CN101296942A - 具有可选择特性的杂合多肽 - Google Patents

Abstract

一般地讲，本发明涉及用于治疗和预防代谢疾病和障碍的新型可选择杂合多肽，其中所述代谢疾病和障碍可通过控制血浆葡萄糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌来减轻，例如为糖尿病和糖尿病相关状况。这样的状况和障碍包括但不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、摄食障碍、胰岛素抵抗、肥胖和任何种类的糖尿病，包括1型、2型和妊娠期糖尿病。

Description

具有可选择特性的杂合多肽

相关申请

[0001]本申请要求2005年8月11日提交的共同拥有的美国临时申请11/201,664和2005年8月17日提交的USSN 11/206,903(这两者的名称都是“具有可选择特性的杂合多肽”)以及2005年12月12日提交的USSN 11/301,744的优先权，在此通过引用整体结合到本文中。

发明领域

[0002]本发明涉及肽化学，更具体地说涉及具有可选择特性的杂合多肽。

发明背景

[0003]许多代谢疾病和障碍的核心是胰岛素水平和血糖水平的调节。胰岛素分泌部分受肠内分泌细胞产生的、称为肠降血糖素的促分泌素激素调节。肠降血糖素激素胰高血糖素样肽-1(“GLP-1”)是肠细胞分泌的肽激素，其已在多个研究中显示出产生增强胰岛素分泌的作用。GLP-1由胰高血糖素原在消化道中加工而来，增强营养物诱导的胰岛素释放(Krcymann B等，Lancet，2：1300-1303(1987))。已知各种截短形式的GLP-1刺激胰岛素分泌(促胰岛素作用)和cAMP形成[参见例如Mojsov，S.，Int.J.Pep.Pro.Res.，40：333-343(1992)]。业已确立了各种体外实验室实验和哺乳动物(尤其是人)对外源施用GLP-1、GLP-1(7-36)酰胺(SEQ IDNO：61)和GLP-1(7-37)酸(SEQ ID NO：204)的促胰岛素反应之间的关系(参见例如Nauck，M.A.等，Diabetologia，36：741-744(1993)；Gutniak，M.等，New Eng.J.of Med.，326(20)：1316-1322(1992)；Nauck，M.A.等，J.Clin.Invest.，91：301-307(1993)；和Thorens，B.等，Diabetes，42：1219-1225(1993))。

[0004]GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：61)通过在生理浓度刺激胰岛素敏感性和增强葡萄糖诱导的胰岛素释放，在胰岛素依赖性糖尿病患者中发挥着显著的抗糖尿病发生作用(Gutniak M.等，New Eng J.Med.，326：1316-1322(1992))。当施用非胰岛素依赖性糖尿病患者GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：61)时，其刺激胰岛素释放、降低胰高血糖素分泌、抑制胃排空和增强葡萄糖利用(Nauck，1993；Gutniak，1992；Nauck，1993)。但是，GLP-1型分子用于长效治疗糖尿病已复杂化，因为这种肽的血清半衰期相当短。

[0005]更具体地说，GLP-1是一种源自胰高血糖素原(160个氨基酸的激素原)的30个氨基酸的肽。在胰腺和肠中的不同激素原转化酶作用导致产生胰高血糖素和其它不明肽，而胰高血糖素原切割导致产生GLP-1和GLP-2以及两种其它肽。GLP-1氨基酸序列在迄今为止研究的所有哺乳动物中都100％同源，意味其关键生理作用。GLP-1(7-37)酸被C-末端截短和酰胺化，形成GLP-1(7-36)NH₂(SEQ ID NO：61)。游离酸GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：204)和酰胺GLP-1(7-36)NH₂(SEQ ID NO：61)的生物学作用和代谢更新难以区分。依照惯例，氨基酸编号基于从胰高血糖素原加工得到的GLP-1(1-37)OH(SEQ ID NO：59)。生物学活性GLP-1是GLP-1(7-36)NH₂(SEQ ID NO：61)进一步加工的结果。因此，GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：204)或GLP-1(7-36)NH₂(SEQ ID NO：61)的第一个氨基酸是⁷His。

[0006]在胃肠道中，GLP-1由肠、结肠和直肠粘膜的L细胞在腔内葡萄糖刺激作用下产生。活性GLP-1的血浆半衰期＜5分钟，其代谢清除率在12-13分钟左右(Holst，Gastroenterology 107(6)：1848-55(1994))。参与GLP-1代谢的主要蛋白酶是二肽基肽酶(DPP)IV(CD26)，其切割N-末端His-Ala二肽，因此产生代谢物GLP-1(9-37)OH(SEQ ID NO：205)或GLP-1(9-36)NH₂(SEQ ID NO：206)，这些代谢物被以不同的名称描述为GLP-1受体的失活、弱激动剂或拮抗剂。GLP-1受体(GLP-1R)是463个氨基酸的G蛋白偶联受体，位于胰腺β细胞中、肺中，以及较低程度地位于脑、脂肪组织和肾脏中。以GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：204)或GLP-1(7-36)NH₂(SEQ ID NO：61)刺激GLP-1R导致腺苷酸环化酶活化、cAMP合成、膜去极化、胞内钙升高和葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加(Holz等，J.Biol.Chem.270(30)：17749-57(1995))。

[0007]GLP-1是反应于食物摄取作用由肠粘膜分泌的有效胰岛素促分泌素。GLP-1R敲除小鼠为葡萄糖不耐受的事实着重说明了GLP-1的意义重大的肠降血糖素作用。静脉输注GLP-1的肠降血糖素反应在糖尿病受试者中得以保持，尽管在这些患者中对口服葡萄糖没有肠降血糖素反应。通过输注或皮下注射施用GLP-1控制糖尿病患者的禁食葡萄糖水平，并保持胰岛素分泌的葡萄糖域值(Gutniak等，N.Engl.J.Med.326：1316-22(1992)；Nauck等，Diabet.Med.13：(9Suppl 5)：S39-S43(1996)；Nauck等，J.Clin.Endocrinol.Metab.76：912-917(1993))。GLP-1已显示出作为治疗剂的极大潜力，其能够以生理方式增强胰岛素分泌，同时避免磺酰脲药物相关的低血糖。

[0008]GLP-1对葡萄糖稳态的其它重要作用是抑制胰高血糖素分泌和抑制胃动力。GLP-1对胰腺α细胞分泌胰高血糖素的抑制作用通过降低糖原异生和糖原分解，导致肝脏葡萄糖产量下降。GLP-1的这种抗胰高血糖素作用在糖尿病患者中被保持。

[0009]利用迷走神经传出受体或通过直接作用于肠平滑肌，实现其中胃动力和胃分泌被抑制的所谓GLP-1回肠制动作用。GLP-1降低胃酸分泌有助于营养物利用度的迟滞期，因此避免了对快速胰岛素响应的需要。总之，GLP-1的胃肠作用明显有助于延迟葡萄糖和脂肪酸吸收，并调节胰岛素分泌和葡萄糖稳态。

[0010]还已经表明，GLP-1诱导β细胞特异性基因，例如GLUT-1转运蛋白、胰岛素(利用PDX-1与胰岛素基因启动子的相互作用)和己糖激酶-1。因此，据啮齿动物实验证实，GLP-1可潜在地逆转一般与衰老相关的葡萄糖不耐受。另外，GLP-1除了在β细胞机能不全之际恢复β细胞功能之外，还可能有助于β细胞再生和增加β细胞量。

[0011]GLP-1的中枢作用包括增加饱感，并伴有利用下丘脑GLP-1R作用实现的食物摄取下降。在II型糖尿病受试者中48小时持续皮下灌输GLP-1降低了饥饿感和食物摄取，增加了饱感。这些食欲减退作用在GLP-1R敲除小鼠中不存在。

[0012]毒蜥外泌肽是另一个涉及胰岛素分泌的肽家族。毒蜥外泌肽存在于希拉毒蜥(Gila-monster)(亚利桑那州的一种内生蜥蜴)和墨西哥串珠蜥(Mexican Beaded Lizard)的唾液中。毒蜥外泌肽-3存在于墨西哥串珠蜥(Heloderma horridum)唾液中，毒蜥外泌肽-4存在于希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中(Eng，J.等，J Biol.Chem.，265：20259-62，1990；Eng.，J.等，J.Biol.Chem.，267：7402-05(1992))。毒蜥外泌肽与胰高血糖素样肽家族的几个成员具有某些序列相似性，与GLP-1具有53％的最高同源性(Goke等.，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993))。

[0013]毒蜥外泌肽-4结合胰岛素分泌性TC1细胞上、豚鼠胰腺的分散性腺泡细胞处和胃壁细胞处的GLP-1受体；该肽还在离体胃中刺激促生长素抑制素释放和抑制胃泌素释放(Goke等，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993)；Schepp等，Eur.J.Pharmacol.，69：183-91(1994)；Eissele等，Life Sci.，55：629-34(1994))。已发现毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4结合胰腺腺泡细胞上的GLP-1受体、刺激胰腺腺泡细胞中的cAMP产生和胰腺腺泡细胞的淀粉酶释放(Malhotra，R等，RelulatoryPeptides，41：149-56(1992)；Raufman等.，J.Biol.Chem.，267：21432-37(1992)；Singh等.，Regul.Pept.，53：47-59(1994))。业已计划使用毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的促胰岛素活性治疗糖尿病和预防高血糖症(Eng，美国专利第5,424,286号)。

[0014]业已报导截短的毒蜥外泌肽(例如羧基酰胺化分子毒蜥外泌肽[9-39]和9-39到3-39的片段)为GLP-1的有效的选择性拮抗剂(Goke等，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993)；Raufman，J.P.等，J.Biol.Chem.，266：2897-902(1991)；Schepp，W.等，Eur.J.Pharm.，269：183-91(1994)；Montrose-Rafizadeh等，Diabetes，45(附录2)：152A(1996))。毒蜥外泌肽[9-39](SEQ ID NO：207)在体内阻断内源GLP-1，导致降低胰岛素分泌(Wang等，J.Clin.Invest.，95：417-21(1995)；D′Alessio等，J.Clin.Invest.，97：133-38(1996))。已由大鼠胰腺胰岛细胞克隆了显然负责GLP-1的促胰岛素作用的受体(Thorens，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8641-8645(1992))。毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽[9-39]结合克隆的GLP-1受体(大鼠胰腺细胞GLP-1受体：Fehmann HC等，Peptides，15(3)：453-6(1994)；人GLP-1受体：Thorens B等，Diabetes，42(11)：1678-82(1993))。在用克隆的GLP-1受体转染的细胞中，毒蜥外泌肽-4是激动剂，即其增加cAMP，而毒蜥外泌肽[9-39](SEQ ID NO：207)是拮抗剂，即其封闭毒蜥外泌肽-4和GLP-1的刺激作用。出处同上。

[0015]更具体地说，毒蜥外泌肽-4是发现于希拉毒蜥(Helodermasuspectum)唾液中的39个氨基酸的C-末端酰胺化肽，与GLP-1肽序列的氨基酸序列同源性为53％。参见例如Eng，J.等，“Isolation andCharacterization of exendin-4，and  毒蜥外泌肽-3Analogue fromHeloderma suspectum Venom，”J.Bio.Chem.，267：11，7402-7405页(1992)，Young，A.A.等，“Glucose-Lowering and Insulin-Sensitizing Actions ofexendin-4，”Diabetes，48卷，1026-1034页，1999年5月。按照其活性，毒蜥外泌肽-4是GLP-1受体的高度特异性激动剂，同GLP-1一样，其能够刺激胰岛素分泌。因此，同GLP-1一样，毒蜥外泌肽-4被看作是促胰岛素肽。

[0016]但是，与GLP-1不同，毒蜥外泌肽-4在人中具有相对较长的半衰期，因为其抵抗在体内快速降解GLP-1序列的二肽基肽酶IV。而且，已经表明，和GLP-1相比，毒蜥外泌肽-4具有较强的刺激胰岛素分泌的能力，可使用较低浓度的毒蜥外泌肽-4来获得这样的刺激活性。参见例如美国专利第5,424,286号，该专利通过引用结合到本文中。因此，对于治疗涉及胰岛素水平失调的状况(例如糖尿病之类的状况)，毒蜥外泌肽-4肽或其衍生物(例如，参见例如美国专利第6,528,486号(该专利通过引用结合到本文中)及其对应的国际申请WO 01/04156描述的那些衍生物)具有比胰岛素或GLP-1高的潜在有用性。

[0017]涉及代谢疾病和障碍的另一个肽激素家族是肽激素的胰淀素(amylin)家族，包括胰淀素、降钙素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素和垂体中间叶激素(也称为“AFP-6”)。胰淀素是一种37个氨基酸的蛋白激素。其被分离、纯化，并化学表征为人2型糖尿病胰腺胰岛中淀粉样沉积物的主要组分(Cooper等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84：8628-8632(1987))。胰淀素分子具有两种翻译后修饰：C-末端酰胺化，以及2位和7位的半胱氨酸交联形成N-末端环。人胰淀素基因可读框序列表明，在N-末端Lys密码子之前存在Lys-Arg双碱性氨基酸蛋白水解切割信号，以及在CLAIMS末端位处的Lys-Arg蛋白水解信号之前存在Gly，这是蛋白酰胺化酶PAM酰胺化的典型序列(Cooper等，Biochem.Biophys.Acta，1014：247-258(1989))。

[0018]一般认为，胰淀素调节胃排空，抑制胰高血糖素分泌和食物摄取，因此调节循环中的葡萄糖生成速率。其似乎补充胰岛素作用，胰岛素调节循环中的葡萄糖清除速率及外周组织对葡萄糖的吸收。这些作用得到在啮齿动物和人中的实验结果的支持，实验结果表明胰淀素以至少三种独立机制补充胰岛素在餐后葡萄糖控制中的作用，所有这些作用都影响葡萄糖生成速率。首先，胰淀素抑制餐后胰高血糖素分泌。和健康成人相比，1型糖尿病患者不具有循环胰淀素，2型糖尿病患者餐后胰淀素浓度降低。而且，输注结合循环胰淀素的胰淀素特异性单克隆抗体又导致胰高血糖素浓度相对于对照极大提升。这两个结果都指出了内源胰淀素在餐后胰高血糖素分泌调节中的生理作用。其次，胰淀素减慢胃肠动力和胃排空。最后，下丘脑内注射大鼠胰淀素显示出降低大鼠取食，改变下丘脑中的神经递质代谢。在某些研究中，在下丘脑内注射大鼠胰淀素和大鼠CGRP后，在长达8小时内，食物摄取显著降低。在人体实验中，胰淀素类似物普兰林肽已表现出减轻体重或体重的增加。胰淀素可能有益于治疗代谢状况，例如糖尿病和肥胖。胰淀素还可用于治疗疼痛、骨疾病、胃炎，用于调节脂质(具体地说是甘油三酯)，或用于影响身体组成，例如脂肪优先减少和节余瘦组织。

[0019]激素降钙素(CT)因其在诱导的高血钙下分泌及其快速的降低血钙作用而得名。其在以前已命名为C细胞的甲状腺神经内分泌细胞中产生，并由该细胞分泌。研究得最多的CT(1-32)(SEQ ID NO：48)作用是其对破骨细胞的作用。CT的体外作用包括皱褶缘快速消失和溶菌酶释放下降。最后，CT对破骨细胞功能的抑制导致骨再吸收下降。但是，甲状腺切除术情况下的血清CT慢性减少和髓质性甲状腺癌中存在的血清CT增加，看起来均与血钙或骨质的变化无关。因此，最有可能的是，CT(1-32)(SEQ ID NO：48)的主要功能是在紧急情况下对抗急性血钙过多和/或在“钙应激”期(例如生长期、妊娠期和哺乳期)保护骨骼。(综述于Becker，JCEM，89(4)：1512-1525(2004)和Sexton，Current MedicinalChemistry 6：1067-1093(1999))。与此相一致的是近期由同时去除了降钙素和CGRP-I肽的降钙素基因敲除小鼠获得的数据，数据揭示小鼠具有正常水平的基础钙相关值，但血钙反应增加(Kurihara H等，Hypertens Res.2003年2月；26附录：S105-8)。CT对血浆钙水平有作用，抑制破骨细胞功能，广泛用于治疗骨质疏松。从治疗上讲，鲑鱼CT(sCT)似乎增加骨密度，降低骨折率，副作用最小。在过去的25年中，CT还已成功地用于治疗骨佩吉特病，骨佩吉特病是一种慢性骨骼疾病，可导致一个或多个骨骼区域中的骨变大或变形。CT还由于其对在骨质疏松过程中经历的骨痛的止痛作用而被广泛使用，尽管还不清楚了解这种作用的机制。

[0020]降钙素基因相关肽(CGRP)是一种其受体广泛分布于体内(包括神经系统和心血管系统)的神经肽。这种肽似乎调节感觉神经递质，是迄今为止发现的最有效的内源性血管舒张肽之一。已报道的CGRP生物学作用包括：调节炎症中P物质、调节神经肌肉接头处的烟碱受体活性、刺激胰酶分泌、减少胃酸分泌、外围血管舒张、心跳加速、神经调节、调节钙代谢、调节成骨刺激、调节胰岛素分泌、增加体温和降低食物摄取。(Wimalawansa，Amylin，calcitonin gene-related peptide，calcitoninand ADM：a peptide superfamily.Crit Rev Neurobiol.1997；11(2-3)：167-239)。CGRP的一个重要作用是利用其有效的血管舒张作用控制血液流向各个器官，以静脉施用α-CGRP后平均动脉压下降为证。血管舒张作用还得到纯合CGRP敲除小鼠新近分析的支持，该分析表明增加周围交感活性引起外周血管阻力提高和高血压(Kurihara H等，Targeteddisruption of ADM andαCGRP genes reveals their distinct biological roles.Hypertens Res.2003年2月；26附录：S105-8)。因此，除了其它作用以外，CGRP似乎还激发血管舒张作用、降血压作用和增加心率。

[0021]对充血性心力衰竭患者持续输注CGRP已表现出对血液动力学功能的持续有益作用，没有副作用，提示CGRP可用于心力衰竭。CGRP应用的其它适应症包括肾衰竭、急性和慢性冠状动脉缺血、治疗心率失常、其它外周血管疾病，例如雷诺现象、蛛网膜下腔出血、高血压和肺动脉高压。还潜在地可治疗妊娠和早产的子痫前毒血症。(Wimalawansa，1997)。近期的治疗应用包括使用CGRP拮抗剂治疗偏头痛。

[0022]肾上腺髓质素(ADM)几乎遍在表达，含该肽的组织比不含该肽的组织多得多。ADM的公开综述(Hinson，J.P.等，Endocrine Reviews(2000)21(2)：138-167)详述了其对心血管系统、细胞生长、中枢神经系统和内分泌系统的作用，生物学作用的范围包括血管舒张、细胞生长、调节激素分泌和尿钠排泄。在大鼠、猫、绵羊和人中的研究证实，静脉输注ADM产生有效和持续的低血压，和CGRP的作用相当。但是，ADM在麻醉大鼠中对平均动脉压的降血压作用未受到CGRP拮抗剂CGRP_8-37的抑制，这提示该作用不经CGRP受体介导。在麻醉、清醒或高血压大鼠中急性或慢性施用人ADM导致总外周阻力显著降低，并伴有血压下降，同时伴有心律、心输出量和每搏输出量升高。

[0023]ADM还被提议作为胚胎发生和分化的重要因子以及作为大鼠内皮细胞的凋亡存活因子。这得到最近的小鼠ADM敲除研究的支持，其中ADM基因缺失的纯合型小鼠在胚胎发生过程中表现出缺陷性血管形成，因此在妊娠中期死亡。有报道指ADM+/-杂合型小鼠具有高血压以及对组织损伤敏感(Kurihara H等，Hypertens Res.2003年2月；26附录：S105-8)。

[0024]ADM影响诸如垂体、肾上腺、生殖器官和胰脏之类的内分泌器官。该肽似乎具有抑制垂体释放ACTH的作用。在肾上腺中，该肽似乎影响大鼠和人二者中的肾上腺皮质分泌活性，增加肾上腺血流，在完整大鼠的肾上腺血管床中起血管舒张剂的作用。业已表明，ADM存在于整个雌性生殖道中，血浆水平在正常妊娠期中升高。在先兆子痫大鼠模型中的研究表明，在晚期妊娠过程中施用大鼠时，ADM可逆转高血压，降低幼畜死亡率。因为ADM在先兆子痫模型的早期妊娠动物或未妊娠大鼠中不具有相似的作用，所以这提示ADM可能在子宫-胎盘心血管系统中起重要调节作用。在胰腺中，ADM最有可能起抑制作用，因为其减弱和延迟了对口服葡萄糖的胰岛素应答，导致首先升高葡萄糖水平。ADM还可影响肾脏功能。外周大剂量施用可显著降低平均动脉压，提升肾脏血流、肾小球滤过率和尿流。在某些情况下，Na+排泄也增加。

[0025]ADM还对骨和肺具有其它外部影响。对于骨，研究支持在心血管系统和体液稳态之外的作用，表明AMD作用于幼年和成年啮齿动物成骨细胞，以将细胞生长增加至和已知成骨细胞生长因子(例如转化生长因子-β)的作用相当的程度。这在临床上很重要，因为在骨质疏松研究中的一个重要挑战是开发一种利用成骨细胞刺激增加骨质的疗法。在肺中，ADM不仅引起肺部血管舒张，而且抑制组胺或乙酰胆碱诱导的支气管收缩。最近在大鼠模型中使用雾化ADM治疗肺高血压的研究表明，吸入治疗这种状况是有效的，由以下事实为证：用ADM治疗的大鼠中平均肺动脉压和总肺阻力比施用盐水的大鼠显著下降。此结果在没有改变全身动脉压或心律的情况下获得(Nagaya N等，Am J PhysiolHeart Circ Physiol.2003；285：H2125-31)。

[0026]业已表明，在健康志愿者中，静脉输注ADM降低动脉压和刺激心律、心输出量，刺激cAMP、促乳素、去甲肾上腺素和凝乳酶的血浆水平。在这些患者中，观察到尿量或钠排泄几乎没有或没有增加。在心力衰竭或慢性肾衰竭患者中，静脉输注ADM的作用与在正常受试者中观察到的作用相似，还根据施用剂量诱发多尿和尿钠排泄(Nicholls，MG等，Peptides.2001；22：1745-1752)。还已经表明，实验性ADM治疗对动脉和肺高血压、脓毒性休克和缺血/再灌注损伤有益(Beltowski J.，Pol J Pharmacol.2004；56：5-27)。ADM治疗的其它适应症包括：外周血管病、蛛网膜下腔出血、高血压、妊娠和早产的子痫前毒血症和骨质疏松。

[0027]AFP-6(即垂体中间叶激素)主要在垂体和胃肠道中表达。还没有报道AFP-6的特异性受体；但结合研究指出，AFP-6结合胰淀素家族所有已知的受体。已经表明，AFP-6在表达内源CGRP受体的SK-N-MC和L6细胞中增加cAMP产量，并在这些细胞中与标记的CGRP竞争结合其受体。在公开的体内研究中，施用AFP-6最有可能通过与CRLR/RAMP受体相互作用而导致正常和自发性高血压大鼠二者中的血压降低。在小鼠中体内施用导致胃排空和食物摄取受抑制。(Roh等，JBiol Chem.2004年2月，20；279(8)：7264-74)。

[0028]业已报道，一般借助于结合两个密切相关的II型G蛋白偶联受体(GPCR)—降钙素受体(CTR)和降钙素受体样受体(CRLR)，介导胰淀素家族肽激素的生物学作用。克隆和功能研究表明，CGRP、ADM和胰淀素与不同组合的CTR或CRLR和受体活性修饰蛋白(RAMP)相互作用。许多细胞表达多种RAMP。一般认为，RAMP和CTR或CRLR的共表达是产生降钙素、CGRP、ADM和胰淀素的功能受体所必需的。RAMP家族包含3个成员(RAMP-1、-2和-3)，其共有的序列同一性低于30％，但具有共同的拓扑组织。CRLR和RAMP1共表达导致形成CGRP受体。CRLR和RAMP2共表达导致形成ADM受体。CRLR和RAMP3共表达导致形成ADM和CGRP受体。hCTR2和RAMP1共表达导致形成胰淀素和CGRP受体。hCTR2和RAMP3共表达导致形成胰淀素受体。

[0029]再另一个涉及代谢疾病和障碍的肽激素家族是瘦蛋白家族。成熟形式的循环瘦蛋白是一种146个氨基酸的蛋白，一般被血脑屏障(BBB)和血-CSF屏障排斥在CNS之外。参见例如Weigle等，1995.JClin Invest 96：2065-2070。瘦蛋白在调节食物摄取和体重的负反馈回路中是传入信号。瘦蛋白受体是细胞因子受体家族的一员。瘦蛋白的食欲减退作用取决于与该受体的Ob-Rb同种型同二聚体的结合，其中所述受体编码含几个蛋白-蛋白相互作用基序的长胞质内结构域。Ob-Rb在下丘脑中高度表达，这提示该脑区域是瘦蛋白作用的重要部位。业已表明，小鼠ob基因突变引起具有病理生理表现的综合征，其包括：肥胖、身体脂肪沉积增加、高血糖、高胰岛素血症、体温过低，以及雄性和雌性纯合ob/ob肥胖小鼠中的甲状腺和生殖功能均受损(参见例如Ingalis等，1950.J Hered 41：317-318)。瘦蛋白或瘦蛋白受体的治疗用途包括：(i)糖尿病(参见例如PCT专利申请WO 98/55139、WO 98/12224和WO97/02004)；(ii)红细胞生成作用(参见例如PCT专利申请WO 97/27286和WO 98/18486)；(iii)不育(参见例如PCT专利申请WO 97/15322和WO98/36763)；和(iv)肿瘤抑制(参见例如专利申请WO 98/48831)，这些专利申请每个均通过引用整体结合到本文中。

[0030]瘦蛋白受体(OB-R)基因(GenBank登录号AF098792)已被克隆，并基因定位至db基因座(参见例如Tartaglia等，1995.Cell 83：1263-1271)。还已经鉴别了由可变剪接产生的若干OB-R转录物。OB-R缺陷在与ob/ob 小鼠表型相同的突变糖尿病ob/ob小鼠中产生综合征(参见例如Ghilardi等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6231-6235)。但是，与ob/ob小鼠相反，将重组瘦蛋白施用C57BLKS/J-m ob/ob小鼠未导致食物摄取和体重下降(参见例如Roberts和Greengerg，1996.NutritionRev.54：41-49)。

[0031]大部分能够由施用重组瘦蛋白、瘦蛋白片段和/或瘦蛋白受体变体报告体重下降活性的瘦蛋白相关研究都将所述构建体直接施用入脑室中。参见例如Weigle等，1995.J Clin Invest 96：2065-2070；Barash等，1996.Endocrinology 137：3144-3147。

[0032]其它研究显示出显著的体重下降活性，原因是通过腹膜内(i.p.)施用测试者施用瘦蛋白肽。参见Grasso等，1997.Endocrinology 138：1413-1418。此外，业已报道，瘦蛋白片段，最具体地说是含取自全长人瘦蛋白残基的18个氨基酸的片段，起体重下降的作用，但仅在通过植入套管直接施用大鼠侧脑室时。参见例如PCT专利申请WO 97/46585，其通过引用整体结合到本文中。

[0033]另一个涉及代谢疾病和障碍的肽激素是胆囊收缩素(CCK)。据报道，CCK由于其刺激胆囊收缩的能力而在1928年由肠提取物制品中鉴别出来。之后报道了CCK的其它生物学作用，包括刺激胰腺分泌、延迟胃排空、刺激肠活动和刺激胰岛素分泌。参见Lieverse等，Ann.N.Y.Acad.Sci.713：268-272(1994)。据报道，CCK的作用还包括对心血管功能、呼吸功能、神经毒性和癫痫发作、癌细胞增殖、痛觉缺失、睡眠、性和生殖行为、记忆、焦虑和多巴胺介导行为的作用。Crawley和Corwin，Peptides 15：731-755(1994)。其它报道的CCK作用包括刺激胰腺生长、刺激胆囊收缩、抑制胃酸分泌、胰腺多肽释放和肠蠕动收缩组分。另外报道的CCK作用包括血管舒张。Walsh，“GastrointestinalHormones，”载于Physiology of the Gastrointestinal Tract(第3版，1994；Raven Press，New York)。

[0034]业已报导，相比于用单个化合物观察到的抑制，在不缺少食物的大鼠中注射胰高血糖素、CCK和铃蟾肽的组合增强了对炼乳试餐摄取的抑制。Hinton等，Brain Res.Bull.17：615-619(1986)。还有报道指胰高血糖素和CCK在大鼠中协同抑制假饲。LeSauter和Geary，Am.J.Physiol.253：R217-225(1987)；Smith和Gibbs，Annals N.Y.Acad.Sci.713：236-241(1994)。还已经提示，雌二醇和CCK对饱感可具有协同作用。Dulawa等，Peptides 15：913-918(1994)；Smith和Gibbs，出处同上。还已经提议，在其中的营养物作用下由小肠产生的信号可与CCK协同地相互作用，以减少食物摄取。Cox，Behav.Brain Res.38：35-44(1990)。另外，已经报道CCK在某些物种中诱生饱感。例如，已经报道在大鼠中腹膜内注射CCK、在猪中动脉内注射CCK、在猫和猪中静脉内注射CCK、将CCK注射入猴、大鼠、犬和绵羊的脑室中以及在肥胖和不肥胖人中静脉注射CCK引起摄食不振。参见Lieverse等，出处同上。据报道，几个实验室的研究通过在猴和大鼠中比较对食物的反应和对非食物强化剂的反应，以及通过表明CCK激发一般在食物消化后观察到的行为序列(即餐后饱感次序)，证实了低剂量CCK对摄食抑制的行为特异性。另外，据报道，CCK后的行为和单独或与CCK组合的食物消化后的行为对比揭示了CCK和食物消化之间的行为相似性。Crawley和Corwin，出处同上。还已经报道，生理血浆浓度的CCK在瘦人和胖人中均抑制食物摄取，增加饱感。参见Lieverse等，出处同上。

[0035]1966年，CCK被表征为一种33个氨基酸的肽。Crawley和Corwin，出处同上。已鉴别了CCK氨基酸序列的种特异性分子变体。据报道，已在猪、大鼠、鸡、毛丝鼠、犬和人中鉴别出33个氨基酸的序列和截短肽—其8个氨基酸的C-末端序列(CCK-8)。据报道，在猪、犬和豚鼠中存在39个氨基酸的序列。据报道，在猫、犬和人中存在58个氨基酸的序列。据报道，蛙和海龟显示出与CCK和胃泌素同源的47个氨基酸的序列。业已报道非常新鲜的人肠含少量的、甚至更大的、称为CCK-83的分子。据报道已在大鼠中鉴别出主要的中间体形式，称为CCK-22。Walsh，“Gastrointestinal Hormones，”载于Physiology of theGastrointestinal Tract(第3版，1994；Raven Press，New York)。已报道在大鼠脑中有非硫酸盐化CCK-8和四肽(称为CCK-4(CCK(30-33))。C-末端五肽(称为CCK-4(CCK(29-33))保留了与CCK的结构同源性，还与神经肽胃泌素同源。据报道，C-末端硫酸化八肽序列CCK-8在种间相对保守。据报道，编码大鼠甲状腺癌、猪脑和猪肠的前缩胆囊素原的cDNA的克隆和序列分析揭示，345个核苷酸编码CCK前体，其为115个氨基酸，含先前报道已分离的所有CCK序列。Crawley和Corwin，出处同上。

[0036]1966年，CCK被表征为一种33个氨基酸的肽。Crawley和Corwin，出处同上。已鉴别了CCK氨基酸序列的种特异性分子变体。据报道，已在猪、大鼠、鸡、毛丝鼠、犬和人中鉴别出33个氨基酸的序列和截短肽—其8个氨基酸的C-末端序列(CCK-8)。据报道，在猪、犬和豚鼠中存在39个氨基酸的序列。据报道，在猫、犬和人中存在58个氨基酸的序列。据报道，蛙和海龟显示出与CCK和胃泌素同源的47个氨基酸的序列。业已报道非常新鲜的人肠含少量的、甚至更大的、称为CCK-83的分子。据报道已在大鼠中鉴别出主要的中间体形式，称为CCK-22。Walsh，“Gastrointestinal Hormones，”载于Physiology of theGastrointestinal Tract(第3版，1994；Raven Press，New York)。已报道在大鼠脑中有非硫酸盐化CCK-8和四肽(称为CCK-4(CCK(30-33)；SEQ IDNO：208)。C-末端五肽(称为CCK-4(CCK(29-33)；SEQ ID NO：209)保留了与CCK的结构同源性，还与神经肽胃泌素同源。据报道，C-末端硫酸化八肽序列CCK-8在种间相对保守。据报道，编码大鼠甲状腺癌、猪脑和猪肠的前缩胆囊素原的cDNA的克隆和序列分析揭示，345个核苷酸编码CCK前体，其为115个氨基酸，含先前报道已分离的所有CCK序列。Crawley和Corwin，出处同上。

[0037]CCK据说分布于整个中枢神经系统中，以及分布在内分泌细胞中和上小肠的肠神经中。CCK激动剂包括CCK自身(也称为CCK-33)、CCK-8(CCK(26-33)；SEQ ID NO：55)、非硫酸化CCK-8、五肽胃泌素(CCK-5或CCK(29-33)；SEQ ID NO：209)和四肽CCK-4(CCK(30-33)；SEQ ID NO：208)。在胰腺CCK受体中，据报道CCK-8以比未硫酸化CCK-8或CCK-4高1000-5000倍的效力取代结合，并已报道CCK-8刺激胰腺淀粉酶分泌的效力是未硫酸化CCK-8或CCK-4的约1000倍。Crawley和Corwin，出处同上。在大脑皮质匀浆中，CCK受体结合据说被和硫酸化CCK-8等摩尔浓度、10倍高或100倍高浓度的未硫酸化CCK-8和CCK-4取代。出处同上。

[0038]涉及代谢疾病和障碍的再另一个肽激素家族是胰多肽家族(“PPF”)。胰多肽(“PP”)被发现为胰岛素提取物的杂质，由其来源器官而不是功能重要性命名(Kimmel等，Endocrinology 83：1323-30(1968))。PP是含不同结构基序的36个氨基酸的肽。后来在肠提取物中发现了相关肽，由于N-末端和C-末端酪氨酸而命名为肽YY(“PYY”)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：2514-8(1982))。后来在脑提取物中发现了第三种相关肽，命名为神经肽Y(“NPY”)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5485-9(1982)；Tatemoto等，Nature 296：659-60(1982))。

[0039]业已报道，这三种相关肽发挥着不同的生物学作用。PP的作用包括抑制胰腺分泌和松弛胆囊。中枢施用PP使摄食产生轻微增加，这可由位于下丘脑和脑干中的受体介导(综述于Gehlert，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.218：7-22(1998))。

[0040]PYY的释放发生在餐后。PYY的替代分子形式是PYY(3-36)(SEQ ID NO：58)(Eberlein等，Peptides 10：797-803(1989)；Grandt等，Regul.Pept.51：151-9(1994))。该片段占人和犬小肠提取物中总PYY样免疫反应性的约40％，占禁食状态总血浆PYY免疫反应性的约36％，餐后稍微高于50％。其显然是PYY的二肽基肽酶-IV(DPP4)切割产物。据报道，PYY(3-36)是Y2和Y5受体的选择性配体，在优选的N-末端截短的NPY类似物(即其C-末端片段)中，Y2和Y5受体在药理学上似乎是独特的。据报道，外周施用PYY降低胃酸分泌、胃动力、外分泌性胰腺分泌(Yoshinaga等，Am.J.Physio.263：G695-701(1992)；Guan等，Endocrinology128：911-6(1991)；Pappas等，Gastroenterology91：1386-9(1986))、胆囊收缩和小肠动力(Savage等，Gut 28：166-70(1987))。如在直接注射入菱脑/脑干中或周围之后所观察到的(Chen and Rogers，Am.J.Physiol.269：R787-92(1995)；Chen等，Regul.Pept.61：95-98(1996)；Yang and Tache，Am.J.Physiol.268：G943-8(1995)；Chen等，Neurogastroenterol.Motil.9：109-16(1997))，中枢注射PYY对胃排空、胃动力和胃酸分泌的作用可能不同于外周注射后观察到的作用。例如，中枢施用PYY具有某些与本文描述的外周注射PYY(3-36)(SEQ ID NO：58)的作用相反的作用，即刺激而不抑制胃酸分泌。胃动力仅在与TRH刺激协同时受到抑制，但在单独施用时不受抑制，通过推定的与PP受体相互作用实际上在较高剂量下被刺激。已表明，PYY在中枢施用后刺激食物和水摄取(Morley等，Brain Res.341：200-3(1985)；Corp等，Am.J.Physiol.259：R317-23(1990))。

[0041]代谢疾病和障碍呈现出多种形式，包括肥胖、糖尿病、脂血异常、胰岛素抵抗、细胞凋亡等。肥胖及其相关状况在美国和整个世界都是常见且非常严重的公共健康问题。上身肥胖是已知最强的2型糖尿病风险因素，是心血管疾病的强风险因素。肥胖是高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖疾病(例如多囊卵巢综合征)、乳癌、前列腺癌和结肠癌的公认风险因素，并增加了全身麻醉并发症的发病率(参见例如Kopelman，Nature404：635-43(2000))。其降低寿命，具有以上共患病以及感染、静脉曲张、棘皮症、湿疹、运动失耐、胰岛素抵抗、高血压、高胆固醇血症、胆石病、矫形损伤和血栓栓塞病之类疾病的严重风险(Rissanen等，Br.Med.J.301：835-7(1990))。肥胖也是叫做胰岛素抵抗综合征或“综合征X”的状况组的风险因素。近期对肥胖和相关疾病医疗成本的评估是全世界1500亿美元。一般认为，肥胖的发病机理是多因素的，但基础问题是肥胖者的营养利用度和能量消耗没有达到平衡，直至脂肪组织过量。肥胖目前是不好治疗的、慢性的、基本上难消除的代谢疾病。用于肥胖人士体重减轻的治疗性药物可对其健康具有意义深远的有益作用。

[0042]糖尿病是一种糖代谢疾病，其特征在于由胰岛素生产或利用不足导致的高血糖和糖尿。糖尿病严重影响发达国家大部分人群的生活质量。胰岛素生产不足是1型糖尿病的特征，胰岛素利用不足是2型糖尿病的特征。但是，现在普遍认为，有许多不同的糖尿病相关疾病在患者被诊断为患有明显糖尿病之前很久就已开始。另外，在糖尿病人中不能最理想地控制葡萄糖代谢的影响是引起了广泛的相关脂质和心血管失调。

[0043]血脂异常或血浆中脂蛋白水平不正常在糖尿病人中经常发生。血脂异常通常特征在于血液中血浆甘油三酯升高、HDL(高密度脂蛋白)胆固醇低、LDL(低密度脂蛋白)胆固醇水平正常至升高以及小密LDL(低密度脂蛋白)颗粒水平增加。血脂异常在糖尿病人中是冠状动脉事件和死亡发生率增加的主要影响因素。流行病学研究已证实了这一点，该研究表明，和非糖尿病受试者相比，糖尿病受试者中的冠状动脉死亡增加几倍。业已描述了在糖尿病受试者中的几种脂蛋白异常。

[0044]胰岛素抵抗是胰岛素在广泛的浓度范围内发挥其生物学作用的能力减弱。在胰岛素抵抗中，身体不正常地分泌大量胰岛素，以补偿这种缺失，出现葡萄糖耐受受损的状况。由于不能补偿缺失的胰岛素作用，血浆葡萄糖浓度必然升高，导致临床糖尿病状态。一般公认，胰岛素抵抗和相对血胰岛素过多在肥胖、高血压、动脉粥样硬化和2型糖尿病中具有促进作用。已将胰岛素抵抗与肥胖、高血压和咽峡炎的关联描述为一种以胰岛素抵抗为共同发病关联的综合征—综合征X。

[0045]凋亡是受正常发育过程中存在的外来或内在信号调节的细胞自杀的主动过程。许多文件证明，凋亡在胰腺内分泌β细胞调节中起关键作用。越来越多的证据表明，在成年哺乳动物中，β细胞量经历动态变化，以适应在特定情况(例如妊娠和肥胖)下维持血糖恒定(euglycemia)的胰岛素产量。β细胞量的控制取决于细胞增殖、生长和程序化细胞死亡(凋亡)之间的微妙平衡。扰乱此平衡可导致葡萄糖稳态受损。例如，值得注意的是，当β细胞复制速率降低时，随着老化出现葡萄糖不耐受，人体尸检研究反复表明，非胰岛素依赖性糖尿病患者中β细胞量比非糖尿病受试者降低40-60％。一般认为，胰岛素抵抗固定伴随着肥胖，但通过补偿性高胰岛素血症维持血糖量正常，直至β细胞变得不能满足胰岛素增加的需要，此时形成2型糖尿病。

[0046]治疗与糖尿病相关的多种异常的尝试已提示施用几种抗糖尿病药物，以便解决不同患者中的这些异常。抗糖尿病药物的实例是蛋白(例如胰岛素和胰岛素类似物)和小分子(例如胰岛素增敏剂、促胰岛素分泌剂和食欲调节化合物)。

[0047]仍需要开发用于上述代谢疾病、状况和障碍的多肽。因此，本发明的一个目标是提供杂合多肽及其生产和使用方法。本发明的化合物可以用于上文和此处描述的代谢疾病、状况和障碍。

[0048]本文引用的所有文件都通过引用结合到本申请中，如同本文完全阐述一样。

发明概述

[0049]一般地讲，本发明涉及用作代谢疾病和障碍治疗剂和预防剂的新型可选择杂合多肽，其中所述代谢疾病和障碍可通过控制血浆葡萄糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌来减轻，例如为糖尿病和糖尿病相关状况。这样的状况和障碍包括但不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、摄食障碍、胰岛素抵抗、肥胖和任何种类的糖尿病，包括1型、2型和妊娠期糖尿病。

