KR20100029195A - 알파-멜라노사이트 촉진 호르몬(알파-ｍｓｈ)와 동맥 나트륨이뇨 단백질(ａｎｐ)의 이기능성 융합 호르몬 및 고혈압과 급성신손상에 이의 용도 - Google Patents

알파-멜라노사이트 촉진 호르몬(알파-ｍｓｈ)와 동맥 나트륨이뇨 단백질(ａｎｐ)의 이기능성 융합 호르몬 및 고혈압과 급성신손상에 이의 용도 Download PDF

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Abstract

알파-MSH활성 및 나트륨이뇨 펩티드 활성을 가지는 이기능성 호르몬을 제공한다. 이기능성 호르몬은 알파-MSH 펩티드 또는 단편, 변이체, 또는 단편의 변이체를 포함하는 제 1 도메인과 나트륨이뇨 펩티드 연관된 호르몬 활성을 가지는 제 2 도메인을 포함하고, 이때 제 1 도메인은 제 2 도메인에 공유결합으로 연결된다. 본 발명의 이기능성 호르몬은 급성신부전증 (ARF) 또는 급성신손상 (AKI)과 같은 신장 관련 질환 또는 상태의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

Description

알파-멜라노사이트 촉진 호르몬(알파-ＭＳＨ)와 동맥 나트륨이뇨 단백질(ＡＮＰ)의 이기능성 융합 호르몬 및 고혈압과 급성신손상에 이의 용도{BIFUNATIONAL FUSION PROTEINS OF THE ALPHA-MELANOCYTE STIMULATING HORMONE(ALPHA-MSH) AND ATRIAL NATRIURETIC PROTEIN(ANP) AND USES IN HYPERSTENSION AND ACUTE KIDNEY INJURY}
본 출원은 U.S.C. §119(e)의 35조하에 2007년 7월 6일자 출원된 미국 가특허출원 No. 60/948,292의 우선권을 청구하며, 이는 전문을 참고문헌으로 본 출원에 첨부한다.
기술분야
본 출원은 일반적으로 호르몬 활성을 보이는 신규한 화합물 및 이의 용도, 특히 이기능성 호르몬 활성을 보이는 신규한 화합물 및 급성신부전증 (ARF) 또는 급성신손상 (AKI)과 같은 신장 관련 질환 또는 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 용도에 관계한다.
급성신부전증 (ARF)은 몇시간 내지 수일에 걸쳐 소변 방출의 감소로 나타나는 신장 기능의 갑작스런 쇠퇴를 말한다. 질소 폐기물의 축적은 전해질 및 유동 항상성(fluid homoeostasis)에 두드러진 변화를 결과한다. 급성신부전증은 허혈 손상 또는 직접적인 신독성(nephrotoxicity)을 유도하는 광범위한 임상 상태 또는 약물에 의해 기인될 수도 있다. 주요 외과적 과정, 감염, 쇼크, 산후 출혈 및 부적절한 신관류(kidney perfusions)가 뇨 배출 감소의 원인이 될 수도 있다. 혈청 크레아티닌이 증가되면 급성신부전증으로 진단된다. 위중한 환자에서, 높은 이화 상태(catabolic state)는 질소성 폐기물의 급격한 상승(혈중요소질소(BUN)의 상승으로 반영됨)과 수분과다를 유도하는 수분 균형에 급격한 변이를 유도할 수 있다.
ARF와 같은 신장 관련 질환 또는 상태의 예방 및 치료를 위한 산물 및 접근 방법의 확인이 지속적으로 필요하다. 본 명세서는 여러 문헌을 언급하며, 이들 내용들은 전문이 참고문헌으로 첨부되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 호르몬 활성을 보이는 신규한 화합물 및 이의 용도, 특히 이기능성 호르몬 활성을 보이는 신규한 화합물 및 급성신부전증 (ARF)에 이의 이용에 관계한다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이기능성 호르몬을 제공한다:
(a) 알파-MSH 펩티드 또는 단편, 변이체, 또는 단편의 변이체를 포함하는 제 1 도메인, 이때 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 알파-MSH 관련된 호르몬 활성을 가지고; 그리고
(b) 제 1 도메인에 공유결합으로 연결된 제 2 도메인, 이때 제 2 도메인은 나트륨이뇨(natriuretic) 펩티드 또는 단편, 변이체, 또는 단편의 변이체를 포함하며, 이때, 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성을 가진다.
구체예에서, 제 1 도메인은 SEQ ID NO: 1의 알파-MSH 펩티드이고; 제 2 도메인은 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성을 가지는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체이며, 그리고 제 2 도메인이 SEQ ID NO: 2, 3, 4 또는 5의 나트륨이뇨 펩티드라면, 제 1 도메인은 알파-MSH 관련된 호르몬 활성을 가지는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체이다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 SEQ ID NO:1 펩티드의 최소 4개 아미노산의 단편 또는 이 단편과 최소 75% 상동성을 가지는 단편의 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 알파-MSH 펩티드의 상기 언급된 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 최소 75% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 다음의 식 I의 아미노산(SEQ ID NO:47)을 포함한다:
X2-H-X1-R-W-X3 (I)
이때,
X1은 L-Phe 또는 D-Phe이며;
X2는 E, M-E 또는 없고;
X3은 G-K-P-X4, G-K-P, G-K, G 또는 없으며;
X4는 M, V 또는 Nle이다
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 다음을 포함한다:
(i) H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO: 48);
(ii) M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 17);
(iii) H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 49);
(iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 50); 또는
(v) H-X1-R-W (SEQ ID NO: 20); 이때 X1은 L-Phe 또는 D-Phe이며;
X4는 M, V 또는 Nle이다.
구체예에서, 상기 제 1 도메인은 다음을 포함한다:
(i) H-f-R-W-G-K-P-V (SEQ ID NO: 51);
(ii) H-f-R-W-G-K-P-M (SEQ ID NO: 52);
(iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle (SEQ ID NO: 53);
(iv) H-f-R-W-G-K-P (SEQ ID NO: 54);
(v) M-E-H-F-R-W-G (SEQ ID NO: 11);
(vi) H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 55);
(vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO: 56);
(ix) E-H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 57); 또는
(iv) H-f-R-W (SEQ ID NO: 6); 이때 f는 D-페닐알라닌이다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 다음으로 구성된다:
(i) H-f-R-W-G-K-P-V (SEQ ID NO: 51);
(ii) H-f-R-W-G-K-P-M (SEQ ID NO: 52);
(iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle (SEQ ID NO: 53);
(iv) H-f-R-W-G-K-P (SEQ ID NO: 54);
(v) M-E-H-F-R-W-G (SEQ ID NO: 11);
(vi) H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 55);
(vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO: 56);
(ix) E-H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 57); 또는
(iv) H-f-R-W (SEQ ID NO: 6); 이때 f는 D-페닐알라닌이다.
구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 최소 15개 아미노산의 단편, 또는 이 단편과 최소 75% 상동성을 가지는 단편의 변이체를 포함한다.
구체예에서, 상기 언급된 나트륨이뇨 펩티드의 변이체는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 최소 75% 상동성을 가지는 아미노산을 포함한다.
구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 식 II의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 58)을 포함한다:
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II)
이때,
X5는 M, Nle, R-R-S-S, S-L-R-R-S-S, 또는 없고;
X6는 C이고;
X7는 H 또는 없고;
X8은 M 또는 Nle이고;
X9는 S-C-Y-R 또는 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y이고;
이때 X6의 C 잔기는 X9의 C 잔기와 이황화결합을 형성하고; 그리고
X5가 Nle인 경우, 제 1 도메인은 제 2 도메인의 N-말단이 된다.
구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 다음을 포함한다:
(i) M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 22);
(ii) Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 23);
(iii) C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 24);
(iv) C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 25);
(v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-l-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 5와 21의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 26);
(vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다((SEQ ID NO: 59); 또는
(vii) M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 2와 18의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 60).
구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 다음으로 구성된다:
(i) M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 22);
(ii) Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 23);
(iii) C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 24);
(iv) C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 25);
(v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 5와과 21의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 26);
(vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 59); 또는
(vii) M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 2와 18의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 60).
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 제 2 도메인의 N-말단이다.
구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬의 아미노 말단의 잔기는 아세틸화되거나 C3-C16 아실기로 아실화된다.
구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬의 카르복시 말단 잔기는 아미드화(amidated)된다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인과 제 2 도메인은 펩티드 결합을 통하여 공유적으로 연결된다. 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 다음을 포함한다;
(i) H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
이때, 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 61);
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 62);
(iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-l-S-C-Y-R,
이때, 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 63);
(iv) H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 64);
(v) M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 12와 28의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 65);
(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 66);
(vii) H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 67);
(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-l-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W,
이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 68); 또는
(ix) E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때, 위치 11과 27의 C 잔기가 이황화결합을 형성하고(SEQ ID NO: 69);
이때 f는 D-페닐알라닌이다.
구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 다음으로 구성된다:
(i) Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,
이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 31);
(ii) Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 33);
(iii) Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,
이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 34);
(iv) Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 35);
(v) M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때 위치 12와 28의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 36);
(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때, 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 38);
(vii) Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 39);
(viii) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W-NH2,
이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 40); 또는
(ix) Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R- Y-NH2,
이때 위치 11과 27의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 42);
이때 Ac는 아미노 말달 아세틸화를 나타내고;
NH2는 카르복시 말단 아미드화를 나타내고; 그리고 f는 D-페닐알라닌이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 이기능성 호르몬과 약리학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 상기 언급된 이기능성 호르몬을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료를 위해 상기 언급된 이기능성 호르몬을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 상기 언급된 이기능성 호르몬과 약리학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압 예방 및/또는 치료를 위해 상기 언급된 이기능성 호르몬과 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 조성물중 최소 한 가지의 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
구체예에서, 상기 언급된 투여는 정맥 주입이다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 정맥 주입은 분당 약 1ng/kg 내지 약 10μg/kg의 속도가 된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 조성물중 최소 한 가지의 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도를 제공한다.
구체예에서, 상기 언급된 신장 질환은 급성신손상이다.
또 다른 구체예에서, 상기 언급된 신장 질환은 수술 후 신장 손상 또는 기능이상이다.
추가 구체예에서, 상기 언급된 수술후 신장 손상 또는 기능이상은 판막 성형을 위한 심폐 바이패스 수술, 대동맥류(aortic anurysm), 기관 이식, 개심술(open heart surgery) 또는 관상동맥이식술로 결과된 것이다.
구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬 또는 조성물은 정맥 주입에 의한 투여에 적합하다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 정맥 주입은 분당 약 1ng/kg 내지 약 10μg/kg의 속도가 된다.
본 발명의 다른 목적, 장점 및 특징들은 첨부된 도면을 참고로 하여 실시예가 제공된 다음의 특정 구체예의 비-제한적인 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
첨부된 도면에서:
도 1은 (A) 일시투여량으로 정맥으로 투여된 펩티드(SEQ ID NO: 2와 33)의 증량이 혈압에 끼치는 영향을 보여준다. 데이터는 기저 평균 동맥 혈압(MAP)(도 1A에서 "B"로 표시함)로부터 변화 비율로 플롯되었다. (B)는 펩티드의 단일 약량(30 μg/kg/h 주입)이 혈압에 끼치는 영향을 보여준다. MAP는 한 시간에 걸쳐 기록되었다. 데이터는 시간(분)의 함수로 기저 MAP로부터 변화 비율로 플롯되었다. #2 = 고유 ANP (SEQ ID NO:2), #33 = 이기능성 호르몬(SEQ ID NO: 33);
도 2에서는 SD 쥐에서 고혈압에 대한 이기능성 호르몬의 효과를 보여준다. 데이터는 기저 혈압으로부터 변화 비율로 플롯되었다.
도 3에서는 신장 허혈후에 급성 신부전에 대한 이기능성 호르몬의 예방 치료의 효과를 보여준다. 펩티드 #2 또는 #33을 신장 동맥 클램핑 이전 1시간과 이후 한 시간동안 15 μg/kg/h의 속도로 주입하였다. 혈장 크레아티닌과 요소를 상이한 시간대에서 측정하였다. 염-처리된 대조군(n=3 per group; sal n=6)에 대항한 유의성은 Bonferroni 테스트를 이용하여 이원 ANOVA로 데이터를 분석하였다.
도 4에서는 신장 허혈 후에 급성 신부전에 대한 이기능성 호르몬의 치료(손상 후) 효과를 보여준다. 펩티드 #2와 #33을 신장 허혈의 쥐 모델에서 신장 클램프 제거후 2시간 동안 주입하였다. 지정된 시간에 혈액 샘플을 취하고, 혈장 크레아티닌 및 요소를 결정하였다. 염-처리된 대조군(n=3 per group; sal n=6)에 대항한 유의성은 Bonferroni 테스트를 이용하여 이원 ANOVA로 데이터를 분석하였다.
도 5에서는 신장 허혈후 급성 신부전에 대한 이기능성 호르몬의 만성 주입 효과를 보여준다. 신장 동맥 클램프를 제거한 후에, 복강 이식된 Alzet™ minipumps (2ML1; 운반 속도 10㎕/h)를 펩티드 #2 또는 #33을 이용하여 두 가지 약량에서 주입하였다. 혈장 크레아티닌 및 BUN을 지정 시간에 측정하였다. 염-처리된 대조군(n=3 per group; sal n=6)에 대항한 유의성은 Bonferroni 테스트를 이용하여 이원 ANOVA로 데이터를 분석하였다.
도 6에서는 30분간 신장 허혈을 겪은 쥐의 신장에서 호중구 마커(CD11b), 관 손상 마커(KIM-1), 그리고 염증성 사이토킨(IL-1 β) 뿐만 아니라 단백질 로딩 마커(β-actin)의 면역화학적 동정을 나타낸다. 이기능성 호르몬 #33을 Alzet™ minipumps를 이용하여 24시간 동안 15㎕/kg/h의 주입 속도로 주입하였다. 특정 항체로 이들 단백질을 확인하였다. (A) 웨스턴 블랏. (B) 마커들의 상대적인 존재를 보여주는 히스토그램이다.
