CZ20012456A3

CZ20012456A3 - Polypeptid a farmaceutický prostředek pro stimulaci růstu kostí

Info

Publication number: CZ20012456A3
Application number: CZ20012456A
Authority: CZ
Inventors: Cherk Shing Tam
Original assignee: Osteopharm Inc.
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-13
Publication date: 2002-02-13
Also published as: IL143990A0; AU779261B2; HUP0105004A2; AU3028200A; NZ512637A; US6693081B2; BG105682A; JP2002538775A; MXPA01007043A; KR20010101425A; NO20013257L; US20020090671A1; CN1341120A; MA25594A1; EP1161450A1; BR0007816A; US20040147450A1; CA2358908A1; NO20013257D0; PL349786A1

Description

Předložený vynález se týká polypeptidů, které stimulují růst kostí.

Dosavadní stav techniky

Pochopení otázek souvisejících s růstem a pevností kostí během let pokročilo. Souhrn lze nalézt například v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/CA 94/00144, publikované 15. září 1994 jako spis WO 94/20615, v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/CA 94/00653, publikované 3. dubna 1997 jako spis WO 97/12036, v USA patentu č. 5 320 970 a v evropské patentové přihlášce č. 92 302 446, publikované 23. září 1992 pod č. 505 210; obsahy těchto přihlášek jsou zde uvedeny jako odkaz.

Podkladem předloženého vynálezu, který je popsán níže, je neutrofily-aktivující peptid (NAP-2; sekv. id. č. 1) a varianta tohoto NAP-2, zde označovaný NAP-2V (sekv. id. č. 2), které jsou již nějakou dobu známy (Walz A. a Baggiolini M: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, 159, 969.). Britský patent č. 2 231 872 (autoři vynálezu: M. Baggiolini, K. J. Clementson a A. Walz, publikovaný 14. června 1990) popisuje aminokyselinovou sekvenci NAP-2 a tři zřejmě přirozeně se vyskytující varianty, mezi nimi NAP-2V. Další dvě varianty mají na N-konci sekvence NAP-2 další čtyři (sekv. id. č. 3) a tři (sekv. id. č. 4) aminokyseliny. NAP-2 je podsekvence B-tromboglobulinu (B-TG; sekv. id. č. 5), která má na N-konci dalších jedenáct aminokyselin. B-TG sám je podsekvencí peptidu aktivujícího tkáň (CTAP-III; sekv. id. č. 6), který má ······ · ·· ·· • · ···· · ♦ · další čtyři aminokyseliny na N-konci. CTAP-III je podsekvencí základního proteinu destiček (PBP; sekv. id. č. 7), který má na N-konci dalších devět aminokyselin.

NAP-2 spolu s interleukinem-8 (lidský IL-8; sekv. id. č. 8; vepřový IL-8; sekv. id. č. 9) a aktivitou stimulující růst melanomu (MGSA) byly zařazeny do podskupiny známé jako α-chemokiny. a-Chemokiny mají společné čtyři cysteinové zbytky ve vysoce konzervativních polohách, které obklopují střední oblast molekuly, jak popsali Brandt a spol. (Ehlert J. E., Peterson F., Kubbuta Μ. H. G., Gerdes J., Flad H.-D. a Brandt E.: J. Biol. Chem. 1955, 270, 6338.). Brandt a spol. nalezli zřejmě přirozeně se vyskytující variantu NAP-2 se zkomoleným C-koncem, které chybějí poslední čtyři aminokyseliny NAP-2 a která vykazuje zvýšení aktivity stimulovat degranulaci neutrofilů. Brandt a spol. také syntetizovali varianty, kterým chybí koncová jedna, dvě, tři, pět a šest aminokyselin na C-konci NAP-2. Všechny tyto na C-konci zkomolené polypeptidy vykazovaly mírné zvýšení aktivity při srovnání s NAP-2 s výjimkou sekvence, která má pouze prvních šedesát čtyři aminokyselin NAP-2. Brandt a spol. diskutovali možný význam modifikací této sekvence, pokud jde o strukturu NASP-2 a jeho funkci.

Destičkový faktor 4 (PF4; sekv. id. č. 10) je polypeptid sedmdesáti aminokyselin (Hermodson M., Schmer G. a Kurachi K.: J. Biol. Chem. 1977, 252, 6276; Morgan F. J., Begg G. S. a Chesterman C. N.: Thromb. Haemost. 1979, 42, 1652.). Bylo ukázáno, že PF4 inhibuje proliferaci dvou buněčných linií osteoblastického osteosarkomu, Saos-2 a G-292 (USA patent č. 5 304 542; autor vynálezu: D. M. Tatakis; vydán 19. dubna 1994). Indomethacin zřetelně neovlivňuje PF-4 indukovanou inhibici buněčné proliferace. Jako užitečné byly navrženy příslušné fragmenty, PF4(58 až 70), PF4(47 až 70) a monomemí nízkoafinitní PF4 (LAPF4), který je z 50 % homologní s PF4 a obsahuje α-helikální C-konec. Jako užitečné při způsobu inhibování proliferace osteoblastů, mimo jiné, lidí trpících osteoporózou, byly tedy popsány PF4 a tyto příbuzné polypeptidy.

Prvních sedmdesát aminokyselin NAP-2V a sekvence PF4 jsou z asi 51 % homologní a mezi těmito dvěma polypeptidy jsou zachovány polohy čtyř cysteinových zbytků.

Již dříve bylo ukázáno, že NAP-2, NAP-2V a stejně tak jisté podsekvence NAP-2V vykazují účinky stimulace kostí, při čemž některé podsekvence nevykazují aktivitu stimulace kostí. Bylo zjištěno, že NAP-2V-(1 až 26) (sekv. id. č. 11) a NAP-2V-(13 až 26; gln²⁵->glu²⁵) (sekv. id. č. 12) zvyšují pozorovanou rychlost apozice kostí, druhý z nich je aktivnější než první. Ukázalo se, že NAP-2V-(10 až 26) (sekv. id. č. 13) způsobuje malé zvýšení pozorované rychlosti apozice kostí, i když statická významnost pozorovaného zvýšení je otázkou. Bylo zjištěno, že NAP-2V-(11 až 26) (sekv. id. č. 14) a NAP-2V-(12 až 26) (sekv. id. č. 15) nemají žádný vliv na pozorovanou rychlost apozice kostních minerálů.

Podstata vynálezu

Podle předloženého vynálezu bylo zjištěno, že chráněné verze NAP-2V-(13 až 26; gln²⁵->glu²⁵) (sekv. id. č. 17) a NAP-2V-(15 až 22) (sekv. id. č. 18) mají aktivitu stimulující kosti.

Tento vynález tedy zahrnuje polypeptid obsahující:

polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, fragment obsahující až 13 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinových sekvencí identifikovaných jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

V jiném aspektu tento vynález znamená takový polypeptid, v němž fragment obsahuje až 12 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

• · ······ · ·· ·· • · · ···· · • ♦ · · · · · · · · · • · · « ······ · • · · ······ ·· ··· ··· ·· ·* ···

Alternativně fragment obsahuje až 11, 10, 9 nebo 8 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

Bude uvedeno, že aminokyselinová sekvence identifikovaná jako sekv. id. č. 19je sekvence 14-meru, která odpovídá sekv. id. č. 12, aleje založena přímo na přirozeně se vyskytující sekvenci, tj. sekv. id. č. 2.

S výhodou má aminokyselinová sekvence, od které polypeptid získává svoji aktivitu, délku alespoň osmi aminokyselin. S výhodou tato sekvence znamená podsekvenci sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19 (nebo jejich chráněnou versi na N- nebo C-konci) nebo jejich konzervativně substituovanou variantu. Nejvýhodněji tato podsekvence obsahuje sekv. id. č. 18 (na kterou se zde odkazuje jako na aminokyselinovou sekvenci per se) nebo její konzervativně substituovanou variantu. Ještě výhodněji tato podsekvence znamená sekv. id. č. 18.

