KR20010101425A

KR20010101425A - 뼈의 촉진인자

Info

Publication number: KR20010101425A
Application number: KR1020017008634A
Authority: KR
Inventors: 탬체크슁
Original assignee: 오스테오팜 인코포레이티드
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-13
Publication date: 2001-11-14
Also published as: NO20013257L; BG105682A; IL143990A0; CZ20012456A3; HUP0105004A2; NZ512637A; EP1161450A1; WO2000042069A1; CN1341120A; MA25594A1; AU3028200A; IS5999A; CA2358908A1; US20040147450A1; JP2002538775A; US20020090671A1; US6693081B2; AU779261B2; PL349786A1; BR0007816A

Abstract

포유 동물 뼈 성장을 증가시키거나 촉진시키는 폴리펩티드, 관련 뉴클레오티드 서열, 항체, 진단 키트 및 치료제. 폴리펩티드 Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Glu Ser의 서브서열은 성장을 촉진시키는 것으로 나타났다. 서브서열은 Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys를 포함한다.

Description

뼈의 촉진인자{BONE STIMULATING FACTOR}

본 발명의 배경으로, 하기된 호중구-활성 펩티드 (NAP-2; SEQ ID NO:1)와 "NAP-2V"로 여기서 명명된 NAP-2의 변이체 (SEQ ID NO:2)는 꽤 오랫동안 알려졌다 (Walz, A.와 M. Baggiolini, (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 969). 영국 특허 제 2 231 872호 (영국 특허 제 2 231 872호. 발명자: M.Baggiolini, K.J. Clemetson, 및 A. Walz. 1990년 6월 14일 공개됨)는 NAP-2와, NAP-2V를 포함하는 세 가지의 명백한 천연발생 변이체의 아미노산 서열을 기술한다. 다른 두 가지의 변이체는 NAP-2 서열의 N-말단에 각각 4개 (SEQ ID NO:3)와 3개 (SEQ ID NO:4)의 추가적 아미노산을 가진다. NAP-2는 N-말단에 추가적 11개의 아미노산을 가지는 β-트롬보글로불린 (β-TG; SEQ ID NO:5)의 서브서열이다. β-TG는 그 자체가 N-말단에 추가적 4개의 아미노산을 가지는 연결조직-활성 펩티드 (CTAP-III; SEQ ID NO:6)의 서브서열이다. CTAP-III는 N-말단에 추가적 9개의 아미노산을 가지는 혈소판 염기성 단백질 (PBP; SEQ ID NO: 7)의 서브서열이다.

인터루킨-8 (인간 IL-8; SEQ ID NO:8; 돼지 IL-8; SEQ ID NO:9)과 함께 NAP-2와 흑색소 세포종(腫) 성장-촉진 활성 (MGSA)은 α-케모카인으로 알려진 서브페밀리로 분류되어 있다. α-케모카인은, Brandt et al. (Ehlert, J.E., F.Peterson, M.H.G. Kubbuta, J. Gerdes, H.-D. Flad, 및 E. Brandt, (1995) J. Biol. Chem. 270: 6338)에 의하여 기술된 바와 같이, 분자의 중심 영역을 에워싸는 고도로 보존적 위치에 4 개의 시스테인을 공통적으로 가진다. Brandt et al.은 마지막 4 개의 아미노산을 결여하고 호중구 탈과립화를 촉진시키는 효과의 강화된 증가를 나타내는, NAP-2의 명백한 천연 발생의 C-말단 절단 변이체를 발견하였다. Brandt et al.은 또한 NAP-2의 C-말단의 마지막 하나, 둘, 셋, 다섯 및 여섯 개의 아미노산을 결여한 변이체를 합성하였다. NAP-2의 앞쪽 64 아미노산만을 가진 서열을 제외하고 이들 C-절단 폴리펩티드 모두는 NAP-2에 비하여 온건한 증가된 효과를 나타내었다. Brandt et al.은 NAP-2의 구조와 그 기능에 대하여 서열 변형의 가능한 유의성을 논의하였다.

혈소판 인자 4(PF4; SEQ ID NO:10)는 70개 아미노산의 폴리펩티드이다 (Hermodson, M., G. Schmer 및 K.Kurachi, (1977) J. Biol. Chem. 252: 6276; Morgan, F.J., G.S.Begg, C.N.Chesterman, (1979) Thromb. Haemost. 42: 1652). PF4는 두 가지 조골세포 골육종 세포주인 Saos-2와 G-292 (미국 특허 No. 5,304,542. 발명자: D.M. Tatakis. 1994년 4월 19일 특허됨)의 증식을 저해하는 것으로 나타났다. 인도메타신은 PF4-유도 세포증식 저해에 명백하게 효과가 없었다. 특정 단편인 PF4(58-70), PF4(47-70), 및 PF4에 50% 상동이고 α-헬릭스 C-말단을 함유하는 단량체 저-친화도 PF4 (LAPF4) 또한 유용할 것으로 시사되었다. PF4와 이 같은 관련 폴리펩티드는 따라서 다른 무엇보다도 골다공증을 앓는 사람에서 조골세포의 증식을 저해하는 방법에 유용한 것으로 기술되었다.

NAP-2V의 처음 70개의 아미노산과 PF4 서열은 약 51% 상동이고 이 두 폴리펩티드 간에 4개의 시스테인 잔기의 위치는 보존된다.

NAP-2, NAP-2V 및 NAP-2V의 특정 서브서열은 뼈 촉진효과를 나타내는 반면 특정 서브서열은 뼈 촉진 효과를 나타내지 않는 것으로 종전에 밝혀졌다. NAP-2V-(1-26) (SEQ ID NO:11)과 NAP-2V-(13-26; gln²⁵→glu²⁵) (SEQ ID NO:12)는 관찰된 뼈의 부가율을 증가시키는 것으로 나타났고, 후자가 전자보다 더 강력하였다. NAP-2V-(10-26) (SEQ ID NO:13)은 비록 관찰된 증가의 통계적 유의성에 의심이 가기는 하지만, 관찰된 뼈의 부가율의 작은 증가를 야기하는 것으로 나타났다. NAP-2V-(11-26) (SEQ ID NO:14)와 NAP-2V-(12-26) (SEQ ID NO:15)는 관찰된 뼈의 미네랄부가율에 효과가 없는 것으로 나타났다.

본 발명에 따라, NAP-2V-(13-26; gln²⁵→glu²⁵) (SEQ ID NO:17)과 NAP-2V-(15-22) (SEQ ID NO:18)의 보호되는 형태는 뼈 촉진 활성을 가지는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명은:

포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편으로서, 그 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 13개 까지의 보존적 아미노산을 함유하는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 단편이 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 12개 까지의 보존적 아미노산을 함유하는 이 같은 폴리펩티드이다.

대안으로, 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 11개, 10개, 9개 또는 8개까지의 보존적 아미노산을 함유한다.

SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12에 대응하는 14-mer 서열이지만, 천연 발생의 서열, 즉 SEQ ID NO:2를 직접적으로 기초로 한다는 점을 알게될 것이다.

바람직하게는, 폴리펩티드가 그것의 활성을 얻는 아미노산 서열은 적어도 8아미노산 길이이다. 바람직하게는, 서열은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19 (또는 그것의 N-말단 또는 C-말단 보호 형태)의 서브서열, 또는 그것들의 보존적 치환 변이체이다. 가장 바람직하게는, 서브서열은 SEQ ID NO:18 (여기에서 아미노산 그 자체로 지칭된), 또는 그것의 보존적 치환 변이체를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 서브서열은 SEQ ID NO:18이다.

