CZ9902036A3 - OB fúzní protein -kompozice a způsoby - Google Patents

Description

OB fúzní protein - kompozice a způsoby

Oblast techniky

Vynález se týká Fc-OB fúzního proteinu, způsobů jeho přípravy a použití. Dále se vynález týká farmaceutických kompozic na bázi tohoto proteinu.

Dosavadní stav techniky

Ačkoliv je molekulární základ obezity z velké části neznámý, identifikace „OB genu a kódovaného proteinu („OB proteinu neboli „leptinu) do určité míry osvětlila mechanismus, který organismus používá pro regulaci ukládání tělesného tuku - viz PCT publikace WO 96/05309 (12/22/96), Friedman et al.; Zhang et al., Nátuře 372, str. 425 až 432 (1994) a také Correction at Nátuře 374, str. 479 (1995). OB protein je aktivní in vivo jak u mutantních myší ob/ob (myši, u nichž je příčinou obezity defekt v produkci produktu OB genu), tak u normálních myší divokého typu. Biologická aktivita se manifestuje mj. ztrátou hmotnosti. Obecně viz Barrinaga, „Obese Protein Slims Míce, Science 269, str. 475 až 456 (1995). OB protein, jeho deriváty a jejich použití jako modulátorů kontroly hmotnosti a adiposity u živočichů, jako u savců a lidí, jsou velmi podrobně popsány v PCT publikaci WO 96/05309 (12/22/96), která zde je citována náhradou na přenesení celého jejího obsahu, včetně obrázků, do tohoto textu.

Ostatní biologické účinky OB proteinu nejsou dobře charakterizovány. Je například známo, že u ob/ob mutantních myší podávání OB proteinu vede ke zvýšení hladiny insulinu v séru a hladiny glukosy v séru. Je rovněž známo, že podávání OB proteinu vede ke snížení hladiny sérového inzulínu a sérové glukosy. Je také známo, že podávání OB proteinu má za následek snížení tělesného tuku. To bylo zjištěno jak u ob/ob mutantních myší, tak u neobézních normálních myší.

(Viz Pelleymounter et al., Science 269, str. 540 až 543, 1995; Halaas et al., Science 269, str. 543 až 546, 1995 a dále Campfield et al., Science 269, str. 546 až 549, 1995, Peripheral and centrál administration of microgram doses of OB protein reduced food intake and body weight of ob/ob and diet-induced obese mice but not in db/db obese mice.) Podle žádné z těchto zpráv nebyla pozorována toxicita, a to ani při nejvyšších dávkách.

Přes příslib klinického využití OB proteinu, není mechanismus jeho působení in vivo zcela objasněn. Informace o OB receptoru ukazují vysokou vazebnou afinitu k OB proteinu zjištěném v hypothalamu potkana, což dokazuje umístění OB receptoru - viz Stephens et al., Nátuře 377, str. 530 až 532. Myš db/db vykazuje stejný fenotyp jako myš ob/ob, tj. extrémní obezitu a diabetes typu II. Má se za to, že k tomuto fenotypu vede defektní OB receptor, zejména proto, že myši db/db neodpovídají na podávání OB proteinu (viz Stephens, výše uvedená citace).

Pokrok dosažený v technologiích s rekombinantni DNA, který zvýšil dostupnost rekombinantních proteinů pro terapeutická použití, se odrazil v rozvoji formulace a chemické modifikace proteinů. Jedním z cílů takové modifikace je • · · ·

ochrana proteinu a snížení jeho degradace. Fúzní proteiny a chemické připojení mohou účinně blokovat fyzický kontakt proteolytického enzymu s hlavním řetězcem proteinu, a tak bránit degradaci. Jako další výhody je za určitých okolností možno uvést zvýšení stability, doby cirkulace a biologické aktivity terapeutického proteinu. Přehledný popis modifikace proteinů a fúzních proteinů lze nalézt ve Francis, Focus on Growth Factors 3, str. 4 až 10 (květen 1992), vyd. Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lané, Londýn N2 0,

OLD, Velká Británie.

Jednou z takových modifikací je použití Fc regionu imunoglobulinů. Protilátky obsahují dvě funkčně nezávislé části, variabilní doménu, známou jako „Fab, která váže antigen, a konstantní doménu, známou jako „Fc, která poskytuje spojení na efektorové funkce, jako komplementu nebo fagocytů. Fc část imunoglobulinu má dlouhý poločas v plasmě, zatímco Fab část má poločas krátký (Capon et al., Nátuře 337, 525 až 531, 1989).

Terapeutické proteinové produkty byly zkonstruovány za použití Fc domény, aby se dosáhlo delšího poločasu nebo začlenění funkcí, jako je vazba Fc receptoru, vazba proteinu A, fixace komplementu a prostup placentou, které všechny náleží Fc proteinům imunoglobulinů. Tak například byla fúzována Fc oblast protilátky IgGl s N-terminálním koncem CD30-L, molekuly, která váže receptory CD30 exprimované na nádorových buňkách Hodgkinova nádoru, buňkách anaplastického lymfomu, leukemických T-buňkách a maligních buňkách jiných typů (viz US patent č. 5 480 981). IL-10, protizánětlivé činidlo a látka snižující odmítavou reakci, byl za účelem zvýšení poločasu cirkulace cytokinů fúzován s myší Fcy2a (Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154: 5590 až 5600, 1995). Byly také zpracovány studie hodnotící použití receptorů faktoru nekrosy nádorů vázaného s Fc proteinem lidského IgGl při léčení pacientů postižených septickým šokem (Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334, 1697 až 1702, 1996; Van Zee, K. et al. , The Journal of Immunology, 156, 2221 až 2230, 1996). Fc byl také fúzován s receptorem CD4 za vzniku terapeutického proteinu pro léčení AIDS (viz Capon et al. , Nátuře, 337,. 525 až 531, 1989). Kromě toho byl za účelem překonání krátkého poločasu interleukinu 2 a jeho systemické toxicity fúzován N-konec interleukinu 2 s Fc částí IgGl nebo IgG3 (viz Harvill et al., Immunotechnology, 1, 95 až 105, 1995).

Vzhledem k tomu, že OB protein byl identifikován jako slibný terapeutický protein, vznikla potřeba vyvinout kompozice na bázi OB analogu pro klinické použití, které by se podávaly spolu s OB proteinem nebo namísto něho. Tento vývoj by mohl být zaměřen na kompozice na bázi OB analogu, při němž by se formulacemi a chemickými modifikacemi proteinů dosáhlo snížení degradace proteinu, zvýšení stability a doby cirkulace. Takové kompozice jsou předmětem tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou kompozice na bázi Fc-OB fúzního proteinu, způsoby jejich přípravy a jejich použití.

Předmětem vynálezu je zejména genetický fúzní protein, který obsahuje Fc oblast nebo analog imunoglobulinu fúzovaný s Nterminální oblastí OB proteinu nebo analogu. Fc-OB fúzní protein je schopen dimerizace na cysteinových zbytcích Fc oblasti. Neočekávaně se ukázalo, že genetická fúzní modifi-

• · 4 4 4 4 ·· ·· • · 4 4 4 · · • 4 4 4 4 4 4 kace s Fc na N-konci OB proteinu je výhodná z hlediska stability, rychlosti clearance a snížení degradace. Těchto výhod se u OB proteinu nebo u fúze Fc s C-koncem OB proteinu nedosáhne. Překvapivé a důležité je zjištění, že ve srovnání s OB proteinem nebo Fc modifikací na C-konci OB proteinu, modifikace na N-konci OB proteinu poskytuje neočekávanou ochranu proteinu před degradací, prodlouženou dobu cirkulace a zvýšenou stabilitu. Tyto neočekávané výhody vyplývající z Fc modifikace OB proteinu by pro konzumenty OB proteinu byly prospěšné, jelikož tyto změny přispívají požadovanému snížení dávek nebo nižší frekvenci podávání. Tento vynález, jak je podrobněji popsáno dále, má tedy řadu aspektů spojených s genetickou modifikací proteinů prostřednictvím fúze Fc oblasti s OB proteinem (nebo jeho analogem), jakož i se specifickými modifikacemi, způsoby výroby a použití.

Podle jednoho aspektu je předmětem vynálezu Fc-OB fúzní protein, v němž je Fc oblast geneticky fúzována s N-koncem OB proteinu (nebo jeho analogu). Kromě toho, jak je známo odborníkům v tomto oboru, může být Fc oblast připojena k N-konci OB proteinu (nebo jeho analogu) prostřednicvím peptidového nebo chemického linkeru. Jak již bylo poznamenáno výše a je podrobněji popsáno dále, Fc-OB fúzní protein vykazuje neočekávanou ochranu proti degradaci, prodlouženou dobu cirkulace a zvýšenou stabilitu ve srovnání s OB proteinem nebo C-terminálními OB-Fc fúzními proteiny. Podle dalších aspektů jsou tedy předmětem vynálezu nejen kompozice na bázi Fc-OB fúzního proteinu, ale také DNA sekvence kódující takové proteiny, příslušné vektory a hostitelské buňky obsahující takové vektory, které jsou užitečné pro produkci fúzních proteinů podle vynálezu.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou způsoby přípravy Fc-OB fúzního proteinu. Tyto postupy zahrnují postupy s rekombinantní DNA pro přípravu rekombinantních proteinů a dále způsoby fermentace a purifikace.

Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob léčení nadváhy u osob nebo živočichů, při němž se podáváním Fc-OB fúzního proteinu snižuje ukládání tuku. Vzhledem k vlastnostem Fc-OB fúzního proteinu se při tomto způsobu za použití tohoto proteinu sníží množství a/nebo frekvence podávání OB proteinu.

Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu způsob léčení chorobných stavů spojených s nadbytkem tukové tkáně, jako je diabetes, dys- nebo hyperlipidemie, arteriální sklerosa a arteriální plát, způsob redukce nebo prevence tvorby žlučových kamenů, léčení mrtvice a rovněž způsob zvyšování citlivosti na inzulín a/nebo zvyšování hmoty tkání tvořených převážně svalovinou bez tuku.

Podle dalšího aspektu jsou předmětem vynálezu farmaceutické kompozice na bázi Fc-OB proteinů a analogů a jejich derivátů pro použití při léčení výše uvedených stavů.

Popis obr, na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna rekombinantní myší metOB (dvouřetězcová) DNA (SEQ. ID. NO: 1 a 2) a sekvence aminokyselin (SEQ. ID: NO: 3).

• · · ·

Na obr. 2 je znázorněn rekombinantní lidský metOB analog DNA (dvouřetězcové) (SEQ. ID. NO: 4 a 5) a sekvence aminokyselin (SEQ. ID. NO: 6) .

Na obr. 3 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská metFc-OB (dvouřetězcová) DNA (SEQ. ID. NO: 7 a 8) a sekvence aminokyselin (SEQ. ID. NO: 9) .

Na obr. 4 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská metFc-OB varianta (dvouřetězcová) DNA (SEQ. ID. No: 10 a 11) a sekvence aminokyselin (SEQ. ID. NO: 12).

Na obr. 5 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská metFc-OB varianta (dvouřetězcová) DNA (SEQ. ID. No: 13 a 14) a sekvence aminokyselin (SEQ. ID. NO: 15).

Na obr. 6 (A-C) je znázorněna rekombinantní lidská metFc-OB varianta (dvouřetězcová) DNA (SEQ. ID. No: 16 a 17) a sekvence aminokyselin (SEQ. ID. NO: 18).

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Předmětem vynálezu jsou kompozice na bázi Fc-OB fúzního proteinu, způsoby přípravy takových kompozic a jejich použití. Konkrétně se vynález týká genetické nebo chemické fúze Fc oblasti imunoglobulinu s N-terminální oblastí OB proteinu. Neočekávané se zjistilo, že fúze Fc na N-konec OB proteinu vykazuje výhody, které OB protein nebo fúze Fc na C-konec OB proteinu nemá. N-terminální Fc modifikace OB proteinu mu překvapivě poskytuje neočekávanou ochranu před degradací, prodlouženou dobu cirkulace a zvýšenou stabilitu. Fc-OB fúzní protein, jeho analogy a jejich deriváty, jakož i způsoby použití a přípravy jsou podrobněji popsány dále.

• · · · fcfcfcfc fcfc ·· • · · ·· · · ♦ · ♦ • fcfcfc · · · · • · · ··· · · · · • fc fc·· fcfc · ·« fcfc

Látky

Fc sekvence rekombinantní humánní Fc-OB sekvence uvedená v SEQ. ID. NO: 9 (viz obr. 3) může být zvolena ze souboru sestávajícího z těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgG-1 (viz Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10, 4071 až 4079, 1982) nebo jakékoliv jiné Fc sekvence známé v tomto oboru (například IgG jiných tříd, jejichž neomezujícími příklady jsou IgG-2, IgG-3 a IgG-4 nebo jiné imunoglobuliny). Varianty, analogy nebo deriváty Fc části mohou být zkonstruovány například různými záměnami zbytků nebo sekvencí.

Cysteinové zbytky lze odstranit nebo nahradit jinými aminokyselinami, aby se zabránilo 'vytvoření disulfidových příčných vazeb v Fc sekvenci. Konkrétně, aminokyselinou v poloze 5 SEQ. ID. NO: 9 je cysteinový zbytek. Rekombinantní Fc-OB sekvencí (SEQ. ID. NO: 9) je 378-aminokyselinový Fc-OB protein (nepočítaje v to methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence rekombinantního Fc-OB proteinu z obr. 3 je označována jako +1 s methioninem v poloze -1.

Cystein v poloze 5 je možno odstranit nebo nahradit jednou aminokyselinou nebo větším počtem aminokyselin. Cysteinový zbytek v poloze 6 je možno nahradit alaninem, čímž se získá variantní aminokyselinová sekvence znázorněná na obr. 4 (SEQ. ID. NO. 12). Rekombinantním Fc-OB proteinem z obr. 4 je 378-aminokyselinový Fc-OB (nepočítaje methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence pro rekombinantní Fc-OB protein z obr. 4 je označována jako +1 s methioninem v poloze -1.

Podobně by cystein v poloze 5 SEQ. ID. NO: 9 mohl být nahrazen serinem nebo zbytkem jiné aminokyseliny nebo vy···· t ·· ···· ♦· 49 ·· · · · «··· • · ··· · · · 4

4 9 4 9 4 4 4 4 9

444 44 4 44 44 puštěn. Variantu nebo analog je také možno připravit delecí aminokyselin v polohách 1, 2, 3, 4 a 5, jak je tomu například u varianty v SEQ. ID. NO. 15 (viz obr. 5). Zbytky v těchto polohách je také možno nahradit, a takové substituce spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Rekombinantní Fc-OB protein z obr. 5 je Fc-OB proteinem se 373 aminokyselinami (nepočítaje methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence pro rekombinantní Fc-OB protein z obr. 5 je označována jako +1 s methioninem v poloze -1.

Modifikace je také možno provádět za účelem zavedení čtyř aminokyselinových substitucí pro odstranění vazebného místa Fc receptorů a vazebného místa komplementu (Clq). Tyto variantní modifikace ze SEQ. ID. NO: 15 by zahrnovaly nahrazení leucinu v poloze 15 kyselinou glutamovou, nahrazení kyseliny glutamové v poloze 98 alaninem a nahrazení lysinu v polohách 100 a 102 alaninem (viz obr 6 a SEQ. ID. NO: 18). Rekombinantní Fc-OB protein z obr. 6 je Fc-OB proteinem se 373 aminokyselinami (nepočítaje methioninový zbytek). První aminokyselina sekvence pro rekombinantní Fc-OB protein z obr. 6 je označena jako +1 s methioninem v poloze -1.

Podobně je jeden nebo více tyrosinových zbytků možno nahradit fenylalaninovými zbytky. Kromě toho je možno provést jiné variantní inserce, delece a/nebo substituce aminokyselin, které rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Dále přicházejí v úvahu alterace ve formě alterovaných aminokyselin, jako jsou peptidomimetika nebo D-aminokyseliny. Fc protein je také možno navázat na OB proteiny Fc-OB proteinu pomocí „linkerových zbytků, kterými jsou buď zbytky chemických sloučenin nebo zbytky aminokyselin o různé délce. Takové chemické linkery jsou odborníkům v tomto oboru

99

9 9 9 «9 9 • 9 · • 9 dobře známy. Jako neomezující příklady sekvencí aminokyseli9· 9999

9 9

9 9 • 9

999

9 9

9

9 9 9

99

nových linkerů je možno uvést:

(a) ala, ala, ala;

(b) ala, ala, ala, ala;

(c) ala, ala, ala, ala, ala;

(d) gly, gly;

(e) gly, gly, gly;

(f) gly/ gly» gly/ gly, giy;

(g) gly/ gly, gly, gly, gly, gly, gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly/ gly/ pro, gly, gly; a

(j) kteroukoliv kombinaci (a) až (i).