V jiném aspektu tento vynález znamená polypeptid obsahující:

polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, fragment obsahující až 13 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinových sekvencí identifikovaných jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

Fragment takového polypeptidu může obsahovat až 12 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19 nebo až 11, 10, 9 nebo 8 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

Tento fragment má s výhodou délku alespoň osm aminokyselin a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 18 nebo její konzervativní variantu.

• · ···· · ·· ·· ' « · ♦··· · · · • · · ·· · · · · · • · · ····♦· ·· ··· ··· ·· ·· ···

V jiném aspektu tento vynález znamená isolovaný polypeptid obsahující polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, tento fragment má aminokyselinovou sekvenci, která sestává v podstatě ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 18 nebo její konzervativní varianta. Výhodněji tento isolovaný polypeptid obsahuje polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, tento fragment má aminokyselinovou sekvenci, která sestává v podstatě ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 18.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou mít na jedné nebo druhé nebo na jak na jedné tak na druhé N-koncové aminokyselině a C-koncové aminokyselině chránící skupinu.

V jiném aspektu je tento vynález definován jako první polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 13 aminokyselin a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, tento druhý polypeptid znamená shora popsaný polypeptidový fragment, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

Takový první polypeptid může sestávat v podstatě z až 12, 11, 10, 9 nebo 8 aminokyselin, s výhodou má délku alespoň 8 aminokyselin.

Polypeptid podle předloženého vynálezu je s výhodou v podstatě čistý a má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 1000 do asi 4000 nebo od asi 1200 do 3000 nebo od asi 1200 do 3000 nebo od asi 1800 nebo od asi 1200 do 1500.

Tento vynález zahrnuje činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, které obsahuje polypeptid podle vynálezu, jak bylo shora popsáno.

000000 0 ·· 00 • 00 · 0 0 · 000

000 00 000 00

Tento vynález zahrnuje farmaceutický prostředek pro podporu růstu kostí, který obsahuje terapeuticky efektivní množství polypeptidu podle vynálezu.

Tento vynález zahrnuje způsob zvýšení růstu kostí u savců, podle kterého se podává terapeuticky efektivní množství polypeptidu podle vynálezu.

Tento vynález zahrnuje použití polypeptidu podle vynálezu pro léčení osteoporózy.

Tento vynález zahrnuje použití polypeptidu podle vynálezu pro podporu růstu kostí u savců.

Tento vynález zahrnuje použití polypeptidu podle vynálezu pro výrobu léčiva pro použití pro podporu růstu kostí nebo pro léčení osteoporózy.

Tento vynález zahrnuje diagnostickou sestavu pro stanovení přítomnosti polypeptidu podle vynálezu, která obsahuje protilátku na uvedený polypeptid navázaný na reporterový systém, při čemž tento reporterový systém produkuje detegovatelnou odpověď, když se předem stanovené množství polypeptidu a protilátka spolu naváží.

Tento vynález zahrnuje isolovaný DNA fragment, který kóduje expresi kteréhokoliv z polypeptidů podle vynálezu, a DNA, která se odlišuje od tohoto fragmentu díky degeneraci genetického kódu.

Tento vynález zahrnuje vektor, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje expresi polypeptidu podle vynálezu.

Tento vynález zahrnuje způsob výroby polypeptidu podle vynálezu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) přípravu DNA fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje uvedený polypeptid, ·♦···· · · · · · • · « ·· · · · ·· • fc fc·· fc fc fc 0fc '7 • fc fc ······ • fc fc·· ··· fcfc ·····

b) inkorporaci uvedeného DNA fragmentu do expresního vektoru, aby se získal rekombinantní DNA fragment, který obsahuje uvedený DNA fragment a je schopen podléhat replikaci,

c) transformování hostitelské buňky uvedeným rekombinantním DNA fragmentem, takže se isoluje transformant, který může exprimovat uvedený polypeptid, a

d) kultivování uvedeného transformantu, což umožní, že transformant produkuje uvedený polypeptid a uvedený polypeptid se isoluje z výsledné kultivační směsi.

Předložený vynález zahrnuje sloučeninu odvozenou od kteréhokoliv polypeptidu podle vynálezu.

Předložený vynález tedy zahrnuje polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z:

i) aminokyselinové sekvence odpovídající sekv. id. č. 18, ii) varianty polypeptidu podle ad i) obsahující více uvedených aminokyselinových sekvencí nebo iii) konzervativně substituované varianty polypeptidu podle ad i) nebo ii).

DNA sekvence NAP-2V popsaná Walzem a spol. (britský patent č. 2 231 872, autoři vynálezu: M. Baggiolini, K. J. Clementson a A. Waltz, publikovaný 14. června 1990: Neutrophil-activating peptide-2 and processes for the production of NAP-2, B-TG, CTAP-III a PBP) je zde identifikován jako sekv. id. č. 16.

Pojem selektivně hybridizován s znamená takové molekuly nukleové kyseliny, které za příslušných selektivních hybridizačních podmínek hybridizují, tvoří duplexy nebo se váží v podstatě pouze navzájem mezi sebou, jestliže tyto molekuly mající předem definované sekvence (tj. druhý polypeptid) jsou přítomny při přípravě DNA nebo RNA. Pro diskusi návrhu molekuly nukleové kyseliny a podmínek anelace viz například Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (druhé • · ♦·«··· « ·· ·· • 9 9 ·· * ♦· • · ··· 9 ♦ ♦ · ·9 • 9 99 999999 9

9 999999 ·· 999 999 99 «·999 vydání), díl '1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) nebo Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel a spol. (red.), Green Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1987).

Pojem selektivní hybridizační podmínky má obvyklý význam, který je znám odborníkům v oblasti techniky. Příslušné selektivní podmínky, které podporují hybridizaci nukleové kyseliny, například 6x chlorid sodný/citrát sodný (SSC) při asi 45 °C, jsou známy zručným odborníkům z oblasti techniky. V Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1 až 6.3.6 jsou uvedeny následující příklady: pro 50 ml prvního vhodného hybridizačního roztoku se spolu smíchá 24 ml formamidu, 12 ml 20x SSC, 0,5 ml 2M Tris-HCI, pH 7,6, 0,5 ml 100x Denhardtova roztoku, 2,5 ml deionizované vody, 10 ml 50% dextransulfátu a 0,5 ml 10% SDS. Druhým vhodným hybridizačním roztokem může být 1% krystalický BSA (frakce V), 1mM EDTA, 0,5M Na₂HPO₄, pH 7,2, 7% SDS. Koncentrace soli ve stupni promývání může být vybrána od nízkoselektivní asi 2x SSC při 50 °C do vysoceselektivní asi 0,2x SSC při 50 °C. Oba tyto promývací roztoky mohou obsahovat 0,1 % SDS. Dále pak teplota ve stupni promývání může být zvýšena z nízkoselektivních podmínek za teploty místnosti, asi 22 °C, na vysoceselektivní podmínky, asi 65 °C. Citovaný odkaz uvádí více podrobností, ale příslušná selektivita promývání závisí na stupni homologie a na délce sondy. Jestliže je homologie 100%, může se použít vysoká teplota (65 až 75 °C). Jestliže je homologie nízká, musí se používat při promývání nízké teploty. Avšak jestliže je sonda velmi krátká (méně než 100 párů nukleotidů), musí se používat nižší teploty, i když je homologie 100 %. Obecně se s promýváním začne za nižších teplot (37 až 40 °C) a teplota se zvyšuje po intervalech 3 až 5 °C tak dlouho, dokud pozadí není natolik dostatečně nízké, aby nebylo při autoradiografii hlavním faktorem.