본 발명은 신규한 이기능성 호르몬 및 이의 용도, 예를 들면, 급성신부전증 (ARF) 또는 급성신손상 (AKI)과 같은 신장-관련 질환 또는 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 용도에 관계한다. 이기능성 호르몬은 α-MSH (α-멜라닌세포-자극 호르몬) 수용체상에, 그리고 나트륨이뇨 펩티드 수용체들중 최소 하나에 생물학적 활성을 보인다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이기능성 호르몬을 제공한다:
(a) 알파-MSH 펩티드 또는 단편, 변이체, 또는 단편의 변이체를 포함하는 제 1 도메인, 이때 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 알파-MSH 관련된 호르몬 활성을 가지고; 그리고
(b) 제 1 도메인에 공유결합으로 연결된 제 2 도메인, 이때 제 2 도메인은 나트륨이뇨 펩티드 또는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체를 포함하고, 이때 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성을 가진다.
구체예에서, 제 1 도메인이 알파-MSH 펩티드(SEQ ID NO: 1)라면, 제 2 도메인은 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성을 가지는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체이고, 그리고 만약 제 도메인이 SEQ ID NO: 2, 3, 4 또는 5의 나트륨이뇨 펩티드라면, 제 1 도메인은 알파-MSH 관련된 호르몬 활성을 가지는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체이다.
본 발명은 또한 나트륨이뇨 펩티드-관련된 생물학적 활성을 가지는 제 2 도메인에 공유적으로 연결된, 알파-MSH-관련된 생물학적 활성을 가지는 제 1 도메인을 포함하는 이기능성 호르몬을 제공하는데, 이때 (i) 제 1 도메인은 전장(즉, 고유)의 알파-MSH 펩티드가 아니며, (ii) 제 2 도메인은 전장(즉, 고유)의 나트륨이뇨 펩티드가 아니며, 또는 (iii) (i) 과 (ii) 모두가 적용된다.
멜라노코르틴(Melanocortin)은 부신피질자극 호르몬 (ACTH(1-39)), α-멜라닌세포-자극 호르몬((α-MSH(1-13)), 그리고 β- 및 γ-MSH를 포함하는 관련 아미노산 서열을 포함하는 전구 아편양 흑색소 부신 피질 자극 호르몬(pro-opioMelanocortin) 유도된 포유류 펩티드 호르몬이다. 멜라노코르틴 펩티드는 강력한 항-염증/항사이토킨 활성을 가진다(Lipton and Catania, Immunol. Today 18: 140-145, 1997). 멜라노코르틴은 멜라노코르틴 수용체 (MCRs)의 자극을 통하여 이들 활성의 최소 일부를 제공한다. 멜라닌세포 자극 호르몬(MSH) 활성은 부분적으로 멜라노코르틴 수용체 타입 1 내지 5(MCR1-MCR5)의 결합 및 활성화에 의한 것이다.
α-MSH는 타입 1 수용체 (MCR1)에 높은 친화성으로 결합되는데, 상기 수용체는 몇몇 조직 및 세포에서 발현되는 것으로 알려져있다. β-MSH, γ-MSH 및 ACTH역시 MCR1에 결합하기는 하지만 결합 친화성은 더 낮다. MCR2는 ACTH에만 결합하는 것으로 보고되고, MSH 펩티드들중 어느 것에도 결합하지 않는다. γ-MSH는 MCR3 수용체에 높은 친화력으로 결합하고, β-MSH는 MCR4 수용체에 높은 친화력으로 결합한다.
α-MSH는 다음을 포함하는 염정 과정의 주요 형태를 저해하는 것으로 나타났다(Lipton and Catania, Immunol Today, 18: 140-145, 1997):
1- 호중구 캐모택티브(chemotactive) 활성의 저해(Catania, A. N. et al. Peptides, 17: 675-679,1996);
2- LPS 처리에 의해 유도된 사이토킨(IL-1 , TNF-α) 방출 저해;
3- 세균성 엔도톡신에 반응한 TNF-α의 저해(Wong, K. Y. et al. Neuroimmunomodulation, 4: 37-41 , 1997);
4- 실험적 염증성 장 질환에서 염증 감소(Rajora, N. et al. Peptides, 18: 381-385, 1997);
5- 허혈-유도된 급성신부전증 (Star, R. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A, 92: 8016-8020, 1995);
6- 피부 미세결관 내피 세포로부터 IL-8 방출 증가 (Hartmeyer, M.T., J. Immunol, 159: 1930-1937, 1997);
α-MSH 효과는 대식세포, 호중구 및 신장 관을 포함하는 다양한 세포 타입에서 발현되는 멜라노코르틴 수용체에 의해 중재된다.
나트륨이뇨 펩티드들은 세 가지 상이한 유전자들에 의해 합성되고 (Flynn TG. Pro. Soc. Exp. Biol. Med. 213: 98-104, 1996; Levin ER et al. N Eng J. Med 339: 321-328, 1998; Ogawa Y et al. Clin Exp Pharmacol physiol. 22: 49-53, 1995; Rosenzweig A., Annu Rev Biochem 60: 229-255, 1991) 그리고 세 가지 상이한 프로-호르몬[즉, 126개 아미노산 ANP, 108개 아미노산 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP), 그리고 126-아미노산 C-타입 나트륨이뇨 펩티드 (CNP) 프로호르몬] (Levin ER et al. N Eng J. Med 339: 321-328, Vesely DL Atrial Natriuretic Hormones. Englewood Cliffs, NJ: Prentice Hall, 1992, 1-256)으로 저장되는 펩티드 패밀리의 일부이다.
사람 및 동물 모두에서 126개 아미노산 ANP 프로호르몬내에는 혈압 강하, 나트륨이뇨, 이뇨 및/또는 칼륨이뇨 성질의 4가지 펩티드 호르몬이 있다. 이러한 프로호르몬의 N-말단에서 시작되는 이들 아미노산 서열에 번호를 붙인 펩티드 호르몬들은 다음과 같다:
- 프로호르몬의 잔기 1-30: 장기 활성 나트륨이뇨 펩티드 (LANP);
- 프로호르몬의 잔기 31-67: 혈관 확장기
- 프로호르몬의 잔기 79-98: 칼륨이뇨 펩티드; 그리고
- 프로호르몬의 잔기 99-126: ANP.
다른 한편, BNP와 CNP 유전자들은 이들 각 프로호르몬 다시 말하면, BNP 및 CNP내에서 한 가지 펩티드 호르몬만을 합성하는 것으로 보인다.
심동맥 근육세포로부터 주로 유도되는 순환 호르몬인 동맥 나트륨이뇨 펩티드 (ANP)는 염과 물의 항성상 조절 및 혈압 조절에 역할을 한다. 또한, ANP는 혈관확장제이며, 또한 나트륨 방출 및 이뇨를 촉진시키기 위해, 사구 여과 증가, 나트륨 재흡수 저해 및 신장 혈류 재분포를 포함하는 신장에서 직접적인 작용을 가진다.
유로딜라틴(Urodilatin)은 나트륨이뇨 펩티드 패밀리의 신장-유도된 멤버로써, 동일한 ANP 프로호르몬으로부터 형성되며, 아미노산 95-126으로 구성된다. N-말단에 4개 아미노산을 제외하고, ANP (99-126)와 동일하다. 유로딜라틴은 신장에서 나트륨과 물의 취급에 중요한 조절물질일 뿐만 아니라 울혈성 심부전(CHF) 환자에서 나트륨 방출의 조절물질로 보인다.
BNP는 건강한 사람의 경우 ANP와 유사한 생물학적 효과를 나타낸다. 정상 남성들에게 BNP를 주입하면 나트륨 방출이 2배 증가되고, 혈장 레닌, 앙지오텐신Ⅱ, 알도스테론 방출이 50% 감소된다. ProBNP의 C-말단에 32개 아미노산의 절단으로, 혈장에서 생리학적으로 활성형인 사람 BNP(77-108)가 결과된다.
CNP는 다른 나트륨이뇨 펩티드들과 유사한 심혈관 효과들을 유도한다. 말단 아미노산 서열 105-126이 proCNP 로부터 절단되어, 생물학적으로 활성 형의 CNP가 만들어진다.
ANP와 BNP의 대부분의 생물학적 효과들은 구아닐레이트 사이클라제 결합된 세포 표면 수용체, A-수용체(NPR-A) (Garbers, DL, Cell 1992, 71: 1-4)에 의해 중재된다. CNP는 또 다른 구아닐레이트 사이클라제 결합된 NP 수용체인, B-수용체 (NPR-B)에 특이적 리간드이다(Maack T, Ann. Rev. physiol. 1992, 54: 11-27). 세 번째 수용체, 소위 NP 소거 수용체 (NPR-C)는 ANP, BNP 및 CNP에 결합한다. 전체 신체에서 NP 소거에 주요 역할((Maack T, Ann. Rev. physiol. 1992, 54: 11-27))과는 별도로 ANP의 몇 가지 효과들은 NPR-C 수용체에 의해 조정되는 것으로도 보고된 바 있다(Maack T, Kidney lnt 1996, 49: 1732- 1737). NP 수용체에 결합하는 것 이외에, 나트륨이뇨 펩티드들은 중성 엔도펩티다제에 의한 단백질분해를 통하여 제거된다. 나트륨이뇨 펩티드 수용체 세가지 모든 서브타입(NPR-A, NPR-B, NPR-C)은 신장계 및 심장을 포함하는 다양한 조직에서 발현되는 것으로 설명되었다 (Nunez, DJR et al., J. CHn Invest. 1992, 90: 1966- 1971).
하기 표 1에는 α-MSH, ANP, 유로딜라틴, BNP 및 CNP의 고유 아미노산 서열을 제공한다.
Figure 112009075628966-PCT00001
[ ] = 이황화결합을 통하여 고리화된 펩티드; "["의 우측 아미노산이 "]" 의 좌측 아미노산과 다리를 형성한다.
여기에서 사용된 "아미노산"에는 자연 발생 L- 아미노산 및 D-이성체 뿐만 아니라 펩티드의 합성 유사체를 준비하기 위해 펩티드 화학에서 이용되는 다른 아미노산(예를 들면, 자연-발생 아미노산, 비-자연 발생 아미노산, 핵산 서열에 의해 인코드되지 않는 아미노산 등)등이 포함된다. 자연-발생 아미노산의 예로는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 세린, 트레오닌 등이 있다. 다른 아미노산에는 예를 들면, 노르루이신, 노르발린, 사이클로헥실 알라닌, 비페닐 알라닌, 호모페닐 알라닌, 나프틸 알라닌, 피리딜 알라닌, 오르소, 파라 및 메타 위치에 알콕시, 할로겐 또는 니트로기로 치환된 페닐 알라닌 등이 포함된다. 이들 아미노산은 생화학/펩티드 화학에 잘 알려진 것들이다.
"생물학적 활성" 또는 "생활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 여기에서 서로 호환적으로 이용되는데, 이들 용어들은 펩티드 호르몬 또는 이기능성 호르몬 또는 이의 임의 단편에 의해 직간접적으로 실행되는 기능을 말한다. 생물학적 활성에는 예를 들면, 호르몬 수용체에 결합, 호르몬 반응/활성의 유도 등이 포함된다.
알파-MSH-관련된 생물학적 활성은 일반적으로 항-염증 및/또는 항-사이토킨 활성과 같은 고유 알파-MSH의 생물학적(가령, 호르몬) 활성을 말한다. 나트륨 이뇨 펩티드-관련된 생물학적 활성은 일반적으로 고유 ANP, 고유 BNP, 고유 CNP 또는 고유 유로딜라틴의 호르몬 활성 예를 들면, 혈압-강하, 나트륨이뇨, 이뇨, 혈관확장 및/또는 칼륨이뇨 활성중 하나를 말한다. 알파-MSH-관련된 생물학적 활성 (예를 들면, 알파-MSH 수용체 결합 활성)의 측정은 실시예 2에서 설명된 것과 같이 MCR1 수용체 발현 세포를 이용한 시험관내 검사를 통하여 실행할 수 있을 것이다. 나트륨이뇨 펩티드 관련된 생물학적 활성 (예를 들면, 나트륨이뇨 펩티드 수용체 결합 활성)의 측정은 실시예 2에서 설명된 것과 같이, ANP 수용체 발현 세포를 이용하는 시험관 검사를 이용하여 실행할 수 있을 것이다.
여기에서 사용된 바와 같이, "단편"은 펩티드의 활성(예를 들면, 알파-MSH 펩티드 또는 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성)을 보유하는 펩티드의 일부/단편을 말한다. 변이체 용어는 야생형 펩티드 (예를 들면, 알파-MSH 펩티드 또는 나트륨이뇨 펩티드) 또는 이의 단편과 비교하였을 때 최소 한 가지 변형을 가지는 도메인을 말한다.
구체예에서, 변형은 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결손, 삽입, 치환 또는 화학적 변형을 말한다. 변형은 예를 들면, 아미노산의 연속(가령 1 내지 10개) 또는 비연속성 결손, 자연 생성 아미노산(L-아미노산) 하나 또는 그 이상의 상응하는 D-아미노산으로의 치환, 한 개, 두 개, 세 개 또는 그 이상의 아미노산으로 서열의 연장이 될 수도 있다.
구체예에서, 상기 언급된 치환들은 보존된 아미노산 치환들이다.
여기에서 사용된 것과 같이, "보존된 아미노산 치환(일부 경우에 '보존성 아미노산 치환')"은 펩티드내에 주어진 위치에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 말하는데, 이때 치환은 관련 기능의 실질적인 상실 없이 이루어진다. 이와 같은 변화를 만들 때, 유사 아미노산 잔기의 치환은 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들면, 크기, 전하, 소수성, 친수성 및 이와 유사한 것에 근거하여 일어날 수 있고, 이와 같은 치환은 통상의 테스트를 통하여 펩티드 기능에 대한 이들의 효과에 대해 검사될 수도 있다.
일부 구체예에서, 보존된 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 친수성 수치(예를 들면, + 또는 - 2.0 범위내)를 가지는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우에 만들어 질 수 있는데, 이때 다음은 아미노산 잔기에 할당되는 약 -1.6의 하이드로패스 지수(hydropathic index)를 가지는 아미노산들, 예를 들면, Tyr (-1.3) 또는 Pro (-1.6)이다. (참고문헌으로 첨부된 미국 특허 4,554,101에 상세하게 설명됨): Arg (+3.0); Lys (+3.0);Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); Trp (-3.4).
