CZ20002370A3 - Beta-lipotropin a jeho použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká izolovaných nukleových kyselin, vektorů, transformovaných hostitelských buněk, analogů, funkčních fragmentů a fúzovaných proteinů, vztahujících se k betalipotropinu. Řešení se také týká farmaceutických kompozic, obsahujících beta-lipotropin nebo jeho fragment a/nebo funkční analog a jejich použití při léčení diabetů a komplikací s ním spojených.

Description

Beta-lipotropin a jeho použiti

Tato přihláška nárokuje výsledky U.S. předběžných patentových přihlášek č. 60/068,659, podaná 23. prosince 1997; 60/079,857, podaná 30. března 1998; 60/086321, podaná 21. května 1998; 60/091,385, podaná 1. června 1998; 60/095,405, podaná 5. srpna 1998; a 60/103,976, podaná 13. října 1998.

Oblast techniky

Předložený vynález se týká oboru farmacie a medicíny. Předložený vynález se obzvláště týká beta-lipotropinu, jeho fragmentů a analogů, farmaceutických přípravků a způsobů jejich použití pro léčbu diabetů a dalších vztahujících se stavů u savců.

Dosavadní stav techniky

Proopiomelanokortin (POMC) je neuropeptidová prekurzorová molekula, která je translokována do sekrečních drah v neuroendokrinních buňkách. POMC se štěpí působením specifických endopeptidáz a tím vznikají peptidy jako je adrenokortikotrofní hormon (ACTH), beta-lipotropin (BLAT) beta-endorfin a melanocytový stimulační hormon (MSH). Ke zpracování POMC na jeden nebo více specifických peptidů dochází v tkáni a způsobem specifickým pro buňku (viz obecně M. Castro a E. Morrison, Crit. Rev. Neurobiol., 11, 35-57, 1997; Roberts, J. L. a Herbert, E., Proč. Nat. Acad. Sci.,

74, 4826 (1977); Roberts, J. L. a Herbert, E

Proč. Nat.

Acad. Sci. 74, 5300 (1977); Mains a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. 74, 3014 (1977)). POMC je produkován hlavně v hypofýze a hypothalamu. Post-translační zpracování POMC v předním laloku hypofýzy produkuje ACTH a BLAT. Na druhé straně hlavní produkty střední části hypofýzy jsou a-MSH, CLIP, γlipotropin, β-endorfin a β-MSH, zatímco v hypothalamu se POMC zpracovává primárně na γ-MSH a β-endorfin.

Peptidy odvozené od POMC hrají řadu důležitých rolí v metabolické a fyziologické regulaci. Například ACTH, peptid o 39 aminokyselinách, stimuluje sekreci glukokortikoidů z nadledvinové kůry. Sloučeniny typu MSH na druhé straně stimulují syntézu melaninu melanocyty v kůži a také se zúčastňují metabolismu tuků. β-endorfin je odvozen od karboxylového konce BLAT (viz rezidua 59 až 89 lidské sekvence) a má analgetickou aktivitu, která je antagonizována naloxonem, známým antagonistou morfinu. Peptidové hormony odvozené od POMC tedy mají různé role ve fyziologické a metabolické regulaci.

Vlastní metabolismus glukózy a energie závisí na inzulínu, peptidu, který nemá vztah k POMC. Specificky inzulín stimuluje syntézu glykogenu, mastných kyselin a proteinů a také stimuluje glykolýzu. Inzulín je kritickou látkou pro podporování vstupu glukóza do svalů a tukových buněk.

Vadný metabolismus inzulínu může vést k diabetů. Diabetici typu 1 vyžadují exogenní podávání inzulínu pro správné řízení metabolismu energie a glukózy. Naopak diabetici typu 2 typicky nepotřebují exogenní inzulín až do pozdních stadií • ·

onemocnění. Správné řízení metabolismu glukózy a energie je nezbytné pro účinné zvládnutí diabety. Bez něj může docházet k závažným a někdy dokonce fatálním následkům, mezi které patří ketoacidóza, kóma, retinopatie, diabetická mikroangiopatie, ateroskleróza, infarkt myokardu, mrtvice, gangréna, hypertriglyceridémie, hypercholesterolémie, kardiomyopatie, dermopatie, syndrom diabetických nohou, nefropatie, infekce močového traktu, papilární nekróza, katarakty, diabetická gastroenteropatie, zácpa, periferální vaskulární onemocnění a dokonce smrt. V mnoha případech musí být udržována delikátní rovnováha mezi podáním příliš velkého množství inzulínu a příliš malého množství inzulínu. Ideální terapií diabetů by tedy byla léčba, která řídí hladinu glukózy v krvi zlepšením citlivosti na inzulín.

V dalším je popsán způsob léčení a farmaceutické kompozice, které jsou účinné pro léčbu nebo prevenci diabetů typu 1 a typu 2 a s nimi souvisejících komplikací, který zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství beta-lipotropinu a/nebo jeho fragmentů a/nebo jeho analogů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká izolovaných proteinů, mezi které patří beta-lipotropin (BLAT), jeho analogy, jeho fragmenty, nukleových kyselin, které je kódují, a způsobů získávání a používání BLAT při léčbě diabetů a komplikací s ním spoj ených.

Jsou popsány způsoby léčení diabetů a komplikací s ním spojených u savců, v to počítaje člověka, podáváním • · • ti • ti • ti • tititi farmaceuticky účinných množství BLAT, jeho analogů nebo jeho funkčních fragmentů. Předložený vynález se dále týká způsobu léčení diabetů typu 1 a typu 2, retinopatie, diabetické mikroangiopatie, aterosklerózy, infarktu myokardu, mrtvice, gangrény, hypertriglyceridémie, hypercholesterolémie, kardiomyopatie, dermopatie, syndrom diabetické nohy, nefropatie, infekce močových cest, papilární nekrózy, kataraktů, diabetické gastroenteropatie, zácpa a periferální vaskulární onemocnění.

Popsány jsou způsoby výroby BLAT v E. coli a kvasinkách. V E. coli se BLAT získává jako fúzovaný protein, který může být získán z buněčných lyzátů v přítomnosti vysoké koncentrace solí obvyklými způsoby čištění. Fúzovaný BLAT protein obsahuje rozpoznávací místo pro specifické proteázy, které jsou používány pro separaci partnera fúze od BLAT. V kvasince Píchia pastoris se fúzovaný protein štěpí po sekreci proteinu buňky, tak že původní BLAT může být získán neporušený z kultivačního média.

V jednom provedení se předložený vynález týká a v zásadě čistého proteinu, který má sekvenci aminokyselin, kterou je SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 7.

V jiném provedení se předložený vynález týká izolované nukleové kyseliny, kódující fúzovaný protein nebo rekombinantní protein nebo peptid zahrnující beta lipotropin.

V dalším provedení se předložený vynález týká alespoň jedné izolované nukleové kyseliny kódující protein nebo peptid ·

• · · · • · · · • · · · • · · 9

9 99 • · · · · · * · podle předloženého vynálezu.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká vektoru zahrnujícího izolovanou nukleovou kyselinu podle předloženého vynálezu.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká vektoru zahrnujícího izolovanou nukleovou kyselinu podle předloženého vynálezu, přičemž uvedená izolovaná nukleová kyselina je operativně vázána k sekvenci promotoru.

V dalším provedení se předložený vynález týká hostitelské buňky, obsahující vektor podle předloženého vynálezu.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká způsobu konstrukce rekombinantní hostitelské buňky, která má schopnost exprimovat beta-lipotropin, přičemž uvedený způsob zahrnuje vložení vektoru do uvedené hostitelské buňky libovolným způsobem.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu exprese beta-lipotropinu v rekombinantní hostitelské buňce, kde uvedený způsob zahrnuje kultivaci uvedené rekombinantní hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresi genu.

V dalším provedení se předložený vynález týká farmaceutického přípravku, obsahujícího jako účinnou složku beta-lipotropin, jeho analog nebo funkční fragment spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, excipienty nebo ředidly.

• · • ·

V dalším provedení se předložený vynález týká farmaceutického přípravku, ve kterém uvedený betalipotropin, jeho analog nebo funkční fragment, je lidský beta-lipotropin.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká betalipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu, pro použití při léčení diabetů nebo komplikací s ním spojených.

V dalším provedení se předložený vynález týká fragmentů BLAT, které mají inzulinotropní aktivitu.

V dalším provedení se předložený vynález týká peptidu, který má inzulinotropní aktivitu a je zvolen ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO: 13.

V dalším provedení se předložený vynález týká peptidu, který má inzulinotropní aktivitu a je zvolen ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 14 až SEQ ID NO: 25.

V dalším provedení se předložený vynález týká funkčního analogu beta-lipotropinového peptidu, který zde byl popsán.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu léčení diabetů, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství alespoň jednoho peptidu, zvoleného ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO: 25.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu léčení diabetů, který zahrnuje podávání terapeuticky účinné množství peptidu, zvoleného ze souboru sestávajícího z •4 4444

SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO: 13.

V dalším provedení se předložený vynález týká farmaceutického přípravku, obsahujícího jako účinnou složku alespoň jeden peptid, který má inzulinotropní aktivitu a je zvolen ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO: 25.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu léčení diabetů u savce, v to počítaje člověka, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství beta-lipotropinu, jeho analog nebo funkčního fragmentu.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká a způsobu snižování hladiny glukózy v krvi u savce podáváním účinného množství beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká způsobu léčení hyperglykémie u savce, který má potřebu takového léčení, podáváním účinného množství beta- lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu léčení hyperinzulinemie u savce podáváním účinného množství betalipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu zvyšování citlivosti na inzulín u savce podáváním účinného množství beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.

A A AAAA

AAAA ··

AA

V dalším provedení se předložený vynález způsobu syntézy v pevné fázi pro syntézu beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.

V dalším provedení se předložený vynález týká způsobu přípravy beta-lipotropinu, který zahrnuje kroky:

a. transformace vhodného hostitele vektorem exprese, kde uvedený vektor kóduje beta-lipotropin, jeho analog nebo funkční fragment;

b. kultivace uvedeného transformovaného hostitele za podmínek, které umožňují expresi uvedeného beta-lipotropinu;

c. čištění libovolného beta-lipotropinu libovolným vhodným způsobem.

V ještě dalším provedení se předložený vynález týká testu na beta-lipotropinovou aktivitu, který zahrnuje následující kroky:

a) podávání testovaného proteinu savci, který vykazuje necitlivost na inzulín a zvýšenou hladinu glukózy v krvi; a

b) testování hladiny glukózy a inzulínu v krvi po provedení kroku (a).

Předložený vynález se také týká způsobu léčení diabetů typu I nebo typu II a komplikací s ním spojených u savců podáváním farmaceuticky účinného množství beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.

• · • · • · · · · · • ·

Podrobný popis předloženého vynálezu

Definice

Výraz analog nebo funkční analog se vztahuje k modifikované formě BLAT, ve které byla provedena alespoň jedna substituce aminokyseliny tak, že uvedený analog si udržuje v zásadě stejnou biologickou aktivitu jako nemodifikovaný BLAT in vivo a/nebo in vitro.

Výraz bíd nebo b.i.d. se vztahuje k dávce BLAT nebo další sloučeniny, která je podávána dvakrát denně.

BLAT znamená beta-lipotropin. Lidský BLAT zahrnuje 89 aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: 8). BLAT protein byl určen v množství organismů a sekvence aminokyselin byla určena v množství organismů, v to počítaje člověka, myš, ovci a prase (Li & Chung, Nátuře, 260, 622-24 (1976); a slona (Li a kol. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988); stejně jako další savce; všechny uvedené práce jsou zde zahrnuty jako reference.

Výraz beta-lipoproteinový fúzovaný protein nebo BLAT fúzovaný protein se vztahuje k třídě hybridních rekombinantních proteinových molekul, které obsahují BLAT, které jsou produkovány v E. coli nebo dalších typech buněk a ze kterých může být BLAT nebo fragment BLAT vytvořen specifickou proteolýzou nebo chemickým štěpením. Příklady BLAT fúzovaných proteinů zahrnují proteiny, které jsou v předložené přihlášce vynálezu specifikovány jako SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7.

• ·

9 9

9 9

Výrazy komplementární nebo komplementarita, jak jsou zde užívány, se vztahují ke schopnosti purinových a pyrimidinových nukleotidů asociovat pomocí vodíkových vazeb a vytvářet dvojvláknové molekuly nukleových kyselin. Následující páry bází se týkají komplementarity: guanin a cytosin; adenin a thymin; a adenin a uráčil. Jak je zde užíván, výraz komplementární znamená, že výše uvedený vztah se týká v zásadě všech párů bází, které jsou obsaženy ve dvou jednovláknových molekulách nukleových kyselin podél celé délky uvedených molekul. Částečně komplementární se vztahuje k výše uvedenému vztahu v případě, kdy jedna ze dvou jednovláknových molekul nukleové kyseliny je délkově kratší než druhá, takže zbývající část jedné z molekul zůstává jednovláknová.

Výraz komplikace nebo komplikace s ním spojené jak je zde užíván, se vztahuje k stavům, syndromům, přidruženým onemocněním nebo onemocněním, chorobám a podobné, které souvisejí s jedním nebo více onemocněními nebo syndromy nebo stavy, souvisejícími s defektem metabolismu inzulínu nebo defektem metabolismu uhlovodíků, například defektem metabolismu glukózy, mezi které neomezujícím způsobem patří diabetes typu 1 a typu 2.

zahrnovat ketoacidózu, kóma, mikroangiopatii, aterosklerózu, gangrénu, hypertriglyceridemii, hypercholesterolemii, kardiomyopatii, dermopatii, syndrom diabetické nohy, nefropatíi, infekce močových cest, papilární nekrózu, katarakty, diabetickou gastroenteropatii, zácpu a periferální vaskulární onemocnění.

Příklady komplikací mohou retinopatii, diabetickou infarkt myokardu, mrtvici, • 9 • 9

9999 • · • 9

• · • ·

9 · • ·

Konzervativní substituce nebo konservativní substituce aminokyselin se vztahuje k nahrazení jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v proteinu nebo peptidu způsobem uvedeným v Tabulce 1.

Jeho fragment se vztahuje k fragmentu, části nebo podoblasti peptidu nebo nukleové kyseliny, tak že fragment obsahuje 2 (dvě) nebo více po sobě následujících aminokyselin nebo alternativně asi 5 až 14 aminokyselin nebo více; nebo 10 nebo více nukleotidů, které po sobě následují ve výchozí molekule peptidu nebo nukleové kyseliny. Fragment si může nebo nemusí uchovávat biologickou aktivitu. Například fragment v předložené přihlášce popsaného peptidu může být použit jako antigen pro vytvoření specifické protilátky proti základnímu peptidu, ze kterého je fragment odvozen. Pokud se mluví o molekule nukleové kyseliny, její fragment se vztahuje k 10 nebo více po sobě následujících nukleotidech, odvozených ze základní nukleové kyseliny a také, v důsledku genetického kódu, ke komplementární sekvenci. Například jestliže fragment představuje sekvenci 5'-AGCTAG-3', potom její fragment bude také zahrnovat komplementární sekvenci, 3'-TCGATC-5'.

Výraz fúzovaný protein označuje hybridní molekulu proteinu, která se nevyskytuje v přírodě a zahrnuje translačně fúzovaný nebo enzymaticky fúzovaný protein, ve kterém dva nebo více proteiny nebo jejich fragmenty jsou kovalentně vázány v jediném polypeptidovém řetězci.

Fúzovaný partner se vztahuje k sekvenci aminokyselin v

• · · · • · · ···· ·· ···· • · · 4 • · · <

·· ··

BLAT fúzovaném proteinu, kde uvedená sekvence není odvozena od BLAT, například sekvence identifikovaná v předložené přihlášce jako SEQ ID NO: 6.

Funkční fragment nebo funkčně ekvivalentní fragment, jak je zde užíván, se vztahuje k oblasti nebo fragmentu BLAT o plné délce, který si uchovává biologickou aktivitu, to jest schopnost zvyšovat účinek inzulínu in vivo a/nebo in vitro; a/nebo schopnost podporovat snižování hladiny glukózy v krvi in vivo nebo zvyšovat příjem glukózy buňkami nebo tkání in vitro. Funkční fragmenty mohou také přinášet biologickou aktivitu, manifestovanou BLAT o plné délce, in vivo a/nebo in vitro, to jest schopnost podporovat příjem glukózy a/nebo zlepšovat účinky inzulínu a/nebo zvyšovat citlivost na inzulín. Funkční fragmenty mohou být vytvářeny klonovacími technologiemi nebo prostředky chemické syntézy nebo chemickým nebo enzymatickým štěpením.

Hostitelská buňka se vztahuje k libovolné eukaryotní nebo prokaryotní buňce, která je vhodná pro propagaci a/nebo expresi klonovaného genu, obsaženého ve vektoru, který byl vložen do uvedené hostitelské buňky například transformací nebo transfekcí nebo podobnými způsoby.

Výraz homolog nebo homologní popisuje vztah mezi různými molekulami nukleových kyselin nebo sekvencemi aminokyselin, kdy se uvedené sekvence nebo molekuly porovnávají na základě identity nebo částečné identity a/nebo podobnosti v jednom nebo více blocích nebo oblastech sekvence v uvedených molekulách.

»» • · · · • · · · · • · · · * · • · · · · φφφφ ·· · · φφ φφφφ φφ ·· • φ φ φ φ φ φ ♦ φ φ φ · φ φ φ · φφ ··

Výraz hybridizace, jak je zde užíván, se vztahuje k procesu, ve kterém jednovláknová molekula nukleové kyseliny se spojuje z komplementárním vláknem prostřednictvím párování nukleotidových bází. Selektivní hybridizace se vztahuje k hybridizaci podmínek vysoké stringence (přísnosti řízení hybridizace). Stupeň hybridizace závisí například na stupni homologie, stringenci hybridizace a délce hybridizovaných vláken.