Tento vynález zahrnuje četné chimemí faktory stimulace kostí vyrobené tak, že mají aminokyselinovou sekvenci polypeptidů podle předloženého vynálezu.

< 4 fc··· · fc*· · • · · ·· · · · · · ····· · · · ·· • fc · · · ···· ·· *·· ·4· *· ··· Φ *

V jiném aspektu tento vynález znamená činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, které jako účinnou složku obsahuje jakýkoliv polypeptid nebo jakékoliv polypeptidy podle předloženého vynálezu.

Tento vynález zahrnuje použití polypeptidu nebo polypeptidů pro výrobu léčiva pro použití při podpoře růstu kostí nebo při léčení osteoporózy.

Tento vynález zahrnuje protilátku syntetizovanou použitím polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 11, sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 13 nebo jejich konzervativně substituovanou variantu.

Popis obrázků

Obrázek 1 graficky ilustruje pozorované rychlosti apozice kostních minerálů (pm za den) u krys, kterým se injekčně podají chemicky syntetizované polypeptidy o sekvenci sekv. id. č. 17 (druhý sloupec) a sekv. id. č. 18 (třetí sloupec) při srovnání s kontrolou (první sloupec). Chyby sloupců jsou ±1 S.E.

Obrázek 2 graficky ilustruje závislost rychlosti apozice kostních minerálů (pm za den) na dávce u krys, kterým se injekčně podají uvedená množství polypeptidu se sekvencí sekv. id. č. 18. Chyby sloupců jsou ± 1 S.E.

Obrázek 3 ilustruje aminokyselinové sekvence testovaných polypeptidů odpovídajících navzájem seřazeným aminokyselinám, aktivní peptidy jsou uvedeny nad čarou a sekvence, o kterých bylo zjištěno, že nestimulují růst kostí, jsou uvedeny pod čarou. Přibližné molekulové hmotnosti jsou uvedeny pod identifikačními čísly sekvencí.

*· ·

· • 9·*·♦

9·« • > ♦· « ·· ·· ···

1.0

Příklady provedení vynálezu

Materiály, způsoby a výsledky

O polypeptidech, které mají sekvenci odpovídající kterékoliv ze sekvencí sekv. id. č. 1, 2,11,12 a 13, bylo již dříve zjištěno, že stimulují růst kostí.

Byly provedeny pokusy, které ukázaly, že polypeptidy se sekvencemi identifikovanými jako sekv. id. č. 17 a 18 vykazují aktivitu stimulace kostí. Tyto polypeptidy byly chemicky syntetizovány přímo podle standardních způsobů známých odborníkům z oblasti techniky. O polypeptidu, který má sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 12, bylo již dříve uvedeno, že má aktivitu stimulace kostí a že má dvě místa citlivá na štěpení peptidasovým plasminem mezi zbytky lysin-threonin a lysin-asparagin.

Devět krysích samic Sprague-Dawley (průměrná hmotnost asi 300 g) bylo rozděleno do tří skupin po třech. Každé z první skupiny, kontrolní skupiny, bylo injekčně podáno 400 μΙ roztoku pufru, 50mM octan sodný upravený na pH 4,5 a bezprostředně následovalo přidání 200 μ11M roztoku hydrochloridu tetracyklinu. Každý tento roztok byl podáván intramuskulámě do pravého velkého hýžďového svalu. Krysám ze druhé skupiny bylo každé podobně injekčně podáno 400 μΙ pufru obsahujícího 100 nmolů chemicky syntetizovaného polypeptidu identifikovaného jako sekv. id. č. 17 a bezprostředně následovalo 200 μΙ 1M roztoku hydrochloridu tetracyklinu. Krysám ze třetí skupiny bylo každé injekčně podáno 400 μΙ pufru obsahujícího 100 nmolů chemicky syntetizovaného polypeptidu, který má sekvence identifikované jako sekv. id. č. 18, bezprostředně následovalo 200 μΙ 1M roztoku hydrochloridu tetracyklinu.

Po 48 hodinách byla každé kryse podána druhá dávka hydrochloridu tetracyklinu. Po asi dalších 24 hodinách byly krysy usmrceny narkózou oxidu uhličitého.

····· · · · * * * * * * ··:*::

Pro kostní měření rychlosti apozice kostních minerálů byly použity sekce dolní metafýzy pravé stehenní kosti. Bezprostředně po pitvě byl vzorek fixován v 10% formaldehydovém roztoku při pH 7,4. Stejný den později byl formaldehydový roztok zaměněn za roztok vody s acetonem (1:1). Tento roztok byl následující den dvakrát zaměněn za aceton. Ten byl následující den zaměněn roztokem aceton-Spurrovo medium (1:1), který byl později tentýž den zaměněn za Spurrovo medium. Následující den byl každý vzorek vložen do čerstvého Spurrova media, byl v něm naložen 24 hodin při 60 °C a následovalo naložení 24 hodin při 80 °C.

Každý naložený blok byl nařezán na sekce o tloušťce 400 μίτι použitím Leitzovy pilky s diamantovým ostřím. Relativně silné sekce byly obroušeny mezi dvěma brusnými skleněnými destičkami předem zdrsněnými karborundovým práškem na konečnou tloušťku asi 10 pm, jako mlecí mazadlo byla použita voda. Tyto tenké sekce byly vysušeny a neobarvené byly upevněny do zařízení Permount (Fischer).

Měření byla prováděna Leitzovým mikroskopickým fotometrem s rozptýleným světlem MPV-CD zvětšujícím sekce 16x, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/CA94/00144. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce jedna a na obrázku 1.

Tabulka jedna

Srovnání aritmetických středů rychlostí apozice kostí (pm/den) skupin, kterým byly podány polypeptidy, které měly sekv. id. č. 17 a sekv. id. č. 18 uvedené na obrázku 3, a kontrolní roztok

kontrola	sekv. id. č. 17	sekv. id. č. 18
střed	1,256 pm/den	1,859 pm/den	2,406 pm/den
S.E.	0,06	0,10	0,25
n	3	3	3

V jiné řadě pokusů byla hodnocena závislost změřené rychlosti apozice kostních minerálů na dávce polypeptidu, který má sekv. id. č. 18. Dvacet osm krysích samiček Sprague-Dawley (průměrná hmotnost asi 300 g) bylo rozděleno do sedmi skupin po čtyřech. Krysy byly ošetřeny tak, jak je popsáno v předcházející řadě pokusů, až na to, že množství polypeptidu bylo měněno následujícím způsobem: 25, 50, 100, 200, 400 a 800 nmolů. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce dvě a na obrázku 2.

Tabulka dvě

Závislost rychlostí apozice kostí (pm/den) na dávce (v nanomolech) polypeptidu, který má sekv. id. č. 18

	kontr.	25	50	100	200	400	800
střed	1,320	1,686	1,753	1,907	2,209	2,123	2,139
S.E.	0,04	0,08	0,03	0,03	0,08	0,06	0,03
n	4	4	4	4	4	4	4

Jak je graficky ilustrováno na obrázku 1, NAP-2V-(15 až 22), který má aminový i karboxylový konec chráněn (sekv. id. č. 18), má větší aktivitu stimulace kostí než podobně chráněný NAP-2V-(13 až 26; gln²⁵->glu²⁵) (sekv. id. č. 17).

Ani sekvence NAP-2V-(15 až 22) ani NAP-2V-(13 až 26; gln²⁵->glu²⁵) si nezachová ani zbytek cys¹⁰ ani zbytek cys¹². Všem těmto sekvencím chybí zbytky cys³⁶a cys⁵² přítomné v rodičovském NAP-2V. Může být, že dříve pozorovaná snížená aktivita NAP-2V-(10 až 26), NAP-2V-(11 až 26) a NAP-2V-(12 až 26) existuje díky spontánní intermolekulámí disulfidové vazbě, která brání interakci polypeptid-receptor potřebné pro efekt stimulace kostí, ale toto není s jistotou známo.