다른 구체예에서, 보존된 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 하이드로패스 지수(예를 들면, + 또는 -2.0 범위내)를 가지는 다른 아미노산 잔기로 치환되어 만들어질 수도 있다. 이와 같은 구체예에서, 각 아미노산 잔기는 소수성 및 하전 특징에 근거하여, 다음과 같이 하이드로패스 지수에 할당될 수도 있다: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn(-3.5); Lys (-3.9); Arg (-4.5).
또 다른 구체예에서, 보존된 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 동일한 클래스의 다른 아미노산 잔기로 치환되어 만들어질 수 있고, 이때, 아미노산은 비-극성, 산성, 염기성, 중성 클래스로 다음과 같이 분류된다:
비-극성: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met;
산성: Asp, Glu;
염기성: Lys, Arg, His;
중성: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.
보존성 아미노산 변화에는 L-아미노산의 상응하는 D-아미노산으로의 치환, 보존성 D-아미노산으로의 치환 또는 자연-발생, 비-유전적으로 인코드되는 아미노산으로의 치환 뿐만 아니라, L-아미노산의 보존성 치환이 포함될 수도 있다. 자연-발생, 비-유전적으로 인코드되는 아미노산에는 베타-알라닌, 3-아미노-프로피온산, 2,3-디아미노 프로피온산, 알파-아미노이소부틸산, 4-아미노-부틸산, N-메틸글리신 (사르코신), 하이드록시프로린, 오르니틴, 시투루린, t-부틸알라닌, t- 부틸글리신, N-메틸이소루이신, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 노르루이신, 노르발린, 2-나프틸알라닌, 피리딜알라닌, 3-벤조티에닐 알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오르페닐알라닌, 3-플루오르페닐알라닌, 4-플루오르페닐알라닌, 페니실아민, 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 베타-2-티에닐알라닌, 메티오닌 설폭시드, 호모아르기닌, N-아세틸 리신, 2-아미노 부틸산, 2-아미노 부틸산, 2,4,-디아미노 부틸산, p-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린, 시스테인산, 엡실론-아미노 헥사논산, 델타-아미노 발레산, 또는 2,3-디아미노부틸산이 포함된다.
또 다른 구체예에서, 보존성 아미노산 변화에는 친수성 또는 소수성, 크기 또는 부피 또는 전하를 고려한 변화가 포함된다. 아미노산은 일반적으로 아미노산 측쇄의 성질에 주로 의존하여 친수성 또는 소수성으로 특징지을 수 있을 것이다. Eisenberg et al. (J. Mol. Biol. 179: 125- 142, 1984)의 표준화된 콘센선스 소수성 스케일에 근거하여 소수성 아미노산은 0 이상의 소수성을 나타내고, 친수성 아미노산은 0 미만의 친수성을 나타낸다. 유전적으로 인코드되는 소수성 아미노산에는 Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met, 그리고 Trp이 포함되고, 유전적으로 인코드된 친수성 아미노산에는 Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser, 그리고 Lys이 포함된다.
소수성 또는 친수성 아미노산은 이들 측쇄의 성질에 근거하여 추가로 나뉠 수 있을 것이다. 예를 들면, 방향족 아미노산은 최소 하나의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 보유하는 측쇄를 가지는 소수성 아미노산으로, 상기 측쇄에는 하나 또는 그 이상의 치환체를 포함할 수도 있다.
무극성 아미노산은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않는 측쇄를 가지는 소수성 아미노산으로, 두 개의 원자에 의해 공통으로 소유되는 전자쌍이 이들 두 원자 각각에 의해 일반적으로 동등하게 유지되는 결합을 보유한다.(즉, 상기 측쇄는 극성이 아니다). 유전적으로 인코드된 무극성 아미노산에는 Gly, Leu, Val, Ile, Ala, 그리고 Met가 포함된다. 무극성 아미노산은 지방족 아미노산을 포함하도록 추가로 더 세분될 수 있는데, 지방족 아미노산은 지방족 탄화수소 측쇄를 가지는 소수성 아미노산이다. 유전적으로 인코드되는 지방족 아미노산에는 Ala, Leu, Val, 및 Ile가 포함된다.
극성 아미노산은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않는 측쇄를 가지는 친수성 아미노산이나, 두 개의 원자에 의해 공통적으로 소유되는 전자쌍이 이들 원자중 하나에 좀더 근접하게 유지되는 결합을 가진다. 유전적으로 인코드되는 극성 아미노산에는 Ser, Thr, Asn, 그리고 Gln이 포함된다.
산성 아미노산은 pKa값이 7 미만인 측쇄를 가지는 친수성 아미노산이다. 산성 아미노산은 일반적으로 수소 이온의 상실로 인하여 생리학적 pH에서 음전하를 가지는 측쇄를 보유한다. 유전적으로 인코드된 산성 아미노산에는 Asp 및 Glu이 포함된다. 염기성 아미노산은 pKa 값이 7이상인 측쇄를 가지는 아미노산이다. 염기성 아미노산은 일반적으로 수소 이온의 연합으로 인하여 생리학적 pH에서 양전하를 띄게 된다. 유전적으로 인코드되는 염기성 아미노산에는 Arg, Lys, 및 His이 포함된다.
상기 분류는 절대적인 것이 아니며, 아미노산은 하나 이상의 카테고리로 분류될 수도 있다. 추가로, 아미노산은 공지된 거동 및 특정 화학적, 물리학적, 또는 특정 검사에 근거한 생물학적 성질에 기초하여, 또는 기존의 확인된 아미노산과 비교하여 분류될 수 있다. 아미노산에는 또한 아미노산-유사 측쇄를 가지는 이기능성 모이어티가 포함될 수 있다.
보존성 변화에는 예를 들면, 아미노산의 기능 측쇄 기의 반응에 의한 비-유도화된 잔기의 화학적으로 유도된 모이어티으로 치환이 포함될 수 있다.
상기 나열된 치환에 추가하여, 유사한 측쇄 기능성을 제공하는 합성 아미노산이 펩티드로 도입될 수도 있다. 예를 들면, 방향족 아미노산은 D- 또는 L-나프틸알라닌, D- 또는 L-페닐글리신, D- 또는 L-2-티에닐알라닌, D- 또는 L-1-, 2-, 3-, 또는 4-피레닐알라닌, D- 또는 L-3-티에닐알라닌, D- 또는 L-(2-피리디닐 )-알라닌, D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌, D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌, D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신, D-(트리플루오르메틸)-페닐글리신, D-(트리플루오르메틸)-페닐알라닌, D-p-플루오르페닐알라닌, D- 또는 L-p-바이페닐알라닌 D-또는L-p-메톡시바이페닐알라닌, D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌, 그리고 D- 또는 L-알킬알라닌으로 대체될 수 있는데, 이때 알킬기는 치환된 또는 치환안된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, 그리고 이소-펜틸로 구성된 군에서 선택된다.
비-카르복실화된 아미노산은, 포스포노 또는 설페이트화된(예를 들면, -SO3H) 아미노산에 의해 제공되는 음전하를 보유하도록 만들수도 있는데, 이는 무제한적인 예로 간주된다.
다른 치환체에는 알킬기를 임의 자연 아미노산과 복합시켜 만들어진, 비-자연적 알킬화된 아미노산이 포함될 수도 있다. 염기성 자연 아미노산, 예를 들면, 리신 및 아르기닌은 아민(NH2) 기능기에서 알킬기로 치환될 수 있다. 또 다른 치환체에는 아스파라진 또는 글루타민의 니트릴 유도체(예를 들면, CONH2 기능기 대신에 CN-모이어티를 포함하는)와 메티오닌의 설폭시드 유도체가 포함된다. 또한, 펩티드에서 임의 아미드 연쇄는 케토메틸렌, 하이드록시에틸, 에틸/환원된 아미드, 티오아미드 또는 리버스 아미드 모이어티(예를 들면, (-C=O)-NH-)의 경우, (-C=O)-CH2-), (-CHOH)-CH2-), (CH2-CH2-), (-C=S)-NH-), 또는 (-NH-(-C=O))에 의해 치환될 수도 있다.
본 발명의 이기능성 호르몬의 변이체 정의내에는 다른 변형도 포함된다. 예를 들면, 펩티드의 크기는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 결손시켜 줄이거나, 및/또는 비-펩티드 결합을 포함하는 아미노산 모방체 또는 이가펩티드 모방체를 이용할 수도 있다. 이와 같은 목적을 위하여, 벤조디아제핀, 아제핀, 치환된 감마 락탐 고리, 케토-메틸렌 슈도펩티드, β-턴 디펩티드 코어 및 β-아미노알코올과 같은 분자 스카폴드를 이용하는 예들은 펩티드 화학자들에게 공지된 것이며, 예를 들면, 펩티드유사체 프로토콜이 설명되어 있다.(Methods in molecular medicine Vol. 23) W. M. Kazmierski (ed.), Humana Press and Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, VoIs. 1 & 2, A. Abell (Ed).
본 발명의 범위내에는 펩티드의 공유 변형도 따라서 포함된다. 이와 같은 변형은 예를 들면, 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 이기능성 호르몬내로 도입될 수도 있을 것이다. 다음의 예시적인 화학적 유도체들은 설명을 위해 제공되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시스테닐 잔기는 알파-할로아세테이트( 및 이에 상응하는 아민), 예를 들면, 2-클로로아세트산 또는 클로로아세타미드와 반응되어, 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공할 수도 있을 것이다. 히스티딜 잔기는 디에틸프로카르보네이트와 같은 화합물과 예를 들면, pH 5.5-7.0에서(이 물질은 히스트딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문에) 반응시킴으로써 유도화될 수도 있고, 그리고 파라-브로모펜아실 브롬화물을 이용할 수도 있을 것이다: 예를 들면, 이 반응은 pH 6.0에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트에서 선호적으로 실행된다. 리시닐 및 아미노 말단 잔기들은 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 같은 화합물들과 반응될 수도 있다. 알파-아미노-포함하는 잔기를 유도화시키기 위한 다른 적절한 시약들에는 이미도에스테르, 예를 들면, 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아; 2,4 펜탄디온, 그리고 글리옥실레이트와 트란스아미나제-촉매화된 반응이 포함된다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 몇 개의 통상적 시약, 그 중에서도, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로핵산디온 및 닌히드린과 공개된 방법 단계에 따라 반응시켜 변형될 수도 있다. 아르기닌 잔기의 유도화는 구아니딘 기능기의 높은 pKa 때문에 알칼리 조건에서 일반적으로 실행한다. 또한, 이들 시약들은 리신기 뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노 기와도 반응시킬 수 있을 것이다. 티로시닐 잔기의 특정 변형은 방향족 디아조니움 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 티로시닐 잔기로 스펙스랄 라벨(spectral label)을 도입시키는 것과 같이 그 자체로 잘 공지된 것이다. N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 이용하여 O-아세틸 티로시닐 종과 3-니트로 유도체를 각각 만들 수도 있다.
카르복실 측쇄군(아스파르틸 또는 글루타밀)은 1-사이클로헥실-3-(2-몰포리닐-(4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카르보디이미드와 같은 카르보디이미드(R'-N=C=N-R')와 반응시켜 선택적으로 변형시킬 수 있을 것이다. 추가로, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기를 암모니움 이온과 반응시켜 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킬 수도 있을 것이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 흔히 탈아미드화(deamidated)시켜 이에 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 만든다. 본 발명에서 펩티드의 다른 변형들에는 공지의 방법 단계들에 따라, 프로린과 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌의 알파-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 히스티딘 측쇄 아세틸화, 주요 쇄 아미드 잔기의 메틸화(또는 N-메틸 아미노산으로 치환), 그리고, 일부 경우에, C-말단 카르복실 기들의 아미드화가 포함될 수 있다.
펩티드에 지방산(예를 들면, C6-C18)의 공유적 부착으로 프로테아제 저항성, 혈장 단편, 변이체 또는 단편의 변이체 결합, 혈장 반감기 증가, 세포내 침투 등과 같은 추가적인 생물학적 성질들이 부여될 수도 있다. 이기능성 호르몬의 상기 변형 설명이 접근 범위를 제한하거나 또는 조작될 수 있는 가능한 변형 범위를 제한하는 것은 아니다.
구체예에서, 이기능성 호르몬의 제 1 도메인은 제 2 도메인에 직접적으로(예를 들면, 펩티드 결합을 통하여) 또는 적절한 링커 모이어티, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 링커(예를 들면, 폴리글리신 링커) 또는 다른 타입의 화학적 링커(예를 들면, 카르보하이드레이트 링커, 지질 링커, 지방산 링커, 폴리에테르 링커, PEG, 등(Hermanson (1996) Bioconjugate techniques))을 통하여 공유적으로 연결될 수도 있다. 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 추가 도메인(예를 들면, 생물학적 활성을 가지는 도메인)이 제 1 과 제 2 도메인 사이에 삽입될 수도 있다. 구체예에서, 제 1 과 제 2 도메인은 펩티드 결합을 통하여 공유적으로 연결된다.
구체예에서, 제 1 도메인은 알파-MSH (SEQ ID NO: 1)의 자연 생성 서열에 비교하였을 때 최소 하나의 변형을 포함한다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 SEQ ID NO: 1의 펩티드의 최소 4개 아미노산 단편 또는 이 단편에 최소 75% 상동성을 가지는 단편 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 알파-MSH 펩티드의 상기 언급된 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 최소 75% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. .
"상동성" 또는 "상동성의"는 두 개 폴리펩티드 또는 두 개 핵산 분자간에 서열 유사성을 말한다. 상동성은 나열된 서열에서 각 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열간에 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산이 동일한 또는 매칭되는 개수에 대한 함수이다. 여기에서 이 용어를 사용하는 것과 같이, 핵산 또는 아미노산 서열은 두 서열이 실질적으로 동일하고 이들 서열의 기능적 활성이 보존되면, 서로간에 "상동성"이라고 한다(여기에서 사용된 바와 같이, "상동성"은 진화론적으로 연관이 있다는 것을 의미하지는 않는다). 두 개 핵산 또는 아미노산 서열을 적절하게 배열하였을 때(허용된 갭을 가지고), 이들이 최소 약 75% 서열 유사성 또는 동일성을 공유하거나, 또는 서열이 정의된 기능적 모티프를 공유하는 경우 "실질적으로 동일한"것으로 간주한다. 또 다른 구체예에서, 최적으로 배열된 실질적으로 동일한 서열에서 서열 유사성은 최소 80%, 85%, 90% 또는 95%가 될 것이다. 여기에서 사용된 것과 같이, 서열간에 상동성 비율은 최적으로 배열된 서열에서 서열 동일성 정도를 나타낸다. "관련안된" 또는 "비-상동성" 서열은 여기에서 설명된 서열과 40% 미만의 상동성을 공유하고, 바람직하게는 약 25% 미만의 상동성을 공유한다.