[0050]在本发明的一个方面，提供具有至少一种激素活性的杂合多肽。本发明的杂合多肽包含至少两个共价连接在一起的生物活性肽激素组件，其中至少一个生物活性肽激素组件具有组分肽激素的至少一种激素活性。生物活性肽激素组件独立选自：组分肽激素、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素片段、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物的片段，以及肽增强剂。

[0051]在一种实施方案中，杂合多肽具有至少一种激素活性，杂合多肽包含至少一个第一生物活性肽组件，其与至少一个额外的生物活性肽组件共价连接；其中生物活性肽激素组件独立选自：组分肽激素；具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素片段；具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物；具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物的片段；以及肽增强剂。组分肽激素典型地独立选自下组中的至少两种：胰淀素、肾上腺髓质素(ADM)、降钙素(CT)、降钙素基因相关肽(CGRP)、垂体中间叶激素、缩胆囊素(“CCK”)、瘦蛋白、肽YY(PYY)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、泌酸调节肽(OXM)、利尿钠肽和毒蜥外泌肽-4。典型地，肽增强剂独立选自：赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素结构基序，以及赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素类似物或衍生物的结构基序。在另一实施方案中，至少一种生物活性肽激素组件具有组分肽激素的至少一种激素活性。在另一替代实施方案中，当具有组分肽激素的至少一种激素活性的至少一种生物活性肽激素组件是胰淀素、具有至少一种激素活性的胰淀素片段、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物和衍生物或具有至少一种激素活性的胰淀素类似物和衍生物的片段，并且至少一种其它生物活性肽激素组件是CCK、具有至少一种激素活性的CCK片段、具有至少一种激素活性的CCK类似物和衍生物或具有至少一种激素活性的CCK类似物和衍生物的片段时，则杂合多肽可以进一步含有至少三个活性肽激素组件，其选择至少三种不同的组分肽激素。在另一替代实施方案中，当具有组分肽激素的至少一种激素活性的至少一种生物活性肽激素组件是GLP-1、具有至少一种激素活性的GLP-1片段、具有至少一种激素活性的GLP-1类似物和衍生物或具有至少一种激素活性的GLP-1类似物和衍生物的片段，并且至少一种其它生物活性肽激素组件是肽增强剂时，则杂合多肽可以进一步含有至少三个活性肽激素组件。

[0052]本发明的组分肽激素包括：胰淀素、肾上腺髓质素(ADM)、降钙素(CT)、降钙素基因相关肽(CGRP)、垂体中间叶激素、缩胆囊素(“CCK”)、瘦蛋白、肽YY(PYY)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、泌酸调节肽(OXM)、利尿钠肽和毒蜥外泌肽-4。

[0053]本发明的肽增强剂包括：赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素结构基序，以及赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素类似物或衍生物的结构基序。

[0054]在本发明的另一方面，提供治疗或预防肥胖的方法，其中该方法包括将治疗或预防有效量的本发明的杂合多肽施用需要其的受试者。在一种优选实施方案中，受试者为肥胖或超重受试者。尽管“肥胖”一般定义为体重指数超过30，但对本公开来说，需要或希望减轻体重的任何受试者，包括体重指数低于30的受试者，都包括在“肥胖”范围内。胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受或具有任何形式的糖尿病(例如1型、2型或妊娠期糖尿病)的受试者均可由该方法获益。

[0055]在本发明的再另一方面，提供减少食物摄取、降低营养物利用度、引起体重下降、治疗糖尿病或糖尿病相关状况以及改善脂质谱(包括降低LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)的方法，其中该方法包括施用受试者有效量的本发明杂合多肽。在一个优选实施方案中，本发明的方法用于治疗或预防在有需要受试者中可通过降低营养物利用度而减轻的状况或障碍，包括施用所述受试者治疗或预防有效量的本发明杂合多肽。在另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗或预防可通过控制血浆葡萄糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌减轻的状况或障碍。在再另一个实施方案中，本发明的方法用于治疗糖尿病和/或糖尿病相关状况。这样的状况和障碍包括但不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、摄食障碍、胰岛素抵抗、肥胖和任何种类的糖尿病(包括I型、II型和妊娠期糖尿病)、糖尿病并发症(神经病(基于例如毒蜥外泌肽-4的神经营养作用)、神经性疼痛(基于例如胰淀素作用)、视网膜病、肾病、胰腺β细胞量不足的状况(基于例如毒蜥外泌肽-4和GLP-1的胰岛新生作用)。

[0056]本发明还涉及药物组合物，其包含治疗或预防有效量的至少一种本发明杂合多肽或其药学可接受盐，以及药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或用于送递杂合多肽的载体。

[0057]参照以下的优选实施方案和详述，可更清楚地理解本发明的这些方面和其它方面。

附图简述

[0058]图1显示了本发明的示例性化合物在DIO小鼠测定中的作用。

[0059]图2显示了本发明的示例性化合物在DIO小鼠测定中的作用。

[0060]图3A-3C显示了本发明的示例性化合物在DIO小鼠测定中的作用。

[0061]图4A-4B显示了本发明的示例性化合物与母体肽化合物相比在食物摄取测定中的作用。

[0062]图5A-5B分别显示了本发明的示例性化合物在血糖降低测定和食物摄取测定中的作用。

[0063]图6描绘了本文使用的多种示例性接头的结构。

[0064]图7描绘了多种示例性接头的结构以及示例性PYY和胰淀素家族杂合体的序列和体外活性。

[0065]图8描绘了多种示例性接头的结构以及另外的示例性PYY/PYY家族杂合体的序列和体外活性。

[0066]图9描绘了示例性PYY和胰淀素家族杂合体减轻体重。

[0067]图10描绘了具有CCK受体的细胞系中CCK8家族杂合体的钙代谢图。

[0068]图11A、B和C描绘了胰淀素，如胰淀素-sCT-胰淀素和PYY(如PYY-NPY嵌合体)家族杂合体的食物抑制。

[0069]图12A描绘了胰淀素-sCT-胰淀素/PYY家族杂合体减少总食物摄取，图12B描绘了胰淀素-sCT-胰淀素/PYY家族杂合体减轻体重。“*”表示与溶媒相比，P＜0.05。

[0070]图13描绘了PYY/PYY家族杂合体抑制食物摄取。剂量是25nmol/kg。约15-20％的差异是统计学显著的。

[0071]图14A和14B描绘了具有胰淀素或PYY家族组分的CCK家族杂合体抑制食物摄取活动。剂量是25nmol/kg。约15-20％的差异是统计学显著的。

[0072]图15A和15B描绘了具有胰淀素或PYY家族组分的MSH家族杂合体抑制食物摄取活动。剂量是25nmol/kg。约15-20％的差异是统计学显著的。

[0073]图16A描绘了具有MSH家族组分和胰淀素，如胰淀素-sCT-胰淀素家族组分的杂合体减少总食物摄取，图16B描绘了该杂合体减轻体重。“*”表示与溶媒相比，P＜0.05。

[0074]图17A-D描绘了含有FN-38家族组分和指出的第二家族组分的杂合体抑制食物摄取。图17A—具有胰淀素家族组分，即胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体化合物10的FN38。图17B—具有PYY家族组分，即PYY-3-36的FN38。图17C--具有PYY家族组分，即PYY-NPY嵌合体的FN38。图17D—具有CCK家族组分，即CCK8的FN38。剂量是25nmol/kg。约15-20％的差异是统计学显著的。

[0075]图18A和18B描绘了含有毒蜥外泌肽家族和胰淀素家族组分的杂合体抑制食物摄取。除非另外指出，剂量是25nmol/kg。约15-20％的差异是统计学显著的。

[0076]图19A和18B描绘了毒蜥外泌肽/胰淀素家族杂合体在暗周期喂食期间抑制食物摄取和长期抑制总食物摄取。

[0077]图20A和20B描绘了示例性毒蜥外泌肽/胰淀素-sCT-胰淀素家族杂合体与母体分子相比，长期抑制食物摄取，并且在保留瘦组织的前提下减轻体重，以及减少脂肪的活性。“*”表示与溶媒相比，P＜0.05。

[0078]图21A、B和C显示在大鼠中处理14天后杂合体对代谢参数的影响。

[0079]图22-29描绘了PPF多肽嵌合体，例如PYY-NPY嵌合体化合物4883和5705在本文描述的食物摄取测定中减少累积食物摄取的能力。

发明详述

[0080]一般地讲，本发明涉及用作代谢疾病和障碍的治疗剂和预防剂的新型可选择杂合多肽，其中所述代谢疾病和障碍可通过控制血浆葡萄糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌来减轻，例如为糖尿病和糖尿病相关状况。这样的状况和障碍包括但不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、摄食障碍、胰岛素抵抗、肥胖和任何种类的糖尿病，包括1型、2型和妊娠期糖尿病。

[0081]在一个方面，本发明涉及可基于“生物活性”(例如治疗效力、功能范围、作用持续时间、物理化学特性和/或其它药代动力学特性)选择的生理学、代谢和/或药代动力学活性肽组件的模块化组装。

[0082]非为理论所限制，本发明至少部分涉及“工具箱”方法，其中生物活性肽激素组件以二元、三元或更多元组合连接，以产生具有可选择特性的新型有效治疗剂。“生物活性肽激素组件”可为肽激素、具有激素活性的肽片段，或赋予化学、代谢和/或其它药代动力学稳定性的肽激素结构基序。肽激素可包括本领域已知和本文描述的天然肽激素以及肽激素类似物和衍生物。

[0083]在本发明的一个方面，业已发现两个或多个肽激素的某些物理化学特征组合成单一形态可利于在功能障碍性代谢循环中的几个位置进行干预。因此，在本发明的一个方面，提供合理设计的杂合多肽，其将可选择生物活性整合入单个多肽物质中。在一个实施方案中，本发明的可选择杂合多肽可包括使用化学稳定接头，以共价连接生物活性组件。在另一个实施方案中，本发明的可选择杂合多肽可包括使用可切割的接头，其自身可为或构成生物活性组件的一部分。

[0084]此外，非为理论所限制，本发明的杂合多肽设计一般可包括：(1)鉴别、选择和配对用于需要效力和治疗用途的生物活性肽激素组件，和(2)直接或利用接头共价连接生物活性组件(例如天然肽激素、具有激素活性的肽激素类似物或衍生物、具有激素活性的肽激素片段、稳定基序等)，而不损失组成组件的生物活性。在某些实施方案中，组件选择标准可包括但不限于：(a)用于所需治疗或预防适应症的所需体内效力；(b)用于多种治疗或预防适应症的连接组件的任选协同或双重作用；和/或(c)所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征。

[0085]本文使用的章节标题仅用于编排目的，不能被解读为以任何方式限于所述主题。

本发明的杂合多肽

[0086]如上所述，本发明部分涉及杂合多肽，其含至少两个选自本文所述组分肽激素的生物活性肽激素组件。本发明的杂合多肽一般用于治疗和预防代谢疾病和障碍。本发明的杂合多肽具有组分肽激素的至少一种激素活性，优选可包括第二种组分肽激素的至少一种另外的生物活性。

[0087]在一个实施方案中，本发明的杂合多肽可包含至少两个生物活性肽激素组件，其中所述至少两个生物活性肽激素组件的每一个都具有组分肽激素的至少一种激素活性。在另一个实施方案中，本发明的杂合多肽可包含至少两个生物活性肽激素组件，其中至少一个所述生物活性肽激素组件具有组分肽激素的至少一种生物活性，至少一个所述生物活性肽激素组件赋予杂合多肽所需的化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征。

[0088]在一个优选实施方案中，本发明的杂合多肽与组分肽激素相比在代谢状况和障碍的治疗和/或预防中可具有相当或更高的效力。在另一个实施方案中，本发明的杂合多肽与组分肽激素相比在糖尿病和/或糖尿病相关疾病的治疗和/或预防中可具有相当或更高的效力。或者，本发明的优选杂合多肽与组分肽激素相比可具有改良的生产简便性、稳定性和/或配制简便性。

[0089]更具体地讲，本发明的杂合多肽一般包含第一生物活性肽激素组件，其共价连接于至少一个另外的生物活性肽激素组件。生物活性肽激素组件可以本领域已知的任何方式共价连接在一起，包括但不限于直接酰胺键或化学接头基团，如下文进一步详述。在一个实施方案中，化学接头基团可包括诱导或稳定多肽构象的肽模拟物。

[0090]第一生物活性肽激素组件可选自第一组分肽激素，可为肽激素(包括天然肽激素及其类似物和衍生物)、具有激素活性的肽片段(包括天然肽激素片段及其类似物和衍生物)，或赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征的肽激素(包括天然肽激素及其类似物和衍生物)结构基序。同样，另外的生物活性肽组件可选自组分肽激素，可为肽激素(包括天然肽激素及其类似物和衍生物)、具有激素活性的肽片段(包括天然肽激素片段及其类似物和衍生物)，或赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征的肽激素(包括天然肽激素及其类似物和衍生物)结构基序。第一肽激素和另外的肽激素可为相同的肽激素，可来自相同的肽激素家族，或者可为不同的肽激素，这取决于生物活性肽激素组件的需要特征。

[0091]本文使用的术语“生物活性”指(1)在至少一个体内激素途径中的生物活性，或(2)此生物活性的治疗效力、功能范围、作用持续时间、物理化学特性和/或其它药代动力学特性的调节。可通过本领域已知或本文描述的靶激素受体结合测定或通过监测生理指标的代谢研究评价生物活性。可通过改变例如化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征，变更对此生物活性的治疗效力、功能范围、作用持续时间、物理化学特性和/或其它药代动力学特性的调节。

[0092]在一个实施方案中，本发明的杂合多肽保留组分肽激素生物活性的至少约25％，优选约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。优选的杂合多肽是在本领域已知或本文描述的一种代谢相关测定(例如受体结合、食物摄取、胃排空、胰腺分泌、胰岛素分泌、血糖降低、体重减轻等)中所具有的效力等于或高于组分肽激素在相同测定中效力的杂合多肽。或者，本发明的优选杂合多肽与组分肽激素相比可具有改良的生产简便性、稳定性和/或配制简便性。

[0093]在另一个实施方案中，就降低营养物利用度、减少食物摄取、体重增加作用和/或治疗和预防代谢疾病和障碍而言，本发明的杂合多肽保留天然组分肽激素生物活性的至少约25％，优选约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在再另一个实施方案中，就降低营养物利用度、减少食物摄取、体重增加作用和/或治疗和预防代谢疾病和障碍而言，本发明的杂合多肽具有天然肽激素生物活性的至少约110％、125％、130％、140％、150％、200％或更高。在另一个实施方案中，本发明的杂合多肽具有改良的组分肽激素受体激动剂活性。

组分肽激素、类似物和衍生物

[0094]组分肽激素一般包括用于治疗或预防代谢疾病和障碍的肽激素，包括：(a)胰淀素家族，包括胰淀素、肾上腺髓质素(“ADM”)、降钙素(“CT”)、降钙素基因相关肽(“CGRP”)、垂体中间叶激素(也称为“AFP-6”)和相关肽；(b)缩胆囊素(“CCK”)；(c)瘦蛋白家族，包括瘦蛋白和瘦蛋白样肽；(d)胰多肽家族，包括胰多肽(“PP”)和肽YY(“PYY”)；(e)肠降血糖素和肠降血糖素模拟物，包括：来源于胰高血糖素原基因的肽激素，例如胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(“GLP-1”)、胰高血糖素样肽-2(“GLP-2”)和泌酸调节肽(“OXM”)；和毒蜥外泌肽，例如毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4；和(f)利尿钠肽，包括ANP、BNP、CNP和尿舒张肽、它们的前体形式和衍生自它们的肽；(g)尿皮质素(urocortin)家族，以及(f)神经调节肽家族及其类似物、衍生物和片段。如上所述，本发明的组分肽激素还包括保留这些天然肽激素的激素活性的类似物和衍生物。在一个实施方案中，这样的类似物和衍生物是靶激素受体的激动剂。

[0095]“胰淀素”指分泌自胰腺β细胞、称为胰淀素的人肽激素及其物种变体，如1993年8月10日授权的美国专利第5,234,906号关于“高血糖组合物”的描述，其内容通过引用结合到本文中。更具体地说，胰淀素是一种37个氨基酸的多肽激素，一般与胰岛素一起由胰腺β细胞共分泌，作为对营养物摄取的响应(参见例如Koda等，Lancet 339：1179-1180，1992)。就此意义来说，“胰淀素”、“野生型胰淀素”和“天然胰淀素”(即未修饰的胰淀素)可互换使用。

[0096]“肾上腺髓质素”或“ADM”指人肽激素及其物种变体。更具体地说，ADM由185个氨基酸的前激素原通过连续酶切割和酰胺化产生。该过程以释放52个氨基酸的生物活性肽而终止。

[0097]“降钙素”或“CT”指人肽激素及其物种变体，包括鲑鱼降钙素(“sCT”)。更具体地说，CT是由较大的激素原切割的32个氨基酸的肽。其含有一个二硫键，使得氨基末端呈现环形。降钙素前mRNA的可变剪接产生编码降钙素基因相关肽的mRNA；该肽似乎在神经和血管系统中起作用。已克隆了降钙素受体，表明其为七次跨膜G蛋白偶联受体家族的一员。

[0098]“降钙素基因相关肽”或“CGRP”指任何生理形式的人肽激素及其物种变体。

[0099]“垂体中间叶激素”或“AFP-6”指任何生理形式的人肽激素及其物种变体。

[00100]“缩胆囊素”或“CCK”指人肽激素及其物种变体。更具体地说，CCK是首先在人中鉴别出的33个氨基酸的序列，包括据报导已在猪、大鼠、鸡、毛丝鼠、犬和人中证实的8个氨基酸的体内C-末端片段(“CCK-8”)。因此，术语CCK-33一般指人CCK(1-33)，而CCK-8(CCK(26-33)；SEQ ID NO：55)指C-末端8肽，其一般既可硫酸化，也可未硫酸化，除非另有说明。此外，五肽胃泌素或CCK-5指C-末端肽CCK(29-33)(SEQ ID NO：209)，CCK-4指C-末端四肽CCK(30-33)(SEQID NO：208)。但是，本文使用的CCK一般指硫酸化和未硫酸化形式(除非另有说明)的激素的所有天然变体，包括CCK-33、CCK-8、CCK-5和CCK-4。

[00101]“瘦蛋白”指任意物种的天然瘦蛋白，以及生物活性D-同种型，或天然瘦蛋白及其变体的片段，以及前述的组合。瘦蛋白是ob基因的多肽产物，如国际专利公开WO 96/05309所述，该专利通过引用整体结合到本文中。瘦蛋白的推定类似物和片段报告于美国专利5,521,283、美国专利5,532,336、PCT/US96/22308和PCT/US96/01471，其各自都通过引用整体结合到本文中。

[00102]“PP”指任意生理形式的人胰腺肽多肽或其物种变体。因此，术语“PP”既包括SEQ ID NO：290列出的36个氨基酸的人全长肽，也包括PP的物种变体，包括例如鼠、仓鼠、鸡、牛、大鼠和犬PP。就此意义而言，“PP”、“野生型PP”和“天然PP”(即未修饰的PP)可互换使用。

[00103]“PYY”指任意生理形式的人肽YY多肽或其物种变体。因此，术语“PYY”既包括36个氨基酸的人全长肽，也包括PYY的物种变体，包括例如鼠、仓鼠、鸡、牛、大鼠和犬PYY。就此意义而言，“PYY”、“野生型PYY”和“天然PYY”(即未修饰的PYY)可互换使用。在本发明背景下，就本发明的PYY类似物多肽所讨论的所有修饰都基于天然人PYY的36个氨基酸序列。

[00104]“GLP-1”指任意生理形式的人胰高血糖素样肽-1或其物种变体。术语“GLP-1”包括人GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：59)、GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：204)和GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：61)，参考全长人GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：59)及GLP-1的物种变体，包括例如鼠、仓鼠、鸡、牛、大鼠和犬GLP-1。就此意义而言，“GLP-1”、“野生型GLP-1”和“天然GLP-1”(即未修饰的GLP-1)可互换使用。

[00105]“GLP-2”指任意生理形式的人胰高血糖素样肽-2或其物种变体。更具体地说，GLP-2是一种33个氨基酸的肽，与GLP-1一起由小肠和大肠中的肠内分泌细胞共分泌。

[00106]“OXM”指任意生理形式的人泌酸调节肽或其物种变体。更具体地说，OXM是一种37个氨基酸的肽，其含29个氨基酸的胰高血糖素序列，后接8个氨基酸的羧基末端延伸。

[00107]“毒蜥外泌肽”指发现于希拉毒蜥(亚利桑那州的一种内生蜥蜴)和墨西哥串珠蜥的唾液中的一种肽激素及其物种变体。更具体地说，毒蜥外泌肽-3存在于墨西哥串珠蜥(Heloderma horridum)唾液中，毒蜥外泌肽-4存在于希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中(Eng，J.等，JBiol.Chem.，265：20259-62，1990；Eng.，J.等，J.Biol.Chem.，267：7402-05(1992))。毒蜥外泌肽与胰高血糖素样肽家族的几个成员具有某些序列相似性，与GLP-1具有53％的最高同一性(Goke等.，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993))。就此意义而言，“毒蜥外泌肽”、“野生型毒蜥外泌肽”和“天然毒蜥外泌肽”(即未修饰的毒蜥外泌肽)可互换使用。

[00108]“尿皮质素”指任意生理形式的人尿皮质素肽激素或其物种变体。更具体地，存在三种人尿皮质素：Ucn-1、Ucn-2和Ucn-3。例如，人尿皮质素1具有下式：

Asp-Asn-Pro-Ser-Leu-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Thr-Leu-Leu-Glu-Leu-Ala-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Arg-Glu-Arg-Ala-Glu-Gln-Asn-Arg-Ile-Ile-Phe-Asp-Ser-Val-NH2(SEQ ID NO：294)。大鼠来源的尿皮质素相同，但有两个取代：Asp2取代Asn2和Pro4取代Ser4。人Ucn-2具有序列Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu GluGln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala Arg IleLeu Ala Arg Val Gly His Cys(SEQ ID NO：399)。人Ucn-3具有序列PheThr Leu Ser Leu Asp Val Pro Thr Asn Ile Met Asn Leu Leu Phe Asn Ile AlaLys Ala Lys Asn Leu Arg Ala Gln Ala Ala Ala Asn Ala His Leu Met AlaGln Ile(SEQ ID NO：299)。Ucn-3优选是酰胺形式。其它尿皮质素和类似物描述于文献中，例如美国专利6214797。保留食物摄取抑制和抗高血压/心脏保护/正性肌力特性的尿皮质素Ucn-2和Ucn-3，特别适用于本发明的杂合体。Stresscopin (Ucn-3)和Stresscopin-相关肽(Ucn 2)是根据它们能够抑制应激性刺激如饮食/禁食后的慢性HPA激活的能力而命名的，它们对2型CRF受体是特异性的，并且不激活介导ACTH释放的CRF-R1。包含例如Ucn-2或Ucn-3的尿皮质素的杂合体特别可用于血管扩张，因此可以用于本文描述的心血管用途，例如CHF。本发明的含有尿皮质素的杂合体特别可用于治疗或预防与刺激ACTH释放相关的状况、由于血管扩张作用导致的高血压、通过ACTH升高以外的因素介导的炎症、体温过高、食欲障碍、充血性心力衰竭、应激、焦虑和牛皮癣。所述化合物也可以用于抗增殖作用，例如用于治疗或预防癌症或肿瘤生长。特别感兴趣的是与利尿钠肽组件、胰淀素家族、毒蜥外泌肽家族或GLP1家族组件组合的尿皮质素肽激素组件，它们提供增强的心血管益处，例如治疗CHF，这是因为提供有益的血管扩增作用。

[00109]“神经调节肽”指神经调节肽的肽家族，包括神经调节肽U和S肽，更特别是它们的活性激素序列。例如，天然活性人神经调节肽U肽激素是神经调节肽-U25：Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser ProPhe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn(SEQ IDNO：308)，特别是酰胺形式。猪U25具有序列：FKVDEEFQGPIVSQNRRYFLFRPRN(SEQ ID NO：314)，特别是其酰胺形式。其它神经调节肽U家族成员包括以下以SWISS-PROT名称和登录号列出的U家族成员：NEUU_CANFA(P34962)，NEUU_CAVPO(P34966)，NEUU_CHICK(P34963)，NEUU_HUMAN(P48645)，NEUU_LITCE(P81872)，NEUU_MOUSE(Q9QXK8)，NEUU_PIG(P34964)，NEUU_RABIT(P34965)，NEUU_RANTE(P20056)和NEUU_RAT(P12760)。特别感兴趣的是它们的经过加工的活性肽激素和类似物、衍生物及其片段。神经调节肽U家族中包括各种截短或剪接变体，如FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN(SEQ IDNO：300)。神经调节肽S家族的示例是具有序列ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN(SEQ ID NO：315)的人神经调节肽S，特别是其酰胺形式。本发明的具有神经调节肽组件的杂合体将具有食欲减退作用，因此具有治疗肥胖、糖尿病、减少食物摄取和治疗本文描述的其它相关状况和障碍的有益价值。特别感兴趣的是与胰淀素家族肽、毒蜥外泌肽家族或GLP1肽家族组件组合的神经调节肽组件。

[00110]本文使用的“类似物”指其序列来源于基础参比肽(例如PP、PYY、胰淀素、GLP-1、毒蜥外泌肽等)序列的肽，包括参比氨基酸序列的插入、取代、延伸和/或缺失，优选与基础肽具有至少50％或55％的氨基酸序列同一性，更优选与基础肽具有至少70％、80％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，这样的类似物可包含保守或非保守氨基酸取代(包括非天然氨基酸以及L和D形式)。

[00111]“衍生物”被定义为这样的分子，其具有天然参比肽或类似物的氨基酸序列，但一个或多个氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧基另外具有化学修饰。化学修饰包括但不限于加入化学部分、建立新键和去除化学部分。氨基酸侧基修饰包括但不限于赖氨酸ε-氨基酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧基团烷基化；以及谷氨酰胺或天冬酰胺脱酰胺化。末端氨基修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基、限制的烷基(例如分支、环状、稠合、金刚烷基)和N-酰基修饰。末端羧基修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、限制的烷基(例如分支、环状、稠合、金刚烷基)烷基、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。而且，可利用肽化学一般技术人员已知的保护基保护一个或多个侧基或末端基团。氨基酸的α-碳可一甲基化或二甲基化。

[00112]“激动剂”指激发天然人参比肽的生物活性的化合物，当用本领域已知的检测(例如受体结合/竞争研究)评价时，所述化合物具有的效力优选好于参比肽，或和参比肽相比在5个数量级(增加或减少)效力之内，更优选为4、3、2或1个数量级。在一个实施方案中，该术语指激发的生物学作用类似于天然人参比肽的化合物，例如(1)在食物摄取、胃排空、胰腺分泌或体重下降检测中所具有的活性类似于天然人参比肽的化合物，或(2)在参比受体测定或竞争结合测定中与标记的参比肽特异性结合的化合物。优选地，激动剂在这样的测定中以高于1μM的亲和性结合，更优选以高于1-5nM的亲和性结合。在另一个实施方案中，该术语指在糖尿病或糖尿病相关疾病或障碍的治疗中激发生物学作用的化合物。这样的激动剂可包括含参比肽活性片段的多肽或小化学分子。

[00113]“氨基酸”和“氨基酸残基”指天然氨基酸、非天然氨基酸和修饰的氨基酸。除非与此相反地规定，否则一般性或以名称具体指出的任何氨基酸都包括D和L立体异构体，如果其结构允许这样的立体异构体形式。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、氮杂环丁烷甲酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、2-吡啶酸和硫代脯氨酸。其它的非天然氨基酸包括修饰的氨基酸残基，其可逆或不可逆地被化学封闭，或在其N-末端氨基或其侧链基团上被化学修饰，例如其中侧链官能团被化学修饰为另一个官能团的N-甲基化D和L氨基酸或残基。例如，修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、天冬氨酸的一种修饰氨基酸—天冬氨酸-(β-甲酯)、甘氨酸的一种修饰氨基酸—N-乙基甘氨酸或丙氨酸的一种修饰氨基酸—丙氨酸甲酰氨。另外的可加入的残基描述于Sandberg等，J.Med.Chem.41：2481-91，1998。

[00114]本文使用的“5Apa”指5氨基-戊酰基，“12Ado”指12-氨基十二烷酰基，“PEG(8)”指3，6，-二氧基辛酰基，而“PEG(13)”指1-氨基-4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰基(succinimoyl)。

[00115]如上所述，本领域已知天然组分肽激素，也已知其类似物和衍生物。下表1提供了几个天然组分肽激素的序列，仅供参考。

表1：示例性组分肽

[00116]这些肽在生理表达时一般C-末端酰胺化，但对本发明目的来说不是必须的。换句话说，这些肽以及本发明的杂合多肽的C-末端可具有游离-OH或-NH2基团。这些肽还可具有其它的翻译后修饰。本领域技术人员会意识到，还可构建具有N-末端甲硫氨酸残基的本发明杂合多肽。

[00117]用于本发明的示例性肽组件进一步包括N末端可延伸的肽组件(及其类似物和片段)，包括Apelin，其具有2种形式，即36和13，两者在AJP受体(LVQPRGSRNGPGPWQGGRRKFRRQRPRLSHKGPMPF-OH(SEQ IDNO：316)和pERPRLSHKGPMPF-OH(SEQ ID NO：317))都有活性；促乳素释放肽，其具有2种形式，即PRP31和PRP20，两者在GPR10(SRTHRHSMEIRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2(SEQ ID NO：318)和TPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2(SEQ ID NO：319))同样有活性；胃泌素，其存在形式为大胃泌素和小胃泌素，但是，大量的活性位于五肽胃泌素(QLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ IDNO：320)；pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO：321)；β-AWMDF-NH2(SEQ ID NO：322))中的残基；CCK，其存在形式为CCK33或CCK8(中枢vs.外周；KAPSGRMSIVKNLQNLDPSHRISDRDYMGWMDF-NH2(SEQ ID NO：323)；DYMGWMDF-NH2)(SEQ ID NO：55)；皮质抑素，存在形式为皮质抑素17或29(QEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK-OH(SEQ IDNO：324)和DRMPCRNFFWKTFSSCK-OH(SEQ ID NO：325))；促生长素抑制素，其存在形式为促生长素抑制素14或28(SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC-OH(SEQ ID NO：326)；AGCKNFFWKTFTSC-OH(SEQ ID NO：327))；GRP，其中C-末端的10个氨基酸的序列具有大多数活性(VPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM-NH2(SEQ ID NO：328)；GNHWAVGHLM-NH2(SEQ ID NO：329))；神经调节肽B，其中C-末端的10个氨基酸的区域具有大多数活性(LSWDLPEPRSRASKIRVHSRGNLWATGHFM-NH2(SEQ ID NO：330)；GNLWATGHFM-NH2(SEQ ID NO：331))；神经调节肽S，其中C-末端的9个氨基酸的区域具有大多数活性(ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：315)；PFFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：332))；神经调节肽U，其中C-末端的9个氨基酸的区域具有大多数活性(FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：308)；GYFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：307))；神经紧张素，其以长和短形式存在(KIPYILKRQLYENKPRRPYIL-OH(SEQ ID NO：333)；QLYENKPRRPYIL-OH)(SEQ ID NO：334)；Kiss-1，其活性主要存在于其C末端(GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF-NH2(SEQ ID NO：335)；EKDLPNYNWNSFGLRF-NH2(SEQ IDNO：336))；RF-酰胺-3，其C-末端片段具有活性(SAGATANLPLRSGRNMEVSLVRRVPNLPQRF-NH2(SEQ ID NO：337)；VPNLPQRF-NH2(SEQ ID NO：338))；强啡肽，其存在形式为大强啡肽(A)和强啡肽B(rimorphin)(YGGFLRRIRPKLKWDNQKRYGGFLRRQFKVVT-OH(SEQ ID NO：339)和YGGFLRRQFKVVT-OH(SEQ ID NO：340))；PYY，其C-末端片段在Y2受体具有活性(YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2(SEQ ID NO：57)；SLRHYLNLVTRQRY-NH2(SEQ ID NO：341))；AFP-6，其7-47区保留活性(TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2(SEQ ID NO：51)；VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2(SEQ ID NO：52))；胰淀素家族，包括肾上腺髓质素、降钙素和CGRP；催产素，其C-末端通常是活性所需的，并且可以耐受N-末端延伸。

[00118]用于本发明的示例性肽组件进一步包括C-末端可延伸的肽组件，包括内皮缩血管肽I、II和III：ETI(CSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRS-OH(SEQ IDNO：342)；CSCSSLMDKECVYFCHLDIIW-OH(SEQ ID NO：343))，ETII(CSCSSWLDKECVYFCHLDIIWVNTPEQTAPYGLGNPP-OH(SEQ IDNO：344)；CSCSSWLDKECVYFCHLDIIW-OH(SEQ ID NO：345))和ETIII(CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR-NH2(SEQ ID NO：346)；CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW-OH(SEQ ID NO：347))；生长素释放肽，其活性主要位于其前10个残基(GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQP-OH(SEQ ID NO：348)；GSSFLSPEHQ-OH(SEQ ID NO：349))；胰高血糖素，包括泌酸调节肽，其是C-末端延伸的胰高血糖素，具有胰高血糖素样活性(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA-OH(SEQ IDNO：350)；HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH(SEQ ID NO：351))；GLP-1/GLP-2，其活性在有或没有C-末端酰胺的条件下都保留；GIP，其以两种形式循环，即GIP1-42和GIP1-30，两者在GIP受体都有完整的活性(YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH(SEQ ID NO：352)；YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-NH2(SEQ ID NO：353))；神经肽W，其存在形式为NPW23和NPW30，在GPR7和8同样有活性(WYKHVASPRYHTVGRAAGLLMGLRRSPYLW-OH(SEQ ID NO：354)；WYKHVASPRYHTVGRAAGLLMGL-OH(SEQ ID NO：355))；PACAP，其以两种形式存在，即PACAP27和38(HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK-NH2(SEQID NO：356)；HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2(SEQ IDNO：357))；PHI和PHV(HADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLMGKRVSSNISEDPVPV-OH(SEQ ID NO：358)；HADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLM-NH2(SEQID NO：359))；GRF，其以两种形式存在，即GRF29和GRF40(YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL-NH2(SEQ ID NO：360)；YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMS-OH(SEQID NO：361))；PTH 1-34和1-37形式，其具有全长PTH 1-84的活性(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ(SEQ ID NO：362)；SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL-OH(SEQID NO：363)；SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF-OH(SEQ ID NO：364))；PTH-RP，其中1-36具有全长1-86的活性(AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRATSEVSPNSKPSPNTKNHPVRFGSDDEGRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKP-NH2(SEQ ID NO：365)；AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI-OH(SEQ IDNO：366))；γ-MSH，其中较短的γ-MSH1和较长的γ-MSH3具有相似的活性(YVMGHFRWDRFGRRNSSSSGSSGAGQ-OH(SEQ ID NO：367)；YVMGHFRWDRF-NH2(SEQ ID NO：368))；MSH，其中α-MSH是ACTH的活性部分(SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF-OH(SEQID NO：369)；SYSMEHFRWGKPV-NH2(SEQ ID NO：370))；和内啡肽，其中α、δ和γ-内啡肽是较大的β-内啡肽的活性亚肽(YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAYKKGE-OH(SEQ ID NO：371)；YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAY-OH(SEQ ID NO：372)；YGGFMTSEKSQTPLVTL-OH(SEQ ID NO：373)；YGGFMTSEKSQTPLVT-OH(SEQ ID NO：374))。

[00119]例如，黑皮质素是来自pro-opiomelanocortin基因的肽，包括α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)和促肾上腺皮质素(ACTH)，并且已知有5种黑皮质素受体，即MC1-5R。MC4R似乎在能量平衡和肥胖中起作用。参见，例如Anderson等，Expert Opin.Ther.Patents11：1583-1592(2001)，Speake等，Expert Opin.Ther.Patents 12：1631-1638(2002)，Bednarek等，Expert Opin.Ther.Patents 14：327-336(2004)。

[00120]以上组分肽激素的类似物是本领域已知的，但一般包含修饰，例如此组分肽激素氨基酸序列的取代、缺失和插入及其任意组合。所述取代、缺失和插入可在N-末端或C-末端，或者可在组分肽激素的内部。在一个优选方面，本发明组分肽激素的类似物包括一种或多种修饰的“非必需”氨基酸残基。在本发明背景下，“非必需”氨基酸残基为在片段(例如组分肽激素片段)的天然人氨基酸序列中可改变(即缺失或取代)而不消除或基本不降低所得类似物的组分肽激素受体激动剂活性的残基。

[00121]优选的取代包括保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链或物理化学特征(例如静电、氢键键合、等排、疏水特征)的氨基酸残基取代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

[00122]本发明还涉及组分肽激素衍生物。这样的衍生物包括缀合至一个或多个水溶性聚合物分子(例如聚乙二醇(“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰等))或加入聚氨基酸(例如聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸和聚丙氨酸)的组分肽激素及其类似物。对组分肽激素及其类似物的修饰还可包括小分子取代基，例如短烷基和约束烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和芳基。水溶性聚合物分子优选具有约500至约20,000Da的分子量。

[00123]这样的聚合物缀合和小分子取代基修饰可单独地发生在杂合多肽序列中的N-末端或C-末端或氨基酸残基的侧链上。或者，沿着杂合多肽可有多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代一个或多个氨基酸可提供另外的衍生化位点。参见例如美国专利第5,824,784号和5,824,778号。优选地，杂合多肽可缀合至1、2或3个聚合物分子。

[00124]水溶性聚合物分子优选连接至氨基、羧基或巯基，可连接在N-末端或C-末端或赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链上。或者，水溶性聚合物分子可与二胺基和二羧基连接。在一个优选实施方案中，本发明的杂合多肽通过赖氨酸上的ε氨基缀合1、2或3个PEG分子。

[00125]本发明的衍生物还包括一个或多个氨基酸残基具有化学改变的组分肽激素或类似物。这样的化学改变包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可单独地发生在PPF杂合多肽序列中的N-末端或C-末端或氨基酸残基的侧链上。在一个实施方案中，这些多肽的C-末端可具有游离-OH或-NH₂基团。在另一个实施方案中，N-末端可用异丁氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、乙氧基羰基、异己酰基(isocap)、辛烷基、辛基甘氨酸基(G(Oct))或8-氨基辛酸基加帽。在一个优选实施方案中，可通过形成二硫键环化。或者，沿着杂合多肽可有多个化学改变位点。

胰淀素家族

[00126]如上所述，用于本发明的组分肽激素包括胰淀素家族肽激素，其包括胰淀素、肾上腺髓质素(“ADM”)、降钙素(“CT”)、降钙素基因相关肽(“CGRP”)、垂体中间叶激素(也称为“AFP-6”)和相关肽。天然胰淀素家族肽激素是本领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些优选的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知胰淀素家族肽都可连同本发明一起使用。

[00127]本领域已知的任何胰淀素类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，胰淀素类似物和衍生物具有天然胰淀素的至少一种激素活性。在某些实施方案中，胰淀素类似物是天然胰淀素能够特异性结合的受体的激动剂。优选的胰淀素类似物和衍生物包括US 2003/0026812A1中描述的物质，该文献通过引用结合到本文中。

[00128]示例性胰淀素类似物包括：

SEQ ID：
		67	25，28，29Pro-h-胰淀素(普兰林肽)
68	des-1Lys-h-胰淀素
		69	25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素
70	18Arg，25，28Pro-h-胰淀素
		71	des-1Lys，18Arg，25，28Pro-h—胰淀素
72	18Arg，25，28，29Pro-h-胰淀素
		73	des-1Lys，18Arg，25，28，29Pro-h-胰淀素
74	des-1，Lys25，28，29Pro-h-胰淀素
		75	25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素
76	28Pro-h-胰淀素，2，7-环-[2Asp，7Lys]-h-胰淀素
		77	2-37h-胰淀素
78	1Ala-h-胰淀素
		79	2Ala-h-胰淀素
80	2，7Ala-h-胰淀素
		81	1Ser-h-胰淀素
82	29Pro-h-胰淀素
		83	25，28Pro-h-胰淀素

84	des-1Lys，25，28Pro-h-胰淀素
		85	23Leu，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素
86	23Leu25Pro26Val28Pro-h-胰淀素
		87	des-1Lys，23Leu，25Pro，26Val，28Pro-h-胰淀素
88	18Arg，23Leu，25Pro 26Val，28Pro-h-胰淀素
		89	18Arg，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素
90	18Arg23Leu，25，28Pro-h-胰淀素
		91	17Ile，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素
92	17Ile，25，28，29Pro-h-胰淀素
		93	des-1Lys，17Ile，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素
94	17Ile，18Arg 23Leu-h-胰淀素
		95	17Ile，18Arg，23Leu，26Val，29Pro-h-胰淀素
96	17Ile，18Arg，23Leu，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素，
		97	13Thr，21His，23Leu，26Ala，28Leu，29Pro，31Asp-h-胰淀素
98	13Thr，21His，23Leu，26Ala，29Pro，31Asp-h-胰淀素
		99	des-1Lys，13Thr，21His，23Leu，26Ala，28Pro，31Asp-h-胰淀素
100	13Thr，18Arg，21His，23Leu，26Ala，29Pro，31Asp-h-胰淀素
		101	13Thr，18Arg，21His，23Leu，28，29Pro，31Asp-h-胰淀素
102	13Thr，18Arg，21His，23Leu，25Pro，26Ala，28，29Pro，31Asp-h-胰淀素

[00129]如本领域所知，这样的胰淀素类似物优选酰胺化，但在本发明背景下，任选可为酸形式，除非另有说明。

[00130]本领域已知的任何ADM类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，ADM类似物和衍生物具有天然ADM的至少一种激素活性。在某些实施方案中，ADM类似物是天然ADM能够特异性结合的受体的激动剂。