OB část Fc-OB fúzního proteinu může být zvolena ze souboru sestávajícího z rekombinantního myšího proteinu popsaného v SEQ. ID. NO: 3 (viz obr. 1) a rekombinatního lidského proteinu uvedeného v Zhang et al., Nátuře, viz výše a proteinu shodného s tímto proteinem, který však v poloze 28 postrádá glutaminylový zbytek (viz Zhang et al., Nátuře, viz výše, str. 428). Rovněž je možno použít analogu rekombinantního lidského OB proteinu, který je uveden v SEQ. ID. NO: 6 (viz obr. 2), jenž obsahuje (1) arginin namísto lysinu v poloze 35; a (2) leucin namísto isoleucinu v poloze 74 (zkratka tohoto analogu je „rekombinantni lidský R—»L³⁵,

I—»L⁷⁴) . Aminokyselinová sekvence pro rekombinantni lidský a rekombinantni myší protein nebo jejich analogy s fúzovanou Fc částí na N-konci OB proteinu nebo bez této části jsou uvedeny dále s methionylovým zbytkem v poloze -1, ačkoliv v kterémkoliv z těchto OB proteinů a analogů může methionylový zbytek chybět.

4 44 ···· ·· ·· • 44 · · · 4 4 4 4 • 4 · · 4 4444

444 444 4444

444 44 4 44 44

Myší protein je v podstatě homologní s lidským proteinem, zejména ve formě maturovaného proteinu, zvláště na N-konci. Analog rekombinantního lidského proteinu je možno připravit alterací (jako substitucí aminokyselinových zbytků) aminokyselin v rekombinantní lidské sekvenci aminokyselinami, které se liší od myší sekvence. Jelikož rekombinantní lidský protein vykazuje biologickou aktivitu u myší, byl by takový analog pravděpodobně aktivní u lidí. Tak je například možno za použití lidského proteinu s lysinem v poloze 35 a isoleucinem v poloze 74, číslováno podle SEQ. ID. NO: 6, kde první aminokyselinou je valin a aminokyselinou v poloze 146 je cystein, jednu nebo více aminokyselin v polohách 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145 nahradit jinými aminokyselinami. Aminokyselinu je možno zvolit ze souboru sestávajícího z aminokyselin v odpovídajícících polohách myšího proteinu (SEQ. ID. NO: 3) a jiných aminokyselin.

Dále je možno připravovat „konvenční molekuly založené na sekvenci potkaního OB proteinu (viz publikace Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209, 944 až 952, 1995, která je zde citována náhradou za přenesení jejího obsahu do tohoto textu). Potkaní OB protein se od lidského OB proteinu liší v následujících polohách (za použití číslování ze SEQ. ID. NO: 6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 a 145. Jinou aminokyselinou je možno nahradit jednu nebo více aminokyselin v těchto polohách s odlišností. Podtržení označuje polohy, v nichž se od lidského OB proteinu odlišuje jak myší OB protein, tak i potkaní OB protein, tedy polohy, které jsou zvláště vhodné pro alteraci. Aminokyselinu z odpovídajícího potkaního OB frfrfrfr • · • fr ··fr · • · · • · · • · · • fr ··· • · fr frfr · frfr frfr fr frfr fr • · · · • frfr · • frfr · • fr frfr proteinu nebo jinou aminokyselinu je možno nahrazovat v jedné nebo více polohách.

Polohy aminokyselin jak z potkaního, tak z myšího OB proteinu, které se liší od maturovaného lidského OB proteinu jsou: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,

100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145. OB protein podle SEQ. ID. NO. 6, který má jednu nebo větší počet výše uvedených aminokyselin nahrazených jinou aminokyselinou, jako aminokyselinou, která se nachází v odpovídající potkaní nebo myší sekvenci, může být také účinný.

Kromě toho aminokyselinami, které se nacházejí v OB proteinu makaka rhesus a jsou odlišné od maturovaného lidského OB proteinu, jsou: 8 (S) , 35 (R) , 48 (V) , 53 (Q) , 60 (I), 66 (I), 67 (N), 68 (L) , 89 (L) , 100 (L) , 108 (Ε) , 112 (D) a 118 (L) (v závorkách je uvedena jednopísmenná zkratka aminokyseliny). Jelikož je rekombinantní lidský OB protein aktivní u opic Cynomolgus, lidský OB protein podle SEQ. ID. NO: 6 (s lysinem v poloze 35 a isoleucinem v poloze 74), v němž je jedna nebo větší počet takových „rhesus divergentních aminokyselin nahrazen jinou aminokyselinou, jako aminokyselinou uvedenou v závorkách, může být účinný. Je třeba poznamenat, že určité „rhesus divergentní aminokyseliny se také nacházejí ve výše uvedeném myším typu polohy 35, 68,

89, 100 a 112) . Je tedy možné připravit myší/rhesus/lidskou konvenční molekulu (s lysinem v poloze 35 a isoleucinem v poloze 74, číslováno podle SEQ. ID. NO: 6), kde je jedna

nebo	více	aminokyselin	v polohách 4, 8,	32,	33,	35,	48, 50,
53,	60, 64	, 66, 67, 68,	71, 74, 77, 78,	89,	97,	100	, 102,
105,	106,	107, 108, 111	, 112, 118, 136,	138,	142	a	145

nahrazeno jinou aminokyselinou.

···· · ·Φ ·♦·· ·· ·· ··· · · · · · · · • · · · ♦ 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 9 99 99

Další analogy je možno připravit deleci části aminokyselinové sekvence proteinu. Například maturovaný protein postrádá vedoucí sekvenci (-22 až -1). Lze připravit následující zkrácené formy molekul lidského OB proteinu (číslováno podle SEQ. ID. NO: 6) :

(a) aminokyseliny 98 až 146 (b) aminokyseliny 1 až 32 (c) aminokyseliny 40 až 116 (d) aminokyseliny 1 až 99 a (současně) 112 až 146 (e) aminokyseliny 1 až 99 a (současně) 112 až 146 s jednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěnými mezi aminokyseliny 99 a 112.

Kromě toho zkrácené formy mohou také obsahovat alteraci v jedné nebo větším počtu aminokyselin, které jsou v potkaním, myším nebo rhesus OB proteinu odlišné (divergentní) od lidského OB proteinu, a jakákoliv alterace mít formu alterovaných aminokyselin, jako jsou peptidomimetika nebo D-aminokyseliny.

Předmětem vynálezu je tedy Fc-OB fúzní protein, v němž je OB protein zvolen ze souboru sestávajícího z (a) aminokyselinové sekvence 1 až 146 uvedené v SEQ. ID.

NO: 3 (níže) nebo SEQ. ID. NO: 6;

(b) aminokyselinové sekvence 1 až 146 uvedené v SEQ. ID:

NO: 6 s lysinovým zbytkem v poloze 35 a isoleucinovým zbytkem v poloze 74;

(c) aminokyselinové sekvence podle odstavce (b) s různými aminokyselinami substituovanými v jedné nebo větším počtu následujících poloh (číslováno podle SEQ. ID. NO: 6, a to i v případě, že glutaminylový zbytek v poloze • •44 • 44 44 4 · 4 4 4 • · 4 4 4 ····

444 44 4 4 · 4 4 4 4 · 444 · 4 4 4 • 4 44· 44 4 44 44 chybí): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145;

(d) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b) nebo (c), v níž popřípadě chybí glutaminylový zbytek v poloze 28;

(e) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b), (c) nebo (d) s methionylovým zbytkem na N-konci;

(f) zkráceného analogu OB proteinu zvoleného ze souboru sestávajícího z (počítáno podle SEQ. ID. NO: 6) (i) aminokyselin 98 až 146 (ii) aminokyselin 1 až 32 (iii) aminokyselin 40 až 116 (iv) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 (v) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 s jednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěnými mezi aminokyseliny 99 a 112; a (vi) zkráceného OB analogu podle odstavce (i), v němž je jedna nebo větší počet aminokyselin 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

(vii) zkráceného analogu podle odstavce (ii), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8 a 32 nahrazen jinou aminokyselinou;

(viii) zkráceného analogu podle odstavce (iii), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106,

107, 108, 111 a 112 nahrazen jinou aminokyselinou;

• · » · • ·· · · · ···· • a a · ♦ · · a a • a · · · a a a a a · aaa a a a a a a a aa aaa ·♦ a «a ·· (ix) zkráceného analogu podle odstavce (iv), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,

112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

(x) zkráceného analogu podle odstavce (v), v němž je jedna nebo větší počet z ami-

nokyselin.	4, 32	, 33,	35,	50, 64,	68, 71,
74, 77, 78	, 89,	97,	100,	102, 105	, 106,
107, 108,	111,	118,	136,	138, 142	a 145

nahrazen jinou aminokyselinou;

(xi) zkráceného analogu podle kteréhokoliv z odstavců (i) až (x) s N-terminálním methionylovým zbytkem;

(g) derivátu OB proteinu nebo analogu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (f), který obsahuje chemický zbytek připojený k proteinovému zbytku;

(h) derivátu podle odstavce (g), v němž je chemickým zbytkem zbytek vodorozpustného polymeru;

(i) derivát podle odstavce (h), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyethylenglykolu;

(j) derivát podle odstavce (h), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyaminokyseliny;

(k) derivát podle odstavce (h) až (j), kde je uvedený zbytek připojen pouze na N-konci proteinového zbytku; a (l) OB protein, analog nebo derivát podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (k) ve farmaceuticky vhodném nosiči.

• tf flfl • •	• • ·	·♦ • •	«··· fl · • fl	• •	•fl	• •	flfl
• •	• fl •
• ·	•	•	• ·	•		•	•		•
flfl	• flfl	flfl	•		flfl			flfl

Deriváty

Fc-OB fúzní proteiny (pod pojmem „protein se rozumí „peptid, Fc, OB nebo analogy, jaké jsou například uvedeny dále, pokud není uvedeno jinak) se derivatizují tak, že se ke zbytku Fc-OB fúzního proteinu připojí jeden nebo větší počet chemických zbytků. Tyto chemicky modifikované deriváty je dále možno zpracovávat na formy pro intraarteriální, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánni, intravenosní, orální, nasální, pulmonární, topické nebo jiné podávání, jak je popsáno dále. Bylo zjištěno, že chemické modifikace biologicky aktivních proteinů poskytují za určitých podmínek další výhody, jako je zvýšení stability a prodloužení doby cirkulace terapeutického proteinu a snížení imunogenity (viz US patent č. 4 179 337, Davis et al., vydaný 18. prosince 1979; a přehled Abuchowski et al., Enzymes as Drugs, J. S. Holcerberg a J. Roberts ed., str. 367 až 383, 1981; Francis et al., výše uvedená citace).

Jako chemické zbytky vhodné pro takovou derivátizaci je možno volit různé vodorozpustné polymery. Zvolený polymer by měl být vodorozpustný, aby se protein, k němuž je připojen, nesrážel ve vodném prostředí, jako fyziologickém prostředí. Pro terapeutické použití konečného produktu bude polymer přednostně farmaceuticky vhodný. Odborník v tomto oboru bude schopen zvolit požadovaný polymer například na základě toho, zda se konjugát polymer/protein bude používat k léčebným účelům, a pokud ano, na základě požadované dávky, doby cirkulace, resistence vůči proteolýze a dalších ohledů. V případě proteinů a peptidů podle vynálezu může být efektivnost derivatizace zjištěna tak, že se podávají deriváty v požadované formě (tj. například pomocí osmotické pumpy, nebo,

• 4·· • •	• • 4 •	«9 4444 • 4 · • 4 4	• 4	44	44
4 4 4 4	4 4 4
• *	•	• · 4	4		4 ·	4
44	···	• 4 4		• 4	4·

výhodněji, pomocí injekcí nebo infúzí, nebo ještě výhodněji, formulací pro orální, pulmonární nebo nasální dodávku) a pozorují se biologické účinky uvedené v tomto popisu.

Vodorozpustný polymer je možno volit ze souboru sestávajícího například z polyethylenglykolu, kopolymerů ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulosy, dextranu, polyvinylalkoholu, polyvinylpyrrolidonu, poly-1,3-dioxolanu, poly-1,3,6-trioxanu, kopolymerů ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, polyaminokyselin (buď homopolymerů nebo statistických kopolymerů) a dextranem nebo póly(n-vinylpyrrolidonem) modifikovaného polyethylenglykolu, homopolymerů propylenglykolu, kopolymerů polypropylenoxidu a ethylenoxidu, pólyoxyethylováných polyolů a polyvinylalkoholu. Při výrobě může být výhodné použití polyethylenglykolpropionaldehydu, vzhledem k jeho stabilitě ve vodě. Rovněž je možno použít polymeru sukcinátu a styrenu.

OB nebo Fc proteiny, jichž se používá pro přípravu Fc-0B fúzního proteinu, lze vyrábět tak, že se ke zbytku Fc nebo OB proteinu (nebo analogu) naváže polyaminokyselina nebo „branch point aminokyselina. Tak například polyaminokyselina může představovat přídavný nosičový protein, který podobně jako Fc fúzovaný k OB proteinu nebo OB analogu podle vynálezu, slouží k tomu, že se kromě výše popsaných výhod Fc-OB fúzního proteinu také dosáhne prodloužení poločasu cirkulace proteinu. Při použití pro terapeutické nebo kosmetické účely by se měly volit polyaminokyseliny, které nemají nebo nevyvolávají neutralizační antigenní odpověď nebo jiné nežádoucí odezvy. Takové polyaminokyseliny lze volit ze souboru sestávajícího ze sérového albuminu (jako lidského sérového albuminu), dalších protilátek nebo jejich

částí (například Fc oblasti) a jiných polyaminokyselin, například lysinů. Jak je uvedeno dále, místo připojení polyaminokyseliny se může nacházet na N-konci Fc-OB proteinového zbytku, na jeho C-konci nebo na jiném místě mezi nimi. Polyaminokyselina může být k Fc-OB fúznímu proteinu také připojena pomocí chemického linkeru.

Polymer může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a může být rozvětvený nebo nerozvětvený. U polyethylenglykolu se s ohledem na snadnost zpracování a výroby dává přednost molekulové hmotnosti od asi 2 kDa do asi 100 kDa (pod pojmem „asi se rozumí, že v polyethylenových produktech budou mít některé molekuly hmotnost vyšší a některé hmotnost nižší, než je uvedená molekulová hmotnost). Je možno použít i jiných velikostí, a to v závislosti na požadovaném terapeutickém profilu, jako jsou například požadovaná doba trvalého uvolňování, účinky na biologickou aktivitu (pokud k nějakým dochází), snadnost zpracování, stupeň nebo absence antigenicity a jiných známých účinků, které má polyethylenglykol na terapeutický protein nebo analog.

Počet takto připojených polymerních molekul může být různý a odborník v tomto oboru bude schopen stanovit jeho účinky na funkci. Lze provádět monoderivatizaci, nebo je možno uskutečnit di-, tri-, tetraderivatizaci nebo určité kombinace derivatizace, přičemž se používá stejných nebo různých chemických zbytků (například polymerů, jako polyethylenglykolů o různé molekulové hmotnosti). Poměr polymerních molekul k molekulám proteinu (nebo peptidu) bude kolísat s jejich koncentrací v reakční směsi. Optimální poměr (z hlediska efektivnosti reakce, tj. aby nebyl přítomen žádný přebytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) • · ···· bude dán takovými faktory, jako je požadovaný stupeň derivatizace (například mono-, di-, tri- atd.), molekulová hmotnost zvoleného polymeru, okolnost zda je polymer rozvětvený nebo nerozvětvený a reakční podmínky).

Chemické zbytky by k proteinu měly být připojeny se zřetelem na účinky na funkční a antigenní domény proteinu. Existuje řada způsobů takových připojení, které jsou dostupné odborníkům v tomto oboru (viz například EP 0 401 384, který je zde citován náhradou za přenesení jeho obsahu do tohoto textu (kopulace PEG k G-CSF)), a dále Malík et al., Exp. Hematol. 20, 1028 až 1035, 1992 (popisující pegylaci GM-CSF za použití tresylchloridu). Tak je například polyethylenglykol možno kovalentně vázat prostřednictvím aminokyselinového zbytku přes reaktivní skupinu, jako je volná aminoskupina nebo karboxyskupina. Reaktivními skupinami jsou skupiny, k nimž se může vázat molekula aktivovaného polyethylenglykolu. Jako příklady aminokyselinových zbytků s volnou aminoskupinou je možno uvést zbytky lysinu a N-terminální aminokyselinové zbytky. Jako příklady aminokyselinových zbytků s volnou karboxyskupinou lze uvést zbytky kyseliny asparagové, zbytky kyseliny glutamové a C-terminální aminokyselinové zbytky. Jako reaktivních skupin pro připojení molekuly nebo molekul polyethylenglykolů je rovněž možno využít sulfhydrylových skupin. Z hlediska použití pro terapeutické účely se dává přednost připojení na aminoskupině, jako je N-terminální připojení nebo na zbytku lysinu. Připojení na zbytcích, které jsou důležité pro vazbu receptoru, je třeba se vyhnout, v případě, že je vazba k receptoru žádoucí.

