MX2013001748A - Macrociclos peptidomimeticos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona macrociclos peptidomiméticos novedosos y los métodos para utilizar estos macrociclos para el tratamiento de una enfermedad.

Description

MACROCICLOS PEPTIDOMIMÉTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La proteína p53 del factor de transcripción humana incluye la interrupción ' del ciclo celular y la apoptosis en respuesta al daño al ADN y estrés celular, y con esto desempeña una función importante en la protección de células a partir de una transformación maligna. La ligasa de ubiquitina E3 HDM2 regula negativamente la función de p53 a través de una interacción de unión directa que neutraliza la actividad de transactivación de p53, conduce a la exportación del núcleo de la proteína p53, y dirige p53 a la degradación vía la trayectoria de ubiquitinación-proteasomal . La pérdida de la actividad de p53, ya sea mediante la supresión, mutación, o sobreexpresión de HDM2, es el defecto más común en cánceres humanos. Los tumores que expresan p53 tipo silvestre son vulnerables a agentes farmacológicos que estabilizan o aumentan la concentración de p53 activa. En este contexto, la inhibición de las actividades de HDM2 ha surgido como un procedimiento validado para restaurar la actividad de p53 y resensibilizar las células cancerosas a la apoptosis in vitro e in vivo. HDMX (HDM4) se ha identificado más recientemente como un regulador negativo similar de p53, y los estudios han revelado una homología estructural significativa entre las interfaces de unión a p53 de HDM2 y HDMX.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las intercciones proteina-proteina de p53-HDM2 y p53-HDMX se suministran mediante el dominio de transactivación alfa helicoidal del residuo 15 de p53, que se inserta en las fisuras hidrofóbicas sobre la superficie de HDM2 y HDMX. Tres residuos dentro de este dominio de p53 (F19, W23, y L26) son esenciales para la unión a HDM2 y HDMX. La presente invención proporciona macrociclos peptidomiméticos a base de p53 que modulan las actividades de p53 al inhibir las interacciones entre p53 y HDM2, p53 y HDMX , o p53 y las proteínas tanto HDM2 como HDMX, y que se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades, entre las que se incluyen de manera enunciativa, cáncer y otras enfermedades hiperproliferativas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Más adelante se describen péptidos establemente reticulados relacionados con una porción de la p53 humana ("macrociclos peptidomiméticos p53") . Estos péptidos reticulados contienen al menos dos aminoácidos modificados que forman conjuntamente una reticulación intramolecular que puede ayudar a estabilizar la estructura secundaria alfa helicoidal de una porción de p53 que se cree será importante para la unión de p53 a HDM2 y para la unión de p53 a HDMX. Por consiguiente, un polipéptido reticulado descrito en la puede tener actividad biológica mejorada con relación a un polipéptido correspondiente que no esté reticulado. Los macrociclos peptidomiméticos de p53 se cree que interfieren con la unión de p53 a HDM2 y/o de p53 a HDMX, liberando asi la p53 funcional e inhibiendo su destrucción. Los macrociclos peptidomiméticos de p53 descritos en la presente se pueden utilizar terapéuticamente, por ejemplo para tratar cánceres y otros trastornos caracterizados por un nivel indeseablemente bajo de una baja actividad de p53, y/o para tratar cánceres y otros trastornos caracterizados por un nivel indeseablemente alto de la actividad de HDM2 o HDMX. Los macrociclos peptidomimético de p53 también pueden ser útiles para el tratamiento de cualquier trastorno asociado con la regulación interrumpida de la trayectoria transcripcional de p53, conduciendo a condiciones de supervivencia y proliferación celular en exceso tales como cáncer y autoinmunidad, además de condiciones de interrupción del ciclo celular y apoptosis inadecuadas, tales como neurodegeneración e inmunodeficiencias . En algunos casos, los macrociclos peptidomiméticos p53 se unen a HDM2 (por ejemplo, No. de acceso GenBank®: 228952; GI: 228952) y/o HDMX (también denominado como HD 4; No. de acceso GenBank®: 88702791; GI:88702791) .

En un aspecto, la presente invención proporciona un macrociclo peptidomimético que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60%, 80%, 90%, o 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de la Tabla 1, 2, 3 ó 4. Alternativamente, una secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la Tabla 1. Alternativamente, una secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético se selecciona como anteriormente, y además en donde el macrociclo no incluye un tioéter o un triazol. En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende una hélice, tal como una hélice a. En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende un aminoácidos OÍ, a-disustituido . Un macrociclo peptidomimético de la invención puede comprender un reticulante que se enlaza a las posiciones a de al menos dos aminoácidos. Al menos uno de los dos aminoácidos puede ser un aminoácidos a, -disustituido .

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético tiene la fórmula: Fórmula I en donde : cada uno de A, C, D y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y los D y E terminales opcional e independientemente incluyen un grupo de remate; B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido, [-NH-L3-CO- ] , [-NH-L3-S02-] o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituido con halo-; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituidos opcionalmente con R5; L es un ligador formador de macrociclos de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno , o -R4-K-R4-]n, cada uno sustituido opcionalmente con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, . alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, , cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8. es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E, v y w son independientemente números enteros de 1- 1000; u es un número entero de 1-10; x, y y z son independientemente números enteros de 0-10; y n es un número entero de 1-5.

En diversas modalidades, el macrociclo peptidomimético incluye Li y L2 en donde Li y L2 ya sea solos o en combinación no incluyen un tioéter o un triazol.