[00131]本领域已知的任何CT类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，CT类似物和衍生物具有天然CT的至少一种激素活性。在某些实施方案中，CT类似物是天然CT能够特异性结合的受体的激动剂。优选的CT类似物和衍生物包括描述于美国专利第4,652,627、4,606,856、4,604,238、4,597,900、4,537,716、4,497,731、4,495,097、4,444,981、4,414,149、4,401,593和4,397,780号的物质，这些专利通过引用结合到本文中。

[00132]示例性CT类似物包括：

SEQ ID：
		103	8Gly-CT
104	22Leu-CT
		105	2Gly，3Ser，8Gly，22des-Tyr-CT
106	14Glu-sCT，
		107	18Arg-sCT，
108	11，18Arg-sCT，
		109	14Glu，18Arg-sCT，
110	14Glu，11，18Arg-sCT

[00133]如本领域所知，这样的CT类似物优选酰胺化，但在本发明背景下，任选可为酸形式，除非另有说明。

[00134]本领域已知的任何CGRP类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，CGRP类似物和衍生物具有天然CGRP的至少一种激素活性。在某些实施方案中，CGRP类似物是天然CGRP能够特异性结合的受体的激动剂。优选的CGRP类似物和衍生物包括描述于美国专利第4,697,002和4,687,839号的物质，这些专利通过引用结合到本文中。

[00135]示例性的CGRP类似物包括：

SEQ ID：
		111	36D-Ser-CGRP
112	36D-Thr-CGRP
		113	36D-Asp-CGRP
114	36D-Asn-CGRP
		115	36Ser-CGRP
116	36Hse-CGRP

117	36Asp-CGRP
		118	36Thr-CGRP
119	36Asn-CGRP

[00136]本领域已知的任何AFP-6类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，AFP-6类似物和衍生物具有天然AFP-6的至少一种激素活性。在某些实施方案中，AFP-6类似物是天然AFP-6能够特异性结合的受体的激动剂。优选的AFP-6类似物和衍生物包括描述于WO 2003/022304的物质，该文献通过引用结合到本文中。

[00137]示例性的AFP-6类似物包括：

SEQ ID：
		120	TQAQLLRVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
121	TQAQLLRVGCDTATCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
		122	TQAQLLRVGMVLGTMQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
123	TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY
		124	TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQESAPVEPSSPHSY
125	TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVDPSSPHSY
		126	TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQL----DSAPVDPSSPHSY
127	RVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
		128	VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY
129	VGCVLGTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY

130	GCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
		131	GCNTATCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVDPSSPHSY
132	GCNTATCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY
		133	GCSNLSTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY
134	GCGNLSTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY
		135	GCVLGTCQVQNLSHRLWQL----RQESAPVEPS SPHSY
136	CVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
		137	QVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
138	VQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
		139	VQNLSHRL----QLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
140	GTMQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY

[00138]如本领域所知，这样的AFP-6类似物优选酰胺化，但在本发明背景下，任选可为酸形式，除非另有说明。

CCK家族

[00139]CCK，包括hCCK和物种变体及其各种类似物，是本领域已知的。一般来说，CCK具有首先在人中鉴别出的33个氨基酸的序列，包含据报导已在猪、大鼠、鸡、毛丝鼠、犬和人中证实的8个氨基酸体内C-末端片段(“CCK-8”)。其它种变体包括存在于猪、犬和豚鼠中的39个氨基酸的序列，存在于猫、犬和人中的58个氨基酸的序列，与CCK和胃泌素均同源的47个氨基酸的序列。C-末端硫酸化八肽序列(CCK-8)在种间相对保守，可为啮齿动物外周组织中最小的生物活性序列。因此，术语CCK-33一般指人CCK(1-33)，而CCK-8(CCK(26-33)；SEQID NO：55)指C-末端8肽，其一般既可硫酸化，也可未硫酸化，除非另有说明。此外，五肽胃泌素或CCK-5指C-末端肽CCK(29-33)(SEQ IDNO：209)，CCK-4指C-末端四肽CCK(30-33)(SEQ ID NO：208)。

[00140]业已报道A型受体亚型(CCK_A)是硫酸化八肽选择性的。已在整个脑和胃中鉴别出B型受体亚型(CCK_B)，据报道其不需要硫酸化或全部8个氨基酸。

[00141]CCK类似物的各种体内和体外筛选方法是本领域已知的。实例包括体内测定和体外测定，体内测定包括在快速静脉内注射要检测其CCK样活性的化合物后观察犬或豚鼠胆囊的收缩，体外测定使用兔胆囊条检测。参见Walsh，“Gastrointestinal Hormones”，载于Physiologyof the Gastrointestinal Tract(第3版，1994；Raven Press，New York)。

[00142]某些具有CCK活性的示例性CCK和CCK类似物包括：

SEQ ID：
		141	DY(SO3H)MGWMDF
142	DYMGWMDF
		143	MGWMDF
144	GWMDF
		145	WMDF
146	KDY(SO3H)MGWMDF
		147	KDYMGWMDF
148	KMGWMDF
		149	KGWMDF
150	KWMDF

[00143]如本领域所知，这样的CCK肽优选酰胺化，但在本发明背景下，任选可为酸形式，除非另有说明。

瘦蛋白家族

[00144]用于本发明的组分肽激素还包括瘦蛋白家族肽激素。天然瘦蛋白家族肽激素是本领域已知的，功能性类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些优选的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知瘦蛋白家族肽都可连同本发明一起使用。

[00145]本领域已知的任何瘦蛋白类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，瘦蛋白类似物和衍生物具有天然瘦蛋白的至少一种激素活性。在某些实施方案中，瘦蛋白类似物是天然瘦蛋白能够特异性结合的受体的激动剂。优选的瘦蛋白类似物和衍生物包括描述于例如WO 2004/039832、WO 98/55139、WO 98/12224和WO 97/02004的物质，所有这些文献都通过引用结合到本文中。

[00146]在一个实施方案中，瘦蛋白肽包括WO97046585中公开的MVPIQK，VQDDTK，TLIK，TIVTR，INDISHTQSVSSK，VTGLDFIPGLHPILTLSK，NVIQISNDLENLR，DLLHVLAFSK，SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSR和LQGSLQDMLWQLDLSPGC。

[00147]在一个实施方案中，瘦蛋白肽可以具有氨基酸序列Xaan-Ser-Cys-Xaa1-Leu-Pro-Xaa2-Xaa3-Xaan，其中Xaan的长度可以是0个残基，或可以是来源于全长人或小鼠瘦蛋白序列的肽残基的连续片段，位于C-末端或N-末端的1-7的片段，或其中瘦蛋白肽的长度是总共15个氨基酸或更少。在另一实施方案中，Xaa1、Xaa2或Xaa3可以是任何氨基酸取代。在另一实施方案中，Xaa1、Xaa2或Xaa3可以是全长小鼠或人瘦蛋白中相应残基的任何保守氨基酸取代。在另一实施方案中，Xaa1可以选自His或Ser，Xaa2或Xaa3是任何氨基酸取代。在另一实施方案中，Xaa2可以选自Trp或Gln，Xaa1或Xaa3是任何氨基酸取代。在另一实施方案中，Xaa3可以选自Ala或Thr，Xaa1或Xaa2是任何氨基酸取代。在另一实施方案中，Xaa1选自His或Ser，Xaa2选自Trp或Gln，Xaa3选自Ala或Thr。参见WO04039832。

[00148]在一个实施方案中，瘦蛋白肽包含天然全长人或小鼠瘦蛋白的C-末端氨基酸残基116-122(相应于它们的成熟形式的位置95-101)及其D-同种型、片段、衍生物、类似物和同源物，其在测试动物中在i.p.(腹膜内)施用后具有调节体重平衡的能量。序列SCSLPQT的特定小鼠D-取代的肽包括[D-Ser-1]-，[D-Cys-2]-，[D-Ser-3]-，[D-Leu-4]-，[D-Pro-5]-，[D-Gln-6]-，[D-Thr-7]-SCSLPQT和全部[D]SCSLPQT。SCHLPWA的特定人D-取代的肽包括[D-Ser-1]-，[D-Cys-2]-，[D-His-3]-，[D-Leu-4]-，[D-Pro-5]-，[D-Trp-6]-，[D-Ala-7]-SCHLPWA和全部[D]-SCHLPWA。此外，SCHLPWA和SCSLPQT肽可以在任何2、3、4、5或6个位置上含有D-取代的氨基酸。也公开了瘦蛋白相关肽，其包含天然瘦蛋白的N-末端氨基酸21-35，31-45，41-55和51-65，及其片段、衍生物、类似物和同源物。本发明的其它瘦蛋白肽包括小鼠和/或人全长瘦蛋白的氨基酸序列61-75，71-85，81-95，91-105，106-120，116-130，126-140，136-150，146-160和156-167。参见WO04039832。

[00149]在一个实施方案中，瘦蛋白的序列是Ser Cys His Leu ProXaa Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala SerGly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa AspXaa Leu Xaa Xaa Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中：第6位的Xaa是Trp或Gln；第36位的Xaa是Gln或Glu；第40位的Xaa是Gln或Glu；第42位的Xaa是Ile、Leu、Met或甲硫氨酸亚砜；第44位的Xaa是Trp或Gln；第45位的Xaa是Gln或Glu。在另一实施方案中，上述的瘦蛋白中，第6位的Xaa是Trp；第36位的Xaa是Gln；第40位的Xaa是Gln；第42位的Xaa是Met；第44位的Xaa是Trp；并且第45位的Xaa是Gln。参见美国专利5521283。

[00150]在一个实施方案中，瘦蛋白是天然序列，包括鼠瘦蛋白：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile ValThr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Xaa Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys ValThr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys MetAsp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg AsnVal Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val LeuAla Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu GluSer Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala LeuSer Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Gln GlnLeu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中：第28位的Xaa是Gln或不存在；猪瘦蛋白Val Pro Ile Trp Arg Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile LysThr Ile Val Thr Arg Ile Ser Asp Ile Ser His Met Gln Ser Val Ser Ser Lys GlnArg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Val Leu Ser Leu SerLys Met Asp Gln Thr Leu Ala Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro SerArg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu HisLeu Leu Ala Ser Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Gln Ala Arg Ala Leu Glu ThrLeu Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val ValAla Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ala Leu Gln Asp Met Leu Arg Gln Leu AspLeu Ser Pro Gly Cys；牛瘦蛋白：Val Pro Ile Cys Lys Val Gln Asp Asp ThrLys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Xaa SerVal Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His ProLeu Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Ile Tyr Gln Gln Ile LeuThr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val Val Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn LeuArg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Ala Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Gln ValArg Ala Leu Glu Ser Leu Glu Ser Leu Gly Val Val Leu Glu Ala Ser Leu TyrSer Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met LeuArg Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中：第28位的Xaa是Gln或不存在；人瘦蛋白：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr LeuIle Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Xaa Xaa Ser Val Ser SerLys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu ThrLeu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser MetPro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp LeuLeu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly LeuGlu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr GluVal Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp GlnLeu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中第27位的Xaa是Thr或Ala，并且第28位的Xaa是Gln或不存在；猕猴瘦蛋白：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln SerAsp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser HisThr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro GlyLeu His Pro Val Leu Thr Leu Ser Gln Met Asp Gln Thr Leu Ala Ile Tyr GlnGln Ile Leu Ile Asn Leu Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp LeuGlu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys HisLeu Pro Leu Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Asp Val Leu GluAla Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser LeuGln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys；和大鼠瘦蛋白：Val Pro Ile His Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr LeuIle Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser HisThr Gln Ser Val Ser Ala Arg Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile ProGly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val TyrGln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala His AspLeu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser CysSer Leu Pro Gln Thr Arg Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val LeuGlu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly SerLeu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Leu Ser Pro Glu Cys。

[00151]在另一实施方案中，瘦蛋白肽的序列是：Val Pro Ile Gln LysVal Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Xaa AspIle Ser His Xaa Xaa Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp PheIle Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Gln Thr Leu AlaVal Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Gln Ile XaaAsn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser LysSer Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly GlyVal Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu GlnGly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中：第22位的Xaa是Asn、Asp或Glu；第27位的Xaa是Thr或Ala；第28位的Xaa是Gln、Glu或不存在；第54位的Xaa是Met或Ala；第68位的Xaa是Met或Leu；第72位的Xaa是Asn、Asp或Glu；第77位的Xaa是Ser或Ala；第118位的Xaa是Gly或Leu；所述蛋白具有至少一个选自下组的取代：第97位的His被Ser或Pro取代；第100位的Trp被Gln、Ala或Leu取代；第101位的Ala被Thr或Val取代；第102位的Ser被Arg取代；第103位的Gly被Ala取代；第105位的Glu被Gln取代；第106位的Thr被Lys或Ser取代；第107位的Leu被Pro取代；第108位的Asp被Glu取代；或第111位的Gly被Asp取代。

[00152]在另一实施方案中，瘦蛋白的序列是：Val Pro Ile GlnLys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr IleVal Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Xaa Gln Ser ValSer Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile ProGly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr LeuAla Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg AsnVal Ile Gln Ile Xaa Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp LeuLeu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu ProTrp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu AlaSer Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu GlnAsp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中第27位的Xaa是Thr或Ala；第77位的Xaa是Ser或Ala；第118位的Xaa是Gly或Leu；所述蛋白具有至少一个取代，优选具有1-5个取代，最优选1-2个取代，所述取代选自下组：第97位的His被Ser取代；第100位的Trp被Gln取代；第101位的Ala被Thr取代；第105位的Glu被Gln取代；第106位的Thr被Lys取代；第107位的Leu被Pro取代；第108位的Asp被Glu取代；或第111位的Gly被Asp取代。在上述序列的进一步的实施方案中，第27位的Xaa是Thr；第77位的Xaa是Ser；第118位的Xaa是Gly；并且第97、100、101、105、106、107、108和111位的氨基酸残基如下表所示：

	97	100	101	105	106	107	108	111
									天然的人瘦蛋白	His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
										His	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
	His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
										His	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
										His	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
	His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
										His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
	Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
										Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
	Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
										Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
										Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
										His	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
	His	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
										His	Gln	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
	His	Gln	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
										His	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly

	His	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
										His	Trp	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
	His	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
										His	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
	His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
										His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
	His	Trp	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly
										His	Trp	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly
	His	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
										His	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp
	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
										His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
										His	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
	His	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
										His	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
	Ser	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Gly
										Ser	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
	Ser	Gln	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
										Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
	Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
										Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
	Ser	Trp	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
										Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
										Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp

	Ser	Trp	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly
										Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly
	Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
										Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp
	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
										Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
										Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
	Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
										Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
	His	Gln	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
										His	Gln	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
	His	Gln	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
										His	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
	His	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
										His	Gln	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly
	His	Gln	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly
										His	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
	His	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp
										His	Gln	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
	His	Gln	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
										His	Gln	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
	His	Gln	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
										His	Gln	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
	His	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
										His	Trp	Thr	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly
	His	Trp	Thr	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly

	His	Trp	Thr	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
										His	Trp	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp
	His	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
										His	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
	His	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
										His	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
	His	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
										His	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
	His	Trp	Ala	Gln	Lys	Pro	Asp	Gly
										His	Trp	Ala	Gln	Lys	Leu	Glu	Gly
	His	Trp	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Asp
										His	Trp	Ala	Gln	Thr	Pro	Glu	Gly
	His	Trp	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Asp
										His	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Asp
	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
										His	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
	His	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
										His	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
	Ser	Gln	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Gly
										Ser	Gln	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Gly
	Ser	Gln	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Gly
										Ser	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Gly
	Ser	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Asp	Asp
										Ser	Gln	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly
	Ser	Gln	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly
										Ser	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
	Ser	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp

	Ser	Gln	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
										Ser	Gln	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
	Ser	Gln	Ala	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
										Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
	Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
										Ser	Gln	Ala	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
	Ser	Trp	Thr	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly
										Ser	Trp	Thr	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly
	Ser	Trp	Thr	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
										Ser	Trp	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp
	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
										Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
	Ser	Trp	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
										Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
	Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
										Ser	Trp	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
	Ser	Trp	Ala	Gln	Lys	Pro	Asp	Gly
										Ser	Trp	Ala	Gln	Lys	Leu	Glu	Gly
	Ser	Trp	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Asp
										Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Pro	Glu	Gly
	Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Asp
										Ser	Trp	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Asp
	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Glu	Gly
										Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Pro	Asp	Asp
	Ser	Trp	Ala	Glu	Lys	Leu	Glu	Asp
										Ser	Trp	Ala	Glu	Thr	Pro	Glu	Asp
	His	Gln	Thr	Gln	Lys	Leu	Asp	Gly

	His	Gln	Thr	Gln	Thr	Pro	Asp	Gly
										His	Gln	Thr	Gln	Thr	Leu	Glu	Gly
	His	Gln	Thr	Gln	Thr	Leu	Asp	Asp
										His	Gln	Thr	Glu	Lys	Pro	Asp	Gly
	His	Gln	Thr	Glu	Lys	Leu	Glu	Gly
										His	Gln	Thr	Glu	Lys	Leu	Asp	Asp
	His	Gln	Thr	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly
										His	Gln	Thr	Glu	Thr	Pro	Asp	Asp
	His	Gln	Thr	Glu	Thr	Leu	Glu	Asp
										His	Gln	Ala	Gln	Lys	Pro	Asp	Gly
	His	Gln	Ala	Gln	Lys	Leu	Glu	Gly
										His	Gln	Ala	Gln	Lys	Leu	Asp	Asp
	His	Gln	Ala	Gln	Thr	Pro	Glu	Gly
										His	Gln	Ala	Gln	Thr	Pro	Asp	Asp
	His	Gln	Ala	Gln	Thr	Leu	Glu	Asp

[00153]在一个实施方案中，瘦蛋白的序列是：Ile Pro Gly Leu HisPro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa XaaIle Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Xaa Ile Ser Xaa Asp Leu GluXaa Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu ProXaa Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala SerGly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa AspXaa Leu Xaa Xaa Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys，其中第13位的Xaa是Ile、Leu、Met或甲硫氨酸亚砜；第15位的Xaa是Gln或Glu；第21位的Xaa是Gln或Glu；第22位的Xaa是Gln或Glu；第27位的Xaa是Ile、Leu、Met或甲硫氨酸亚砜；第31位的Xaa是Asn、Asp或Gln；第34位的Xaa是Gln或Glu；第37位的Xaa是Asn、Asp或Gln；第41位的Xaa是Asn、Asp或Gln；第59位的Xaa是Trp或Gln；第89位的Xaa是Gln或Glu；第93位的Xaa是Gln或Glu；第95位的Xaa是Ile、Leu、Met或甲硫氨酸亚砜；第97位的Xaa是Trp或Gln；第98位的Xaa是Gln或Glu。在另一实施方案中，上式的瘦蛋白中第13位的Xaa是Met；第15位的Xaa是Gln；第21位的Xaa是Gln；第22位的Xaa是Gln；第27位的Xaa是Met；第31位的Xaa是Asn；第34位的Xaa是Gln；第37位的Xaa是Asn；第41位的Xaa是Asn；第59位的Xaa是Trp；第89位的Xaa是Gln；第93位的Xaa是Gln；第95位的Xaa是Met；第97位的Xaa是Trp；并且第98位的Xaa是Gln。参见美国专利5532336。

[00154]示例性的瘦蛋白类似物包括这样的类似物：其中第43位的氨基酸被Asp或Glu取代；第48位的氨基酸被Ala取代；第49位的氨基酸被Glu取代或缺失；第75位的氨基酸被Ala取代；第89位的氨基酸被Leu取代；第93位的氨基酸被Asp或Glu取代；第98位的氨基酸被Ala取代；第117位的氨基酸被Ser取代，第139位的氨基酸被Leu取代，第167位的氨基酸被Ser取代，或其任意组合

[00155]某些具有瘦蛋白活性的示例性瘦蛋白和瘦蛋白类似物包括：

SEQ ID：
		151	43Asp-瘦蛋白
152	43Glu-瘦蛋白
		153	48Ala-瘦蛋白
154	49Glu-瘦蛋白
		155	49Des-AA-瘦蛋白
156	75Ala-瘦蛋白
		157	89Leu-瘦蛋白
158	93Asp-瘦蛋白
		159	93Glu-瘦蛋白
160	98Ala-瘦蛋白
		161	117Ser-瘦蛋白
162	139Leu-瘦蛋白
		163	167Ser-瘦蛋白

164	43Asp，49Glu-瘦蛋白
		165	43Asp，75Ala-瘦蛋白
166	89Leu，117Ser-瘦蛋白
		167	93Glu，167Ser-瘦蛋白

PPF家族

[00156]用于本发明的组分肽激素还包括PPF肽激素，包括PP和PYY。天然PPF肽激素是本领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些优选的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知PPF家族肽都可连同本发明一起使用。

[00157]本领域已知的任何PPF类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，PPF类似物和衍生物具有天然PPF多肽的至少一种激素活性。在某些实施方案中，PPF类似物是天然PPF多肽能够特异性结合的受体的激动剂。优选的PPF类似物和衍生物包括描述于WO 03/026591和WO 03/057235的物质，这些文献通过引用整体结合到本文中。

[00158]在一个实施方案中，具有至少一种PPF激素活性的优选PPF类似物和衍生物一般包含至少两个PYY基序，包括聚脯氨酸基序和C-末端尾基序。这样的类似物一般描述于2004年2月11日提交的美国临时申请第60/543,406号，该申请于2006年6月22日公开为2006/013547A1，其通过引用结合到本文中。其它优选的PPF类似物公开于名称为“胰腺多肽家族基序和包含其的多肽”的PCT/US2005/004351，该申请于2005年8月25日公开为WO2005/077094，其内容通过引用结合到本文中。其它优选的PPF类似物公开于名称为“胰腺多肽家族基序、包含其的多肽和方法”的PCT/US2005/045471，该申请2006年6月22日公开为WO2006/066024，其内容通过引用结合到本文中。作为背景，研究已提示，Y受体结合亲和性的差异与二级和三级结构差异有关。参见例如Keire等，Biochemistry 2000，39，9935-9942。天然猪PYY已表征为包含由残基23、24和25处的结分隔的残基17至22和25至33两个C-末端螺旋节段、以残基12-14为中心的转角以及在残基30和31附近折叠的N-末端。此外，全长猪PYY已表征为包含PP折叠，由N-末端和C-末端残基中的疏水相互作用稳定。参见上文出处。

[00159]“PYY”基序一般为天然PP家族多肽的一级、二级或三级结构组件，其对生物活性是关键性的，即生物活性在基序缺失或紊乱时显著下降。优选的PYY基序包括天然PP家族多肽的N-末端聚脯氨酸II型基序、天然PP家族多肽的II型β-转角基序、在天然PP家族多肽C末端的α-螺旋基序和天然PP家族多肽的C-末端尾基序。更具体地说，在N-末端聚脯氨酸区中，对应于天然PP家族多肽的残基5和8的氨基酸一般保守为脯氨酸。II型β-转角基序一般包括对应于天然PP家族多肽的残基12-14的氨基酸。α-螺旋基序一般可由对应于天然PP家族多肽的大约残基14的氨基酸延伸至任意点，直到C末端并包含C末端，只要α-螺旋基序包含足够数目的氨基酸残基，使得在溶液中形成α-螺旋转角。α-螺旋基序还可包含对天然PP家族组列的氨基酸取代、插入和缺失，只要α-螺旋转角仍在溶液中形成。C-末端尾基序一般包含对应于天然PP家族多肽最后约10个残基的氨基酸，更优选为天然PP家族多肽的最后7、6或5个残基，更优选为氨基酸残基32-35。

[00160]优选的PYY类似物包括在不对应于聚脯氨酸基序和/或C-末端尾基序的PYY分子区域中具有内部缺失、插入和取代的类似物。例如，预期在4、6、7、9或10位内部缺失。

[00161]在特别感兴趣的另一实施方案中，组分激素是含有至少两个PPF基序的PPF多肽，所述PPF基序至少包括N-末端聚脯氨酸PPF基序和C-末端尾PPF基序。如本文中用到的，“基序”是指特定生物化学功能的特征性氨基酸序列，或限定独立折叠的结构域的氨基酸序列。其它PPF基序可以对应于任何PP家族多肽，包括PP、PYY和NPY的基序，例如PYY的II型-转角区基序或PYY的C-末端的α-螺旋基序。

[00162]在另一实施方案中，PPF家族组分组件是PPF嵌合多肽，其包含PP、PYY或NPY多肽的片段，所述片段共价连接于第二PP、PYY或NPY多肽的至少一个额外的片段，其中每个PP、PYY或NPY片段都包括PPF基序。或者，PPF嵌合多肽可以包含PP家族多肽的片段，所述片段连接于1、2、3或4个多肽区段，其中至少一个所述连接的多肽区段是第二PP家族多肽的片段。在某些实施方案中，PPF多肽不包括具有C-末端NPY片段的N-末端PP片段。PPF嵌合多肽组分组件将与天然PYY(3-36)在PYY(3-36)的全长上具有至少50％序列同一性。在一些实施方案中，所述PPF嵌合多肽组分组件可以与天然PYY(3-36)在PYY(3-36)的全长上具有至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。所述PPF嵌合多肽可以与天然PP具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。在另一实施方案中，所述PPF嵌合多肽可以与天然NPY具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，PPF嵌合多肽可以至少包括N-末端聚脯氨酸PPF基序和C-末端尾PPF基序。这些PPF嵌合体以及其它PYY和PP类似物描述于2006年6月22日公开的US2006/013547A1中。在一种实施方案中，任何PPF家族肽，如果不包含为杂合组分，则可以提供为第二试剂，例如作为第二抗肥胖剂，同时提供本文描述的杂合体。

[00163]同样，PPF嵌合多肽通常将保留天然人PP、PYY或NPY的至少一部分生物活性。在一些实施方案中，PPF嵌合多肽在代谢状况和障碍的治疗和预防中具有生物活性。

[00164]PPF嵌合体的多肽片段可以通过本领域已知的任何方式共价连接在一起，包括但不限于直接酰胺键或化学接头基团。化学接头基团可以包括诱导或稳定多肽构象的肽模拟物。PPF嵌合多肽包括PYY-PP，PYY-NPY，PP-PYY，PP-NPY，NPY-PP或NPY-PYY嵌合体。

[00165]PPF嵌合体的长度可以是至少21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34个氨基酸。在一些实施方案中，PYY类似物多肽仅仅包括天然L氨基酸残基和/或修饰的天然L氨基酸残基。在一些实施方案中，PYY类似物不包括非天然氨基酸残基。

[00166]在一些实施方案中，PPF嵌合多肽包括：hPP(1-7)-pNPY，hPP(1-17)-pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro³⁴pNPY，hPP(19-23)-His³⁴pNPY，rPP(19-23)-pNPY，rPP(19-23)-Pro³⁴pNPY，rPP(19-23)-His³⁴pNPY，hPP(1-17)-His³⁴pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-NPY(19-23)-His³⁴hPP，hPP(1-17)-His³⁴pNPY，hPP(19-23)-pNPY，hPP(19-23)-Pro³⁴pNPY，pNPY(1-7)-hPP，pNPY(19-23)-hPP，pNPY(19-23)-Gln³⁴hPP，pNPY(19-23)-His³⁴hPP，pNPY(19-23)-Phe⁶Gln³⁴hPP，pNPY(19-23)-Phe⁶His³⁴hPP，pNPY(1-7，19-23)-hPP，pNPY(1-7，19-23)-Gln³⁴hPP，cPP(20-23)-Pro³⁴-pNPY，cPP(21-23)-Pro³⁴-pNPY，cPP(22-23)-Pro³⁴-pNPY，cPP(1-7)-Pro³⁴-pNPY，cPP(20-23)-Pro³⁴-pNPY，cPP(1-7，20-23)-Pro³⁴-pNPY，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His³⁴hPP，cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala³¹Aib³²Gln³⁴-hPP，cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala³¹Aib³²His³⁴-hPP    hPP(1-7)-Ala³¹Aib³²-pNPY，hPP(1-17)-Ala³¹Aib³²-pNPY，pNPY(1-7)-Ala³¹Aib³²Gln³⁴-hPP，或pNPY(1-7，19-23)-Ala³¹Aib³²Gln³⁴-hPP。

[00167]在一些实施方案中，PPF嵌合多肽可以包含PP家族类似物多肽的片段。例如，PPF嵌合多肽可以包含本文描述的PPF类似物多肽，以及PP类似物多肽，和NPY类似物多肽。

[00168]用于本发明的杂合体中或作为第二试剂的PYY类似物多肽是在本文描述的测定(包括食物摄取、胃排空、胰腺分泌、身体组成或体重降低测定)之一中的效能等于或大于相同测定中NPY、PYY或PYY(3-36)的效能的那些。在一些实施方案中，PPY类似物多肽可以用于治疗代谢疾病，例如肥胖、胰岛素抵抗综合征(综合征X)或糖尿病。在一些实施方案中，PYY类似物多肽与PP，NPY，PYY或PYY(3-36)相比可以具有改进的易生产性、稳定性和/或易配制性。

[00169]在一些实施方案中，PPF嵌合多肽保留了天然人PYY在减少营养物利用、减少食物摄取、体重增加作用和/或治疗和预防代谢状况和障碍方面的至少约25％，或约30％，约40，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，约98％或约99％的生物活性。在另一实施方案中，PPF嵌合多肽具有改进的PYY激动剂活性。在一些实施方案中，PPF嵌合多肽具有天然人PYY在减少营养物利用、减少食物摄取、体重增加作用和/或治疗和预防代谢状况和障碍方面的至少约110％，约125％，约130％，约140％，约150％，约200％或更多的生物活性。

[00170]更特别地，一方面，PPF嵌合多肽包含连接于PYY片段的PP片段。在一个实施方案中，PPF嵌合多肽包含PP或PP类似物多肽的N-末端片段，其在C-末端与PYY或PYY类似物多肽的C-末端片段连接。在另一实施方案中，PPF嵌合多肽包含PYY、PYY(3-36)或PYY类似物多肽的N-末端片段，其在C-末端与PP或PP类似物多肽的C-末端片段连接。

[00171]在一些实施方案中，PPF嵌合多肽包含连接于NPY片段的PYY片段。在一个实施方案中，PPF嵌合多肽包含PYY、PYY(3-36)或PYY类似物多肽的N-末端片段，其在C-末端与NPY或NPY类似物多肽的C-末端片段连接。在另一实施方案中，PPF嵌合多肽包含NPY或NPY类似物多肽的N-末端片段，其在C-末端与PYY或PYY类似物多肽的C-末端片段连接。

[00172]在一些实施方案中，PPF嵌合多肽包含连接于NPY片段的PP片段。在一个实施方案中，PPF嵌合多肽包含PP或PP类似物多肽的N-末端片段，其在C-末端与NPY或NPY类似物多肽的C-末端片段连接。在另一实施方案中，PPF嵌合多肽包含NPY或NPY类似物多肽的N-末端片段，其在C-末端与PP或PP类似物多肽的C-末端片段连接。

[00173]在一些实施方案中，PP、PP类似物多肽、PYY、PYY(3-36)、PYY类似物多肽、NPY或NPY类似物多肽的片段是包含PP、PP类似物多肽、PYY、PYY(3-36)、PYY类似物多肽、NPY或NPY类似物在任何位置的4-20个氨基酸残基的片段。在一些实施方案中，选择片段的长度，从而获得长度为至少34个氨基酸的最终PPF嵌合多肽。

[00174]PPF嵌合多肽也可以包含其它修饰，包括但不限于对所述PPF嵌合多肽的氨基酸序列的取代、缺失和插入及其任意组合。在一些实施方案中，PPF嵌合多肽包括“非必需”氨基酸残基的一种或多种修饰。“非必需”氨基酸残基为在天然人氨基酸序列中可改变(即缺失或取代)而不消除或基本不降低感兴趣的活性的残基。

[00175]PPF嵌合多肽的衍生物也是有用的。这样的衍生物包括缀合至一个或多个水溶性聚合物分子(例如聚乙二醇(“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰、油酰等))或加入聚氨基酸(例如聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸和聚丙氨酸)的PPF嵌合多肽。对PPF嵌合多肽的修饰还可包括小分子取代基，例如短烷基和约束烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和芳基。水溶性聚合物分子优选具有约500至约20,000Da的分子量。

[00176]这样的聚合物缀合和小分子取代基修饰可单独地发生在PPF嵌合多肽序列中的N-末端或C-末端或氨基酸残基的侧链上，其不参与杂合体的形成。或者，沿着PPF嵌合多肽可有多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代一个或多个氨基酸可提供另外的衍生化位点。参见例如美国专利第5,824,784号和5,824,778号。优选地，PPF嵌合多肽可缀合至1、2或3个聚合物分子。

[00177]在一些实施方案中，水溶性聚合物分子连接至氨基、羧基或巯基，并且可连接在N末端或C末端或赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链上。或者，水溶性聚合物分子可与二胺基和二羧基连接。在一些实施方案中，PPF嵌合多肽通过赖氨酸上的ε氨基缀合1、2或3个PEG分子。

[00178]PPF嵌合多肽还包括一个或多个氨基酸残基具有化学改变的PPF嵌合多肽。这样的化学改变包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可单独地发生在PPF嵌合多肽序列中的N-末端或C-末端或氨基酸残基的侧链上。在一个实施方案中，这些多肽的C-末端可具有游离-OH或-NH₂基团。在另一个实施方案中，N-末端可用异丁氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、乙氧基羰基、异己酰基(isocap)、辛烷基、辛基甘氨酸基(G(Oct))或8-氨基辛酸基加帽。在一些实施方案中，可通过形成二硫键环化。或者，沿着PYY类似物多肽可有多个化学改变位点。

[00179]在一些实施方案中，PPF嵌合多肽包括具有US2006/013547A1的SEQ ID NOs.238-347的氨基酸序列的那些。

[00180]示例性PPF嵌合多肽包括式(VI)的多肽：

Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Pro Glu Xaa₇Pro Xaa₉Glu

Asp Xaa₁₂Xaa₁₃Xaa₁₄Glu Xaa₁₆Xaa₁₇Xaa₁₈Xaa₁₉Tyr

Xaa₂₁Xaa₂₂Xaa₂₃Leu Xaa₂₅Xaa₂₆Tyr Xaa₂₈Asn Xaa₃₀

Xaa₃₁Thr Arg Gln Xaa₃₅Xaa₃₆

其中：

Xaa₁是Tyr或不存在；

Xaa₂是Ile、Pro或不存在；

Xaa₃是Ile、BH-修饰的Lys、Lys、Val或Pro；

Xaa₄是Lys、BH-修饰的Lys、Ala、Ser或Arg；

Xaa₇是Ala、Gly或His；

Xaa₉是Gly或Ala；

Xaa₁₂是Ala或Pro；

Xaa₁₃是Ser或Pro；

Xaa₁₄是Pro、Ala或Ser；

Xaa₁₆是Glu或Asp；

Xaa₁₇是Leu或Ile；

Xaa₁₈是Asn或Ala；

Xaa₁₉是Arg、Lys、BH-修饰的Lys、Gln或N(Me)Ala；

Xaa₂₁是Tyr、Ala、Phe、Lys或BH-修饰的Lys；

Xaa₂₂是Ala或Ser；

Xaa₂₃是Ser、Ala或Asp；

Xaa₂₅是Arg、Lys或BH-修饰的Lys；

Xaa₂₆是His、Ala或Arg；

Xaa₂₈是Leu或Ile；

Xaa₃₀是Leu或Met；

Xaa₃₁是Val、Ile或Leu；

Xaa₃₅是Lys、BH-修饰的Lys或Arg；并且

Xaa₃₆是Tyr、Trp或Phe。

[00181]在一个实施方案中，式VI的PPF多肽可以是天然的PPF多肽，PYY(2-36)，Val3hPYY(3-36)，Lys25hPYY(3-36)，Lys25Ile28hPYY(3-36)，Lys25Ile31hPYY(3-36)，Lys25Leu31hPYY(3-36)，Lys25Phe36hPYY(3-36)，Ile28hPYY(3-36)，Ile31hPYY(3-36)，Leu31hPYY(3-36)，Phe36hPYY(3-36)，Leu31Phe36hPYY(3-36)或Pro13Ala14hPYY。

[00182]如本领域技术人员可以理解的，式VI的多肽可以是游离酸形式，或可以是C-末端酰胺化的。

[00183]在一些实施方案中，PPF多肽可以包含基本由天然人PYY(Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu LeuAsn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg GlnArg Tyr)的前17个氨基酸残基组成的N-末端片段，该片段连接于基本由天然人NPY(Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro AlaGlu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile ThrArg Gln Arg Tyr)的氨基酸残基18-36组成的C-末端片段，其中PYY片段的N-末端的一个或多个氨基酸残基可以缺失或不存在，并且其中在PYY和NPY片段中的每一个片段中进行1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一些实施方案中，基本由PPF多肽的前17个氨基酸组成的N-末端片段可以与天然PYY的前17个氨基酸具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，基本由氨基酸残基18-36组成的PPF多肽的C-末端片段可以与天然NPY的氨基酸18-36具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，PPY的N-末端片段中的氨基酸(如第5和8位的脯氨酸，第6、10和15位的谷氨酸，或第11位的天冬氨酸)，和/或NPY的C-末端片段中的氨基酸(如第20和27位的酪氨酸、第24位的亮氨酸，第29位的天冬酰胺，第32位的苏氨酸，第33位的精氨酸，或第34位的谷氨酰胺)不被取代。在一些实施方案中，PPF多肽包括具有US2006/013547A1的SEQ ID Nos.266，267，274，282，320和436-480的氨基酸序列的那些。在一些实施方案中，PPF多肽进一步包括N-末端帽。这些PPF多肽的实例包括US2006/013547A1的SEQ ID NOs：282，320，437，441，444，445-447，452，454-459，461-464，466，468-470和472-480。

[00184]其它PPF多肽包括式(VII)的多肽：

Xaa₁Xaa₂Pro Xaa₄Pro Xaa₆His Pro Xaa₉Xaa₁₀

Xaa₁₁Xaa₁₂Xaa₁₃Xaa₁₄Xaa₁₅Xaa₁₆Xaa₁₇Ala Xaa₁₉Tyr

Xaa₂₁Xaa₂₂Xaa₂₃Leu Xaa₂₅Xaa₂₆Xaa₂₇Xaa₂₈Xaa₂₉Xaa₃₀

Xaa₃₁Thr Arg Gln Arg Tyr

其中：

Xaa₁是Tyr或不存在；

Xaa₂是Ile、Pro或不存在；

Xaa₄是Lys、BH-修饰的Lys、Ala、Ser或Arg；

Xaa₆是Glu、Gln、Ala、Asn、Asp或Val；

Xaa₉是Gly或Ala；

Xaa_10是Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Gly、Pro或Aib；

Xaa_11是Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Gly、Pro或Aib；

Xaa₁₂是Ala或Pro；

Xaa₁₃是Ser或Pro；

Xaa₁₄是Pro、Ala或Ser；

Xaa₁₅是Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Gly、Pro或Aib；

Xaa₁₆是Glu或Asp；

Xaa₁₇是Leu或Ile；

Xaa₁₉是Arg、Lys、BH-修饰的Lys、Gln或N(Me)Ala；

Xaa₂₁是Tyr、Ala、Phe、Lys或BH-修饰的Lys；

Xaa₂₂是Ala或Ser；

Xaa₂₃是Ser、Ala或Asp；

Xaa₂₅是Arg、Lys或BH-修饰的Lys；

Xaa₂₆是His、Ala或Arg；

Xaa₂₇是Tyr或Phe；

Xaa₂₈是Leu或Ile；

Xaa₂₉是Asn或Gln；

Xaa₃₀是Leu或Met；并且

Xaa₃₁是Val、Ile或Leu。

[00185]如本领域技术人员可以理解的，式VII的多肽可以是游离酸形式，或可以是C-末端酰胺化的。

[00186]在一些实施方案中，PPF多肽可以包含基本由天然人PYY(US2006/013547A1的SEQ ID NO：2)的前17个氨基酸残基组成的N-末端片段，该片段连接于基本由天然人NPY(US2006/013547A1的SEQ ID NO：4)的氨基酸残基18-36组成的C-末端片段，其中PYY片段的N-末端的一个或多个氨基酸残基可以缺失或不存在，并且其中在PYY和NPY片段中的每一个片段中进行1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一些实施方案中，基本由PPF多肽的前17个氨基酸组成的N-末端片段可以与天然PYY的前17个氨基酸具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，基本由氨基酸残基18-36组成的PPF多肽的C-末端片段可以与天然NPY的氨基酸18-36具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少92％，至少94％或至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，PPY的N-末端片段中的氨基酸(如第3、5和8位的脯氨酸或第7位的组氨酸)，和/或NPY的C-末端片段中的氨基酸(如第18位的丙氨酸，20和36位的酪氨酸，第24位的亮氨酸，第32位的苏氨酸，第33位的精氨酸，第34位的谷氨酰胺或第35位的精氨酸)不被取代。在一些实施方案中，PPF多肽包括具有例如US 2006/013547A1的SEQ ID Nos.266，437，438，439，442，462，469，470，471和472的PYY-NPY嵌合体的氨基酸序列的那些，或具有氨基酸序列Ile，Lys，Pro，Glu，His，Pro，Gly，Glu，Asp，Ala，Ser，Pro，Glu，Glu，Leu，Ala，Arg，Tyr，Tyr，Ala，Ser，Leu，Arg，Ala，Tyr，Ile，Asn，Leu，Ile，Thr，Arg，Gln，Arg，Tyr-NH2的化合物。在一些实施方案中，PPF多肽进一步包含N-末端帽。这些PPF多肽的实例包括US2006/013547A1的SEQ ID NOs：437，462，469，470和472。例如，US2006/013547A1的序列438是Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Glu Asp AlaSer Pro Glu Glu Leu Ala Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Ala Tyr Ile Asn LeuIle Thr Arg Gln Arg Tyr。在一种实施方案中，本发明的杂合体包括US2006/013547A1的序列438作为一种组分，特别是在用于治疗肥胖、减轻体重、减少或重新分布脂肪和减少热量摄取的杂合体中。所述杂合体也可以包含胰淀素模拟组分或瘦蛋白组分或这两者。

