JP5373855B2 - 選択可能な特性を有するハイブリッドポリペプチド - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、2005年8月11日に出願された保有者が共通の米国特許仮出願番号11/201,664、および2005年8月17日に出願された米国特許出願番号11/206,903（これらの両方が、「Hybrid Polypeptides with Selectable Properies」と題する）、ならびに2005年12月12日に出願された米国特許出願番号11/301,744に対する優先権を主張するものである。前記すべての出願は、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている。

本発明は、ペプチド化学に関し、より詳細には、選択可能な特性を有するハイブリッドポリペプチドに関する。

多くの代謝性疾患および代謝障害の中核をなすものは、インスリンレベルおよび血糖値の調節である。インスリン分泌は、腸内分泌細胞によって生産されるインクレチンと呼ばれる分泌促進ホルモンにより、部分的に調整される。インクレチンホルモン、グルカゴン様ペプチド-1（「GLP-1」）は、腸管細胞によって分泌されるペプチドホルモンであり、これは、インスリン分泌に対する増進作用を生じさせることが多くの研究において証明されている。GLP-1は、腸管内のプログルカゴンからプロセッシングされ、栄養誘発インスリン放出を増進させる（Krcymann B., et al., Lancet, 2:1300-1303 (1987)）。GLP-1の様々なトランケート形が、インスリン分泌を刺激すること（インスリン分泌刺激作用）およびcAMP形成を刺激することは公知である［例えば、Mojsov, S., Int. J. Pep. Pro. Res., 40:333-343 (1992)参照］。様々なインビトロ研究室実験と、GLP-1、GLP-1(7-36)アミド（配列番号：61）、およびGLP-1(7-37)酸（配列番号：204）の外因性投与への哺乳動物、特にヒト、のインスリン分泌刺激応答との関係が確立されている（例えば、Nauck, M. A., et al., Diabetologia, 36:741-744 (1993); Gutniak, M., et al., New Eng. J. of Med., 326(20):1316-1322 (1992); Nauck, M. A., et al., J. Clin. Invest., 91:301-307 (1993); and Thorens, B., et al., Diabetes, 42:1219-1225 (1993)参照）。

GLP-1(7-36)アミド（配列番号：61）は、インスリン感受性を刺激することにより、および生理的濃度でのグルコース誘発インスリン放出を増進することにより、インスリン依存性糖尿病において顕著な抗糖尿病誘導作用を発揮する（Gutniak M., et al., New Eng. J. Med., 326:1316-1322 (1992)）。非インスリン依存性糖尿病患者に投与されたとき、GLP-1(7-36)アミド（配列番号：61）は、インスリン放出を刺激し、グルカゴン分泌を低下させ、胃内容排出を抑制し、グルコース利用能を強化する（Nauck, 1993; Gutniak, 1992; Nauck, 1993）。しかし、糖尿病の長期治療のためのGLP-1型の分子の使用は、こうしたペプチドの半減期が相当短いため、複雑であった。

より詳細には、GLP-1は、プログルカゴン、160-アミノ酸プロホルモンから誘導される30-アミノ酸ペプチドである。膵臓および腸内の種々のプロホルモンコンバターゼの作用は、グルカゴンおよび他の不明確なペプチドの生産を生じさせるが、プログルカゴンの切断は、GLP-1およびGLP-2ならびに二つの他のペプチドの生産を生じさせる。GLP-1のアミノ酸配列は、これまでに研究されたすべての哺乳動物において100%相同性であり、これは、重要な生理的役割を意味する。GLP-1(7-37)酸は、C末端がトランケートされ、アミド化されて、CLP-1(7-36) NH₂（配列番号：61）を形成する。この遊離酸GLP-1 (7-37) OH（配列番号：204）、アミド、GLP-1 (7-36) NH₂（配列番号：61）の生物学的作用および代謝回転は、区別がつかない。慣例により、アミノ酸の番号付けは、プログルカゴンからプロセッシングされたGLP-1 (1-37) OH（配列番号：59）に基づく。生物学的に活性なGLP-1は、さらなるプロセッシングの結果である：GLP-1 (7-36) NH₂（配列番号：61）。従って、GLP-1 (7-37) OH（配列番号：204）またはGLP-1 (7-36) NH₂（配列番号：61）の最初のアミノ酸は、⁷Hisである。

胃腸管内で、腔内グルコースによる刺激に反応して、腸、結腸および直腸粘膜のL-細胞がGLP-1を生産する。活性GLP-1の血漿半減期は、<5分であり、その代謝クリアランス速度は、約12-13分である（Holst, Gastroenterology 107(6):1848-55 (1994)）。GLP-1の代謝に関与する主要なプロテアーゼは、ジペプチジルペプチダーゼ(DPP)IV(CD26)であり、これは、N末端His-Alaジペプチドを切断し、例えば、代謝産物GLP-1 (9-37) OH（配列番号：205）またはGLP-1 (9-36) NH₂（配列番号：206）を生産する。これらの代謝産物は、GLP-1受容体の不活性、弱作動薬または拮抗薬と様々に記載されている。GLP-1受容体(GLP-1R)は、463アミノ酸のGタンパク結合受容体であり、膵臓ベータ細胞内、肺内、ならびにより小程度だが、脳、脂肪組織および腎臓内に位置する。GLP-1 (7-37) OH（配列番号：204）またはGLP-1 (7-36) NH₂（配列番号：61）によるGLP-1Rの刺激は、アデニル酸シクラーゼの活性化、cAMPの合成、膜の脱分極、細胞内カルシウムの上昇およびグルコース誘発インスリン分泌の増加を生じさせる（Holz et al., J. Biol. Chem. 270(30):17749-57 (1995)）。

GLP-1は、食事摂取に反応して腸粘膜から分泌される強力なインスリン分泌促進物質である。GLP-1の絶大なるインクレチン効果は、GLP-1Rノックアウトマウスがグルコース不耐性であるという事実によって強調される。静脈内注入されたGLP-1のインクレチン反応は、糖尿病被験者において維持されるが、これらの患者における経口グルコースに対するインクレチン反応は損なわれる。注入または皮下注射によるGLP-1投与は、糖尿病患者における空腹時グルコースレベルを制御し、インスリン分泌のためのグルコース閾値を維持する（Gutniak et al., N. Engl. J. Med. 326:1316-22 (1992); Nauck et al., Diabet. Med. 13:(9 Suppl 5):S39-S43 (1996); Nauck et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:912-917 (1993)）。GLP-1は、スルホニル尿素薬に随伴する低血糖を回避しながら、生理学的様式でインスリン分泌を増加させることができる治療薬として、とてつもない可能性を示した。

グルコース恒常性に対するGLP-1の他の重要な効果は、グルカゴン分泌の抑制および胃運動性の抑制である。グルカゴンの膵臓アルファ細胞分泌に対するGLP-1阻害作用は、糖新生および糖原分解を減少させることにより肝臓グルコース生産の減少をもたらす。糖尿病患者では、GLP-1のこの抗グルカゴン効果が維持される。

胃の運動性および胃液分泌が抑制される、GLP-1のいわゆる回腸ブレーキ効果は、迷走神経遠心性受容体により、または腸平滑筋に対する直接作用によってもたらされる。GLP-1による胃酸分泌の減少は、栄養利用の遅滞期の一因となり、従って、急速なインスリン応答を不要にする。要約すると、GLP-1の胃腸作用は、グルコースおよび脂肪酸吸収遅延に有意に寄与し、インスリン分泌およびグルコース恒常性を変調する。

GLP-1が、ベータ細胞特異的遺伝子、例えば、GLUT-1トランスポーター、インスリン（PDX-1とインスリン遺伝子プロモーターとの相互作用による）、およびヘキソキナーゼ-1を誘導することも証明されている。従って、GLP-1は、齧歯動物実験によって実証されているように、加齢に通常随伴するグルコース不耐性を逆行させる可能性を秘めている。加えて、GLP-1は、ベータ細胞不足状態の間、ベータ細胞機能を回復させることに加えて、ベータ細胞新生に寄与し、ベータ細胞量を増加させることができる。

GLP-1の主要な効果としては、視床下部GLP-1Rの作用によりもたらされる、食餌摂取量の減少と対での満腹が挙げられる。II型糖尿病被験者におけるGLP-1の48時間持続SC注入は、空腹および食事摂取を減少させ、満腹を増大させた。これらの食欲抑制効果は、GLP-1Rノックアウトマウスには存在しなかった。

エキセンジンは、インスリン分泌に関係するペプチドの別のファミリーである。エキセンジンは、アメリカドクトカゲ（Gila-monster）、アリゾナに内在するトカゲ、およびメキシコドクトカゲ（Mexican Beaded Lizard）の唾液中で見出せる。エキセンジン-3は、メキシコドクトカゲ（学名：Heloderma horridum）の唾液中に存在し、エキセンジン-4は、アメリカドクトカゲ（学名：Heloderma suspectum）の唾液中に存在する（Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265:20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05 (1992)）。エキセンジンは、グルカゴン様ペプチドファミリーの幾つかのメンバーとの多少の配列類似性を有し、最高の同一性、53%、は、GLP-1とのものである（Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993)）。

エキセンジン-4は、インスリン分泌性TC1細胞上の、モルモット膵臓からの散在性腺房細胞の、および胃からの壁細胞のGLP-1受容体に結合し；このペプチドは、また、ソマトスタチン放出を刺激し、摘出された胃におけるガストリン放出を抑制する（Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993); Schepp, et al., Eur. J. Pharmacol., 69:183-91 (1994); Eissele, et al., Life Sci., 55:629-34 (1994)）。エキセンジン-3およびエキセンジン-4は、膵臓腺房細胞上のGLP-1受容体に結合すること、膵臓腺房細胞内でのcAMP生産および膵臓腺房細胞からのアミラーゼ放出を刺激することが判明した（Malhotra, R., et al., Relulatory Peptides, 41:149-56 (1992); Raufman, et al., J. Biol. Chem., 267:21432-37 (1992); Singh, et al., Regul. Pept., 53:47-59 (1994)）。糖尿病の治療および高血糖の予防のためのエキセンジン-3およびエキセンジン-4のインスリン分泌刺激活性の使用が報告されている（Eng、米国特許第5,424,286号）。

トランケート型エキセンジンペプチド、例えば、エキセンジン[9-39]、カルボキシアミド化分子、およびフラグメント3-39から9-39まで、は、GLP-1の強力で選択的な拮抗薬であると報告されている（Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993); Raufman, J. P., et al., J. Biol. Chem., 266:2897-902 (1991); Schepp, W., et al., Eur. J. Pharm., 269:183-91 (1994); Montrose-Rafizadeh, et al., Diabetes, 45(Suppl. 2):152A (1996)）。エキセンジン[9-39]（配列番号：207）は、内因性GLP-1をインビボで遮断し、その結果、インスリンの分泌を減少させる（Wang, et al., J. Clin. Invest., 95:417-21 (1995); D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97:133-38 (1996)）。GLP-1のインスリン分泌刺激効果の原因であるように見える受容体が、ラット膵島細胞からクローニングされた（Thorens, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8641-8645 (1992)）。エキセンジンおよびエキセンジン[9-39]は、このクローニングされたGLP-1受容体に結合する（ラット膵臓細胞GLP-1受容体：Fehmann HC, et al., Peptides, 15 (3): 453-6 (1994)；ヒトGLP-1受容体：Thorens B, et al., Diabetes, 42 (11): 1678-82 (1993)）。そのクローニングされたGLP-1受容体でトランスフェクションされた細胞において、エキセンジン-4は、作動薬であり、すなわち、cAMPを増加させるが、エキセンジン[9-39]（配列番号：207）は、拮抗薬であり、すなわち、エキセンジン-4およびGLP-1の刺激作用を遮断する。Id.

より詳細には、エキセンジン-4は、アメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum）の唾液中で見出せる39アミノ酸C末端アミド化ペプチドであり、GLP-1ペプチド配列との53%アミノ酸配列同一性を有する。例えば、Eng, J., et al. “Isolation and Characterization of Exendin-4, and Exendin-3 Analogue from Heloderma suspectum Venom” J. Bio. Chem., 267:11, p. 7402-7405 (1992), Young, A. A., et al., “Glucose-Lowering and Insulin-Sensitizing Actions of Exendin-4,” Diabetes, Vol. 48, p. 1026-1034, May, 1999参照。その活性の観点から、エキセンジン-4は、GLP-1受容体に対する非常に特異的な作動薬であり、GLP-1同様、インスリン分泌を刺激することができる。従って、GLP-1同様、エキセンジン-4は、インスリン分泌刺激ペプチドとみなされる。

しかし、GLP-1とは異なり、エキセンジン-4は、GLP-1配列をインビボで急速に分解するジペプチジルペプチダーゼIVに対するその耐性のため、ヒトにおいて比較的長い半減期を有する。さらに、GLP-1と比較して、エキセンジン-4は、強いインスリン分泌刺激能力を有すること、および低いエキセンジン-4濃度を用いて、そうした刺激活性を得ることができることが証明された。例えば、米国特許第5,424,286号（参照により本明細書に取り入れられている）参照。従って、エキセンジン-4ペプチドまたはそれらの誘導体（そうした誘導体の例については、例えば、米国特許第6,528,486号（参照により本明細書に取り入れられている）およびその対応する国際出願WO01/04156を参照のこと）は、インスリンレベルの調節不全を伴う状態（例えば、糖尿病などの状態）の治療に対して、インスリンよりも、またはGLP-1よりも、大きな潜在的有用性を有する。

代謝性疾患および代謝障害に関係するペプチドホルモンの別のファミリーは、アミリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、アドレノメジュリンおよびインテルメジン（「ＡＦＰ−６」としても知られている）をはじめとする、ペプチドホルモンのアミリンファミリーである。アミリンは、37-アミノ酸ペプチドホルモンである。これは、ヒト2型糖尿病患者の膵島におけるアミロイド沈着物の主成分として単離、精製および化学的に特性付けされた（Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:8628-8632 (1987)）。アミリン分子は、二つの後翻訳修飾を有する：C末端はアミド化され、位置2および7のシステインが架橋されて、N末端ループを形成する。ヒトアミリン遺伝子のオープンリーディングフレームの配列は、LysのN末端コドンの前にLys-Arg二塩基性アミノ酸タンパク質分解的切断シグナルの存在、およびCLAIMS末端位置のそのLys-Argタンパク質分解性シグナルの前にGlyの存在、タンパク質アミド化酵素、PAMによるアミド化についての典型的な配列を示す（Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)）。

アミリンは、胃内容排出を調節し、グルカゴン分泌および食事摂取を抑制し、従って、循環におけるグルコース出現速度を調節すると考えられている。循環からのグルコースの消失速度および末梢組織によるその取り込みを調節するインスリンの作用を補足するように見える。これらの作用は、アミリンが、食後のグルコース制御に関するインスリンの効果を、少なくとも三つの独立したメカニズムにより補足し、これらのメカニズムのすべてがグルコース出現速度に影響を及ぼすことを示す、齧歯動物およびヒトにおける実験に基づく所見によって裏付けられる。第一に、アミリンは、食後グルカゴン分泌を抑制する。健常な成体と比較して、1型糖尿病の患者は、循環性アミリンを有さず、2型糖尿病の患者は、低減された食後アミリン濃度を有する。さらに、循環性アミリンに結合するアミリン特異的モノクローナル抗体の注入もまた、対照を基準にして大いに上昇したグルカゴン濃度を生じさせる。これら両方の結果が、食後グルカゴン分泌の調節における内因性アミリンの生理的役割を指している。第二に、アミリンは、胃腸の運動性および胃内容排出を遅速させる。最後に、ラットアミリンの視床下部内注射は、ラットの摂食を減少させ、その視床下部における神経伝達物質の代謝を改変することが証明された。ある研究では、ラットアミリンおよびラットCGRPの視床下部内注射後八時間までの間、餌摂取量が有意に減少した。ヒトでの試験では、アミリン類似体、プラムリンチドが、体重または体重増加を減少させることが証明された。アミリンは、糖尿病および肥満などのメタボリック状態の治療に有益であり得る。アミリンは、疼痛、骨疾患、胃炎を治療するために、脂質、特にトリグリセリドを調整するために、または脂肪の優先的減少および除脂肪組織の節約など、身体成分に影響を及ぼすために使用することもできる。

ホルモン・カルシトニン（CT）は、誘導された高カルシウム血症に応答したその分泌およびその急速な低カルシウム効果のために名づけられた。CTは、甲状腺内の神経内分泌細胞において生産され、それらの細胞から分泌される。それ故、それらの細胞は、C細胞と名付けられた。CT(1-32)（配列番号：48）の最もよく研究された作用は、破骨細胞に対する効果である。CTのインビトロ効果としては、波状縁の急速な喪失およびリソソーム酵素の放出減少が挙げられる。結局、CTによる破骨細胞機能の阻害は、骨吸収を減少させることとなる。しかし、甲状腺切除術の場合の血清CTの慢性的減少も、骨髄性甲状腺癌において見られる血清CT増加も、血清カルシウムおよび体重の変化には関係がないように見える。それ故、CT(1-32)（配列番号：48）の主要な機能は、緊急事態時の急性高カルシウム血症の抑制に努めること、ならびに／または「カルシウムストレス」、例えば成長、妊娠および授乳の期間、骨格を保護することである可能性が高い（Reviewed in Becker, JCEM, 89(4): 1512-1525 (2004) and Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067-1093 (1999)）。マウスが、正常レベルの基底カルシウム関連値を有するが、増大したカルシウム血症性応答を有することを示した、カルシトニンとCGRP-Iペプチドとの両方を除去するカルシトニン遺伝子ノックアウトマウスからの最近のデータ（Kurihara H, et al., Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8）は、これと一致する。CTは、血漿カルシウムレベルに影響を及ぼし、破骨細胞機能を阻害し、骨粗しょう症の治療に広く用いられている。治療的には、サケCT（sCT）は、最少の副作用で、骨密度を増加させ、骨折率を減少させるように見える。CTは、骨格の一つ以上の領域において拡大または変形した骨を生じさせ得る慢性骨格疾患である、骨のパジェット病の治療薬として、過去25年にわたって成功裏に使用されてもいる。CTは、また、骨粗しょう症中に経験する骨の疼痛に対するその鎮痛効果に広く使用されているが、この効果のメカニズムは、明確には理解されていない。

カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）は神経ペプチドであり、その受容体は、神経系および心血管系をはじめとする体内に広く分布している。このペプチドは、感覚神経伝達を変調するようであり、今までに発見された最も強力な内因性血管拡張ペプチドの一つである。CGRPについての報告されている生物学的効果としては、炎症の際の物質Pの変調、神経筋接合部でのニコチン性受容体活性、膵酵素分泌の刺激、胃酸分泌の減少、末梢血管拡張、心拍加速、神経変調、カルシウム代謝の調節、造骨刺激、インスリン分泌、体温の上昇および食事摂取量の減少が挙げられる。（Wimalawansa, Amylin, calcitonin gene-related peptide, calcitonin and ADM: a peptide superfamily. Crit Rev Neurobiol. 1997; 11(2-3):167-239）。CGRPの重要な役割は、α-CGRPの静脈内投与後の平均動脈圧の低下によって明示されるような、その強力な血管拡張作用による様々な器官への血流の制御である。血管拡張作用は、末梢交感神経活性増加に起因する高い末梢血管抵抗および高血圧を実証した同型接合ノックアウトCGRPマウスの最近の分析（Kurihara H, et al., Targeted disruption of ADM and αCGRP genes reveals their distinct biological roles. Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8）によっても裏付けられる。このように、CGRPは、数ある作用の中でも血管拡張効果、血圧降下効果および心拍数増加を惹起するように見える。

うっ血性心不全の患者へのCGRPの持続注入は、副作用を伴うことなく血行力学的機能に対する持続的薬効を示し、心不全での使用を示差した。CGRP使用の他の適応症としては、腎不全、急性および慢性冠動脈虚血、心不整脈の治療、他の末梢血管疾患、例えば、レイノー現象、クモ膜下出血、高血圧、および肺高血圧が挙げられる。子癇前症性妊娠中毒症および早期分娩も治療できる可能性を秘めている（Wimalawansa, 1997）。最近の治療的使用としては、偏頭痛の治療のためのCGRP拮抗薬の使用が挙げられる。

アドレノメジュリン（ADM）は、ほぼあらゆるところで発現され、このペプチドを含む組織の方が含まない組織よりはるかに多い。出版されているADMの総説（Hinson, J.P. et al., Endocrine Reviews (2000) 21(2): 138-167）には、血管拡張、細胞増殖、ホルモン分泌の調節およびナトリウム利尿を含む一定範囲の生物学的効果と共に、心血管系、細胞増殖、中枢神経系および内分泌系に対するその効果が詳述されている。ラット、ネコ、ヒツジおよび人間での研究は、ADMの静脈内注入が、強力な持続性低血圧を生じさせること、およびCGRPのものに匹敵することを確認している。しかし、麻酔されたラットにおける平均動脈圧に対するADMの血液降下効果は、CGRP拮抗薬CGRP_8-37によって阻害されず、これは、この効果がCGRP受容体によって媒介されないことを示唆している。麻酔された、意識のある、または高血圧のラットにおけるヒトＡＤＭの急性または慢性投与は、血圧降下を伴う全末梢抵抗の有意な低下と、心拍数、心送血量および１回拍出量の付随的上昇とを生じさせる。

ADMは、胚形成および分化における重要な因子として、ならびにラット内皮細胞についてのアポトーシス生残因子としても提案されている。これは、ADM遺伝子の喪失のために同型接合のマウスが胚形成中に血管形成不良を示し、それ故、妊娠中期に死亡した、最近のマウスADMノックアウト研究によって裏付けられる。ADM+/-異型接合マウスは、高い血圧を有すると共に組織損傷を受けやすいと報告されている（Kurihara H, et al., Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S105-8）。

ADMは、下垂体、副腎、生殖器官および膵臓などの内分泌器官に影響を及ぼす。このペプチドは、下垂体からのACTH放出に関して一定の役割を果すように見える。副腎において、それは、ラットおよびヒトの両方で副腎皮質の分泌活性に影響を及ぼすように見え、無傷ラットでは、副腎血管床において血管拡張薬として作用して、副腎血流を増加させる。ADMは、女性生殖管全体にわたって存在することが証明されており、正常妊娠時には血漿レベルが上昇される。子癇前症のラットモデルでの研究により、ADMは、妊娠後期の間にラットに与えると、高血圧を反転させ、仔の死亡率を減少させることができることが証明された。この子癇前症モデルにおいて妊娠初期および妊娠していない動物では同様の効果を有さなかったので、これは、ADMが、子宮胎盤心血管系において重要な調節的役割を果し得ることを示唆している。膵臓において、ADMは、初期高グルコースレベルを生じさせる経口グルコース負荷に対するインスリンの応答を減弱し、遅延させるので、阻害的役割を果す可能性が最も高い。ADMは、腎機能に作用することもできる。抹消投与されたボーラスは、平均動脈圧を有意に低下させ、腎臓血流、糸球体濾過率および尿流を上昇させることができる。一部の事例では、Na+排泄も増加させる。

ADMは、骨および肺に対する他の末梢効果も有する。骨について、研究は、心血管系および流体の恒常性を越える一定の役割を裏付け、ADMが、胎仔および成体齧歯動物骨芽細胞に対して作用して、細胞増殖を増加させ、それが形質転換増殖因子-βなどの既知骨芽細胞増殖因子のものに匹敵することを証明した。これは、骨粗しょう症研究における主な課題の一つが、骨芽細胞刺激により骨質量を増加させる治療法の開発であるので、臨床的に重要である。肺において、ADMは、肺の血管拡張を生じさせるばかりでなく、ヒスタミンまたはアセチルコリンによって誘導される気管支収縮も抑制する。ラットモデルにおいて肺高血圧を治療するためにエーロゾル化ADMを使用した最近の研究は、ADMで治療したラットにおいて、食塩水を与えたラットにおけるより、平均肺動脈圧および全肺抵抗が顕著に低かったことを証拠として、この条件の吸入治療が有効であることを示している。この結果は、全身動脈圧または心拍数の変化を伴わずに達成された（Nagaya N et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285:H2125-31）。

健常なボランディアにおいて、ADMの静脈内注入は、動脈圧を低下させ、心拍数、心送血量、cAMP、プロラクチン、ノルエピネフリンおよびレニンの血漿レベルを刺激することが証明された。これらの患者において、尿量およびナトリウム排泄の増加は、殆どまたはまったく観察されなかった。心不全または慢性腎不全を有する患者において、静脈内ADMは、正常な被験者において見られる効果と同様の効果を有し、ならびに投与される用量に依って、利尿およびナトリウム利尿も誘導した（Nicholls, MG et al. Peptides. 2001; 22:1745-1752）。実験的ADM治療は、動脈および肺高血圧、敗血症性ショックおよび虚血／再潅流傷害において有益であることも証明された（Beltowski J., Pol J Pharmacol. 2004;56:5-27）。ADM治療についての他の適応症としては、末梢血管疾患、クモ膜下出血、高血圧、子癇前症性妊娠中毒症および早期分娩、ならびに骨粗しょう症が挙げられる。

AFP-6（すなわち、インテルメジン）の発現は、主として下垂体および胃腸管においてである。AFP-6についての特異的受容体は報告されていない。しかし、結合研究は、AFP-6がアミリンファミリーの既知受容体すべてに結合することを示している。AFP-6は、内因性CGRP受容体を発現するSK-N-MCおよびL6細胞においてｃAMP生産を増加させ、これらの細胞においてその受容体への結合について標識CGRPと競合することが証明された。出版物に掲載されたインビボ研究において、AFP-6投与は、正常なラットおよび自然発生高血圧ラットの両方において、最も可能性が高いところではCRLR/RAMP受容体との相互作用により血圧低下をもたらした。マウスにおけるインビボ投与は、胃内容排出および食事摂取の抑制をもたらした（Roh et al. J Biol Chem. 2004 Feb 20;279(8):7264-74）。

アミリンファミリーペプチドホルモンの生物学的作用は、二つの密接な関係のII型Gタンパク結合受容体（GPCR）、カルシトニン受容体（CTR）およびカルシトニン受容体様受容体（CRLR）への結合によって、一般に媒介されることが報告されている。クローニングおよび機能の研究により、CGRP、ADMおよびアミリンが、CTRまたはCRLRと受容体活性修飾タンパク質（RAMP）との種々の組み合わせと相互作用することが証明された。多くの細胞は多数のRAMPを発現する。カルシトニン、CGRP、ADMおよびアミリンの機能的受容体を生じさせるために、RAMPとCRTまたはCRLRのいずれかとの共発現が必要であると考えられている。RAMPファミリーは、三つのメンバー（RAMP 1、-2および-3）を含み、これらは、共有する配列同一性は30%未満だが、共通の位相構成を有する。CRLRおよびRAMP1の共発現は、CGRPの受容体の形成をもたらす。CRLRおよびRAMP2の共発現は、ADMの受容体の形成をもたらす。CRLRおよびRAMP3の共発現は、ADMおよびCGRPの受容体の形成をもたらす。hCTR2およびRAMP1の共発現は、アミリンおよびCGRPの受容体の形成をもたらす。hCTR2およびRAMP3の共発現は、アミリンの受容体の形成をもたらす。

代謝性疾患および代謝異常に関係するさらに別のペプチドホルモンファミリーは、レプチンファミリーである。成熟形の循環性レプチンは、血液脳関門（BBB）および血液−CSF関門によりCNSから通常は排除される、146-アミノ酸タンパク質である。例えば、Weigle et al., 1995. J Clin Invest 96 : 2065-2070参照。レプチンは、食事摂取量および体重を調節する、負のフィードバックにおける求心性シグナルである。レプチン受容体は、サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。レプチンの食欲不振誘発効果は、タンパク質−タンパク質相互作用のための幾つかのモチーフを含む長い細胞質内ドメインをコードする、この受容体のOb-Rbアイソフォームのホモ二量体への結合に依存する。Ob-Rbは、視床下部において高度に発現され、これは、この脳領域が重要なレプチン作用部位であることを示唆している。マウスob遺伝子の突然変異は、雄と雌との両方の同型接合ob/ob肥満マウスにおける肥満、体脂肪蓄積増加、高血糖、高インスリン血症、低体温ならびに甲状腺および生殖機能障害を含む、病態生理を示す症候群を生じさせることが実証された（例えば、Ingalis, et al., 1950. J Hered 41 : 317-318参照）。レプチンまたはレプチン受容体についての治療的使用としては、（i）糖尿病（例えば、PCT特許出願 W0 98/55139、W0 98/12224、およびW0 97/02004参照）；（ii）造血（例えば、PCT特許出願 W0 97/27286およびW0 98/18486)；（iii）不妊症（例えば、PCT特許出願W0 97/15322およびW0 98/36763）；および（iv）腫瘍抑制（例えば、PCT特許出願W0 98/48831）が挙げられる。前述の各特許出願は、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている。

レプチン受容体（OB-R）遺伝子は、クローニングされており（GenBankアクセッション番号AF098792）、db遺伝子座にマッピングされている（例えば、Tartaglia, et al., 1995. Cell 83: 1263-1271参照）。可変スプライシングから得られたOB-Rの幾つかの転写産物も特定されている。OB-Rの欠失は、ob/obマウスと表現型的に同一である突然変異糖尿病ob/obマウスにおいて一定の症候群を生じさせる（例えば、Ghilardi, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6231-6235参照）。しかし、ob/obマウスとは対照的に、C57BLKS/J-m ob/obマウスへの組換えレプチンの投与は、食事摂取量および体重減少を生じさせない（例えば、Roberts and Greengerg, 1996. Nutrition Rev. 54: 41-49参照）。

組換えレプチン、レプチンフラグメントおよび／またはレプチン受容体変異体の投与から体重減少活性を報告できる殆どのレプチン関連研究は、前記構築物を脳室に直接投与したものである。例えば、Weigle, et al., 1995. J Clin Invest 96: 2065-2070; Barash, et al., 1996. Endocrinology 137: 3144-3147参照。

他の研究は、被験者への腹腔内（i.p.）投与によるレプチンペプチドの投与に起因する有意な体重減少活性を証明した。Grasso et al., 1997. Endocrinology 138: 1413-1418参照。さらに、レプチンフラグメント、最も特定的には、完全長ヒトレプチンから取った残基を含む18アミノ酸フラグメントは、ラットの後脳室への内植カニューレによる直接投与によってのみだが、体重減少に関して機能することが報告されている。例えばPCT特許出願W0 97/46585参照（これは、その全体が参照により本明細書に取り入れられている）。

代謝性疾患および代謝異常に関係する別のペプチドホルモンは、コレシストキニン（CCK）である。報告によれば、CCKは、1928年に、胆嚢収縮を刺激するその能力により、腸抽出物の調製試料から特定された。以来、膵液分泌の刺激、胃内容排出の遅延、腸の運動性の刺激およびインスリン分泌の刺激をはじめとするCCKの他の生物学的作用が報告されている。Lieverse et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 713: 268-272 (1994)参照。報告によると、CCKの作用としては、心血管機能、呼吸機能、神経毒および発作、癌細胞増殖、痛覚脱失、睡眠、性および生殖行動、記憶、不安ならびにドーパミン媒介行動に対する効果も挙げられる。Crawley and Corwin, Peptides 15: 731-755 (1994)。CCKの他の報告されている効果としては、膵臓成長の刺激、胆嚢収縮の刺激、胃酸分泌、膵臓ポリペプチド放出および蠕動の収縮成分の抑制が挙げられる。CCKのさらなる報告されている効果としては、血管拡張が挙げられる。Walsh, “Gastrointestinal Hormones,” In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York)。

グルカゴン、CCKおよびボンベシンの配合剤の注射は、非剥奪ラットにおいてコンデンスミルク試験食の摂取の抑制を個々の化合物で観察された抑制より強化したと報告されている。Hinton et al., Brain Res. Bull. 17:615-619 (1986)。グルカゴンおよびCCKは、ラットにおいて偽栄養負荷を相乗的に抑制することも報告されている。LeSauter and Geary, Am. J. Physiol. 253:R217-225 (1987); Smith and Gibbs, Annals N.Y. Acad. Sci. 713:236-241 (1994)。エストラジオールおよびCCKは、満腹に対する相乗効果を有し得ることも示唆されている。Dulawa et al., Peptides 15:913-918 (1994); Smith and Gibbs, （上記）。小腸からその中の栄養素に反応して生じるシグナルが、CCKと相乗的に相互作用して接触を減少させることも報告されている。Cox, Behav. Brain Res. 38:35-44 (1990)。加えて、CCKは、幾つかの種において満腹を誘導することが報告されている。例えば、ラットにおいて腹腔内注射された、ブタにおいて動脈内注射された、ネコおよびブタにおいて静脈内注射された、サル、ラット、イヌおよびヒツジにおいて脳室に注射された、ならびに肥満および肥満でないヒトにおいて静脈内注射されたCCKによって食欲低下が生じたと報告されている。Lieverse et al.,（上記）参照。報告によると、幾つかの研究室からの研究は、サルおよびラットの両方において食物補強剤に対する反応と非食物補強剤に対する反応を比較することにより、ならびに食餌摂取後に通常観察される行動の順序（すなわち、食後満腹順序）をCCKが惹起することを証明することにより、摂食の抑制に対する低用量のCCKの行動的特異性を確認した。加えて、報告によると、CCK後の行動と、単独でまたはCCKと併用での食物摂取後の行動との比較は、CCKと食物摂取の間の行動的類似性を示した。Crawley and Corwin,（上記）。生理的血漿濃度のCCKが、食事摂取を抑制し、痩せたヒトと肥満のヒト、両方において満腹を増大させることも報告された。Lieverse et al.,（上記）参照。

CCKは、1966年に33-アミノ酸ペプチドとして特性付けされた。Crawley and Corwin,（上記）。CCKのアミノ酸配列の種特異的分子変異体が特定された。報告によると、ブタ、ラット、ニワトリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて、33-アミノ酸配列およびトランケート型ペプチド、その8-アミノ酸C末端配列（CCK-8)が特定された。報告によると、ブタ、イヌおよびモルモットにおいて、39-アミノ酸配列が発見された。ネコ、イヌおよびヒトにおいて、58-アミノ酸配列が発見されたと報告された。報告によると、カエルおよびカメは、CCKおよびガストリンの両方と相同性の47-アミノ酸配列を示した。非常に新鮮なヒトの腸は、CCK-83と呼ばれる、さらに長い分子を少量含有すると報告された。報告によると、ラットにおいて、重要な中間形が特定されており、CCK-22と呼ばれている。Walsh， “Gastrointestinal Hormones，” In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York)。非硫酸化CCK-8およびテトラペプチド（CCK-4（CCK(30-33) と呼ばれている）が、ラットの脳において報告されている。C末端ペンタペプチド（CCK-4（CCK(29-33) と呼ばれている）は、CCKの構造相同性を保存し、神経ペプチド、ガストリンとの相同性も保存している。報告によると、そのC末端硫酸化オクタペプチド配列、CCK-8は、種を越えて比較的保存される。報告によると、ラット甲状腺癌、ブタの脳およびブタの腸からのプレプロコレシストキニンをコードするcDNAのクローニングおよび配列分析は、115アミノ酸であり、以前に単離されたと報告されているすべてのCCK配列を含有するCCKの前駆体をコードする、345ヌクレオチドを明らにした。Crawley and Corwin,（上記）。

CCKは、1966年に33-アミノ酸ペプチドとして特性付けされた。Crawley and Corwin,（上記）。CCKのアミノ酸配列の種特異的分子変異体が特定された。報告によると、ブタ、ラット、ニワトリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて、33-アミノ酸配列およびトランケート型ペプチド、その8-アミノ酸C末端配列（CCK-8)が特定された。報告によると、ブタ、イヌおよびモルモットにおいて、39-アミノ酸配列が発見された。ネコ、イヌおよびヒトにおいて、58-アミノ酸配列が発見されたと報告された。報告によると、カエルおよびカメは、CCKおよびガストリンの両方と相同性の47-アミノ酸配列を示した。非常に新鮮なヒトの腸は、CCK-83と呼ばれる、さらに長い分子を少量含有すると報告されている。報告によると、ラットにおいて、重要な中間形が特定されており、CCK-22と呼ばれている。Walsh, “Gastrointestinal Hormones,” In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York)。非硫酸化CCK-8およびテトラペプチド（CCK-4（CCK(30-33) と呼ばれている；配列番号：208）が、ラットの脳において報告されている。C末端ペンタペプチド（CCK-4（CCK(29-33) と呼ばれている；配列番号：209）は、CCKの構造相同性を保存し、神経ペプチド、ガストリンとの相同性も保存している。報告によると、そのC末端硫酸化オクタペプチド配列、CCK-8は、種を越えて比較的保存される。報告によると、ラット甲状腺癌、ブタの脳およびブタの腸からのプレプロコレシストキニンをコードするcDNAのクローニングおよび配列分析は、115アミノ酸であり、以前に単離されたと報告されているすべてのCCK配列を含有するCCKの前駆体をコードする、345ヌクレオチドを明らにした。Crawley and Corwin,（上記）。

CCKは、中枢神経系全体にわたって、ならびに内分泌細胞内および上小腸の腸神経内に分布していると言われている。CCK作動薬としては、CCKそれ自体（CCK-33とも呼ばれる）、CCK-8（CCK(26-33)；配列番号：55）、非硫酸化CCK-8、ペンタガストリン（CCK-5またはCCK(29-33)；配列番号：209）、およびテトラペプチド、CCK-4（CCK(30-33)；配列番号：208）が挙げられる。報告によると、膵臓CCK受容体で、CCK-8は、非硫酸化CCK-8またはCCK-4より1000-5000大きな力で結合を置換し、ならびにCCK-8は、膵臓アミラーゼ分泌の刺激に関して、非硫酸化CCK-8またはCCK-4より約1000倍大きな効力があると報告されている。Crawley and Corwin,（上記）。大脳皮質からのホモジネートにおいて、CCK受容体結合は、非硫酸化CCK-8によって、および等モル濃度、非硫酸化CCK-8より10倍または100倍大きい濃度のCCK-4によって置換されると言われている。

代謝性疾患および代謝障害に関係するペプチドホルモンのさらに別のファミリーは、膵臓ポリペプチドファミリー（「PPF」）である。膵臓ポリペプチド（「PP」）は、インスリン抽出物の不純物として発見され、機能的重要性ではなくその起源器官によって名づけられた（Kimmel et al., Endocrinology 83: 1323-30 (1968)）。PPは、個別の構造モチーフを含有する36-アミノ酸ペプチドである。その後、腸の抽出物において関連ペプチドが発見され、そのNおよびC末端チロシンのため、ペプチドYY（「PYY」）と名づけられた（Tatemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2514-8 (1982)）。後に、第三の関連ペプチドが脳の抽出物において発見され、神経ペプチドY（「NPY」）と名づけられた（Tatemoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5485-9 (1982); Tatemoto et al., Nature 296: 659-60 (1982)）。

これら三つの関連ペプチドは、様々な生物学的効果を発揮すると報告されている。PPの効果としては、膵液分泌の抑制、および胆嚢の弛緩が挙げられる。中枢投与されたPPは、摂食量のわずかな増加を生じさせ、これは、視床下部および脳幹に局在する受容体によって媒介され得る（Gehlert, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22 (1998)に概説されている）。

PYYの放出は、食事の後に起こる。PYYの代替分子形は、PYY(3-36)（配列番号：58）である（Eberlein et al., Peptides 10: 797-803 (1989); Grandt et al., Regul. Pept. 51: 151-9 (1994)）。このフラグメントは、ヒトおよびイヌの腸抽出物においてPYY様免疫反応性の約40%を構成し、ならびに絶食状態での全血漿PYY免疫反応性の約36%から食事後には50%をわずかに超えて構成する。それは、見たところ、PYYのジペプチジルペプチダーゼ-IV（DPP4）切断産物である。報告によると、PYY(3-36)（配列番号：58）は、Y2およびY5受容体での選択的リガンドであり、該受容体は、N末端がトランケートされたNPY類似体（すなわち、NPYのC末端フラグメント）を好む点で薬理学的にユニークと思われる。報告によると、PYYの末梢投与は、胃酸分泌、胃の運動性、外分泌性膵液分泌を減少させ（Yoshinaga et al., Am. J. Physiol. 263: G695-701 (1992); Guan et al., Endocrinology 128: 911-6 (1991); Pappas et al., Gastroenterology 91: 1386-9 (1986)）、胆嚢収縮および腸の運動性を減少させる (Savage et al., Gut 28: 166-70 (1987)）。菱脳／脳幹内または周囲への直接注射後に見られるような、胃内容排出、胃の運動性および胃酸分泌に対するPYYの中枢注射の効果（Chen and Rogers, Am. J. Physiol. 269: R787-92 (1995); Chen et al., Regul. Pept. 61: 95-98 (1996); Yang and Tache, Am. J. Physiol. 268: G943-8 (1995); Chen et al., Neurogastroenterol. Motil. 9: 109-16 (1997)）は、末梢注射後に観察される効果とは異なることがある。例えば、中枢投与されたPYYは、胃酸分泌を刺激し、抑制しない点で、末梢注射されたPYY(3-36)（配列番号：58）について本明細書で説明するものと相反する幾つかの効果を有した。胃の運動性は、TRH刺激と共同でしか抑制されず、単独で投与しても抑制されず、実際には、より高い用量でPP受容体との推定的相互作用により刺激性であった。PYYは、中枢投与後に食物および水の摂取を刺激することが証明された（Morley et al., Brain Res. 341: 200-3 (1985); Corp et al., Am. J. Physiol. 259: R317-23 (1990)）。

