CN102066421A - α-促黑激素（α-MSH）和心房利尿钠蛋白（ANP）的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损伤中的用途 - Google Patents

α-促黑激素（α-MSH）和心房利尿钠蛋白（ANP）的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损伤中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102066421A
CN102066421A CN2008800229244A CN200880022924A CN102066421A CN 102066421 A CN102066421 A CN 102066421A CN 2008800229244 A CN2008800229244 A CN 2008800229244A CN 200880022924 A CN200880022924 A CN 200880022924A CN 102066421 A CN102066421 A CN 102066421A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
hormone
difunctional
residue
nle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2008800229244A
Other languages
English (en)
Inventor
克里希纳·佩里
阿卜德尔卡里姆·哈比
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Theratechnologies Inc
Original Assignee
Theratechnologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Theratechnologies Inc filed Critical Theratechnologies Inc
Publication of CN102066421A publication Critical patent/CN102066421A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

本发明描述了显示α-MSH活性和利尿钠肽活性的双功能激素。双功能激素包含例如与具有利尿钠肽相关激素活性的第二结构域共价连接的具有α-MSH相关激素活性的第一结构域。本发明的双功能激素被用于例如肾相关疾病或病况诸如急性肾衰竭(ARF)或急性肾损伤(AKI)的预防和/或治疗。

