; és (k) a (h)-(j) alrész származéka, melyben az említett egység egyedül az említett protein N-terminusnál kapcsolódik; és (l) az (a)-(k) alrész egy OB proteinje, analógja vagy származéka egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban van.

Származékok

A jelen F_C-OB proteineket (a találmányban „protein” kifejezés magában foglalja a „peptid”-et, az F_c-t, OB-t vagy analógokat, amint azokra infra utalunk, hacsak másként nem jelezzük) úgy származtatjuk, hogy egy vagy több kémiai egységet kapcsolunk az F_C-OB fúziós protein egységhez. Ezek a kémiailag módosított származékok tovább formulázhatók az intraarteriális, intraperitoneális, intramuscularis, subcutan, intravénás, orális, nazális, pulmonáris, topikális vagy más alkalmazási módokhoz, amint azt az alábbiakban bemutatjuk. A biológiailag aktív proteinek kémiai módosítását úgy találtuk, hogy további előnyöket biztosít bizonyos körülmények között, például növeli a stabilitást és a terápiás protein keringési idejét és csökkenti a immunogenitást. Lásd, 4,179,337 számú US szabadalmi bejelentést Davis et al., 1997 dec. 18-án adták közzé. Áttekintésként lásd Abuchowski et al., in: Enzymes as Drugs [J. S. Holcerberg and J. Roberts eds. pp. 367-383 (1981)]; Francis et al., lásd fent.

Az ilyen származtatáshoz megfelelő kémiai egységek különböző vízoldható polimerek közül választhatók. A választott polimer vízoldható kell legyen, hogy a protein, melyhez kapcsolódik ne csapódjon ki vizes környezetben, például fiziológiai környezetben. Előnyösen, a végtermék készítmény terápiás használatához a polimer gyógyszerészetileg elfogadható kell legyen. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember képes lesz kiválasztani a kívánt polimert az olyan szempontok alapján, hogy a polimer/protein konjugátumot terápiásán használják-e fel, és ha igen, a kívánt dózis, keringési idő, proteolízissei szembeni ellenállás és más szempontok alapján. A jelen proteinekhez és peptidekhez a származtatás hatékonysága megállapítható a származék kívánt formában (azaz ozmotikus pumpával, vagy még előnyösebben, injekcióval vagy infúzióval, vagy egyéb orális, pulmonáris vagy nazális bejuttatáshoz) való alkalmazásával és a biológiai hatás itt leírtak alapján végzett megfigyelésével.

A vízoldható polimer szelektálható olyan csoportból, mely a következőket foglalja magában, például polietilénglikol, az etilénglikol/propilénglikol kopolimerei, a karboxi-metil-cellulóz, dextrán, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon), poli-1,3-dioxolán, poli-1,3,6-trioxán, etilén/maleinsavanhidrid kopolimer, poliaminosavak (akár a homopolimerek, akár a random polimerek) és a dextrán vagy poli(n-vinil-pirrolidon) polietilénglikol, propilénglikol homopolimerek, polioxi-etilált poliolok és poli(vinil-alkohol). A polietilénglikol propionaldehid előnyöket jelenthet a gyártás során vízben való stabilitásának köszönhetően. A szukcinát és a sztirén szintén felhasználhatók.

Az F_C-OB fúziós proteinek előállításához használt OB vagy F_c proteinek előállíthatok úgy, hogy poliaminosavakat vagy elágazási pont aminosavakat kapcsolunk az F_c vagy OB protein (vagy analóg) egységhez. Például, a poliaminosav lehet egy további hordozó protein, mely mint a jelen találmány OB proteinjéhez vagy OB analógjához fuzionált F_c azt a célt szolgálja, hogy növelje a protein keringési felezési idejét azokon az előnyökön túl, melyeket a fenti F_C-OB fúziós proteinnel elértünk. A jelen találmány jelen terápiás vagy kozmetikai céljaira az ilyen poliaminosavak azok kell legyenek, melyek rendelkeznek vagy nem képeznek semlegesítő antigenikus választ vagy más kedvezőtlen válaszokat. Az ilyen poliaminosavak választhatók a szérumalbumint (például a humán szérumalbumint), egy további antitestet vagy annak egy részét (például az F_c régió) vagy más polimalnosavakat, például a lizineket magában foglaló csoportból. Amint azt az alábbiakban jelezzük, a poliaminosav kapcsolódásának lokációja lehet az F_C-OB protein egység N-terminusánál vagy C-terminusánál, vagy a kettő között más helyen, és kapcsolható egy kémiai „kötő” egységen (linker) keresztül az F_C-OB proteinhez.

A polimer lehet bármilyen molekulasúlyú és lehet elágazó és elágazás nélküli. A polietilénglikolhoz az előnyben részesített molekulasúly körülbelül 2 kDa és körülbelül 100 kDa között van (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy a polietilénglikol-készítményekben néhány molekula nagyobb súlyú, néhány molekula kisebb súlyú, mint a megadott molekulasúly) a használat és előállítás megkönnyítése céljából. Más méretek is alkalmazhatók a kívánt terápiás profiltól függően (például a fenntartott felszabadulás kívánt időtartama, a hatá6

HU 227 088 Β1 sok, az esetleges biológiai hatások, a kezelés kényelmessége, a polietilénglikol terápiás proteinnel vagy analóggal szembeni antigenitása és más ismert hatásainak mértéke vagy hiánya).

Az ily módon kapcsolt polimer molekulák száma változó a tudomány e területén átlagosan képzett szakember képes lesz meghatározni a funkcióra kifejtett hatást. Biztosítható monoszármazék, vagy biztosítható egy di-, tri-, tetra- vagy a származtatás néhány kombinációja ugyanazzal vagy eltérő kémiai egységekkel (például polimerek, mint például a különböző molekulasúlyú polietilénglikolok). A polimer molekulák proteinekhez (vagy peptidhez) való részaránya változó, ahogy változó a reakcióelegyben való koncentrációjuk is. Általában az optimális arányt (a reakció hatékonyságában kifejezve, olyan értelemben, hogy nincs felesleges nem reagált protein vagy polimer) olyan tényezőkkel határozzuk meg, mint a származtatás kívánt foka (például mono-, di-, tri- stb.) a választott polimer molekulasúlya, az, hogy a polimer elágazó vagy elágazás nélküli és a reakció körülményei.

A kémiai egységek úgy kell a proteinhez kapcsolódjanak, hogy figyelembe vesszük a protein funkcionális vagy antigén doménjeire kifejtett hatásokat. Számos kapcsolási módszer áll rendelkezésre a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára. Például, EP 0 401 384, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak (a PEG G-CSF-hez való kapcsolása), lásd még Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (tresil klorid használatával a GM-CSF pegilálásáról számol be). Például, a polietilénglikol kovalensen kapcsolható aminosavmaradékokon keresztül egy reakcióképes csoporttal, mint például egy szabad amino- vagy karboxilcsoporttal. A reakcióképes csoportok azok, melyekhez egy aktivált polietilénglikol-molekula kapcsolható. Egy szabad aminocsoporttal rendelkező aminosavmaradék magában foglalhatja a lizinmaradékot és az N-terminális aminosavmaradékot. Azok melyek egy szabad karboxilcsoportot tartalmaznak az aszparaginsavmaradékokat, a glutaminsavmaradékokat és a C-terminális aminosavmaradékokat foglalják magukba. Szulfhidrilcsoportok szintén felhasználhatók reakcióképes csoportként a polietilénglikol-molekula(ák) kapcsolásához. Terápiás célokra az előnyben részesített kapcsolás egy aminocsoportnál történik, mint például az N-terminusnál vagy a lizincsoportnál. A receptorkötődésben fontos maradékoknál való kapcsolás kerülendő ha a receptorkötődés kívánatos.

Specifikusan kívánatos lehet az N-terminálisan, kémiailag módosított F_C-OB fúziós proteinek létrehozása. A polietilénglikol használatával, a jelen készítmények illusztrálásaként, egy sor polietilénglikol-molekula (molekulatömeg alapján, elágazás szerint stb.), a polietilénglikol-molekulák protein- (vagy peptid-) molekulához való részaránya a reakciókeverékben, az elvégzendő pegilálási reakció típusa és a szelektált N-terminálisan pegilált protein kinyerési módszere közül lehet választani. Az N-terminálisan pegilált készítmény kinyerési módszere (azaz, ezen egység szeparálása más monopegilált egységektől, szükség esetén) megvalósítható az N-terminálisan pegilált anyag pegilált proteinmolekulák populációjától való tisztításával. Szelektív N-terminális kémiai módosítás is elvégezhető reduktív alkilezéssel, mely egy adott proteinben a származtatáshoz rendelkezésre álló különböző típusú primer aminocsoportok eltérő reakciókészségét használja ki (lizin versus N-terminális). A megfelelő reakciókörülmények között lényegében a protein szelektív származtatás valósítható meg az N-terminusnál egy karboxilcsoportot tartalmazó polimerrel. Például, szelektíven, N-terminálisan pegilálható a protein ha a reakciót olyan pH-értéken végezzük el, mely lehetővé teszi hogy kihasználjuk a lizinmaradékok ε-aminocsoportja és a protein-N-terminális α-aminocsoportja közötti pK_a differenciák előnyét. Ilyen szelektív származtatással egy vízoldható polimer proteinhez való kapcsolása szabályozható: a polimerrel való konjugáció zömében a protein-N-terminális végén megy végbe és más reakcióképes csoportok, mint például a lizinoldallánc aminocsoportok szignifikáns módosulása nem következik be. Reduktív alkilezést használva a vízoldható polimer lehet bármely fent leírt típus és rendelkeznie kell egy egyedüli reakcióképes aldehiddel a proteinhez való kapcsolódáshoz. A polietilénglikol propionaldehid, mely egy egyedüli reakcióképes aldehidet tartalmaz, szintén használható.

Egy N-terminálisan monopegilált származék előnyben részesül egy terápiás anyag kényelmes előállításához. Az N-terminális pegilálás egy homogén terméket biztosít, mivel a termék jellemzése leegyszerűsödik a di-, tri- vagy többszörösen pegilált termékekhez képest. A fenti, egy N-terminális termék előállítására szolgáló, reakcióképes alkilezési folyamat előnyben részesül a kereskedelmi célú gyártás kényelmessége miatt.

Komplexek

Az F_C-OB fúziós protein, ezek analógja vagy származéka alkalmazható egy kötőkészítményhez való komplexálás után. Az ilyen kötőkészítmények még tovább hosszabbíthatják azt a keringési időt, amit az F_C-OB fúziós proteinnel analóggal vagy származékkal értünk el. Az ilyen készítmény lehet egy protein (vagy szinonimként peptid). Egy kötőproteinre példa az OB proteinreceptor vagy annak egy része, mint például annak egy vízoldható része. Más kötőproteinek meghatározhatók az OB protein vagy a szérumban levő F_C-OB protein vizsgálatával, vagy a kötődés meglétének empirikus szkrínelésével. A használt kötőproteinek tipikusan nem akadályozzák meg az OB protein, az F_C-OB fúziós proteinek, analógjaik vagy származékaik azon képességét, hogy kötődjenek az endogén OB proteinreceptorhoz és/vagy hatással legyenek a jeltranszdukcióra.

Gyógyszerészeti készítmények

A jelen találmány az F_C-OB fúziós proteinek és származékaik gyógyszerészeti készítményeinek használati módszereit is biztosítja. Az ilyen gyógyszerészeti készítmények alkalmazhatók injekciókhoz, vagy orális, pulmonáris, nazális, transzdermális vagy más alkalma7

HU 227 088 Β1 zási formákban. Általánosságban a jelen találmány magában foglalja azokat a gyógyszerészeti készítményeket, melyek a protein vagy a jelen találmány származékának hatékony mennyiségeit tartalmazza egy gyógyszerészetileg elfogadható hígítóval, tartósítószerrel, oldhatóvá tevő anyaggal, emulgeálószerrel, hatásjavítóval és/vagy hordozókkal. Az ilyen készítmények közé tartoznak a különböző puffertartalmú hígítószerek (például a Tris-HCI, az acetát, a foszfát) a pH és ionerősség; adalék anyagok, mint például a detergensek és oldhatóvá tevő anyagok (például a Tween 80, Polysorbate 80), antioxidánsok (például az aszkorbinsav, nátrium-metabiszulfit), tartósítószerek (például Thimersol, benzil-alkohol) és a tömeget adó anyagok (például a laktóz, a mannitol); az anyag polimer vegyületű részecske készítménybe, mint például politejsav, poliglikolsav stb. való beépítése, vagy liposzómákba való beépítése. A hialuroinsav szintén használható, és ez elősegítheti a keringésben eltöltött idő megnövelését. Az ilyen készítmények hatással lehetnek a fizikai állapotra, a stabilitásra, az in vivő felszabadulási sebességre és a jelen proteinek és származékaik in vivő kiürülési sebességére. Lásd például Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), pp 1435-1712, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. A készítmények előállíthatok folyadék formában vagy lehetnek szárított por alakjában, például liofilezett formában. A beültethető fenntartott felszabadulású készítmények szintén a találmány részét képezik, ilyenek a transzdermális készítmények.