代謝性疾患および代謝障害は、肥満、糖尿病、脂質異常症、インスリン抵抗性、細胞アポトーシスなどをはじめとする多くの形を呈する。肥満およびその関連疾患は、米国内および世界中で、一般的、且つ、非常に深刻な公衆衛生問題である。上半身肥満は、2型糖尿病について知られている最も強いリスク因子であり、且つ、心血管疾患についての強いリスク因子である。肥満は、高血圧、アテローム硬化症、うっ血性心不全、卒中、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸症、生殖器疾患、例えば多嚢胞性卵巣症候群、乳癌、前立腺癌、大腸癌、および全身麻酔の併発症の発生率増加についての認知されているリスク因子である（例えば、Kopelman, Nature 404: 635-43 (2000)参照）。これは、寿命を縮め、上の併発症、さらには感染、静脈瘤、黒色表皮腫、湿疹、運動不耐性、インスリン抵抗性、高血圧、高コレステロール血症、胆石症、整形外科的傷害、および血栓塞栓性疾患などの疾患の深刻なリスクを有する（Rissanen et al., Br. Med. J. 301: 835-7 (1990)）。肥満は、インスリン抵抗性症候群、または「X症候群」と呼ばれる状態の群についてのリスク因子でもある。肥満および関連疾患の医療費についての最近の推定値は、世界中で$1,500,000,000である。肥満の病因は、多くの要素があると考えられているが、基本的な問題は、肥満患者における栄養利用率およびエネルギー消費が、脂肪組織が過剰になるまで、平衡にならないことである。肥満は、最近では、十分に治療できない、慢性の、本質的に難治性の代謝性疾患である。肥満の人々の体重減少に有用な治療薬は、彼らの健康に重大で有益な効果を有するはずである。

糖尿病は、インスリンの不十分な生産または利用に起因する高血糖および糖尿を特徴とする炭水化物代謝の疾患である。糖尿病は、先進国の人口の大部分についての生活の質に深刻な影響を及ぼす。インスリンの不十分な生産は、1型糖尿病として特徴付けられ、インスリンの不十分な利用が、2型糖尿病である。しかし、患者が顕性糖尿病を有すると診断されるかなり前に発症される多くの明瞭な糖尿病関連疾患があることは、今では広く認知されている。また、糖尿病における最適に満たないグルコース代謝制御による影響が、広範な関連脂質および心血管疾患を生じさせる。

脂質異常症、すなわち血漿中の異常なリポタンパク質レベルは、糖尿病患者の中では頻繁に起こることである。脂質異常症は、一般に、高血漿トリグリセリド、低HDL（高密度リポタンパク）コレステロース、正常から高レベルのLDL（低密度リポタンパク）コレステロール、および血液中の低比重、LDL（低密度リポタンパク）粒子レベル増加を特徴とする。脂質異常症は、糖尿病被験者の間の冠動脈事象および死の発生率増加の主な誘因の一つである。疫学的研究は、非糖尿病被験者と比較したときの糖尿病被験者の間での冠動脈死の数倍の増加を証明することにより、これを確認した。糖尿病被験者の間での幾つかのリポタンパク異常が記載されている。

インスリン抵抗性は、広い範囲の濃度にわたってその生物学的作用を発揮するインスリンの能力低下である。インスリン抵抗性では、身体が、この不足およびグルコース抵抗性発現減損状態を補うために異常に多い量のインスリンを分泌する。インスリン作用不足を補うことに失敗すると、血漿グルコース濃度が必然的に上昇し、その結果、糖尿病の臨床状態となる。インスリン抵抗性および相対的高インスリン血症は、肥満、高血圧、アテローム硬化症および2型糖尿病において誘因的役割を有する。肥満、高血圧およびアンギナとインスリン抵抗性との連合は、共通の病原関連因子としてインスリン耐性を有する症候群、X症候群として説明されている。

アポトーシスは、正常な発育中に発生する外因性および内因性シグナルによって調節される細胞自己破壊の能動的プロセスである。アポトーシスが膵臓内分泌ベータ細胞の調節において重要な役割を果すことが、十分に文献に記載されている。成体哺乳動物では、妊娠および肥満などの特定の状態の際に正常血糖を維持するためにインスリンを生産するようにベータ細胞量を動的に変化させるという証拠も増えつつある。ベータ細胞量の制御は、細胞増殖、成長および細胞自己死（アポトーシス）の間の微妙なバランスに依存する。このバランスの乱れは、グルコース恒常性の欠陥を招くことがある。例えば、ベータ細胞複製率が減少される加齢に伴ってグルコース抵抗性が発現すること、およびヒト検死研究が、非糖尿病被験者と比較してインスリン非依存性糖尿病を有する患者においてベータ細胞量の40-60%減少を繰り返し示したことは、注目に値する。インスリン抵抗性は肥満の不変的付随要素であるが、ベータ細胞がインスリンに対する要求増加を満たすことができなくなる2型糖尿病が開始する時点までは、正常血糖が代償的高インスリン血症によって維持されることは、一般に認められている。

糖尿病に随伴する多数の異常を治療しようと試みたことが、種々の患者におけるこれらの異常に対処するために幾つかの抗糖尿病薬を投与するきっかけであった。抗糖尿病薬の例は、タンパク質、例えばインスリンおよびインスリン類似体、ならびに小分子、例えばインスリン増感剤、インスリン分泌促進物質および食欲調節化合物である。

上で説明した代謝性疾患、状態および代謝異常において有用なポリペプチドの開発は、依然として必要とされている。従って、本発明の目的は、ハイブリッドポリペプチドならびにそれらの生産および使用方法を提供することである。本発明の化合物は、上で説明したおよび本明細書中で説明する代謝性疾患、メタボリック状態および代謝異常において使用することができる。

本明細書中で言及するすべての文献は、本明細書中に完全に記載されているかのように参照により本出願に取り入れられている。

発明の概要
一般に、本発明は、血漿グルコースレベル、インスリンレベルおよび／またはインスリン分泌の制御により緩和することができる代謝性疾患および代謝異常、例えば糖尿病および糖尿病に関連した状態の治療および予防のための薬剤として有用な、新規、選択可能ハイブリッドポリペプチドに関する。こうした状態および異常としては、高血圧、脂質異常症、心血管疾患、摂食障害、インスリン抵抗性、肥満、ならびに1型、2型および妊娠性糖尿病をはじめとするあらゆる種類の糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一つの態様において、少なくとも一つのホルモン活性を示すハイブリッドポリペプチドを提供する。本発明のハイブリッドポリペプチドは、互いに共有結合で連結された少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含み、生物活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも一つは、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す。生物活性ペプチドホルモンモジュールは、成分ペプチドホルモン、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す成分ペプチドホルモンのフラグメント、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す成分ペプチドホルモンの類似体および誘導体、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す成分ペプチドホルモンの類似体および誘導体のフラグメント、ならびにペプチドエンハンサーから独立して選択される。

一つの実施形態において、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも一つのホルモン活性を示しており、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも一つの追加の生物活性ペプチドホルモンモジュールに共有結合で連結された第一生物活性ペプチドホルモンモジュールを含有し、これらの生物活性ペプチドホルモンモジュールは、成分ペプチドホルモン；成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す成分ペプチドホルモンのフラグメント；成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す成分ペプチドホルモンの類似体および誘導体；成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す成分ペプチドホルモンの類似体および誘導体のフラグメント；ならびにペプチドエンハンサーから成る群より独立して選択される。これらの成分ペプチドホルモンは、典型的には、アミリン、アドレノメジュリン(ADM)、カルシトニン(CT)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、インテルメジン、コレシストキニン(「CCK」)、レプチン、ペプチドYY(PYY)、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、グルカゴン様ペプチド2(GPL-2)、オキシントモジュリン(OXM)、ナトリウム利尿ペプチドおよびエキセンジン-4から成る群の少なくとも二つから独立して選択される。典型的には、ペプチドエンハンサーは、ハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合または他の薬物動態特性を付与する成分ペプチドホルモンの構造モチーフ、およびハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合または他の薬物動態特性を付与する成分ペプチドホルモンの類似体または誘導体の構造モチーフから成る群より独立して選択される。尚、さらなる実施形態において、生物活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも一つは、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す。尚、さらなる代替実施形態において、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す少なくとも一つの生物活性ペプチドホルモンモジュールが、アミリン、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリンのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリンの類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリンの類似体もしくは誘導体のフラグメントであり、ならびに少なくとも一つの他の生物活性ペプチドホルモンモジュールが、CCK、少なくとも一つのホルモン活性を示すCCKのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すCCKの類似体もしくは誘導体、少なくとも一つのホルモン活性を示すCCKの類似体もしくは誘導体のフラグメント、CT、少なくとも一つのホルモン活性を示すCTのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すCTの類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すCTの類似体もしくは誘導体のフラグメントであるときには、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも三つの異なる成分ペプチドホルモンから選択される少なくとも三つの生物活性ペプチドホルモンモジュールをさらに含有し得る。尚、さらなる代替実施形態において、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す少なくとも一つの生物活性ペプチドホルモンモジュールが、GLP-1、少なくとも一つのホルモン活性を示すGLP-1のフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すGLP-1の類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すGLP-1の類似体もしくは誘導体のフラグメントであり、ならびに少なくとも一つの他の生物活性ペプチドホルモンモジュールが、エキセンジンフラグメントを含むペプチドエンハンサーであるときには、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも三つの生物活性ペプチドホルモンモジュールをさらに含有し得る。

本発明の成分ペプチドホルモンとしては、アミリン、アドレノメジュリン(ADM)、カルシトニン(CT)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、インテルメジン、コレシストキニン(「CCK」)、レプチン、ペプチドYY(PYY)、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、グルカゴン様ペプチド2(GPL-2)、オキシントモジュリン(OXM)、ナトリウム利尿ペプチドおよびエキセンジン-4が挙げられる。

本発明のペプチドエンハンサーとしては、ハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合または他の薬物動態特性を付与する成分ペプチドホルモンの構造モチーフ、およびハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合または他の薬物動態特性を付与する成分ペプチドホルモンの類似体または誘導体の構造モチーフが挙げられる。

本発明の別の態様において、肥満を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、本発明のハイブリッドポリペプチドの治療または予防有効量をその必要がある被験者に投与することを含む。好ましい実施形態において、被験者は、肥満または過体重被験者である。「肥満」は、一般に、30を越えるボディーマス指数と定義されるが、本開示の目的のために、体重減少を必要とするまたは望む、30未満のボディーマス指数を有する者を含む任意の被験者を本「肥満」範囲に含める。インスリン抵抗性である、グルコース不耐性である、または任意の形の糖尿病（例えば、1型、2型もしくは妊娠性糖尿病）を有する被験者は、この方法から恩恵を受けることができる。

本発明のさらに別の態様において、食事摂取量を減少させる方法、栄養利用率を低下させる方法、体重減少を生じさせる方法、糖尿病または糖尿病に関連した状態を治療する方法、および脂質プロフィールを改善する方法（LDLコレステロールおよびトリグリセリドレベルを低下させる方法、ならびに／またはHDLコレステロールレベルを変化させる方法を含む）を提供し、これらの方法は、本発明のハイブリッドポリペプチドの有効量を被験者に投与することを含む。好ましい実施形態において、本発明の方法は、被験者における栄養利用率を低下させることにより緩和することができる状態または異常を治療または予防するために用いられ、これらの方法は、本発明のハイブリッドポリペプチドの治療または予防有効量を前記被験者に投与することを含む。別の実施形態において、本発明の方法は、血漿グルコースレベル、インスリンレベルおよび／またはインスリン分泌を制御することにより緩和することができる状態または異常を治療または予防するために用いられる。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、糖尿病および／または糖尿病に関連した状態を治療するために用いられる。こうした状態および異常としては、高血圧、脂質異常症、心血管疾患、摂食障害、インスリン抵抗性、肥満、ならびにI型、II型および妊娠性糖尿病を含むあらゆる種類の糖尿病、糖尿病合併症（神経障害（例えば、エキセンジン-4の神経向性作用に基づくもの）、神経障害性疼痛（例えば、アミリン作用に基づくもの）、網膜症、腎症、膵臓ベータ細胞量不足状態（例えば、エキセンジン-4およびGLP-1の島新生作用に基づくもの））が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、本発明の少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドまたはその医薬的に許容される塩の治療もしくは予防有効量を、ハイブリッドポリペプチドの送達に有用な、医薬的に許容される希釈剤、保存薬、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と共に含む医薬組成物にも関する。

本発明のこれらおよび他の態様は、後続の好ましい実施形態および詳細な説明を参照して、さらに明瞭に理解されるだろう。

一般に、本発明は、血漿グルコースレベル、インスリンレベルおよび／またはインスリン分泌の制御により緩和することができる代謝性疾患および代謝異常、例えば糖尿病および糖尿病に関連した状態の治療および予防用の薬剤として有用な、新規、選択可能ハイブリッドポリペプチドに関する。そうした状態および障害としては、高血圧、脂質異常症、心血管疾患、摂食障害、インスリン抵抗性、肥満、ならびに1型、2型および妊娠性糖尿病をはじめとするあらゆる種類の糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。

一つの態様において、本発明は、「生物活性」、例えば、治療有効度、機能の範囲、作用持続、生理化学的特性、および／または他の薬物動態特性に基づいて選択することができる、生理的、代謝的および／または薬物動態的に活性なペプチドモジュールのモジュール組立体を含む。

理論によって限定されるつもりはないが、本発明は、生物活性ペプチドホルモンモジュールが二次、三次またはより高次の組み合わせで連結されて、選択可能な特性を有する新規の、効能のある治療薬を作る、「ツールボックス」アプローチに、少なくとも部分的に関する。「生物活性ペプチドホルモンモジュール」は、ペプチドホルモン、ホルモン活性を有するペプチドフラグメント、または化学的安定性、代謝安定性および／もしくは他の薬物動態の安定性を付与するペプチドホルモンの構造モチーフであり得る。ペプチドホルモンは、当該技術分野において公知であるおよび本明細書において説明するような、天然ペプチドホルモンならびにペプチドホルモン類似体および誘導体を包含し得る。

本発明の一つの態様において、二つ以上のペプチドホルモンの一定の生理化学的特性を組み合わせて単一のモダリティーにすることにより、機能不全代謝回路における幾つかの点での介入を助長できることが判明した。従って、本発明の一つの態様において、選択可能な生物活性を単一のポリペプチド剤に統合する合理的設計のハイブリッドポリペプチドを提供する。一つの実施形態において、本発明の選択可能ハイブリッドポリペプチドは、生物活性モジュールを共有結合で取り付けるために化学的に安定なリンカーの使用を含むことができる。別の実施形態において、本発明の選択可能ハイブリッドポリペプチドは、それら自体が生物活性モジュールの一部である場合もあり、または生物活性モジュールの一部を形成する場合もある、切断可能なリンカーの使用を含むことができる。

重ねて、理論によって限定されるつもりはないが、本発明のハイブリッドポリペプチドの設計は、一般に、(1)所望の効能および治療的使用のための生物活性ペプチドホルモンモジュールの特定、選択およびペアリング、ならびに(2)生物活性モジュール（例えば、天然ペプチドホルモン、ホルモン活性を有するペプチドホルモン類似体または誘導体、ホルモン活性を有するペプチドホルモンフラグメント、安定化モチーフなど）の、成分モジュールの生物活性の喪失を伴わない、直接的またはリンカーによる共有結合性連結を含むことができる。一定の実施形態において、モジュール選択基準としては、(a)所望の治療的もしくは予防的適用に望ましいインビボ効能、例えば、相加もしくは相乗効果；(b)多数の治療的もしくは予防的適用のための連結モジュールの最適な相乗作用もしくは二重作用；ならびに／または(c)所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合および／もしくは他の薬物動態特性が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書では、単に構成を目的としてセクション標題を用いており、如何なる点においても、それらを、記載する主題を限定するものと見なすべきではない。
本発明のハイブリッドポリペプチド

上で述べたように、本発明は、本明細書において説明する成分ペプチドホルモンから選択できる少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むハイブリッドポリペプチドに部分的に関する。本発明のハイブリッドポリペプチドは、一般に、メタボリック状態および代謝異常の治療および予防において有用であろう。本発明のハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示すであろうし、好ましくは、第二の成分ペプチドホルモンの少なくとも一つの追加の生物活性を含むことができる。

一つの実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むことができ、少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールの各々が、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す。別の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むことができ、生物活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも一つは、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示し、前記生物活性ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも一つは、ハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合、および／または他の薬物動態特性を付与する。

好ましい実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドホルモンと比較したとき、メタボリック状態および代謝異常の治療および／または予防において匹敵するまたはそれらより高い効力を有する。別の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドホルモンと比較したとき、糖尿病および／または糖尿病関連疾患の治療および／または予防において匹敵するまたはそれらより高い効力を有する。あるいは、本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドホルモンと比較して、改善された製造容易性、安定性、および／または調合容易性を示すことができる。

さらに詳細には、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも一つの追加の生物活性ペプチドホルモンモジュールに共有結合で連結された第一生物活性ペプチドホルモンモジュールを一般に含むであろう。生物活性ペプチドホルモンモジュールは、本明細書中でさらに詳細に説明するような、直接アミド結合または化学的リンカー基を含む（しかし、これらに限定されない）当該技術分野において公知の任の様式で、互いに共有結合で連結させることができる。一つの実施形態において、化学的リンカー基としては、ポリペプチドの配座を誘導または安定化するペプチド模倣体を挙げることができる。

第一生物活性ペプチドホルモンモジュールは、第一成分ペプチドホルモンから選択することができ、ペプチドホルモン（天然ペプチドホルモンならびにそれらの類似体および誘導体を含む）である場合もあり、ホルモン活性を有するペプチドフラグメント（天然ペプチドホルモンならびにそれらの類似体および誘導体のフラグメントを含む）である場合もあり、またはそのハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合または他の薬物動態特性を付与するペプチドホルモン（天然ペプチドホルモンならびにそれらの類似体および誘導体を含む）の構造モチーフである場合もある。同様に、追加の生物活性ペプチドモジュール（単数または複数）は、成分ペプチドホルモンから選択することができ、ペプチドホルモン（天然ペプチドホルモンならびにそれらの類似体および誘導体を含む）である場合もあり、ホルモン活性を有するペプチドフラグメント（天然ペプチドホルモンならびにそれらの類似体および誘導体のフラグメントを含む）である場合もあり、またはそのハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合または他の薬物動態特性を付与するペプチドホルモン（天然ペプチドホルモンならびにそれらの類似体および誘導体を含む）の構造モチーフである場合もある。第一ペプチドホルモンおよび追加のペプチドホルモンは、生物活性ペプチドホルモンモジュールの所望の特性に依存して、同じペプチドホルモンである場合もあり、ペプチドホルモンの同じファミリーからのものである場合もあり、または異なるペプチドホルモンである場合もある。

本明細書で用いる場合、用語「生物活性」は、(1)少なくとも一つのインビボホルモン経路における生物学的活性、または(2)そうした生物学的活性の治療有効度、機能範囲、作用持続、生理化学的特性および／もしくは他の薬物動態特性の修飾を指す。生物学的活性は、当該技術分野において公知であるおよび本明細書において説明するような、ターゲットホルモン受容体結合アッセイにより、または生理学的指標をモニタリングする代謝試験により評価することができる。こうした生物学的活性の治療有効度、機能範囲、作用持続、生理化学的特性および／または他の薬物動態特性の修飾は、例えば、化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合および／または薬物動態特性の変更により修飾することができる。

一つの実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドホルモンの生物学的活性の少なくとも約25%、好ましくは、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%パーセントを保持する。好ましいハイブリッドポリペプチドは、当該技術分野において公知であるまたは本明細書において説明する代謝関連アッセイのうちの一つにおいて、同じアッセイにおける成分ペプチドホルモンの効力に等しいまたはそれよい大きい効力（例えば、受容体結合、食事摂取、胃内容排出、膵液分泌、インスリン分泌、血糖低下、体重減少など）を有するものである。あるいは、本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドは、成分ペプチドホルモンと比較して、改善された製造容易性、安定性、および／または調合容易性を示すことができる。

別の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、栄養利用率の低下、食事摂取量の減少、体重増加の作用、ならびに／またはメタボリック状態および代謝異常の治療および予防に関して、天然成分ペプチドホルモンの生物学的活性の少なくとも約25%、好ましくは、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%パーセントを保持する。さらに別の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、、栄養利用率の低下、食事摂取量の減少、体重増加の作用、ならびに／またはメタボリック状態および代謝異常の治療および予防に関して、天然ペプチドホルモンの生物学的活性の少なくとも約110%、125%、130%、140%、150%、200%またはそれ以上を示す。別の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、改善された成分ペプチドホルモン受容体作動薬活性を示す。
成分ペプチドホルモン、類似体および誘導体

一般に、成分ペプチドホルモンとしては、(a)アミリン、アドレノメジュリン（「ADM」）、カルシトニン（「CT」）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（「CGRP」）、インテルメジン（「AFP-6」としても知られている）および関連ペプチドを含む、アミリンファミリー；(b)コレシストキニン（「CCK」）；(c)レプチンおよびレプチン様ペプチドを含む、レプチンファミリー；(d)膵臓ポリペプチド（「PP」）およびペプチドYY（「PYY」）を含む、膵臓ポリペプチドファミリー；(e)プログルカゴン遺伝子に由来するペプチドホルモン、例えば、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1（「GLP-1」）、グルカゴン様ペプチド2（「GPL-2」）およびオキシントモジュリン（「OXM」）、ならびにエキセンジン、例えば、エキセンジン-3およびエキセンジン-4を含む、インクレチンおよびインクレチン模倣体；(f) ANP、BNP、CNPおよびウロジラチンを含むナトリウム利尿ペプチド、それらの前駆体形およびそれらに由来するペプチド、(g)ウロコルチンファミリーおよび(h)ニューロメジンファミリー、ならびにそれらの類似体、誘導体およびフラグメントをはじめとする、代謝性疾患および代謝異常の治療または予防に有用なペプチドホルモンが挙げられる。本明細書において論じる本発明の成分ペプチドホルモンは、これらの天然ペプチドホルモンのホルモン活性を保持する類似体および誘導体も包含する。一つの実施形態において、こうした類似体および誘導体は、ターゲットホルモン受容体の作動薬である。

「アミリン」は、1993年8月10日に発行された「血糖上昇ホルモン」についての米国特許第5,234,906号（この内容は、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているような、アミリンと呼ばれており、膵臓のベータ細胞から分泌されるヒトペプチドホルモンおよびその種異形を意味する。さらに詳細には、アミリンは、栄養摂取に反応して膵臓ベータ細胞によって通常はインスリンと共分泌される37-アミノ酸ポリペプチドホルモンである（例えば、Koda et al., Lancet 339:1179-1180, 1992参照）。この意味で、「アミリン」、「野生型アミリン」、および「天然アミリン」すなわち非修飾アミリンは、同義で用いる。

「アドレノメジュリン」または「ADM」は、ヒトペプチドホルモンおよびその種変異体を意味する。さらに詳細には、ADMは、連続的酵素切断およびアミド化により185アミノ酸プレプロホルモンから生成される。このプロセスは、52アミノ酸生物活性ペプチドの遊離で最高点に達する。

「カルシトニン」または「CT」は、ヒトペプチドホルモン、およびサケカルシトニン（「sCT」）をはじめとするその種変異体を意味する。さらに詳細には、CTは、より大きなプロホルモンから切断された32アミノ酸ペプチドである。これは、単一のジスルフィド結合を含有し、この結合に起因してそのアミノ末端は環の形をとる。カルシトニンプレ-mRNAの可変スプライシングは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドをコードするmRNAを生じさせることができ、このペプチドは、神経および血管系において機能するようである。カルシトニン受容体は、クローニングされ、七回膜貫通型Gタンパク結合受容体ファミリーのメンバーであることが示されている。

「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」または「CGRP」は、任意の生理形態でのヒトペプチドホルモンおよびその種変異体を意味する。

「インテルメジン」または「AFP-6」は、任意の生理形態でのヒトペプチドホルモンおよびその種変異体を意味する。

「コレシストキニン」または「CCK」は、ヒトペプチドホルモンおよびその種変異体を意味する。さらに詳細には、CCKは、ヒトにおいて最初に特定された33-アミノ酸配列であり、報告によるとブタ、ラット、ニワトリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて証明されている、8-アミノ酸インビボC末端フラグメント（「CCK-8」）を含む。従って、用語CCK-33は、一般に、ヒトCCK(1-33)を指し、一方、CCK-8（CCK(26-33)；配列番号：55）は、特に別に示さなければ、遺伝的に硫酸化形および非硫酸化形の両方のC末端オクタペプチドを指す。さらに、ペンタガストリンまたはCCK-5は、C末端ペプチドCCK(29-33)（配列番号：209）を指し、CCK-4は、C末端テトラペプチドCCK(30-33)（配列番号：208）を指す。しかし、本明細書で用いる場合、一般に、CCKは、特に別に示さなければ、硫酸化形および非硫酸化形の、CCK-33、CCK-8、CCK-5およびCCK-4を含む、ホルモンのすべての自然発生異形を指す。

「レプチン」は、任意の種からの自然発生レプチンおよび生物学的に活性なD-アイソフォーム、または自然発生レプチンのフラグメントおよびそれらの変異体、ならびに前述のものの組み合わせを意味する。レプチンは、国際特許公開番号WO 96/05309（これは、その全体が参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているようなob遺伝子のペプチド産物である。レプチンの推定類似体およびフラグメントは、米国特許第5,521,283号、米国特許第5,532,336号、PCT/US96/22308およびPCT/US96/01471（これらは、各々、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている）に報告されている。

「PP」は、任意の生理形態でのヒト膵臓ペプチドポリペプチドまたはその種変異体を意味する。従って、用語「PP」は、（配列番号：290）で示されるような完全長、36アミノ酸ペプチド、ならびに、例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌPPを含む、PPの種異形の両方を包含する。この意味で、「PP」、「野生型PP」および「天然PP」、すなわち非修飾PPは、同義で用いる。

「PYY」は、任意の生理形態でのヒトYYポリペプチドまたはその種変異体を意味する。従って、用語「PYY」は、ヒト完全長、36アミノ酸ペプチド、ならびに、例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌPYYを含む、PYYの種異形の両方を包含する。この意味で、「PYY」、「野生型PYY」および「天然PYY」、すなわち非修飾PYYは、同義で用いる。本発明に関連して、本発明のPYY類似体ポリペプチドに関して論じるすべての修飾は、天然ヒトPYYの36アミノ酸配列に基づく。

「GLP-1」は、任意の生理形態でのヒトグルカゴン様ペプチド-1またはその種変異体を意味する。用語「GLP-1」は、ヒトGLP-1(1-37)（配列番号：59）、その完全長ヒトGLP-1(1-37)（配列番号：59）に関連して、GLP-1(7-37)（配列番号：204）およびGLP-1(7-36)アミド（配列番号：61）、ならびに例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌPPを含む、GLP-1の種異形を包含する。この意味で、「GLP-1」、「野生型GLP-1」および「天然GLP-1」、すなわち非修飾GLP-1は、同義で用いる。

「GLP-2」は、任意の生理形態でのヒトグルカゴン様ペプチド-2またはその種変異体を意味する。さらに詳細には、GLP-2は、小腸および大腸における腸内分泌細胞からGLP-1と共に共分泌される33アミノ酸ペプチドである。

「OXM」は、任意の生理形態でのヒトオキシントモジュリンまたはその種変異体を意味する。さらに詳細には、OXMは、グルカゴンの29アミノ酸配列、続いて8アミノ酸カルボキシ末端延長部を含有する37アミノ酸ペプチドである。

「エキセンジン」は、アメリカドクトカゲ（Gila-monster）、アリゾナに内在するトカゲ、およびメキシコドクトカゲ（Mexican Beaded Lizard）の唾液中で見出せるペプチドホルモンを意味する。さらに詳細には、エキセンジン-3は、メキシコドクトカゲ（学名：Heloderma horridum）の唾液中に存在し、エキセンジン-4は、アメリカドクトカゲ（学名：Heloderma suspectum）の唾液中に存在する（Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265:20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05 (1992)）。エキセンジンは、グルカゴン様ペプチドファミリーの幾つかのメンバーとの多少の配列類似性を有し、最高の同一性53%、は、GLP-1とのものである（Goke, et al., J. Biol. Chem., 268:19650-55 (1993)）。この意味で、「エキセンジン」、「野生型エキセンジン」および「天然エキセンジン」、すなわち非修飾エキセンジンは、同義で用いる。

「ウロコルチン」は、任意の生理形態でのヒトウロコルチンペプチドホルモンまたはその種変異体を意味する。さらに詳細には、三つのヒトウロコルチン：Ucn-1、Ucn-2およびUcn-3が存在する。例えば、ヒトウロコルチン1は、式：Asp-Asn-Pro-Ser-Leu-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Thr-Leu-Leu-Glu-Leu-Ala-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Arg-Glu-Arg-Ala-Glu-Gln-Asn-Arg-Ile-Ile-Phe-Asp-Ser-Val-NH2（配列番号：294）を有する。ラット由来のウロコルチンは、二つの置換：Asn2がAsp2でおよびAer4がPro4で置換されていること；を別にすれば、同一である。ヒトUcn-2は、配列Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu Glu Gln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala Arg Ile Leu Ala Arg Val Gly His Cys（配列番号：399）を有する。ヒトUcn-3は、配列Phe Thr Leu Ser Leu Asp Val Pro Thr Asn Ile Met Asn Leu Leu Phe Asn Ile Ala Lys Ala Lys Asn Leu Arg Ala Gln Ala Ala Ala Asn Ala His Leu Met Ala Gln Ile（配列番号：299）を有する。Ucn-3は、好ましくは、アミド形である。さらなるウロコルチンおよび類似体は、文献、例えば米国特許第6214797号に記載されている。食事摂取抑制および抗高血圧／心臓保護／筋変力特性を保持するウロコルチンUcn-2およびUcn-3は、特に、本発明のハイブリッドにおいて使用することができる。摂食／絶食などのストレスの多い刺激後の慢性HPA活性化を抑制するそれらの能力にちなんで名づけられたストレスコピン（Ucn-3）およびストレスコピン関連ペプチド（Ucn 2）は、CRF 2型受容体に特異的であり、ACTH放出を媒介するCRF-R1を活性化しない。ウロコルチン、例えばUcn-2またはUcn-3を含むハイブリッドは、血管拡張に、従って本明細書に記載するような心血管用途、例えばCHFに特に有用である。本発明のウロコルチン含有ハイブリッドは、特に、ACTH放出の刺激に関連した状態、血管拡張効果のために高血圧、ACTH上昇以外により媒介される炎症、高体温、食欲異常、うっ血性心不全、ストレス、不安および乾癬の治療または予防に使用することができる。こうした化合物は、抗増殖効果のために、例えば、癌または腫瘍増殖を治療または予防するためにも有用である。強化された心血管的恩恵をもたらすために、例えば有益な血管拡張効果をもたらすことなどによりCHFを治療するために、ナトリウム利尿ペプチドモジュール、アミリンファミリー、エキセンジンファミリーまたはGLP1ファミリーモジュールと組み合わせたウロコルチンペプチドホルモンモジュールが特に興味深い。

「ニューロメジン」は、ニューロメジンUおよびSペプチド、さらに詳細にはそれらの活性ホルモン配列を含むニューロメジンファミリーのペプチドを意味する。例えば、天然活性ヒトニューロメジンUペプチドホルモンは、ニューロメジン-U25：Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn（配列番号：308）、特にそのアミド形である。ブタU25は、配列：FKVDEEFQGPIVSQNRRYFLFRPRN（配列番号：314）、特にそのアミド形を有する。他のニューロメジンUファミリーメンバーとしては、それらのSWISS-PROT記号および登録番号として次に列挙するものが挙げられる：NEUU_CANFA (P34962)、NEUU_CAVPO (P34966)、NEUU_CHICK (P34963)、NEUU_HUMAN (P48645)、NEUU_LITCE (P81872)、NEUU_MOUSE (Q9QXK8)、NEUU_PIG (P34964)、NEUU_RABIT (P34965)、NEUU_RANTE (P20056)、およびNEUU_RAT (P12760)。これらのプロセッシングされたペプチドホルモンならびにそれらの類似体、誘導体およびフラグメントは、特に興味深い。様々なトランケート型またはスプライス変異体、例えば、FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN（配列番号：300）が、ニューロメジンUファミリーに含まれる。ニューロメジンSファミリーの例は、配列ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN（配列番号：315）を有するヒトニューロメジンS、特に、そのアミド形である。ニューロメジンモジュールを有する本発明のハイブリッドは、食欲不振誘発効果、従って、肥満、糖尿病の治療、食事摂取量減少ならびに本明細書において説明するような他の関連した状態および障害の際に有益な価値を有するであろう。アミリンファミリーペプチド、エキセンジンペプチドファミリーまたはGLP1ペプチドファミリーモジュールと組み合わせたニューロメジンモジュールは、特に興味深い。

本明細書で用いる場合、「類似体」は、その配列が、基本参照ペプチド（例えば、PP、PYY、アミリン、GLP-1、エキセンジンなど）の配列から誘導された、その参照アミノ酸配列の挿入、置換、延長および／または欠失を含むペプチド、好ましくは、その基本ペプチドとの少なくとも50または55%のアミノ酸配列同一性を有する、さらに好ましくは、その基本ペプチドとの少なくとも70%、80%、90%または95%のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを指す。一つの実施形態において、こうした類似体は、保存的または非保存的アミノ酸置換（非天然アミノ酸ならびにLおよびD形を含む）を含むことができる。

「誘導体」は、天然参照ペプチドまたは類似体のアミノ酸配列を有するが、加えて、そのアミノ酸側基、α-炭素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基のうちの一つ以上の化学的修飾を有する分子と定義する。化学的修飾としては、化学的部分の付加、新たな結合の生成、および化学的部分の除去が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸側基での修飾としては、リシンε-アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリシンのN-アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。末端アミノの修飾としては、脱アミノ、N-低級アルキル、N-ジ-低級アルキル、拘束アルキル（例えば、分枝アルキル、環状アルキル、融合アルキル、アダマンチルアルキル）およびN-アシル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾としては、アミド、低級アルキルアミド、拘束アルキル（例えば、分枝、環状、融合、アダマンチル）アルキル、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。低級アルキルは、C1-C4アルキルである。さらに、一つ以上の側基または末端基を、通常技能のペプチド化学者には既知の保護基によって保護することができる。アミノ酸のα-炭素を一または二メチル化してよい。

「作動薬」は、天然ヒト参照ペプチドの生物学的活性を惹起する化合物、好ましくは、受容体結合／競合試験などの当該技術分野では公知の手段によって評価したとき、その参照ペプチドより良好な効力、またはその参照ペプチドと比較して五桁（プラスもしくはマイナス）以内、さらに好ましくは、4、3、2または1桁の効力を有する化合物を意味する。一つの実施形態において、これらの用語は、天然ヒト参照ペプチドのものに類似した生物学的効果を惹起する化合物、例えば、(1)食事摂取、胃内容排出、膵液分泌または体重減少アッセイにおいて、天然ヒト参照ペプチドに類似した活性を有する、または(2)参照受容体アッセイにおいて、もしくは標識された参照ペプチドとの競合的結合アッセイにおいて、特異的に結合する化合物を指す。好ましくは、作動薬は、そうしたアッセイにおいて、1 μMより大きい親和性で、さらに好ましくは、1-5 nMより大きい親和性で結合するであろう。別の実施形態において、これらの用語は、糖尿病または糖尿病に関連した状態もしくは疾患の治療において生物学的効果惹起する化合物を指す。こうした作動薬は、参照ペプチドまたは小さな化学的分子の活性フラグメントを含むポリペプチドを含むことができる。

「アミノ酸」および「アミノ酸残基」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、および修飾アミノ酸を意味する。相反する明記がない限り、アミノ酸へのあらゆる言及は、D立体異性体およびL立体異性体の両方への言及を、それらの構造がそうした立体異性体形を許すならば、一般にまたは具体的に名指しして含む。天然アミノ酸としては、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リシン（Lys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）およびバリン（Val）が挙げられる。非天然アミノ酸としては、ホモ−リシン、ホモ−アルギニン、アゼチジンカルボン酸、2−アミノアジピン酸、3−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、2−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、2−アミノヘプタン酸、2−アミノイソ酪酸、3−アミノイソ酪酸、2−アミノピメリン酸、ｔ−ブチルグリシン、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアルパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシシリン、アロ−ヒドロキシリシン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、N-メチルアラニン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルペンチルグリシン、N-メチルバリン、ナフタラミン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。追加の非天然アミノ酸としては、例えば、N-メチル化DおよびLアミノ酸または残基（その側鎖官能基が別の官能基へと化学的に修飾されているもの）のような、N末端アミノ基またはそれらの側鎖基が化学的にブロックされている、可逆的に、不可逆的にもしくは化学的に修飾されている修飾アミノ酸残基が挙げられる。例えば、修飾アミノ酸としては、メチオニンスルホキシド；メチオニンスルホン；アルパラギン酸−（ベータ−メチルエステル）、アスパラギン酸の修飾アミノ酸；N-エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸；またはアラニンカルボキサミド、アラニンの修飾アミノ酸が挙げられる。組み込むことができるさらなる残基は、Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998に記載されている。

本明細書で用いる場合、「5 Apa」は、5 アミノ−ペンタノイルを意味し、「12 Ado」は、12-アミノドデカノイルを意味し、「PEG(8)」は、3,6,-ジオキシオクタノイルを意味し、および「PEG(13)」は、1-アミノ-4,7,10-トリオキサ-13-トリデカンアミンスクシニモイルを意味する。

本明細書において論じる成分ペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、それらの類似体および誘導体も公知である。参考のため、幾つかの天然成分ペプチドホルモンの配列を表1に提供する。
表 1: 例示的成分ペプチドホルモン

これらのペプチドは、一般に、生理的に発現されたときにはC末端アミド化されているが、本発明の目的にはされている必要はない。言い換えると、これらのペプチドおよび本発明のハイブリッドポリペプチドのC末端は、遊離 -OHまたは‐NH₂ 基を有することがある。これらのペプチドは、他の後修飾修飾を有することもある。本発明のハイブリッドポリペプチドが、N末端メチオニン残基で構成されていることもあることは、当業者には理解されるであろう。

本発明において使用するための例示的ペプチドモジュールとしては、二つの形、アペリン36および13で存在し、両方がAJP受容体で活性あるアペリン（LVQPRGSRNGPGPWQGGRRKFRRQRPRLSHKGPMPF-OH（配列番号：316）およびpERPRLSHKGPMPF-OH（配列番号：317））；二つの形、PRP31およびPRP20で存在し、GPR10で等しく活性であるプロラクチン放出ペプチド（SRTHRHSMEIRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2（配列番号：318）およびTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2（配列番号：319））；大きなガストリンおよびミニ−ガストリンとして存在するが、活性の大部分はペンタガストリン内の残基に属するガストリン（QLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2（配列番号：320）；pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2（配列番号：321）；ベータ-AWMDF-NH2（配列番号：322））；CCK33またはCCK8として存在する、CCK（中枢対末梢；KAPSGRMSIVKNLQNLDPSHRISDRDYMGWMDF-NH2（配列番号：323）；DYMGWMDF-NH2）（配列番号：55）；コルチスタチン17または29として存在するコルスタチン（QEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK-OH（配列番号：324）およびDRMPCRNFFWKTFSSCK-OH（配列番号：325））；ソマトスタチン14または28として存在するソマスタチン（SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC-OH（配列番号：326）;AGCKNFFWKTFTSC-OH（配列番号：327））；C末端10アミノ酸配列がその活性の大部分を有するGRP（VPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM-NH2（配列番号：328）；GNHWAVGHLM-NH2（配列番号：329））；C末端10アミノ酸領域がその活性の大部分を有するニューロメジンB（LSWDLPEPRSRASKIRVHSRGNLWATGHFM-NH2（配列番号：330）；GNLWATGHFM-NH2（配列番号：331））；C末端9アミノ酸領域がその活性の大部分を有するニューロメジンS（ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN-NH2（配列番号：315）；PFFLFRPRN-NH2（配列番号：332））；C末端9アミノ酸領域がその活性の大部分を有するニューロメジンU（FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRN-NH2（配列番号：308）；GYFLFRPRN-NH2（配列番号：307））；長形および短形として存在するニューロテンシン（KIPYILKRQLYENKPRRPYIL-OH（配列番号：333）；QLYENKPRRPYIL-OH)（配列番号：334））；その活性がそのC末端に主として存するKiss-1（GTSLSPPPESSGSPQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF-NH2（配列番号：335）；EKDLPNYNWNSFGLRF-NH2（配列番号：336））；そのC末端フラグメントが活性を有するRF-アミド-3（SAGATANLPLRSGRNMEVSLVRRVPNLPQRF-NH2（配列番号：337）；VPNLPQRF-NH2（配列番号：338））；ジノルフィンB（リモルフィン）の大きなジノルフィン（A）として存在するジノルフィン（YGGFLRRIRPKLKWDNQKRYGGFLRRQFKVVT-OH（配列番号：339）およびYGGFLRRQFKVVT-OH（配列番号：340））；そのC末端がY2受容体で活性であるPYY（YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2（配列番号：57）；SLRHYLNLVTRQRY-NH2（配列番号：341））；その7-47領域が活性を保持するAFP-6（TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2（配列番号：51）；VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2（配列番号：52））；アドレノモジュリン、カルシトニンおよびCGRPを含むアミリンファミリー；そのC末端アミドが活性のために一般に必要とされ、N末端延長を許容できるオキシトシンをはじめとするN末端延長可能モジュール（ならびにそれらの類似体および誘導体）がさらに挙げられる。