Výraz inzulinotropní se vztahuje k aktivitě posilování inzulínu, například reverzí nebo ulehčením necitlivosti na inzulín.

Izolovaná nukleová kyselina se vztahuje k libovolné sekvenci RNA nebo DNA, ať již konstruované nebo syntetizované, která je místně odlišná od svého přirozeného místa výskytu, například v buňce.

Výraz sonda nukleové kyseliny nebo sonda, jak je zde užíván, se vztahuje k označené nukleové kyselině, která hybridizuje s jinou nukleovou kyselinou. Sonda nukleové kyseliny znamená jednovláknovou sekvenci nukleové kyseliny, která se kombinuje s komplementární nebo částečně komplementární jednovláknovou cílovou sekvencí nukleové kyseliny pro vytvoření dvouvláknové molekuly. Sonda nukleové kyseliny může být oligonukleotid nebo nukleótidový polymer. Sonda obvykle obsahuje detekovatelnou část, která může být vázána ke konci nebo koncům sondy nebo se nacházet uvnitř sekvence sondy.

Výraz plasmid se vztahuje k extrachromosomálnímu ···· * 0 ·· · · • · · 0

0 • «0

0 • t 0

genetickému prvku. Plasmidy popsané v předložené přihlášce jsou komerčně dostupné, veřejně dostupné ne neomezených základnách nebo mohou být konstruovány ze snadno dostupných plasmidů postupem podle publikovaných procedur.

Primer je fragment nukleové kyseliny, který funguje jako iniciační substrát pro enzymatickou nebo syntetickou elongaci například molekuly nukleové kyseliny.

Výraz promotor se vztahuje k sekvenci nukleové kyseliny, která řídí transkripci například DNA na RNA. Indukovatelný promotor je takový, který je možno regulovat signály z okolního prostředí jako jsou například zdroj uhlíku, teplo nebo ionty kovů. Konstitutivní promotor obecně operuje na konstantní úrovni a není regulovatelný.

Výrazy protein a peptid jsou používány navzájem zaměnitelně a vztahují se ke dvěma nebo více aminokyselinovým zbytkům, které jsou kovalentně vázány peptidovou vazbou. V některých případech tyto výrazy popisují aminokyselinové biopolymery, obsahující více než 10 a až do asi 500 aminokyselinových zbytků, vázaných peptidovou vazbou.

Výraz rekombinantní DNA klonovací vektor, jak je zde užíván, se vztahuje k libovolnému autonomně se replikujícímu činiteli, v to neomezujícím způsobem počítaje plasmidy a fágy, které obsahují molekulu DNA, do které mohou být nebo byly vloženy jeden nebo více dodatečných segmentů DNA.

Výraz rekombinantní DNA vektor exprese nebo vektor • · • · · • ·

exprese, jak je zde užíván, se vztahuje k libovolnému rekombinantnímu DNA klonovacímu vektoru, například plasmidu nebo fágu, ve kterém je přítomen promotor a další regulační prvky, čímž je umožněna transkripce vložené DNA, která může kódovat protein.

Výraz stringence se vztahuje k hybridizačním podmínkám a znamená přísnost řízení hybridizace. Vysoce stringentní podmínky znevýhodňují nehomologní párování bází. Málo stringentní podmínky mají opačný účinek. Stringence může být změněna například změnou teploty a koncentrace solí.

Malá (nízká) stringence představuje podmínky, zahrnující například teplotu okolo 37 °C nebo méně, koncentraci formamidu menší než přibližně 50% a střední až nízkou koncentraci solí (SSC); nebo alternativně teplotu okolo 50 °C nebo menší a střední až vysokou koncentraci solí (SSPE), například 1M NaCl.

Vysoká stringence představuje podmínky, zahrnující například teplotu okolo 42 °C nebo méně, koncentraci formamidu menší než přibližně 20% a nízkou koncentraci solí (SSC) ; nebo alternativně teplotu okolo 65 °C nebo menší nízkou koncentraci solí (SSPE). Vysoce stringentní podmínky například zahrnují hybridizaci v 0,5 M NaHPO₄, 7% dodecylsulfátu sodného (SDS) , 1 mM EDTA při teplotě 65 °C (Ausubel, F.M. a kol. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, 1989; Green lne. New York, v 2.10.3).

SSC představuje hybridizační a promývací roztok. Zásobní roztok 20x SSC obsahuje 3M chlorid sodný, 0,3M citrát sodný, • ••A AA ·· « e « A

A ♦ A A • A A · A • A · A

A ·· ··

- 16 pH 7,0.

SSPE představuje hybridizační a promývací roztok, lx SSPE roztok obsahuje 180 mM NaCl, 9 mM Na₂HPO₄, 0,9 mM NaH₂PO₄ a 1 mM EDTA, pH 7,4.

V zásadě čistý s odvoláním na protein znamená, že uvedený protein je oddělen od dalších buněčných a nebuněčných složek, v to počítaje molekuly jiných proteinů.

V zásadě čistý přípravek je alespoň na 85% čistý; a výhodně na alespoň 95% čistý. V zásadě čistý protein může být připraven libovolným z mnoha vhodných způsobů, které zahrnují například IMAC proteinový purifikační způsob (U.S. patent č. 4,569,794), který je zde uveden jako reference.

Výraz léčení, jak je zde užíván, popisuje zacházení a péči o pacienta s cílem potlačit onemocnění, stav nebo poruchu a zahrnuje podávání proteinu podle předloženého vynálezu pro prevenci vypuknutí symptomů nebo komplikací, úlevu symptomů nebo komplikací nebo eliminaci onemocnění, stavu nebo poruchy.

Všechny reference citované v tomto popisu vynálezu jsou zde zahrnuty jako reference.

Beta-lipotropin byl izolován v roce 1964 z ovčí hypofýzy a jeho primární struktura byla popsána následujícího roku (Li a kol., Nátuře, 208, 1093, 1965). Od té doby byly popsány primární sekvence BLAT ovce, krávy, myši, vepře, morčete, krysy, slona a člověka. (Viz například Lohmar a Li, Biochim.

· · ·

4

44

Biophys. Acta, 147, 381, 1967; Li a Chung, Nátuře, 260, 622, 1976; Drouin a Goodman, Nátuře, 288, 619, 1980; Li a kol.

Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988; Blake a Li, Proč. Nat. Acad. Sci. 80, 1556-1559, 1983; Takahashi a kol. FEBS

Lett. 135, 97-102, 1981; všechny tyto citace jsou zde zahrnuty jako reference). Data o sekvenci ukazují, že karboxy konec BLAT je vysoce konzervován napříč druhy. Naopak existují značné rozdíly v sekvenci na amino konci molekul BLAT u různých druhů.

Předložený vynález se dále týká BLAT fúzovaných proteinů, v to počítaje lidský BLAT (SEQ ID NO: 8) nebo BLAT dalších druhů nebo jeho funkční fragmenty. Příklady BLAT fúzovaných proteinů jsou popsány jako SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7.

Funkční fragmenty BLAT jsou výhodně identifikovány jako fragmenty BLAT, které vykazují biologickou aktivitu, například schopnost zlepšovat diabetické symptomy, pokud jsou podávány savci, který má jejich potřebu, nebo snižovat hladiny inzulínu v séru a/nebo zlepšovat citlivost na inzulín a/nebo snižovat hladinu glukózy v krvi, a/nebo stimulovat příjem glukózy v adipozní nebo svalové tkáni, in vivo nebo in vitro nebo v adipocytech in vitro. Funkční fragmenty BLAT zahrnují libovolné fragmenty, které si uchovávají biologickou aktivitu a které obsahují alespoň dva (2) nebo více aminokyselinových zbytků, které jsou v některých případech vedle sebe v BLAT proteinu. Výhodné fragmenty obsahují souvislé oblasti BLAT které se nacházejí částečně nebo úplně mimo oblast zbytků 59 až 89 lidského BLAT (SEQ ID NO: 8) nebo ekvivalentní oblasti jiného než lidského BLAT (t.j. oblasti kódující β-endorfin).

Příklady funkčních fragmentů lidského BLAT jsou v předložené přihlášce popsány jako SEQ ID NO: 9 až SE(5 ID NO: 25. Výhodné fragmenty jsou v předložené přihlášce označeny jako 13; nejvýhodnéjší fragmenty jsou označeny jako SE(2 ID NO: 10,

SEQ ID NO: 9 až SEQ ID NO v předložené přihlášce SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO

13. V některých případech mohou funkční fragmenty obsahovat vnitřní deleci původního BLAT, například SEQ ID NO: 13, ve které aminokyselinové zbytky 7 až 23 lidského BLAT jsou vynechány. Funkční fragmenty mohou být vytvářeny chemickou syntézou v pevné fázi a/nebo rekombinantními DNA technikami, které jsou odborníkovi dobře známy. Viz například K. Struhl, Reverse biochemistry: Methods and applications for synthesizing yeast proteins in vitro, Meth. Enzymol. 194, 520-535. Například při jednom způsobu se zahnízděný soubor delečních mutací vloží do nukleové kyseliny kódující BLAT tak, že různá množství oblasti kódující peptid jsou vynechány, buď na amino konci nebo na karboxylovém konci molekuly. Tento způsob může být také použit pro vytvoření vnitřních fragmentů neporušeného proteinu, ve kterých jak karboxylový, tak i amino konec jsou vyjmuty. Vhodné nukleázy pro vytvoření takových deleci zahrnují například Bal31 nebo v případě jednovláknové molekuly nukleové kyseliny nukleázu bobů mung. Pro zjednodušení se předpokládá, že BLAT kódující nukleovou kyselinu je klonována do jednovláknového klonovacího vektoru jako je bakteriofág M13 nebo ekvivalent. Je-li to požadováno, výsledné deleční fragmenty subklonovány do vhodného vektoru pro propagaci libovolné vhodné hostitelské buňce.

mohou být a expresi v

9 9 9 *

9 9 9 9 9 • « 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9

9999 99 999

Funkční fragmenty BLAT mohou být identifikovány a testovány na biologickou aktivitu použitím libovolného vhodného testu, například schopností peptidového fragmentu stimulovat nebo posilovat citlivost na inzulín a/nebo příjem glukózy buňkami in vivo nebo in vitro.

Funkční analogy BLAT mohou být vytvořeny delecí, insercí, inverzí a/nebo substitucí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v uvedeném BLAT nebo v libovolném z peptidů popsaných v předložené přihlášce vynálezu. Substituční analogy mohou obecně být vytvořeny syntézou v pevné fázi nebo rekombinantními technikami, ve kterých byly provedeny jednoduché nebo vícenásobné konzervativní aminokyselinové substituce, například podle Tabulky 1. Obecně, v případě vícenásobných substitucí, je výhodné aby bylo změněno méně než deset zbytků v libovolné dané molekule, nejvýhodněji aby bylo změněno od jednoho do pěti zbytků v libovolné dané molekule tak, aby od 90% do 99% zbytků bylo identických se sekvencí alternativně aby přibližně identických se SEQ ID NO: 8 pocházejícím od jiného druhu.

SEQ ID NO: 8; zbytků bylo vhodným BLAT

95% až 99% nebo dalším

Například analogy lidského BLAT (SEQ ID NO: 8) obsahující jednoduché nebo vícenásobné aminokyselinové substituce v oblasti mezi aminokyselinovými zbytky 1 až 89, zahrnují substituce, ve kterých:

• · • «

zbytek v	poloze	1	představuj e	alternativně	Glu, Ala,	Asp
nebo Gin;
zbytek v	poloze	2	představuje	alternativně	Leu, Ile,	Val
nebo Met;
zbytek v	poloze	3	představuje	alternativně	Thr, Ala,	Glu,
Ser, Pro	nebo Gly	9
zbytek v	poloze	4	představuje	alternativně	Gly, Arg,	Ala,
Leu, Pro	nebo Ser	9
zbytek v	poloze	5	představuje	alternativně	Glu, Gin,	Asp,
Asn nebo	Ala;
zbytek v	poloze	6	představuj e	alternativně	Arg, Glu,	Leu,
Lys, Gin	nebo Ala	9
zbytek v	poloze	7	představuje	alternativně	Leu, Pro,	Asp,
Val, Ile	nebo Met	t
zbytek v	poloze	8	představuje	alternativně	Arg, Glu,	Ala,
Tyr, Leu,	Lys, Pro,	Gin nebo Trp	9
zbytek v	poloze	9	představuj e	alternativně	Glu, Ala,	Pro,
Asp, Asn	nebo Gin	9
zbytek v	poloze	10	představuj e	alternativně	Gly, Ala,	Ser
nebo Asp;
zbytek v	poloze	11	představuj e	alternativně	Asp, Arg,	Pro,
Asn, Gin,	Ala nebo Glu;
zbytek v	poloze	12	představuj e	alternativně	Gly, Ala,	Ser
nebo Met;
zbytek v	poloze	13	představuj e	alternativně	Pro, Glu,	Gly
nebo Val;
zbytek v	poloze	14	představuj e	alternativně	Asp, Glu,	Asn,
Gin nebo	Gly;
zbytek v	poloze	15	představuj e	alternativně	Gly, Ala,	Ser
nebo Glu;
zbytek v	poloze	16	představuje	alternativně	pro, Gin,	Leu,

·· ·· • · · · · · fc··· • · · ·· · · ί ί J • · · ··· ···· ···· ·· ·· · ·· ··

Gly nebo Glu;

zbytek v	poloze	17	představuje
nebo Gly;
zbytek v	poloze	18	představuje
nebo Asn;
zbytek v	poloze	19	představuj e
nebo Gin;
zbytek v	poloze	20	představuje
Ala;
zbytek v	poloze	21	představuje
nebo Phe;
zbytek v	poloze	22	představuje
nebo Lys;
zbytek v	poloze	23	představuje
Gly, Ser	nebo Leu	V
zbytek v	poloze	24	představuje
Asn, Leu	nebo Val;
zbytek v	poloze	25	představuj e
Ile, Gly,	Ser nebo Thr;
zbytek v	poloze	26	představuje
Asn, Gin	nebo Lys;
zbytek v	poloze	27	představuje
Met nebo	Val;
zbytek v	poloze	28	představuj e
nebo Asp;
zbytek v	poloze	29	představuje
Ala, Gin	nebo Glu;
zbytek v	poloze	30	představuj e
Ala, Leu	nebo Asp;
zbytek v	poloze	31	představuje
Met nebo	Ile;

alternativně	Ala,	Asp,	Ser
alternativně	Asp,	Glu,	Gin
alternativně	Asp,	Glu, Asn
alternativně	Gly,	Ser nebo
alternativně	Ala,	Gly,	Ser
alternativně	Gly,	Ala,	Ser
alternativně	Ala,	Phe,	Thr,
alternativně	Gin,	Arg,	Asp,
alternativně	Ala,	Leu,	Asp,
alternativně	Asp,	Glu,	Gly,
alternativně	Leu,	Ala,	Ile,
alternativně	Glu,	Gin, Asn
alternativně	His,	Asn,	Tyr,
alternativně	Ser,	Gly,	Glu,
alternativně	Leu,	Ala,	Val,

• ti ··· ·

zbytek v	poloze	32	představuje	alternativně	Leu, Ala, Val,
Ile, Met	nebo Pro	r
zbytek v	poloze	33	představuje	alternativně	Val, Ala, Glu,
Leu, Ile,	Met nebo Arg;
zbytek v	poloze	34	představuje	alternativně	Ala, Ser, Pro,
Glu nebo	Gly;
zbytek v	poloze	35	představuj e	alternativně	Ala, Asp, Gly,
Ser nebo	Leu;
zbytek v	poloze	36	představuje	alternativně	Glu, Ala, Thr,
Leu, Asp,	Asn nebo Gin;
zbytek v	poloze	37	představuj e	alternativně	Lys, Glu, Thr,
Arg, Gin	nebo Asp	1;
zbytek v	poloze	38	představuje	alternativně	Lys, Arg, Gin
nebo Glu;
zbytek v	poloze	39	představuj e	alternativně	Asp, Ala, Asn,
Glu, Gin	nebo Lys	v
zbytek v	poloze	40	představuj e	alternativně	Glu, Ser, Asp,
Asn, Gin	nebo Gly;
zbytek v	poloze	41	představuje	alternativně	Gly, Ala nebo
Ser ;
zbytek v	poloze	42	představuj e	alternativně	Pro, Gly, Ser
nebo Asn;
zbytek v	poloze	43	představuje	alternativně	Tyr, Phe nebo
Trp ;
zbytek v	poloze	44	představuje	alternativně	Arg, Lys, Gin
nebo Glu;
zbytek v	poloze	45	představuj e	alternativně	Met, Ile, Ser
nebo Val;
zbytek v	poloze	46	představuj e	alternativně	Glu, Gin, Asp,

Asn, His, Arg nebo Gly;

zbytek v poloze; 48 představuje alternativně Tyr nebo Trp;

• φ ΦΦΦΦ φφ φφ

ΦΦ φ zbytek v poloze 45 představuje alternativně Arg nebo Lys;

zbytek v	poloze	50	představuj e	alternativně	Trp,	Tyr	nebo
Phe; zbytek v	poloze	51	představuje	alternativně	Gly,	Ala,	Ser
nebo gin; zbytek v	poloze	52	představuje	alternativně	Ser,	Thr,	Asn
nebo Ala; zbytek v	poloze 53 představuje alternativně Pro nebo Gly	r
zbytek v	poloze	54	představuj e	alternativně	Pro,	Ala,	Gly,
Arg, Leu zbytek v	nebo Thr poloze	r 55	představuj e	alternativně	Lys,	Arg,	Gin
nebo Ala; zbytek v	poloze	56	představuj e	alternativně	Asp,	Asn,	Glu,
Gin, Ala, zbytek v	Gly nebo Ile; poloze 57 představuje	alternativně	Lys,	Gin	nebo
Arg ; zbytek v	poloze	58	představuj e	alternativně	Arg,	Gin	nebo
Lys ; zbytek v	poloze	59	představuj e	alternativně	Tyr,	Phe	nebo
Trp ; zbytek v	poloze	60	představuje	alternativně	Gly,	Ala	nebo
Ser; zbytek v	poloze	61	představuj e	alternativně	Gly,	Ala	nebo
Ser; zbytek v	poloze	62	představuje	alternativně	Phe,	Tyr	nebo
Trp; zbytek v	poloze	63	představuj e	alternativně	Met,	Leu,	Ile
nebo Val; zbytek v	poloze	64	představuj e	alternativně	Thr,	Ala,	Ser
nebo Lys; zbytek v	poloze	65	představuje	alternativně	Ser,	Ala,	Thr