Figyelembe vesszük a találmányban való alkalmazáshoz az orális, szilárd dózis formákat, melyek általánosságban a Remington’s Pharmaceutical Sciencesben kerültek leírásra [18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), 89. fejezet; mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak]. A szilárd dózis formák közé tartoznak a tabletták, a kapszulák, a pirulák, a pasztillák vagy a szögletes tabletták, a kapszulák vagy a pelletek. A liposzómás vagy proteinoid kapszulázások szintén felhasználhatók a jelen készítmények formulázásához (mint például a proteinoid mikroszférák, melyekről a 4,925,673 számú US szabadalmi bejelentésben számoltak be). A liposzómás bekapszulázás is használható és a liposzómák származtathatók különböző polimerekkel (például 5,013,556 számú US szabadalmi bejelentés). A terápiás célokhoz való lehetséges szilárd dózis formák leírását Marshall, K. adta meg a Modern Pharmaceutics c. munkában (Es. G. S. Bankerand C. T. Rhodes, Chapter 10. 1979., mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak). Általánosságban a készítmény F_C-OB fúziós proteint (analógot vagy származékot) és inért alkotórészt tartalmaz, mely lehetővé teszi a gyomor környezetével szembeni védelmet, valamint felszabadítja a biológiailag aktív anyagot a bélben.

Specifikusan foglalkozunk a fentiek szerint származtatott proteinek orális dózis formáival. A F_C-OB fúziós protein módosítható kémiailag oly módon, hogy a származék orális bejuttatása hatékony legyen. Általánosságban a tervezett kémiai módosítás legalább egy egység a protein- (vagy peptid-) molekulához való kapcsolását jelenti, ahol az említett egység lehetővé teszi (a) a proteolízis gátlását; és (b) a véráramba való felvételt a gyomorból vagy bélből. Kívánatos a protein teljes stabilitásának fokozása is, valamint a testben való keringési idő növelése. Az ilyen egységekre való példák közé tartoznak: a polietilénglikol, az etilénglikol és a propilénglikol kopolimerei, a karboxi-metil-cellulóz, a dextrán, a poli(vinil-alkohol), a poli(vinil-pirrolidon) és a polipropilén. Abuchowski and Davis, Soluble PolymerEnzyme Adducts. In: „Enzymes as Drugs”, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY, (1981), pp. 367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-198 (1982). Más felhasználható polimerek közé tartoznak a poli-1,3-dioxolán és a poli-1,3,6trioxan. A gyógyszerészeti készítményhez előnyben részesülnek, ahogy azt a fentiekben jeleztük, a polietilénglikol egységek.

Az F_C-OB fúziós proteinhez, analóghoz vagy származékhoz a felszabadulási hely lehet a gyomor, a vékonybél [például a duodenum, az éhbél (jejunum) vagy a csípőbél (ileum)j vagy a vastagbél. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára elérhető készítmények állnak rendelkezésre, melyek nem olvadnak fel a gyomorban, mégis felszabadítják a duodenumban vagy a bél más szakaszában levő anyagot. Előnyösen, a felszabadulás elkerüli a gyomor környezetének káros hatásait, vagy úgy, hogy védi az F_C-OB fúziós proteint, analógot vagy származékot vagy úgy, hogy felszabadítja a biológiailag aktív anyagot a gyomor környezetén kívül, például a bélben.

A teljes gasztrikus rezisztencia biztosításához egy legalább 5,0 pH-értékig áthatolhatatlan borítás lényeges. A leggyakoribb inért alkotórészekre - melyek belső borításként használhatók - példák a cellulóz-acetát-trimellitát (CAT), a hidroxi-propil-metil-cellulóz-ftalát (HPMCP), a HPMCP 50, HPMCP 55, a polivinil-acetátftalát (PVAT), Eudragit L30D, az aquateric, a cellulózacetát-ftalát (CAP), az Eudragit L, Eudragit S és a Shellac. Ezek a borítások kevert filmekként használhatók.

Egy borítás vagy borítások keveréke felhasználható tablettákon, melyeket nem szándékszunk a gyomor ellen védeni. Ezek közé tartozhatnak a cukros borítások vagy az olyanok, melyek megkönnyítik a tabletta lenyelését. A kapszulák állhatnak kemény héjból (mint például zselatinból) a száraz terápiás anyag, azaz a por, bejuttatásához; folyadék formához lágy zselatin használható. A kapszulák anyaga lehet vastag keményítő vagy más ehető anyag. A pirulákhoz, szögletes tablettákhoz, az öntött tablettákhoz, vagy tablettapépekhez nedves tömörítő technikák használhatók.

A terápiás anyag finom multirészecskékként, például 1 mm-es részecskeméretű granulum vagy pellet formájában lehet a készítményben. Az anyag formátuma a kapszulás alkalmazáshoz lehet por is, enyhén préselt tömés vagy akár tabletta. A terápiás anyag elkészíthető préseléssel is.

Színanyagok és ízesítőanyagok is adhatók hozzá.

Például a protein (vagy származéka) formulázható

HU 227 088 Β1 (mint például liposzómával vagy mikroszféra bekapszulázással), majd a továbbiakban egy ehető termékbe helyezhető, például színezéket és ízanyagot tartalmazó hűtött italba.

A terápiás anyag hígítható, vagy térfogata növelhető egy inért anyaggal. Ezek a hígítószerek magukban foglalhatják a szénhidrátokat, különösen a mannitolt, α-laktózt, vízmentes laktózt, a cellulózt, a szacharózt és a módosított dextránokat és a keményítőt. Bizonyos szervetlen sók szintén felhasználhatók töltőanyagokként, ideértve a kalcium-trifoszfátot, a magnézium-karbonátot és a nátrium-kloridot. Néhány a kereskedelemben is beszerezhető hígítószer a Fast-Flo, az Emdex, a STA-Rx 1500, az Emcompress és az Avicell.

Diszintegránsok is szerepelhetnek a terápiás anyag készítményében a szilárd dózis formában. A diszintegránsként használt anyagok az ezekre való korlátozás nélkül magukban foglalhatják a keményítőt, ideértve a kereskedelemben kapható, keményítőalapú Explotab diszintegránst. A nátrium-keményítő-glikolát, az Amberlite, a nátrium-karboxi-metil-cellulóz, az ultramilopektin, a nátrium-alginát, a zselatin, a narancshéj, a savas karboxi-metil-cellulóz, a természetes szivacs és a bentonit is felhasználhatók. A diszintegránsok másik formája az oldhatatlan kation cserés gyanták. A porított gumik is felhasználhatók diszintegránsokként és kötőanyagként és ezek közé tartozhatnak a porított gumiszerű anyagok, mint például az agar, a Karaya vagy a tragantmézga. Az alginsav és ennek nátriumsója szintén hasznos diszintegráns.

A kötőanyagok arra használhatók, hogy együtt tartsák a terápiás anyagot, hogy kemény tablettát képezzen, és természetes anyagokból származó anyagokat foglalnak magukban, mint például az akáciát, a tragantmézgát, a keményítőt és a zselatint. Mások a metilcellulózt (MC), az etil-cellulózt (EC) és a karboxi-metilcellulózt (CMC) foglalják magukba. A poli(vinil-pirrolidon) (PVP) és a hidroxi-metil-cellulóz (HPMC) szintén felhasználható alkoholos oldatokban a terápiás anyag granulálásához.

Egy antifrikciós anyag is használható a terápiás készítményben a formulázási folyamat során a tapadás gátlására. Síkosítószerek is használhatók a terápiás anyag és az alakmás fala közötti rétegként és ezek az ezekre való korlátozás nélkül a következőket foglalhatják magukba: sztearinsavat, ideértve magnézium és kalcium sóit, a politetrafluoroetilént (PTFE), a folyékony paraffint, növényi olajokat és viaszokat. Az oldható síkosítószerek szintén felhasználhatók, ilyenek a nátrium-lauril-szulfát, a magnézium-lauril-szulfát, a különböző molekulasúlyú polietilénglikol, a Carbovax 4000 és 6000.

A készítményhez adhatók olyan csúszást elősegítő anyagok, melyek javítják a szer folyási tulajdonságait a formulázás során és elősegítik a préselés alatti újrarendeződést. A csúszást elősegítő szerek közé tartoznak a keményítő, a talkum, a pirogén szilika és a hidráit szilikoaluminát.

A terápiás anyag vizes környezetben való felolvadásának elősegítése céljából felületaktív anyag adható nedvesítőszerként. A felületaktív anyagok közé tartozhatnak az anionos detergensek, mint például a nátrium-lauril-szulfát, a dioktil-nátrium-szulfoszukcinát és a dioktil-nátrium-szulfonát. A kationos detergensek is használhatók, és ezek közé tartozhatnak a benzalkónium-klorid, vagy a benzetómium-klorid. A készítményben felületaktív anyagként felhasználható potenciális nemionos detergensek listája magában foglalja a lauromacrogol 400-at, a polioxil 40 sztearátot, a polietilén hidrogénéit kasztor olaj 10-et, 50-et és 60-at, a glicerolmonosztrearátot, a poliszorbát 40-et, 60-at, 65-öt és 80-at, a szacharóz-zsírsav-észtert, a metil-cellulózt és a karboxi-metil-cellulózt. Ezek a felületaktív anyagok jelen lehetnek a protein vagy származéka készítményében akár magukban, akár különböző arányokban keverékekben.

A protein (vagy származék) felvételét potenciálisan fokozó adalék anyagok például a zsírsavak, olajsav, lenolajsav és linolénsav.

Szabályozott felszabadulású készítményre is szükség lehet. A gyógyszer egy inért mátrixba építhető, mely vagy diffúzióval vagy kimosódási mechnaizmus révén teszi lehetővé a kiszabadulást, ilyenek például a gumik. Lassan lebomló mátrixok is felhasználhatók a készítményben, például alginátok, poliszacharidok. Az ezen terápiás anyag szabályozott felszabadulásának másik formája egy olyan módszerrel valósítható meg, mely az Oros terápiás rendszerre épül (Alza Corp.), azaz, a gyógyszert egy féligáteresztő membránba zárjuk, mely lehetővé teszi, hogy a víz belépjen és a gyógyszert egy egyedüli kis nyíláson át nyomja ki az ozmotikus hatások következtében. Néhány enterikus (bélben oldódó) bevonat szintén késleltetett felszabadulási hatással rendelkezik.

Más bevonatok is használhatók a készítményhez. Ezek közé tartozik számos cukor, melyek felhasználhatók a drazsírozóüstben. A terápiás anyag adható filmborítású tablettában is, és ilyen esetben az alkalmazott anyagok két csoportba oszthatók. Az első a nem enterikus anyagok csoportja, ezek közé tartoznak a metil-cellulóz, az etil-cellulóz, a hidroxi-etil-cellulóz, a metil-hidroxi-etil-cellulóz, a hidroxi-propil-cellulóz, a hídroxi-propil-metil-cellulóz, a nátrium-karboxi-metilcellulóz, a providon és a polietilénglikolok. A második csoport az enterikus anyagokból áll, ezek általában a ftálsav észterei.

Anyagok keveréke is használható az optimális filmbevonat biztosításához. A filmbevonat megvalósítható egy üstburkolóban vagy folyadékágyban vagy kompressziós borítással.

A találmányban figyelembe vesszük a jelen protein (vagy származék) pulmonáris bejuttatását is. A proteint (vagy származékot) emlősök tüdejébe juttatjuk, míg a belégzés és a tüdő epitel borítása mentén történő mozgás a véráramba juttatja azt. (Más erről beszámoló jelentések közé tartoznak az Adjei et al., Pharmaceutical Research 7:565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (leuprolid acetát); Braquet et al., Journal of cardiovascular Pharmacology 13: (suppl. 5): s. 143-146 (1989) (endothe9

HU 227 088 Β1 lin-1); Hubbard et al., Annals of Internál Medicine 3:206-212 (1989) (cd-antitripszin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (α-1-proteináz); Oswein et al., „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (rekombináns humán növekedési hormon); Debs et al., The Journal of Immunology 140:3482-3488 (1988) (interferon-γ és tumor nekrózis faktor a) és Platz et al., 5.284.656 számú US szabadalmi bejelentés (granulocita telep stimuláló faktor).

A jelen találmány használatában a terápiás termékek pulmonáris bejuttatáshoz tervezett mechanikai eszközök széles skáláját tervezzük, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a porlasztókészülékeket, a kimért dózisú inhalálókat, a porinhalálókat, melyek mindegyike ismerős a tudomány e területén képzett szakember számára.

A jelen találmány alkalmazásához megfelelő, a kereskedelemben beszerezhető készülékek néhány specifikus példája az Ultravent porlasztókészülék, melyet a Mallinckrodt, Inc. készít (St. Louis, Missouri; azAcorn II porlasztókészülék, melyet a Marquest Medical Products (Englewood, Colorado) gyárt; a Ventolin kimért dózisú inhaláló, melyet a Glaxo Inc., (Research Triangle Park, North Carolina) gyárt és a Spinhaler porinhaláló, melyet a Fisons Corp., (Bedford, Massachusetts) gyárt.