本発明において使用するための例示的ペプチドモジュールとしては、エンドセリンI、IIおよびIII：ETI（CSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRS-OH（配列番号：342）；CSCSSLMDKECVYFCHLDIIW-OH（配列番号：343））、ETII（CSCSSWLDKECVYFCHLDIIWVNTPEQTAPYGLGNPP-OH（配列番号：344）；CSCSSWLDKECVYFCHLDIIW-OH（配列番号：345））およびETIII（CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR-NH2（配列番号：346）；CTCFTYKDKECVYYCHLDIIW-OH（配列番号：347））；その活性が主としてその最初の10残基に存するグレリン（GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQP-OH（配列番号：348）；GSSFLSPEHQ-OH（配列番号：349）；グルカゴン様活性を有するC末端延長グルカゴンであるオキシントモジュリンを含むグルカゴン（HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA-OH（配列番号：350）；HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH（配列番号：351））；その活性がC末端アミドと共にまたは無しで保持されるGLP-1/GLP-2；二つの形態、GIP1-42およびGIP1-30で循環し、両方がGIP受容体で十分に活性であるGIP（YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH（配列番号：352）；YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-NH2（配列番号：353））；NPW23およびNPW30として存在し、GPR7および8で等しく活性である神経ペプチドW（WYKHVASPRYHTVGRAAGLLMGLRRSPYLW-OH（配列番号：354）；WYKHVASPRYHTVGRAAGLLMGL-OH（配列番号：355））；二つの形、PACAP27および38で存在するPACAP（HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK-NH2（配列番号：356）；HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2（配列番号：357））；PHIおよびPHV（HADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLMGKRVSSNISEDPVPV-OH（配列番号：358）；HADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLM-NH2（配列番号：359））；二つの形態GRF29およびGRF40で存在するGRF（YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL-NH2（配列番号：360）；YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMS-OH（配列番号：361））；完全長PTH 1-84の活性を有するPTH 1-34および1-37形（SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ（配列番号：362）；SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL-OH（配列番号：363）；SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF-OH（配列番号：364））；1-36が完全長1-86の活性を有するPTH-RP（AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRATSEVSPNSKPSPNTKNHPVRFGSDDEGRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKP-NH2（配列番号：365）；AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI-OH（配列番号：366））；より短いガンマ-MSH1およびより長いガンマ-MSH3が同様の活性を有するガンマ-MSH（YVMGHFRWDRFGRRNSSSSGSSGAGQ-OH（配列番号：367）；YVMGHFRWDRF-NH2（配列番号：368））；アルファ-MSHがACTHの活性部分であるMSH（SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF-OH（配列番号：369）；SYSMEHFRWGKPV-NH2（配列番号：370）；ならびにA、デルタおよびγエンドルフィンがより大きなβエンドルフィンの活性サブペプチドである、エンドルフィン（YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAYKKGE-OH（配列番号：371）；YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAY-OH（配列番号：372）；YGGFMTSEKSQTPLVTL-OH（配列番号：373）；YGGFMTSEKSQTPLVT-OH（配列番号：374））をはじめとするC末端延長可能ペプチドがさらに挙げられる。

例えば、メラノコルチンは、アルファ−メラニン細胞刺激ホルモン（アルファ-MSH）および副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）を含む、プロ−オピオメラノコルチン遺伝子からのペプチドであり、五つのメラノコルチン受容体が知られている、MC1-5R。MC4Rは、エネルギーバランスおよび肥満において一定の役割を果すようである。例えば、Anderson et al., Expert Opin. Ther. Patents 11:1583-1592 (2001), Speake et al., Expert Opin. Ther. Patents 12:1631-1638 (2002), Bednarek et al., Expert Opin. Ther. Patents 14:327-336 (2004)参照。

上の成分ペプチドホルモンの類似体は、当該技術分野において公知であるが、一般に、そうした成分ペプチドホルモンおよびそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列への置換、欠失および挿入などの修飾を含む。置換、挿入および欠失は、N末端先端部である場合もあり、C末端先端部である場合もあり、またはその成分ペプチドホルモンの内部部分である場合もある。好ましい態様において、本発明の成分ペプチドホルモンの類似体は、「非必須」アミノ酸残基の一つ以上の修飾を含む。本発明に関連して、「非必須」アミノ酸残基は、結果として生じる類似体の成分ペプチドホルモン受容体作動薬活性を完全に破壊または実質的に減少させることなく改変、すなわち欠失または置換することができる、そのフラグメント、例えば成分ペプチドホルモンフラグメントの天然ヒトアミノ酸配列内の残基である。

好ましい置換としては、保存アミノ酸置換が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖または生理化学的特性（例えば、静電的、水素結合の、等配電子の、疎水性の特徴）を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において公知である。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アルパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。

本発明は、成分ペプチドホルモンの誘導体にも関する。こうした誘導体としては、一つ以上の水溶性ポリマー分子、例えば、ポリエチレングリコール（「PEG」）もしくは様々な長さの脂肪酸鎖（例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイルなど）にコンジュゲートした、またはポリアミノ酸、例えばポリ-his、ポリ-arg、ポリ-lys、およびポリ-alaの付加によりコンジュゲートした成分ペプチドホルモンおよびそれらの類似体が挙げられる。成分ペプチドホルモンまたはそれらの類似体への修飾は、小分子置換基、例えば短いアルキルおよび拘束アルキル（例えば、分枝アルキル、環状アルキル、融合アルキル、アダマンチルアルキル）、および芳香族基を含む場合もある。水溶性ポリマー分子は、好ましくは、約500から約20,000ダルトンの範囲にわたる分子量を有するであろう。

こうしたポリマー・コンジュゲーションおよび小分子置換基修飾は、本ハイブリッドポリペプチドの配列内のNもしくはC末端で、またはアミノ酸残基の側鎖で一回行うことができる。あるいは、ハイブリッドポリペプチドに沿って多数の誘導体化部位が存在することもある。リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインで一つ以上のアミノ酸を置換することにより、追加の誘導体化部位を生じさせることができる。例えば、米国特許第5,824,784号および同第5,824,778号参照。好ましくは、本ハイブリッドポリペプチドを一つ、二つまたは三つのポリマー分子にコンジュゲートすることができる。

水溶性ポリマー分子は、好ましくはアミノ、カルボキシルまたはチオール基に連結させ、ならびにNもしくはC末端によって、またはリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸もしくはシステインの側鎖で連結させることができる。あるいは、水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボン酸基と連結させることができる。好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドを、リシンアミノ酸上のイプシロンアミノ基により、一つ、二つまたは三つのPEG分子にコンジュゲートさせる。

本発明の誘導体は、一つ以上のアミノ酸残基への化学的改変を有する成分ペプチドホルモンまたは類似体も含む。こうした化学的改変としては、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化が挙げられる。これらの化学的改変は、PPFハイブリッドポリペプチドの配列内のNもしくはC末端で、またはアミノ酸残基の側鎖で行うことができる。一つの実施形態において、これらのペプチドのC末端は、遊離-OHまたは‐NH₂ 基を有することがある。別の実施形態において、N末端先端部は、イソブチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、n-ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基（イソキャップ）、オクタニル基、オクチルグリシン基（G(Oct））、または8-アミノオクタン酸基でキャップされていることがある。好ましい実施形態において、環化は、ジスルフィド架橋の形成によるものであり得る。あるいは、本ハイブリッドポリペプチドに沿って多数の化学的改変部位が存在することがある。
アミリンファミリー

本明細書において論じる、本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、アミリン、アドレノメジュリン（「ADM」）、カルシトニン（「CT」）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（「CGRP」）、インテルメジン（「AFP-6」としても知られている）および関連ペプチドをはじめとするアミリンファミリーペプチドホルモンが挙げられる。天然アミリンファミリーペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意のアミリンファミリーペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野において公知の任意のアミリン類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、アミリン類似体および誘導体は、天然アミリンの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのアミリン類似体は、天然アミリンが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいアミリン類似体および誘導体としては、US 2003/0026812 A1（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

例示的アミリン類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたアミリン類似体は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。

当該技術分野では公知の任意のADM類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、これらのADM類似体および誘導体は、天然ADMの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのADM類似体は、天然ADMが特異的に結合できる受容体の作動薬である

当該技術分野では公知の任意のCT類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、これらのCT類似体および誘導体は、天然CTの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのCT類似体は、天然CTが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいCT類似体および誘導体としては、米国特許第4,652,627号、同第4,606,856号、同第4,604,238号、同第4,597,900号、同第4,537,716号、同第4,497,731号、同第4,495,097号、同第4,444,981号、同第4,414,149号、同第4,401,593号、および同第4,397,780号（これらは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

例示的CT類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたCT類似体は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。

当該技術分野では公知の任意のCGRP類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、これらのCGRP類似体および誘導体は、天然CGRPの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのCGRP類似体は、天然CGRPが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいCGRP類似体および誘導体としては、米国特許第4,697,002号、および同第4,687,839号（これらは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

例示的CGRP類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知の任意のAFP-6類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、これらのAFP-6類似体および誘導体は、天然AFP-6の少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのAFP-6類似体は、天然AFP-6が特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいAFP-6類似体および誘導体としては、WO 2003/022304（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

例示的AFP-6類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたAFP-6類似体は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。
CCKファミリー

CCK（hCCKおよび種変異体および種変異体を含む）およびそれらの様々な類似体は、当該技術分野において公知である。一般に、CCKは、ヒトにおいて最初に特定された33-アミノ酸配列を有し、ならびに報告によるとブタ、ラット、ニワトリ、チンチラ、イヌおよびヒトにおいて証明された8-アミノ酸インビボC末端フラグメント（「CCK-8」）を含む。他の種変異体としては、ブタ、イヌおよびモルモットにおいて見出せる39-アミノ酸配列、およびネコ、イヌおよびヒトにおいて見出せる58-アミノ酸、およびCCKとガストリンとの両方に相同な47-アミノ酸配列が挙げられる。C末端チロシン硫酸化オクタペプチド配列（CCK-8）は、種を越えて比較的保存され、ならびに齧歯動物の末梢部における生物学的活性のための最低限の配列であり得る。従って、用語CCK-33は、一般に、ヒトCCK(1-33）を指し、一方、CCK-8（CCK(26-33)；配列番号：55）は、特に別に示さなければ、遺伝的に硫酸化形および非硫酸化形の両方のC末端オクタペプチドを指す。さらに、ペンタガストリンまたはCCK-5は、C末端ペプチドCCK(29-33)（配列番号：209）を指し、CCK-4は、C末端テトラペプチドCCK(30-33)（配列番号：208）を指す。

A型受容体サブタイプ（CCK_A）は、硫酸化オクタペプチドに対して選択的であると報告されている。B型受容体サブタイプ（CCK_B）は、脳および胃のいたるところで特定されており、報告によると、硫酸化および八つすべてのアミノ酸を必要としない。

CCK類似体についての様々なインビボおよびインビトロスクリーニング法が、当該技術分野において知られている。例としては、CCK様活性について試験すべき化合物を急速に静脈内注射した後のイヌまたはモルモットの胆嚢の収縮を含むインビボアッセイ、およびウサギの胆嚢のストリップを用いるインビトロアッセイが挙げられる。Walsh, “Gastrointestinal Hormones” In Physiology of the Gastrointestinal Tract (3d ed. 1994; Raven Press, New York)参照。

一定の例示的CCKおよびCCK活性を有するCCK類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたCCK類似体は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。
レプチンファミリー

本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、レプチンファミリーペプチドホルモンも挙げられる。天然レプチンファミリーペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意の公知のアミリンファミリーペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野では公知の任意のレプチン類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、これらのレプチン類似体および誘導体は、天然レプチンの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのレプチン類似体は、天然レプチンが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいレプチン類似体および誘導体としては、例えば、WO 2004/039832、WO 98/55139、WO 98/12224、およびWO 97/02004（これらのすべてが、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

一つの実施形態において、レプチンペプチドとしては、WO 97046585に記載されているようなMVPIQK、VQDDTK、TLIK、TIVTR、INDISHTQSVSSK、VTGLDFIPGLHPILTLSK、NVIQISNDLENLR、DLLHVLAFSK、SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRおよびLQGSLQDMLWQLDLSPGCが挙げられる。

一つの実施形態において、レプチンペプチドは、アミノ酸配列Xaan-Ser-Cys-Xaa1-Leu-Pro-Xaa2-Xaa3-Xaanを有することができ、この配列式中のXaanは、長さがゼロの残基である場合もあり、または完全長ヒトもしくはマウスレプチン配列に由来するペプチド残基の連続伸張部、C末端もしくはN末端いずれかでの1と7との間の伸張部である場合もあり、あるいは、このレプチンペプチドは、合計アミノ酸数15以下の長さである。別の実施形態において、Xaa1、Xaa2またはXaa3は、任意のアミノ酸置換であり得る。さらに別の実施形態において、Xaa1、Xaa2またはXaa3は、完全長マウスまたはヒトレプチンにおけるそれぞれの残基の任意の保存的アミノ酸置換であり得る。さらなる実施形態において、Xaa1は、HisまたはSerから成る群より選択することができ、ならびにXaa2またはXaa3は、任意のアミノ酸置換である。別の実施形態において、Xaa2は、TrpまたはGlnから成る群より選択することができ、ならびにXaa1またはXaa3は、任意のアミノ酸置換である。さらに別の実施形態において、Xaa3は、AlaまたはThrから成る群より選択することができ、ならびにXaa1またはXaa2は、任意のアミノ酸置換である。別の実施形態において、Xaa1は、HisまたはSerから成る群より選択され、Xaa2は、TrpまたはGlnから成る群より選択され、ならびにXaa3は、AlaまたはThrから成る群より選択される。WO 04039832参照。

一つの実施形態において、レプチンペプチドは、i.p.（腹腔内）投与されたとき試験動物において体重恒常性を変調させる能力を有する、天然完全長ヒトまたはマウスレプチンのC末端アミノ酸残基116-122（それらの成熟形の位置95-101に対応する）ならびにそれらのD-アイソフォーム、フラグメント、誘導体、類似体および同族体を含む。配列SCSLPQTの具体的なマウスD-置換ペプチドとしては、[D-Ser-l]-、[D-Cys-2]-、[D-Ser-3]-、[D-Leu-4]-、[D-Pro-5]-、[D-Gln-6]-、[D-Thr-7]-SCSLPQTおよびすべての[D]SCSLPQTが挙げられる。SCHLPWAの具体的なヒトD-置換ペプチドとしては、[D-Ser-l]-、[D-Cys-2]-、[D-His-3]-、[D-Leu-4]-、[D-Pro-5]-、[D-Trp-6]-、[D-Ala-7]-SCHLPWAおよびすべての[D]-SCHLPWAが挙げられる。加えて、SCHLPWAおよびSCSLPQTペプチドは、任意の二つ、三つ、四つ、五つまたは六つの位置にD-置換アミノ酸を含有し得る。天然レプチンのN末端アミノ酸21-35、31-45、41-55および51-65を含むレプチン関連ペプチド、ならびにそれらのフラグメント、誘導体、類似体および同族体も開示する。本発明のさらなるレプチンペプチドは、マウスおよび／またはヒト完全長レプチンのアミノ酸配列61-75、71-85、81-95、91-105、106-120、116-130、126-140、136-150、146-160、および156-167を含む。WO 04039832参照。

一つの実施形態において、レプチンは、配列Ser Cys His Leu Pro Xaa Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cysのものであり、この配列中、位置6のXaaは、TrpまたはGlnであり；位置36のXaaは、GlnまたはGluであり；位置40のXaaは、GlnまたはGluであり；位置42のXaaは、Ile、Leu、Metまたはメチオニンスルホキシドであり；位置44のXaaは、TrpまたはGlnであり；および位置45のXaaは、GlnまたはGluである。別の実施形態において、上のレプチンは、位置6のXaaがTrpであり；位置36のXaaがGlnであり；位置40のXaaがGlnであり；位置42のXaaがMetであり；位置44のXaaがTrpであり；および位置45のXaaがGlnである。米国特許第5521283号参照。

一つの実施形態において、レプチンは、次のものをはじめとする天然配列である：
マウスレプチン：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Xaa Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Gln Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys（配列中、位置28のXaaは、Glnであるか、不在である）；
ブタレプチン：Val Pro Ile Trp Arg Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Ser Asp Ile Ser His Met Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Val Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Ser Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Gln Ala Arg Ala Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ala Leu Gln Asp Met Leu Arg Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys；
ウシレプチン：Val Pro Ile Cys Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Xaa Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Leu Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val Val Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Ala Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Gln Val Arg Ala Leu Glu Ser Leu Glu Ser Leu Gly Val Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Arg Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys（配列中、位置28のXaaは、Glnであるか、不在である）；
ヒトレプチン：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Xaa Xaa Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys（配列中、位置27のXaaは、ThrまたはAlaであり；および位置28のXaaは、Glnであるか、不在である）；アカゲザルレプチン：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Ser Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Val Leu Thr Leu Ser Gln Met Asp Gln Thr Leu Ala Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Ile Asn Leu Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Leu Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Glu Ser Leu Gly Asp Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys；および
ラットレプチン：Val Pro Ile His Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala Arg Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala His Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Arg Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Leu Ser Pro Glu Cys。

別の実施形態において、レプチンペプチドは、配列：
Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Xaa Asp Ile Ser His Xaa Xaa Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Gln Ile Xaa Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cysのものであり、配列中、位置22のXaaは、Asn、AspまたはGluであり；位置27のXaaは、ThrまたはAlaであり;位置28のXaaは、GlnまたはGluであるか、不在であり；位置54のXaaは、MetまたはAlaであり；位置68のXaaは、MetまたはLeuであり；位置72のXaaは、Asn、AspまたはGluであり；位置77のXaaは、SerまたはAlaであり；位置118のXaaは、GlyまたはLeuであり；前記タンパク質は、以下から成る群より選択される少なくとも一つの置換を有する：位置97のHisが、SerもしくはProで置換されている;位置100のTrpが、Gln、AlaもしくはLeuで置換されている；位置101のAlaが、ThrもしくはValで置換されている；位置102のSerが、Argで置換されている；位置103のGlyが、Alaで置換されている；位置105のGluが、Glnで置換されている；位置106のThrが、LysもしくはSerで置換されている;位置107のLeuが、Proで置換されている；位置108のAspが、Gluで置換されている; または位置111のGlyが、Aspで置換されている。

別の実施形態において、レプチンは、配列：Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Xaa Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Xaa Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cysのものであり、配列中、位置27のXaaは、ThrまたはAlaであり；位置77のXaaは、SerまたはAlaであり；位置118のXaaは、GlyまたはLeuであり;前記タンパク質は、以下から成る群より選択される少なくとも一つの置換を有し、好ましくは、一つから五つの置換、最も好ましくは、一つから二つの置換を有する：位置97のHisが、Serで置換されている；位置100のTrpが、Glnで置換されている；位置101のAlaが、Thrで置換されている；位置105のGluが、Glnで置換されている；位置106のThrが、Lysで置換されている；位置107のLeuが、Proで置換されている；位置108のAspが、Gluで置換されている；または位置111のGlyが、Aspで置換されている。上の配列のさらなる実施形態において、位置27のXaaは、Thrであり；位置77のXaaは、Serであり；位置118のXaaは、Glyであり;および位置97、100、101、105、106、107、108および111のアミノ酸残基は、次の表にあるとおりである：

一つの実施形態において、レプチンは、Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa Xaa Ile Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Xaa Ile Ser Xaa Asp Leu Glu Xaa Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Xaa Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cysのものであり、この配列式中、位置13は、Ile、Leu、Metまたはメチオニンスルホキシドであり; 位置15のXaaは、GlnまたはGluであり；位置21のXaaは、GlnまたはGluであり；位置22のXaaは、GlnまたはGluであり；位置27のXaaは、Ile、Leu、Metまたはメチオニンスルホキシドであり；位置31のXaaは、Asn、AspまたはGlnであり；位置34のXaaは、GlnまたはGluであり；位置37のXaaは、Asn、AspまたはGlnであり；位置41のXaaは、Asn、AspまたはGlnであり；位置59のXaaは、TrpまたはGlnであり；位置89のXaaは、GlnまたはGluであり；位置93のXaaは、GlnまたはGluであり；位置95のXaaは、Ile、Leu、Met、またはメチオニンスルホキシドであり；位置97のXaaは、TrpまたはGlnであり；および位置98のXaaは、GlnまたはGluである。別の実施形態において、上の式のレプチンは、位置13のXaaがMetであり；位置15のXaaがGlnであり；位置21のXaaがGlnであり;位置22のXaaがGlnであり；位置27のXaaがMetであり；位置31のXaaがAsnであり；位置34のXaaがGlnであり；位置37のXaaがAsnであり；位置41のXaaがAsnであり；位置59のXaaがTrpであり；位置89のXaaがGlnであり；位置93のXaaがGlnであり；位置95のXaaがMetであり；位置97のXaaがrpであり；および位置98のXaaがGlnである。米国特許第5532336号参照。

例示的レプチン類似体としては、位置43のアミノ酸が、AspまたはGluで置換されているもの；位置48がAlaで置換されているもの；位置49がGluで置換されているか、不在であるもの；位置75がAlaで置換されているもの；位置89がLeuで置換されているもの；位置93がAspまたはGluで置換されているもの；位置98がAlaで置換されているもの；位置117がSerで置換されているもの；位置139がLeuで置換されているもの；位置167がSerで置換されているものが挙げられる。

一定の例示的レプチンおよびレプチン活性を有するレプチン類似体としては、次のものが挙げられる：

PPFファミリー

本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、PPおよびPYYを含む、PPFペプチドホルモンも挙げられる。天然PPFペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意のアミリンファミリーペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野では公知の任意のPPF類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、これらのPPF類似体および誘導体は、天然PPFポリペプチドの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのPPF類似体は、天然PPFポリペプチドが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいPPF類似体および誘導体としては、WO 03/026591およびWO 03/057235（これらは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

一つの実施形態において、少なくとも一つのPPFホルモン活性を示す好ましいPFF類似体および誘導体は、ポリプロリンモチーフおよびC末端尾部モチーフをはじめとする少なくとも二つのPYYモチーフを一般に含む。こうした類似体は、一般に、2006年6月22日にUS 2006/013547A1として公開された、2004年2月11日出願の米国特許仮出願第60/543,406号に記載されている（これらは、参照により本明細書に取り入れられている）。他の好ましいPPF類似体は、2005年8月25日にWO 2005/077094として発行された、「Pancreatic Polypeptide Family Motifs and Polypeptides Comprising the Same」と題するPCT/US2005/004351に開示されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれている。他の好ましいPPF類似体は、2006年6月22日にWO 2006/066024として発行された、「Pancreatic Polypeptide Family Motifs, Polypeptides and Methods Comprising the Same」と題するPCT/US2005/045471に開示されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれている。背景として、研究は、Y受容体結合親和性の差が、二次および三次構造の差と相関していることを示唆している。例えば、Keire et al., Biochemistry 2000, 39, 9935-9942参照。天然ブタPYYは、残基23、24および25でのねじれによって隔てられた残基17から22および25から33からの二つC末端ヘリックスセグメント、残基12-14辺りに中心があるターン、および残基30および31付近でフォールディングしたN末端を含むと特性付けされている。さらに、完全長ブタPYYは、NおよびC末端における残基の間の疎水性相互作用によって安定化されたPPフォールドを含むと特性付けされている。同書参照。

一般に、「PYYモチーフ」は、生物学的活性に不可欠である、すなわち、生物学的活性が、そのモチーフの不在または妨害時に実質的に低減される、天然PPファミリーポリペプチドの一次、二次、または三次構造成分である。好ましいPYYモチーフとしては、天然PPファミリーポリペプチドのN末端ポリプロリンII型モチーフ、天然PPファミリーポリペプチドのII型β-ターンモチーフ、天然PPファミリーポリペプチドのC末端先端部のα-ヘリックスモチーフ、および天然PPファミリーポリペプチドのC末端尾部モチーフが挙げられる。さらに詳細には、N末端ポリプロリン領域内では、天然PPファミリーポリペプチドの残基5および8に対応するアミノ酸が、一般にプロリンとして保存される。II型β-ターンモチーフは、一般に、天然PPファミリーポリペプチドのの残基12-14に対応するアミノ酸を含む。一般に、α-ヘリックスモチーフは、天然PPファミリーポリペプチドのほぼ残基14に対応するアミノ酸から、C末端先端を含むC末端先端までの任意の地点にわたり得るが、但し、そのα-ヘリックスモチーフが、溶解状態でα-ヘリックスターンを形成するために十分な数のアミノ酸残基を含むことを条件とする。α-ヘリックスモチーフは、その天然PPファミリー配列へのアミノ酸置換、挿入および欠失を含む場合もあるが、但し、溶解状態でα-ヘリックスターンが、依然として形成されることを条件とする。C末端尾部モチーフは、一般に、天然PPファミリーポリペプチドの最後の約10残基、さらに好ましくは、天然PPファミリーポリペプチドの最後の7、6または5残基に対応するアミノ酸、およびさらに好ましくは、アミノ酸残基32-35を含む。

好ましいPYY類似体としては、ポリプロリンモチーフおよび／またはC末端尾部モチーフに対応しないPYY分子の領域における内部欠失、挿入および置換を有するものが挙げられる。例えば、位置4、6、7、9または10での内部欠失が考えられる。

特に興味深い別の実施形態において、成分ホルモンは、N末端ポリプロリンPPFモチーフとC末端尾部PPFモチーフとを少なくとも含む少なくとも二つのPPFモチーフを含有するPPFポリペプチドである。本明細書で用いる場合、「モチーフ」は、特定の生化学的機能の特性を示す、または独立してフォールディングしているドメインを画定するアミノ酸配列を指す。さらなるPPFモチーフは、PP、PYYおよびNPYをはじめとする任意のPPファミリーポリペプチドのモチーフ、例えば、PYYのII型β-ターン領域モチーフまたはPYYのC末端先端部のα-ヘリックスモチーフに対応し得る。

さらに別の実施形態において、PPFファミリー成分モジュールは、第二のPP、PYYまたはNPYポリペプチドの少なくとも一つの追加のフラグメントに共有結合で連結されたPP、PYYまたはNPYポリペプチドのフラグメントを含み、各PP、PYYまたはNPYフラグメントがPPFモチーフを含む、PPFキメラポリペプチドである。あるいは、PPFキメラは、一つ、二つ、三つまたは四つのポリペプチドセグメントに連結されたPPファミリーポリペプチドのフラグメントを含むことがあり、この場合、連結されたポリペプチドセグメントのうちの一つは、第二のPPポリペプチドのフラグメントである。一定の実施形態において、PPFポリペプチドは、N末端PPフラグメントとC末端NPYフラグメントを含まない。PPFキメラポリペプチド成分モジュールは、そのPYY(3-36)の全長にわたる天然PYY(3-36)との少なくとも50%の配列同一性を示すであろう。一部の実施形態において、こうしたPPFキメラポリペプチドは、そのPYY(3-36)の全長にわたる天然PYY(3-36)との少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。こうしたPPFキメラポリペプチドは、天然PPとの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。さらに別に実施形態において、こうしたPPFキメラポリペプチドは、天然NPYとの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、少なくともN末端ポリプロリンPPFモチーフおよびC末端尾部PPFモチーフを含むことができる。これらのPPFキメラならびに他のPYYおよびPP類似体は、2006年6月22日公開のUS 2006/013547A1に記載されている。一つの実施形態において、任意のPPFファミリーペプチドは、ハイブリッド成分として含有されない場合には、第二の薬剤として、例えば抗肥満剤として、本明細書に記載のハイブリッドと共に供給することができる。

重ねて、PPFキメラポリペプチドは、一般に、少なくとも一部は、天然PP、PYYまたはNPYの生物学的活性を保持するであろう。一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、メタボリック状態および代謝異常の治療および予防において生物学的活性を示す。

PPFキメラのポリペプチドフラグメントは、直接アミド結合または化学的リンカー基を含む（しかし、これらに限定されない）、当該技術分野において公知の任意の様式で互いに共有結合で連結させることができる。化学的リンカー基としては、ポリペプチド配座を誘導または安定化するペプチド模倣体を挙げることができる。PPFキメラポリペプチドとしては、PYY-PP、PYY-NPY、PP-PYY、PP-NPY、NPY-PPまたはNPY-PYYキメラを挙げることができる。

PPFキメラは、少なくともアミノ酸数21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34の長さである。一部の実施形態において、PYY類似体ポリペプチドは、天然Lアミノ酸残基および／または修飾天然Lアミノ酸残基のみを含む。一部の実施形態において、PYY類似体ポリペプチドは、非天然アミノ酸残基を含まない。

一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドとしては、hPP(1-7)-pNPY、hPP(1-17)-pNPY、hPP(19-23)-pNPY、hPP(19-23)-Pro³⁴pNPY、hPP(19-23)-His³⁴pNPY、rPP(19-23)-pNPY、rPP(19-23)-Pro³⁴pNPY、rPP(19-23)-His³⁴pNPY、hPP(1-17)-His³⁴pNPY、pNPY(1-7)-hPP、pNPY(1-7,19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP、cPP(1-7)-NPY(19-23)-His³⁴hPP、hPP(1-17)-His³⁴pNPY、hPP(19-23)-pNPY、hPP(19-23)-Pro³⁴pNPY、pNPY(1-7)-hPP、pNPY(19-23)-hPP、pNPY(19-23)-Gln³⁴hPP、pNPY(19-23)-His³⁴hPP、pNPY(19-23)-Phe⁶Gln³⁴hPP、pNPY(19-23)-Phe⁶His³⁴hPP、pNPY(1-7,19-23)-hPP、pNPY(1-7,19-23)-Gln³⁴hPP、cPP(20-23)-Pro³⁴-pNPY、cPP(21-23)-Pro³⁴-pNPY、cPP(22-23)-Pro³⁴-pNPY、cPP(1-7)-Pro³⁴-pNPY、cPP(20-23)-Pro³⁴-pNPY、cPP(1-7,20-23)-Pro³⁴-pNPY、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-His³⁴hPP、cPP(1-7)-gPP(19-23)-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala³¹Aib³²Gln³⁴-hPP、cPP(1-7)-pNPY(19-23)-Ala³¹Aib³²His³⁴-hPP hPP(1-7)-Ala³¹Aib³²-pNPY、hPP(1-17)-Ala³¹Aib³²-pNPY、pNPY(1-7)-Ala³¹Aib³²Gln³⁴-hPP、またはpNPY(1-7,19-23)-Ala³¹Aib³²Gln³⁴-hPPが挙げられる。

一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、PPファミリー類似体ポリペプチドのフラグメントを含むことがある。例えば、PPFキメラポリペプチドは、本明細書において説明するPPF類似体ポリペプチド、ならびにPP類似体ポリペプチドおよびNYP類似体ポリペプチドを含むことがある。

本発明のハイブリッドにおいてまたは第二の薬剤として使用するためのPYY類似体ポリペプチドは、本明細書中で説明するアッセイ（食事摂取、胃内容排出、膵液分泌、体組成または体重減少アッセイを含む）の一つにおいて、同じアッセイでのNPY、PYYまたはPYY(3-36)の効力に等しいかそれより大きい効力を有するものである。一部の実施形態において、PPY類似体ポリペプチドは、例えば肥満、インスリン抵抗性症候群（X症候群）または糖尿病などの代謝性疾患の治療において有用であり得る。一部の実施形態において、PYY類似体ポリペプチドは、PP、NYP、PYYまたはPYY(3-36)と比較して、改善された製造容易性、安定性、および／または調合容易性を示すことができる。

一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、栄養利用率の低下、食事摂取量の減少、体重増加の作用、ならびに／またはメタボリック状態および代謝障害の治療および予防に関して、天然ヒトPYYの生物学的活性の少なくとも約25%、または約30%から、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%、または約99%パーセントを保持する。別の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、改善されたPYY作動薬活性を示す。一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、栄養利用率の低下、食事摂取量の減少、体重増加の作用、ならびに／またはメタボリック状態および代謝障害の治療および予防に関して、天然ヒトPYYの生物学的活性の少なくとも約110%、約125%、約130%、約140%、約150%、約200%またはそれ以上を示す。

さらに詳細には、一つの態様において、PPFキメラポリペプチドは、PYYのフラグメントに連結されたPPのフラグメントを含む。一つの実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、PYYまたはPYY類似体ポリペプチドのC末端フラグメントにそのC末端先端部で連結されたPPまたはPP類似体ポリペプチドのN末端フラグメントを含む。別の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、PPまたはPP類似体ポリペプチドのC末端フラグメントにそのC末端先端部で連結されたPYY、PYY(3-36)またはPYY類似体のN末端フラグメントを含む。

一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、NPYのフラグメントに連結されたPYYのフラグメントを含む。一つの実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、NYPまたはNYP類似体ポリペプチドのC末端フラグメントにそのC末端先端部で連結されたPYY、PYY(3-36)またはPYY類似体ポリペプチドのN末端フラグメントを含む。別の実施形態において、PFFキメラポリペプチドは、PYYまたはPYY類似体ポリペプチドのC末端フラグメントにそのC末端先端部で連結されたNYPまたはNPY類似体ポリペプチドのN末端フラグメントを含む。

一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、NPYのフラグメントに連結されたPPのフラグメントを含む。一つの実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、NPYまたはNPY類似体ポリペプチドのC末端フラグメントにそのC末端先端部で連結されたPPまたはPP類似体ポリペプチドのN末端フラグメントを含む。別の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、PPまたはPP類似体ポリペプチドのC末端フラグメントにそのC末端先端部で連結されたNPYまたはNPY類似体ポリペプチドのN末端フラグメントを含む。

一部の実施形態において、PP、PP類似体ポリペプチド、PYY、PYY(3-36)、PYY類似体ポリペプチド、NPYまたはNPY類似体ポリペプチドのフラグメントは、そのPP、PP類似体ポリペプチド、PYY、PYY(3-36)、PYY類似体ポリペプチド、NPYまたはNPY類似体ポリペプチドのおよそ4から20のアミノ酸残基を含むフラグメントである。一部の実施形態において、このフラグメント長は、少なくともアミノ酸数34の長さの最終PPFキメラポリペプチドが得られるように選択される。

PPFキメラポリペプチドは、こうしたPPFキメラポリペプチドのアミノ酸配列の置換、欠失および挿入ならびにこれらの任意の組み合わせを含む（しかし、それらに限定されない）さらなる修飾を含む場合もある。一部の実施形態において、PPFキメラポリペプチドは、「非必須」アミノ酸残基の一つ以上の修飾を含む。「非必須」アミノ酸残基は、対象となる活性を完全に破壊または実質的に減少させずに改変、すなわち欠失または置換することができる天然ヒトアミノ酸配列内の残基である。

PPFキメラポリペプチドの誘導体も有用である。こうした誘導体としては、一つ以上の水溶性ポリマー分子、例えば、ポリエチレングリコール（「PEG」）もしくは様々な長さの脂肪酸鎖（例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイル、オレオイルなど）にコンジュゲートした、またはポリアミノ酸、例えばポリ-his、ポリ-arg、ポリ-lys、およびポリ-alaの付加によってコンジュゲートしたPPFキメラペプチドが挙げられる。PPFキメラポリペプチドへの修飾は、小分子置換基、例えば短いアルキルおよび拘束アルキル（例えば、分枝アルキル、環状アルキル、融合アルキル、アダマンチルアルキル）、および芳香族基も含むことがある。一部の実施形態において、水溶性ポリマー分子は、約500から約20,000ダルトンの範囲にわたる分子量を有するであろう。

こうしたポリマー・コンジュゲーションおよび小分子置換基修飾は、PPFキメラポリペプチドの配列内の、NもしくはC末端で、またはハイブリッドの形成に関与しないアミノ酸残基の側鎖で一回行うことができる。あるいは、PPFキメラポリペプチドに沿って多数の誘導体化部位が存在することもある。リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインで一つ以上のアミノ酸を置換することにより、追加の誘導体化部位を生じさせることができる。例えば、米国特許第5,824,784号および同第5,824,778号参照。一部の実施形態では、PPFキメラポリペプチドを一つ、二つまたは三つのポリマー分子にコンジュゲートすることができる。

一部の実施形態において、水溶性ポリマー分子は、アミノ、カルボキシルまたはチオール基に連結され、ならびにNもしくはC末端によって、またはリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸もしくはシステインの側鎖で連結させることができる。あるいは、水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボン酸基と連結させることができる。一部の実施形態では、PPFキメラポリペプチドを、リシンアミノ酸上のイプシロンアミノ基により、一つ、二つまたは三つのPEG分子にコンジュゲートさせる。

PPFキメラポリペプチドは、一つ以上のアミノ酸残基への化学的改変を有するPPFキメラポリペプチドも包含する。こうした化学的改変としては、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化が挙げられる。これらの化学的改変は、PPFキメラポリペプチドの配列内のNもしくはC末端で、またはアミノ酸残基の側鎖で一回行うことができる。一つの実施形態において、これらのペプチドのC末端は、遊離-OHまたは‐NH₂ 基を有することがある。別の実施形態において、N末端先端部は、イソブチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、n-ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基（イソキャップ）、オクタニル基、オクチルグリシン基（G(Oct））、または8-アミノオクタン酸基でキャップされていることがある。一部の実施形態において、環化は、ジスルフィド架橋の形成によるものであり得る。あるいは、PYY類似体ポリペプチドに沿って多数の化学的改変部位が存在することもある。

一部の実施形態において、前記PPFキメラポリペプチドとしては、US 2006/013547A1の配列番号238-347のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

例示的PPFキメラポリペプチドとしては、式(IV)：
Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Pro Glu Xaa₇ Pro Xaa₉ Glu
Asp Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Glu Xaa₁₆ Xaa₁₇ Xaa₁₈ Xaa₁₉ Tyr
Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Leu Xaa₂₅ Xaa₂₆ Tyr Xaa₂₈ Asn Xaa₃₀
Xaa₃₁ Thr Arg Gln Xaa₃₅ Xaa₃₆
のポリペプチドが挙げられ、式中、
Xaa₁は、Tyrであるか、不在であり；
Xaa₂は、Ile、Proであるか、不在であり；
Xaa₃は、Ile、BH-修飾Lys、Lys、ValまたはProであり；
Xaa₄は、Lys、BH-修飾Lys、Ala、SerまたはArgであり；
Xaa₇は_、Ala、GlyまたはHisであり；
Xaa₉は、GlyまたはAlaであり；
Xaa₁₂は、AlaまたはProであり；
Xaa₁₃は、SerまたはProであり；
Xaa₁₄は、Pro、AlaまたはSerであり；
Xaa₁₆は、GluまたはAspであり；
Xaa₁₇は、LeuまたはIleであり；
Xaa₁₈は、AsnまたはAlaであり；
Xaa₁₉は、Arg、Lys、BH-修飾Lys、GlnまたはN(Me)Alaであり；
Xaa₂₁は、Tyr、Ala、Phe、LysまたはBH-修飾Lysであり；
Xaa₂₂は、AlaまたはSerであり；
Xaa₂₃は、Ser、AlaまたはAspであり；
Xaa₂₅は、Arg、LysまたはBH-修飾Lysであり；
Xaa₂₆は、His、AlaまたはArgであり；
Xaa₂₈は、LeuまたはIleであり；
Xaa₃₀は、LeuまたはMetであり；
Xaa₃₁は、Val、IleまたはLeuであり；
Xaa₃₅は、Lys、BH-修飾LysまたはArgであり；ならびに
Xaa₃₆は、Tyr、TrpまたはPheである。

一つの実施形態において、式VIのPPFポリペプチドは、天然PPFポリペプチド、PYY(2-36)、Val3hPYY(3-36)、Lys25hPYY(3-36)、Lys25Ile28hPYY(3-36)、Lys25Ile31hPYY(3-36)、Lys25Leu31hPYY(3-36)、Lys25Phe36hPYY(3-36)、Ile28hPYY(3-36)、Ile31hPYY(3-36)、Leu31hPYY(3-36)、Phe36hPYY(3-36)、Leu31Phe36hPYY(3-36)、またはPro13Ala14hPYYであり得る。

当業者には理解されるだろうが、式VIのポリペプチドは、遊離酸形態であってもよく、またはC末端がアミド化されていてもよい。

一つの実施形態において、PPFポリペプチドは、天然ヒトNPY（Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr）のアミノ酸残基18-36から本質的に成るC末端フラグメントに連結された、天然ヒトPYY（Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr）の最初の17のアミノ酸残基から本質的に成るN末端フラグメントを含むことがあり、この場合、PYYフラグメントのN末端の一つ以上のアミノ酸残基が、欠失されているまたは不在であることもあり、ならびに一、二、三、四、五、六、七、八、九または十のアミノ酸置換が、PYYおよびNPYフラグメントの各々において成されていることもある。一部の実施形態において、PPFポリペプチドの最初の17のアミノ酸から本質的になるN末端フラグメントは、天然PYYの最初の17のアミノ酸との少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。一部の実施形態において、アミノ酸残基18-36から本質的に成るPPFポリペプチドのC末端フラグメントは、天然NPYのアミノ酸18-36との少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。一部の実施形態において、PYYのN末端フラグメント内のアミノ酸（例えば、位置5および8のプロリン、位置6、10および15のグルタメート、または位置11のアスパルテート）、および／またはNPYのC末端フラグメント内のアミノ酸（例えば、位置20および27のチロシン、位置24のロイシン、位置29のアスパラギン、位置32のトレオニン、位置33のアルギニン、または位置34のグルタミン）は置換されない。一部の実施形態において、PPFポリペプチドとしては、US 2006/013547A1の配列番号266、267、274、282、320、および436から480のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。一部の実施形態において、PPFポリペプチドは、N末端キャップをさらに含む。これらのPPFポリペプチドの例としては、US 2006/013547A1の配列番号282、320、437、441、444、445-447、452、454-459、461-464、466、468-470および472-480が挙げられる。