En otras modalidades, el macrociclo peptidomimético puede comprender un reticulante que enlaza un grupo amino estructural de un primer aminoácido con un segundo aminoácido dentro del macrociclo peptidomimético. Por ejemplo, la invención proporciona macrociclos peptidomiméticos de la fórmula (IV) o (IVa) : Fórmula (IV) Fórmula (IVa) en donde: cada uno de A, C, D, y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y los D y E terminales opcional e independientemente incluyen un grupo de remate; B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituido con halo-; o parte de una estructura cíclica con un residuo E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo , sustituidos opcionalmente con R5; Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o -R4-K-R4-]n, cada uno sustituido opcionalmente con R¾; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5; v y w son independientemente números enteros de 1- 1000; u es un número entero de 1-10; x, y y z son independientemente números enteros de n es un número entero de 1-5.

Adicionalmente, la invención proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de la invención. También se proporciona un método para modular la actividad de p53 o HDM2 o HDMX en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de la invención, o un método para antagonizar la interacción entre las proteínas p53 y HDM2 y/o HDMX en un sujeto que comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las características novedosas de la invención se establecen con particularidad en las reivindicaciones anexas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención al hacer referencia a la siguiente descripción detallada que establece las modalidades ilustrativas, en las cuales se utilizan los principios de la invención, y los dibujos acompañantes de los cuales: La figura 1, describe la síntesis de Fmoc-Me-6-cloro-triptófano y Fmoc-6-cloro-triptófano .

La figura 2, muestra una traza LC-MS de Me-6-cloro- (Boc) -Triptofan-Ni-S-BPB.

La figura 3, muestra un espectro de 1H-RMN de Me-6-cloro- (Boc) -Triptofan-Ni-S-BPB.

La figura 4, muestra una traza LC-MS de Fmoc-Me-6-cloro- (Boc) triptófano.

La figura 5, muestra un espectro 1H-RMN de Fmoc-Me-6-cloro- (Boc) triptófano .

Las figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E y 6F, describen los resultados de un análisis de viabilidad celular, un análisis ELISA de competición, un análisis GRIP, los datos Kd, un análisis de activación con p21, una unión de competición con polarización de fluorescencia y los datos helicidad circular para los macrociclos peptidomiméticos ilustrativos de la invención .

Las figuras 7A, 7B, 7C y 7D, proporcionan los datos provenientes de una variedad de macrociclos.

Las figuras 8A y 8B, proporcionan los datos de una variedad de macrociclos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "macrociclo" se refiere a una molécula que tiene una estructura química que incluye un anillo o ciclo formado por al menos 9 átomos enlazados covalentemente .

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "macrociclo peptidomimético" o "polipéptido reticulado" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos unidos mediante una pluralidad de enlaces peptidicos y al menos un ligador formador de macrociclos que forma un macrociclo entre un primer residuo de aminoácidos que se presenta en la naturaleza o que no se presenta en la naturaleza (o análogo) y un segundo residuo de aminoácidos que se presenta en la naturaleza o que no se presenta en la naturaleza (o análogo) dentro de la misma molécula. El macrociclo peptidomimético incluye las modalidades, donde el ligador formador de macrociclos conecta el carbono a del primer residuo de aminoácidos (o análogo) al carbono a del segundo residuo de aminoácido (o análogo) . Los macrociclos peptidomiméticos incluyen opcionalmente uno o más enlaces no peptidicos entre uno o más residuos de aminoácidos y/o residuos de análogos aminoácidos, y opcionalmente, incluyen uno o más residuos de aminoácidos que no se presentan en la naturaleza o residuos de análogos de aminoácidos, además de cualquiera que forme el macrociclo. Un "polipéptido no reticulado correspondiente" cuando se hace referencia en el contexto de un macrociclo peptidomimético se entiende que se relaciona con un polipéptido de la misma longitud que el macrociclo y que comprende los aminoácidos naturales equivalentes de la secuencia tipo silvestre correspondientes al macrociclo.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "estabilidad" se refiere al mantenimiento de una estructura secundaria definida en solución mediante un macrociclo peptidomimético de la invención según se mide mediante dicroísmo circular, RMN u otra medición biofísica, o resistencia a la degradación proteolítica in vitro o ín vivo. Los ejemplos no limitantes de estructuras secundarias contempladas en esta invención son las hélices a, giros ß, y hojas plegadas ß.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "estabilidad helicoidal" se refiere al mantenimiento de una estructura helicoidal mediante un macrociclo peptidomimético de la invención según se mide mediante dicroísmo circular o RMN. Por ejemplo, en algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos de la invención exhiben al menos un aumento de 1.25, 1.5, 1.75 ó 2 veces en la helicidad a según se determinada mediante dicroísmo circular en comparación con un macrociclo no reticulado correspondiente .

El término "aminoácido a" o simplemente "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unido a un átomo de carbono que se designa el carbono a. Los aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, ambos de los isómeros D-y L- de los ácidos que se presentan en la naturaleza, asi como los aminoácidos que no se presentan en la naturaleza preparados mediante síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. A menos que el contexto indique específicamente lo contrario, el término aminoácido, en el sentido en el que se utiliza en la presente, pretende incluir análogos de aminoácidos .

El término "aminoácido que se presenta en la naturaleza", se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos comúnmente encontrados en péptidos sintetizados en la naturaleza, y conocido por una de abreviaturas con letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y v.