Sekvence NAP-2V-(13 až 26; gln²⁵->glu²⁵) je odlišná od odpovídající subsekvence NAP-2V v poloze 25, zbytek kyseliny glutamové je přítomen místo glutaminového zbytku. Ovšem že by se čekalo, že subsekvence, která má glutaminový zbytek, jak je tomu v NAP-2V, by také měla působit stimulaci růstu kostí u savců.

Předpokládá se, že NAP-2 obsahuje dvě vnitřní disulfidové vazby mezi Cys-5 a Cys-31 a mezi Cys-7 a Cys~47 (Baggiolini M., Clementson K. J., Walz A.: Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/EP 89/01389, publikovaná 14. července 1990 pod číslem spisu WO 90/06321.). Prodloužením by zde popsané sekvence a podsekvence, které obsahují odpovídající cysteinové zbytky, pravděpodobně mezi nimi obsahovaly podobné vazby.

To bude ovšem chápáno tak, aniž by tím byl vynález nějak omezen, že jsou možné rozmanité jiné substituce aminokyselin za zachování struktury zodpovědné za účinek zde popsaných podsekvencí NAP-2V stimulovat kosti. Konzervativní substituce jsou popsány v patentové literatuře, jako například v USA patentu č. 5 264 558. Očekává se tedy, že by byla možná vzájemná záměna mezi nepolárními alifatickými neutrálními aminokyselinami, glycinem, alaninem, prolinem, valinem a isoleucinem. Rovněž by bylo možné provést substituce mezi polárními alifatickými neutrálními aminokyselinami, serinem, threoninem, methioninem, asparaginem a gluta« · minem. Pravděpodobně by se mohly provést substituce mezi nabitými kyselými aminokyselinami, kyselinou asparagovou a kyselinou glutamovou, stejně jako substituce mezi nabitými bazickými aminokyselinami, lysinem a argininem. Pravděpodobně by byly možné také substituce mezi aromatickými aminokyselinami, mezi které patří fenylalanin, histidin, tryptofan a tyrosin. Tyto druhy substitucí a vzájemných záměn jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky. Rovněž mohou být možné další substituce. Peptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která může být seřazena se sekvencí sekv. id. č. 17 nebo č. 18 a která má s nimi menší než 100% homologii, si může zachovávat alespoň část své aktivity stimulovat kosti. Ovšem, že by se také mělo očekávat, že větší procento homologie, řekněme 70 %, 80 %, 90 % nebo větší, by mohlo zvýšit stupeň zachování aktivity stimulovat kosti.

Sekvenční identita nebo homologie, jak se zde používá, označuje sekvenční podobnost mezi dvěma molekulami polypeptidu nebo mezi dvěma molekulami nukleové kyseliny. Jestliže poloha v obou srovnávaných polypeptidových sekvencích je například zaujata stejnou aminokyselinou (například jestliže nějaká poloha v každé z těchto dvou molekul polypeptidu znamená zbytek alaninu), potom jsou tyto molekuly homologní nebo sekvence jsou v této poloze identické. Procento homologie mezi dvěma molekulami nebo identita sekvencí mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu takových shodných poloh sdílených těmito dvěma sekvencemi podělených počtem srovnávaných poloh, to celé vynásobeno 100. Například jestliže 6 z 10 poloh ve dvou sekvencích je stejných, potom tyto dvě sekvence jsou ze 60 % homologní nebo mají 60% identitu sekvencí. Jako příklad - polypeptidové sekvence METLIA a MPTWIF sdílejí 50% homologii nebo identitu sekvencí. Srovnání se obecně provádí tak, že dvě sekvence se seřadí tak, aby se dosáhla maximální homologie.

Srovnání sekvencí a stanovení procent homologie mezi těmito dvěma sekvencemi se může provést použitím matematického algoritmu. Seřazení se může provést podle dvou způsobů, podle Clustalova způsobu a podle J. Heineho způsobu. Z nich je výhodným Clustalúv způsob.

Clustalúv algoritmus (jak je zde aplikován použitím softwaru dostupného od DNASTAR lne., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin, USA, 1994) je doporučován pro seřazení sekvencí, jejichž podobnost nemusí být nutně evoluční. Algoritmus je popsán Higginsem D. G. a spol.: CABIOS 1989, 5, 151. Stejný softwarový program poskytuje seřazení sekvencí podle Jotun Heineho způsobu, který je doporučován pro seřazení sekvencí vysoce vyvinutých skupin, které mají jasný evoluční vzájemný vztah. Tento algoritmus je popsán Heinem J.: Methods in Enzymology, 1990, 183, 626. Používají se standardní parametry programu (default settings). V případě hodnocení aminokyselinových zbytků na bázi evolučních substitučních parametrů, nábojové, strukturní a chemické podobnosti, se používá default PAM250 nastavení. Pro seřazení proteinů se používají párové parametry seřazení Ktuple = 1, Gap penalty = 3, Window = 3 a Diagonals Saved = 5.

Pokud se týká delece jedné nebo více aminokyselin, je pravděpodobné, že mohou být možné delece malého počtu aminokyselin z každého konce kterékoliv sekvence, při čemž se vezme v úvahu zjištění, že delece, kterými se získají sekv. id. č. 14 a 15, poskytují polypeptidy, které nevykazují zvýšený růst kostí.

Adice aminokyselin by se mohla velice pravděpodobně provést na koncích sekvence, a podobně jako u delecí, jsou pravděpodobně možné symetrické nebo téměř symetrické adice na karboxylový a aminový konec sekvence, ty pak vykazují aktivitu stimulace kostí.

Polypeptid podle předloženého vynálezu by mohl být zlepšen, pokud jde o možnou degradaci, jelikož by se mohl vyskytovat v těle v přítomnosti proteasy, například chráněním C-konce, N-konce nebo jak C-konce tak N-konce polypeptidu.

Chráněná koncová aminová skupina, jak se zde používá, znamená koncovou aminovou skupinu (N-koncovou) kondenzovanou s jakoukoliv z rozmanitých skupin chránících aminový konec, které se mohou používat v syntéze peptidů. Mezi příklady vhodných skupin patří acylové chránící skupiny, například formylová, acetylová, ben• φ zoylová, trifluoracetylová, sukcinylová a methoxysukcinylová skupina, aromatické urethanové chránící skupiny, například benzyloxykarbonylová, a alifatické urethanové chránící skupiny, např. terc.butoxykarbonylová nebo adamantyloxykarboxylová skupina (Gross a Mienhofer (red.) The Peptides, díl 3, str. 3 až 88 (Academie Press, New York 1981).).

Chráněná koncová karboxylová skupina, jak se zde používá, znamená koncovou karboxylovou skupinu (C-konec) kondenzovanou s jakoukoliv z různých skupin chránících karboxylovou skupinu. Jak bude ihned zřejmé zručnému odborníkovi z oblasti techniky, mezi vhodné skupiny patří terc.butylová, benzylová nebo jiné přijatelné skupiny navázané na koncovou karboxylovou skupinu esterovou nebo etherovou vazbou.

Sloučeniny v rozsahu tohoto vynálezu mohou být syntetizovány chemicky prostředky dobře známými v oblasti techniky, jako je například syntéza peptidú v pevné fázi. Tato syntéza začíná na karboxylovém konci peptidu použitím aminokyseliny chráněné na α-aminové skupině. Mohou se používat terc.butoxykarbonylové (Boc) chránící skupiny nebo jiné vhodné chránící skupiny (Stewart a spol.: Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco (1969); Merrifield: J. Amer. Chem. Soc. 1963, 85, 2149 až 2154; Vale a spol.: Science 1981, 213, 1394 až 1397, a Marke a spol.: J. Amer. Chem. Soc. 1981, 103, 3178.). Syntetické způsoby jsou popsány také v Principles of Peptide Synthesis, M. Bodansky (red.), Springer-Verlag 1984. Příklady těchto a dalších způsobů syntézy peptidů jsou uvedeny také v USA patentech č. 3 862 925, 3 842 067, 3 972 859, 4 105 602, 4 683 291, 4 244 946 a 4 305 872.