Description

α-促黑激素(α-MSH)和心房利尿钠蛋白(ANP)的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损伤中的用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2007年7月6日提交的美国临时专利申请序列号60/948,292的权益，其通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明通常涉及显示激素活性的新的化合物和其用途，并且特别地涉及显示双功能激素活性的新的化合物和其用途，例如用于预防和/或治疗肾相关的疾病或病况诸如急性肾衰竭(ARF)或急性肾损伤(AKI)。
背景技术
急性肾衰竭(ARF)是数小时至数天内通过尿排出量上的减少表现出的肾功能上的突然衰退。含氮排泄物累积导致电解质和液体动态平衡上的显著变化。急性肾衰竭可由诱导缺血性损伤或直接的中毒性肾损伤的多种临床病况和药疗法所引起。较大的手术操作、感染、休克、产后出血和肾脏灌注不足可导致尿排出量下降。急性肾衰竭通过血清肌酸酐上升来诊断。在危重病人中，高分解代谢状态能导致含氮排泄物的迅速升高(通过血尿素氮(BUN)的升高来反映)以及导致液体过剩的液体平衡上的严重偏移。
具有对鉴定用于肾相关的疾病或病况例如ARF的预防和治疗的产品和方法的持续的需求。
本说明书提及大量文献，其内容通过引用全文并入本文。
发明概述
本发明一般涉及显示激素活性的新的化合物和其用途，并且特别地涉及显示双功能激素活性的新的化合物和其用途。
在第一方面，本发明提供双功能激素，其包含：
(a)第一结构域，其包含α-MSH肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有α-MSH相关的激素活性；和
(b)与所述第一结构域共价连接的第二结构域，所述第二结构域包含利尿钠肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有利尿钠肽相关的激素活性。
在一个实施方案中，当第一结构域是SEQ ID NO：1的α-MSH肽时，第二结构域是具有利尿钠肽相关的激素活性的片段、变体或片段的变体，而当第二结构域是SEQ ID NO：2、3、4或5的利尿钠肽时，第一结构域是具有α-MSH相关的激素活性的片段、变体或片段的变体。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含SEQ ID NO：1的肽的至少4个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75％同源性的所述片段的变体。
在另一个实施方案中，上文提到的α-MSH肽的变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少75％同源性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含式I(SEQ ID NO：47)的氨基酸序列：
X2-H-X1-R-W-X3        (I)
其中：
X1是L-Phe或D-Phe；
X2是E、M-E或者不存在；
X3是G-K-P-X4、G-K-P、G-K、G或者不存在；
X4是M、V或Nle。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含：
(i)H-X1-R-W-G-K-P-X4(SEQ ID NO：48)；
(ii)M-E-H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：17)；
(iii)H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：49)；
(iv)E-H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：50)；
(v)H-X1-R-W(SEQ ID NO：20)；或者
其中X1是L-Phe或D-Phe，并且X4是M、V或Nle。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含：
(i)H-f-R-W-G-K-P-V(SEQ ID NO：51)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M(SEQ ID NO：52)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle(SEQ ID NO：53)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P(SEQ ID NO：54)；
(v)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO：11)；
(vi)H-f-R-W-G(SEQ ID NO：55)；
(vii)E-H-F-R-W(SEQ ID NO：56)；
(ix)E-H-f-R-W-G(SEQ ID NO：57)；或
(iv)H-f-R-W(SEQ ID NO：6)；
其中f是D-苯丙氨酸。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域由下列组成：
(i)H-f-R-W-G-K-P-V(SEQ ID NO：51)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M(SEQ ID NO：52)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle(SEQ ID NO：53)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P(SEQ ID NO：54)；
(v)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO：11)；
(vi)H-f-R-W-G(SEQ ID NO：55)；
(vii)E-H-F-R-W(SEQ ID NO：56)；
(ix)E-H-f-R-W-G(SEQ ID NO：57)；或
(iv)H-f-R-W(SEQ ID NO：6)；
其中f是D-苯丙氨酸。
在一个实施方案中，上文提到的第二结构域包含SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的至少15个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75％同源性的所述片段的变体。
在一个实施方案中，上文提到的利尿钠肽的变体包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少75％的同源性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，上文提到的第二结构域包含式II(SEQ ID NO：58)的氨基酸序列：
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9     (II)
其中：
X5是M、Nle、R-R-S-S、S-L-R-R-S-S或者不存在；
X6是C；
X7是H或者不存在；
X8是M或Nle；
X9是S-C-Y-R或G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y；
其中
X6的C残基与X9的C残基形成二硫桥；并且
当X5是Nle时，所述第一结构域在所述第二结构域的N端。
在一个实施方案中，上文提到的第二结构域包含：
(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：22)；
(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：23)；
(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：24)；
(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置5和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：26)；
(vi)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：59)；或者
(vii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2和18的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：60)。
在一个实施方案中，上文提到的第二结构域由下列组成：
(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：22)；
(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：23)；
(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：24)；
(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置5和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：26)；
(vi)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：59)；或者
(vii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2和18的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：60)。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域在所述第二结构域的N端。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素的氨基末端被C3-C16酰基基团乙酰化或酰基化。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素的羧基末端残基被酰胺化。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域和第二结构域通过肽键共价连接。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有：
(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：61)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：62)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：63)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：64)；
(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：65)；
(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：66)；
(vii)H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：67)；
(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：68)；或者
(ix)E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：69)；
其中f是D-苯丙氨酸。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素由下列组成：
(i)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：31)；
(ii)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：33)；
(iii)Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：34)；
(iv)Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：35)；
(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：36)；
(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：38)；
(vii)Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：39)；
(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W-NH2，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：40)；或者
(ix)Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：42)；
其中
Ac代表氨基末端乙酰化；
NH2代表羧基末端酰胺化；并且
f是D-苯丙氨酸。
在另一个方面，本发明提供了含有上文提到的双功能激素以及药学上可接受的载体的组合物。
在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的上文提到的双功能激素。
在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的上文提到的双功能激素。
在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物组合物，其含有上文提到的双功能激素和药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物组合物，其含有上文提到的双功能激素和药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的方法，其包括向所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种：(a)上文提到的双功能激素，或者(b)上文提到的组合物。
在一个实施方案中，上文提到的施用通过静脉内输注。在又一个实施方案中，上文提到的静脉内输注是以约1ng/kg/min至约10μg/kg/min的速率。
在另一个方面，本发明提供了用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的方法，其包括向所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种：(a)上文提到的双功能激素，或者(b)上文提到的组合物。
在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物的制备中的用途。
在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的用途。
在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素，或者(b)上文提到的组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的用途。
在另一个方面，本发明提供了(a)上文提到的双功能激素，或者(b)上文提到的组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物的制备中的用途。
在一个实施方案中，上文提到的肾病症是急性肾损伤。
在另一个实施方案中，上文提到的肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。
在又一个实施方案中，上文提到的手术后肾损伤或功能障碍是由用于瓣膜修复的心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素或组合物适合通过静脉内输注来施用。在又一个实施方案中，上文提到的静脉内输注是以约1ng/kg/min至约10μg/kg/min的速率。
本发明的其他目的、优点和特征在阅读其具体实施方案的下列非限制性描述时将变得更加明显，其中所述具体实施方案通过仅引用附图的实施例的方式给出。
附图简述
在所附的附图中：
图1显示(A)以推注剂量静脉内注射逐渐增加的剂量的肽(SEQ ID NO：2和33)对血压的作用。数据被绘制为从基线平均动脉压(MAP)(在图1A中用“B”表示)的百分比变化。(B)单一剂量(30μg/kg/h输注)的肽对血压的作用。在一小时内记录MAP。数据被绘制为作为时间(分)的函数的从基础MAP的百分比变化。#2＝天然ANP(SEQ ID NO：2)，#33＝SEQID NO：33的双功能激素；
图2显示在SD大鼠中双功能激素对高血压的作用。数据被绘制为从基础血压的百分比变化；
图3显示使用双功能激素的预防性处理对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用；在肾动脉夹紧前和夹紧后以15μg/kg/h输注肽#2或#33一小时。在不同的时间测定血浆肌酸酐和尿素。通过两因素方差分析(two wayANOVA)使用Bonferroni检验分析数据对盐水处理组的显著性(每组n＝3；盐水组n＝6)。
图4显示使用双功能激素的治疗性(即损伤后)处理对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用。在肾缺血的大鼠模型中在除掉肾夹之后输注肽#2和#332小时。在指定的时间收集血液样品并测定血浆肌酸酐和尿素。通过两因素方差分析使用Bonferroni检验分析数据对盐水处理组的显著性(每组n＝3；盐水组n＝6)；
图5显示双功能激素的长期输注对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用。在除掉肾动脉夹之后，使用腹膜内植入式AlzetTM微型泵以两个剂量输注肽#2或#33(2ML1；输送速率10μl/h)。在指定时间测定血浆肌酸酐和BUN。通过两因素方差分析使用Bonferroni检验分析数据对盐水处理组的显著性(每组n＝3；盐水组n＝6)；以及
图6显示在经历30分钟肾缺血的大鼠的肾脏中嗜中性粒细胞标志物(CD11 b)、肾小管损伤标志物(KIM-1)和炎性细胞因子(IL-1β)以及蛋白上样标志物(β-肌动蛋白)的免疫化学鉴别。使用AlzetTM微型泵以15μg/kg/h的输注速率输注双功能激素#33 24小时。用特异性抗体鉴别蛋白。(A)蛋白质印迹。(B)柱状图显示标志物的相对丰度。
发明的公开内容
本发明涉及新的双功能激素以及其用途，例如用于预防和/或治疗肾相关的疾病或病况诸如急性肾衰竭(ARF)或急性肾损伤(AKI)。双功能激素显示出对α-MSH(α-促黑激素)受体的生物活性和对利尿钠肽受体中的至少一种的生物活性。
相应地，在一个方面，本发明提供了双功能激素，其包含：
(a)第一结构域，其包含α-MSH肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有α-MSH相关的激素活性；和
(b)与所述第一结构域共价连接的第二结构域，所述第二结构域包含利尿钠肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有利尿钠肽相关的激素活性。
在一个实施方案中，其中当第一结构域是SEQ ID NO：1的α-MSH肽时，第二结构域是具有利尿钠肽相关的激素活性的片段、变体或片段的变体，而如果第二结构域是SEQ ID NO：2、3、4或5的利尿钠肽，第一结构域是具有α-MSH相关的激素活性的片段、变体或片段的变体。
本发明还提供了双功能激素，其包含与具有利尿钠肽相关生物活性的第二结构域共价连接的具有α-MSH相关生物活性的第一结构域，其中(i)所述第一结构域不是全长(即天然的)α-MSH肽，(ii)所述第二结构域不是全长(即天然的)利尿钠肽，或者(iii)(i)和(ii)两者。
黑皮质素是阿黑皮素原衍生的哺乳动物的肽激素，其包括促肾上腺皮质激素(ACTH(1-39))、α-促黑激素((α-MSH(1-13))和包括β-和γ-MSH的相关的氨基酸序列。黑皮质素肽具有强效的抗-炎性/抗细胞因子活性(Lipton和Catania，Immunol.Today 18：140-145，1997)。黑皮质素经由刺激黑皮质素受体(MCR)提供它们的活性中的至少一些。促黑激素(MSH)活性部分归因于1至5型黑皮质素受体(MCR1-MCR5)的结合和激活。
α-MSH以大的亲和力与已知在几种组织和细胞中表达的1型受体(MCR1)结合。β-MSH、γ-MSH和ACTH也与MCR1结合但亲和力较低。已报道MCR2仅结合ACTH而不与MSH肽中的任何一个结合。γ-MSH以高亲和力与MCR3受体结合而β-MSH以高亲和力与MCR4受体结合。
α-MSH已经显示出抑制炎症过程的主要形式(Lipton和Catania，Immunol Today，18：140-145，1997)，其包括：
1-嗜中性粒细胞趋化活性的抑制(Catania，A.N.等人，Peptides，17：675-679，1996)；
2-由LPS处理诱导的细胞因子(IL-1，TNF-α)释放的抑制；
3-响应细菌内毒素的TNF-α的抑制(Wong，K.Y.等人，Neuroimmunomodulation，4：37-41，1997)；
4-实验性炎性肠病中的炎症减少(Rajora，N.等人Peptides，18：381-385，1997)；
5-缺血诱导的急性肾衰竭(Star，R.A.等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，92：8016-8020，1995)；
6-来自皮肤微血管内皮细胞的IL-8释放的增加(Hartmeyer，M.T.，J.Immunol，159：1930-1937，1997)；
α-MSH作用通过在包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肾小管的各种细胞类型中表达的黑皮质素受体介导。
利尿钠肽是由三种不同基因合成的肽家族中的一部分(Flynn TG.Pro.Soc.Exp.Biol.Med.213：98-104，1996；Levin ER等人.N Eng J.Med339：321-328，1998；Ogawa Y等人.Clin Exp Pharmacol physioi.22：49-53，1995；Rosenzweig A.，Annu Rev Biochem 60：229-255，1991)并且之后被储存为三种不同激素原[即126氨基酸的ANP、108氨基酸的脑利尿钠肽(BNP)和126-氨基酸的C-型利尿钠肽(CNP)激素原](Levin ER等人，N Eng J. Med 339：321-328，Vesely DL Atrial Natriuretic Hormones(心房利尿钠激素).Englewood Cliffs，NJ：Prentice Hall，1992，1-256)。
在动物和人类中，126-氨基酸的ANP激素原中有四个肽激素，具有降低血压、利尿钠、利尿和/或利尿钾特性。通过从激素原的N端末端开始的以它们的氨基酸序列编号的这些肽激素如下：
-激素原的残基1-30：长效利尿钠肽(LANP)；
-激素原的残基31-67：血管舒张剂；
-激素原的残基79-98：利尿钾肽；以及
-激素原的残基99-126：ANP。
在另一方面，BNP和CNP基因看起来每种在它们各自的激素原中合成仅一种肽激素即BNP和CNP。
心房利尿钠肽(ANP)，主要来源于心房肌细胞的一种循环激素，在盐和水的动态平衡以及血压的控制中起作用。此外，ANP是血管舒张剂并且也对肾脏具有直接作用，包括肾小球滤过增加、钠再吸收抑制和促进尿钠增多和利尿的肾血流重分布。
尿舒张素是利尿钠肽家族中的肾源性成员并且从相同的ANP激素原形成并由氨基酸序列95-126组成。除了N端的4个氨基酸，其与ANP相同(99-126)。尿舒张素看起来是肾脏中钠和水处理的重要调节剂，以及患有充血性心力衰竭(CHF)的患者中钠排出的介质。
BNP在健康人类中产生与ANP相似的生物学作用。在正常男性中输注BNP产生钠排出上两倍的增加，血浆肾素、血管紧张素II和醛固酮分泌上50％的减少。从BNP原的C端末端切割32个氨基酸的序列产生为在血浆中生理活性形式的人类BNP(77-108)。
CNP诱导与其他利尿钠肽相似的心血管作用。从CNP原切割末端氨基酸序列105-126以产生CNP的生物学活性形式。
ANP和BNP的大多数生物学作用是由鸟苷酸环化酶偶合的细胞表面受体A-受体(NPR-A)介导的(Garbers，DL，Cell 1992，71：1-4)。CNP是另一种鸟苷酸环化酶偶合的NP受体B-受体(NPR-B)的特异性配体(Maack T，Ann.Rev.physiol.1992，54：11-27)。第三种受体，所谓的NP清除受体(NPR-C)，结合ANP、BNP和CNP。除了在整个机体中NP清除上的主要作用(Maack T，Ann.Rev.physiol.1992，54：11-27)，也报道过ANP的几种作用是经由NPR-C受体介导的(Maack T，Kidney Int 1996，49：1732-1737)。除了与NP受体结合，利尿钠肽还借助中性内肽酶通过蛋白质水解被清除。利尿钠肽受体的所有三个亚型(NPR-A、NPR-B和NPR-C)已经被证实在包括肾系统和心脏的不同组织中表达(Nunez，DJR等人，J.ClinInvest.1992，90：1966-1971)。