Az összes ilyen készülék a protein (vagy analóg vagy származék) kiadagolásához alkalmas készítmények alkalmazását teszi szükségessé. Tipikusan minden egyes készítmény specifikus az alkalmazott készülékre és magában foglalhatja a megfelelő hajtóanyag alkalmazását a terápia során hasznos hígítószeren, hatásjavítón és/vagy hordozóanyagon kívül.

A protein (vagy származék) legelőnyösebben részecske formában készül, melynek átlagos részecskemérete 10 μΜ-nél (vagy mikronnál) kisebb, legelőnyösebben 0,5-5 μίτι a tüdő távoli részeihez való leghatékonyabb bejuttatáshoz.

A hordozók közé tartoznak a szénhidrátok, mint például a trehalóz, a mannit, a xilit, a szacharóz, a laktóz és a szorbit. A készítményekben használható egyéb alkotórészek közé tartoznak a DPPC, a DOPE, a DSPC és a DOPC. Természetes vagy szintetikus felületaktív anyagok is használhatók. Polietilénglikol is használható (még a protein vagy analóg származtatásától függetlenül). Dextránok, mint például a ciklodextrán is alkalmazható. Az epesók és más rokon hatásjavítók is alkalmazhatók. A cellulóz és cellulózszármazékok is felhasználhatók. Aminosavak is alkalmazhatók, például pufferkészítményben.

Tervezzük a liposzómák, mikrokapszulák vagy mikroszférák, inklúziós komplexek vagy más hordozótípusok használatát is.

A porlasztókészülékes - akár kilövellő, akár ultraszonikus - alkalmazáshoz való készítmények tipikusan F_C-OB proteint, analógokat vagy származékokat tartalmaznak, vízben feloldva 0,1-25 mg biológiailag aktív protein/mL oldat koncentrációban. A készítmény tartalmazhat puffért és egy egyszerű cukrot (például a protein stabilizálásához és az ozmotikus nyomás szabályozásához) is. A porlasztókészülékhez való készítmény tartalmazhat felületaktív anyagot is, a protein felület indukálta aggregációjának csökkentése vagy megelőzése céljából, amit a képződött aeroszolban az oldat atomizációja okoz.

A kimért dózisú inhalálóval történő alkalmazáshoz való készítmény általában finoman eloszlatott port tartalmaz, melyben benne van a felületaktív anyag segítségével a hajtóanyagban szuszpendált protein (vagy a származék). A hajtóanyag lehet bármilyen hagyományosan erre a célra alkalmazott anyag, például klorofluorokarbon, egy hidrokloro-fluorokarbon, egy hidrofluorokarbon vagy egy szénhidrogén, ideértve a trikloro-fluoro-metánt, a dikloro-difluoro-metánt, a diklorotetrafluoro-metanolt és az 1,1,1,2-tetrafluoro-etánt vagy ezek kombinációit. A megfelelő felületakítv anyagok közé tartoznak a szorbitán-trioleát és a szójalecitin. Az olajsav is hasznos felületaktív anyag lehet.

A porinhalálóból való eloszlatáshoz való készítmények finoman eloszlatott száraz port tartalmazó proteint (vagy származékot) tartalmaznak és magukban foglalhatnak egy tömeget adó anyagot, például laktózt, szorbitot, szacharózt, mannitot, trehalózt, vagy xilózt olyan mennyiségben, mely elősegíti a készülékből a por eloszlatását, például a készítmény 50-90 súlyszázaléknyi részét.

A protein (vagy analóg vagy származék) nazális bejuttatását szintén tervezzük. A nazális bejuttatás lehetővé teszi, hogy a terápiás anyag orrba való juttatása után a protein azonnal a véráramba lépjen, anélkül, hogy a terméknek a tüdőben le kellene rakódnia. A nazális bejuttatáshoz való készítmények magukban foglalják a dextránt vagy ciklodextránt tartalmazó készítményeket. A más nyálkahártyán keresztül történő bejuttatást is tervezzük.

Adagolás

A tudomány e területén képzett szakember képes lesz megállapítani a hatékony dózist oly módon, hogy alkalmazza és figyeli a kívánt terápiás hatást. Az OB protein-N-terminális módosításának köszönhetően a jelen találmány nem várt proteinvédelmet biztosít a lebomlással szemben és megnöveli a keringési időt és stabilitást, ha az OB proteinnel vagy az OB protein C-terminális módosításával hasonlítjuk össze. A tudomány e területén képzett szakember ezért képes lesz megállapítani ezen változásokból, hogy a hatékony dózishoz kevesebb dózis vagy kevésbé gyakori alkalmazás szükséges.

Előnyösen, a molekula készítménye olyan, hogy 0,10 pg/kg/nap és 10 mg/kg/nap közötti mennyiség fogja eredményezni a kívánt terápiás hatást. A hatékony dózisokat egy idő után diagnosztikai eszközök használatával lehet megállapítani. Például a vérben (vagy plazmában vagy szérumban) levő OB protein vagy F_C-OB fúziós protein mennyiségének meghatározásához való diagnosztikai eljárást először a protein endogén szintjeinek meghatározásához használhatjuk. Az ilyen diagnosztikai eszközök lehetnek antitestvizs10

HU 227 088 Β1 gálát tornájában, például antitest szendvics vizsgálat formájában. Először meghatározzuk az endogén OB protein mennyiségét és meghatározzuk az alapértéket. A terápiás dózisokat az endogén és az exogén (azaz a testen belül talált - akár saját termelésű, akár adagolt protein, analóg vagy származék) OB protein vagy F_C-OB fúziós protein mennyiségi meghatározásával állapítjuk meg és végig folytatjuk a terápia során. A terápia során tehát a dózisok változhatnak, esetleg kezdetben viszonylag magas dózist használunk, míg a terápiás előnyöket megtapasztaljuk és alacsonyabb dózisokat a terápiás előny fenntartása érdekében.

Ideális esetben olyan esetekben, amikor csak a vér lipidszintjeinek csökkentése a cél, amikor a vér lipidszintjei csökkentésének fenntartása a cél vagy amikor a sovány testtömeg növelése a cél, a dózis nem lesz elegendő a súlycsökkenés eléréséhez. így egy elhízott személy terápiájának elején olyan dózisok alkalmazhatók, melyekkel súlycsökkenés és ezzel együtt járó vérlipidszint-csökkenés vagy ezzel együtt járó zsírosszövet-csökkenés/soványtömeg-növekedés érhető el. Ha egyszer sikerül elérni az elegendő súlycsökkenést az ismételt súlygyarapodás megakadályozásához elegendő, azonban a kívánt vérlipidszintek vagy soványtömeg-növekedés fenntartásához (vagy a soványtömegcsökkenés megakadályozásához) elegendő dózis alkalmazható. Ezek a dózisok empirikusan határozhatók meg, mivel az OB vagy F_C-OB protein hatása reverzibilis [például Campfield et al., Science 269:546-549 (1995) 547]. így ha a súlycsökkenést eredményező dózist figyelünk meg amikor súlycsökkenésre nincs szükség kisebb dózis alkalmazandó a kívánt vérlipidszintek, vagy a soványszövettömeg-növelés eléréséhez és a kívánt testtömeg fenntartásához.

Az egyén inzulinnal szembeni érzékenységének növeléséhez hasonló dózis szempontokat kell figyelembe venni. A tömegcsökkenés nélküli soványtömegnövekedés elérhető oly módon, ami elegendő azon inzulin (vagy potenciálisan az amilin, thiazolidinedionok vagy más potenciális diabétesz kezeléséhez alkalmazott gyógyszerek) mennyiségének csökkentéséhez, melyet a diabétesz kezeléséhez alkalmaznánk a betegnél.

Az általános erőnlét növeléséhez hasonló dózis szempontokat kell figyelembe venni. Az általános erőnlét növekedésével együtt járó soványtömeg-növelés a tömegcsökkenéshez kevés dózisok alkalmazásával érhető el. Más előnyök, mint például a vörösvérsejt számának (és a vérben az oxigenáció) növekedése, valamint a csontreszorpció vagy osteoporosis csökkenése szintén elérhető tömegcsökkenés nélkül.

Kombinációk

A jelen módszer más gyógyszerekkel együtt használható, mint például a diabétesz kezelésében hasznos gyógyszerekkel (például inzulinnal, lehetőleg thiazolidindionokkal, amilinnal, vagy ezek antagonistáival), koleszterin- és vérnyomáscsökkentő gyógyszerekkel (mint például a vérlipidszinteket csökkentő szerekkel és más kardiovaszkuláris gyógyszerekkel) és aktivitást fokozó gyógyszerekkel (például amfetaminokkal). Az étvágycsökkentők szintén felhasználhatók (mint például azok, melyek hatással vannak a szerotonin vagy Y neuropeptid szintjeire). Az ilyen alkalmazások lehetnek szimultán vagy egymás utáni alkalmazások.

Ezenkívül, a jelen módszerek használhatók sebészeti eljárásokkal együtt is, mint például az egész test megjelenését megváltoztató kozmetikai sebészeti beavatkozásokkal együtt (például zsírleszívás vagy lézersebészet, melyek a testtömeg csökkentését célozzák). A szívsebészet, mint például a bypass beavatkozások vagy más sebészeti beavatkozások - melyek a zsíros lerakódások miatti érelzáródások, például artériás plakkok által okozott kóros állapotok megszüntetését célozzák - egészségügyi haszna növelhető a jelen készítmények és módszerek együttes használatával. Az epekő eltávolítására szolgáló módszerek, mint például az ultraszonikus vagy lézeres módszerek, szintén felhasználhatók a jelen terápiás módszerek előtt, alatt vagy után. Ezenkívül, a jelen módszerek felhasználhatók a törött csontok, sérült izmok sebészeti beavatkozásainak vagy terápiáinak, vagy más olyan terápiák kiegészítéseként is, melyek eredményesebbek a soványszövet-tömeg növelése esetében.

A következő példákat a jelen találmány még teljesebb illusztrálására ajánljuk, azonban nem szándékozzuk velük a találmány körét korlátozni.

1. példa

Patkány/egér (murine) F_C-OB protein használata szubkután injekcióval

Ez a példa azt mutatja be, hogy a patkány/egér (murine) F_C-OB protein szubkután injektálása súlycsökkenést okoz normál egerekben. A normál (nem elhízott) CD1 egerek patkány/egér (murine) F_C-OB proteint kapnak szubkután injekciózással 22 napos időtartam alatt. Egy 10 mg/protein/kg testtömeg/nap dózis 14%-os (±1,1%) tömegcsökkenést okoz az alapértékhez képest az injekciózás 22. napjára. A PBS dózisa 3,9% (±3,3%) csökkenést okoz az alaptömeghez képest az injekciózás 22. napjára. A 10 mg/protein/kg testtömeg/nap F_C-OB protein használatával elért tömegcsökkenés elhízott egerekben 10% (±4,3%) csökkenést eredményez az alaptömeghez képest és a PBS dózis 8,7% (±1,3%) tömegcsökkenést eredményez az alaptömeghez képest az injekciózás 22. napjára.

Az alábbiakban az alapértéktömegtől való százalékos eltérést (%) mutatjuk be (8 hetes) CD1 egerekben:

1. táblázat

Súlycsökkenés a szubkután injekció hatására

Idő (napok)	Hordozó (PBS)	Sovány/rekombináns F_C-OB fúziós protein	Elhízott/rekombináns F_C-OB fúziós protein
1-2	- ,44±1,1	—3,6±,41	-1,03±1,36
3-4	—1,07±,13	—6,8±1,5	-2,7±1,1
5-6	-,13±1,1	-9,5±1,2	—4,9±,95

HU 227 088 Β1

1. táblázat (folytatás)

Idő (napok)	Hordozó (PBS)	Sovány/rekombináns F_C-OB fúziós protein	Elhízott/rekombináns F_C-OB fúziós protein
7-8	- 92±,29	—12,5±1,6	-7,7±2,9
9-10	1,6±1,3	—,12,6±1,9	—8,2±2,9
11-12	-1,98±1	-13,6±1,96	—8,6±2,9
13-14	-5,2±1,3	—14,6±1,7	—10,1±3,6
15-16	—8,6±0,1	—14,5±2	—9,4±2,2
17-18	-8,5±,64	—16,1±1,8	-9,6±2,99
19-20	-4,1 ±,99	—16±1,5	—10,4±3,3
21-22	—3,9±3,3	—14,1±1,1	—10±4,3

Amint az látható, egy 22 napos szubkután kúra végén az F_C-OB proteint kapó egerek testtömegük 14,1%-át veszítették el sovány és 10%-át elhízott állatokban a csupán PBS hordozót kapó kontrollállatokhoz képest és az alapértékekhez hasonlítva.