Sloučeniny se mohou syntetizovat také použitím ručních nebo automatických způsobů, například syntetizátorem peptidů Applied BioSystems 430A Peptide Synthesizer (Foster City, Kalifornie) nebo automatickým syntetizátorem peptidů Biosearch SAM 11 (Biosearch, lne., San Rafael, Kalifornie).

• ♦ ··· ·

Sloučenina odvozená od polypeptidu, která má příslušnou aminokyselinovou sekvenci, znamená jakoukoliv část molekuly, která je identická, v podstatě homologní nebo jinak funkčně nebo strukturně ekvivalentní s tímto polypeptidem. Molekula odvozená od příslušného polypeptidu může tedy zahrnovat aminokyselinovou sekvenci polypeptidu, jakoukoliv část tohoto polypeptidu nebo jinou molekulovou část, která funguje při stimulaci růstu kostí. Molekula, která je odvozena od takové vazebné domény, bude napodobovat polypeptid, z něhož je odvozena. Mezi takové molekulové částice mohou být zahrnuta peptidová mimetika a podobně.

Peptidová mimetika jsou takové struktury, které slouží jako náhrady za peptidy při interakcích s akceptorovými molekulami (viz Morgan a spol: Ann. Reports Med. Chem. 1989, 24, 243 až 252 pro souhrn o peptidových mimetikách). Mezi peptidová mimetika, jak jsou zde používána, patří syntetické struktury, které mohou nebo nemusí obsahovat aminokyseliny a/nebo peptidové vazby, ale zachovávají si strukturní a funkční znaky peptidu, od něhož jsou odvozeny. Pojem peptidová mimetika zahrnuje také peptoid a oligopeptoidy, což jsou peptidy nebo oligomery N-substituovaných aminokyselin (Simon a spol.: Proč. Nati. Acad. Sd. USA 1972, 89, 9367 až 9371.). Mezi peptidová mimetika jsou dále zahrnuty peptidové knihovny, což jsou sbírky peptidů navržených tak, aby poskytly danou délku aminokyselin a představující všechny myslitelné sekvence aminokyselin, které jí odpovídají.

Dvě polypeptidové sekvence jsou v podstatě homologní, jestliže alespoň asi 85 % (s výhodou alespoň asi 85 % až 90 % a nejvýhodněji alespoň asi 95 %) nukleotidů nebo aminokyselin se shoduje v definované délce polypeptidu. Jak se zde používá, v podstatě homologní znamená také sekvence vykazující identitu se specifickou polypeptidovou sekvencí.

Peptidová mimetika, která strukturně a funkčně napodobují polypeptidy se zde popsanou aktivitou stimulace kostí, zde také najdou svoje použití a mohou být generována použitím následujících strategií a postupů. Obecně se mimetika navrhují na základě informací získaných systematickým nahrazováním L-aminokyselin D-amino18 kyselinami, nahrazováním skupin postranního řetězce methylovou skupinou nebo pseudoisostemími skupinami s jinými elektronickými vlastnostmi (viz Hrubý a spol.: Biochem. J. 1990, 268, 249 až 262) a systematickým nahrazováním peptidových vazeb ve shora popsaných peptidových inhibitorech náhradami amidovou vazbou. Například analogy obsahující náhrady amidovou vazbu se mohou použít k výzkumu aspektů struktury a funkce peptidů, jako je volnost rotace v základním skeletu, sestavy intra a intermolekulámích vodíkových vazeb, modifikace lokální a celkové polarity a hydrofóbnosti a orální biologické dostupnosti.

Pro stanovení konformačních požadavků se mohou zavést místní konformační napětí, aby se zjistily konformační požadavky související s aktivitou potenciálu peptidového mimetika, které má aktivitu stimulovat kosti. Například se mohou pro zkoumání účinků konformačního napětí na peptidovou aktivitu použít β,β-disubstituované aminokyseliny (viz např. Manning a spol.: J. Med. Chem. 1982, 25, 408 až 414; Mosberg a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1983, 106, 506 až 512; Pelton a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1985, 82, 236 až 239.).

Mezi mimetika mohou patřit isosterické amidové vazby, jako je \|/[CH₂S], ψ[ΟΗ₂ΝΗ], ψ[0ΝΗ₂], v|/[COCH₂] a ψ[(Ε) nebo (Z) CH==CH], pro souhrn viz Spatola v Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, díl VII (Weinstein, red.), str. 267 až 357, Marcel Dekker, New York 1983. Mezi syntetické molekuly mohou patřit také D-aminokyseliny pro stabilizování nebo pro podporu obrácených konformací a pro pomoc při stabilizování molekuly před enzymatickou degradací (viz např. Freidinger a spol. v Peptides: Structure and Function (Deber a spol., red.), 549 až 552, Pierce Chem. Co., Rockford, III., 1985; Sawyer a spol.: Proč. Natí. Acad. Sci. USA 1980, 77, 5754 až 5758; Torchiana a spol.: Arch. Int. Pharmacol. Ther. 1978, 235, 170 až 176.). Cyklická aminokyselinová analoga se mohou použít pro zvýšení pnutí aminokyselinových zbytků na příslušné konformační stavy, např. a,a'- a β,β-substituované cyklické aminokyseliny, jako je 1-aminocyklopentankarboxylová kyselina (cykloleucin) a B,íi-cyklopentanmethylen-B-merkaptopropionová kyselina (viz Hrubý a spol.: 1990, výše).

Mezi mimetika mohou patřit také mimetika polypeptidové sekundární struktury - struktur, která mohou modelovat trojrozměrnou orientaci aminokyselinových zbytků na známé sekundární konformace proteinů - zahrnující mimetika β-řady, jako je fenoxathinový cyklický systém, a mimetika β-listu, jako jsou epindolidionové struktury. Byl popsán návrh syntézy a konformační analýza templátu indukujícího a-šroubovici (Kemp a spol.: Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4931; Kemp a spol.: Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4935.).

Potenciální mimetikum může být testováno, nebo předběžně vyhodnoceno, na potenciální aktivitu jako sloučenina stimulující kosti měřením afinity této sloučeniny na protiláku proti polypeptidu, od něhož je toto mimetikum odvozeno. Jak bylo shora popsáno pro polypeptidy, ta mimetika, která reagují positivně s protilátkou na již známý peptid, by mohla být testována na účinky stimulace kostí in vivo použitím systému popsaného zde například pro krysy. V této souvislosti by byly zvláště užitečné protilátky proti polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 9.

Používat se zde budou peptoidy. Peptoidy jsou oligomery N-substituovaných aminokyselin (Simon a spol.: 1972, viz výše.). Mohou se používat jako motify pro generaci chemicky různých knihoven nových molekul, které se pak mohou testovat na navázání a aktivitu stimulovat kosti. Monomery mohou inkorporovat ochranu a-aminu postranním řetězcem na bázi terc.butylu a chránit α-amin 9-fluorenylmethoxykarbonylem. Oligomerizace peptoidních monomerů se může provádět například in šitu aktivací buď benzotriazol-1 ~yloxytris(pyrrolidino)fosfonium-hexafluorfosforečnanem nebo bromtris(pyrrolidino)fosfonium-hexafluorfosforečnanem. Další stupně jsou identické se syntézou konvenčního peptidu použitím a-(9-fluorenylmethoxykarbonyl)aminokyselin. Mohou být identifikovány oligopeptoidy, které mají afinity srovnatelné s odpovídajícími polypeptidy a jsou tedy potenciálně užitečné jako stimulační činidla kostí.