α-MSH、ANP、尿舒张素、BNP和CNP的天然氨基酸序列在下文表1中给出。
表1
  名称   SEQ IDNO：   氨基酸序列
  α-MSH   1   Ac-S-Y-S-M-E-H-F-R-W-G-K-P-V
  ANP   2   S-L-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y
  尿舒张素   3   T-A-P-R-S-L-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y
  BNP   4   S-P-K-M-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H
  CNP   5   G-L-S-K-G-[C-F-G-L-K-L-D-R-I-G-S-M-S-G-L-G-C]
[ ]＝经由二硫桥环化的肽；“[”右边的氨基酸与“]”左边的氨基酸形成桥。
如本文所用的，术语“氨基酸”包括肽化学中用于制备肽的合成类似物的天然存在的氨基酸以及其他氨基酸(例如天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸、不被核酸序列编码的氨基酸等)的L-和D-异构体。天然存在的氨基酸的实例是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。其他氨基酸包括例如在邻位、对位和间位由烷氧基、卤素或硝基基团等取代的正亮氨酸、正缬氨酸、环己基丙氨酸、二苯基丙氨酸、高苯丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、苯丙氨酸。这些氨基酸是在生物化学/肽化学领域中所熟知的。
在本文可互换使用的“生物学活性”或“生物活性”或“活性”或“生物学功能”是指通过肽激素或双功能激素或者通过其任何片段直接或间接执行的功能。生物学活性包括例如与激素受体结合并引起激素响应/活性。
α-MSH相关的生物学活性通常是指天然α-MSH的生物学(例如激素)活性，例如抗炎性和/或抗细胞因子活性。利尿钠肽相关的生物学活性通常是指天然ANP、天然BNP、天然CNP或天然尿舒张素的激素活性之一，例如降低血压、利尿钠、利尿、血管舒张剂和/或利尿钾活性。如实施例2中所描述的，α-MSH相关的生物学活性(例如α-MSH受体结合活性)的测定可例如通过使用MCR1受体表达细胞的体外测定来完成。如实施例2中所描述的，利尿钠肽相关的生物学活性(例如利尿钠肽受体结合活性)的测定可通过使用ANP受体表达细胞的体外测定来完成。
如本文所用的，术语“片段”是指保留肽活性(例如α-MSH肽或利尿钠肽相关的激素活性)的肽的部分/区段。术语变体是指与野生型肽(例如α-MSH肽和/或利尿钠肽)或其片段相比具有至少一个修饰的结构域。
在实施方案中，修饰是一个或多个氨基酸的缺失、插入、取代或化学修饰。修饰可是例如(诸如一至十个)连续的或非连续的氨基酸的缺失、(诸如一至十个)氨基酸的取代、天然存在的氨基酸(L-氨基酸)经由相应的D-氨基酸的一个或多个取代、以例如一个、两个、三个或更多个氨基酸的序列的伸长。
在一个实施方案中，上文提到的取代是保守的氨基酸取代。
如本文所用的，术语“保守的(conserved)氨基酸取代”(或有时“保守的(conservative)氨基酸取代”)是指肽中在给定位置的一个氨基酸对另一个氨基酸的取代，其中能进行所述取代而没有相关功能的显著丢失。当进行这样的变化时，能在侧链取代基的相对相似性(例如它们的大小、电荷、疏水性、亲水性以及类似性质)的基础上进行相似氨基酸残基的取代，并且这些取代可通过常规检测来测定它们对肽的功能的影响。
在一些实施方案中，当氨基酸残基被另一个具有相似亲水性值(例如在正或负2.0的值的范围内)的氨基酸取代时，进行了保守的氨基酸取代，其中下列可以是具有指定给氨基酸残基的亲水性指数(例如约-1.6，Tyr(-1.3)或Pro(-1.6))的氨基酸(如通过引用并入本文的美国专利第4,554,101中所详细描述的)：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。
在其他的实施方案中，当氨基酸残基被另一个具有相似亲水性指数(例如在正或负2.0的值的范围内)的氨基酸取代时，进行了保守的氨基酸取代。在这样的实施方案中，每个氨基酸残基可在其疏水性和电荷特性的基础上被指定亲水性指数，如下：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。
在其他的实施方案中，当氨基酸残基被另一个相同类型的氨基酸残基取代时，进行了保守的氨基酸取代，其中氨基酸被分为非极性、酸性、碱性和中性类型，如下：非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性Asp、Glu；碱性：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
保守的氨基酸变化能包括L-氨基酸被相应的D-氨基酸、被保守的D-氨基酸或被天然存在的非遗传编码形式的氨基酸取代以及L-氨基酸的保守取代。天然存在的非遗传编码的氨基酸包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2，3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、4-氨基-丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯代苯丙氨酸、2-氟代苯丙氨酸、3-氟代苯丙氨酸、4-氟代苯丙氨酸、青霉胺、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、蛋氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸、对氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、半胱磺酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。
在其他的实施方案中，保守的氨基酸变化包括以对亲水性或疏水性、大小或体积或者电荷的考虑为基础的变化。氨基酸通常可主要依赖于氨基酸侧链的性质而被表征为疏水的或亲水的。以Eisenberg等人(J.Mol.Biol.179：125-142，1984)标准化的统一疏水性等级为基础，疏水的氨基酸表现出大于零的疏水性而亲水氨基酸表现出小于零的亲水性。遗传编码的疏水性氨基酸包括Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met和Trp，而遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser和Lys。
疏水的或亲水的氨基酸还可以它们的侧链的表征为基础被进一步细分。例如，芳香族氨基酸是具有含有至少一个芳香族环或杂芳香族环的侧链的疏水的氨基酸，其可含有一个或多个取代基。
非极性氨基酸是具有在生理pH下不带电荷的并且具有其中对两个原子中的每一个来说平等地拥有被两个原子共享的一对电子的键的侧链(即侧链是非极性的)的疏水性氨基酸。遗传编码的非极性的氨基酸包括Gly、Leu、Val、Ile、Ala和Met。非极性的氨基酸可被进一步细分以包括脂肪族氨基酸，其是具有脂肪烃侧链的疏水的氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala、Leu、Val和Ile。
极性氨基酸是具有在生理pH下不带电但是具有其中对原子中的一个来说更靠近地拥有被两个原子共享的电子对的一个键的侧链的亲水的氨基酸。遗传编码的极性氨基酸包括Ser、Thr、Asn和Gln。
酸性氨基酸是具有小于7的侧链pKa值的亲水的氨基酸。酸性氨基酸通常在生理pH下由于失去氢离子而具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸是具有大于7的侧链pKa值的亲水的氨基酸。碱性氨基酸通常在生理pH下由于与水合氢离子缔合而具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg、Lys和His。
上文的分类并不完全，氨基酸可被分为不止一种类别。此外，氨基酸分类能基于已知的作用和或以特定的测定为基础表征的化学、物理或生物学特性或与之前鉴定的氨基酸相比较。氨基酸还可包括具有氨基酸类似侧链的双功能部分。
保守的变化还可包括化学衍生的部分对非衍生的残基的取代，通过例如氨基酸功能侧基的反应。
除了上文概述的取代，提供相似的侧链官能度的合成的氨基酸也可被引入肽中。例如，芳香族氨基酸可被D-或L-萘基丙氨酸、D-或L-苯甘氨酸、D-或L-2-噻吩丙氨酸、D-或L-1-、2-、3-或4-芘基丙氨酸、D-或L-3-噻吩丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯丙氨酸、D-对氟代苯丙氨酸、D-或L-对二苯基丙氨酸D-或L-对甲氧基二苯基丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸，和D-或L-烷基丙氨酸置换，其中烷基基团选自由取代的或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基和异戊基组成的组。
可制备非羧酸盐氨基酸以具有负电荷，如被认为是非限制性实例的膦酰基-或硫酸化的(例如-SO3H)氨基酸所提供的。
其他的取代可包括非天然的烷基化的氨基酸，通过将烷基基团与任何天然氨基酸结合而制得。碱性的天然氨基酸例如赖氨酸和精氨酸可在胺(NH2)官能度处被烷基基团取代。还有其他的取代包括天冬酰胺或谷氨酰胺的腈衍生物(例如含有代替CONH2官能度的CN部分)和蛋氨酸的亚砜衍生物。此外，肽中的任何酰胺键可被酮亚甲基、羟乙基、乙基/还原的酰胺、硫代酰胺或反向的酰胺部分置换(例如(-C＝O)-CH2-)、(-CHOH)-CH2-)、(CH2-CH2-)、(-C＝S)-NH-)或(-NH-(-C＝O)置换(-C＝O)-NH-))。
其他修饰也可包括在本发明的双功能激素的变体的定义中。例如肽的太小可通过缺失一个或多个氨基酸来减小，和/或可使用氨基酸模拟物或含有非肽键的二肽模拟物。用于这些目的的使用分子支架例如苯并二氮杂
Figure GA20191534200880022924401D00181
、氮杂
Figure GA20191534200880022924401D00182
、取代的γ内酰胺环、酮亚甲基伪肽、β-转角二肽核和β-氨基醇的实例是肽化学家已知的并且描述在例如Peptidomimeticprotocols(肽模拟物方案)(Methods in molecular medicine(分子医学中的方法)第23卷)W.M.Kazmierski(编辑)，Humana Press和Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics(氨基酸模拟物和肽模拟物中的进展)，第1和2卷，A.Abell(编辑)。
肽的共价修饰于是包括在本发明的范围内。这些修饰例如可通过将多肽的靶氨基酸残基与能够与所选择的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而被引入双功能激素中。化学衍生物的下列实例是以示例性说明而非限制性的方式提供的。
半胱氨酰基残基可与α-卤乙酸(以及相应的胺)例如2-氯乙酸或氯乙酰胺反应以产生羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。组氨酰基残基可通过与化合物例如二乙基焦碳酸酯诸如在pH 5.5-7.0反应而被衍生，因为这种试剂对组氨酰基侧链相对特异，并且对溴苯甲酰基甲基溴也可被使用，例如当反应优选地在0.1M的二甲胂酸钠中于pH6.0下进行时。赖氨酰基和氨基末端残基可与化合物例如琥珀酸或其他羧酸的酸酐反应。用于衍生含有α氨基的残基的其他适合的试剂包括化合物诸如亚氨酸酯如甲基吡啶亚胺甲酯、吡哆醛磷酸酯、吡哆醛、氯代硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰基残基可依照已知的方法步骤通过与苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮中的一种或几种常规试剂反应而被修饰。因为胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生通常在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε氨基基团反应。酪氨酰基残基的特异性修饰本身是熟知的，例如通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰基残基。N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷可分别被用来形成O-乙酰基酪氨酰基物类和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)可通过与碳二亚胺(R’-N＝C＝N-R’)例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应而被选择性地修饰。此外天冬氨酰基和谷氨酰基残基可通过与铵离子反应被转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基常常被脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。根据已知的方法步骤，本发明中的肽的其他的修饰可包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化，N端胺的乙酰化，主链酰胺残基的甲基化(或被N-甲基氨基酸取代)以及在某些实例中C端羧基基团的酰胺化。
脂肪酸(例如，C6-C18)与肽的共价连接可赋予另外的生物学特性例如蛋白酶抗性、血浆蛋白结合、增加的血浆半衰期、细胞内穿透等。上文描述的双功能激素的修饰没有限制方法的范围也没有限制可被设计的可能的修饰。
在实施方案中，双功能激素的第一结构域可直接(例如通过肽键)或通过适当的连接体部分例如一个或多个氨基酸的连接体(诸如聚甘氨酸连接体)或其它类型的化学连接体(例如糖类连接体、脂类连接体、脂肪酸连接体、聚醚连接体、PEG等)(参见例如(Hermanson(1996)Bioconjugatetechniques(生物轭合技术))与第二结构域共价连接。在一个实施方案中，一个或多个另外的结构域(例如具有生物学活性的结构域)可被插在第一和第二结构域之间。在一个实施方案中，第一和第二结构域可通过肽键共价连接。
在一个实施方案中，第一结构域与天然存在的α-MSH序列(SEQ ID NO：1)相比包含至少一个修饰。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含SEQ ID NO：1的肽的至少4个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75％同源性的所述片段的变体。
在另一个实施方案中，上文提到的α-MSH肽的变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少75％同源性的氨基酸序列。
“同源性”和“同源的”是指两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较所比对的序列中的每个位置而测定。核酸之间或氨基酸序列之间的同源性的程度是序列共有的位置处相同或匹配的核苷酸或氨基酸的数目的函数。当该术语在本文使用时，如果核酸或氨基酸序列与另一个序列基本上相同，那么两个序列是“同源的”并且序列的功能性活性是保守的(如本文所用的，术语“同源的”没有推断进化上的关联性)。如果当最佳地比对(允许缺口)时，两个核酸或氨基酸序列共有至少约75％的序列相似性或同一性，或者如果所述序列共有确定的功能基序时，它们被认为是“基本上相同的”。在可选择的实施方案中，在最佳地比对的基本上相同的序列中序列相似性可是至少80％、85％、90％或95％。如本文所用的，序列之间给定百分比的同源性指出在最佳地比对的序列中序列同一性的程度。“不相关的”或“非同源的”序列与本文所描述的序列共有少于40％的同一性，尽管优选地少于约25％的同一性。
用于同一性比较的序列的最佳比对的进行可使用不同的算法例如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2：482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的搜索相似性的方法和这些算法的计算机实现(例如Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.)。序列同一性还可使用Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-10中描述的BLAST算法测定(使用公开的默认设置)。用于实行BLAST分析的软件是可通过National Center for BiotechnologyInformation(美国国家生物技术信息中心)的网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。BLAST算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字来鉴定高分序列对(HSP)，所述长度W的短字当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值的阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值。最初的相邻字匹配(word hits)作为用于起始搜索的种子以找到更长的HSP。只要累积的比对得分可以增加，字匹配便沿每个序列向两个方向延伸。当下列参数被满足时字匹配在每个方向上的延伸被终止：累积的比对得分从其最高达到的值降低数量X；累积的得分由于一个或多个负得分残基比对的积累变为零或以下；或者到达任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序可使用11的字长(W)、BLOSUM62得分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)、50的比对(B)、10(或1或0.1或0.01或0.001或0.0001)的期望值(E)、M＝5、N＝4以及两条链的比较作为默认设置。使用BLAST算法的两条序列之间的统计学相似性的一个量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率的指示。在本发明的可选择的实施方案中，如果检验序列的比较中最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01并且最优选地小于约0.001时，核苷酸或氨基酸序列被认为是基本相同的。
基本上互补的核酸是其中一个分子的补体与另一个分子基本上相同的核酸。两个核酸序列是基本上互补的可选择的指示是两条序列在适度严格或优选地严格的条件下彼此杂交。与滤器结合序列在适度严格的条件下的杂交可例如在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃进行并在0.2x SSC/0.1％SDS中于42℃清洗(参见Ausubel，等人(编辑)，1989，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法)，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.和JohnWiley & Sons，Inc.，New York，第2.10.3页)。可选择地，与滤器结合序列在严格条件下的杂交可例如在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃进行并在0.1x SSC/0.1％SDS中于68℃清洗(参见Ausubel，等人(编辑)，1989，如上)。杂交条件可根据已知的方法取决于感兴趣的序列而修改(参见Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分子生物学中的实验室技术—与核酸探针的杂交)，第I部分，第2章″Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays(核酸探针测定的杂交原理和策略的概述)″，Elsevier，New York)。通常，将严格条件选择为比在指定的离子强度和pH下特异性序列的热解链温度(thermal melting point)低约5℃。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含式I(SEQ ID NO：47)的氨基酸序列：
X2-H-X1-R-W-X3         (I)
其中：
X1是L-Phe或D-Phe；
X2是E、M-E或者不存在；
X3是G-K-P-X4、G-K-P、G-K、G或者不存在；
X4是M、V或Nle。
在又一个实施方案中，上文提到的第一结构域包含：
(i)H-X1-R-W-G-K-P-X4(SEQ ID NO：48)；
(ii)M-E-H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：17)；
(iii)H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：49)；
(iv)E-H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：50)；或者
(v)H-X1-R-W(SEQ ID NO：20)；
其中X1是L-Phe或D-Phe而X4是M、V或Nle。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域含有10个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，上文提到的第一结构域含有9个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，上文提到的第一结构域含有8个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，上文提到的第一结构域含有7个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，上文提到的第一结构域含有6个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，上文提到的第一结构域含有5个氨基酸或更少。
在一个实施方案中，上文提到的第一结构域由下列组成：
(i)H-f-R-W-G-K-P-V(SEQ ID NO：51)；
(i i)H-f-R-W-G-K-P-M(SEQ ID NO：52)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle(SEQ ID NO：53)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P(SEQ ID NO：54)；
(v)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO：11)；
(vi)H-f-R-W-G(SEQ ID NO：55)；
(vii)E-H-F-R-W(SEQ ID NO：56)；
(ix)E-H-f-R-W-G(SEQ ID NO：57)；或者
(iv)H-f-R-W(SEQ ID NO：6)；
其中
f是D-苯丙氨酸。
在一个实施方案中，如果第一结构域位于双功能激素的N端部分，那么氨基末端残基被C2-C16酰基基团酰基化。在又一个实施方案中，氨基末端残基被乙酰化。
根据本发明的双功能激素的第一结构域的氨基酸序列的代表性实例在表I中列出。
表I
  SEQ ID NO：   氨基酸序列
  6   H-f-R-W
  7   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M
  8   Ac-H-f-R-W
  9   Ac-H-f-R-W-G
  10   M-E-H-f-R-W-G
  11   M-E-H-F-R-W-G
  12   Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle
  13   Ac-H-F-R-W-G
  14   Ac-E-H-F-R-W-G
  15   Ac-E-H-f-R-W-G
  16   Ac-H-Xa-R-W-G-K-P-Xb
  17   M-E-H-Xa-R-W-G
  18   Ac-H-Xa-R-W-G
  19   Ac-E-H-Xa-R-W
  20   H-Xa-R-W
  21   Ac-H-Xa-R-W
f是D-Phe
Xa是L-Phe或D-Phe并且
Xb是Met、Val或Nle
在一个实施方案中，本发明的双功能激素的第二结构域与天然存在的ANP(SEQ ID NO：2)、尿舒张素(SEQ ID NO：3)、BNP(SEQ ID NO：4)或CNP(SEQ ID NO：5)的序列相比含有至少一个修饰。
在一个实施方案中，第二结构域包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的至少15个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75％同源性的所述片段的变体。