V určitých případech může být potřebné Fc-OB fúzní protein N-terminálně chemicky modifikovat. V případě polyethylenglykolu, který je zde uveden jako ilustrativní příklad, je možno volit z různých molekul polyethylenglykolu (co do molekulové hmotnosti, rozvětvení atd.), poměrů polyethylenglykolových molekul k molekulám proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typů pegylační reakce, která se má provádět, a způsobů přípravy zvoleného N-terminálně pegylovaného proteinu. Způsobem přípravy N-terminálně pegylovaného přípravku (tj. oddělení tohoto zbytku od jiných monopegylovaných zbytků, pokud je to nezbytné) může být purifikace N-terminálně pegylované látky ze souboru molekul pegylovaného proteinu. Selektivní N-terminálni chemickou modifikaci je možno provádět reduktivní alkylací, která využívá různou reaktivitu různých typů primárních aminoskupin (lysin versus N-konec), jež jsou v konkrétním proteinu dostupné pro derivatizaci. Za vhodných reakčních podmínek se za použití polymeru obsahujícího karbonylovou skupinu dosáhne v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci. Tak je například možno selektivně N-terminálně pegylovat protein tak, že se reakce provádí při pH, které umožní využít výhody rozdílů v pK_a mezi ε-aminoskupinou lysinových zbytků a a-aminoskupinou N-terminálního zbytku proteinu. Takovou selektivní derivatizací je řízeno připojení vodorozpustného polymeru k proteinu: ke konjugaci s polymerem dochází převážně na Nkonci proteinu a nedochází k žádné významné modifikaci jiných reaktivních skupin, jako je aminoskupina lysinového postranního řetězce. Za použití postupu reduktivní alkylace může být vodorozpustným polymerem polymer výše popsaného typu, který by měl mít jedinou reaktivní aldehydovou skupinu pro kopulaci s proteinem. Může se použít polyethylen• · · · « ···

glykolpropionaldehydu, který obsahuje jedinou reaktivní aldehydovou skupinu.

N-terminálně monopegylovaným derivátům se dává přednost z hlediska usnadnění přípravy léčiv. N-terminální pegylace zajišťuje homogenní produkt, jelikož charakterizace produktu je vzhledem k di-, tri- nebo jiným multi-pegylovaným produktům zjednodušena. Použití výše popsaného postupu reduktivní alkylace pro přípravu N-terminálního produktu se dává přednost z hlediska usnadnění výroby v průmyslovém měřítku.

Komplexy

Fc-OB fúzní protein, jeho analog nebo jejich derivát je možno podávat ve formě komplexu s vazebnou látkou. Taková vazebná látka může mít vliv na prodloužení doby cirkulace, která může být dokonce delší než za použití Fc-OB fúzního proteinu, jeho analogu nebo derivátu. Takovými vazebnými látkami mohou být proteiny (neboli peptidy). Jako příklad vazebného proteinu lze uvést receptor OB proteinu nebo jeho část, jako je jeho vodorozpustná část. Jiné vazebné proteiny je možno zjistit zkouškou OB proteinu nebo Fc-OB proteinu v séru nebo empirickým screeningem na přítomnost vazby. Použité vazebné proteiny obvykle nebudou interferovat se schopností OB proteinu, Fc-OB fúzních proteinů nebo analogů nebo jejich derivátů vázat se k endogennímu receptorů OB proteinu a/nebo vyvolávat transdukci signálu.

Farmaceutické kompozice

Předmětem vynálezu jsou také způsoby použití farmaceutických kompozic na bázi Fc-OB fúzních proteinů a derivátů.

• · · ·

Takové farmaceutické kompozice mohou být ve formě pro injekční, orální, pulmonární, nasální, transdermální nebo jiné podávání. Předmětem vynálezu jsou farmaceutické kompozice, které obsahují účinné množství proteinového produktu nebo derivátu podle vynálezu spolu s farmaceuticky vhodným ředidlem, konzervačním činidlem, solubilizátorem, emulgátorem, adjuvantem a/nebo nosičem. Jako příklady takových látek je možno uvést ředidla s obsahem různých pufrů (jako je např. Tris-HCl, acetátový pufr a fosfátový pufr), různým pH a iontovou silou; aditiva, jako detergenty a solubilizační činidla (například Tween 80, Polysorbate 80), antioxidační činidla (například askorbovou kyselinu, disiřičitan sodný), konzervační činidla (například Thimersol, benzylalkohol) a látky dodávající objem (například laktosu, mannitol).

V úvahu také přichází začlenění látky do částicového přípravku na bázi polymerní sloučeniny, jako kyseliny polymléčné, polyglykolové atd. nebo do liposomú. Také je možno použít kyseliny hyaluronové, která může mít podpůrný účinek na prodloužení doby cirkulace. Takové látky mohou ovlivnit fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost clearance in vivo proteinů a derivátů podle vynálezu (viz například publikace Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, str. 1435 až 1712, která je zde citována náhradou za přenesení jejího obsahu do tohoto textu). Kompozice je možno připravovat v kapalné formě nebo ve formě suchého prášku, jako v lyofilizované formě. V úvahu rovněž přicházejí implantovatelné prostředky s přetrvávajícím uvolňováním, a dále také transdermální prostředky.

Pro použití přicházejí v úvahu orální pevné dávkovači formy, které jsou obecně popsány v Remington's Pharmaceuti·· ··

cal Sciences, 18. vydání, 1990, Mack Publishing Co., Easton PA 18042 v kapitole 89, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího obsahu do tohoto textu. Jako příklady pevných dávkovačích forem je možno uvést tablety, tobolky, pilule, pastilky nebo zdravotní bombóny, oplatky nebo pelety. Při formulaci kompozic podle vynálezu také lze využít zapouzdření v liposomech nebo proteinoidech (například proteinoidové mikrokuličky popsané v US patentu č. 4 925 673) . Je možno použít liposomálního zapouzdření a liposomy je možno derivatizovat různými polymery (například US patent č. 5 013 556). Popis možných pevných dávkovačích forem pro léčivé látky je uveden v publikaci Marshall, K., Modern Pharmaceutics, Ed. G. S. Bankéř a C. T. Rhodes, kapitola 10, 1979, která je zde citována náhradou na přenesení jejího obsahu do tohoto textu. Kompozice bude obvykle obsahovat Fc-OB fúzní protein (nebo analog nebo derivát) a inertní přísady, které biologicky účinné látce poskytnou ochranu proti prostředí žaludku a umožní její uvolňování ve střevě.

Zvláště pozoruhodné jsou také orální dávkovači formy výše popsaných derivátizovaných proteinů. Fc-OB fúzní protein je možno chemicky modifikovat tak, aby orální dodávka tohoto derivátu byla účinná. Obvykle je takovou chemickou modifikací připojení alespoň jednoho zbytku k samotné molekule proteinu (nebo peptidu), pokud takový zbytek umožní (a) inhibovat proteolýzu; a (b) vstřebávání do krevního řečiště z žaludku nebo střeva. Žádoucí je také zvýšení celkové stability proteinu a prodloužení doby cirkulace v organismu. Jako příklady takových zbytků lze uvést polyethylenglykol, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulosu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a polyprolin (Abuchowski a Davis, Soluble Polymer-Enzyme • · · ·· φφφ • φ · • φ φ • φ φ φ φ φ φ φ φ

Adducts, „Enzymes as Drugs, eds. Hocenberg a Roberts, Wiley-Interscience, New York, NY, 1981, str. 367 až 383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4, 185 až 189, 1982). Jako jiné polymery, kterých by sé mohlo použít, je možno uvést poly-1,3-dioxolan a poly-1,3,β-tioxokan. Jak bylo uvedeno výše, pro farmaceutické použití se dává přednost zbytkům polyethylenglykolu.

Místem uvolňování Fc-OB fúzního proteinu, analogu nebo derivátu může být žaludek nebo tenké střevo (například duodenum, jejunum nebo ileum) nebo tlusté střevo. Pro odborníka v tomto oboru jsou dostupné prostředky, které se nebudou rozpouštět v žaludku, avšak budou látku uvolňovat v duodenu nebo kdekoliv jinde ve střevě. Uvolňování se bude přednostně vyhýbat škodlivým účinkům prostředí žaludku, a to buď pomocí ochrany Fc-OB fúzního proteinu, analogu nebo derivátu nebo prostřednictvím uvolňování biologicky účinné látky mimo prostředí žaludku, jako ve střevě.

Pro zajištění plné resistence vůči prostředí v žaludku jsou podstatné obaly, které jsou nepropustné při pH alespoň 5,0. Jako příklady nej obvyklejších inertních přísad, kterých se používá jako enterických povlaků, je možno uvést acetát trimelitát celulosy (CAT), ftalát hydroxypropylmethylcelulosy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinylacetátftalát (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, acetát ftalát celulosy (CAP), Eudragit L, Eudragit S a šelak. Těchto povlaků se může používat jako směsných filmů.

Obalů nebo směsí obalů se také může používat na tabletách, které nemají být chráněny před prostředím žaludku.

Jako příklady takových obalů je možno uvést cukerné obaly • · · ·· ·· * * · · • · · · • · · · · • · · ·

99 nebo obaly, které usnadňují polykání tablety. Tobolky mohou být tvořeny tvrdými tobolkami (jako želatinovými) pro dodávku suchého léčiva (tj. prášku); pro kapalné formy je možno použít měkkých želatinových tobolek. Stěnu oplatek může tvořit ztužený škrob nebo jiný jedlý papír. Pro pilule, pastilky, lité tablety a tabletové trituráty je možno použít postupů kompaktování, hnětení nebo zpracování za vlhka.

Léčivo může být v prostředku obsaženo jako jemné multičástice ve formě granulí nebo pelet o velikosti částic asi 1 mm. Látka pro podávání ve formě tobolek může také mít formu prášku, lehce slisovaných válečků nebo pelet či dokonce formu tablet. Léčivo je možno připravovat lisováním.

Je možno použít všech barvicích a aromatizačních činidel. Tak je například možno připravit formulaci na bázi proteinu nebo derivátu (jako zapouzdřením v liposomech nebo mikroperlách) a poté ji dále začlenit do jedlého produktu, jako chlazených nápojů obsahujících barvicí a aromatizační činidla.

Za použití inertní látky je možno terapeutikum ředit nebo zvyšovat jeho objem. Jako příklady takových ředidel je možno uvést sacharidy, zejména mannitol, α-laktosu, bezvodou laktosu, celulosu, saeharosu, modifikované dextrany a škrob. Jako plniv je možno také použít některých anorganických solí, jako fosforečnanu vápenatého, uhličitanu hořečnatého a chloridu sodného. Ředidly dostupnými na trhu jsou například Fast-Flo, Emdex, STA-RX 1500, Encompress a Avicell.

Při formulacích terapeutika na pevnou dávkovači formu je možno začlenit rozvolňovadla. Jako neomezující příklady »» ···» ·» ·· > » · 1 > * · , • · látek, které jsou používány jako rozvolňovadla, je možno uvést škroby, jako obchodně dostupné rozvolňovadlo na bázi škrobu, Explotab. Také lze použít sodnou sůl škrobového glykolátu, Amberlite, sodnou sůl karboxymethylcelulosy, ultramylopektin, alginát sodný, želatinu, pomerančovou slupku, karboxymethylcelulosu ve velné formě, přírodní houby a bentonit. Další formu rozvolňovadel představují nerozpustné katexové pryskyřice. Jako rozvolňovadel a pojiv je možno použít práškovaných pryskyřic, jako je agar, Karaya nebo tragant. Užitečné jako rozvolňovadla jsou také kyselina alginová a její sodná sůl.

Při výrobě tvrdých tablet je možno použít pojiv, aby se dosáhlo soudržnosti terapeutického činidla. Jako příklady pojiv je možno uvést látky z přírodních produktů, jako je klovatina, tragant, škrob a želatina, a dále methylcelulosu (MC) , ethylcelulosu (EC) a karboxymethylcelulosu (CMC) . Pro granulaci léčiva je možno použít polyvinylpyrrolidonu (PVP) i hydroxypropylmethylcelulosu (HPMC) v alkoholických roztocích.

Aby se snížila lepivost směsi během formulačního procesu, mohou terapeutické prostředky obsahovat příslušná činidla snižující tření. Lze použít lubrikantů, které budou tvořit vrstvu mezi léčivem a stěnou formy. Jako neomezující příklady takových látek je možno uvést kyselinu stearovou, včetně jejích hořečnatých a vápenatých solí, polytetrafluorethylen (PTFE), kapalný parafin, rostlinné oleje a vosky. Také lze použít rozpustných lubrikantů, jako laurylsulfátu sodného, laurylsulfátu hořečnatého, polyethylenglykolu o různých molekulových hmotnostech, Carbowax 4000 a 6000.

·«·· ♦ « · · ·· ·· • · « » • » » · * · · · · • · · · ·♦ ··

Je možno přidat kluzné látky, které mohou zlepšovat tokové vlastnosti léčiva během formulace a napomáhat přeskupování během lisování. Jako příklady kluzných látek je možno uvést škrob, mastek, koloidní oxid křemičitý a hydratovaný hlinitokřemičitan.

Pro usnadnění rozpouštění léčiva ve vodném prostředí je možno přidat povrchově aktivní látku, jako smáčedlo. Jako příklady povrchově aktivních látek lze uvést aniontové detergenty, jako laurylsulfát sodný, dioktylsulfojantaran sodný a dioktylsulfonan sodný. Je možno použít také kationtových detergentů, jako benzalkoniumchloridu nebo benzethomiumchloridu. Jako povrchově aktivní látky ve formulacích mohou být obsaženy následující potenciální neiontové detergenty: lauromakrogol 400, polyoxyl 40 stearát, polyoxyethylenovaný hydrogenovaný ricinový olej 10, 50 a 60, glycerolmonostearát, polysorbate 40, 60, 65 a 80, ester mastné kyseliny a sacharosy, methylcelulosa a karboxymethylcelulosa. Tyto povrchově aktivní látky mohou být v přípravku na bázi proteinu nebo derivátu přítomny samotné nebo ve formě směsí v různých poměrech.

Dalšími přídavnými látkami, které mohou podporovat absorpci proteinu (nebo derivátu), jsou například mastné kyseliny, jako je kyselina olejová, kyselina linolová a kyselina linolenová.

Může být žádoucí připravit formulace s řízeným uvolňováním. Léčivo lze začlenit do inertní matrice, která umožni uvolňování difusí nebo prostřednictvím mechanismu vyluhování (např. pryskyřice). Do formulace také mohou být začleněny pomalu degenerující matrice, například algináty a polysa• ·· Β ··

Β·

Β Φ Φ · Β Β Β Β

ΒΒ

ΒΒ »

Φ

Β

Β charidy. Další formou řízeného uvolňování tohoto léčiva je způsob založený na terapeutickém systému Oros (Alza Corp.), kdy se léčivo uzavře v semipermeabilní membráně, která vodě dovoluje vstoupit a osmoticky vytlačit léčivo jediným malým otvorem. Účinek odloženého uvolňování také mají některé enterické povlaky.

Pro formulaci je možno použít dalších obalů, jako jsou různé cukry, které je možno nanášet v dražovacím bubnu. Terapeutické činidlo lze také podávat v tabletách opatřených filmovým povlakem. Látky, které se používají pro tento účel se dělí do dvou skupin. První skupinu představují neenterické látky, jako jsou methylcelulosa, ethylcelulosa, hydroxyethylcelulosa, methylhydroxyethylcelulosa, hydroxypropylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy, providone a polyethylenglykoly. Druhou skupinu tvoří enterické látky, kterými obvykle jsou estery kyseliny ftalové.

Aby se získal optimální filmový povlak, je možno použít směsi látek. Filmové povlaky je možno nanášet v zařízení s bubnem nebo fluidním ložem nebo nalisováním.

Protein podle vynálezu (nebo jeho deriváty) také lze podávat pulmonárně. Protein (nebo derivát) se dodává do plic savce při inhalaci a epitheliální výstelkou plic prochází do krevního řečiště (další zprávy viz Adjei et al., Pharmaceutical Research 7, 565 až 569, 1990; Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63, 135 až 144, 1990 (leuprolid acetát); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5), 143 až 146, 1989 (endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine ·«·· •» ··· · • · »· *· • ·« * • · « · • · · · • · · · ·· ··

3, 206 až 212, 1989 (αΐ-antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84, 1145 až 1146, 1989 (α-1-proteasa); Oswein et al., „Aerosolization of Proteins, Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Deiivery II, Keystone, Colorado, březen 1990 (rekombinantni lidský růstový hormon); Debs et al., The Journal of Immunology 140, 3482 až 3488, 1988 (interferon-γ a faktor nekrosy nádorů a) a Platz et al., US patent č.

284 656 (faktor stimulující kolonie granulocytů).

V praxi přichází v úvahu řada mechanických zařízení zkonstruovaných pro pulmonární dodávku léčiv, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy. Jako neomezující příklady takových zařízení je možno uvést rozmlžovače, inhalátory pro odměřenou dávku a inhalátory pro prášková léčiva.

Jako příklady konkrétních zařízení, které jsou v praxi dostupné, je možno uvést rozmlžovač Ultravent, výrobek firmy Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, USA; rozmlžovač Acorn II, výrobek firmy Marquest Medical Products,

Englewood, Colorado, USA; inhalátor odměřené dávky Ventolin, výrobek firmy Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, USA; a inhalátor pro prášková léčiva Spinhaler, výrobek firmy Fisons Corp., Bedford, Massachusetts, USA.

Všechna tato zařízení vyžadují použití formulací vhodných pro dávkování proteinu (nebo jeho analogu nebo derivátu). Obvykle je každá formulace specifická vzhledem k typu použitého zařízení a může kromě použití ředidel, adjuvantů a/nebo nosičů užitečných při léčení zahrnovat použití vhodné hnací látky.

frfrfrfr • fr frfrfrfr

Protein (nebo derivát) by se pro nejúčinnější dodávku do distální části plic měl nejvýhodněji připravovat ve formě částic o průměrné velikosti méně než 10 gm, nejvýhodněji v rozmezí od 0,5 do 5 μπι.