• 4	4444	•	44			44		4
• 4	4	4 · ·		4	•		4	4 4
• 4	4 44	4 4		4	4		4	4
• 4	4 4	4 4		4	4 4		4	4
φ 4	4	4 4		4	4		4	4
44	444	444	• 4			44		4 4 4

Sloučeniny podle předloženého vynálezu a prostředky, které je obsahují, nalézají použití v četných terapeutických a profylaktických aplikacích při předcházení a léčení onemocnění souvisejících s redukcí kostí. Tyto sloučeniny se tedy mohou používat jako léčení pro podporu růstu kostí, při léčení osteoporózy, například jakýmkoliv vhodným způsobem. Výhodné způsoby jsou vhodné pro dodávání sloučenin typu polypeptidů do krevního oběhu subjektu, při čemž se vezmou v úvahu příslušné podmínky pro skladování a zacházení vyžadované u polypeptidů, jako jsou ty, které jsou zde popsány.

Předložený vynález tedy poskytuje také prostředky obsahující účinné množství sloučenin podle předloženého vynálezu, mezi které patří jejich netoxické adiční soli, amidy a estery, které mohou, samotné, sloužit k dosažení shora popsaných příznivých účinků léčení. Tyto prostředky se mohou připravovat společně s fysiologicky tolerovatelnými kapalnými, gelovými nebo pevnými ředidly, přísadami nebo vehikuly.

Ve shora uvedených příkladech zahrnujících podsekvence NAP-2V se pro podávání používá asi 75 nmolú polypeptidů na kg tělesné hmotnosti živočicha. Při praktickém používání, zvláště jde-li o člověka, může být denní dávka mezi 0,01 a 300 nebo více mg na kg tělesné hmotnosti. Výhodněji by tato dávka měla být blízko od asi 0,1 do asi 30 mg na kg tělesné hmotnosti. Může být, že výhodná frekvence podávání by mohla být větší nebo menší než jednou denně, což závisí na způsobu podávání, vhodnosti, změny účinnosti léčení v závislosti na frekvenci a na množství použitém pro podávání. Podávaná dávka také závisí na subjektu a dále na tom, jaký účinek se má tímto podáváním dosáhnout. Dávkování jakékoliv jedné nebo více sloučenin bude záviset na mnoha faktorech, mezi které patří specifická sloučenina nebo kombinace sloučenin, která se používá, způsob podávání a savec, který je léčen. Dávkování příslušné sloučeniny nebo kombinace sloučenin lze stanovit za použití konvenčních úvah; například srovnáním různých aktivit předmětných sloučenin a aktivit známého činidla pro daného uživatele, to znamená, pomocí prostředků příslušného farmakologického protokolu, v němž se například měří hustota kostí subjektů v závislosti na čase.

·· ·♦♦♦ • 4 ·· • · · ♦ 4 • · • « ·· ·

Mezi farmaceutické přípravky patří jakékoliv sloučeniny vyrobené jako injektovatelný roztok včetně injektovatelného roztoku vyrobeného právě před použitím, pro podpoření růstu kostí a/nebo pro léčení osteoporózy. Injektovatelný může být buď kapalný roztok nebo suspenze; mohou se vyrábět také pevné formy vhodné pro roztok v kapalině nebo pro suspenzi v kapalině před podáním injekce. Přípravek může být také emulgován. Účinný polypeptid se často smíchá s ředidly a vehikuly, která jsou fysiologicky tolerovatelná a jsou slučitelná s polypeptidem. Vhodnými ředidly a vehikuly jsou například voda, solný roztok, dextrosa, glycerol nebo podobné a jejich kombinace. Navíc, jestliže je to žádoucí, prostředky mohou obsahovat menší množství pomocných látek, jako jsou smáčecí nebo emulgační činidla, stabilizační činidla nebo činidla pufrující pH a podobně.

Mezi farmaceutické přípravky patří použití sloučenin ve směsi s konvenčními vehikuly, to znamená farmaceuticky přijatelnými organickými nebo anorganickými nosnými látkami, které nereagují škodlivě se sloučeninami a které umožňují zvýšit stabilitu těchto sloučenin při jejich skladování a při zacházení s nimi. Mezi preparativní postup může patřit sterilizace farmaceutických přípravků. Tyto sloučeniny se mohou smíchat s pomocnými činidly, jako jsou mazadla, ochranná činidla, stabilizační činidla, soli pro ovlivnění osmotického tlaku atd., která nereagují škodlivě s těmito sloučeninami.

Tyto prostředky se konvenčně podávají parenterálně, injekcí, například buď subkutánně nebo intravenózně. Mezi další přípravky, které jsou vhodné pro další způsoby podávání, patří čípky, intranazální aerosoly a v některých případech orální přípravky. U čípků mezi tradiční vazebná činidla a vehikula mohou patřit například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy; takové čípky se mohou vyrábět ze směsí obsahujících účinnou složku v rozmezí od 0,5 % do 10 %, s výhodou od 1 % do 2 %. Orální prostředky obsahují taková normálně používaná vehikula, jako je například manitol pro farmaceutické použití, laktosa, škrob, stearát hořečnatý, sodná sůl sacharinu, celulosa, uhličitan hořečnatý a podobné. Tyto prostředky mají formu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, tobolek, přípravků s trvalým uvolňováním nebo prášků a

4444 • φ · · 4 · 444 4 *44* ··♦* f»4*«4* \·* « obsahují 10 % až 95 % účinné složky, s výhodou 25 % až 70 %. Mezi tyto orální přípravky patří přípravky navržené tak, aby chránily peptid tak dlouho, dokud není absorbován.

Peptidové sloučeniny se mohou do prostředků sestavovat jako neutrální nebo ve formě solí. Mezi farmaceuticky přijatelné netoxické soli patří adiční soli s kyselinami (vytvořené s volnými aminovými skupinami), které jsou vyrobeny s anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo takovými organickými kyselinami, jako je kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová a podobné. Soli vytvořené s volnými karboxylovými skupinami mohou být odvozeny od anorganických bází, jako je například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý, a takovými organickými bázemi, jako je isopropylamin, trimethylamin,

2-ethylaminoethanol, histidin, prokain a podobné.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být homopolymerovány samy se sebou (tj. (peptid)_n) nebo heteropolymerovány jeden s druhým. Tyto sloučeniny mohou být také konjugovány s biologicky slučitelnými polymemími sloučeninami, jako je BIOPOL™ (WR Grace & Co., Conn.).

Jestliže se vyrábějí použitím rekombinantních technik, DNA sekvence kódující žádaný polypeptid podle předloženého vynálezu se syntetizují použitím standardních automatizovaných technik nebo se kódující sekvence nebo jejich části získají z cDNA nebo genomových knihoven. Tato DNA se liguje do příslušných expresních vektorů a tyto vektory se transformují do vhodných hostitelů. Mohou se použít rozmanité systémy expresní vektor/hostitelská buňka, mezi které patří jako prokaryotické tak eukaryotické kultivační systémy.

Prokaryoty jsou nejčastěji representovány různými kmeny E. coli. Mohou se však používat také jiné mikrobiální kmeny, jako jsou bacilli, například Bacillus subtilis, různé druhy Pseudomonas nebo jiné bakteriální kmeny. V těchto prokaryotických systémech se používají plasmidové vektory, které obsahují počátky replikace a regulační sekvence odvozené od druhů slučitelných s hostitelem. Například E. coli se typicky transformuje použitím derivátů pBR322, plasmidu odvozeného od druhů E. coli (Bolivar a spol.: Gene 1977, 2, 95.). Mezi obvykle používané prokaryotické regulační sekvence, které jsou zde definovány, zahrnující promotory pro iniciaci transkripce, popřípadě s operátorem, spolu se sekvencemi ribosomového vazebného míst, patří takové obvykle používané promotory, jako je beta-laktamasa (penicilinasa), laktosové (1nc) promotorové systémy (Chang a spol.: Nátuře 1977, 198, 1056.), tryptofanové (trp) promotorové systémy (Goeddel a spol.: NucleicAcids Res. 1990, 8, 4057.) a od lambda-odvozený P_L promotor a ribosomové vazebné místo N-genu (Shimatake a spol.: Nátuře 1981, 292, 128.). Může se však používat jakýkoliv dostupný promotorový systém, který je slučitelný s prokaryoty.