상동성 비교를 위한 최적의 서열 배열은 다양한 예를 들면, Smith and Waterman의 로칼 상동성 알고리즘, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, Needleman and Wunsch의 상동성 배열 알고리즘, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443, Pearson and Lipman의 유사성 조사 방법, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 그리고 이들 알고리즘의 전산화 이행(예를 들면 GAP, BESTFIT, FASTA 및TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.) 알고리즘을 이용하여 실시할 수 있다. 서열 동일성은 Altschul et al., 1990, J. MoI. Biol. 215: 403-10 (공개된 디폴트 세팅을 이용)에서 설명하는 것과 같이, BLAST 알고리즘을 이용하여 결정할 수도 있을 것이다. BLAST 분석을 실행하는 소프트웨어는 the National Center for Biotechnology Information web site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻을 수 있다. BLAST 알고리즘은 데이터베이스에 동일한 길이의 단어로 배열하였을 때, 문제 서열에서 일부-포지티브 값의 역치 T와 일치하거나 만족하는 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 수치 서열 쌍(HSP)을 우선 확인하는 것과 관련된다. T는 이웃 단어 수치 역치를 말한다. 초기 이웃 단어 히트(hits)는 더 긴 HSPs를 발견하기 위한 검색을 개시하는 근원으로 작용하다. 단어 히트는 누적 배열 수치가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 다음의 매개 변수들을 만나는 경우에 중단된다: 누적된 배열 수치가 최대 수득 치로부터 X 만큼 떨어질때; 하나 또는 그 이상의 네가티브-수치 잔기 배열의 누적으로 인하여 누적 수치가 0 또는 그 이하로 갈 때; 또는 서열의 어느 방향이건 말단에 다다를 때. BLAST 알고리즘 매개 변수들 W, T 및 X는 배열의 감응성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로써 11의 단어 길이(W), BLOSUM62 scoring 매트릭스(Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) 50의 배열(B), 10의 기댓값(E) (또는 1 또는 0.1 또는 0.01 또는 0.001 또는 0.0001), M=5, N=4, 그리고 양쪽 스트랜드 비교를 이용한다. BLAST 알고리즘을 이용하여 두 서열간에 통계학적 유사성의 한 가지 측도는 최소 합 확률(P(N))인데, 이는 두 개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간에 매치가 우연히 일어나는 확률 도수를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 테스트 서열과 비교하였을 때 최소 합 확률이 1 미만, 적절하게는 0.1 미만, 더욱 적절하게는 0.01, 그리고 가장 적절하게는 약 0.001 미만인 경우에 실질적으로 동일한 것으로 간주한다.
실질적으로 상보성 핵산들은 한 분자의 보체가 다른 분자와 실질적으로 동일한 핵산들이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 상보적임을 지시하는 또 다른 지표는 두 서열이 중간정도의 스트린젼트(strigent) 또는 바람직하게는 스트린젼트 조건하에 서로 하이브리드된다는 것이다. 중간 정도의 스트린젼트 조건하에 필터-결합된 서열에 하이브리드화 반응은 예를 들면, 0.5 M NaHPO4, 7% 도데실 설페이트 나트륨(SDS), 1 mM EDTA, 65℃에서 실행하고, 42℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS로 세척한다. (Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 , Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3). 또는, 스트린젼트 조건하에 필터-결합된 서열에 하이브리드화 반응은 예를 들면, 0.5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA, 65℃에서 실행하고, 68℃에서 0.1 x SSC/0.1% SDS로 세척한다. (Ausubel, et al. (eds), 1989, supra). 하이브리드반응 조건은 관심 서열에 따라 공지의 방법들에 따라 변형될 수도 있을 것이다( Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). 일반적으로, 스트린젼트 조건들은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 열 용융점보다 약 5℃ 낮게 선택된다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 다음의 식 I의 아미노산(SEQ ID NO:47)을 포함한다:
X2-H-X1-R-W-X3 (I)
이때,
X1은 L-Phe 또는 D-Phe이며;
X2는 E, M-E 또는 없고;
X3은 G-K-P-X4, G-K-P, G-K, G 또는 없고;
X4는 M, V 또는 Nle이다
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 다음을 포함한다:
(i) H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO: 48);
(ii) M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 17);
(iii) H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 49);
(iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 50); 또는
(v) H-X1-R-W (SEQ ID NO: 20);
이때 X1은 L-Phe 또는 D-Phe이며;
X4는 M, V 또는 Nle이다.
한 구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 10개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 9개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 8개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 7개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 6개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 5개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다.
구체예에서, 상기 언급된 제 1 도메인은 다음으로 구성된다:
(i) H-f-R-W-G-K-P-V (SEQ ID NO: 51);
(ii) H-f-R-W-G-K-P-M (SEQ ID NO: 52);
(iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle (SEQ ID NO: 53);
(IV) H-f-R-W-G-K-P (SEQ ID NO: 54);
(V) M-E-H-F-R-W-G (SEQ ID NO: 11);
(vi) H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 55);
(vii) E-H-F-R-W (SEQ ID NO: 56);
(ix) E-H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 57); 또는
(iv) H-f-R-W (SEQ ID NO: 6);
이때 f는 D-페닐알라닌이다.
구체예에서, 제 1 도메인이 이기능성 호르몬의 N-말단에 위치한다면, 아미노-말단 잔기는 C2-C16 아실기로 이실화된다. 추가 구체예에서, 아미노-말단 잔기는 아세틸화된다.
본 발명에 따른 이기능성 호르몬의 제 1 도메인의 아미노산 서열의 대표적인 예들을 표 2에 나열하였다.
Figure 112009075628966-PCT00002
Figure 112009075628966-PCT00003
이때,
f는 D-Phe이고,
Xa는 L-Phe 또는 D-Phe 이고,
Xb는 Met, Val 또는 Nle이다.
구체예에서, 본 발명의 이기능성 호르몬의 제 2 도메인은 ANP (SEQ ID NO: 2), 유로딜라틴 (SEQ ID NO: 3), BNP (SEQ ID NO: 4) 또는 CNP (SEQ ID NO: 5)의 자연 발생 서열과 비교하였을 때, 최소 한 가지 변형을 포함한다.
구체예에서, 제 2 도메인은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 최소 15개 아미노산으로된 단편 또는 이 단편과 최소 75% 상동성을 가지는 단편의 변이체를 포함한다.
구체예에서, 나트륨 이뇨 펩티드의 상기 언급된 변이체는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 최소 75% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
구체예에서, 제 2 도메인은 식 Ⅲ의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 72)을 포함한다;
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (Ⅲ)
이때,
X5는 M, Nle, R-R-S-S, S-L-R-R-S-S, 또는 없고;
X6는 E, D, 또는 C이고;
X7은 H 또는 없고;
X8은 M 또는 Nle이고;
X9는 S-K-Y-R, S-C-Y-R 또는 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y이고;
이때, X6가 C이고, X9는 S-C-Y-R 또는 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y이면, X6의 C잔기가 X9의 C 잔기와 이황화결합을 형성하고;
X6가 E 또는 D이고, X9는 S-K-Y-R이면, X9의 잔기는 X6의 E 또는 D와 락탐 다리를 형성한다.
구체예에서, 제 2 도메인은 식 II의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 58)을 포함한다:
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II)
이때,
X5는 M, Nle, R-R-S-S, S-L-R-R-S-S, 또는 없고;
X6는 C이고;
X7는 H 또는 없고;
X8은 M 또는 Nle이고;
X9는 S-C-Y-R 또는 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y이고;
이때 X6의 C 잔기는 X9의 C 잔기와 이황화결합을 형성하고; 그리고
X5가 Nle인 경우, 제 1 도메인은 제 2 도메인의 N-말단이 된다.
구체예에서, 제 2 도메인은 식 Ⅲ의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 72)을 포함한다;
X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (Ⅲ)
이때,
X5는 M, Nle, R-R-S-S, S-L-R-R-S-S, 또는 없고;
X6는 E 또는 D이고;
X7은 H 또는 없고;
X8은 M 또는 Nle이고;
X9는 S-K-Y-R이고;
이때, X9의 잔기는 X6의 E 또는 D와 락탐 다리를 형성한다.
구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 25개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 24개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 23개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 22개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 21개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 20개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 19개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 18개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 17개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 제 2 도메인은 16개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다.
구체예에서, 제 2 도메인은 다음을 포함한다:
(i) M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
이때 위치 2과 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 22);
(ii) Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
이때 위치 2과 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 23);
(iii) C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 24);
(iv) C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 25);
(v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 5와 21의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 26);
(vi) Nle-E-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-K-Y-R,
이때 위치 2의 E 잔기와 위치 13의 K 잔기가 락탐 다리를 형성한다(SEQ ID NO: 70);
(vii) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 59); 또는
(viii) M-C-F-G-G-R-M-D-R-l-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 2와 18의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 60).
한 구체예에서, 제 2 도메인은 다음으로 구성된다:
(i) M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
이때 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 22);
(ii) Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
이때 위치2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 23);
(iii) C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 24);
(iv) C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 25);
(v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-l-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 5와 21의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 26);
(vi) Nle-E-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-K-Y-R,
이때 위치 2의 E 잔기와 위치 13의 K 잔기가 락탐 다리를 형성한다 (SEQ ID NO: 70);
(vii) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 59); 또는
(viii) M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 2와 18의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 60).
본 발명에 따른 이기능성 호르몬의 제 2 도메인의 아미노산 서열의 대표적인 예를 표 3에 나타낸다.
Figure 112009075628966-PCT00004
[ ] = 이황화결합을 통하여 고리화된 펩티드; "["의 우측 아미노산이 "]" 의 좌측 아미노산과 다리를 형성한다.
구체예에서, 제 1 도메인과 제 2 도메인은 C-말단이 N-말단에, C-말단이 C-말단에, N-말단이 N-말단에 또는 N-말단이 C-말단에 연결될 수 있다. 구체예에서, 제 1 도메인(알파-MSH 펩티드)과 제 2 도메인(나트륨이뇨 펩티드) 각각은 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산을 가지고, 제 1 도메인의 C-말단 아미노산은 제 2 도메인의 N-말단 아미노산에 공유결합에 의해 연결된다. 구체예에서, 제 1 도메인은 제 2 도메인의 N-말단이다.
구체예에서, N- 및/또는 C-말단 아미노산은 아미드화, 아세틸화, 아실화 또는 당분야에 공지된 다른 변형에 의해 변형될 수도 있다. 구체예에서, 이기능성 호르몬의 아미노 말단 잔기(예를 들면, 펩티드의 N-말단에 자유 아미노기)가 변형(즉, 분해에 대항하여 보호를 위해)된다. 구체예에서, 변형은 C2-C16 아실기로 아실화된다. 추가 구체예에서, 변형은 아세틸화이다.
구체예에서, 상기 이기능성 호르몬의 카르복시 말단 잔기(예를 들면, 펩티드의 C-말단의 자유 카르복시기)는 변형(예를 들면, 분해에 대항하여 보호를 위해)된다. 구체예에서, 변형은 아미드화이다.
구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 100개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 90개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 80개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 70개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 50개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 40개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 30개 또는 그 미만의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 약 20개 내지 약 30개의 아미노산을 포함한다.
구체예에서, 이기능성 호르몬은 다음을 포함한다:
(i) H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 61 );
(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 62);
(iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 63);
(iv) H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 64);
(v) M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 12와 28의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 65);
(vi) H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 66);
(vii) H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다 (SEQ ID NO: 67);
(viii) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W,
이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다 (SEQ ID NO: 68); 또는
(ix) E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
이때 위치 11과 27의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 69);
이때 f는 D-페닐알라닌이다.
구체예에서, 이기능성 호르몬은 다음으로 구성된다:
(i) Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,
이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 31);
(ii)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y- NH2,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 33);
(iii) Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,
이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 34);
(iv)Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F- R-Y-NH2,
이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 35);
(v)
M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때 위치 12와 28의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 36);
(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R- Y-NH2,
이때 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 38);
(vii) Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
이때 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 39);
(viii) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W- NH2,
이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 40); 또는
(ix)Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F- R-Y-NH2,
이때 위치 11과 27의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 42);
이때 Ac는 아미노 말달 아세틸화를 나타내고;
NH2는 카르복시 말단 아미드화를 나타내고; 그리고 f는 D-페닐알라닌이다.
본 발명에는 추가적으로 상기 언급된 이기능성 호르몬의 약리학적으로 수용가능한 염도 포함된다.