在一个实施方案中，上文提到的利尿钠肽的变体包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少75％同源性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二结构域包含式III(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列：
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9       (III)
其中
X5是M、Nle、R-R-S-S、S-L-R-R-S-S或者不存在；
X6是E、D或C；
X7是H或者不存在；
X8是M或Nle；
X9是S-K-Y-R、S-C-Y-R或G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y；
其中
当X6是C而X9是S-C-Y-R或G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y时，X6的C残基与X9的C残基形成二硫桥；
当X6是E或D，X9是S-K-Y-R时，X9的K残基与X6的E或D残基形成内酰胺桥。
在一个实施方案中，第二结构域包含式II(SEQ ID NO：58)的氨基酸序列：
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9       (II)
其中：
X5是M、Nle，R-R-S-S、S-L-R-R-S-S或者不存在；
X6是C；
X7是H或者不存在
X8是M或Nle；
X9是S-C-Y-R或G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y；
其中
X6的C残基与X9的C残基形成二硫桥；并且
当X5是Nle时，所述第一结构域在所述第二结构域的N端。
在一个实施方案中，第二结构域包含式III(SEQ ID NO：71)的氨基酸序列：
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9      (III)
其中
X5是M、Nle、R-R-S-S、S-L-R-R-S-S或者不存在；
X6是E或D；
X7是H或者不存在；
X8是M或Nle；
X9是S-K-Y-R；
其中
X9的K残基与X6的E或D残基形成内酰胺桥。
在一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有25个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有24个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有23个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有22个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有21个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有20个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有19个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有18个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有17个氨基酸或更少。
在又一个实施方案中，上文提到的第二结构域含有16个氨基酸或更少。
在一个实施方案中，第二结构域包含：
(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：22)；
(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：23)；
(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：24)；
(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置5和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：26)；
(vi)Nle-E-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-K-Y-R，其中位于位置2的E残基和位于位置13的K残基形成内酰胺桥(SEQ ID NO：70)；
(vii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：59)；或者
(viii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2和18的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：60)。
在一个实施方案中，第二结构域由下列组成：
(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：22)；
(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：23)；
(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：24)；
(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置5和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：26)；
(vi)Nle-E-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-K-Y-R，其中位于位置2的E残基和位于位置13的K残基形成内酰胺桥(SEQ ID NO：70)；
(vii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：59)；或者
(viii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2和18的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：60)。
根据本发明的双功能激素的第二结构域的氨基酸序列的代表性实例在下文的表II中列出。
表II
 SEQ ID NO：   氨基酸序列
 22   M-[C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C]-Y-R
 23   Nle-[C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C]-Y-R
 24   [C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y
 25   [C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y
 26   R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y
 27   S-P-K-M-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H
 28   P-K-P-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H
[ ]＝经由二硫桥环化的肽；“[”右边的氨基酸与“]”左边的氨基酸形成桥。
在实施方案中，第一和第二结构域可C端对N端、C端对C端、N端对N端或N端对C端地连接。在一个实施方案中，第一结构域(α-MSH肽)和第二结构域(利尿钠肽)中的每一个具有N端氨基酸和C端氨基酸，并且第一结构域的C端氨基酸与第二结构域的N端氨基酸共价连接。在一个实施方案中，第一结构域在第二结构域的N端。
在实施方案中，N和/或C端氨基酸可通过酰胺化、乙酰化、酰基化或本领域内已知的其他修饰而被修饰。在一个实施方案中，双功能激素的氨基末端残基(即在肽的N端末端的自由氨基基团)被修饰(例如为了防止降解)。在一个实施方案中，修饰是用C2-C16酰基基团酰基化，在又一个实施方案中，修饰是乙酰化。
在一个实施方案中，所述双功能激素的羧基末端残基(即在肽的C端末端的自由羧基基团)被修饰(例如为了防止降解)。在一个实施方案中，修饰是酰胺化。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约100个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约90个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约80个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约70个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约60个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约50个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约40个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有约30个氨基酸或更少。在又一个实施方案中，上文提到的双功能激素含有在约20至约30个之间的氨基酸。
在一个实施方案中，双功能激素包含：
(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：61)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：62)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：63)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：64)；
(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：65)；
(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：66)；
(vii)H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：67)；
(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：68)；或者
(ix)E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：69)；其中f是D-苯丙氨酸。
在一个实施方案中，双功能激素由下列组成：
(i)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：31)；
(ii)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：33)；
(iii)Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：34)；
(iv)Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：35)；
(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：36)；
(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：38)；
(vii)Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：39)；
(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W-NH2，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：40)；或者
(ix)Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：42)；
其中
Ac代表氨基末端乙酰化；
NH2代表羧基末端酰胺化，并且
f是D-苯丙氨酸。
本发明还包括上文提到的双功能激素的药学上可接受的盐。
本发明的双功能激素可通过在包含编码双功能激素的核酸的宿主细胞中的表达(重组表达)或通过化学合成(例如固相肽合成)来生产。肽可通过本领域内熟知的自动化固相程序容易地合成。适当的合成可通过利用“T-boc”或“Fmoc”程序来完成。用于固相合成的技术和程序描述于例如IRL，Oxford University Press，1989出版的E.Atherton和R.C.Sheppard的Solid Phase peptide Synthesis：A Practical Approach(固相肽合成：一种实用方法)中。可选择地，肽可通过如下描述的区段缩合的方法来制备：例如在Liu等人，Tetrahedron Lett.37：933-936，1996；Baca等人，J.Am.Chem.Soc.117：1881-1887，1995；Tam等人，Int.J.Peptide Protein Res.45：209-216，1995；Schnolzer和Kent，Science256：221-225，1992；Liu和Tam，J.Am.Chem.Soc.116：4149-4153，1994；Liu和Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6584-6588，1994以及Yamashiro和Li，Int.J.Peptide Protein Res.31：322-334，1988中。用于合成肽的其他方法描述于Nakagawa等人，J.Am.Chem.Soc.107：7087-7092，1985中。肽合成服务的商业提供者也被用来制备合成的D-或L-构型的肽。这些提供者包括例如Advanced ChemTech(Louisville，Ky.)、Applied Biosystems(Foster City，Calif.)，Anaspec(San Jose，Calif.)和Cell Essentials(Boston，Mass.)。
还可使用标准方法使用重组DNA技术制备含有由遗传密码编码的天然存在的氨基酸的肽和肽类似物。可使用本领域中熟知的方法修饰通过重组技术生产的肽(例如N端酰基化[诸如乙酰化]、C端酰胺化、肽内的环化或形成环[如经由Cys残基之间二硫桥的形成])。因此在实施方案中，在本文描述的双功能激素含有由遗传密码编码的天然存在的氨基酸的情况下，双功能激素可使用重组方法生产并在实施方案中可经历例如刚提到的修饰(例如酰基化、酰胺化、环化)。相应地，在另一方面，本发明还提供编码上文提到的双功能激素的核酸。本发明还提供含有上文提到的核酸的载体。还在另一个方面，本发明提供含有上文提到的核酸和/或载体的细胞(例如宿主细胞)。本发明还提供使用例如本领域内熟知的培养基、生产、分离和纯化方法，用于表达/生产本发明的肽或双功能激素的重组表达系统、载体和宿主细胞，例如上文所描述的那些。
这些载体含有可操作地连接至一个或多个转录调节序列的能够编码这样的肽的核酸序列。在一个实施方案中，肽是含有有利于其纯化的结构域(例如His-标签，GST-标签)的融合肽。可使用用于稳定或瞬时表达的标准重组技术将核酸引入用于表达的细胞中。本发明的核酸分子可包括含有天然存在或非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物的两个或更多个核苷酸的任何链。
“重组表达”是指通过重组技术生产肽或多肽(例如双功能激素)，其中通常编码肽或多肽的核酸被插入适合的表达载体中，表达载体反过来被用于转化/转染宿主细胞以生产蛋白。术语“重组体”当在引用蛋白或多肽使用时是指使用通过分子生物学技术的方法生产的重组核酸构建体表达的肽、多肽或蛋白分子。重组核酸构建体可包括核苷酸序列，其被连接至或被操作以成为连接至其原本没有连接的核酸序列或其原本在不同位置连接的核酸序列。因此，将核酸构建体称为“重组体”表明核酸分子已经使用基因工程即通过人为介入而被操作过。重组核酸构建体可例如通过转化/转染被引入宿主细胞。这种重组核酸构建体可包括来源于相同宿主细胞物种或来源于不同宿主细胞物种的序列，其已经被分离并被重新引入宿主物种的细胞中。重组核酸构建体序列可被整合至宿主细胞基因组，作为宿主细胞的最初转化的结果或作为随后的重组和/或修复事件的结果。
术语“载体”是指核酸分子，其能够运输已经与其连接的另一个核酸。一种优选的载体类型是附加体，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自动复制和/或表达已经与其连接的核酸的那些载体。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体本文被称为“表达载体”。
本发明的重组表达载体可通过本领域的一名普通技术人员已知的并且可在例如Sambrook等人(1989)的Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)中找到的标准技术来构建。对于连接DNA片段有各种策略可用，策略的选择取决于DNA片段末端的性质，并可由本领域的技术人员容易地确定。本发明的载体还可含有其他序列元件以帮助细菌和宿主细胞中的载体繁殖和选择。此外，本发明的载体可含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的核苷酸序列。诸如用于可选择的标志物和报告基因的编码序列是本领域的技术人员所熟知的。
含有本发明的核酸序列的重组表达载体可被引入宿主细胞，其可包括能够表达来自定义的重组表达载体的蛋白编码区的活细胞。活细胞可包括培养的细胞和活体器官中的细胞。相应地，本发明还提供含有本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”本文可交替使用。这些术语不仅是指特定的受体细胞还指这些细胞的后代或可能的后代。因为由于突变或者环境影响某些修饰可在随后的世代中发生，这些后代事实上与母细胞不同，但是仍包括在本文所使用的术语的范围内。
载体DNA可经由常规的转化或转染技术被引入细胞，术语“转化”和“转染”是指用于将外源核酸引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔、显微注射和病毒介导的转染。用于转化或转染宿主细胞的适当的方法可例如在Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他实验室手册中找到。用于将DNA体内引入哺乳动物细胞中的方法也是已知的，并且被用来将本发明的载体DNA递送至受治疗者以进行基因治疗。
“转录调节序列/元件”是通用术语，指DNA序列，例如诱导或控制与其可操作地连接的蛋白编码序列的转录的起始和终止信号、增强子和启动子、剪接信号、聚腺苷酸化信号。当第一个核酸序列与第二个核酸序列处于功能性关系时，第一个核酸序列与第二个核酸序列“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列可操作地连接。通常可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且当对于连接两个蛋白编码区来说必要时，在读码框中。然而，因为例如增强子通常在与启动子相隔几千个碱基时起作用，并且内含子序列可具有可变的长度，某些多核苷酸元件可被可操作地连接但不是相邻的。
如本文所用的术语“转染”或“转化”通常是指核酸例如经由表达载体通过核酸介导的基因转移引入受体细胞中。
已经被引入外源核酸(例如外源的或异源的DNA[诸如DNA构建体])的细胞(例如宿主细胞或指示细胞)、组织、器官或生物被认为是“转化的”、“转染的”或“转基因的”。转基因的或转化的细胞或生物还包括细胞或生物的后代以及从利用转基因生物作为母本的育种计划产生的并表现出由于重组核酸构建体的存在而产生的变化的表型的后代。转基因生物因此是已经用异源核酸转化的生物或包含所述转基因的这种生物的后代。引入的DNA可被整合到细胞基因组的染色体DNA中，或可选择地可被附加地保持(例如在质粒上)。转染的方法是本领域中熟知的(参见例如Sambrook等人1989，同上；Ausubel等人1994，同上)
对于哺乳动物细胞的稳定的转染来说，取决于表达载体和所使用的转染技术，仅有小部分细胞可将外源DNA整合至它们的基因组中是已知的。为了鉴别和选择这些整合体，编码可选择的标志物(例如对抗生素的抗性)的基因可随感兴趣的基因一起被引入宿主细胞。如本文所用的，术语“可选择的标志物”被广义地用于指对指示细胞提供可鉴别的特征的标志物。可选择地标志物的非限制性实例包括影响生存力、代谢、增殖、形态以及类似性质的标志物。优选的可选择的标志物包括提供对药物例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的那些。编码可选择的标志物的核酸可在与编码肽化合物的核酸相同的载体上被引入宿主细胞或可在不同的载体上被引入。使用引入的核酸稳定地转染的细胞可通过药物选择来鉴别(已经结合了可选择的标志物基因的细胞将存活，而其他的细胞将死亡)。
本发明的肽可通过本领域中熟知的许多技术例如反向色谱、高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、凝胶电泳和类似技术来纯化。用于纯化特定肽或肽类似物的实际条件将部分取决于合成策略和诸如净电荷、疏水性、亲水性和类似性质的因素，并且对本领域的那些普通技术人员来说是明显的。对于亲和色谱纯化，与肽或肽类似物特异性结合的任何抗体例如可被使用。
在一个实施方案中，上文提到的双功能激素是基本上纯的。当化合物与天然伴随其的组分分离时，化合物是“基本上纯的”。通常，当化合物重量上为样品中总体材料的至少60％、更通常75％，优选地超过90％并且更优选地超过95％时，化合物是基本上纯的。因此，例如化学合成的或通过重组技术生产的多肽将通常基本上不含与其天然相关的组分。当核酸分子不与在本发明的DNA所源自的生物的天然存在的基因组中通常与其相邻的编码序列直接相邻(即共价连接)时，核酸分子是基本上纯的。基本上纯的化合物可例如通过从天然来源的提取，通过编码多肽化合物的重组核酸分子的表达或通过化学合成来获得。纯度可使用任何适当的方法例如柱色谱、凝胶电泳、HPLC等测量。
在另一方面，本发明还提供含有上文描述的双功能激素以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本发明还提供用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的含有上文描述的双功能激素以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本发明还提供用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的含有上文描述的双功能激素以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
本发明还提供用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的方法，其包括对所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种：(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的药物组合物。
在另一方面，本发明还提供用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的方法，其包括对所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种：(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的药物组合物。
本发明还涉及上文描述的双功能激素在制备药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的药物组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物的制备中的用途。
在另一个方面，本发明提供(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的药物组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的用途。
在另一个方面，本发明提供(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的药物组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物的制备中的用途。
在另一个方面，本发明提供(a)上文提到的双功能激素或者(b)上文提到的药物组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的用途。
“有效量”是指在必需的剂量上和时间段内对达到所期望的预防和/或治疗结果(例如肾病症的预防和/或治疗)来说有效的量。本发明的化合物的有效量可根据因素例如个人的疾病状况、年纪、性别和体重以及化合物在个体引起所期望的响应的能力而变化。可调整给药方案以提供最佳的治疗响应。有效量也是化合物的任何有毒的或有害的作用超过治疗上有益的作用的量。对于任何特定的受治疗者来说，特定的给药方案可随着时间根据个人的需要和施用或管理组合物的施用的人的专业判断而调整。