• 9 99 ·· 9···

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9999 99 99

9 9 9 ·9 9

9 9 9

99 nebo Pro;

zbytek v	poloze	66	představuje	alternativně	Glu,	Asp,	Asn,
Lys nebo	Gin;
zbytek v	poloze	67	představuje	alternativně	Lys,	Arg	nebo
Gin; zbytek v nebo Gly;	poloze	68	představuj e	alternativně	Ser,	Ala,	Thr
zbytek v	poloze	69	představuje	alternativně	Gin,	Glu,	Asp,
Asn, Arg	nebo His	r
zbytek v nebo Lys;	poloze	70	představuje	alternativně	Thr,	Ser,	Ala
zbytek v	poloze 71 představuje alternativně Pro nebo Gly	r
zbytek v	poloze	72	představuje	alternativně	Leu,	Ile,	Met
nebo Val;
zbytek v	poloze	73	představuje	alternativně	Val,	Leu,	Ile
nebo Met;
zbytek v	poloze	74	představuj e	alternativně	Thr,	Ala	nebo
Ser;
zbytek v	poloze	75	představuje	alternativně	Leu,	Ile,	Met
nebo Val;
zbytek v	poloze	76	představuje	alternativně	Phe,	Tyr,	Trp
nebo Leu;
zbytek v	poloze	77	představuje	alternativně	Lys,	Gin	nebo
Arg;
zbytek v	poloze	78	představuje	alternativně	Asn,	Asp,	Glu,
Gin nebo	His;
zbytek v	poloze	79	představuj e	alternativně	Ala,	Gly,	Ser,
Ile nebo	Val;
zbytek v	poloze	80	představuje	alternativně	Ile,	Leu,	Met,
Val nebo	Thr;
zbytek v	poloze	81	představuje	alternativně	Ile,	Met,	Val,

04

0 0 ·

0 0

0 · ·

0 0

0000 00

00 0 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 « 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ·· ·* •0 0000

Thr nebo Leu;

zbytek	v	poloze	82	představuje	alternativně	Lys,	Gin	nebo
Arg ;
zbytek	v	poloze	83	představuj e	alternativně	Asn,	Asp,	Glu,
Gin nebo	Ser;
zbytek	v	poloze	84	představuje	alternativně	Ala,	Val,	Ser,
Gly nebo	Glu;
zbytek	v	poloze	85	představuje	alternativně	Tyr,	Phe,	Trp

nebo His;

zbytek	v	poloze	86	představuje	alternativně	Lys,	Gin	nebo
Arg; zbytek	v	poloze	87	představuje	alternativně	Lys,	Gin	nebo
Arg; zbytek	v	poloze	88	představuje	alternativně	Gly,	Ala	nebo
Ser; zbytek	v	poloze	89	představuje	alternativně	Glu,	Gin,	Asp,

Asn nebo His.

Dodatečné specifické substituce (SEQ ID NO: 8) zahrnují jednoduché substituce v SEQ ID NO: 8, kde: zbytek v poloze 3 je Glu;

zbytek v poloze 4 je Arg;

zbytek v poloze 6 je Gin;

zbytek v poloze 7 je Pro;

zbytek v poloze 8 je Glu, Ala nebo Pro; zbytek v poloze 5 je Pro nebo Ala; zbytek v poloze 11 je Arg nebo Pro; zbytek v poloze 16 je Leu nebo Gin; zbytek v poloze 21 je Phe; zbytek v poloze 23 je Thr, Leu nebo Pro;

v lidském BLAT nebo vícenásobné ·· 99

9 9 9

9 9 9

9 9 9 ··

9 9 9

9 9

9 9

9999

9999 99

99

zbytek	v	poloze	24	je	Arg	nebo	Val;
zbytek	v	poloze	27	je	Ala;
zbytek	v	poloze	29	je	Asn,	Tyr	nebo Ala;
zbytek	v	poloze	30	je	Glu;
zbytek	v	poloze	31	je	Ala;
zbytek	v	poloze	32	je	Ala;
zbytek	v	poloze	33	je	Ala	nebo	Glu;
zbytek	v	poloze	34	je	Pro	nebo	Ser;
zbytek	v	poloze	35	je	Asp;
zbytek	v	poloze	36	je	Thr	nebo	Ala;
zbytek	v	poloze	37	je	Glu;
zbytek	v	poloze	40	je	Ser;
zbytek	v	poloze	42	je	Ser ;
zbytek	v	poloze	44	je	Glu;
zbytek	v	poloze	45	je	Val;
zbytek	v	poloze	52	je	Asn;
zbytek	v	poloze	54	je	Ala	nebo	Arg;
zbytek	v	poloze	56	je	Gly;
zbytek	v	poloze	84	je	Val;
zbytek	v	poloze	85	je	His;	a
zbytek	v	poloze	89	je	His.

44 « 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 ·

44 ··

4«

4 4 9

4 4

4 4

4 4

4444 «· •4 4444 • 4 4 • 4 4 • 4 4 4

4 4 • 4 4

Tabulka 1

Příklady substitucí aminokyselin

Původní zbytek	Příklad substituce
ALA	SER, GLY
ARG	LYS
ASN	GLN, HIS, ASP, GLU
ASP	GLU, GLN, ASN
CYS	SER
GLN	ASN, GLU, ASP
GLU	ASP, GLN, ASN
GLY	PRO, SER, ALA
HIS	ASN, GLN
ILE	LEU, VAL, MET
LEU	ILE, VAL, MET
LYS	ARG, GLN, GLU
MET	LEU, ILE, VAL
PHE	MET, LEU, TYR, TRP
SER	THR, ALA
THR	SER, ALA
TRP	TYR, PHE
TYR	TRP, PHE
VAL	ILE, LEU, MET
PRO	GLY

> · · * · • 00 · β » · · · · 0 0 »·00 00 9 i:

Tabulka 2

Identifikátory seznamu sekvencí

SEQ ID 1 2 3

NO: Popis

Nukleová kyselina kódující Met-Arg-BLT Aminokyselinová sekvence Met-Arg-BLT Aminokyselinová sekvence fúzovaného partnera použitého pro vytvoření SEQ ID NO: Oligonukleotidový linker použitý pro konstrukci BLAT fúze

Aminokyselinová sekvence fúzovaného BLAT Glutathion-S-transferázový (GST) fúzový partner

GST/BLAT fúzovaný protein Aminokyselinová sekvence lidského BLAT

9	Lidský	BLAT	(1-49)
10	Lidský	BLAT	(50-89)
11	Lidský	BLAT	(38-67)
12	Lidský	BLAT	(38-89)
13	Lidský	BLAT	(Δ7-23)
14	Lidský	BLAT	(1-14)
15	Lidský	BLAT	(8-21)
16	Lidský	BLAT	(15-28)
17	Lidský	BLAT	(22-35)
18	Lidský	BLAT	(29-42)
19	Lidský	BLAT	(36-49)
20	Lidský	BLAT	(43-56)
21	Lidský	BLAT	(50-63)
22	Lidský	BLAT	(57-70)
23	Lidský	BLAT	(64-77)
24	Lidský	BLAT	(71-84)

25	Lidský BLAT	(78-89)
26	BLAT analog	(l:Glu-Ala)
27	BLAT analog	(3:Thr-Ser)
28	BLAT analog	(5:Gln-Glu)
29	BLAT analog	(7:Leu-Asp)
30	BLAT analog	(10:Gly-Ala)
31	BLAT analog	(15:Gly-Glu)
32	BLAT analog	(17:Ala-Gly)
33	BLAT analog	(23:Ala-Phe)
34	BLAT analog	(30:Ser-Glu)
35	BLAT analog	(42:Pro-ser)

Procedury izolace genů

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že nukleová kyselina kódující BLAT nebo fúzovaný BLAT může být získána množstvím rekombinantních DNA technik zahrnujících například polymerázovou řetězovou reakční (PCR) amplifikaci nebo de novo DNA syntézu. (Viz například, T. Maniatis a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. Chap. 14 (1989)).

Například oligonukleotidové primery cílené na 3' a 5' konce SEQ ID NO: 1 mohou být použity pro PCR amplifikaci Met-ArgBLT. Viz například PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis a kol., Academie Press (1990). PCR amplifikace zahrnuje templátovou DNA, vhodné enzymy, primery a pufry, a je výhodně prováděna v přístroji DNA Thermal Cykler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Pozitivní výsledek je určen detekcí DNA fragmentů vhodné velikosti (273 párů bází) pomocí agarózové gelové elektroforézy.

A »

A »

A A A

A A A

A · * · • · A A

A A 9· • · A * · * aaaa áa <· AAAA A · ·

A A · a

Způsoby vytváření proteinů

Jedno provedení předloženého vynálezu se týká použití BLAT proteinu jako farmaceutické sloučeniny.

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že proteiny a jejich fragmenty nebo funkční fragmenty podle předloženého vynálezu mohou být syntetizovány množstvím různých způsobů jako jsou chemické způsoby dobře známé v oboru, v to počítaje syntézu peptidů v pevné fázi nebo rekombinantní způsoby. Oba typy metod jsou popsány v U.S. patentu 4,617,149, který je zahrnut jako reference.

Způsoby chemické syntézy proteinů v pevné fázi jsou dobře známy v oboru a mohou být nalezeny v obecných učebnicích oboru. Viz například H. Dugas a C. Penney, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92. Například peptidy mohou být syntetizovány způsobem v pevné fázi použitím peptidového syntetizátoru Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) a syntetickými cykly dodávanými společností Applied Biosystems.

Sekvenční t-butoxykarbonylová chemie používající dvojitě kopulovaných protokolů se aplikuje na výchozí p-methyl benzhydryl aminové pryskyřice pro získání C-terminálních karboxamidů. Pro získání C-terminálních kyselin se použije odpovídající pyridine-2-aldoxim methjodidová pryskyřice. Asparagin, glutamin, a arginin se kopulují použitím předem vytvořených hydroxybenzotriazolových esterů. Po ukončení syntézy mohou být peptidy zbaveny ochrany a odštěpen od

• * *· • · · · • ♦ · ♦ • φ · · • · · * « ft 9 9 pryskyřice bezvodým fluorovodíkem, obsahujícím 10% metakresol. Odštěpení ochranné skupiny nebo skupin postranních řetězců a odštěpení peptidu od pryskyřice se provádí při teplotě 0 °C nebo nižší, výhodně -20 °C po dobu třiceti minut následovaných třiceti minutami při teplotě 0 °C.

Obecně syntéza peptidu sestává z posloupnosti následujících kroků. Nejprve se aminokyselina s chráněnou α-amino skupinou (a funkční skupinou postranního řetězce, je-li to nutné) aktivuje pro vytvoření reaktivního esteru. Tato aktivovaná aminokyselina se váže na inertní pevný nosič prostřednictvím této aktivované esterové skupiny a vázaná aminokyselina se důkladně promývá. Po ukončení tohoto kroku se druhá chráněná aminokyselina aktivuje na ester v oddělené reakci, a-amino skupina první aminokyselina se zbaví ochrany, čímž se získá reaktivní amin a druhá aktivovaná aminokyselina se s ní nechá reagovat pro vytvoření dipeptidu na pevném nosiči. Sekvenční opakování těchto kroků vede k peptidu vzrůstající délky. Po ukončení syntézy se peptid odstraní od pevného nosiče a funkční skupiny postranních řetězců se zbaví ochrany zpracováním peptidu silnou kyselinou. Peptid se potom oddělí od pevného nosiče filtrací, precipituje s organickým rozpouštědlem a čisti množstvím technik, které jsou známy z oboru.

V konkrétním případě je ochrannou skupinou α-amino skupiny 9-fluoroenylmethylkarbonyl (Fmoc). Ochranné skupiny postranních řetězců jsou: Boc (pro zbytky Lys a Trp) , Trt (pro Asn, His, Gin), tBu (pro Ser, Thr, Tyr), OtBu (pro Asp, Glu) a Pmc (pro Arg). Aktivní estery se vytvářejí pomocí 2(lH-benzo-triazole-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyl uronium

- 32 • · «· hexafluorfosfátu (HBTU).

Ochranná skupina Fmoc skupiny α-amino se odstraní zpracováním pevné fáze piperidinem. Za těchto podmínek se Fmoc skupina snadno odstraní, zatímco vazba k pevné fázi a ochranné skupiny postranních řetězců nejsou ovlivněny. Chráněná aminokyselina, která má být přidána k vytvářenému peptidovému řetězci se aktivuje pomocí HBTU.

Syntéza lidského BLAT přináší několik specifických problémů. Předně sekvence peptidů obsahuje ser-pro-pro tripeptidový segment. Standardní kopulační chemické postupy vedou k sérii delečních chyb při syntéze. Takové delece se minimalizují dvojitou kopulací zbytků pro. Ve výhodném provedení se syntéza provádí dvojitou kopulací zbytků Pro a Ser.

Navíc, po ukončení kopulačního kroku se veškerý nezreagovaný nechráněný peptid blokuje acetanhydridem pro zabránění prodlužování řetězce delečního peptidů.

Za druhé, lidský peptid obsahuje 3 asp-gly dipeptidové sekvence. Tyto sekvence jsou náchylné k vytváření cyklického iminu, dokonce i když jsou postranní řetězce asp chráněny. Tyto cyklické iminy potom mohou reagovat s piperidinem v deprotekčním kroku za vytvoření piperidinem modifikovaného peptidů. Tato cyklizace byla eliminována použitím N-a-Hmb ochrany každého glycinového zbytku, který předchází zbytek asp. Viz například Qubbell a kol., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 2343, 1994, zahrnutý zde jako reference. Dva z aspgly dipeptidů předchází zbytek pro. V důsledku této vlastnosti sekvence a nižší reaktivity hmb chráněných ·· ·· « · · · · · • · · · · • 99 · ·· aminokyselin, je každý z nich vícenásobně kopulován a potom provedena čepičková úprava acetanhydridem. Ve výhodném provedení jsou dvojnásobně kopulovány.

Ve výhodném způsobu se peptid syntetizuje v jednom kroku použitím Fmoc. Syntéza BLAT je komplikována přítomností několika asp-gly dipeptidových sekvencí v N-terminální části molekuly. Bylo pozorováno, že aspartylové postranní řetězce v asp-gly dipeptidové sekvenci podstupují bází katalyzovanou cyklizaci a následnou adici piperidinem během FMOC syntézy. Tato reakce se eliminuje použitím Fmoc-(FmocHmb)-glycinu v každé asp-gly sekvenci během syntézy. Ochrana glycylového amidu skupinou Hmb inhibuje cyklizaci aspartylového postranního řetězce. Po provedení štěpení, zbavení ochrany a čištění pomocí HPLC s obrácenými fázemi může být peptid analyzován elektosprejovou hmotovou spektometrií. Hlavní součástí, pozorovanou při této syntéze BLAT je peptid plné délky, který má očekávanou hmotnost. Použití tohoto způsobu dovoluje produkci množství čistého proteinu, které přesahuje 100 mg z jednoho běhu v 0,1 mmolové škále.

Proteiny podle předloženého vynálezu také mohou být vytvářeny rekombinantními DNA způsoby. Exprese klonované nukleové kyseliny kódující BLAT nebo fúzovaný BLAT (například SEQ ID NO: 1) může být prováděna v množství vhodných hostitelských buněk, dobře známých odborníkům v oboru. Pro tento účel se BLAT kódující nukleová kyselina vloží do hostitelské buňky libovolným z řady způsobů, dobře známých odborníkům v oboru. I když chromosomová integrace spadá do rozsahu předmětu předloženého vynálezu, je výhodné, aby sekvence byla klonována do vhodného extrachromosomálně

4 4 4 ·· ·· • · · ·

4 4 » • · 4 4 · • 4 · · <<·· * * ·4 • * 4 *

4 4 4 • ·· ·

4 4 · udržovaného vektoru exprese tak, že kódující oblast BLAT genu je operativně vázána ke konstitučnímu nebo indukovatelnému promotoru.

Základní kroky rekombinantní produkce BLAT proteinu jsou:

a) konstrukce přírodní, syntetické nebo semi-syntetické DNA, kódující BLAT nebo jeho fúzovaný protein;

b) integrace uvedené DNA do vektor exprese způsobem umožňujícím expresi uvedeného proteinu;

c) transformace nebo jiný způsob vložení vektoru do vhodné eukaryotní nebo prokaryotní hostitelské buňky, představující rekombinantní hostitelskou buňku,

d) kultivace uvedené rekombinantní hostitelské buňky způsobem, vhodným pro expresi uvedeného proteinu; a

e) získání a čištění proteinu libovolným vhodným způsobem.

Exprese rekombinantního BLAT fúzovaného proteinu v prokaryotních a eukaryotních hostitelských buňkách

Lidský beta-lipotropin (BLAT) je hormon, obsahující 89 aminokyselin, který je produkován hypofýze ve formě prekurzorového proteinu, který podstupuje post-translační zpracování pro vytvoření několika biologicky aktivních hormonů včetně proteolyticky

BLAT. Jelikož BLAT je malý a obsahuje citlivá místa, byl tento protein přihlašovateli nejprve vytvořen pomocí chemické syntézy. Tento způsob však není vhodný pro vytváření velkého množství látky. V tomto předloženém vynálezu je popisován způsob, kterým BLAT může být produkován v bakteriálním nebo fungálním hostiteli exprese ve formě fúzovaných proteinů.