본 발명의 이기능성 호르몬은 이기능성 호르몬을 인코드하는 핵산을 포함하는 숙주세포에서 발현에 의해(재조합 발현) 또는 화학적 합성(예를 들면, 고형-상 펩티드 합성)에 의해 만들어질 수 있을 것이다. 펩티드는 당분야에 공지된 자동화된 고형상 과정에 의해 바로 합성될 수 있다. 적절한 합성은 "T-boc" 또는 "Fmoc" 과정을 이용하여 실행할 수도 있다. 고형상 합성을 위한 기술 및 과정은 Solid Phase Peptides Synthesis: A Practical Approach, by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL, Oxford University Press, 1989에서 설명하고 있다. 대안으로, 펩티드는 단편 응축 방법으로 준비할 수도 있는데, 예를 들면, Liu et al, Tetrahedron Lett. 37: 933-936, 1996; Baca et at., J. Am. Chem. Soc. 117: 1881-1887, 1995; Tarn et al., Int. J. Peptide Protein Res. 45: 209-216, 1995; Schnolzer and Kent, Science 256: 221-225, 1992; Liu and Tarn, J. Am. Chem. Soc. 116: 4149-4153, 1994; Liu and Tarn, Proc. Natl. Acad. ScL USA 91: 6584-6588, 1994; and Yamashiro and Li, Int. J. Peptide Protein Res. 31 : 322-334, 1988)에서 설명하고 있다. 펩티드를 합성하는데 유용한 다른 방법들은 Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092, 1985.에서 설명하고 있다. 상업적 펩티드 합성 서비스 공급업체들을 이용하여 D- 또는 L- 형태의 합성 펩티드를 준비할 수도 있을 것이다. 이와 같은 공급업체에는 예를 들면, Advanced ChemTech (Louisville, Ky.), Applied Biosystems (Foster City, Calif.), Anaspec (San Jose, Calif.), 그리고 Cell Essentials (Boston, Mass.)가 포함된다. 유전자 코드에 의해 인코드되는 자연 발생 아미노산을 포함하는 펩티드 및 펩티드 유사체는 표준 방법들을 이용한 재조합 DNA 기술을 이용하여 준비할 수도 있을 것이다. 재조합 기술에 의해 만들어진 펩티드들을 당분야에 공지된 방법들을 이용하여 변형시킬 수도 있다[예를 들면, N-말단 아실화[아세틸화], C-말단 아미드화, 펩티드내에 루프의 고리화/형성[예를 들면, Cys 잔기들 사이에 이황화결합의 형성을 통하여]. 따라서, 구체예에서, 여기에서 설명하는 이기능성 호르몬에 유전자 코드에 의해 인코드된 자연 발생 아미노산을 포함하는 경우, 이기능성 호르몬은 재조합 방법을 이용하여 만들어질 수 있고, 그리고 구체예에서, 금방 명시한 변형(예를 들면, 아실화, 아미드화, 고리화)을 받게 될 수도 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 이기능성 호르몬을 인코드하는 핵산을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 상기 언급된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포(예를 들면, 숙주 세포)를 제공한다. 본 발명은 또한 예를 들면, 상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 펩티드 또는 이기능성 호르몬의 발현/생산을 위하여 당분야에 공지된 배양 배지, 생산, 분리 및 정제 방법을 이용하여 재조합 발현 시스템, 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
이와 같은 벡터는 하나 또는 그 이상의 전사 조절 서열에 작용가능하도록 연결된 이와 같은 펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 구체예에서, 펩티드는 정제를 실행하는 도메인(예를 들면, His-tag, GST-tag)을 포함하는 융합 펩티드이다. 핵산은 안정적인 또는 일과적인 발현을 위하여 표준 재조합 기술로 발현시키기에 적절한 세포내로 도입될 수도 있다. 본 발명의 핵산 분자들에는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 두 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 임의 사슬이 포함될 수 있다.
"재조합 발현"은 재조합 기술에 의한 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들면, 이기능성 호르몬)의 생산을 말하는데, 이때 일반적으로 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 적절한 발현 벡터내로 삽입시키고, 이 벡터를 다시 숙주 세포로 형질도입/형질감염시켜 단백질을 생산한다. 단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때 "재조합"은 분자 생물학적 기술에 의해 만들어진 재조합 핵산 구조물을 이용하여 발현되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 재조합 핵산 구조물은 자연 상태에서는 결찰되지 않은 핵산 서열에 결찰되는 또는 결찰되도록 조작된 또는 자연상태와는 상이한 위치에 결찰되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 따라서, "재조합"핵산 구조물은 핵산 분자가 유전공학에 의해 즉, 인간의 개입에 의해 조작된 것을 말한다. 재조합 핵산 구조물은 예를 들면, 형질도입/형질감염에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 이와 같은 재조합 핵산 구조물에는 동일한 숙주 세포로부터 유도된 서열 또는 상이한 숙주 세포종으로부터 분리되어, 이 숙주 세포로 재도입된 서열이 포함될 수도 있다. 재조합 핵산 구조물 서열은 숙주 세포의 고유한 형질변환의 결과로써 또는 후속적 재조합 및/또는 복구 과정의 결과로써 숙주 세포 게놈내로 통합될 수도 있다.
"벡터"는 벡터에 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 바람직한 벡터의 한 가지 타입은 에피좀 예를 들면, 염색체이외의 복제를 할 수 있는 핵산이다. 적절한 벡터는 벡터에 연결된 핵산의 자가 복제 및/또는 발현이 가능한 것들이다. 작용가능하도록 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 여기에서 "발현 벡터"라고 한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 당분야에 당업자에 공지된 표준 기술에 의해 작제될 수 있고, 예를 들면, Sambrook et a/. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual에서도 찾아볼 수 있다. DNA 단편들의 결찰에는 다양한 전략이 이용될 수 있는데, 이의 선택은 DNA 단편의 말단 성질에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자가 바로 결정할 수 있는 것들이다. 본 발명의 벡터들에는 세균 및 숙주 세포들에서 벡터 증식 및 선별을 용이하게 하는 다른 서열 요소들이 포함될 수도 있다. 또한, 본 발명의 벡터들에는 하나 또는 그 이상의 제한 엔도뉴클라제 부위에 대한 뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있다. 이와 같은 선택성 마커 및 리포터 유전자에 대한 코딩 서열은 당업자에 잘 알려져있다.
본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입시킬 수 있는데, 숙주 세포에는 정의된 재조합 발현 벡터로부터 단백질 코딩 부분을 발현시킬 수 있는 살아있는 세포가 포함될 수도 있다. 살아있는 세포에는 배양된 세포 및 유기체내에 세포가 모두 포함될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 여기에서 호환 사용된다. 이와 같은 용어들은 특정 개체 세포 뿐만 아니라 세포의 후손 또는 잠재적 후손도 의미한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경 영향으로 인하여 후손 세대에도 발생할 수 있기 때문에, 이와 같은 후손은 실제 부모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여기에서 사용된 이 용어의 범위내에는 여전히 포함된다.
벡터 DNA를 통상적인 형질변형 또는 형질감염 기술을 통하여 세포로 도입시킬 수 있다. "형질변형(transformation)" 또는 "형질감염(transfection)"은 숙주 세포내로 외부 핵산을 도입시키는 기술을 말하는데, 인산칼슘염 또는 염화칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-중개된 형질감염, 리포펙션, 전기천공, 마이크로인젝션 또는 바이러스-중개된 형질감염 등이 포함된다. 숙주 세포의 형질변형 또는 형질 감염의 적절한 방법은 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) 및 기타 다른 실험실 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다. 생체내에서 포유류 세포로 DNA를 도입시키는 방법도 공지되어 있는데, 이를 이용하여 유전자 요법을 위해 개체에 본 발명의 벡터 DNA를 운반할 수 있을 것이다.
"전사 조절 서열/요소"는 작용가능하도록 연결된 단백질 코딩 서열을 유도 또는 조절하는 개시 및 종료 시그날, 인헨서, 및 프로모터, 스플라이스 시그날, 폴리아데닐화 시그날과 같은 DNA 서열을 지칭하는 일반적인 용어이다. 제1핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 상관관계에 놓여있을 때, 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열에 "작용가능하도록-연결"된다. 예를 들면, 프로모터는 이 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주면 코딩 서열에 작용가능하도록 연결되어 있다고 한다. 일반적으로, 작용가능하도록-연결된 DNA 서열은 인접되며, 필요에 따라 리딩 프레임내에 두 개 단백질 코딩 부분을 결합시킨다. 그러나, 예를 들면, 인헨서는 일반적으로 몇 kb 거리를 두고 프로모터와 분리되어 있을 때 기능을 하고, 인트론 서열들은 다양한 길이로 존재하고, 일부 폴리뉴클레오티드 요소들은 접해있지는 않지만 작용가능하도록 연결될 수도 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "형질감염" 또는 "형질변환"은 일반적으로 발현 벡터를 통하여, 핵산-중개된 유전자 전달에 의한 수용 세포내로 핵산의 도입을 말한다. 외부 핵산(예를 들면, 외생성 또는 이형성 DNA[가령, DNA 구조체])이 도입되는 세포(예를 들면, 숙주 세포 또는 지시 세포), 조직, 기관 또는 유기체는 "형질변환된", "형질감염된" 또는 "유전자전이된" 것으로 간주한다. 유전자전이된 또는 형질변환된 세포 또는 유기체에는 또한 재조합 핵산 구조의 존재로 인하여 변형된 표현형을 나타내는, 세포 또는 유기체의 후손 및 유전자전이 유기체를 부모로 이용한 번식 프로그램으로부터 생산된 후손이 포함된다. 따라서, 유전자전이 유기체는 이형성 핵산으로 형질변환된 유기체이거나 또는 전이유전자를 포함하는 유기체의 후손이다. 도입된 DNA는 세포 게놈의 염색체 DNA로 통합되거나 또는 에피좀(가령, 플라스미드상에서)으로 유지될 수도 있다 형질감염의 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다(예를 들면, Sambrook et al., 1989, supra; Ausubel et al., 1994 supra).
포유류 세포의 안정적인 형질감염을 위하여, 이용되는 발현 벡터와 형질감염 기술에 따라, 소수의 세포만 게놈내로 외부 DNA를 통합할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 이와 같은 삽입체(integrants)를 확인하고 선별하기 위해, 선별가능한 마커(가령 항생제 저항성)를 관심 유전자와 함께 숙주 세포로 도입시킬 수도 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, "선별가능한 마커"는 지표 세포에 확인가능한 형질을 부여하는 마커로 광범위하게 이용된다. 선별가능한 마커의 비-제한적인 예로, 생존성, 대사, 증식, 형태 및 이와 유사한 것에 영향을 주는 마커들이 포함된다. 바람직한 선별가능한 마커에는 약물에 저항성을 부여하는 것들 예를 들면, G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트 등이 포함된다. 선별가능한 마커를 인코드하는 핵산은 펩티드 화합물을 인코드하는 것과 동일한 벡터상에 존재하며 숙주 세포로 도입되거나 또는 별도 벡터로 도입될 수도 있다. 도입된 핵산에 의해 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 확인될 수 있다(선별가능한 마커 유전자가 결합된 세포는 생존할 것이고, 다른 세포들은 죽는다).
본 발명의 펩티드는 당분야에 공지된 많은 기술에 의해 정제될 수 있는데, 예를 들면, 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이온 교환 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 이와 유사한 것들이 있다.
특정 펩티드 또는 펩티드 유사체를 정제하는데 이용되는 실제 조건등은 합성 전략 및 네트 전하, 소수성, 친수성 및 이와 유사한 것들과 같은 인자들에 따라 부분적으로 달라지고, 이는 당업자들에게 명백할 것이다. 친화력 크로마토그래피 정제의 경우, 펩티드 또는 펩티드 유사체에 특이적으로 결합하는 임의 항체를 이용할 수도 있다. 구체예에서, 상기 언급된 이기능성 호르몬은 실질적으로 순수하다. 화합물은 자연상태에서 수반되는 성분들로부터 분리되었을 때 "실질적으로 순수"한 상태이다. 일반적으로, 화합물은 샘플에 전체 물질의 중량에 대해 최소 60%, 좀더 일반적으로 75%, 적절하게는 90%이상, 더욱 적절하게는 95%이상인 경우에 실질적으로 순수하다. 따라서, 예를 들면, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산된 폴리펩티드는 일반적으로 자연적으로 연합된 성분들이 없을 것이다. 핵산 분자는 본 발명의 DNA를 유도한 유기체의 자연 발생 게놈에 통상적으로 접해있는 코딩 서열에 바로 접해있지 않으면(즉, 공유결합에 의해 연결되지 않으면) 실질적으로 순수하다. 실질적으로 순수한 화합물은 예를 들면, 자연 소스로부터 추출에 의해 수득되거나, 폴리펩티드 화합물을 인코드하는 재조합 핵산의 발현에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 수득할 수도 있다. 순도는 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동, HPLC 등과 같은 임의 적절한 방법을 이용하여 측정할 수 있을 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 이기능성 호르몬 및 약학적으로 수용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물도 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 조성물도 제공하는데, 이 조성물은 상기 설명된 이기능성 호르몬과 약학적으로 수용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 조성물도 제공하는데, 이 조성물은 상기 설명된 이기능성 호르몬과 약학적으로 수용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 개체에서 신장 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 추가로 제공하는데, 이 방법은 (a) 상기 설명된 이기능성 호르몬 또는 (b) 상기 언급된 약학 조성물 중에서 최소한 한 가지의 효과량을 개체로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 개체에서 고혈압을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 추가로 제공하는데, 이 방법은 (a) 상기 설명된 이기능성 호르몬 또는 (b) 상기 언급된 약학 조성물 중에서 최소한 한 가지의 효과량을 개체로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 약물 준비를 위하여 상기 언급된 이기능성 호르몬의 용도에 관계한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 조제에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 약학적 조성물중 최소 하나를 이용하는 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 약학적 조성물중 최소 하나를 이용하는 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 조제에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 약학적 조성물중 최소 하나를 이용하는 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료에 (a) 상기 언급된 이기능성 호르몬, 또는 (b) 상기 언급된 약학적 조성물중 최소 하나를 이용하는 용도를 제공한다.
"효과량"은 예방 및/또는 치료의 원하는 결과(가령, 신장 질환의 예방 및/또는 치료)를 얻기 위해, 필요한 시간 동안, 약량으로 효과가 있는 양을 말한다. 본 발명의 화합물의 효과량은 개체의 질병 단계, 나이, 성별, 체중과 같은 인자에 따라, 그리고 개체에서 원하는 반응을 유도하는 화합물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 약량 섭생은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있을 것이다. 효과량은 또한 치료요법적 유익성이 화합물의 임의 독성 또는 결정적인 효과를 압도하는 양이 된다. 임의 특정 개체에서, 특정 약량 섭생은 필요 개체에 따라 그리고 조성물을 투여하는 또는 투여를 감독하는 전문인의 판단에 따라 시간을 두고 조정할 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 수용가능한 캐리어" 또는 "부형제"에는 임의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균 및 항곰팡이제, 등장액 및 흡수 지연제, 그리고 생리학적으로 양립하는 이와 유사한 것들이 포함된다. 구체예에서, 캐리어는 장관외 투여에 적절하다. 장관외 투여용 조제물은 예를 들면, 부형제, 멸균수 또는 염, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일 또는 수소화된 나프탈렌을 포함할 수 있다. 생체적합한, 생분해가능한 폴리머, 락티드/글리코락티드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머는 화합물의 방출을 제어하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물/조성물에 대한 다른 잠재적 유용한 장관외 운반계에는 에틸렌비닐 아세테이트 코폴리머 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템 및 리포좀이 포함된다. 대안으로, 캐리어는 정맥내, 복막내, 근육내, 설하 또는 경구 투여에 적합할 수도 있다. 약학적으로 수용가능한 캐리어에는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 준비를 위한 멸균 분말과 멸균 수용액 또는 분산액이 포함된다. 약학적 활성 성분에 대한 이와 같은 매질과 물질의 이용은 당분야에 잘 공지되어 있다. 활성 화합물과 임의 통상의 매질 또는 물질이 서로 맞지않는 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서 이들의 사용도 고려된다. 보조적인 활성 화합물도 조성물에 포함될 수 있다.