• frfr • í · · • · · · • frfr · • frfr · • fr frfr

Jako příklady nosičů lze uvést sacharidy, jako je trehalosa, mannitol, xylitol, sacharosa, laktosa a sorbitol. Ve formulacích je možno použít dalších přísad, jako DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Lze také použít přírodních nebo syntetických povrchově aktivních látek. Může se použít polyethylenglykolu (i kromě jeho použití při derivatizaci proteinu nebo analogu). Dále jsou použitelné dextrany, jako cyklodextran; soli žlučových kyselin a další příbuzné podpůrné látky a také celulosa a deriváty celulosy. Je možno použít aminokyselin, jako je použití v pufrových formulacích.

Předpokládá se rovněž použití liposomů, mikrotobolek nebo mikrokuliček, inkluzních komplexů a dalších typů nosičů.

Formulace vhodné pro použití s rozmlžovačem, proudovým nebo ultrazvukovým, budou obvykle obsahovat Fc-OB protein nebo jeho analogy nebo deriváty rozpuštěné ve vodě v koncentraci asi 0,1 až 25 mg biologicky aktivního proteinu na 1 ml roztoku. Formulace také mohou obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku). Rozmlžovací formulace rovněž mohou obsahovat povrchově aktivní látku, aby se snížila nebo vyloučila agregace proteinu vyvolaná rozprašováním roztoku při tvorbě aerosolu.

··«· * ·

·» · ···· ·· ·· * · · • · · • · · • · · ·· ·'

Formulace podávané pomocí zařízeni pro inhalaci odměřené dávky budou obvykle obsahovat jemně rozdělený prášek s obsahem proteinu (nebo derivátu), který je pomocí povrchově aktivní látky suspendován v propelentu. Propelentem může být jakákoliv látka, které se obvykle používá pro tento účel, jako je například plně chlorfluorovaný uhlovodík, částečně chlorfluorovaný uhlovodík, částečně fluorovaný uhlovodík nebo uhlovodík, jako trichlorfluormethan, dichlordifluormethan, dichlortetrafluorethanol a 1,1,1,2tetrafluorethan a jejich kombinace. Vhodnými povrchově aktivními látkami jsou například sorbitantrioleát a sojový lecithin. Jako povrchově aktivní látka může být užitečná také kyselina olejová.

Formulace pro dodávku ze zařízení pro inhalaci prášků budou obsahovat jemně rozdělený prášek s obsahem proteinu (nebo derivátu) a popřípadě také činidlo zvyšující objem, jako laktosu, sorbitol, sacharosu, mannitol, trehalosu nebo xylitol, a to v množství, které usnadní dispergování prášku ze zařízení, například v množství 50 až 90 %, vztaženo na hmotnost formulace.

Protein (nebo analog nebo derivát) je také možno dodávat nasálně. Nasální dodávka umožňuje proteinu přejít do krevního řečiště přímo poté, co léčivo bylo podáno do nosu, bez nezbytného ukládání produktu v plicích. Jako příklady formulací pro nasální dodávku je možno uvést formulace s dextranem nebo cyklodextranem. V úvahu také přichází dodávka přes jiné slizniční membrány.

•fl flflflfl • · · • · · • flfl • flfl • fl fl ·· fl · • · • · • · • fl·· fl •

• fl · • fl flflfl «

fl fl • fl

Dávkování

Odborník v tomto oboru bude schopen zjistit účinné dávky z pozorování požadovaného terapeutického účinku po podání léčiva. N-terminální modifikace OB proteinu podle vynálezu ve srovnání s OB proteinem nebo jeho C-terminální modifikací poskytuje proteinu neočekávanou ochranu před degradací, prodlouženou dobu cirkulace a stabilitu. Odborníku v tomto oboru bude na základě těchto změn zřejmé, že účinná dávka může být nižší nebo že lze snížit frekvenci podávání.

V přednostním provedení bude formulace taková, že se při denní dávce asi 0,10 μg/kg až asi 10 mg/kg dosáhne požadovaného terapeutického účinku. Účinné dávky lze stanovit v průběhu doby za použití diagnostických nástrojů. Tak se například nejprve stanoví endogenní hladina proteinu za použití diagnostiky pro měření množství OB proteinu nebo FcOB fúzního proteinu v krvi (nebo plasmě nebo séru). Takové diagnostické nástroje mohou mít podobu stanovení protilátky, například sendvičové stanovení protilátky. Nejprve se kvantifikuje množství endogenního OB proteinu a stanoví se základní linie. Terapeutické dávky se určí na základě toho, jak se vyvíjí množství endogenního a exogenního OB proteinu nebo Fc-OB fúzního proteinu (tj. proteinu, analogu nebo derivátu zjištěného v organismu, který si organismus vyprodukoval nebo který mu byl dodán) během léčení. Dávky se tedy během léčení mohou měnit tak, že se nejprve používá relativně vysoké dávky, a to až do doby, kdy je pozorován pozitivní terapeutický účinek, a pro udržení pozitivních terapeutických účinků se používá nižších dávek.

··»· «

* *

···» ·» «· • * * · ’ · · · > · · * »· ·»

V čistě teoretické situaci, kdy je požadováno pouhé snížení hladiny lipidů v krvi, kdy je žádoucí udržení snížené hladiny lipidů v krvi nebo zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku bude dávka nedostatečná pro snížení hmotnosti. Během počátečního období léčení obézní osoby je tedy možno podávat dávky, při nichž se dosáhne snížení hmotnosti a současného snížení hladiny lipidů v krvi nebo současné snížení tukové tkáně/zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku. Jakmile se dosáhne dostatečného snížení hmotnosti, je možno podávat dávku, která je dostatečná pro zabránění opětovnému vzrůstu hmotnosti, leč postačuje pro udržení požadované hladiny lipidů v krvi nebo zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku (nebo prevenci ztráty této tkáně). Tyto dávky je možno stanovit empiricky, jelikož účinky OB nebo Fc-OB proteinu jsou reverzibilní (např. Campfield et al., Science 269: 546 až 549, 1995, na straně 547). Jestliže je tedy pozorováno, že dávka vede ke snížení hmotnosti, které není žádoucí, lze podávat dávku nižší, při níž se dosáhne požadované hladiny lipidů v krvi nebo zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku, ale požadovaná hmotnost zůstane zachována.

Při zvyšování citlivosti jedince na inzulín je možno brát v úvahu podobné faktory ovlivňující dávkování. Bez úbytku hmotnosti lze dosáhnout takového zvýšení podílu tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku, které umožní snížit množství inzulínu (nebo potenciálně amylinu, thiazolidindionů nebo jiných možných léčiv pro léčení diabetes), jaké by se jedinci podávalo pro léčení diabetes.

···· • ♦ «·>»'»

Při zvyšování celkové síly lze brát opět v úvahu podobné faktory ovlivňující dávkování. Zvýšení podílu tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku spolu se současným zvýšením celkové síly je možno dosáhnout s dávkami, které nejsou dostatečné pro ztrátu hmotnosti. Beze ztráty hmotnosti lze rovněž dosáhnout dalších pozitivních výsledků, jako je zvýšení červených krvinek (a okysličování krve) a snížení resorpce kosti nebo osteoporosy.

Kombinace

Výše uvedených postupů je možno použít spolu s jinými léčivy, jako jsou léčiva užitečná pro léčení diabetes (například inzulín, potenciálně thiazolidindiony, amylin nebo jejich antagonisty), léky snižující cholesterol a krevní tlak (jako jsou léky snižující hladinu lipidů v krvi nebo jiná kardiovaskulární léčiva) a léky zvyšující aktivitu (například amfetaminy). Rovněž lze používat činidel potlačujících chuť k jídlu (jako jsou látky ovlivňující hladinu serotoninu nebo neuropeptidu Y). Takové podávání může být simultánní nebo posloupné.

Kromě toho je těchto způsobů možno použít spolu s chirurgickými postupy, jako jsou kosmetické chirurgické výkony prováděné za účelem změny celkového vzhledu těla (například liposukce nebo laserová chirurgie za účelem snížení tělesné hmotnosti). Současným použitím kompozic a způsobů podle vynálezu je možno posílit pozitivní výsledky srdečních operací, jako jsou operace bypass, nebo jiných zákroků, které mají zmírnit stavy vyvolané blokádou cév tukovými úsadami, jako je arteriální plát. Před léčením za použití kompozic nebo způsobů podle vynálezu, v průběhu • fcfcfc • fcfc ·* fcfc • fcfc 4 • · · <

» fc· « • · · ' ·· ·· takového léčení či po něm, je možno použít postupů eliminujících žlučové kameny, jako jsou postupy využívající ultrazvuk nebo laser. Způsobů léčení podle vynálezu je dále možno použít jako podpůrné léčby při operacích nebo léčení zlomených kostí, poškozených svalů nebo jiných terapiích, u nichž by vlivem zvýšení hmoty tkání tvořených v podstatě svalovinou bez tuku došlo ke zlepšení.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Aplikace myšího Fc-OB proteinu ve formě subkutánních injekcí

Tento příklad demonstruje, že subkutánní injekce myšího Fc-OB proteinu vedou u normálních myší ke snížení hmotnosti. Normálním (neobézním) myším CD1 se subkutánnimi injekcemi po dobu 22 dní podává myší Fc-OB protein. Při denní dávce proteinu 10 mg/kg tělesné hmotnosti se 22. den podávání injekcí dosáhlo 14% (+/- 1,1 %) úbytku hmotnosti vzhledem k základní linii. Podávání PBS vedlo 22. den injekčního podávání k 3,9% (+/- 3,3 %) úbytku hmotnosti vzhledem k základní linii Podáváním Fc-OB proteinu obézním myším CD1 v denní dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti se 22. den dosáhlo 10% (+/- 4,3 %) snížení hmotnosti vzhledem k základní linii a podávání PBS vedlo 22. den k 8,7% (+/- 1,3 %) snížení hmotnosti vzhledem k základní linii.

····

9 «

9 « • •99 «9 9 • · 4 • 9 · • 9 9 »» 94

Dále jsou uvedeny procentické odchylky od základní linie hmotnosti u myší CD1 (o stáří 8 týdnů):

Tabulka 1

Úbytek hmotnosti při subkutánním injekčním podávání

Čas (dny)	Vehikulum (PBS)	Normální myši/ řekombinantní Fc-OB fúzní protein	Obézní myši/ řekombinantní Fc-OB fúzní protein
1 až 2	-0,44 ±1,1	-3,6 ± 0,41	-1,03 ± 1,36
3 až 4	-1,07 ±0,13	-6,8 ± 1,5	-2,7 ±1,1
5 až 6	-0,13 ± 1,1	-9,5 ± 1,2	-4,9 ±0,95
7 až 8	-0,92 ± 0,29	-12,5 ± 1,6	-7,7 ±2,9
9 až 10	1,6 ± 1,3	-12,6 ± 1,9	-8,2 ± 2,9
11 až 12	-1,98 ± 1	-13,6 ± 1,96	-8,6 ± 2,9
13 až 14	-5,2 ±1,3	-14,6 ± 1,7	-10,1 ± 3,6
15 až 16	-8,6 ± 0,1	-14,5 ± 2	-9,4 ± 2,2
17 až 18	-8,5 ± 0,64	-16,1 ±1,8	-9,6 ± 2,99
19 až 20	-4,1 ± 0,99	-16 ± 1,5	-10,4 ± 3,3
21 až 22	-3,9 ±3,3	-14,1 ±1,1	-10 ± 4,3

Jak je zřejmé, na konci 22denního režimu subkutánního podávání u zvířat, která obdržela Fc-OB protein, se snížila hmotnost o 14,1 % (neobézní zvířata) a 10 % (obézní zvířata) , na rozdíl od zvířat, která dostávala pouze vehikulum PBS a ve srovnání se základní linií.

U zvířat, kterým byl podáván Fc-OB protein celých 22 dnů, se hmotnost překvapivě snižovala po dobu až 28 dnů, ještě 4 dny po poslední injekci. U normálních (neobézních) ·«·· ** *·?· fr fr fr frfrfr fr* frfrfr • · • · fr « • · myší CD1 subkutánní injekční podávání Fc-OB myšího proteinu v denní dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti, které bylo zastaveno 22. den, vedlo k úbytku hmotnosti 21 % vzhledem k základní linii zjištěné 28. den, oproti 14% úbytku zjištěnému 22. den. Podobně u obézních myší CD1 subkutánní injekční podávání Fc-OB myšího proteinu v denní dávce 10 mg/kg tělesné hmotnosti, které bylo zastaveno 22. den, vedlo k úbytku hmotnosti 13 % vzhledem k základní linii zjištěné 28. den, oproti 10% úbytku zjištěnému 22. den. 34. den se úbytek hmotnosti u obézních myší udržel na 10 %, přičemž u myší s nízkým podílem tukové tkáně došlo k opětovnému nabytí hmotnosti, takže úbytek činil 5 %. Kontrola v každém systému v období od 22. do 34. dne v případě obézních myší vykázala 4% a v případě myší s nízkým podílem tukové tkáně 7% přírůstek.

Příklad 2

Aplikace lidského Fc-OB proteinu ve formě subkutánního injekčního podávání myším C57

Tento příklad demonstruje, že subkutánní injekce lidského Fc-OB proteinu vedou u normálních myší ke ztrátě hmotnosti. Normálním (neobézním) myším C57 byl po dobu 7 dnů subkutánními injekcemi podáván lidský Fc-OB protein. Denní dávka proteinu 10 mg/kg tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 12% (± 1,3 %) úbytku vzhledem k základní linii. Denní dávka proteinu 1 mg/kg tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 8,9% (± 1,5 %) úbytku vzhledem k základní linii. U obézních myší C57 denní dávka lidského OB proteinu 10 mg/kg tělesné hmotnosti vedla 7. den injekčního podávání k 1,1% (± 0,99 %) úbytku vzhledem k základní ···· •a ···· ··· linii a denní dávka proteinu 1 mg/kg tělesné hmotnosti vedla

7. den injekčního podávání k 2,5% (± 1,1 %) úbytku vzhledem k základní linii.

·· •e • · · • · · • · · •9 9

Výsledky

Dále uvedené hodnoty představují procentické rozdíly od základní hmotnosti myší C57 (o stáří 8 týdnů):

Tabulka 2

Úbytek hmotnosti při subkutánním injekčním podávání

Čas (dny)	Vehikulum (PBS)	Rekombinantní Fc-OB fúzní protein	Rekombinantní OB protein
1 až 2	0,258 ± 1,3	-6,4 ± 1,6	-2,1 ±0,91
3 až 4	2,2 ± 1,1	-12,1 ± 1,5	-0,78 ± 0,36
5 až 6	4,5 ± 2	-11,5 ± 1,5	-1,7 ± 0,6
7 až 8	7,0 ±2,1	-11,9 ± 1,6	0,1 ± 1,2
9 až 10	9,0 ± 1,9	-11,5 ± 1,3	7,2 ± 2,7
11 až 12	10 ± 3,8	-9 ±1,4	10,9 ± 2,9
13 až 14	12,5 ± 4,4	-9,5 ± 1,6	12,3 ± 6,4
15 až 16	11,1 ±1,0	-3,0 ± 1,5	10,3 ± 3,3
17 až 18	17,2 ± 3,6	8,0 ± 1,3	13,3 ± 3,4

Lze si povšimnout, že na konci 17. dne po 7 dnech režimu s subkutánní denní dávkou 10 mg/kg tělesné hmotnosti, zvířata, kterým byl podáván Fc-OB protein, opětovně získala % své tělesné hmotnosti. Zvířata, která dostávala denní • · dávku 1 mg/kg při sedmidenním režimu subkutánního podávání, po 12 dnech znovu získala 6,4 % tělesné hmotnosti.

Tyto zkoušky také ukazují, že během období regenerace od 7. do 22. dne po poslední injekci, která byla podána 7. den, je návrat tělesné hmotnosti u myší C57 ošetřených Fc-OB pomalejší než u myší ošetřených OB proteinem. Z toho se dá usoudit, že Fc-OB protein není eliminován tak rychle jako OB protein, což prodlužuje účinek spočívající ve snižování hmotnosti.

Příklad 3

Závislost odpovědi na dávce u myší CF7 ošetřovaných Fc-OB fúzním proteinem

Další zkouška dokládá existenci závislosti odpovědi na dávce při nepřetržitém podávání Fc-OB fúzního proteinu. Při této zkoušce se obézním myším CF7 o hmotnosti 35 až 40 g podává rekombinantní lidský Fc-OB protein za použití metodologie popsané v předchozím příkladu. Výsledky zkoušky jsou uvedeny následující tabulce 3, kde úbytek tělesné hmotnosti (%) vzhledem k základní linii je stanoven výše popsaným postupem:

Tabulka 3

Dávka (mg/kg/den)	Čas	Úbytek tělesné hmotnosti (%)
0,25	den 5	4
0,5	den 5	12
1	den 5	16

• ·

Je zřejmé, že zvýšení dávky z 0,25 mg/kg/den na 1 mg/kg/den vede ke zvýšení úbytku ze 4 % na 16 %. 16% snížení tělesné hmotnosti v den 5 při dávce 1 mg/kg/den je rovněž pozoruhodné. Tyto zkoušky také svědčí o pomalém návratu hmotnosti na 0 %, a je tedy možno usoudit, že Fc-OB protein není eliminován rychle, což je příčinou prodlouženého účinku spočívajícího ve snižování hmotnosti.