El · término "análogo de aminoácidos" o "aminoácidos no natural", se refiere a una molécula que sea estructuralmente similar a un aminoácido y que esté sustituida por un aminoácido en la formación de un macrociclo peptidomimético . Los análogos de aminoácidos incluyen, sin limitación, compuestos que sean estructuralmente idénticos a un aminoácido, según se define en la presente, excepto por la inclusión de uno o más grupos metileno adicionales entre los grupos aminó y carboxilo (por ejemplo, los ácidos amino-a carboxi-ß) , o para la sustitución del grupo amino o carboxi mediante un grupo similarmente reactivo (por ejemplo, la sustitución de la amina primaria con una amina secundaria o terciaria, o la sustitución del grupo carboxi con un éster) . Los aminoácidos no naturales incluyen las estructuras de acuerdo con las siguientes: ?? ?? $/s8 S/r8 Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar a partir de la secuencia tipo silvestre de un polipéptido sin anular o alterar sustancialmente su actividad biológica o bioquimica esencial (por ejemplo, la unión o activación del receptor) . Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera a partir de la secuencia tipo silvestre del polipéptido, da por resultado el anular u anular sustancialmente la actividad biológica o bioquimica esencial del polipéptido.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tenga una cadena lateral similar. Se han identificado en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tengan cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, K, R, H) , cadenas laterales ácidas- (por ejemplo, D, E) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, G, N, Q, S, T, Y, C ) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, A, V, L, I, P, F, M, W) , cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, T, V, I) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, Y, F, W, H) . De esta forma, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido, por ejemplo, de preferencia se reemplaza con otro residuo de aminoácidos proveniente de la misma familia de cadena lateral. Otros ejemplos de sustituciones aceptables son las sustituciones con base en consideraciones isostéricas (por ejemplo, metionina por norleucina) u otras propiedades (por ejemplo fenilalanina por 2-tienilalanina ) .

El término "grupo de remate" se refiere a la porción química que se presenta en el término ya sea carboxi o amino de la cadena polipeptídica del macrociclo peptidomimético sujeto. El grupo de remate de un término carboxi incluye un ácido carboxílico sin modificar (es decir, -COOH) o un ácido carboxílico con un sustituyente . Por ejemplo, el término carboxi puede estar sustituido con grupo amino para proporcionar una carboxamida en el término C. los diversos sustituyentes incluyen de manera enunciativa aminas primarias y secundarias, entre las que se incluyen aminas secundarias pegiladas. Los grupos de remate con amina secundaria representantivo para el término C incluyen: isopropilamida propilamida sec-butilamida butilamida isobutilamida (-NHPr) (-NHnPr) (-NHsBu) (-NHnBu) (-NHiBu) amilamida isoamilamida hexilamida 3,3dimetilbutilamida (-NHAm) (-NHiAm) (-NHHex) (-NHnBu3,3Me) ciclohexilamida 2-ciclohexiletilamida 2-ciclopentiletilamida (-NHChx) (-NHnEt2Ch) (-NHnEt2Cp) bencilamida fenetilamida 3 -fenil-1 -propilamida (-NHBn) (-???T) (-NHnPr3Ph) n-diPeg2-amida n-diPeg4-amida (-NHmdPeg2) (-NHmdPeg4) El grupo de remate de un término amino incluye una amina sin modificar (es decir, -NH2) o una amina con un sustituyente . Por ejemplo, el término amino puede estar sustituido con un grupo acilo para proporcionar una carboxamida en el término N. los diversos sustituyentes incluyen, de manera enunciativa grupos acilo sustituidos, entre los que se incluyen Ci-C6carbonilos, C7-C30carbonilos, y carbamatos pegiladas. Los grupos de remate representativos para el término N incluyen: Adamantilcarbonilo Isonicotinilo 1-naftilo (Admac) (tsoac) (Napac) H- N,N-dimetilaminoacetilo Trimetilaoetilo Hexanoilo t-tep/ (sin tapar) (Omaac) (Tmac) (Hexac) Decanoilo Palmitilo (Decae) (Pam) mdPEG7 El' término "miembro", en el sentido en el que se utiliza en la presente, junto con macrociclos o ligadores formadores de macrociclos se refiere a los átomos que forman o pueden formar el macrociclo, y excluye el sustituyente o los átomos dé cadena lateral. Por analogía, ciclodecano, 1,2- difluoro-decano y 1 , 3-dimetilciclodecano todos se consideran macrociclos de diez miembros ya que los sustituyentes de hidrógeno o flúor o las cadenas laterales de metilo no participan en la formación del macrociclo.

A' El símbolo " cuando se utiliza como parte de una estructura molecular se refiere a un enlace individual o un trans o cis doble enlace.

El término "cadena lateral de aminoácidos" se refiere a una porción unida al carbono a en un aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoácidos para alanina es metilo, la cadena lateral de aminoácido para fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de un aminoácido para cisteína es tiometilo/ la cadena lateral de aminoácido para aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoácido para tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etc. También se incluyen otras cadenas laterales de aminoácidos que no se presentan en la naturaleza, por ejemplo, aquellos que se presentan en la naturaleza (por ejemplo, un metabolito de aminoácidos) o aquellos que se producen sintéticamente (por ejemplo, un aminoácido a, a di-sustituido) .

El término ácido "amino OÍ, OÍ di-sustituido" se refiere a una molécula o porción que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unido a un átomo de carbono (el carbono a) que está unido a dos cadenas laterales de aminoácidos natural o no natural.

El término "polipéptido" abarca dos o más aminoácidos que se presentan en la naturaleza o que no se presentan en la naturaleza unidos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida) . Los polipéptidos como se describe en la presente incluyen proteínas de longitud total (por ejemplo, proteínas procesadas completamente), así como secuencias de aminoácidos más corta (por ejemplo, los fragmentos de proteínas que se presentan en la naturaleza o fragmentos de polipéptidos sintéticos) .