구체예에서, 상기 언급된 신장 질환은 급성신손상이다. 여기에서 사용된 것과 같이, "신장 손상(kidney injury)"은 "신손상(renal injury)과 등가이며, 호환된다. 또 다른 구체예에서, 상기 언급된 신장 질환은 수술후 신장 손상 또는 기능이상이다. 한 구체예에서, 상기 언급된 수술후 신장 손상 또는 기능 이상은 판막 성형을 위한 심폐 바이패스 수술, 대동맥류(aortic anurysm), 기관 이식, 개심술(open heart surgery) 또는 관상동맥이식술로 결과된 것이다.
구체예에서, 상기 언급된 투여는 정맥 주입이다. 추가 구체예에서, 상기 언급된 정맥 주입은 약 1 ng/kg/min 내지 약 10 ㎍/kg/min의 속도로 주입된다. 구체예에서, 상기 언급된 처리는 하나이상의 활성제/치료제(가령 복합)를 이용/투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 예방제/치료제 및/또는 조성물의 복합은 임의 통상의 약형으로 투여 또는 공동-투여(가령, 연속적으로, 동시에, 상이한 시간대에)될 수 있다. 본 발명의 내용에서 공동-투여는 개선된 임상적 결과를 얻기 위해 협력 치료 과정에서 하나이상의 치료제를 투여하는 것을 말한다. 이와 같은 공동-투여는 동일한 시간에 걸쳐, 즉, 시간이 겹쳐지는 기간 동안에 일어날 수도 있다. 예를 들면, 제1물질은 환자에 제2물질이 투여되기 전, 동시에, 전과 후 또는 투여된 후에 투여될 수도 있다. 물질들은 단일 조성물에 복합되거나 조제되어 동시에 투여된다. 구체예에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 활성 물질은 문제의 질환(가령, 신장질환, 고혈압)을 예방 또는 치료하기 위해 현재 이용되는 하나 또는 그 이상의 물질과 복합하여 이용/투여된다.
본 발명은 또한 신장 질환 또는 고혈압을 예방 및/또는 치료를 위한 상기 언급된 이기능성 호르몬 또는 상기 언급된 조성물이 개체에서 설명서와 함께 포함된 키트 또는 패키지를 추가로 제공한다.
구체예에서, 상기 언급된 개체는 포유류, 추가 구체예에서, 사람이 된다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명된다.
실시예 1: 이기능성 호르몬의 제조
고형상 합성
본 발명의 이기능성 호르몬은 적절하게 측쇄가 보호된 플루오레닐메톡시카르 보닐-보호된 알파-아미노산과 벤지하이드릴아민(BHA) 수지(BACHEM AG)를 이용하여, 0.75 mmol/g 로딩으로 매뉴얼 고형성 펩티드 합성을 이용하여 만들었다.
아미노산을 커플링하기 전에, 6-아미노헥사논산과 Rink 링커를 수지에 결합시키고, Fmoc-[9H-플루오렌-9-yl메톡시카르보닐] 보호된 아미노산을 [2-(6-클로로-1H-벤조트라졸-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸라미니움 헥사플루오르포스페이트] (HCTU) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA)/N,N-디메틸포름아미드(DMF)를 이용하여 1시간 동안 결합시켰다. Fmoc 탈보호는 20% (v/v) 피페리딘/DMF를 이용하여 1시간 동안 실행하였다. 아세트 무수물 및 DIEA를 이용하여 본 발명의 펩티드를 아세틸로 N-캐핑(capping)시키는 일반 과정을 실행하였다. 합성이 완료된 후, 펩티드를 고형상으로부터 절단하는데, 동시에 측쇄 탈보호도 실시하였다. 정제안된 선형 펩티드는 예비 RP-HPLC를 이용하여 Vydac™ C18-컬럼상에서 0.1% TFA(트리플로오르 아세트산)에서 아세토니트릴 그라디언트를 이용하여 추가 정제시켰다. 펩티드를 진공-건조시켜 아세토니트릴을 제거하고, 0.1% TFA로부터 동결건조시켰다. 순도는 분석용 HPLC를 이용하여 평가하고, Voyager™ 기구(PerSeptive Biosystems Inc.)를 이용하여 Matrix Assisted Laser Desorption/ionisation Mass Spectromety (MALDI-TOF MS) 분석을 통하여, 질량을 결정하였다.
고리 펩티드( 디설파이드 )에 선형 펩티드의 산화성 고리화반응
선형 펩티드는 약 1mg/㎖의 농도로 20% DMSO/HCl 1M(v/v)의 용액에 용해시켰다. 산화 반응 과정은 분석용 C18 RP-HPLC을 이용하여 모니터하였다. 반응은 12시간 후에 종료되었다. 용액을 예비 C18 RP-HPLC를 이용하여 정제하였다. 순도는 분 석용 HPLC를 이용하여 측정하였고, Voyager™ 기구(PerSeptive Biosystems Inc.)를 이용하여 MALDI-TOF MS 분석으로 질량을 측정하였다.
수지상에서 락탐에 고리화
선형 서열을 어셈블링한 후, 글루타민산과 리신 측쇄의 직각 보호기, 즉, Glu(γ-O-All) 및 Lys(ε-N-Aloc) 보호기 각각을 팔란디움(O) 촉매를 이용하여 제거하였다. 측쇄 보호기를 제거한 후(Kaiser 테스트를 이용하여 확인함), 자유 아미노 및 카르복실 측쇄는 [(7-아자벤조트리아졸-1-yl) 옥시트리스-(피롤리디노)포스포니움 헥사플루오르포스페이트](PyAOP) DMF 용액으로 처리하여 고리화시켰다. 네가티브 Kaiser 테스트를 얻을 때까지 고리화 조건을 반복하였다.
상이한 이기능성 호르몬을 합성하여 이를 표 4에서 나열하였다.
Figure 112009075628966-PCT00005
Figure 112009075628966-PCT00006
Ac = N-말단 아세틸화
NH2 = C-말단 아미드화
f = D-페닐알라닌
[ ] = 디설파이드 다리 또는 락탐 다리를 통하여 고리화된 펩티드
"["의 우측 아미노산은 "]"의 좌측 아미노산과 다리를 형성한다.
이기능성 호르몬의 상기 각 서열에서 밑줄 부분은 제 1 도메인(α-MSH 활성)이며, 제2도메인(나트륨이뇨 활성)을 나타내는 부분은 밑줄이 없는 부분.
실시예 2: 이기능성 호르몬의 활성
ANP 수용체-발현 LLC-PK1 세포와 MCR1 수용체-발현 B16-F1 세포상에서 이기능성 호르몬을 테스트하였다. 이들 세포 타입을 자극 전 24시간에 96-웰 플레이트상에서 1.0 x 105 cells/㎖의 농도로 배양하였다. 자극 전에 세포는 DPBS만으로 2시간 굶기고, 검사 완충액(20 mM HEPES, 0.1 % BSA 및 500 μM IBMX을 포함하는 DPBS)에 10분간 배양시켰다. 이기능성 호르몬의 약량 반응 곡선은 30분간 10-6M부터 10-12M의 농도로 실행하였다. 상층액을 수거하고, cAMP (B16-F1) 또는 cGMP (LLC-PK1)는 방사능라벨된 키트(GE Healthcare Company)를 이용하여 측정하였다. 이 실험 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Figure 112009075628966-PCT00007
Figure 112009075628966-PCT00008
NR = 감지된 반응 없음
NT = 테스트안됨
실시예 3: 쥐의 평균 동맥 압력(MAP)상에 이기능성 호르몬의 효과
이기능성 호르몬의 in vivo 약학을 연구하기 위하여, MAP(가령 저혈압 효과)상에 이들의 효과를 화합물의 약량을 증가시키면서 정맥 주사하는 것과 연관된 프로토콜로 측정하였다.
동물. Sprague-Dawley (SD) 쥐(수컷, 300 내지 330g의 체중)를 Charles River Inc로부터 구하였다. 동물은 12:12 명암 사이클하에 표준 음식으로 유지시켰다.
외과적 준비. 실험 동안 이소플루란 2.5%로 쥐를 마취시켰다. 동물은 온도를 37.5℃로 유지시키기 위해 온열 복사기(radiant warmer)하에 두었다. 멀티채널 리코더(TA240 Gould)에 연결된 압력 변환기(Statham™)로 지속적으로 동맥의 압력을 기록하기 위해 카테테르를 경동맥에 연결시켰다(Polyethlyene™ Tubing PE90). 약물 투여를 위해 캐뉼러를 우측 경정맥에 꽂았다(Polyethylene™ Tubing PE90). 외과적으로 준비한 후, 실험 프로토콜을 시작하기 전에 30분 정도의 안정화 시간을 허용하였다. 이 시간 동안, 혈압의 안정성을 평가하였다. 경정맥을 통하여 정맥주사(intravenous bolus) 로 펩티드를 투여하였다.10㎍/㎏, 20㎍/㎏, 40㎍/㎏ 및 100㎍/㎏의 약량을 주사하였다. 각 약량 주사 사이에 15분의 간격을 두었다.
약량 용액의 준비. 펩티드, SEQ ID NO: 2 (고유 ANP, 도면에서 #2) 및 이기능성 호르몬, SEQ ID NO: 33 (도면에서 #33)는 100㎍/㎖의 농도로 염 용액에서 매일 새로 준비하였다. 살균 염 용액에서 적절하게 펩티드를 희석하여 경정맥으로 주사전에 약량을 10-100㎍/㎏이 되도록 하였다. 펩티드를 시간당 30㎍/㎏으로 주입하기 위해, 원액의 희석액(100㎍/㎖)을 0.1% 사람 혈청 알부민(HSA)에서 만들고, 경정맥에 이식된 카테테르(PE-90)을 통하여 실험이 종료될 때까지 시간당 1㎖의 속도로 주입하였다.
결과. 도 1A에서 볼 수 있는 것과 같이, 고유 ANP (SEQ ID NO: 2)는 1㎍/㎏ 속도의 정맥주사에서도 MAP가 감소하는 반면, 이기능성 호르몬 (SEQ ID NO: 33)는 최고 20㎍/㎏의 약량에서도 관용되었다. 따라서, 이기능성 호르몬 (SEQ ID NO: 33)은 고유 ANP보다 더 높은 약량에서도 관용된다. 주입 섭생에서 효과를 연구하기 위하여, 펩티드의 단일 약량(30㎍/kg/h)을 정맥 주입으로 투여하였다. 도 1B에서 볼 수 있는 것과 같이, 고유 ANP 펩티드 (SEQ ID NO: 2)는 MAP를 신속하게 낮추지만, 동일한 약량에서 이기능성 호르몬 (SEQ ID NO: 33)의 연속 주입은 여전히 관용되었다.
실시예 4: SD 쥐에서 고혈압에 대한 이기능성 호르몬의 효과
BNP (Natrecor®)는 혈압이 올라가는 위기에서 혈압을 낮추기 위해 FDA의 승인을 받았다. 이의 천연 유사체, ANP 또한 신속하게 혈압을 낮추는 것으로 나타났고, 이는 혈압이 올라가는 위기 상황에서 치료제로 유용하다. 레닌-앙지오텐신 시스템의 활성화는 고혈압과 연관이 있는 몇몇 의학 징후에 관련된다. 따라서, 앙지오텐신 II을 지속적으로 주입하여 혈압을 상승시킨 쥐 모델을 이용하고, 혈압을 낮추는데, 고유 ANP (도면에서 #2 펩티드)와 이기능성 호르몬, SEQ ID NO: 33 (도면에서 #33 펩티드)의 효과/영향을 SD 쥐에서 펩티드의 정맥 주사후에 테스트하였다.
동물. Sprague-Dawley (SD) 쥐(수컷, 300 내지 330g의 체중)를 Charles River Inc로부터 구하였다. 동물은 12:12 명암 사이클하에 표준 음식으로 유지시켰다.
외과적 준비. 실험 동안 이소플루란 2.5%로 쥐를 마취시켰다. 동물은 온도를 37.5℃로 유지시키기 위해 온열 복사기(radiant warmer)하에 두었다. 멀티채널 리코더(TA240 Gould)에 연결된 압력 변환기(Statham)로 지속적으로 동맥의 압력을 기록하기 위해 카테테르를 경동맥에 연결시켰다(Polyethlyene™ Tubing PE90). 약물 투여를 위해 캐뉼러를 우측 경정맥에 꽂았다(Polyethylene™ Tubing PE90). 또한, 꼬리 정맥에도 살수 펌프(Harvard Apparatus)에 의해 지속적으로 앙지오텐신 II를 주입하기 위해 카테테르를 연결하였다(Blood Collection Set 25G3/4 x 12", Becton Dickinson). 외과적으로 준비한 후, 실험 프로토콜을 시작하기 전에 30분 정도의 안정화 시간을 허용하였다. 이 시간 동안, 혈압의 안정성을 평가하였다. 꼬리 정맥으로 앙지오텐신 II(5㎍/㎏/h)을 정맥주사하여 고혈압을 유도하였다. 혈압이 안정적이 되도록 하기 위해, 앙지오텐신 II 주입후 30분 시점후에, 경정맥을 통하여 정맥주사(intravenous bolus)로 펩티드를 투여하였다. 100㎍/㎏, 200㎍/㎏, 300㎍/㎏, 400㎍/㎏ 및 500㎍/㎏의 약량을 주사하였다. 각 약량 주사 사이에 15분의 간격을 두었다.
약량 용액의 준비. 앙지오텐신II는 100㎍/㎖ 농도로 염을 이용하여 매일 새로 준비하였다. 5㎍/㎏/h 의 앙지오텐신II을 주입하기 위해, 2시간 주입(1㎖/h)을 위해 2㎖ 염에 30㎕ 앙지오텐신II(100㎍/㎖)를 넣었다. 펩티드(#2, #33)도 100㎍/㎖의 농도로 염 용액에서 매일 새로 준비하였다. 살균 염 용액에서 적절하게 펩티드를 희석하여 0.2㎖ 주사용액에서 약량을 10-100㎍/㎏이 되도록 하였다.