他のPPFポリペプチドとしては、式(VII)：
Xaa₁ Xaa₂ Pro Xaa₄ Pro Xaa₆ His Pro Xaa₉ Xaa₁₀
Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Xaa₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇ Ala Xaa₁₉ Tyr
Xaa₂₁ Xaa₂₂ Xaa₂₃ Leu Xaa₂₅ Xaa₂₆ Xaa₂₇ Xaa₂₈ Xaa₂₉ Xaa₃₀
Xaa₃₁ Thr Arg Gln Arg Tyr
のポリペプチドが挙げられ、式中、
Xaa₁は、Tyrであるか、不在であり；
Xaa₂は、Ile、Proであるか、不在であり；
Xaa₄は、Lys、BH-修飾Lys、Ala、SerまたはArgであり；
Xaa₆は、Glu、Gln、Ala、Asn、AspまたはValであり；
Xaa₉は、GlyまたはAlaであり；
Xaa₁₀は_、Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Gly、ProまたはAibであり；
Xaa₁₁は_、Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Gly、ProまたはAibであり；
Xaa₁₂は、AlaまたはProであり；
Xaa₁₃は、SerまたはProであり；
Xaa₁₄は、Pro、AlaまたはSerであり；
Xaa₁₅は、Glu、Ala、Asp、Asn、Gln、Gly、ProまたはAibであり；
Xaa₁₆は、GluまたはAspであり；
Xaa₁₇は、LeuまたはIleであり；
Xaa₁₉は、Arg、Lys、BH-修飾Lys、GlnまたはN(Me)Alaであり；
Xaa₂₁は、Tyr、Ala、Phe、LysまたはBH-修飾Lysであり；
Xaa₂₂は、AlaまたはSerであり；
Xaa₂₃は、Ser、AlaまたはAspであり；
Xaa₂₅は、Arg、LysまたはBH-修飾Lysであり；
Xaa₂₆は、His、AlaまたはArgであり；
Xaa₂₇は、TyrまたはPheであり；
Xaa₂₈は、LeuまたはIleであり；
Xaa₂₉は、AsnまたはGlnであり；
Xaa₃₀は、LeuまたはMetであり；ならびに
Xaa₃₁は、Val、IleまたはLeuである。

当業者には理解されるであろうが、式VIIのポリペプチドは、遊離酸形態であってもよく、またはC末端がアミド化されていてもよい。

一部の実施形態において、PPFポリペプチドは、天然ヒトNPYのアミノ酸残基18-36（US 2006/013547A1の配列番号：4）から本質的に成るC末端フラグメントに連結された、天然ヒトPYYの最初の17のアミノ酸残基（US 2006/013547A1の配列番号：2）から本質的に成るN末端フラグメントを含むことがあり、この場合、PYYフラグメントのN末端の一つ以上の残基が、欠失されているまたは不在であることもあり、ならびに一、二、三、四、五、六、七、八、九または十のアミノ酸置換が、PYYおよびNPYフラグメントの各々において成されていることもある。一部の実施形態において、PPFポリペプチドの最初の17のアミノ酸から本質的になるN末端フラグメントは、天然PYYの最初の17のアミノ酸との少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。一部の実施形態において、アミノ酸残基18-36から本質的に成るPPFポリペプチドのC末端フラグメントは、天然NPYのアミノ酸18-36との少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%または少なくとも97%の配列同一性を示すことができる。一部の実施形態において、PYYのN末端フラグメント内のアミノ酸（例えば、位置3、5および8のプロリン、または位置7のヒスチジン）、および／またはNPYのC末端フラグメント内のアミノ酸（例えば、位置18のアラニン、位置20および36のチロシン、位置24のロイシン、位置32のトレオニン、位置33のアルギニン、位置34のグルタミン、または位置35のアルギニン）は置換されない。一部の実施形態において、PPFポリペプチドとしては、US 2006/013547A1の配列番号266、437、438、439、442、462、469、470、471および472などの、PYY-NPYキメラのアミノ酸配列を有するもの、またはアミノ酸配列Ile, Lys, Pro, Glu, His, Pro, Gly, Glu, Asp, Ala, Ser, Pro, Glu, Glu, Leu, Ala, Arg, Tyr, Tyr, Ala, Ser, Leu, Arg, Ala, Tyr, Ile, Asn, Leu, Ile, Thr, Arg, Gln, Arg, Tyr-NH2を有する化合物が挙げられる。一部の実施形態において、PPFポリペプチドは、N末端キャップをさらに含む。これらのPPFポリペプチドの例としては、US 2006/013547A1の配列番号437、462、469、470および472が挙げられる。例えば、US 2006/013547A1の配列438は、Pro Lys Pro Glu His Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Ala Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Ala Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyrである。一つの実施形態において、本発明のハイブリッドは、特に肥満治療、体重減少、脂肪の減少または再分布、およびカロリー摂取量減少に有用なハイブリッドでは、一つの成分、US2006/013547A1の配列438を含む。こうしたハイブリッドは、アミリン模倣成分もしくはレプチン成分または両方を含有することもある。

PPFポリペプチドおよびPPFキメラを、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者の体組成の改変を含む方法において使用することができ、この方法は、その被験者に本化合物を（PPFポリペプチドまたはPPFキメラを単独で、第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として）投与することを含み、その化合物が、脂肪対除脂肪比を改変し、その結果、体組成を改変する。PPFポリペプチドは、5705と呼ばれるPYY-NPYキメラならびにUS2006/013547A1からの次の配列：266、267、274、282、320、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479および480のものから成る群より選択されるアミノ酸を含むことがある。一つの実施形態では、脂肪を減少させ、除脂肪体重を維持または増加させる。一つの実施形態において、体脂肪および除脂肪体重は、それぞれ、体脂肪率および除脂肪体重率として測定する。一つのさらなる実施形態では、体重を減少させる。別の実施形態では、体重を維持または増加させる。化合物は、末梢投与することができる。PPFポリペプチドまたはPPFキメラまたはPPF含有ハイブリッドは、アミリン、アミリン作動薬またはアミリン類似体作動薬、サケカルシトニン、コレシストキニン（CCK）またはCCK作動薬、レプチン（OBタンパク質）またはレプチン作動薬、エキセンジンまたはエキセンジン類似体作動薬、GLP-1、GLP-1作動薬またはGLP-1類似体作動薬、CCKまたはCCK作動薬、カルシトニン、カルシトニン作動薬、小分子カンナビノイドCB1受容体拮抗薬、リモナバント、11ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ-1阻害剤、シブトラミンおよびフェンテルミンから成る群より選択される少なくとも一つの他の薬剤を被験者に投与することをさらに含む方法において使用することができる。一つの実施形態において、被験者は、過体重または肥満である。さらに別の実施形態において、PPFポリペプチドおよびPPFキメラを、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者の血漿トリグリセリドレベルを優先的に低下させる方法を含む方法において使用することができ、この方法は、血漿トリグリセリドレベルを低下させるために有効な量の化合物を被験者に投与することを含み、この方法では、より小程度にコレステロールレベルを低下させる。さらなる実施形態では、トリグリセリドレベルを低下させ、コレステロールレベルは低下させない。さらなる実施形態では、トリグリセリドレベルを低下させ、LDLコレステロールレベルは低下させない。さらなる実施形態では、トリグリセリドレベルを低下させ、LDLコレステロールレベルは、より小程度に低下させる。尚、さらなる実施形態では、アミラーゼレベルも低下させる。さらに別の実施形態において、PPFポリペプチドおよびPPFキメラを、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者における体脂肪または体脂肪増加を減少させる一方で除脂肪体重を維持または増加させるための方法を含む方法において使用することができ、この方法は、体脂肪または体脂肪増加を減少させる一方で除脂肪体重を維持または増加させるために有効な量の化合物をその被験者に投与することを含む。別の実施形態において、PPFポリペプチドおよびPPFキメラを、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者における内臓体脂肪を減少させる方法を含む方法において使用することができ、この方法は、内臓体脂肪を減少させ、除脂肪体重を維持または増加させるために有効な量の化合物を被験者に投与することを含む。別の実施形態において、PPFポリペプチドおよびPPFキメラを、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者の脂肪分布を改変する方法を含む方法において使用することができる。一つの態様において、改変は、被験者における内臓もしくは異所脂肪または両方の代謝増加の結果として生じる。別の実施形態において、PPFポリペプチドおよびPPFキメラは、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者における脂肪酸β-酸化を増加させる一方で除脂肪体重を維持または増加させる方法を含む方法において使用することができ、この方法は、脂肪酸β-酸化を増加させる一方で除脂肪体重を維持または増加させるために有効な量の化合物を被験者に投与することを含む。別の実施形態において、PPFポリペプチドおよびPPFキメラを、単独で、または第二の薬剤として、または本発明のハイブリッドの成分として使用するとき、被験者における非アルコール性脂肪肝炎または脂肪異栄養症を治療する方法を含む方法において使用することができ、この方法は、非アルコール性脂肪肝炎または脂肪異栄養症を治療するために有効な量の化合物をその被験者に投与することを含む。上の使用において特に興味深いハイブリッドは、レプチンファミリーもしくはアミリンファミリー、例えばアミリン-sCT-アミリンハイブリッドからの成分、または両方との組み合わせで、本明細書において説明するPPFキメラを含有することができる。PPF-キメラ／レプチンハイブリッドまたはPPF-キメラ／アミリン-sCT-アミリンハイブリッドは、いずれかの化合物単独より優れた効果を提供するであろう。尚、さらなる実施形態おいて、PPF-キメラ／レプチンハイブリッドは、アミリン-sCT-アミリンキメラなどのアミリン模倣体と共に投与され、またはPPF-キメラ／アミリン-sCT-アミリンハイブリッドは、レプチンと共に投与される。

ハイブリッドの成分モジュールではないとき、本明細書で述べるPPFポリペプチドキメラは、単独で、または第二の薬剤として、好ましくは本発明のハイブリッドと併用で投与することができる。それらは、単回または多数回用量で、医薬的に許容される担体もしくは賦形剤と共にまたはそれらを伴わずに提供することができる。これらの医薬化合物は、医薬的に許容される担体または希釈剤、ならびにE. W. MartinによりRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されているものなどの従来技術に関連した他の公知アジュバントおよび賦形剤を用いて調合することができる。Wang, Y. J. and Hanson, M. A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988)も参照のこと。PPFポリペプチドは、投薬単位形で提供することができる。例えば、体組成に作用するためのPPFポリペプチドの治療有効量は、患者の年齢および体重、患者の身体状態、他の治療薬とのそれらの併用、達成すべき最終目標、例えば総合的体重減少および／または除脂肪体重維持もしくは増加、ならびに他の要因を含む多数の要因によって変わるであろう。しかし、典型的な用量（ハイブリッドの成分でないとき）は、一日当たりその医薬化合物の約0.05 μg、約0.1 μg、約1 μg、約5 μg、約10 μg、約50 μg、約75μgまたは約100 μgの下限から、約50 μg、約100 μg、約500 μg、約1 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mg、約50 mg、約100 mgまたは約150 mgの上限までを含むことができる。一用量当たりその化合物の0.1 μgから1 mg、または一用量当たり約0.001 μg/kgから約500 μg/kgなどの用量範囲も考えられる。一部の実施形態において、PPFポリペプチドキメラは、一回もしくは分割用量または制御持続放出で一日当たり約0.5 μgから約5 mgの用量で、または一用量当たり約0.01 μg/kgから約500 μg/kgで、または約0.05 μg/kgから約250 μg/kgで末梢投与される。一部の実施形態において、PPFポリペプチドキメラは、約50 μg/kgより低い用量で投与される。これらの範囲の投薬量は、各々の類似体または誘導体の効力によって変わるであろうし、勿論、当業者はそれを容易に決定することができる。一日当たりの用量は、個別の単位用量で送達することができ、24時間またはその24時間の任意の部分において継続的に供給することができる。一日当たりの投薬数は、一日当たり1から約4であるが、それより多くてもよい。持続送達は、持続注入の形態で行うことができる。他の考えられる例示的用量および注入率としては、個別用量当たり0.005 nmol/kgから約20 nmol/kg、または持続注入で約0.01/pmol/kg/分から約10 pmol/kg/分が挙げられる。これらの用量および注入は、任意の公知従来型または将来開発される末梢法、例えば、静脈内(i.v.)、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、球後、肺内（例えば、期間限定放出）、皮下投与(s.c.)により、経口、舌下、鼻、肛門、膣もしくは経皮送達により、または特定部位での手術移植により送達することができる。静脈内投与される医薬組成物の例示的全用量／送達は、一日当たり約1 μgから約8 mgであり得、これに対して、皮下投与される医薬組成物の全用量／送達は、一日当たり約6 μgから約16 mgであり得る。
インクレチンおよびインクレチン模倣体

本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、CLP-1ペプチドホルモンも挙げられる。GLP-1(1-37)（配列番号：59）、GLP-1(7-37)（配列番号：204）およびGLP-1(7-36)アミド（配列番号：61）をはじめとする天然GLP-1ペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。本明細書で用いる場合、GLP-1は、GLP-1ペプチドホルモンのすべての天然形態を指す。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意の公知GLP-1ペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野において公知の任意のGLP-1ペプチド類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、GLP-1ペプチド類似体および誘導体は、天然GLP-1ペプチドの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのGLP-1ペプチド類似体は、天然GLP-1ペプチドが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいGLP-1ペプチド類似体および誘導体としては、WO 91/11457（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。

当該技術分野において公知のGLP-1類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたGLP-1類似体は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。

他のGLP-1類似体および誘導体は、米国特許第5,545,618号（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に開示されている。GLP-1類似体および誘導体の好ましい群としては、米国特許第6,747,006号（これは、その全体が参照により本明細書に取り入れられている）に開示されているものが挙げられる。米国特許第5,188,666号（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されている分子の本発明における使用も考えられる。本発明において使用するための分子の別の群としては、米国特許第5,512,549号（これは、特に、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されている化合物が挙げられる。本発明において使用するためのGLP-1化合物の別の好ましい群は、WO 91/11457（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に開示されている。

本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、GLP-2ペプチドホルモンも挙げられる。天然GLP-2ペプチドホルモン、例えば、ラットGLP-2およびその相同体（牛GLP-2(ox GLP-2)、ブタGLP-2、デグーGLP-2、ウシGLP-2(bovine GLP-2)、モルモットGLP-2、ハムスターGLP-2、ヒトGLP-2、ニジマスGLP-2、およびニワトリGLP-2を含む）は、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意の公知GLP-2ペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野において公知の任意のGLP-2ペプチド類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、GLP-2ペプチド類似体および誘導体は、天然GLP-2ペプチドの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのGLP-2ペプチド類似体は、天然GLP-2ペプチドが特異的に結合できる受容体の作動薬である。好ましいGLP-2ペプチド類似体および誘導体としては、例えば、米国特許出願番号08/669,791およびPCT出願 PCT/CA97/00252（これらの両方が、参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものが挙げられる。当該技術分野において公知の具体的なBLP-2類似体としては、AlaをGlyで置換することによりDPP-IV耐性を付与するように位置2で改変されたラットまたはヒトGLP-2が挙げられる。

本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、オキシントモジュリン（OXM）ペプチドホルモンも挙げられる。天然OXMペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意の公知OXMペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野において公知の任意のOXMペプチド類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、OXMペプチド類似体および誘導体は、天然OXMペプチドの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、これらのOXMペプチド類似体は、天然OXMペプチドが特異的に結合できる受容体の作動薬である。

本発明において有用な成分ペプチドホルモンとしては、エキセンジンペプチドホルモンも挙げられる。天然エキセンジンペプチドホルモンは、当該技術分野では公知であり、機能的ペプチド類似体および誘導体も公知である。一定の好ましい天然ペプチド、ペプチド類似体および誘導体を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知のホルモン活性を示す任意の公知エキセンジンペプチドを本発明と併用できることは理解されるはずである。

当該技術分野において公知の任意のエキセンジンペプチド類似体または誘導体を本発明と併用することができる。一つの実施形態において、エキセンジンペプチド類似体および誘導体は、天然エキセンジンペプチドの少なくとも一つのホルモン活性を有する。一定の実施形態において、エキセンジンペプチド類似体は、天然エキセンジンペプチドが特異的に結合できる受容体の作動薬である。

例示的エキセンジン類似体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたエキセンジン類似体は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。

追加の例示的エキセンジン類似体および誘導体は、1997年8月8日出願の米国特許仮出願番号60/055,404の利益を請求する、1998年8月6日出願の「Novel Exendin Agonist Compounds」と題するPCT出願番号PCT/US98/16387に記載されており、前記両出願は、参照により本明細書に取り入れられている。他のエキセンジン類似体および誘導体は、1997年11月14日出願の米国特許仮出願番号60/065,442の利益を請求する、1998年11月13日出願の、「Novel Exendin Agonist Compounds」と題するPCT出願番号PCT/US98/24210に記載されており、前記両出願は、参照により本明細書に取り入れられている。さらに他のエキセンジン類似体および誘導体は、1997年11月14日出願の米国特許仮出願番号60/066,029の利益を請求する、1998年11月13日出願の「Novel Exendin Agonist Compounds」と題するPCT出願番号PCT/US98/24273に記載されており、前記両出願は、参照により本明細書に取り入れられている。さらに他のエキセンジン類似体および誘導体は、1996年8月8日出願の米国特許仮出願番号08/694,954の一部係属出願である、1997年8月8日出願の「Methods for Regulating Gastrointestinal Activity」と題するPCT出願番号PCT/US97/14199に記載されており、前記両出願は、参照により本明細書に取り入れられている。さらに他のエキセンジン類似体および誘導体は、1997年1月7日出願の米国特許仮出願番号60/034,905への優先権を主張する、1998年1月7日出願の「Use of Exendins and Agonists Thereof for the Reduction of Food Intake」と題するPCT出願番号PCT/US98/00449に記載されており、前記両出願は、参照により本明細書に取り入れられている。さらに他のエキセンジン類似体および誘導体は、2003年12月19日出願の「Compositions for the Treatment and Prevention of Neuropathy」と題するUS 2004/0209803 A1に記載されており、前記公開出願は、参照により本明細書に取り入れられている。

ナトリウム利尿ペプチド
ナトリウム利尿ペプチドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳ナトリウム利尿ペプチド（BNP）およびC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）から成るホルモンのファミリーである。これらを、126アミノ酸ANP、108アミノ酸BNPおよび104アミノ酸CNPである3つの別個の前駆体プロホルモンとして合成し、保管する。これらは、各々、別の遺伝子によってコードされ、別個の合成部位および調節メカニズムを有する。親ナトリウム利尿ペプチド配列としては、次のものが挙げられる：

ANPプロホルモンの主合成部位は、心房筋細胞であり、151-アミノ酸プレプロホルモンとして合成される。そのN末端先端部からの25-アミノ酸シグナルペプチドの除去が小胞体内で発生し、その結果、126-アミノ酸ANPプロホルモン（ProANP）、心臓内での主貯蔵形が残る。このプロホルモンは、4つの生物学的活性ペプチドセグメント：アミノ酸1-30（ProANF 1-30、長期作用性Na刺激因子としても知られている）、31-67（ProANF 31-67、血管拡張因子としても知られている）、79-98（ProANF 79-98、カリウム排泄因子としても知られている）および99-126（ANF、心房性ナトリウム利尿因子としても知られている）から成る。

BNPは、当初、ブタの脳から単離されたが、ヒトにおいても合成され、左心室から分泌される。配列分析は、プレプロBNPが、134の残基から成り、切断されて108-アミノ酸ProBNPになることを示している。ProBNP残基のC末端先端部からの32-アミノ酸配列の切断によりヒトBNP(77-108)が得られ、これは、血漿中で生理活性形態である。

CNPは、ナトリウム利尿ペプチド系の第三のメンバーであり、ヒトの血管内皮細胞、腎臓およびブタの脳において主として見出される。ヒトの視床下部および中脳においても高濃度のCNPが見出される。ヒトにおいて、プレプロCNPは、そのN末端先端部からの23の残基の切断によりプロCNPにプロセッシングされた126-アミノ酸前駆体である。この23-アミノ酸配列は、シグナルペプチドとしての役割を果す。プロCNPから末端の22(105-126)のアミノ酸が切断されて、CNPの生物学的活性形態が生じる。

ウロジラチンは、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの腎臓由来メンバーであり、同じANPプロホルモンから形成され、アミノ酸95-126から成る。4アミノ酸N末端延長部を除き、ANF(99-126)と同じである。ウロジラチンは、腎臓におけるナトリウムおよび水処理の重要な調節因子、ならびにうっ血性心不全（CHF）の患者におけるナトリウム排泄の媒介因子であるようである。

ナトリウム利尿ペプチドは、ターゲット細胞の表面上の高親和性受容体に結合することにより、それらの生物学的効果を発揮する。NPRの三つのサブタイプ−NPR-A、NPR-BおよびNPRC−が、単離されている。従って、一つの実施形態において、ナトリウム利尿受容体結合および／または活性化についてハイブリッドをスクリーニングする方法を提供する。プロホルモン変異体を含むナトリウム利尿ペプチドは、本発明のハイブリッドに非常に多くのナトリウム利尿ペプチドホルモン活性を付与することができる。他の実施形態では、ナトリウム利尿拮抗薬ハイブリッドが興味深い。ナトリウム利尿は、過剰に多い量のナトリウムの尿への排泄である。ナトリウム利尿は、利尿（非常に大量の尿の排泄）と同様であるが、ナトリウム利尿ではその尿の塩分が非常に高い。ナトリウム利尿は、一部の利尿薬および疾病（副腎の疾病など）に伴って発生し、脱水、嘔吐、低血圧、および突然死のリスクを特徴とする塩類消失性症候群をもたらすことがある。ANPプロホルモンの4つの独立した循環性ペプチド（1-30、31-67、79-98および99-126）の外因性投与は、インビボ血管拡張、利尿、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の抑制、ならびにナトリウム利尿および／またはカリウム尿増進を生じさせる。プロANF 1-30、プロANF 31-67およびANF 99-126は、各々、ナトリウム利尿特性、血圧降下特性および利尿特性を有し、プロANF 31-67およびANF 99-126は、血圧に対して最大の影響を及ぼす。カリウム恒常性に対するANPペプチドの効果は様々である：プロANF 79-98は、カリウム排泄を刺激し、これに対してプロANF 31-67は、髄質部集合管細胞におけるNa/K ATPアーゼを阻害することによりカリウム喪失を控える。アンギオテンシンII-媒介アルドステロン分泌の用量依存性阻害は、NAF 99-126に特異的であり、これに対してプロANF 31-67は、プロスタグランジンの生成によりナトリウム利尿を誘導する特性を有する。

BNPは、正常なヒトでは、ANFと同様の生物学的効果を生じさせる。正常な人間におけるBNPの注入は、ナトリウム排泄の2倍増加、血漿レニン、アンギオテンシンIIおよびアルドステロン分泌の50%減少、ならびに血漿容量の減少を生じさせる。

CNPは、他のナトリウム利尿ペプチドと同様の心血管効果を誘導するが、腎性作用は一切媒介しないようである。麻酔したイヌにANFと等価の用量でCNFを注入すると、平均動脈圧、右心房圧および心送血量の相伴う低下に伴って血漿ｃGMPが上昇するが、糸球体濾過率、腎血流およびナトリウム排泄は減少する。

ナトリウム利尿ペプチドは、心不全の際に治療的利益をもたらすことができる。うっ血性心不全（CHF）は、バソプレッシン、エンドセリンの増加と、血管収縮、ナトリウムおよび水貯留ならびに血管および心臓のネガティブ・リモデリングを媒介する、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系および副交感神経系の活性化とを随伴する。これらの作用は、心不全の患者における高いナトリウム利尿ペプチドレベルにもかかわらず発生する。本発明の一つの実施形態におけるハイブリッドは、CHFを含む心臓関連疾患および状態の治療または予防のために、増加したまたは治療的血清レベルのナトリウム利尿ペプチド活性をもたらすハイブリッドである。ANF注入は、正常な個体ではナトリウム排泄および尿流量の持続的増加を生じさせることがあるが、心不全患者では腎臓応答の顕著で有益な低下を達成することができる。BNP注入は、心不全の患者ではナトリウム排泄を顕著に増加させ、有意で有益な血行力学的効果を発揮する。ANPと比較すると、BNPの利尿およびナトリウム利尿効果のほうが有意に大きい。BNPは、ANPよりゆっくりと除去され、ならびにアルドステロン分泌の抑制および血清ANPレベルの増加をはじめとする他の効果を発揮する。BNPペプチドは、肺毛細管楔入圧、全身血管抵抗、右心房圧の有益な低減と共に、症候性CHFのために入院している患者の心係数の増加をもたらすこともできる。非代償性心不全の患者において、ナトリウム利尿ペプチドハイブリッドは、肺毛細管楔入圧の有益な減少、および改善された呼吸困難スコアをもたらすことができる。（呼吸困難は、呼吸が困難である不快感であり、一般には心不全の早期に随伴する）。一つ、二つまたは三つのナトリウム利尿ホルモン機能を有するハイブリッドは、CHF患者、好ましくは、代償不全のCHF患者、慢性CHFの患者、および高血圧の患者の予防的処置および治療的処置の両方に有用である医薬活性組成物の投与方法をもたらす。ハイブリッドのナトリウム利尿部分（単数または複数）は、治療に有効な期間にわたって治療に有効な用量で投与されたとき、そうした患者に治療に有効な量のナトリウム利尿ペプチドを供給するために十分なものである。

本明細書において論じる任意のファミリーの治療有効ナトリウム利尿ペプチドまたはそれらの類似体を使用することができる。有用なナトリウム利尿ペプチドとしては、例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳ナトリウム利尿ペプチド（BNPまたはB型ナトリウム利尿ペプチド）およびC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）が挙げられる。有用な形態のナトリウム利尿ペプチドの配列は、米国特許公開第20010027181号（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に開示されている。ANPの例としては、ヒトANP（Kangawa et al., BBRC 118:131 (1984)）、またはブタおよびラットANPをはじめとする様々な種からのもの（Kangawa et al., BBRC 121:585 (1984)）が挙げられる。こうしたANPは、28のアミノ酸を含む。こうしたANPは、ANPの環構造（Cysに基づくジスルフィド結合の形成）およびその環構造に続くC末端部分を有するペプチドとして投与することができる。こうしたペプチドの一例は、ANPの7位から28位にアミノ酸残基を有するペプチドであり、米国特許出願公開第20010027181号に提供されている。別の例は、カエルANPである。本発明の方法において使用することができるBNPの具体例としては、ヒトBNP（hBNP）が挙げられる。ヒトBNPは、32のアミノ酸を含み、ジスルフィド結合の形成を伴う（Sudoh et al., BBRC 159:1420 (1989)、ならびに米国特許第5,114,923号、同第5,674,710号、同第5,674,710号および同第5,948,761号；これらの各々が、参照により本明細書に取り入れられている）。ブタBNPおよびラットBNPをはじめとする、ヒト以外の起源の様々なBNPも公知であり、使用することができる。さらなる例は、ニワトリBNPである。本発明の方法において使用することができるCNPの例としては、ブタCNPが挙げられる。ブタCNPは、22のアミノ酸を含み、上で説明したANPおよびBNP（Sudoh et al., BBRC 168:863 (1990)）（ヒトおよびラットは、同じアミノ酸配列を有する）、ニワトリCNP（Arimura et al., BBRC 174:142 (1991)）のようなジスルフィド結合の形成を伴う。カエルCNP（Yoshihara et al., BBRC 173:591 (1990)）を使用することもできる。本明細書において論じるように、当業者は、説明したような公知ナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基に、公知の方法により、修飾、例えば、欠失、置換、付加もしくは挿入、および／または化学的修飾を適用することができる。結果として生じる化合物は、出発ANP、BNPまたはCNPの受容体に対して作用する活性を有する化合物である。従って、この活性を有する類似体は、本発明の方法に従って使用するためのハイブリッドに含まれる。

別の実施形態において、一つ以上のナトリウム利尿機能を有するハイブリッドを高血圧の治療に用いることができる。一つの実施形態において、ナトリウム利尿ハイブリッドは、心拍数に対して有害な影響を及ぼさす、不整脈を随伴しない。一つの実施形態において、ハイブリッドは、二つまたは三つのナトリウム利尿ペプチド機能、例えば、ANP活性とBNP活性との両方を含むであろう。一つ以上のナトリウム利尿ホルモン機能を任意の他のホルモン機能、または本明細書で説明するようなペプチドエンハンサーと併用することができる。別の実施形態において、前記ナトリウム利尿部分（単数または複数）は、天然ナトリウム利尿ペプチドのものと比較したとき、延長されたインビボ半減期を有する、より安定な類似体である。NEPなどの内因性酵素による望ましくない切断を防止する類似体も考えられる。ナトリウム利尿因子含有ハイブリッドは、さらに、高血圧降下、利尿誘導、ナトリウム利尿誘導、血管伝導拡張または弛緩、ナトリウム利尿ペプチド受容体（例えば、NPR-A）結合、腎臓からのレニン分泌の抑制、副腎からのアルドステロン分泌の抑制、心血管疾患および心血管障害の治療、うっ血性心不全における心臓リモデリングの低減、停止または逆行、腎疾患および腎障害の治療、虚血性発作の治療または予防、ならびに喘息の治療にも関する。ナトリウム利尿、利尿および血管拡張の誘導から利益を受けるであろう患者にハイブリッドを投与することができる。ハイブリッドは、単独で投与することができ、または次のタイプの化合物のうちの一つ以上と併用で投与することもできる：ACE阻害剤、ベータ−遮断薬、利尿薬、スピロノラクトン、ジゴキシン、抗凝結薬、抗血小板物質、およびアンギオテンシン受容体遮断薬。追加の疾患または状態としては、腎障害、腎疾患、喘息、高血圧および肺高血圧が挙げられる。ハイブリッドは、炎症に関連した疾患、勃起機能不全および抗コレステロール血症の治療にも有用である。
生物活性ペプチドホルモンモジュール

本明細書において論じるような本発明のハイブリッドポリペプチドは、一般に、互いに共有結合で連結された少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含む。これらの生物活性ペプチドホルモンモジュールは、(a)天然成分ペプチドホルモン、(b)ホルモン活性を保持する天然成分ペプチドホルモンの類似体もしくは誘導体、(c)ホルモン活性を保持する天然成分ペプチドホルモンのフラグメント、(d)ホルモン活性を保持する天然成分ペプチドホルモンの類似体もしくは誘導体のフラグメント、(e)ハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合および／もしくは他の薬物動態特性を付与する天然成分ペプチドホルモンの構造モチーフ、または(f)ハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合および／もしくは他の薬物動態特性を付与する天然成分ペプチドホルモンの類似体もしくは誘導体の構造モチーフであり得る。(e)および(f)の構造モチーフを、本明細書では、総称して「ペプチドエンハンサー」と呼ぶことにする。

好ましい生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK(1-33)、CCK-8、レプチン、PYY(1-36)（配列番号：57）、PYY(3-36) （配列番号：58）、GLP-1(1-37) （配列番号：59）、GLP-1(7-37) （配列番号：204）、GLP-1(7-36) （配列番号：61）、GLP-2、OXM、エキセンジン-3、エキセンジン-4、ナトリウム利尿ペプチドホルモン、ウロコルチンファミリーペプチド、例えば、Ucn‐2およびUcn‐3、ニューロメジンファミリーペプチド、例えば、ニューロメジンU25またはスプライス変異体、ならびにANP、BNP、CNPまたはウロジラチンから選択される天然ペプチドホルモンが挙げられる。

他の好ましい生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK、レプチン、PYY(1-36)（配列番号：57）、PYY(3-36)（配列番号：58）、GLP-1(1-37)（配列番号：59）、GLP-1(7-37)（配列番号：204）、GLP-1(7-36)（配列番号：61）、GLP-2、OXM、エキセンジン-3、およびエキセンジン-4、ナトリウム利尿ペプチドホルモン、ウロコルチンファミリーペプチド、例えば、Ucn-2およびUcn-3、ニューロメジンファミリーペプチド、例えば、ニューロメジンU25またはスプライス変異体、ならびにANP、BNP、CNPまたはウロジラチンから選択される成分ペプチドホルモンの類似体および誘導体が挙げられ、類似体または誘導体は、その成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す。類似体は、成分ペプチドホルモンのアミノ酸配列の一つ以上の挿入、欠失または置換を含むことがあり、ならびに誘導体は、本明細書においてさらに十分に説明するおよび当該技術分野において公知であるような、類似体または成分ペプチドホルモンのアミノ酸残基の一つ以上の化学的修飾を含むことがある。

さらに具体的には、類似体および誘導体は、上で説明したおよび／または当該技術分野において公知のいずれかから選択することができる。本発明の生物活性ペプチドホルモンモジュールとして有用な少なくとも一つのホルモン活性を示す、特に好ましい類似体および誘導体としては、次のものが挙げられる：

当該技術分野では公知であるように、こうしたペプチド化合物は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。

さらに他の好ましい生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK、レプチン、PYY(1-36)（配列番号：57）、PYY(3-36)（配列番号：58）、GLP-1(1-37)（配列番号：59）、GLP-1(7-37)（配列番号：204）、GLP-1(7-36)（配列番号：61）、GLP-2、OXM、ナトリウム利尿ペプチド、エキセンジン-3、およびエキセンジン-4、ウロコルチンファミリーペプチド、例えば、Ucn-2およびUcn‐3、ニューロメジンファミリーペプチド、例えば、ニューロメジンU25またはスプライス変異体、ならびにANP、BNP、CNPまたはウロジラチンから選択される成分ペプチドホルモンのフラグメントが挙げられ、フラグメントは、その成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す。

さらに他の好ましい生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、アミリン、ADM、CT、CGRP、インテルメジン、CCK、レプチン、PYY(1-36)（配列番号：57）、PYY(3-36)（配列番号：58）、GLP-1(1-37)（配列番号：59）、GLP-1(7-37)（配列番号：204）、GLP-1(7-36)（配列番号：61）、GLP-2、OXM、ANP、BNP、CNP、ウロジラチン、エキセンジン-3、エキセンジン-4、ナトリウム利尿ペプチドホルモン、ウロコルチンファミリーペプチド、例えば、Ucn-2およびUcn-3、ニューロメジンファミリーペプチド、例えば、ニューロメジンU25またはスプライス変異体、ならびにANP、BNP、CNPから選択される成分ペプチドホルモンの類似体または誘導体のフラグメントが挙げられ、フラグメントは、成分ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を示す。重ねて、類似体は、成分ペプチドホルモンのアミノ酸配列の一つ以上の挿入、欠失または置換を含むことがあり、ならびに誘導体は、本明細書においてさらに十分に説明するおよび当該技術分野において公知であるような、類似体または成分ペプチドホルモンのアミノ酸残基の一つ以上の化学的修飾を含むことがある。

少なくともホルモン活性を示す一定の好ましいフラグメントとしては、以下のものが挙げられる。しかし、下に記載する好ましいフラグメントを含む当該技術分野において公知のフラグメントを伴う上記類似体および誘導体の組み合わせが考えられることは理解されるはずである。

重ねて、当該技術分野では公知であるように、こうしたペプチド化合物は、好ましくはアミド化されているが、本発明に関連して、特に別に示さなければ、場合によってはその酸形態であってもよい。さらに、上の好ましいフラグメントを、本明細書において論じるまたは当該技術分野において公知である類似体または誘導体のいずれかと組み合わせることもできる。例えば、好ましい類似体フラグメントとしては、⁵Ala,¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：240）、¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-27)（配列番号：241）、⁵Ala,¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：240）、¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-27)（配列番号：241）、本開示フラグメント、類似体および誘導体の任意の他の組み合わせを挙げることができる。

さらに他の好ましい生物活性ペプチドモジュールとしては、「ペプチドエンハンサー」、すなわち、ハイブリッドポリペプチドに所望の化学的安定性、配座安定性、代謝安定性、バイオアベイラビリティ、器官／組織ターゲティング、受容体相互作用、プロテアーゼ阻害、血漿タンパク質結合および／または他の薬物動態特性を付与する成分ペプチドホルモン（それらの類似体および誘導体を含む）の構造モチーフが挙げられる。例示的ペプチドエンハンサーとしては、以下のものが挙げられる。重ねて、以下の生物活性ペプチドモジュールを伴う上記類似体および誘導体の組み合わせが考えられることは理解されるはずである。例えば、当該技術分野において公知であるおよび／または上で説明したアミリンファミリーペプチドホルモン類似体および誘導体の最後の六つのアミノ酸残基も、好ましい生物活性ペプチドモジュールと考えられる。

ペプチドモジュール選択の考察、スペーサーおよび連結基

本発明のハイブリッドポリペプチドは、一般に、本発明の少なくとも二つの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含み、ペプチドホルモンモジュールのうちの少なくとも一つは、少なくとも一つのホルモン活性を示す。少なくとも一つのホルモン活性を示す生物活性ペプチドホルモンモジュールは、ハイブリッドポリペプチドのN末端先端部、またはハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置されていてよく、またはハイブリッドポリペプチドが二つより多くの生物活性ペプチドホルモンモジュールを含む場合には、ハイブリッドポリペプチドの内部に配置されていてよい。

一定の実施形態では、少なくとも一つのホルモン活性を示す生物活性ペプチドホルモンモジュールを、生物活性ペプチドホルモンモジュールのC末端先端部がアミド化されるように配置することが好ましい場合がある。生物活性ペプチドホルモンモジュールのC末端先端部のアミド化は、ハイブリッドペプチドのC末端先端部にそのモジュールを配置することにより、またはハイブリッドポリペプチドのN末端に、C末端からN末端の配向でそのモジュールを配列することにより果すことができる。両方の配置で、生物活性ペプチドホルモンモジュールのC末端先端部は、アミド化に利用できる。C末端アミド化が好適であり得る場合の具体的な成分ペプチドホルモンとしては、アミリンファミリーペプチドホルモン、CCK、PYY、hGLP-1(7-36)（配列番号：61）およびhGLP-2が挙げられる。C末端アミド化が必ずしも好ましくない（別様に述べると、モジュールのC末端での伸長が容易に許容されない場合）具体的な成分ペプチドホルモンとしては、エキセンジン-4、エキセンジン-4(1-28)（配列番号：237）、GLP-1(7-37)（配列番号：204）、カエルGLP-1(7-36)（配列番号：283）およびカエルGLP-2が挙げられる。しかし、これらの成分ペプチドホルモンをハイブリッドポリペプチドのC末端に配置すると、場合によっては、それらを、尚、アミド化することができ、実際、好ましくは、場合によってはアミド化することができる。

生物活性ペプチドホルモンモジュールは、当該技術分野において公知の任意の様式で共有結合により連結させることができる。適する連結を用いることができ、または切断可能な連結を用いることができる。一つの実施形態では、第一モジュールのカルボキシを第二モジュールのアミノに直接連結させることができる。別の実施形態では、連結基を用いてモジュールに取り付けることができる。さらに、所望される場合には、当該技術分野において公知のスペーサーまたはターン誘導因子を利用して連結を安定させることができる。例として、N末端に配置された生物活性ペプチドホルモンモジュールのC末端先端部のアミド化が望ましくない場合、そのモジュールを第二モジュールに直接、または当該技術分野において公知の任意の適切な連結基、例えば、アルキル；PEG；アミノ酸、例えば、Lys、Glu、β-Ala；ポリアミノ酸、例えば、ポリ-his、ポリ-arg、ポリ-lys、ポリ-ala、Gly-Lys-Arg(GKR)など；二官能性リンカー（例えば、Pierce catalog, Rockford, Il参照）；アミノカプロイル（「Aca」）、β-アラニル、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイル、または当該技術分野において公知の他の切断可能および切断不能リンカーを使用して取り付けることができる。各々が明確に書かれているかのように、本明細書に具体的に記載するのは、各々の例示するリンカー含有ハイブリッド内のリンカーがGlyリンカーよって置換されている特定のハイブリッドの実施形態、特に、GlyリンカーがGly-Gly-Glyである実施形態である。一例として、例示種²⁹5 Apa-エキセンジン(1-28)-¹des-Lys-hアミリン(1-7)-^11,18Arg-sCt(8-27)-hアミリン(33-37)（配列番号：32）（本明細書中の表を参照のこと）について、そのGlyリンカーの種類似体も具体的に指定し開示する。この種は、²⁹GlyGlyGly-エキセンジン(1-28)-¹des-Lys-hアミリン(1-7)-^11,18Arg-sCt(8-27)-hアミリン(33-37)（配列番号：313）であり、この場合、三つのグリシンは、エキセンジン(1-28)配列の後に配置する。一つの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、残基数1から30の長さであり、別の実施形態では残基数2から30、さらに別の実施形態では、残基数3-30の長さ、および2から30の任意の整数（2と30とを含み、各整数単位、例えば、2、3、4、5、6、7などが考えられる）の長さである。一つの実施形態では、Glyリンカーを使用し、特定の実施形態では、三残基リンカーGly-Gly-Glyを使用する。

N末端に配置された生物活性ペプチドホルモンモジュールのC末端先端部のアミド化が望まれる場合、そのモジュールもまた、当該技術分野において公知の任意の適切な連結基を使用して第二モジュールに連結させることができる。さらに具体的には、少なくとも一つのホルモン活性を示す生物活性ペプチドホルモンモジュールを、C末端からN末端の配向で配列し、アミノ−アミノ連結が生じさせる場合、好ましい連結基としては、ジカルボン酸、アルキル、PEG、ならびにアミノ酸、例えばLys、CysおよびGluが挙げられる。

上で述べたように、ハイブリッドポリペプチドは、好ましくは、生物活性ペプチドホルモンモジュールの連結をさらに安定させるためのスペーサーを含むことができる。当該技術分野において公知の任意のスペーサーまたはターン誘導因子を使用することができる。例として、好ましいβ-ターン模倣体としては、下に図示する模倣体Aおよび模倣体Bが挙げられ、Ala-AibおよびAla-Proジペプチドも挙げられる。それらのIUPAC名は、模倣体A： N-(3S,6S,9S)-2-オキソ-3-アミノ-1-アザビシクロ[4.3.0]-ノナン-9-カルボン酸であり、模倣体B： N-(3S,6S,9R)-2-オキソ-3-アミノ-7-チア-1-アザビシクロ[4.3.0]-ノナン-9-カルボン酸である。