El término "reactivo de macrociclización" o "reactivo formador de macrociclos" en el sentido n el que se utiliza en la presente, se refiere a cualquier reactivo que se pueda utilizar para preparar un macrociclo peptidomimético de la invención al suministrar la reacción entre dos grupos reactivos. Los grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, una azida y alquileno, en cuyo caso los reactivos de macrociclización incluyen, sin limitación, reactivos Cu tales como los reactivos que proporcionan una especie reactiva Cu (I), tal como CuBr, Cul o CuOTf, así como sales de Cu (II) tales como Cu(C02CH3)2, CuS04, y CuCl2 que se pueden convertir in situ a un reactivo Cu (I) activo mediante la adición de un agente reductor tal como ácido ascórbico o ascorbato de sodio. Los reactivos de macrociclización adicionalmente pueden incluir, por ejemplo, reactivos Ru conocidos en la técnica como Cp*RuCl (PPh3) 2, [Cp*RuCl]4 u otros reactivos Ru que pueden proporcionar una especie reactiva Ru (II). En otros casos, los grupos reactivos, son olefinas terminales. En estas modalidades, los reactivos de macrociclización o reactivos formadores de macrociclo son catalizadores de metátesis entre los que se incluyen de manera enunciativa, catalizadores del complejo, carbeno con metal transición estabilizado tardío tales como los catalizadores de carbeno con metal de transición grupo VIII. Por ejemplo, estos catalizadores son centros metálicos Ru y Os que tienen un estado de oxidación +2, un conteo de electrones de 16 y pentacoordinados . Los catalizadores adicionales se describen en Grubbs et al., "Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452, y la patente de los Estados Unidos No. 5,811,515. Todavía en otros casos, los grupos reactivos son grupos tiol. En estas modalidades, el reactivo de macrociclización es, por ejemplo, un ligador de grupo funcional con grupos reactivos tiol tales como grupos halógeno.

El término "halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo o un radical de los mismos.

El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena recta o una cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C1-C10 indica que el grupo tiene de 1 a 10 (inclusive) átomos de carbono en el mismo. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquilo" es una cadena (recta o ramificado) que tiene de 1 a 20 (inclusive) átomos de carbono en la misma.

El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir, -R-).

El término "alquenilo", se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena recta o una cadena ramificada que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. La porción alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo tiene de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono en el mismo. El término "alquenilo inferior", se refiere a una cadena de C2-C6 alquenilo. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquenilo", es una cadena (lineal o ramificada) que tiene 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono en la misma.

El término "alquinilo", se refiere a una cadena de hidrocarburo que es una cadena recta o una cadena ramificada que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. La porción alquinilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-Ci0 indica que el grupo tiene de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono en el mismo. El término "alquinilo inferior" se refiere a una cadena de C2-Cealquinilo. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquinilo" es una cadena (lineal o ramificado) que tiene de 2 a 20 (inclusive) átomos de carbono en el mismo.

El término "arilo", se refiere a un sistema de anillos aromáticos monociclicos de 6 átomos de carbonos o biciclicos de 10 átomos de carbono en donde 0, 1, 2, 3 ó 4 átomos de cada anillo están sustituidos mediante un sustituyente . Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y lo semejante. El término "arilalquilo" o el término "aralquilo" se refiere a alquilo sustituido con un arilo. El término "arilalcoxi" se refiere a alcoxi sustituido con arilo.

"Arilalquilo", se refiere a un grupo arilo, según se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado con un grupo Ci-C5alquilo, según se definió anteriormente. Los ejemplos representativos de un grupo arilalquilo incluyen, de manera enunciativa, 2-metilfenilo, 3-metilfenilo, 4-metilfenilo, 2-etilfenilo, 3-etilfenilo, 4-etilfenilo, 2-propilfenilo, 3-propilfenilo, 4-propilfenilo, 2-butilfenilo, 3-butilfenilo, 4-butilfenilo, 2-pentilfenilo, 3-pentilfenilo, 4-pentilfenilo, 2-isopropilfenilo, 3-isopropilfenilo, 4- isopropilfenilo, 2-isobutilfenil, 3-isobutilfenilo, 4- isobutilfenilo, 2-sec-butilfenilo, 3-sec-butilfenilo, 4-sec-butilfenilo, 2-t-butilfenilo, 3-t-butilfenilo y 4-t-butilfenilo.

El "arilamido" se refiere a un grupo arilo, según se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo arilo se ha reemplazado con uno o más grupos-C (0) H2. Los ejemplos representativos de un grupo arilamido incluyen 2-C (O) NH2-fenilo, 3-C (0) NH2-fenilo, 4-C (0)NH2-fenilo, 2-C (0) NH2-piridilo, 3-C (0) H2-piridilo y 4-C (0) H2-piridilo.

"Heterociclo de alguilo" se refiere a un grupo Ci ~ Csalquilo, según se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo d-C5alquilo se ha reemplazado con un heterociclo. Los ejemplos representativos de un grupo heterociclo de alquilo incluyen, de manera enunciativa, -CH2CH2-morfolina, -CH2CH2-piperidina, -CH2CH2CH2-morfolina, y-CH2CH2CH2-imidazol .

"Alquilamido" se refiere a un grupo C3-C5 alquilo, según se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo C1-C5 alquilo se ha reemplazado con un grupo -C(0)NH2. Los ejemplos representativos de un grupo alquilamido incluyen, de manera enunciativa, -CH2-C (0) H2, -CH2CH2-C (0)NH2, -CH2CH2CH2C (0)NH2, -CH2CH2CH2CH2C (0)NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2C (0) NH2, -CH2CH (C (0) NH2) CH3, -CH2CH(C(0)NH2)CH2CH3, -CH (C (0) NH2) CH2CH3, -C (CH3) 2CH2C (0) NH2, -CH2-CH2-NH-C (O) -CH3, -CH2-CH2-NH-C (O) -CH3-CH3 y -CH2-CH2-NH-C ( 0 ) -CH=CH2.

"Alcanol" se refiere a un grupo Ci-C5alquilo, según se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo C1-C5 alquilo se ha reemplazado con un grupo hidroxilo. Los ejemplos representativos de un grupo alcanol incluyen, de manera enunciativa, -CH20H , -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, ' -CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH (OH) CH3, -CH2CH (OH) CH2CH3, -CH( 0H)CH3 y -C (CH3) 2CH2OH.