다른 측면에서 본 발명은 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편으로서, 그 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 13개 까지의 인접하는 보존적 아미노산을 함유하는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

이 같은 폴리펩티드의 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 12개까지의 인접하는 보존적 아미노산을 함유할 수 있거나, 또는 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 11개, 10개, 9개 또는 8개까지의 인접하는 보존적 아미노산을 함유할 수 있다.

바람직하게는, 단편은 적어도 여덟 아미노산 길이이고 SEQ ID NO:18로 식별되는 아미노산 서열 또는 그것의 보존적 변이체를 함유한다.

다른 측면에서, 본 발명은 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드이고, 그 단편은 SEQ ID NO:18로 식별되는 서열 또는 그것의 보존적 변이체로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 가진다. 더 바람직하게는, 분리된 폴리펩티드는 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드단편을 포함하고, 그 단편은 SEQ ID NO:18로 식별되는 서열로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 폴리펩티드는 보호기 함유 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 둘 중 하나 또는 둘 모두를 가질 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 제 1의 폴리펩티드로 정의되는데 이는 13 개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 포함하며 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진하고, 상기 기술된 폴리펩티드 단편인 제2의 폴리펩티에 충분히 중복되어서 제 1의 폴리펩티드는 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 긴축조건하에서 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩된다.

이 같은 제 1의 폴리펩티드는 12 개, 11개, 10개, 9개 또는 8개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 적어도 여덟 아미노산 길이이다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 폴리펩티드는 약 1000 내지 4000, 또는 약 1200 내지 3000, 또는 약 1800 내지 3000, 또는 약 1200 내지 1500 범위의 분자량을 가진다.

본 발명은 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 뼈 감소 관련 질환의 예방과 치료용 작용제를 포함한다.

본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 뼈 성장 촉진용 약제학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 투여하여 포유동물에서 뼈 성장을 증가시키는 방법을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 골다공증의 치료에 사용하는 것을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는데 사용하는 것을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 뼈 성장 촉진이나 골다공증의 치료에 사용되는 의약의 제조에 사용하는 것을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 존재를 결정하는 진단 키트로서, 리포터 시스템이 연결된 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 진단 키트를 포함하며, 리포터 시스템은 사전결정된 양의 폴리펩티드와 항체가 서로 결합할 때 검출 가능한 반응을 생산하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 발현을 코딩하는 분리된 DNA 단편, 및 유전 코드의 디제네러시 때문에 그 단편과 상이한 DNA를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 발현 가능하게 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 포함한다.

본 발명은:

a) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 준비하는 단계;

b) 상기 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하여 상기 DNA 단편을 포함하고 복제 수행 증력이 있는 재조합 DNA 단편을 얻는 단계;

c) 숙주세포를 상기 재조합 DNA 단편으로 형질전환하여 상기 폴리펩티드를발현할 수 있는 형질전환체를 분리하는 단계; 및

d) 상기 형질전환체를 배양하여 형질전환체가 상기 폴리펩티드를 생산하도록 허용하고, 상기 폴리펩티드를 결과적 배양 혼합물에서 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 중 어느 하나"로부터 유래된" 화합물을 포함한다.

따라서, 본 발명은 아미노산 서열이:

(i) SEQ ID NO:18에 대응하는 아미노산 서열;

(ii) 다수의 상기 아미노산 서열을 함유하는, (i)의 폴리펩티드의 변이체; 또는

(iii) (i) 또는 (ii)의 폴리펩티드의 보존적 치환 변이체로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다.

Walz et al. (영국 특허 No. 2 231 872. 발명자: M. Baggiolini, K.J. Clemetson, 및 A. Walz. 1990년 6월 14일 공개됨. Neutrophil-activating peptide-2 and processes for the production of NAP-2, B-TG, CTAP-III and PBP)에 의하여 기술된 NAP-2V의 DNA 서열은 여기에 SEQ ID NO:16으로 식별된다.

용어 "에 선택적으로 혼성화되다"는 적당한 긴축 혼성화 조건 하에서는 사전정의된 서열 (즉, 제 2의 폴리펩티드)를 가지는 분자들이 DNA나 RNA 제제에 존재할 때 본질적으로 오직 상호 혼성화, 이중나선 형성 또는 결합하는 핵산 분자들을 말한다. 핵산 분자의 고안과 어닐 조건의 논의는 예를 들어 Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제2판), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel et al., (ed.) Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)를 참조하시오.

"긴축 혼성화 조건"은 여기서 당업계 숙련자에게 통상적인 의미를 취한다. 핵산 혼성화를 촉진시키는 적당한 긴축 조건은, 예를 들어 약 45℃ 에서 6x 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)이 당업계 숙련자에게 알려져 있다. 다음 예는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6에 나타난다: 50ml의 제 1의 적당한 혼성화 용액을 위하여, 24ml 포름알데히드, 12 ml 20x SSC, 0.5ml 2M Tris-HCl pH 7.6, 0.5ml 100x Denhardt's 용액, 2.5ml 탈이온수, 10ml 50% 황산텍스트란, 및 0.5ml 10% SDS를 함께 혼합한다. 제 2의 적당한 혼성화 용액은 1% 결정화 BSA (프렉션 V), 1mM EDTA. 0.5 M Na₂HPO₄pH7.2, 7% SDS가 될 수 있다. 세척 단계에서의 염 농도는 50℃, 약 2x SSC의 낮은 긴축부터 50℃, 약 0.2x SSC의 높은 긴축까지에서 선택될 수 있다. 이들 세척 용액 둘 모두는 0.1% SDS를 함유할 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 실온인 약 22℃인 낮은 긴축조건으로부터 약 65℃인 높은 긴축으로 증가될 수 있다. 인용된 참고문헌은 더 자세한 것을 제공하지만, 적당한 세척 긴축은 프로브의 상동성과 길이에 의존한다. 만일 상동성이 100%라면 고온 (65℃ 내지 75℃)이 사용될 수 있다. 만일 상동성이 낮으면, 낮은 세척 온도가 사용되어야 한다. 그러나, 프로브가 매우 짧다면(<100bp),100% 상동성일지라도 낮은 온도가 사용되어야 한다. 일반적으로, 세척은 낮은 온도에서 (37℃ 내지 40℃) 시작하고, 자동방사선사진에서 백그라운드가 주요 인자가 되지 않을 정도로 충분히 낮을 때까지 온도를 3 내지 5℃씩 간격으로 올린다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 아미노산 서열을 가지는 어떤 수의 잠재적 뼈 촉진인자도 포함한다.

다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 어떤 폴리펩티드나 폴리펩티드들을 활성성분으로 함유하는, 뼈 감소 관련 질환의 예방과 치료용 작용제이다.

본 발명은 폴리펩티드나 폴리펩티드들의, 뼈 성장 촉진이나 골다공증의 치료용 의약의 제조에서의 사용을 포함한다.

본 발명은 SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12;또는 SEQ ID NO:13로 식별되는 아미노산 서열 또는 그들의 보존적 치환 돌연변이로 구성되는 폴리펩티드를 사용하여 합성된 항체를 포함한다.