さらなる例示的組み合わせおよび具体的な実施形態

本発明のハイブリッドポリペプチドを形成するための生物活性ペプチドホルモンモジュールの例示的組み合わせとしては、天然ペプチドホルモン、少なくとも一つのホルモン活性を示すペプチドホルモンの類似体および誘導体、少なくとも一つのホルモン活性を示す天然ペプチドホルモンのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すペプチドホルモンの類似体および誘導体のフラグメント、ならびにペプチドエンハンサーから選択される二つ以上の生物活性ペプチドホルモンモジュールの組み合わせが挙げられるが、但し、少なくとも一つのモジュールが少なくともホルモン活性を示すことを条件とする。

本発明のハイブリッドポリペプチドは、各モジュールが成分ペプチドホルモンから構成される、少なくとも二つ生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むであろう。本発明に関連して、本ハイブリッドポリペプチドの成分ペプチドホルモンは、同じである場合もあり、または異なる場合もあるが、但し、それらの成分ペプチドホルモンのうちの少なくとも二つが異なることを条件とする。好ましい実施形態において、成分ペプチドホルモンの少なくとも二つは、異なるペプチドホルモンファミリー、例えば、アミリンファミリー、CCK、レプチンファミリー、PPF、プログルカゴンファミリー、ナトリウム利尿ペプチドファミリー、ウロコルチンファミリーペプチド、例えばUcn-2およびUcn-3、ニューロメジンファミリーペプチド、例えばニューロメジンU25またはスプライス変異体、ならびにANP、BNP、CNPまたはウロジラチン、ならびにGLP-1およびエキセンジンファミリーからのものである。

一定の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも一つのホルモン活性を示す二つ以上のモジュールを含むことがある。例えば、ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも一つの追加のペプチドホルモン類似体のフラグメントに共有結合で連結された、少なくともホルモン活性を示す第一ペプチドホルモンまたは類似体のフラグメントを含むことがある。追加のフラグメント（単数または複数）は、場合によっては少なくとも一つのホルモン活性を示すことがある。第一ペプチドホルモンは、追加のペプチドホルモン（単数または複数）と同じである場合もあり、または異なる場合もあるが、但し、それらの追加のペプチドホルモンのうちの少なくとも一つが、その第一ホルモンと異なることを条件とし、ならびに第一ホルモン活性は、任意選択の追加のホルモン活性と同じである場合もあり、または異なる場合もある。

他の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも一つのホルモン活性を示す一つ以上のモジュールを、一つ以上のペプチドエンハンサーモジュールとの組み合わせで含むことがある。例えば、少なくとも一つのホルモン活性を示す第一ペプチドホルモンのフラグメントをペプチドエンハンサーに共有結合で連結させることができ、または少なくとも一つのホルモン活性を示す第一ペプチドホルモンのフラグメントを、少なくとも一つのホルモン活性を示す第二ペプチドホルモンに共有結合で連結させることができ、そしてまたそれをペプチドエンハンサーに連結させる。あるいは、ペプチドエンハンサーを二つのペプチドホルモンの間に安定化スペーサーとして配置することができる。重ねて、第一ペプチドホルモンは、第二ペプチドホルモンと同じである場合もあり、または異なる場合もあり、ならびに第一ホルモン活性は、第二ホルモン活性と同じである場合もあり、または異なる場合もある。

別の実施形態において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、二つ、三つ、四つまたはそれ以上の生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むことがある。例示的組み合わせとしては、一つ、二つまたは三つのペプチドエンハンサーとの組み合わせでの、ホルモン活性を有する一つのモジュール；一つまたは二つのペプチドエンハンサーとの組み合わせでの、ホルモン活性を有する二つのモジュール；一つのペプチドエンハンサーとの組み合わせでの、ホルモン活性を有する三つのモジュールなどが挙げられる。

成分ペプチドホルモンは、好ましくは、アミリン、アドレノメジュリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、インテルメジン、コレシストキニン、レプチンペプチドYY、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、オキシントモジュリン、ANP、BNP、CNP、ウロジラチン、ナトリウム利尿ペプチドホルモン、ウロコルチンファミリーペプチド、例えばUcn-2およびUcn-3、ニューロメジンファミリーペプチド、例えばニューロメジンU25またはスプライス変異体、ならびにANP、BNP、CNPまたはウロジラチンまたはエキセンジン-4から選択される。

さらに詳細には、好ましいモジュールとしては、成分ペプチドホルモンとしてエキセンジン、アミリン（および／またはsCT）、BNPおよびPYYの組み合わせを含むものが挙げられる。特定の組み合わせとしては、スペーサーまたは連結基を伴うまたは伴わない、エキセンジン-4/PYYおよびPYY/エキセンジン-4の組み合わせが挙げられる。他の組み合わせとしては、スペーサーまたは連結基を伴うまたは伴わない、エキセンジン／アミリンおよびアミリン／エキセンジンの組み合わせが挙げられる。さらに他の組み合わせとしては、スペーサーまたは連結基を伴うまたは伴わない、アミリン/PYYおよび／アミリン/PYYの組み合わせが挙げられる。

一つの態様において、好ましいモジュールの組み合わせとしては、エキセンジン-4、少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4のフラグメント、少なくともホルモン活性を示すエキセンジン-4類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4類似体のフラグメントを含む第一モジュールを、少なくとも一つの追加の生物活性ペプチドホルモンモジュールとの組み合わせで含むものである。一つの実施形態では、第一モジュールを、一つ、二つまたは三つの追加の生物活性ペプチドホルモンモジュールに連結させる。

好ましい実施形態では、エキセンジン-4ペプチドを含む第一モジュールを、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリン（および／またはsCT）ペプチドを含む第二生物活性ペプチドホルモンモジュールに連結させる。別の実施形態では、第二モジュールを、少なくとも一つのホルモン活性を示すカルシトニンペプチドを含む第三生物活性ペプチドホルモンモジュールにさらに連結させる。さらに別の実施形態では、第三モジュールを、アミリンペプチドから選択されるぺプチドエンハンサーを含む第四生物活性ペプチドホルモンモジュールにさらに連結させることができる。一つの実施形態において、第一モジュールは、ハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置することができる。あるいは、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置することができる。一定に実施形態では、所望される場合、βAlaなどのスペーサーまたはリンカーを挿入して、モジュールを連結させることができる。

好ましいエキセンジン-4ペプチドとしては、エキセンジン-4、エキセンジン-4(1-27)（配列番号：236）、エキセンジン-4(1-28)（配列番号：237）、¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：284）、および⁵Ala,¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：240）が挙げられる。エキセンジン(7-15)およびそのSer2類似体、HSEGTFTSD（配列番号：378）も有用である。少なくとも一つのホルモン活性を示す好ましいアミリンペプチドとしては、アミリン、アミリンフラグメント、例えば、アミリン(1-17)（配列番号：214）、アミリン (1-16)（配列番号：215）、アミリン(1-15)（配列番号：216）、およびアミリン(1-7)（配列番号：217）、ならびにアミリン類似体、例えば、プラムリンチド、²Ala-h-アミリン（配列番号：79）、^2,7Ala-h-アミリン（配列番号：80）、およびこれらのフラグメントが挙げられる。少なくとも一つのホルモン活性を示す好ましいカルシトニンペプチドとしては、sCT、sCTフラグメント、例えば、sCT(8-10)、sCT(8-27)（配列番号：288）、ならびにカルシトニン類似体、例えば、 ^11,18Arg-sCT（配列番号：108）、¹⁸Arg-sCT（配列番号：107）、¹⁴Glu,¹⁸Arg-sCT（配列番号：109）、¹⁴Glu,^11,18Arg-sCT（配列番号：110）およびこれらのフラグメントが挙げられる。好ましいアミリンペプチドエンハンサーとしては、アミリン(32-37)（配列番号：242）、アミリン(33-37)（配列番号：243）およびアミリン(34-37)（配列番号：244）ならびにこれらの類似体が挙げられる。本発明との関連で有用なアミリン-sCTの組み合わせとしては、PCT/US 2005/004631, Amylin Family Agonist,代理人ドケット番号18528.835（これは、参照により本明細書に取り入れられている）に開示されているものが挙げられる。本発明のハイブリッドの生成に特に有用なアミリン-sCTキメラは、化合物10（本明細書およびPCT/US 2005/004631に記載されている）ならびにそれらの類似体および誘導体である。

一つの態様において、好ましいモジュールの組み合わせとしては、エキセンジン-4、少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4のフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4類似体のフラグメントを含む第一モジュールを、ペプチドエンハンサーとの組み合わせで含むものが挙げられる。好ましいエキセンジン-4化合物としては、エキセンジン-4、エキセンジン-4(1-27) (SEQ ID NO: 236）、 エキセンジン-4(1-28) （配列番号：237）、¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：284）、および⁵Ala,¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：240）が挙げられる。好ましいペプチドエンハンサーとしては、PYY(25-36)（配列番号：257）、PYY(30-36)（配列番号：262）およびPYY(31-36)（配列番号：263）が挙げられる。一つの実施形態では、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置し、ペプチドエンハンサーをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置する。あるいは、第一モジュールを本ハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置することができ、ペプチドエンハンスをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置することができる。一定の実施形態では、所望される場合、βAlaなどのスペーサーまたはリンカーを挿入して、モジュールを連結させることができる。

別の態様において、好ましいモジュールの組み合わせとしては、エキセンジン-4、少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4のフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すエキセンジン-4類似体のフラグメントを含む第一モジュールを、CCK、少なくとも一つのホルモン活性を示すCCKのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すCCK類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すCCK類似体のフラグメントを含む第二モジュールとの組み合わせで含むものが挙げられる。重ねて、好ましいエキセンジン-4化合物としては、エキセンジン-4、エキセンジン-4(1-27)（配列番号：236）、エキセンジン-4(1-28)（配列番号：237）、¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：284）、⁵Ala,¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：240）、および¹⁴Leu-エキセンジン-4(1-28)（配列番号：190）が挙げられる。好ましいCCK化合物としては、CCK-8、およびCCK-8(Phe(CH₂SO₃))が挙げられる。一つの実施形態では、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置し、第二モジュールをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置する。あるいは、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置することができ、ペプチドエンハンスをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置することができる。一定の実施形態では、所望される場合、βAlaなどのスペーサーまたはリンカーを挿入して、モジュールを連結させることができる。

別の態様において、好ましいモジュールの組み合わせとしては、アミリン、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリンのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリン類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリン類似体のフラグメントを含む第一モジュールを、ペプチドエンハンサー、例えば、PYY(25-36)（配列番号：257）またはPYY(30-36)（配列番号：262）で構成されている第二モジュールとの組み合わせで含むものが挙げられる。一つの実施形態では、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置し、ペプチドエンハンサーをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置する。あるいは、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置することができ、ペプチドエンハンスをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置することができる。一定の実施形態では、所望される場合、βAlaなどのスペーサーまたはリンカーを挿入して、モジュールを連結させることができる。別の態様において、好ましいモジュールの組み合わせとしては、アミリン、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリンのフラグメント、少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリン類似体もしくは誘導体、または少なくとも一つのホルモン活性を示すアミリン類似体のフラグメントを含む第一モジュールを、ペプチドエンハンサー、例えば、PYY(25-36)（配列番号：257）またはPYY(30-36)で構成されている第二モジュールとの組み合わせで含むものが挙げられる。一つの実施形態では、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置し、ペプチドエンハンサーをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置する。あるいは、第一モジュールをハイブリッドポリペプチドのN末端先端部に配置することができ、ペプチドエンハンスをハイブリッドポリペプチドのC末端先端部に配置することができる。一定の実施形態では、所望される場合、βAlaなどのスペーサーまたはリンカーを挿入して、モジュールを連結させることができる。

他の好ましいモジュールの組み合わせとしては、三元性の組み合わせとして、エキセンジンおよびCCKまたはアミリン、カルシトニン、およびCCKの組み合わせを含むものが挙げられる。特定の組み合わせとしては、スペーサーまたはリンカーおよび連結基を伴う、および伴わない、エキセンジン／CCKおよびCCK／エキセンジンが挙げられる。他の組み合わせとしては、スペーサーまたはリンカーおよび連結基を伴う、および伴わない、CCK／アミリン／カルシトニンおよびCCK／アミリン／カルシトニン／アミリンが挙げられる。ハイブリッドポリペプチドの所望の特性に依存して、各モジュールは、独立して、ペプチドエンハンサーである場合もあり、またはホルモン活性を示す場合もある。一つの実施形態において、アミリン／カルシトニン／アミリンは、化合物10の場合などのアミリン／カルシトニン／アミリンのキメラとして供給される。

さらに他の好ましいモジュールの組み合わせとしては、三元性およびテトラ−ハイブリッド分子として、エキセンジン、アミリンおよびカルシトニンの組み合わせを含むものが挙げられる。例示的組み合わせとしては、スペーサーまたは連結基を伴う、および伴わない、エキセンジン／アミリン／カルシトニン；エキセンジン／アミリン／カルシトニン／アミリン；／アミリン／カルシトニン／エキセンジン；および／アミリン／カルシトニン／アミリン／エキセンジンの組み合わせが挙げられる。ハイブリッドポリペプチドの所望の特性に依存して、各モジュールは、独立して、ペプチドエンハンサーである場合もあり、またはホルモン活性を示す場合もある。一つの実施形態において、アミリン／カルシトニン／アミリンは、化合物10の場合などのアミリン／カルシトニン／アミリンのキメラとして供給される。

一つの実施形態において、少なくとも一つのホルモン活性を示す生物活性ペプチドホルモンモジュール（単数または複数）のうちの一つが、アミリンまたはその類似体もしくはフラグメントであり、第二生物活性ペプチドホルモンモジュールが、CCKを含むときには、好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、異なる成分ペプチドホルモンから選択された第三の生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むだろう。例示的第三生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、カルシトニン、さらに好ましくはサケカルシトニン、それらの類似体またはフラグメントが挙げられる。

別の実施形態において、少なくとも一つのホルモン活性を示す生物活性ペプチドホルモンモジュール（単数または複数）のうちの一つが、アミリンまたはその類似体もしくはフラグメントであり、第二生物活性ペプチドホルモンモジュールが、CTを含むときには、好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、異なる成分ペプチドホルモンから選択された第三の生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むだろう。例示的第三生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、エキセンジン−4、その類似体またはフラグメントが挙げられる。

さらに別の実施形態において、少なくとも一つのホルモン活性を示す生物活性ペプチドホルモンモジュール（単数または複数）のうちの一つが、GLP-1またはその類似体もしくはフラグメントであり、第二生物活性ペプチドホルモンモジュールが、エキセンジンフラグメントを含むペプチドエンハンサーであるときには、好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、第三の生物活性ペプチドホルモンモジュールを含むだろう。例示的第三生物活性ペプチドホルモンモジュールとしては、PYY（その類似体、誘導体およびフラグメントを含む）およびCCK（その類似体、誘導体およびフラグメントを含む）が挙げられる。

本明細書に記載する組み合わせの各々の中の、成分ペプチドホルモンへの言及は、それに関連した類似体、誘導体、フラグメントおよびペプチドエンハンサーを包含すると理解される。

好ましい態様において、本ハイブリッドポリペプチドとしては、次のものが挙げられる：

例示的エキセンジンおよびニューロメジンハイブリッドとしては、
エキセンジン-(1-28)-ベータ-Ala-ベータ-Ala-FN-38：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-ベータ-Ala-ベータ-Ala-FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN-NH2（配列番号：391）；
エキセンジン-(1-28)-ベータ-Ala-ベータ-Ala-ニューロメジン(U25)：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-ベータ-Ala-ベータ-Ala-FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRN-NH2（配列番号：392）；および
エキセンジン-(1-28)-ベータ-Ala-ベータ-Ala-ニューロメジン(U-9)：
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-ベータ-Ala-ベータ-Ala-GYFLFRPRN-NH2（配列番号：393）
が挙げられる。ベータ-Ala-ベータ-Alaスペーサーは、任意選択であり、Gly-Gly-Gly、ミニ-PEG基、または当該技術分野において公知の他のリンカー、特に本明細書に記載するもので置換することができる。

例示的エキセンジンおよびナトリウム利尿ペプチドハイブリッドとしては、
エキセンジン-(1-28)- ベータ-Ala-ベータ-Ala-hBNP:
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-ベータ-Ala-ベータ-Ala-SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH（配列番号：394）;および
エキセンジン-ベータ-Ala-ベータ-Ala-hBNP:
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-ベータ-Ala-ベータ-Ala-SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH（配列番号：395）
をはじめとする、エキセンジン-hBNPペプチドハイブリッドが挙げられる。

本発明のすべてのハイブリッドにおけるようなベータ-Ala-ベータ-Alaスペーサーは、任意選択であり、Gly-Gly-Gly、ミニ-PEG基、または当該技術分野において公知の他のリンカー、特に本明細書に記載するもので置換することができる。

本発明のハイブリッドポリペプチドは、そうしたハイブリッドポリペプチドのアミノ酸配列への置換、欠失および挿入ならびにそれらの組み合わせをはじめとする（しかし、これらに限定されない）さらなる修飾を含む場合もある。好ましい態様において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、「非必須」アミノ酸残基の一つ以上の修飾を含む。本発明に関連して、「非必須」アミノ酸残基は、ハイブリッドポリペプチドの成分ペプチドホルモン受容体作動薬活性を完全に破壊または実質的に減少させることなく改変、すなわち欠失または置換することができるフラグメント、例えば成分ペプチドホルモンフラグメントの天然ヒトアミノ酸配列内の残基である。

好ましい置換としては、保存アミノ酸置換が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖または生理化学的特性（例えば、静電的、水素結合の、等配電子の、疎水性の特徴）を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において公知である。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アルパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。

本発明は、ハイブリッドポリペプチドの誘導体にも関する。こうした誘導体としては、一つ以上の水溶性ポリマー分子、例えば、ポリエチレングリコール（「PEG」）もしくは様々な長さの脂肪酸鎖（例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイルなど）にコンジュゲートした、またはポリアミノ酸、例えばポリ-his、ポリ-arg、ポリ-lys、およびポリ-alaの付加によってコンジュゲートした、ハイブリッドポリペプチドが挙げられる。ハイブリッドポリペプチドへの修飾は、小分子置換基、例えば短いアルキルおよび拘束アルキル（例えば、分枝アルキル、環状アルキル、融合アルキル、アダマンチルアルキル）、および芳香族基も含むことがある。水溶性ポリマー分子は、好ましくは、約500から約20,000ダルトンの範囲にわたる分子量を有するであろう。

こうしたポリマー・コンジュゲーションおよび小分子置換基修飾は、ハイブリッドポリペプチドの配列内の、NもしくはC末端で、またはアミノ酸残基の側鎖で、一回行うことができる。あるいは、ハイブリッドポリペプチドに沿って多数の誘導体化部位が存在することもある。リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインで一つ以上のアミノ酸を置換することにより、追加の誘導体化部位を生じさせることができる。例えば、米国特許第5,824,784号および同第5,824,778号参照。好ましくは、ハイブリッドポリペプチドを一つ、二つまたは三つのポリマー分子にコンジュゲートすることができる。

水溶性ポリマー分子は、好ましくはアミノ、カルボキシルまたはチオール基に連結させ、ならびにNもしくはC末端によって、またはリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸もしくはシステインの側鎖で連結させることができる。あるいは、水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボン酸基と連結させることができる。好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドを、リシンアミノ酸上のイプシロンアミノ基により、一つ、二つまたは三つのPEG分子にコンジュゲートさせる。

本発明のハイブリッドポリペプチド誘導体は、一つ以上のアミノ酸残基への化学的改変を有するハイブリッドポリペプチドも含む。こうした化学的改変としては、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化が挙げられる。これらの化学的改変は、PPFハイブリッドポリペプチドの配列内の、NもしくはC末端で、またはアミノ酸残基の側鎖で行うことができる。一つの実施形態において、これらのペプチドのC末端は、遊離-OHまたは‐NH₂ 基を有することがある。別の実施形態において、N末端先端部は、イソブチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、n-ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基（イソキャップ）、オクタニル基、オクチルグリシン基（G(Oct））、または8-アミノオクタン酸基でキャップされていることがある。好ましい実施形態において、環化は、ジスルフィド架橋の形成によるものであり得る。あるいは、ハイブリッドポリペプチドに沿って多数の化学的改変部位が存在することがある。

さらなる実施形態において、本ハイブリッドは、WO 2005/077072に開示されているいずれのハイブリッドも含まない。従って、一つの実施形態において、新規ハイブリッドを特許請求する。別の実施形態において、本明細書に、WO 2005/077072に、または他のいずこかに開示されている任意のハイブリッドの、本明細書に開示するような新規使用も特許請求する。本発明のハイブリッドポリペプチドの例は、配列表に提供し、本明細書中の実施例セクションにおいてさらに論じる。
メタボリック状態または代謝異常の治療または予防におけるハイブリッドポリペプチドの使用

本発明のハイブリッドは、食事摂取量の減少、食欲の減少、カロリー摂取量の減少、満腹の誘導、栄養利用率の低下、体重減少を生じさせること、体組成への作用、身体のエネルギー内容またはエネルギー消費の改変、脂質プロフィールの改善（LDLコレステロールおよびトリグリセリドレベルの減少、ならびに／またはHDLコレステロールレベルの変更を含む）、胃腸運動性の遅速、胃内容排出の遅延、食後の血糖のエクスカージョンの減速、グルカゴン分泌の予防または抑制、および血圧の降下に有用であり得る。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、CLP1、アミリン、および／またはcST部分を含有する。

従って、一定の実施形態において、本発明のハイブリッドは、本発明の化合物の治療または予防有効量を被験者に投与することを含む、栄養利用率を低下させることにより緩和することができる状態または疾患の治療または予防に有用である。こうした状態および疾患としては、摂食障害、インスリン抵抗性、肥満、異常食後高血糖、あらゆる種類の糖尿病（I型、II型および妊娠糖性尿病を含む）、メタボリック症候群、ダンピング症候群、高血圧、脂質異常症、心血管疾患、高脂血症、睡眠時無呼吸症、癌、肺高血圧、胆嚢炎および変形性関節症が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、CLP1、アミリンおよび／またはsCT部分を含有する。

例示的なペプチドモジュールのペアリングとしては、心臓作用性／保護性ペプチド、例えば、ウロコルチンとGLP-1またはエキセンジン、ANP、BNPまたはCNPとCLP-1またはエキセンジン、およびウロコルチンとANP、BNPまたはCNPが挙げられる。こうしたハイブリッドは、心臓保護性であろうし、特に、急性または慢性CHF、虚血性再潅流、心筋梗塞をはじめとする本明細書に記載の関連疾患および状態に、ならびに抗高血圧性適応症およびアンギナを治療または予防するために有用な血管拡張に有用であろう。Ucn2および3は、本発明のハイブリッドにおいて特に有用である。

心血管の状態または心血管疾患の非限定的な例は、高血圧、心筋虚血、および心筋再潅流である。本発明の化合物は、卒中、癌（例えば、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌および大腸癌）、胆嚢疾患、睡眠時無呼吸症、受胎能低下、および変形性関節症をはじめとする肥満に随伴する他の状態（例えば、Lyznicki et al, Am. Fam. Phys. 63:2185, 2001参照）の治療または予防に有用である。他の実施形態では、本発明の化合物を使用して、美容的理由で体組成を変えること、身体的能力を強化すること、またはより脂肪の少ない肉源を生産することができる。ハイブリッドは、筋肉量を有意に減少させることなく脂肪を減少させる、従って、除脂肪体重を維持しながら望ましい体脂肪減少を生じさせることによる体組成の変更に有用である。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、GLP1、アミリンおよび／またはsCT部分を含有する。

別の一般的な態様では、本発明のハイブリッドを使用して、グレリンの分泌を抑制することができる。従って、本発明の化合物は、このメカニズムを利用して、グレリン関連疾患、例えば、プラダー・ウィリ症候群、すべての型の糖尿病およびその合併症、肥満、過食症、高脂血症、または栄養過剰に関連した他の疾患を治療または予防することができる。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、GLP1、アミリンおよび／またはsCT部分を含有する。

別の一般的な態様において、アミリンおよび／またはsCT部分を含有するハイブリッドは、バレット食道、胃食道逆流性疾患（GERD）およびそれらに関連した状態の治療または予防に有用であり得ることが今般認められている。そうした状態としては、胸焼け、口または肺への胃／腸内容物の逆流を伴う胸焼け、嚥下困難、咳、間欠性喘鳴および声帯炎症（GERDに関連した状態）、食道びらん、食道潰瘍、食道狭窄、バレット化正（正常食道上皮の異常上皮での置換）、バレット腺癌、および肺吸引を挙げることができるが、これらに限定されない。こうしたハイブリッドは、胃酸の抑制、胆汁酸の抑制および膵酵素の抑制などの抗分泌特性を有する。さらにこうしたハイブリッドは、胃保護効果を有することがあり、これがそれらをバレット食道および／またはGERDならびに本明細書に記載するような関連もしくは随伴状態の治療または予防の際に特に有用なものにする。

別の一般的な態様において、ハイブリッドは、さらに、膵炎、膵臓癌および胃炎の治療または予防に、特に、内視鏡的逆行性胆道膵管撮像（ERCP）を受けた患者における膵炎の治療および予防の際に有用である。アミリンおよび／またはsCT含有ハイブリッド作動薬は、ソマスタチンと併用したとき、驚くべき優れた治療効果を有することがある。従って、一定の実施形態において、膵炎の治療または予防方法は、被験者へのそうしたハイブリッドの投与ならびにソマスタチンおよびソマスタチン作動薬の投与を含む。

別の一般的な態様において、ハイブリッドは、骨吸収の減少、血漿カルシウムの減少、および鎮痛効果の誘導に有用であり、特に、オステオペニアおよび骨粗しょう症などの骨疾患の治療に有用である。さらに他の実施形態において、ハイブリッドは、疼痛および疼痛性神経障害の治療に有用である。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、GLP1、アミリンおよび／またはsCT部分を含有する。

本発明の別の態様において、肥満の治療または予防方法を提供し、この方法は、ハイブリッドポリペプチドの治療または予防有効量をその必要がある被験者に投与することを含む。好ましい実施形態において、被験者は、肥満または過体重被験者である。「肥満」は、一般に、３０を越えるボディーマス指数と定義されるが、本発明の目的のために、体重を減少させることを必要とするまたは望む、３０未満のボディーマス指数を有する被験者を含む任意の被験者を「肥満」の範囲に包含する。インスリン抵抗性、グルコース不耐性である、または任意の形態の糖尿病（例えば、1型、2型もしくは妊娠性糖尿病）を有する被験者は、これらのハイブリッドからの利益を受けることができる。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、PYY、GLP1、アミリンおよび／またはsCT部分を含有する。

さらに別の実施形態において、先ず被験者の体重を病的肥満であるレベルより下のレベルに減少させ、次に、被験者の体重をさらに減少させるために有効な量で抗肥満薬の配合剤をその被験者に投与することによる、病的肥満患者の体重を減少させる方法を提供する。被験者の体重を病的肥満のものより下に減少させるための方法としては、カロリー摂取量を減少させる方法、身体活動量を増加させる方法、薬物療法、肥満手術、例えば胃バイパス手術、または前述の方法の任意の組み合わせが挙げられる。一つの態様において、抗肥満薬の配合剤の投与は、被験者の体重をさらに減少させる。別の実施形態において、被験者の体重をさらに減少させるために有効な量の抗肥満薬の配合剤を投与することによる、４０以下のボディーマス指数を有する被験者においてボディーマス指数を減少させるための方法を提供する。

体重の減少とは、その治療コースが数日であろうと、数週間であろうと、数ヶ月であろうと、または数年であろうと、被験者が、その治療コースを通して彼／彼女の全体重の一部分を喪失することを意味する。あるいは、体重の減少とは、脂肪量の徐脂量に対する比率の減少と定義することができる（言い換えると、被験者は、対応する総合的体重減少を必ずしも有さず、脂肪量を喪失したが、除脂量を維持または増した）。この実施形態において併用で投与される抗肥満薬の有効量は、その治療コースを通して被験者の体重を減少させるために有効な量であるか、あるいは、その治療コースを通してその被験者の脂肪量百分率を減少させるために有効な量である。一定の実施形態では、被験者の体重を、その治療コースを通して、少なくとも約1%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、または少なくとも約20%減少させる。あるいは、被験者の脂肪量百分率を、その治療コースを通して、少なくとも約1%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、または少なくとも約25%減少させる。

本発明の他の態様において、食事摂取量を減少させる方法、栄養利用率を低下させる方法、体重減少を生じさせる方法、体組成に作用する方法、身体のエネルギー内容を改変するまたはエネルギー消費を増加させる方法、糖尿病を治療する方法、および脂質プロフィールを改善する方法（LDLコレステロールおよびトリグリセリドレベルの減少、ならびに／またはHDLコレステロールレベルの変更を含む）を提供し、これらの方法は、本発明のハイブリッドポリペプチドの有効量を被験者に投与することを含む。好ましい実施形態において、本発明の方法は、栄養利用率を低下させることにより緩和することができる状態または疾患をその必要がある被験者において治療または予防するために用いることができ、この方法は、本発明のハイブリッドポリペプチドの治療または予防有効量を前記被験者に投与することを含む。こうした状態および疾患としては、高血圧、脂質異常症、心血管疾患、摂食障害、インスリン抵抗性、肥満およびあらゆる種類の糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、こうしたハイブリッドは、エキセンジン、GLP1、アミリンおよび／またはsCT部分を含有する。

理論により限定されるつもりはないが、食事摂取量の減少、胃内容排出の遅延、栄養利用率の低下、および体重減少を生じさせることに関する、予防的に投与された本発明のハイブリッドポリペプチドの効果は、PPファミリー内の、またはPPファミリー内のものに類似した、一つ以上の一意的受容体クラスとの相互作用によって決定されると考えられる。さらに詳細には、受容体またはPYY嗜好性（もしくはY7）受容体に類似した受容体が関係するようである。

抗肥満、体重減少、食事減少、代謝率増加ならびに体脂肪減少および／または脂肪再分布ハイブリッドとして特に興味深いのは、CNSに対して作用する少なくとも一つの、好ましくは二つの成分を有するものである。前脳（脳の終脳由来および間脳由来構成要素）および菱脳または脳幹（中脳、脳橋および骨髄を含む）の特定領域は、エネルギーバランスの制御に関与する領域として特定されている。食事摂取量および／または体重の調整に関与する視床下部内に存在する前脳構造または核としては、例えば、弓状核（ARC）、傍室核（PVN）、視床下部背内側（DMH）、複内側核（VMH）および視床下部外側核（LHA）が挙げられる。食事摂取量および／または体重の調整に関与する脳幹内に存在する菱脳構造または核としては、例えば、孤束核（NST）、最後野（AP）および外側傍小脳脚核（IPBN）が挙げられる。完了運動制御系の要素を制御する脳幹核は、NST、APおよびIPBNのような脳幹領域からの一次または二次投射により制御される可能性が高い。AP、NSTおよびIPBNが、すべて、それら固有の統合能力を（集合的にまたは独自に）有すると証明されていることは、注目に値する。

様々なCNS特異的抗肥満薬は、食事摂取量および／または体重の調整に関与する視床下部内に存在するこれらの前脳構造に対して作用する。加えて、CNS特異的抗肥満薬は、食事摂取量および／または体重の調整に関与する脳幹内に存在する菱脳構造に対して作用する。こうした抗肥満薬の例は、本明細書の中に記載されている。抗肥満薬ハイブリッドの形成に寄与することができる、および前脳と菱脳との両方に対する活性を有する抗肥満薬を形成するために併用することができる、ペプチドファミリーモジュールのさらなる例については、下の表を参照のこと。こうした成分としては、例えば、本明細書において説明するものをはじめとする、神経ペプチドY1（NPY1）受容体拮抗薬、NPY5受容体拮抗薬、レプチンおよびレプチン作動薬、毛様体神経栄養因子（CNTF）およびCNTF作動薬、ペプチドYY（PYY）およびPYY作動薬、エキセンジンおよびエキセンジン作動薬、GLP-1およびGLP-1作動薬、グレリンおよびグレリン拮抗薬、コレシストキニン（CCK）およびCCK作動薬、ならびにアミリンおよびアミリン作動薬が挙げられる。さらなるペプチドファミリー成分および臨床的ガイダンスは、本出願人の同時係属特許出願PCT/US06/17529において見出すことができ、該出願は、参照により本明細書に取り入れられている。

一定の実施形態において、本ハイブリッドは、主として前脳に作用するペプチドファミリー成分を一つ以上含むことができる抗肥満薬である。他の実施形態において、本ハイブリッドは、主として菱脳に作用するペプチドファミリー成分を一つ以上含むことができる抗肥満薬である。例示的ペプチドファミリーおよび成分は、NPY1受容体拮抗薬、NPY5受容体拮抗薬、レプチンまたはレプチン作動薬もしくは類似体、CNTF、NPY2受容体作動薬（例えば、PYY(3-36)またはPYY(3-36)作動薬）、エキセンジンまたはエキセンジン作動薬もしくは類似体、GLP-1またはGLP-1作動薬もしくは類似体、グレリン拮抗薬、CCKまたはCCK作動薬もしくは類似体、ならびにアミリンまたはアミリン作動薬もしくは類似体である。

一定の実施形態において、ハイブリッドおよびそれを使用するための方法は、視床下部のエネルギーバランス中枢、例えばARC、PVN、VMおよびLH、を主としてターゲットにする第一成分を含む。一つの実施形態において、ハイブリッドは、第一成分とは異なる位置でまたは異なる作用メカニズムによってだが同じく視床下部をターゲットにする、一つ以上の他のペプチドファミリー成分を含有する。ハイブリッドが、一つより多くのペプチドファミリー成分を含有し、これらも視床下部をターゲットにするとき、それらの一つより多くの他のペプチドファミリー成分は、互いに同じ作用メカニズムにより同じ位置をターゲットにする場合もあり、または異なる位置および／または異なる作用メカニズムをターゲットにする場合もある。別の実施形態において、ハイブリッドは、第一成分と異なり、且つ、互いに異なる位置または作用メカニズムによる抗肥満作用、血糖の制御、心臓保護、ならびに／または高血圧の制御をはじめとする一つ以上の追加の有益な治療効果を所望によりもたらす、一つ以上の他のペプチドファミリー成分を含有する。一定の実施形態において、追加のペプチドファミリー成分は、菱脳のエネルギーバランス中枢、例えばNST、APおよびIPBNを主としてターゲットにするものである。

一定の実施形態において、ハイブリッドおよびそれを使用するための方法は、菱脳のエネルギーバランス中枢、例えばNST、APおよびIPBNを主としてターゲットにする第一成分を含む。一つの実施形態において、ハイブリッドは、第一成分と異なり、且つ、互いに異なる位置でまたは異なる作用メカニズムによるが同じく視床下部をターゲットにする、一つ以上の他のペプチドファミリー成分を含有する。別の実施形態において、ハイブリッドは、第一成分と異なり、且つ、互いに異なる位置または作用メカニズムによる抗肥満作用、血糖の制御、心臓保護、ならびに／または高血圧の制御をはじめとする一つ以上の追加の有益な治療効果を所望によりもたらす、一つ以上の他のペプチドファミリー成分を含有する。一定の実施形態において、追加のペプチドファミリー成分は、視床下部のエネルギーバランス中枢、例えばARC、PVN、VMおよびLHを主としてターゲットにするものである。

本明細書で用いる場合、「食事摂取量および／または体重の調整に関与する前脳構造に対して作用する」抗肥満薬は、前脳内の特定領域、例えば、特に、核および／または神経回路の活性を刺激または抑制する。この前脳刺激または抑制は、身体への栄養利用の減少をもたらす。「食事摂取量および／または体重の調整に関与する菱脳構造に対して作用する」抗肥満薬は、菱脳内の特定領域、例えば、特に、核および／または神経回路の活性を刺激または抑制する。この菱脳刺激または抑制は、結果として、身体への栄養利用を減少させる。

別の態様において、被験者において代謝率を増加することにより脂肪量を減少させるための方法を提供し、これらの方法は、被験者の代謝率を増加させることにより脂肪量を減少させるために有効な量で抗肥満ハイブリッドを投与することを含む。脂肪量は、総合体重に対する百分率として表すことができる。一部の態様では、脂肪量を、その治療コースを通して、少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、または少なくとも25%減少させる。一つの態様において、被験者の除脂肪量は、その治療コースを通して減少されない。別の態様において、被験者の除脂肪量は、その治療コースを通して維持または増加される。別の態様において、被験者は、低カロリー食または制限食を続ける。「低カロリー食」は、被験者が、同被験者の通常の食事と比較して低い一日当たりのカロリー量を摂取することを意味する。一例では、被験者は、一日当たり少なくとも50カロリー低いカロリーを消費している。他の例では、被験者は、一日当たり100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900または1000カロリー低いカロリーを消費している。

一つの実施形態において、被験者において脂肪分布を改変する、脂肪量を減少させる、または両方の場合の使用方法を提供する。従って、体組成の改変が有益である被験者も本方法からの利益を受けることができる。ここでの意図として、改変された体組成は、除脂肪体重の減少の最小化、維持または増加を伴う体脂肪の減少または維持を含む。こうした状況では、体重は増加する場合もあり、減少する場合もある。従って、これらの用語が当該技術分野において用いられるとき、被験者は、痩せている場合もあり、過体重である場合もあり、または肥満である場合もある。提供する方法は、無脂肪組織において除脂肪量を残しながらの脂肪を減少させる方法も含むことができる。こうした方法の用途としては、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）または脂肪異栄養症などの疾病の治療が挙げられる。

一つの実施形態において、被験者における脂肪分布を改変するための方法を提供し、この方法は、被験者における脂肪分布を改変するために有効な量で抗肥満薬ハイブリッドを投与することを含む。一つの態様において、改変は、内臓脂肪もしくは異所脂肪または両方の代謝増加の結果として生じる。「脂肪分布」は、体内の脂肪蓄積位置を意味する。こうした脂肪蓄積位置としては、例えば、皮下、内臓および異所脂肪貯蔵所が挙げられる。「皮下脂肪」は、皮膚表面の直ぐ下の脂質蓄積物を意味する。被験者における皮下脂肪の量は、皮下脂肪の測定に利用可能な任意の方法を用いて測定することができる。皮下脂肪を測定する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第6,530,886号に記載されているものである（該特許全体が参照により本明細書に取り入れられている）。「異所脂肪貯蔵」は、除脂肪体重を構成する組織および器官（例えば、骨格筋、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、血管）内および周囲の脂質蓄積物を意味する。一般に、異所脂肪貯蔵は、体内の典型的な脂肪組織貯蔵所外の脂肪の蓄積である。「内臓脂肪」は、腹内脂肪組織としての脂肪蓄積物を意味する。内臓脂肪は、生体器官を包囲し、ならびに肝臓により代謝されて血中コレステロールを生じさせることがある。内臓脂肪は、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリック症候群および心血管疾患などの状態のリスク上昇と関係付けられている。一部の実施形態において、前記方法は、皮下脂肪より少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%または50%大きい率での内臓脂肪もしくは異所脂肪または両方の代謝を含む。一つの態様において、これらの方法は、結果として、好適な脂肪分布を生じさせる。一部の実施形態において、好適な脂肪分布とは、皮下脂肪の内臓脂肪、異所脂肪または両方に対する比率増加である。一つの態様において、前記方法は、例えば、筋肉細胞量の増加の結果として、除脂肪体重の増加を含む。

別の実施形態において、被験者における皮下脂肪の量を減少させるための方法を提供し、この方法は、抗肥満ハイブリッドを、その必要がある被験者に、その被験者における皮下脂肪の量を減少させるために有効な量で投与することを含む。一例では、被験者における皮下脂肪の量を少なくとも約5%減少させる。他の例では、皮下脂肪の量を、その抗肥満ハイブリッドの投与前のその被験者と比較して、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、40%または50%減少させる。

本明細書に記載する方法を用いて、被験者における内臓脂肪の量を減少させることができる。一例では、内臓脂肪を被験者において少なくとも約5%減少させる。他の例では、内臓脂肪を、その抗肥満ハイブリッドの投与前のその被験者と比較して、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、40%または50%減少させる。内臓脂肪は、被験者における内臓脂肪量の判定に利用可能な任意の手段により測定することができる。そうした方法としては、例えば、CTスキャンおよびMRIによる腹部断層撮影法が挙げられる。内臓脂肪を判定するための他の方法は、たとえば、米国特許第6,864,415号、同第6,850,797号および同第6,487,445号に記載されている。

一つの実施形態において、被験者における内臓脂肪の蓄積を防止するまたは異所脂肪の量を減少させるための方法を提供し、この方法は、その必要がある被験者に、その被験者における異所脂肪の蓄積を防止するまたは異所脂肪の量を減少させるために有効な量で、抗肥満ハイブリッドを投与することを含む。一例では、異所脂肪の量を、その抗肥満ハイブリッドを投与する前の被験者と比較して少なくとも約5%減少させる。他の例では、異所脂肪の量を、被験者において少なくとも約10%、または少なくとも約15%、20%、25%、30%、40%もしくは50%減少させる。あるいは、異所脂肪の量を、被験者における皮下脂肪と比較して、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%比例減少させる。異所脂肪は、異所脂肪の測定に利用可能な任意の方法を用いて、被験者において測定することができる。