"Alquilcarboxi" se refiere a un grupo Ci-Csalquilo, según se definió anteriormente, en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo Ci-C5alquilo se ha reemplazado con un grupo-COOH. Los ejemplos representativos de un grupo alquilcarboxi incluyen, de manera enunciativa, -CH2C00H , -CH2CH2CO0H , -CH2CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2CH2COOH , -CH2CH( C00H)CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH ( C00H ) CH2CH3, -CH (COOH) CH2CH3 y -C(CH3)2CH2COOH.

El término "cicloalquilo", según se emplea en la presente, incluye grupos hidrocarburo cíclicos saturados y parcialmente ' insaturados que tienen de 3 hasta 12 átomos, de preferentemente 3 hasta 8 átomos, y de mayor preferencia de 3 hasta 6 átomos, en donde el grupo cicloalquilo adicionalmente está sustituido opcionalmente . Algunos grupos cicloalquilo incluyen, sin limitación, 4 ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo . y ciclooctilo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos monociclicos de 5-8 miembros, biciclicos de 8-12 miembros, o triciclicos de 11-14 que tiene 1-3 heteroátomos¦ si son monociclicos, 1-6 heteroátomos si son biciclicos o 1-9 heteroátomos si son triciclico, los heteroátomos se seleccionan de 0, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 ó 1-9 heteroátomos de 0, N o S si son monociclicos/ biciclicos o triciclicos, respectivamente) , en donde 0, 1, 2, 3 ó 4 átomos de cada anillo están sustituidos mediante un sustituyente . Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo y lo semejante.

El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo.' El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillos no aromáticos monociclicos de 5-8 miembros, biciclicos de 8-12 miembros, o triciclicos de 11-14 que tienen 1-3 heteroátomos si son monociclicos, 1-6 heteroátomos si son biciclicos o 1-9 heteroátomos si son triciclicos, los heteroátomos se seleccionan de 0, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 ó 1-9 heteroátomos de 0, N o S si son monociclicos, biciclicos o triciclicos, respectivamente) , en donde 0, 1, 2 ó 3 átomos de cada anillo están sustituidos mediante un sustituyente . Los ejemplos de grupos heterociclilo incluyen piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo y lo semejante.

El término "sustituyente" se refiere a un grupo que reemplaza un segundo átomo o un grupo tal como un átomo de hidrógeno en cualquier molécula, compuesto o porción. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, grupos halo, hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alcoxicarbonilo, amido, carboxilo, alcansulfonilo, alquilcarbonilo, y ciano.

En algunas modalidades, los compuestos de esta invención contienen uno o más centros asimétricos y de esta forma se presentan como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros únicos, diastómeros individuales y mezclas diastoméricas . Todas estas formas isómeras de estos compuestos se incluyen en la presente invención a menos que se proporcione expresamente de otra manera. En algunas modalidades, los compuestos de esta invención también están representados en múltiples formas tautoméricas, en estos casos, la invención incluye todas las formas tautoméricas de los compuestos descritos en la presente (por ejemplo, si la alquilación de un sistema de anillos da por resultado en la alquilación en múltiples sitios, la invención incluye todos estos productos de reacción) . Todas estas formas isoméricas de estos compuestos se incluyen en la presente invención a menos que se proporcione expresamente de otra manera. Todas las formas cristalinas de los compuestos descritos en la presente se incluyen en la presente invención a menos que se proporcione expresamente otra cosa.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "aumentar" y "disminuir" significan, respectivamente, provocar un aumento o disminución estadísticamente significativas (es decir, p <0.1) de al menos el 5%.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, la mención de una variación numérica para una variable se pretende que exprese que la invención se puede practicar con la variable igual a cualquiera de los valores dentro de esa variación. De esta forma, para una variable que sea inherentemente discreta, la variable es igual a cualquier valor entero dentro de la variación numérica, incluyendo los puntos finales de la variación. Similarmente, para una variable que sea inherentemente continua, la variable es igual a cualquier valor real dentro de la variación numérica, incluyendo los puntos finales. Como ejemplo, y sin limitación, una variable que se describa que tiene valores entre 0 y 2 toma los valores 0, 1 ó 2 si la variable es inherentemente discreta, y toma los valores 0.0, 0.1, 0.01, 0.001, o cualesquiera otro valores reales >0 y <2 si la variable es inherentemente continua.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, a menos que se indique específicamente de otra manera, la palabra "o" se utiliza en el sentido inclusivo de "y/o" y no en el sentido exclusivo de "cualquiera/o".

El término "en promedio" representa el valor medio derivado de realizar al menos tres replicados independientes para cada punto de datos.

El término "actividad biológica" abarca las propiedades estructurales y funcionales de un macrociclo de la invención. La actividad biológica, por ejemplo, es una estabilidad estructural, helicidad-alfa, afinidad por un blanco, resistencia a la degradación proteolítica, penetrabilidad celular, estabilidad intracelular , estabilidad in vivo, o cualquier combinación de los mismos.

Los detalles de una o más modalidades particulares de la invención se establecen en los dibujos anexos y la descripción más adelante. Otras características, objetivos y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones .

En algunas modalidades, las secuencias peptídicas se derivan de la proteína p53.

Una lista ilustrativa no limitante de los péptidos p53 adecuados para utilizarse en la presente invención se proporciona más adelante.

TABLA 1 TABLA 2 TABLA 3 En la Tabla 3 y en otro sitio, "Aib" representa un residuo de ácido 2-aminoisobutirico, mientras que "Ac3c" representa un residuo de ácido aminociclopropancarboxílico .