결과. 도 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 앙지오텐신II 주입으로 약 10-15%(Ang)정도 기저 혈압(Bas)을 신속하게 상승시켰다. 고유 ANP (SEQ ID NO: 2)는 100㎍/㎏의 약량에서 신속하게 혈압을 정상화시켰고, 더 높은 약량(가령, 200-500㎍/㎏)에서는 저혈압을 유도하였다. 이기능성 호르몬 (#33)은 최고 300㎍/㎏의 약량에서도 저혈압을 유도하지 않았고, 400㎍/㎏ 또는 그 이상의 약량에서, 이기능성 호르몬은 ANP와 유사한 효과를 가졌다.
실시예 5: 신장 허혈 후에 급성신장기능이상에 대한 이기능성 호르몬의 예방 처리 효과
신장 허혈후 (30-60분간 한쪽 또는 두쪽 신장 동맥을 클램핑하여 동물모델에서 만듬) 급성신손상으로 혈류 감소를 유도하는 신장 도관 수축, 뇨에서 도관 마커의 상승을 포함하는 상피 손상, 그리고 손상 부위에 호중구 및 단세포의 침윤과 IL-1와 같은 사이토킨의 분비 후에 아팝토시스 및 염증을 복합적으로 유도한다.
동물. Sprague-Dawley (SD) 쥐(수컷, 300 내지 330g의 체중)를 Charles River Inc로부터 구하였다. 동물은 12:12 명암 사이클하에 표준 음식으로 유지시켰다.
외과적 준비. 실험 동안 이소플루란 2.5%로 쥐를 마취시켰다. 동물은 온도를 37.5℃로 유지시키기 위해 온열 복사기(radiant warmer)하에 두었다. 신장 동맥 클램핑 전에 꼬리 정맥을 통하여 혈액 샘플(0.5㎖)을 수거하였다. 동물은 일단 마취시키고, 반듯히 누이고, 복벽의 우측에 1.5cm 옆구리 절개를 만들었다. 우측 신장을 노출시키고, 수뇨관, 신장 동맥 및 정맥을 조심스레 절개하여 결찰시켰다. 신장 육경(pedicle)을 절단한 후, 신장을 제거하였다. 복벽의 좌측에도 동일한 절개를 만들었다. 좌측 신장을 노출시키고, 신장 도관 육경을 조심스레 절단한다. 신장 도관 육경에 도관 클립(Micro Serrefine™, Fine Science Tools)을 배치시켜 30분 또는 45분간 차단시켰다. 신장 도관 육경 클램핑으로 급성 신장 동맥 폐색 (RAO)을 발생시켰다. 허혈 및 도관 클립을 제거한 후 양호한 재관류에 대해 신장을 2분간 면밀히 살폈다. 복벽 상처는 2개 층으로 봉합하였다. 근육 층은 3-0 실크로 꿰메고, 피부는 봉합 클립(Fine Science Tools)으로 봉하였다. 우측 신적출과 좌측 신장 동맥 클립핑 과정후 21시간 시점에, 뇨 수거(사전 무게를 측정한 Tube 50㎖)를 위해 3시간 동안 대사 우리에 쥐를 넣어두었다. 그 다음 동물을 이소플루란 2.5%로 마취시켰다. 좌측 신장을 제거하고, 앞으로 조직 검사를 위해 포르말린에 유지시켰다. 심장에 구멍을 뚫어 헤파린처리된 주사기(3㎖)에 채혈하고, 항응고제로 헤파린을 포함하는 라벨을 붙인 튜브에 바로 옮겼다. 수거후, 모든 혈액 샘플을 얼음위에 두고, 13000rpm에서 2분간 원심분리하였다. 혈장과 뇨 몇방울(400㎕)을 빼내, -80℃에 보관하였다.
약량 용액의 준비: 펩티드(#2 및 #33)는 100㎍/㎕의 농도로 0.1% HSA 염 용액 (33㎕의 30 % HSA /9.967㎕ 염)에서 매일 새로 준비하였다. 15㎍/kg/h 주입을 위해, 2시간 주입용으로(1㎖/h) 0.1% HSA 염 2㎖에 9㎕ 펩티드 (100㎍/㎕)를 넣었다.
결과. 도 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 혈장 크레아티닌과 요소 수준은 염 처리된 대조군에서는 시간-의존적 방식으로 상승하였다. 이들 두 펩티드는 각 시간대에 크레아티닌 및 혈중 뇨질소(BUN)의 혈중 농도의 상승을 상당히 감소시켰다. 따라서, 이기능성 호르몬 (#33)은 예방용도로 사용하였을 때 신장 손상을 감소시키는데 고유 ANP (#2)와 마찬가지로 효과가 있다.
실시예 6: 신장 허혈후에 급성신장기능이상에 대한 이기능성 호르몬으로 손상후 치료 효과
손상후 펩티드의 단기 주입(치료요법적 처리)이 신장 손상을 감소시키는데 유익한지를 확인하기 위하여, 펩티드 #2 또는 #33를 신장 동맥 클램프 제거후 2시간 동안 15㎍/㎏/h로 주입하였다. 상이한 시간대에 혈장 크레아티닌 및 요소를 결정하였다. 동물 모델 및 약량 용액은 상기 실시예 5에서 설명하는 것과 동일하게 준비하였다.
결과. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 혈장 크레아티닌 및 BUN 수준은 시간-의존적 방식으로 염 처리된 대조군에서 증가되었다. 두 펩티드는 4시간째에 크레아티닌 및 BUN의 상승을 저해하였으나 그 이후시점(가령, 21시간 및 27시간)에 이기능성 호르몬 (#33)은 신장 허혈후 크레아티닌 및 BUN 수준을 감소시키는데 있어서, 고유 ANP (#2)보다 더 효과적이었다.
실시예 7: 신장 허혈후 급성 신장 기능이상에 대한 이기능성 호르몬의 장기 주입의 효과
손상후 펩티드의 장기 주입이 신장 손상을 감소시키는데 유익한지를 확인하기 위하여, 펩티드 #2 또는 #33를 신장 동맥 클램프 제거후 24시간 동안 1.5 또는 15㎍/㎏/h로 주입하였다. 손상 후 24시간 째에 혈장 크레아티닌 및 뇨질소를 결정하였다. 실험 과정(동물 모델, 약량 용액)은 상기 실시예 5에서 설명하는 것과 동일하게 준비하였다.
결과. 고유 ANP (#2) 및 이기능성 호르몬 (#33)은 24시간 주입후 염-처리된 대조군 동물과 비교하였을 때, 혈장 크레아티닌 및 BUN을 상당히 감소시켰다(도 5). 이들 두 펩티드는 신장 허혈의 혈액 마커들을 약량-의존적인 방식으로 감소시켰다. 크레아티닌 및 BUN 수준의 좀더 명확한 감소로 증거되는 것과 같이, 신장 손상 결과를 개선시키는데 있어서, 고유 ANP보다는 이기능성 호르몬 #33가 더 효과적이었다(도 5).
실시예 8: 신장 허혈후 염증 및 급성 신장 손상 마커들에 대한 이기능성 호르몬으로 처리한 효과
신장 허혈은 IL-1β, IL-18, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 및 CD11b (호중구 마커: 조직의 호중구 침윤의 증거)와 같은 염증 마커들의 발현 증가를 유도할 뿐만 아니라, 관상피마커, 예를 들면, KIM-1, NGAL 및 NAG의 발현증가를 유도하였다. 이들 마커들은 혈청 크레아티닌 수준의 관찰된 상승보다 더 초기에 발현되기 때문에 이들 마커들이 상당한 관심을 받고 있다. 따라서, 이들 마커에 근거하여 급성신손상으로 진단하면, 환자를 더 빨리 치료할 수 있고, 이는 투석의 필요 및 치사율에 근거하여 더 나은 결과를 얻을 수 있다. 실시예 5에서 설명된 동물 모델을 이용하여 염증 마커 및 도관 손상 마커들의 발현에서 이기능성 호르몬 #33의 효과를 평가하였다.
약량 용액의 준비. 펩티드 #33를 Alzet™ 미니펌프를 이용하여 15㎍/㎏/h의 속도로 24시간 동안 주입하였다.
웨스턴 블랏팅. 새로운 신장들을 신속하게 절개하여, 얼음 냉각된 용해 완충액(20mM Tris, 135 mM NaCl, 1% NP-40™, 0.1% SDS, Complete-Mini Protease Inhibitor Cocktail™ (Roche)을 포함하는 10% 글리세롤)으로 균질화시켰다. 얼음위에 15분 항온처리한 후에, 샘플은 40℃, 13,000rpm에서 원심분리하여, 용해된 단백질 추출물을 포함하는 상청액을 수거하였다. 단백질 샘플(40㎍ 단백질)은 10% SDS폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 해리하고, PVDF 막(Amersham, Pharmacia)으로 이동시켰다. 실온에서 1시간 동안 5% 탈지유/TBST (10mM Tris, 150 mM NaC, 0.2% Tween-20) 용액에서 막을 항온처리하여 비-특이적 결합을 제거하였다. 그 다음 막을 1차 항체[항-KIM-1 (1:400; RD Systems), 항-IL-1β (1:500; Calbiochem), 항-NGAL (1:500; Santa-Cruz Biotech), 항-CD11b/c (1:400; Abeam)] 또는 단클론 항-β-악틴 (0.5 Ag/ml Sigma)와 함께 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. TVST로 연속하여 막을 세척하고, 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 2차 항체(0.5㎍/㎖, Amersham Pharmacia, Baie d'Urfe, QC)로 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 블랏은 화학적발광시약(ECL™, Amersham Pharmacia)으로 처리하고, X-OMAT™ (Kodak) 이미지 필름에 노출시켰다.
결과. 도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 30분간의 신장 클램핑으로 CD11b/c, KIM-1 및 IL-1β (손상)의 강력한 발현을 유도하였다. 이기능성 호르몬 (#33) 의 지속적인 주입으로 이들 마커들의 발현이 감소되었고, 이는 허혈후에 신장 손상 및 염증을 감소시키는데 이의 효과를 보여주는 것이다.
본 발명은 특정 구체예를 통하여 상기에서 설명되었지만, 본 발명의 요지(청구범위에서 정의된)와 범위를 벗어나지 않고 변형될 수도 있다.