Expresní systémy užitečné v eukaryotických systémech podle vynálezu zahrnují promotory odvozené od příslušných eukaryotických genů. Mezi skupinu promotorů užitečných v kvasinkách patří například promotory pro syntézu glykolytických enzymů zahrnujících alkohol-dehydrogenasové promotory, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasový promotor (Holland a Holland: J. Biol. Chem. 1980, 25, 2596.), α-faktorový promotor (Bitter a spol.: Proč. Natí. Acad. Sci. USA 1984, 81, 5330.), gal-promotor (Johnston a David: Mol. Cell Biol. 1984, 4, 1440.), promotory pro 3-fosfoglycerát-kinasu (Hitzeman a spol.: J. Biol. Chem. 1980, 256, 1385.) nebo Leu2 gen získaný z YEp13 (Broach a spol.: Gene 1978, 8,121.).

Mezi vhodné savčí promotory patří časné a pozdní promotory z SV40 (Fiers a spol.: Nátuře 1978, 273, 113.) nebo jiné virové promotory, jako jsou ty, které jsou odvozeny od polyomu, adenovirů II, hovězího papilloma viru nebo viru ptačího sarkomu. Vhodné virové a savčí zesilovače jsou uvedeny výše. V případě rostlinných buněk jsou používány jako expresní systém, příslušný je promotor nopalinové syntézy (Depicker A. a spol.: J. Mol. Appl. Gen. 1982, 1, 56.).

Expresní systémy jsou zahrnuty na replikačních virech nebo způsobují to, že se integrují do chromosomu rekombinantního hostitele. U systémů, u nichž vektory

• ·			«	• ·			• 0
•	•	«	·* ·		•	•		•	• ·
•	•	···	• ·		fc	fc		•

•	•	•	• ·		•	•		•
··		···	fc · ·	• fc			• fc		fc fc

zahrnují replikační systém, mohou existovat s nízkým nebo vysokým počtem kopií, obvykle mají počty kopií menší než asi 1000, i když v některých situacích se mohou ¹používat uprchlé vektory. Ať existují na vektoru, který připadá v úvahu pro integraci, nebo v replikačním systému, sekvence kódující polypeptid podle vynálezu může být ligována v tandemu s amplifikujícím se genem, jako je dihydrofolátreduktasa, metalothioneiny, thymidinkinasa nebo podobné. U prokaryotických systémů může existovat jak amplifikující se gen tak cílový gen pod regulací stejných transkripčních a translačních regulačních sekvencí.

Tento vektor bude obvykle zahrnovat markér, který umožňuje selekci hostitelských buněk obsahujících expresní systém; povaha těchto markérů závisí na hostiteli a je známa v oblasti techniky. Vedle požadovaných regulátorů, jako jsou promotory, se mohou pro zvýšení hladiny transkripce používat také další sekvence, jako jsou zesilovače. Jestliže se má polypeptid sekretovat, může se použít sekvence po směru vlákna kódující signální peptidy, jako jsou ty, které jsou popsány v USA patentech č. 4 336 336, 4 338 397 a 4 546 082. Signální sekvence se enzymaticky štěpí, když se polypeptidový produkt sekretuje.

V závislosti na použité hostitelské buňce se transformace provádí použitím standardních způsobů příslušných pro takové buňky. Zpracování s vápníkem používající chlorid vápenatý, jak je popsáno Cohenem S. N.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1972, 69, 2110, nebo RbCI způsob popsaný v Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1992, Cold Spring Harbor Press, strana 254, se používá pro prokaryoty nebo pro jiné buňky, které obsahují podstatné bariery buněčné stěny. Pro některé rostlinné buňky se používá infekce Agrobacterium tumefaciens (Shaw C. H. a spol.: Gene, 1938, 23, 315.). Pro savčí buňky bez takových buněčných stěn je výhodný způsob srážení fosforečnanem vápenatým podle Grahama a van der Eba: Virology, 1978, 52(2), 546. Transformace do kvasinek se provádí například způsobem podle Van Sollingena P. a spol.: J. Bacter. 1977, 130, 946, a Hsiaoa C. L. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1979, 76, 3829.

• · ·♦» · · · * · Σ > · · * ······ · ·» · φφ···· ·· ··· ··♦ ·· ·· ···

Obecně se po konstrukci vhodného expresního systému tento systém transfektuje do příslušného hostitele a úspěšné trasformanty se vyberou pomocí markérů obsažených na expresních vektorech. Úspěšně transformované kolonie se pak kultivují tak, aby se vyrobil žádaný polypeptid. Někdy je výhodné, aby promotor, který může být regulován regulačními podmínkami z okolí, byl použit tak, aby buňky mohly růst za takových podmínek, kdy se gen kódující žádaný polypeptid podle vynálezu neexprimuje a potom se produkce polypeptidu indukuje příslušnou úpravou podmínek. Například jestliže se v E. coli použije trp promotor, buňky rostou v přítomnosti tryptofanu a exprese se pak indukuje snížením koncentrace tryptofanu nebo přidáním analoga tryptofanu, jako je indolyloctová kyselina. Jestliže je gen pod regulací PL promotoru, buňky rostou za relativně nízké teploty, jako je teplota kolem asi 35 °C, na vhodnou hustotu buněk. Potom se teplota zvýší, aby se tento promotor aktivoval. Jestliže se v bakteriálních hostitelích produkuje jako maturovaný intracelulámí polypeptid, N-koncový methionin může nebo nemusí být odštěpen. V savčích systémech například použití metalothioneinového promotoru dovoluje indukci přidáním těžkých kovů nebo glukokortikoidú. Tento protokol je výhodný pro předcházení prematurované akumulace polypeptidu, který může být škodlivý pro růst buněk.

Polypeptid se může produkovat intracelulámě nebo v sekretované formě konstrukcí vektorů, v nichž před peptidem předchází signální peptid zpracovatelný v příslušném hostiteli.

Tento polypeptid se isoluje z media nebo z buněk použitím vhodných způsobů obecně známých z oblasti techniky a vyčistí se například chromatografií na ionexu, vysrážením síranem amonným, chromatografií na gelu a tak dále.

Polypeptidy, které jsou dostupné podle zde popsaného vynálezu, se mohou použít pro získání antisera na ně (Stites D. P. a Terr A. I. v Basic & Clinical Immunology, sedmé vydání, Appleton a Lange (red.), Norwalk, Connecticut a San Matea 1991, Kalifornie). Metodologie a produkty se mohou vyvinout použitím protilátky na polypeptid pro použití při detegování polypeptidu, s nímž se protilátka váže. Toto bylo

		• ··				•
•	•	•	··	•	•		•	··
•	•		•	•	•	•	•	•
•	•	• ·	• ·	•	• ·	•	•
•	•	•	•	•	•	•	•	•
··	·«·	···	··			··	···

zřetelně provedeno alespoň pro polypeptid, který má sekvenci CTAP-II (sekv. id. č. 3) (Baggiolini M., Clemetson K. J., Walz A.: mezinárodní patentová přihláška č. PCT/EP 89/01389, publikovaná 14. června 1990 pod číslem spisu WO 90/06321). Použitím protilátky na polypeptid může být vyvinuta metodologie a produkty pro použití při detegování polypeptidu, se kterým se protilátka váže.