如本文所用的“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及类似物。在一个实施方案中，载体适于肠胃外的施用。用于肠胃外施用的制剂可例如含有赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物来源的油或氢化的萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可被用于控制化合物的释放。用于本发明的化合物/组合物的其他可能有用的肠胃外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入式输注系统和脂质体。可选择地，载体可是适于静脉内、腹膜内、肌肉内、舌下或口服施用的。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌的注射溶液或分散液的无菌粉末。用于药学活性物质的这些介质和试剂的使用是本领域内熟知的。除非任何常规介质或试剂都是与活性化合物不相容的，否则其在本发明的药物组合物中的使用是预期的。补充的活性化合物还可掺入组合物中。
在一个实施方案中，上文提到的肾病症是急性肾损伤。如本文所用的术语“肾损伤”等同于“肾的损伤”并且这些术语可交替使用。在另一个实施方案中，上文提到的肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。在一个实施方案中，上文提到的手术后肾损伤或功能障碍是由瓣膜修复的心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。
在一个实施方案中，上文提到的施用经由静脉内输注。在又一个实施方案中，上文提到的静脉内输注以约1ng/kg/min至约10μg/kg/min的速率。
在一个实施方案中，上文提到的治疗包括不止一种(即组合的)活性/治疗剂的使用/施用。预防/治疗剂和/或本发明的组合物的组合可以任何常规剂型被施用或被共施用(例如，连续地、同时地、在不同时间地)。在本发明的背景下共施用是指在协调治疗期间不止一种治疗的施用以达到改善的临床结果。这种共施用还可是同延的，也就是说发生在重叠的时间段中。例如第一种药剂可在第二活性剂被施用之前、同时、之前和之后、或者之后施用于患者。在一个实施方案中，药剂可被组合/配制在单一的组合物中并由此在同一时间施用。在一个实施方案中，本发明的一种或多种活性剂与目前用于预防或治疗所讨论的病症(例如肾病症、高血压)的一种或多种药剂组合使用/施用。
本发明还提供试剂盒或包装，其包含用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病况或高血压的上文提到的双功能激素或上文提到的组合物连同说明书。
在一个实施方案中，上文提到的受治疗者是哺乳动物，在又一个实施方案中，是人。
发明实施方式
本发明通过下列非限制性实施例被更加详细地示例性说明。
实施例1：双功能激素的制备
固相合成
使用手动的固相肽合成方法使用具有适合的侧链保护的芴甲氧羰基-保护的α-氨基酸和具有0.75mmol/g负载的二苯甲基胺(BHA)树脂(BACHEM AG)制得本发明的双功能激素。在偶联氨基酸之前，将6-氨基己酸和Rink连接体偶联至树脂，之后使用溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的[2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯](HCTU)和二异丙基乙胺(DIEA)将Fmoc-[9H-芴-9-基甲氧羰基]保护的氨基酸偶联1小时。使用溶于DMF的20％(v/v)的哌啶进行Fmoc脱保护1小时。使用乙酸酐和DIEA进行用于使用乙酰基将本发明的肽N-加帽的通用程序。合成完成后，伴随同时的侧链脱保护将肽从固相支持体上切下。粗制直链的肽通过使用溶于0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈梯度在VydacTM C18-柱上的制备型RP-HPLC进一步纯化。将肽真空干燥以除去乙腈并从0.1％TFA冷冻干燥。通过分析型高效液相色谱(HPLC)测定纯度并通过使用VoyagerTM设备(PerSeptive Biosystems Inc.)的Matrix Assisted LaserDesorption/ionisation Mass Spectromety(基质辅助激光解吸/电离质谱)(MALDI-TOF MS)分析测定质量。
线性肽向环状肽的氧化环化(二硫化物)
将线性肽以约1mg/ml的浓度溶解在20％DMSO/HCl 1M(v/v)的溶液中。氧化反应的过程通过分析型C18 RP-HPLC监测。反应在12h后完成。之后使用制备型C18 RP-HPLC纯化溶液。通过分析型HPLC评估纯度并通过使用VoyagerTM设备(PerSeptive Biosystems Inc.)的MALDI-TOF MS分析测定质量。
在树脂上环化为内酰胺
装配线性序列后，使用钯(0)催化剂除去谷氨酸和赖氨酸侧链上正交的保护基团，即分别地Glu(γ-O-All)和Lys(ε-N-Aloc)保护基团。除去侧链保护基团后(通过Kaiser检测证实)，自由的氨基和羧基侧链可通过使用溶于DMF的[(7-氮杂苯并三唑-1-基)氧三-(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐](PyAOP)的处理而被环化。重复环化条件直到获得负的Kaiser检测。
不同的双功能激素被合成并列在下文的表III中。
表III
  SEQ.ID.NO： 序列
  29   Nle-[E-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-K]-Y-R-H-f-R-W-NH2
  30   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[E-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-K]-Y-R-NH2
  31   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C]-Y-R-NH2
  32   Nle-[C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C]-Y-R-H-f-R-W-NH2
  33   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  34   Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-[C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C]-Y-R-NH2
  35   Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-[C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  36   M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  37   M-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  38   Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  39   Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  40   S-L-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-H-f-R-W-NH2
  41   Ac-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  42   Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  43   Ac-H-R-W-G-K-P-M-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-s-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  44   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[C-F-G-G-R-M-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2
  45   Ac-H-f-R-W-S-P-K-M-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H-NH2
  46   Ac-H-f-R-W-G-P-K-P-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H-NH2
Ac＝N端乙酰化
NH2＝C端酰胺化
f＝D-苯丙氨酸
[ ]＝经由二硫桥或内酰胺桥环化的肽；“[”右边的氨基酸与“]”左边的氨基酸形成桥。
上文双功能激素的序列中的每一个的下划线部分代表第一结构域(α-MSH活性)而没有下划线的部分代表第二结构域(利尿钠活性)。
实施例2：双功能激素的活性
在表达ANP受体的LLC-PK1细胞和表达MCR1受体的B16-F1细胞上检测双功能激素。刺激前，两种细胞类型都在96孔板中以1.0x105细胞/ml的浓度培养24小时。刺激前，使细胞仅在DPBS中饥饿2小时并在测定缓冲液(含有20mM HEPES、0.1％BSA和500μM IBMX的DPBS)中孵育10分钟。在30分钟内以10-6M至10-12M的浓度获得双功能激素的剂量响应曲线。收集上清液并用来自GE Healthcare Company的放射性标记的试剂盒测量cAMP(B16-F1)或cGMP(LLC-PK1)。这些实验的结果示于表IV中。
表IV：双功能激素在cAMP(BC16-F1细胞)和cGMP(LLC-PK1细胞)产生上的EC50
SEQ.ID.NO： 序列   EC50MCR1受体BC16-F1细胞   EC50ANP受体LLC-PK1细胞
1   Ac-S-Y-S-M-E-H-F-R-W-G-K-P-V-NH 2 (天然α-MSH) 0.6nM NT
  2   S-L-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2(天然ANP) NR 3.3nM
  29   Nle-[E-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-K]-Y-R-H-f-R-W-NH 2 NT 1.43μM
31   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C]-Y-R-NH2 20.9nM 74.3nM
  32   Nle-[C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C]-Y-R-H-f-R-W-NH 2   NR   NR
33   Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 10.4nM 69nM
34   Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-[C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C]-Y-R-NH2 62.5nM 131.9nM
35   Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-[C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 31.4nM 216.3nM
  36 M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2   49.1nM   33.1nM
38   Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 258.9nM 6.9nM
  39   Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 11.5nM 52.1nM
  40 S-L-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-H-f-R-W-NH 2   9.8nM   7μM
  41   Ac-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 NR 8.9nM
42   Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 6.0nM 502.4nM
  43 Ac-H-R-W-G-K-P-M-[C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 NR 86.8nM
  44 Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-[C-F-G-G-R-M-G-A-Q-S-G-L-G-C]-N-S-F-R-Y-NH2 1.2nM NR
45   Ac-H-f-R-W-S-P-K-M-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H-NH2 364.7nM NR
46   Ac-H-f-R-W-G-P-K-P-V-Q-G-S-G-[C-P-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C]-K-V-L-R-R-H-NH2 28.0nM NR
NR＝检测无响应
NT＝未检测的
实施例3：双功能激素对大鼠的平均动脉压(MAP)的作用
为了研究双功能激素的体内药理学，以包括逐渐增加剂量的化合物的静脉内推注的方案测量它们对MAP的作用(例如降低血压的作用)。
动物：从Charles River Inc.获得Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，300g至330g重)。在12∶12光照∶黑暗循环下以标准的实验室食物喂养动物。
外科准备：将大鼠在实验过程中用异氟烷2.5％麻醉。将动物放置在辐射加热器下以保持37.5℃的温度。将导管(PolyethyleneTM Tubing PE90)插入颈动脉以便用与多通道记录器(TA240 Gould)相连的压力传感器(StathamTM)连续记录动脉血压。将导管(PolyethyleneTM Tubing PE90)插入右侧颈静脉以便药物施用。外科准备后，在实验方案开始前允许有30分钟的稳定期。在这一时间段内，评估血压的稳定性。通过静脉内推注经由颈静脉注射肽。注射10、20、40和100μg/kg的剂量。每个剂量的注射之间允许15分钟的时间段。
剂量溶液的制备：在盐水溶液中以100μg/ml的浓度每天新鲜配制肽，SEQ ID NO：2(天然ANP，图中的#2)和SEQ ID NO：33的双功能激素(图中的#33)。颈静脉中注射前在无菌盐水中进行肽的适当的稀释以产生10-100μg/kg的剂量。对于30μg/kg/h的肽的输注剂量，在0.1％的人血清白蛋白(HSA)中进行贮备溶液(100μg/ml)的稀释并经由植入式导管(PE-90)在颈静脉中以1ml/h的速率输注直到实验完成。
结果：如图1A中所示，天然ANP(SEQ ID NO：2)甚至在1μg/kg的静脉内推注剂量下产生MAP的下降，然而双功能激素(SEQ ID NO：33)在多达20μg/kg的剂量下是耐受的。因此，双功能激素(SEQ ID NO：33)在比天然ANP高的剂量下是耐受的。为了研究输注方案的影响，通过静脉内输注施用单一剂量(30μg/kg/h)的肽。如图1B所示，天然ANP肽(SEQID NO：2)迅速降低MAP而以同样剂量连续输注的双功能激素(SEQ ID NO：33)被很好的耐受。
实施例4：SD大鼠中双功能激素对高血压的影响
BNP(Natrecor)已经由FDA批准用于在高血压危象中降低血压。其天然同源物ANP也显示出迅速降低血压并且在高血压危象中被用作治疗剂。肾素-血管紧张素系统的激活涉及包括高血压的几种医学适应症。因此，使用了其中用连续输注血管紧张素II升高血压的大鼠模型，并且在SD大鼠中的静脉内推注肽后检测了天然ANP(图中的肽#2)和SEQ ID NO：33的双功能激素(图中的肽#33)的降低血压的效力/功效。
动物：从Charles River Inc.获得Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，300g至330g重)。在12∶12光照∶黑暗循环下以标准的实验室食物喂养动物。
外科准备：将大鼠在实验过程中用异氟烷2.5％麻醉。将动物放置在辐射加热器下以保持37.5℃的温度。将导管(PolyethyleneTM Tubing PE90)插入颈动脉以便用与多通道记录器(TA240 Gould)相连的压力传感器(Statham)连续记录动脉血压。将导管(PolyethyleneTM Tubing PE90)插入右侧颈静脉以便药物施用。同样，也将导管(Blood Collection Set25G3/4x 12″，Becton Dickinson)插入尾静脉以便经由灌注泵(HarvardApparatus)连续输注血管紧张素II。外科准备后，在实验方案开始前允许有30分钟的稳定期。在这一时间段内，评估血压的稳定性。通过经由尾静脉的血管紧张素II的静脉内输注(5ug/kg/h)诱导高血压。血管紧张素II输注30分钟后使得血压稳定，通过静脉内推注经由颈静脉注射肽。注射100、200、300、400和500ug/kg的剂量。每个剂量的注射之间有15分钟的时间段。
剂量溶液的制备：在盐水中以100μg/ml的浓度每天新鲜配制血管紧张素II。对于5μg/kg/h的输注，将30μl血管紧张素II(100μg/ml)放入2ml盐水中输注2h(1ml/h)。同样在盐水溶液中以1000μg/ml的浓度每天新鲜配制肽(#2和#33)。在无菌盐水中进行贮备溶液的适当的稀释以产生0.2ml的注射体积中100-500μg/kg的剂量。
结果：如图2中所示，血管紧张素II的输注迅速将基础血压(Bas)升高了约10-15％(血管紧张素)。天然ANP(#2)的推注在100μg/kg的剂量下使血压迅速正常化并在较高的剂量(即200-500μg/kg)产生低血压。多达300μg/kg剂量的双功能激素(#33)没有诱导低血压，然而在400μg/kg及以上的剂量，双功能激素具有与ANP相似的作用。
实施例5：使用双功能激素的预防性治疗对肾缺血之后的急性肾功能障碍的作用
肾缺血后的急性肾损伤(在动物模型中通过夹紧一条或两条肾动脉30-60分钟而重现)引起以下的组合：导致降低的血流量的肾血管缩窄、包括尿液中肾小管标志物的上升的上皮损伤以及细胞因子例如IL-1的分泌和嗜中性粒细胞和单核细胞向损伤位点的浸润之后的细胞凋亡和炎症。
动物：从Charles River Inc.获得Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，300g至330g重)。在12∶12光照∶黑暗循环下以标准的实验室食物喂养动物。
外科准备：将大鼠在实验过程中用异氟烷2.5％麻醉。将动物放置在辐射加热器下以保持37.5℃的温度。在肾动脉夹紧前经由尾静脉动脉收集血液样品(0.5ml)。一旦动物被麻醉，将其放置在仰卧的位置，在腹壁的右侧做一个1.5cm的侧切口。之后暴露右侧肾脏并将输尿管、肾动脉和肾静脉小心解剖并结扎。切掉肾蒂后将肾脏除去。在腹壁的左侧做同样的切口。暴露左侧肾脏并小心解剖肾血管蒂。之后通过放置血管夹(MicroSerrefineTM，Fine Science Tools)将肾血管蒂堵塞30或45分钟的时间段。这一肾血管蒂夹紧产生急性肾动脉闭塞(RAO)。检查肾脏的缺血以及在移开血管夹2分钟后良好的再灌注。将腹壁的伤口分两层闭合。肌肉层用连续的3-0丝线缝合而皮肤用缝合夹(Fine Science Tools)闭合。右侧肾切除和左侧肾动脉夹紧程序后21小时，将大鼠放在代谢笼中3小时以便尿液收集(在预称重的50ml管中)。尿液体积通过称重含有尿液的管来测量。之后将动物用异氟烷2.5％麻醉。除去左侧肾并保存在福尔马林中以便将来的组织学研究。通过心脏穿刺将血液收集在肝素化注射器(3ml)中并立即转移至适当标记的含有作为抗凝血剂的肝素的管中。收集之后，所有血液样品被保存在冰上并以13000rpm离心2分钟。血浆和尿液等份(400μl)被移走并于-80℃贮存。
剂量溶液的制备：在0.1％HSA的盐水溶液(30％的溶于9.967μl盐水中的HSA，33μl)中以100μg/100μl的浓度同样每天新鲜配制肽(#2和#33)。对于15μg/kg/h的输注：将9μl的肽(100μg/100μl)放入2ml的0.1％HSA盐水中输注2h(1ml/h)。
结果：如图3中所示，在盐水处理组中血浆肌酸酐和尿素水平以时间依赖性方式升高。在每个时间点两种肽都显著降低肌酸酐和血尿素氮(BUN)的血液浓度上的升高。因此，对于减少肾损伤来说，当预防性使用时，双功能激素(#33)和天然ANP(#2)同样有效。
实施例6：使用双功能激素的损伤后治疗对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用
为了证实是否损伤后肽的短期输注(治疗性处理)将对降低肾损伤有利，肾动脉夹移走后将肽#2或#33以15μg/kg/h输注2h。在不同的时间测定血浆肌酸酐和尿素。如上文实施例5中所描述的制备动物模型和剂量溶液。
结果：如图4所示，血浆肌酸酐和BUN水平在盐水处理组中以时间依赖性方式上升。两种肽都在4h阻止了肌酸酐和BUN的上升，但是在较晚的时间点(即21h和27h)双功能激素(#33)在降低肾缺血后的肌酸酐和BUN水平上比天然ANP(#2)更有效。
实施例7：双功能激素的长期输注对肾缺血后的急性肾功能障碍的作用
为了检测双功能激素的长期输注对肾损伤肾功能的作用，肾动脉夹移走后将肽#2或#33以1.5μg/kg/h或15μg/kg/h输注24h。在损伤后24h测定血浆肌酸酐和尿素氮。实验程序(动物模型、剂量溶液)与上文实施例5中所描述的相同。
结果：24小时的输注后，与盐水处理的动物相比天然ANP(#2)和双功能激素(#33)都显著降低了血浆肌酸酐和BUN(图5)。使用两种肽都有在肾缺血的血液标志物上剂量依赖性的降低。如通过更显著的肌酸酐和BUN水平降低所证实的，双功能激素#33在改善肾损伤的结果上比天然ANP更有效(图5)。
实施例8：使用双功能激素的治疗对肾缺血后的炎性和急性肾损伤标志物的作用
肾缺血引发炎性标志物例如IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CD11b(嗜中性粒细胞标志物；组织的嗜中性粒细胞浸润的证据)以及肾小管上皮标志物例如KIM-1、NGAL和NAG的表达增加。对这些标志物相当有兴趣因为这些标志物在血清肌酸酐水平的可观察的升高之前表达。因此，以这些标志物为基础的急性肾损伤的诊断允许更早的治疗患者，这可在透析需要和死亡率方面产生更好的效果。使用实施例5中描述的动物模型评估双功能激素#33对炎性和肾小管损伤标志物的表达的作用。
剂量溶液的制备：使用AlzetTM微型泵将肽#33以15μg/Kg/h的输注速率输注24h。
蛋白质印迹：将新鲜肾脏迅速解剖并用组织匀浆器在冰冷溶解缓冲液中匀浆，所述溶解缓冲液为含有20mM Tris、135mM NaCl、1％NP-40TM、0.1％SDS、10％甘油的Complete-Mini Protease Inhibitor CocktailTM(完全-迷你型蛋白酶抑制剂鸡尾酒TM)(Roche)。在冰上孵育15分钟后，将样品以13,000rpm于4℃离心5分钟并收集含有溶解的蛋白提取物的上清液。将蛋白样品(40ug蛋白)在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上解析并转移至PVDF膜(Amersham，Pharmacia)。通过将膜在溶于TBST(10mM Tris、150mM NaCl、0.2％Tween-20)的5％的脱脂奶的溶液中于室温孵育1h来消除非特异性结合。之后用下列第一抗体中的任一种将膜于4℃孵育过夜：抗KIM-1(1∶400；RD Systems)、抗IL-1β(1∶500；Calbiochem)、抗NGAL(1∶500；Santa-Cruz Biotech)、抗CD11b/c(1∶400；Abcam)或单克隆的抗β-肌动蛋白(0.5Ag/ml Sigma)。随后将膜在TBST中清洗并用轭合过氧化物酶的第二抗体(0.5μg/ml，Amersham Pharmacia，Baied’Urfé，QC)于室温孵育1小时。将印迹用化学发光试剂(ECLTM，AmershamPharmacia)处理并曝光在X-OMATTM(Kodak)成像胶片上。
结果：如图6所示，肾夹紧30分钟引发CD11 b/c、KIM-1和IL-1β的强表达(损伤)。双功能激素(#33)的连续输注降低了标志物的表达，因此显示出其在降低缺血后的肾损伤和炎症中的功效。
尽管已在上文通过其具体的实施方案描述了本发明，但不背离如所附的权利要求中所定义的本发明的精神和本质时，它可被修改。
序列表
<110>瑟瑞技术公司
     克里希纳·佩里
     阿卜德尔卡里姆·哈比
 