• ·

- 35 Tyto fúzované proteiny jsou chráněny proti proteolytické degradaci a dovolují získání neporušeného BLAT způsoby popsanými dále.

V E. coli se BLAT produkuje jako fúzovaný protein, který může být získán z buněčných lyzátů v přítomnosti velkého množství soli obvyklými purífikačními způsoby. Fúzovaný protein obsahuje rozpoznávací místo pro specifické proteázy, které jsou použity pro separaci fúzového partnera od BLAT. V Pichia pastoris se fúzovaný protein štěpí po sekreci z buňky takovým způsobem, že přirozený BLAT může být detekován a získán neporušený z kultivačního média.

Tento způsob přináší způsob produkce BLAT. Na rozdíl od chemické syntézy zde popsaný způsob může být prováděn ve velkém měřítku pro získávání velkých množství BLAT.

Prokaryota mohou být použita pro produkci rekombinantního BLAT proteinu. Například Escherichia coli K12, kmen 294 (ATCC No. 31446) je obzvláště užitečný pro expresi cizích proteinů v prokaryotní buňce. Jako hostitelská buňky pro klonování a expresi rekombinantních proteinů podle předloženého vynálezu mohou také být použity další kmeny E. coli, bacily jako je Bacillus subtilis, enterobakterie jako je Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans, různé druhy Pseudomonád a další bakterie, jako jsou Streptomyces.

Promotorové sekvence, vhodné pro provádění exprese genů v prokaryotech zahrnují b-laktamázu [například vektor pGX2907, ATCC 39344, obsahuje gen s replikonem a b-laktamázou], laktózové systémy [Chang a kol., Nátuře (London), 275:615

A · · *

- 36 AA * A · A A « ► A A * » A A I «· A· (1978); Goeddel a kol., Nátuře (London), 281:544 (1979)], alkalické fosfatázy a tryptofanové (trp) promotorové systémy [vektor pATHl (ATCC 37695)], které jsou navrženy pro usnadnění exprese otevřeného čtecího rámce jako je trpE fúzovaný protein za řízení trp promotorem. Hybrid promotory jako je tac promotor (isolovatelný z plasmidu pDR540, ATCC37282) jsou také vhodné, stejně tak jako T7 promotory. Ještě další bakteriální promotory, jejichž nukleotidové sekvence jsou obecně známy, mohou být ligovány na DNA kódující protein podle předloženého vynálezu, používajíce spojovníky (linker) nebo adaptéry pro vytvoření libovolných restrikčních míst. Promotory pro použití v bakteriálních systémech také mohou obsahovat Shine-Dalgarno sekvence operativně vázané k DNA kódující požadované' polypeptidy. Tyto příklady jsou ilustrativní a nikoli omezující.

Proteiny podle předloženého vynálezu mohou být syntetizovány buď přímou expresí nebo jako fúzované proteiny, ze kterých fúzový partner může být odstraněn enzymatickým nebo chemickým štěpením. V principu se předložený vynález týká libovolného fúzovaného systému, který může být exprimován v bakteriálním nebo fungálním hostiteli. V jednom provedení vhodného fúzovaného systému se rozpoznávací místo umístí mezi BLAT a fúzového partnera, kdy například se fúzový partner umístí na amino terminální konec BLAT. Vhodné místo může být rozpoznávací sekvence pro proteázu nebo místo, které je náchylné chemickému štěpení.

Příklady vhodných bakteriálních fúzových partnerů zahrnují glutathion-S-transferázu, maltózové vazebné proteiny, prokarboxypeptidázu, kalmodulinové vazebné proteiny nebo w · • · » 9 · • · • ·

- 37 ·· ·· • · · 9 « · · ♦ • · · · · • * 9 9

99 libovolnou sekvenci umístěnou na aminovém konci, která podporuje vysokou úroveň exprese fúzovaného proteinu.

Příklady vhodných proteáz zahrnují faktor Xa, thrombin a enterokinázu. Činidla pro chemické štěpení zahrnují kyanogenbromid, kyselinu a podobně.

Příklady fúzových partnerů užitečných ve fungálních systémech zahrnují alfa párovací faktor, propeptid, lidský sérový albumin a libovolné další sekvence, které podporují expresi a sekreci fúzovaného proteinu a následné štěpení (během sekrece) pro uvolnění přirozeného BLAT do kultivačního média.

V jednom provedení BLAT fúzovaný protein obsahuje přirozenou BLAT sekvenci fúzovanou na dipeptíd (například Met-Arg) na amino terminálním konci přirozené BLAT molekuly (například SEQ ID NO: 2) . Dipeptidový partner této fúzované molekuly může být uvolněn působením Cathepsinu C a přirozená BLAT molekula může být čištěna technikami známými z oboru jako je například HPLC. V jiném způsobu produkce rekombinantního BLAT fúzovaného proteinu se používá glutathion-S-transferáza (GST) jako fúzový partner pro získání proteinu označeného jako SEQ ID NO: 7, v zásadě způsobem, který popsali Smith a Johnson (Gene, 67, 31, 1988), a který je zde zahrnut jako reference.

Často bylo při vytváření jistých peptidů v rekombinantních systémech pozorováno, že exprese ve formě fúzovaného proteinu prodlužuje dobu života, zvyšuje výtěžek požadovaného peptidu nebo poskytuje výhodné prostředky pro • 0 • 0 « ·

0 • · · čištění proteinu. To je obzvláště platné při expresi savčích proteinů prokaryotních hostitelích. Je známa řada peptidáz (například enterokinázy a thrombin), které štěpí polypeptid ve specifických místech nebo provádí natrávení peptidů z amino nebo karboxy konce (například diaminopeptidáza) peptidového řetězce. Kromě toho jisté chemikálie (například kyanogenbromid) štěpí polypeptidový řetězec ve specifických místech. Odborníkovi je zřejmé, že modifikace sekvence aminokyselin (a syntetické nebo semi-syntetické kódovací sekvence pokud jsou použity rekombinantní prostředky) jsou nutné pro vložení místně specifických vnitřních míst štěpení. Viz například P. Carter, Site Specific Proteolysis of Fusion Protein, Kapitola 13, v Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes, American Chemical Society, Washington, D.C. (1990).

Kromě prokaryotů je možno použít množství systémů exprese založených na obojživelnících, jako jsou žabí oocyty a dále savčí buněčné systémy. Volba konkrétní hostitelské buňky závisí v jistém rozsahu na konkrétním použitém vektoru exprese. Příklady savčích hostitelských buněk vhodných pro použití podle předloženého vynálezu zahrnují například HepG2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK₂ (ATCC CCL 7.1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-Kl (ATCC CCL 61), HeLa (ATCC CCL 2), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 1616), HS-Sultan (ATCC CCL 1484) a BHK-21 (ATCC CCL 10).

Existuje velké množství vhodných vektorů pro transformaci savčích hostitelských buněk. Například vektory typu pSV2 obsahují segmenty genomu opičího viru 40 (simian virus SV40)

Φ ·· ···· • · · φ • · φ φ · φ φ · » • φ φφ požadované pro transkripci a polyadenylaci. Bylo zkonstruováno velké množství plasmidových vektorů typu pSV2, jako jsou pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg a pSV2-bglobinve kterých SV4 0 promotor provádí transkripci vloženého genu. Tyto vektory jsou snadno dostupné ze zdrojů jako je American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852

Research Laboratory (NRRD), 1815 Peoria, Illinois, 61604.

nebo Northern Regional N. University Street,

Promotory vhodné pro expresi v savčích buňkách zahrnují SV40 pozdní promotor, promotory z eukaryotních genů, jako je například estrogenem indukovatelný kuřecí ovalbuminový gen, interferonové geny, glukokortikoidově indukovatelný gen tyrosin aminotransferázy, genový promotor thymidinkinázy a promotory hlavních genů časných a pozdních adenovirů.

Transfekce savčích buněk vektory může být prováděna množstvím známých způsobů, které zahrnují, aniž by tím byly omezeny, protoplastovou fúzi, koprecipitace fosforečnanem vápenatým, elektroporace a podobně. Viz například Maniatis a kol., supra.

Některé viry také vytvářejí vhodné vektory. Příklady zahrnují adenoviry, viry souvisejcí s adenoviry, virus vaccinia, herpes viry, bakuloviry a sarkomový Rous virus, jak je popsáno v U.S. patentu 4,775,624, zahrnutém jako reference.

Eukaryotní mikroorganismy jako je kvasinka a další houby jsou také vhodnými hostitelskými buňkami. Kvasinky ·· ·♦··

Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris jsou výhodné eukaryotní mikroorganismy. Dalši kvasinky jako je Xluyveromyces lactis jsou také vhodné. Pro expresi v Saccharomyces může být použit například plasmid YRp7 (ATCC40053). Viz například L. Stinchcomb a kol., Nátuře, 282, 39 (1979); J. Kingsman a kol., Gene, 7, 141 (1979); S.

Tschemper a kol., Gene, 10, 157 (1980). Plasmid YRp7 obsahuje gen TRPÍ, který přináší volitelný markér pro použití v trpí auxotrofním mutantu.

Další provedení předloženého vynálezu zahrnují sekvence izolované nukleové kyseliny, které kódují BLAT nebo jeho fragmenty. Jak je odborníkovi v oboru zřejmé, aminokyselinové sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být kódovány řadou různých sekvencí nukleových kyselin. Jelikož tyto alternativní sekvence nukleových kyselin kódují stejné aminokyselinové sekvence, předložený vynález dále zahrnuje tyto alternativní sekvence nukleových kyselin.

konvenčních zařízení syntetizátor Applied

Nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, kódující BLAT, mohou také být produkovány způsoby chemické syntézy. Syntéza nukleových kyselin je dobře známa z oboru. Viz například E.L. Brown, R. Belagaje, M.J. Ryan a H.G. Khorana, Methods in Enzymology, 68:109-151 (1979). Fragmenty DNA sekvence odpovídající BLAT mohou být vytvořeny pomocí pro syntézu DNA jako je DNA Biosystems Model 380A nebo 380B (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) použitím fosforamiditových chemických postupů, následovných ligací fragmentů pro rekonstituci celého genu. Alternativně mohou být použity fosfotriesterové

0 ·

0

0 chemické postupy pro syntézu nukleových kyselin podle předloženého vynálezu. (Viz například M.J. Gait, ed., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, (1984)).

Vektory

Další předmět předloženého vynálezu se týká rekombinantních DNA klonovacích vektorů exprese obsahujících nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu. Výhodné vektory nukleové kyseliny jsou ty, které obsahují DNA. Nejvýhodnější rekombinantní DNA vektory zahrnují izolovanou DNA sekvenci SEQ ID NO: 1.

Odborníkovi je zřejmé, že volba nejvýhodnějšího klonovacího vektoru nebo vektoru exprese závisí na řadě faktorů zahrnujících dostupnost míst pro restrikční enzymy, typy hostitelských buněk, do kterých má být vektor transfektován nebo transformován, účel transfekce nebo transformace (například, stabilní transformace jako extrachromosomální prvek nebo integrace do hostitelského chromosomu), přítomnost nebo nepřítomnost snadno testovatelných nebo volitelných markérů (například odolnost na antibiotika a metabolické markéry jednoho a druhého typu) a počet kopií genu, požadovaných v hostitelské buňce.

Vektory vhodné pro to, aby nesly nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, zahrnují RNA viry, DNA viry, lytické bakteriofágy, lysogenní bakteriofágy, stabilní bakteriofágy, plasmidy, viroidy a podobně. Nejvýhodnější vektory jsou plasmidy.

• *

- 42 produkováno,

Vzhledem k promotory výhodné, neboť regulovatelnost exprese Odborníkovi je promotorů například relevantní úvahy týkající

Odborníkovi je jasné, že při přípravě vektoru exprese je třeba vzít do úvahy mnoho proměnných, například zda použít konstituční nebo indukovatelný promotor. Praktik také chápe, že množství nukleové kyseliny nebo proteinu, které má být částečně diktuje volbu systému exprese, promotorovým sekvencím jsou indukovatelné umožňují vysokou úroveň a operativně vázaného genu. zřejmé, že existuje množství vhodných které odpovídají množství indukujících faktorů, zdroji uhlíku, iontům kovů a teplu. Další se vektoru exprese zahrnují otázku, zda zahrnout sekvence pro řízení lokalizace rekombinantního proteinu. Například sekvence kódující signální peptid předcházející kódující oblast genu je užitečná pro řízení extracelulárního exportu vzniklého polypeptidů.

Předložený vynález se také týká způsobu konstrukce rekombinantní hostitelské buňky, která je schopna exprimovat BLAT proteiny, přičemž uvedený způsob zahrnuje transformaci nebo jiný způsob vložení do hostitelské buňky týkající se který obsahuje izolovanou DNA která kóduje BLAT. Výhodná hostitelská buňka je buňka, která může poskytnout vysokou úroveň exogenně vloženého genu nebo proteinu.

Transformované hostitelské buňky mohou být kultivovány za podmínek dobře známých odborníkům v oboru, tak aby byl exprimován rekombinantní BLAT.

rekombinantního DNA vektoru, sekvenci, libovolná exprese

Předložený vynález také podává způsob léčení člověka a ·· ·»·· ·· ·· • * · · • · ♦ • · · • · · · • · · ·· dalších savců postižených onemocněními nebo stavy spojenými s defektem metabolismu inzulínu nebo metabolismu uhlovodíků, jako je například hyperglykémie, hyperinzulínemie, diabetes typu 1 a typu 2 a komplikace s nimi spojené. Způsob zahrnuje podávání organismu, který má jeho potřebu, účinného množství BLAT proteinu nebo peptidů nebo fúzovaný protein obsahující BLAT nebo jeho funkční fragment nebo jeho analog v dávce, která je v rozmezí od 1 do 1000 μg/kg tělesné hmotnosti. Při provádění tohoto způsobu může být BLAT podáván v jedné denní dávce, ve více dávkách za den nebo pomocí kontinuálního nebo přerušovaného podávání mechanickou pumpou, která je implantována do těla nebo je k tělu připevněna. Množství BLAT nebo vztahujícího se proteinu nebo peptidů, které má být podáváno, bude určeno ošetřujícím lékařem a závisí na takových faktorech jako je povaha a závažnost stavu, syndromu nebo onemocnění, které mají být léčeny, na věku a celkovém zdravotním stavu pacienta.

nebo jeho ve směsi s farmaceuticky farmaceuticky přijatelnou přijatelným

Předložený vynález se také týká farmaceutických kompozic, obsahujících jako účinnou složku BLAT protein nebo jeho funkční fragment nebo jeho analog, například ten, který je reprezentovaný sekvencí SEQ ID NO: 8, netoxickou sůl, pevným nebo tekutým nosičem. Protein, výhodně ve formě farmaceuticky přijatelné soli, může být připraven pro parenterální podávání pro terapeutické nebo profylaktické ošetření při diabetů nebo jeho komplikacích. Sloučenina o sekvenci SEQ ID NO: 8 nebo jiný BLAT nebo jeho fragment může být například smíchána s obvyklými farmaceutickými nosiči a excipienty. Kompozice obsahující BLAT protein obsahují přibližně 0,1 až 90% hmot.

·4

4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 • 4 4 4

4444 44

4« 4444

4 44

4 4 4

4 4 4

4 4 4 • 4 44 proteinu, výhodně v rozpustné formě a obecně obsahují 10 až 30% proteinu. Dále mohou být proteiny podle vynálezu podávány samotné nebo v kombinaci s dalšími antidiabetickými činidly nebo činidly použitelnými pro léčení diabetů.

Pro intravenózní (IV) použití se BLAT protein, jeho fragment nebo analog podává v obvykle používaných intravenózních kapalinách a podává se infúzí. Takovými tekutinami jsou například fyziologický roztok, Ringerův roztok nebo 5% roztok dextrózy.

Pro intramuskulární podávání může být sterilní přípravek, výhodně ve formě vhodné rozpustné soli BLAT proteinu, například SEQ ID NO: 8, jako je hydrochlorid, rozpuštěn a podáván ve farmaceutickém ředidle jako je apyrogenní voda (destilovaná, fyziologický roztok nebo 5% roztok glukózy.

Vhodná nerozpustná forma sloučeniny může být připravena a podávána jako suspenze ve vodné bázi nebo farmaceuticky přijatelné olejové bázi, například esteru mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, jako je ethyloleát.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady úplněji popisují předložený vynález a použití BLAT pro léčení diabetů. Odborníkovi je zřejmé, že konkrétní reagenty, zařízení a procedury jsou pouze ilustrativní a nejsou zamýšleny jako omezení předloženého vynálezu jakýmkoli způsobem.

4* 4444 ··

4 4 4 ·

4 4 · • · 4 4 · • · · · »· • 4 4 4 • · · ·

4 4 4

4 4 4

Příklad 1

Syntéza v pevné fázi a čištění lidského BLAT proteinu

Lidský BLT peptid (SEQ ID NO: 8) byl syntetizován v jednom běhu použitím Fmoc. Syntéza BLAT je komplikována přítomností několika asp-gly dipeptidových sekvencí v N-terminální části peptidu. Bylo pozorováno, že aspartylový postranní řetězec asp-gly dipeptidových sekvencí podstupuje bází katalyzovanou cyklizaci a následnou adici s piperidinem v průběhu FMOC syntézy. Tato reakce je eliminována použitím Fmoc-(FmocHmb)glycinu v každé asp-gly sekvenci během syntézy. Ochrana glycylamidu skupinou Hmb inhibuje cyklizaci aspartylového postranního řetězce. Po provedení štěpení, deprotekce a čištění pomocí HPLC s obrácenými fázemi, může být peptid analyzován elektrosprejovou hmotovou spektrometrií. Hlavní součástí, pozorovanou při této syntéze BLAT je peptid plné délky, který má očekávanou hmotnost. Použití tohoto způsobu dovoluje produkci množství čistého proteinu, které přesahuje 100 mg z jednoho běhu v 0,1 mmolové škále.