본원은 1998년 3월 26일 선행 출원된 미국 특허출원 제 09/048,058호의 부분계속출원인 1999년 1월 13일 출원된 미국 특허출원 제 09/229,304호에 기초하여 우선권을 주장하고 이들 두 선행 출원은 여기에 참고문헌으로 수록된다.

본 발명은 뼈의 성장을 촉진시키는 폴리펩티드에 관련된다.

뼈의 성장과 세기와 관련된 문제의 이해는 수년에 걸쳐 진보되어 왔고, 그 개요는, 예를 들어 1994년 9월 15일 공개번호 WO 94/20615로 공개된 국제출원 제 PCT/CA 94/00144호, 1997년 4월 3일 공개번호 WO 97/12036으로 공개된 국제출원 제 PCT/CA 96/00653호, 미국 특허 제 5,320,970호 및 1992년 9월 23일 505 210으로 공개된 유럽특허출원 제 92 302 446호에 제공되며, 이들 출원들의 내용은 여기에 참고문헌으로 수록된다.

도 1은 대조군 (첫번째 막대)에 비교하여 SEQ ID NO:17 (두번째 막대), SEQ ID NO:18 (세번째 막대)을 가지는, 화학적으로 생산된 폴리펩티드로 주사된 래트에 대한, 관찰된 뼈 미네랄 부가율 (일 당 ㎛)을 그래프로 도시한다. 오차 한계는 ±1 S.E.이다.

도 2는 지시된 양의 SEQ ID NO:18을 가지는 폴리펩티드로 주사된 래트에서 발견되는 뼈 미네랄 부가률 (일 당 ㎛)의 투여량 의존도를 그래프로 도시한다. 오차 한계는 ±1 S.E.이다.

도 3은 시험된 폴리펩티드의 아미노산 서열, 서로의 대응되는 아미노산 서열의 정렬, 선 위에 나타낸 활성 펩티드 및 선 아래의 뼈 성장을 촉진하지 않는 것으로 나타난 서열을 도시한다. 대략적인 분자량이 서열 식별 번호 아래에 나타난다.

재료, 방법 및 결과

SEQ ID NO:1, 2, 11, 12 및 13에 대응하는 서열을 가지는 폴리펩티드는 뼈 성장을 촉진시키는 것으로 이전에 밝혀졌다.

SEQ ID NO: 17과 18로 식별되는 서열을 가진 폴리펩티드 서열이 뼈 촉진 활성을 가지는지 여부를 확립하는 실험이 수행되었다. 폴리펩티드는 당업계 숙련자에게 공지의 표준 방법에 따라 직접 화학적으로 합성되었다. 이전에 뼈 촉진 활성을 가지는 것으로 밝혀진 SEQ ID NO:12로 식별되는 서열을 가지는 폴리펩티드는 펩티다제 플라스민으로 절단되기 쉬운 두개의 부위를 리신-트레오닌과 리신-아스파라긴 잔기 사이에 각각 가진다.

9 마리의 Sprague-Dawley 래트 (평균중량, 약 300gm)를 세 마리의 세 가지 군으로 나누었다. 대조군인 제 1 군의 각각은 400㎕의 pH를 4.5로 조정한 완충액인 50mM 아세트산 나트륨 용액으로 주사하고 즉시 200㎕의 1M 테트라사이클린히드로클로라이드 용액으로 주사하였다. 각 용액은 우측 대둔근 내로 근육내주사로 투여하였다. 제 2 군의 래트는 각각 400㎕의 100nmole의 SEQ ID NO:17로 식별되는 서열을 가지는 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 함유하는 완충액으로 주사하고 즉시 200㎕의 1M 테트라사이클린히드로클로라이드 용액으로 주사하였다. 제 3 군의 래트는 각각 400㎕의 100nmole의 SEQ ID NO:18로 식별되는 서열을 가지는, 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 함유하는 완충액으로 주사하고 즉시 200㎕의 1M 테트라사이클린히드로클로라이드 용액으로 주사하였다.

약 48시간 경과 후, 테트라사이클린 히드로클로라이드의 제2 투여량을 각 래트에 투여하였다. 그 다음 약 24시간 후, 래트는 이산화탄소 혼수에 의하여 희생되었다.

우측 대퇴의 하부 골단중절 절편을 뼈 미네랄 부가율의 뼈 측정용으로 사용하였다. 절단 직후에, 뼈 샘플은 pH 7.4의 10% 포름알데히드 용액으로 고정하였다. 같은 날의 그 이후에, 1:1 H₂O-아세톤 용액으로 포름알데히드를 교체하였다. 다음날 이 용액은 두번 아세톤으로 교체하였다. 이것은 그 다음날 1:1 아세톤-Spurr's 배지 용액으로 교체하였고 같은 날 그 이후에 Spurr's 배지 용액으로 교체하였다. 그 다음날, 각 샘플을 교체된 신선한 Spurr's 배지 용액에 담가서 24시간동안 60℃에서 보관하고 다시 24시간 동안 80℃에서 보관하였다.

각 보관된 블럭은 다이아몬드 함유 칼로 장치된 Leitz 톱 마이크로톰을 사용하여 400 ㎛ 두께 절편으로 잘랐다. 상대적으로 두꺼운 절편을 카보런덤 분말로 사전에 거칠게 만든 두 연마 유리 평판 사이에서 연마하여 최종 두께 약 10㎛가 되도록 하였고 물이 연마 윤활제로 사용되었다. 얇은 절편을 건조시키고 Permount (Fisher)에 염색하지 않고 올려놓았다.

측정은 Leitz 스케닝 광학 현미경 광학계 MPV-CD을 사용하여 절편을 16X로확대하여 국제출원 No. PCT/CA94/00144에 기술된 바와 같이 이루어졌다. 얻어진 결과는 표 1과 도 1에 나타난다.

도 3에서 나타낸 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18를 가지는 폴리펩티드, 대조군 용액이 투여된 군 간의 뼈 부가율 (㎛/일)의 군산술평균의 비교

	대조군	SEQ ID NO:17	SEQ ID NO:18
평균	1.256 ㎛/일	1.859 ㎛/일	2.406 ㎛/일
S.E.	0.06	0.10	0.25
N	3	3	3

다른 세트의 실험에서, 측정된 뼈 미네랄 부가율의 SEQ ID NO:18을 가지는 폴리펩티드의 양에 대한 투여량 의존성을 평가하였다. 28 마리의 암컷 Sprague-Dawley 래트 (평균 중량, 약 300gm)를 네마리의 일곱 군으로 나누었다. 래트는 시험 폴리펩티드의 양이 다음:25, 50, 100, 200, 400 및 800 nmole과 같이 다양한 것을 제외하고는 이전의 실험 세트에서 기술된 바와 같이 처리되었다. 얻어진 결과는 표 2와 도 2에 나타난다.

뼈 부가율 (㎛/일)의 SEQ ID NO:18을 가지는 폴리펩티드 양에 대한 투여량 의존도

	대조군	25 nmol	50 nmol	100 nmol	200 nmol	400 nmol	800 nmol
평균	1.320	1.686	1.753	1.907	2.209	2.123	2.139
S.E.	0.04	0.08	0.03	0.03	0.08	0.06	0.03
N	4	4	4	4	4	4	4

도 1에 그래프로 도시된 바와 같이, 아미노 말단과 카르복시 말단이 보호되는 NAP-2V-(15-22) (SEQ ID NO:18)는 유사하게 보호되는 NAP-2V-(13-26; gln²⁵→glu²⁵) (SEQ ID NO:17)보다 더 큰 뼈 촉진 활성을 가진다.