[00187]当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于包括改变受试者的身体组成的方法中，该方法包括施用受试者化合物(单独或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分的PPF多肽或PPF嵌合体)，其中该化合物改变脂肪与瘦组织的比例，从而改变身体组成。PPF多肽可以包含选自US2006/013547A1中命名为5705以及具有以下序列的PYY-NPY嵌合体：SEQ ID NOs：266，267，274，282，320，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479和480。在一个实施方案中，体脂减少而保持或增加身体瘦组织质量。在一个实施方案中，身体脂肪和身体瘦组织质量分别测量为体脂百分比和身体瘦组织质量百分比。在一个进一步的实施方案中，减轻体重。在另一实施方案中，保持或增加体重。可以外周施用化合物。PPF多肽或PPF嵌合体或含PPF的杂合体可以用于一种方法，该方法进一步包括施用受试者至少一种选自下组的其它试剂：胰淀素、胰淀素激动剂或胰淀素类似物激动剂、鲑鱼降钙素、缩胆囊素(CCK)或CCK激动剂、瘦蛋白(OB蛋白)或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物激动剂、GLP-1、GLP-1激动剂或GLP-1类似物激动剂、CCK或CCK激动剂、降钙素、降钙素激动剂、小分子大麻素(cannabinoid)CB1受体激动剂、利莫那班、11β-羟基类固醇脱氢酶-1抑制剂、西布茶明和苯丁胺。在一个实施方案中，受试者是超重或肥胖的。在另一实施方案中，当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于包括优先降低受试者中的血浆甘油三酯水平的方法中，该方法包括施用受害者有效降低血浆甘油三酯水平的量的化合物，其中胆固醇水平降低的程度较低。在进一步的实施方案中，降低甘油三酯水平而不降低LDL胆固醇水平。在进一步的实施方案中，降低甘油三酯水平而LDL胆固醇水平降低的程度较低。在进一步的实施方案中，淀粉酶水平也降低。在另一实施方案中，当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于减少体脂或体脂增加同时保持或增加身体瘦组织质量的方法中，该方法包括施用受试者有效减少体脂或减少体脂增加同时保持或增加身体瘦组织质量的量的化合物。在另一实施方案中，当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于包括减少受试者中的内脏体脂的方法中，该方法包括施用受试者有效减少内脏体脂并且保持或增加身体瘦组织质量的量的化合物。在另一实施方案中，当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于包括改变受试者的脂肪分布的方法中。一方面，所述改变由受试者中的内脏或异位脂肪或这两者的代谢增加导致。在另一实施方案中，当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于包括增加脂肪酸β-氧化同时保持或增加身体瘦组织质量的方法中，该方法包括施用受试者有效增加脂肪酸β-氧化同时保持或增加身体瘦组织质量的量的化合物。在另一实施方案中，当单独使用或作为第二试剂或作为本发明的杂合体的组分时，PPF多肽和PPF嵌合体可以用于包括治疗非酒精性肝硬变或脂肪代谢障碍的方法中，该方法包括施用受试者有效治疗非酒精性肝硬变或脂肪代谢障碍的量的化合物。上述用途中的特别感兴趣的杂合体包括上文描述的PPF嵌合体与来自瘦蛋白家族或胰岛素家族的组分，如胰淀素-sCT-胰淀素杂合体或这两者的组合。PPF-嵌合体/瘦蛋白杂合体或PPF-嵌合体/胰淀素-sCT-胰淀素杂合体将提供优于任何单独化合物的作用。在另外的进一步的实施方案中，PPF-嵌合体/瘦蛋白杂合体与胰淀素模拟物如胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体一起施用，或PPF-嵌合体/胰淀素-sCT-胰淀素杂合体与瘦蛋白一起施用。

[00188]当不是杂合体的组分组件时，本文提到的PPF多肽嵌合体可以单独或作为第二试剂施用，优选与本发明的杂合体组合。它们可以在有或没用药学可接受的载体或赋形剂的条件下以单或多剂提供。可以根据常规技术，如公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin中的那些，将这些药物化合物与药学可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂一起配制。也参见Wang，Y.J.和Hanson，M.A.″Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stability andStabilizers，″Journal of Parenteral Science and Technology，TechnicalReport No.10，Supp.42：2S(1988)，所述文献通过引用整体结合到本文中。可以以剂量单位形式提供PPF多肽。例如，影响身体组成的治疗有效量的PPF多肽可以根据很多因素而改变，包括患者的年龄和体重、患者的身体状况、它们与其它治疗的组合使用、要实现的最终目的，例如总体体重减轻和/或保持或增加身体瘦组织质量，以及其它因素。但是，典型剂量(当不是杂合体的组分时)可以含有从每日约0.05μg，约0.1μg，约1μg，约5μg，约10μg，约50μg，约75μg或约100μg药物化合物的下限到约50μg，约100μg，约500μg，约1mg，约5mg，约10mg，约15mg，约50mg，约100mg或约150mg药物化合物的上限。也考虑其它剂量范围，如每剂0.1μg-1mg化合物，或每剂约0.001μg/kg-约500μg/kg。在一些实施方案中，以单次或分开的剂量或受控的连续释放，外周施用剂量为每日约0.5μg-约5mg的PPF多肽嵌合体，或每剂约0.01μg/kg-约500μg/kg，或约0.05μg/kg-约250μg/kg。在一些实施方案中，以低于约50μg/kg的剂量施用PPF多肽嵌合体。这些范围内的剂量将根据每个类似物或衍生物的效能改变，当然，本领域技术人员可以容易地确定。可以用分散的单位剂量送递每日剂量，在24小时的阶段中或该24小时的任何部分连续提供。每日的剂数可以是每日1-约4剂，但也可以更多。连续送递可以是连续输注的形式。其它考虑的示例剂量和输注速度包括每次分散的施用0.005nmol/kg-约20nmol/kg或连续输注中0.01/pmol/kg/分钟-约10pmol/kg/分钟。这些剂量和输注可以通过任何已知的常规或将来开发的外周方法送递，例如静脉内(i.v.)、皮内、肌内、乳腺内、腹膜内、鞘内、眶内、肺内(如期间释放)；皮内施用(s.c.)、口服、舌下、鼻内、肛门、阴道或经皮送递，或通过在特定部位的手术植入。静脉内施用的药物组合物的示例性总剂量/送递可以是每日约1μg-约8mg，而皮下施用的药物组合物的总剂量/送递可以是每日约6μg-约16mg。

肠降血糖素和肠降血糖素模拟物

[00189]用于本发明的组分肽激素还包括GLP-1肽激素。天然GLP-1肽激素，包括GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：59)、GLP-1(7-37)(SEQ IDNO：204)和GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：61)，是本领域已知的，功能肽类似物和衍生物也是已知的。本文使用的GLP-1指所有天然形式的GLP-1肽激素。本文描述了某些优选天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，本领域已知具有激素活性的任何已知GLP-1肽都可连同本发明一起使用。

[00190]本领域已知的任何GLP-1肽类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，GLP-1肽类似物和衍生物具有天然GLP-1肽的至少一种激素活性。在某些实施方案中，GLP-1肽类似物是天然GLP-1肽能够特异性结合的受体的激动剂。优选的GLP-1肽类似物和衍生物包括描述于例如WO 91/11457的物质，该文献通过引用结合到本文中。

[00191]本领域已知的GLP-1类似物包括：

SEQ ID：
		168	9Gln-GLP-1(7-37)
169	D-9Gln-GLP-1(7-37)
		170	16Thr-18Lys-GLP-1(7-37)
171	18Lys-GLP-1(7-37)
		172	8Gly-GLP-1(7-36)
173	9Gln-GLP-1(7-37)
		174	D-9Gln-GLP-1(7-37)
175	乙酰-9Lys-GLP-1(7-37)

176	9Thr-GLP-1(7-37)
		177	D-9Thr-GLP-1(7-37)
178	9Asn-GLP-1(7-37)
		179	D-9Asn-GLP-1(7-37)
180	22Ser23Arg24Arg26Gln-GLP-1(7-37)
		181	16Thr18Lys-GLP-1(7-37)
182	18Lys-GLP-1(7-37)
		183	23Arg-GLP-1(7-37)
184	24Arg-GLP-1(7-37)

[00192]如本领域所知，这样的GLP-1类似物优选酰胺化，但在本发明背景下，其可任选为酸形式，除非另有说明。

[00193]其它GLP-1类似物和衍生物公开于美国专利第5,545,618号，该专利通过引用结合到本文中。一组优选的GLP-1类似物和衍生物包括公开于美国专利第6,747,006号的物质，该专利通过引用整体结合到本文中。还设想了描述于美国专利第5,188,666号的分子在本发明中的用途，该专利特地通过引用结合到本文中。用于本发明的另一组分子包括描述于美国专利第5,512,549号的化合物，该专利特地通过引用结合到本文中。用于本发明的另一组优选的GLP-1化合物公开于WO91/11457，其通过引用结合到本文中

[00194]用于本发明的组分肽激素还包括GLP-2肽激素。天然GLP-2肽激素，例如大鼠GLP-2及其同源物，包括牛GLP-2、猪GLP-2、八齿鼠GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、仓鼠GLP-2、人GLP-2、虹鳟鱼GLP-2和鸡GLP-2，是本领域已知的，功能肽类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些优选的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知GLP-2肽都可连同本发明一起使用。

[00195]本领域已知的任何GLP-2肽类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，GLP-2肽类似物和衍生物具有天然GLP-2肽的至少一种激素活性。在某些实施方案中，GLP-2肽类似物是天然GLP-2肽能够特异性结合的受体的激动剂。优选的GLP-2肽类似物和衍生物包括描述于例如美国专利序号08/669,791和PCT申请PCT/CA97/00252的物质，这两个文献都通过引用结合到本文中。本领域已知的特异性GLP-2类似物包括：在2位改变或通过以Gly取代Ala赋予DPP-IV抗性的大鼠或人GLP-2。

[00196]用于本发明的组分肽激素还包括泌酸调节肽(OXM)肽激素。天然OXM肽激素是本领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些优选的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知OXM肽都可连同本发明一起使用。

[00197]本领域已知的任何OXM肽类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，OXM肽类似物和衍生物具有天然OXM肽的至少一种激素活性。在某些实施方案中，OXM肽类似物是天然OXM肽能够特异性结合的受体的激动剂。

[00198]用于本发明的组分肽激素还包括毒蜥外泌肽激素。天然毒蜥外泌肽激素是本领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些优选的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知毒蜥外泌肽都可连同本发明一起使用。

[00199]本领域已知的任何毒蜥外泌肽类似物或衍生物都可连同本发明一起使用。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽类似物和衍生物具有天然毒蜥外泌肽的至少一种激素活性。在某些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物是天然毒蜥外泌肽能够特异性结合的受体的激动剂。

[00200]示例的的毒蜥外泌肽类似物包括：

SEQ ID：
		185	14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4
186	5Ala，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4
		187	14Leu，22Ala，25Phe-毒蜥外泌肽-4

[00201]如本领域所知，这样的毒蜥外泌肽类似物优选酰胺化，但在本发明背景下，其可任选为酸形式，除非另有说明。

[00202]另外的示例性毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1998年8月6日提交的题为“Novel Exendin Agonist Compounds”的PCT申请序号PCT/US98/16387，其要求1997年8月8日提交的美国专利申请序号60/055,404的权益，这两个申请都通过引用结合到本文中。其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1998年11月13日提交的题为“NovelExendin Agonist Compounds”的PCT申请序号PCT/US98/24210，其要求1997年11月14日提交的美国临时专利申请第60/065,442号的权益，这两个申请都通过引用结合到本文中。再其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1998年11月13日提交的题为“Novel Exendin AgonistCompounds”的PCT申请序号PCT/US98/24273，其要求1997年11月14日提交的美国临时专利申请第60/066,029号的权益，这两个申请都通过引用结合到本文中。再其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1997年8月8日提交的题为“Methods for Regulating GastrointestinalActivity”的PCT申请序号PCT/US97/14199，其是1996年8月8日提交的美国专利申请序号08/694,954的部分继续申请，这两个申请都通过引用结合到本文中。再其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1998年1月7日提交的题为“Use of Exendins and Agonists Thereof for theReduction of Food Intake”的PCT申请序号PCT/US98/00449，其要求1997年1月7日提交的美国临时专利申请第60/034,905号的优先权，这两个申请都通过引用结合到本文中。再其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于2003年12月19日提交的题为“Compositions for the Treatmentand Prevention of Neuropathy”的US 2004/0209803A1，该申请通过引用结合到本文中。

[00203]利尿钠肽

利尿钠肽是由心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和C-型利钠肽(CNP)组成的激素家族。它们作为3种不同的前体激素原而合成和保存，它们是126氨基酸ANP，108氨基酸BNP，和104氨基酸CNP。它们分别由各自的基因编码，并具有不同的合成部位和调节机理。母体利尿钠肽序列包括：

SEQ IDNO：375	151氨基酸人ANP前激素原	MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRANPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSDPNEEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY
			SEQ IDNO：376	134氨基酸人BNP前激素原	MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRSHPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPRSPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH
SEQ IDNO：377	126氨基酸人CNP前CNP原	MHLSQLLACALLLTLLSLRPSEAKPGAPPKVPRTPPAEELAEPQAAGGGQKKGDKAPGGGGANLKGDRSRLLRDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC

[00204]ANP激素原的主要合成部位是心房肌细胞，它在那里合成为151个氨基酸的前激素原。在内质网中，从它的N末端去除25个氨基酸的信号肽，剩下126个氨基酸的ANP激素原(ProANP)，即ANP在心脏中的主要储存形式。所述激素原由4个有生物活性的肽段组成：氨基酸1-30(ProANF 1-30，也称作长效Na刺激剂)，31-67(ProANF 31-67，也称作血管扩张剂)，79-98(ProANF 79-98，也称作钾排泄剂)，和99-126(ANF，也称作心房利钠因子)。

[00205]BNP最初分离自猪脑，但是在人类中，它由左心室合成和分泌。序列分析揭示，preproBNP由134个残基组成，并切割成108个氨基酸的ProBNP。从ProBNP的C-末端切割32个氨基酸的序列，产生人BNP(77-108)，它是在血浆中的生理活性形式。

[00206]CNP是利尿钠肽系统的第三个成员，主要存在于人血管内皮细胞、肾、和猪脑中。高浓度的CNP也存在于人下丘脑和中脑中。在人类中，preproCNP是126个氨基酸的前体，通过从它的N-末端切割23个残基，加工成proCNP。该23个氨基酸的序列用作信号肽。从proCNP切割末端22(105-126)氨基酸，产生生物学上有活性形式的CNP。

[00207]尿舒张肽是利尿钠肽家族的一个肾-衍生的成员，从相同的ANP激素原形成，由氨基酸95-126组成。除了4氨基酸N末端延伸外，它与ANF(99-126)相同。尿舒张肽似乎是肾中钠和水处理的重要调节剂，以及充血性心力衰竭(CHF)患者的钠排泄的介导剂。

[00208]利尿钠肽通过结合靶细胞表面上的高亲和力受体，发挥它们的生物作用。已经分离了3种NPR亚型：NPR-A，NPR-B，和NPR-C。结果，在一个实施方案中，提供了筛选用于促尿钠排泄受体结合和/或激活的杂合体的方法。包含激素原变体的利尿钠肽，可以赋予本发明的杂合体许多利尿钠肽激素活性。在感兴趣的其它实施方案中，是促尿钠排泄拮抗剂杂合体。尿钠排泄是非常大量的钠向尿中的排泄。尿钠排泄类似于利尿(非常大量的尿的排泄)，不同之处是，在尿钠排泄中，尿是格外含盐的。尿钠排泄随着有些利尿剂和疾病(肾上腺疾病)而发生，可以导致失盐综合征，其特征在于，脱水、呕吐、低血压、和猝死的危险。外源施用ANP激素原的4种独立的循环肽(1-30，31-67，79-98，和99-126)，会产生体内血管舒张、利尿、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的抑制和增强的尿钠排泄和/或尿钾排泄。ProANF 1-30，ProANF 31-67和ANF 99-126各自具有促尿钠排泄、降低血压和利尿性质，ProANF 31-67和ANF 99-126对血压具有最大影响。ANP肽对钾体内稳态具有不同作用：ProANF 79-98会刺激钾排泄，而ProANF 31-67会通过抑制髓质收集管细胞中的Na/K ATP酶，避免钾流失。对ANF 99-126特异性的是，血管紧张素II-介导的醛固酮分泌的剂量-依赖性的抑制，而proANF31-67具有通过前列腺素的产生来诱导尿钠排泄的性质。

[00209]在正常人中，BNP会产生与ANF类似的生物作用。给正常人输注BNP，会使钠排泄增加2倍，使血浆肾素、血管紧张素II和醛固酮分泌减少50％，以及使血浆体积减少。

[00210]类似于其它利尿钠肽，CNP会诱导心血管作用，但是似乎不会介导任何肾作用。当在等同剂量的ANF，将CNP输注给麻醉的狗时，血浆cGMP升高，伴有平均值动脉压、右房压和心输出量的降低，但是肾小球滤过率、肾血流量和钠排泄减少。

[00211]利尿钠肽可以在心力衰竭中提供治疗益处。充血性心力衰竭(CHF)与加压素、内皮缩血管肽的增加有关，也与肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统的激活有关，会介导血管收缩、钠和水保持和负的血管和心脏重建模。除了心力衰竭患者的利尿钠肽水平升高外，还发生这些作用。在本发明的一个实施方案中，是杂合体，它提供增加的或治疗性血清水平的利尿钠肽活性，用于治疗或预防心脏相关疾病和状况，包括CHF。尽管正常个体中的ANF输注可以导致持续的钠排泄和尿流速率的增加，在心力衰竭患者中，可以得到明显有益的肾反应的减少。BNP输注会显著增加心力衰竭患者的钠排泄，并发挥显著有益的血液动力作用。相对于ANP，BNP的利尿和促尿钠排泄作用明显更大。BNP比ANP更缓慢地清除，并发挥其它作用，包括抑制醛固酮分泌和增加ANP的血清水平。BNP肽也可以提供有益的肺毛细血管楔压、全身血管阻力、右房压和收缩期血压的降低，和为有征候的CHF而住院的患者的心脏指数的升高。在代偿失调的心力衰竭患者中，利尿钠肽杂合体可以提供有益的肺毛细血管楔压和升高的呼吸困难评分的降低(呼吸困难是难以呼吸的不适感觉，通常与早期心力衰竭有关)。具有1、2或3种促尿钠排泄激素功能的杂合体，提供施用药学活性的组合物的方法，其可以用于预防和治疗性处理CHF患者，尤其是代偿失调的CHF患者、慢性CHF患者、和高血压患者。当经治疗有效阶段施用治疗有效剂量时，杂合体的利尿钠部分足以给这样的患者提供治疗有效量的利尿钠肽。

[00212]如本文讨论的，可以使用任一个家族的治疗有效的利尿钠肽或它们的类似物。有用的利尿钠肽包括，例如，心房利尿钠肽(ANP)，脑利尿钠肽(BNP或B-型利尿钠肽)和C-型利尿钠肽(CNP)。在本文引作参考的美国专利公开20010027181中，公开了有用形式的利尿钠肽的序列。ANP的实例包括人ANP(Kangawa等，BBRC 118：131(1984))或来自不同物种的那些，包括猪和大鼠ANP(Kangawa等，BBRC 121：585(1984))。这样的ANP包含28个氨基酸。这样的ANP可以作为具有ANP的环结构(基于Cys，形成二硫键)和连接该环结构的C-末端部分的肽来施用。这样的肽的一个实例是，具有ANP的7-位置至28-位置的氨基酸残基的肽，它提供在美国专利申请公开号20010027181中。另一个实例是蛙ANP。可以用于本发明的方法中的BNP的具体实例包括人BNP(hBNP)。人BNP包含32个氨基酸，并参与二硫键的形成(Sudoh等，BBRC 159：1420(1989))和美国专利号5,114,923，5,674,710，5,674,710，和5,948,761，它们各自引作参考。也已知且可以使用人以外的起源的各种BNP，包括猪BNP和大鼠BNP。另一个实例是鸡BNP。可以用于本发明的方法中的CNP的实例包括猪CNP。猪CNP包含22个氨基酸，并参与二硫键的形成，这与上述的ANP和BNP(Sudoh等，BBRC 168：863(1990))(人和大鼠具有相同的氨基酸序列)、鸡CNP(Arimura等，BBRC 174：142(1991))一样。也可以使用蛙CNP(Yoshihara等，BBRC173：591(1990)。如本文讨论的，根据需要，通过已知的方法，本领域技术人员可以将修饰(例如缺失、取代、添加或插入)和/或化学修饰应用于已知利尿钠肽氨基酸序列的氨基酸残基。得到的化合物具有作用于起始ANP、BNP或CNP的受体的活性。因此，具有该活性的类似物包含在根据本发明的方法使用的杂合体中。

[00213]在另一个实施方案中，具有一种或多种促尿钠排泄功能的杂合体可以用于治疗高血压。在一个实施方案中，促尿钠排泄杂合体对心率没有有害作用，且与心律失常无关。在一个实施方案中，所述杂合体具有至少1、2或3种利尿钠肽功能，例如，ANP和BNP活性。一种或多种促尿钠排泄激素功能可以与本文所述的任意其它激素功能或肽增强子相组合物。在另一个实施方案中，促尿钠排泄部分是比天然利尿钠肽更稳定的具有延长的体内半衰期的类似物。也预见到会阻止内源酶(例如NEP)的意外切割的类似物。含有促尿钠排泄的杂合体还进一步指向高血压降低，利尿诱因，尿钠排泄诱因，血管管道扩张或松弛，利尿钠肽受体(例如NPR-A)结合，肾的肾素分泌抑制，肾上腺的醛固酮分泌抑制，心血管疾病和病症的治疗，减少、终止或逆转充血性心力衰竭的心脏重建模，肾疾病和病症的治疗；缺血性中风的治疗或预防，和哮喘的治疗。可以将杂合体施用给会从诱导尿钠排泄、利尿和血管舒张获益的患者。可以单独地或与一种或多种下述类型的化合物组合地施用杂合体：ACE抑制剂，β-阻断剂，利尿剂，螺内酯，地高辛，抗凝剂和抗血小板剂，和血管紧缩素受体阻断剂。其它疾病或状况包括肾病症和疾病，哮喘，高血压和肺动脉高压。杂合体也可以用于治疗炎症-相关疾病，勃起机能障碍和高胆固醇血症。

生物活性肽激素组件

[00214]如上所述，本发明的杂合多肽一般包含至少两个共价连接在一起的生物活性肽激素组件。生物活性肽激素组件可为：(a)天然组分肽激素；(b)保留激素活性的天然组分肽激素的类似物或衍生物；(c)保留激素活性的天然组分肽激素的片段；(d)保留激素活性的天然组分肽激素的类似物或衍生物的片段；(e)赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征的天然组分肽激素结构基序；或(f)赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征的天然组分肽激素的类似物或衍生物的结构基序。(e)和(f)的结构基序在本文统称为“肽增强剂”。

[00215]优选的生物活性肽激素组件包括选自以下的天然肽激素：胰淀素、ADM、CT、CGRP、垂体中间叶激素、CCK(1-33)、CCK-8、瘦蛋白、PYY(1-36)(SEQ ID NO：57)、PYY(3-36)(SEQ ID NO：58)、GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：59)、GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：204)、GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：61)、GLP-2、OXM、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4、利尿钠肽激素、尿皮质素家族肽，例如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽。

[00216]其它优选的生物活性肽激素组件包括选自以下的组分肽激素的类似物和衍生物：胰淀素、ADM、CT、CGRP、垂体中间叶激素、CCK(1-33)、CCK-8、瘦蛋白、PYY(1-36)(SEQ ID NO：57)、PYY(3-36)(SEQID NO：58)、GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：59)、GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：204)、GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：61)、GLP-2、OXM、毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4、利尿钠肽激素、尿皮质素家族肽，例如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽，其中所述类似物或衍生物具有组分肽激素的至少一种激素活性。如本文更全面地描述和本领域所知，类似物可包含组分肽激素氨基酸序列的一个或多个插入、缺失或取代，衍生物可包含类似物或组分肽激素的氨基酸残基的一个或多个化学修饰。

[00217]更具体地说，类似物和衍生物可选自上述和/或本领域所知的任何类似物和衍生物。用作本发明的生物活性肽激素组件、具有至少一种激素活性的特别优选的类似物和衍生物包括以下物质：

胰淀素：	2Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO：79)，2，7Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO：80)，28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：189)，25，28Pro-h-胰淀素(SEQID NO：83)，25，28，29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：67)，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：69)，18Arg，25，28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：70)，18Arg，25，28，29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：72)，25Pro，26Val 28，29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：75)，18Arg，23Leu 25，28，29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：89)，18Arg23Leu，25，28Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：90)，和2，7-环-[2Asp，7Lys]-h-胰淀素(SEQ ID NO：76)
		CT：	14Glu-sCT(SEQ ID NO：106)，18Arg-sCT(SEQ ID NO：107)，11，18Arg-sCT(SEQ ID NO：108)，14Glu，18Arg-sCT(SEQ ID NO：109)，14Glu，11，18Arg-sCT(SEQ ID NO：110)
CGRP：	36D-Ser-CGRP(SEQ ID NO：111)，36D-Thr-CGRP(SEQ ID NO：112)，36D-Asp-CGRP(SEQ ID NO：113)，36D-Asn-CGRP(SEQ IDNO：114)，36Ser-CGRP(SEQ ID NO：115)，36Hse-CGRP(SEQ IDNO：116)，36Asp-CGRP(SEQ ID NO：117)，36Thr-CGRP(SEQ IDNO：118)，36Asn-CGRP(SEQ ID NO：119)
		AFP-6：	TQAQLLRVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY(SEQ ID NO：120)，TQAQLLRVGCDTATCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY(SEQ ID NO：121)，TQAQLLRVGMVLGTMQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY(SEQ ID NO：122)，TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY(SEQ ID NO：123)，TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQESAPVEPSSPHSY(SEQ ID NO：124)，
CCK：	DY(OSO3H)MGWMDF(SEQ ID NO：141)，DYMGWMDF(SEQID NO：142)，MGWMDF(SEQ ID NO：143)，GWMDF(SEQ IDNO：144)，WMDF(SEQ ID NO：145)，KDY(OSO3H)MGWMDF(SEQ ID NO：146)，KDYMGWMDF(SEQ ID NO：147)，KMGWMDF(SEQ ID NO：148)，KGWMDF(SEQ ID NO：149)，

	KWMDF(SEQ ID NO：150)
		瘦蛋白：	43Asp-瘦蛋白(SEQ ID NO：151)，43Glu-瘦蛋白(SEQ ID NO：152)，48Ala-瘦蛋白(SEQ ID NO：153)，49Glu-瘦蛋白(SEQ IDNO：154)，49Des-AA-瘦蛋白(SEQ ID NO：155)，75Ala-瘦蛋白(SEQ ID NO：156)，89Leu-瘦蛋白(SEQ ID NO：157)，93Asp-瘦蛋白(SEQ ID NO：158)，93Glu-瘦蛋白(SEQ ID NO：159)，98Ala-瘦蛋白(SEQ ID NO：160)，139Leu-瘦蛋白(SEQ ID NO：162)，
PYY：	3Leu-PYY(SEQ ID NO：192)，3Val-PYY(SEQ ID NO：193)，4Arg-PYY(SEQ ID NO：194)，4Gln-PYY(SEQ ID NO：195)，4Asn-PYY(SEQ ID NO：196)，25Lys-PYY(SEQ ID NO：197)，34Pro-PYY(SEQ ID NO：198)，34His-PYY(SEQ ID NO：199)，1，36Tyr-PYY(SEQ ID NO：57)，13Pro14Ala-PYY(SEQ ID NO：200)，31Leu34Pro-PYY(SEQ ID NO：201)，des-AA--4-PYY(SEQ IDNO：202)
		GLP-1	9Gln-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：168)，D-9Gln-GLP-1(7-37)(SEQID NO：169)，16Thr-18Lys-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：170)，18Lys-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：171)，8Gly-GLP-1(7-36)(SEQ IDNO：172)，9Gln-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：173)，D-9Gln-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：174)，乙酰-9Lys-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：175)，9Thr-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：176)，D-9Thr-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：177)，9Asn-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：178)，D-9Asn-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：179)，22Ser23Arg24Arg26Gln-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：180)，16Thr18Lys-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：181)，18Lys-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：182)，23Arg-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：183)，24Arg-GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：184)
毒蜥外泌肽	14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：185)，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：185)，5Ala，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(SEQID NO：186)，和14Leu，22Ala，25Phe-毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：187).

[00218]如本领域所知，这样的肽化合物优选酰胺化，但在本发明背景下，其可任选为酸形式，除非另有说明。

[00219]其它优选的生物活性肽激素组件包括选自以下的组分肽激素的片段：胰淀素、ADM、CT、CGRP、垂体中间叶激素、CCK(1-33)、CCK-8、瘦蛋白、PYY(1-36)(SEQ ID NO：57)、PYY(3-36)(SEQ ID NO：58)、GLP-1(1-37)(SEQ  ID NO：59)、GLP-1(7-37)(SEQ  ID NO：204)、GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：61)、GLP-2、OXM、毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4、利尿钠肽激素、尿皮质素家族肽，例如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽，其中所述片段具有组分肽激素的至少一种激素活性。

[00220]其它优选的生物活性肽激素组件包括选自以下的组分肽激素类似物或衍生物的片段：胰淀素、ADM、CT、CGRP、垂体中间叶激素、CCK(1-33)、CCK-8、瘦蛋白、PYY(1-36)(SEQ ID NO：57)、PYY(3-36)(SEQ ID NO：58)、GLP-1(1-37)(SEQ ID NO：59)、GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：204)、GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：61)、GLP-2、OXM、毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4、利尿钠肽激素、尿皮质素家族肽，例如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽，其中所述片段具有组分肽激素的至少一种激素活性。此外，如本文更全面地描述和本领域所知，类似物可包含组分肽激素氨基酸序列的一个或多个插入、缺失或取代，衍生物可包含类似物或组分肽激素的氨基酸残基的一个或多个化学修饰。

[00221]具有至少一种激素活性的某些优选片段包括以下物质。但是，应当理解的是，设想了上述类似物和衍生物以及本领域已知片段的组合，包括下述优选片段。

胰淀素：	胰淀素(1-36)(SEQ ID NO：210)，胰淀素(1-35)(SEQ ID NO：211)，胰淀素(1-20)(SEQ ID NO：212)，胰淀素(1-18)(SEQ IDNO：213)，胰淀素(1-17)(SEQ ID NO：214)，胰淀素(1-16)(SEQ ID NO：215)，胰淀素(1-15)(SEQ ID NO：216)，胰淀素(1-7)(SEQ ID NO：217)
		CT：	CT(8-32)(SEQ ID NO：218)，CT(8-27)(SEQ ID NO：219)，CT(8-26)(SEQ ID NO：220)，CT(8-10)(SEQ ID NO：221)，CT(18-26)(SEQ ID NO：222)，CT(18-27)(SEQ ID NO：223)

AFP-6：	AFP-6(18-27)(SEQ ID NO：224)
		CCK：	CCK-8，CCK-5，CCK-4
瘦蛋白：	瘦蛋白(22-167)(SEQ ID NO：225)，瘦蛋白(56-73)(SEQ IDNO：226)
		PYY：	PYY(1-35)(SEQ ID NO：227)，PYY(1-30)(SEQ ID NO：228)，PYY(1-25)(SEQ ID NO：229)，PYY(1-15)(SEQ ID NO：230)，PYY(1-10)(SEQ ID NO：231)，PYY(2-36)(SEQ ID NO：232)，PYY(3-36)(SEQ ID NO：58)，PYY(4-36)(SEQ ID NO：233)，PYY(5-36)(SEQ ID NO：234)
GLP-1	GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：204)，GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：61)，GLP-1(7-35)(SEQ ID NO：235)
		毒蜥外泌肽	毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：236)，毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：237)，毒蜥外泌肽-4(1-29)(SEQ ID NO：238)，毒蜥外泌肽-4(1-30)(SEQ ID NO：239)或更长

[00222]同样，如本领域所知，这样的肽化合物优选可酰胺化，但在本发明的内容中，其可任选为酸形式，除非另有说明。而且，上述优选的片段可与本文论述或本领域已知的任何类似物或衍生物组合。例如，优选的类似物片段可包括⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQID NO：240)，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：241)，⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：240)，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：241)或所公开的片段、类似物和衍生物的任何其它组合。

[00223]其它优选的生物活性肽组件包括“肽增强剂”，即赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合和/或其它药代动力学特征的组分肽激素(包括其类似物和衍生物)的结构基序。示例性的肽增强剂包括以下物质。同样，应当理解的是，设想了上述类似物和衍生物以及以下生物活性肽组件的组合。例如，还设想了本领域已知和/或上述的胰淀素家族肽激素类似物和衍生物的最后6个氨基酸残基作为优选的生物活性肽组件。

胰淀素家族	胰淀素(32-37)(SEQ ID NO：242)，胰淀素(33-37)(SEQID NO：243)，胰淀素(34-37)(SEQ ID NO：244)，胰淀素(35-37)，胰淀素(36-37)，胰淀素(37)，ADM(47-52)(SEQID NO：245)，ADM(48-52)(SEQ ID NO：246)，ADM(49-52)(SEQ ID NO：247)，ADM(50-52)，ADM(51-52)，ADM(52)，CT(27-32)(SEQ ID NO：248)，CT(27-32)(SEQ ID NO：249)，CT(28-32)(SEQ ID NO：250)，CT(29-32)，CT(30-32)，CT(31-32)，CT(32)，CGRP(32-37)(SEQ ID NO：251)，CGRP(33-37)(SEQ IDNO：252)，CGRP(34-37)(SEQ ID NO：253)，CGRP(35-37)，CGRP(36-37)，CGRP(37)，垂体中间叶激素(42-47)(SEQ ID NO：254)，垂体中间叶激素(43-47)(SEQ ID NO：255)，垂体中间叶激素(44-47)(SEQ IDNO：256)，垂体中间叶激素(45-47)，垂体中间叶激素(46-47)，垂体中间叶激素(47)
		PYY	PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)，PYY(26-36)(SEQ IDNO：258)，PYY(27-36)(SEQ ID NO：259)，PYY(28-36)(SEQ ID NO：260)，PYY(29-36)(SEQ ID NO：261)，PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)，PYY(31-36)(SEQ IDNO：263)，PYY(32-36)(SEQ ID NO：264)，PYY(25-35)(SEQ ID NO：265)，PYY(26-35)(SEQ ID NO：266)，PYY(27-35)(SEQ ID NO：267)，PYY(28-35)(SEQ IDNO：268)，PYY(29-35)(SEQ ID NO：269)，PYY(30-35)(SEQ ID NO：270)，PYY(31-35)(SEQ ID NO：271)，PYY(32-35)(SEQ ID NO：272)
GLP-1和2	蛙GLP-1(29-37)(SEQ ID NO：273)；蛙GLP-1(30-37)(SEQ ID NO：274)；蛙GLP-2(24-31)(SEQ ID NO：275)，蛙GLP-2(25-31)(SEQ ID NO：276)

毒蜥外泌肽-4

毒蜥外泌肽-4(31-39)(SEQ ID NO：277)，毒蜥外泌肽-4(32-39)(SEQ ID NO：278)，毒蜥外泌肽-4(33-39)(SEQID NO：279)，毒蜥外泌肽-4(34-39)(SEQ ID NO：280)，毒蜥外泌肽-4(35-39)(SEQ ID NO：281)，毒蜥外泌肽-4(36-39)(SEQ ID NO：282)，毒蜥外泌肽-4(37-39)，毒蜥外泌肽-4(38-39)，毒蜥外泌肽-4(39)

肽组件选择理由、间隔基和连接基团

[00224]本发明的杂合多肽一般包含至少两个本发明的生物活性肽激素组件，其中至少一个生物活性肽激素组件具有至少一种激素活性。具有至少一种激素活性的生物活性肽激素组件可位于杂合多肽的N-末端、杂合多肽的C-末端，或者在杂合多肽含两个以上生物活性肽激素组件的情况下，可位于杂合多肽的内部。

[00225]在某些实施方案中，可优选定位具有至少一种激素活性的生物活性肽激素组件，使得生物活性肽激素组件的C-末端酰胺化。可通过将组件定位在杂合多肽的C-末端，或通过将组件以C-末端至N-末端方向排列在杂合多肽的N-末端，实现生物活性肽激素组件C-末端酰胺化。在两种构型中，生物活性肽激素组件的C-末端都可用于酰胺化。其中优选C-末端酰胺化的特定组分肽激素可包括胰淀素家族肽激素、CCK、PYY、hGLP-1(7-36)(SEQ ID NO：61)和hGLP-2。其中不一定优选C-末端酰胺化(除非另有说明，否则其中在组件C-末端延长易被接受)的特定组分肽激素包括毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：237)、GLP-1(7-37)(SEQ ID NO：204)、蛙GLP-1(7-36)(SEQ ID NO：283)和蛙GLP-2。但是，如果这些组分肽激素位于杂合多肽的C-末端，则其仍可任选酰胺化，实际上可优选任选酰胺化。

[00226]生物活性肽激素组件可以本领域已知的任何方式共价连接。可使用稳定的连接，或者可使用可切割的连接。在一个实施方案中，第一个组件的羧基可直接连接至第二个组件的氨基。在另一个实施方案中，可使用连接基团连接组件。此外，如果有需要，可使用本领域已知的间隔基或转角诱发物稳定连接。作为实例，当N-末端定位的生物活性肽激素组件不需要C-末端酰胺化时，组件可直接地或使用本领域已知的任何合适连接基团连接至第二个组件，所述连接基团例如为烷基；PEG；氨基酸，例如Lys、Glu、β-Ala；聚氨基酸，例如聚-his、聚-arg、聚-lys、聚-ala、Gly-Lys-Arg(GKR)等；双功能接头(参见例如Pierce catalog，Rockford，Il)；氨基已酰基(“Aca”)、β-丙氨酰，8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基，或本领域已知的其它可切割和不可切割的接头。如同各自明确指出地，本文特别指出的是特定杂合体的实施方案，其中每个示例的含有接头的杂合体中的接头被替换为Gly接头，尤其这样的实施方案，其中Gly接头是Gly-Gly-Gly。作为一个实例，关于示例的种类²⁹5Apa-毒蜥外泌肽(1-28)-¹des-Lys-h胰淀素(1-7)-^11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)(SEQID NO：32)(参见本文表)，也特别地预见到和公开了它的Gly接头种类类似物。该种类是²⁹GlyGlyGly-毒蜥外泌肽(1-28)-¹des-Lys-h胰淀素(1-7)-^11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：313)，其中所述三个甘氨酸位于毒蜥外泌肽(1-28)序列后。在一个实施方案中，接头或间隔物的长度是1-30个残基，在另一个实施方案中，是2-30个残基，在另一个实施方案中，是3-30个残基，和2-30个的任意整数长度(包含端点)；包括每个整数单位，例如2，3，4，5，6，7，等。在一个实施方案中，使用Gly接头，在一个具体的实施方案中，使用3残基的接头Gly-Gly-Gly。

[00227]当N-末端定位的生物活性肽激素组件需要C-末端酰胺化时，可使用本领域已知的任何合适连接基团将组件再连接至第二个组件。更具体地说，在以C-末端至N-末端方向排列具有至少一种激素活性的生物活性肽激素组件而产生氨基至氨基键的情况下，优选的连接基团包括二羧酸、烷基、PEG和氨基酸，例如Lys、Cys和Glu。

[00228]如上所述，杂合多肽还可优选地包括间隔基，以进一步稳定生物活性肽激素组件的连接。可使用本领域已知的任何间隔基或转角诱导物。作为实例，所提及的β-转角模拟物包括以下图示的模拟物A和模拟物B，也叫做Ala-Aib和Ala-Pro二肽。它们的IUPAC名称是模拟物A：N-(3S，6S，9S)-2-氧代-3-氨基-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9-甲酸。模拟物B：N-(3S，6S，9R)-2-氧代-3-氨基-7-硫代-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9-甲酸。

模拟物A                              模拟物B

其它示例性组合和具体实施方案

[00229]形成本发明杂合多肽的生物活性肽激素组件的示例性组合包括选自以下的两个或更多个生物活性肽激素组件的组合：天然肽激素、具有至少一种激素活性的肽激素类似物和衍生物、具有至少一种激素活性的天然肽激素片段、具有至少一种激素活性的肽激素类似物和衍生物的片段，以及肽增强剂，前提条件是至少一个组件具有至少一种激素活性。

[00230]本发明的杂合多肽包含至少两个生物活性肽激素组件，其中每个组件都由组分肽激素组成。在本发明背景下，杂合多肽的组分肽激素可相同或不同，前提条件是至少两个组分肽激素不同。在一个优选实施方案中，至少两个组分肽激素来自不同的肽激素家族，例如胰淀素家族、CCK、瘦蛋白家族、PPF、胰高血糖素原家族、利尿钠肽家族、尿皮质素家族肽，例如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽，和GLP-1和毒蜥外泌肽家族。

[00231]在某些实施方案中，本发明的杂合多肽可包含两个或更多个具有至少一种激素活性的组件。例如，杂合多肽可包含具有至少一种激素活性的第一肽激素或类似物的片段，其共价连接至至少一个另外的肽激素类似物的片段。另外的片段任选可具有至少一种激素活性。第一肽激素可与另外的肽激素相同或不同，前提条件是至少一个另外的肽激素与第一肽激素不同，第一个激素活性可与任选的另外的激素活性相同或不同。