Například protilátka se může vázat na nebo konjugovat s reportérovým systémem, který je nastaven tak, že indikuje positivní navázání polypeptidu na protilátku. Mezi dobře známé reportérové systémy patří radioimunotest (RIA) nebo imunoradiometrické testy (IRMA). Společně s RIA a IRMA také ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) má relativně vysoký stupeň citlivosti, ale obecně by se nemělo spoléhat na použití radioisotopů. Může se připravit vizuálně detegovatelná látka nebo látka detegovatelná alespoň spetrofotometrem. Mohl by se použít také test spoléhající se na fluorescenci látky navázané na enzym, který je testován. Existují četné reportérové systémy, které se mohou používat podle předloženého vynálezu pro detegování přítomnosti příslušného polypeptidu. U standardní sbírky vzorků a zpracování by se mohly dobře stanovovat polypeptidy, které jsou přítomny nad prahovým množstvím v krevním seru.

Takový reporterový systém s navázanou protilátkou by se mohl používat při způsobu stanovení toho, jestli krevní sérum subjektu obsahuje deficitní množství polypeptidu. Pro danou normální prahovou hodnotu koncentrace takového polypeptidu v krevním seru daného typu subjektu by mohly být tedy vyvinuty testovací sestavy.

Další výhodu lze získat chimemími formami proteinu, jak je známo v oblasti techniky. Například DNA sekvence kódující celý protein nebo část proteinu by mohla být tedy navázána na sekvenci kódující C-koncovou část E. coli β-galaktosidasy, takže se produkuje napojený protein. Například expresní systém pro lidské respirační syncyciální virové glykoproteiny F a G je popsán v USA patentu č. 5 288 630, vydaném 22. února 1994, a v odkazech tam uvedených.

Všechny odkazy citované v tomto spisu jsou zde zahrnuty jako citace, včetně

USA prozatímní patentové přihlášky č. 004 314, podané 26. září 1995.

• · • · · ·

Claims

1. Polypeptid obsahující polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, fragment obsahující až 13 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinových sekvencí identifikovaných jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

2. Polypeptid podle nároku 1, v němž fragment obsahuje až 12 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

3. Polypeptid podle nároku 2, v němž fragment obsahuje až 11 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

4. Polypeptid podle nároku 3, v němž fragment obsahuje až 10 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

5. Polypeptid podle nároku 4, v němž fragment obsahuje až 9 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 19 nebo konzervativní varianta sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

6. Polypeptid podle nároku 5, v němž fragment obsahuje až 8 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo její konzervativní varianty.

• · ··

7. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, v němž fragment má délku alespoň osm aminokyselin a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 18 nebo její konzervativní variantu.

8. Polypeptid obsahující polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, tento fragment obsahující až 13 po sobě jdoucích aminokyselin je vybrán z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

9. Polypeptid podle nároku 8, v němž fragment obsahuje až 12 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

10. Polypeptid podle nároku 9, v němž fragment obsahuje až 11 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

11. Polypeptid podle nároku 10, v němž fragment obsahuje až 10 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

12. Polypeptid podle nároku 11, v němž fragment obsahuje až 9 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

13. Polypeptid podle nároku 12, v němž fragment obsahuje až 8 po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 12 nebo sekv. id. č. 19.

14. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 8, 9, 10, 11, 12 nebo 13, v němž fragment má délku alespoň osm aminokyselin a zahrnuje aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 18 nebo její konzervativní variantu.

15. Isolovaný polypeptid obsahující polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, tento fragment má aminokyselinovou sekvenci, která sestává v podstatě ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 18 nebo její konzervativní varianty.

16. Isolovaný polypeptid obsahující polypeptidový fragment, který podporuje růst kostí u savců, tento fragment má aminokyselinovou sekvenci, která sestává v podstatě ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 18.

17. Polypeptid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, v němž jedna nebo druhá nebo jak N-koncová aminokyselina tak C-koncová aminokyselina obsahuje chránící skupinu.

18. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 13 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 1, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

19. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 12 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 2, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

20. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 11 aminokyselin, a je dostatečně dup- likativní k druhému polypeptidů, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 3, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

21. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 10 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidů, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 4, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

22. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 9 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidů, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 5, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

23. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 8 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidů, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 6, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

24. První polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 18 až 23, při čemž tento první polypeptid má délku alespoň 8 aminokyselin.

25. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 13 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidů, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 8, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

····

26. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 12 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 9, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

27. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 11 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 10, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

28. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 10 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 11, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

29. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 9 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 12, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

30. První polypeptid, který podporuje růst kostí u savců, obsahující sekvenci aminokyselin, která sestává v podstatě z až 8 aminokyselin, a je dostatečně duplikativní k druhému polypeptidu, druhý polypeptid znamená polypeptidový fragment definovaný podle nároku 13, takže první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

• · · • · ·

31. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30, při čemž tento polypeptid je v podstatě čistý a má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 1000 do asi 4000 nebo od asi 1200 do 3000 nebo od asi 1200 do 3000 nebo od asi 1800 nebo od asi 1200 do 1500.

32. Činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31.

33. Farmaceutický prostředek pro podporu růstu kostí, vyznačující se t í m, že obsahuje terapeuticky efektivní množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31.

34. Způsob zvýšení růstu kostí u savců, vyznačující se tím, že se savci podává terapeuticky efektivní množství polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci polypeptidu definovaného podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31.

35. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31 pro léčení osteoporózy.

36. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31 pro podporu růstu kostí u savců.

37. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31 pro výrobu léčiva pro podporu růstu kostí nebo pro léčení osteoporózy.

38. Diagnostická sestava pro stanovení přítomnosti polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1až31, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku na uvedený polypeptid navázanou na reporterový systém, při čemž tento repor-

9 9 ···· ·9 9 * · · 9 · ··

9 9 9 ·« 9 99

9 9 9 9 · ·9 • 9 · · ··

99999 999·· změněné stránky reportérovy systém produkuje detegovatelnou odpověď, když se předem stanovené množství polypeptidu a protilátka spolu naváží.

39. Isolovaný DNA fragment, který kóduje expresi kteréhokoliv z polypeptidú podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31, a DNA, která se odlišuje od tohoto fragmentu díky degeneraci genetického kódu.

40. Vektor, vyznačující se tím, že obsahuje DNA sekvenci, která kóduje expresi kteréhokoliv z polypeptidú podle nároků 1 až 31.

41. Vektor, vyznačující se tím, že obsahuje heterologní DNA sekvenci, která obsahuje DNA fragment podle nároku 39.

42. Způsob výroby polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1až31, vyznačující se t í m, že zahrnuje:

a) přípravu DNA fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje uvedený polypeptid,

b) inkorporaci uvedeného DNA fragmentu do expresního vektoru, takže se získá rekombinantní DNA fragment, který obsahuje uvedený DNA fragment a je schopen podléhat replikaci,

43. Isolovaný polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 18.

φφ φφφφ ♦ · ♦ • · ··· φφ φ«φ « ·· ·· ♦ • Φ ♦ ♦ ♦ ♦ ·· * · · · ♦ · « φ φφφ · · φφφ φ · · φφφ ♦ · ·· ♦ · · změněné stránky

44. Farmaceutický prostředek pro podporu růstu kostí, vyznačující se t í m, že obsahuje terapeuticky efektivní množství polypeptidu podle nároku 43.

45. Použití polypeptidu podle nároku 43 pro léčení osteoporózy.

46. Použití polypeptidu podle nároku 43 pro podporu růstu kostí u savce.

47. Použití polypeptidu podle nároku 43 pro výrobu léčiva pro použití pro podporu růstu kostí nebo pro léčení osteoporózy.