Meglepő módon, a 22 napon keresztül F_C-OB proteint kapó állatok tovább veszítettek tömegükből a 28. napig, az utolsó injekció után még 4 napig. A normál (nem elhízott), 10 mg protein/kg testtömeg/nap patkány/egér (murine) F_C-OB proteint szubkután injekcióban kapó - amit a 22. napon abbahagyunk CD1 egerek 21 %-ot veszítettek alaptesttömegükből a 28. napon a 22. napi 14%-os veszteséghez képest. Hasonlóképpen, az elhízott CD1 egerek, melyek 10 mg protein/kg testtömeg/nap patkány/egér (murine) F_C-OB proteint kaptak, amit a 22. napon abbahagytunk, 13%-ot veszítettek alaptesttömegükből a 28. napon a 22. napi 10%-os veszteséghez képest. A 34. napon a tömegvesztés még mindig 10% maradt az elhízott egerekben, míg a sovány állatok 5%-os tömegvesztésig módosultak. Az egyes rendszerekben a kontrollállatok a 22-34. nap között átlagosan 4%-ot híztak az elhízott és 7%-ot a sovány egerek esetében.

2. példa

A humán F_C-OB protein használata szubkután injekcióval C57 egerekben

Ez a példa azt mutatja be, hogy a humán F_C-OB protein szubkután injekciózása tömegcsökkenést eredményez normál egerekben. A normál (nem elhízott) C57 egerek F_C-OB proteint kapnak 7 napon keresztül szubkután injekcióval. Egy 10 mg protein/kg testtömeg/nap dózis 12%-os (±1,3%) súlycsökkenést okoz az alapértékhez képest az injekciózás 7. napjára. Az 1 mg protein/kg testtömeg/nap dózis 8,9% (±1,5%) csökkenést eredményez az alapértékhez képest az injekciózás 7. napjára. A 10 mg protein/kg testtömeg/nap humán OB protein dózis elhízott C57 egerekben 1,1% (±0,99%) veszteséget okoz az alapértékhez képest és az 1 mg protein/kg testtömeg/nap dózis 2,5% (±1,1%) veszteséget az alapértékhez képest az injekciózás 7. napjára.

Eredmények

Az alábbiakban az alapértéktömegtől való százalékos eltérést (%) mutatjuk be (8 hetes) C57 egerekben:

2. táblázat

Tömegcsökkenés a szubkután injekció hatására

Idő (napok)	Hordozó (PBS)	Rekombináns F_C-OB fúziós protein	Rekombináns F_C-OB fúziós protein
1-2	,258±1,3	-6,4±1,6	-2,1 ±,91
3-4	2,2±1,1	—12,1±1,5	- ,78±,36
5-6	4,5±2	-11,5±1,5	-1,7±,6
7-8	7,0±2,1	-11,9±1,6	0,1±1,2
9-10	9,0±1,9	-11,5±1,3	7,2+2,7
11-12	10±3,8	—9±1,4	10,9±2,9
13-14	12,5±4,4	-9,5±1,6	12,3±6,4
15-16	11,1±1,0	-3,0±1,5	10,3±3,3
17-18	17,2±3,6	8,0±1,3	13,3±3,4

Amint az látható, a 7 napos szubkután kezelés után a 17. nap végén, 10 mg/kg/nap dózis mellett az F_C-OB proteint kapó állatok testtömegük 8%-át visszanyerik. Az 1 mg/kg/nap dózist kapó állatok a 7 napos szubkután kezelés után 12 nap után testtömegük 6,4%-át nyerik vissza.

Ezek a vizsgálatok azt is megmutatják, hogy a visszahízási időszak során a 7-22. napon az utolsó injektálás után a 7. napon, a testtömeg-visszanyerés lassabb az F_c-OB-vel kezelt C57 egerek esetében, mint az OB-vel kezelt egereknél. Ez azt sugallja, hogy az F_C-OB protein nem ürül ki olyan gyorsan, mint az OB protein, így meghosszabbított tömegcsökkentési hatással bír.

3. példa

Az F_C-OB fúziós proteinnel kezelt CF7 egerek dózisválasza

Egy további vizsgálat azt mutatja, hogy dózisválasz tapasztalható az F_C-OB protein folyamatos alkalmazása esetén. Ebben a vizsgálatban elhízott CF7 egereket (35-40 g) kezelünk rekombináns humán F_C-OB proteinnel, a fenti példában bemutatott módszerhez hasonló módon. Az eredményeket az alábbi 3. táblázatban mutatjuk be (a %-os testtömegcsökkenést a fentiek szerint mért alapértékhez viszonyítjuk):

3. táblázat

Dózisválasz folyamatos alkalmazás esetén

Dózis	Idő	% csökkenés a testsúlyban
0,25 mg/kg/nap	5 nap	4
0,5 mg/kg/nap	5 nap	12
1 mg/kg/nap	5 nap	16

HU 227 088 Β1

Amint az látható, a dózis 0,25 mg/kg/nap dózisról 1 mg/kg/nap dózisra való növelése 4%-ról 16%-ra fokozta a tömegcsökkenést. Említésre méltó az is, hogy az 5. napon az 1 mg/kg/nap dózis 16% testsúlycsökkenést eredményez. Ezek a vizsgálatok lassú - 0% tömeg-visszaszerzési sebességet mutatnak, ami azt sugallja, hogy az F_C-OB protein nem ürül ki gyorsan, így meghosszabbodott tömegcsökkentési hatással rendelkeznek.

4. példa

A rekombináns humán F_C-OB farmakokinetikáia

CD-1 egerekben és kutyákban

Ez a vizsgálat a rekombináns humán met F_C-OB protein farmakokinetikáját mutatja CD-1 egerekben és kutyákban. Az 1 mg/kg/nap dózisban intravénásán vagy szubkután alkalmazott kezelést követően a rekombináns humán met F_C-OB protein és a humán met OB protein szérumkoncentrációit enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálattal (ELISA) határozzuk meg.

Mindkét fajban a kitettség növekedését figyeltük meg, ahogy azt a magasabb csúcs-szérumkoncentrációk és a szérum-koncentráció-görbe alatti (AUC) nagyobb területtel meghatároztuk, amikor a rekombináns met humán OB proteinhez viszonyítottuk. Az F_C-OB alacsonyabb szisztémás kiürüléssel rendelkezik, mint a rekombináns met-humán OB protein. Ez az alacsonyabb kiürülésből és az F_C-OB hosszabb felezési idejéből látható az OB proteinhez képest. A méretbeli növekedés nem csupán proteinstabilitásbeli növekedést eredményez, hanem csökkenti a vesekiürülési hatékonyságot is. Eredményként, az F_C-OB lassabban ürül ki a szisztémás keringésből. Az F_C-OB protein megnövekedett csúcsideje, csúcs-szérumkoncentrációi és AUC növekedése egyezik az alacsonyabb kiürüléssel. Az F_C-OB protein lényegesen magasabb szisztémás expozíciót eredményez, ha az OB proteinhez hasonlítjuk. Az eredményeket az alábbi 4. táblázatban mutatjuk be.

4. táblázat

Farmakokinetikus tulajdonságok

Fajták	CD-1 egerek	CD-1 egerek	Beagle kutya
Az alk. módja	intravénás	szubkután	szubkután
OB protein	F_C-OB protein	OB protein	F_C-OB protein	OB protein	F_C-OB protein
Dózisszint (mg/kg)	1	1	1	1	0,5	0,5
Csúcsidő (h)			0,14	6	2,8	8
Csúcs-szérumkonc. (ng/ml)			1520	7 550	300	1 120
AUC (ng*h/ml)	1470	366 000	1230	132 000	2200	52 500
Felezési idő (h)	0,491	21,4	0,388		2,13	22,9
Kiürülés	681	2,73

5. példa

Ez a példa azt mutatja, hogy normál egerekben, melyek nem híztak el és melyeknek nincs emelt vérlipidszintjük, a humán rekombináns F_C-OB protein alkalmazása a koleszterin-, glükóz- és trigliceridszintek csökkenését eredményezi. Ezenkívül ez a példa azt is bemutatja, hogy ezek a szintek alacsonyak is maradnak egy 3 napig tartó felépülési periódusban.

A normál CD1 egerek rekombináns humán F_C-OB proteint kapnak szubkután injektálással. Vérmintákat veszünk 24 órával a 23., azaz az utolsó injekciózás napja után. A fent megvitatottak szerint, az állatok fogytak az alkalmazott dózisok esetében. Ahogy azt az

5. táblázatban bemutatjuk, az egerekben lényegesen csökkent dózisfüggő módon a szérum koleszterin, glükóz és trigliceridek szintje a kontrollokhoz képest:

5. táblázat

Dózis	Glükóz	Koleszterin	Trigliceridek
PBS	232,6±15,1	67,8±3,6	52,6±3,7
1 mg/kg/nap	225,8±29,1	54±5,6	43±8,7
10 mg/kg/nap	193,2±21,4	53,4±5,7	38±11
1 mg/kg minden 2. napon	242,0±9,3	52,6±4,4	40,8±7,2
10 mg/kg minden 2. napon	197,4±27,9	51,4±5,9	29,8±6,3
1 mg/kg minden 3. napon	244,8±19,5	60,8±7,3	54±7,1
10 mg/kg minden 3. napon	188±31,2	52,2±6,9	26,2±10,7

HU 227 088 Β1

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az F_C-OB protein vagy ennek analógjai vagy származékai hatékony vérlipidcsökkentő anyagok.

6. példa

Egy elhízott humán betegnek humán F_C-OB proteint, vagy analógot vagy származékot adunk tömegcsökkentési céllal. Az elhízott beteg emelt vérlipidszintekkel rendelkezik, ideértve a koleszterin megemelkedett - 200 mg/100 ml érték fölött - szintjeit. A beteg kielégítő súlycsökkenést ér el az F_C-OB terápia során. Az F_C-OB protein vagy analóg vagy származék fenntartó dózisát nem elhízott betegnek adjuk a csökkent vérlipidszintek, ideértve a csökkent koleszterinszintek, 200 mg/100 ml érték alatt tartása céljából. Az alkalmazott dózis nem elegendő ahhoz, hogy további tömegcsökkenést okozzon. Az alkalmazás krónikus. A keringő F_C-OB protein vagy analóg vagy származék szintjei nyomon követhetők diagnosztikai kit használatával, mint például az OB protein elleni antitest vizsgálattal (vagy más antigenikus forrással, ha rendelkezésre áll).

7. példa

Egy nem elhízott humán beteg koronáriás bypass sebészeti vagy más invasive kezelési beavatkozáson esik át az előrehaladott artériás plakk képződés állapotának enyhítése érdekében. A sebészeti beavatkozás után a beteg fenntartó dózist kap az F_C-OB proteinből vagy analógból vagy származékból az artériás plakk újraképződésének megakadályozása céljából. Az alkalmazott dózis nem elegendő ahhoz, hogy tömegcsökkenést okozzon. Az alkalmazás krónikus. A keringő F_C-OB protein, analóg vagy származék szintjei nyomon követhetők diagnosztikai kit használatával, mint például az OB protein elleni antitest vizsgálattal (vagy más antigenikus forrással, ha rendelkezésre áll).

8. példa

Egy nem elhízott humán beteg magas vérnyomást tapasztal az elzáródott artériákból adódó korlátozott véráramlás miatt. A beteg az F_C-OB protein, analóg vagy származék olyan dózisát kapja, mely elegendő ahhoz, hogy csökkentse az elzáródott artériákból adódó artériás plakkokat. Ezután a beteget a további artériás plakk-képződésre és magas vérnyomásra figyelemmel kísérjük. Ha az állapot újra bekövetkezik, a beteg újra olyan hatékony mennyiségű F_C-OB proteint, analógot vagy származékot kap, mely elegendő a véráram visszaállításához, azonban a tömegcsökkenéshez nem elegendő. A keringő F_C-OB protein, analóg vagy származék szintjei nyomon követhetők diagnosztikai kit használatával, mint például az OB protein elleni antitest vizsgálattal (vagy más antigenikus forrással, ha rendelkezésre áll).

9. példa

Egy humán betegnek epeköve van. Az epeköveket vagy nem távolítják el és a további epekőképződést szándékozzák elkerülni, vagy az epekövet eltávolítják, de az epehólyag bent marad (például lézeres vagy ultrahangos sebészeti beavatkozás után) és a további epekőképződés megakadályozása a cél. A beteg hatékony mennyiségű F_C-OB proteint, analógot vagy származékot kap ahhoz, hogy megakadályozza a további epekőakkumulációt vagy az epekövek újult akkumulációját. A keringő F_C-OB protein, analóg vagy származék szintjei nyomon követhetők diagnosztikai kit használatával, mint például az OB protein elleni antitest vizsgálattal (vagy más antigenikus forrással, ha rendelkezésre áll).

10. példa

Egy diabetikus humán beteg csökkent dózisú inzulin mennyiséget szeretne használni a diabétesz kezelésére. A beteg az F_C-OB protein, analóg vagy származék olyan hatékony mennyiségét kapja, mely a soványszövet-tömeg növekedését eredményezi. A beteg inzulinnal szembeni érzékenysége nő és a diabétesz tüneteinek enyhítéséhez szükséges inzulin mennyisége csökken, a szükséges inzulinegység csökkenése vagy a naponként szükséges inzulininjekciók számának csökkenése révén. A keringő F_C-OB protein, analóg vagy származék szintjei nyomon követhetők diagnosztikai kit használatával, mint például az OB protein elleni antitest vizsgálattal (vagy más antigenikus forrással, ha rendelkezésre áll).