서열 NAP-2V-(15-22) 또는 NAP-2V-(13-26; gln²⁵→glu²⁵)의 어느 것도 cys¹⁰과 cys¹²잔기를 보유하지 않는다. 이들 NAP-2V 서브서열 모두는 모NAP-2V에 존재하는 cys³⁶과 cys⁵²잔기를 결여한다. NAP-2V-(10-26), NAP-2V-(11-26) 및 NAP-2V-(12-26)의 사전에 관찰된 감소된 활성은, 뼈 촉진 효과에 요구되는 폴리펩티드-수용체 상호작용을 방해하는, 분자간 자발적 이황화 결합 때문일 수 있으나 이는 확실하게 알려지지 않았다.

NAP-2V-(13-26: gln²⁵→glu²⁵)는 글루타민 잔기 대신 글루탐산 잔기가 존재하는 NAP-2V의 25위치의 대응하는 서열과 상이하다. NAP-2V에서 나타나는 것과 같은 글루타민 잔기를 가지는 서브서열 또한 포유 동물에서 뼈 성장 촉진에 작용할 것이 물론 예상될 것이다.

NAP-2가 Cys-5와 Dys-31 사이 및 Cys-7와 Cys-47사이 각각에 두개의 이황화 결합을 함유하는 것이 가정되었다 (Baggiolini, M., Clemetson, K.J., Walz, A. 국제출원 No. PCT/EP89/01389, 1990년 6월 14일에 WO90/06321로 공개됨). 확대하면, 대응하는 시스테인 잔기를 함유하는 여기에 개시된 서열과 서브서열은 그것들 간의 유사한 연결을 함유할 수 있다.

그것에 의하여 한정될 의도 없이, 여기에 개시된 NAP-2V의 서브서열의 뼈 촉진 효과의 원인이 되는 구조를 유지한 채, 다양한 다른 아미노산 치환이 가능함이이해될 것이다. 보존적 치환은 예를 들어 미국 특허 No. 5,264,558와 같은 특허 문헌에 기술된다. 그러므로, 예를 들어 비극성 지방족 중성 아미노산인 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린 및 이소류신 간의 상호치환이 가능하다는 것이 예상된다. 마찬가지로, 극성 지방족 중성 아미노산인 세린, 트레오닌, 메티오닌, 아스파라긴 및 글루타민 간의 치환은 가능하게 이루어질 수 있다. 전하를 띠는 염기성 아미노산인 리신과 아르기닌 간의 치환이 가능한 것과 마찬가지로 전하를 띠는 산성 아미노산인 아스파르트산, 글루탐산 간의 치환도 가능하게 수행될 수 있다. 페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판 및 티로신을 포함하는 방향성 아미노산 간의 치환 또한 가능할 수 있다. 이런 종류의 치환과 교환은 당업계 숙련자에게 주지이다. 다른 치환도 가능할 것이다. SEQ ID NO:17이나 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열과 정렬될 수 있는 아미노산 서열을 함유하고 그것과 100% 미만의 상동성을 가지는 펩티드는 그것의 뼈 촉진 효과의 적어도 일부를 보유할 수 있다. 물론, 더 큰 백분율, 예를 들어 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상의 상동성이 보유된 뼈 촉진 활성의 정도를 증가시킬 수 있음이 또한 예상될 수 있다.

"서열 동일성 또는 상동성"은 여기에서 사용될 때, 두 폴리펩티드 분자 간 또는 두 뉴클레오티드 분자 간의 서열 유사성을 말한다. 비교되는 두 폴리펩티드 서열 모두에서의 한 위치가, 예를 들어 동일한 아미노산 (예를 들어, 두 폴리펩티드 분자 각각에서의 한 위치가 알라닌 잔기)이면, 그 분자들은 그 위치에서 상동 또는 서열이 동일하다. 두 분자 간의 상동성 백분율이나 두 서열 간의 서열 동일성은 비교되는 위치의 갯수로 나눈 두 서열에 의하여 공유되는 이 같이 일치되는 위치의 갯수 x100의 함수이다. 예를 들어, 만일 두 서열의 위치 중 10개 중의 6개가 동일하다면 두 서열은 60% 상동이거나 60% 서열 동일성을 가진다. 예로서, METLIA와 MPTWIF는 50% 상동 또는 서열 동일성을 공유한다. 일반적으로, 두 서열이 정렬되면 비교가 수행되어 최대 상동성을 가져온다.

두 서열 간의 서열의 비교와 백분율 상동성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다. 정렬은 두가지 방법, 즉 Clustal 방법과 J. Hein 방법에 따라 수행될 수 있다. 이들 중 Clustal 방법이 바람직하다.

(DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin, USA, 1994로부터 구입 가능한 소프트웨어를 사용하여 여기 사용된) Clustal 알고리즘이, 그 유사성은 반드시 진화적이지 않을 수 있는 서열의 정렬용으로 추천된다. 그 알고리즘은 Higgins, D.G. et al. 1989. CABIOS 5:151에 의하여 기술된다. 동일한 소프트웨어 프로그램이, 명백한 진화적 관계를 가지는 고도로 진화된 부류의 서열 정렬에 추천되는 Jotun Hein 방법에 따른 서열 정렬을 제공한다. 그 알고리즘은 Hein, J. 1990. Methods in Enzymology 183:626에 의하여 기술된다. 프로그램 디폴트 세팅(표준 매개변수)가 사용된다. 진화적 치환 패턴, 전하, 구조 및 화학적 유사성을 기준으로 아미노산 잔기를 조작하는 경우, 디폴트 PAM250 세팅이 사용된다. 단백질 정렬을 위하여, 한쌍씩의 정렬 매개변수는 Ktuple=1, 갭 패널티=3, 윈도우=5, 및 Diagonal Saved=5가 사용된다.

하나 이상의 아미노산의 결실이 관련되는 한은, SEQ ID NO:14와 SEQ ID NO:15를 얻기 위한 결실이, 뼈 성장을 촉진하지 않는 것으로 나타난 폴리펩티드를산출한 관찰결과를 주목한다면, 각 서열 중 어느 하나의 각 말단으로 부터의 작은 수의 아미노산 결실이 가능할 것으로 보인다.

아미노산의 첨가는 서열의 말단에서 수행될 가능성이 매우 높고, 결실과 함께 뼈 촉진 활성을 나타내는 서열의 카르복실 또는 아미노 말단에의 대칭 또는 거의 대칭 첨가는 가능할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어 폴리펩티드의 C-말단, N-말단, 또는 C-말단과 N-말단 모두의 보호에 의하여 프로테아제 존재 하에서 몸체에서 일어날 수 있는 가능한 분해에 대하여 개선될 수 있다.

여기에서 사용될 때, "보호되는" 말단 아미노기는 펩티드 합성에 채택될 수 있는 다양한 아미노-말단 보호기 중 어느 하나로 커플링된 말단 아미노기 (N-말단)를 말한다. 적당한 기의 예는 아실 보호기, 예를 들어 포르밀, 아세틸, 벤조일, 트리플루오로아세틸, 숙신일, 및 메톡시숙신일; 방향족 우레탄 보호기, 예를 들어 벤질옥시카르보닐; 및 지방족 우레탄 보호기, 예를 들어 t-부톡시카르보닐 또는 아다맨틸옥시카르보닐을 포함한다 (Gross와 Mienhofer, eds., The Peptides, vol 3, pp.3 내지 88(Academic Press, New York, 1981)).