[00232]在其它实施方案中，本发明的杂合多肽可包含一个或多个具有至少一种激素活性的组件，其与一个或多个肽增强剂组件组合。例如，具有至少一种激素活性的第一肽激素的片段可共价连接至肽增强剂，或具有至少一种激素活性的第一肽激素的片段可共价连接至具有至少一种激素活性的第二肽激素，第二肽激素又连接至肽增强剂。或者，肽增强剂可位于两个肽激素组件之间，作为稳定性间隔基。此外，第一肽激素可与第二肽激素相同或不同，第一肽激素的活性可与第二肽激素的活性相同或不同。

[00233]在另一个实施方案中，本发明的杂合多肽可包含2、3、4或更多个生物活性肽激素组件。示例性的组合包括具有激素活性的组件与1、2或3个肽增强剂组合；两个具有激素活性的组件和1或2个肽增强剂组合；3个具有激素活性的组件和1个肽增强剂组合等。

[00234]组分肽激素优选选自胰淀素、肾上腺髓质素、降钙素、降钙素基因相关肽、垂体中间叶激素、缩胆囊素、瘦蛋白肽YY、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽2、泌酸调节肽、ANP、BNP、CNP、尿舒张肽、利尿钠肽激素、尿皮质素家族肽，例如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，以及ANP、BNP、CNP或尿舒张肽或毒蜥外泌肽-4。

[00235]更具体的说，优选的组件组合包括毒蜥外泌肽、胰淀素(和/或sCT)、BNP和PYY作为组分肽激素的组合。具体的组合包括毒蜥外泌肽-4/PYY和PYY/毒蜥外泌肽-4组合，有和没有间隔基或连接基团。其它组合包括毒蜥外泌肽/胰淀素和胰淀素/毒蜥外泌肽组合，有和没有间隔基或连接基团。再其它组合包括胰淀素/PYY和PYY/胰淀素组合，有和没有间隔基或连接基团。

[00236]在一方面，优选的组件组合包括含第一个组件和至少一个另外的生物活性肽激素组件的组合，第一个组件包含毒蜥外泌肽-4、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4片段、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物或衍生物，或具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物片段。在一个实施方案中，第一个组件连接至1、2或3个另外的生物活性肽激素组件。

[00237]在优选的实施方案中，含毒蜥外泌肽-4肽的第一个组件连接至第二个生物活性肽激素组件，该组件含具有至少一种激素活性的胰淀素(和/或sCT)肽。在另一个实施方案中，第二个组件进一步连接至第三个生物活性肽激素组件，该组件含具有至少一种激素活性的降钙素肽。在再另一个实施方案中，第三个组件可进一步连接至第四个生物活性肽激素组件，该组件含选自胰淀素肽的肽增强剂。在一个实施方案中，第一个组件可位于杂合多肽的C-末端。或者，第一个组件可位于杂合多肽的N-末端。在某些实施方案中，如果需要连接组件，可插入间隔基或接头，例如βAla。

[00238]优选的毒蜥外泌肽-4肽包括：毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：236)、毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：237)、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：284)和⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：240)。毒蜥外泌肽(7-15)及其Ser2类似物HSEGTFTSD(SEQ ID NO.378)也是有用的。具有至少一种激素活性的优选胰淀素肽包括胰淀素、胰淀素片段，例如胰淀素(1-17)(SEQ ID NO：214)、胰淀素(1-16)(SEQ ID NO：215)、胰淀素(1-15)(SEQ ID NO：216)和胰淀素(1-7)(SEQ ID NO：217)，以及胰淀素类似物，例如普兰林肽、²Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO：79)、²⁷Ala-h-胰淀素(SEQ ID NO：80)，及其片段。具有至少一种激素活性的优选降钙素肽包括sCT、sCT片段，例如sCT(8-10)、sCT(8-27)(SEQ ID NO：288)，和降钙素类似物，例如^11，18Arg-sCT(SEQ ID NO：108)、¹⁸Arg-sCT(SEQ ID NO：107)、¹⁴Glu，¹⁸Arg-sCT(SEQ ID NO：109)、¹⁴Glu，^11，18Arg-sCT(SEQ ID NO：110)及其片段。优选的胰淀素肽增强剂包括胰淀素(32-37)(SEQ ID NO：242)、胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：243)和胰淀素(34-37)(SEQ ID NO：244)及其类似物。连同本发明一起使用的胰淀素/sCT组合包括公开于PCT/US2005/004631-胰岛素家族激动剂，代理律师档案号18528.835中的那些，该申请通过引用结合到本文中。对制备本发明的杂合体特别有用的胰淀素-sCT嵌合体是化合物10(描述于本文和PCT/US2005/004631中)及其类似物和衍生物。

[00239]在一方面，优选的组件组合包括含第一个组件和肽增强剂的组合，第一个组件包含毒蜥外泌肽-4、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4片段、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物或衍生物，或具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物片段。优选的毒蜥外泌肽-4化合物包括：毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：236)、毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：237)、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：284)和⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ IDNO：240)。优选的肽增强剂包括：PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)、PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)和PYY(31-36)(SEQ ID NO：263)。在一个实施方案中，第一个组件可定位在杂合多肽的C-末端，肽增强剂定位在杂合多肽的N-末端。或者，第一个组件可定位在杂合多肽的N-末端，肽增强剂可定位在杂合多肽的C-末端。在某些实施方案中，如果需要连接组件，可插入间隔基或接头，例如βAla。

[00240]在另一方面，优选的组件组合包括含第一个组件和第二个组件的组合，第一个组件包含毒蜥外泌肽-4、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4片段、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物或衍生物，或具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物片段，第二个组件包含CCK、具有至少一种激素活性的CCK片段、具有至少一种激素活性的CCK类似物或衍生物，或具有至少一种激素活性的CCK类似物片段。此外，优选的毒蜥外泌肽-4化合物包括：毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：236)、毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：237)、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：284)、⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：240)和¹⁴Leu-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ IDNO：190)。优选的CCK化合物包括：CCK-8和CCK-8(Phe(CH₂SO₃))。在一个实施方案中，第一个组件定位在杂合多肽的C-末端，第二个组件定位在杂合多肽的N-末端。或者，第一个组件可定位在杂合多肽的N-末端，第二个组件定位在杂合多肽的C-末端。在某些实施方案中，如果需要连接组件，可插入间隔基或接头，例如βAla。

[00241]在另一方面，优选的组件组合包括含第一个组件和第二个组件的组合，第一个组件包含胰淀素、具有至少一种激素活性的胰淀素片段、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物或衍生物，或具有至少一种激素活性的胰淀素类似物片段，第二个组件包含肽增强剂，例如PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)或PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)。在一个实施方案中，第一个组件定位在杂合多肽的C-末端，肽增强剂定位在杂合多肽的N-末端。或者，第一个组件可定位在杂合多肽的N-末端，肽增强剂可定位在杂合多肽的C-末端。在某些实施方案中，如果需要连接组件，可插入间隔基或接头，例如βAla。在另一方面，优选的组件组合包括含第一个组件和第二个组件的组合，第一个组件包含胰淀素、具有至少一种激素活性的胰淀素片段、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物或衍生物，或具有至少一种激素活性的胰淀素类似物片段，第二个组件包含肽增强剂，例如PYY(25-36)或PYY(30-36)。在一个实施方案中，第一个组件定位在杂合多肽的C-末端，肽增强剂定位在杂合多肽的N-末端。或者，第一个组件可定位在杂合多肽的N-末端，肽增强剂可定位在杂合多肽的C-末端。在某些实施方案中，如果需要连接组件，可插入间隔基或接头，例如βAla。

[00242]其它优选的组件组合包括含毒蜥外泌肽和CCK组合的组合，或包含胰淀素、降钙素和CCK作为三元组合的组合。具体的组合包括毒蜥外泌肽/CCK和CCK/毒蜥外泌肽，有和没有间隔基或接头和连接基团。其它组合包括CCK/胰淀素/降钙素和CCK/胰淀素/降钙素/胰淀素，有和没有间隔基或连接基团。根据杂合多肽的需要特性，每个组件均可独立地为肽增强剂，或可具有激素活性。在一个实施方案中，胰淀素/降钙素/胰淀素提供为胰淀素/降钙素/胰淀素的嵌合体，如在化合物10中。

[00243]再其它优选的组件组合包括含毒蜥外泌肽、胰淀素和降钙素组合作为三杂合和四杂合分子的组合。示例性的组合包括毒蜥外泌肽/胰淀素/降钙素、毒蜥外泌肽/胰淀素/降钙素/胰淀素、胰淀素/降钙素/毒蜥外泌肽和胰淀素/降钙素/胰淀素/毒蜥外泌肽组合，有和没有间隔基或连接基团。根据杂合多肽的需要特性，每个组件均可独立地为肽增强剂，或可具有激素活性。在一个实施方案中，胰淀素/降钙素/胰淀素提供为胰淀素/降钙素/胰淀素的嵌合体，如在化合物10中。

[00244]在一个实施方案中，当具有至少一种激素活性的一个生物活性肽激素组件为胰淀素或其类似物或片段、而第二个生物活性肽激素组件含CCK时，则杂合多肽优选应包含选自不同组分肽激素的第三个生物活性肽激素组件。示例性的第三个生物活性肽激素组件包括降钙素，更优选为鲑鱼降钙素、其类似物或片段。

[00245]在另一个实施方案中，当具有至少一种激素活性的一个生物活性肽激素组件为胰淀素或其类似物或片段、而第二个生物活性肽激素组件含CT时，则杂合多肽优选应包含选自不同组分肽激素的第三个生物活性肽激素组件。示例性的第三个生物活性肽激素组件包括毒蜥外泌肽-4、其类似物或片段。

[00246]在再另一个实施方案中，当具有至少一种激素活性的一个生物活性肽激素组件为GLP-1或其类似物或片段、而第二个生物活性肽激素组件为含毒蜥外泌肽片段的肽增强剂时，则杂合多肽优选应包含选自不同组分肽激素的第三个生物活性肽激素组件。示例性的第三个生物活性肽激素组件包括PYY(包括其类似物、衍生物和片段)和CCK(包括其类似物、衍生物和片段)。

[00247]要理解的是，在上述优选组合的每一种中，所提及的组分肽激素包括所提及的类似物、衍生物、片段，以及与其相关的肽增强剂。

[00248]在一个优选方面，杂合多肽包括：

[00249]示例性毒蜥外泌肽和神经调节肽杂合体包括

毒蜥外泌肽-(1-28)-β-Ala-β-Ala-FN-38：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-β-Ala-β-Ala-FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：391)；

毒蜥外泌肽-(1-28)-β-Ala-β-Ala-神经调节肽(U25：)

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-β-Ala-β-Ala-FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：392)；和

毒蜥外泌肽-(1-28)-β-Ala-β-Ala-神经调节肽(U-9)：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-β-Ala-β-Ala-GYFLFRPRN-NH2(SEQ ID NO：393)。β-Ala-β-Ala间隔基是任选的，并且可以用Gly-Gly-Gly、微PEG基团或本领域已知的其它接头，特别是本文描述的接头代替。

[00250]示例性毒蜥外泌肽和利尿钠肽杂合体包括毒蜥外泌肽-hBNP肽杂合体，包括

毒蜥外泌肽-(1-28)-β-Ala-β-Ala-hBNP：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-β-Ala-β-Ala-SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH(SEQ ID NO：394)；和

毒蜥外泌肽-β-Ala-β-Ala-hBNP：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-β-Ala-β-Ala-SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH(SEQ ID NO：395)。

[00251]在本发明的所有杂合体中，β-Ala-β-Ala间隔基是任选的，并且可以用Gly-Gly-Gly、微PEG基团或本领域已知的其它接头，特别是本文描述的接头代替。

[00252]本发明的杂合多肽还可包含进一步的修饰，其包括但不限于此杂合多肽氨基酸序列的取代、缺失和插入及其任意组合。在一个优选方面，本发明的杂合多肽包括一个或多个“非必需”氨基酸残基的修饰。在本发明背景下，“非必需”氨基酸残基为在片段(例如组分肽激素片段)的天然人氨基酸序列中可改变(即缺失或取代)而不消除或基本不降低杂合多肽的组分肽激素受体激动剂活性的残基。

[00253]优选的取代包括保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链或物理化学特征(例如静电、氢键键合、等排、疏水特征)的氨基酸残基取代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

[00254]本发明还涉及杂合多肽衍生物。这样的衍生物包括缀合至一个或多个水溶性聚合物分子或加入聚氨基酸的杂合多肽，聚合物分子例如聚乙二醇(“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰等)，聚氨基酸例如聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸和聚丙氨酸。对杂合多肽的修饰还可包括小分子取代基，例如短烷基和约束烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和芳基。水溶性聚合物分子优选具有约500至约20,000Da的分子量。

[00255]这样的聚合物缀合和小分子取代基修饰可单独地发生在杂合多肽的N末端或C末端或序列中氨基酸残基的侧链上。或者，沿着杂合多肽可有多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸取代一个或多个氨基酸可提供另外的衍生化位点。参见例如美国专利第5,824,784号和5,824,778号。优选地，杂合多肽可缀合至1、2或3个聚合物分子。

[00256]水溶性聚合物分子优选连接至氨基、羧基或巯基，可连接在N末端或C末端或赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链上。或者，水溶性聚合物分子可与二胺基和二羧基连接。在一个优选实施方案中，本发明的杂合多肽通过赖氨酸氨基酸上的ε氨基缀合1、2或3个PEG分子。

[00257]本发明的杂合多肽衍生物还包括一个或多个氨基酸残基具有化学改变的杂合多肽。这样的化学改变包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可单独地发生在PPF杂合多肽的N端或C端或序列中氨基酸残基的侧链上。在一个实施方案中，这些多肽的C-末端可具有游离-OH或-NH₂基团。在另一个实施方案中，N-末端可用异丁氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、乙氧基羰基、异已酰基(isocap)、辛烷基、辛基甘氨酸基(G(Oct))或8-氨基辛酸基加帽。在一个优选实施方案中，可通过形成二硫键环化。或者，沿着杂合多肽可有多个化学改变位点

[00258]在进一步的实施方案中，杂合体不包括WO2005/077072中公开的任何杂合体。因此，在一个实施方案中，是要求保护的新杂合体。在另一实施方案中，是本文、WO2005/077072或其它地方公开的任何杂合体的本文描述的要求保护的新用途。在序列表中提供了本发明杂合多肽的实例，并在以下的实施例章节进一步讨论。

杂合多肽在治疗或预防代谢疾病或障碍中的用途

[00259]本发明的GIP杂合体可以用于减少食物摄取，减少食欲，减少热量摄取，诱导饱感，减少营养物利用度，造成体重减轻，影响身体组成，改变身体能量含量或能量消耗，改进脂质谱(包括减少LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)，减慢胃肠蠕动，延迟胃排空，减轻餐后血糖偏移，预防或抑制胰高血糖素分泌，和减少血压。在一个实施方案中，这样的GIP杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00260]因而，在某些实施方案中，本发明的杂合体可以用于治疗或预防通过减少营养物利用度可以缓解的状况或病症，所述方法包含，给所述受试者施用治疗或预防有效量的本发明的化合物。这样的状况和病症包括但不限于，摄食障碍，胰岛素抵抗，肥胖，异常的餐后高血糖症，任何种类的糖尿病，包括I型、II型和妊娠糖尿病，代谢综合征，倾倒综合征，高血压，血脂异常，心血管疾病，高脂血症，睡眠呼吸暂停，癌症，肺动脉高压，胆囊炎，和骨关节炎。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00261]示例性肽组件配对包括心脏活性/保护肽，例如尿皮质素与GLP-1或毒蜥外泌肽，ANP、BNP或CNP与GLP-1或毒蜥外泌肽，和尿皮质素与ANP、BNP或CNP。所述杂合体将是心脏保护的，并且特别可以用于本文描述的相关疾病和状况，包括急性或慢性CHF、缺血再灌注、心肌梗塞，和用于血管扩张剂作用，以便用于治疗或预防抗高血压适应症和心绞痛。Ucn 2和3特别可以用于本发明的杂合体。

[00262]心血管状况或疾病的非限制性实例是高血压，心肌缺血，和心肌再灌注。本发明的化合物也可以用于治疗或预防其它与肥胖有关的状况，包括中风，癌症(例如子宫内膜癌，乳腺癌，前列腺癌，和结肠癌)，胆囊疾病，睡眠呼吸暂停，生育力降低，和骨关节炎，(参见Lyznicki等，Am.Fam.Phys.63：2185，2001)。在其它实施方案中，本发明的化合物可以用于改变身体组成(为了美感的原因)、增强身体能力、或产生更少脂肪的肉来源。杂合体可以用于改变身体组成，其通过减少脂肪而不显著减少肌肉块，从而产生希望的身体脂肪减少，同时保持身体瘦组织团块。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00263]在另一个一般方面，本发明的杂合体可以用于抑制生长素释放肽的分泌。因此，本发明的化合物可以利用该机理来治疗或预防生长素释放肽相关病症，例如普拉德-威利综合征，所有类型的糖尿病和并发症，肥胖，饮食过多，高脂血症，或与营养过度有关的其它病症。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00264]在另一个一般方面，认识到含有胰岛素和/或sCT部分的杂合体可以用于治疗或预防巴雷特食管、胃食管返流疾病(GERD)，以及与之相关的状况。这样的状况包括但不限于烧心，与胃/肠内容物反流进嘴或肺中有关的烧心，吞咽困难，咳嗽，间歇性喘鸣和声带炎症(与GERD有关的状况)，食管糜烂，食管溃疡，食管狭窄，食管组织化生(用异常上皮替代正常食管上皮)，巴雷特食管腺癌，和肺吸入。这样的杂合体具有抗分泌性质，例如抑制胃酸、抑制胆酸、和抑制胰酶。此外，这样的杂合体可以具有胃保护功能，这使得它们特别适用于治疗或预防巴雷特食管，和/或GERD和本文所述的相关或伴随状况。

[00265]在另一个方面，GIP杂合体可以用于治疗或预防胰腺炎，胰腺癌，和胃炎，尤其用于治疗和预防已经经历内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)的患者的胰腺炎。当与生长抑素相组合时，含有胰淀素和/或sCT的GIP杂合体激动剂可以具有令人惊奇的优良的治疗效果。因此，在某些实施方案中，治疗或预防胰腺炎的方法包含，给受试者施用这样的杂合体和施用生长抑素和生长抑素激动剂。

[00266]在另一个一般方面，杂合体可以用于减少骨重吸收，减少血钙，和/或诱导镇痛作用，尤其是用于治疗骨病例如骨质减少和骨质疏松症。在其它实施方案中，杂合体可以用于治疗疼痛和疼痛性神经病。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00267]在本发明的另一方面，提供治疗或预防肥胖的方法，其中该方法包括将治疗或预防有效量的杂合多肽施用有需要的受试者。在一个优选实施方案中，受试者为肥胖或超重受试者。尽管“肥胖”一般定义为体重指数超过30，但对本说明书来说，需要或希望减轻体重的任何受试者，包括体重指数低于30的受试者，都包括在“肥胖”的范围内。为胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受或具有任何形式糖尿病(例如1型、2型或妊娠期糖尿病)的受试者均可由该方法获益。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，PYY，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00268]在另一实施方案中，提供了通过以下步骤减轻病态肥胖受试者体重的方法：首先将受试者的体重减轻到病态肥胖的水平以下，然后将有效量的抗肥胖剂的组合施用受试者，以进一步减轻受试者的体重。将受试者的体重减轻到病态肥胖水平以下的方法包括减少热量摄取、增加身体活动、药物治疗、肥胖手术，如胃旁路手术，或上述方法的任何组合。一方面，施用抗肥胖剂的组合进一步减轻受试者体重。在另一实施方案中，提供了通过施用有效量的抗肥胖剂的组合减少体重指数为40或更少的受试者的体重指数的方法，以进一步减轻受试者的体重。

[00269]减轻体重表示受试者在治疗过程中损失他/她的总体重的一部分，不论治疗过程是日、周、月或年。或者，减轻体重可以定义为脂肪质量与瘦组织质量的比例的减少(也就是说，受试者丧失了脂肪质量，但是保持或增加瘦组织质量，不一定导致总体重的相应丧失)。在该实施方案中组合施用的有效量的抗肥胖剂是在治疗过程中有效减轻受试者体重的量，或者是在治疗过程中有效减少受试者的脂肪质量百分比的量。在某些实施方案中，受试者的体重在治疗过程中减轻至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，或至少约20％。或者，受试者的脂肪质量百分比在治疗过程中减少至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，或至少约20％。

[00270]在本发明的其它方面，提供减少食物摄取、降低营养物利用度、引起体重下降、影响身体组成、改变身体能量含量或增加能量消耗、治疗糖尿病以及改善脂质谱(包括降低LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)的方法，其中该方法包括施用受试者有效量的本发明杂合多肽。在一个优选实施方案中，本发明的方法用于治疗或预防可通过在有需要受试者中降低营养物利用度而减轻的状况或障碍，包括施用所述受试者治疗或预防有效量的本发明杂合多肽。这样的状况和障碍包括但不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、摄食障碍、胰岛素抵抗、肥胖和任何种类的糖尿病。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，PYY，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。

[00271]非为理论所限制，一般认为，通过与PP家族中的或类似于PP家族的一种或多种独特受体类别相互作用，测定外周施用本发明的杂合多肽在减少食物摄取、延迟胃排空、降低营养物利用度和引起体重减轻中的作用。更具体地说，似乎涉及类似于PYY优选(或Y7)受体的一种或多种受体。

[00272]特别感兴趣的抗肥胖、减轻体重、减少食物摄取、增加代谢速度和减少体脂和/或脂肪重新分布杂合体是具有至少一个，优选两个作用于CNS的组分的那些。前脑的特定区域(端脑和间脑衍生的脑成分)和后脑或脑干(包括中脑、脑桥和髓质)已被鉴定为参与控制能量平衡。参与食物摄取和/或体重调节的前脑结构或位于下丘脑中的核包括，例如，弓状核(ARC)、室旁核(PVN)、背内侧下丘脑(DMH)、腹内侧核(VMH)和下丘脑外侧核(LHA)。参与食物摄取和/或体重调节的后脑结构或位于脑干中的核包括，例如，孤束核(NST)、最后区(AP)和臂旁外侧核(1PBN)。控制完善运动控制系统元件的脑干核有可能受来自如NST、AP和1PBN这样的脑干区域的初级或二级投射(projections)的控制。值得注意的是，AP、NST和1PBN已全部显示出(共同地和独立地)具有其自身的综合能力。

[00273]多种定位于CNS的抗肥胖剂作用于位于下丘脑中的参与食物摄取和/或体重调节的前脑结构。此外，定位于CNS的抗肥胖剂作用于位于脑干中的参与食物摄取和/或体重调节的后脑结构。这样的抗肥胖剂的实例在本文中有描述。可以组合形成抗肥胖剂杂合体并且可以组合形成对前脑和后脑都具有活性的抗肥胖杂合体的肽家族组件的其它实例参见下表。这样的组分包括例如，神经肽Y1(NPY1)受体拮抗剂、NPY5受体拮抗剂、瘦蛋白和瘦蛋白激动剂、睫状神经营养因子(CNTF)和CNTF激动剂、肽YY(PYY)和PYY激动剂、毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽激动剂、GLP-1和GLP-1激动剂、生长素释放肽和生长素释放肽拮抗剂、缩胆囊素(CCK)和CCK激动剂、和胰淀素和胰淀素激动剂，包括本文描述的那些。其它肽家族组分和临床指导可以参见申请人的共同未决的专利申请PCT/US06/17529，其通过引用整体结合到本文中。

各个抗肥胖靶和定位

信号传递系统	CNS区	食物摄取作用	抗肥胖剂
				神经肽Y(NPY)	前脑(ARC/PVN)	增加摄取	NPY1和NPY5受体拮抗剂
瘦蛋白	前脑(ARC)	减少摄取	瘦蛋白或激动剂
				睫状神经营养因子(CNTF)	前脑(ARC)	减少摄取	CNTF
肽YY(PYY)	前脑(ARC)	减少摄取	PYY(3-36)激动剂
				胰高血糖素样肽-1(GLP-1)	前脑(PVN)	减少摄取	Exenatide和其它GLP-1配体，DPP-IV抑制剂
生长素释放肽	前脑(ARC)	增加摄取	生长素释放肽拮抗剂
				缩胆囊素(CCK)	后脑(AP)	减少摄取	CCK激动剂
胰淀素	后脑(AP)	减少摄取	胰淀素激动剂，普兰林肽，胰淀素类似物
				黑皮质素(MC)	前脑(PVN/ARC)	激动剂减少摄取	MC4激动剂

[00274]在某些实施方案中，杂合体是抗肥胖剂，其可以包括一种或多种主要前脑作用肽家族组分。在某些实施方案中，杂合体是抗肥胖剂，其可以包括一种或多种主要后脑作用抗肥胖剂。示例性肽家族和组分是NPY1受体拮抗剂、NPY5受体拮抗剂、瘦蛋白或瘦蛋白激动剂或类似物、CNTF、NPY2受体激动剂(例如PYY(3-36)或PYY(3-36)激动剂)、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽激动剂或类似物、GLP-1或GLP-1激动剂或类似物、生长素释放肽拮抗剂、CCK或CCK激动剂或类似物和胰淀素激动剂或类似物。

[00275]在某些实施方案中，杂合体和使用它的方法包括主要靶定如ARC、PVN、VM和LH这样的下丘脑能量平衡中心的第一组分。在一个实施方案中，杂合体含有也靶定下丘脑，但是与第一组分靶定不同位置或通过不同作用机理起作用的一个或多个其它肽家族组件。当杂合体含有一个以上其它肽家族组件并且它们也靶定下丘脑时，所述一个以上的其它肽家族组件可以彼此通过相同作用机理靶定相同位置，或它们可以靶定不同位置和/或通过不同作用机理。在另一实施方案中，杂合体含有根据需要提供一种或多种额外的有益治疗效果的一个或多个其它肽家族组分，所述有益治疗效果包括通过与第一组分和彼此之间不同的位置或作用机理提供的抗肥胖效果、控制血糖、心脏保护和/或控制高血压。在某些实施方案中，额外的肽家族组件是主要靶定后脑的能量平衡中心，如NST、AP和1PBN的肽家族组分。

[00276]在某些实施方案中，杂合体和使用它的方法包括主要靶定如NST、AP和1PBN这样的后脑能量平衡中心的第一组分。在一个实施方案中，杂合体含有也靶定下丘脑，但是与第一组分和彼此靶定不同位置或通过不同作用机理起作用的一个或多个其它肽家族组件。在另一实施方案中，杂合体含有根据需要提供一种或多种额外的有益治疗效果的一个或多个其它肽家族组分，所述有益治疗效果包括通过与第一组分和彼此之间不同的位置或作用机理提供的抗肥胖效果、控制血糖、心脏保护和/或控制高血压。在某些实施方案中，额外的肽家族组件是主要靶定下丘脑的能量平衡中心，如ARC、PVN、VM和LH的肽家族组分。

[00277]如本文所使用的，“作用于参与食物摄取和/或体重调节的前脑结构”的抗肥胖剂刺激或抑制前脑中特定区域的活性，例如，特定的核和/或神经元回路。该前脑刺激或抑制导致身体营养物利用度下降。“作用于参与食物摄取和/或体重调节的后脑结构”的抗肥胖剂刺激或抑制后脑中特定区域的活性，例如，特定的核和/或神经元回路。该后脑刺激或抑制导致身体营养物利用度下降。

[00278]在另一方面，提供了一种通过降低受试者代谢速度来降低脂肪质量的方法，其中的方法包括施用抗肥胖杂合体，所述杂合体的量能够有效地通过提高受试者的代谢速度来降低脂肪质量。脂肪质量可以总体重的百分比表示。在一些方面，脂肪质量在治疗过程中被减少至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％。在一方面，受试者的瘦组织在治疗过程中不减少。在另一方面，受试者的瘦组织在治疗过程中得以保持或者提高。在另一方面，受试者正接受热量降低的饮食或者受限制的饮食。“热量降低的饮食”意指，与相同受试者的正常饮食相比，受试者每天摄食更少的热量。在一种情况中，受试者每天少消耗至少50卡路里。在其它情况中，受试者每天少消耗至少100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000卡路里。

[00279]在一种实施方案中，提供了在受试者中改变受试者脂肪分布、降低脂肪量或这二者的方法。因此，对于改变身体组成是有益的受试者来说，他们也可受益于本发明的方法。如本文中所欲意指的，改变的身体组成包括身体脂肪的损失或维持，以及瘦体重损失的最小化、维持或获得。在这样的情形中，体重可以增加也可以减少。因此，根据这些术语在本领域通常所使用的，受试者可以是瘦的、超重的或者肥胖的。本发明的方法还包括减少非脂肪组织中的脂肪而不损害无脂肪组织。该方法的用途包括治疗比如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或脂肪代谢障碍这样的疾病。

[00280]在一种实施方案中，提供了一种改变受试者中脂肪分布的方法，该方法包括施用抗肥胖杂合体，所述杂合体的量能够有效地改变受试者的脂肪分布。在一方面，这一改变源于受试者的内脏或异位脂肪或者这两者的代谢的提高。“脂肪分布”意指身体内脂肪沉积的位置。脂肪沉积的所述位置包括例如皮下、内脏和异位脂肪储存。“皮下脂肪”意指紧靠在皮肤表面下的脂质沉积。受试者的皮下脂肪量可采用任何一种可采用的测量皮下脂肪的方法来测量。测量皮下脂肪的方法是本领域已知的，例如，在第6,530,886号美国专利中描述的那些，该专利全文引入本文作为参考。“异位脂肪储存”意指在构成瘦体重的组织和器官(例如，骨骼肌、心脏、肝、胰、肾、血管)内或其周围的脂质沉积。总的来说，异位脂肪储存是脂质在身体的经典脂肪储存之外的累积。“内脏脂肪”意指作为腹内脂肪组织的脂肪沉积。内脏脂肪围绕着重要器官，且可以被肝脏代谢从以产生血胆固醇。内脏脂肪已与提高的比如多囊性卵巢综合征、代谢综合征和心血管疾病这样的状况的风险相关。在一些实施方案中，该方法涉及内脏或异位脂肪或二者的代谢率比皮下脂肪代谢速度高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。在一方面，这些方法导致令人满意的脂肪分布。在一种实施方案中，令人满意的脂肪分布是皮下脂肪与内脏脂肪、异位脂肪或这两者的比例提高。在一方面，该方法涉及由，例如，肌细胞量的提高导致的身体瘦组织质量的提高。

[00281]在另一种实施方案中，提供了降低受试者皮下脂肪量的方法，其中所述方法包括向有此需求的受试者施用抗肥胖杂合体，所述杂合体的量能够有效降低受试者的皮下脂肪的量。在一种情况中，受试者的皮下脂肪量减少至少约5％。在其它情况下，与施用抗肥胖杂合体之前的受试者相比，皮下脂肪量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％40％或50％。

[00282]本文中所描述的方法可用于减少受试者的内脏脂肪量。在一种情况下，受试者的内脏脂肪量减少至少约5％。在其它情况下，与施用抗肥胖杂合体之前的受试者相比，受试者的内脏脂肪减少至少约10％、15％、20％、25％、30％40％或50％。内脏脂肪可通过任何可获得的测定受试者内脏脂肪量的方法来测量。这样的方法包括，例如，借助CT扫描和MRI的腹部体层摄影术。例如，第6,864,415、6,850,797和6,487,445号美国专利中描述了测定内脏脂肪的其他方法。

[00283]在一种实施方案中，提供了预防异位脂肪累积或减少受试者中异位脂肪量的方法，其中所述方法包括向有此需求的受试者施用抗肥胖杂合体，所述杂合体的量能够有效预防异位脂肪累积或减少受试者中的异位脂肪的量。在一种情况下，与施用抗肥胖杂合体之前的受试者相比，受试者的异位脂肪量减少至少约5％。在其它情况下，受试者的异位脂肪量减少至少约10％或至少约15％、20％、25％、30％40％或50％。作为选择，与受试者的皮下脂肪相比，异位脂肪的量按比例减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。可以用可获得的任何测量异位脂肪的方法来测量受试者中的异位脂肪。

[00284]在另一种实施方案中，提供了在受试者中产生更令人满意的脂肪分布的方法，所述方法包括向受试者施用有效作为抗肥胖剂的杂合体，所述杂合体的量能有效地产生令人满意的脂肪分布。在一种实施方案中，抗肥胖杂合体的施用减少受试者中内脏脂肪或异位脂肪或这二者的量。在一种实施方案中，使用抗肥胖杂合体，其包含至少一种作用于前脑中参与食物摄取或体重调节或这二者的结构的家族组件，其与至少一种作用于后脑中参与食物摄取或体重调节或这二者的结构的家族组件进行组合。在一种实施方案中，与减少皮下脂肪相比，该方法优选减少内脏或异位脂肪或这二者组合的量。这样的方法导致产生更高的皮下脂肪与内脏脂肪或异位脂肪的比率。这样的提高的比率可导致心血管疾病，多囊性卵巢综合征，代谢综合征或其任意组合的发展的风险降低。在一种实施方案中，异位或内脏脂肪比皮下脂肪的代谢速度高5％。在其它实施方案中，异位或内脏脂肪比皮下脂肪的代谢速度高至少10％、15％、20％、25％、30％50％、60％、70％、80％、90％或100％。

[00285]对于本文讨论的抗肥胖、体重和脂肪组成相关治疗特别感兴趣的是含有胰淀素(如胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体)、瘦蛋白和/或PPF(如PYY类似物或PPY/NPY嵌合体)家族组件的杂合体。例如，胰淀素家族组件可以连接于瘦蛋白家族组件，并且可以是单独施用，或在进一步的实施方案中与PPF家族化合物组合施用(例如分开或混合在一起)。在另一实施方案中，杂合体含有单独施用或与胰淀素家族化合物组合施用的瘦蛋白-PPF组合。在另一实施方案中，杂合体含有单独或与瘦蛋白家族化合物组合施用的胰淀素-PPF组合。在进一步的实施方案中，杂合体含有所有三种肽家族组件。例如，在双室送递系统中，胰淀素-PPF杂合体可以提供在无菌、药学可接受的溶液中，随后该溶液用于溶解冻干或粉末化的瘦蛋白家族化合物。

[00286]在另一方面，提供了施用与糖皮质类固醇组合施用的治疗有效量的有效作为抗肥胖剂的杂合体的方法。糖皮质类固醇有提高脂肪量和减少受组织量的副作用。因此预期，抗肥胖剂组合可在糖皮质类固醇使用有益的条件下与糖皮质类固醇联合施用，以便抵消糖皮质类固醇的副作用。

[00287]进一步关于降脂，本发明的杂合体可以用于降低血脂水平，如甘油三酯、总胆固醇、LDL胆固醇和VLDL胆固醇，并且在需要所述治疗的受试者中提供更有益的脂质谱。因此，在一个实施方案中，提供了降低血甘油三酯、总胆固醇、LDL胆固醇、VLDL胆固醇或其任意组合的方法，包括给有需要的受试者施用降低脂质的杂合体。在进一步的实施方案中，降低脂质的杂合体可以含有毒蜥外泌肽(肠降血糖素)家族组分、胰淀素家族组分、PPF或PYY(NPY)家族组分或其任意组合。在该方法的一个实施方案中，要降低的脂质是血浆甘油三酯。在另一实施方案中，它是总血浆胆固醇。在另一实施方案中，它是LDL胆固醇。在另一实施方案中，它是VLDL胆固醇。杂合体可以急性和/或慢性有效，以维持或降低空腹脂质水平和/或减少餐后脂质(特别是甘油三酯)波动。需要所述治疗的患者可能具有升高的甘油三酯、升高的LDL胆固醇、升高的VLDL胆固醇或其任意组合。所述患者可以包括原本可能表现为正常、具有糖尿病或糖尿病前状况、肥胖、具有脂质疾病或状况如血脂异常、高胆固醇血脂或高甘油三酯血症和/或具有心血管疾病的患者。杂合体的该作用对于减少高风险患者，如有遗传倾向、肥胖、糖尿病的患者的心脏和动脉硬化风险是有益的。因此，患者可以是血脂或胆固醇水平升高的患有动脉粥样硬化的患者。本发明的方法提供了在受试者中减少餐后甘油三酯波动、减少循环脂质水平、治疗血脂异常、改进循环脂质谱、治疗高甘油三酯血症、治疗高胆固醇血脂和/或降低餐后甘油三酯浓度的方法，该方法包括给需要所述治疗的患者施用有效量的本发明的杂合体。本文用的“脂质谱”是指循环脂质，包括甘油三酯水平、HDL、LDL、胆固醇等的平衡、比例或实际浓度。在一个优选的方面，本发明的方法可以用于降低患者中的甘油三酯水平，包括施用有效量的胰淀素或胰淀素激动剂。可以用该方法降低总体脂质或甘油三酯水平，例如，空腹水平、餐后峰水平和总体餐后脂质/甘油三酯水平波动(例如通过与非胰淀素激动剂治疗状态中的增加相比，餐后甘油三酯曲线下面积(AUC)增加而测得的)。本发明的方法也减少各个临床相关的测量值，例如空腹脂质水平(包括甘油三酯、胆固醇、HDL和LDL等)和餐后脂质(例如甘油三酯)水平。通过施用胰淀素或胰淀素激动剂，可以治疗与正常相比具有血脂异常或改变的脂质水平的患者。糖尿病和肥胖患者，以及具有血脂异常或心血管疾病的遗传倾向的患者特别适于通过本发明的方法进行治疗。本文用到的“治疗患者中升高的甘油三酯水平”是指相对于治疗前的水平，防止这些水平增加或导致这些水平降低。本文用到的“减少餐后甘油三酯波动”是指降低餐后患者中观察到的峰浓度和甘油三酯浓度曲线下的总面积。这典型地表示在餐后的1小时内，减少诸如图2-4提供的图中的总曲线下面积。本文用到的“降低患者的循环脂质水平”表示相对于治疗前的水平，降低可测量的量的血脂。本文用到的“治疗血脂异常”表示改进或恢复到接近于任何或所有临床可测量的脂质或脂蛋白参数的正常和/或健康的水平、比例、谱或平衡。本文用到的“治疗血脂异常”是指改进或恢复到接近于任何或所有临床可测量的脂质或脂蛋白参数的正常和/或健康的水平、比例、谱或平衡。这包括但不限于甘油三酯、LDL、HDL、IDL、VLDL、总胆固醇、载脂蛋白等的水平。本文用到的“改进患者中的循环脂质谱”是指导致血液中存在的一种或多种脂质的浓度改变，从而将患者的总体血脂含量改变为优选的状态。也可以包括改变脂质在不同脂蛋白级分上的分布，而不改变循环脂质的总含量/浓度。本文用到的“治疗患者中的高甘油三酯血症”表示在一个或多个相关时间，例如在空腹或餐后，导致血液中存在的甘油三酯的浓度降低。本文中用到的“降低患者中的餐后循环甘油三酯”表示相对于治疗前或未治疗时引用相似饮食的患者中餐后观察到的甘油三酯水平，在餐后(例如餐后4-6小时的时间段)降低循环中可测量的量的甘油三酯。

[00288]本发明的杂合体和PYY嵌合体可以与其它降脂药物一起使用。降脂药物包括任何能够降低血浆脂质水平的化合物。示例的降脂药物包括但不限于，他汀类，如阿伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀(cerivastatin)或瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)；胆酸结合剂，如消胆胺或考来替泊(colestipol)；过氧化物酶体增殖激活的受体(PPAR)激动剂，如泰沙格列赛(tesaglitazar)、维生素E；胆固醇酯转移蛋白抑制剂(CETP)如依替米贝(ezetimibe)、JTT-705和托彻普(Torcetrapib)。

[00289]用于本发明的其它测定包括可测定PPF化合物对身体组成的作用的测定。示例性测定可为包括使用用于代谢疾病的饮食诱导肥胖(DIO)小鼠模型的测定。在治疗期之前，可于4周龄开始，喂饲雄性C57BL/6J小鼠高脂肪饮食(#D12331，58％的热量来自脂肪；ResearchDiets，Inc.，)，持续6周。在研究过程中，小鼠可继续吃其高脂肪饮食。在整个研究中，水可任意提供。为了与DIO组对比代谢参数，可对一组相似年龄的非肥胖小鼠喂饲低脂肪饮食(#D12329，11％的热量来自脂肪)。

[00290]DIO小鼠可皮下(SC)肩胛内植入渗透泵，以送递溶媒(50％二甲基亚砜(DMSO)的水溶液)或本发明化合物。后一组的泵可设定为送递任意量，例如7-28天内送递1000μg/kg/天的本发明化合物。

[00291]在整个研究阶段内，可以固定间隔检测体重和食物摄取。可使用全动物间接测热法(Oxymax，Columbus Instruments，Columbus，OH)测定呼吸商(RQ，定义为CO₂产生÷O₂消耗)和代谢率。可用过量异氟烷麻醉小鼠，检测肥胖指数(两侧附睾脂垫重量)。而且，在测定附睾重量之前，可使用双能X-射线吸光测定(DEXA)仪器，按照生产商的说明(Lunar Piximus，GE Imaging System)，分析每只小鼠的身体组成(瘦组织量、脂肪量)。在本发明方法中，本发明的优选PPF多肽是这样的多肽：其在本文描述的一种测定(优选为食物摄取、胃排空、胰腺分泌、体重下降或身体组成测定)中所具有的效能高于组分肽激素在相同测定中的效能。

[00292]除了在有需要的患者中由于减少食物摄取、体重降低或治疗肥胖而改善高血压之外，本发明的化合物还可用于治疗低血压。

[00293]本发明的化合物还可用于加强、诱导、增强或恢复胰腺胰岛或细胞中的葡萄糖反应性。这些作用可用于治疗或预防与代谢疾病相关的状况，例如描述于美国专利申请US20040228846的疾病。测定此活性的实验是本领域已知的。例如，在公开的美国专利申请US20040228846(其通过引用整体结合到本文中)中，描述了用于胰岛分离和培养的实验以及测定胎儿胰岛成熟度的实验。在专利申请US20040228846的实施例中，包括胰多肽(PP)、神经肽Y(NPY)、神经肽K(NPK)、PYY、肠促胰液素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和铃蟾肽在内的肠源激素肽购自Sigma。XI型胶原酶得自Sigma。RPMI 1640培养基和胎牛血清得自Gibco。含抗胰岛素抗体的放免测定试剂盒([¹²⁵I]-RIA试剂盒)购自Linco，St Louis。