Příklad 4

Farmakokinetické vlastnosti rekombinantního Fc-OB proteinu při zkoušce na myších CD-I a psech

Tato zkouška demonstruje farmakokinetické vlastnosti rekombinantního lidského met Fc-OB proteinu u myší CD-I a psů. Po intravenosním nebo subkutánním podávání v dávce 1 mg/kg/den se enzymově spraženým imunochemickým stanovením na pevném povrchu (ELISA) zjistí sérové koncentrace rekombinantního lidského met Fc-OB proteinu a lidského met OB proteinu.

U obou druhů byla pozorována zvýšená expozice, kvantifikovaná vyšším pikem sérových koncentraci a větší plochou pod křivkou koncentrace v séru (AUC), oproti rekombinantnímu met-lidskému OB proteinu. Fc-OB má nižší systemickou clearanci než rekombinantní met-lidský OB protein. To je patrné z nižší clearance a delšího poločasu Fc-OB proteinu oproti OB proteinu. Větší velikost proteinu nevyvolává pouze zvýšení jeho stability, ale také snížení účinnosti renální clearance. Výsledkem je, že Fc-OB protein je ze systemického oběhu eliminován pomaleji. Zvýšení časového maxima, maxima sérové koncentrace a AUC pro Fc-OB protein jsou ·

v souladu s nižší clearancí. Fc-OB protein poskytuje podstatně vyšší systemickou expozici než OB protein. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.

Tabulka 4

Farmakokinetické vlastnosti

Druh	Myši CD-I	Myši CD-I	Psi beagle
Způsob podávání	Intravenosní	Subkutánní	Subkutánní
	OB protein	Fc-OB protein	OB protein	Fc-OB protein	OB protein	Fc-OB protein
Dávkování (mg/kg)	1	1	1	1	0,5	0,5
Časové maximum (h)			0,14	6	2,8	8
Maximum sérové koncentrace (ng/ml)			1520	7550	300	1120
AUC (ng.h/ml)	1470	366 000	1230	132 000	2200	52 500
Poločas (h)	0,491	21,4	0,388		2,13	22,9
Clearance (ml/h/kg)	681	2,73

Příklad 5

Tento příklad demonstruje, že u normálních myší, které nejsou obézní a nemají zvýšenou hladinu lipidů v krvi, • · · · ·· ···· ·· ·· • * · · · · · • · · · · · ·

podávání lidského rekombinantního Fc-OB proteinu vede ke snížení hladiny cholesterolu, glukosy a triglyceridů. Tento příklad kromě toho demonstruje, že hladiny těchto látek zůstávají během třídenního regeneračního období nízké.

Normálním myším CD1 se subkutánními injekcemi podává rekombinantní lidský Fc-OB protein. 24 hodin po dni 23, což je den podání poslední injekce, se odeberou krevní vzorky. Jak je diskutováno výše, zvířata při podávaných dávkách ztratila na hmotnosti. Z tabulky 5 vyplývá, že u myší ve srovnání s kontrolou došlo k významnému snížení sérového cholesterolu, glukosy a triglyceridů, které je závislé na dávce.

Tabulka 5

Dávka	Glukosa	Cholesterol	Triglyceridy
PBS	232,6 ± 15,1	67,8 ± 3,6	52,6 ± 3,7
1 mg/kg/den	225,8 ± 29,1	54 ±5,6	43 ± 8,7
10 mg/kg/den	193,2 ± 21,4	53,4 ± 5,7	38 ± 11
1 mg/kg/každé 2 dny	242,0 ± 9,3	52,6 ± 4,4	40,8 ± 7,2
10 mg/kg/každé 2 dny	197,4 ±27,9	51,4 ± 5,9	29,8 ± 6,3
1 mg/kg/každé 3 dny	244,8 ± 19,5	60,8 ±7,3	54 ± 7,1
10 mg/kg/každé 3 dny	188 ± 31,2	52,2 ± 6,9	26,2 ± 10,7

Tyto údaje dokládají, že Fc-OB protein nebo jeho analogy nebo deriváty jsou činidly, která účinně snižují krevní lipidy.

Příklad 6

Obéznímu pacientu (člověku) se za účelem snížení hmotnosti podává lidský Fc-OB protein nebo analog nebo derivát. Tento obézní pacient má také zvýšenou hladinu lipidů v krvi, jako je zvýšená hladina cholesterolu, nad 200 mg/100 ml.

·· ··· · φ · ·· • · · ♦ φ φ • · φφφφ φ φ · · · · φ • · · ··· Φ··· ·· ·ΦΦ ·· · ·· ··

Pacient v průběhu léčení Fc-OB proteinem dosáhne uspokojivého snížení hmotnosti. Tomuto neobéznímu pacientu se podává udržovací dávka Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu, aby se udržela snížená hladina krevních lipidů, včetně snížené hladiny cholesterolu, pod 200 mg/100 ml. Tato podávaná dávka není natolik vysoká, aby vedla k dalšímu snižování hmotnosti. Podávání je dlouhodobé. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Příklad 7

Pacientem je neobézní člověk, který prodělal koronární operaci bypass nebo jiné invasivní ošetření za účelem zmírnění rozvinuté tvorby arteriálního plátu. Po operaci se pacientu podává udržovací dávka Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu, aby se zabránilo opětovné tvorbě arteriálního plátu. Podávaná dávka není tak vysoká, aby vedla ke ztrátě hmotnosti. Podávání je dlouhodobé. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Příklad 8

Pacientem je neobézní člověk, který trpí hypertensí vyvolanou omezením krevního toku z ucpaných arterií. Tomuto pacientu se podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v dávce, která je dostatečná pro redukci arteriálního plátu vedoucího k ucpání tepen. Poté se u pacienta monito·· ··· · ·· 4 4 • · 4 · · · • · 4 · · · ··· · · · · · · · ·· ··· · · · · · · t ruje další tvorba arteriálního plátu a hypertenze. Pokud opět dojde k tomuto stavu, pacientu se znovu podává Fc-OB protein, analog nebo derivát v množství dostatečném pro obnovení krevního toku, přičemž toto množství není natolik vysoké, aby vedlo ke snížení hmotnosti. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti Fc-OB proteinu (nebo jinému zdroje antigenicity, je-li použitelný).

Příklad 9

Pacientem je člověk se žlučovými kameny. Žlučové kameny buď nebyly odstraněny, a je snaha vyhnout se tvorbě dalších kamenů, nebo odstraněny byly, avšak žlučník byl ponechán (jako v případě použití laserové nebo ultrazvukové chirurgie) , a je snaha vyhnout se tvorbě dalších kamenů. Pacientu se podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v množství, které je účinné pro zabránění akumulaci dalších žlučových kamenů nebo opětovné akumulaci žlučových kamenů. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti Fc-OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Příklad 10

Pacientem je diabetik, u něhož je snaha snížit dávky inzulínu při léčení diabetes. Pacientu se podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v množství, které je účinné pro zvýšení hmoty tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk. Citlivost pacienta na inzulín se zvýší a ···· fr fr· frfrfrfr fr* ·· ··· ·· · frfrfrfr • •••••«frfr • ····· frfr frfr · ♦ frfr frfrfr frfrfrfr ·· ··· frfr · frfr ·· dávka inzulínu nezbytná pro alevaci od symptomů diabetes se sníží. Toto snížení se projeví buď jako snížení potřebných jednotek inzulínu nebo ve formě snížení potřebného počtu inzulínových injekcí za den. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Příklad 11

Pacientem je neobézní člověk, který pro léčebné účely potřebuje zvýšit hmotu tkáně tvoření v podstatě svalovinou neobsahující tuk, jako je například rekonvalescence po prodělaném onemocnění, které tyto tkáně vyčerpává. Pacientu se podává Fc-OB protein nebo jeho analog nebo derivát v množství, které je účinné pro požadované zvýšení hmoty tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk. Zvýšení hmoty této tkáně lze monitorovat snímáním DEXA. Hladiny cirkulujícího Fc-OB proteinu nebo analogu nebo derivátu lze monitorovat za použití diagnostického kitu, jako je stanovení protilátek proti OB proteinu (nebo jinému zdroji antigenicity, je-li použitelný).

Materiály a metody

Zvířata

Při zkouškách podle výše uvedených příkladů bylo použito myší CD1 divokého typu a myší ( + /+) C57B16. Věk myší na počátku byl 8 týdnů a zvířata měla stabilizovanou hmotnost.

• fl · fl · ·

Krmení a měření hmotnosti

Myším bylo podáváno mleté krmivo pro hlodavce (PMI Feeds, lne.) v krmícím zařízení pro prášková krmivá (Allentown Caging and Equipment), které umožňuje přesnější a citlivější odměřování, než jaké je u kusového krmivá. Hmotnost se měří během požadovaného období každý den ve stejnou dobu (14.00). Tělesná hmotnost den před injekcí byla definována jako základní linie hmotnosti. Myši použité při zkoušce vážily 18 až 22 g.

Chov

Myši se chovají po jedné za humánních podmínek.

Podávání proteinu nebo vehikula

Protein (popsaný dále) nebo vehikulum (fosfátem pufrovaný solný roztok, pH 7,4) se podávají subkutánními injekcemi nebo intravenosně.

Kontrola

Kontrolní zvířata jsou zvířata, jimž bylo injekčně podáno samotné vehikulum, k němuž nebyl přidán ani Fc-OB fúzní protein ani OB protein.

Protein

V SEQ. ID. NO: 1, 2 a 3 je popsána myší rekombinantní OB DNA a protein (obr. 1) a v SEQ. ID: NO: 4, 5 a 6 je popsán analog rekombinantní lidské OB DNA a protein (obr.

2). Jak již bylo uvedeno výše, rekombinantní lidský OB protein popsaný v SEQ. ID. NO: 6 má lysinový zbytek v poloze 35 a isoleucinový zbytek v poloze 74. Jako ilustrativní příklady OB proteinu, kterého lze použít při tvorbě Fc-OB fúzního proteinu pro účely způsobu léčení a způsobu výroby léčiva podle vynálezu je dále možno uvést rekombinantní lidský protein uvedený v Zhang et al., Nátuře, viz výše a PCT publikaci WO 96/05309 (12/22/96) (citace představují náhradu za přenesení celého obsahu citovaných publikací, včetně obrázků, do tohoto textu) a myší a lidské analogy rekombinantních proteinů uvedené na obr. 1 a 2. Při tvorbě Fc-OB fúzního proteinu je také možno použít jiných OB nebo Fc proteinů nebo jejich analogů nebo derivátů.

První aminokyselinou sekvence aminokyselin pro rekombinantní OB protein, která je označena jako +1, je valin, a aminokyselinou v poloze -1 je methionin. C-terminální aminokyselina má číslo 146 (cytein) (viz obr. 1 a 2). První aminokyselina sekvence pro rekombinantní lidský Fc-OB protein uvedené na obr. 3 je označena jako +1 a jedná se o kyselinu glutamovou a aminokyselinou v poloze -1 je methionin. C-terminální aminokyselina má číslo 378 (cystein). První aminokyselina sekvence pro variantu rekombinantního lidského Fc-OB proteinu znázorněné na obr. 4 je označená jako +1, a je jí kyselina glutamová. Aminokyselinou v poloze -1 je methionin. C-terminální aminokyselina má číslo 378 (cystein). První aminokyselina sekvence pro variantu rekombinatního lidského Fc-OB proteinu znázorněné na obr. 5 je označena jako +1, a je jí kyselina asparagová. Aminokyselinou v poloze -1 je methionin a C-terminální aminokyselina má číslo 373 (cystein). První aminokyselina sekvence pro variantu rekombinatního lidského Fc-OB proteinu znázorněné na obr. 6 je • · · · označena jako +1, a je jí kyselina asparagová. Aminokyselinou v poloze -1 je methionin a C-terminální aminokyselina má číslo 373 (cystein).

Expresní vektor a hostitelský kmen

Použitým plasmidovým expresním vektorem je pAMG21 (přírůstkové číslo ATCC 98113), který je derivátem pCFM1656 (přírůstkové číslo ATCC 69576) a obsahuje vhodná restrikční místa pro inserci genů za (ve směru exprese) lux PR promotor (popis systému lux exprese viz US patent č. 5 169 318). Vytvoří se Fc-OB DNA popsaná dále a znázorněná na obr. 3 až 6 a liguje se do expresního vektoru pAMG21 linearizovaného restrikčními endonukleasami Ndel a BamHI a transformuje do hostitelského kmene E. coli FM5. Buňky E. coli FM5 byly odvozeny firmou Amgen lne., Thousand Oaks, CA, USA z kmene E. coli K-12 (Bachmann, et al., Bacterial. Rev. 40: 116 až 167, 1976) a obsahují integrovaný represorový gen fágu lambda, cl₈57 (Sussman et al., C. R. Acad. Sci. 254: 1517 až 1579, 1962). Produkce vektoru, buněčná transformace a selekce kolonií se provádí za použití standardní metodologie (např. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Hostitelské buňky se pěstují v LB médiu.

Konstrukce Fc-OB DNA

Jako zdroj sekvence pro těžký řetězec lidského imunoglobulinu IgG-1 od aminokyseliny číslo 99 (Glu) do přirozeného karboxylového konce slouží plasmid pFC-A3 ···* ·· · (popsaný dále). Sekvenci lidského IgG-1 je možno získat z genové banky Genebank (PO1857).

• ► 1 • T • * · • · · ♦ fe · » • fe · fe · · · • fe ·· • · · fe • · · fe • · · fe ♦ • fe fe · • fe fefe

Lidská OB sekvence je popsána výše a také v publikaci Zhang et al., Nátuře, viz výše a PCT WO 96/05309, které jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu, včetně obrázků, do tohoto textu. OB DNA se liguje do expresního vektoru pCFM1656 linearizovaného restrikčními endonukleasami Xbal a BamHI za použití standardních postupů klonování (viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Plasmid pCFM1656, který nese OB DNA sekvenci slouží jako zdroj sekvence pro rekombinantní lidský OB gen.

Genetická fúze těchto dvou sekvencí se provádí prodloužením překryvu pomocí polymerasové řetězové reakce (Ho, S. N., et al., Site Directed Mutagenesis by Overlap Extension Using The Polymerase Chain Reaction, Gene 77: 51 až 59, 1989). Produkt PCR se štěpí restrikční endonukleasou Ndel, aby vznikl 5'-lepivý konec a restrikční endonukleasou BamHI, aby vznikl 3'- lepivý konec. Podobně se štěpí vektor pAMG21. Ligace se provádí za použití fúzního fragmentu a linearizovaného vektoru. Ligovaná DNA se elektroporuje do hostitelského kmene E. coli. Klony přežívající na kanamycinových (50 gg/ml) selekčních agarových miskách se prověří na expresi proteinu velikosti Fc-OB. Izolují se plasmidy jednotlivých klonů a ověří se sekvence oblasti kódující gen.

V případě, že je žádoucí Fc-OB gen dále modifikovat, pro provedení změn se použije opět PCR postupů. Za účelem získání variant SEQ. ID. NO: 12 a 15 byly Na N-konci Fc ···♦ fcfc • fcfc • · • · • ·· fcfc • · · · • fc · · · • · fcfc • fc ··· fcfc části fúzního proteinu (SEQ. ID. NO: 9) provedeny dvě sady změn. Další varianta byla zkonstruována zavedením čtyř aminokyselinových substitucí, aby se odstranilo vazebné místo Fc-receptoru (leucin v poloze 15 se nahradí kyselinou glutamovou) a vazebné místo komplementu (Clq) (kyselina glutamová v poloze 98 se nahradí alaninem, lysin v poloze 100 se nahradí alaninem a lysin v poloze 102 se nahradí alaninem) (viz Xin Xiao Zheng et al. , J. Immunol. 154: 5590 až 5600, 1995). Templátem pro tento konstrukt je SEQ. ID. NO. 15 a výsledná varianta je SEQ. ID. NO: 18.

Konstrukce pFC-A3 vektoru

Plasmid pFc-A3, který obsahuje oblast kódující Fc oblast těžného řetězce lidského imunoglobulinu IgG-1 (viz Ellison, J. W. et al., Nucleis Acids Res. 10: 4071 až 4079, 1982) od první aminokyseliny Glu-99 pantové domény do karboxylového konce plus fúzní místo 5'-Notl a místa 3'-SalI a Xbal, se připraví PCR amplifikací knihovny cDNA lidské sleziny. PCR reakce byly provedeny v konečném objemu 100 ml a použilo se 2 jednotek Vent DNA polymerasy ve 20mM Tris-HCl (pH 8,8), lOmM chloridu draselném, lOmM síranu amonném, 2mM síranu hořečnatém, 0,1% Triton X-100 a 400mM každého z dNTP a 1 ng cDNA knihovny, která se má amplifikovat, spolu s ΙμΜ každého primeru. Reakce se zahájí denaturací při 95°C po dobu 2 minut, po níž následuje 30 cyklů zahřívání 30 sekund na 95°C, 3 0 sekund na 55°C a 2 minuty na 73°C. 5 '-primer začlení místo Notl bezprostředně 5 k prvnímu zbytku (Glu99) pantové domény IgG-1. 3'-primer zavede místa Sáli a Xbal. 717bp PCR produkt se štěpí Notl a Sáli a výsledný DNA fragment se izoluje elektroforézou na 1% agarosovém gelu, purifikuje a klonuje do Notl vektoru pBluescript II KS ···♦

9 9 • 9 9

9 9

9 9

9 štěpeného Sáli (Stratagene). Insert ve výsledném plasmidu, pFC-A3, se sekvenuje, aby se potvrdila přesnost PCR reakce.