別の実施形態において、被験者においてさらに好適な脂肪分布を生じさせるための方法を提供し、この方法は、抗肥満薬として有効であるハイブリッドを、好適な脂肪分布を生じさせるために有効な量で被験者に投与することを含む。一つの実施形態において、抗肥満ハイブリッドの投与は、被験者における内臓脂肪もしくは異所脂肪または両方の量を減少させる。一つの実施形態において、食事摂取量もしくは体重の調整または両方に関与する前脳構造に対して作用する少なくとも一つのファミリーモジュールを、食事摂取量もしくは体重の調整または両方に関与する菱脳構造に対して作用する少なくとも一つのファミリーモジュールとの組み合わせで含む、抗肥満ハイブリッドを投与する。一つの実施形態において、これらの方法は、皮下脂肪の減少より、優先的に、内臓脂肪もしくは異所脂肪または両方の組み合わせの量を減少させる。こうした方法は、結果として、より高い皮下脂肪対内臓脂肪または異所脂肪比を生じさせる。こした改善された比率は、結果として、心血管疾患、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリック症候群またはこれらの任意に組み合わせの発現のリスクを低下させることができる。一つの実施形態において、異所または内臓脂肪は、皮下脂肪より5%高い比率で代謝される。他の実施形態において、異所または内臓脂肪は、皮下脂肪より10%、15%、20%、25%、30%、50%、60%、70%、80%、90%または100%高い比率で代謝される。

本明細書において論じるような抗肥満、体重および脂肪組成関連治療のために特に興味深いものは、アミリン（例えば、アミリン-sCT-アミリンキメラ）、レプチンおよび／またはPPF（例えば、PYY類似体またはPPY/NPYキメラ）ファミリーモジュールを含有するハイブリッドである。例えば、アミリンファミリーモジュールをレプチンファミリーモジュールに取り付けて単独で投与することができ、またはさらなる実施形態では、PPFファミリー化合物と併用で（例えば、別々にもしくは共に混合して）投与することができる。別の実施形態において、ハイブリッドは、単独でまたはアミリンファミリー化合物と併用で投与されるレプチン-PPF配合剤を含有する。別の実施形態において、ハイブリッドは、単独でまたはレプチンファミリー化合物と併用で投与されるアミリン-PPF配合剤を含有する。尚さらなる実施形態において、ハイブリッドは、三つすべてのファミリーモジュールを含有する。例えば、複室送達システムの場合のように、アミリン-PPFハイブリッドを医薬的に許容される滅菌溶液で供給することができ、該溶液は、凍結乾燥または粉末レプチンファミリー化合物を溶解するために使用される。

さらに別の態様では、グルココルチコステロイドと併用で投与される抗肥満薬として有効なハイブリッドの治療有効量を投与するための方法を提供する。グルココルチコステロイドは、脂肪量を増加させ、除脂肪量を減少させる副作用を有する。従って、この抗肥満薬配合剤は、グルココルチコステロイドの副作用を阻止するために、グルココルチコステロイドの使用が有益である条件下でグルココルチコステロイドと併用することができると考えられる。

さらに、脂質低下に関して、本発明のハイブリッドは、トリグリセリド、全コレステロール、LDLコレステロールおよびVLDLコレステロールなどの血中脂質レベルを低下させる際、ならびにそうした治療が必要な被験者においてさらに有益な脂質プロフィールを生じさせる際に使用することができる。従って、一つの実施形態において、その必要がある被験者に脂質低下ハイブリッドを投与することを含む、血中トリグリセリド、全コレステロール、LDLコレステロール、VLDLコレステロールまたはこれらの任意の組み合わせを低下させるために方法を提供する。さらなる実施形態において、脂質低下ハイブリッドは、エキセンジン（インクレチン）ファミリー成分、アミリンファミリー成分、PPFもしくはPPF(NPY)ファミリー成分またはこれらの任意の組み合わせを含有し得る。この方法の一つの実施形態において、低下させるべき脂質は、血漿トリグリセリドである。別の実施形態において、それは、全血漿コレステロールである。別の実施形態において、それは、LDLコレステロールである。別の実施形態において、それは、VLDLコレステロールである。このハイブリッドは、空腹時脂質レベルを維持するもしくは減少させる、および／または食後の脂質（特に、トリグリセリド）エクスカージョンを減少させるために、急性的および／または長期的に有効であり得る。そうした治療の必要がある患者は、高トリグリセリド、高LDLコレステロール、高VLDLコレステロールまたはこれらの任意の組み合わせを有し得る。そうした患者としては、他の点では正常に見える、糖尿病または前糖尿病を有する、肥満症を有する、脂質疾患または状態、例えば脂質異常症、高コレステロール血症もしくは高トリグリセリド血症を有する、および／あるいは心血管疾患を有する患者を挙げることができる。ハイブリッドのこの効果は、より高いリスクを有する患者、例えば、遺伝的素因を有する患者、肥満である患者、糖尿病である患者などにおいて、心臓病およびアテローム硬化症のリスクを減少させる点で有益である。例えば、患者は、高い脂質またはコレステロールレベルを有する、アテローム硬化法に罹患している患者であり得る。本方法は、被験者における食後トリグリセリドエクスカージョンを減少させる、循環性脂質レベルを低下させる、脂質異常症を治療する、循環性脂質プロフィールを改善する、高トリグリセリド血症を治療する、高コレステロール血症を治療する、および／または食後トリグリセリド濃度を低下させる方法を提供し、この方法は、そうした治療が必要な被験者に本発明のハイブリッドの有効量を投与することを含む。本明細書で用いる場合、「脂質プロフィール」は、トリグリセリドレベル、HDL、LDL、コレステロールなどをはじめとする循環性脂質のバランス、比率または実際の濃度を意味する。好ましい態様において、アミリンまたはアミリン作動薬の有効量を投与することを含む本発明の方法は、患者におけるトリグリセリドレベルを低下させるために有用である。総合脂質またはトリグリセリドレベル、例えば、空腹時レベル、食後ピークレベル、および総合食後脂質／トリグリセリドレベルエクスカージョン（例えば、アミリン作動薬で治療していない状態での増加と比較して食後トリグリセリド増加の曲線下面積（AUC）により測定した場合のもの）をこの方法で低下させることができる。個々の臨床関連測定値、例えば、空腹時脂質レベル（トリグリセリド、コレステロール、HDLおよびLDLなどを含む）および食後脂質（例えば、トリグリセリド）レベルも、本発明の方法によって低下される。脂質異常症、すなわち、正常なレベルと比較して改変されて脂質レベルを有する患者を、アミリンまたはアミリン作動薬の投与によって治療することができる。糖尿病および肥満患者、ならびに脂質異常症または心血管疾患の遺伝的素因を有する患者は、本発明の方法による治療に特に適する。本明細書で用いる場合、「患者における高トリグリセリドレベルの治療」は、治療前のレベルを基準にして、それらのレベルの増加を防止することまたはそれらのレベルの低下を生じさせることのいずれかを意味する。本明細書で用いる場合、「食後トリグリセリドエクスカージョンの減少」は、食事摂取後に患者において見られるピーク濃度およびトリグリセリド濃度曲線の全曲線下面積の両方の低下を意味する。典型的には、これは、食後のその時間内の、図2-4に提供するものなどのグラフについての全曲線下面積の低下を意味するであろう。本明細書で用いる場合、患者における「循環性脂質レベルの低下」は、治療前のレベルを基準にして測定可能な血中脂質量の低下を意味する。本明細書で用いる場合、「脂質異常症の治療」は、臨床的に測定可能な正常および／または健常な任意のまたはすべての脂質またはリポタンパク質パラメータと医学的に定義されているものにより近いレベル、比率、プロフィールまたはバランスへの改善または回復を意味する。これには、トリグリセリド、LDL、HDL、IDL、VLDL、全コレステロール、アポリポタンパクなどのレベルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いる場合、「患者における循環性脂質プロフィールの改善」は、血液中で見出される一つ以上の脂質の濃度の変化を生じさせて、患者の総血中脂質含量を好ましい状態に変えることを意味する。これは、循環性脂質の総含量／濃度を変化させずに異なるリポタンパク画分にわたって脂質の分布をシフトさせることを含む場合もある。本明細書で用いる場合、患者における「高トリグリセリド血症の治療」は、一つ以上の該当時点で、例えば、空腹時または食後に患者の血液中で見出されるトリグリセリドの濃度の低下を生じさせることを意味する。本明細書で用いる場合、「食後循環性トリグリセリドの減少」は、食後（例えば、食後約4-6時間の期間内）の血液循環における測定可能なトリグリセリド量を、同様の食事についての治療前または治療を受けていない患者において食後に見られるそうした脂質のレベルを基準にして、低下させることを意味する。

本発明のハイブリッドおよびPYYキメラは、他の脂質低下薬と共に使用することができる。脂質低下薬としては、血漿脂質レベルを低下させることができる任意の化合物が挙げられる。例示的脂質低下薬としては、スタチン、例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンまたはロスバスタチン；胆汁酸結合剤、例えば、コレスチラミンまたはコレスチポール；ペルオキシソーム増殖活性化受容体（PPAR）作動薬、例えば、テサグリタザール、ビタミンE；コレステロールエステルエステル輸送タンパク質（CETP）阻害剤、例えば、エゼチミブ、JTT-705およびトルセトラピブが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に有用な追加のアッセイとしては、体組成に対するハイブリッド化合物の効果を判定することができるものが挙げられる。例示的アッセイは、代謝性疾患のための食餌誘発肥満（DIO）マウスモデルの利用を含むものであり得る。治療期間に先立ち、週齢4週ではじめて、6週間、雄C57BL/6Jマウスに高脂肪食（#D12331、脂肪からカロリーの58%；Research Diets, Inc.）を給餌することができる。この試験中、マウスは、それらの高脂肪食を食べ続けることができる。水は、この試験の全体を通して自由に得ることができる。同様の週齢の非肥満マウスの一群には、DIO群との代謝パラメータの比較のために、低脂肪食（#D12329、脂肪からカロリーの11%）を与えることができる。

DIOマウスに皮下（SC）肩甲骨内浸透圧ポンプを内植して、ビヒクル（水中、50%ジメチルスルホキシド（DMSO））または本発明の化合物のいずれかを送達することができる。後述の群のポンプは、7-28日間、任意の量、例えば1000μg/kg/日の本発明の化合物を送達するように設定することができる。

この試験期間全体を通して定期的な間隔で体重および食餌摂取量を測定することができる。呼吸商（RQ、CO₂産出÷O₂消費と定義される）および代謝率は、全動物間接熱量測定（Oxymax, Columbus Instruments, Columbus, OH）を用いて決定することができる。イソフラン過剰投与によりマウスを安楽死させ、肥満指数（両側精巣上体脂肪パッド重量）を測定することができる。さらに、精巣上体重量の決定前に、二重X線エネルギー吸収測定 (DEXA)装置を製造業社（Lunar Piximus, GE Imaging System）の使用説明書に従って使用して、各マウスの体組成（除脂肪量、脂肪量）を分析することができる。本発明の方法において、本発明の好ましいハイブリッドポリペプチドは、本明細書に記載するアッセイ（好ましくは、食事摂取量、胃内容排出、膵液分泌、体重減少または体組成アッセイ）のうちの一つにおいて、同じアッセイにおける成分ペプチドホルモンの効力より大きい効力を有するものである。

その必要がある被験者における食事摂取量減少、体重減少または肥満治療の結果としての高血圧の改善に加えて、本発明の化合物は、低血圧の治療に使用することができる。

本発明の化合物は、膵島または膵臓細胞におけるグルコース応答性の強化、誘導、向上または回復にも有用である。これらの作用は、上で説明したものおよび米国特許出願第US 20040228846号に記載されているものなどの代謝性疾患に関連した状態の治療または予防に有用であり得る。そうした活性を判定するためのアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許公開出願第US 20040228846号（これは、その全体が参照として取り入れられている）には、膵島の単離および培養ならびに胎児膵島成熟の判定のためのアッセイが記載されている。特許出願US 20040228846の実施例において、膵臓ポリペプチド（PP）、神経ペプチドY（NPY）、神経ペプチドK（NPK）、PYY、セクレチン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）およびボンベシンをはじめとする腸由来のホルモンペプチドは、Sigmaから購入した。XI型コラゲナーゼは、Sigmaから入手した。RPMI1640培地およびウシ胎仔血清は、Gibcoから入手した。抗インスリン抗体を収容したラジオイムノアッセイキット（[¹²⁵I]-RIAキット）は、Linco, St Louisから購入した。

産後ラット膵島は、年齢P-02ラットから得た。成体ラット膵島は、週齢6-8週のラットから得た。胎仔ラット膵島は、以下のように得た。妊娠したメスのラットを妊娠日数E21に犠牲にした。胎仔を子宮から取り出した。10-14の膵臓を各同腹子から切除し、ハンクス緩衝液で二回洗浄した。それらの膵臓をプールし、6 mL 1 mg/mLコラゲナーゼ（XI型、Sigma）に懸濁させ、37℃で8-10分間、絶えず振盪しながらインキュベーションした。10容積の氷冷ハンクス緩衝液の添加により消化を停止させ、その後、ハンクス緩衝液で三回洗浄した。その後、それらの膵島をフィコール勾配により精製、1μM IBMXを添加したまたはしていない、10%ウシ胎仔血清（FBS）／RPMI培地中で培養した。五日の最後に、20の膵島を手選して各試験管に移し、静的インスリン放出について分析した。一般に、膵島を先ずKRP緩衝液で洗浄し、その後、3mM（低）グルースを含有する1mLのKRP緩衝液と共に30分間、37℃で、絶えず振盪しながらインキュベーションした。上清を回収した後、それらの膵島を17mM（高）グルコースと共に1時間、37℃でインキュベーションした。低および高グルコース刺激により放出されたインスリンを、[¹²⁵I]-RIAキットを使用するラジオイムノアッセイ（RIA）によってアッセイした。E21胎仔膵島を５日間、200ng/mLのPYY、PP、CCK、NPK、NPY、セクレチン、CLP-1またはボンベシンの存在下で培養した。

ズッカー糖尿病肥満（ZDF）雄ラット、齧歯動物標準食Purina 5008を給餌したすべてのfa/fa雄において糖尿病を自然発現する近交系（>F30世代）ラットモデルを使用する例示的インビボアッセイも提供する。ZDF fa/fa雄では、週齢約七週で高血糖が発現し始め、典型的には、週齢10から11週までにグルコースレベル（給餌）が500mg/DLに達する。インスリンレベル（給餌）は、糖尿病の発現中は高い。しかし、週齢19週までに、インスリンは、痩せた対照同腹子兄弟のレベル付近に低下する。肥満ラットのトリグリセリドおよびコレステロールレベルは、通常、痩せたラットものより高い。このアッセイにおいて、週齢7週ZDFラットの三つの群（一群当たりラット6匹）に、14日間、ALZAポンプによる注入治療：1)ビヒクル対照、2)および3)、二つの異なる用量、それぞれ、100pmol/kg/時および500pmol/kg/時でのPYYを施した。注入前および注入後第7日および第14日に四つの測定を行った：1)血漿グルコースレベル、2)血漿インスリンレベル、3)血漿トリグリセリド（TG）レベル、ならびに経口グルコース負荷（OGTT）試験。従って、これらのアッセイを本発明の化合物で用いて、所望の活性について試験することができる。

ハイブリッドポリペプチドについて考えられる他の用途としては、アルツハイマー病を治療する、予防するまたはその発症を遅延させるために中枢神経系におけるアルミニウム（Al）濃度を低下させる方法（例えば、米国特許第6,734,166号参照（これは、その全体が参照により取り入れられている））が挙げられる。ディプロイドおよびTsマウスを使用してAlに対する効果を判定するためのアッセイは、当該技術分野において公知であり、米国特許第6,734,166号において見出すことができる。これらのマウスを、Nalgene（登録商標）ブランド代謝またはポリプロピレンケージに個々に収容し、実験前に三日与えて、ケージに順応させた。マウスは、餌を与えなかった安楽死前の16時間を除き、実験の間、餌（LabDiet（登録商標）NIH Rat and Moust/Auto 6F5K52, St. Louis, Mo.）および水を自由採食できた。活性化合物または食塩水のいずれかの皮下注射を毎日マウスに施した。ある実験については第13日および別の実験については第3日の終わりにマウスを犠牲にし、サンプルを収集した。マウス脳サンプルを清浄なテフロンライナー中で計量し、低微量元素グレードの硝酸中でのマイクロ波消化により分析のための準備を施した。その後、誘導結合プラズマ質量分析法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry）（Nuttall et al., Annals of Clinical and Laboratory Science 25, 3, 264-271 (1995)）を用いて、サンプルをAl含量について分析した。分析中のすべての組織の取扱は、バックグラウンド汚染を最少にするために、HEPA空気濾過システムを利用してクリーンルーム環境で行った。本発明のハイブリッドは、高血圧性および糖尿病性腎障害ならびにインスリン抵抗性およびメタボリック症候群に関連した腎障害をはじめとする腎障害の予防および治療に有用である。ハイブリッドは、数ある中でも、高血圧、内皮機能、腎機能および糸球体硬化症の改善および悪化防止によりこれらの目的を達成する。一つの実施形態において、本発明は、本発明の化合物を投与することを含む、高血圧性および糖尿病性腎障害またはインスリン抵抗性に関連した腎障害をはじめとする腎障害を予防または治療するための方法を提供する。さらに、ハイブリッドは、血管拡張能力が低下した患者、または糸球体硬化症もしくは他の任意の糸球体流量減少を有する患者における内皮機能を改善するために使用することができる。内皮機能におけるこうした改善は、高血圧を降下させるためにも、糸球体の毛細血管の機能を改善するためにも役立つ。追加の実施形態において、本発明の分子は、ESRDへの腎障害の進行を予防するために、タンパク尿および／または糸球体硬化症を予防する、その進行を遅らせる、治療するまたは改善するために有用である。ハイブリッドは、心不整脈に罹患するリスクの低減、心不整脈の予防または治療に有用である。ハイブリッドは、心臓虚血、心臓虚血−再潅流、およびうっ血性心不全を有する患者において抗不整脈作用を生じさせることができる。例えば、GLP-1は、これらの疾患を有する患者において心臓損傷を減少させ回復を増進させることが判明した。GLP-1をはじめとするインクレアチンは、グルコース依存性インスリン分泌刺激ホルモンである。GLP-1およびエキセンジンは、危険な低血糖を誘発せずに末梢グルコース取り込みを有効に増進させる。それらは、そのインスリン分泌刺激作用とは無関係なグルカゴン分泌を強く抑制もし、その結果、血漿遊離脂肪酸（FFA）レベルを、インスリンで達成することができるより実質的に大きく低下させることができる。高FFAレベルは、心筋虚血中の主毒性メカニズムとして関係付けられている。別の実施形態において、ハイブリッドは、再潅流および虚血を随伴する傷害を確実に減少させ、患者の回復を増進させる、心不整脈の予防および治療に有用である。尚、さらなる実施形態において、急性発作または出血後のハイブリッド治療、好ましくは静脈内投与は、インスリン分泌を最適化し、脳同化作用を増加させ、グルカゴンの抑制によりインスリン有効性を向上させ、ならびに重度低血糖または他の有害副作用のリスクを伴わずに正常血糖または軽度低血糖を維持するための手段をもたらす。一つの実施形態において、そうしたハイブリッドは、GLP1またはエキセンジン部分を含有する。さらなる実施形態では、GLP1またはエキセンジンファミリーモジュールをナトリウム利尿性ファミリーペプチド、アミリンファミリーペプチド、ウロコルチンファミリーペプチドモジュールと組み合わせて、本明細書に記載するような、CHFをはじめとする心血管の状態または心血管疾患の治療または予防向上を達成する。

うっ血性心不全は、先進諸国における罹病率および死亡率の最も有意な原因の一つである。これは、様々な心血管疾患において後期発現として発生し、収縮量減少および／または容量もしくは圧過負荷を特徴とする（Fortuno, Hypertension 38: 1406-1412 (2001)）。非常に多くの研究が、心臓リモデリングは、その病因に関係なく、CHFの臨床経過の主決定要因であることを提案している（Fedak, Cardiovascular Pathology 14:1-11 (2005)）。それ故、心臓リモデリングは、うっ血性心不全の治療にとっての魅力的なターゲットである。従って、心臓リモデリングを予防または減少させるように作用する薬剤が望まれる。実際、文献では、心臓リモデリングを減弱させることができる分子の必要性が特定されている（Fortuno, Hypertension 38:1406-1412 (2001)）。文献報告は、心室リモデリングの減弱は、心筋傷害後の生存も向上させるが、リモデリングを悪化させる治療は、収縮期機能が改善された場合でさえ、不良な結果を随伴することを示している（Somasundaram, Med. Clin. N. Am., 88: 1193-1207 (2004)参照）。

従って、心血管疾患、一つの実施形態では急性または慢性心不全、別の実施形態では心筋梗塞、別の実施形態では虚血性心不全、およびさらに別の実施形態ではうっ血性心不全を治療するための方法をここで提供する。一つの実施形態において、この治療は、高血糖により誘発される心血管系への傷害を予防または改善することによって施される。一つの実施形態において、この治療は、心臓保護効果をもたらすことによって施される。別の実施形態において、この治療は、心臓リモデリングを予防する、心臓リモデリングの発現を遅延する、心臓リモデリングを減弱または改善することによって達成される。一般に、心臓リモデリングは、心臓のいずれかの心室の再構成および再造形を指す。一つの実施形態において、心臓リモデリングは、心室の再構成および再造形を指す。上で説明したように、および理論によって限定されるつもりはないが、心臓リモデリングは、後に分子、細胞および腸の変化を伴い、心室の再構成および再造形を招く、心筋に対する傷害後のゲノムの変化と説明することができる。そうした再構成および再造形は、心臓のサイズ、形状および機能の変化として臨床的に証明することができる。心臓リモデリングは、心筋への任意の刺激または刺激の組み合わせに応答して発生し得る。一つの実施形態において、心臓リモデリングは、心筋傷害の結果である。非限定的な例として、心臓リモデリングは、心筋梗塞、高血圧、容量過負荷（例えば、大動脈弁閉鎖不全から）、感染、炎症、糖尿病、ウイルス性心筋症、および特発性心筋症の結果として生じる心筋傷害に応答して発生し得る。

一つの態様において、心臓リモデリングは、本発明のハイブリッドの投与により予防、遅延、減弱または改善される。ハイブリッドは、次の心臓パラメータ：左心室収拡張期機能、E波対A波比、左心室拡張末期圧、心送血量、心収縮性、左心室量、左心室量対体重比、左心室容積、左心房容積、左心室拡張終期径もしくは収縮終期径、梗塞サイズ、運動能力、運動効率、または心臓収縮期および／もしくは拡張期機能の任意の測定値、のうちの少なくとも一つを改善する（向上させる）能力；あるいは、心室の拡張または上の心臓パラメータのうちの一つに対する有害作用を減弱、遅延または予防する能力を含むことができる。一つの実施形態において、ハイブリッドは、GLP-1またはエキセンジン受容体に結合する一定のファミリーのメンバー、例えばエキセンジン-4を含有する。本方法に関連して、心臓リモデリングの予防または改善としては、心臓リモデリングのあらゆる量の減少を挙げることができる。一つの実施形態において、心臓リモデリングの予防または改善は、うっ血性心不全のリスク低減により達成される。

一つの実施形態において、心臓リモデリングを、ハイブリッドの投与が不在の状態での心臓リモデリングの量の約1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%未満である量に改善または減少させる。別の実施形態において、ハイブリッドの投与が不在の状態での心臓リモデリングの発生と比較して、心臓リモデリングをわずかに減少させる、中等度に減少させる、実質的に減少させる、または実質的に排除することができる。本明細書で用いる場合、心臓リモデリングのわずかな減少は、ハイブリッドの投与が不在の状態での心臓リモデリングと比較して約25%以下減少される心臓リモデリングを指す。心臓リモデリングにおける中等度の減少は、ハイブリッドの投与が不在の状態での心臓リモデリングと比較して約50%以下減少される心臓リモデリングを指す。心臓リモデリングにおける実質的減少とは、ハイブリッドの与が不在の状態での心臓リモデリングと比較して約80%以下減少される心臓リモデリングを指す。心臓リモデリングの実質的排除とは、ハイブリッドの投与が不在の状態での心臓リモデリングと比較して約80%以上減少される心臓リモデリングを指す。

心臓リモデリングを予防、改善、減弱または遅延させる程度を評価するために、当業者に利用可能な任意の手段を利用することができる。例えば、心臓リモデリングは、心臓の組織検査、LV質量を含む（しかし、これらに限定されない）分析によって、または被験者の生涯を通じて、例えば心エコー検査法により、室寸法および壁厚および運動を測定すること、またはE波およびA波のピーク速度比（E/A比）を用いて左心室（LV）拡張期機能を定量することによって評価することができる。

一つの実施形態において、当業者は、心臓リモデリングを予防、改善、減弱または遅延させる、本ハイブリッドの投与による利益を受けることができる被験者を、その被験者に関連した状態およびリスク因子に鑑みて突き止めることができる。一つの実施形態において、被験者は、心臓リモデリングの予防、改善、減弱または遅延を必要としている。別の実施形態において、被験者は、心臓リモデリングの予防、改善、減弱または遅延を望む者であり得る。一つのリスク因子は、心臓リモデリングを被る心臓についての遺伝的素因であり得る。本明細書に提供する本方法の例示的サンプルおよび被験者としては、心臓リモデリングに関連した状態を経験した、経験している、または経験するリスクを有するものが挙げられる。心臓リモデリングに関連した状態は、心臓リモデリングが発生することが判っているまたはリスクであると考えられる任意の状態または疾患であり得る。心臓リモデリングに関連した状態としては、例えば、心筋梗塞、炎症、虚血／再潅流、酸化ストレス、肺性心、後期糖化反応生成物、心臓壁張力異常、交感神経刺激、心筋炎、高血圧、ウイルス性心筋症、特発性心筋症、心臓移植、および心臓の外科手術手順が挙げられる。

上で述べたように、ハイブリッドは、急性事象または慢性状態の結果として投与することができる。それが急性事象であろうと、または慢性状態であろうと、本明細書に提供する方法は、ハイブリッドでの慢性治療を含む。例えば、慢性治療の長さは、その事象が起こった時間、およびその被験者が急性事象から回復したまたは慢性状態から回復したと考える時間を含むことができる。

心臓リモデリングの予防、減弱、遅延または改善のためのハイブリッドの慢性投与またはハイブリッドでの慢性治療は、心臓リモデリングに関連した特定の一過性事象または一過性の状態が確認されない場合、許可される。慢性投与は、心臓リモデリングの遺伝的素因に基づいて、または一過性でない素因を形成する状態（例えば、確認できないおよび容易に排除することができない、一過性でない状態、例えば、糖尿病）に基づいて、明確でないが継続的な期間にわたってハイブリッドを投与することを含む。ハイブリッドは、病因にかかわらず、うっ血性心不全を示す被験者における心臓リモデリングを予防するために、本明細書に提供する方法において慢性投与することができる。心臓リモデリングを予防または改善するためのハイブリッドの慢性投与は、うっ血性心不全のリスクを有する糖尿病患者にも関係し得る。ハイブリッドは、心臓移植を受けた個体において移植臓器を保護するために慢性ベースで投与することもできる。ハイブリッドを慢性投与するとき、投与は任意の時間長にわたって継続し得る。しかし、慢性投与は、多くの場合、長期間行われる。例えば、例示的実施形態において、慢性投与は、6ヶ月、1年、2年またはそれより長く継続する。

別の実施形態において、本明細書に開示する方法は、改善された心収縮性をもたらす。心収縮性の改善としては、収縮する心筋細胞の能力を挙げることができる。心収縮性の改善を評価するために、任意の評価モードを用いることができる。例えば、心送血量の増加もしくは心拍数の減少または両方などの臨床的観察が心収縮性増加の判定につながる。あるいは、インビボでの心臓の収縮性増加は、左心室の分割短縮増加の判定によって評価することができる。左心室の分割短縮は、心エコー検査などの任意の利用可能な手段によって観察することができる。心収縮性増加を評価する場合、左心室の分割短縮の増加は、ハイブリッドの投与前の分割短縮と比較したときのあらゆる量の増加であり得る。例えば、この短縮の増加は、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%または約200%より大きいことがある。

さらに別の態様において、ハイブリッドの投与による心房リモデリングの減少または予防方法を提供する。心房リモデリングの減少または予防は、ハイブリッドの投与前の心房リモデリングと比較して評価することができる。心房リモデリングのそうした減少または予防の治療的効果としては、心房性細動の減少が挙げられる。さらに別の態様において、ハイブリッドの投与により心室リモデリングを減少または予防するための方法を提供する。心室リモデリングの減少または予防は、ハイブリッドの投与前の心室リモデリングと比較して評価することができる。

さらなる態様において、予防的および治療的方法を提供する。急性または慢性ベースでの治療が考えられる。加えて、そう指示された場合には、急性ベースでの治療を慢性治療に延長することができる。慢性治療は、2週間より長いと考えられる。一定の実施形態において、慢性治療は、1ケ月、3カ月、6ヵ月、1年、2年、5年より長いこともあり、生涯にわたることもある。一つの態様において、その必要がある被験者において心臓リモデリングに関連した状態を治療または予防するための方法を本明細書に提供する。この方法は、一般に、心臓リモデリングを予防または改善するために有効な量の本ハイブリッドを被験者に投与し、そのリモデリングに関連した状態を改善、予防または遅延させることを含む。本明細書において説明するように、本ハイブリッドの投与は、心血管的恩恵をもたらす他の薬剤との併用を含む任意の様式で行うことができる。

さらに別の実施形態において、本明細書に提供する方法は、治療の必要がある被験者の特定を含む。任意の有効な基準を用いて、被験者がハイブリッドの投与からの利益を受けることを判定することができる。例えば心疾患および／または糖尿病を診断するための方法、ならびにこれらの状態の発現のリスクを有する個体を特定するための手順は、当業者には公知である。そうした手順としては、臨床試験、身体検査、個人面接および家族歴評価を挙げることができる。

尚、さらなる実施形態において、インスリン抵抗性を低下させることができるまたはインスリン感受性を増大することができるハイブリッドは、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）の治療に有用である。本発明のハイブリッドの投与は、PCOSに罹患している被験者におけるインスリン抵抗性を減少または予防することができる。さらに別の実施形態において、ハイブリッドは、PCOSに罹患している被験者における2型糖尿病の発症を予防する。さらに、ハイブリッドは、PCOSに罹患している被験者における定期的月経、排卵または受胎能を回復させることができる。一つの実施形態において、そうしたハイブリッドは、GLP1受容体を結合または活性化するためのGLP1またはエキセンジン部分を含有する。

本発明の化合物は、一部はそれらの抗分泌特性および抗運動特性に関係した広い生物学的活性範囲を示す。化合物は、上皮細胞との直接相互作用により、またはおそらく、腸分泌を刺激するホルモンもしくは神経伝達物質の分泌を阻害することにより、胃腸分泌を阻害することができる。抗分泌特性は、胃液および／または膵液分泌の阻害を含み、ならびに胃炎、膵炎、バレット食道および胃食道逆流疾患をはじめとする疾病および疾患の治療または予防に有用で有用であり得る。

本発明の化合物は、腸の電解質および水分泌過多ならびに吸収減少を随伴する任意の数の胃腸疾患、例えば感染性下痢、炎症性下痢、短腸症候群、または一般には外科手術手順、例えば回腸フィステル形成術、後に起こる下痢の治療（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill Inco, New York, 12th Ed.参照）に有用である。感染性下痢の例としては、急性ウイルス性下痢、急性細菌性下痢（例えば、サルモネラ菌、カンピロバクター菌およびクロストリジウム、または原虫感染に起因するもの）または旅行者の下痢（例えば、ノーウォークウイルスまたはレトロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。炎症性下痢の例としては、消化不良症候群、熱帯性下痢、慢性膵炎、クローン病、下痢および過敏性腸症候群が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチドを使用して、胃腸障害を伴う緊急または生命を危うくする状態、例えば、手術後のまたはコレラに起因する状態を治療できることも判明した。

本発明の化合物は、腸損傷を随伴する症状（例えば、下痢）の単なる治療とは対照的に、腸損傷の治療または予防にも有用であり得る。腸に対するそうした損傷は、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、腸萎縮、腸粘膜喪失、および／または腸粘膜機能喪失であり得、またはこれらの結果であり得る（WO 03/105763参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれている））。WO 03/105763に記載されいるような、そうした活性のアッセイは、12:12 明：暗サイクルで飼育され、齧歯動物標準食（Teklad LM 485, Madison, WI）および水の自由採食を許された、250-300グラムの範囲の週齢11週雄HSDラットを含む。実験前24時間は動物を絶食させた。慢性結腸炎の簡単で再現性のあるラットモデルは、Morris GP, et al., "Hapten- induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon." Gastroenterology. 1989; 96:795-803により、以前に説明されている。それは、比較的長い炎症および潰瘍形成期間を示すので、特異的に制御された様式で結腸炎症性疾患の病態生理を研究する、およびヒトにおける炎症性腸疾患に適用できる可能性を秘めた新たな治療を評価する機会が得られる。

ラットを3%イソフルオランで麻酔し、37℃に設定した調整された加熱パッドの上に配置した。ガバージュ・ニードルを結腸7cmへと直腸内挿入した。Mazelin, et al., Juton Nerv Syst. 1998;73:38 45に記載されているように、50%エタノール（v/v）に溶解したハプテントリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）を、0 0.4-0.6mLの全容積で、30mg/kgの用量で、そのガバージュ・ニードルにより結腸内腔に送達した。対照群には食塩溶液（NaCl 0.9%）を結腸内投与した。

結腸炎誘発の四日後、麻酔したラットから結腸を切除し、その後、ラットを断頭術により安楽死させた。切除した結腸および脾臓の重量を測定し、総体的な形態的損傷の評点を付けるために結腸の写真を撮った。炎症は、充血および腸壁肥厚の領域と定義した。

本発明のハイブリッドポリペプチドを使用して、膵臓腫瘍を治療または予防する（例えば、膵臓腫瘍の増殖を抑制する）こともできる。本発明の方法は、腫瘍細胞の増殖を減少させることを含む。本発明に従って治療することができる良性膵臓腫瘍細胞のタイプとしては、漿液性嚢胞腺腫、小嚢胞性腫瘍、および充実性−嚢胞性腫瘍が挙げられる。方法は、悪性膵臓腫瘍細胞、例えば膵臓の管、腺房または島から生じる癌腫の増殖の減少にも有効である。米国特許第5,574,010号（その全体が参照により取り入れられている）は、抗増殖特性を検査するための例示的アッセイを提供している。例えば、‘010特許は、二つのヒト膵臓腺癌癌細胞系統であるPANC-1およびMiaPaCa-2を提供しており、これらは、米国微生物系統保存機関、ATCC（Rockville, Md.）などの供給者から市販されている。これら二つの腫瘍細胞を、NAPCOウォータージャケット式5% CO₂インキュベータにおいて、摂氏37度で、10%ウシ胎仔血清、29.2mg/Lのグルタミン、25μgのゲンタマイシン、5mlのペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンギソン溶液（JRH Biosciences, Lenexa, Kans.）を補足したRPMI-1640培地中で増殖させた。すべての細胞系統は、腫瘍細胞の集密単層が達成されたら、週に一回から二回、0.25%トリプシン（Clonetics, San Diego, Calif.）で剥離させた。摂氏4度の冷却遠心機において500gで7分間、細胞をペレット化し、トリプシン負含の強化RPMI1640培地に再び懸濁させた。トリパンブルーを用い血球計数器で生細胞を計数した。

各タイプの10,000、20,000、40,000および80,000の細胞を、ウエル当たり200μLの培地の全容量で、96ウエルマイクロタイタープレート（Costar, Cambridge, Mass.）に添加した。PYYまたは試験ペプチドの添加前、24時間、細胞を放置して付着させた。ペプチドを添加する前に、新たな培地に交換した。PYYまたは試験化合物のいずれかと膵臓腫瘍細胞のインビトロインキュベーションを6時間および36時間の時間長で継続した。PYYは、ウエル（N=14）当たり250pmol、25pmolおよび2.5pmolの用量で細胞に添加した。試験化合物は、ウエル当たり400pmol、40pmolおよび4pmolの用量で細胞培養物に添加した。対照ウエルには、容量および付着腫瘍細胞に対する物理的障害を模倣するように2μLの0.9%食塩水を施した。各96ウエルプレートは、実験中に各プレート内での比較ができるように18の対照ウエルを含んでいた。PANC-1およびMiaPaCa-2細胞両方に関して、九十六（96）ウエルプレートを様々な濃度のPYYおよび試験化合物で6回繰り返した。

インキュベーション期間終了時、3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、MTｒテトラゾリウムブロマイド（Sigma, St. Louis, Mo.）を0.5mg/mLで新たな培地に添加した。培地を交換し、腫瘍細胞を4時間、MTTテトラゾリウムブロマイドと共に37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了時、培地を吸引した。ホルマゾン結晶沈殿を200μLのジメチルスルホキシド（Sigma, St. Louis, Mo.）に溶解した。可溶化ホルマゾンの定量は、ELISAリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, Calif.）を用いて500nm波長での吸収読取値を得ることにより行った。MTTアッセイによりミトコンドリアNADH依存性デヒドロゲナーゼ活性を測定した。このアッセイは、腫瘍細胞のインビトロ化学療法応答を定量する最も高感度で信頼できる方法の一つであった。（Alley, M. C., et al., Cancer Res., 48:589-601, 1988; Carmichael, J., et al., Cancer Res., 47:936-942, 1987; McHale, A. P., et al., Cancer Lett., 41:315-321, 1988; and Saxton, R. E., et al., J. Clin. Laser Med. and Surg., 10(5):331-336, 1992）。550nmでの吸収読取値の分析は、同じ試験条件のウェルをグループにし、対照と様々なペプチド濃度治療の間で発生する差を片側ANOVAにより検証することによって分析した。

例示的インビボアッセイも提供する。ヒト膵管腺癌Mia Paca-2を、YYおよび試験化合物によるインビボ増殖阻害について試験した。70,000から100,000のヒトMia PaCa-2細胞を、48の雄無胸腺マウスに正位移植した。一週間後、それらの動物を、PYYまたは試験化合物で、浸透圧ミニポンプにより200pmol/kg/時で四週間治療した。対の培養物には食塩水を施した。犠牲時、腫瘍のサイズと質量、両方を測定した。対照マウスは、組織切片により証明されるように膵臓内での有意なヒト癌増殖を有した。9週間の時点で、対照マウスの九十パーセント（90%）が、実質的な転移性疾患を有した。腫瘍質量は、試験治療マウスでは60.5%、PYY治療マウスでは27%減少された。

ハイブリッドは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチングトン病、ALS、卒中、ADDおよび神経精神症候群を含む（しかし、これらに限定されない）、ニューロン喪失または機能不全に随伴する神経疾患および神経系異常の治療的および予防的処置、ならびに哺乳動物における学習、記憶および認知の強化または助長にも有用である。これに関して特に有用なのは、エキセンジンまたはCLP1活性部分を含有するハイブリッド、さらに具体的には、少なくともN末端7-15アミノ酸またはそれらの類似体、例えば、HSEGTFTSD（配列番号：378）を含むハイブリッドである。

すべての適応症について、好ましい実施形態では、本発明のハイブリッドポリペプチドを、単回もしくは分割用量または継続的制御放出での一日当たり約0.5μgから約5mgの用量で、あるいは1用量当たり約0.01μg/kgから約500μg/kg、さらに好ましくは、約0.05μg/kgから約250μg/kg、最も好ましくは、約50μg/kg未満で末梢投与する。これらの範囲内の投薬量は、勿論、各類似体または誘導体の効力によって変わるものであり、当業者にはそうした投薬量を決定することができる。

本発明の方法において、本発明のハイブリッドポリペプチドは、アミリンもしくはアミリン類似体作動薬、サケカルシトニン、コレシストキニン（CCK）もしくはCCK作動薬、レプチン（OBタンパク質）もしくはレプチン作動薬、エキセンジンもしくはエキセンジン類似体作動薬、またはGLP-1もしくはGLP-1類似体作動薬を含む他の化合物および組成物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、栄養利用率を低下させる長期または短期作用を示す一つ以上の他の化合物および組成物と、別々にまたは一緒に投与することができる。適するアミリン作動薬としては、例えば、[^25,28,29Pro-]ヒトアミリン（配列番号：67）（「プラムリンチド」としても知られており、米国特許第5,686,511号および同第5,998,367号に記載されている）が挙げられる。使用されるCCKは、好ましくはCCKオクタペプチド（CCK-8）、さらに好ましくはその硫酸化形である。レプチンは、例えば、（Pelleymounter et al., Science 269: 540-3 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-6 (1995); Campfield et al., Science 269: 546-9 (1995)）において論じられている。適するエキセンジンとしては、エキセンジン-3およびエキセンジン-4が挙げられ、エキセンジン作動薬化合物としては、例えば、PCT公開公報WO 99/07404、WO 99/25727およびWO 99/25728に記載されているものが挙げられる。

本明細書で論じているように、本発明のハイブリッドは、一つ以上の他の薬剤と別々にまたは一緒に投与して、追加の利益を得ることまたはハイブリッドもしくは他の薬剤の効果を強化することができる。例えば、抗肥満ハイブリッドは、治療が必要なおよび治療の成果を望むその被験者に関係するリスク因子に依存して、抗肥満薬または心臓保護もしくは抗高血圧薬と共に投与することができる。ハイブリッドと共に投与（別々に投与または混合して投与；そのハイブリッドより前に、そのハイブリッドと同時にまたはそのハイブリッドの後に投与）するための例示的抗肥満薬としては、パロキセチン、フルオキセチン、フェンフルラミン、フルボキサミン、セルトラリンおよびイミプラミンをはじめとする（しかし、これらに限定されない）セロトニン（5HT）輸送阻害剤が挙げられる。抗肥満薬としては、デクスフェンフルラミン、フルオキセチン、シブトラミン（例えば、MERIDIA（登録商標））、ならびに米国特許第6,365,633号ならびにPCT特許出願公開番号WO 01/27060およびWO 01/162341（これらは、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている）に記載されているものを含む（しかし、これらに限定されない）選択的セロトニン取り込み阻害剤も挙げられる。こうした5HT輸送阻害剤およびセロトニン取り込み阻害剤、類似体、誘導体、製剤、調合物、医薬組成物、用量および投与経路は以前に記載されている。