<110> THERATECHNOLOGIES INC. PERI, Krishna HABI, Abdelkrim <120> BIFUNCTIONAL HORMONE AND USES THEREOF <130> IP-635-CA <150> US 60/948,292 <151> 2007-07-06 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <400> 1 Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 10 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (7)..(23) <400> 2 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (11)..(27) <400> 3 Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (10)..(26) <400> 4 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu 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19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Nle <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> The glutamic acid residue at position 2 forms a lactam bridge with the lysine residue at position 13 <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220> <221> PEPTIDE <222> (13) <223> The lysine residue at position 13 forms a lactam bridge with the glutamic acid residue at position 2 <220> <221> PEPTIDE <222> (17) <223> Xaa at position 17 = D-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (19) <223> AMIDATION <400> 29 Xaa Glu His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Ser Lys Tyr Arg His 1 5 10 15 Xaa Arg Trp <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (9)..(20) <220> <221> MOD_RES <222> (22) <223> AMIDATION <400> 30 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Glu 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D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (9)..(25) <220> <221> MOD_RES <222> (30) <223> AMIDATION <400> 33 His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg 1 5 10 15 Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> DISULFID <222> (9)..(20) <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Nle <220> <221> MOD_RES <222> (22) <223> AMIDATION <400> 34 His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Cys Tyr Arg 20 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine 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Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg 20 25 30 Tyr <210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> DISULFID <222> (10)..(26) <220> <221> MOD_RES <222> (31) <223> AMIDATION <400> 38 His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (10)..(26) <220> <221> MOD_RES <222> (31) <223> AMIDATION <400> 39 His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> DISULFID <222> (7)..(23) <220> <221> PEPTIDE <222> (30) <223> Xaa at position 30 = D-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (32) <223> AMIDATION <400> 40 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr His Xaa Arg Trp 20 25 30 <210> 41 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> DISULFID <222> (11)..(27) <220> <221> MOD_RES <222> (32) <223> AMIDATION <400> 41 Glu His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 42 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> Xaa at position 3 = D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (11)..(27) <220> <221> MOD_RES <222> (32) <223> AMIDATION <400> 42 Glu His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 43 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> DISULFID <222> (8)..(24) <220> <221> MOD_RES <222> (29) <223> AMIDATION <400> 43 His Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile 1 5 10 15 Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (9)..(22) <220> <221> MOD_RES <222> (27) <223> AMIDATION <400> 44 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Gly Ala 1 5 10 15 Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 45 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (14)..(30) <220> <221> MOD_RES <222> (36) <223> AMIDATION <400> 45 His Xaa Arg Trp Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly 1 5 10 15 Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val 20 25 30 Leu Arg Arg His 35 <210> 46 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic bifunctional hormone <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 = D-phenylalanine <220> <221> DISULFID <222> (14)..(30) <220> <221> MOD_RES <222> (36) <223> AMIDATION <400> 46 His Xaa Arg Trp Gly Pro Lys Pro Val Gln Gly Ser Gly Cys Pro Gly 1 5 10 15 Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val 20 25 30 Leu Arg Arg His 35 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1) <223> Xaa at position 1 is Met or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is Glu or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> Xaa at position 4 is L-Phe or D-Phe <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> Xaa at position 7 is Gly or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> Xaa at position 8 is Lys or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (9) <223> Xaa at position 9 is Pro or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (10) <223> Xaa at position 10 is Met, Val, Nle or is absent <400> 47 Xaa Xaa His Xaa Arg Trp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is L-Phe or D-Phe <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> Xaa at position 8 is Met, Val or Nle <400> 48 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is L-Phe or D-Phe <400> 49 His Xaa Arg Trp Gly 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> Xaa at position 3 is L-Phe or D-Phe <400> 50 Glu His Xaa Arg Trp Gly 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <400> 51 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <400> 52 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <400> 53 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <400> 54 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <400> 55 His Xaa Arg Trp Gly 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 56 Glu His Phe Arg Trp 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> Xaa at position 3 is D-Phe <400> 57 Glu His Xaa Arg Trp Gly 1 5 <210> 58 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Xaa at positions 1 to 6 correspond to: Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser; Arg-Arg-Ser-Ser wherein Xaa at positions 1 and 2 are absent; Met wherein Xaa at positions 1 to 5 are absent; or Nle wherein Xaa at positions 1 to 5 are absent <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> Xaa at position 8 is His or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (13) <223> Xaa at position 13 is Met or Nle <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(29) <223> Xaa at position 17 to 29 corresponds to: Ser-Cys-Tyr-Arg wherein Xaa at positions 21 to 29 are absent; or Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr <220> <221> DISULFID <222> (7)..(18) <223> When Xaa at position 17 to 29 corresponds to: Ser-Cys-Tyr-Arg and Xaa at positions 21 to 29 are absent, Cys at position 7 and Cys at position 18 are linked via a disulfide bridge <220> <221> DISULFID <222> (7)..(24) <223> When Xaa at position 17 to 29 corresponds to: Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr, Cys at position 7 and Cys at position 24 are linked via a disulfide bridge <400> 58 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 59 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (7)..(23) <400> 59 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (2)..(18) <400> 60 Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu 1 5 10 15 Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <220> <221> DISULFID <222> (9)..(20) <400> 61 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys His Phe Gly Gly Arg Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Cys Tyr Arg 20 <210> 62 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <220> <221> DISULFID <222> (9)..(25) <400> 62 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Met Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg 1 5 10 15 Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220> <221> DISULFID <222> (9)..(20) <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Nle <400> 63 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Cys Tyr Arg 20 <210> 64 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <220> <221> DISULFID <222> (9)..(25) <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Nle <400> 64 His Xaa Arg Trp Gly Lys Pro Xaa Cys Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg 1 5 10 15 Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 65 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (12)..(28) <400> 65 Met Glu His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg 1 5 10 15 Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg 20 25 30 Tyr <210> 66 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (10)..(26) <400> 66 His Phe Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 67 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Xaa at position 2 is D-Phe <220> <221> DISULFID <222> (10)..(26) <400> 67 His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 68 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (7)..(23) <220> <221> PEPTIDE <222> (30) <223> Xaa at position 30 is D-Phe <400> 68 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr His Xaa Arg Trp 20 25 30 <210> 69 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3) <223> Xaa at position 3 is D-Phe <220> <221> DISULFID <222> (11)..(27) <400> 69 Glu His Xaa Arg Trp Gly Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met 1 5 10 15 Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 30 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Nle <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(13) <223> The Glu residue at position 2 and the Lys residue at position 13 are linked by a lactam bridge <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Nle <400> 70 Xaa Glu His Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile Ser Lys Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Xaa at positions 1 to 6 correspond to: Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser; Arg-Arg-Ser-Ser wherein Xaa at positions 1 and 2 are absent; Met wherein Xaa at positions 1 to 5 are absent; or Nle wherein Xaa at positions 1 to 5 are absent <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> Xaa at position 7 is Asp or Glu <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(18) <223> The Asp or Glu residue at position 7 and the Lys residue at position 18 are linked by a lactam bridge <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> Xaa at position 8 is His or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (13) <223> Xaa at position 13 is Met or Nle <400> 71 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile 1 5 10 15 Ser Lys Tyr Arg 20 <210> 72 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Xaa at positions 1 to 6 correspond to: Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser; Arg-Arg-Ser-Ser wherein Xaa at positions 1 and 2 are absent; Met wherein Xaa at positions 1 to 5 are absent; or Nle wherein Xaa at positions 1 to 5 are absent <220> <221> PEPTIDE <222> (7) <223> Xaa at position 7 is Asp, Glu or Cys <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(18) <223> When Xaa at position 7 is Asp or Glu and Xaa at position 18 is Lys, the Asp or Glu residue at position 7 and the Lys residue at position 18 are linked by a lactam bridge <220> <221> PEPTIDE <222> (8) <223> Xaa at position 8 is His or is absent <220> <221> PEPTIDE <222> (13) <223> Xaa at position 13 is Met or Nle <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(29) <223> Xaa at position 17 to 29 corresponds to: Ser-Cys-Tyr-Arg or Ser-Lys-Tyr-Arg wherein Xaa at positions 21 to 29 are absent; or Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr <220> <221> DISULFID <222> (7)..(18) <223> When Xaa at position 17 to 29 corresponds to: Ser-Cys-Tyr-Arg and Xaa at positions 21 to 29 are absent, Cys at position 7 and Cys at position 18 are linked via a disulfide bridge <220> <221> DISULFID <222> (7)..(24) <223> When Xaa at position 17 to 29 corresponds to: Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr, Cys at position 7 and Cys at position 24 are linked via a disulfide bridge <400> 72 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Arg Xaa Asp Arg Ile 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25

Claims (42)

  1. 다음을 포함하는 이기능성 호르몬:
    (a) 알파-MSH 펩티드 또는 단편, 변이체, 또는 단편의 변이체를 포함하는 제 1 도메인, 이때 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 알파-MSH 관련된 호르몬 활성을 가지고; 그리고
    (b) 제 1 도메인에 공유결합으로 연결된 제 2 도메인, 이때 제 2 도메인은 나트륨이뇨(natriuretic) 펩티드 또는 단편, 변이체, 또는 단편의 변이체를 포함하며, 이때, 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성을 가진다.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 도메인은 SEQ ID NO:1 펩티드의 알파-MSH 펩티드이고; 제 2 도메인은 나트륨이뇨 펩티드 관련된 호르몬 활성을 가지는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체이며, 제 2 도메인이 SEQ ID NO: 2, 3, 4 또는 5의 나트륨이뇨 펩티드라면, 제 1 도메인은 알파-MSH 관련된 호르몬 활성을 가지는 단편, 변이체 또는 단편의 변이체인 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 1 도메인은 SEQ ID NO:1 펩티드의 최소 4개 아미노산의 단편 또는 이 단편과 최소 75% 상동성을 가지는 단편의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  4. 제 1 항에 있어서, 알파-MSH 펩티드의 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 최소 75% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 도메인은 다음의 식 I의 아미노산(SEQ ID NO:47)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    X2-H-X1-R-W-X3 (I)
    이때,
    X1은 L-Phe 또는 D-Phe이며;
    X2는 E, M-E 또는 없고;
    X3은 G-K-P-X4, G-K-P, G-K, G 또는 없으며;
    X4는 M, V 또는 Nle이다
  6. 제 3 항에 있어서, 제 1 도메인은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    (i) H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO: 48);
    (ii) M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 17);
    (iii) H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 49);
    (iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO: 50);
    (v) H-X1-R-W (SEQ ID NO: 20); 이때 X1은 L-Phe 또는 D-Phe이며;
    X4는 M, V 또는 Nle이다.
  7. 제 4 항에 있어서, 제 1 도메인은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    (i) H-f-R-W-G-K-P-V (SEQ ID NO: 51);
    (ii) H-f-R-W-G-K-P-M (SEQ ID NO: 52);
    (iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle (SEQ ID NO: 53);
    (iv) H-f-R-W-G-K-P (SEQ ID NO: 54);
    (v) M-E-H-F-R-W-G (SEQ ID NO: 11);
    (vi) H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 55);
    (vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO: 56);
    (ix) E-H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 57); 또는
    (iv) H-f-R-W (SEQ ID NO: 6); 이때 f는 D-페닐알라닌이다.
  8. 제 5 항에 있어서, 제 1 도메인은 다음으로 구성된 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    (i) H-f-R-W-G-K-P-V (SEQ ID NO: 51);
    (ii) H-f-R-W-G-K-P-M (SEQ ID NO: 52);
    (iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle (SEQ ID NO: 53);
    (iv) H-f-R-W-G-K-P (SEQ ID NO: 54);
    (v) M-E-H-F-R-W-G (SEQ ID NO: 11);
    (vi) H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 55);
    (vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO: 56);
    (ix) E-H-f-R-W-G (SEQ ID NO: 57); 또는
    (iv) H-f-R-W (SEQ ID NO: 6); 이때 f는 D-페닐알라닌이다.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 제 2 도메인은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 최소 15개 아미노산의 단편, 또는 이 단편과 최소 75% 상동성을 가지는 단편의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  10. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 나트륨이뇨 펩티드의 변이체는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 최소 75% 상동성을 가지는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르 몬.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 제 2 도메인은 식 II의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 58)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II)
    이때,
    X5는 M, Nle, R-R-S-S, S-L-R-R-S-S, 또는 없고;
    X6는 C이고;
    X7는 H 또는 없고;
    X8은 M 또는 Nle이고;
    X9는 S-C-Y-R 또는 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y이고;
    이때 X6의 C 잔기는 X9의 C 잔기와 이황화결합을 형성하고; 그리고
    X5가 Nle인 경우, 제 1 도메인은 제 2 도메인의 N-말단이 된다.
  12. 제 11 항에 있어서, 제 2 도메인은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    (i) M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
    이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 22);
    (ii) Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
    이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 23);
    (iii) C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 24);
    (iv) C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 25);
    (v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-l-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 5와 21의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 26);
    (vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다((SEQ ID NO: 59); 또는
    (vii) M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 2와 18의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 60).
  13. 제 12 항에 있어서, 제 2 도메인은 다음으로 구성되는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    (i) M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
    이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 22);
    (ii) Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R,
    이때, 위치 2와 13의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 23);
    (iii) C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 24);
    (iv) C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 1과 17의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 25);
    (v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 5와 21의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 26);
    (vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 59); 또는
    (vii) M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 2와 18의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 60)
  14. 제1항 내지 13항중 어느 한 항에 있어서, 제 1 도메인은 제 2 도메인의 N-말단이 되는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  15. 제 1 항 내지 제 14항중 어느 한 항에 있어서, 이기능성 호르몬의 아미노 말단은 C3-C16 아실기로 아실화되는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  16. 제 15 항에 있어서, 이기능성 호르몬의 아미노 말단 잔기는 아세틸화되는 것 을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  17. 제 1 항 내지 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 이기능성 호르몬의 카르복시 말단 잔기는 아미드화(amidated)되는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  18. 제 1 항 내지 제 17항중 어느 한 항에 있어서, 제 1 도메인과 제 2 도메인은 펩티드 결합을 통하여 공유적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬.
  19. 제 1 항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 이기능성 호르몬은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬;
    (i) H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R,
    이때, 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 61);
    (ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 62);
    (iii) H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-l-S-C-Y-R,
    이때, 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 63);
    (iv) H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 64);
    (v) M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 12와 28의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 65);
    (vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 66);
    (vii) H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 67);
    (viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-l-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W,
    이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 68); 또는
    (ix) E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,
    이때, 위치 11과 27의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 69);
    이때 f는 D-페닐알라닌이다.
  20. 제 19 항에 있어서, 이기능성 호르몬은 다음으로 구성된 것을 특징으로 하는 이기능성 호르몬:
    (i) Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,
    이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 31);
    (ii)
    Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
    이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 33);
    (iii) Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,
    이때 위치 9와 20의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 34);
    (iv)
    Ac-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
    이때 위치 9와 25의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 35);
    (v)
    M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
    이때 위치 12와 28의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 36);
    (vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R- Y-NH2,
    이때, 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 38);
    (vii)
    Ac-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
    이때 위치 10과 26의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 39);
    (viii)
    S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W-NH2,
    이때 위치 7과 23의 C 잔기가 이황화결합을 형성한다(SEQ ID NO: 40); 또는
    (ix)
    Ac-E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,
    이때 위치 11과 27의 C 잔기가 이황화결합을 형성하고(SEQ ID NO: 42);
    이때 Ac는 아미노 말달 아세틸화를 나타내고;
    NH2는 카르복시 말단 아미드화를 나타내고; 그리고 f는 D-페닐알라닌이다.
  21. 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬 및 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  22. 개체에서 신장질환 예방 및/또는 치료를 위한 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬.
  23. 개체에서 고혈압 예방 및/또는 치료를 위한 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬.
  24. 개체에서 신장질환의 예방 및/또는 치료용, 제1항 내지 제20항중 어느 한항에 따른 이기능성 호르몬 및 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  25. 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료용, 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬 및 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  26. (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬 또는 (b)제 21 항의 조성물중 최소 하나의 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 신장 질환의 예방 또는 치료 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 신장 질환은 급성신손상인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 신장 질환은 수술후 신장 손상 또는 기능이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 수술후 신장 손상 또는 기능이상은 판막 성형을 위한 심폐 바이패스 수술, 대동맥류(aortic anurysm), 기관 이식, 개심술(open heart surgery) 또는 관상동맥이식술로 결과된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26 항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서, 투여는 정맥 주입인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 정맥 주입은 분당 약 1ng/kg 내지 약 10μg/kg의 속도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬 또는 (b)제 21항의 조성물중 최소 하나의 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 고 혈압의 예방 또는 치료 방법.
  33. 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에 (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬, 또는 (b) 제 21항의 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도.
  34. 개체에서 신장 질환의 예방 및/또는 치료에 (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬, 또는 (b) 제 21항의 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도.
  35. 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료에 (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬, 또는 (b) 제 21항의 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도.
  36. 개체에서 고혈압의 예방 및/또는 치료용 약물 제조에 (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬, 또는 (b) 제 21항의 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도.
  37. 제 33항 또는 제 34 항에 있어서, 신장 질환은 급성신손상인 것을 특징으로 하는 용도.
  38. 제 33항 또는 제 34 항에 있어서, 신장 질환은 수술후 신장 손상 또는 기능이상인 것을 특징으로 하는 용도.
  39. 제 38 항에 있어서, 수술후 신장 손상 또는 기능이상은 판막 성형을 위한 심폐 바이패스 수술, 대동맥류(aortic anurysm), 기관 이식, 개심술(open heart surgery) 또는 관상동맥이식술로 결과된 것인 것을 특징으로 하는 용도.
  40. 제33항 내지 제39항중 어느 한 항에 있어서, 이기능성 호르몬 또는 조성물은 정맥주입에 의한 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 용도.
  41. 제 40항에 있어서, 이기능성 호르몬 또는 조성물은 분당 약 1ng/kg 내지 약 10μg/kg의 속도의 정맥주입에 의한 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 용도.
  42. 약물 제조에 (a) 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 이기능성 호르몬, 또는 (b) 제 21항의 조성물중 최소 한 가지를 이용하는 용도.
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