여기에서 사용될 때, "보호되는" 말단 카르복실기는 다양한 카르복시-말단 보호기 중 어느 하나로 커플링된 말단 카르복실기 (C-말단)를 말한다. 당업계 숙련자에게 명백할 것과 같이, 적당한 기는 t-부틸, 벤질 또는 에스테르 또는 에테르 결합을 통하여 말단 카르복실기에 연결이 허용되는 다른 기를 포함한다.

본 발명의 범위에 속하는 화합물은 예를 들어 고체상 펩티드 합성 같은 당업계 주지의 수단에 의하여 화학적으로 합성될 수 있다. 합성은 α-아미노 보호되는 아미노산을 사용하여 펩티드의 카르복시-말단에서부터 개시된다. t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 보호기 또는 다른 적당한 보호기가 사용될 수 있다 (Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis," W.H.Freeman Co., San Francisco (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963); Vale et al., Science 213, 1394-1397 (1981), 및 Marke et al. J. Am. Chem. Sci. 103, 3178 (1981)). 합성 방법은 또한 "Princeples of Peptide Synthesis" M. Bodansky Ed. (Spring-Verlag 1984)에 기술된다. 이들 및 다른 펩티드 합성 방법은 또한 미국 특허 Nos. 3,862,925, 3,842,067, 3,972,859, 4,105,602, 4,683,291, 4,244,946 및 4,305,872에 의하여 예시된다.

화합물은 또한 수동 또는 자동 기술, 예를 들어 Applied BioSystems 430A Peptide Synthesizer (Foster City, California) 또는 Biosearch SAM 11 자동 펩티드 합성기 (Biosearch, Inc., San Rafael, California)에 의하여 합성될 수 있다.

특정 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드"로부터 유래한" 화합물은 그 폴리펩티드와 동일하거나, 실질적으로 상동이거나, 또는 그렇지 않으면 기능적이나 구조적으로 동등한 어떤 분자이다. 그러므로, 특정 폴리펩티드로부터 유래한 분자는 그 폴리펩티드의 아미노산 서열, 그 폴리펩트드의 어떤 일부, 또는 뼈 성장을 촉진시키는 기능을 하는 다른 분자를 포괄한다. 이 같은 결합 도메인으로부터 유래한 분자는 그것이 유래한 폴리펩티드를 모방할 것이다. 이 같은 분자체는 펩티드 유사체 등을 포함한다.

"펩티드 유사체 (mimentics)"는 수용체 분자와 상호작용에서 펩티드에 대한 치환체 역할을 하는 구조체이다 (펩티드 유사체의 리뷰에 대하여는 Morgan et al. (1989) Ann. Reports Med. Chem. 24: 243-252 참조). 펩티드 유사체는 여기에서 사용될 때, 아미노산 및/또는 펩티드 결합을 함유하거나 함유하지 않지만, 그들이 유래된 펩티드의 구조적 및 기능적 특성을 보유하는 합성적 구조를 포함한다. 용어, "펩티드 유사체"는 또한, N-치환된 아미노산의 펩티드 또는 올리고머인 펩토이드와 올리고펩토이드를 포함한다 (Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-9371). 펩티드 유사체로 더 포함되는 것은 펩티드 라이브러리인데, 이는 주어진 아미노산 길이이고 그것에 대응하는 아미노산의 모든 상상할 수 있는 서열이 존재하는 펩티드의 수집체이다.

두 폴리펩티드 서열이 적어도 약 85% (바람직하게는 적어도 약 85% 내지 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%)의 뉴클레오티드나 아미노산이 정의된 길이의 폴리펩티드에서 일치할 때, "실질적으로 상동"이다. 여기에서 사용될 때, 실질적으로 상동은 또한 특정된 폴리펩티드 서열에 동일성을 나타내는 서열을 말한다.

여기에 기술된 뼈 촉진 활성을 가지는 폴리펩티드를 구조적 및 기능적으로 모방하는 펩티드 유사체는 또한 여기에서 용도를 발견할 것이고 다음 전략과 과정을 사용하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 유사체는 L-아미노산의 D-아미노산으로의 전체적 교체, 측쇄 부분의 전기적 특성이 상이한 메틸기 또는 슈도이소스테릭기로의 치환 (Hruby et al. (1990) Biochem, J. 268: 249-262 참조), 및 상기된 펩티드 저해제에서의 펩티드 결합을 아미드 결합으로 전체적으로 교체함에 의하여 얻어진 정보에 기초하여 고안된다. 예를 들어, 아미드결합을 함유하는 유사체 대용물은, 골격에서의 회전 자유도, 분자내 또는 분자간 수소-결합 패턴, 국지적과 전체적 극성과 소수성의 변형, 및 경구 생체이용가능성 같은 펩티드 구조와 기능의 측면을 관찰하는데 사용될 수 있다.

국지적 입체구조 제약은 또한 도입되어 뼈 촉진 활성을 가지는 잠재적 펩티드 유사체의 활성에 요구되는 입체구조를 결정할 수 있다. 예를 들어, β,β-분포 아미노산은 입체구조 제약의 펩티드 활성에의 효과를 시험하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Manning et al. (1982) J. Med. Chem. 25: 408-414: Mosberg et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 506-512; Pelton et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 236-239).

유사체는 ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CNH₂], ψ[NHCO], ψ[COCH₂], ψ[(E)또는 (Z) CH==CH] 같은 이소스테릭 아미드 결합을 포함할 수 있다. 리뷰를 위하여는 Spatola (1983) in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins," Volume VII. (Weinstein ed., Marcel Dekker, New York, 2670357)을 참조하시오. 합성 본자는 또한 역회전 입체구조를 안정화하고 촉진하며 효소적 분해로부터 분자를 안정화시키는 D-아미노산을 포함할 수 있다 (Freidinger et al (1985) in "Peptides: Structure and Function." (Deber et al. eds.), Pierce Chem. Co., Rochford, III., 549-552; Sawyer et al (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5754-5758; Torchiana et al (1978) Arch. Int. Pharmacol. Ther.235: 170-176 참조). 환상 아미노산 유사체는 아미노산 잔기를 특정 입체구조 상태, 예를 들어 1-아미노시클로 펜탄카르복실산 (시클로류신)과 ββ- 시클로펜타메틸렌-β- 메르캅토프로피온산 같은 αα'- 와 ββ- 치환 환상 아미노산으로 제약하는데 사용될 수 있다 (Hruby et al (1990), 상기 참조).

유사체는 또한 페녹사틴 고리 시스템 같은 β-회전 유사체와 에핀도리디온 구조 같은 β-시트 유사체를 포함하는 - 아미노산 잔기의 3차원 아미노산 잔기 방향성을 기지의 단백질 2차 입체구조로 모형화할 수 있는 구조인 - 폴리펩티드 2차구조의 모방체를 포함할 수 있다. 디자인 합성과 주형을 포함하는 α-헬릭스의 입체구조 분석이 기술되었다 (Kemp et al (1988) Tetrahedron Lett. 29: 4931; Kemp et al (1988) Tetrahedron Lett. 29: 4935).