[00294]产后大鼠胰岛得自P-02岁大鼠。成年大鼠胰岛得自6-8周龄大鼠。胎大鼠胰岛如下获得。在妊娠日E21处死妊娠雌性大鼠。由子宫中取出胎儿。从各幼仔中解剖出10-14个胰腺，用Hanks缓冲液清洗两次。合并胰腺，悬浮在6ml 1mg/ml胶原酶(XI型，Sigma)中，并于37℃以恒定振荡温育8-10分钟。通过加入10体积的冰冷Hanks缓冲液，接着用Hanks缓冲液清洗3次，终止消化。然后利用Ficoll梯度纯化胰岛，并在有或没有加入1μM IBMX的10％胎牛血清(FBS)/RPMI培养基中培养。在第5天结束时，将20个胰岛人工挑选入各个试管中，并检测静态胰岛素释放。一般地讲，首先用KFP缓冲液清洗胰岛，然后与1ml含3mM(低)葡萄糖的KFP缓冲液在恒定振荡下于37℃温育30分钟。在收集上清液后，接着将胰岛与17mM(高)葡萄糖于37℃温育1小时。使用[¹²⁵I]-RIA试剂盒通过放免测定(RIA)检测低或高葡萄糖刺激释放的胰岛素。在200ng/ml PYY、PP、CCK、NPK、NPY、肠促胰液素、GLP-1或铃蟾肽存在下培养E21胎胰岛5天。

[00295]还提供使用Zucker糖尿病肥胖(ZDF)雄性大鼠的示例性体内测定，ZDF是在喂饲标准啮齿动物饮食Purina 5008的所有fa/fa雄性大鼠中自发表现出糖尿病的近交(＞F30代)大鼠模型。在ZDF fa-fa雄性大鼠中，在约7周龄开始出现高血糖，葡萄糖水平(喂饲)通常在10-11周龄达到500mg/DL。在发展糖尿病的过程中胰岛素水平(喂饲)高。但是，到第19周龄时，胰岛素降低至约同窝出生的瘦大鼠对照的水平。肥胖大鼠的甘油三酯和胆固醇水平一般高于瘦大鼠的水平。在检测中，每组6只大鼠的3组7周龄ZDF大鼠通过ALZA泵接受14天的输注治疗：1)溶媒对照，2)和3)，具有两种不同剂量(分别为100pmol/kg/小时和500pmol/kg/小时)的PYY。在输注前和输注后的第7天和第14天进行4种检测：1)血浆葡萄糖水平，2)血浆胰岛素水平，和3)血浆甘油三酯(TG)水平，以及口服葡萄糖耐受(OGTT)测试。因此，这些测定可与本发明的化合物一起用于测试所需活性。

[00296]杂合多肽的其它设想用途包括在中枢神经系统中降低铝(Al)浓度的方法(参见美国专利6,734,166，其通过引用整体结合到本文中)，用于治疗、预防或延迟Alzheimer病发作。测定对Al的作用的实验是本领域已知的，可见于使用二倍体和Ts小鼠的美国专利6,734,166。这些小鼠单独圈养在

牌代谢笼或聚丙烯笼中，在实验前给小鼠3天时间适应笼。在实验过程中小鼠自由获取食物(

NIH Rat andMoust/Auto 6F5K52，St.Louis，Mo.)和水，除了在安乐死前16小时以外，此时不提供食物。每天对小鼠皮下注射活性化合物或盐水。对于一个实验，在第13天结束时处死小鼠，对另一个实验，在第3天结束时处死小鼠，收集样品。在干净的聚四氟乙烯衬垫中制备小鼠脑样品并称重，用于在低痕量元素级硝酸中通过微波消化进行分析。然后使用电感耦合等离子体质谱测定法(Nuttall等，Annals of Clinical and LaboratoryScience 25，3，264-271(1995))分析样品的Al含量。分析过程中的所有组织处理都在使用HEPA空气过滤系统的洁净室环境中进行，以使本底污染最小化。本发明的杂合体可以用于预防和治疗肾病，包括高血压性和糖尿病÷肾病，和与胰岛素抗性和代谢综合征有关的肾病。杂合体尤其通过下述方式达到这些目的：改善或预防高血压的恶化，内皮功能，肾功能，和肾小球硬化症。在一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗肾病(包括高血压性和糖尿病性肾病，或与胰岛素抗性有关的肾病)的方法，其包含施用本发明的化合物。杂合体还可以用于改善具有减少的血管舒张能力、具有肾小球硬化症或肾小球流动的任何其它减少的患者的内皮功能。这样的内皮功能的改善，可以用于降低高血压和改善肾小球毛细血管的功能。在其它实施方案中，本发明的分子可以用于预防肾病向ESRD的发展，预防、减缓蛋白尿和/或肾小球硬化症的发展，治疗或改善蛋白尿和/或肾小球硬化症。杂合体可以用于减少经受心律失常的风险，预防或治疗心律失常。杂合体可以在心脏缺血、心脏缺血-再灌注、和充血性心力衰竭患者中提供抗心律失常作用。例如，已经发现肠降血糖素GLP-1会减少心脏损害，并增强具有这些病症的患者的恢复。肠降血糖素，包括GLP-1，是葡萄糖-依赖性的促胰岛素激素。GLP-1和毒蜥外泌肽可以有效地增强外周葡萄糖摄入，而不诱导危险的低血糖。它们也可以有力地抑制胰高血糖素分泌，这独立于它的促胰岛素作用，从而基本上比胰岛素更有力地减少血浆游离脂肪酸(FFA)水平。已经将高FFA水平视作心肌缺血过程中的一个重要中毒机理。在另一个实施方案中，杂合体可以用于预防和治疗心律失常，其可靠地减少与再灌注和缺血有关的损伤，并增强患者恢复。在另一个实施方案中，急性中风或出血之后的杂合体治疗、优选静脉内给药，会通过抑制胰高血糖素和维持血糖正常或轻度低血糖，没有严重低血糖或其它不利副作用的危险，提供优化胰岛素分泌、增加脑合成代谢、增强胰岛素效力的方式。在一个实施方案中，这样的GIP杂合体含有GLP1或毒蜥外泌肽部分。在进一步的实施方案中，GLP1或毒蜥外泌肽家族组件与利尿钠肽家族肽、胰淀素家族肽、尿皮质素家族肽组件组合，以获得上文描述的心血管状况或疾病的治疗或预防的增强。

[00297]充血性心力衰竭是发达国家发病率和死亡率的最显著原因之一。它是由于各种特征在于收缩量损失和/或体积或压力过载的心血管疾病的晚期表现而发生的(Fortuno，Hypertension 38：1406-1412(2001))。许多研究提出心脏重塑是CHF的临床阶段的主要决定因素，而无论其病因学如何(Fedak，Cardiovascular Pathology 14：1-11(2005))。因此，心脏重塑是治疗充血性心力衰竭的有吸引力的靶。因此，需要预防或减少心脏重塑的试剂。实际上，文献中鉴定了对能够减少心脏重塑的分子的需要(Fortuno，Hypertension 38：1406-1412(2001))。文献报道表明，减弱血管重塑也改变心肌受损后的存活率，而使重塑恶化的治疗与不良结果相关，即使它们改进了收缩功能(参见Somasundaram，Med.Clin.N.Am.，88：1193-1207(2004))。

[00298]因此，本文提供了治疗心血管疾病的方法，在一个实施方案中是急性或慢性心力衰竭，在另一实施方案中是心肌梗塞，在另一实施方案中是缺血性心力衰竭，在另一实施方案中是充血性心力衰竭。在一个实施方案中，通过预防或改善心血管系统的高血糖诱导的损伤，提供该治疗。在一个实施方案中，该治疗是通过提供心脏保护作用而提供的。在另一实施方案中，该治疗是通过预防心脏重塑、延迟心脏重塑的发生、减弱心脏重塑或改善心脏重塑而提供的。一般地，心脏重塑是指心脏的任何心脏区室的重新结构化和重新塑形。如上文的描述，并且不希望受到理论的限制，心脏重塑可以描述为心肌损害后的基因组改变，随后发生分子、细胞和间质改变，导致心脏区室的重新结构化和重新塑形。所述重新结构化和重新塑形临床上可以表现为心脏大小、形状和功能的改变。心脏重塑可以反应于对心肌的任何刺激或刺激组合而发生。在一个实施方案中，心脏重塑是心脏受损的结果。作为非限制性的实例，心脏重塑可以反应于由心肌梗塞、高血压、体积过载(例如由于主动脉反流)、感染、炎症、糖尿病、病毒性心肌病和特发性心肌病导致的心肌受损而发生。

[00299]一方面，通过施用本发明的杂合体，预防、延迟、减弱或改善心脏重塑。杂合体可以包括改善(改进)以下至少一种心脏参数的能力：左室舒张功能、E波与A波的比例、左室终末舒张压、心输出量、心脏收缩力、左室质量、左室质量与体重的比例、左室体积、左房体积、左室终末舒张尺寸或收缩尺寸、梗塞大小、运动能力、运动效率或心脏收缩和/或舒张功能的任何测量值；或减弱、延迟或预防心脏区室扩大或对上述心脏参数之一的有害作用。在一个实施方案中，杂合体含有肠降血糖素家族的成员，如毒蜥外泌肽-4，其结合于GLP-1或毒蜥外泌肽受体。在本发明方法的上下文中，预防或改善心脏重塑可以包括以任何量减少心脏重塑。在一种实施方案中，预防或改善心脏重塑伴随充血性心力衰竭的风险降低。

[00300]在一种实施方案中，心脏重塑改善或减少到小于不施用杂合体时心脏重塑量的约1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。在另一实施方案中，与不施用杂合体时心脏重塑的发生相比，心脏重塑可以略微减少、中度减少、显著减少或基本消除。本文用到的心脏重塑的略微减少是指与不施用杂合体时的心脏重塑相比，心脏重塑减少约25％或更少。心脏重塑的中度减少是指与不施用杂合体时的心脏重塑相比，心脏重塑减少约50％或更少。心脏重塑的显著减少是指与不施用杂合体时的心脏重塑相比，心脏重塑减少约80％或更少。心脏重塑的基本消除是指与不施用杂合体时的心脏重塑相比，心脏重塑减少约80％或更多。

[00301]为了评估预防、改善、减弱或延迟心脏重塑的程度，可以采用本领域技术人员可以获得的任何方式。例如，可以通过分析包括但不限于以前的心脏检查、LV质量，或在受试者的生命过程中通过测量心脏区室尺寸和壁厚度和运动(例如通过超声心动图或用E波与A波的峰速度比(E/A比)对左室(LV)舒张功能定量)，评估心脏重塑。

[00302]在一种实施方案中，可以通过施用杂合体预防、改善、减轻或延迟心脏重塑而获益的受试者可以由技术人员根据与受试者相关的状况和危险因素来确定。在一个实施方案中，受试者可能需要预防、改善、减轻或延迟心脏重塑。在另一实施方案中，受试者可能需要预防、改善、减弱或延迟心脏重塑。一个危险因素可能是对心脏进行心脏重塑的遗传倾向。本文提供的本方法的示例性样本和受试者包括曾经经历、正在经历与心脏重塑相关的状况或有经历该状况的危险性的那些。与心脏重塑相关的状况可以是任何这样的状况或障碍，即其中已知发生心脏重塑，或认为心脏重塑是一种危险因素。与心脏重塑相关的状况包括例如心肌梗塞、炎症、缺血/再灌注、氧化应激、肺心病、晚期糖基化终产物、异常心脏壁拉伸、交感神经刺激、心肌炎、高血压、病毒性心肌病、特发性心肌病、心脏移植和心脏手术。

[00303]如上文提到的，可以由于急性事件或慢性状况而施用杂合体。不论是急性事件还是慢性状况，本文提供的方法包括用杂合体进行慢性治疗。因此，慢性治疗的长度可以包括经过该事件的时间和认为受试者从急性事件恢复或从慢性状况恢复的时间。

[00304]慢性施用杂合体或用杂合体治疗，用于预防、减弱、延迟或改善心脏重塑可能是有理由的，其中鉴定出没有与心脏重塑相关的特定的瞬时事件或瞬时状况。慢性施用包括基于对心脏重塑的一般倾向，或基于非瞬时的倾向性状况(例如可能未鉴定或无法消除的非瞬时状况，如糖尿病)，在一段连续、但不确定的时间中施用杂合体。在本文提供的方法中，杂合体可以慢性施用，以便预防表现出充血性心力衰竭(无论病因学如何)的受试者中的心脏重塑。在有发生充血性心力衰竭的危险性的糖尿病中也可以涉及慢性施用用于预防或改善心脏重塑的杂合体。也可以在慢性基础上施用杂合体，以便保护接受心脏移植的个体中的移植器官。当杂合体是慢性施用时，施用可以持续任何长度的时间。但是，慢性施用通常施用较长的时间。例如，在示例性实施方案中，慢性施用持续6个月、1年、2年或更长。

[00305]在另一实施方案中，本文公开的方法导致心脏收缩力改进。改进心脏收缩力可以包括心肌细胞收缩的能力。为了评估心脏收缩力的改进，可以采用任何评估方式。例如，临床观察结果，如心输出量的增加或心率的减少，或上述两者，可以导致确定心脏收缩力增加。或者，在体内，可以通过确定左室缩短比例的增加，评估心脏收缩力的增加。可以通过可获得的方式如超声心动图观察到左室的缩短比例。在评估心脏收缩力的增加中，左室的缩短比例可以是与施用杂合体之前的缩短比例相比的任何量的增加。例如，缩短的增加可以是约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％或超过约200％。

[00306]另一方面，提供了通过施用杂合体减少或预防心房重塑的方法。可以与施用杂合体前的心房重塑进行比较，评估心房重塑的减少或预防。心房重塑的所述减少或预防的疗效包括心房纤颤的减少。另一方面，提供了通过施用杂合体，减少或预防心室重塑的方法。可以与施用杂合体前的心室重塑进行比较，评估心室重塑的减少或预防。

[00307]另一方面，提供了预防和治疗方法。考虑急性或慢性基础上的治疗。此外，急性基础上的治疗可以延伸到慢性治疗，如果如此说明。慢性治疗考虑为长于2周。在某些实施方案中，慢性治疗可以常于1个月、3个月、6个月、1年、2年、5年，或终身治疗。另一方面，本文提供了治疗或预防有需要的受试者中与心脏重塑相关的状况的方法。该方法一般包括给受试者施用有效预防或改善心脏重塑的量的杂合体，其中由此改进、预防或延迟与重塑相关的状况。如本文描述的，可以通过任何方式施用杂合体，包括与其它提供心血管益处的试剂一起施用。

[00308]在另一实施方案中，本文提供的方法进一步包括鉴定需要所述治疗的受试者。任何有效的标准都可以用于确定受试者可能从杂合体的施用获益。例如，诊断心脏病和/或糖尿病的方法，以及鉴定具有发生这些状况的危险性的个体的程序，是本领域技术人员公知的。所述程序可以包括临床测试、体检、个别检查和评估家族史。

[00309]在另一个实施方案中，能降低胰岛素抵抗或增强胰岛素敏感性的杂合体可以用于治疗多囊性卵巢综合征(PCOS)。施用本发明的杂合体，可以减少或预防经受PCOS的受试者中的胰岛素抵抗。在另一个实施方案中，杂合体预防经受PCOS的受试者中的2型糖尿病的发病。其它杂合体可以恢复经受PCOS的受试者的规则的月经、排卵或生育力。在一个实施方案中，这样的GIP杂合体含有GLP1或毒蜥外泌肽部分，用于结合和激活GLP1受体。

[00310]本发明的化合物具有广泛的生物活性，有一些涉及其抗分泌特性和抗运动性特性。所述化合物可通过与上皮细胞直接相互作用，或者可能通过抑制刺激肠分泌的激素或神经递质的分泌，抑制胃肠分泌。抗分泌特性包括抑制胃和/或胰腺分泌，可用于治疗或预防疾病和障碍，包括胃炎、胰腺炎、巴雷特食管和胃食管反流疾病。

[00311]本发明的化合物用于治疗许多胃肠疾病(参见例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill Inco，New York，第12版)，这些胃肠疾病与过量肠电解质和水分泌和降低的吸收相关，例如传染性腹泻、炎性腹泻、短肠综合征或通常在手术例如回肠造口术后发生的腹泻。传染性腹泻的实例包括但不限于急性病毒性腹泻、急性细菌性腹泻(例如沙门氏菌、弧形杆菌和梭状芽胞杆菌或由于原生动物感染)或旅行者腹泻(例如诺瓦克病毒或轮状病毒)。炎性腹泻的实例包括但不限于吸收障碍综合征、热带口炎性腹泻、慢性胰腺炎、克隆氏病、腹泻和肠易激综合征。还已经发现，本发明的肽可用于治疗与胃肠疾病相关的紧急情况或危及生命的情况，例如在手术后或由于霍乱。

[00312]和仅用于治疗肠损伤相关综合征(例如腹泻)相反，本发明的化合物还可用于治疗或预防肠损伤。这样的肠损伤可为溃疡性结肠炎、炎性肠病、肠萎缩、肠粘膜脱落和/或肠粘膜功能丧失或为这些疾病的后果(参见WO 03/105763，其通过引用整体结合到本文中)。如WO03/105763所述，用于此活性的检测包括处于12:12昼:夜循环中圈养的250-300g 11周龄雄性HSD大鼠，允许其随意获取标准啮齿动物饮食(Teklad LM 485，Madison，WI)和水。动物在实验前禁食24小时。先前Morris GP等，“Hapten-induced model of chronic inflammation andulceration in the rat colon”1989；96：795-803已描述了慢性结肠炎的简单且可重现的大鼠模型。其具有相对较长的炎症和溃疡时程，提供了以明确可控方式研究结肠炎疾病病理生理学和评价潜在可应用于人炎性肠病的新治疗的机会。

[00313]用3％异氟烷麻醉大鼠，将大鼠置于设定在37℃的可调节加热垫上。将管针经直肠插入结肠7cm。如Mazelin等，Juton Nerv Syst.1998；73：3845所述，通过管针将溶解在50％乙醇(v/v)中的半抗原三硝基苯磺酸(TNBS)以30mg/kg剂量、0.4-0.6mL总体积送递入结肠腔中。对照组结肠内接受盐水溶液(NaCl 0.9％)。

[00314]诱发结肠炎后4天，切除麻醉大鼠的结肠，然后使大鼠断头安乐死。检测离体的结肠和脾的重量，对结肠拍照，以记录总体形态学损伤。炎症被定义为充血和肠壁变厚的区域。

[00315]本发明的杂合多肽还可用于治疗或预防胰腺肿瘤(例如抑制胰腺肿瘤增殖)。本发明的方法包括减少肿瘤细胞增殖。可按照本发明治疗的良性胰腺肿瘤细胞的类型包括浆液性囊腺瘤、微囊性肿瘤和囊性-实体肿瘤。该方法还有效降低恶性胰腺肿瘤细胞(例如由胰腺导管、腺泡或胰岛产生的癌)的增殖。美国专利5,574,010(其通过引用整体结合到本文中)提供了测试抗增殖特性的示例性实验。例如，′010专利指出，PANC-1和MiaPaCa-2是两种人胰腺腺癌细胞系，可由提供者如美国典型培养物保藏中心ATCC(Rockville，Md)购买获得。在NAPCO水夹套式5％CO₂培养箱中，在补加10％胎牛血清、29.2mg/L谷氨酰胺、25μg庆大霉素、5ml青霉素、链霉素和两性霉素B溶液(JRH Biosciences，Lenexa，Kans.)的RPMI-1640培养基中，于37℃培养两种肿瘤细胞。当肿瘤细胞达到铺满单层时，1周1-2次用0.25％胰蛋白酶(Clonetics，SanDiego，Calif.)分离所有细胞系。在冷冻离心机中于4℃以500g沉淀细胞7分钟，将细胞重悬浮在无胰蛋白酶的强化RPMI 1640培养基中。用血细胞计数板和锥虫蓝计数活细胞。

[00316]将每种类型的10,000、20,000、40,000和80,000细胞以每孔200μl培养基总体积加入到96孔微量培养板(Costar，Cambridge，Mass.)中。在加入PYY或测试肽之前，使细胞贴壁24小时。在加入肽之前更换新鲜培养基。将胰腺肿瘤细胞和PYY或测试化合物继续在体外温育6小和36小时。将PYY以250pmol、25pmol和2.5pmol/孔的剂量加入到细胞中(N＝14)。将测试化合物以400pmol、40pmol和4pmol/孔的剂量加入到细胞中(N＝14)。对照孔接受2μl 0.9％盐水，以模拟体积和对贴壁肿瘤细胞的物理干扰。每个96孔板都含有18个对照孔，使得可在实验过程中在每个板内进行对比。对于PANC-1和MiaPaCa-2细胞，均使用各种浓度的PYY或测试化合物重复6次96孔板检测。

[00317]在温育期结束时，将溴化3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-二苯基四唑—溴化MTr四唑(Sigma，St.Louis，Mo.)以0.5mg/ml加入到新鲜培养基中。更换培养基，将肿瘤细胞与溴化MTT四唑鎓于37℃温育4小时。在温育结束时，对培养基抽气。将甲臜晶体沉淀溶解在200μl二甲基亚砜(Sigma，St.Louis，Mo.)中。通过用ELISA读数器(MolecularDevices，Menlo Park，Calif.)获得500nm波长的吸光读数，对溶解性甲臜进行定量。MTT测定检测线粒体NADH依赖性脱氢酶活性，其已成为定量肿瘤细胞体外化疗反应性的最敏感和最可靠的方法之一。(Alley，M.C.等，Cancer Res.，48：589-601，1988；Carmichael，J.等，Cancer Res.，47：936-942，1987；McHale，A.P.等，Cancer Lett.，41：315-321，1988；和Saxton，R.E.等，J.Clin.Laser Med.and Surg，10(5)：331-336，1992)。通过对相同测试条件的孔分组，并利用单因素ANOVA鉴别对照和各种肽浓度治疗之间的差异，分析550nm的吸光读数。

[00318]还提供示例性的体内测定。利用肽PYY和测试化合物检测人胰腺导管腺癌Mia Paca-2的体内生长抑制。将数千至100,000个人Mia PaCa-2细胞同位移植至48只雄性无胸腺小鼠中。1周后，用PYY或测试化合物以200pmol/kg/小时经微渗透泵治疗动物4周。对应的培养物接受盐水。在处死时，检测肿瘤大小和质量。通过组织学切片证实，对照小鼠在胰腺中有显著的人癌生长。在第9周时，90％的对照小鼠具有实质性转移疾病。测试治疗小鼠中肿瘤质量降低达60.5％，PYY治疗小鼠中降低达27％。

[00319]杂合体也可以用于治疗性和预防性处理与神经元损失或功能障碍有关的神经学和神经系统病症，包括但不限于帕金森病，阿耳茨海默病，亨延顿舞蹈病，ALS，中风，ADD，和神经精神病综合征，和用于增强或促进哺乳动物的学习、记忆和认知。在这方面尤其有用的是含有毒蜥外泌肽或GLP1活性部分的GIP杂合体，更具体地，至少包含N-末端7-15个氨基酸或其类似物例如HSEGTFTSD(SEQ ID NO.378)的那些。

[00320]在优选实施方案中，对于所有适应症，以单剂量或分剂量或受控持续释放的约0.5μg/天至约5mg/天的剂量，或以每剂约0.01μg/kg至约500μg/kg，更优选约0.05μg/kg至约250μg/kg，最优选约50μg/kg以下，外周施用本发明的杂合多肽。在这些范围中的剂量随每种类似物或衍生物的效能而变化，当然，剂量可由本领域技术人员确定。

[00321]在本发明方法中，本发明的杂合多肽可单独地或与一种或多种对降低营养物利用度具有长期或短期作用的其它化合物和组合物一起施用，其它化合物和组合物包括但不限于含胰淀素或胰淀素类似物激动剂、鲑鱼降钙素、缩胆囊素(CCK)或CCK激动剂、瘦蛋白(OB蛋白)或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物激动剂或者GLP-1或GLP-1类似物激动剂的其它化合物和组合物。合适的胰淀素激动剂包括例如[^25，28，29Pro-]人胰淀素(SEQ ID NO：67)(也称为“普兰林肽”，述于美国专利第5,686,511和5,998,367号)。使用的CCK优选为CCK八肽(CCK-8)，更优选是其硫酸化形式。瘦蛋白论述于例如(Pelleymounter等，Science 269：540-3(1995)；Halaas等，Science 269：543-6(1995)；Campfield等，Science 269：546-9(1995))。合适的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4，毒蜥外泌肽激动剂化合物包括例如描述于PCT公开WO 99/07404、WO 99/25727和WO 99/25728的化合物。

[00322]如本文所讨论的，本发明的杂合体可以与一种或多种其它试剂分开或一起施用，以便获得额外的益处或增强杂合体或其它试剂的作用。例如，抗肥胖杂合体可以与抗肥胖剂或心脏保护或抗高血压剂一起施用，这取决于需要治疗的受试者固有的危险因素或需要的治疗结果。与杂合体一起施用(分开或混合；在之前、同时或之后)的抗肥胖剂包括5-羟色胺(5HT)转运抑制剂，包括但不限于，帕罗西汀、氟西汀、氟苯丙胺、氟伏沙明、舍曲林(sertraline)和依米帕明。抗肥胖剂还包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，包括但不限于右旋氟苯丙胺、氟西汀、西布茶明(例如，

)和第6,365,633号美国专利以及第WO 01/27060和WO 01/162341号PCT专利申请公开文本中描述的那些，其全文引入本文作为参考。这样的5HT转运抑制剂和5-羟色胺再摄取抑制剂、类似物、衍生物、制品、制剂、药物组合物、剂量和施用途径在之前已经描述过了。

[00323]抗肥胖剂还包括选择性5-羟色胺激动剂和选择性5-HT2C受体激动剂，包括但不限于，第3,914,250号美国专利；和第WO02/36596、WO 02/48124、WO 02/10169、WO 01/66548、WO 02/44152；WO 02/51844、WO 02/40456和WO 02/40457号PCT申请公开文本，其全文引入本文作为参考。这样的选择性5-羟色胺激动剂和5-HT2C受体激动剂、含有这样的激动剂组合物、以及适于本发明方法中使用的施用途径是本领域已知的。参见，例如，Halford等人(2005)Curr.DrugTargets 6：201-213和Weintraub等人(1984)Arch.Intern.Med.144：1143-1148。

[00324]抗肥胖剂还包括中枢大麻素受体(CB-1受体)的拮抗剂/反向激动剂，包括但不限于，利莫那班(Sanofi Synthelabo)、和SR-147778(Sanofi Synthelabo)。CB-1拮抗剂/反向激动剂，衍生物、制品、制剂、药物组合物、剂量和施用途径之前已经描述于，例如，第6,344,474、6,028,084、5,747,524、5,596,106、5,532,237、4,973,587、5,013,837、5,081,122、5,112,820、5,292,736、5,624,941号美国专利；第EP-656354和EP-658546号欧洲专利申请；和第WO 96/33159、WO98/33765、WO 98/43636、WO 98/43635、WO 01/09120、WO 98/31227、WO 98/41519、WO 98/37061、WO 00/10967、WO 00/10968、WO 97/29079、WO 99/02499、WO 01/58869和WO 02/076949号PCT申请公开文本中，其全文引入本文作为参考。

[00325]抗肥胖剂还包括黑皮质素和黑皮质素激动剂。MC4R在能量平衡和肥胖中起作用。参见，例如，Anderson等人(2001)Expert Opin.Ther.Patents 11：1583-1592，Speake等人(2002)Expert Opin.Ther.Patents12：1631-1638，Bednarek等人(2004)Expert Opin.Ther.Patents14：327-336。黑皮质素激动剂，包括但不限于，MC4R激动剂，且适于本发明方法使用的含有这样的激动剂的组合物是本领域已知的。MCR激动剂、MC4R激动剂、衍生物、制品、制剂、药物组合物、剂量和施用途径之前已描述于，例如，以下PCT专利公开文本中，其全文引入本文作为参考：WO 03/007949、WO 02/068388、WO 02/068387、WO02/067869、WO 03/040117、WO 03/066587、WO 03/068738、WO03/094918和WO 03/031410。

[00326]抗肥胖剂还包括代谢型谷氨酸亚型5受体(mGluR5)拮抗剂，包括但不限于，比如2-甲基-6-(苯乙炔基)-吡啶(MPEP)和(3-[(2-甲基-1，3-噻唑-4-基)乙炔基]吡啶)(MTEP)这样的化合物和那些描述于Anderson等人(2003)J.Eur.J.Pharmacol.473：35-40；Cosford等人(2003)Bioorg.Med.Chem.Lett.13(3)：351-4；和Anderson等人(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303：1044-1051中的化合物。

[00327]抗肥胖剂还包括托吡酯((Ortho McNeilPharmaceuticals)，示为抗抽搐剂和抗抽搐剂，但也显示出提高体重减轻。该试剂也可以包括脂酶抑制剂如奥利司他(orlistat)。

[00328]抗肥胖剂还包括神经肽Y1(NPY1)拮抗剂和NPY5拮抗剂。NPY1和NPY5拮抗剂是本领域已知的。参见，例如Duhault等人(2000)Can.J Physiol.Pharm.78：173-185，和第6,124,331、6,214,853和6,340,683号美国专利。NPY1和NPY5拮抗剂、衍生物、制品、制剂、药物组合物、剂量和施用途径之前已描述过。可用于本发明的NPY1拮抗剂，包括：第6,001,836号美国专利；和第WO 96/14307、WO 01/23387、WO 99/51600、WO 01/85690、WO 01/85098、WO 01/85173和WO01/89528号PCT申请公开文本，其全文引入本文作为参考。可用于本发明的NPY5拮抗剂，包括但不限于，第6,140,354、6,191,160、6,258,837、6,313,298、6,337,332、6,329,395、6,340,683、6,326,375和6,335,345号美国专利；第EP-01010691和EP-01044970欧洲专利；和第WO 97/19682、WO 97/20820、WO 97/20821、WO 97/20822、WO 97/20823、WO 98/27063、WO 00/64880、WO 00/68197、WO 00/69849、WO 01/09120、WO 01/85714、WO 01/85730、WO 01/07409、WO 01/02379、WO 01/02379、WO 01/23388、WO，01/23389、WO 01/44201、WO 01/62737、WO 01/62738、WO 01/09120、WO 02/22592、WO 0248152、WO 02/49648和WO 01/14376号PCT专利公开文本中描述的那些化合物。

[00329]抗肥胖剂还包括黑色素浓缩激素(MCH)拮抗剂，其包括比如T-226296(Takeda)这样的黑色素浓缩激素1受体(MCH1R)拮抗剂和黑色素浓缩激素2受体(MCH2R)拮抗剂。MCH受体拮抗剂，衍生物、制品、制剂、药物组合物、剂量和施用途径之前已描述于，例如，第2005/0009815、2005/0026915、2004/0152742、2004/0209865号美国专利申请公开文本；第WO 01/82925、WO 01/87834、WO 02/06245、WO 02/04433和WO 02/51809号PCT专利申请公开文本；和第JP13226269号日本专利申请中，其全文引入本文作为参考。

[00330]抗肥胖剂还包括阿片样物质拮抗剂，包括但不限于描述于第WO 00/21509号PCT申请中的那些。可用于本发明的特定阿片样物质拮抗剂包括但不限于，纳美芬

、3-甲氧基纳曲酮纳洛酮(3-methoxynaltrexone naloxone)、纳曲酮、纳洛肼(naloxonazine)、β-funaltrexamine、δ1([D-Ala2，Leu5，Cys6]-英脑啡肽(DALCE)、异硫氰酸纳屈吲哚(naltrindole isothiocyanate)和nor-binaltorphamine。

[00331]抗肥胖剂还包括食欲肽拮抗剂，包括但不限于，描述于第WO 01/96302、WO 01/68609、WO 02/51232和WO 02/51838号PCT专利申请中的那些。可用于本发明的特定食欲肽拮抗剂包括但不限于，SB-334867-A。

[00332]抗肥胖剂还包括神经肽Y2(NPY2)激动剂，包括但不限于，比如PYY3-36(例如，Batterham等人(2003)Nature 418：650-654)、NPY3-36这样的化合物，和其它比如N乙酰基[Leu(28，31)]NPY 24-36(White-Smith等人(1999)Neuropeptides 33：526-533，TASP-V(Malis等人(1999)Br.J.Pharmacol.126：989-996)、环-(28/32)-Ac-[Lys28-Glu32]-(25-36)-pNPY(Cabrele等人(2000)J.Pept.Sci.6：97-122)这样的Y2激动剂。本发明的抗肥胖剂还包括神经肽Y4(NPY4)激动剂，包括但不限于，比如胰肽(PP)(例如，Batterham等人(2003)J.Clin.Endocrinol.Metab.88：3989-3992)这样的化合物和比如1229U91(Raposinho等人(2000)Neuroendocrinology 71：2-7)这样的其他Y4激动剂。NPY2激动剂和NPY4激动剂、衍生物、制品、制剂、药物组合物、剂量和施用途径之前已描述于，例如，第2002/0141985号美国专利公开文本和第WO 2005/077094号PCT申请公开文本中。

[00333]抗肥胖剂还包括组胺3(H3)拮抗剂/逆激动剂，包括但不限于，描述于第WO 02/15905号PCT申请中的那些，O-[3-(1H-咪唑-4-基)丙醇]氨基甲酸酯(Kiec-Kononowicz等人(2000)Pharmazie55：349-355)、含哌啶的组胺H3-受体拮抗剂(Lazewska等人(2001)Pharmazie 56：927-932)、二苯酮衍生物和相关化合物(Sasse等人(2001)Arch.Pharm.(Weinheim)334：45-52)、取代的N-苯基氨基甲酸酯(Reidemeister等人(2000)Pharmazie 55：83-86)、和proxifan衍生物(Sasse等人(2000)J.Med.Chem.43：3335-3343)。用于本发明的特定H3拮抗剂/逆激动剂包括但不限于，thioperamide、3-(1H-咪唑-4-基)丙基N-(4-戊烯基)氨基甲酸酯、clobenpropit、iodophenpropit、imoproxifan和GT2394(Gliatech)。

[00334]抗肥胖剂还包括缩胆囊肽(CCK)和CCK激动剂。用于本发明的缩胆囊肽-A(CCK-A)激动剂包括但不限于，描述于第5,739,106号美国专利中的那些。特定CCK-A激动剂包括，但不限于，AR-R15849、GI181771、JMV-180、A-71378、A-71623和SR146131。

[00335]抗肥胖剂还包括比如描述于第WO 01/87335和WO02/08250号PCT申请公开文本中的那些的生长素释放肽拮抗剂。生长素释放肽拮抗剂也称为GHS(生长激素促分泌素受体)拮抗剂。因此本发明的组合物和方法包括用GHS拮抗剂取代生长素释放肽拮抗剂。

[00336]抗肥胖剂包括肥胖抑制素(obestatin)和肥胖抑制素类似物和激动剂。肥胖抑制素是一种来源于与生长素释放肽所来源的前体相同的前体的肽。参见，例如Zhang等(2005)Science 310：996-999；Nogueiras等(2005)Science 310：985-986；Pan等(2006)Peptides27：911-916。与生长素释放肽的活性相反，肥胖抑制素似乎通过减少食物摄取、胃排空活动、空肠运动和体重增加，作为食欲减退激素。有用的肥胖抑制素肽包括但不限于Zhang等(2005)Science 310：996-999中描述的那些。

[00337]胰淀素模拟物如普兰林肽、胰淀素-sCT-胰淀素(化合物10)、肠降血糖素如毒蜥外泌肽-4和PPY类似物也是可以作为抗肥胖剂与杂合体一起施用的抗肥胖剂。例如，瘦蛋白-化合物10杂合体可以与毒蜥外泌肽-4、PYY或这两者一起施用。在另一实施方案中，瘦蛋白-PYY类似物杂合体可以与毒蜥外泌肽-4、胰淀素模拟物或这两者一起施用。

[00338]在本文讨论的用于治疗糖尿病和相关疾病的特别感兴趣的实施方案中，是包含毒蜥外泌肽家族和α-MSH组件，以及毒蜥外泌肽和胰淀素家族成员的杂合体。特别感兴趣的是这样的杂合体，即其中毒蜥外泌肽是毒蜥外泌肽-4或其类似物或衍生物，并且胰淀素组分是普兰林肽或胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体。

[00339]在本文讨论的用于治疗肥胖和相关疾病和状况(减少体脂)的特别感兴趣的实施方案中，是包含毒蜥外泌肽家族与α-MSH组件的组合、毒蜥外泌肽与胰淀素家族成员、胰淀素家族成员与PYY家族成员、胰淀素家族成员与CCK家族成员、胰淀素家族成员与α-MSH家族成员、FN-38家族成员、胰淀素家族成员与PYY家族成员、PYY家族成员与另一种相同或不同的PYY家族成员、PYY家族成员与CCK家族成员、PYY家族成员与FN-38家族成员、CCK家族成员与FN-38家族成员的杂合体。特别感兴趣的是这样的杂合体，即其中毒蜥外泌肽是毒蜥外泌肽-4或其类似物或衍生物，胰淀素组分是普兰林肽或胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体，FN38家族成员是FN38或其类似物或衍生物，PYY嵌合体是本文描述的PYY-NPY嵌合体，如US 2006/013547A1的SEQ IDNos.266，437，438，439，442，462，469，470，471和472，以及例如PYY-NPY嵌合体5705。

多肽生产和纯化

[00340]可使用本领域已知的标准重组技术或化学肽合成技术(例如使用自动化或半自动化肽合成仪)，或这二者，制备本文描述的杂合多肽。

[00341]可按照常规技术，在溶液中或固相支持体上合成本发明的杂合多肽。可获得市售的各种自动化合成仪，并可按照已知的方法使用。参见例如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，PierceChemical Co.(1984)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.105：6442(1983)；Merrifield，Science 232：341-7(1986)；以及Barany和Merrifield，ThePeptides，Gross和Meienhofer编辑，Academic Press，New York，1-284(1979)。可用使用NMP/HOBt(选项1)系统的自动化肽合成仪(例如430A型，Applied Biosystems Inc.，Foster City，California)和包含加帽的tBoc或Fmoc化学法(参见Applied Biosystems关于ABI 430A肽合成仪的用户指引，1.3B版，1998年7月1日，第6章，49-70页，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)进行固相肽合成。还可使用Advanced ChemTech合成仪(MPS 350型，Louisville，Kentucky)组装肽。可使用例如Waters Delta Prep 3000系统和C4、C8或C18制备型柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，California)，通过RP-HPLC(制备型和分析型)纯化肽。可容易地合成活性肽，然后用设计用于鉴别反应性肽的筛选实验筛选活性肽。

[00342]或者，可通过本领域众所周知的重组技术生产本发明的杂合多肽。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(1989)。通过重组技术产生的这些杂合多肽可由多核苷酸表达。本领域技术人员会认识到，包括DNA和RNA在内的编码杂合多肽各种不同片段的多核苷酸，考虑到密码子选择的简并性，可由野生型cDNA获得，或者可根据需要工程改造。这些多核苷酸序列可掺入有利于mRNA在微生物宿主中转录和翻译的密码子。按照本领域众所周知的方法，可容易地构建这种生产序列。参见例如WO83/04053。以上多核苷酸还可任选地编码N-末端甲硫氨酰残基。可利用本领域已知的方法制备用于本发明的非肽类化合物。例如，可使用本领域已知的方法制备含磷酸的氨基酸和含这些氨基酸的肽。参见例如Bartlett和Landen，Bioorg Chem.14：356-77(1986)。

[00343]可利用各种各样的表达载体/宿主系统，以包含和表达杂合多肽编码序列。这些系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。下文描述了蛋白重组表达的示例性方案。

[00344]因此，本发明提供的多核苷酸序列用于产生新且有用的病毒和质粒DNA载体、新且有用的转化和转染原核和真核宿主细胞(包括在培养基中生长的细菌、酵母和哺乳动物细胞)以及能够表达本发明杂合多肽的宿主细胞的新且有用的培养生长方法。在待缓解嵌合体的组分肽激素生产不足或要满足其水平增加需要的情况下，编码本文杂合多肽的多核苷酸序列可用于基因治疗。

[00345]本发明还提供本发明杂合多肽的重组DNA生产方法。提供由含杂合多肽编码核酸的宿主细胞生产该杂合多肽的方法，其包括：(a)在有利于表达此DNA分子的条件下培养含该杂合多肽编码多核苷酸的所述宿主细胞；和(b)获得该杂合多肽。

[00346]宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括细菌、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞或其它细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。

[00347]表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统对本领域技术人员来说也是众所周知的。可根据加工表达蛋白或生产某些用于提供蛋白活性的翻译后修饰的特定能力，选择宿主细胞株。这样的多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“前原”形式蛋白的翻译后加工对正确的插入、折叠和/或功能可能也很重要。不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对这样的翻译后活性具有特定的细胞机器和特征机制，可对宿主细胞进行选择，以确保导入的外源蛋白的正确修饰和加工。

[00348]或者，可使用酵母系统生产本发明的杂合多肽。通过PCR扩增杂合多肽cDNA的编码区。使用一个含α交配因子基因核苷酸1-20的引物和与该基因核苷酸255-235互补的另一个引物，在PCR反应中由酵母基因组DNA扩增编码酵母前-原-α前导序列的DNA(Kurjan和Herskowitz，Cell，30：933-43(1982))。将前-原-α前导编码序列和杂合多肽编码序列片段连接入含酵母乙醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，使得该启动子引导由融合至成熟杂合多肽的前-原-α因子组成的融合蛋白的表达。如Rose和Broach，Meth.Enz.185：234-79，Goeddel编辑，AcademicPress，Inc.，San Diego，California(1990)所述，载体进一步包含克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2-微米”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别用于细菌和酵母中的选择。leu-2d基因还有利于增加质粒在酵母中的拷贝数，以诱导较高水平的表达。REP1和REP2基因编码蛋白参与质粒拷贝数的调节。