Materiály:

Wangova pryskyřice (1% zesíťovaný polystyren funkcionalizovaný p-benzoxybenzyl alkoholem) s předem naneseným Fmoc-Glu (OtBu) s přibližně 0,6 mmolu aminokyseliny na jeden gram pryskyřice.

N-methylpyrrolidon (NMP), piperidin, 2-(lH-benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát (HBTU), 2 M N,N-diisopopylethylamin (DIEA), 1-hydroxybenzotriazol (HOBt), dichloromethan (DCM), dimethylformamid (DMF).

Pryskyřice, na kterou byla předem vázána Fmoc-chráněná C-

····

9 99

9 9 9 • 9 9 ·

9 9 ·

9 9 9

99 terminální aminokyselina (0,1 nebo 0,25 mmolu aminokyselina), byla zvážena a umístěna do reakční komory. Pryskyřice byla předem nabobtnána promýváním DCM. Potom byla pryskyřice promývána NMP. N-terminální Fmoc skupiny byla odstraněna inkubací pryskyřice v 18-22 % roztoku piperidinu v NMP. Po deprotekci byla pryskyřice extenzivně promývána NMP.

Jeden mol následující Fmoc-chráněné aminokyseliny určené k přidání k peptidu byl rozpuštěn v 2,1 g NMP, 2,0 g 0,45 M HBTU/HOBt reagentu v DMF. Po rozpuštění byla započata aktivace aminokyseliny přidáním 3 ml 2M DIEA v NMP. Aktivovaná aminokyselina byla potom přidána k pryskyřici zbavené ochrany a ponechána kopulovat. Po ukončení kopulace byla pryskyřice extenzivně promývána NMP. Úplný cyklus deprotekce a kopulace byl potom opakován pro každou následující aminokyselinu.

Specifické cyklové kroky v syntéze byly následující:

Cykl	Aminokyselina	Kroky
1	Glu(OtBu)	úplné promývání
2	Gly	jednoduchá kopulace
3	Lys(Boc)	jednoduchá kopulace
4	Lys(Boc)	jednoduchá kopulace
5	Tyr(tBu)	jednoduchá kopulace
6	Ala	jednoduchá kopulace
7	Asn (Trt)	jednoduchá kopulace
8	Lys (Boc)	jednoduchá kopulace
9	Ile	jednoduchá kopulace
10	Ile	jednoduchá kopulace

9« • 9 · · • 9 9

9 9 9

9 9

9999 9« «···

9 9

9*9 9 9 9

9 9

9» 9

99 • 9 9 9 • «9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 re

11	Ala	jednoduchá	kopulace
12	Asn(Trt)	jednoduchá	kopulace
13	Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
14	Phe	j ednoduchá	kopulace
15	Leu	jednoduchá	kopulace
16	Thr(tBu)	jednoduchá	kopulace
17	Val	jednoduchá	kopulace
18	Leu	j ednoduchá	kopulace
19	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
20	Thr(tBu)	jednoduchá	kopulace
21	Gin(Trt)	jednoduchá	kopulace
22	Ser(tBu)	j ednoduchá	kopulace
23	Lys (Boc)	j ednoduchá	kopulace
24	Glu(OtBu)	jednoduchá	kopulace
25	Ser(tBu)	j ednoduchá	kopulace
26	Thr(tBu)	j ednoduchá	kopulace
27	Met	jednoduchá	kopulace
28	Phe	jednoduchá	kopulace
29	Gly	j ednoduchá	kopulace
30	Gly	jednoduchá	kopulace
31	Tyr(tBu)	jednoduchá	kopulace
32	Arg(Pmc)	jednoduchá	kopulace
33	Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
34	Asp(OtBu)	jednoduchá	kopulace
35	Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
36	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
37	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
38	Ser(tBu)	j ednoduchá	kopulace
39	Gly	j ednoduchá	kopulace
40	Trp(Boc)	j ednoduchá	kopulace
41	Arg(Pmc)	jednoduchá	kopulace

čepička čepička čepička • ·

42	Phe	jednoduchá	kopulace
43	His(Trt)	jednoduchá	kopulace
44	Glu(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
45	Met	jednoduchá	kopulace
46	Arg (Prtic)	j ednoduchá	kopulace
47	Tyr(tBu)	jednoduchá	kopulace
48	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
49	Gly	j ednoduchá	kopulace
50	Glu(OtBu)	jednoduchá	kopulace
51	Asp(OtBu)	jednoduchá	kopulace
52	Lys (Boc)	jednoduchá	kopulace
53	Lys(Boc)	j ednoduchá	kopulace
54	Glu(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
55	Ala	j ednoduchá	kopulace
56	Ala	jednoduchá	kopulace
57	Val	jednoduchá	kopulace
58	Leu	jednoduchá	kopulace
59	Leu	j ednoduchá	kopulace
60	Ser(tBu)	jednoduchá	kopulace
61	His(Trt)	j ednoduchá	kopulace
62	Glu(OtBu)	jednoduchá	kopulace
63	Leu	jednoduchá	kopulace
64	Asp(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
65	Ala	j ednoduchá	kopulace
66	Gin(Trt)	j ednoduchá	kopulace
67	Ala	jednoduchá	kopulace
68	Gly	j ednoduchá	kopulace
69	Ala	jednoduchá	kopulace
70	Gly(Fmoc-hmb)	dvojitá kopulace/Ac20
71	Asp(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
72	Asp(OtBu)	j ednoduchá	kopulace

čepička čepička • · • ·

73	Ala	jednoduchá kopulace
74	Pro	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
75	Gly(Fmoc-hmb)	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
76	Asp(OtBu)	jednoduchá kopulace
77	Pro	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
78	Gly(Fmoc-hmb)	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
79	Asp (OtBu)	jednoduchá kopulace
80	Gly	jednoduchá kopulace
81	Glu (OtBu)	jednoduchá kopulace
82	Arg (Pmc)	jednoduchá kopulace
83	Leu	jednoduchá kopulace
84	Arg(Pmc)	jednoduchá kopulace
85	Gin(Trt)	jednoduchá kopulace
86	Gly	jednoduchá kopulace
87	Thr(tBu)	jednoduchá kopulace
88	Leu	jednoduchá kopulace
89	Glu(OtBu)	jednoduchá kopulace
90		konečná deprotekce

Pro aminokyseliny, které reagují pomalu nebo neúčinně byly prováděny dvě oddělené kopulační reakce. Veškerý zbylý nezreagovaný peptid byl blokován zpracováním acetanhydridem. Posloupnost kroků pro jednu z takových aminokyselin byla deprotekce, kopulační reakce 1, promývání, kopulační reakce 2, promývání, Ac20 čepička, promývání, deprotekce.

Zkratky:

OtBu: t-butylester, tBu: t-butyl,

Boc: t-butoxykarbonyl,

Pmc: 2,2,5,7,8-pentamethylchroma-6-sulfonyl,

Hmb: 2-hydroxy-4-methoxybenzyl,

Fmoc: 9-fluorenylmethoxykarbonyl.

Příklad 2

Konstrukce syntetického genu, kódujícího BLAT

Plasmidové konstrukce byly prováděny použitím standardních klonovacích metodologií, jak jsou popsány v Maniatis a kol., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982). Enzymy a další reagenty byly získány od společnosti Gibco-BRL, Gaithersgurg, MD nebo New England Biolabs, Beverly MA 01915. Způsoby natrávení, identifikace, získávání a čištění různých oligonukleotidů a DNA fragmentů používaných podle předloženého vynálezu jsou známy odborníkům stejně tak jako způsoby ligace těchto sekvencí do vektorů, transformace hostitelských mikroorganismů a kultivace těchto hostitelských mikroorganismů za podmínek umožňujících produkci plasmidové DNA a rekombinantních proteinových produktů.

DNA sekvence kódující lidský BLAT (SEQ ID NO: 8) byla sestavena z 8 chemicky syntetizovaných oligonukleotidů s rozmezím velikostí od 52 do 86 bází. Oligonukleotidy byly vytvořeny použitím konvenčního přístroje pro syntézu DNA jako je Applied Biosystems model 380A nebo 380B (komerčně dostupný od společnosti Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404). Sekvence oligonukleotidů byla navržena tak, aby 4 z oligonukleotidů vytvářely jedno vlákno syntetického genu a zbývající 4 oligonukleotidy vytvářely komplementární vlákno syntetického genu. Před sestavením byly oligonukleotidy zpracovány ·· ··. .*·. · ♦ · · :

• · - ! .« ·· ·· • · ?*! · · · · polynukleotidovou kinázou v přítomnosti ATP pro fosforylaci volných hydroxylových skupin jednotlivých oligonukleotidů.

oligonukleotidů bylo smícháno v ekvimolární koncentraci (3 pikomolů/ μΐ) v objemu 100 μΐ, zahřáto na teplotu 95 °C a postupně ochlazováno na teplotu okolí v průběhu periody několika hodin. To umožnilo správné párování bází jednotlivých oligonukleotidů. T4 DNA ligáza byla přidána pro ligaci oligonukleotidů a vytvoření dvouvláknové DNA s přibližně 285 páry bází, která byla analyzována a čištěna na 2% agarózovém gelu. Tento fragment, který měl lepivé konce, byl ligován do pUC18 vektoru natráveného Ndel a BamHI. Ligační směs byla transformována do kompetentních DH10B buněk, které byly naneseny na trypton-kvasinkové agarové destičky obsahující 100 μg/ml ampicilinu. Kolonie, které přes noc vyrostly, byly analyzovány na přítomnost plasmidů, které obsahovaly chemicky syntetizovaný gen. To bylo provedeno vyčištěním plasmidové DNA z těchto kolonií, natrávením plasmidové DNA pomocí Ndel a BamHI a ověřením přítomnosti fragmentů s přibližně 285 páry bází. Správnost sekvence byla následně potvrzena DNA sekvenční analýzou. Plasmid byl pojmenován pOJ838.

Příklad 3

Konstrukce plasmidů exprimujících BLAT fúzovaný protein

Jelikož BLAT je malý protein, bylo výhodné zvýšit jeho velikost vytvořením fúzovaného proteinu. Pro tento účel byly používáni dva fúzoví partneři. Jedním byla glutathion-Stransferáza (GST), která má místo štěpení faktorem Xa a sekvence aminokyselin označené v předložené přihlášce jako

• ·· · ··

SEQ ID NO: 6, jako je kódovaná vektorem pGEX-21 (Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ 08855); druhým byla kratší peptidová sekvence MIIGLMVGGVSGSGSGSGDDDDP (SEQ ID NO: 3).

Pro získání přirozeného beta-lipotropinu se fúzované proteiny zpracovávají buď chemicky nebo enzymatickým natrávením pro oddělení beta-lipotropinu od jeho fúzového partnera. Toho se dosahuje vložením míst pro enzymatické nebo chemické štěpení mezi fúzovaného partnera a betalipotropin. Pro GST fúzi byla zvolena rozpoznávací místa pro enterokinázu nebo faktor Xa; pro fúzi malého syntetického peptidu (SEQ ID NO: 3) byl vložen prolin, čímž se umožnilo chemické štěpení po zpracování kyselinou.

Plasmid kódující GST fúzi s rozpoznávací sekvencí faktoru Xa (IEGR) byl konstruován následujícím způsobem. Plasmid pOJ838 (pUC18 obsahující syntetický beta-lipotropin; viz Příklad 4) byl natráven Ndel a Nrul a největší vektorový fragment byl gelově čištěn. Syntetický linker sekvence 5'vektoru a DH10B buněk.

kvasinkové ampicilinu.

analyzovány

TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 4) a jeho komplement byly smíchány v ekvimolárních množstvích, zahřívány na teplotu 95 °C a ponechány ochladit se postupným snižováním teploty na přibližně 25 °C. Ochlazený linker byl ligován do fragmentu ligační směs byla transformována do kompetentních Transformované buňky přeneseny na tryptonagarové destičky, obsahující 100 gg/ml Kolonie, které vyrostly přes noc, byly na přítomnost plasmidů, které obsahovaly sekvenci linkeru. To bylo provedeno čištěním plasmidové DNA z těchto kolonií a ověřením přítomnosti nového BglII místa, φ φ φ φ » φ

které bylo vloženo prostřednictvím linkeru. Správné sekvence linkeru byly následně potvrzeny DNA sekvenční analýzou. Výsledný plasmid byl pojmenován pOJ839.

Plasmid pOJ839 byl natráven BglII a EcoRI a malý fragment obsahující gen beta-lipotropinu (nyní vázaný k rozpoznávací sekvenci faktoru Xa) byl gelově čištěn a lígován do PGEX 2-T natráveného BamHl a EcoRI. Ligační směs byla transformována do kompetentních DH10B buněk, které byly naneseny na trypton-kvasinkové agarové destičky obsahující 100 μg/ml ampicilinu. Kolonie, které vyrostly přes noc, byly analyzovány na přítomnost plasmidů, které obsahovaly nový fragment s přibližně 300 páry bází s následujícím natrávením Sací. Tento nový plasmid byl pojmenován p0J840.

Příklad 4

Rekombinantní vektor pHMM260-ProCpB(10)/LVPR/beta lipotropin (R49) kódující fúzovaný protein prokarboxypeptidázy a BLAT

Rekombinantní DNA vektor exprese, pHMM26O, obsahuje kazetu exprese ProCpB(10)/LVPR/beta lipotropin (R49) , fúzovaný protein prokarboxypeptidázy a BLAT. Tento vektor byl vytvořen použitím standardních klonovacích technik. Anotace kazety exprese pHMM26O je znázorněna na Obr. 16. Kazeta exprese se lemuje místem Ndel na konci 5' a místem BamHl na konci 3'. Propeptidová část prasečího proteinu prokarboxypeptidáza B se nachází na konci 5' kazety, začíná zbytkem Met a končí zbytkem Ser. Rozpoznávací sekvence thrombinové proteázy, LVPR, se nachází okamžitě na 3' prokarboxypeptidázové sekvence. Sekvence začínající zbytkem Glu na konci 3’ thrombinového místa štěpení kóduje divoký ··♦· typ lidského beta-lipotropinu.

Několik odvozených kazet bylo zkonstruováno tak, že poloha 45 BLAT sekvence byla změněna z Arg (R49) sekvence divokého typu na Ala (A4 9) pHMM261 nebo Glu (E49) pHMM262 nebo Gin (Q49) pHMM263. Tyto deriváty byly vytvořeny s cílem snížit náchylnost na proteolýzu během syntézy a čištění fúzovaných proteinů. Všechny tyto vektory kódují rozpustné fúzované proteiny.

Příklad 5

Rekombinantní vektor pHMM268 kódující fúzovaný protein serinové hydroxymethyltransferázy (SHMT) a BLAT

Fúzovaný protein obsahující aminoterminální sekvenci enzymu serinová hydroxymethyltransferáza (SHMT) byl konstruován použitím standardních klonovacích technik. Plasmid pHMM268 byl exprimován na vysoké úrovni v E. coli. Fúzovaný protein produkovaný pHMM268 byl nerozpustný a bylo možno získat částicovou frakci. Tento rys představoval výhodu v ochraně proti proteolytické degradaci.

Příklad 6

Podávání myšího BLAT po 7 dní samcům myši A^vy/A

A^vy/A myš je model pro obezitu a diabetes. U tohoto inbredního kmenu se vyvíjí hyperglykémie, hyperinzulínemie a necitlivost na inzulín ve střední části života a proto představuje užitečný model jak pro obezitu, tak i pro diabetes.

• I» · ·· · ·· ·· ► · · • ·

Samci myši A^vy/A byli zakoupeni od Harlan Co. (Indianapolis, IN) ve stáří přibližně 6 měsíců. Zvířata byla chována po 6 v kleci a krmena ad libitum krmivém 5008 a vodou. Hladina glukózy v krvi byla měřena v pravidelných intervalech; jakmile ranní hladina glukózy dosáhla alespoň 300 mg/dl, zvířata byla vystavena experimentálnímu protokolu. Pět náhodně zvolených zvířat bylo společně chováno jako kontrola; pět náhodně zvolených zvířat bylo chováno společně a dostávalo ošetření myším BLAT (myší BLAT sekvence je snadno dostupná; viz například M. Notake a kol., FEBS Lett. 156, 67-71, 1983; zde zahrnuto jako reference), syntetizovaný technikami v pevné fázi.

Myši podstupující ošetření BLAT dostávaly 60 μg bid subkutánně (SC) (200 μΐ celkový objem každé dávky); kontrolní zvířata dostávala 200 μΐ vehikula bid (solný roztok) Zvířatům byla injekce dávána dvakrát denně, ráno a odpoledne, po 6 dní; v den 7 dostaly pouze ranní injekci.

Hladina glukózy v krvi, tělesná hmotnost a spotřeba potravy byly měřeny ráno v den 0. Tělesná hmotnost a spotřeba potravy byly měřeny ráno v den 1 až 6. Triglyceridy v plasmě byly měřeny ráno v den 6. Myši byly ponechány hladovět od odpoledne dne 6 do rána dne 7. V den 7 byl proveden orální test tolerance glukózy. Hladina glukózy v krvi v čase nula byla měřena 2 hodiny po ranní injekci solného roztoku nebo BLAT. Pro tento test byl zvířatům orálně podán 25% roztok dextrózy (100 μ1/10 g tělesné hmotnosti), potom jim byly odebrány vzorky krve 30, 60 a 120 minut později. Vzorky krve byly použity pro určení hladin glukózy a inzulínu. Po • 9 • · • · ·

• · · ·· · ·· ···· ·· ·· provedeném testu tolerance glukózy byla zvířata krmena ad libitum. Ve dnech 1, 3 a 14 po poslední SC injekci solného roztoku nebo BLAT byly zvířatům odebrány vzorky krve pro určení hodnot glukózy v krvi.