Způsoby produkce

Dále popsaných způsobů produkce se používá pro přípravu biologicky aktivního rekombinantního methionylovaného myšího nebo lidského analogu OB proteinu a Fc-OB fúzních proteinů. Podobných postupů lze použít pro přípravu biologicky aktivního methionylovaného lidského OB proteinu.

Fermentace

Použije se postupu jednorázové fermentace. Složení médií je uvedeno dále.

Dávka média, které obsahuje především zdroje dusíku se sterilizuje (zvýšením teploty na 120 až 123°C po dobu 25 až 35 minut) ve fermentační nádobě. Po ochlazení se k médiu za aseptických podmínek přidají zdroje uhlíku, hořčíku, fosfátu a stopových kovů. Do fermentoru se přidá noční kultura (500 ml) bakterií produkujících výše uvedený rekombinantni myší protein (pěstovaná v živné půdě LB). Když se optická hustota kultury (měřená při 600 nm jako indikátor hustoty buněk) zvýší na 15 až 25 absorpčních jednotek, přidá se autoindukční roztok (0,5 mg/ml homoserinlaktonu) (1 ml/1), aby se indukovala exprese rekombinantního genu. Fermentační proces se nechá probíhat po dobu dalších 10 až 16 hodin a poté se půda sklidí centrifugaci.

Složení média

4444 •

• 44 4

4 • 44 ·· 44

4 4 • 4 4

4 4

4 4

44

34 <	3/1	kvasinkový extrakt
78 g/1	sojový pepton
0,9	g/i	chlorid draselný
5,0	g/i	hexaphos
1,7	g/i	kyselina citrónová
120	g/i	glycerol
0,5	g/i	MgSO4.7H2O
0,2	ml/1	roztok stopových kovů
0,5	ml/1	protipěnové činidlo P2000

Roztok stopových kovů

Chlorid železitý (FeCl₃.6H₂O) : 27 g/1

Chlorid zinečnatý (ZnCl₂.4H₂O) : 2 g/1

Chlorid kobaltnatý (CoCl₂.6H₂0) : 2 g/1

Molybdenan sodný (NaMo0₄.2H₂O) : 2 g/1

Chlorid vápenatý (CaCl₂.2H₂O) : 1 g/1

Síran měďnatý (CuSO₄.5H₂O) 1,9 g/1

Kyselina boritá (H₃BO₃) 0,5 g/1

Chlorid manganatý (MnCl₂.4H₂O) : 1,6 g/1

Dihydrát cítranu sodného: 73,5 g/1

Purifíkace lidského Fc-OB fúzního proteinu

Purifíkace lidského Fc-OB fúzního proteinu se provádí v dále uvedených stupních (pokud není uvedeno jinak, provádějí se tyto stupně při teplotě 4°C) . Purifíkace myšího a lidského OB proteinu je popsána v PCT publikaci WO 96/05309, viz výše, která je zde citována náhradou za přenesení celého jejího obsahu do tohoto textu.

···· • · •

♦ Β • t Β

Β • Β ΒΒ * Β Β Β

Β · Β Β

Β Β Β Β Β • Β Β Β

ΒΒ ΒΒ

1. Buněčná pasta. Pasta z buněk E, coli se suspenduje v pětinásobném objemu destilované vody. Buňky ve vodě se dále rozbijí tak, že se dvakrát nechají projít mikrofluidizérem. Rozbité buňky se centrifugují jednu hodinu při 4200 min'¹ v centrifuze Beckman JB-6 s rotorem J5-4.2.

2. Promytí inklusního tělesa. Supernatant z výše uvedeného stupně se odstraní a peleta se resuspenduje v pěti objemech destilované vody. Směs se centrifuguje za výše uvedených podmínek.

3. Solubilizace. Peleta se solubilizuje v 10 objemech 50mM tris, pH 8,5, 8M hydrochloridu guanidinu, lOmM dithiothreitolu a míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. K roztoku se přidá dihydrochlorid cystaminu (do 40mM koncentrace) a roztok se 1 hodinu míchá.

4. Roztok se stupně 3 se přidá ke 20 až 30 objemům roztoku o následujícím složení: 50mM tris, pH 8,5, 0,8M arginin, 2M močovina a 4mM cystein. Směs se míchá 16 hodin při 8°C.

5. Výměna pufru. Roztok ze stupně 4 se zkoncentruje a diafiltruje do lOmM tris, pH 8,5.

6. Vysrážení kyselinou. Hodnota pH roztoku ze stupně 5 se 50% ledovou kyselinou nastaví na 4,75. Výsledný roztok se inkubuje 30 minut při teplotě místnosti a poté přefiltruj e.

7. Katexová chromatografie. Hodnota pH roztoku ze stupně 6 se nastaví na 7,0 a roztok se při 10°C umístí na sloupec CM Sepharose Fast Flow. Sloupcem se nechá projít gradient 0 až 0,lM chlorid sodný v lOmM fosfátu o pH 7,0 (20 objemů sloupce).

8. Anexová chromatografie. Shromážděné CM frakce ze stupně 7 se pětinásobně zředí 5mM tris, pH 7,5 a při 10°C umístí na sloupec Q Sepharose Fast Flow. Gradient (20 objemů sloupce): lOmM tris, pH 7,5, 0 až 0,2M NaCl.

• · * · • fr ···· fr fr · fr ♦ ♦ frfr fr fr fr • fr fr · fr fr frfr fr frfr frfr » frfr · * frfr fr • frfr · frfr frfr

9. Hydrofobní chromatografie. Ke shromážděným Q sepharosovým frakcím se přidá síran amonný do koncentrace 0,75M a roztok se umístí na hydrofobní interakční sloupec methyl Macroprep při teplotě místnosti. Gradient (20 objemů sloupce): lOmM fosfát, pH 7,0, 0,75M až 0M síran amonný.

10. Výměna pufru. Shromážděné frakce ze stupně 9 se zkoncentrují, toho jak je to nutné a dialyzují proti pufru PBS.

frfrfr· fr · • fr frfrfrfr fr fr fr • « fr ♦ frfr ♦ · frfr • frfr · • frfr · frfr frfr · • frfr · frfr frfr

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNE INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Mann, Michael B.

Hecht, Randy I.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: OB fúzní protein - kompozice a způsoby (iii) POČET SEKVENCÍ: 18

ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A)	ADRESA	: Amgen lne.
(B)	ULICE:	1840 DeHavilland Drive
(C)	MĚSTO:	Thousand Oaks
(D)	STÁT:	Kalifornie
(E)	ZEMĚ:	Spojené státy americké
(F)	ZIP:	91320-1789

(v) POČÍTAČOVĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: pružný disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (vi) ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) PŘIHLÁŠKA ČÍSLO: US 08/770,973 (B) DATUM PODÁNÍ: 20. prosinec 1996 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Knight, Matthew W.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 36,846 (C) ZNAČKA SPISU: A-416 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 491 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak • flflfl

fl fl fl ř » · • · fl

fl » flflfl (B) POZICE: 41 (D) JINÁ INFORMACE: Met je ATG (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 1:

TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATGGTACCGA TCCAGAAAGT 60

TCAGGACGAC ACCAAAACCT TAATTAAAAC GATCGTTACG CGTATCAACG ACATCAGTCA 120

CACCCAGTCG GTCTCCGCTA AACAGCGTGT TACCGGTCTG GACTTCATCC CGGGTCTC-CA 180

CCCGATCCTA AGCTTGTCCA AAATGGACCA GACCCTGGCT GTATACCAGC AGGTGTTAAC 240

CTCCCTGCCG TCCCAGAACG TTCTTCAGAT CGCTAACGAC CTCGAGAACC TTCGCGACCT 300

GCTGCACCTG CTGGCATTCT CCAAATCCTG CTCCCTGCCG CAGACCTCAG GTCTTCAG.AA 360

ACCGGAATCC CTGGACGGGG TCCTGGAAGC ATCCCTC-TAC AGCACCGAAC- TTGTTGCTCT 420

GTCCCGTCTG CAGGGTTCCC TTCAGGACAT CCTTCAGCAC- CTGGACGTTT CTCCGGAATG 480

TTAATGGATC C ⁴⁹¹ (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 491 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO:2:

AGATCTAAAC	TCAAAATTGA	AAATCTTCCT	CCTTATTGTA	TACCATGGCT	AGGTCTTTCA	60
AGTCCTGCTG	TGGTTTTGGA	ATTAATTTTG	CTAGCAATGC	C-CATAGTTGC	TGTAGTCAGT	120
GTGGGTCAGC	CAGAGGCGAT	TTGTCGCACA	ATGGCCAGAC	CTGAAGTAGG	GCCCAGACGT	180
GGGCTAGGAT	TCGAACAGGT	TTTACCTGGT	CTGGGACCC-A	CATATGGTCG	TCCACAATTG	240
GAGGGACGGC	AGGGTCTTGC	AAGAAGTCTA	GCGATTC-CTG	GAGCTCTTGG	AAGCGCTGGA	300
CGACGTGGAC	GACCGTAAGA	GGTTTAGGAC	GAGGGACGGC	GTCTGGAGTC	CAGAAGTCTT	360
TGGCCTTAGG	GACCTGCCCC	AGGACCTTCG	TAC-GGACATG	TCGTGGCTTC	AACAACGAGA	420
CAGGGCAGAC	GTCCCAAGGG	AAGTCCTGTA	GGAAGTCGTC	GACCTGCAAA	GAGGCCTTAC	480

AATTACCTAG G

491 • 444 ·

• · 4 4 4 •4 4 4 4 » « 4 4 4 4 * · 4 4 4 4 ♦· ♦·· 44 4 ·4 • 4 4 4

4 4 4

4 4 «

4 4 4

44

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 3:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 147 aminokyselin TYP: aminokyselina DRUH ŘETĚZCE: neznámý TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAK:
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: protein
	(B)	POZICE: 1
	(D)	JINÁ INFORMACE: Met (ATG)
		v poloze -1
(xi)	POPIS	> SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 3

Met Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Len Ile Lys 15 10 15

Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser Val Ser 20 25 30

Ala Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro C-iy Leu His Pro 35 40 45

Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin 50 55 60

Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Gin Ile Aia Asn Asp

70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser

90 95

Cys Ser Leu Pro Gin Thr Ser Gly Leu Gin Lys Pro Glu Ser Leu Asp 100 105 HO

Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala L-eu Ser 115 120 125

Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin Leu Asp Val Ser

130 135 140

Pro Glu Cys

145 • flfl· fl* fl • · • · • · flfl flfl· • fl · ·« · fl fl • · • fl *

flflfl flfl flfl fl · · · • · · « • · flfl fl • flfl fl • fl flfl

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 4:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 454 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(ix)	ZNAK: (A) (B) (D)	JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak POZICE: 4 JINÁ INFORMACE: Met je ATG
(xi)	POPIS	1 SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 4:

CATATGGTAC	CGATCCAGAA	AGTTCAC-C-AC	GACACCAAAA	CCTTAATTAA	AACGATCGTT	60
ACGCGTATCA	ACGACATCAG	TCACACCCAG	TCGGTGAGCT	CTAAACAGCG	TGTTACAGGC	120
CTGGACTTCA	TCCCGGGTCT	GCACCCGATC	CTGACCTTGT	CCAAAATGGA	CCAGACCCTG	180
GCTGTATACC	AGCAGATCTT	AACCTCCATG	CCGTCCCGTA	ACGTTCTTCA	GATCTCTAAC	240
GACCTCGAGA	ACCTTCGCGA	CCTGCTC-CAC	GTGCTGGCAT	TCTCCAAATC	CTGCCACCTG	300
CCATGGGCTT	CAGGTCTTC-A	GACTCTGGAC	TCTCTGGGCG	GGGTCCTGGA	AC-CATCCGGT	360
TACAGCACCG	AAGTTGTTGC	TCTGTCCCGT	CTGCAGGGTT	CCCTTCAGGA	CATGCTTTGG	420
CAGCTGGACC	TGTCTCCGGG	TTC-TTAATGG	ATCC			454

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 454 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 5:

GTATACCATG GCTAGGTCTT TCAAGTCCTG CTGTGGTTTT GGAATTAATT TTGCTAGCAA 60

TGCGCATAGT TGCTGTAGTC AGTGTGGGTC AGCCACTCGA GATTTGTCGC ACAATGTCCG 120

4444 • ·· • · • · ·

4 4 ···

4444 «

t ·

• ·

4 4

4

4« • 4 ·

• ·

4

4

GACCTGAAGT	AGGGCCCAGA	CGTGGGCTAG	GACTGGAACA	ggttttacct	GGTCTGGGAC	180
CGACATATGG	TCGTCTAGAA	TTGGAGGTAC	GGCAGGGCAT	TGCAAGAAGT	CTAGAGATTG	240
CTGGAGCTCT	TGGAAGCGCT	C-GACGACGTG	CACGACCGTA	AGAGGTTTAG	GACGGTGGAC	300
GGTACCCGAA	GTCCAGAACT	CTGAGACCTG	AGAGACCCGC	CCCAGGACCT	TCGTAGGCCA	360
ATGTCGTGGC	TTCAACAACG	AGACAGGGCA	GACGTCCCAA	GGGAAGTCCT	GTACGAAACC	420
GTCGACCTGG	ACAGAGGCCC	AACAATTACC	TAGG			454

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 147 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1

				(D)	JINÁ	INFORMACE:	Met (ATG	) začíná
poloze	-1
	(	Ixi)	POPIS SEKVENCE: SEQ.	ID. NO	: 6
Met X	Val	Pro	Ile	Gin 5	Lys Val	Gin Asp Asp 10	Thr Lys	Thr	Leu Ile Lys 15
Thr	Ile	Val	Thr 20	Arg	Ile Asn	Asp Ile Ser 25	His Thr	Gin	Ser Val Ser 30
Ser	Lys	C-ln 35	Arg	Val	Thr Gly	Leu Asp Phe 40	Ile Pro	Gly 45	Leu His Pro
Ile	Leu 50	Thr	Leu	Ser	Lys Met 55	Asp Gin Thr	Leu Ala 60	Val	Tyr Gin Gin
Ile 65	Leu	Thr	Ser	Met	Pro Ser 70	Arg Asn Val	Leu Gin 75	Ile	Ser Asn Asp 80
Leu	Glu	Asn	Leu	Arg 85	Asp Leu	Leu His Val 90	Leu Ala	Phe	Ser Lys Ser 95
Cys	His	Leu	Pro 100	Trp	Ala Ser	Gly Leu Glu 105	Thr Leu	Asp	Ser Leu Gly .110

• ·

Val Val Ala Leu Ser

125

Glv Val Leu Glu Ala 115

Arg Leu Gin Gly Ser 130

Pro Gly Cys 145

Ser Gly Tyr Ser Thr Glu 120

Leu Gin Asp. Met Leu Trp 135

Gin Leu Asd Leu Se»· 140 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 7:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 1150 bázových párů TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: CDNA
	ZNAK: (A) (B) (D)	JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak POZICE: 4 JINÁ INFORMACE: Met je ATG
(xi)	POPIS	1 SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 7:

CATATGGAAC CCAAATCTTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA 60

CTCCTGGGGG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC 120

TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATC-CGTGGTG GTGGACGTGA C-CCACGAAGA CCCTGAGGTC 180

AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG 240

GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCC7GCA CCAGGACTGG 300

CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 360

AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 420

TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT C-CCTGGTCAA AGGCTTCTAT 480

CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 540

ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 600

AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 660

AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 720 •· ·· ·· • · · · · • 0 · · · •·00· • · * · ·· · • · · ·· ··

CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG	ATCC-7TACGC	GTATCAACGA	CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAG7?	ACAGGCCTGG	ACTTCATCCC	GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATGGACCAG	ACCCTGGCTG	TATACCAGCA	GATCTTAACC	900
TCCATGCCGT	CCCGTAACGT	TATCCAGATC	TCTAACGACC	TCGAGAACCT	TCGCGACC7G	960
CTGCACGTGC	TGGCATTCTC	CAAATCC7GC	CACCTGCCAT	GGGCTTCAGG	7C77GAGACT	1020
CTGGACTCTC	TGGGCGGGGT	CCTGGAAGCA	TCCGGTTACA	GCACCGAAG7	7G77GCTC7G	1080
TCCCGTCTGC	AGGGTTCCCT	TCAGGACA7G	CTTTGGCAGC	TGGACCTGTC	TCCGGGTTGT	1140
TAATGGATCC						1150

(2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1150 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 8:

GTATACCTTG	GGTTTAGAAC	ACTGTTTTGA	GTGTGTACGG	GTGGCACGGG	TCGTGGACTT	60
GAGGACCCCC	C7GGCAGTCA	GAAGGAGaAG	GGGGGT777G	GG7TCCTGTG	GGAGTACTAG	120
AGGGCCTGGG	GACTCCAGTG	TACGCACCAC	CACCTGCAC7	CC-GTGC7TC7	GGGAC7CCAC-	180
TTCAAGTTGA	CCATGCACCT	GCCGCACCTC	CACGTATTAC	GGTTCTGTT7	CC-GCGCCCTC	240
CTCGTCATGT	TGTCGTGCAT	GGCACACCAG	TCGCAGGAGT	GGCAGGACGT	GGTCCTGACC	300
GACTTACCG7	TCCTCATGTT	CACGTTCCAG	AGGTTGTTTC	GGGAGGGTCG	GC-GGTAC-CTC	360
TTTTGGTAGA.	GG7TTCGGTT	TCCCGTCGGG	GCTCTTGGTG	TCCACATGTG	GGACGGGGGT	420
AGGGCCCTAC	TCGACTGGTT	CTTGGTCCAG	TCGGACTGGA	CGGACCAGTT	TCCGAAGATA	480
GGGTCGCTGT	AGCGGCACCT	CACCCTCTCG	TTACCCGTCG	GCCTCTTGTT	GATGTTCTGG	540
TGCGGAGGGC	ACGACCTGAG	GCTGCCGAGG	AAGAAGGAGA	TGTCGTTCGA	GTGGCACCTG	600
TTCTCGTCCA	CCGTCGTCCC	CTTGCAGAAG	AGTACGAGGC	ACTACGTACT	CCGAGACGTG	660
TTGGTGATGT	GCGTCTTCTC	GGAGAGGGAC	AGAGGCCCAT	TTCATGGCTA	GGTCTTTCAA	720

• · · ·

GTCCTGCTGT	GGTTTTGGAA	TTAATTTTGC	TAGCAATGCG	CATAGTTGCT	GTAGTCAGTG	780
TGGGTCAGCC	ACTCGAGATT	TGTCTTTCAA	TGTCCGGACC	TGAAGTAGC-G	CCCAGACGTG	840
GGCTAGGACT	GGAACAGGTT	T7ACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAAT7GG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAC-GTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGC-CTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTGTAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140

ATTACCTAGG 1150 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE

	(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 379 aminokyselin TYP: aminokyselina DRUH ŘETĚZCE: neznámý TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: protein
	(B)	POZICE: 1
	(D)	JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná

v poloze -1

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEQ	. ID. NO:	9 :
Met 1	Glu Pro	Lys Ser 5	Cys Asp Lys	Thr	His Thr Cys 10	Pro Pro Cys Pro 15
Ala	Pro Glu	Leu Leu 20	Gly Gly Pro	Ser 25	Val Phe Leu	Phe Pro Pro Lys 30
Pro	tys Asp 35	Thr Leu	Met lle Ser 40	Arg	Thr Pro Glu	Val Thr Cys Val 45
Val	Val Asp 50	Val Ser	His Glu Asp 55	Pro	Glu Val Lys 60	Phe Asn Trp Tyr
Val 65	Asp Gly	Val Glu	Val His Asn 70	Ala	Lys Thr Lys 75	Pro Arg Glu Glu 80

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr Val

Leu

His

85

90

95

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val Ser

Asn

Lys

100

105

110

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala Lys

Gly

Gin

115

120

125

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

C-ln

Val Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly Phe

Tvr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

Ile

Ala

Val Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro Glu

Asn

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser Phe

Phe

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin Gly

Asn

Val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

Val Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg Ile

Asn

Asp

245

250

255

Ile

Ser

His

Thr

Gin Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val Tyr

Gin

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Ile

Gin

Ile Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg Asp

Leu

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp Ala

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala Ser

Gly

Tyr

340

345

350

Ser

Thr

Glu

Val

Val Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser Leu

Gin

Asp

355

360

365

• · · ·

Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370 375 ·· (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE

		(A) DÉLKA: 1150 bázových párů
		(B) TYP: nukleová kyselina
		(C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
		(D) TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	DRUH MOLEKULY: cDNA
(ix)	ZNAK:
		(A) JMÉNO/KLIČ: zvláštní znak
		(B) POZICE: 4
		(D) JINÁ INFORMACE: Met je ATG
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 10:
CATATGGAAC	CAAAATCTGC	TC-ACAAAACT CACACATGTC CACCTTGTCC AGCTCCGGAA	60
CTCCTGGGGG	GTCCTTCAGT	CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC	120
TCCCGGACCC	CTGAGGTCAC	ATGCGTGGTG GTGGACGTGA C-CCACGAAGA CCCTGAGGTC	180
AAGTTCAACT	GGTACGTGGA	CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG	240
GAGCAGTACA	ACAGCACGTA	CCGTGTC-GTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG	300
CTGAATGC-CA	AC-GAGTACAA	GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG	360
AAAACCATCT	CCAAAGCCAA	AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA	420
TCCCGGGATG	AC-CTGACCAA	GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT	480
CCCAGCGACA	TCC-CCGTGGA	GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC	540
ACGCCTCCCG	TGCTGGACTC	CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC	600
AAGAGCAC-GT	GGCAGCAGGG	GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC	660
AACCACTACA	CGCAGAAGAG	CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT	720
CAGGACGACA	CCAAAACCTT	AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC	780
ACCCAGTCGG	TGAGCTCTAA	ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC	840
CCGATCCTGA	CCTTGTCCAA	AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC	900

TCCATGCCGT

CTGCACGTGC

CTGGACTCTC

TCCCGTCTGC

TAATGGATCC

CCCGTAACGT

TGGCATTCTC

TGGGCGGGGT

AGGGTTCCCT

TATCCAGATC

CAAATCCTGC

CCTGGAAGCA

TCAGGACATG

TCTAACGACC

CACCTGCCAT

TCCGGTTACA

CTTTGGCAGC

TCGAGAACCT

GGGCTTCAGG

GCACCGAAGT

TGGACCTGTC

TCGCGACCTG

TCTTGAGACT

TGTTGC7CTG

TCCGGG7TGT

960

1020

1080

1140

1150 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1150 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetezcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 11:

GTATACCTTG GTTTTAGACG ACTGTTTTGA GTGTGTACAG GTGGAACAGG TCGAGGCCTT 60

GAGGACCCCC CAGGAAGTCA GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG GGTTCCTGTG GGAGTACTAG 120

AGGGCCTGGG GACTCCAGTG TACGCACCAC CACCTGCACT CGGTGCTTCT GGGACTCCAG 180

TTCAAGTTGA CCATGCACCT GCCGCACCTC CACGTATTAC GGTTCTGTTT CGGCGCCCTC 240

CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCC7GACC 300

GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTG77TC GC-GAGGGTCG GGGG7AGCTC 360

TTTTGGTAGA GGTTTCGGTT TCCCGTCGC-G GCTCTTGGTG TCCACATGTG GGACGGGGGT 420

AGGGCCCTAC TCGACTGGTT CTTGGTCCAG TCGGACTGGA CGGACCAGTT TCCGAAGATA 480

GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 540

TGCGGAGGGC ACGACCTGAG GCTGCCGAGG AAGAAGGAGA TGTCGTTCGA GTGGCACCTG 600

TTCTCGTCCA CCGTCGTCCC .CTTGCAGAAG AGTACGAGGC ACTACGTACT CCGAGACGTG 660

TTGGTGATGT GCGTCTTCTC GGAGAGGGAC AGAGGCCCAT TTCATGGCTA GGTCTTTCAA 720

GTCCTGCTGT GGTTTTGGAA TTAATTTTGC TAGCAATGCG CATAGTTGCT GTAG7CAGTG 780

TGGGTCAGCC ACTCGAGATT TGTCTTTCAA TGTCCGGACC TGAAGTAGGG CCCAGACGTG 840 • · · · ·

··

GGCTAGGACT	GGAACAGGTT	TTACCTGGTC	TGGGACCGAC	ATATGGTCGT	CTAGAATTGG	900
AGGTACGGCA	GGGCATTGCA	ATAGGTCTAG	AGATTGCTGG	AGCTCTTGGA	AGCGCTGGAC	960
GACGTGCACG	ACCGTAAGAG	GTTTAGGACG	GTGGACGGTA	CCCGAAGTCC	AGAACTCTGA	.1020
GACCTGAGAG	ACCCGCCCCA	GGACCTTCGT	AGGCCAATGT	CGTGGCTTCA	ACAACGAGAC	1080
AGGGCAGACG	TCCCAAGGGA	AGTCCTGTAC	GAAACCGTCG	ACCTGGACAG	AGGCCCAACA	1140

ATTACCTAGG (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 379 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 12:

Met 1

Glu

Pro

Lys

Ser 5

Ala

Asp

Lys

Thr

Eis 10

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys 15

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 20

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser 25

Val

Phe

Leu

Pro 30

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 35

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 40

Arg

Thr

Pro

C-lu

Val 45

Thr

Cys

Val

Val

Val 50

Asp

Val

Ser

Eis

Glu 55

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 60

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 65

Asp

Gly

Val

Glu

Val 70

His

Asn

Ala

Lys

Thr 75

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 80

Gin

Tyr

A.sn

Ser

Thr 85

Tyr

Arg

Val

Val

Ser 90

Val

Leu

Thr

Val

Leu 95

His

Gin

Asp

Trp

Leu 100

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 105

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 110

Asn

Lys

•· ·φ·φ ·« ·» • * · φφφφ • · · φφφφ

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr Ile Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

115

120

125

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu Pro Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

130

135

140

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys Leu Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser Asn Gly

C-ln

Pro

Glu

Asn

Asn

165

170

175

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp Ser Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

180

185

190

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser Arg Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

195

200

205

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala Leu His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

210

215

220

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys Val Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

225

230

235

240

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr Ile Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

245

.250

255

Ile

Ser

His

Thr

Gin

Ser

Val

Ser

Ser Lys Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

260

265

270

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

Ile Leu Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

275

280

285

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

Gin

Ile Leu Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

290

295

300

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu Glu Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

305

310

315

320

His

Val

Leu

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys His Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

325

330

335

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu

Gly

Gly Val Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

340 345 350

Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 ' 375

Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gin. Gly Ser Leu Gin Asp

355 360 365

	• · fe fe fe • ·	• . i ·» ··.♦ • » · » • · · · · · * * fefefe • · · · fe «	• fe ·· * » · · • fefe * • · · · · • fefe · ♦ · fefe
68 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 13: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK: (A) JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak (B) POZICE: 4 (D) JINÁ INFORMACE: Met je ATG (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 13: CATATGGACA AAACTCACAC ATGTCCACCT TGTCCAGCTC CGGAACTCCT GGGGGGTCCT	60
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG	GACCCCTGAG	120
GTCACATGCG	TGC-TGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC	180
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA	GTACAACAGČ	240
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA	TGGCAAGGAG	300
TACAAGTGCA	AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC	CATCTCCAAA	360
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG	GGATGAGCTG	420
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG	CGACATCGCC	480
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC	TCCCGTGCTG	540
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 7GGACAAGAG	CAGGTGGCAG	600
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA	CTACACGCAG	660
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA	CGACACCAAA	720
ACCTTAATTA	AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA	GTCGGTGAGC	780
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT	CCTGACCTTG	840
TCCAAAATGG	ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT	900
AACGTTATCC	AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA	960
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC	1020

• ·♦ ♦ ··

GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 1080

TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 1135 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 14:

GTATACCTGT	TTTGAGTGTG	TACAGGTGGA	ACAGGTCGAG	GCCTTGAGGA	CCCCCCAGGA	60
AGTCAGAAGG	AGAAGGGGGG	TTTTGGGTTC	CTGTGGGAGT	ACTAGAGGGC	CTGGGGACTC	120
CAGTGTACGC	ACCACCACCT	GCACTCGGTG	CTTCTGGGAC	TCCAGTTCAA	GTTGACCATG	180
CACCTGCCGC	ACCTCCACGT	ATTACGGTTC	TGTTTCGGCG	CCCTCCTCGT	CATGTTGTCG	240
TGCATGGCAC	ACCAGTCGCA	GGAGTGGCAG	GACGTGGTCC	TGACCGACTT	ACCGTTCCTC	300
ATGTTCACGT	TCCAGAGGTT	GTTTCGGGAG	GGTCGGGGGT	AGCTCTTTTG	GTAGAGGTTT	360
CGGTTTCCCG	TCGGGGCTCT	TGGTGTCCAC	ATGTGGGACG	GGGGTAGGGC	CCTACTCGAC	420
TGGTTCTTGG	TCCAGTCGGA	CTGGACGGAC	CAGTTTCCGA	AGATAGGGTC	GCTGTAGCGG	480
CACCTCACCC	TCTCGTTACC	CGTCGGCCTC	ttgttgatgt	TCTGGTGCGG	A.GGGCACGAC	540
CTGAGGCTGC	CGAGGAAGAA	GGAGATGTCG	TTCGAGTGGC	ACCTGTTCTC	GTCCACCGTC	600
GTCCCCTTGC	AGAAGAGTAC.	GAGGCACTAC	GTACTCCGAG	ACGTGTTGGT	GATGTGCGTC	660
TTCTCGGAGA	GGGACAGAGG	CCCATTTCAT	GGCTAGGTCT	TTCAAGTCCT	GCTGTGGTTT	720
TGGAATTAAT	TTTGCTAGCA	ATGCGCATAG	TTGCTGTAGT	CAGTGTGGGT	CAGCCACTCG	780
AGATTTGTCT	TTCAATGTCC	GGACCTGAAG	TAGGGCCCAG	ACGTGGGCTA	GGACTGGAAC	840
AGGTTTTACC	TGGTCTGGGA	CCGACATATG	gtcgtctaga	ATTGGAGGTA	CGGCAGGGCA	900
TTGCAATAGG	TCTAGAGATT	GCTGGAGCTC	TTGGAAGCGC	TGGACGACGT	GCACGACCGT	960

AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020

CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080

AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135

• · · · • · · · ♦ » ·« (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 374 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SE(	2. ID.	NO:	15:
Met 1	Asp Lys	Thr His 5	Thr Cys Pro	Pro	Cys Prc 10	Aia	Pro Glu Leu Leu 15
Gly	Gly Pro	Ser Val 20	Phe Leu Phe	Pro 25	Pro Lys	Pro	Lys Asp Thr Leu 30
Met	Ile Ser 35	Arg Thr	Pro Glu Val 40	Thr	Cys Va1	Val	Val Asp Val Ser 45
His	Glu Asp 50	Pro Glu	Val Lys Phe 55	Asn	Trp Tyr	Val 60	Asp Gly Val Glu
Val 65	His Asn	Ala Lys	Thr Lys Pro 70	Arg	Glu Glu 75	Gin	Tyr Asn Ser Thr 80
Tyr	Arg Val	Val Ser 85	Val Leu Thr	Val	Leu His 90	Gin	Asp Trp Leu Asn 95
Gly	Lys Glu	Tyr Lys 100	Cys Lys Val	Ser 105	Asn Lys	Ala	Leu Pro Ala Pro 110
Ile	Glu Lys 115	Thr Ile	Ser Lys Ala 120	Lys	Gly Gin	Pro	Arg Glu Pro Gin 125
Val	Tyr Thr 130	Leu Pro	Pro Ser Arg 135	Asp	Glu Leu	Thr 140	Lys Asn Gin Val
Ser 145	Leu Thr	Cys Leu	Val Lys Gly 150	Phe	Tyr Pro 155	Ser	Asp Ile Ala Val 160

• frfrfr • frfrfr

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 165

Gly Gin

Pro

Glu

Asn 170

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 175

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

'185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

lle

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

225

230

235

240

Leu

lle

Lys

Thr

lle

Val

Thr

Arg

lle

Asn

Asp

lle

Ser

His

Thr

Gin

245

250

255

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

val

Thr

Giv

Leu

Asp

Phe

lle

Pro

Gly

260

265

270

Leu

His

Pro

lle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

Gin

lle

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

lle

Gin

lle

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Gly

Va í

Leu

Glu

Ala

Ser

C-iy

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

355

360

365

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)

DRUH MOLEKULY: cDNA ·♦·· ··

(ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: zvláštní znak (B) POZICE: 4 (D) JINÁ INFORMACE: Met je ATG (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 16:

CATATGGACA	AAACTCACAC	ATGCCCACCG	TGCCCAGCTC	CGGAACTCGA	AGGTGGTCCG
TCAGTCTTCC	TCTTCCCCCC	AAAACCCAAG	GACACCCTCA	TGATCTCCCG	GACCCCTGAG
GTCACATGCG	TGGTGGTGGA	CGTGAGCCAC	GAAGACCCTG	AGGTCAAGTT	CAACTGGTAC
GTGGACGGCG	TGGAGGTGCA	TAATGCCAAG	ACAAAGCCGC	GGGAGGAGCA	GTACAACAGC
ACGTACCGTG	TGGTCAGCGT	CCTCACCGTC	CTGCACCAGG	ACTGGCTGAA	TGGCAAAGCT
TACGCATGCG	CGGTCTCCAA	CAAAGCCCTC	CCAGCCCCCA	TCGAGAAAAC	CATCTCCAAA
GCCAAAGGGC	AGCCCCGAGA	ACCACAGGTG	TACACCCTGC	CCCCATCCCG	GGATGAGCTG
ACCAAGAACC	AGGTCAGCCT	GACCTGCCTG	GTCAAAGGCT	TCTATCCCAG	CGACATCGCC
GTGGAGTGGG	AGAGCAATGG	GCAGCCGGAG	AACAACTACA	AGACCACGCC	TCCCGTGCTG
GACTCCGACG	GCTCCTTCTT	CCTCTACAGC	AAGCTCACCG	TGGACAAGAG	CAGGTGGCAG
CAGGGGAACG	TCTTCTCATG	CTCCGTGATG	CATGAGGCTC	TGCACAACCA	CTACACGCAG
AAGAGCCTCT	CCCTGTCTCC	GGGTAAAGTA	CCGATCCAGA	AAGTTCAGGA	CGACACCAAA
ACCTTAATTA	AAACGATCGT	TACGCGTATC	AACGACATCA	GTCACACCCA	GTCGGTGAGC
TCTAAACAGA	AAGTTACAGG	CCTGGACTTC	ATCCCGGGTC	TGCACCCGAT	CCTGACCTTG
TCCAAAATGG	ACCAGACCCT	GGCTGTATAC	CAGCAGATCT	TAACCTCCAT	GCCGTCCCGT
AACGTTATCC	AGATCTCTAA	CGACCTCGAG	AACCTTCGCG	ACCTGCTGCA	CGTGCTGGCA
TTCTCCAAAT	CCTGCCACCT	GCCATGGGCT	TCAGGTCTTG	AGACTCTGGA	CTCTCTGGGC
GGGGTCCTGG	AAGCATCCGG	TTACAGCACC	GAAGTTGTTG	CTCTGTCCCG	TCTGCAGGGT
TCCCTTCAGG	ACATGCTTTG	GCAGCTGGAC	CTGTCTCCGG	GTTGTTAATG	GATCC

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1135 • · · · .