11. példa

Egy nem elhízott humán betegnek megnövekedett soványszövet-tömegre van szüksége terápiás célból, például a soványszövet-tömeget kimerítő betegségből való felgyógyuláshoz. A beteg az F_C-OB protein, analóg vagy származék olyan hatékony mennyiségét kapja, mely a soványszövet-tömeg szükséges növekedését eredményezi. A soványszövet-tömeg növekedését DEXA szkennelést használva követjük nyomon. A keringő F_C-OB protein, analóg vagy származék szintjei nyomon követhetők diagnosztikai kit használatával, mint például az OB protein elleni antitest vizsgálattal (vagy más antigenikus forrással, ha rendelkezésre áll).

Anyagok és módszerek

Állatok. A fenti példákhoz vad típusú CD1 egereket és (+/+) C57B16 egereket használunk. A kísérlet kiindulási időpontjában az egerek 8 hetesek és az állatok súlyát stabilizáltuk.

Táplálkozás és tömegmérés. Az egereket őrölt rágcsálótáppal (PMI Feeds, Inc.) etetjük porított étel etetővel (Allentown Caging and Equipment), mely sokkal pontosabb és érzékenyebb mérést tesz lehetővé, mint a hagyományos blokkos táppal való etetés. A tömeget minden nap ugyanabban az időben mérjük (2.00 órakor délután) a kívánt időtartam alatt. Az injektálás előtti testsúlyt alaptömegértékként határozzuk meg. A használt egerek 18-22 grammosak.

Elhelyezés. Az egereket egyesével tartjuk humánus körülmények között.

A protein vagy a hordozó alkalmazása. Az állatok a proteint (az alábbiakban írjuk le) vagy a hordozót (foszfátpufferelt sóoldat, pH=7,4) szubkután injekcióval vagy intravénásán kapják.

HU 227 088 Β1

Kontrollok. A kontrollállatok azok, melyeket csak a hordozóval injekciózzuk anélkül, hogy F_C-OB fúziós proteint vagy OB proteint adnánk a hordozóhoz.

Protein. Az 1., 2. és 3. számú szekvenciákban a patkány/egér (murine) rekombináns OB DNS-t és proteint (1. ábra) és a 4., 5. és 6. számú szekvenciákban egy analóg rekombináns humán OB DNS-t és proteint (2. ábra) mutatunk be. Ahogy azt korábban megemlítettük, a rekombináns humán OB protein, mint a 6. számú szekvenciában, egy lizinmaradékot tartalmaz a 35. pozícióban és egy izoleucinmaradékot a 74. pozícióban. Ezenkívül, a Zhag és munkatársai által leírt (Natúré, lásd fent) és a WO 96/05309 számú PCT szabadalmi bejelentésben leírt (melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak) rekombináns humán protein és az 1. és 2. ábrák patkány/egér (murine) és humán analóg rekombináns proteinjei az OB protein illusztrációi, melyek felhasználhatók a kezelés jelen módszereinek F_C-OB fúziós proteinje előállításában és a gyógyszer előállításában. Más OB vagy F_cproteinek, analógok vagy származékok szintén felhasználhatók az F_C-OB fúziós protein létrehozásához.

Erre vonatkozóan, a rekombináns OB proteinhez való aminosavszekvencia első aminosavjára +1-ként hivatkozunk és ez valin és a -1 pozícióban levő aminosav egy metionin. A C-terminális aminosav száma 146 (cisztein) (lásd az 1. és 2. ábrákat). A 3. ábra rekombináns humán F_C-OB proteinjéhez való első aminosavszekvenciára +1 -ként hivatkozunk és ez glutamát és a -1. pozícióban levő metionin. A C-terminális aminosav száma 378 (cisztein). A 4. ábra rekombináns humán F_C-OB protein variánsának első aminosavszekvenciájára +1 -ként hivatkozunk és ez glutamát, és a -1. pozícióban levő metionin. A C-terminális aminosav száma 378 (cisztein). Az 5. ábra rekombináns humán F_C-OB protein variánsának első aminosavszekvenciájára +1 -ként hivatkozunk és ez aszparaginsav, és a -1. pozícióban levő metionin. A C-terminális aminosav száma 373 (cisztein). A 6. ábra rekombináns humán F_C-OB protein variánsának első aminosavszekvenciájára +1 -ként hivatkozunk és ez aszparaginsav, és a -1. pozícióban levő metionin. A C-terminális aminosav száma 373 (cisztein).

Expressziós vektor és gazdatörzs

A használt expressziós vektor a pAMG21 (ATCC 98113 katalógusszám), mely a pCFM1656 (ATCC 69576 katalógusszám) származéka és tartalmazza a megfelelő restrikciós helyeket a gének lux PR promotertől downstream irányban történő inzertálásához (lásd az 5.169.318 számú US szabadalmi bejelentést a lux expressziós rendszer leírásához). Az F_C-OB DNS-t, mely az alábbiakban kerül leírásra és a 3-6. ábrákon kerül bemutatásra, létrehozzuk és a pAMG21 expressziós vektorba ligáljuk, melyet az Ndel és BamHI restrikciós endonukleázokkal linearizáltunk és az FM5 £ coli gazdasejtbe transzformáljuk. Az £ coli FM5 sejteket az Amgen Inc.-nél (Thousand Oaks, CA) az E. coli K-12 törzsből [Bachmann et al., Bacterial

Rév. 40:116-167 (1976)] származtatják és tartalmazza az integrált lambda fág represszor gént, a cl₈57-et [Saussman et al., C.R. Acad. Sci. 254:1517-1579 (1962)]. A vektortermelés, a sejttranszformáció és a telepszelekció standard módszerekkel történik (például Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). A gazdasejteket LB tápközegben szaporítjuk.

F_C-OB szerkesztés

A pF_c-A3 plazmid (az alábbiakban írjuk le) szolgál a humán lgG-1 immunoglobulin nehéz lánc szekvenciájának forrásaként a 99. számú aminosavtól (Glu) a természetes karboxil terminusig. A humán lgG-1 szekvencia a Genebanktól szerezhető be (P01857).

A humán OB szekvencia a fentiekben került leírásra, akárcsak Zhang et al., Natúré, lásd fent és a WO 96/05309 számú PCT szabadalmi bejelentés, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, ideértve a rajzokat. Az OB DNS-t a pCFM1656 expressziós vektorhoz ligáljuk, melyet az Xbal és BamHI restrikciós endonukleázokkal linearizáltunk standard klónozási eljárást használva, lásd például Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Az OB DNS-szekvenciát hordozó pCFM1656 plazmid szolgál a rekombináns humán OB gén szekvenciájának forrásaként.

A két szekvencia genetikai fúzióját PCR átfedő extenzióval [Ho S. N. et al., Site Directed Mutagenesis By Overlap Extension Using The Polymerase Chain Reaction, Gene 77:51-59 (1989)] hajtjuk végre. A PCR-termékét Ndel restrikciós endonukleázzal hasítjuk egy 5’-kohéziós vég létrehozása céljából és a BamHI restrikciós endonukleázzal egy 3’-kohéziós terminus létrehozása céljából. A pAMG21 vektort hasonlóan hasítjuk. A ligációt a fúziós fragmenttel és a linearizált vektorral végezzük. A ligáit DNS-t elektroporációval transzformáljuk az £ coli gazdatörzsbe. A kanamicin szelekciós agar lemezeken (50 pg/ml) életben maradó kiónokat ellenőrizzük, hogy expresszálják-e az F_C-OB méretű proteint. Az egyes klónokból származó plazmidot izoláljuk és a gént kódoló régiót ellenőrizzük.

Amikor kívánatos az F_C-OB gén további módosítása, ismét PCR-technikát használunk a változások megvalósítása céljából. Két változtatási sorozatot végzünk a fúziós protein F_c részének N-terminusán (9. számú szekvencia) a 12. és 15. számú szekvenciákkal rendelkező variánsok létrehozása céljából. Egy másik variánst azért hoztunk létre, hogy 4 aminosav szubsztitúciót juttassunk be az F_c-receptor kötő hely (a 15. pozícióban levő leucint helyettesítjük glutamáttal) és a komplementer (C1q) kötő hely (a 98. pozícióban levő glutamátot helyettesítjük alaninnal, a 100. pozícióban levő lizint helyettesítjük alaninnal és a 102. pozícióban levő lizint helyettesítjük alaninnal) eltávolítása céljából [lásd Xin Xiao Zheng et al., J. Immunoi. 154:5590-5600 (1995)]. Az ezen szerkezethez való

HU 227 088 Β1 templát a 15. számú szekvencia és a kapott variáns a 18. számú szekvencia.

pF_c vektorszerkesztés

A humán lgG-1 immunoglobulin nehéz lánc [lásd Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Rés. 10:4071 —4079 (1982)] F_c részét kódoló régiót tartalmazó pF_c-A3 plazmidot az összekötő dómén első aminosavától, a Glu99-től a karboxil terminus+egy 5’-Notl fúziós helyig és 3’-Sall és Xbal helyekig, a humán lép cDNS-könyvtár PCR amplifikálásával hoztuk létre. A PCR-reakciókat 100 ml-es vágső térfogatban végezzük és 2 egység Vént DNS-polimerázt alkalmazunk 20 mM Tris-HCI (pH=8,8), 10 mM Kel, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100 elegyében 400 mM dNTPvel (mindegyikből) és 1 ng amplifikálandó cDNS-könyvtárral 1 μΜ primerrel együtt (mindegyikből). A reakciókat 2 percig tartó 95 °C hőmérsékleten végzett denaturációval kezdjük, melyet 30 ciklus 95 °C, 30 másodperc, 55 °C, 30 másodperc és 73 °C, 2 perc követ. Az 5’-primer egy Notl helyet foglal magában az lgG-1 összekötő doménjének közvetlenül 5’-irányban levő első maradéktól (Glu-99). A 3’-primer egy Sáli és Xbal helyet tartalmaz. A 717 bázispár hosszúságú PCR-terméket Notl és Sáli enzimekkel emésztetjük és a kapott DNS-fragmentet elektroforézissel izoláljuk 1% agarózon keresztül és a Notl-gyel és SAII-gyel emésztett pBluescript II KS vektorba (Stratagene) klónozzuk. A kapott plazmidban - pF_c-A3 - levő inzertet szekvenáljuk a PCR-reakció hitelességének megerősítése céljából.

Az előállításhoz való módszerek

Az előállításhoz való alábbi módszereket biológiailag aktív rekombináns metionil patkány/egér (murine) vagy humán analóg OB protein és F_C-OB fúziós protein előállítására használták. Hasonló módszerek használhatók a biológiailag aktív metionil humán OB protein előállításához.

Fermentációs eljárás

Batch-fermentációs eljárást alkalmazunk. A tápközeg összetételét az alábbiakban adjuk meg.

A főként nitrogénforrást tartalmazó tápközeg egy részét sterilezzük (a hőmérsékletet 25-35 percre 120-123 °C-ra emeljük) a fermentációs tartályban. Lehűtés után szénforrást, magnézium-, foszfát- és nyomelemforrást adunk aszeptikus körülmények között. A fenti rekombináns patkány/egér (murine) proteint termelő termelőbaktérium egyéjszakás tenyészetének 500 mL mennyiségét (LB tápközegben szaporítottuk) adjuk a fermentorhoz. Amikor a tenyészet optikai denzitása (600 nm hullámhosszon mérjük a sejtsűrűség indikátoraként) eléri a körülbelül 15-25 abszorpciós egységet egy autoindukálóoldatot (0,5 mg/mL homoszerin lakton) adunk (1 mL/L) a tenyészethez a rekombináns génexpresszió indukálása céljából. A fermentációs folyamatot további 10-16 óráig hagyjuk továbbfolytatódni, ezután a táplevest centrifugálással összegyűjtjük.

Tápközeg-összetétel

Töltet: 34 g/L	élesztőkivonat
78 g/L	szója pepton
0,9 g/L	kálium-klorid
5,0 g/L	hexaphos
1,7 g/L	citromsav
120 g/L	glicerin
0,5 g/L	MgSO₄*7H₂O
0,2 mL/L	nyom fém oldat
0,5 mL/L	P2000 habzásgátló
Nyom fémoldat:

Vas-klorid (FeCI₃*6H₂O): 27 g/L

Cink-klorid (ZnCI₂*4H₂O): 2 g/L

Kobalt-klorid (CoCI₂*6H₂O): 2 g/L

Nátrium-molibdát (NaMoO₄*2H₂O): 2 g/L

Kalcium-klorid (CaCI₂*2H₂O): 1 g/L

Réz-szulfát (CuSO₄*5H₂O): 1,9 g/L

Bórsav (H₃BO₃): 0,5 g/L

Mangán-klorid (MnCI₂*4H₂O): 1,6 g/L

Nátrium-citrát-dehidrát: 73,5 g/L

Tisztítási eljárás a humán F_C-OB fúziós proteinhez

A humán F_C-OB fúziós proteinhez való tisztítási eljárást az alábbi lépések szerint végezzük el (hacsak másként nem jelezzük, a következő lépéseket 4 °C hőmérsékleten végezzük). A patkány/egér (murine) és humán OB protein tisztítása a PCT WO 96/05309 számú szabadalomban (lásd fent, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak) írták le.