<120>双功能激素和其用途
 
<130>780/11718.225
 
<150>US 60/948,292
<151>2007-07-06
 
<160>72
 
<170>PatentIn 3.5版本
 
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<400>1
 
Ser Tyr Ser Met Glu His  Phe Arg Trp Gly Lys  Pro Val
1               5                    10
 
<210>2
<211>28
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(23)
 
<400>2
 
Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys  Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly
1               5                    10                  15
Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25
 
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>二硫化
<222>(11)..(27)
 
<400>3
 
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>4
<211>32
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>二硫化
<222>(10)..(26)
 
<400>4
 
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly Arg Lys Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
            20                  25                  30
 
<210>5
<211>22
<212>PRT
<213>人类
 
<220>
<221>二硫化
<222>(6)..(22)
 
<400>5
 
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
            20
 
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<400>6
 
His Xaa Arg Trp
1
 
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<400>7
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met
1               5
 
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<400>8
 
His Xaa Arg Trp
1
 
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<400>9
 
His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>位置4的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<400>10
 
Met Glu His Xaa Arg Trp Gly
1               5
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<400>11
 
Met Glu His Phe Arg Trp Gly
1               5
 
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<400>12
 
His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Xaa
1               5
 
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<400>13
 
His Phe Arg Trp Gly
1               5
 
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<400>14
 
Glu His Phe Arg Trp Gly
1               5
 
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<400>15
 
Glu His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>位置8的Xaa是蛋氨酸、缬氨酸或正亮氨酸
<400>16
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa
1               5
 
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa是L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸
 
<400>17
 
Glu His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸
 
<400>18
 
His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa是L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸
 
<400>19
 
Glu His Xaa Arg Trp
1               5
 
<210>20
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸
 
<400>20
 
His Xaa Arg Trp
1
<210>21
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于α-MSH的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸
 
<400>21
 
His Xaa Arg Trp
1
 
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(2)..(13)
 
<400>22
 
Met Cys His Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Ser Cys Tyr Arg
1               5                   10                  15
 