잠재적인 유사체는, 화합물을 그 유사체가 유래한 폴리펩티드에 대하여 만들어진 항체에 대한 친화성을 측정함으로써 뼈 촉진 화합물로서 잠재적 활성에 대하여 시험되거나 사전-스크리닝될 수 있다. 폴리펩티드에 대하여 상기된 바와 같이, 이미 기지인 펩티드에 대한 항체와 양성으로 반응하는 그 유사체는 그 다음 예를 들어 여기에서 래트에 대하여 기술한 시스템을 사용하여 생체 내에서 뼈 촉진 효과에 대하여 시험될 수 있다. SEQ ID NO:9으로 식별되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 대하여 만들어진 항체는 이와 관련하여 특히 유용하다.

펩토이드는 여기에서 용도를 찾을 것이다. 펩토이드는 N-치환 아미노산의 올리고머이고 (Simon et al (1972), 상기) 신규 분자의 화학적으로 다양한 라이브러리의 생산용 모티프로 사용될 수 있고, 그 다음 결합과 뼈 촉진 활성에 대하여 시험될 수 있다. 단량체는 t-부틸-기초 측쇄와 9-플루오레닐메톡시-카르보닐 α-아민 보호를 삽입할 수 있다. 펩토이드 단량체의 올리고머화는 예를 들어 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오포스페이트 또는 브로모트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오포스페이트에 의한 원위치 활성화에 의하여 수행될 수 있다. 다른 단계는 α-(9-플루오렌일메톡시카르보닐)아미노산을 사용하는 관습적 펩티드 합성과 동일하다. 올리고펩토이드는 대응하는 폴리펩티드에 비교할만한 친화도를 가지는 것으로 동정할 수 있고 따라서 잠재적으로 뼈 촉진제로서 유용하다.

본 발명의 화합물과 그것을 함유하는 조성물은 다수의 뼈 감소 관련 질병의 예방과 치료에서의 치료제와 예방약 적용에서 용도를 발견한다. 그러므로, 화합물은, 예를 들어 어떤 적당한 경로에 의하여 골다공증의 치료에 있어 뼈 성장을 촉진시키는 치료제로 사용될 수 있다. 여기에 기술된 것 같은 폴리펩티드에 대하여 요구되는 적당한 저장과 취급 조건을 염두에 두면, 바람직한 경로는 폴리펩티드-타입 화합물의 환자의 혈류로의 송달에 적당하다.

그러므로, 본 발명은 또한, 단독으로도 상기된 치료 장점을 제공 할 수도 있는, 그것의 무독성 첨가염, 아미드 및 에스테르를 포함하는 유효한 양의 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다. 이 같은 조성물은 또한 생리학적으로 내성있는 액체, 겔 또는 고형 희석제, 아쥬반트 및 약희석제와 함께 제공될 수 있다.

NAP-2V의 서브서열과 관련된 다른 실시예에서, 동물의 체중 kg 당 약 75 nmol의 폴리펩티드가 각 투여마다 사용되었다. 실시에서, 특히 인간 환자가 관련된때, 일일 투여량은 체중 kg 당 0.01 내지 300mg일 것이다. 바람직하게는, 투여량은 체중 kg 당 약 0.1 내지 약 30mg 근처일 것이다. 바람직한 투여 빈도는, 투여빈도와 투여 당 사용되는 양과 함께 투여 경로, 편리성, 및 치료의 효과에 따라 하루 한 번보다 많거나 적다. 투여되는 양은 또한 환자와 이 같은 투여가 환자에게 가져올 효과에 의존한다. 하나 이상의 화합물의 투여량은, 이용되는 특정 화합물 또는 화합물의 조합, 투여의 모드, 및 치료되는 포유 동물을 포함하는 여러 인자에 의존할 것이다. 특정 화합물 또는 화합물의 조합의 투여량은 종래의 고려할 점을 사용하여; 예를 들어 대상 화합물의 상이한 활성과 기지의 작용제의 활성의 관습적 비교에 의하여, 즉 예를 들어 환자의 골밀도가 여러번에 걸쳐 측정되는 적당한 약리학적 프로토콜의 수단에 의하여 결정될 수 있다.

약제학적 제제는 뼈 성장 촉진 및/또는 골다공증 치료용의, 사용되기 직전에 준비되는 주사 가능 용액을 포함하는 주사 가능 용액으로서 준비된 어떤 화합물을 포함한다. 주사용제는 액성 용액 또는 현탁액일 수 있고; 주사 전에 액체에 용해하거나 현탁하기 적당한 형태의 고형 또한 준비된다. 제제는 또한 에멀젼화할 수 있다. 활성 폴리펩티드는, 생리학적으로 내성이고 폴리펩티드와 양립할 수 있는 희석제 및 약희석제와 자주 혼합된다. 적당한 희석제와 약희석제는 예를 들어 물, 식염, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 그것들의 조합이다. 또한, 만약 원한다면, 조성물은 습화제나 에멀젼화제, 안정화제 또는 완충제 등 같은 소량의 보조물질을 함유할 수 있다.

약제학적 제제는 관습적 약희석제, 즉 화합물과 해롭게 반응하지 않고 화합물의 저장 및 취급 안정성을 증가시킬 수 있는, 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체물질과의 혼합물 내의 화합물의 채택을 포함한다. 조제 과정은 약제학적 제제의 멸균을 포함한다. 화합물은 화합물과 해롭게 반응하지 않는 윤활제, 보존제, 안정화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염 등 같은 보조제와 혼합될 수 있다.

조성물은 관습적으로 비경구적으로, 주사에 의하여, 예를 들어 피하 또는 정맥내로 투여된다. 다른 투여 모드에 적당한 추가적 조제물은 좌약, 비 내 에어로졸, 및 어떤 경우에는 경구 조제물을 포함한다. 좌약용으로, 전통적 접합제와 약희석제는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함한다; 이 같은 좌약은 0.5% 내지 10% 범위, 바람직하게는 1% 내지 2% 범위의 활성 성분을 포함하는 혼합물으로부터 형성된다. 경구용 조제물은 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘스테아레이트, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등 같은 통상적으로 채택되는 약희석제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약캡슐, 지속용출 조제물, 또는 분말 형태를 채택하고, 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%의 활성성분을 함유한다. 이들 경구용 조제물은 흡수될 때까지 펩티드를 보호하도록 고안된 조제물을 포함한다.

펩티드 화합물은 중성 또는 염 형태로 조성물 내로 조제될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 무독성 염은 (자유 아미노기와 함께 형성되는) 산 첨가염을 포함하며, 이는 예를 들어 히드로클로릭산이나 포스포릭산 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등 같은 유기산과 함께 형성된다. 자유 카르복실기와 함께 형성되는 염은 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모니아, 칼슘, 또는 수산화철 같은무기염기와 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아민에탄올, 히스티딘, 프로케인 등 같은 유기염기에서 유래할 수 있다.

본 발명의 화합물은 자신끼리 동형중합 (즉, (펩티드)_n)할 수 있거나 상호 이형중합할 수 있다. 화합물은 또한 BIOPOL^TM(WR Grace & Co..-Conn.) 같은 생체공존 가능한 중합체 화합물과 접합될 수 있다.