Macrociclos peptidomiméticos En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético de la invención tiene la fórmula (I) : Fórmula I en donde : cada uno de A, C, D, y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y los D y E terminales opcional e independientemente incluyen un grupo de remate; B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] o [-NH-L3-] ; Ri y f son independientemente -H, alguilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo , heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituido con halo-; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituidos opcionalmente con R5; L es un ligador formador de macrociclos de la fórmula -Li-L2-; Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o -R4-K-R4-]n, cada uno sustituido opcionalmente con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o CONR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo , heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; Rs es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, ' cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo E, v y w son independientemente números enteros de 1- 1000; u es un número entero de 1-10; x, y y z son independientemente números enteros de 0-10; y n es un número entero de 1-5.

En una modalidades, Li y L2 ya sea solos o en combinación no forman un triazol o un tioéter.

En un ejemplo, al menos uno de Ri y R2 es alquilo, sin sustituir o sustituido con halo-. En otro ejemplo, tanto Ri como R2 son independientemente alquilo, sin sustituir o sustituido con halo-. En algunas modalidades, al menos uno de Ri y R2 es metilo. En otras modalidades, Ri y R2 son metilo.

En algunas modalidades de la invención, x + y + z es al menos 3. En otras modalidades de la invención, x + y + z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Se selecciona independientemente cada caso de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor de macrociclos. Por ejemplo, una secuencia representada por la fórmula [A]x, cuando x es 3, abarca las modalidades donde los aminoácidos no son idénticos, por ejemplo, Gln-Asp-Ala, asi como las modalidades donde los aminoácidos son idénticos, por ejemplo, Gln-Gln-Gln. Esto se. aplica para cualquier valor de x, y o z, en las variaciones indicadas. Similarmente, cuando u es mayor que 1, cada compuesto de la invención puede abarcar los macrociclos peptidomiméticos que sean iguales o diferentes. Por ejemplo, un compuesto.de la invención puede comprender los macrociclos peptidomimético que comprenden diferentes longitudes ligadores o composiciones químicas.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético de la invención comprende una estructura secundaria que es hélice a y R8 es -H, permitiendo la unión de hidrógeno intra-helicoidal . En algunas modalidades, al menos uno de A, B, C, D o E es un aminoácido a, -disustituido . En un ejemplo, B es un aminoácido a, -disustituido . Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutírico . En otras modalidades, al menos uno En otras modalidades, la longitud del ligador L formador de macrociclos según se mide a partir de un primer Ccc a un segundo Ccc se selecciona para estabilizar una estructura péptido secundaria deseada, tal como una hélice a formada por los residuos del macrociclo peptidomimético incluyendo, aunque no necesariamente limitado a, aquellos entre el primer Ca a un segundo Ca.

En una modalidad, el macrociclo peptidomimético de la fórmula (I) es: en donde cada Ri y R2 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sustituido o sustituido con halo-.

En modalidades relacionadas, macrociclo peptidomimético de la fórmula (I) es: En otra modalidad, el macrociclo peptidomimético de la fórmula (I) es un compuesto de cualquiera de las fórmulas mostradas enseguida: 42 en donde "AA" representa cualquier cadena lineal de aminoácidos naturales o no naturales es [D]v, [E]w como se definió anteriormente, y n es un número entero entre 0 y 20, 50, 100, 200, 300, 400 ó 500. En algunas modalidades, n es 0. En otras modalidades, n es menor que 50.

Las modalidades ilustrativas del ligador L formador de macrociclos se muestran más adelante. , o NH 0 donde X, Y =-CH2-, O, S, o NH, donde X, Y =-CH2-, O, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o = 0-10 R = H, alquilo, otro sustituyente En otras modalidades, D y/o E en el compuesto de la fórmula I están modificados adicionalmente para facilitar la absorción celular. En algunas modalidades, la lipidación o PEGilación de un macrociclo peptidomimético facilita la absorción celular, aumenta la biodisponibilidad, aumenta la circulación en sangre, altera la farmacocinética, disminuye la inmunogenicidad y/o disminuye la frecuencia necesaria de administración.

En otras modalidades, al menos uno de [D] y [E] en el compuesto de la fórmula I representa una porción que comprende un ligador adicional formador de macrociclos de tal forma que el macrociclo peptidomimético comprenda al menos dos ligadores formadores de macrociclos. En una modalidad específica, un macrociclo peptidomimético comprende dos ligadores formadores de macrociclos. En una modalidad, u es 2.