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>Nle
<220>
<221>二硫化
<222>(2)..(13)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<400>23
 
Xaa Cys His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Ser Cys Tyr Arg
1               5                   10                  15
 
<210>24
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(1)..(17)
 
<400>24
 
Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20
 
<210>25
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(1)..(17)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>Nle
<400>25
 
Cys Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20
 
<210>26
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(5)..(21)
 
<400>26
 
Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp ArgIle Gly Ala Gln
1               5                   10                 15
Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25
 
<210>27
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(10)..(26)
 
<400>27
 
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly Arg Lys Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
            20                  25                  30
 
<210>28
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来源于利尿钠肽的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(25)
 
<400>28
 
Pro Lys Pro Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly Arg Lys Met Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
            20                  25                  30
 
<210>29
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的谷氨酸残基与位置13的赖氨酸残基形成内酰胺桥
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>位置13的赖氨酸残基与位置2的谷氨酸残基形成内酰胺桥
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>位置17的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(19)..(19)
<223>酰胺化
 
<400>29
 
Xaa Glu His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Ser Lys Tyr Arg His
1               5                   10                  15
Xaa Arg Trp
 
<210>30
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(20)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(22)..(22)
<223>酰胺化
 
<400>30
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Glu His Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Ser Lys Tyr Arg
            20
 
<210>31
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(20)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(22)..(22)
<223>酰胺化
 
<400>31
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys His Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Ser Cys Tyr Arg
            20
 
<210>32
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>Nle
 
<220>
<221>二硫化
<222>(2)..(13)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<400>32
Xaa Cys His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Ser Cys Tyr Arg His
1               5                   10                  15
Phe Arg Trp
 
<210>33
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(25)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
<400>33
 
His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>34
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可是任何天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(20)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(15)..(15)
<223>Nle
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(22)..(22)
<223>酰胺化
 
<400>34
 
His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Ser Cys Tyr Arg
            20
 
<210>35
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(25)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(14)..(14)
<223>Nle
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>35
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>36
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>二硫化
<222>(12)..(28)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(33)..(33)
<223>酰胺化
 
<400>36
 
Met Glu His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg
1               5                   10                  15
Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg
            20                  25                  30
Tyr
<210>37
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>位置4的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(12)..(28)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(33)..(33)
<223>酰胺化
 
<400>37
 
Met Glu His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg
1               5                   10                  15
Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg
            20                  25                  30
Tyr
 
<210>38
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>二硫化
<222>(10)..(26)
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>酰胺化
 
<400>38
 
His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>39
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(10)..(26)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(31)..(31)
<223>酰胺化
 
<400>39
 
His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>40
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(23)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>位置30的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>酰胺化
 
<400>40
 
Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr His Xaa Arg Trp
            20                  25                  30
 
<210>41
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>二硫化
<222>(11)..(27)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>酰胺化
 
<400>41
 
Glu His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>42
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(11)..(27)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(32)..(32)
<223>酰胺化
 
<400>42
 
Glu His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>43
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
<220>
<221>二硫化
<222>(8)..(24)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(29)..(29)
<223>酰胺化
 
<400>43
 
His Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25
 
<210>44
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(22)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(27)..(27)
<223>酰胺化
 
<400>44
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Gly Ala
1               5                   10                  15
Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25
<210>45
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(14)..(30)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(36)..(36)
<223>酰胺化
 
<400>45
 
His Xaa Arg Trp Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly
1               5                   10                  15
Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val
            20                  25                  30
Leu Arg Arg His
        35
 
<210>46
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的双功能激素
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>乙酰化
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa＝D-苯丙氨酸
 
<220>
<221>二硫化
<222>(14)..(30)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(36)..(36)
<223>酰胺化
 
<400>46
 
His Xaa Arg Trp Gly Pro Lys Pro Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly
1               5                   10                  15
Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val
            20                  25                  30
Leu Arg Arg His
        35
 
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>位置1的Xaa是Met或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是Glu或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>位置4的Xaa是L-Phe或D-Phe
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>位置7的Xaa是Gly或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>位置8的Xaa是Lys或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>位置9的Xaa是Pro或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>位置10的Xaa是Met、Val、Nle或不存在
 
<400>47
 
Xaa Xaa His Xaa Arg Trp Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
 
<210>48
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_ FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是L-Phe或D-Phe
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>位置8的Xaa是Met、Val或Nle
 
<400>48
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa
1               5
 
<210>49
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是L-Phe或D-Phe
 
<400>49
 
His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>50
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa是L-Phe或D-Phe
 
<400>50
 
Glu His Xaa Arg Trp Gly
1                   5
 
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<400>51
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Val
1               5
 
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<400>52
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys  Pro Met
1               5
 
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<400>53
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa
1               5
 
<210>54
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<400>54
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro
1               5
 
<210>55
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<400>55
 
His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>56
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<400>56
 
Glu His Phe Arg Trp
1               5
 
<210>57
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa是D-Phe
 
<400>57
 
Glu His Xaa Arg Trp Gly
1               5
 
<210>58
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(6)
<223>位置1至6的Xaa对应于：Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser；
     其中位置1和2的Xaa不存在的Arg-Arg-Ser-Ser；其中位置1至5的Xaa不存在的
     Met；
     或者其中位置1至5的Xaa不存在的Nle
 
<220>
<221>MISC_ FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>位置8的Xaa是His或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>位置13的Xaa是Met或Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(29)
<223>位置17至29的Xaa对应于：其中位置21至29的Xaa不存在的Ser-Cys-Tyr-Arg；或
者
     Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(18)
<223>当位置17至29的Xaa对应于：Ser-Cys-Tyr-Arg并且位置21至29的Xaa不存在
时，位置7的Cys和位置18的Cys经由二硫桥连接
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(24)
<223>当位置17至29的Xaa对应于：Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-
Phe-Arg-Tyr时，位置7的Cys和位置24的Cys经由二硫桥连接
 
<400>58
 
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25
 
<210>59
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(23)
 
<400>59
 
Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25
 
<210>60
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(2)..(18)
 
<400>60
 
Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu
1               5                   10                  15
Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20
 
<210>61
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(20)
 
<400>61
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys His  Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                   15
Arg Ile Ser Cys Tyr Arg
            20
 
<210>62
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(25)
 
<400>62
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>63
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(20)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(15)..(15)
<223>Nle
 
<400>63
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Ser Cys Tyr Arg
            20
 
<210>64
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<220>
<221>二硫化
<222>(9)..(25)
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(14)..(14)
<223>Nle
 
<400>64
 
His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>65
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(12)..(28)
 
<400>65
 
Met Glu His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg
1               5                   10                  15
Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg
            20                  25                  30
Tyr
 
<210>66
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(10)..(26)
 
<400>66
 
His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>67
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>二硫化
<222>(10)..(26)
 
<400>67
 
His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>68
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(23)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>位置30的Xaa是D-Phe
 
<400>68
 
Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr His Xaa Arg Trp
            20                  25                  30
 
<210>69
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>位置3的Xaa是D-Phe
 
<220>
<221>二硫化
<222>(11)..(27)
 
<400>69
 
Glu His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
            20                  25                  30
 
<210>70
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(13)
<223>位置2的Glu残基和位置13的Lys残基通过内酰胺桥连接
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>Nle
 
<400>70
 
Xaa Glu His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Ser Lys Tyr Arg
1               5                   10                  15
 
<210>71
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(6)
<223>位置1至6的Xaa对应于：Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser；
     其中位置1和2的Xaa不存在的Arg-Arg-Ser-Ser；其中位置1至5的Xaa不存在的
Met；
     或者其中位置1至5的Xaa不存在的Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>位置7的Xaa是Asp或Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(18)
<223>位置7的Asp或Glu残基和位置18的Lys残基通过内酰胺桥连接
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>位置8的Xaa是His或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>位置13的Xaa是Met或Nle
 
<400>71
 
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Ser Lys Tyr Arg
            20
 
<210>72
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(6)
<223>位置1至6的Xaa对应于：Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser；
     其中位置1和2的Xaa不存在的Arg-Arg-Ser-Ser；其中位置1至5的Xaa不存在的
Met；或者其中位置1至5的Xaa不存在的Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>位置7的Xaa是Asp、Glu或Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(18)
<223>当位置7的Xaa是Asp或Glu并且位置18的Xaa是Lys时，位置7的Asp或Glu残基
和位置18的Lys残基通过内酰胺桥连接
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>位置8的Xaa是His或不存在
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>位置13的Xaa是Met或Nle
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(29)
<223>位置17至29的Xaa对应于：其中位置21至29的Xaa不存在的Ser-Cys-Tyr-Arg或
Ser-Lys-Tyr-Arg；或者Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(18)
<223>当位置17至29的Xaa对应于：Ser-Cys-Tyr-Arg并且位置21至29的Xaa不存在时，
位置7的Cys和位置18的Cys经由二硫桥连接
 
<220>
<221>二硫化
<222>(7)..(24)
<223>当位置17至29的Xaa对应于：Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-
Phe-Arg-Tyr时，位置7的Cys和位置24的Cys经由二硫桥连接
 
<400>72
 
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25

Claims (42)