재조합 기술을 사용하여 준비되면, 본 발명의 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 표준 자동화된 기술을 사용하여 합성되거나 또는 코딩 서열이나 그것의 일부가 cDNA나 게놈 라이브러리로부터 회수될 수 있다. 이 DNA는 적당한 발현 벡터에 라이게이션되고 이들 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된다. 원핵생물과 진핵생물 배양 시스탬을 포함하는 다양한 발현 벡터/숙주 세포 시스템이 사용될 수 있다.

가장 자주 사용되는 원핵생물은E.coli의 각종 균주로 대표된다. 그러나,Bacillus예를 들어Bacillus subtilis, Pseudomonas의 다양한 종, 또는 다른 박테리아 균주같은 다른 미생물 균주 또한 사용될 수 있다. 이 같은 원핵생물 시스템에서, 숙주와 양립 가능한 종 유래의 복제기점과 조절서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 사용된다. 예를 들어,E.coli는 전형적으로E.coli종에서 유래한 플라스미드인 pBR322의 유도체를 사용하여 형질전환된다 (Bolivar et al., (1977) Gene 2:95). 프로모터를 전사 개시를 위하여 포함하고, 선택적으로 리보솜-결합 부위 서열을 따라 오퍼레이터를 가지도록 여기에 정의된 일반적으로 사용되는 원핵생물 조절 서열은 β- 락타마제 (페니실린), 락토스 (1nc) 프로모터 시스템 (Chang et al., (1977) Nature 198:1056), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al., (1990) Nucleic Acids Res 8: 4057), 및 람다-유래 P_L프로모터와 N-유전자 리보솜 결합 부위 (Shimatake et al., (1981) Nature 292:128) 같은 일반적으로 사용되는 프로모터 시스템을 포함한다. 그러나, 원핵생물과 양립 가능한 어떤 이용 가능한 프로모터 시스템이 사용될 수 있다.

본 발명의 진핵생물에서 유용한 발현 시스템은 적당한 진핵생물 유전자로부터 유래한 프로모터를 포함한다. 효모에서 유용한 한 부류의 프로모터는, 예를 들어 알콜디히드로나제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로지나제 프로모터 (Holland & Holland, (1980) J Biol Chem 25: 2596), α-인자 프로모터 (Bitter et al., (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 5330), 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzeman et al., (1980) J. Biol Chem 256: 1385) 또는 YEp13에서 얻어진 Leu2 유전자 (Broach,J., et al., (1978) Gene 8: 121)에 대한 gal 프로모터 (Johnston & David, (1984) Mol Cell Biol 4: 1440)를 포함하는 글리코리틱 효소의 합성에 대한 프로모터를 포함한다.

적당한 포유동물 프로모터는 SV40 유래 초기와 말기 프로모터 (Fiers et al., (1978) Nature 273: 113) 또는 폴리오마, 아데노바이러스 II, 소의 파필로마 바이러스 또는 조(鳥)류의 살코마 바이러스에서 유래한 것 같은 다른 바이러스 프로모터를 포함한다. 적당한 바이러스와 포유 동물 인핸서는 상기 인용된다. 식물세포가 발현 시스템으로 사용되는 경우, 노팔린 (nopaline) 합성 프로모터가 적당하다 (Depicker,A., et al., (1982) J Mol Appl Gen 1:56).

발현 시스템은 복제 벡터에 포함되거나 재조합 숙주의 염색체 내로 삽입되도록 야기된다. 벡터가 복제 시스템을 포함하는 시스템에 대하여, 이들은 저복제수 또는 고복제수, 통상적으로 약 1000보다 적은 복제수를 가지지만, 어떤 상황에서는 런어웨이 벡터가 채택될 수 있다. 삽입용 벡터에 제공되려 의도되든 복제 시스템에서의 벡터에 제공되려 의도되든지, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 디히드로폴레이트 리덕타제, 메탈로티오네인, 티미딘키나제 등 같은 증폭 유전자로 반복적으로 라이게이션될 수 있다. 원핵생물 시스템에서, 증폭 유전자와 표적 유전자는 동일한 전사와 번역 조절 영역 하에 있을 수 있다.

통상적으로, 벡터는 발현 시스템을 함유하는 숙주 세포를 선택하는 것을 허용하는 마커를 포함한다; 이들 마커의 성질은 숙주에 의존하고 당업계에서 알려져있다. 프로모터 같은 요구되는 조절자에 추가하여, 인핸서 같은 추가적 서열이 또한 전사 수준을 증가시키기 위하여 채택될 수 있다. 만약 그 폴리펩티드가 분비될 것이면, 미국 특허 Nos. 4,336,336; 4,338,397; 및 4,546,082에 기술된 것과 같은 신호 펩티드를 코딩하는 상류 서열이 채택될 수 있다. 신호 서열은 폴리펩티드 산물이 분비될 때 효소적으로 절단된다.

사용되는 숙주세포에 따라, 그 같은 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 형질전환이 수행된다. Cohen, S.N., (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69: 2110에 의하여 기술된 바와 같은 염화칼슘을 채택하는 칼슘 처리; 또는 Maniatis et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, p. 254에 기술된 RbCl 방법이 원핵생물이나 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 다른 세포에 대하여 사용된다.Agrobacterium tumefaciens(Shaw, C.H., (1938) et al., Gene 23: 315)로의 감염은 특정 식물 세포에 사용된다. 이 같은 세포벽이 없는 포유 동물 세포에 대하여는, Graham과 van der Eb, (1978) Virology 52: 2: 546의 인산칼슘 방법이 바람직하다. 효모세포 내로의 형질전환은 예를 들어 Van Solingen, P., et al., (1977) J Bacter 130: 946; 및 Hsiao, C.L., et al., (1979) Proc Natl Acad Sci USA 76:3829의 방법에 따라 수행된다.

일반적으로, 적당한 발현 시스템의 제작 후, 시스템은 적당한 숙주 세포 내로 트렌스펙션되고 성공적인 형질전환체는 발현 벡터 상에 함유된 마커에 의하여 선택된다. 성공적으로 형질전환된 콜로니는 그 다음 원하는 폴리펩티드를 생산하기 위하여 배양된다. 환경의 조건을 조절하여 조절될 수 있는 프로모터가 사용되어 세포가 원하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 발현되지 않는 조건에서 성장된 다음, 적당한 조건의 조작에 의하여 폴리펩티드가 유도되도록 하는 것이 때로는 바람직하다. 예를 들어, trp 프로모터가 E.coli에서 사용된다면, 세포는 트립토판 존재 하에서 성장되고, 발현은 그 다음 트립토판 농도의 삭감이나 인돌일아세트산 같은 트립토판 유사체의 첨가에 의하여 유도된다. 유전자가 PL 프로모터의 조절 하에 있다면, 세포는 약 35℃ 같은 상대적으로 낮은 온도에서 적당한 세포 농도까지 성장되고, 그 다음 온도가 증가되어 이 프로모터를 활성화시킨다. 만약 박테리아 숙주에서 성숙 세포 내 폴리펩티드로서 생산된다면, N-말단 메티오닌은 절단되거나 절단되지 않는다. 예를 들어, 포유 동물 시스템에서 메탈로티오네인 프로모터는 중금속이나 글루코코르티코이드의 첨가에 의한 유도를 허용한다. 이 프로토콜은 세포의 성장에 해로울 수도 있는 폴리펩티드의 미성숙 축적을 방지하는데 바람직하다.