1. Sejtpaszta. Az £ co//-sejtpasztát ötszörös térfogatnyi desztillált vízben szuszpendáljuk. A sejtben levő sejteket tovább tárjuk fel oly módon, hogy mikroelfolyósító készüléken kétszer átengedjük. A feltárt sejteket 4.2k rpm fordulatszámon centrifugáljuk 1 órán keresztül Beckman JB-6-os centrifugában J5—4,2 rotorban.

2. Inklúziós test mosás. A fenti lépésből származó felülúszót eltávolítjuk és a pelletet ötszörös térfogatnyi desztillált vízben reszuszpendáljuk. Az elegyet az 1. lépésben leírtak szerint centrifugáljuk.

3. Oldhatóvá tétel. A pelletet 10 térfogat 50 mM tris, (pH=8,5), 8 M guanidin-hidroklorid, 10 mM ditiotreitol elegyében tesszük oldhatóvá és 1 órán keresztül rázzuk szobahőmérsékleten. Az oldatot 40 mM cisztamindihidrokloridos oldattá tesszük és 1 órán keresztül rázzuk.

4. A 3. lépésből származó oldatot hozzáadjuk 20-30 térfogatnyi újratekeredési oldathoz: 50 mM tris (pH=8,5), 0,8 M arginin, 2 M karbamid és 4 mM cisztein. Az újratekeredési oldatot 16 órán keresztül rázatjuk 8 °C hőmérsékleten.

5. Puffercsere. A 4. lépésből származó oldatot koncentráljuk és diaszűrjük 10 mM trisbe (pH=8,5).

6. Savas kicsapatás. Az 5. lépésből származó oldat pH-értékét 4,75-re igazítjuk 50% jégecet hozzáadásával és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az oldatot szűrjük.

7. Kationcserés kromatográfia. A 6. lépésből származó oldat pH-értékét 7,0-ra igazítjuk és egy CM Sepharose Fást Flow oszlopra helyezzük 10 ’C-nél. Egy

HU 227 088 Β1 húsz oszloptérfogatos gradienst készítünk 10 mM foszfáttal (pH=7,0)0-0,1 M NaCI-dal.

8. Anioncserés kromatográfia. A 7. lépésből származó CM elúciós összegyűjtött anyagot ötszörösére hígítjuk 5 mM trissel (pH=7,5) és Q Sepharose Fást Flow oszlopra helyezzük 10 ’C-nél. Egy húsz oszloptérfogatos gradienst készítünk 10 mM trissel (pH=7,5) 0-0,2 M NaCI-dal.

9. Hidrofób kölcsönhatás kromatográfia. A Q sepharose összegyűjtött anyagot 0,75 M ammónium-szulfáttal készítjük és egy metil Macroprep hidrofób kölcsönhatás oszlopra helyezzük szobahőmérsékleten.

Egy húsz oszloptérfogatos gradienst készítünk 10 mM foszfáttal (pH=7,0) 0,75-0 M ammónium-szulfáttal.

10. Puffercsere. A 9. lépésből származó összegyűjtött anyagot szükség szerint koncentráljuk és PBS puf5 ferrel szemben dializáljuk.

Míg a jelen találmányt az előnyben részesített megvalósulásokkal írtuk le, érthető, hogy a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára variációk és módosulások fognak bekövetkezni. Ezért szán10 dékunk szerint a csatolt igénypontok minden azonos értékű variációt lefednek, melyek az igénypontokban megadott találmány körén belül esnek.

Szekvencialista (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) A FELTALÁLÓ: Mann, Michael B.

Hecht, Randy I.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: OB FÚZIÓS PROTEINKÉSZÍTMÉNYEK ÉS MÓDSZEREK (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 18 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) NÉV: Amgen Inc.

(B) UTCA: 1840 DeHavilland Drive (C) VÁROS: Thousand Oaks (D) ÁLLAM: CA (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 91320-1789 (v) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:

(A) ADATHORDOZÓ: Floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) A JELEN ALKALMAZÁS ADATAI:

(A) ALKALMAZÁSI SZÁM: US 08/770973 (B) IKTATÁSI DÁTUM: 1996. dec. 20.

(C) KLASSZIFIKÁCIÓ:

(viii)ÜGYVÉD/IRODA INFORMÁCIÓ:

(A) NÉV: Knight, Matthew W.

(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 36846 (C) REFERENCIA/DOKUMENTUM SZÁM: A-416 (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 491 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: miscjellemző

HU 227 088 Β1 (Β): 41 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met=ATG” (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATGGTACCGA TCCAGAAAGT 60

TCAGGACGAC ACCAAAACCT TAATTAAAAC GATCGTTACG CGTATCAACG ACATCAGTCA 120

CACCCAGTCG GTCTCCGCTA AACAGCGTGT TACCGGTCTG GACTTCATCC CGGGTCTGCA 180

CCCGATCCTA AGCTTGTCCA AAATGGACCA GACCCTGGCT GTATACCAGC AGGTGTTAAC 240

CTCCCTGCCG TCCCAGAACG TTCTTCAGAT CGCTAACGAC CTCGAGAACC TTCGCGACCT 300

GCTGCACCTG CTGGCATTCT CCAAATCCTG CTCCCTGCCG CAGACCTCAG GTCTTCAGAA 360

ACCGGAATCC CTGGACGGGG TCCTGGAAGC ATCCCTGTAC AGCACCGAAG TTGTTGCTCT 420

GTCCCGTCTG CAGGGTTCCC TTCAGGACAT CCTTCAGCAG CTGGACGTTT CTCCGGAATG 480

TTAATGGATC C 491

A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 491 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGATCTAAAC

AGTCCTGCTG

GTGGGTCAGC

GGGCTAGGAT

GAGGGACGGC

CGACGTGGAC

TGGCCTTAGG

CAGGGCAGAC

AATTACCTAG

TCAAAATTGA

TGGTTTTGGA

CAGAGGCGAT

TCGAACAGGT

AGGGTCTTGC

GACCGTAAGA

GACCTGCCCC

GTCCCAAGGG

G

AAATCTTCCT	CCTTATTGTA	TACCATGGCT	AGGTCTTTCA	60
ATTAATTTTG	CTAGCAATGC	GCATAGTTGC	TGTAGTCAGT	120
TTGTCGCACA	ATGGCCAGAC	CTGAAGTAGG	GCCCAGACGT	180
TTTACCTGGT	CTGGGACCGA	CATATGGTCG	TCCACAATTG	240
AAGAAGTCTA	GCGATTGCTG	GAGCTCTTGG	AAGCGCTGGA	300
GGTTTAGGAC	GAGGGACGGC	GTCTGGAGTC	CAGAAGTCTT	360
AGGACCTTCG	TAGGGACATG	TCGTGGCTTC	AACAACGAGA	420
AAGTCCTGTA	GGAAGTCGTC	GACCTGCAAA	GAGGCCTTAC	480 491

(2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 147 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: protein (B) : 1 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés^,Met (ATG) -1-nél kezdődik” (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Lle Lys 15 10 15

Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

HU 227 088 Β1

Alá

Lys

Gin 35

Arg

Val

Thr

Gly

Leu 40

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly 45

Leu

His

Pro

Ile

Leu 50

Ser

Leu

Ser

Lys

Met 55

Asp

Gin

Thr

Leu

Alá 60

Val

Tyr

Gin

Val 65

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro 70

Ser

Gin

Asn

Val

Leu 75

Gin

Ile

Alá

Asn

Asp 80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 85

Asp

Leu

His

Leu 90

Leu

Alá

Phe

Ser

Lys 95

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro 100

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu 105

Gin

Lys

Pro

Glu

Ser 110

Leu

Asp

Gly

Val

Leu 115

Glu

Alá

Ser

Leu

Tyr 120

Ser

Thr

Glu

Val

Val 125

Alá

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Leu

Gin

Leu

Asp

Val

Ser

130 135 140

Pro Glu Cys

145 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 454 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: miscjellemzö (B) :4 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met=ATG” (xi)A4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATATGGTAC	CGATCCAGAA	AGTTCAGGAC	GACACCAAAA	CCTTAATTAA	AACGATCGTT	60
ACGCGTATCA	ACGACATCAG	TCACACCCAG	TCGGTGAGCT	CTAAACAGCG	TGTTACAGGC	120
CTGGACTTCA	TCCCGGGTCT	GCACCCGATC	CTGACCTTGT	CCAAAATGGA	CCAGACCCTG	180
GCTGTATACC	AGCAGATCTT	AACCTCCATG	CCGTCCCGTA	ACGTTCTTCA	GATCTCTAAC	240
GACCTCGAGA	ACCTTCGCGA	CCTGCTGCAC	GTGCTGGCAT	TCTCCAAATC	CTGCCACCTG	300
CCATGGGCTT	CAGGTCTTGA	GACTCTGGAC	TCTCTGGGCG	GGGTCCTGGA	AGCATCCGGT	360
TACAGCACCG	AAGTTGTTGC	TCTGTCCCGT	CTGCAGGGTT	CCCTTCAGGA	CATGCTTTGG	420
CAGCTGGACC	TGTCTCCGGG	TTGTTAATGG	ATCC			454

(2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 454 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS

HU 227 088 Β1 (χί)ΑΖ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTATACCATG

TGCGCATAGT

GACCTGAAGT

CGACATATGG

CTGGAGCTCT

GGTACCCGAA

ATGTCGTGGC

GTCGACCTGG

GCTAGGTCTT

TGCTGTAGTC

AGGGCCCAGA

TCGTCTAGAA

TGGAAGCGCT

GTCCAGAACT

TTCAACAACG

ACAGAGGCCC

TCAAGTCCTG

AGTGTGGGTC

CGTGGGCTAG

TTGGAGGTAC

GGACGACGTG

CTGAGACCTG

AGACAGGGCA

AACAATTACC

CTGTGGTTTT

AGCCACTCGA

GACTGGAACA

GGCAGGGCAT

CACGACCGTA

AGAGACCCGC

GACGTCCCAA

TAGG

GGAATTAATT

GATTTGTCGC

GGTTTTACCT

TGCAAGAAGT

AGAGGTTTAG

CCCAGGACCT

GGGAAGTCCT

TTGCTAGCAA ACAATGTCCG GGTCTGGGAC CTAGAGATTG GACGGTGGAC TCGTAGGCCA GTACGAAACC

120

180

240

300

360

420

454 (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) NÉV/KULCS: protein (B) :1 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met (ATG) -1-nél kezdődik” (Xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Val 1

Pro

Ile

Gin 5

Lys Val

Gin

Asp Asp Thr 10

Lys

Thr Leu

Ile 15

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

20

25

30

Ser

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

35

40

45

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Alá

Val

Tyr

Gin

50

55

60

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Leu

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

65

70

75

80

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Alá

Phe

Ser

Lys

Ser

85

90

95

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Alá

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

100

105

110

Gly

Val

Leu

Glu

Alá

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Alá

Leu

Ser

115

120

125

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

130 135 140

Pro Gly Cys

145

HU 227 088 Β1 (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1150 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: miscjellemző (B) :4 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met=ATG” (xi)A7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATATCGAAC	CCAAATCTTG	TGACAAAACT	CACACATGCC	CACCGTGCCC	AGCACCTGAA	60
CTCCTGGGGG	GACCGTCAGT	CTTCCTCTTC	CCCCCAAAAC	CCAAGGACAC	CCTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCAC	ATGCGTGGTG	GTGGACGTGA	GCCACGAAGA	CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGA	CGGCGTGGAG	GTGCATAATG	CCAAGACAAA	GCCGCGGGAG	240
GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCAA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	GCCTGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCTCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720
CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAGTT	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCCTGC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	TCTTGAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGAAGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAGT	TGTTGCTCTG	1080
TCCCGTCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACATG	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGGTTGT	1140

TAATGGATCC 1150 (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1150 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi)A8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTATACCTTG	GGTTTAGAAC	ACTGTTTTGA	GTGTGTACGG	GTGGCACGGG	TCGTGGACTT	60
GAGGACCCCC	CTGGCAGTCA	GAAGGAGAAG	GGGGGTTTTG	GGTTCCTGTG	GGAGTACTAG	120
AGGGCCTGGG	GACTCCAGTG	TACGCACCAC	CACCTGCACT	CGGTGCTTCT	GGGACTCCAG	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTCTGTTT	CGGCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG	TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GGTCCTGACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTGTTTC	GGGAGGGTCG	GGGGTAGCTC	360
TTTTGGTAGA	GGTTTCGGTT	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600