Výsledky :

BLAT Podávání snižuje krevní glukózu a inzulín in vivo

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na Obr. 1-8. V průběhu sedmidenního ošetřování zkonzumovala zvířata v kontrolní skupině a testované skupině přibližně 4,5 až 6 gramů potravy (Obr. 1) . Tělesná hmotnost v obou skupinách zůstala stejná v obou skupinách na přibližně 50 gramech (Obr. 2).

Ošetření pomocí BLAT snížilo triglyceridy v plasmě u ošetřených myší po 6 dnech ošetřování (viz Obr. 3) . Kontrolní zvířata vykazovala střední hodnotu 3,05 nmol/L (standardní odchylka 0,58), zatímco ošetřená zvířata byla změřena s hodnotou 2,05 nmol/L (standardní odchylka 0,43). To reprezentuje pokles triglyceridů v séru o přibližně 30% až 35

BLAT také indukoval podstatný pokles hladiny glukózy v krvi u ošetřovaných zvířat (Obr. 4) . Po 7 dnech podávání. BLAT ošetřená skupina manifestovala hladinu glukózy v krvi 135 mg/dl (standardní odchylka 16); v znatelném kontrastu naproti tomu kontrolní skupina měla 171 mg/dl (standardní odchylka 16) .

·« «>

• · * ϊ • · i • · · •··· ··

·· • ·

Pokles hladiny glukózy v krvi u ošetřovaných zvířat pokračoval po alespoň 3 dny po posledním podání BLAT v den 7 (Obr. 5) . Kontrolní zvířata vykazovala hladinu glukózy 331 mg/dl (standardní odchylka 79). Naproti tomu ošetřená zvířata si udržovala znatelně nižší hladinu glukózy v krvi 205 mg/dl (standardní odchylka 76). Účinek BLAT na snižování hladiny glukózy v krvi nebyl pozorován 14 dní po posledním podávání BLAT (Obr. 6).

Pro určení účinků ošetření pomocí BLAT na hladinu inzulínu byl proveden orální test tolerance glukózy po 7 dnech ošetřovací periody a hladovění přes noc (Obr. 7 a Obr. 8) . Kontrolní a ošetřovaná zvířata vykázala počáteční vzrůst hladiny glukózy v krvi z přibližně 80 mg/dl na 200 mg/dl nebo více v časový bod 30 minut po počátku testu; potom obě skupiny vykázaly srovnatelné rychlosti poklesu hodnot po 2 hodinách (Obr. 7) . Zarážející bylo, že ošetřená zvířata vykazovala hodnoty inzulínu v plasmě podstatně pod hodnotami kontrolních zvířat (Obr. 8) . Například v časovém bodě 30 minut měla kontrolní zvířata hladinu inzulínu 11,5 ng/ml (standardní odchylka 1,9), zatímco ošetřená zvířata měla hodnoty inzulínu 6,0 ng/ml (standardní odchylka 3,0).

Příklad 7

Podávání myšího BLAT po 14 dní samcům A^vy/a myši byli chováni po 6 v kleci a krmeni ad libitum krmivém 5008 a vodou. Hladina glukózy v krvi byla měřena v pravidelných intervalech; jakmile ranní hladina glukózy dosáhla alespoň 300 mg/dl, zvířata byla vystavena experimentálnímu protokolu. Pět náhodně zvolených zvířat bylo společně

chováno jako kontrola; pět náhodně zvolených zvířat bylo chováno společně a dostávalo ošetření myším BLAT, který byl syntetizován technikami v pevné fázi.

Myši podstupující ošetření BLAT dostávaly 60 gg bid subkutánně (SC) (200 μΐ celkový objem každé dávky); kontrolní zvířata dostávala 200 μΐ vehikula bid (solný roztok) Zvířatům byla injekce dávána dvakrát denně, ráno a odpoledne, po 13 dní; v den 14 dostala pouze ranní injekci.

Hladina glukózy v krvi, tělesná hmotnost a spotřeba potravy byly měřeny ráno v den 0. Tělesná hmotnost a spotřeba potravy byly měřeny ráno v den 1 až 13. Myši byly ponechány hladovět od odpoledne dne 13 do rána dne 14. V den 7 byl proveden orální test tolerance glukózy. Hladina glukózy v krvi v čase nula byla měřena 2 hodiny po ranní injekci solného roztoku nebo BLAT. Pro tento test byl zvířatům orálně podán 25% roztok dextrózy (100 μ1/10 g tělesné hmotnosti), potom jim byly odebrány vzorky krve 30, 60 a 120 minut později. Vzorky krve byly použity pro určení hladin glukózy a inzulínu. Po provedeném testu tolerance glukózy byla zvířata krmena ad libitum. Ve dnech 1, 3 a 14 po poslední SC injekci solného roztoku nebo BLAT byly zvířatům odebrány vzorky krve pro určení hodnot glukózy v krvi.

Výsledky:

BLAT podávání po 14 dní snižuje krevní glukózu a inzulín

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na Obr. 9-10. V průběhu čtrnáctidenního ošetřování zkonzumovala zvířata v kontrolní skupině a testované skupině přibližně 4,5 až 6 gramů potravy. Tělesná hmotnost v obou skupinách zůstala stejná v obou skupinách na přibližně 50 gramech (data nejsou znázorněna).

Pro určení účinků dvoutýdenního ošetření pomocí BLAT na hladinu inzulínu byl proveden orální test tolerance glukózy po 14 dnech ošetřovací periody (Obr. 9 a Obr. 10). Kontrolní a ošetřovaná zvířata vykázala počáteční vzrůst hladiny glukózy v krvi z asi 80 mg/dl na 300 mg/dl nebo více, v časovém bodě 30 minut; potom obě skupiny vykazovaly srovnatelnou rychlost poklesu hodnot, až do konečného bodu testu po dvou hodinách (Obr. 9). Například, ošetřená zvířata vykázala průměrnou hladina glukózy v krvi v 30 minutovém časovém bodě 289 mg/dl (standardní odchylka 24), zatímco kontrolní zvířata měla hladinu 348 mg/dl (standardní odchylka 18). Nižší hladiny byly pozorovány také v časových bodech 60 minut a 120 minut. Například po 120 minách ošetřená zvířata měla střední hladinu glukózy v krvi 114 mg/dl (standardní odchylka 4) , zatímco kontrolní zvířata měla hladinu 188 mg/dl (standardní odchylka 23).

Ošetřená zvířata vykazovala hodnoty inzulínu v plasmě podstatně pod hodnotami kontrolních zvířat (Obr. 10) . Například v časovém bodě 30 minut měla kontrolní zvířata

hladinu inzulínu 7,4 ng/ml (standardní odchylka 2,1), zatímco ošetřená zvířata měla hladinu inzulínu 4,8 ng/ml (standardní odchylka 0,6).

Příklad 8

BLAT stimuluje příjem glukózy u 3T3 adipocytů

Myší 3T3-L1 buňky byly uloženy do 100 μΐ růstového média na jamku v 96 jamkových destičkách, tak aby na jednu jamku připadlo přibližně 25,000 buněk.

Růstové médium:

DMEM, vysoké množství glukózy, bez L-glutaminu

10% telecí sérum mM L-glutamin

1% PenStrep

1,25 μg/ml fungizonu

Buňky byly indukovány k diferenciaci na adipocyty 3 dny po umístění na destičky nahrazením růstového média diferenciačním médiem.

Diferenciační médium:

DMBM, vysoké množství glukózy, bez L-glutaminu

10% FBS mM L-glutaminu

1% Pen Střep

1,25 μg/ml fungizonu mM Hepes

0,25 μΜ dexamethasonu (1 μΙ/ml 0,25 mM zásobního roztoku)

0,5 mM IBNX (10 μΐ/ml 50 mM zásobního roztoku) gg/ml inzulínu (1 μΐ/ml 5 mg/ml zásobního roztoku)

Médium bylo odstraněno z buněk odsátím použitím osmikanálového zařízení připojeného k zdroji podtlaku regulátorem průtoku. Čerstvé médium bylo dodáno do jamek použitím osmikanálového maticového elektronického pipetoru, nastaveného na nejmenší rychlost, tak aby se minimalizovalo porušení buněk.

V den 1 bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ diferenciačního média pro inicializaci diferenciace 3T3 buněk na adipocyty.

V den 3 po počátku diferenciace bylo médium změněno na diferenciační médium obsahující inzulín, ale bez IBMX nebo dexamethasonu (inzulínové médium). V den 6 bylo médium znovu změněno na diferenciační médium neobsahující inzulín, IBNX nebo dexamethason (FBS médium). Buňky byly udržovány ve FBS médiu, s napájením další den, dokud nebyly připraveny pro test transportu glukózy ve dnech 15 až 21 po začátku diferenciace.

Příklad 9

Test transportu glukózy v 3T3 buňkách indukovaných pro diferenciaci na adipocyty v přítomnosti BLAT

Myší 3T3-L1 buňky byly indukovány na diferenciaci na adipocyty způsobem podle Příkladu 8. 15 - 24 hodin před provedením testu transportu glukózy byly buňky zpracovány následujícím způsobem:

Jamky byly promývány dvakrát 100 ml fosfátově pufrovaným • · · · • · · · ·· ··

- 62 ’ . ······ °C, odsávání mezi fyziologickým roztokem (PBS) při promýváními.

2. Dále byly do každé jamky přidány 100 ml DMEM, vysoké množství glukózy, 1% antibiotický/antimykotický roztok, 2 mM glutamin, 0,1% BSA (zahřáté na teplotu 37 °C) , 0 až 1000 nM myšího BLAT (syntetizován technikami v pevné fázi), a 0 až 100 nM inzulínu. Toto je fáze sérového hladovění.

3. Potom byly buňky inkubovány přes noc při teplotě 37 °C.

V den pokusu byly buňky ošetřeny následujícím způsobem:

Médium bylo odstraněno, destičky byly přeneseny na papír a buňky byly dvakrát promývány 100 ml KRBH pufru (KrebsRingerův pufr, obsahující Hepes, pH 7,4).

2. Po odstranění závěrečného promývacího roztoku byly buňky inkubovány při teplotě 37 °C po 1 hodinu v 100 μΐ KRBH, 0,1% BSA s 100 μΜ glukózy, 10 μΐ/ml (0,1 μΟί/^βιη^) radioaktivně označené 2- deoxyglukózy (C¹⁴) a požadovanou koncentrací inzulínu.

3. Po provedení inkubace s radioaktivně označenou glukózou bylo přidáno 10 μΐ lOx cytochlasinu B (200 μΜ) pro zastavení dalšího příjmu glukózy buňkami.

4. Příjem radioaktivně označené glukóza byl stanoven odečtením destiček na destičkové čtečce Microbeta.

Výsledky:

Výsledky tohoto experimentu jsou souhrnně uvedeny na Obr. 11. Příjem glukózy 3T3 buňkami indukovanými k diferenciaci na adipocyty byl stimulován od asi 3-násobku do asi 6násobku, pokud byly adipocyty předem ošetřeny v testu příjmu pomocí BLAT.

• · »9»·

Příklad 10

Test transportu glukózy v 3T3 buňkách indukovaných pro diferenciaci na adipocyty v přítomnosti funkčních fragmentů BLAT

Myší 3T3-L1 buňky byly indukovány na diferenciaci na adipocyty způsobem podle Příkladu 8. 15 - 24 hodin před provedením testu transportu glukózy byly buňky zpracovány následujícím způsobem:

Jamky byly promývány dvakrát 100 ml fosfátově pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) při 37 °C, odsávání mezi promýváními.

2. Dále byly do každé jamky přidány 100 ml DMEM, vysoké množství glukózy, 1% antibiotický/antimykotický roztok, 2 mM glutamin, 0,1% BSA (zahřáté na teplotu 37 °C), 0 až 1000 nM myšího nebo lidského BLAT (syntetizován technikami v pevné fázi) , a 0 až 100 nM inzulínu. Toto je fáze sérového hladovění. Například, v jednom testu byl použit lidský BLAT fragment označený v této přihlášce vynálezu jako SEQ ID NO: 10; v jiném testu byl použit lidský BLAT fragment označený v této přihlášce vynálezu jako SEQ ID NO: 12.

3. Potom byly buňky inkubovány přes noc při teplotě 37 °C.

V den pokusu byly buňky ošetřeny následujícím způsobem:

1. Médium bylo odstraněno, destičky byly přeneseny na papír a buňky byly dvakrát promývány 100 ml KRBH pufru (KrebsRingerův pufr, obsahující Hepes, pH 7,4).

2. Po odstranění závěrečného promývacího roztoku byly. buňky inkubovány při teplotě 37 °C po 1 hodinu v 100 μΐ KRBH, 0,1% BSA s 100 μΜ glukózy, 10 μΐ/ml (0,1 μΟί/^πΟοΛ) radioaktivně označené 2- deoxyglukózy (C¹⁴) a požadovanou koncentrací ··· · inzulínu.

3. Po provedení inkubace s radioaktivně označenou glukózou bylo přidáno 10 μΐ lOx cytochlasinu B (200 μΜ) pro zastavení dalšího příjmu glukózy buňkami.

4. Příjem radioaktivně označené glukóza byl stanoven odečtením destiček na destičkové čtečce Microbeta.

Výsledky:

Příjem glukózy 3T3 buňkami indukovanými k diferenciaci na adipocyty je zvýšen ve srovnání s kontrolními buňkami, pokud byly adipocyty před provedením testu příjmu zpracovány funkčními fragmenty BLAT.

Příklad 11

Funkční Analogy BLAT

Myší 3T3-L1 buňky byly indukovány k diferenciaci na adipocyty jako v Příkladu 10. Adipocyty byly potom vystaveny analogům lidského BLAT, například SEQ ID NO: 26 až SEQ ID NO: 35 a transport glukózy byl monitorován jako v Příkladu 8. Funkční analogy vykazovaly v zásadě stejné výsledky jako přirozený BLAT.

Příklad 12

Podávání lidského BLAT po 14 dní samcům myši A^vy/ft

V pevné fázi syntetizovaný lidský BLAT byl podáván samcům myši A^vy/A v dávkování a podle režimu, popsaného v Příkladu .

•4 4444

4· ··

4 <

4 <

4 ¹

Výsledky:

Podávání lidského BLAT snížilo podstatně hladiny inzulínu v séru samců myši A^vy/a (viz Obr. 12 a 13) .

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na Obr. 12-13. V průběhu čtrnáctidenního ošetřování zkonzumovala zvířata v kontrolní skupině a testované skupině přibližně 4,5 až 6 gramů potravy a tělesná hmotnost v obou skupinách zůstala stejná v obou skupinách na přibližně 50 gramech (data nejsou znázorněna).

Pro určení účinků dvoutýdenního ošetření pomocí lidského BLAT na hladinu glukózy a inzulínu v plasmě byl proveden orální test tolerance glukózy po 14 dnech ošetřovací periody. Kontrolní a ošetřovaná zvířata vykázala počáteční vzrůst hladiny glukózy v krvi z asi 80 mg/dl na 300 mg/dl nebo více, v časovém bodě 30 minut; potom obě skupiny vykazovaly srovnatelnou rychlost poklesu hodnot, až do konečného bodu testu po dvou hodinách (Obr. 12). Například, ošetřená zvířata vykázala průměrnou hladina glukózy v krvi v 30 minutovém časovém bodě 400 mg/dl (standardní odchylka 12), zatímco kontrolní zvířata měla hladinu 330 mg/dl (standardní odchylka 19). Nižší hladiny byly pozorovány také v časových bodech 60 minut a 120 minut. Například po 120 minách ošetřená zvířata měla střední hladinu glukózy v krvi 178 mg/dl (standardní odchylka 16), zatímco kontrolní zvířata měla hladinu 202 mg/dl (standardní odchylka 13) .

Ošetřená zvířata vykazovala hodnoty inzulínu v plasmě podstatně pod hodnotami kontrolních zvířat (Obr. 13) . Například v časovém bodě 30 minut měla kontrolní zvířata

4444

4 4 4

4 · • * ί ► e · ;

> 4 4 « ·· hladinu inzulínu 14,0 ng/ml (standardní odchylka 1,5), zatímco ošetřená zvířata

-61zvířata měla hladinu inzulínu 10,2 ng/ml (standardní odchylka 0,4). V časovém bodě 120 minut měla kontrolní zvířata hladinu inzulínu 9,3 ng/ml (standardní odchylka 2,3) a ošetřená zvířata měla hladinu inzulínu 5,4 ng/ml (standardní odchylka 0,9).

Příklad 13

Podávání myšího beta lipotropinu samcům myši Lep^ob/Lep^ob

Samci myši Lep^ob/Lep^ob zakoupení od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) byly chováni jednotlivě a krmeni ad libitum krmivém 5008 a vodou. Myším byla odebrána krev z ocasu pro počáteční stanovení hodnot glukózy, inzulínu a triglyceridů. Myši byly rozděleny buď do kontrolní skupiny nebo do skupiny pro podávání 60 μg nebo 120 μg bid myšího beta lipotropinu. Ošetřované myši dostávaly buď 60 μg bid SC nebo 120 μg bid SC (200 μΐ celkový objem každé dávky); kontrolní myši dostávaly 200 μΐ vehikula (solný roztok). Myším byla podávána injekce denně v 7.00 a 15.00 po 16 dní a pouze injekce v 7.00 v den 17. Tělesná hmotnost a spotřeba potravy byly měřeny ráno ve dnech 0 až 17. Myším byla odebrána krev z ocasu ráno v den 7 pro stanovení hodnot glukózy, inzulínu a triglyceridů v krvi. Zvířata byla ponechána přes noc od odpoledne v den 13 do rána v den 14. V den 14 byl proveden orální test tolerance glukózy. Hladiny glukózy a inzulínu v krvi v čase nula byly měřeny 2 hodiny po ranní injekci.