1.一种双功能激素，其包括：
(a)第一结构域，其包含α-MSH肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有α-MSH相关的激素活性；和
(b)与所述第一结构域共价连接的第二结构域，所述第二结构域包含利尿钠肽或其片段、变体或片段的变体，所述片段、变体或片段的变体具有利尿钠肽相关的激素活性。
2.根据权利要求1所述的双功能激素，其中当所述第一结构域是SEQID NO：1的α-MSH肽时，所述第二结构域是具有利尿钠肽相关的激素活性的所述片段、变体或片段的变体，而如果所述第二结构域是SEQ ID NO：2、3、4或5的利尿钠肽，所述第一结构域是具有α-MSH相关的激素活性的所述片段、变体或片段的变体。
3.根据权利要求1所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含SEQID NO：1的肽的至少4个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75％同源性的所述片段的变体。
4.根据权利要求1所述的双功能激素，其中α-MSH肽的所述变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少75％同源性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含式I(SEQ ID NO：47)的氨基酸序列：
X2-H-X1-R-W-X3    (I)
其中：
X1是L-Phe或D-Phe；
X2是E、M-E或者不存在；
X3是G-K-P-X4、G-K-P、G-K、G或者不存在；
X4是M、V或Nle。
6.根据权利要求3所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含：
(i)H-X1-R-W-G-K-P-X4(SEQ ID NO：48)；
(ii)M-E-H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：17)；
(iii)H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：49)；
(iv)E-H-X1-R-W-G(SEQ ID NO：50)；或者
(v)H-X1-R-W(SEQ ID NO：20)；或者
其中X1是L-Phe或D-Phe，并且X4是M、V或Nle。
7.根据权利要求4所述的双功能激素，其中所述第一结构域包含：
(i)H-f-R-W-G-K-P-V(SEQ ID NO：51)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M(SEQ ID NO：52)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle(SEQ ID NO：53)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P(SEQ ID NO：54)；
(v)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO：11)；
(vi)H-f-R-W-G  (SEQ ID NO：55)；
(vii)E-H-F-R-W(SEQ ID NO：56)；
(ix)E-H-f-R-W-G(SEQ ID NO：57)；或
(iv)H-f-R-W(SEQ ID NO：6)；
其中f是D-苯丙氨酸。
8.根据权利要求5所述的双功能激素，其中所述第一结构域由下列组成：
(i)H-f-R-W-G-K-P-V(SEQ ID NO：51)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M(SEQID NO：52)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle(SEQ ID NO：53)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P(SEQ ID NO：54)；
(v)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO：11)；
(vi)H-f-R-W-G(SEQ ID NO：55)；
(vii)E-H-F-R-W(SEQ ID NO：56)；
(ix)E-H-f-R-W-G(SEQ ID NO：57)；或
(iv)H-f-R-W(SEQ ID NO：6)；
其中f是D-苯丙氨酸。
9.根据权利要求1至8中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第二结构域包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的至少15个氨基酸的片段，或与所述片段具有至少75％同源性的所述片段的变体。
10.根据权利要求1至8中的任何一项所述的双功能激素，其中所述利尿钠肽的变体包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少75％的同源性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至10中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第二结构域包含式II(SEQ ID NO：58)的氨基酸序列：
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9    (II)
其中：
X5是M、Nle、R-R-S-S、S-L-R-R-S-S或者不存在；
X6是C；
X7是H或者不存在；
X8是M或Nle；
X9是S-C-Y-R或G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y；其中
X6的C残基与X9的C残基形成二硫桥；并且
当X5是Nle时，所述第一结构域在所述第二结构域的N端。
12.根据权利要求11所述的双功能激素，其中所述第二结构域包含：
(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：22)；
(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：23)；
(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：24)；
(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置5和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：26)；
(vi)
S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：59)；或者
(vi i)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2和18的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：60)。
13.根据权利要求12所述的双功能激素，其中所述第二结构域由下列组成：
(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：22)；
(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：23)；
(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：24)；
(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1和17的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置5和21的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：26)；
(vii)
S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置7和23的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：59)；或者
(viii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2和18的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：60)。
14.根据权利要求1至13中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第一结构域在所述第二结构域的N端。
15.根据权利要求1至14中的任何一项所述的双功能激素，其中所述双功能激素的氨基末端残基被C2-C16酰基基团酰基化。
16.根据权利要求15所述的双功能激素，其中所述双功能激素的氨基末端残基被乙酰化。
17.根据权利要求1至16中的任何一项所述的双功能激素，其中所述双功能激素的羧基末端残基被酰胺化。
18.根据权利要求1至17中的任何一项所述的双功能激素，其中所述第一结构域和第二结构域通过肽键共价连接。
19.根据权利要求1至18中的任何一项所述的双功能激素，其中所述双功能激素包含：
(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：61)；
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：62)；
(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：63)；
(iv)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：64)；
(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：65)；
(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：66)；
(vii)H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：67)；或者
(viii)E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：69)；其中f是D-苯丙氨酸。
20.根据权利要求19所述的双功能激素，其中所述双功能激素由下列组成：
(i)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：31)；
(ii)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：33)；
(iii)c-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9和20的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：34)；
(iv)Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置9和25的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：35)；
(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置12和28的C残基形成二硫桥(SEQ IDNO：36)；
(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：38)；
(vii)Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置10和26的C残基形成二硫桥(SEQ ID NO：39)；或者
(viii)Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2，其中位于位置11和27的C残基形成二硫桥(SEQ IDNO：42)；
其中
Ac代表氨基末端乙酰化；
NH2代表羧基末端酰胺化；并且
f是D-苯丙氨酸。
21.一种组合物，其含有根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素和药学上可接受的载体。
22.根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，其用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症。
23.根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，其用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压。
24.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物组合物，其含有根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素和药学上可接受的载体。
25.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物组合物，其含有根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素和药学上可接受的载体。
26.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的方法，其包括向所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种：(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述肾病症是急性肾损伤。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述手术后肾损伤或功能障碍是由瓣膜修复的心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。
30.根据权利要求26至29中的任何一项所述的方法，其中所述施用经由静脉内输注。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述静脉内输注是以约1ng/kg/min至约10μg/kg/min的速率。
32.一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的方法，其包括向所述受治疗者施用有效量的下列物质中的至少一种：(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物。
33.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的药物的制备中的用途。
34.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗肾病症的用途。
35.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物中的至少一种用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的用途。
36.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物中的至少一种在用于在受治疗者中预防和/或治疗高血压的药物的制备中的用途。
37.根据权利要求33或34所述的用途，其中所述肾病症是急性肾损伤。
38.根据权利要求33或34所述的用途，其中所述肾病症是手术后肾损伤或功能障碍。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述手术后肾损伤或功能障碍是由瓣膜修复的心肺旁路手术、主动脉瘤、器官移植、开心手术或冠状动脉移植所引起的。
40.根据权利要求33至39中的任何一项所述的用途，其中所述双功能激素或组合物适合于通过静脉内输注施用。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述双功能激素或组合物适合于通过静脉内输注以约1ng/kg/min至约10μg/kg/min的速率施用。
42.(a)根据权利要求1至20中的任何一项所述的双功能激素，或者(b)根据权利要求21所述的组合物中的至少一种在药物的制备中的用途。
CN2008800229244A 2007-07-06 2008-07-04 α-促黑激素（α-MSH）和心房利尿钠蛋白（ANP）的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损伤中的用途 Pending CN102066421A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94829207P 2007-07-06 2007-07-06
US60/948,292 2007-07-06
PCT/CA2008/001250 WO2009006732A1 (en) 2007-07-06 2008-07-04 Bifunctional fusion proteins of the alpha-melanocyte stimulating hormone (alpha-msh) and atrial natriuretic protein (anp) and uses in hypertension and acute kidney injury

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102066421A true CN102066421A (zh) 2011-05-18

Family

ID=40221938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008800229244A Pending CN102066421A (zh) 2007-07-06 2008-07-04 α-促黑激素（α-MSH）和心房利尿钠蛋白（ANP）的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损伤中的用途

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8822413B2 (zh)
EP (1) EP2173773A4 (zh)
JP (1) JP2010532323A (zh)
KR (1) KR20100029195A (zh)
CN (1) CN102066421A (zh)
AP (1) AP2009005091A0 (zh)
AU (1) AU2008274845A1 (zh)
BR (1) BRPI0812947A2 (zh)
CA (1) CA2691898A1 (zh)
IL (1) IL202610A0 (zh)
MX (1) MX2009013372A (zh)
RU (1) RU2010103995A (zh)
WO (1) WO2009006732A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017101089A1 (zh) * 2015-12-18 2017-06-22 兰州大学 一种α促黑素细胞激素的融合蛋白及其制备方法和应用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3404102T3 (pl) 2004-04-21 2021-12-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Koniugaty do dostarczania do kości i sposób ich wykorzystania do nakierowywania białek na kość
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2012115772A2 (en) 2011-02-25 2012-08-30 Medtronic, Inc. Therapy for kidney disease and/or heart failure
EP2750697A4 (en) 2011-09-02 2015-03-25 Medtronic Inc CHIMERIC NATRIURETIC PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
US20150327525A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Charles J. Noack, JR. Valley Hook
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
RU2708068C2 (ru) 2014-12-05 2019-12-04 Алексион Фармасьютикалз, Инк. Лечение судорог с использованием рекомбинантной щелочной фосфатазы
JP6868561B2 (ja) 2015-01-28 2021-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼ欠損を有する被験者を治療する方法
CN108350440A (zh) 2015-08-17 2018-07-31 阿雷克森制药公司 碱性磷酸酯的制造
EP3355904A4 (en) 2015-09-28 2019-06-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA
WO2017074466A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
US11065306B2 (en) 2016-03-08 2021-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
US10898549B2 (en) 2016-04-01 2021-01-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
EP3436052A4 (en) 2016-04-01 2019-10-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF MUSCLE WEAKNESS USING ALKALINE PHOSPHATASES
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
JP7018933B2 (ja) 2016-08-18 2022-02-14 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 気管気管支軟化症の治療方法
US11224637B2 (en) 2017-03-31 2022-01-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
CN107828819B (zh) * 2017-10-30 2020-11-03 武汉生物工程学院 一种利用ANP或IgANP基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
CN112062857A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Eta抗体与bnp的融合蛋白质，及其药物组合物和应用
BR112021024938A2 (pt) 2019-06-12 2022-01-25 Novartis Ag Anticorpos de receptor 1 de peptídeo natriurético e métodos de uso
WO2022159382A1 (en) * 2021-01-19 2022-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reactivation of mtor in acute kidney injury (aki)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK380288D0 (da) * 1988-07-07 1988-07-07 Novo Industri As Hidtil ukendet peptider
JP2006514607A (ja) * 2002-07-31 2006-05-11 コンジュケム，インコーポレーテッド 長時間持続性ナトリウム排泄増加性ペプチド誘導体
US20040142893A1 (en) * 2002-10-21 2004-07-22 Uichi Ikeda Methods for treating and preventing vascular disease
WO2005077072A2 (en) 2004-02-11 2005-08-25 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
JP5638177B2 (ja) 2004-02-11 2014-12-10 アミリン・ファーマシューティカルズ, リミテッド・ライアビリティ・カンパニーAmylin Pharmaceuticals, Llc 膵臓ポリペプチドファミリーモチーフおよびそのモチーフを含むポリペプチド
KR101272402B1 (ko) 2004-12-13 2013-06-10 아스트라제네카 파마수티컬스 엘피 췌장 폴리펩티드 족 모티프, 폴리펩티드 및 이를 포함하는방법
WO2007022123A2 (en) 2005-08-11 2007-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
JP5399244B2 (ja) 2006-08-17 2014-01-29 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 選択可能な特性を持つｄｐｐ−ｉｖ耐性ｇｉｐハイブリッドポリペプチド

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017101089A1 (zh) * 2015-12-18 2017-06-22 兰州大学 一种α促黑素细胞激素的融合蛋白及其制备方法和应用
US11459369B2 (en) 2015-12-18 2022-10-04 Lanzhou University Fusion protein for alpha-melanocyte stimulating hormone and preparation method and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX2009013372A (es) 2010-02-22
CA2691898A1 (en) 2009-01-15
US8822413B2 (en) 2014-09-02
US20090011997A1 (en) 2009-01-08
AU2008274845A1 (en) 2009-01-15
WO2009006732A9 (en) 2009-03-05
BRPI0812947A2 (pt) 2014-12-23
IL202610A0 (en) 2011-08-01
RU2010103995A (ru) 2011-08-20
KR20100029195A (ko) 2010-03-16
AP2009005091A0 (en) 2009-12-31
WO2009006732A1 (en) 2009-01-15
EP2173773A4 (en) 2010-07-07
JP2010532323A (ja) 2010-10-07
EP2173773A1 (en) 2010-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102066421A (zh) α-促黑激素（α-MSH）和心房利尿钠蛋白（ANP）的双功能融合蛋白以及在高血压和急性肾损伤中的用途
Pöschl et al. Two non‐contiguous regions contribute to nidogen binding to a single EGF‐like motif of the laminin gamma 1 chain.
JP5964767B2 (ja) インスリン過敏症を治療するためのメラノコルチン類の使用
WO1994020534A1 (en) Vasonatrin peptide and analogs thereof
CN103665170A (zh) 肽治疗剂轭合物及其应用
TW201811821A (zh) 用於治療糖尿病及慢性腎臟病之新穎脂肪酸修飾之尿皮質素－2類似物
JP2009538120A (ja) 四量体化ポリペプチドおよび使用方法
JP5165537B2 (ja) ニューロメジンｂおよびソマトスタチンレセプターアゴニスト
JP2020521784A (ja) 長時間作用性ｇｉｐペプチド類似体
JP2021515759A (ja) コンプスタチン類似体及びその医療用途
Kuipers et al. Intranasal delivery of a methyllanthionine-stabilized galanin receptor-2-selective agonist reduces acute food intake
US8722623B2 (en) Compositions and methods utilizing fibrin beta chain fragments
AU712327B2 (en) Two non-contiguous regions contribute to nidogen binding to a single EGF-like motif of the laminin gamma1 chain
Reissmann et al. Highly selective bradykinin agonists and antagonists with replacement of proline residues by N-methyl-D-and L-phenylalanine
CA2610496A1 (en) Synthetic peptide inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
Oliveira Jr et al. Biological and conformational evaluation of angiotensin II lactam bridge containing analogues
Farquhar et al. Novel mastoparan analogs induce differential secretion from mast cells
CN116209671A (zh) 补体因子c3的抑制剂及其医学用途
AU2013316700B2 (en) Peptide antagonists of the vasopressin-2 receptor
Seyfarth et al. New cyclic bradykinin antagonists containing disulfide and lactam bridges at the N‐terminal sequence
EP1025127A1 (en) Msh-receptor subtype selective cyclic peptides
Labudda et al. New bradykinin analogues substituted in positions 7 and 8 with sterically restricted 1‐aminocyclopentane‐1‐carboxylic acid
HUT73187A (en) Trifunctional antithrombin and antiplatelet peptides
Kwiatkowska et al. Design, Synthesis and Structure–Activity Relationship of New Arginine Vasopressin Analogues Containing Proline Derivatives in Position 2
Uzubalis A study of the metabolism, pharmacological properties and disposition of substance P/Renate Ingrid Uzubalis.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110518