抗肥満薬としては、米国特許第3,914,250号;ならびにPCT出願公開番号WO 02/36596、WO 02/48124、WO 02/10169、WO 01/66548、WO 02/44152、WO 02/51844、WO 02/40456およびWO 02/40457（これらは、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている）を含む（しかし、これらに限定されない）、選択的セロトニン作動薬および選択的5-HT2C受容体作動薬も挙げられる。提供する方法における使用に適する、そうした選択的セロトニン作動薬および5-HT2C受容体作動薬、そうした作動薬を含有する組成物および投与経路は、当該技術分野では公知である。例えば、Halford et al. (2005) Curr. Drug Targets 6:201-213 and Weintraub et al. (1984) Arch. Intern. Med. 144:1143-1148参照。

抗肥満薬としては、リモナバント（Sanofi Synthelabo）およびSR-147778（Sanofi Synthelabo）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、中枢カンナビノイド受容体（CB-1受容体）の拮抗薬／逆作動薬も挙げられる。CB-1拮抗薬／逆作動薬、誘導体、製剤、調合物、医薬組成物、用量および投与経路は、以前に、例えば、米国特許第6,344,474号、同第6,028,084号、同第5,747,524号、同第5,596,106号、同第5,532,237号、同第4,973,587号、同第5,013,837号、同第5,081,122号、同第5,112,820号、同第5,292,736号、同第5,624,941; 欧州特許出願番号EP-656354およびEP-658546;ならびにPCT出願公開番号WO 96/33159、WO 98/33765、WO 98/43636、WO 98/43635、WO 01/09120、WO 98/31227、WO98/41519、WO 98/37061、WO 00/10967、WO 00/10968、WO 97/29079、WO 99/02499、WO 01/58869およびWO 02/076949（これらは、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている）に記載されている。

抗肥満薬としては、メラノコルチンおよびメラノコルチン作動薬も挙げられる。受容体MC4Rは、エネルギーバランスおよび肥満において一定の役割を果すようである。例えば、Anderson et al., Expert Opin. Ther. Patents 11:1583-1592 (2001), Speake et al,. Expert Opin. Ther. Patents 12:1631-1638 (2002), Bednarek et al., Expert Opin. Ther. Patents 14:327-336 (2004)参照。提供する方法における使用に適する、MC4R作動薬およびそうした作動薬を含有する組成物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）メラノコルチン作動薬は、当該技術分野では公知である。MCR作動薬、MC4R作動薬、誘導体、製剤、調合物、医薬組成物、用量および投与経路は、以前に、例えば以下のPCT特許出願（これらは、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている）に記載されている：WO 03/007949、WO 02/068388、WO 02/068387、WO 02/067869、WO 03/040117、WO 03/066587、WO 03/068738、WO 03/094918、およびWO 03/031410。

抗肥満薬としては、2-メチル-6-(フェニルエチニル)-ピリジン(MPEP)および(3-[(2-メチル-1,3-チアゾール-4-イル)エチニル]ピリジン)(MTEP)ならびにAnderson et al. J. Eur. J. Pharmacol. 473:35-40 (2003); Cosford et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 13(3):351-4 (2003);およびAnderson et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:1044-1051 (2002)に記載されている化合物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）代謝調節型グルタミン酸サブタイプ5受容体も挙げられる。

抗肥満薬としては、抗痙攣薬および抗痙攣薬として指示されるが、体重減少を増加させることも証明されている、トピラメート（TOPIMAX（登録商標）（Ortho McNeil Pharmaceuticals））も挙げられる。薬剤は、オルリスタットなどのリパーゼ阻害剤も含む。

抗肥満薬としては、神経ペプチドY1（NPY1）拮抗薬およびNPY5拮抗薬も挙げられる。NPY1およびNPY5拮抗薬は、当該技術分野では公知である。例えば、Duhault et al. (2000) Can. J Physiol. Pharm. 78:173-185、ならびに米国特許第6,124,331号、同第6,214,853号および同第6,340,683号参照。PY1およびNPY5拮抗薬、誘導体、製剤、調合物、医薬組成物、用量および投与経路は、以前に記載されている。提供する組成物および方法において有用なNPY1拮抗薬としては、米国特許第6,001,836号;ならびにPCT出願公開番号WO 96/14307、WO 01/23387、WO 99/51600、WO 01/85690、WO 01/85098、WO 01/85173およびWO 01/89528が挙げられる。本明細書に提供する組成物および使用方法において有用なNPY5拮抗薬としては、米国特許第6,140,354号、同第6,191,160号、同第6,258,837号、同第6,313,298号、同第6,337,332号、同第6,329,395号、同第6,340,683号、同第6,326,375号および同第6,335,345号;欧州特許番号EP-01010691およびEP-01044970;ならびにPCT特許公開番号WO 97/19682、WO 97/20820、WO 97/20821、WO 97/20822、WO 97/20823、WO 98/27063、WO 00/64880、WO 00/68197、WO 00/69849、WO 01/09120、WO 01/85714、WO 01/85730、WO 01/07409、WO 01/02379、WO 01/02379、WO 01/23388、WO,01/23389、WO 01/44201、WO 01/62737、WO 01/62738、WO 01/09120、WO 02/22592、WO 0248152、WO 02/49648およびWO 01/14376に記載されている化合物が挙げられるが、これらに限定されない。

抗肥満薬としては、メラニン凝集ホルモン1受容体（MCH1R）拮抗薬、例えばT-226296（武田薬品工業株式会社（Takeda））、およびメラニン凝集ホルモン2受容体（MCH1R）拮抗薬をはじめとする、メラニン凝集ホルモン（MCH）拮抗薬も挙げられる。MCH受容体拮抗薬、誘導体、製剤、調合物、医薬組成物、用量および投与経路は、以前に、例えば、米国特許出願公開第2005/0009815号、同第2005/0026915号、同第2004/0152742号、同第2004/0209865号; PCT特許出願公開番号WO 01/82925、WO 01/87834、WO 02/06245、WO 02/04433およびWO 02/51809;ならびに日本特許出願 特開平13-226269（これらは、それら全体が参照により本明細書に取り入れられている）に記載されている。

抗肥満薬としては、PCT出願番号WO 00/21509に記載されているものをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、オピオイド拮抗薬も挙げられる。本明細書に提供する組成物および使用方法において有用な具体的なオピオイド拮抗薬としては、ナルメフェン（REVEX（登録商標））、3-メトキシナルトレキソン ナロキソン、ナルトレキソン、ナロキソナジン、ベータ-フナールトレキサミン、デルタ1（[D-Ala2,Leu5,Cys6]-エンケファリン（DALCE））、ナルトリンドールイソチオシアネート、およびノル-ビナルトルファミンが挙げられるが、これらに限定されない。

抗肥満薬としては、PCT特許出願番号WO 01/96302、WO 01/68609、WO 02/51232およびWO 02/51838に記載されているものをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、オレキシン拮抗薬も挙げられる。提供する組成物および使用方法において有用な、具体的なオレキシン拮抗薬としては、SB-334867-Aが挙げられるが、これに限定されない。

抗肥満薬としては、PYY3-36（例えば、Batterham et al. (2003) Nature 418:650-654）、NPY3-36および他のY2作動薬、例えばNアセチル[Leu(28,31)]NPY24-36（White-Smith et al. (1999) Neuropeptides 33:526-533）、TASP-V (Malis et al. (1999) Br. J. Pharmacol. 126:989-996)、シクロ-(28/32)-Ac-[Lys28-Glu32]-(25-36)-pNPY（Cabrele et al. (2000) J. Pept. Sci. 6:97-122）などの化合物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、神経ペプチドY2（NPY2）作動薬も挙げられ、これらは、論じたようなハイブリッド成分である場合もあり、または別々に投与される場合もある。提供する抗肥満薬としては、膵臓ペプチド（PP）（例えば、Batterham et al. (2003) J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:3989-3992）および他のY4拮抗薬、例えば1229U91（Raposinho et al. (2000) Neuroendocrinology 71:2-7）などの化合物をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、神経ペプチドY4（NPY4）作動薬も挙げられる。NPY2作動薬およびNPY4作動薬、誘導体、製剤、調合物、医薬組成物、用量および投与経路は、以前に、例えば、米国特許出願公開第2002/0141985号およびPCT出願公開番号WO 2005/077094に記載されている。

抗肥満薬としては、PCT出願番号WO 02/15905に記載されているもの、O-[3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノール]カルバメート（Kiec-Kononowicz et al. (2000) Pharmazie 55:349-355）、ピペリジン含有ヒスタミンH3-受容体拮抗薬（Lazewska et al. (2001) Pharmazie 56:927-932）、ベンゾフェノン誘導体および関連化合物（Sasse et al. (2001) Arch. Pharm.(Weinheim) 334:45-52）、置換N-フェニルカルバメート（Reidemeister et al. (2000) Pharmazie 55:83-86）およびプロキシファン誘導体（Sasse et al. (2000) J. Med. Chem. 43:3335-3343）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）、ヒスタミン3（H3）拮抗薬／逆作動薬も挙げられる。提供する組成物および使用方法において有用な、具体的なH3拮抗薬／逆作動薬としては、チオペラミド、3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロピルN-(4-ペンテニル)カルバメート、クロベンプロピット、ヨードフェンプロピット、イモプロキシファンおよびGT2394（Gliatech）が挙げられるが、これらに限定されない。

抗肥満薬としては、コレシストキニン（CCK）およびCCK作動薬も挙げられる。用いられるコレシストキニン-A（CCK-A）作動薬としては、米国特許第5,739,106号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。具体的なCCK-A作動薬としては、AR-R15849、GI181771、JMV-180、A-71378、A-71623およびSR146131が挙げられるが、これらに限定されない。

抗肥満薬としては、グレリン拮抗薬、例えば、PCT出願公開番号01/87335およびWO 02/08250に記載されているものも挙げられる。グレリン拮抗薬は、GHS（成長ホルモン分泌促進物質受容体）拮抗薬としても知られている。従って、提供する組成物および方法はグレリン拮抗薬の代わりにGHS拮抗薬を使用することも考えられる。

抗肥満薬としては、オベスタチンならびにオベスタチン類似体および作動薬が挙げられる。オベスタチンは、グレリンが誘導される同じ前駆体、プレプログレリンから誘導されるペプチドである。例えば、Zhang et al. (2005) Science 310: 996-999; Nogueiras et al. (2005) Science 310: 985-986; Pan et al. (2006) Peptides 27:911-916参照。グレリンの活性とは対照的に、オベスタチンは、食事摂取量、胃内容排出活性、空腸の運動性、および体重増加を減少させることにより、食欲抑制ホルモンとして作用するようである。用いられるオベスタチンペプチドとしては、Zhang et al. (2005) Science 310: 996-999に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

そして、アミリン模倣体、例えばプラムリンチド、アミリン-sCT-アミリン（化合物10）、インクレスチン、例えばエキセンジン-4、およびPYY類似体は、抗肥満薬としてハイブリッドと共に投与することもできる抗肥満薬である。例えば、レプチン−化合物10ハイブリッドを、エキセンジン−4、PYY類似体または両方と共に投与することができる。別の実施形態では、レプチン-PYY類似体ハイブリッドを、エキセンジン-4、アミリン模倣体または両方と共に投与することができる。

本明細書において論じるような糖尿病および関連疾患を治療するために特に興味深い実施形態には、エキセンジンファミリーおよびアルファ-MSHモジュール、ならびエキセンジンおよびアミリンファミリーメンバーを含むハイブリッドがある。エキセンジンがエキセンジン-4またはその類似体もしくは誘導体であり、アミリン成分がプラムリンチドまたはアミリン-sCT-アミリンキメラであるハイブリッドは、特に興味深い。

本明細書において論じるような肥満ならびに関連疾患および状態を治療する（体脂肪減少）ために特に興味深い実施形態には、アルファ-MSHモジュールとの組み合わせでエキセンジンファミリー、エキセンジンとアミリンファミリーメンバー、アミリンファミリーメンバーとPYYファミリーメンバー、アミリンファミリーメンバーとCCKファミリーメンバー、アミリンファミリーメンバーとアルファ-MSHファミリーメンバー、FN-38ファミリーメンバー、アミリンファミリーメンバーとPYYファミリーメンバー、PYYファミリーメンバーと別の同じまたは異なるPYYファミリーメンバー、PPYファミリーメンバーとCCKファミリーメンバー、PYYファミリーメンバーとFN-38ファミリーメンバー、CCKファミリーメンバーとFN-38ファミリーメンバーを含むハイブリッドがある。エキセンジンがエキセンジン-4またはその類似体もしくは誘導体であり、アミリン成分がプラムリンチドまたはアミリン-sCT-アミリンキメラであり、FN38ファミリーメンバーがFN38またはその類似体もしくは誘導体であり、PYYキメラが、本明細書に記載するようなPYY-NPYキメラ、例えば、US 2006/013547A1の配列番号266、437、438、439、442、462、469、470、471および472、ならびにPYY-NPYキメラ5705であるハイブリッドは、特に興味深い。
ペプチド生産および精製

本明細書に記載するハイブリッドポリペプチドは、当該技術分野において公知である標準的な組換え技術またはキメラペプチド合成技術を用い、例えば、自動もしくは半自動ペプチド合成装置または両方を用いて作製することができる。

本発明のハイブリッドポリペプチドは、従来の技術に従って、溶液状態でまたは固体支持体上で合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコルに従ってそれらを使用することができる。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-7 (1986);およびBarany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, 1-284 (1979)参照。固相ペプチド合成は、NMP/HOBt（Option 1）系およびtBocまたはFmoc化学（Applied Biosystems User’s Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California参照）とキャッピングとを用いて、自動ペプチド合成装置（例えば、Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California）で行うことができる。Advanced Chem Tech Synthesizer（Model MPS 350, Louisville, Kentucky）を使用してペプチドを組み立てることもできる。ペプチドは、例えば、Waters Delta Prep 3000システムおよびC4、C8またはC18分取カラム（10μ、2.2x25cm; Vydac, Hesperia, California）を使用して、RP-HPLC（分取および分析的）によって精製することができる。活性ペプチドを容易に合成することができ、その後、反応性ペプチドを特定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングすることができる。

あるいは、当該技術分野では周知の組換え技術によって、本発明のハイブリッドポリペプチドを生産することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor (1989)参照。組換え技術によって生産されたこれらのハイブリッドポリペプチドは、ポリヌクレオチドから発現させることができる。ハイブリッドポリペプチドのそうした様々なフラグメントをコードする、DNAおよびRNAをはじめとするポリヌクレオチドを、コドンの縮重の使用を考慮して野生型ｃDNAから得ることができ、または所望により設計作製することができることは、当業者には理解されるであろう。これらのポリヌクレオチド配列は、微生物宿主におけるmRNAの転写および翻訳を助長するコドンに組み込むことができる。そうした製造配列は、当該技術分野では周知の方法に従って容易に構築することができる。例えば、WO 83/04053参照。上のポリヌクレオチドは、場合によってはN末端メチオニル残基をコードすることもできる。本発明において有用な非ペプチド化合物は、当該技術分野では公知の方法によって作製することができる。例えば、リン酸含有アミノ酸およびそうしたアミノ酸を含有するペプチドを、当該技術分野では公知の方法を用いて作製することができる。例えば、Bartlett and Landen, Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986)参照。

ハイブリッドポリペプチドコーディング配列を収容し、発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系を利用することできる。これらとしては、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）でトランスフェクションされたもしくは細菌発現ベクター（例えば、TiもしくはpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。組換えタンパク質生産において有用である哺乳動物細胞としては、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系統、COS細胞（例えば、COS-7）、WI38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562および293細胞が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の組換え発現のための例示的プロトコルは、本明細書中で説明する。

従って、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列は、新規で有用なウイルスおよびプラスミドDNAベクターの産生、新規で有用な形質転換およびトランスフェクションされた原核および真核宿主細胞（培養で増殖させた細菌、酵母および哺乳動物細胞を含む）の産生、ならびに本発明のハイブリッドポリペプチドを発現することができるそうした宿主細胞の培養増殖のための新規で有用な方法において有用である。本明細書におけるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、そのキメラの成分ペプチドホルモン（単数または複数）の生産不足を緩和する場合、またはそうしたもののレベル増加の必要性を満たす場合の遺伝子療法に有用であり得る。

本発明は、ハイブリッドポリペプチドの組換えDNA生産のためのプロセスも提供する。ハイブリッドポリペプチドを、そうしたハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞から生産するためのプロセスを提供し、このプロセスは、(a)そうしたハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する前記宿細胞を、そうしたDNA分子の発現を助長する条件下で培養すること；および(b)そうしたハイブリッドポリペプチドを得ることを含む。

宿主細胞は、原核細胞である場合もあり、または真核細胞である場合もあり、細菌、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル細胞、ベビーハムスター腎細胞、癌細胞または他の細胞）、酵母細胞および昆虫細胞を含む。

組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系も当業者には周知である。宿主株は、タンパク質活性を生じさせるのに有用であろう発現されたタンパク質をプロセッシングするまたは一定の後翻訳修飾を生じさせる特定の能力について選択することができる。ポリペプチドのそうした修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グルコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する後翻訳プロセッシングも、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能に重要であり得る。種々の宿主細胞、例えば、CHO、HeLa、MDCK、293、WI38などは、そうした後翻訳活性のための特異的細胞機械および特徴的メカニズムを有し、ならびに導入された異種タンパク質を確実に正しく修飾およびプロセッシングするように選択することができる。

あるいは、酵母系を利用して、本発明のハイブリッドポリペプチドを作製することができる。ハイブリッドポリペプチドｃDNAのコーディング領域をPCRによって増幅する。酵母プレ−プロ−アルファリーダー配列をコードするDNAを、酵母ゲノムDNAから、そのアルファマッチング因子遺伝子のヌクレオチド1-20を含有する一つのプライマーと、この遺伝子のヌクレオチド255-235に相補的な別のプライマーとを使用するPCR反応で増幅させる（Kurjan and Herskowitz, Cell, 30: 933-43 (1982)）。このプレ−プロ−アルファリーダーコーディング配列およびハイブリッドポリペプチドコーディング配列フラグメントを、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH2）プロモーターを含有するプラスミドにライゲートするので、そのプロモーターが、成熟ハイブリッドポリペプチドに融合したプレ−プロ−アルファリーダー因子から成る融合タンパク質の発現を命令する。Rose and Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990)により教示されるように、このベクターは、そのクローニング部位の下流のADH2転写ターミネーター、酵母「2-ミクロン」複製起点、酵母leu-2d遺伝子、酵母REP1およびREP2遺伝子、大腸菌（E. coli）β-ラクタマーゼ遺伝子、ならびに大腸菌複製起点をさらに含む。β-ラクタマーゼおよびleu-2d遺伝子は、それぞれ、細菌および酵母における選択に対処する。leu-2d遺伝子は、酵母におけるプラスミドのコピー数増加も助長して、より高い発現レベルを誘導する。REP1およびREP2遺伝子は、プラスミドコピー数の調節に関与するタンパク質をコードする。

公知の方法、例えば、酢酸リチウム処理（Steams et al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990)）を用いて、前の段落で説明したDNA構築物を酵母細胞に形質転換させる。ADH2プロモーターは、増殖培地中のグルコースが枯渇すると誘発される（Price et al., Gene 55: 287 (1987)）。プレ−プロ−アルファ配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌に影響を及ぼす。付随して、酵母KEX2タンパク質が、成熟PYY類似体ポリペプチドからそのプレ−プロ配列を切断する（Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984)）。

本発明のハイブリッドポリペプチドは、市販の発現系、例えば、Pichia Expression System（Invitrogen, San Diego, California）を、その製造業社の使用説明書に従って使用して、酵母において組換え発現させることもできる。この系も、プレ−プロ−アルファ配列に依存して分泌を命令するが、その挿入の転写は、メタノールによる誘導に基づきアルコールオキシダーゼ（AOX1）プロモーターによって行われる。分泌されたハイブリッドポリペプチドは、例えば、細菌および哺乳動物細胞上清からハイブリッドポリペプチドを精製するために用いられる方法により、酵母増殖培地から精製する。

あるいは、ハイブリッドポリペプチドをコードするｃDNAを、バキュロウイルス発現ベクターpVL1393（PharMingen, San Diego, California）にクローニングすることができる。その後、このハイブリッドポリペプチド含有ベクターを、その製造業社の説明書（PharMingen）に従って使用して、sF9タンパク質不含培地においてツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞を感染させ、組換えタンパク質を生産する。そのタンパク質は、ヘパリン−セファロースカラム（Pharmacia, Piscataway, New Jersey）および逐次分子量サイジングカラム（Amicon, Beverly, Massachusetts）を使用して培地から精製および濃縮し、PBSに再び懸濁させる。SDS-PAGE分析により、単結合を証明し、そのタンパク質のサイズを確認し、ならびにProton 2090 Peptide SequencerでのEdman塩基配列決定法によりN末端配列を確認する。

例えば、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA配列を、所望のプロモーターおよび場合によってはリーダー配列を含有するプラスミドに、クローニングすることができる（例えば、Better et al., Science 240: 1041-3(1988)参照）。この構築物の配列を、自動塩基配列決定により確認することができる。その後、CaCl₂インキュベーションおよび細菌の熱ショック処理を利用する標準的な手順（Sambrook et al., （上記））を用いて、そのプラスミドを大腸菌、MC1061株に形質転換させる。形質転換された細菌を、カルベニシリンを補足したLB培地中で増殖させ、適切な倍地中での増殖により、発現タンパク質の生産を誘導する。存在する場合、リーダー配列は、ハイブリッドポリペプチドの分泌を促進し、分泌中に切断されることとなる。分泌された組換えタンパク質を、本明細書中で説明する方法により細菌培地から精製する。

あるいは、本発明のハイブリッドポリペプチドは、昆虫系において発現させることができる。タンパク質発現のための昆虫系は、当業者には周知である。一つのそうした系において、オートグラファ・カルフォルニカ（Autographa californica）核多角体ウイルス（AcNPV）をベクターとして使用して、ツマジロクサヨトウ細胞においてまたはイラクサギンウワバ（Trichoplusia）幼虫において異種遺伝子を発現させる。ハイブリッドポリペプチドコーディング配列をそのウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子にクローニングし、そのポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。ハイブリッドポリペプチドの成功裏の挿入は、そのポリヘドリン遺伝子を不活性化させ、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスを産生させる。その後、それらの組換えウイルスを使用して、ツマジロクサヨトウ（S. frugiperda）細胞またはイラクサギンウワバ幼虫を感染させ、それらにおいてハイブリッドポリペプチドを発現させる（Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994)）。

別の実施形態では、ハイブリッドポリペプチドをコードするDNA配列をPCRによって増幅し、適切なベクター、例えば、pGEX-3X（Pharmacia, Piscataway, New Jersey）にクローニングすることができる。このpGEXベクターは、そのベクターによってコードされた、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合タンパク質と、そのベクターのクローニング部位に挿入されたDNAフラグメントによってコードされたタンパク質とを生産するように設計されている。PCRのためのプライマーは、例えば適切な切断部位を含むように、作製することができる。その後、組換え融合タンパク質を、その融合タンパク質のGST部分から切断することができる。そのpGEX-3X/PYY類似体ポリペプチド構築物を大腸菌XL-1 Blue細胞（Stratagene, La Jolla, California）に形質転換させ、個々の形質転換体を単離し、LB培地（カルベニシリンを補足したもの）中、37℃で、0.4の波長600nmでの光学密度まで増殖させ、その後、0.5mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri）の存在下で4時間、さらにインキュベーションする。個々の形質転換体からのプラスミドDNAを精製し、自動塩基配列決定装置を使用して部分的に塩基配列を決定して、所望のPPFハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子挿入物の正しい配向での存在を確認する。

細菌において不溶性封入体として生産されると予想される融合タンパク質は、次のように精製することができる。細胞を遠心分離によって回収し；0.15MのNaCl、10mMのTris、pH8、1mMのEDTA中で洗浄し；室温で15分間、0.1mg/mLのリソザイム（Sigma Chemical Co.）で処理する。溶解産物を超音波処理によって清澄化し、10分間、12,000xgでの遠心分離により細胞破壊片をペレット化する。その融合タンパク質含有ペレットを、50mMのTris、pH8、および10mMのEDTAに再び懸濁させ、50%グリセロールを層状に重ね、30分間、6000xgで遠心分離する。そのペレットを、Mg⁺⁺およびCa⁺⁺不含の標準リン酸緩衝食塩溶液（PBS）に再び懸濁させる。その融合タンパク質を、変性SDSポリアクリルアミドゲル中でのその再懸濁ペレットの分画（Sambrook et al., （上記））によって、さらに精製する。そのゲルを0.4MのKClに浸漬させてタンパク質を視覚化し、それを切除し、ゲル−ランニング緩衝液なしのSDSで電気溶出する。GST/PYY類似体ポリペプチド融合タンパク質を細菌において可溶性タンパク質として生産する場合、GST精製モジュール（Pharmacia Biotech）を使用してそれを精製することができる。

その融合タンパク質を消化に付して、PPFハイブリッドポリペプチドからGSTを切断する。その消化反応物（0.5mL PBS中、20-40μg融合タンパク質、20-30単位ヒトトロンビン（4000U/mg（Sigma））を16-48時間、室温でインキュベーションし、変性SDS-PAGEゲル上に負荷して、反応生成物を分画する。そのゲルを0.4MのKClに浸漬させてタンパク質バンドを視覚化する。ハイブリッドポリペプチドの予想分子量に対応するタンパク質バンドの素性は、自動塩基配列決定装置（Applied Biosystems Model 473A, Foster City, California）を使用する部分的アミノ酸配列分析によって確認することができる。

本発明のハイブリッドポリペプチドの特に好ましい組換え発現法では、293細胞を、リン酸カルシウム法により、pCMVベクター（5'CMVプロモーター、3’HGHポリA配列）およびpSV2neo（neo耐性遺伝子を含有する）中、ハイブリッドポリペプチドｃDNAを含有するプラスミドでコ・トランスフェクションする。好ましくは、トランスフェクション前にこれらのベクターをScaIで線形化すべきである。同様に、neo遺伝子が組み込まれた類似のpCMVを使用する代替構築を用いることができる。10-14日間、0.5mg/mLのG418（ネオマイシン様抗生物質）を含有する増殖培地中での限界希釈により、単個細胞クローンから安定な細胞系統を選択する。ELISAまたはウエスタンブロットによりハイブリッドポリペプチドの発現について細胞系統をスクリーニングし、高発現性細胞系統を大規模増殖のために増幅する。

長期の高収率タンパク質生産には形質転換細胞を使用することが好ましく、それ自体、安定な発現が望ましい。そうした細胞を、所望の発現カセットと共に選択可能マーカーを含有するベクターで形質転換したら、それらの細胞を栄養強化培地中で1-2日間放置して増殖させ、その後、選択培地に切り替える。選択可能マーカーは、耐選択性を付与するように設計され、ならびにその存在により、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性集塊は、その細胞に適する組織培養技術を用いて増殖させることができる。

組換えタンパク質生産のために形質転換された細胞を回収するために、多数の選択系を使用することができる。そうした選択系としては、tk-、hgprt-またはaprt-細胞における、それぞれ、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホロリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホロリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt；アミノグリコシド、G418に対する耐性を付与する、およびクロルスルフロンに対する耐性も付与するneo；ならびにヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygroについての選択の基準として用いることができる。有用であり得るさらなる選択可能遺伝子としては、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisDが挙げられる。形質転換体の特定のための視覚的指標を与えるマーカーとしては、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質、GUS、ならびにルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンが挙げられる。

本発明のハイブリッドポリペプチドの多くは、自動ペプチド合成と組換え技術との両方を併用して生産することができる。例えば、本発明のハイブリッドポリペプチドは、PEG化による欠失、置換および挿入を含む修飾の組み合わせを含有する。こうしたハイブリッドポリペプチドは、段階的に生産することができる。第一段階では、欠失、置換、挿入およびそれらの任意の組み合わせの修飾を含む中間ポリペプチドを、説明されているような組換え技術によって生産することができる。次に、本明細書において説明するような任意選択の精製段階の後、適切なPEG化試薬（例えば、Nektar Therapeutics, San Carlos, Californiaからのもの）での化学的修飾によってその中間ポリペプチドをPEG化して、所望のハイブリッドポリペプチドを生じさせる。欠失、置換、挿入、誘導および当該技術分野では周知であり、本発明によって考えられる他の修飾手段から選択される修飾の組み合わせを含むハイブリッドポリペプチドに適用するために、上で説明した手順を一般化できることは、当業者には理解されるであろう。

本発明によって作製されるハイブリッドポリペプチドを精製することが望ましい場合もある。ペプチド精製技術は、当業者には周知である。これらの技術は、あるレベルで、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を含む。他のタンパク質からポリペプチドを分離した場合、対象となるポリペプチドを、クロマトグラフおよび電気泳動技術を用いてさらに精製して、軽度または完全精製（すなわち、均一まで精製）を達成することができる。純粋なペプチドの作製に特に適する分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法および等電収束法である。特に有効なペプチド精製法は、逆相HPLC、その後の液体クロマトグラフィー／質量分析法（LC/MS）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法による精製産物の特性付けである。精製のさらなる確認は、アミノ酸分析の判定によって達成される。

本発明の一定の態様は、コードされたタンパク質またはペプチドの精製、および特定の実施形態では、実質的な精製に関する。本明細書で用いる用語「精製ペプチド」は、他の成分から単離可能な組成物を指すためのものであり、この場合のペプチドは、その自然に得ることができる状態を基準にして任意の程度に精製されている。従って、精製ペプチドは、それが自然発生し得る環境がないペプチドも指す。

一般に、「精製された」は、分画に付して様々な他の成分を除去したペプチド組成物であって、その発現された生物学的活性を実質的に保持している組成物を指すであろう。用語「実質的に精製された」が用いられている場合、この明示は、そのペプチドが、その組成物の主成分を形成する組成物、例えば、そのペプチドが、その組成物中のペプチドの約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれ以上を構成する組成物を指すであろう。

ペプチド精製での使用に適する様々な技術は、当業者には周知であろう。これらとしては、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などでの沈降法；熱変性、その後の遠心分離；クロマトグラフィー段階、例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、水酸アパタイトおよび親和クロマトグラフィー；等電収束法；ゲル電気泳動法；ならびにこうしたおよび他の技術の組み合わせが挙げられる。当該技術分野において一般に知られているように、様々な精製段階を行う順序を変えることができ、または一定の段階を削除することができ、そしてそれにもかかわらず、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの適する作製方法が得られると考えられる。

ペプチドを、常に、それらの最も精製された状態で提供する必要は一般にない。実際、一定の実施形態では、さほど実質的に精製されていない生成物が利用されるだろうと考えられる。軽度精製は、より少ない精製段階を併用することにより、または同じ一般精製スキームの異なる形式を利用することにより達成することができる。例えば、HPLC装置を利用して行われるカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術より「-倍」優れた精製をもたらすであろう。低い相対精製度を示す方法のほうが、タンパク質生成物の総回収率の点、または発現されたタンパク質の活性の維持の点で有利であり得る。

場合によっては、そうしたハイブリッドポリペプチドを、そのプロセスにおいて得られる他の成分から精製および単離することがある。ポリペプチドの精製方法は、米国特許第5,849,883号において見出すことができる。これらの文献には、本発明のハイブリッドポリペプチドの単離および精製に有用であり得る、G-CSF組成物の単離および精製のための特定の例示的方法が記載されている。これらの特許の開示からして、所与の源からのハイブリッドポリペプチドの精製に用いることができる非常に多数の精製技術を当業者がよく知っていることは明らかである。

また、アニオン交換クロマトグラフィーと免疫親和性クロマトグラフィーとの組み合わせを利用して、本発明の精製ハイブリッドポリペプチド組成物を生産できると考えられる。
医薬組成物

本発明は、本発明の少なくとも一つのハイブリッドポリペプチド、またはその医薬的に許容される塩の治療もしくは予防有効量と共に、それらのハイブリッドポリペプチドの送達に有用な医薬的に許容される希釈剤、保存薬、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬組成物にも関する。こうした組成物は、様々な緩衝剤含量（例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、pHおよびイオン強度の希釈剤；添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween 80、ポリソルベート80）、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存薬（例えば、チメルゾール、ベンジルアルコール）、および充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の粒状製剤へのまたはリポソームと共同での材料の組み込みを含むことがある。こうした組成物は、ハイブリッドポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990)参照。

一般に、ハイブリッドポリペプチドは、個々の成分ポリペプチドがそれらの薬理特性に鑑みて有用であるのと同様に有用である。一つの好ましい用途は、メタボリック状態および代謝異常の治療または予防のためのそうしたハイブリッドポリペプチドの末梢投与である。詳細には、本発明の化合物は、栄養利用率を低下させる、食事摂取量を減少させる、食欲を抑制する、および体重減少をもたらす薬剤としての活性を有する。別の実施形態において、好ましい用途は、糖尿病または糖尿病に関連した状態および異常の治療のためのそうしたハイブリッドポリペプチドの投与である。

ハイブリッドポリペプチドは、注射、経口投与、鼻投与、肺投与、局所投与、または当業者にはわかるであろう他のタイプの投与のための調合を含めて、抹消投与のために調合することができる。さらに詳細には、本発明による医薬組成物の投与は、ターゲット組織をその経路経由で利用できる限り、いずれの一般的経路を経由するものであってもよい。好ましい実施形態において、医薬組成物は、任意の従来的末梢法によって、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、球後、肺内（例えば、期間限定放出）送達によって；経口、舌下、鼻、肛門、膣もしくは経皮送達によって；または特定部位での外科的内植によって被験者に導入することができる。この治療は、単回用量から成る場合もあり、または一定期間にわたっての多回用量から成る場合もある。本発明の組成物の継続的制御放出も考えられる。

調合物は、液体である場合もあり、または再構成のための固体、例えば凍結乾燥されたものである場合もある。本発明の水性組成物は、医薬的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させたハイブリッドポリペプチドの有効量を含む。句「医薬的にまたは約理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与されたとき、副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じさせない分子単位および組成物を指す。本明細書で用いる場合、「医薬的に許容される担体」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、殺菌および殺真菌剤、等張および吸収遅延性薬剤などを包含する。医薬活性物質のためのそうした媒体および薬剤の使用は、当該技術分野では周知である。任意の従来的媒体または薬剤が活性成分と非相溶性である限りを除き、治療組成物におけるその使用が考えられる。補足的活性成分を本組成物に組み込むこともできる。一部の事例では、本発明のハイブリッドポリペプチドと、別の食事摂取減少、糖尿病治療、血漿グルコース低下または血漿脂質改変剤、例えば、アミリン、アミリン作動薬類似体、CCKもしくはCCK作動薬、またはレプチンもしくはレプチン作動薬、またはエキセンジンもしくはエキセンジン作動薬類似体とを一緒に投与するための単一組成物または溶液の状態で提供することが便利であろう。他の事例では、前記ハイブリッドポリペプチドとは別に追加の薬剤を投与する方が有利であり得る。

本発明のハイブリッドポリペプチドは、投与のために、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中の遊離塩基または薬理学的に許容される塩の溶液として調製することができる。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質のアミノ基とで形成されたもの）および例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とで形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基とで形成された塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。こうした生成物は、当業者には周知の手順によって容易に調製される。グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中、および油中の分散液を調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存薬を含有する。

一つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、末梢投与、例えば注射または注入による投与に適するように調合する。好ましくは、ハイブリッドポリペプチドは、水性担体に、例えば、約3.0から約8.0のpH、好ましくは約3.5から約7.4、3.5から6.0、または3.5から約5.0のpHの等張緩衝溶液に懸濁させる。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナトリウム−リン酸、ならびに酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が挙げられる。持続性または「デポー」遅速放出製剤の形態を用いて、経皮注射または送達後にその製剤の治療有効量を多くの時間または日数にわたって血流に送達することもできる。

注射用用途に適する医薬組成物としては、滅菌水溶液または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。すべての場合、この形態は、滅菌したものであるべきであり、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。本発明のハイブリッドポリペプチドが、製造および保管条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならないことも望ましいことである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適する混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、コーティング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合には必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含める方が好適であろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物での使用によってもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した様々な他の成分と共に配合し、その後、滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒と上に列挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌活性成分を配合することによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と、それらを事前に滅菌濾過した溶液からの任意の追加の望ましい成分との粉末を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥である。

一般に、ハイブリッドポリペプチドの治療または予防有効量は、レシピエントの年齢、体重および状態またはその疾病、状態もしくは障害の重症度によって決定されるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 697-773参照。Wang and Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988)も参照。典型的には、約0.001μg／体重kg／日から約1000μg／体重kg／日の間の投薬量を使用することができるが、当業者にはわかるように、それより多いまたは少ない投薬量を使用することもできる。投薬は、一日一回以上である場合もあり、またはそれより少ない頻度である場合もあり、ならびに本明細書に記載するような他の組成物と共にである場合もある。本発明は、本明細書に列挙する投薬量に限定されないことに留意しなければならない。

適切な投薬量は、関連した用量−応答データと共にメタボリック状態または代謝異常のレベルを判定するための確立されたアッセイを用いることより突き止めることができる。最終的な薬剤投与計画は、薬物の作用を修飾する因子、例えば、その薬物の特異的活性、傷害の重症度および患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、任意の感染の重症度、投薬回数ならびに他の臨床因子を考慮して担当医が決定することとなる。研究を行うにつれて、特定の疾患および状態についての適切な投薬レベルおよび治療期間に関するさらなる情報が出てくるであろう。

50kgの患者について単回用量または分割用量で投与される有効な用量は、一般に、約1から30μgから約5mg／日、好ましくは、約10から30μgから約2mg／日、さらに好ましくは、約5から100μgから約1mg／日、最も好ましくは、約5μgから約500μg／日であろう。好ましくは、投薬量は、約0.01から約100μg／kg／用量の間である。投薬すべき正確な用量は、当業者が決定でき、また個々の化合物の効力、ならびに個体の年齢、体重および状態に依存する。投与は、例えば、栄養利用の抑制、食事摂取量、体重、血糖または血漿脂質の調整が望まれる時にいつでも、例えば、肥満、糖尿病もしくはインスリン抵抗性症候群の、症状の最初の徴候時または診断の直後に開始すべきである。投与は、任意の経路、例えば、注射、好ましくは皮下または筋肉内注射、経口経路、経鼻経路、経皮経路などによるものであり得る。一定の経路、例えば経口投与のための投薬量は、バイオアベイラビリティ低下を考慮して、例えば約5-100倍増加させることがある。

非経口投与は、最初はボーラスで、その後、薬品の治療循環レベルを維持するために持続注入で行うことができる。通常の当業者は、十分な医療経験および個々の患者の臨床状態により判定して、有効な投薬量および投薬計画を容易に最適化するであろう。

投薬頻度は、薬剤の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存するであろう。最適な医薬調合は、投与経路および所望の投薬量に依存して、当業者が決定することとなろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,（上記）、1435-1712頁参照。そうした調合は、投与される薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。投与経路に依存して、体重、体表面積または器官サイズに従って、適する用量を計算することができる。適切な治療用量を決定するために必要な計算のさらなる改善は、特に、本明細書に開示する投薬量情報およびアッセイ、ならびに動物またはヒト臨床試験において観察された薬物動態データに鑑みて、過度の実験を伴わずとも通常の当業者により日常的に行われる。

本発明の医薬組成物および治療方法は、人間医学および獣医学の分野で有用であり得ることは理解されるであろう。従って、治療され得る被験者は、哺乳動物、好ましくはヒトまたは他の動物であり得る。獣医学的用途のための被験者としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびヤギをはじめとする家畜、イヌおよびネコなどのペット、外国産および／または動物園の動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターをはじめとする実験動物、ならびにニワトリ、シチメンチョウ、カモ類およびガチョウなどの家禽が挙げられる。

加えて、本発明は、本発明のハイブリッドポリペプチドと、医薬用途のための本発明の前記ハイブリッドポリペプチドの作製に適する成分と、医薬用途のための前記ハイブリッドポリペプチドおよび成分を使用するための使用説明書とを含むキットを意図している。

本発明の理解を助けるために、以下の実施例を含める。本発明に関する実験は、勿論、本発明を具体的に限定するものと解釈すべきなく、ならびに当業者の範囲内であろう、現在わかっているまたは後に開発されるような本発明の変形は、本明細書に記載するおよび下の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲内に入ると考える。

DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 DIOマウスアッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 親ペプチド化合物と比較した、食餌摂取アッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 親ペプチド化合物と比較した、食餌摂取アッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 それぞれ、血糖低下アッセイおよび食餌摂取アッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 それぞれ、血糖低下アッセイおよび食餌摂取アッセイにおける本発明の例示的化合物の効果を実証する図である。 本明細書で使用した様々な例示的リンカーの構造を示す図である。 様々な例示的リンカーの構造、ならびに例示的PYYおよびアミリンファミリーハイブリッドの配列およびインビトロ活性を示す図である。 様々な例示的リンカーの構造、ならびにさらなる例示的PYY/PYYファミリーハイブリッドの配列およびインビトロ活性を示す図である。 例示的PYYおよびアミリンファミリーハイブリッドによる体重の減少を示す図である。 CCK受容体を有する細胞系統におけるCCK8ファミリーハイブリッドによるカルシウム動員のグラフである。 アミリン、例えばアミリン-sCT-アミリン、およびPYY（例えば、PYY-NPYキメラ）ファミリーハイブリッドによる食餌抑制を示す図である。 アミリン、例えばアミリン-sCT-アミリン、およびPYY（例えば、PYY-NPYキメラ）ファミリーハイブリッドによる食餌抑制を示す図である。 アミリン、例えばアミリン-sCT-アミリン、およびPYY（例えば、PYY-NPYキメラ）ファミリーハイブリッドによる食餌抑制を示す図である。 図12Aは、アミリン-sCT-アミリン／PYYファミリーハイブリッドによる全食餌摂取量の減少を示す図であり、図12Bは、体重の減少を示す図である。「^＊」は、ビヒクルと比較してP<0.05を示す。 図12Aは、アミリン-sCT-アミリン／PYYファミリーハイブリッドによる全食餌摂取量の減少を示す図であり、図12Bは、体重の減少を示す図である。「^＊」は、ビヒクルと比較してP<0.05を示す。 PYY/PYYファミリーハイブリッドによる食餌摂取の抑制を示す図である。用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 アミリンまたはPYYファミリー成分のいずれかを有するCKKファミリーハイブリッドの食餌摂取活性の抑制を示す図である。用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 アミリンまたはPYYファミリー成分のいずれかを有するCKKファミリーハイブリッドの食餌摂取活性の抑制を示す図である。用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 アミリンまたはPYYファミリー成分のいずれかを有するMSHファミリーハイブリッドの食餌摂取活性の抑制を示す図である。用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 アミリンまたはPYYファミリー成分のいずれかを有するMSHファミリーハイブリッドの食餌摂取活性の抑制を示す図である。用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 図16Aは、MSHファミリー成分およびアミリン、例えばアミリン-sCT-アミリン、ファミリー成分を有するハイブリッドによる全食餌摂取量の減少を示す図であり、図16Bは、体重の減少を示す図である。「^＊」は、ビヒクルと比較してP<0.05を示す。 図16Aは、MSHファミリー成分およびアミリン、例えばアミリン-sCT-アミリン、ファミリー成分を有するハイブリッドによる全食餌摂取量の減少を示す図であり、図16Bは、体重の減少を示す図である。「^＊」は、ビヒクルと比較してP<0.05を示す。 FN-38ファミリー成分および示されている第二ファミリー成分を含有するハイブリッドによる食餌摂取の抑制を示す図である。図17A−FN38とアミリンファミリー成分、アミリン-sCT-アミリンキメラ化合物10。図17B--FN38とPYYファミリー成分、PYY-3-36。図17C--FN38とPYYファミリー成分、PYY-NPYキメラ。図17D--FN38とCCK8ファミリー成分、CCK8。用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 エキセンジンファミリーおよびアミリンファミリー成分を含有するハイブリッドによる食餌摂取の抑制を示す図である。別に示さない場合、用量は、25nmol/kgであった。〜15-20%の差は、統計学的に有意である。 エキセンジン／アミリンファミリーハイブリッドによる、暗サイクル飼育中の食餌摂取抑制および全食餌摂取の長期抑制を示す図である。 エキセンジン／アミリンファミリーハイブリッドによる、暗サイクル飼育中の食餌摂取抑制および全食餌摂取の長期抑制を示す図である。 親分子と比較した例示的エキセンジン／アミリン-sCT-アミリンファミリーハイブリッドの食餌摂取の長期抑制および除脂体重を残す（lean-sparing）体重減少および脂肪減少活性を示す図である。「^＊」は、ビヒクルと比較してP<0.05を示す。 親分子と比較した例示的エキセンジン／アミリン-sCT-アミリンファミリーハイブリッドの食餌摂取の長期抑制および除脂体重を残す（lean-sparing）体重減少および脂肪減少活性を示す図である。「^＊」は、ビヒクルと比較してP<0.05を示す。 ラットにおける14日治療後の代謝パラメータに対するハイブリッドの効果を実証する図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。 本明細書に記載の食餌摂取量アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、例えば、PYY-NPYキメラ化合物4883および5705の能力を示す図である。

（実施例）
以下の非限定的実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をさらに十分に例証するために提供するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。これらの実施例は、本ハイブリッドポリペプチドの作製、本発明のこれらのハイブリッドポリペプチドのインビトロおよび／またはインビボでの試験を例証するものである。これらの実施例に記載する技術は、本発明の実施の際に十分に機能するように本発明者らが記載する技術の代表であり、従って、本発明の実施のための好ましい様式の構成要素であることは、当業者には理解されるであろう。しかし、当業者が、本開示に鑑みて、本発明の精神および範囲を逸脱することなく開示されている特定の方法に多くの変更を行い、同様のまたは類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきであることは、理解されるであろう。

（実施例１）
ハイブリッドポリペプチドの調製
本発明のペプチドは、0.050-0.100mmolでの0.43-0.49mmol/gの負荷量でRinkアミド樹脂（Novabiochem）、または予備負荷Wang Resin（Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂）0.63mmol/g（Novabiochem）を使用して、Symphonyペプチド合成装置（Protein Technologies, Inc.）で組み立てることができる。Fmocアミノ酸（5.0当量、0.250-.500mmol）残基を1-メチル-2-ピロリジノンに0.10Mの濃度で溶解する。すべての他の試薬（HBTU、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン）は、0.55Mジメチルホルムアミド溶液として調製する。次に、HBTU（2.0当量、0.100-0.200mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（1.8当量、0.090-0.18mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（2.4当量、0.120-0.240mmol）を使用して、2時間、Fmoc保護アミノ酸をその樹脂結合アミノ酸にカップリングさせる。最後のアミノ酸のカップリング後、ジメチルホルムアミド中、20%(v/v)ピペリジンを使用して、1時間、そのペプチドを脱保護する。ペプチド配列が完了したら、樹脂を切断するようにSymphonyペプチド合成装置をプログラムする。93%TFA、3%フェノール、3%水および1%トリイソプロピルシランを使用して、1時間、樹脂からのペプチドのトリフルオロ酢酸（TFA）切断を行う。切断されたペプチドを、t-ブチルメチルエーテルを使用して沈殿させ、遠心分離によりペレット化し、凍結乾燥させる。ペレットを水（10-15mL）に再び溶解し、濾過し、C18カラム、および0.1%TFAを含有するアセトニトリル／水の勾配を用いて逆相HPLCにより精製する。

脂肪酸（例えば、オクタン酸およびステアリン酸）を有する本発明のペプチドをNキャッピングするための一般手順は、次のとおりである：リンクアミド樹脂上のペプチド（0.1mmol）をNMP(5mL)に懸濁させる。別のバイアルにおいて、HBTU（0.3mmol）、HOBt（0.3mmol）をDMF（5mL）に溶解し、その後、DIEA（0.6mmol）を添加する。この溶液を樹脂に添加し、この懸濁液を2時間振盪する。溶媒を濾過し、NMP（5mLx4）およびCH₂Cl₂（20mL）で入念に洗浄し、乾燥させ、1時間TFA切断に付す。所望のペプチドの収量は、切断および精製後、約40mgである。

市販の活性化PEGエステルを使用して、リシンの遊離イプシロン−アミノ基または精製ペプチドの末端アミノ基に対するPEG修飾を溶液中で行うことができる。得られたPEG化誘導体を、逆相HPLCによって均一になるまで精製し、その純度をLC/MSおよびMALDI-MSによって確認する。

本発明の一定の例示的ハイブリッドポリペプチドを表1-1に示す。実施化合物への様々な修飾、例えば、化学的修飾、例えば、グリコシル化、PEG修飾など；アミノ酸修飾、例えば、置換、挿入および欠失などが考えられる。さらに、C末端がアミド化されているように表現されていたとしても、本発明のハイブリッドポリペプチドは代替的に遊離酸形態であり得ると解釈する。
表1-1: 本発明の一定の例示的ハイブリッド化合物

成分ペプチドファミリーの様々な組み合わせを含むさらなる例示的ハイブリッドは、次の表において見出せる。本明細書で論じるようなそれらの類似体および誘導体ハイブリッドも具体的に考えられる。記号「#」は、各成分についての連結位置を示す。示されているリンカーは、本明細書中で説明するとおりである。CCK-8は、DY(SO3H)MGWMDF-NH2であり、これに対して「CCK-8^*」は、硫酸化フェニルアラニン形DF(CH2SO3H)MGWMDF-NH2である。

（実施例２）
結合アッセイ
本発明のハイブリッドポリペプチドは、当業者に一般に知られている結合アッセイ方法論を用いて、様々な受容体結合アッセイで試験することができる。そうしたアッセイは、本明細書に記載するものを含む。

アミリン結合アッセイ：本発明の一部の例示的化合物のアミリン受容体への結合の評価は、ラット脳から用意した側坐核膜において次のように行うことができる。雄Sprague-Dawley（登録商標）ラット（200-250）グラムを断頭術によって犠牲にする。脳を除去し、冷リン酸緩衝食塩水（PBS）に入れる。腹表面から、視床下部の吻側に切開を行い、嗅索を横の境界にし、これらの嗅索から内側45°の角度で延長する。側坐核および周囲領域を含むこの基底前脳組織を計量し、氷冷20mMのHEPES緩衝液（20mMのHEPES酸、23℃にてNaOHでｐHを7.4に調整したもの）中で均質化する。15分間、48,000xgでの遠心分離により、膜を新たな緩衝液中で三回洗浄する。最終的な膜ペレットを、0.2mMのフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF）を含有する20mMのHEPES緩衝液に再び懸濁させる。

¹²⁵I-アミリン結合を測定するために（Beaumont K et al. Can J Physiol Pharmacol. 1995 Jul; 73(7):1025-9参照）、4mg原湿潤重量の組織からの膜を、0.5mg/mLのバシトラシン、0.5mg/mLのウシ血清アルブミンおよび0.2mのPMSFを含有する20mMのHEPES緩衝液中、12-16pMの¹²⁵I-アミリンと共にインキュベーションする。溶液は、60分間、2℃でインキュベーションする。放射性標識ペプチドの非特異的結合を減少させるために、0.3%のポリエチレンイミンに4時間、予備浸漬させたGF/Bガラス繊維フィルター（Whatman Inc., Clifton, N.J.）によって濾過することにより、インキュベーションを終わらせる。フィルターは、濾過直前に5mLの冷PBSで、および濾過直後に15mLの冷PBSで洗浄する。フィルターを取り外し、ガンマ−カウンターにおいて77%の計数効率で放射活性をアッセイする。10^-12から10^-6M非標識試験化合物の存在下で結合を特定することにより競合曲線を作成し、4パラメータ理論式（Inplot program; GraphPAD Software, San Diego）を用いて非線形回帰により分析する。

CGRP受容体結合アッセイ：本発明の化合物のCGRP受容体への結合の評価は、CGRP受容体を発現することがわかっているSK-N-MC細胞（Muff, R. et.al., Ann NY Acad. Sci. 1992: 657, 106-16）から作製した膜を使用することを除き、本質的にはアミリンについて説明したとおりである。結合アッセイは、13,500cpm 125I-hCGRP／ウエルまたは21.7pM／ウエル（Amersham）を使用することを除き、アミリンについて説明したとおり行う。

アドレノメジュリン結合アッセイ：アドレノメジュリン受容体への結合は、アドレノメジュリン受容体を含有するHUVEC（Kato J et.al., Eur J Pharmacol. 1995, 289:383-5）を使用し、サイクリックAMPについてのPerkin Elmer AlphaScreen（商標）アッセイを用い、1ウエル当たり25-30,000の細胞の最適条件を用いて調査することができる。HUVECについてのｃAMPレベルの評価は、CHO細胞と比較して大きくない。従って、CHO細胞を陰性対照として選ぶことができる。CHO細胞は、所望によりアドレノメジュリン受容体を発現しないからである。

カルシトニン受容体結合アッセイ：カルシトニン受容体への結合は、当該技術分野において公知であるような、CHO細胞またはT47D細胞を使用して調査することができ、これらの細胞もカルシトニン受容体を発現する（Muff R. et.al, Ann N Y Acad Sci. 1992, 657:106-16 and Kuestner R.E. et. al. Mol Pharmacol. 1994, 46:246-55）。

レプチン結合アッセイ：二つのインビトロバイオアッセイを日常的に用いて、レプチン結合および受容体活性化を評価する（例えば、White, et al., 1997. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 10657-10662参照）。アルカリホスファターゼ（「AP」）−レプチン（「OB」）融合タンパク質（「AP-OB」）を使用して、組換えマウスレプチン（陽性対照）またはペプチドの不在下または存在下、長い（シグナリング）形態のマウスOB受容体（「OB-RL」）でトランスフェクションされたCOS-7細胞によるレプチン結合の阻害を測定することができる。シグナル伝達アッセイは、APレポーターおよびOB-RL構築物でコ・トランスフェクションされたGT1-7細胞において行うことができる。マウスレプチンまたはペプチドでの刺激に応答して分泌されるアルカリホスファターゼ（「SEAP」）活性は、化学発光により測定することができる。

Y1受容体結合アッセイ：神経ペプチドY1受容体を内因的に発現するSK-N-MC細胞の集密培養物から膜を作製する。膜を、96ウエルポリスチレンプレート内で、60pM[¹²⁵I]-ヒトペプチドYY（2200 Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences）と共に、および非標識活性化合物と共に60分間、周囲温度でインキュベーションする。その後、Perkin Elmerプレートハーベスターを使用して、ウエルの内容物を96ウエルガラス繊維プレートに回収する。乾燥させたガラス繊維プレートをシンチラントと併せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンターで計数する。

Y2受容体結合アッセイ：神経ペプチドY2受容体を内因的に発現するSK-N-BE細胞の集密培養物から膜を作製する。膜を、96ウエルポリスチレンプレート内で、30pM[¹²⁵I]-ヒトペプチドYY（2200Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences）と共に、および非標識活性化合物と共に60分間、周囲温度でインキュベーションする。その後、Perkin Elmerプレートハーベスターを使用して、ウエルの内容物を96ウエルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートをシンチラントと併せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンターで計数する。

Y4受容体結合アッセイ：神経ペプチドY4遺伝子をコードするｃDNAでCHO-K1細胞を一過的にトランスフェクションし、48時間後、膜を集密細胞培養物から作製する。膜を、96ウエルポリスチレンプレート内で、18pM[¹²⁵I]-ヒト膵臓ポリペプチド（2200Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences）と共に、および非標識活性化合物と共に60分間、周囲温度でインキュベーションする。その後、Perkin Elmerプレートハーベスターを使用して、ウエルの内容物を96ウエルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートをシンチラントと併せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンターで計数する。

Y5受容体結合アッセイ：神経ペプチドY5遺伝子をコードするｃDNAでCHO-K1細胞を一過的にトランスフェクションし、48時間後、膜を集密細胞培養物から作製する。膜を、96ウエルポリスチレンプレート内で、44pM[¹²⁵I]-ヒトペプチドYY（2200Ci/mmol、PerkinElmer Life Sciences）と共に、および活性化合物と共に60分間、周囲温度でインキュベーションする。その後、Perkin Elmerプレートハーベスターを使用して、ウエルの内容物を96ウエルガラス繊維プレート上に回収する。乾燥させたガラス繊維プレートをシンチラントと併せ、Perkin Elmerシンチレーションカウンターで計数する。

GLP-1受容体結合アッセイ：GLP-1受容体結合活性および親和性は、受容体源がRINm5F細胞膜であり、リガンドが[¹²⁵I]GLP-1である結合置換アッセイを用いて測定することができる。均質化したRINm5F細胞膜を、20mMのHEPES緩衝液中、40,000cpm[¹²⁵I]GLP-1トレーサーおよび様々な濃度の試験化合物と共に2時間、23℃で、絶えず混合しながらインキュベーションする。0.3%のPEI溶液で予備湿潤させたガラスフィルターパッドによって反応混合物を濾過し、氷冷リン酸緩衝食塩水ですすぐ。シンチレーションカウンターを使用して結合カウントを決定する。結合親和性は、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）を使用して計算する。

例示ハイブリッドについての、成分モジュールの特異的受容体活性化をはじめとするインビトロ受容体結合および受容体活性化を次の表に示す。

（実施例３）
マウス食餌摂取アッセイ
本発明のハイブリッドポリペプチドは、マウス食餌摂取アッセイにおいて食欲抑制について、および食餌誘発肥満（DIO）マウスにおける体重増加に対するそれらの効果について試験することができる。スクリーニングのための実験プロトコルを下で説明する。

雌NIH/Swissマウス（週齢8-24週）を、06時00分に点灯する12:12時間の明:暗サイクルで群居飼育する。水および標準ペレット状マウス用チャウ（chow）飼料は、注記がある場合を除き自由採食できる。実験の1日前、ほぼ15時00分に動物の絶食を開始する。実験の朝、動物を実験群に分ける。典型的な試験では、3マウス／ケージでのn=4ケージ。

時間＝0の時点ですべての動物に、典型的には約10nmol/kgから75nmol/kgの範囲の量でビヒクルまたは化合物の腹腔内注射を施し、予め計量された量（10-15g）の標準チャウを直ちに与える。食餌を取り出し、様々な時点、典型的には30、60および120分の時点で計量して、消費された食餌の量を決定する（Morley, Flood et al., Am. J. Physiol. 267: R178-R184, 1994）。食餌摂取量は、時間＝0の時点で最初に給餌した食餌の重量から、例えば、30、60、120、180および／または240分の時点で残っている食餌の重量を引くことによって計算する。有意な治療効果をANOVA（p<0.05）によって特定する。有意差が存在する場合、ダンネット検定（Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California）を用いて、試験平均値を対照平均値と比較する。
ここでの食餌摂取アッセイにおける活性およびハイブリッドの合成に使用した親分子の配列は、次のとおりである：

（実施例４）
体重、脂肪再分布、および除脂肪体重アッセイ
体重および関連効果についてのアッセイは、次のとおり行うことができる。

Sprague-Dawleyラットにおける食餌誘発肥満（DIO）は、肥満およびエネルギー恒常性調節の研究のために利用できるモデルである。これらのラットは、脂肪およびエネルギーが比較的高い飼料を用いて、肥満になりやすいラットの系統（Crl:CD（登録商標）(SD)BR）から成長させた。例えば、Levin (1994) Am. J. Physiol. 267:R527-R535, Levin et al. (1997) Am. J. Physiol. 273:R725-R730参照。DIO雄ラットは、Charles River Laboratories, Inc.（Wilmington, MA）から入手する。ラットは、靴箱ケージの中、22℃、12/12時間の明暗サイクルで個別飼育する。ラットは、中等度高脂肪食（脂肪から32% kcal；Research Diets D1226B）を用いて自由採食で飼育する。動物は、典型的に、約500gの平均体重に達する。LevinDIOラットを7日間、カゴでの飼育環境に馴れさせる。3晩の馴化中、動物にビヒクルの単回腹腔内（IP）注射を施す。試験当日、連続6-14夜にわたる暗サイクル開始時に化合物またはビヒクル（10% DMSO）の単回IP注射をラットに施す。食餌摂取量は、自動食餌摂取量測定システム（BioDAQ, Research Diets）により、この試験コース全体を通して5秒間隔で測定する。体重は、毎夜記録する。

NMR（Echo Medical Systems, Houston, TX）を使用して、治療前および後に体組成を測定した。体組成測定のために、ラットを、十分に換気されたプレキシグラス管に短時間（約1分）入れ、その後、それを専用の齧歯動物NMR機に挿入した。これは、脂肪および乾燥除脂肪組織の正確なグラム数の変化の計算（例えば、治療後の体脂肪のグラム数−ベースラインでの体脂肪のグラム数＝体脂肪のグラム数の変化）ならびに脂肪および乾燥除脂肪組織についての体組成%の変化の計算（例えば、治療後の体脂肪%−ベースラインでの体脂肪%＝体脂肪%の変化）を行うことができる。すべてのデータを平均±SEMとして表す。分散分析（ANOVA）および多重比較検定を用いて、群間差について検定した。P-値<0.05を有意とみなした。統計解析およびグラフ作成は、ウィンドウズ用PRISM（登録商標）4（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）を使用して行った。幾つかの初期研究では、ウィンドウズ用SYSTAT（登録商標）（Systat Software, Inc., Point Richmond CA）を分析に使用した。アミリン模倣体、エキセンジン、PYY類似体および／またはレプチンを含有するハイブリッドについては、体脂肪の変化が除脂肪組織の有意な減少を伴わなかった。グラフおよび結果を、典型的には、体重パーセントのビヒクル補正変化、体脂肪および体タンパク質の変化として提示する。

他の実験では、雄C57BL/6マウス（試験開始時に週齢4週）に高脂肪チャウ（HF、脂肪として食餌kcalの58%）または低脂肪チャウ（LF、脂肪として食餌kcalの11%）を給餌する。チャウを用いて4週間後、予め決められた用量のハイブリッドポリペプチドを二週間、継続的に皮下送達する浸透圧ポンプ（Alzet ＃ 2002）を各マウスに内植する。体重および食餌摂取量を毎週測定する（Surwit et al., Metabolism‐Clinical and Experimental, 44: 645-51, 1995）。試験化合物の効果は、治療群当たり少なくとも14匹のマウスの体重変化％（すなわち、出発体重からの変化％）の平均+/-sdとして表す（p<0.05 ANOVA, Dunnett’s test, Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California）。

エキセンジン／PYYハイブリッド。C末端トランケート型エキセンジン（例えば、エキセンジン-4(1-28)または⁵Ala,¹⁴Leu,²⁵Phe-エキセンジン-4(1-28)）および18-36領域から31-36領域にわたるN末端トランケート型PYYを使用して、本発明の例示的ハイブリッドポリペプチドを合成した。従って、これらの例示的ハイブリッドポリペプチドは、一般に、二つのモジュールを含み、この場合、第一のモジュールは、エキセンジン-4類似体であり、第二のモジュールは、PYYトランケーション体から選択されるペプチドエンハンサーである。比較のため、β-アラニンジペプチドスペーサーも幾つかの変異体におけるペプチド構成単位間に組み込んだ（表4-1参照）
表4-1:エキセンジン/PYYハイブリッド、受容体結合データ、および食餌摂取アッセイにおけるそれらの効果

表4-1に示したように、本発明の一定の例示的化合物は、食餌摂取アッセイにおいて有効性を示した。一定のペプチドは、DIOアッセイにおいて75nmol/kgででも試験し、PYYより効能があると証明された（図1）。ここで他のハイブリッドについて観察されるように、ハイブリッドは、親分子を認識する一つ、二つまたはそれ以上の受容体への結合を保持することができる。所望により、各親からのまたは一つだけの親からの少なくとも一つの受容体を認識するハイブリッドを設計した。ここで他のハイブリッドについて観察されるように、（各隣接ホルモン部分間のスペーサーとしての役割を果すことができる）リンカーの使用は、受容体（単数または複数）結合ならびにインビトロおよびインビボ活性、例えば体重減少をはじめとする活性増加をもたらすことができる。ここでの結果は、PYYのC末端部分が活性を修飾できることを示している。

エキセンジン／アミリンハイブリッド。エキセンジン／アミリンハイブリッド。本発明のさらなる例示的ハイブリッドポリペプチドを、C末端トランケート型エキセンジン(1-27)（配列番号：236）、C-末端トランケート型アミリンペプチド（例えば、アミリン(1-7)（配列番号：217）、^2,7Ala-アミリン(1-7)（配列番号：285）およびアミリン(33-27)（配列番号：243））、ならびに任意選択のsCTフラグメント（例えば、 sCT(8-10)、^11,18Arg-sCT(8-27)（配列番号：289）および¹⁴Glu,^11,18Arg-sCT(8-27)（配列番号：286）から作製した。両方のハイブリッドポリペプチドが、食欲抑制の点で非常に活性であり（表4-2参照）、同じ用量のラットアミリンより勝っていたが、作用の開始は、親分子の活性プロフィールとは異なっていた（データは示さない）。1nmol/kgの用量で、化合物５は、ラットアミリンと同じように有効であった。
表 4-2:エキセンジン／アミリンハイブリッドおよびFIアッセイにおけるそれらの効果

DIOアッセイにおいてスクリーニングしたとき、両方の化合物が、優れた有効性を示した（図2）。

さらなる例示的化合物を、血糖値に対する効果について、食餌摂取アッセイでアッセイした。これらの試験は、化合物14および15を含んだ。ベータAlaリンカーを含む化合物14は、²⁹βAla-βAla-エキセンジン(1-28),hアミリン(1-7)-^11,18Arg-sCt(8-27)-hアミリン(33-37)（配列番号：33）、（あるいは、エキセンジン(1-28)- βAla-βAla-hアミリン(1-7)-^11,18Arg-sCt(8-27)-hアミリン(33-37)と記載される）であり、一方、化合物15は、Glyリンカーを含有する：²⁹GlyGlyGly-エキセンジン(1-28),hアミリン(1-7)-^11,18Arg-sCt(8-27)-hアミリン(33-37)（配列番号：312）。より長いエキセンジン(1-28)は、エキセンジン(1-27)と比較して増加した活性をもたらした。

血糖アッセイを行って、血糖値の低下に対する効果を検定した。雌NIM/Swissマウス（週齢8-20週）を06時00分に点灯する12:12時間の明:暗サイクルで群居飼育した。水および標準ペレット状マウス用チャウ飼料は、注記がある場合を除き、自由採食できた。実験の朝、動物を実験群に分け、ほぼ06時30分に絶食を開始した。典型的な試験では、3マウス／ケージでのn=2ケージ。時間＝0の時点で、血糖サンプルを採取し、その直後、約1nmol/kgから25nmol/kgの範囲の量でのビヒクルまたは化合物の腹腔内注射を行った。30、60、120、180および240分の時点で血糖を測定した。例えば、30、60、120、180および／または240分の時点で血糖を、時間＝0分での血糖で割ることにより、治療前パーセントを計算した。有意な治療効果をANOVA (p<0.05)によって特定した。有意差が存在する場合、ダンネット検定（Prism v. 4.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California）を用いて、試験平均値を対照平均値と比較した。例示的化合物の結果を図5Aに提示する。点は、平均±sdを表す。2時間絶食させたNIH/Swissマウスに、ベースラインサンプリングの直後、t=0の時点で、ペプチドを腹腔内（IP）注射した。サンプルは、t=30、60、120、180および240分の時点で採取した。血糖は、OneTouch（登録商標）Ultra（登録商標）（LifeScan, Inc., a Johnson & Johnson Company, Milpitas, CA）で測定した。* p<0.05対ビヒクル対照；ANOVA、ダンネット検定。

食餌摂取アッセイは、本明細書中で前に説明したとおり行った。結果を図5Bに提示する。点は、n=4ケージ（3マウス／ケージ）の平均±sdを表す。一晩絶食させたNIH/Swissマウスにt=0の時点でペプチドを腹腔内（IP）注射した。注射の直後、餌を導入し、t=30、60および120分の時点で消費量を測定した。* p<0.05対ビヒクル対照；ANOVA、ダンネット検定。

親化合物10およびエキセンジン化合物は、この血糖アッセイにおいて相対する結果を有する。それらを併せると、中和作用または、最もよくても、より強力な親化合物で見られる効果の希釈が生じるであろうと予想される。しかし、この血糖アッセイにおいて、例示的ハイブリッド化合物は、エキセンジン(1-28)とちょうど同じくらい効能があり、且つ、より長い作用期間を有した。

食餌摂取データから、これらの例示的化合物は、食欲不振誘発性であった。活性は、一般に、個々に投与した親化合物より良好であった。活性は、一緒に投与したが半分の薬物濃度で投与した親化合物に匹敵し（3nmol/kgハイブリッド対6nmol/kg共同投与した親化合物の合計）、従って、ハイブリッドが優れていることをさらに実証した。リンカーの追加は、これらのハイブリッドの活性を増加させた。この事例では、Gly-Gly-Glyリンカーの方が、ベータAla-ベータAlaリンカーより有効であった。

エキセンジン／CCK-8ハイブリッド。CCK-8のN末端アミドを保持する、CCK-8のN末端に直接またはリンカーにより取り付けた完全長またはC末端トランケート型エキセンジン-4から、本発明の尚さらなる例示的ハイブリッドポリペプチドを作製した。さらに、自然発生Tyr(SO₃)を組み込んだ一定のハイブリッドを作製し、一方、より安定なPhe(CH₂SO₃)基を組み込んだ別のハイブリッドも作製した。作製したハイブリッドポリペプチドのすべてが、食餌摂取を抑制する点で活性であった（表4-3）。
表 4-3：エキセンジン／CCK-8ハイブリッドおよび食餌摂取アッセイにおけるそれらの効果

例示的エキセンジン／CCK-8ハイブリッドポリペプチドをDIOアッセイにおいて25nmol/kgで試験した（図3Aおよび3B）。データは、すべての化合物において、初期体重減少、その後、リバウンド効果を示した。興味深いことに、このリバウンド効果は、より加水分解安定性が高いPhe(CH₂SO₃)残基を組み込んだハイブリッド（図3Aと3Cを比較）、ならびにエキセンジンとCCK残基との間にリンカー、例えば、リンカー8-アミノ-3,6-ジオキサオクタノイルを組み込んだハイブリッド（図3Aと3Bとを比較）では減少されるようである。第2日での約‐2.8%の変化を生じさせるために、十倍多い量のCCK-8（250 nmol/kg/日）を必要とし、第7日でHF食対照レベルにリバウンドした。

アミリン／PYYハイブリッド。各ペプチドのトランケート型セグメントを含有するアミリン／PYYハイブリッドポリペプチドを合成した。食餌摂取アッセイにおけるインビボ活性を表4-4に示す。
表4-4：アミリン／PYYハイブリッド

本発明の例示的ハイブリッドポリペプチドが、それらの親成分ペプチドホルモンより効力があるかどうかを確かめるために、食餌摂取アッセイにおいて、より活性の高い親分子の最少有効用量で例示的化合物を試験した。結果を図4Aおよび4Bに示す。これにより、プールされた親ペプチドの効果も比較される（化合物1、11および12は、成分ペプチドホルモン、類似体またはそれらのフラグメントである）。データは、幾つかのペプチドが、プールされた親ペプチドと少なくとも等しい効力であることを示している。インビボ試験と並行して、インビトロ受容体結合および機能アッセイ（シクラーゼ活性）をすべての化合物について行った（データは示さない）。

アミリン-sCT／レプチンハイブリッド。化合物10、本明細書中で説明したアミリン-sCT-アミリンキメラに連結したレプチンペプチドフラグメントを含有する、さらなる例示ハイブリッドを作った。化合物16は、[Ser117, dLeu119]レプチン(116-122)-アミリン(1-7)-[^11,18Arg]sCT(8-27)-アミリン(33-37)（配列番号：397）である。化合物は、アミリンおよびCT受容体に結合し（RBA＝受容体結合アッセイ）、幾らかがCGRP受容体に結合した。この化合物は、CT受容体を活性化することもできた（C1Aアッセイ）。

この代表分子を、本明細書に記載するような食餌摂取アッセイにおいて活性について試験した。レプチンは、このアッセイにおいて活性ではなかったが、化合物16は、1 mg/kgで食欲不振誘発性であった。化合物16は、その食欲不振誘発効果の点でも、（25 mg/kgでの）ラットアミリンより優れていた。化合物10は、対照と比較してさらにはるかに有効に食餌摂取量を91-95%減少させた一方で、化合物16は、累積摂取量を対照のものの34-38%に減少させた。さらなる例示的実施形態としては、レプチンペプチドのN末端とアミリン(1-7)-[^11,18Arg]sCT(8-27)-アミリン(33-37)化合物との頭−頭連結が挙げられる。

CCK／アミリン-sCTハイブリッド。CCKとアミリン-sCTキメラとの例示的ハイブリッドは、妥当な受容体特異性および活性化を明示した。配列DF(P-CH₂SO₃)MGWMDFGKR KCNTATCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY（配列番号：398）を有する例示的化合物は、CT受容体結合アッセイにおいて0.044nM、CGRP受容体結合アッセイにおいて4.4nM、アミリン受容体結合アッセイにおいて0.083nM、およびGLP受容体シクラーゼ（RIN）アッセイにおてい1000nMのIC50を明示した。

（実施例５）
食餌摂取量、体重および体重増加の減少
本発明の例示的ハイブリッドポリペプチドを、本明細書中で説明したように、マウスおよびラットにおいて食欲抑制、体重の減少および体重増加の減少について検定した。単独でまたは併用で、親化合物もアッセイした。図9-21は、本明細書中で説明したようなアッセイにおける例示ハイブリッドのインビボ作用を実証するものである。

例示的ハイブリッドおよびそれらの親化合物についてのマウスにおける食餌摂取抑制のインビボ活性を次の表に示す。値は、提供されている場合には、示されている期間の注入後の食餌摂取の抑制パーセントとして提供されている。「ns」は、ビヒクルと比較して「有意でない」ことを意味する。

例示的ハイブリッドおよびそれらの親化合物についてのマウスDIOモデルにおける体重抑制のインビボ活性を次の表に示す。値は、提供されている場合には、示されている期間の注入後の体重の抑制パーセントとして提供されている。

例示的ハイブリッドおよびそれらの親化合物に関するラットDIOモデルにおける体重の抑制についてのインビボ活性を次の表に示す。値は、提供されている場合には、示されている期間の注入後の体重の抑制パーセントとして提供されている。

ラットモデル（毎日注射）における体重の抑制に関する例示的ハイブリッドおよびそれらの親化合物についてのインビボ活性を次の表に示す。値は、体重の抑制パーセントとして与える。太字の値は、ビヒクルからの有意を示す。

示されている期間にわたっての注入および示されている期間にわたっての一日一回の注射の両方についてのラットモデルにおける体重の抑制に関する、例示ハイブリッドおよびそれらの親化合物についての体重および体重増加の減少のインビボ活性を次の表に示す。値は、体重の抑制パーセントとして与える。第6日の8時間の夜間摂取期間に関する食餌摂取の抑制パーセントも測定した。ハイブリッドは、別の注記がなければ、15nmol/kg/日で供給した。体重：約2%の差は、統計学的に有意である。食餌摂取：約20%の差は、統計学的に有意である。

（実施例７）
血糖低下
Levinラットにおける示されている期間に関するOGTTアッセイでの血糖低下についての例示ハイブリッドおよびそれらの親化合物のインビボ活性を次の表に示す。値は、血糖値

低下パーセントとして与える。太字の値は、ビヒクルからの有意を示す。

（実施例８）
胃内容排出活性
示されている期間に関するLevinラットにおける胃内容排出についての例示ハイブリッドおよびそれらの親化合物のインビボ活性を次の表に示す。値は、胃内容排出の抑制パーセントおよび通過したアセトアミノフェンのパーセントとして与える。

（実施例９）
PPFポリペプチドは急性および慢性食餌摂取を抑制する
雌NIH/Swissマウス（週齢8-24週）を06時00分に点灯する12:12時間の明:暗サイクルで群居飼育した。水および標準ペレット状マウス用チャウ飼料は、注記のある場合を除き自由採食できた。実験の1日前、ほぼ15時00分に動物の絶食を開始した。実験の朝、動物を実験群に分けた。典型的な試験では、3マウス／ケージでのn=4ケージ。

時間＝0の時点で、すべての動物に、約10nmol/kgから100nmol/kgの範囲の量でビヒクルまたは化合物の腹腔内注射を施し、予め計量された量（10-15g）の標準チャウを直ちに与えた。食餌を取り出し、30、60および120分の時点で計量して、消費された食餌の量を決定した（Morley, Flood et al., Am. J. Physiol. 267: R178-R184, 1994）。食餌摂取に対するPPFポリペプチドの急性効果を試験するために、時間＝0の時点で最初に給餌した食餌の重量から、30、60、120および180分の時点で残っている食餌の重量を引くことによって食餌摂取量を計算した。同様に、最初に供給したグラム数での水の重量からこれらの時点で残っている水のグラム数での重量を引くことによって、水摂取量を計算した。長期（慢性）食餌摂取および／または体組成に対するPPFポリペプチドの効果を試験するために、二週間の期間にわたって消費された食餌の量を測定した。長期食餌摂取および／または体組成に対するPPFポリペプチドの効果についてのこれらの試験のために、治療開始前、1週間、マウスを個別飼育した。この実験全体を通して、食餌摂取量および体重を毎日モニタリングした。治療期間中、ビヒクル（水中50%ジメチルスルホキシド）およびPYY(3-36)（1 mg/kg/日）を、イソフラン麻酔下で肩甲骨内領域に配置したAlzet（登録商標）浸透圧ポンプ（Durect Corp., Cupertino, CA;3、7および28日試験のために、それぞれ、Models 1003D、2001および2004）を使用して皮下（s.c.）持続注入により投与した。各試験の終了時、動物を、2-4時間の絶食後、イソフルラン過剰投与により犠牲にした。Na-ヘパリンでフラッシングした注射器に、心臓穿刺により血液を採取し、直ちに血漿を冷凍した。一部の試験では、二重X線エネルギー吸収測定法（DEXA; PixiMus, GE Lunar）を用いて体組成を判定した。一部の試験では、齧歯動物用NMR機（EchoMRI-700（商標））を使用して、治療前および治療後に体組成（例えば、脂肪およびタンパク質の量）を測定した。この場合、動物を拘束管内に配置し、そのNMR内に2分間置き、脂肪および除脂肪体重のグラム数での量を定量する。両側精巣上体脂肪パッドおよび肩甲骨内褐色脂肪組織（BAT）を動物から切除し、これらの器官の重量を決定することができる。摘出した肝臓サンプルをRNALater（Ambion, Austin, TX）に入れ、‐20℃で保管することができる。

図22-29は、上で説明した食餌摂取アッセイにおいて累積食餌摂取量を減少させるPPFポリペプチドキメラ、特にPPY-NPYキメラ、例えば、化合物4883および5705の能力を示すものである。

図22は、ビヒクルのみと比較して、化合物5705の投与に基づく三時間にわたる累積食餌摂取量の減少を示すものである。図23Aおよび24Aは、食餌摂取量（グラム数）の変化を示すものであり、図23Bおよび24Bは、13日間、ビヒクルまたは化合物4883または5705を（500μg/kg/日の投薬量で）継続的に投与したマウスにおける、体重の変化（ビヒクル補正体重百分率の変化）を示すものである。PPFポリペプチドの投与開始後、一日という早期に、化合物4883または化合物5705で治療した動物では、食餌摂取量および体重減少の傾向があるように見える。

図25および26は、13日間、ビヒクルまたは化合物4883または5705を（500μg/kg/日の投薬量で）継続的に投与したマウスにおける、化合物4883または化合物5705の投与に基づく一日当たりの水摂取量および尿排泄量の変化を示すものである。

図27は、NMRによって評価した場合の体組成に対する13日間の（500μg/kg/日の投薬量での）継続投与ビヒクルまたは化合物4883または5705の効果を示すものである。図28Aおよび28Bは、13日間、ビヒクルまたは化合物4883または5705を（500μg/kg/日の投薬量で）継続的に投与したマウスにおいてグラム数およびパーセントで測定した場合の水の変化を示すものである。

図29は、尿電解質に対する、（500μg/kg/日の投薬量での）化合物4883または5705の14日の継続的投与の効果を示す図である。

好ましい実施例および実施形態によって本発明を説明したが、変形および変更が発生するであろうことは、当業者には理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、本特許請求の範囲に記載する本発明の範囲内に入る、そうした等価の変形すべてを包含すると解釈する。

Claims (8)

1. 第二の生物活性ペプチドホルモンモジュールに共有結合で連結された第一の生物活性ペプチドホルモンを含む、少なくとも二つのホルモン活性を呈するハイブリッドポリペプチドであって、
   ここに、該第一の生物活性ペプチドホルモンはエキセンジン−４、エキセンジン−４（１−２７）、エキセンジン−４（１−２８）、エキセンジン−４（１−２９）、エキセンジン−４（１−３０）、 ^１４ Ｌｅｕ−エキセンジン−４（１−２８）、 ^１４ Ｌｅｕ， ^２５ Ｐｈｅ−エキセンジン−４（１−２７）、 ^１４ Ｌｅｕ， ^２５ Ｐｈｅ−エキセンジン−４（１−２８）、および ^５ Ａｌａ， ^１４ Ｌｅｕ， ^２５ Ｐｈｅ−エキセンジン−４（１−２８）からなる群より選択され；
   該第二の生物活性ペプチドホルモンはｈアミリン（１−７）−^{１１，１８}Ａｒｇ−ｓＣＴ（８−２７）−アミリン（３３−３７）であり；
   該生物活性ペプチドホルモンモジュールは、グリシンを含むがグリシン−リシン−アルギニンではない１ないし３０残基長のリンカーを使用して共有結合で取り付けられ、
   該生物活性ペプチドホルモンモジュールの双方はその構成ペプチドホルモンの少なくとも一つのホルモン活性を呈し、および
   該第一の生物活性ペプチドホルモンは、該ハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置する
   ことを特徴とする、ハイブリッドポリペプチド。
2. 該ハイブリッドポリペプチドのＣ末端がアミド化されている請求項１記載のハイブリッドポリペプチド。
3. 該リンカーが２ないし３０残基長である請求項１または２記載のハイブリッドポリペプチド。
4. 該リンカーが３ないし３０残基長である請求項１ないし３いずれか１記載のハイブリッドポリペプチド。
5. 該リンカーがＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含む請求項１ないし４いずれか１記載のハイブリッドポリペプチド。
6. 請求項１ないし５いずれか１記載のハイブリッドポリペプチドを含む医薬組成物。
7. 糖尿病治療用の医薬を製造するための請求項１ないし６いずれか１記載のハイブリッドポリペプチドの使用。
8. 該糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項７記載の使用。

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