폴리펩티드는 세포 내에서 생산되거나, 적당한 숙주에서 작동 가능한 신호서열을 펩티드 앞에 위치시켜 분비형으로 생산될 수 있다.

폴리펩티드는 당업계에 일반적으로 알려진 적당한 기술을 사용하여 배지 또는 세포로부터 회수되고, 예를 들어 이온교환크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 겔 투과 크로마토그래피 등에 의하여 정제된다.

여기에 개시된 발명에 의하여 이용가능하게 된 폴리펩티드는 그것에 대한 항혈청을 얻는데 사용될 수 있다 (Stites, D.P.와 A.I. Terr. 1991. In Basic & Clinical Immunology, 7th Ed. Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut and San Matea California). 항체가 결합하는 폴리펩티드를 검출하는데 사용하는 방법학과 산물은 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 개발될 수 있다. 이것은 적어도 CTAP-III(SEQ ID NO:3)(Baggiolini,M., Clemetson,K.J., Walz,A. 국제출원 No. PCT/EP89/01389, 1990년 6월 14일 WO90/06321로 공개됨)의 서열을 가지는 폴리펩티드에 대하여 명백하게 성취되어 있다. 항체가 결합하는 폴리펩티드를 검출하는데 사용하는 방법학과 산물은 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 개발될 수 있다.

예를 들어, 항체는 항체에 대한 폴리펩티드의 양성 결합을 지시하기 위하여 수립된 리포터 시스템과 연결되거나 융합될 수 있다. 주지의 리포터 시스템은 방사성면역분석 (RIAs) 또는 면역방사성측정 분석 (IRMAs)을 포함한다. 대안으로, 효소-연결 면역흡착제 분석 (ELISA)은 RIAs와 IRMAs와 마찬가지로 상대적으로 고도의 감도를 가지지만, 일반적으로 방사성동위원소의 사용에 의존하지 않는다. 시각적 검출 가능한 물질이 분광광도계에서 생산되거나 또는 적어도 하나는 분광광도계에서 검출 가능하다. 분석될 효소에 의하여 결합된 물질의 형광에 의존하는 분석법이 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, 특정 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 다수의 리포터 시스템이 있다는 것이 이해될 것이다. 표준화된 샘플 수집과 처리가 있다면, 혈액 혈청 내 한계량 이상의 폴리펩티드 존재는 결정될 수 있다.

이 같은 항체-연결 리포터 시스템은 환자의 혈액 혈청이 폴리펩티드를 결핍된 양만큼 함유하는지 여부를 결정하는 방법에 사용될 수 있다. 주어진 타입의 대상의 혈액 혈청 내 이 같은 폴리펩티드의 정상적 한계농도가 주어진다면, 따라서 시험 키트가 개발될 수 있다.

더 나아간 장점은 당업계에 알려진 바와 같이 단백질의 키메릭 형태를 통하여 얻어질 수 있다. 전체 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하는 DNA 서열은 따라서E.coliβ-갈락토시다제의 C-말단 부위를 코딩하는 서열과 연결되어, 예를 들어 융합단백질을 생산할 수 있다. 인간 호흡기 융합세포 바이러스 당단백질 F와 G에 대한 발현 시스템은 예를 들어 1994년 2월 22일 특허된 미국특허 No. 5,288,630와 그것에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.

이 명세서에 인용된 모든 참고문헌은, 1995년 9월 26일에 출원된 미국의 조건부 특허 출원 No.004,314를 포함하여 여기에 참고문헌으로써 수록되어있다.

Claims

SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 13개까지의 인접하는 아미노산을 함유하며, 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편을 포함하는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 12개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 11개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 3 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 10개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 4 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 9개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 5 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:12나 SEQ ID NO:19의 보존적 변이체로부터 선택되는 8개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 적어도 여덟 아미노산 길이이고 SEQ ID NO:18로 식별되는 아미노산 서열 또는 그것의 보존적 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 13개까지의 인접하는 아미노산을 함유하며, 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편을 포함하는 폴리펩티드.
제 8 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 12개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 9 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 11개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 10 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 10개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 11 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 9개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 12 항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:19로 식별되는 아미노산 서열로부터 선택되는 8개까지의 인접하는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 적어도 여덟 아미노산 길이이고 SEQ ID NO:18로 식별되는 아미노산 서열 또는 그것의 보존적 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:18로 식별되는 아미노산 서열 또는 그것의 보존적 변이체로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 가지며, 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
SEQ ID NO:18로 식별되는 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열을 가지며, 포유 동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 폴리펩티드 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 아미노산 또는 C-말단 아미노산, 또는 두 아미노산 모두가 보호기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 13개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 1 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 12개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 2 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 11개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 3 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 10개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 4 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 9개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 5 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 8개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 6 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
제 18 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1의 폴리펩티드는 적어도 여덟 아미노산 길이인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 13개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 8 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 12개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 9 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 11개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 10 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 10개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 11 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 9개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 12 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
포유동물에서 뼈 성장을 촉진시키는 제 1의 폴리펩티드로서, 8개까지의 아미노산으로 본질적으로 구성되며, 제 13 항을 따라 정의되는 폴리펩티드 단편인 제 2의 폴리펩티드에 충분히 중복되는 아미노산 서열을 포함하여, 제 1의 폴리펩티드는 긴축조건에서 제 2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 혼성화되도록 하는 DNA에 의하여 코딩되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제 1의 폴리펩티드.
제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 실질적으로 순수하고 폴리펩티드는 약 1000 내지 약 4000, 또는 약 1200 내지 3000 또는 약 1200 내지 3000 또는 약 1800 내지 또는 약 1200 내지 1500 범위의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
활성성분으로서 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는, 뼈 감소 관련 질병의 예방과 치료에 사용되는 약제.
치료학적 유효량의 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는, 뼈 성장을 촉진시키는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가지는 치료학적 유효량의 폴리펩티드를 투여하여 포유 동물에서 뼈 성장을 증가시키는 방법.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의, 골다공증 치료제용의 사용.
포유류에서 뼈의 성장을 촉진시키기 위한, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 사용.
뼈 성장 촉진이나 골다공증 치료에 사용되는 의약의 제조에서의, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 사용.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 존재를 결정하는 용도의 진단 키트로서, 리포터 시스템에 연결된, 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하고, 리포터 시스템은 사전 결정된 양의 폴리펩티드와 항체가 함께 결합하였을 때 검출 가능한 반응을 생산하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 중 어느 하나의 발현을 코딩하는 분리된 DNA 단편 및 유전자 코드의 디제네러시 때문에 그 단편과 상이한 DNA.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 중 어느 하나의 발현을코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
제 39 항의 DNA 단편을 포함하는 비상동 DNA 서열을 포함하는 벡터.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,

a) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 단편을 준비하는 단계;

b) 상기 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하여 상기 DNA 단편을 함유하고 복제를 수행할 능력이 있는 재조합 DNA 단편을 얻는 단계;

c) 숙주세포를 상기 재조합 DNA 단펼으로 형질전환시켜 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 형질전환체를 분리시키는 단계; 및

d) 상기 형질전환체를 배양하여 형질전환체가 상기 폴리펩티드를 생산하도록 허용하고, 상기 폴리펩티드를 결과적 배양 혼합물로부터 회수하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 생산하는 방법.