··

Myším byl orálně podán 25% roztok dextrózy (100 μ1/10 g tělesné hmotnosti), potom jim byly odebrány vzorky krve 30, 60 a 120 minut později. Vzorky krve byly použity pro určení hladin glukózy a inzulínu. Po provedeném testu tolerance glukózy byla zvířata krmena ad libitum. Ve den 16 byly odebrány vzorky krve z ocasu pro určení hodnot glukózy, inzulínu, triglyceridů a kortikosteronu v krvi. V den 17 byly myši usmrceny.

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na Obr. 14. Hladina inzulínu v krvi byla významné nižší u ošetřených zvířat v průběhu 16 denní periody ošetřování. Například v den 7 ošetřování kontrolní zvířata vykazovala hodnoty inzulínu přibližně 300 ng/ml, zatímco ošetřeným zvířatům bylo změřeno přibližně 215 ng/ml, snížení alespoň 30%. Navíc hladina inzulínu v krvi zůstávala nižší u ošetřených zvířat v den 16 ošetřování (Obr. 14).

Příklad 14

Podávání lidského BLAT samcům myši Lep^ob/Lep^ob pumpou Alzet™

Samci myši Lep /Lep zakoupené od společnosti Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) ve věku jeden měsíc byly chovány jednotlivě a krmeny ad libitum krmivém 5008 a vodou s osvětlením po dobu 12 hodin (vypnuto od 18.00 do 6.00). Myším byla odebrána krev z ocasu pro počáteční stanovení hladin glukózy, inzulínu a triglyceridů. Ošetřovaná zvířata dostávala 0,24 mg/den nebo 0,48 mg/den kontinuálního podávání lidského beta lipotropinu implantovanou pumpou Alzet™ (Alza, (ER4-VBH-43) podkožně lne.) takže střední hladiny glukózy a triglyceridů byly stejné ve všech třech ·»··

4

· · ·

4 skupinách; kontrolním zvířatům byl podáván solný roztok. Pumpy byly plněny solným roztokem pro kontrolní skupinu a 20 mg/ml lidského beta lipotropinu pro skupinu s nízkými dávkami a 40 mg/ml lidského beta lipotropinu pro skupinu s vysokými dávkami. Myši byli anestetizovány isofluranem před implantací pumpy. Tělesná hmotnost a spotřeba krmivá byly měřeny ráno ve dnech 0 až 7. Myším byla odebrána krev z ocasu ráno v den 4 pro stanovení hodnot glukózy, inzulínu a triglyceridů v krvi. Myši byly ponechány hladovět přes noc od odpoledne v den 6 do rána v den 7.

V den 7 byl proveden orální test tolerance glukózy. Myším byla odebrána krev z ocasu pro stanovení hodnot inzulínu a glukózy v čase nula, potom jim byl orálně podáván 25% roztok dextrózy (100 μ1/10 g tělesné hmotnosti), pak jim byly odebrány vzorky krve 30, 60 a 120 minut později. Krevní vzorky byly použity pro stanovení hladin glukózy a inzulínu. Po provedení orálního testu tolerance glukózy byly myši krmeny ad libitum.

Výsledky testu tolerance glukózy ukazující hodnoty inzulínu v plasmě jsou znázorněny na Obr. 15. Hodnoty 0,24 mg BLAT/den byla přibližně 25% nižší než u kontrolní skupiny, zatímco hodnoty 0,48 mg BLAT/den byly o asi 40% nižší než u kontrolní skupiny (viz Obr. 15, oblast pod křivkami).

Příklad 15

Syntéza v pevné fázi a čištění analogu lidského BLAT proteinu

Analog lidského BLAT peptidu (t.j. analog představovaný ·· ·♦ ·*··

···· ··

A t · ·· ·· ·«

SEQ ID NO: 26), ve kterém Ala je vložen namísto Glu v SEQ ID NO: 8, byl syntetizován v jediném běhu použitím Fmoc chemických postupů. Syntéza BLAT je komplikována přítomností několika asp-gly dipeptidových sekvencí v N-terminální části peptidu. Bylo pozorováno, že aspartylové postranní řetězce v asp-gly dipeptidové sekvenci podstupují bází katalyzovanou cyklizaci a následnou adici piperidinem během FMOC syntézy. Tato reakce se eliminuje použitím Fmoc-(FmocHmb)-glycinu v každé asp-gly sekvenci během syntézy. Ochrana glycylového amidu skupinou Hmb inhibuje cyklizaci aspartylového postranního řetězce. skupinou Hmb inhibuje cyklizaci aspartylového postranního řetězce. Po provedení štěpení, zbavení ochrany a čištění pomocí HPLC s obrácenými fázemi může být peptid analyzován elektosprejovou hmotovou spektometrií. Hlavní součástí, pozorovanou při této syntéze BLAT je peptid plné délky, který má očekávanou hmotnost. Použití tohoto způsobu dovoluje produkci množství čistého proteinu, které přesahuje 100 mg z jednoho běhu v 0,1 mmolové škále.

Materiály:

Wangova pryskyřice (1% zesíťovaný polystyren funkcionalizovaný p-benzoxybenzyl alkoholem) s předem naneseným Fmoc-Glu (OtBu) s přibližně 0,6 mmolu aminokyseliny na jeden gram pryskyřice, N-methylpyrrolidon (NMP), piperidin, 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3tetramethyluronium hexafluorfosfát (HBTU), 2 M N,Ndiisopopylethylamin (DIEA), 1-hydroxybenzotriazol (HOBt), dichloromethan (DCM), dimethylformamid (DMF).

Pryskyřice, na kterou byla předem vázána Fmoc-chráněná C- 70 • titi titi titi * ti • · • ti «ti terminální aminokyselina (0,1 nebo 0,25 mmolů aminokyselina) , byla zvážena a umístěna do reakční komory. Pryskyřice byla předem nabobtnána promýváním DCM. Potom byla pryskyřice promývána NMP. N-terminální Fmoc skupiny byla odstraněna inkubací pryskyřice v 18-22 % roztoku piperidinu v NMP. Po deprotekci byla pryskyřice extenzivně promývána NMP.

Jeden mol následující Fmoc-chráněné aminokyseliny určené k přidání k peptidu byl rozpuštěn v 2,1 g NMP, 2,0 g 0,45 M HBTU/HOBt reagentu v DMF. Po rozpuštění byla započata aktivace aminokyseliny přidáním 3 ml 2M DIEA v NMP. Aktivovaná aminokyselina byla potom přidána k pryskyřici zbavené ochrany a ponechána kopulovat. Po ukončení kopulace

byla pryskyřice extenzivně promývána NMP. Úplný cyklus
deprotekce a kopulace	byl potom	opakován pro každou
následující aminokyselinu. Specifické cyklové kroky v
syntéze	byly následující:
Cykl	Aminokyšelina	Kroky
1	Ala	úplné promývání
2	Gly	jednoduchá	kopulace
3	Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
4	Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
5	Tyr(tBu)	jednoduchá	kopulace
6	Ala	jednoduchá	kopulace
7	Asn(Trt)	jednoduchá	kopulace
8	Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
9	Ile	j ednoduchá	kopulace
10	Ile	j ednoduchá	kopulace

• ·

11	Ala	jednoduchá kopulace
12	Asn(Trt)	jednoduchá kopulace
13	Lys(Boc)	jednoduchá kopulace
14	Phe	jednoduchá kopulace
15	Leu.	jednoduchá kopulace
16	Thr(tBu)	jednoduchá kopulace
17	Val	jednoduchá kopulace
18	Leu	jednoduchá kopulace
19	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
20	Thr(tBu)	jednoduchá kopulace
21	.Gin(Trt)	jednoduchá kopulace
22	Ser(tBu)	jednoduchá kopulace
23	Lys(Boc)	jednoduchá kopulace
24	Glu(OtBu)	jednoduchá kopulace
25	Ser(tBu)	jednoduchá kopulace
26	Thr(tBu)	jednoduchá kopulace
27	Met	jednoduchá kopulace
28	Phe	jednoduchá kopulace
23	Gly	jednoduchá kopulace
30	Gly	jednoduchá kopulace
31	Tyr(tBu)	jednoduchá kopulace
32	Arg (Pníc)	jednoduchá kopulace
33	Lys(Boc)	jednoduchá kopulace
34	Asp(OtBu)	jednoduchá kopulace
35	Lys(Boc)	jednoduchá kopulace
36	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
37	Pro	dvojitá kopulace/Ac20
38	Ser(tBu)	jednoduchá kopulace
39	Gly	jednoduchá kopulace
40	Trp (Boc)	jednoduchá kopulace
41	Arg(Pmc)	jednoduchá kopulace

čepička čepička čepička • · • · • · e

	- 72 -	»····· · • · · · · · · · »
Phe	jednoduchá	kopulace
His(Trt)	jednoduchá	kopulace
Glu(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
Met	jednoduchá	kopulace
Arg(Pmc)	jednoduchá	kopulace
Tyr(tBu)	jednoduchá	kopulace
Pro	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
Gly	j ednoduchá	kopulace
Glu(OtBu)	jednoduchá	kopulace
Asp(OtBu)	jednoduchá	kopulace
Lys(Boc)	jednoduchá	kopulace
Lys(Boc)	j ednoduchá	kopulace
Glu(OtBu)	jednoduchá	kopulace
Ala	jednoduchá	kopulace
Ala	jednoduchá	kopulace
Val	j ednoduchá	kopulace
Leu	j ednoduchá	kopulace
Leu	j ednoduchá	kopulace
Ser(tBu)	jednoduchá	kopulace
His (Trt)	j ednoduchá	kopulace
Glu(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
Leu	jednoduchá	kopulace
Asp(OtBu)	j ednoduchá	kopulace
Ala	jednoduchá	kopulace
Gin(Trt)	jednoduchá	kopulace
Ala	j ednoduchá	kopulace
Gly	jednoduchá	kopulace
Ala	jednoduchá	kopulace
Gly(Fmoc-hmb)	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
Asp(OtBu)	jednoduchá	kopulace
Asp(OtBu)	jednoduchá	kopulace

• · ·'·· · · · · · ·· ··· ·· · · * ♦ -73 ·*··*··· ♦ · ·

73	Ala	jednoduchá kopulace
74	pro	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
75	Gly(Fmoc-hmb)	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
76	Asp(OtBu)	jednoduchá kopulace
77	Pro	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
78	Gly(Fmoc-hmb)	dvojitá kopulace/Ac20	čepička
79	Asp(OtBu)	jednoduchá kopulace
80	Gly	jednoduchá kopulace
81	Glu(OtBu)	jednoduchá kopulace
82	Arg(Pmc)	jednoduchá kopulace
83	Leu	jednoduchá kopulace
84	Arg(Pmc)	jednoduchá kopulace
85	Gin(Trt)	jednoduchá kopulace
86	Gly	jednoduchá kopulace
87	Thr(tBu)	jednoduchá kopulace
88	Leu	jednoduchá kopulace
89	Glu(OtBu)	jednoduchá kopulace
90		konečná deprotekce

Pro aminokyseliny, které reaguji pomalu nebo neúčinně byly prováděny dvě oddělené kopulačni reakce. Veškerý zbylý nezreagovaný peptid byl blokován zpracováním acetanhydridem. Posloupnost kroků pro jednu z takových aminokyselin byla deprotekce, kopulačni reakce 1, promývání, kopulačni reakce 2, promývání, Ac20 čepička, promývání, deprotekce.

Zkratky:

OtBu: t-butylester, tBu: t-butyl,

Boc: t-butoxykarbonyl,

Pmc: 2,2,5,7,8-pentamethylchroma-6-sulfonyl,

- 74 Hmb: 2-hydroxy-4-methoxybenzyl,

Fmoc: 9-fluorenylmethoxykarbonyl.

Příklad 16

Podávání lidského BLAT samcům krys ZDF Alzetovou pumpou

Samci krys „Zucker Diabetic Fatty (ZDF), zakoupené od společnosti Genetic Models lne. (Indianapolis, IN) , byly chovány jednotlivě a krmeny ad libitum krmivém 5008 a vodou. Ve věku pěti týdnů byly krysy ponechány hladovět přes noc pro počáteční test orální tolerance glukózy. Krev byla odebrána z ocasu pro stanovení hladin inzulínu a glukózy v časovém bodě 0 a potom byla zvířatům orálně podáván 50% roztok dextrózy (2,5 g/kg tělesné hmotnosti) a krev byla odebírána 30, 60 a 120 minut po podávání. Po provedení testu orální tolerance glukózy byly krysy krmeny ad libitum. Ve věku 6 týdnů byla zvířata rozdělena do skupin po 4 zvířatech podávání lidského BLAT. V den nula testu byla opět z ocasu odebrána krev pro měření hodnot glukózy, inzulínu, kortikosteronu a triglyceridů. Krysy byly náhodně rozděleny do kontrolní skupiny a skupin pro kontinuální podávání 0,5 mg/den nebo 1,0 mg/den lidského beta lipotropinu (ER4-VTA2) podkožně implantovanou Alzetovou pumpou. Pumpy byly naplněny solným roztokem pro kontrolní skupinu a 20,835 mg/ml lidského beta lipotropinu pro skupinu s nízkou dávkou a 41,67 mg/ml lidského beta lipotropinu pro skupinu s vysokou dávkou. Pumpy byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C v solance před podkožní implantací. Tělesná hmotnost a spotřeba potravy byly měřeny v den 0 až 8. Krevní vzorky byly odebírány ráno v den 3 pro určení hodnot glukózy, inzulínu, kortikosteronu a triglyceridů. Krysy byly ·· ···· ·

ponechány hladovět přes noc od odpoledně dne 5 do rána dne 6. V den 6, byl proveden orální test tolerance glukózy. Po provedení orálního testu tolerance glukózy byly krysy krmeny ad libitum.

Zvířata Zucker, použitá v této studii, představují dobrý model pro diabetes typu 2. Ve věku 6 až 7 týdnů hodnoty glukózy v krvi a hladina triglyceridů stoupají, zatímco sekrece inzulínu klesá. Tato zvířata jsou hyperkortikosteronemická a resistentní na inzulín.

Tabulka 3. ZDF krysy, ošetřované lidským BLAT

	Krevní	glukóza	mg/dl)	Triglyc. (mmol/1)
Ošetření (mg/den BLAT)	0	Den 2	Den 7	0	Den 2	Den 7
Kontrola	149	153	150±8	1,9	2,4	4,l±0,5
0,5	151	160	150±5,5	2,0	2,8	4,0±0,4
1,0	154	144	141±5,7	2,0	2,8	3,6±0,1

Výsledky presentované v Tabulce 3 a na Obr. 16 demonstrují zřetelný účinek lidského BLAT na ZDF krysy v dávce 1 mg denně lidského BLAT. Po 30 minutách po započetí orálního testu tolerance glukózy byla hladina glukózy v plasmě v průměru 191 ± 16 mg/dl v kontrolní skupině a 172 ± 5 mg/dl u zvířat ošetřených BLAT (viz Obr. 16) . Po 60 minutách od započetí kontrolní zvířata vykazovala hladinu glukózy 157 ± 6 mg/dl, zatímco BLT-ošetřená zvířata byla na 154 ± 8 mg/dl.

• · · · · · • ·

Tabulka 3 ilustruje, že hodnoty glukózy v krvi zůstaly nižší u zvířat, ošetřených BLAT ve srovnání s kontrolními zvířaty, obzvláště při vyšší dávce. Kontrolní zvířata vykazovala hodnoty glukózy přibližně 150 mg/dl po 0, 2 a 7 dnech následujících po začátku podávání BLAT. Naproti tomu zvířata ošetřovaná 1 mg/den lidského BLAT měla průměr 140 mg/dl v den 7, zhruba 7% nižší než kontrolní zvířata. Ošetřovaná zvířata také vykázala o 11% nižší hladinu triglyceridů v krvi než kontrolní zvířata (Tabulka 3), což demonstruje inzulinotropní účinek léčby pomocí BLAT.

Příklad 17

Lidský BLAT stimuluje transport glukózy v kosterních svalech ZDF krys

Studie byla prováděna pro určení účinku beta-lipotropinu na transport glukózy kosterním svalu. Samci Zucker diabetických obézních (ZDF/Gmi™-fa/fa) krys byly získány od společnosti Genetic Models lne. (Indianapolis, IN) . Krysy byly krmeny krysím krmivém Purina Formulab 5008 (Purina Mills, lne., St. Louis, MO) a umístěny ve světlých kontrolovaných prostorách s alternujícím dvanáctihodinovým cyklem světla a tmy. Krysy byly chovány po jedné v kleci a byl jim dán volný přístup k potravě a vodě.

Pro určení transportu glukózy ve svalové tkáni byla zvířata z Příkladu 16 anestetizována intraperitoneální injekcí pentabarbitolu sodného (6,5 mg/100 g tělesné hmotnosti) a motorické svaly byly izolovány a rozděleny na polovinu. Každá polovina tkáňového vzorku byla promývána v solance po dobu 2 minut a potom v plynem syceném (95% 02-5% CO2) KHB s

99

9999 • 9 99 · 9

9 • 9

9

9999 99

1% BSA, 8 mM glukózy a 32 mM manitolu.

Test transportu glukózy byl prováděn následujícím způsobem.

Preinkubace:

Vzorky svalové tkáně byly přeneseny do 20 ml nádobek, obsahujících 1,8 ml plynem syceného KHB s 1% BSA, 8 mM glukózy a 32 mM manitolu, s nebo bez 500 nM myšího betalipotropinu. Vzorky byly umístěny v třepané vodní lázni po dobu 20 hodin při teplotě okolí se dvěmi výměnami pufru.