[00349]使用已知方法，例如乙酸锂处理(Steams等，Meth.Enz.185：280-97(1990))，将在前述段落中描述的DNA构建体转化入酵母细胞中。当生长培养基中的葡萄糖耗尽时诱导ADH2启动子(Price等，Gene55：287(1987))。前-原-α序列影响细胞分泌融合蛋白。与此相伴的是酵母KEX2蛋白切开成熟PYY类似物多肽和前-原序列(Bitter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5330-4(1984))。

[00350]还可以使用市售的表达系统，例如Pichia表达系统(Invitrogen，San Diego，California)，按照生产商的说明，在酵母中重组表达本发明的杂合多肽。此系统也依靠前-原-α序列引导分泌，但插入片段的转录在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)驱动。通过例如用于由细菌和哺乳动物细胞上清液纯化杂合多肽的方法，由酵母生长培养基中纯化分泌的杂合多肽。

[00351]或者，可将编码杂合多肽的cDNA克隆入杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，San Diego，California)中。然后按照生产商的指引(PharMingen)，使用含此杂合多肽的载体感染无sF9蛋白培养基中的草地夜蛾细胞，并生产重组蛋白。使用肝素-Sepharose柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)和串接的分子量筛分柱(Amicon，Beverly，Massachusetts)，由培养基中纯化和浓缩蛋白，并重悬浮在PBS中。SDS-PAGE分析显示单一条带，确定蛋白大小，用Proton 2090肽测序仪进行Edman测序确认其N-末端序列。

[00352]例如，可将杂合多肽编码DNA序列克隆入含所需启动子和任选前导序列的质粒中(参见例如Better等，Science 240：1041-3(1988))。该构建体的序列可通过自动化测序确认。然后使用采用CaCl₂温育和细菌热休克处理的标准方法将质粒转化入大肠杆菌菌株MC1061中(Sambrook等，出处同上)。转化的细菌在补加羧苄青霉素的LB培养基中培养，通过在合适的培养基中生长诱导表达蛋白的生产。如果存在前导序列，则前导序列影响杂合多肽的分泌，并在分泌过程中被切除。利用下文描述的方法由细菌培养基中纯化分泌出的重组蛋白。

[00353]或者，本发明的杂合多肽可在昆虫系统中表达。用于蛋白表达的昆虫系统是本领域技术人员周知的。在一个这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为在草地夜蛾细胞或银纹夜蛾(Trichoplusia larvae)中表达外源基因的载体。将杂合多肽编码序列克隆入病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并处于多角体蛋白启动子控制之下。杂合多肽的成功插入将使多角体蛋白基因失活，产生没有外壳蛋白包被的重组病毒。然后使用重组病毒感染草地夜蛾细胞或银纹夜蛾，在其中表达杂合多肽(Smith等，J.Virol.46：584(1983)；Engelhard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3224-7(1994))。

[00354]在另一个实施例中，可通过PCR扩增编码杂合多肽的DNA序列，并将其克隆入合适的载体中，例如pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)。pGEX载体设计用于生产融合蛋白，其包含由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入到载体克隆位点中的DNA片段编码的蛋白。可生产含例如合适切割位点的PCR引物。然后可由融合蛋白的GST部分切割重组融合蛋白。将pGEX-3X/PYY类似物多肽构建体转化入大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，California)中，分离单个转化子，并在LB培养基(补加羧苄青霉素)中于37℃培养至600nm波长的光密度为0.4，接着在0.5mM异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)存在下再温育4小时。纯化单个转化子的质粒DNA，并使用自动化测序仪部分测序，以确认存在正确方向的目的PPF杂合多肽编码基因插入片段。

[00355]预期可作为不溶性包函体在细菌中生产的融合蛋白可如下纯化。通过离心收集细胞；用0.15M NaCl、10mM Tris(pH 8)、1mMEDTA清洗；并用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)于室温处理15分钟。超声澄清裂解物，通过以12,000×g离心10分钟沉淀细胞碎片。将含融合蛋白的沉淀重悬浮在50mM Tris(pH 8)和10mM EDTA中，经50％甘油分层，并以6000×g离心30分钟。沉淀重悬浮在无Mg⁺⁺和Ca⁺⁺的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离重悬浮沉淀，进一步纯化融合蛋白(Sambrook等，出处同上)。凝胶浸泡在0.4M KCl中，以显现蛋白，切下蛋白，并在没有SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果GST/PYY类似物多肽融合蛋白在细菌中作为可溶性蛋白生产，则其可使用GST纯化模块(Pharmacia Biotech)纯化。

[00356]融合蛋白可经历消化，以切开GST和PPF杂合多肽。消化反应物(20-40μg融合蛋白、20-30单位人凝血酶(4000U/mg(Sigma)的0.5mL PBS溶液)于室温温育16-48小时，并上变性SDS-PAGE凝胶，以分级分离反应产物。将凝胶浸泡在0.4M KCl中，以显现蛋白条带。使用自动化测序仪(Applied Biosystems 473A型，Foster City，California)，通过部分氨基酸序列分析，可确认对应于杂合多肽预期分子量的蛋白条带的标识。

[00357]在特别优选的本发明杂合多肽重组表达方法中，可通过磷酸钙法，用在pCMV载体(5′CMV启动子，3′HGH聚腺苷酸序列)中含杂合多肽cDNA的质粒和pSV2neo(含neo抗性基因)共转染293细胞。优选地，载体应当在转染前用ScaI线性化。同样，可使用替代性构建体，其使用相似的pCMV载体，具有掺入的neo基因。通过在10-14天的含0.5mg/mL G418(新霉素样抗生素)的生长培养基中有限稀释，由单个细胞克隆选择稳定细胞系。通过ELISA或蛋白质印迹筛选细胞系的杂合多肽表达，并扩增高表达细胞系，以用于大规模生长。

[00358]优选将转化细胞用于长期、高产的蛋白生产，因此需要稳定表达。一旦应用含选择标记以及所需表达盒的载体转化这样的细胞，就可使细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后将其转换至选择培养基。选择标记用于赋予选择抗性，其存在使得成功表达导入序列的细胞可生长和回收。可使用适于该细胞的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性簇。

[00359]可使用多种选择系统回收已转化用于重组蛋白生产的细胞。这样的选择系统包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。另外，抗代谢抗性可用作dhfr、gpt、neo、also和hygro的选择基础，dhfr赋予对氨甲喋呤的抗性；gpt赋予对霉酚酸的抗性；neo赋予对氨基糖苷G418的抗性；also赋予对氯磺隆的抗性；而hygro赋予对潮霉素的抗性。其它可使用的选择基因包括trpB或hisD，trpB允许细胞利用吲哚代替色氨酸，hisD允许细胞利用组氨醇代替组氨酸。产生用于鉴别转化子的目测指示的标记包括花色素苷、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS和荧光素酶及其底物荧光素。

[00360]可使用自动化肽合成和重组技术二者的组合生产本发明的多种杂合多肽。例如，本发明的杂合多肽可包含PEG化和修饰的组合，包括缺失、取代和插入。这样的杂合多肽可分阶段生产。在第一阶段，可通过如所述的重组技术生产含缺失、取代、插入及其任意组合的修饰的中间体多肽。接着，在如下所述的任选纯化步骤后，通过用合适的PEG化试剂(例如得自Nectar Transforming Therapeutics，San Carlos，California)通过化学修饰PEG化中间体多肽，以产生所需杂合多肽。本领域技术人员会认识到，上述步骤可推广应用于含修饰组合的杂合多肽，所述修饰组合选自缺失、取代、插入、衍化以及本领域众所周知和本发明设想的其它修饰手段。

[00361]可能需要纯化本发明生产的杂合多肽。肽纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括在一个水平上将细胞环境粗分离为多肽和非多肽级分。在将多肽和其它蛋白分离后，可使用层析和电泳技术进一步纯化目的多肽，以达到部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合于纯肽制备的分析方法是离子交换层析、排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化法是反相HPLC，接着通过液相色谱/质谱法(LC/MS)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱法特征鉴定纯化产物。通过确定氨基酸分析结果获得对纯度的额外证实。

[00362]本发明的某些方面涉及编码蛋白或肽的纯化，在具体的实施方案中，涉及编码蛋白或肽的大致纯化。本文使用的术语“纯化肽”意指可由其它组分中分离的组合物，其中所述肽相对于其天然可获得的状态被纯化至一定的程度。因此，纯化肽还指脱离其可能天然存在的环境的肽。

[00363]一般地讲，“纯化的”指已经过分级分离而去除各种其它组分的肽组合物，该组合物基本保留了其表达的生物活性。在使用术语“大致纯化的”时，该名称指其中肽构成组合物主要组分的组合物，例如在组合物中肽占约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更高。

[00364]适用于肽纯化的各种技术是本领域技术人员周知的。这些技术包括用例如硫酸铵、PEG、抗体等沉淀；热变性后离心；层析步骤，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、反相层析、羟磷灰石层析和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。如本领域一般所已知的，相信可改变进行各种纯化步骤的顺序，或可省略某些步骤，仍可得到用于制备基本纯化的蛋白或肽的方法。

[00365]一般不要求肽总是以其最纯状态提供。实际上，设想在某些实施方案中使用纯化程度较小的产物。通过使用较少纯化步骤的组合，或利用不同形式的相同通用纯化流程，可实现部分纯化。例如，人们意识到，使用HPLC装置进行的阳离子交换柱层析一般产生比使用低压层析系统的相同技术更高“倍”的纯化。具有较低程度的相对纯化的方法在蛋白产物总回收率或保持表达蛋白活性方面可能具有优势。

[00366]人们可任选地纯化和分离该杂合多肽和由该方法获得的其它组分。纯化多肽的方法可见于美国专利第5,849,883号。这些文件描述了分离和纯化G-CSF组合物的具体示例性方法，这些方法可用于分离和纯化本发明的杂合多肽。在已知本发明公开内容的情况下，本领域技术人员显然会意识到，可使用各种纯化技术由给定的来源纯化杂合多肽。

[00367]另外，设想可使用阴离子交换和免疫亲和层析的组合生产本发明的纯化杂合多肽组合物。

药物组合物

[00368]本发明还涉及药物组合物，其包含治疗或预防有效量的至少一种本发明杂合多肽或其药学可接受盐，以及药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或用于送递杂合多肽的载体。这样的组合物可包括：各种缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，例如变性剂和增溶剂(例如Tween 80、Polysorbate 80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苄醇)和填充剂(例如乳糖、甘露醇)；将材料掺入到特定聚合化合物制品中，例如聚乳酸、聚乙醇酸等；或与脂质体结合。这样的组合物将影响本发明杂合多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences 1435-712，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1990)。

[00369]一般来说，本发明杂合多肽的使用方式可以和鉴于单个组成多肽药理学特性而使用其的方式相同。一个优选用途是外周施用此杂合多肽，用于治疗或预防代谢疾病和障碍。具体地说，本发明化合物具有作为降低营养物利用度、减少食物摄取和影响体重下降的物质的活性。在另一个实施方案中，一个优选用途是施用此杂合多肽，用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾病和障碍。

[00370]本发明的杂合多肽可配制用于外周施用，包括配制用于注射、口服施用、鼻施用、肺施用、局部施用或本领域技术人员了解的其它施用类型。更具体地说，可通过任何普通途径施用本发明的药物组合物，只要经过该途径可到达靶组织。在一个优选实施方案中，可通过任何常规外周方法，例如通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内(例如末端释放)；通过口服、舌下、鼻、肛门、阴道或经皮送递，或通过在特定部位手术植入，将药物组合物导入到受试者中。治疗可由一段时间内的单剂量或多剂量组成。还考虑了受控持续释放本发明组合物。

[00371]制剂可为液体，或可为固体，例如用于重建的冻干固体。本发明的水性组合物包含有效量的杂合多肽，其溶解或分布在药学可接受的载体或水性介质中。短语“药物或药理学可接受的”指在施用动物或人时不产生副反应、变态反应或其它不适当反应的分子实体和组合物。本文使用的“药学可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和物质对药学活性物质的用途在本领域众所周知。除非任何常规的介质或物质与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物。还可将互补活性成分加入到组合物中。在某些情况下，方便地在一起施用的单个组合物或溶液中提供本发明的杂合多肽和另一种减少食物摄取、治疗糖尿病、降低血浆葡萄糖或改变血浆脂质的物质，例如胰淀素、胰淀素激动剂类似物、CCK或CCK激动剂、瘦蛋白或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽激动剂类似物。在其它情况下，将另外的物质与所述杂合多肽分开施用可能更有利。

[00372]可配制本发明的杂合多肽，作为与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的游离碱或药学可接受盐的水溶液施用。药学可接受盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐还可来源于无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。这样的产物易于通过本领域技术人员众所周知的方法制备。还可以制备在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中的分散液。在一般的储存和使用条件下，这些制品包含防腐剂，以防止微生物生长。

[00373]在一个实施方案中，配制本发明的药学组合物以适于胃肠外施用，例如通过注射或输注施用。优选地，杂合多肽悬浮在水性载体中，例如在pH约3.0至约8.0的等渗缓冲溶液中，优选pH在约3.5至约7.4、3.5至6.0或3.5至约5.0。有用的缓冲液包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸以及乙酸钠/乙酸缓冲液。可使用一种长效或“贮存”缓释的制剂，以在经皮注射或送递后的多个小时或天数内，将治疗有效量的制剂送递入血流中。

[00374]适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散液和用于即时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。就一切情况而论，剂型应当是无菌的，流动性应达到保持易注射能力的程度。还需要本发明的杂合多肽在生产和储存条件下是稳定的，其必须防腐，以对抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。可保持适当的流动性，例如通过使用包衣剂(例如卵磷脂)、在分散液情况下通过保持所需颗粒大小和使用表面活性剂。可利用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，达到对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包含等渗剂(例如糖或氯化钠)。通过在组合物中使用吸收延迟剂(例如一硬脂酸铝和明胶)，可实现可注射组合物的吸收延长。

[00375]可通过向合适溶剂中加入需要量的活性化合物，以及根据需要加入以上列举的各种其它成分，接着除菌过滤，制备无菌注射溶液。一般来说，通过将各种无菌活性成分加入到无菌溶媒中，制备分散液，其中无菌溶媒含有基础分散介质和以上列举物质中的所需其它成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由其先前除菌过滤的溶液产生活性成分加任何其它需要成分的粉末。

[00376]一般来说，根据年龄、体重以及疾病的状况或严重性、受者的状况或障碍来确定本发明杂合多肽的治疗或预防有效量。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences 697-773。另参见Wang和Hanson，Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stability and Stabilizers，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，附录42：2S(1988)。通常，可使用约0.001μg/kg体重/天至约1000μg/kg体重/天的剂量，但熟练医师认识到，可使用更大或更小的剂量。施用可为每日一次或多次，或频率更低，可与本文描述的其它组合物联合施用。应当指出的是，本发明不限于本文提及的剂量。

[00377]可通过使用已确立的测定代谢疾病或障碍水平的实验连同相关的剂量-反应数据，确定合适的剂量。最终的施用方案由主治医师考虑改变药物作用的因素来确定，这些因素例如为药物的具体活性、损伤的严重性和患者的响应性、患者的年龄、身体状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、施用时间和其它临床因素。随着研究的进行，将显露出关于具体疾病和状况的合适剂量水平和治疗时程的进一步信息。

[00378]对于50kg患者，有效剂量通常为约1-30μg至约5mg/天，优选约10-30μg至约2mg/天，更优选约5-100μg至约1mg/天，最优选约5μg至约500μg/天，以单剂或分剂施用。优选地，剂量为约0.01至约100μg/kg/剂。要施用的确切剂量可由本领域技术人员确定，其取决于具体化合物的效力，以及个体的年龄、体重和身体状况。施用应当在例如需要抑制营养物利用度、食物摄取、体重、血糖或血浆脂质调节的时候开始，例如，在状况最初有征兆的时候或在诊断出肥胖、糖尿病或胰岛素抵抗综合征后不久开始。可通过任何途径施用，例如注射(优选皮下或肌内注射)、口服、鼻、经皮等。由于生物利用度降低，用于某些途径(例如口服施用)的剂量可增加，例如增加约5-100倍。

[00379]可用初始推注，接着持续输注，以保持药品的治疗循环水平，进行胃肠外施用。本领域一般技术人员易于优化有效剂量和施用方案，这可根据良好医疗规范和个体患者的临床状况确定。

[00380]施用频率取决于药物的药代动力学参数和施用途径。本领域技术人员根据施用途径和需要的剂量确定最佳的药物制剂。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，出处同上，1435-1712页。这样的制剂可影响施用药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。根据施用途径，可按照体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。本领域一般技术人员不需要过多实验即可常规作出确定合适治疗剂量必须的更精细计算，尤其是在依据本文公开的剂量信息和实验以及在动物或人体临床实验中观察到药代动力学数据的情况下。

[00381]要认识到，本发明的药物组合物和治疗方法可用于人类医药和兽医领域。因此，要治疗的受试者可为哺乳动物，优选为人或其它动物。对于兽用目的，受试者包括例如家畜(例如牛、绵羊、猪、马和山羊)、宠物(例如狗和猫)、野外动物和/或动物园动物、实验室动物(包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠)；以及家禽，例如鸡、火鸡、鸭和鹅。

[00382]另外，本发明设想了一种试剂盒，其包含本发明的杂合多肽、适于制备所述本发明杂合多肽的药用组分和使用所述杂合多肽和药用组分的说明书。

[00383]为帮助理解本发明，纳入以下的实施例。涉及本发明的实施例当然不应当被解释为对本发明的具体限制，现在已知或以后开发的本发明的这些改变应属于本领域技术人员的能力范围，这些改变被认为属于本文描述的和后文要求保护的本发明范围。

实施例

[00384]参照以下的非限制性实施例，更详细地描述了本发明，提供这些实施例是为了更全面地理解本发明，不应被解释为限制其范围。实施例阐述了本发明杂合多肽的制备，以及本发明的这些杂合多肽的体外和/或体内测试。本领域技术人员应理解，这些实施例中描述的技术代表了本发明的发明人描述的、在实施本发明时运行良好的技术，因此构成了本发明实施的优选模式。但是，应当认识到，按照本文公开内容，本领域技术人员会意识到，可对所公开的具体方法进行多种改变，仍可获得同样或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1.杂合多肽的制备

[00385]可使用以0.050-0.100mmol装量为0.43-0.49mmol/g的Rink酰胺树脂(Novabiochem)，或0.63mmol/g预装填Wang树脂(Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂)(Novabiochem)，在Symphony肽合成仪(Protein Technologies，Inc.)上组装本发明的肽。以0.10M浓度将Fmoc氨基酸(5.0当量，0.250-0.500mmol)残基溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中。所有其它试剂(HBTU、1-羟基苯并三唑水合物和N，N-二异丙基乙胺)都制备为0.55M二甲基甲酰胺溶液。然后使用HBTU(2.0当量，0.100-0.200mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(1.8当量，0.090-0.18mmol)、N，N-二异丙基乙胺(2.4当量，0.120-0.240mmol)，将Fmoc保护的氨基酸与结合树脂的氨基酸偶联2小时。在最后的氨基酸偶联后，使用20％(v/v)哌啶的二甲基甲酰胺溶液对肽去保护1小时。一旦肽序列完成，Symphony肽合成仪就按照程序切割树脂。使用93％TFA、3％苯酚、3％水和1％三异丙基硅烷，对肽与树脂进行1小时的三氟乙酸(TFA)切割。使用叔丁基甲基醚沉淀切割的肽，通过离心沉淀，并冻干。沉淀再溶解在水(10-15mL)中，过滤，经使用C18柱和含0.1％TFA的乙腈/水梯度的反相HPLC纯化。

[00386]用脂肪酸(例如辛酸和硬脂酸)N-加帽本发明肽的一般方法如下：将在Rink酰胺树脂上的肽(0.1mmol)悬浮在NMP(5mL)中。在单独的小瓶中，将HBTU(0.3mmol)、HOBt(0.3mmol)溶解在DMF(5mL)中，接着加入DIEA(0.6mmol)。将该溶液加入到树脂中，振摇该悬浮液2小时。过滤溶剂，用NMP(5mL×4)和CH₂Cl₂(20mL)彻底清洗，干燥，并进行1小时的TFA切割。在切割和纯化后，目的肽的产量约为40mg。

[00387]可使用市售的活化PEG酯，在溶液中对赖氨酸的游离ε氨基或纯化肽的末端氨基进行PEG修饰。通过反相HPLC将获得的PEG化衍生物纯化至均一，通过LC/MS和MALDI-MS确认纯度。

[00388]本发明的某些示例性杂合多肽示于以下表1-1。设想了对具体化合物的各种修饰，例如化学修饰，如糖基化、PEG修饰等；氨基酸修饰，例如取代、插入和缺失等。此外，要理解的是，虽然以C-末端酰胺化为代表，但本发明的杂合多肽可替代性地为游离酸形式。

[00389]包含各种组分肽家族组合的其它示例性杂合体参见下表。也特别考虑了本文讨论的它们的类似物和衍生物杂合体。“#”号表明每个组件的连接位置。指出的接头是本文描述的那些。CCK-8是DY(SO3H)MGWMDF-NH2，而“CCK-8*”是硫酸化苯丙氨酸形式的DF(CH2SO3H)MGWMDF-NH2。

实施例2.结合测定

[00390]可使用本领域技术人员周知的结合测定方法，在各种受体结合测定中测试本发明的杂合多肽。这样的测定包括以下描述的测定。

[00391]胰淀素结合测定：可如下在由大鼠脑制备的伏核膜中对本发明的某些示例性化合物与胰淀素受体的结合进行评价。断头处死雄性Sprague-

大鼠(200-250g)。取出脑，并置于冷磷酸缓冲盐水(PBS)中。从腹面开始，制作由喙至下丘脑的切口，侧面以嗅束为界，并由这些嗅束向中线以45°角延伸。此基础前脑组织包含伏核和周围区域，对其称重并在冰冷的20mM HEPES缓冲液(20mM HEPES酸，于23℃用NaOH将pH调节至7.4)中匀浆。通过以48,000×g离心15分钟，用新鲜缓冲液清洗膜3次。将最终的膜沉淀重悬浮在含0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的20mM HEPES缓冲液中。

[00392]为检测¹²⁵I-胰淀素结合(参见Beaumont K等，Can J PhysiolPharmacol.1995Jul；73(7)：1025-9)，将4mg原始湿重组织的膜与12-16pM ¹²⁵I-胰淀素的20mM HEPES缓冲溶液(其含0.5mg/ml杆菌肽、0.5mg/ml牛血清白蛋白和0.2mM PMSF)温育。溶液于2℃温育60分钟。通过GF/B玻璃纤维滤器(Whatman Inc.，Clifton，N.J.)过滤终止温育，该滤器预先在0.3％聚乙烯亚胺中浸泡4小时，以便减少放射性标记肽的非特异性结合。在过滤前立即用5ml冷PBS清洗滤器，在过滤后立即用15ml冷PBS清洗滤器。取下滤器，在γ-计数器中以77％的计数效率评测放射性。通过在10^-12-10^-6M未标记测试化合物存在下检测结合，产生竞争曲线，并通过使用4-参数逻辑斯谛方程的非线性回归(Inplotprogram；GraphPAD Software，San Diego)分析竞争曲线。

[00393]CGRP受体结合测定：除了使用由SK-N-MC细胞制备的膜以外，基本如对胰淀素的描述评价本发明化合物与CGRP受体的结合，已知SK-N-MC细胞表达CGRP受体(Muff，R.等，Ann NY Acad.Sci.1992：657，106-16)。除了使用13,500cpm ¹²⁵I-hCGRP/孔或21.7pM/孔(Amersham)以外，如对胰淀素的描述进行结合测定。

[00394]肾上腺髓质素结合测定：使用含肾上腺髓质素受体的HUVEC(Kato J等，Eur J Pharmacol.1995，289：383-5)，使用用于环状AMP的Perkin Elmer AlphaScreen^TM测定，使用优化的25-30,000个细胞/孔，可研究与肾上腺髓质素受体的结合。相比于CHO细胞，HUVEC的cAMP水平提升不大。因此，可选择CHO细胞作为阴性对照，因为如果需要的话，其可不表达肾上腺髓质素受体。

[00395]降钙素受体结合测定：如本领域所知，可使用同样表达降钙素受体的CHO细胞或T47D细胞(Muff R.等，Ann N YAcad Sci.1992，657：106-16和Kuestner R.E.等，Mol Pharmacol.1994，46：246-55)研究与降钙素受体的结合。

[00396]瘦蛋白结合测定：常规使用两个体外生物测定评测瘦蛋白结合和受体活化(参见例如White等，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：10657-10662)。可通过用长(信号转导)形式小鼠OB受体(“OB-RL”)转染的COS-7细胞，在没有或有重组小鼠瘦蛋白(阳性对照)或肽的情况下，用碱性磷酸酶(“AP”)-瘦蛋白(“OB”)融合蛋白(“AP-OB”)检测瘦蛋白结合抑制。信号转导测定可在用AP受体和OB-RL构建体共转染的GT1-7细胞中进行。可通过化学发光检测在小鼠瘦蛋白或肽刺激作用下的分泌性碱性磷酸酶(“SEAP”)活性。

[00397]Y1受体结合测定：由内源性表达神经肽Y1受体的SK-N-MC细胞的铺满培养物制备膜。在96孔聚苯乙烯板中，将膜与60pM[¹²⁵I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽于室温温育60分钟。然后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集在96孔玻璃纤维板上。将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。

[00398]Y2受体结合测定：由内源性表达神经肽Y2受体的SK-N-BE细胞的铺满培养物制备膜。在96孔聚苯乙烯板中，将膜与30pM[¹²⁵I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽于室温温育60分钟。然后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集在96孔玻璃纤维板上。将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。

[00399]Y4受体结合测定：用编码神经肽Y4基因的cDNA瞬时转染CHO-K1细胞，然后在48小时后由铺满的细胞培养物制备膜。在96孔聚苯乙烯板中，将膜与18pM[¹²⁵I]-人胰多肽(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽于室温温育60分钟。然后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集在96孔玻璃纤维板上。将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。

[00400]Y5受体结合测定：用编码神经肽Y5基因的cDNA瞬时转染CHO-K1细胞，然后在48小时后由铺满的细胞培养物制备膜。在96孔聚苯乙烯板中，将膜与44pM [¹²⁵I]-人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽于室温温育60分钟。然后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集在96孔玻璃纤维板上。将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。

[00401]GLP-1受体结合测定：可使用结合取代测定检测GLP-1受体结合活性和亲和性，在结合取代测定中，受体源是RINm5F细胞膜，配体是[¹²⁵I]GLP-1。将在20mM HEPES缓冲液中的均质RINm5F细胞膜与40,000cpm[¹²⁵I]GLP-1示踪剂和各种浓度的测试化合物于23℃、恒定混合下温育2小时。反应混合物通过预先用0.3％PEI溶液浸泡并用冰冷磷酸缓冲盐水淋洗的玻璃纤维垫过滤。使用闪烁计数器测定结合数目。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)计算结合亲和性。

[00402]下表示出了示例性杂合体的体外受体结合和受体激活，包括组分组件的特异性受体激活。

化合物编号/名称	受体结合					受体激活
												GLP-1	胰淀素	CGRP	CT	Y2	GLP1环化酶	GLP-1/GIP/CT环化酶	CT环化酶	Y1	CCK
---母体---
											大鼠胰淀素	＞1000	0.05	21	3	＞1000		5	326
人NPY					0.2
											化合物10	＞1000	0.03	2.3	0.03	＞1000		1.4	0.7		1000
毒蜥外泌肽-4酰胺	0.5		＞1000	＞1000			0.3	10000		1000
											毒蜥外泌肽-(1-28)酰胺	0.6	＞1000	＞1000	＞1000			0.8	tbd
PYY(3-36)					0.08				874	1000
											大鼠NMU24
CCK8(硫酸化的酪氨酸)										7.8
											FN-38
CCK8										1000
											---杂合体---
4240	1.7	0.6	178	0.5	＞1000		8	28
											4277			4.4	0.04			1000
NH2-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKKANTATAVLG-NH2	tbd	＞1000	＞1000	＞1000			2.9	-
											4487	49		1000		1000			1000		42.1

4489	31				1000					229.5
											5133	0.4	0.2	63	0.03			6.4	8
5138	0.3	0.2	113	0.1			7.4	7.8
											5401				0.09	0.48			8.3
5403				0.052	0.2			7.5
											5425				643	1.2			2271
5426				46	0.39			645
											5453				6.6		5.8		108.3
5454					98.9					83.3
											5455
5457				0.21				1.6		58
											5493							13
5497					0.163
											5498				0.5				0.8		57
5499				0.02				3
											5522										61.7
5527					0.2
											5528								2.9
5550					151.6					175
											5561				0.11	2.3			27
5562				0.084	1.3			3.7
											5567					0.8
5568					0.8
											5581					0.8
5582				0.064	0.5			10
											5598					0.3			7.6
5603					12.2					1000
											5604					44.8					1000
5626					0.2
											5666				0.16				0.43		1000

实施例3：小鼠食物摄取测定

[00403]可在小鼠食物摄取测定中测试本发明杂合多肽的食欲抑制性，并在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中测试本发明杂合多肽对体重增加的作用。用于筛选的测定方法如下所述。

[00404]以12:12小时昼:夜循环分组圈养雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)，光照由06:00时开始。水和标准丸状小鼠饲料可随意获取，注明处除外。动物在测定前1天约15:00时开始禁食。在测定日早晨，将动物分为各测定组。在典型的研究中，n＝4笼，每笼3只小鼠。

[00405]在时间＝0分钟时，以约10nmol/kg-75nmol/kg的量，给所有动物腹膜内注射溶媒或化合物，并立即施用预称重量(10-15g)的标准饲料。取出食物，并于各个时间，典型是30、60和120分钟称重，以确定食物消耗量(Morley，Flood等，Am.J.Physiol.267：R178-R184，1994)。通过由时间＝0时开始提供的食物重量中减去例如30、60、120、180和/或240分钟时间点后剩余的食物重量，计算食物摄取。以ANOVA鉴定出显著治疗效果(p＜0.05。当存在显著差异时，使用Dunnett检验(Prism v.2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，California)比较测试平均值和对照平均值。

食物摄取测定中的活性和本文杂合体的合成中使用的母体分子的序列是：

实施例4：体重、脂肪重新分布和身体瘦组织质量测定

[00406]可以如下进行体重和相关作用的测定。

[00407]饮食诱导的肥胖(DIO)在Sprague-Dawley大鼠中是一种用于研究肥胖和调节能量稳态的有价值的模型。这些大鼠是从摄取相对高脂肪和能量饮食时容易肥胖的大鼠种系(Crl：

(SD)BR)开发的。参见例如Levin(1994)Am.J.Physiol.267：R527-R535，Levin等(1997)Am.J.Physiol.273：R725-R730。DIO雄性大鼠获自Charles River Laboratories，Inc.(Wilmington，MA)。22℃下以12/12小时昼夜周期将大鼠单独圈养在鞋盒式笼中。大鼠保持随意摄取中度高脂肪饮食(32％kcal来自脂肪；研究饮食D1226B)。动物典型地获得约500g的平均体重。使Levin DIO大鼠在笼养环境中习惯7天。在3夜的习惯中，动物接受单次腹膜内(IP)注射溶媒。测试当天，在6-14个连续夜晚的黑暗周期开始时给大鼠施用单次IP注射化合物或溶媒(10％DMSO)。在研究过程中，以5秒的间隔通过自动化食物摄取测量系统(BioDAQ，Research Diets)自动化测量食物摄取。每夜记录体重。

[00408]进行药物处理前和后用NMR(Echo Medical Systems，Houston，TX)测量身体组成。对于身体组成测量，将大鼠短暂放置(约1分钟)在通风良好的树脂玻璃管中，随后将管插入特制的啮齿动物NMR仪器中。这使得能够计算脂肪和干的瘦组织实际克数的改变(如处理后的体脂克数-基线体脂克数＝体脂克数的改变)和脂肪和干的瘦组织的％身体组成的改变(例如，处理后的％体脂-基线％体脂＝％体脂改变)。所有数据都表示为平均值±SEM。用方差分析(ANOVA)和post-hoc检验来检验组差异。P值＜0.05认为是显著的。用Windows系统的

4(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)进行统计分析和作图。在一些早期研究中，用Windows系统的(Systat Software，Inc.，Point Richmond CA)进行分析。对于含有胰淀素模拟物、毒蜥外泌肽、PYY类似物和/或瘦蛋白的杂合体，体脂改变不伴随瘦组织的显著减少。图表和结果典型地表示为溶媒校正的体重百分比、体脂改变和体蛋白改变。

[00409]在其它测定中，喂饲雄性C57BL/6小鼠(在研究开始时为4周龄)高脂肪(HF，58％的饮食千卡为脂肪)或低脂肪(LF，11％的饮食千卡为脂肪)饲料。在饲料喂养4周后，每只小鼠都植入渗透泵(Alzet#2002)，该泵在两周内持续地皮下送递预定剂量的杂合多肽。每周检测体重和食物摄取(Surwit等，Metabolism-Clinical and Experimental，44：645-51，1995)。测试化合物的作用表示为每个治疗组至少14只小鼠体重变化百分率(即由起始重量变化的百分率)的平均值±标准差(p＜0.05ANOVA，Dunnett检验，Prism v.2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego，California)。

[00410]毒蜥外泌肽/PYY杂合体。使用C-末端截短的毒蜥外泌肽(例如毒蜥外泌肽-4(1-28)或⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28))和跨18-36至31-36区的N-末端截短PYY合成本发明的示例性杂合多肽。因此，示例性的杂合多肽一般包含两个组件，其中第一个组件是毒蜥外泌肽-4类似物的片段，第二个组件是选自PYY截短物的肽增强剂。为进行对比，还在几个变体的肽基本单位之间加入β-丙氨酸二肽间隔基(参见表4-1)。

表4-1：毒蜥外泌肽/PYY杂合体、受体结合数据及其在食物摄取测 定中的作用

[00411]由表4-1可见，本发明的某些示例性化合物在食物摄取测定中显示出效力。还在DIO测定中以75nmol/kg测试了某些肽，证明比PYY更有效(图1)。如对本文的其它杂合体所观察到的，杂合体可以保持与识别母体分子的一种、两种或更多种受体结合。设计杂合体，其根据需要识别来自每个母体或来自仅仅一个母体的至少一种受体。如对本文的其它杂合体所观察到的，接头(其可以作为每个相邻激素部分之间的间隔基)的使用可以提供增加的活性，包括受体结合和体外及体内活性，例如，体重减轻。本文的结果表明PYY的C-末端部分可以调节活性。

[00412]毒蜥外泌肽/胰淀素杂合体。毒蜥外泌肽/胰淀素杂合体。由C-末端截短的毒蜥外泌肽(1-27)(SEQ ID NO：236)、C-末端截短的胰淀素肽(例如胰淀素(1-7)(SEQ ID NO：217)、^2，7Ala-胰淀素(1-7)(SEQ ID NO：285)和胰淀素(33-27)(SEQ ID NO：243))以及任选的sCT片段(例如sCT(8-10)、^11，18Arg-sCT(8-27)(SEQ ID NO：289)和¹⁴Glu，^11，18Arg-sCT(8-27)(SEQ ID NO：286))制备本发明另外的示例性杂合多肽。尽管两种杂合多肽在食欲抑制中都非常有效(参见表4-2)，但作用的开始与母体分子的活性模式谱(未列出数据)。采用1nmol/kg的剂量，化合物5与大鼠胰淀素同样有效。

表4-2：毒蜥外泌肽/胰淀素杂合体及其在FI测定中的作用

[00413]当在DIO测定中筛选时，两种化合物都显示极佳的效力(图2)。

[00414]测定了其它示例性化合物对血糖水平的影响和在食物摄取测定中的作用。这些测试包括化合物14和15。包括βAla接头的化合物14是²⁹βAla-βAla-毒蜥外泌肽(1-28)，h胰淀素(1-7)-^11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：33)(或者表示为毒蜥外泌肽(1-28)-βAla-βAla-h胰淀素(1-7)-^11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37))，而化合物15含有Gly接头：²⁹GlyGlyGly-毒蜥外泌肽(1-28)，h胰淀素(1-7)-^11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：312)。与毒蜥外泌肽(1-27)相比，较长的毒蜥外泌肽(1-28)提供增加的活性。

[00415]进行了血糖测定，以测试降低血糖水平的效果。以12:12小时昼:夜循环分组圈养雌性NIH/Swiss小鼠(8-20周龄)，光照由06:00时开始。水和标准丸状小鼠饲料可随意获取，注明处除外。实验的早晨，将动物分为实验组，从大约06:30开始禁食。在典型研究中，n＝2个笼子，3只小鼠/笼。在时间＝0分钟，采取血糖样品，随后立即腹膜内注射溶媒或化合物，其量是约1nmol/kg-25nmol/kg。在30，60，120，180和240分钟测量血糖。通过用例如30，60，120，180和/或240分钟的时间点的血糖除以时间＝0分钟时的血糖，计算占处理前的百分比。通过ANOVA鉴定显著治疗效果(p＜0.05)。当存在显著差异时，用Dunnett检验将测试平均值与对照平均值进行比较(Prism v.4.01，GraphPadSoftware Inc.，San Diego，California)。示例化合物的结果显示于图5A。点代表平均值±标准差。在t＝0，在基线样品后立即将肽腹膜内(IP)注射到禁食2小时的NIH/Siwss小鼠中。在t＝30，60，120，180和240分钟取样。用

(LifeScan，Inc.，a Johnson & JohnsonCompany，Milpitas，CA)测量血糖。*与溶媒对照相比p＜0.05；ANOVA，Dunnett检验。

[00416]按照上文的描述进行食物摄取测定。结果示于图5B。点代表n＝4笼(3只小鼠/笼)的平均值±标准差。在t＝0，将肽腹膜内(IP)注射到禁食过夜的NIH/Swiss小鼠中。在注射后立即喂食，并且在t＝30，60和120分钟测量消耗的量。*与溶媒对照相比p＜0.05；ANOVA，Dunnett检验。

[00417]母体化合物10和毒蜥外泌肽化合物在葡萄糖测定中具有相反的效果。一般预期将它们连接起来将导致作用抵消，或最佳导致使用更有效的母体化合物观察到的作用稀释。但是，在葡萄糖测定中，示例性杂合体化合物与毒蜥外泌肽(1-28)同样有效，并且具有更长的作用持续时间。

[00418]从食物摄取数据可以看出，示例性化合物是抑制食欲的。活性通常比单独给药的母体化合物显著更佳。在一半的药物浓度，活性与一起给药的母体化合物相似(3nmol/kg杂合体，总共6nmol/kg共同给药的母体化合物)；因此进一步证明了杂合体的优越性。加入接头增加了杂合体的活性。在此情况下，Gly-Gly-Gly接头比βAla-βAla接头更有效。

[00419]毒蜥外泌肽/CCK-8杂合体。由直接或通过接头连接至CCK-8N-末端、保留CCK-8N-末端酰胺的全长或C-末端截短的毒蜥外泌肽-4，制备本发明的再其它示例性杂合多肽(表4-3)。此外，制备某些加入天然Tyr(SO₃)的杂合体，同时制备加入更稳定的Phe(CH₂SO₃)基团的另一种杂合体。所有制备的杂合多肽在食物摄取抑制中均有活性(表4-3)。

表4-3：毒蜥外泌肽/CCK-8杂合体及其在食物摄取测定中的作用

[00420]在DIO实验中以25nmol/kg测试了示例性的毒蜥外泌肽/CCK-8杂合多肽(图3A和3B)。数据表明，对于所有化合物，初期体重下降，接着出现反弹作用。令人感兴趣的是，在加入对水解更稳定的Phe(CH₂SO₃)残基的杂合体中，反弹作用似乎降低(比较图3A和3C)，在毒蜥外泌肽和CCK残基之间加入接头8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基的杂合体也是如此(比较图3A和3B)。需要多10倍的量的CCK-8(250nmol/kg/天)在第2天产生约-2.8％的改变，这在第7天反弹到15饮食对照水平。

[00421]胰淀素/PYY杂合体。合成含每种肽截短节段的胰淀素/PYY杂合多肽。在食物摄取测定中的体内活性示于表4-4。

表4-4：胰淀素/PYY杂合体

[00422]为确定本发明的示例性杂合多肽是否比其母体组分肽激素更有效，以更有活性的母体分子的最小有效剂量在食物摄取实验中测试示例性化合物。结果示于图4A和4B，其也对比了合并的母体肽的作用(化合物1、11和12是组分肽激素、其类似物或片段)。数据表明，几种肽至少与合并的母体肽等效。在体内研究的同时，已对所有化合物进行体外受体结合和功能检测(环化酶活性)(未列出数据)。

[00423]胰淀素-sCT/瘦蛋白杂合体。制备了其它示例性杂合体，其含有与化合物10连接的瘦蛋白肽片段，所述化合物10是本文描述的胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体。化合物16是[Ser117，dLeu119]瘦蛋白(116-122)-胰淀素(1-7)-[^11，18Arg]sCT(8-27)-胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：397)。该化合物结合(RBA＝受体结合测定)胰淀素和CT受体，与CGRP受体一定程度地结合。该化合物也能够激活CT受体(C1A测定)。

化合物	化合物编号	测定	IC50
				[Ser117，dLeu119]瘦蛋白(116-122)-胰淀素(1-7)-[11，18Arg]sCT(8-27)-胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：397)	16	胰淀素RBA	0.04nM
	16	CGRP RBA	81nM
					16	CT环化酶(C1A)	2.2nM
	16	CT RBA(C1A)	0.063nM
					16	GLP RBA(RIN)	1000nM