»· ·♦»· ·* ·· » » ♦ · • · · » • · · · • · · · »« ♦♦ (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 1135 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 17:

GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACGGGTGGC ACGGGTCGAG GCCTTGAGCT TCCACCAGGC 60

AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 120

CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 180

CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 240

TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTTCGA 300

ATGCGTACGC GCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 360

CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC 420

TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 480

CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 540

CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCC- TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 600

GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTC-CGTC 660

TTCTCC-GAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT 720

TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 780

AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 840

AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 900

TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 960

AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA ÁGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020

CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080

AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG

1135 (2) ÚDAJE K SEKVENCI ID NO: 18 *♦·· ♦ fcfc » • fcfc ♦ ·· fcfc • fc ·· • · · · • · · t • · · ·

9 9 9

99

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 374 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix)

ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: protein (B) POZICE: 1 (D) JINÁ INFORMACE: Met (ATG) začíná v poloze -1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ. ID. NO: 18

Met

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Glu

1

5

10

15

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

20

25

30

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

Gly

Lys

Ala

Tyr

Ala

Cys

Ala

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

ne

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

130

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

155

160

145

150

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 • φ φ · • φφφ

Pro Val

Leu

Asp 180

Ser Asp

Gly Ser

Phe 185

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 190

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

'Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

>·

Met

His

Glu

' Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

«

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Asp

Thr

Lys

Thr

•

225

230

235

240

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

Gin

•

245

250

255

Ser

Val

Ser

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

260

265

270

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

Val

275

280

285

Tyr

Gin

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

Ile

290

295

300

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Val

Leu

Ala

Phe

305

310

315

320

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

Asp

325

330

335

Ser

Leu

Gly

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val

340

345

350

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

Leu

-

355

360

365

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Cys

370

Claims (19)

1. PATENTOVÉ •

   4 4

   NÁROKY

   4 4

   4 4

   4 4 4

   4 4

   4 4

   4 4 4 *4 4

   4 4 4 • 4 4

   1. Protein obecného vzorce R_x-R₂ nebo Ri-L-R₂, kde Ri představuje Fc protein nebo jeho analog; R₂ představuje OB protein nebo jeho analog; a L představuje linker.
2. 2. Protein podle nároku 1, v němž je Fc protein, jeho analog nebo jejich derivát zvolen ze souboru sestávajícího ze (a) Fc sekvence aminokyselin uvedených v SEQ. ID. NO: 9, 12, 15 a 18;

   (b) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), v níž je nahrazena nebo vypuštěna různá aminokyselina v jedné nebo větším počtu následujících poloh (za použití číslování podle SEQ. ID: NO: 9) tak, že:

   (i) jeden nebo větší počet cysteinových zbytků je nahrazen zbytkem alaninu nebo šeřinu;

   (ii) jeden nebo větší počet tyrosinových zbytků je nahrazen zbytkem fenylalaninu;

   (iii) aminokyselina v poloze 5 je nahrazena alaninem;

   (iv) aminokyselina v poloze 20 je nahrazena glutamátem;

   (v) aminokyselina v poloze 103 je nahrazena alaninem;

   ·» ··♦· (vi) aminokyselina v poloze 105 je nahrazena alaninem?

   (vii) aminokyselina v poloze 107 je nahrazena alaninem;

   (viii) aminokyselina v poloze 1, 2, 3, 4 nebo 5 je vypuštěna;

   (ix) jeden nebo větší počet zbytků je nahrazen nebo vypuštěn, aby se odstranilo vazebné místo Fc receptoru;

   (x) jeden nebo větší počet zbytků je nahrazen nebo vypuštěn, aby se odstranilo vazebné místo komplementu (Clq); a (xi) kombinace (i) až (x) ;

   (c) aminokyselinové sekvence podle odstavců (a) nebo (b) s methionylovým zbytkem na N-konci;

   (d) Fc protein, jeho analog nebo jejich derivát podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (c) , který obsahuje chemický zbytek připojený ke zbytku proteinu;

   (e) derivát podle odstavce (d), kde chemickým zbytkem je zbytek vodorozpustného polymeru;

   (f) derivát podle odstavce (e), kde zbytkem vodorozpustného polymeru je polyethylenglykol;

   • frfrfr fr • fr • fr fr · frfr ♦ ♦ · frfr • fr· frfr frfr fr • fr · frfr fr • · · frfr (g) derivát podle odstavce (e), kde zbytkem rozpustného polymeru je zbytek polyaminokyseliny; a vodo(h) derivát podle odstavce (e), kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na N-konci zbytku proteinu.
3. 3. Protein podle nároku 1, v němž je OB protein, jeho analog nebo jejich derivát zvolen ze souboru sestávajícího z (a) sekvence aminokyselin 1 až 146 uvedené v SEQ. ID. NO: 3 nebo SEQ. ID. NO: 6;

   (b) sekvence aminokyselin 1 až 146 uvedené v SEQ. ID: NO: 6 s lysinovým zbytkem v poloze 35 a isoleucinovým zbytkem v poloze 74;

   (c) aminokyselinové sekvence podle odstavce (b) s různou aminokyselinou nahrazenou v jedné nebo větším počtu následujících poloh (číslováno podle SEQ. ID. NO: 6):
4. 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 a 145;

   (d) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b) nebo (c), v níž popřípadě chybí glutaminylový zbytek v poloze 28;

   (e) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b), (c) nebo (d) s methionylovým zbytkem na N-konci;

   (f) zkráceného analogu OB proteinu zvoleného ze souboru sestávajícího z (počítáno podle SEQ. ID. NO: 6 se zbytkem lysinu v poloze 35 a zbytkem isoleucinu v poloze 74):

   ·»»· • 9 4·4· ·· 9 4 « 9 » ♦ 9 9 <

   • 9 4 ··· 44 • 4 49

   9 9 · ·· 4 • · 9 ·· 9 (i) (ii) (iii) (iv) (V) (vi) aminokyselin 98 až 146 aminokyselin 1 až 32 aminokyselin 40 až 116 aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 s jednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěným mezi aminokyseliny 99 a 112; a zkráceného OB analogu podle odstavce (f) (i), v němž je jedna nebo větší počet aminokyselin 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen (vii) (viii) (ix) jinou aminokyselinou;

   zkráceného analogu podle odstavce (f) (ii), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8 a 32 nahrazen jinou aminokyselinou;

   zkráceného analogu podle odstavce (f) (iii), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 a 112 nahrazen jinou aminokyselinou;

   zkráceného analogu podle odstavce (f) (iv) , v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,

   112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

   zkráceného analogu podle odstavce (f) (v) , v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,

   4444 • 4 ···· • 4 4 *44 •4 ·· • 4 4 4 • 4 4 4 • · · 4 • 4 4 ·

   44 ··

   100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen j inou aminokys e1inou; (xi) zkráceného analogu podle kteréhokoliv z odstavců (f) (i) až (x) s N-terminálním

   methionylovým zbytkem;

   (g) derivátu OB proteinu nebo jeho analogu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (f), který obsahuje chemický zbytek připojený k proteinovému zbytku;

   (h) derivátu podle odstavce (g), v němž je chemickým zbytkem zbytek vodorozpustného polymeru;

   (i) derivátu podle odstavce (h), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyethylenglykolů;

   (j) derivát podle odstavce (h), v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyaminokyseliny; a (k) derivát podle odstavce (h), kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na N-konci proteinového zbytku.

   4. Protein podle nároku 1, v němž je sekvence linkeru tvořena jednou nebo větším počtem aminokyselin zvolených ze souboru sestávajícího z glycinu, asparaginu, šeřinu, threoninu a alaninu.
5. 5. Protein podle nároku 1, v němž je linker zvolen ze souboru sestávajícího z

   (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; (d) giy, gly;

   fl··· ···· • t ·· ·· • · ·♦· «

   fl fl flfl r· • · • · · • · ·· «· • · « · • · • fl flfl

   (e) giy. giy/ gly; (f) gly. giy/ gly. giy. giy; (g) gly. giy/ gly, giy. giy, giy, gly; (h) gly-pro-gly; (i) giy/ gly/ pro, giy. gly;

   (j) chemického zbytku; a (k) kterékoliv kombinace (a) až (j).
6. 6. Fúzní protein obsahující Fc protein, jeho analog nebo jejich derivát fúzovaný k N-konci OB proteinu, jeho analogu nebo jejich derivátu.
7. 7. Sekvence nukleové kyseliny kódující protein obecného vzorce Ri-R₂ nebo Ri-L-R₂, kde Ri představuje Fc protein nebo jeho analog; R₂ představuje OB protein nebo jeho analog; a L představuje linker.
8. 8. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7 kódující protein s oblastí Fc proteinu nebo jeho analogu nebo jejich derivátu zvolenou ze souboru sestávajícího z:

   (a) Fc sekvence aminokyselin uvedených v SEQ. ID. NO: 9, 12, 15 a 18;

   (b) aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), v níž je nahrazena nebo vypuštěna různá aminokyselina v jedné nebo větším počtu následujících poloh (za použití číslování podle SEQ. ID: NO: 9) tak, že:

   (i) jeden nebo větší počet cysteinových zbytků je nahrazen zbytkem alaninu nebo šeřinu;

   ···· ·· flfl·· • » · • · · • fl · • · · ·· · • flfl ·· flfl fl · «· • · · • · fl flfl · • fl · ·· (ii) jeden nebo větší počet tyrosinových zbytků je nahrazen zbytkem fenylalaninu;

   (iii) aminokyselina v poloze 5 je nahrazena alaninem;

   (iv) aminokyselina v poloze 20 je nahrazena glutamátem;

   (v) aminokyselina v poloze 103 je nahrazena alaninem;

   (vi) aminokyselina v poloze 105 je nahrazena alaninem;

   (vii) aminokyselina v poloze 107 je nahrazena alaninem;

   (viii) aminokyselina v poloze 1, 2, 3, 4 nebo 5 je vypuštěna;

   (ix) jeden nebo větší počet zbytků je nahrazen nebo vypuštěn, aby se odstranilo vazebné místo Fc receptorú;

   (x) jeden nebo větší počet zbytků je nahrazen nebo vypuštěn, aby se odstranilo vazebné místo komplementu (Clq); a (xi) kombinace (i) až (x);

   (c) aminokyselinové sekvence podle odstavců (a) nebo (b) s methionylovým zbytkem na N-konci;

   (d) Fc protein, jeho analog nebo jejich derivát podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (c), který obsahuje chemický zbytek připojený kě zbytku proteinu;

   (e) derivát podle odstavce (d) , kde chemickým zbytkem je zbytek vodorozpustného polymeru;

   (f) derivát podle odstavce (e), kde zbytkem vodorozpustného polymeru je polyethylenglykol;

   (g) derivát podle odstavce (e), kde zbytkem vodorozpustného polymeru je zbytek polyaminokyseliny; a (h) derivát podle odstavce (e), kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na N-konci zbytku proteinu.
9. 9. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7 kódující protein s oblastí OB proteinu nebo jeho analogu nebo jejich derivátu zvolenou ze souboru sestávajícího z:

   (a) sekvence aminokyselin 1 až 146 uvedené v SEQ. ID. NO: 3 nebo SEQ. ID. NO: 6;

   (b) sekvence aminokyselin 1 až 146 uvedené v SEQ. ID: NO: 6 s lysinovým zbytkem v poloze 35 a isoleucinovým zbytkem v poloze 74;

   (c) aminokyselinové sekvence podle odstavce (b) s různou aminokyselinou nahrazenou v jedné nebo větším počtu následujících poloh (číslováno podle SEQ. ID. NO: 6):

   4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, ··· · ·* ···· ·· ·· • · · · · · · · · · • · ··· ···· • · · ··· ···· ·· ··· ·· · ·· ·· (d) (e) (f)

   74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 a 145;

   aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b) nebo (c), v níž popřípadě chybí glutaminylový zbytek v poloze 28;

   aminokyselinové sekvence podle odstavce (a), (b), (c) nebo (d) s methionylovým zbytkem na N-konci; zkráceného analogu OB proteinu zvoleného ze souboru sestávajícího z (počítáno podle SEQ. ID. NO: 6 se zbytkem lysinu v poloze 35 a zbytkem isoleucinu v poloze 74) :

   (i) aminokyselin 98 až 146 (ii) aminokyselin 1 až 32 (iii) aminokyselin 40 až 116 (iv) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 (v) aminokyselin 1 až 99 a 112 až 146 s jednou nebo větším počtem aminokyselin 100 až 111 umístěným mezi aminokyseliny 99 a 112; a (vi) zkráceného OB analogu podle odstavce (f) (i), v němž je jedna nebo větší počet aminokyselin 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

   (vii) zkráceného analogu podle odstavce (f) (ii), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8 a 32 nahrazen jinou aminokyselinou;

   (viii) zkráceného analogu podle odstavce (f) (iii), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68,

   71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106,

   107, 108, 111 a 112 nahrazen jinou aminokyselinou;

   (ix) zkráceného analogu podle odstavce (f) (iv), v němž je jedna nebo větší počet z ami-

   nokyselin 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen

   jinou aminokyselinou;

   (x) zkráceného analogu podle odstavce (f) (v), v němž je jedna nebo větší počet z aminokyselin 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97,

   100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112,

   118, 136, 138, 142 a 145 nahrazen jinou aminokyselinou;

   (xi) zkráceného analogu podle kteréhokoliv z odstavců (f) (i) až (x) s N-terminálním methionylovým zbytkem;

   (g) derivátu OB proteinu nebo jeho analogu podle kteréhokoliv z odstavců (a) až (f), který obsahuje chemický zbytek připojený k proteinovému zbytku;

   (h) derivátu podle odstavce (g) , v němž je chemickým zbytkem zbytek vodorozpustného polymeru;

   (i) derivátu podle odstavce (h) , v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyethylenglykolu;

   (j) derivát podle odstavce (h) , v němž je zbytkem vodorozpustného polymeru zbytek polyaminokyseliny; a (k) derivát podle odstavce (h), kde je zbytek vodorozpustného polymeru připojen pouze na N-konci proteinového zbytku.

   • · · · tt · · · · ·· · · • * · · « · · • · · · · · · • · · ··· · · · · • · · · · ·· · ·· ··
10. 10. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7 kódující protein, v němž je sekvence linkeru tvořena jednou nebo větším počtem aminokyselin zvolených ze souboru sestávajícího z Gly, Asn, Ser, Thr a Ala.
11. 11. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 7 kódující protein, v němž je sekvence linkeru tvořena jednou nebo větším počtem aminokyselin zvolených ze souboru sestávajícího z

    (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; (d) gly. gly; (e) giy/ gly. gly; (f) giy/ giy/ giy/ gly. gly; (g) gly. gly. giy/ gly. gly, gly, gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly. giy/ pro, giy/ giy;

    (j) chemického zbytku; a (k) kterékoliv kombinace (a) až (j).
12. 12. Sekvence nukleové kyseliny kódující fúzni protein obsahující Fc protein, jeho analog nebo jejich derivát fúzovaný k N-konci OB proteinu, jeho analogu nebo jejich derivátu.
13. 13. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 7 nebo 12.

    • · · ·
14. 14. Vektor podle nároku 13, kterýmžto vektorem je pAMG21 land sekvence nukleové kyseliny podle nároků 7 nebo 12 .
15. 15. Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 13.
16. 16. Způsob produkce proteinu podle nároku 1 nebo 6, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň kultivace hostitelské buňky podle nároku 15 za vhodných podmínek a stupeň izolace vyrobeného proteinu.
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se t í m , že dále zahrnuje stupeň purifikaee vyrobeného proteinu.
18. 18. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje účinné množství proteinu podle nároku 1 nebo 6 ve farmaceuticky vhodném ředidle, adjuvantu nebo nosiči.
19. 19. Způsob léčení poruchy zvolené ze souboru sestávajícího z nadměrné tělesné hmotnosti, diabetes, vysokého hladiny lipidů v krvi, arteriosklerosy a arteriálního plátu, způsob redukce nebo prevence vzniku žlučových kamenů a způsob léčení poruchy zvolené ze souboru sestávajícího z nedostatečnosti tkáně tvořené v podstatě svalovinou neobsahující tuk, nedostatečné citlivosti k inzulínu a mrtvice, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství proteinu podle nároku 1 nebo 6.