En los macrociclos peptidomiméticos de la invención, cualquiera de los ligadores formadores de macrociclos descritos en la presente se puede utilizar en cualquier combinación con cualquiera de las secuencias mostradas en las Tablas 1-4 y también con cualquiera de los sustituyentes R indicados en la presente.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético comprende al menos un motivo con hélice a. Por ejemplo, A, B y/o C en el compuesto de la fórmula I incluyen una o más hélices a. Como una cuestión general, las hélices a incluyen entre 3 y 4 residuos de aminoácidos por giro. En algunas modalidades, la hélice del macrociclo peptidomimético incluye 1 a 5 giros y, por lo tanto, de 3 hasta 20 residuos de aminoácidos. En modalidades específicas, la hélice a incluye 1 giro, 2 giros, 3 giros, 4 giros, 5 giros. En algunas modalidades, el ligador formador de macrociclos estabiliza un motivo con hélice incluido dentro del macrociclo peptidomimético . De esta forma, en algunas modalidades, la longitud del ligador formador de macrociclos L a partir de un primer Ca a un segundo Ca se selecciona para aumentar la estabilidad de una hélice a. En algunas modalidades, . el ligador formador de macrociclos gira de 1 vuelta hasta 5 vueltas de la hélice a. En algunas modalidades, el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 1 vuelta, 2 vueltas, 3 vueltas, 4 vueltas, o 5 vueltas de' la hélice a. En algunas modalidades, la longitud del ligador formador de macrociclo es de aproximadamente 5 Á hasta 9 Á por vuelta de la hélice a, o aproximadamente 6 Á hasta 8 Á por vuelta de la hélice a. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 5 enlaces carbono-carbono hasta 13 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 7 enlaces carbono-carbono hasta 11 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 9 enlaces carbono-carbono. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 2 vueltas de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 8 enlaces carbono-carbono hasta 16 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 10 enlaces carbono-carbono hasta 14 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 12 enlaces carbono-carbono. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 3 veces de una hélice , la longitud es igual a aproximadamente 14 enlaces carbono-carbono hasta 22 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 16 enlaces carbono-carbono hasta 20 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 18 enlaces carbono-carbono. Cuando el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 4 vueltas de una hélice , la longitud es igual a aproximadamente 20 enlaces carbono-carbono hasta 28 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 22 enlaces carbono-carbono hasta 26 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 24 enlaces carbono-carbono. Cuando el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 5 vueltas de una hélice a, la longitud es igual a aproximadamente 26 enlaces carbono-carbono hasta 34 enlaces carbono-carbono, aproximadamente 28 enlaces carbono-carbono hasta 32 enlaces carbono-carbono, o aproximadamente 30 enlaces carbono-carbono. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta de una hélice a, el ligador formador contiene aproximadamente 4 átomos hasta 12 átomos, de aproximadamente 6 hasta 10 átomos, o aproximadamente 8 átomos. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 2 vueltas de la hélice a, la ligadura contiene aproximadamente 7 átomos hasta 15 átomos, aproximadamente 9 átomos hasta 13 átomos, o aproximadamente 11 átomos. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 3 vueltas de la hélice a, la ligadura contiene aproximadamente 13 átomos hasta 21 átomos, aproximadamente 15 átomos hasta 19 átomos, o aproximadamente 17 átomos. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 4 vueltas de la hélice a, la unión contiene aproximadamente 19 átomos hasta 27 átomos, de aproximadamente 21 átomos hasta 25 átomos, o aproximadamente 23 átomos. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 5 vueltas de la hélice a, la ligadura contiene aproximadamente 25 átomos hasta 33 átomos, de aproximadamente 27 átomos hasta 31 átomos, o aproximadamente 29 átomos. Cuando el ligador formador de macrociclo gira aproximadamente 1 vuelta de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 17 miembros hasta 25 miembros, aproximadamente 19 miembros hasta 23 miembros, o aproximadamente 21 miembros. Cuando el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 2 vueltas de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 29 miembros hasta 37 miembros, aproximadamente 31 miembros hasta 35 miembros, o aproximadamente 33 miembros. Cuando el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 3 vueltas de la hélice a, el macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 44 miembros hasta 52 miembros, aproximadamente 46 miembros hasta 50 miembros, o aproximadamente 48 miembros. Cuando el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 4 vueltas de la hélice a, macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 59 miembros hasta 67 miembros, aproximadamente 61 miembros hasta 65 miembros, o aproximadamente 63 miembros. Cuando el ligador formador de macrociclos gira aproximadamente 5 vueltas de la hélice a, macrociclo resultante forma un anillo que contiene aproximadamente 74 miembros hasta 82 miembros, aproximadamente 76 miembros hasta 80 miembros o aproximadamente 78 miembros.

En otra modalidad, la invención proporciona macrociclos peptidomiméticos de la fórmula (IV) o (IVa) : (fórmula IV) (fórmula IVa) en donde : cada uno de A, C, D, y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y los D y E terminales opcional e independientemente incluyen un grupo de remate; B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-SO2-] o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituido con halo-; o parte de una estructura cíclica con un residuo E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, ¦ heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituidos opcionalmente con R5; L es un ligador formador de macrociclos de la fórmula -Li~L2-; Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o -R4-K-R4-]n, cada uno sustituido opcionalmente con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es O, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -S02R6, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5; v y w son independientemente números enteros de 1- 1000; u es un número entero de 1-10; x, y y z son independientemente números enteros de 0-10; y n es un número entero de 1-5.

En un ejemplo, Li y L2 ya sea solos o en combinación, no forman un triasol o un tioéter.

En un ejemplo, al menos uno de Ri y R2 es alquilo, sin sustituir o sustituido con halo-. En otro ejemplo, tanto Ri como R2 son independientemente alquilo, sin sustituir o sustituido con halo-. En algunas modalidades, al menos uno de Ri y R2 es metilo. En otras modalidades, Ri y R2 son metilo.

En algunas modalidades de la invención, x + y + z es al menos 1. En otras modalidades de la invención, x + y + z es al menos 2. En otras modalidades de la invención, x + y + z es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Se selecciona independientemente cada caso de A, B, C, D o E en un macrociclo o precursor de macrociclos de la invención. Por ejemplo, una secuencia representada por la fórmula [A]x, cuando x es 3, abarca las modalidades donde los aminoácidos no son idénticos, por ejemplo, Gln-Asp-Ala, asi como las modalidades donde los aminoácidos son idénticos, por ejemplo, Gln-Gln-Gln. Esto se aplica para cualquier valor de x, y o z, en las variaciones indicadas.

En algunas modalidades, el macrociclo peptidomimético de la invención comprende una estructura secundaria que es hélice a y Rs es -H, permitiendo la unión de hidrógeno intra-helicoidal . En algunas modalidades, al menos uno de A, B, C, D o E es un aminoácido , a- disustituido . En un ejemplo, B es un aminoácido , - disustituido . Por ejemplo, al menos uno de A, B, C, D o E es ácido 2-aminoisobutirico . En otras modalidades, al menos uno En otras modalidades, la longitud del ligador L formador de macrociclos según se mide a partir de un primer Ca a un segundo Ca se selecciona para estabilizar una estructura péptidica secundaria deseada, tal como una hélice a formada por los residuos del macrociclo peptidomimético incluyendo, aunque no necesariamente limitado a, aquellos entre el primer Ca a un segundo Ca.