Po preinkubaci byly vzorky svalové tkáně promývány při teplotě 29 °C po 15 minut za konstantního sycení plynem tvořeným 95% O₂ a 5% 00₂. Vzorky byly promývány v nádobkách, obsahujících 1,8 ml KHB s 40 mM manitolu, inzulínem (2000 μϋ/ml) nebo bez inzulínu a s nebo bez beta-lipotropinu (500 nM) .

Svalové vzorky byly potom přeneseny do nových nádobek za konstantního sycení plynem, tvořeným 95% O₂-5% C0₂. Inkubační médium sestávalo z 8 mM 3-O-methyl-glukózy (OMG), 2 mCi/ml ³H-3-OMG, 30 mM manitolu, 0,3 mCi/ml ¹⁴C manitol, 2 mM pyruvátu, inzulínu (2000 μϋ/ml), a myšího beta-lipotropinu. Kontrolní vzorky postrádaly inzulín a/nebo beta-lipotropin. Po 10 minutách při teplotě 29 °C byly vzorky fixovány vymrazováním a uchovávány zmrazené až do okamžiku testování transportu glukózy.

Transport glukózy:

Svaly byly zmenšeny na přibližně 20-25 mg pro natrávení v 0,5 ml 1M KOH při teplotě 70 °C po dobu 30 minut. Po

9 9 99 9 natrávení byly vzorky umístěny na led a 100 μΐ vzorku bylo odebráno pro analýzu glykogenu. Do zbývajících 0,4 ml vzorku bylo přidáno 0,4 ml IN HC1 a zkumavka byla podrobena víření. Potom bylo 300 ml vzorku zpracovaného HC1 přidáno do 6,4 ml scintilační tekutiny a radioaktivita ve vzorku byla určena scintilačním počítačem.

Transport glukózy byl vypočítáván na základě vnitrobuněčné akumulace ³H-3-OMG použitím ¹⁴C manitolu jako extracelulárního markéru.

Úroveň glykogenu:

Do 100 μΐ vzorku uvedeného výše bylo přidáno 17 μΐ ledové kyseliny octové spolu s 500 μΐ 0,3 M pufru octanu sodného (Ph 4,8+5 mg/ml amyloglukosidázy). Zkumavky byly ponechány inkubovat přes noc při teplotě 37 °C. Následující den bylo 50 μΐ vzorku umístěno do 96 jamkové destičky a bylo přidáno 200 μΐ Trinderova reagentu (Sigma 315-100; zředěný na 20 μΐ vodou). Destička byla inkubována po 10 minut při teplotě 37 °C a absorbance byla odečítána při vlnové délce 505 nm.

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. V zásadě čistý protein, který má aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7.
2. 2. Izolovaná nukleová kyselina kódující protein podle nároku

   1.
3. 3. Vektor zahrnující izolovanou nukleovou kyselinu podle nároku 2.
4. 4. Vektor podle nároku 3, ve kterém uvedená izolovaná nukleová kyselina je operativně vázána na promotorovou sekvenci.
5. 5. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 4.
6. 6. Způsob konstrukce rekombinantní hostitelské buňky, která má schopnost exprimovat beta-lipotropin, vyznačující se tím, že se do uvedené hostitelské buňky vloží libovolným způsobem vektor podle nároku 5.
7. 7. Způsob exprese beta-lipotropinu v rekombinantní hostitelské buňce podle nároku 6, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci uvedené rekombinantní hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresi genu.
8. 8. Farmaceutický přípravek obsahující jako účinnou složku ·* ··»·

   Ηϊ

   -&r·« 49

   4 9 4 4

   4 4 4

   4 4 4

   9444 99
9. 9 4 9

   94 4

   44 94

   Λ 9 4 ·

   9 4 9 4 • 4 · 4

   4 4 4 4

   9 4 44 beta-lipotropin, jeho analog nebo funkční fragment, společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, excipienty nebo ředidly.

   g. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, ve kterém uvedený beta-lipotropin je lidský beta-lipotropin.
10. 10. Beta-lipotropin, jeho analog nebo funkční fragment, pro použití při léčení diabetů nebo jeho komplikací.
11. 11. Způsob léčení diabetů u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství betalipotropinu nebo jeho analogu.
12. 12. Způsob léčení diabetů u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství funkčního fragmentu beta-lipotropinu.
13. 13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený beta-lipotropin je lidský beta-lipotropin, který má sekvence identifikovanou jako SEQ ID NO: 8.
14. 14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený beta-lipotropin je rekombinantní lidský beta-lipotropin.
15. 15. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený diabetes je diabetes typu 1 nebo typu 2.
16. 16. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený savec je člověk.

    « · • · • · • · • · • ·

    -μ

    -8217. Způsob léčení komplikací diabetů u pacienta, který má jeho potřebu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.
17. 18. Způsob snižování hladiny glukózy v krvi u savce, vyznačující se tím, že se podává účinné množství betalipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.
18. 19. Způsob léčení hyperglykémie u savce, který má jeho potřebu, vyznačující se tím, že se podává účinné množství beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.
19. 20. Způsob léčení hyperinzulínemie u savce, vyznačující se tím, že se podává účinné množství beta-lipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.
20. 21. Způsob zvyšování citlivosti na inzulín u savce, vyznačující se tím, že se podává účinné množství betalipotropinu, jeho analogu nebo funkčního fragmentu.
21. 22. Způsob syntézy beta-lipotropinu, jeho analogu nebo fragmentu, v pevné fázi v jednom běhu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    a) aktivace aminokyseliny která má chráněnu svoji cc-amino skupinu a alternativně funkční skupinu postranního řetězce, pro vytvoření reaktivního esteru;

    b) navázání uvedené aktivované aminokyseliny na inertní pevný nosič;

    c) aktivace druhé chráněné aminokyseliny na ester, zatímco • · α-amino skupina první aminokyseliny je zbavena ochrany pro získání reaktivního aminu a druhá aktivovaná aminokyselina se nechá reagovat s uvedenou první aminokyselinou pro vytvoření dipeptidu na pevném nosiči;

    d) opakování kroků (a) až (c);

    e) odstranění peptidu z pevného nosiče a deprotekce funkčních skupin postranních řetězců;

    f) oddělení peptidu od pevného nosiče; a

    g) čištění peptidu libovolným vhodným způsobem; přičemž,

    h) jestliže BLT sekvence obsahuje tripeptidový segment serpro-pro, provádí se vícenásobná kopulace zbytků pro;

    i) po ukončení kopulačního kroku se veškerý nezreagovaný a nechráněný peptid blokuje pro zabránění prodlužování řetězce delečního peptidu; a

    j) pokud BLT sekvence obsahuje dipeptidovou sekvenci aspgly, použije se N-a ochranná skupina na každém glycinovém zbytku, který předchází zbytek asp.
22. 23. Způsob přípravy beta-lipotropinu podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    a. transformace vhodného hostitele vektorem exprese, kde uvedený vektor kóduje beta-lipotropin;

    b. kultivace uvedeného transformovaného hostitele za podmínek, které umožňují expresi uvedeného beta-lipotropinu;

    c. čištění uvedeného beta-lipotropinu libovolným vhodným způsobem.
23. 24. Test aktivity beta-lipotropinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

    a) podávání testovaného proteinu savci, který vykazuje necitlivost na inzulín a zvýšenou hladinu glukózy v krvi; a • 4

    4 4

    4 4

    4 4

    4 · « • · ·

    4 ·

    4 4

    4 · • 444

    b) testování hladiny glukózy a inzulínu v krvi libovolným způsobem po provedení kroku (a).
24. 25. Způsob, podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený beta-lipotropin je zvolen ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 8.
25. 26. Peptid, který má inzulinotropní aktivitu, zvolený ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,

    SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 13. 27. Peptid, který má inzulinotropní aktivitu, zvolený ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 25. 28. Peptid, který má inzulinotropní aktivitu, zvolený ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 25.
26. 29. Způsob léčení diabetů, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství alespoň jednoho peptidu, zvoleného ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9,

    SEQ. ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

    10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 25.

    ···· * ·
27. 30. Způsob léčení diabetů, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství alespoň jednoho peptidů, zvoleného ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, a SEQ ID NO: 13.
28. 31. Farmaceutický přípravek zahrnující jako účinnou složku peptid, který má inzulinotropní aktivitu a je zvolen ze

    souboru sestáváj ícího z SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 25.
29. 32. Funkční analog beta-lipotropinu.
30. 33. Fragment beta-lipotropinu, který má inzulinotropní aktivitu in vitro nebo in vivo.
31. 34. Funkční analog beta-lipotropinu, který je přibližně 90% až 95% identický se SEQ ID NO: 8, přičemž substituce aminokyselin jsou vybrány ze souboru sestávajícího z následujících substitucí:

    zbytek v poloze 1 představuje alternativně Glu, Ala, Asp nebo Gin; zbytek v poloze 2 představuj e alternativně Leu, Ile, Val nebo Met; zbytek v poloze 3 představuje alternativně Thr, Ala, Glu, Ser, Pro nebo Gly r zbytek v poloze 4 představuj e alternativně Gly, Arg, Ala,

    Leu, Pro nebo Ser;

    zbytek v poloze 5 představuje

    Asn nebo Ala;

    zbytek v poloze 6 představuje

    Lys, Gin nebo Ala;

    zbytek v poloze 7 představuje

    Val, Ile nebo Met;

    zbytek v poloze 8 představuje

    Tyr, Leu, Lys, Pro, Gin nebo zbytek v poloze 9 představuje

    Asp, Asn nebo Gin;

    alternativně Glu, Gin, Asp, alternativně Arg, Glu, Leu, alternativně Leu, Pro, Asp, alternativně Arg, Glu, Ala, Trp;

    alternativně Glu, Ala, Pro, zbytek v poloze 10 představuje nebo Asp;

    zbytek v poloze 11 představuje Asn, Gin, Ala nebo Glu; zbytek v poloze 12 představuje nebo Met;

    zbytek v poloze 13 představuje nebo Val;

    zbytek v poloze 14 představuje Gin nebo Gly;

    zbytek v poloze 15 představuje nebo Glu;

    zbytek v poloze 16 představuje Gly nebo Glu;

    zbytek v poloze 17 představuje nebo Gly;

    zbytek v poloze 18 představuje nebo Asn;

    zbytek v poloze 19 představuje

    alternativně Gly, Ala, Ser alternativně Asp, Arg, Pro, alternativně Gly, Ala, Ser alternativně Pro, Glu, Gly alternativně Asp, Glu, Asn, alternativně Gly, Ala, Ser alternativně Pro, Gin, Leu, alternativně Ala, Asp, Ser alternativně Asp, Glu, Gin alternativně Asp, Glu, Asn

    nebo Gin;

    flo .. ··. .··.···: ‘‘ .·«···.. - 82- ·· ·

    zbytek v poloze 20 představuje alternativně Gly, Ser nebo Ala; zbytek v poloze 21 představuje alternativně Ala, Gly, Ser nebo Phe; zbytek v poloze 22 představuj e alternativně Gly, Ala, Ser nebo Lys; zbytek v poloze 23 představuje alternativně Ala, Phe, Thr, Gly, Ser nebo Leu; zbytek v poloze 24 představuje alternativně Gin, Arg, Asp, Asn, Leu nebo Val; zbytek v poloze 25 představuje alternativně Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser nebo Thr; zbytek v poloze 26 představuj e alternativně Asp, Glu, Gly, Asn, Gin nebo Lys; zbytek v poloze 27 představuje alternativně Leu, Ala, Ile, Met nebo Val; zbytek v poloze 28 představuje alternativně Glu, Gin, Asn nebo Asp; zbytek v poloze 29 představuje alternativně His, Asn, Tyr, Ala, Gin nebo Glu; zbytek v poloze 30 představuj e alternativně Ser, Gly, Glu, Ala, Leu nebo Asp; zbytek v poloze 31 představuje alternativně Leu, Ala, Val, Met nebo Ile; zbytek v poloze 32 představuje alternativně Leu, Ala, Val, Ile, Met nebo Pro; zbytek v poloze 33 představuje alternativně Val, Ala, Glu, Leu, Ile, _r Met nebo Arg; zbytek v poloze 34 představuje alternativně Ala, Ser, Pro, Glu nebo Gly; zbytek v poloze 35 představuje alternativně Ala, Asp, Gly,

    44 ···· .··.. · :: .· : ·· :

    ’ ·· ··

    Ser nebo zbytek v Leu, Asp, zbytek v Arg, Gin zbytek v nebo Glu; zbytek v Glu, Gin zbytek v Asn, Gin zbytek v Ser;

    zbytek v nebo Asn₍ zbytek v Trp;

    zbytek v nebo Glu zbytek v nebo Val zbytek v Asn, His zbytek v zbytek v zbytek v Phe;

    zbytek v nebo gin zbytek v nebo Ala

    Leu;

    poloze 36 Asn nebo poloze 37 nebo Asp; poloze 38 poloze 39 nebo Lys; poloze 40 nebo Gly; poloze 41 poloze 42 poloze 43 poloze 44 poloze 45 poloze 46 Arg nebo poloze 48 poloze 49 poloze 50 poloze 51 poloze 52

    představuje

    Gin;

    představuj e představuje představuj e představuje představuje představuje představuje představuje představuj e představuj e Gly;

    představuje představuje představuj e představuje představuj e alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně alternativně

    Glu, Ala, Thr, Lys, Glu, Thr, Lys, Arg, Gin Asp, Ala, Asn, Glu, Ser, Asp, Gly, Ala nebo Pro, Gly, Ser

    Tyr, Phe nebo

    Arg, Lys, Gin Met, Ile, Ser Glu, Gin, Asp Tyr nebo Trp; Arg nebo Lys; Trp, Tyr nebo Gly, Ala, Ser Ser, Thr, Asn

    0 0 fotr

    -^900 ·· » · · ¹

    0 0

    zbytek v poloze 53 představuj e alternativně Pro nebo Gly; zbytek v poloze 54 představuje alternativně Pro, Ala, Gly, Arg, Leu nebo Thr; zbytek v poloze 55 představuj e alternativně Lys, Arg, Gin

    nebo Ala;

    zbytek v Gin, Ala, poloze 56 Gly nebo představuj e Ile; alternativně Asp, Asn, Glu zbytek Arg; v poloze 57 představuj e alternativně Lys, Gin nebo zbytek Lys ; v poloze 58 představuje alternativně Arg, Gin nebo zbytek Trp; v poloze 59 představuj e alternativně Tyr, Phe nebo zbytek Ser; v poloze 60 představuje alternativně Gly, Ala nebo zbytek Ser; v poloze 61 představuj e alternativně Gly, Ala nebo zbytek Trp; v poloze 62 představuj e alternativně Phe, Tyr nebo zbytek v poloze 63 představuje alternativně Met, Leu, Ile

    nebo Val;

    zbytek v poloze 64 představuj e alternativně Thr, Ala, Ser nebo Lys; zbytek v poloze 65 představuje alternativně Ser, Ala, Thr nebo Pro; zbytek v poloze 66 představuj e alternativně Glu, Asp, Asn, Lys nebo Gin; zbytek v poloze 67 představuje alternativně Lys, Arg nebo Gin; zbytek v poloze 68 představuj e alternativně Ser, Ala, Thr

    nebo Gly;

    /Γ& ->0 ·♦··

    zbytek v poloze 69 představuj e alternativně Gin, Glu, Asp, Asn, Arg nebo His; zbytek v poloze 70 představuje alternativně Thr, Ser, Ala nebo Lys; zbytek v poloze 71 představuj e alternativně Pro nebo Gly zbytek v poloze 72 představuje alternativně Leu, Ile, Met nebo Val; zbytek v poloze 73 představuj e alternativně Val, Leu, Ile nebo Met; zbytek v poloze 74 představuj e alternativně Thr, Ala nebo Ser; zbytek v poloze 75 představuje alternativně Leu, Ile, Met nebo Val; zbytek v poloze 76 představuje alternativně Phe, Tyr, Trp nebo Leu; zbytek v poloze 77 představuje alternativně Lys, Gin nebo Arg; zbytek v poloze 78 představuj e alternativně Asn, Asp, Glu, Gin nebo His; zbytek v poloze 79 představuj e alternativně Ala, Gly, Ser, Ile nebo Val; zbytek v poloze 80 představuj e alternativně Ile, Leu, Met, Val nebo Thr; zbytek v poloze 81 představuj e alternativně Ile, Met, Val, Thr nebo Leu; zbytek v poloze 82 představuj e alternativně Lys, Gin nebo Arg; zbytek v poloze 83 představuj e alternativně Asn, Asp, Glu, Gin nebo Ser; zbytek v poloze 84 představuje alternativně Ala, Val, Ser, Gly nebo Glu;

    ·· ·· //7 ý -Μ - • · ···· ··

    zbytek v poloze 85 představuj e alternativně Tyr, Phe, Trp nebo His; zbytek v poloze 86 představuje alternativně Lys, Gin nebo Arg; zbytek v poloze 87 představuje alternativně Lys, Gin nebo Arg; zbytek v poloze 88 představuje alternativně Gly, Ala nebo Ser; zbytek v poloze 89 představuj e alternativně Glu, Gin, Asp

    Asn nebo His.
32. 35. Funkční analog beta-lipotropinu podle nároku 34, kde analog je přibližně mezi 95% a 99% identický se SEQ ID NO: 8.
33. 36. Peptid, který má inzulinotropní aktivitu, zvolený ze souboru sestávajícího z SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22.
34. 37. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že v kroku:

    h) pokud BLT sekvence obsahuje tripeptidový segment ser-propro, provádí se dvojitá kopulace zbytků pro a ser;

    i) po ukončení kopulačního kroku se veškerý nezreagovaný nechráněný peptid je blokuje anhydridem pro zabránění prodlužování řetězce delečního peptidu.

    ·« ♦ ··· w
35. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že v kroku:

    j) uvedená N-α ochrana zahrnuje Ν-α-Hmb nebo methylbenzoát.
36. 39. Funkční analog beta-lipotropinu, který je alespoň 90% identický se SEQ ID NO: 8.