[00424]在上文描述的食物摄取测定中测试该代表性分子的活性。尽管瘦蛋白在该测定中是无活性的，化合物16在1mg/kg时是抑制食欲的。化合物16的食欲抑制作用也优于大鼠胰淀素(25nmol/kg)。化合物10与对照相比使食物摄取减少91-95％，即有效得多；化合物16将累积摄取减少到对照的34-38％。进一步的示例性实施方案包括瘦蛋白肽的N-末端与胰淀素(1-7)-[^11，18Arg]sCT(8-27)-胰淀素(33-37)化合物的N-末端头对头连接。

[00425]CCK/胰淀素-sCT杂合体。CCK与胰淀素-sCT嵌合体的示例性杂合体证明了相关的受体特异性和激活。具有序列DF(P-CH₂SO₃)MGWMDFGKRKCNTATCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY(SEQ ID NO：398)的示例性化合物在CT受体结合测定中证明了IC50是0.044nM，在CGRP受体结合测定中是4.4nM，在胰淀素受体结合测定中是0.083nM，在GLP受体环化酶(RIN)测定中是1000nM。

实施例5.减少食物摄取、体重和体重增加

[00426]进一步测试了本发明的示例性杂合多肽在本文描述的小鼠和大鼠中抑制食欲、减轻体重和减少体重增加。也单独或组合测定了母体化合物。图9-21证明了本文描述的测定中示例性杂合体的体内作用。

[00427]下表示出了示例性杂合体和它们的母体化合物在小鼠中的体内食物摄取抑制活性。数值提供为指定时间的输注后的食物摄取抑制百分比。“ns”表示与溶媒相比“不显著”。

化合物/剂量	时间点(min)
						大鼠胰淀素	30	60	120	180	240
25nmol/kg	46	35	21	17	7
250nmol/kg	70	53	38	30
300nmol/kg	88	90	51	21
人NPY

37.5nmol/kg	21	29	0	0
化合物10	30	60	120	180	240
						10nmol/kg	24	26	27	21
						25nmol/kg	57	46	31	19	9
						30nmol/kg	64	55	33
						100nmol/kg	81	89	55
						300nmol/kg	93	96	88
						毒蜥外泌肽-4酰胺	30	60	120	180	240
3nmol/kg	40	48	61
10nmol/kg	46	61	67	67
30nmol/kg	48	61	68
毒蜥外泌肽-4(1-28)酰胺	30	60	120	180	240
						3nmol/kg	7	24	16.3
						10nmol/kg	23	41	41
						30nmol/kg	34	51	60
						100nmol/kg	45	60	72
						300nmol/kg	41	57	65

PYY(3-36)	30	60	120	180	240
						3nmol/kg	n.s.	7.3	10	6	0
						7.5nmol/kg	32	39	34	31
						8nmol/kg	48	40	20	13
						10nmol/kg	28	36	38	30	30
						25nmo/kg	40	51	54	43
						30nmol/kg	45	33	58	54	46
						100nmol/kg	41	35	56	56	52
						300nmol/kg	37	34	52	51	51
						CCK8硫酸化的Tyr	30	60	120
3nmol/kg	49	26	0
10nmol/kg	92	56	27
30nmol/kg	92	73	43
100nmol/kg	100	78	59
CCK8	30	60	120
						1000μg/kg	ns	ns	ns
						--杂合体--
4240	30	60	120	180	240

10nmol/kg	37	50	60
25nmol/kg	24	40	48
4277	30	60	120	180	240
						172nmol/kg(1000μg/kg)	76	70	50
						NH2-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKKANTATAVLG-NH2	30	60	120	180	240
10nmol/kg	33	49	57
25nmol/kg	40	59	66
4487	30	60	120
						10nmol/kg	0	36	45
						4489	30	60	120
3nmol/kg	ns	25	ns
10nmol/kg	ns	47	66
5133	30	60	120	180	240
						3nmol/kg	7.5	36	51
						5138	30	60	120	180	240
3nmol/kg	4.7	30	38
5401	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	32	52	59	57

5403	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	52	68	65	55
						5425	30	60	120	180	240
25nmol/kg	8	27	31	18
5426	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	49	66	55	45
						5453	30	60	120	180	240
25nmol/kg	55	66	71	61
5454	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	39	33	28	20
						5455	30	60	120	180	240
25nmol/kg	28	33	39
5457	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	ns	ns	ns
						5493	30	60	120	180	240
25nmol/kg	54	59	68	64
5497	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	54	63	41	ns
						5498	30	60	120	180	240
25nmol/kg	ns	ns	ns	ns
5499	30	60	120	180	240

25nmol/kg	40	32	25
5522	30	60	120	180	240
						25nmol/kg
						5527	30	60	120	180	240
25nmol/kg	40	32	25
5528	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	56	55	50
						5550	30	60	120	180	240
25nmol/kg	0	34	0
5561	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	0	42	47
						5562	30	60	120	180	240
25nmol/kg
5567	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	0	0	0
						5568	30	60	120	180	240
25nmol/kg	0	39	48
5581	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	0	45	32
						5582	30	60	120	180	240
25nmol/kg	0	58	57

						5598	30	60	120	180	240
25nmol/kg	0	50	58
5603	30	60	120	180	240
						25nmol/kg	0	0	0
						5604	30	60	120	180	240
25nmol/kg	0	0	0

[00428]下表显示了示例性杂合体和它们的母体化合物在小鼠DIO模型中的体内体重抑制活性。数值提供为指定时间的输注后的体重抑制百分比。

			天
															化合物	单位	2	7	14	21	28	35	42	49	56	63	70	77	84
大鼠胰淀素	Nmol/kg/d
															30		1.9	1.5	2.1	2.5	2.2
75		1.5	1.4	2.1
															100		1.6	1.8	3.1	3.8	4.4	6.9	8.6	9.6	10.4	10.3	11.4	12	13.4
300		1.1	-0.7	-0.9	-1.5	-1.5
		2	7
															化合物10	nmol/kg/d
150		2.2	-2.4
		2	7	14
															毒蜥外泌肽-4	nmol/kg/d

2.5		7	6.3	7.6
															PYY(3-36)	nmol/kg/d	2	7	14
25			2.6	3.1
															75		4.6	4.7	5.9
100		4.4	3.4	3.9
															250			9	10.1
															4240	nmol/kg/d	2	7
75		9.6	10.1
															NH2-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKKANTATAVLG-NH2	nmol/kg/d	2	7
75		11.6	12.1

[00429]下表显示了示例性杂合体和它们的母体化合物在大鼠DIO模型中的体内体重抑制活性。数值提供为指定时间的输注后的体重抑制百分比。

	天
														化合物/剂量(nmol/kg/d)	3	7	14	21	28	35	42	49	56	63	70	77	84
大鼠胰淀素
														0.7		1.6	1.3	1.6	2.1
1.8		2.2	2.2	2.2	2.2
														2.3		4	5.4	5.4	6.2
5.6		2.9	3.9	4.2	4.8
														7		5.7	7.3	7.9	8.3
18.4		5.9	7.5	6.7	6.5
														23		7.8	9.4	8.8	8.8	9.5	10	9.8	9.1
69		7.6	9.3	11.1	12.2	14.4	14.9	15.4	15.7	16.2	15.8
														70		7.6	8.9	10.2	11.8
															3	7	14	21	28	35	42	49	56	63	70	77	84
化合物10
														0.29		2.3	3.8
0.9		5.1	7.1
														2.9		7.7	10.0	12.0	11.5	11.6	12.1	11.7	12.3
7.5		11.6	14.9	17.9	19.5	20.8	22.1	23.3	24.2	26.2	26
														11	8.5	9.9
69		11.5	13.7	15.6	17
														69		11.5	13.7	15.6	17
															3	7	14	21	28
毒蜥外泌肽-4(1-28)
														0.8		n.s.
2.6		1.4	n.s.	n.s.	n.s.
														8		7.5	8.3	8.5	8.2

11	6.5	6.8
														26		10.4	13	14.6	15.7
															3	7	14	21	28	35	42	49	56	63	70	77	84
毒蜥外泌肽-4
														0.7		9.6	8.4	6.3	4.3
2.4		12.1	10.8	10	8.4
														7		13.9	12.8	11.4	10.6
6.3		12.2	13.7	14.4	14.4	19.1	18.6	18.9	18.5	19	18.1
														21		11.9	13.2	13.3	12.6
														大鼠NMU 24	2	7
300	2.3	1.6
	3	7	14	21	28
														PYY(3-36)
67		6.7	7.3	6.2	5.8
														67		5.5	7.3	7.8	9
67		4.9	5.2	5	4.6
FN-38	2	7
														300	3.7	2.7
	3	7
														5138
11	7.5	9.3

[00430]下表证明了示例性杂合体和它们的母体化合物在大鼠模型(每日注射)中的体内体重抑制活性。数值提供为体重抑制百分比。粗体表示的值表明与溶媒相比是显著的。

	剂量	第1天	第5天	第6天	第7天	第10天	第14天
								大鼠胰淀素	25nmol/kg	NS	NS	NS	NS	NS	NS
化合物10	15nmol/kg	1.7	3.0		3.2	4.5	6.2
								毒蜥外泌肽-4	15nmol/kg	2.8	6.1		7.8	9.3	12.0
5138	15nmol/kg	1.3	5.2		5.8	7.9	10.7
								5401	15nmol/kg
5403	15nmol/kg
								5426	15nmol/kg
5454	15nmol/kg
								5455	15nmol/kg	0.7	2.6		3.2
5493	15nmol/kg	1	3.3		5.1
								5499	15nmol/kg	0.5	0.9	1	1.3
5568	15nmol/kg	0.5	0.5		0.5
								5581	15nmol/kg	0.6	0.8		1.2
5582	15nmol/kg	0.3	0.7	1	1
								5598	15nmol/kg	0.7	1.7	2.5

[00431]在下表中证明了示例性杂合体和它们的母体化合物用于在大鼠模型中抑制体重的减轻体重和减少体重增加的体内活性，所述杂合体和母体化合物是在指定的时间段中输注和在指定的时间段中每日一次注射的。数值以体重抑制百分比给出。在第6天，也测量了8小时的夜间喂食过程中的食物摄取的抑制。除非另外指出，杂合体是以15nmol/kg/天提供的。体重：约2％的差异是统计学显著的。食物摄取：约20％的差异是统计学显著的。

实施例7.降低血糖

[00432]在下表中证明了示例性杂合体和它们的母体化合物在指出的时间段中在Levin大鼠中进行的OGTT测定中降低血糖的体内活性。数值以血糖水平降低百分比给出。粗体表示的数值表明与溶媒相比有显著差异。

实施例8.胃排空活性

[00433]在下表中证明了示例性杂合体和它们的母体化合物在指出的时间段中在Levin大鼠中的胃排空体内活性。数值表示为胃排空抑制百分比和通过的醋氨酚百分比。

					化合物	剂量	研究时间	％通过	％抑制
					大鼠胰淀素	69nmol/kg/d	21天	55	45
	100μg/kg/d	26天	76	24
化合物10	69nmol/kg/d	21天	87	13
毒蜥外泌肽-4(1-28)	30μg/kg/d	26天	94	6

实施例9.PPF多肽抑制急性和慢性食物摄取

[00434]以12:12小时昼:夜循环分组圈养雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)，光照由06:00时开始。水和标准丸状小鼠饲料可随意获取，注明处除外。动物在测定前1天约15:00时开始禁食。在测定日早晨，将动物分为各测定组。在典型的研究中，n＝4笼，每笼3只小鼠。

[00435]在时间＝0分钟时，以约10nmol/kg-100nmol/kg的量，给所有动物腹膜内注射溶媒或化合物，并立即施用预称重量(10-15g)的标准饲料。取出食物，并于30、60和120分钟称重，以确定食物消耗量(Morley，Flood等，Am.J.Physiol.267：R178-R184，1994)。对于PPF多肽对食物摄取的急性作用的研究，通过由时间＝0时最初提供的食物重量中减去30、60、120和180分钟时间点剩余的食物重量，计算食物摄取量。类似地，通过由最初提供的水的重量(以克表示)减去这些时间点剩余的水的重量(以克表示)，计算水的摄取。对于PPF多肽对长期(慢性)食物摄取和/或身体组成的作用的研究，测量在两周的时间段中消耗的食物量。对于这些关于PPF多肽对长期食物摄取和/或身体组成的作用的研究，在开始处理前1周，将小鼠单独圈养。在实验过程中，每日监测食物摄取和体重。在处理阶段中，用异氟烷麻醉下放置在肩胛内区域的

渗透泵(Durect Corp.，Cupertino，CA；Models 1003D，2001，&2004，分别用于3，7，&28天研究)连续皮下(s.c.)输注溶媒(50％二甲基亚砜水溶液)和PYY(3-36)(1mg/kg/天)。每个研究结束时，在2-4小时禁食后通过过量异氟烷处死动物。通过心脏穿刺将血液采集到Na-肝素冲洗过的注射器中，立即冷冻血浆。在一些研究中，用双能量X线吸光测量法(DEXA；PixiMus，GE Lunar)确定身体组成。在一些研究中，在处理前和处理后用啮齿动物NMR仪(EchoMRI-700^TM)测量身体组成(如脂肪和蛋白量)，其中将动物放置在控制管中，并且放置在NMR中2分钟，对脂肪和瘦组织质量进行定量(用克表示)。可以从动物解剖出双侧附睾脂肪垫和肩胛内褐色脂肪组织(BAT)，并且确定这些器官的重量。可以将切除的肝样品放置在RNALater(Ambion，Austin，TX)中，并且在-20℃下储存。

[00436]图22-29显示了PPF多肽嵌合体，特别是PPY-NPY嵌合体，例如化合物4883和5705在上文描述的食物摄取测定中减少累积食物摄取的能力。

[00437]图22显示施用化合物570后的3小时后，与单独的溶媒相比，累积食物摄取的减少。图23A和24A显示连续施用溶媒或化合物4883或5705(剂量是500μg/kg/d)13天的小鼠中食物摄取(克)的改变，图23B和24B显示体重改变(溶媒校正的体重改变百分比)。在开始施用PPF后1天，在化合物4883或化合物5705处理的动物中就出现了减少动物食物摄取和体重的倾向。

[00438]图25和26显示连续施用溶媒或化合物4883或5705(剂量是500μg/kg/d)13天的小鼠中每日水摄取和排尿的改变。

[00439]图27显示NMR评估的连续施用溶媒或化合物4883或5705(剂量是500μg/kg/d)13天对身体组成的影响。图28A和28B显示连续施用溶媒或化合物4883或5705(剂量是500μg/kg/d)13天的小鼠中测量的水克数和百分比的改变。

[00440]图29显示连续施用溶媒或化合物4883或5705(剂量是500μg/kg/d)14天对尿电解质的影响。

[00441]尽管已按照优选的实施例和实施方案描述了本发明，但要理解的是，本领域技术人员会考虑到改变和修饰。因此，所附权利要求书意在覆盖所有这样的等同改变，这些改变属于本发明要求保护的范围。

Claims (103)

1.具有至少一种激素活性的杂合多肽，所述杂合多肽包含第一生物活性肽激素组件，其共价连接于至少一个另外的生物活性肽激素组件；其中：

生物活性肽激素组件独立选自：组分肽激素、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素片段、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物片段，以及肽增强剂；

组分肽激素独立选自下组中的至少两种：胰淀素、肾上腺髓质素(ADM)、降钙素(CT)、降钙素基因相关肽(CGRP)、垂体中间叶激素、缩胆囊素(“CCK”)、瘦蛋白、肽YY(PYY)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、泌酸调节肽(OXM)、利尿钠肽、尿皮质素家族肽，如Ucn-2和Ucn-3、神经调节肽家族肽，如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽，和毒蜥外泌肽-4；

肽增强剂独立选自：赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素结构基序，以及赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素类似物或衍生物的结构基序；并且

所述生物活性肽激素组件中的至少一个具有组分肽激素的至少一种激素活性。

2.权利要求1的杂合多肽，其中所述肽增强剂独立选自：胰淀素(32-37)(SEQ ID NO：242)、胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：243)、胰淀素(34-37)(SEQ ID NO：244)、胰淀素(35-37)、胰淀素(36-37)、胰淀素(37)、ADM(47-52)(SEQ ID NO：245)、ADM(48-52)(SEQ ID NO：246)、ADM(49-52)(SEQ ID NO：247)、ADM(50-52)、ADM(51-52)、ADM(52)、CT(27-32)(SEQ ID NO：248)、CT(27-32)(SEQ ID NO：248)、CT(28-32)(SEQ ID NO：249)、CT(29-32)(SEQ ID NO：250)、CT(30-32)、CT(31-32)、CT(32)、CGRP(32-37)(SEQ ID NO：251)、CGRP(33-37)(SEQ ID NO：252)、CGRP(34-37)(SEQ ID NO：253)、CGRP(35-37)、CGRP(36-37)、CGRP(37)、垂体中间叶激素(42-47)(SEQID NO：254)、垂体中间叶激素(43-47)(SEQ ID NO：255)、垂体中间叶激素(44-47)(SEQ ID NO：256)、垂体中间叶激素(45-47)、垂体中间叶激素(46-47)、垂体中间叶激素(47)、PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)、PYY(26-36)(SEQ ID NO：258)、PYY(27-36)(SEQ ID NO：259)、PYY(28-36)(SEQ ID NO：260)、PYY(29-36)(SEQ ID NO：261)、PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)、PYY(31-36)(SEQ ID NO：263)、PYY(32-36)(SEQ ID NO：264)、PYY(25-35)(SEQ ID NO：265)、PYY(26-35)(SEQ ID NO：266)、PYY(27-35)(SEQ ID NO：267)、PYY(28-35)(SEQ ID NO：268)、PYY(29-35)(SEQ ID NO：269)、PYY(30-35)(SEQ ID NO：270)、PYY(31-35)(SEQ ID NO：271)、PYY(32-35)(SEQ ID NO：272)、蛙GLP-1(29-37)(SEQ ID NO：273)、蛙GLP-1(30-37)(SEQ ID NO：274)、蛙GLP-2(24-31)(SEQ ID NO：275)、毒蜥外泌肽-4(31-39)(SEQ ID NO：277)、毒蜥外泌肽-4(32-39)(SEQ IDNO：278)、毒蜥外泌肽-4(33-39)(SEQ ID NO：279)、毒蜥外泌肽-4(34-39)(SEQ ID NO：280)、毒蜥外泌肽-4(35-39)(SEQ ID NO：281)、毒蜥外泌肽-4(36-39)(SEQ ID NO：282)、毒蜥外泌肽-4(37-39)、毒蜥外泌肽-4(38-39)、毒蜥外泌肽-4(39)，及其类似物。

3.权利要求1的杂合多肽，其中至少一个第一生物活性肽激素组件或至少一个另外的生物活性肽激素组件是组分肽激素或具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素片段。

4.权利要求1的杂合多肽，其中至少一个第一生物活性肽激素组件或至少一个另外的生物活性肽激素组件是具有至少一种激素活性的组分肽激素类似物或衍生物，或具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物或衍生物片段。

5.权利要求1的杂合多肽，其中至少一个第一生物活性肽激素组件或至少一个另外的生物活性肽激素组件是肽增强剂。

6.权利要求1的杂合多肽，其中组分肽激素独立选自：胰淀素、降钙素、CCK、PYY、尿皮质素家族肽、神经调节肽家族肽和ANP、BNP、CNP或尿舒张肽，和毒蜥外泌肽-4。

7.权利要求1的杂合多肽，其中具有至少一种激素活性的至少一个生物活性肽激素组件位于杂合多肽的N-末端部分。

8.权利要求7的杂合多肽，其中位于杂合多肽的N-末端部分的具有至少一种激素活性的至少一个生物活性肽激素组件是以C-末端到N-末端方向排列的。

9.权利要求8的杂合多肽，其中杂合多肽的N-末端部分是酰胺化的。

10.权利要求1的杂合多肽，其中具有至少一种激素活性的至少一个生物活性肽激素组件位于杂合多肽的C-末端部分。

11.权利要求10的杂合多肽，其中杂合多肽的C-末端是酰胺化的。

12.权利要求1的杂合多肽，其中一个生物活性肽激素组件的C-末端直接连接于另一生物活性肽激素组件的N-末端，以形成共价连接。

13.权利要求1的杂合多肽，其中生物活性肽激素组件通过独立选自下组的一个或多个连接基团共价连接：烷基；二羧酸PEGs；氨基酸；聚氨基酸；双功能接头；氨基己酰基(Aca)；Gly；β-丙氨酰；8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基和Gly-Lys-Arg(GKR)。

14.权利要求1的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件选自：毒蜥外泌肽-4、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4片段、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物或衍生物、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物片段；并且

至少一种另外的生物活性肽激素组件独立选自：胰淀素、具有至少一种激素活性的胰淀素片段、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物或衍生物、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物片段、CCK、具有至少一种激素活性的CCK片段、具有至少一种激素活性的CCK类似物或衍生物、具有至少一种激素活性的CCK类似物片段、CT、具有至少一种激素活性的CT片段、具有至少一种激素活性的CT类似物或衍生物、具有至少一种激素活性的CT类似物片段，和肽增强剂。

15.权利要求14的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件选自：毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-27)(SEQ ID NO：236)、毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：237)、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：284)；⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：240)和¹⁴Leu-毒蜥外泌肽-4(1-28)(SEQ ID NO：190)；并且至少一种另外的生物活性肽激素组件独立选自：^25，28，29Pro-h-胰淀素(SEQ ID NO：67)、胰淀素(1-7)(SEQ ID NO：217)、^2，7Ala-胰淀素(1-7)(SEQ ID NO：285)、sCT(8-10)、sCT(8-27)(SEQ ID NO：288)、^11，18Arg-sCT(8-27)(SEQ ID NO：289)、¹⁴Glu，^11，18Arg-sCT(8-27)(SEQ ID NO：286)、CCK-8、Phe²CCK-8(SEQ IDNO：287)、胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：243)、PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)、PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)和PYY(31-36)(SEQ ID NO：263)。

16.权利要求14的杂合多肽，其中杂合多肽包含至少3个生物活性肽激素组件。

17.权利要求14的杂合多肽，其中杂合多肽包含至少4个生物活性肽激素组件。

18.权利要求14的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件位于杂合多肽的C-末端，并且至少一个另外的生物活性肽激素组件位于杂合多肽的N-末端。

19.权利要求14的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件位于杂合多肽的N-末端，并且至少一个另外的生物活性肽激素组件位于杂合多肽的C-末端。

20.权利要求1的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件选自：胰淀素、具有至少一种激素活性的胰淀素片段、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物或衍生物、具有至少一种激素活性的胰淀素类似物片段；并且

至少一个另外的生物活性肽激素组件是肽增强剂，其独立选自：PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)、PYY(26-36)(SEQ ID NO：258)、PYY(27-36)(SEQ ID NO：259)、PYY(28-36)(SEQ ID NO：260)、PYY(29-36)(SEQ ID NO：261)、PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)、PYY(31-36)(SEQ ID NO：263)、PYY(32-36)(SEQ ID NO：264)、PYY(25-35)(SEQ ID NO：265)、PYY(26-35)(SEQ ID NO：266)、PYY(27-35)(SEQ ID NO：267)、PYY(28-35)(SEQ ID NO：268)、PYY(29-35)(SEQ ID NO：269)、PYY(30-35)(SEQ ID NO：270)、PYY(31-35)(SEQ ID NO：271)、PYY(32-35)(SEQ ID NO：272)，及其类似物。

21.具有至少一种激素活性的杂合多肽，所述杂合多肽包含第一生物活性肽激素组件，其共价连接于第二生物活性肽激素组件；其中

生物活性肽激素组件独立选自：组分肽激素、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素片段、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物片段，以及肽增强剂；

组分肽激素独立选自下组中的至少两种：胰淀素、PYY和毒蜥外泌肽-4；

肽增强剂独立选自：赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素结构基序，以及赋予杂合多肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合或其它药代动力学特征的组分肽激素类似物或衍生物的结构基序；并且

其中所述生物活性肽激素组件中的至少一个具有组分肽激素的至少一种激素活性。

22.权利要求21的杂合多肽，其中肽增强剂独立选自：胰淀素(32-37)(SEQ ID NO：242)、胰淀素(33-37)(SEQ ID NO：243)、胰淀素(34-37)(SEQ ID NO：244)、胰淀素(35-37)、胰淀素(36-37)、胰淀素(37)、PYY(25-36)(SEQ ID NO：257)、PYY(26-36)(SEQ ID NO：258)、PYY(27-36)(SEQ ID NO：259)、PYY(28-36)(SEQ ID NO：260)、PYY(29-36)(SEQ ID NO：261)、PYY(30-36)(SEQ ID NO：262)、PYY(31-36)(SEQ ID NO：263)、PYY(32-36)(SEQ ID NO：264)、PYY(25-35)(SEQ ID NO：265)、PYY(26-35)(SEQ ID NO：266)、PYY(27-35)(SEQ ID NO：267)、PYY(28-35)(SEQ ID NO：268)、PYY(29-35)(SEQ ID NO：269)、PYY(30-35)(SEQ ID NO：270)、PYY(31-35)(SEQ ID NO：271)、PYY(32-35)(SEQ ID NO：272)、毒蜥外泌肽-4(31-39)(SEQ ID NO：277)、毒蜥外泌肽-4(32-39)(SEQ ID NO：278)、毒蜥外泌肽-4(33-39)(SEQ ID NO：279)、毒蜥外泌肽-4(34-39)(SEQ ID NO：280)、毒蜥外泌肽-4(35-39)(SEQ ID NO：281)、毒蜥外泌肽-4(36-39)(SEQ ID NO：282)、毒蜥外泌肽-4(37-39)、毒蜥外泌肽-4(38-39)、毒蜥外泌肽-4(39)，及其类似物。

23.权利要求21的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件位于杂合多肽的C-末端。

24.权利要求21的杂合多肽，其中第一生物活性肽激素组件位于杂合多肽的N-末端。

25.权利要求21的杂合多肽，其中杂合多肽包含选自下组的生物活性肽激素组件组合：毒蜥外泌肽-4/PYY、PYY/毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽/胰淀素、胰淀素/毒蜥外泌肽、胰淀素/PYY，和PYY/胰淀素生物活性肽激素组件。

26.具有至少一种激素活性的杂合多肽，所述杂合多肽包含第一生物活性肽激素组件，其共价连接于至少一个第二生物活性肽激素组件；其中

生物活性肽激素组件独立选自：组分肽激素、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素片段、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物、具有组分肽激素的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物的片段，以及肽增强剂；

第一组分肽激素包括瘦蛋白；

至少一个第二生物活性肽激素组件包括独立选自毒蜥外泌肽或GLP1的多肽；并且

生物活性肽激素组件中的至少一个具有其组分肽激素的至少一种激素活性。

27.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白肽激素组件包括选自下组的多肽：瘦蛋白、具有至少一种激素活性的瘦蛋白片段、具有至少一种激素活性的瘦蛋白类似物或衍生物，和具有至少一种激素活性的瘦蛋白类似物和衍生物片段。

28.权利要求26的杂合多肽，其中第一和第二生物活性肽激素组件具有组分肽激素的至少一种激素活性。

29.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白包含序列MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC或其活性片段。

30.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白包含序列VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC或其活性片段。

31.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白类似物包含第43、48、49、75、89、93、98、117、139或167位或类似物中相应位置的一个或多个氨基酸取代，选自第43位的氨基酸取代为Asp或Glu、第48位的氨基酸取代为Ala、第49位的氨基酸取代为Glu或不存在、第75位的氨基酸取代为Ala、第89位的氨基酸取代为Leu、第93位的氨基酸取代为Asp或Glu、第98位的氨基酸取代为Ala、第117位的氨基酸取代为Ser、第139位的氨基酸取代为Leu，和第167位的氨基酸取代为Ser。

32.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白选自43Asp-瘦蛋白、43Glu-瘦蛋白、48Ala-瘦蛋白、49Glu-瘦蛋白、49Des-AA-瘦蛋白、75Ala-瘦蛋白、89Leu-瘦蛋白、93Asp-瘦蛋白、93Glu-瘦蛋白、98Ala-瘦蛋白、117Ser-瘦蛋白、139Leu-瘦蛋白、167Ser-瘦蛋白、43Asp、49Glu-瘦蛋白、43Asp，75Ala-瘦蛋白、89Leu，117Ser-瘦蛋白、93Glu，167Ser-瘦蛋白，和117Ser、D-119Leu-瘦蛋白。

33.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白是选自瘦蛋白(22-167)、瘦蛋白(116-122)、¹¹⁷Ser，D-¹¹⁹Leu-瘦蛋白(116-12)和瘦蛋白(56-73)的片段。

34.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白肽激素组件包括选自下组的多肽：瘦蛋白、具有至少一种激素活性的瘦蛋白片段、具有至少一种激素活性的瘦蛋白类似物或衍生物，和具有至少一种激素活性的瘦蛋白类似物和衍生物片段；并且

至少一个GLP1肽激素组件包括选自下组的多肽：胰高血糖素肽-1(GLP-1)、具有至少一种激素活性的GLP1片段、具有至少一种激素活性的GLP1类似物或衍生物，和具有至少一种激素活性的GLP1类似物片段。

35.权利要求26的杂合多肽，其中GLP1选自GLP1(1-37)、GLP1(1-36)、GLP1(7-37)、GLP1(7-36)、GLP1(7-35)及其类似物和衍生物。

36.权利要求26的杂合多肽，其中GLP1来自鼠、仓鼠、鸡、牛、大鼠、蛙或犬。

37.权利要求26的杂合多肽，其中GLP1来自人或蛙。

38.权利要求26的杂合多肽，其中GLP1选自HDEFERHAEGTFTSDVSSTLEGQAALEFIAWLVKGRG，HAEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGKPKKIRYS；HAEGTFTSDVTQQLDEKAAKEFIDWLINGGPSKEIIS和HAEGTFTSDVSSYLEGQAALEFIAWLVKGR。

39.权利要求26的杂合多肽，其中毒蜥外泌肽选自⁹Gln-GLP-1(7-37)、D-⁹Gln-GLP-1(7-37)、¹⁶Thr-¹⁸Lys^-GLP-1(7-37)、¹⁸Lys-GLP-1(7-37)、⁸Gly-GLP-1(7-36)、⁹Gln-GLP-1(7-37)、D-⁹Gln-GLP-1(7-37)、乙酰-⁹Lys-GLP-1(7-37)、⁹Thr-GLP-1(7-37)、D-⁹Thr-GLP-1(7-37)、⁹Asn-GLP-1(7-37)、D-⁹Asn-GLP-1(7-37)、²²Ser²³Arg²⁴Arg²⁶Gln-GLP-1(7-37)、¹⁶Thr¹⁸Lys-GLP-1(7-37)、¹⁸Lys-GLP-1(7-37)、²³Arg-GLP-1(7-37)，和²⁴Arg-GLP-1(7-37)。

40.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白肽激素组件包括选自下组的多肽：瘦蛋白、具有至少一种激素活性的瘦蛋白片段、具有至少一种激素活性的瘦蛋白类似物或衍生物，和具有至少一种激素活性的瘦蛋白类似物和衍生物片段；并且其中至少一个毒蜥外泌肽激素组件包括选自下组的多肽：毒蜥外泌肽-4、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4片段、具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物或衍生物，和具有至少一种激素活性的毒蜥外泌肽-4类似物片段。

41.权利要求26的杂合多肽，其中毒蜥外泌肽选自毒蜥外泌肽-4、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4、⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4、¹⁴Leu，²²Ala，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4，及其活性片段。

42.权利要求26的杂合多肽，其中毒蜥外泌肽包含序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS或其活性片段。

43.权利要求26的杂合多肽，其中毒蜥外泌肽选自毒蜥外泌肽(7-15)、²Ser-毒蜥外泌肽(7-15)、毒蜥外泌肽-4(1-27)、毒蜥外泌肽(1-28)、毒蜥外泌肽-4(1-29)、毒蜥外泌肽-4(1-30)、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)、⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)、¹⁴Leu，²²Ala，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)、¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)、⁵Ala，¹⁴Leu，²⁵Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)，和¹⁴Leu-毒蜥外泌肽-4(1-28)。

44.权利要求26的杂合多肽，其中C-末端是酰胺化的。

45.权利要求26的杂合多肽，其中任何一个组分肽激素组件与及其基础肽具有至少70％序列同一性。

46.权利要求26的杂合多肽，其中任何一个组分肽激素组件与及其基础肽具有至少80％序列同一性。

47.权利要求26的杂合多肽，其中任何一个组分肽激素组件与及其基础肽具有至少90％序列同一性。

48.权利要求26的杂合多肽，其中任何一个组分肽激素组件与及其基础肽具有至少95％序列同一性。

49.权利要求26的杂合多肽，其中任何一个组分肽激素组件包含D-氨基酸。

50.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白肽激素组件的N-末端连接于至少一个毒蜥外泌肽和/或GLP1肽激素组件的C-末端。

51.权利要求26的杂合多肽，其中瘦蛋白肽激素组件通过接头共价连接于至少一个毒蜥外泌肽和/或GLP1肽激素组件。

52.权利要求51的杂合多肽，其中接头是化学稳定的。

53.权利要求51的杂合多肽，其中瘦蛋白肽激素组件或至少一个毒蜥外泌肽和/或GLP1肽激素组件包含用赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或半胱氨酸对一个或氨基酸的取代，以建立接头位点。

54.权利要求51的杂合多肽，其中接头包含选自烷基、PEG、氨基酸、聚氨基酸、双功能接头、氨基己酰基、β-丙氨酰和8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基的部分。

55.权利要求51的杂合多肽，其中接头包含选自氨基酸：Lys、Glu、Gly、Cys或β-Ala和聚氨基酸：聚-his、聚-arg、聚-lys、聚-ala、βAla-βAla、Gly-Gly-Gly或Gly-Lys-Arg的部分。

56.权利要求51的杂合多肽，其中接头的长度是1-30个残基、2-30个残基，或3-30个残基。

57.权利要求51的杂合多肽，其中接头的长度是2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基。

58.权利要求26的杂合多肽，其中至少一个组分肽激素是重组产生的。

59.权利要求26的杂合多肽，其中杂合多肽是重组产生的。

60.权利要求26的杂合多肽，其中至少一个组分肽激素是化学合成的。

61.权利要求26的杂合多肽，其中杂合多肽是化学合成的。

62.权利要求26的杂合多肽，其中杂合多肽包含2、3或4个毒蜥外泌肽和/或GLP1肽激素组件。

63.治疗具有代谢疾病或障碍的患者的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的权利要求26的杂合多肽。

64.权利要求63的方法，其中患者需要调节食物摄取。

65.权利要求63的方法，其中患者需要调节体重。

66.权利要求63的方法，其中患者需要调节造血。

67.权利要求63的方法，其中杂合体提供治疗有效的食欲减退作用。

68.权利要求63的方法，其中杂合体提供治疗有效的葡萄糖降低作用。

69.权利要求63的方法，其中杂合体提供治疗有效的胰岛素分泌增强。

70.权利要求63的方法，其中患者需要调节食物摄取、调节体重、造血、食欲减退作用、葡萄糖降低作用、胰岛素分泌增强或胰腺β细胞量增加中的一种或多种作用。

71.权利要求63的方法，其中代谢疾病或障碍是糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、肥胖、高血压、动脉粥样硬化、血脂异常、充血性心力衰竭、中风、高胆固醇血症、心血管疾病、心肌缺血、心肌再灌注、摄食障碍、妊娠期糖尿病、糖尿病神经病、肺动脉高压或与胰腺β细胞量不足相关。

72.治疗肥胖的方法，包括给需要所述治疗的受试者施用抗肥胖杂合体。

73.权利要求72的方法，其中受试者的体重至少减轻10％。

74.权利要求72的方法，其中受试者减少体脂量。

75.权利要求72的方法，其中杂合体的至少一个成分作用于参与食物摄取或体重调节的前脑中的结构。

76.权利要求72的方法，其中杂合体的至少一个成分作用于参与食物摄取或体重调节的后脑中的结构。

77.权利要求72的方法，其中杂合体包含至少一个作用于参与食物摄取或体重调节的前脑中的结构的成分和至少一个作用于参与食物摄取或体重调节的后脑中的结构的成分。

78.权利要求72的方法，进一步包括施用抗肥胖剂，其选自NPY1受体拮抗剂、NPY5受体拮抗剂、NPY2受体激动剂、NPY4受体激动剂、瘦蛋白、瘦蛋白衍生物、瘦蛋白激动剂、CNTF、CNTF激动剂/调节剂、CNTF衍生物、MCH1R拮抗剂、MCH2R拮抗剂、黑皮质素4激动剂、MC4受体激动剂、大麻素受体(CB-1)拮抗剂/反向激动剂、生长素释放肽拮抗剂、5HT2c激动剂、5-羟色胺再摄取抑制剂、5-羟色胺转运抑制剂、毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽衍生物、毒蜥外泌肽激动剂、GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1激动剂、DPP-IV抑制剂、阿片样物质拮抗剂、食欲肽拮抗剂、代谢型谷氨酸亚型5受体拮抗剂、组胺3拮抗剂/反向激动剂、托吡酯、CCK、CCK类似物、CCK激动剂、胰淀素、胰淀素类似物和胰淀素激动剂。

79.权利要求78的方法，其中施用的抗肥胖剂是苯丁胺、利莫那班、西布茶明或普兰林肽。

80.权利要求78的方法，其中施用的抗肥胖剂是ADM、ADM类似物或ADM激动剂、瘦蛋白、瘦蛋白衍生物或瘦蛋白激动剂，或PPF嵌合体或其衍生物。

81.权利要求78的方法，其中杂合体作用于参与食物摄取或体重调节的前脑结构并且抗肥胖剂作用于参与食物摄取或体重调节的后脑结构，或杂合体作用于参与食物摄取或体重调节的后脑结构并且抗肥胖剂作用于参与食物摄取或体重调节的前脑结构。

82.通过减弱、延迟或预防心脏重塑，治疗有需要的受试者中的心血管疾病的方法，所述方法包括：施用治疗有效量的心脏保护杂合体，所述杂合体有效预防对受试者的至少一个心脏参数的有害作用或改进受试者的至少一个心脏参数，其中受试者经历过心肌损害、正在经历心肌损害或有经历心肌损害的危险性；从而减弱、延迟或预防心脏重塑。

83.权利要求82的方法，其中所述心脏参数选自左室舒张功能、E/A比、左室终末舒张压、心输出量、心脏收缩力、左室质量、左室质量与体重的比例、左室体积、左房体积、左室终末舒张尺寸(LVEDD)、左室终末收缩尺寸(LVESD)、梗塞大小、运动能力、运动效率，和心脏区室大小。

84.权利要求83的方法，其中所述心脏区室大小的尺寸或壁厚度不增加。

85.权利要求83的方法，其中所述E/A比在心肌梗塞后增加。

86.权利要求83的方法，其中所述梗塞大小减少。

87.权利要求83的方法，其中所述运动能力增加。

88.权利要求83的方法，其中所述运动效率增加。

89.权利要求83的方法，其中所述心输出量在心肌梗塞后正常化。

90.权利要求82的方法，其中所述心肌损害是选自下组的状况的结果：心瓣膜疾病、心肌梗塞、心肌病、高血压、感染、炎症、手术、遗传倾向、体积过载、肺心病和肺动脉高压。

91.权利要求90的方法，其中所述心肌病是扩张性心肌病、病毒性心肌病或特发性心肌病。

92.权利要求91的方法，其中所述受试者还患有糖尿病。

93.权利要求91的方法，其中所述心脏保护杂合体是给所述受试者急性施用的。

94.权利要求91的方法，其中所述心脏保护杂合体是给所述受试者慢性施用的。

95.预防或减少心房或心室重塑的方法，所述方法包括施用治疗有效量的心脏保护杂合体，所述杂合体有效预防或减少需要或想要采用所述方法的受试者的心房或心室重塑，其中受试者经历过心肌损害、正在经历心肌损害或有经历心肌损害的危险性。

96.治疗或预防受试者中与心脏重塑相关或由心脏重塑导致的状况的方法，所述方法包括施用治疗有效量的心脏保护杂合体，所述杂合体有效预防有需要的受试者的心脏重塑，其中受试者经历过心肌损害、正在经历心肌损害或有经历心肌损害的危险性，由此改进所述与心脏重塑相关的状况。

97.权利要求96的方法，其中所述状况是心肌梗塞、炎症、缺血/再灌注、氧化应激、肺心病、晚期糖基化终产物、异常心脏壁拉伸、交感神经刺激、心肌炎、高血压、心脏移植、心脏手术、左室肥大、冠心病、原发性高血压、急性高血压紧急状况、心肌病、心功能不全、运动耐受、慢性心力衰竭、心律失常、心脏节律不整、猝死、晕厥、动脉粥样硬化、轻度慢性心力衰竭、心绞痛、心脏旁路再阻塞、间歇性跛行、舒张功能障碍和/或收缩功能障碍。

98.预防表现充血性心力衰竭的受试者中的心脏重塑的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效预防心脏重塑的量的心脏保护杂合体。

99.权利要求82-98的任一项的方法，其中心脏保护杂合体包含能够结合GLP-1或毒蜥外泌肽受体的肠降血糖素家族组件。

100.权利要求99的方法，其中杂合体进一步包含能够提供有益的心血管作用、减少葡萄糖诱导的组织损伤、减少高血压或减轻体重的肽家族组件。

101.降低或预防或治疗有需要的受试者中升高的脂水平、升高的甘油三酯水平或升高的胆固醇的方法，包括：施用治疗有效量的降脂杂合体，所述杂合体是单独的或与第二降脂剂组合。

102.上述任何权利要求的杂合体，其中所述杂合体不是WO2005/077072中公开的杂合体。

103.上述任何权利要求的方法，其中所述杂合体不是WO2005/077072中公开的杂合体。

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