HU 227 088 Β1

TTCTCGTCCA

TTGGTGATGT

GTCCTGCTGT

TGGGTCAGCC

GGCTAGGACT

AGGTACGGCA

GACGTGCACG

GACCTGAGAG

AGGGCAGACG

ATTACCTAGG

CCGTCGTCCC

GCGTCTTCTC

GGTTTTGGAA

ACTCGAGATT

GGAACAGGTT

GGGCATTGCA

ACCGTAAGAG

ACCCGCCCCA

TCCCAAGGGA

CTTGCAGAAG

GGAGAGGGAC

TTAATTTTGC

TGTCTTTCAA

TTACCTGGTC

ATAGGTCTAG

GTTTAGGACG

GGACCTTCGT

AGTCCTGTAC

AGTACGAGGC

AGAGGCCCAT

TAGCAATGCG

TGTCCGGACC

TGGGACCGAC

AGATTGCTGG

GTGGACGGTA

AGGCCAATGT

GAAACCGTCG

ACTACGTACT CCGAGACGTG TTCATGGCTA GGTCTTTCAA CATAGTTGCT GTAGTCAGTG TGAAGTAGGG CCCAGACGTG ATATGGTCGT CTAGAATTGG AGCTCTTGGA AGCGCTGGAC CCCGAAGTCC AGAACTCTGA CGTGGCTTCA ACAACGAGAC ACCTGGACAG AGGCCCAACA

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1150 (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 379 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: protein (B) :1 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met (ATG) -1 -nél kezdődik” (Xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Glu

Pro

Lys

Ser 5

Cys

Asp

Lys

Thr

His 10

Thr

Cys

Pro

Cys 15

Pro

Alá

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

20

25

30

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

50

55

60

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Alá

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

65

70

75

80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

85

90

95

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

100

105

110

Alá

Leu

Pro

Alá

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Alá

Lys

Gly

Gin

115

120

125

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

Ile

Alá

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

165

170

175

HU 227 088 Β1

Tyr Lys

Thr

Thr 180

Pro

Val

Leu

Asp 185

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 190

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asp

Val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Alá

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

245

250

255

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Alá

Val

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Lle

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Alá

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Alá

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Alá

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Alá

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370 375 (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) NÉV/KULCS: miscjellemzö (B) :4 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met=ATG” (xi) A10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATATGGACC CAAAATCTGC TGACAAAACT CACACATGTC CACCTTGTCC AGCTCCGGAA CTCCTGGGGG GTCCTTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG

120

180

240

HU 227 088 Β1

GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTGGTC	AGCGTCCTCA	CCGTCCTGCA	CCAGGACTGG	300
CTGAATGGCA	AGGAGTACAA	GTGCAAGGTC	TCCAACAAAG	CCCTCCCAGC	CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC	CGAGAACCAC	AGGTGTACAC	CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AGCTGACCAA	GAACCAGGTC	AGCCTGACCT	GCCTGGTCAA	AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCGCCGTGGA	GTGGGAGAGC	AATGGGCAGC	CGGAGAACAA	CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC	TTCTTCCTCT	ACAGCAAGCT	CACCGTGGAC	600
AAGAGCAGGT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC	TCATGCTCCG	TGATGCATGA	GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG	TCTCCGGGTA	AAGTACCGAT	CCAGAAAGTT	720
CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG	ATCGTTACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAGTT	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACCTG	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCCTGC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	TCTTGAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGAAGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAGT	TGTTGCTCTG	1080
TCCCGTCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACATG	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGGTTGT	1140
TAATGGATCC						1150

(2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1150 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A11. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTATACCTTG	GTTTTAGACG	ACTGTTTTGA	GTGTGTACAG	GTGGAACAGG	TCGAGGCCTT	60
GAGGACCCCC	CAGGAAGTCA	GAAGGAGAAG	GGGGGTTTTG	GGTTCCTGTG	GGAGTACTAG	120
AGGGCCTGGG	GACTCCAGTG	TACGCACCAC	CACCTGCACT	CGGTGCTTCT	GGGACTCCAG	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTCTGTTT	CGGCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG	TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GGTCCTGACC	300
GACTTACCGT	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTGTTTC	GGGAGGGTCG	GGGGTAGCTC	360
TTTTGGTAGA	GGTTTCGGTT	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACGAGGC	ACTACGTACT	CCGAGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGCTA	GGTCTTTCAA	720
GTCCTGCTGT	GGTTTTGGAA	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAA	TGTCCGGACC	TGAAGTAGGG	CCCAGACGTG	840
GGCTAGGACT	GGAACAGGTT	TTACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAATTGG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAGGTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTGTAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140
ATTACCTAGG						1150

(2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 379 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen

HU 227 088 Β1 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: protein (B) : 1

(D): EGYEB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés^,Met (ATG) -1-nél kezdődik

(xi) A12

. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Glu

Pro

Lys

Ser

Ala

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

1

5

10

15

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

20

25

30

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

lle

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

50

55

60

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

65

70

75

80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

85

90

95

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

100

105

110

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

He

Glu

Lys

Thr

lle

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

115

120

125

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

lle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

lle

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

lle

Lys

Thr

lle

Val

Thr

Arg

lle

Asn

Asp

245

250

255

lle

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

HU 227 088 Β1

Asp

Phe

Lle 275

Pro

Gly

Leu

His

Pro 280

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser 285

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Alá

Val

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Lle

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Alá

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Alá

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Alá

Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Alá

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

355

360

365

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370 375 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1135 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: miscjellemző (B) :4 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met=ATG” (xi)A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGTCCACCT	TGTCCAGCTC	CGGAACTCCT	GGGGGGTCCT	60
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	TGGCAAGGAG	300
TACAAGTGCA	AGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CATCTCCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTG	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCCT	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	AACCTTCGCG	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	GCCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020
GGGGTCCTGG	AAGCATCCGG	TTACAGCACC	GAAGTTGTTG	CTCTGTCCCG	TCTGCAGGGT	1080
TCCCTTCAGG	ACATGCTTTG	GCAGCTGGAC	CTGTCTCCGG	GTTGTTAATG	GATCC	1135

HU 227 088 Β1 (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1135 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi) A14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTATACCTGT	TTTGAGTGTG	TACAGGTGGA	ACAGGTCGAG	GCCTTGAGGA	CCCCCCAGGA	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGGGG	TTTTGGGTTC	CTGTGGGAGT	ACTAGAGGGC	CTGGGGACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGGTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCGT	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTCCTC	300
ATGTTCACGT	TCCAGAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGGGGT	AGCTCTTTTG	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGGACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTTACC	CGTCGGCCTC	TTGTTGATGT	TCTGGTGCGG	AGGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTGC	AGAAGAGTAC	GAGGCACTAC	GTACTCCGAG	ACGTGTTGGT	GATGTGCGTC	660
TTCTCGGAGA	GGGACAGAGG	CCCATTTCAT	GGCTAGGTCT	TTCAAGTCCT	GCTGTGGTTT	720
TGGAATTAAT	TTTGCTAGCA	ATGCGCATAG	TTGCTGTAGT	CAGTGTGGGT	CAGCCACTCG	780
AGATTTGTCT	TTCAATGTCC	GGACCTGAAG	TAGGGCCCAG	ACGTGGGCTA	GGACTGGAAC	840
AGGTTTTACC	TGGTCTGGGA	CCGACATATG	GTCGTCTAGA	ATTGGAGGTA	CGGCAGGGCA	900
TTGCAATAGG	TCTAGAGATT	GCTGGAGCTC	TTGGAAGCGC	TGGACGACGT	GCACGACCGT	960
AAGAGGTTTA	GGACGGTGGA	CGGTACCCGA	AGTCCAGAAC	TCTGAGACCT	GAGAGACCCG	1020
CCCCAGGACC	TTCGTAGGCC	AATGTCGTGG	CTTCAACAAC	GAGACAGGGC	AGACGTCCCA	1080
AGGGAAGTCC	TGTACGAAAC	CGTCGACCTG	GACAGAGGCC	CAACAATTAC	CTAGG	1135

(2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 374 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: ismeretlen (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: protein (B) :1 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met (ATG) -1-nél kezdődik” (xi)A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Asp

Lys

Thr

His 5

Thr

Cys

Pro

Cys 10

Pro

Alá

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser 20

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 25

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 30

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 35

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 40

Thr

Cys

Val

Val 45

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

55 60

HU 227 088 Β1

Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr

70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn

90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Alá Leu Pro Alá Pro 100 105 110

Ile Glu Lys Thr Lle Ser Lys Alá Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205

Met His Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220

Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr

225 230 235 240

Leu Lle Lys Thr Lle Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin

245 250 255

Ser Val Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Lle Pro Gly 260 265 270

Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Alá Val 275 280 285

Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gin Ile 290 295 300

Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Alá Phe

305 310 315 320

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Alá Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp

325 330 335

Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Alá Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 340 345 350

Alá Leu Ser Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu 355 360 365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370

HU 227 088 Β1 (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) NÉV/KULCS: miscjellemző (B) :4 (D): EGYÉB INFORMÁCIÓK: /megjegyzés=„Met=ATG” (xi)A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGCCCACCG	TGCCCAGCTC	CGGAACTCGA	AGGTGGTCCG	60
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	TGGCAAAGCT	300
TACGCATGCG	CGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CATCTCCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTG	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCCT	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	AACCTTCGCG	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	GCCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020
GGGGTCCTGG	AAGCATCCGG	TTACAGCACC	GAAGTTGTTG	CTCTGTCCCG	TCTGCAGGGT	1080
TCCCTTCAGG	ACATGCTTTG	GCAGCTGGAC	CTGTCTCCGG	GTTGTTAATG	GATCC	1035

(2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 1135 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (xi)A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTATACCTGT	TTTGAGTGTG	TACGGGTGGC	ACGGGTCGAG	GCCTTGAGCT	TCCACCAGGC	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGGGG	TTTTGGGTTC	CTGTGGGAGT	ACTAGAGGGC	CTGGGGACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGGTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCGT	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTTCGA	300
ATGCGTACGC	GCCAGAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGGGGT	AGCTCTTTTG	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGGACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTTACC	CGTCGGCCTC	TTGTTGATGT	TCTGGTGCGG	AGGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTGC	AGAAGAGTAC	GAGGCACTAC	GTACTCCGAG	ACGTGTTGGT	GATGTGCGTC	660

HU 227 088 Β1

TTCTCGGAGA

TGGAATTAAT

AGATTTGTCT

AGGTTTTACC

TTGCAATAGG

AAGAGGTTTA

CCCCAGGACC

AGGGAAGTCC

GGGACAGAGG

TTTGCTAGCA

TTCAATGTCC

TGGTCTGGGA

TCTAGAGATT

GGACGGTGGA

TTCGTAGGCC

TGTACGAAAC

CCCATTTCAT

ATGCGCATAG

GGACCTGAAG

CCGACATATG

GCTGGAGCTC

CGGTACCCGA

AATGTCGTGG

CGTCGACCTG

GGCTAGGTCT

TTGCTGTAGT

TAGGGCCCAG

GTCGTCTAGA

TTGGAAGCGC

AGTCCAGAAC

CTTCAACAAC

GACAGAGGCC

TTCAAGTCCT

CAGTGTGGGT

ACGTGGGCTA

ATTGGAGGTA

TGGACGACGT

TCTGAGACCT

GAGACAGGGC

CAACAATTAC

GCTGTGGTTT

CAGCCACTCG

GGACTGGAAC

CGGCAGGGCA

GCACGACCGT

GAGAGACCCG

AGACGTCCCA

CTAGG

720

780

840

900

960

1020

1080

1135 (2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) NÉV/KULCS: protein (B) :1

(D):l

EGYEI

B INFORMA'

CIOK:

/megji

sgyzés

i=„Met

(atg;

1 -1 -nél keze

lődik”

(X

i) A18

. SZÁMÚ SZ

EKVE

NCIAI

_EÍRÁ

SA:

Met

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Alá

Pro

Glu

Leu

Glu

1

5

10

15

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

20

25

30

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val

His

Asn

Alá

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Alá

Tyr

Alá

Cys

Alá

Val

Ser

Asn

Lys

Alá

Leu

Pro

Alá

Pro

100

105

110

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Alá

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Alá

Val

145

150

155

160

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165

170

175

HU 227 088 Β1

Pro

Val

Leu

Asp 180

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 185

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 190

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Alá

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

260

265

270

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Alá

Val

275

280

285

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Alá

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Alá

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Alá

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

340

345

350

Alá

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Fehérje, amely R-|-R₂ vagy R-|-L-R₂ általános képlettel rendelkezik, ahol:

R·! jelentése egy Fc fehérje vagy egy Fc fehérje analóg 45 vagy egy Fc fehérje származék, amely az alábbi csoportból választott aminosavszekvenciát tartalmazza:

(a) a 9. számú szekvencia 1-233 aminosavai, a 12. számú szekvencia 1-233 aminosavai, a 15. számú szekvencia 1-228 aminosavai vagy a 50 18. számú szekvencia 1-228 aminosavai, (b) az (a) alrész aminosavszekvenciája, mely egy eltérő aminosavat tartalmaz, melyet a következő pozíciók egyikében vagy többje esetében helyettesítünk vagy deléciónak vetünk alá (a 9. 55 számú szekvencia szerinti számozás alapján):

(i) egy vagy több ciszteinmaradékot helyettesítünk alanin- vagy szerinmaradékkal;

(ii) egy vagy több tirozinmaradékot helyettesítünk egy fenil-alanin-maradékkal; 60 (iii) az 5. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(iv) a 20. pozícióban levő aminosavat glutaminsavval helyettesítjük;

(v) a 103. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(vi) a 105. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(vii) a 107. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(viii) az 1., 2., 3., 4. vagy 5. pozíciókban levő aminosavakat deléciónak vetjük alá;

(ix) a 15-ös pozícióban lévő aminosavat helyettesítjük az F_c receptor kötő hely eltávolítása céljából;

(x) egy vagy több a 98, 100 és 102 pozíciókban található aminosavat helyettesítünk a komplementer (C1q) kötő hely eltávolítása céljából; vagy (xi) az i-x részek kombinációi;

HU 227 088 Β1 (c) az (a) vagy (b) alrészek aminosavszekvenciája, mely egy metioninmaradékot tartalmaz az N-terminálison;

(d) az (a)-(c) alrészek F_c fehérjéje, analógja vagy származéka egy fehérjelánchoz kapcsolódó kémiai egységet tartalmaz;

(e) a (d) alrész egy származéka, melyben az említett kémiai egység egy vízoldható polimer lánc;

(f) az (e) alrész egy származéka, melyben az említett vízoldható polimer lánc polietilénglikol;

(g) az (e) alrész egy származéka, melyben az említett vízoldható polimer lánc egy poliaminosavlánc; és (h) az (e) alrész egy származéka, melyben az említett vízoldható polimer lánc egyedül az említett fehérjelánc N-terminusához kapcsolódik;

R₂ jelentése egy OB fehérje, egy OB fehérje analóg vagy egy OB fehérje származék, amely az alábbi csoportba tartozó aminosavszekvenciát tartalmaz:

(a) a 3. vagy 6. sz. szekvencia 1-146 aminosavai;

(b) a 6. számú szekvencia 1-146 aminosavai, ahol a 35-ös pozícióban egy lizinmaradék és a 74-es pozícióban egy izoleucinmaradék van jelen;

(c) a (b) alpontban aminosavszekvencia, ahol az alábbi pozíciók közül egynél vagy többnél eltérő aminosavak vannak jelen: (6. számú szekvencia számozását alapul véve): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71,74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118,136, 138,142 és 145;

(d) az (a), (b) vagy (c) alpontokban szereplő aminosavszekvenciák, amelyeknél a 28-as pozícióban adott esetben nincs jelen egy glutaminilmaradék;

(e) az (a), (b) (c) vagy (d) alpontokban szereplő aminosavszekvenciák, amelyeknél az N-terminálison egy metionilmaradék található;

(f) csonkolt OB fehérje analóg, amelyet az alábbi csoportból választunk (a 35-ös pozícióban lizinmaradékot és a 74-es pozícióban izoleucinmaradékot tartalmazó 6. számú szekvencia számozását alapul véve):

(i) a 98-146 aminosavak (ii) az 1-32 aminosavak (iii) a 40-116 aminosavak (iv) az 1-99 és 112-146 aminosavak (v) az 1-99 és 112-146 aminosavak, ahol a 100-111 pozíciókban lévő aminosavak közül egyet vagy többet sorrendben a 99 és a 112 pozíciókban lévő aminosavak közé illesztünk;

(vi) az (f)(i) alpontban ismertetett csonkolt OB fehérje amelynél a 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 és 145 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(vii) az (f)(ii) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél a 4, 8 és 32 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(viii) az (f)(iii) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél az 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 és 112 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(ix) az (f)(iv) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél a 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 és 145 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(x) az (f)(v) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél a 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105,106,107,108,111, 112,118,136, 138, 142 és 145 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(xi) az (f)(i)-(x) alpontok bármelyike szerinti csonkolt analóg, amely az N-terminálison egy metioninmaradékkal rendelkezik;

(g) az (a)-(f) alpontok bármelyike szerinti aminosavszekvencia, amely továbbá egy a fehérjelánchoz kapcsolódó kémiai egységet tartalmaz;

(h) a (g) alpont szerinti aminosavszekvencia egy származéka, amelynél az említett kémiai egység egy vízoldható polimer lánc;

(i) a (h) alpont szerinti aminosavszekvencia származéka, amelynél az említett vízoldható polimer lánc polietilénglikol;

(j) a (h) alpont szerinti aminosavszekvencia, ahol az említett vízoldható polimer lánc egy poliaminosavlánc; és (k) a (h) alpont szerinti aminosavszekvencia, ahol az említett vízoldható polimer lánc kizárólag az említett fehérjelánc N-terminálisához kapcsolódik; és

L egy linker.
2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a linker egy vagy több olyan aminosavat jelent, melyeket a glicint, aszparagint, szerint, treonint és alanint tartalmazó csoportból választjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a linkért az (a) ala, ala, ala;

(b) ala, ala, ala, ala;

(c) ala, ala, ala, ala, ala;

(d) gly, gly;

(e) gly, gly, gly;

(f) gly, gly, gly, gly, gly;

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly;

(h) gly-pro-gly;

(I) gly, gly, pro, gly, gly;

(j) egy kémiai egység; és (k) az (a)-(j) alrészek bármilyen kombinációjából szelektáljuk.

HU 227 088 Β1
4. Egy fehérjét kódoló nukleinsavszekvencia, amely Ri-R₂ vagy R-|-L-R₂ általános képlettel rendelkezik, ahol:

R-ι jelentése egy Fc fehérje vagy egy Fc fehérje analóg vagy egy Fc fehérje származék, amely az alábbi csoportból választott aminosavszekvenciát tartalmazza:

(a) a 9. számú szekvencia 1-233 aminosavai, a 12. számú szekvencia 1-233 aminosavai, a 15. számú szekvencia 1-228 aminosavai vagy a 18. számú szekvencia 1-228 aminosavai, (b) az (a) alrész aminosavszekvenciája, mely egy eltérő aminosavat tartalmaz, melyet a következő pozíciók egyikében vagy többje esetében helyettesítünk vagy deléciónak vetünk alá (a 9. számú szekvencia szerinti számozás alapján):

(i) egy vagy több ciszteinmaradékot helyettesítünk alanin- vagy szerinmaradékkal;

(ii) egy vagy több tirozinmaradékot helyettesítünk egy fenil-alanin-maradékkal;

(iii) az 5. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(iv) a 20. pozícióban levő aminosavat glutaminsavval helyettesítjük;

(v) a 103. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(vi) a 105. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(vii) a 107. pozícióban levő aminosavat egy alaninnal helyettesítjük;

(viii) az 1., 2., 3., 4. vagy 5. pozícióban levő aminosavakat deléciónak vetjük alá;

(ix) a 15-ös pozícióban lévő aminosavat helyettesítjük az F_c receptor kötő hely eltávolítása céljából;

(x) egy vagy több a 98, 100 és 102 pozíciókban található aminosavat helyettesítünk a komplementer (C1q) kötő hely eltávolítása céljából; és (xi) az i-x részek kombinációi;

(c) az (a) vagy (b) alrészek aminosavszekvenciája, mely egy metioninmaradékot tartalmaz az N-terminálison (d) az (a)-(c) alrészek aminosavszekvenciája, analógja vagy származéka egy a fehérjelánchoz kapcsolódó kémiai egységet tartalmaz;

(e) a (d) alrész egy aminosavszekvenciája, amelyben az említett kémiai egység egy vízoldható polimer lánc;

(f) a (d) alrész egy aminosavszekvenciája, amelyben az említett vízoldható polimer lánc polietilénglikol;

(g) a (d) alrész egy aminosavszekvenciája, amelyben az említett vízoldható polimer lánc egy poliaminosavlánc; és (h) a (d) alrész egy aminosavszekvenciája, amelyben az említett vízoldható polimer lánc egyedül az említett fehérjelánc N-terminusához kapcsolódik;

R₂ jelentése egy OB fehérje, egy OB fehérje analóg vagy egy OB fehérje származék, amely az alábbi csoportba tartozó aminosavszekvenciát tartalmaz:

(a) a 3. vagy 6. sz. szekvencia 1-146 aminosavai;

(b) a 6. sz. szekvencia 1-146 aminosavai, ahol a 35-ös pozícióban egy lizinmaradék és a 74-es pozícióban egy izoleucinmaradék van jelen;

(c) a (b) alpontban aminosavszekvencia, ahol az alábbi pozíciók közül egynél vagy többnél eltérő aminosavak vannak jelen: (6. számú szekvencia számozását alapul véve): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71,74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111,112, 118, 136,138, 142 és 145;

(d) az (a), (b) vagy (c) alpontokban szereplő aminosavszekvenciák, amelyeknél a 28-as pozícióban adott esetben nincs jelen egy glutaminilmaradék;

(e) az (a), (b) (c) vagy (d) alpontokban szereplő aminosavszekvenciák, amelyeknél az N-terminálison egy metionilmaradék található;

(f) csonkolt OB fehérje analóg, amelyet az alábbi csoportból választunk (a 35-ös pozícióban lizinmaradékot és a 74-es pozícióban izoleucinmaradékot tartalmazó 6. számú szekvencia számozását alapul véve):

(i) a 98-146 aminosavak (ii) az 1-32 aminosavak (iii) a 40-116 aminosavak (iv) az 1-99 és 112-146 aminosavak (v) az 1-99 és 112-146 aminosavak, ahol a 100-111 pozíciókban lévő aminosavak közül egyet vagy többet sorrendben a 99 és a 112 pozíciókban lévő aminosavak közé illesztünk;

(vi) az (f)(i) alpontban ismertetett csonkolt OB fehérje, amelynél a 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 és 145 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosawal helyettesített;

(vii) az (f)(ii) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél a 4, 8 és 32 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(viii) az (f)(iii) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél az 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 és 112 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(ix) az (f)(iv) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél a 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 és 145 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosawal helyettesített;

(x) az (f)(v) alpont szerinti csonkolt analóg, amelynél a 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100,

HU 227 088 Β1

102,105, 106,107,108,111, 112,118,136, 138, 142 és 145 pozíciókban lévő aminosavak közül egy vagy több egy másik aminosavval helyettesített;

(xi) az (f)(i)—(x) alpontok bármelyike szerinti csonkolt analóg, amely az N-terminuson egy metioninmaradékkal rendelkezik;

(g) az (a)-(f) alpontok bármelyike szerinti aminosavszekvencia, amely továbbá egy a fehérjelánchoz kapcsolódó kémiai egységet tartalmaz;

(h) a (g) alpont szerinti aminosavszekvencia egy származéka, amelynél az említett kémiai egység egy vízoldható polimer lánc;

(i) a (h) alpont szerinti aminosavszekvencia származéka, amelynél az említett vízoldható polimer lánc polietilénglikol;

(j) a (h) alpont szerinti aminosavszekvencia, ahol az említett vízoldható polimer lánc egy poliaminosavlánc; és (k) a (h) alpont szerinti aminosavszekvencia, ahol az említett vízoldható polimer lánc kizárólag az említett fehérjelánc N-terminálisához kapcsolódik; és

L jelentése egy linker.
5. A 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy olyan fehérjét kódol, mely egy olyan linkért tartalmaz, melyben egy vagy több olyan aminosav szerepel, melyeket a Gly, Asn, Ser, Thr és Ala aminosavakat tartalmazó csoportból választunk.
6. A 4. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy olyan fehérjét kódol, melyben a linkért az (a) ala, ala, ala;

(b) ala, ala, ala, ala;

(c) ala, ala, ala, ala, ala;

(d) gly, gly;

(e) gly, gly, gly;

(f) gly, gly, gly, gly, gly;

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly;

(h) gly-pro-gly;

(I) gly, gly, pro, gly, gly;

(j) egy kémiai egység; és (k) az (a)-(j) alrészek bármilyen kombinációjából választjuk.
7. Egy vektor, azzal jellemezve, hogy a 4-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor egy pAMG21 vektor, és a nukleinsavszekvencia a 4-6. igénypontok bármelyike szerinti.
9. Egy prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy 8. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
10. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő körülmények között tenyésztjük a 9. igénypont szerinti gazdasejtet és a termelt fehérjét izoláljuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még a termelt fehérje tisztítását is magában foglalja.
12. Egy gyógyszerészeti készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje egy hatékony mennyiségét tartalmazza egy gyógyszerészetileg elfogadható hígítóban, hatásjavítóban vagy hordozóban.
13. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása tömegfelesleg, diabétesz, magas vérlipidszint, artériás szklerózis, artériás plakk, elégtelen sovány hústömeg, elégtelen inzulinnal szembeni érzékenység vagy stroke kezelésére szolgáló vagy epekő képződésének csökkentésére vagy megakadályozására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.