Las modalidades ilustrativas del ligador -L1-L2- formador de macrociclos se muestran enseguida. donde X, Y =-CH2-, O, S, o H, donde X, Y =-CH2-, 0, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o, p = 0-10 donde X, Y =-CH2-, O, S, o NH, donde X, Y =-CH2-, 0, S, o NH m, n, o, p = 0-10 m, n, o = 0-10 R = H, alquilo, otro sustituyente Preparación de macrociclos peptidomimeticos Los macrociclos peptidomiméticos de la invención se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cualquiera de los residuos indicados por "X" en las Tablas 1, 2, 3 ó 4 puede estar sustituido con un residuo capaz de formar un reticulante con un segundo residuo en la misma molécula o un precursor de este residuo.

Se conocen en la técnica diversos métodos para llevar a cabo la formación de macrociclos peptidomiméticos. Por ejemplo, la preparación de los macrociclos peptidomiméticos de la Fórmula I se describe en Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892(2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004); patente de los Estados Unidos No. 7,192,713 y solicitud PCT WO 2008/121767. Los aminoácidos , a-disustituidos y los precursores de aminoácidos descritos en las referencias citadas se pueden emplear en la síntesis de los polipéptidos del precursor de macrociclos peptidomiméticos. Por ejemplo, el "aminoácido S5-olefina" es (S) -a- (2' -pentenil) alanina y el "aminoácido R8-olefina" es (R) -a- (2' -octenil) alanina . Después de la incorporación de estos aminoácidos en los polipéptidos precursores, las definas terminales se hacen reaccionar con un catalizador de metátesis, conduciendo a la formación del macrociclo peptidomimético . En diversas modalidades, se pueden emplear los siguientes aminoácidos en la síntesis del macrociclo peptidomimético : En otras modalidades, los macrociclos peptidomiméticos de la invención son de las fórmulas IV o IVa. Los métodos para la preparación de estos macrociclos se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 7,202,332.

Los métodos adicionales para formar macrociclos peptidomiméticos se prevén como adecuados para realizar la presente invención incluyen aquellos descritos por ustapa, . Firouz Mohd et al., J. Org. Chem (2003), 68, pp. 8193- 8198; Yang, Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pp. 1403-1406; patente de los Estados Unidos No. 5,364,851; patente de los Estados Unidos No. 5,446,128; patente de los Estados Unidos No. 5,824,483; patente de los Estados Unidos No. 6,713,280; y patente de los Estados Unidos No. 7,202,332. En estas modalidades, se utilizan precursores de aminoácidos que contienen un sustituyente R-adicional en la posición alfa. Estos aminoácidos se incorporan en el precursor de macrociclos en las posiciones deseadas, que pueden estar en las posiciones donde está sustituido el reticulante o, alternativamente, en otro sito en la secuencia del precursor de macrociclo. La ciclación del precursor luego se lleva a cabo de acuerdo con el método indicado.

Análisis Las propiedades de los macrociclos peptidomiméticos de la invención se analizan, por ejemplo, al utilizar los métodos descritos más adelante. En algunas modalidades, un macrociclo peptidomimético de la invención tiene propiedades biológicas mejoradas con relación a un polipéptido correspondiente que carece de los sustituyentes descritos en la presente.

Análisis para determinar la helicidad- En solución, la estructura secundaria de los polipéptidos con dominios a-helicoidales alcanzará un equilibrio dinámico entre estructuras espirales aleatorias y estructuras a-helicoidales, con frecuencia expresadas como una "helicidad porcentual". De esta forma, por ejemplo, los dominios alfa-helicoidales son predominantemente espirales aleatorios en solución, con el contenido a-helicoidal usualmente por debajo del 25%. Los macrociclos peptidomiméticos con ligadores optimizados, por otro lado, poseen, por ejemplo, una alfa-helicidad que es al menos dos veces mayor que la de un polipéptido no reticulado correspondiente. En algunas modalidades, los macrociclos de la invención poseerán una alfa-helicidad mayor que el 50%. Para analizar la helicidad de los macrociclos peptidomiméticos de la invención, los compuestos se disuelven en una solución acuosa (por ejemplo, una solución 50 mM de fosfato de potasio a pH 7, en H20 destilada, a concentraciones de 25-50 µ?) . Los espectros de dicroismo circular (CD) se obtienen en un espectropolarimetro (por ejemplo, Jasco J-710) utilizando parámetros de medición estándar (por ejemplo, temperatura 20 °C; longitud de onda 190-260 nm; resolución escalonada 0.5 nm; velocidad 20 nm/seg; acumulaciones 10; respuestal seg; ancho de banda 1 nm, longitud de trayectoria 0.1 cm) . El contenido OÍ-helicoidal de cada péptido se calcula al dividir la elipticidad residual media (por ejemplo, [0]222obs) entre el valor reportado para un decapéptido helicoidal modelo (Yang et al. (1986), Methods Enzymol. 130:208)).

Análisis para determinar la temperatura de fusión (Tm) Un macrociclo peptidomimético de la invención que comprende una estructura secundaria tal como una hélice exhibe, por ejemplo, una mayor temperatura de fusión que un polipéptido no reticulado correspondiente. Típicamente los macrociclos peptidomiméticos de la invención exhiben una Tm de >60°C lo que representa una estructura bastante estable en soluciones acuosas. Para analizar el efecto de la formación de macrociclos sobre la temperatura de fusión, los macrociclos peptidomiméticos o los péptidos sin modificar se disuelven en H20 destilada (por ejemplo, a una concentración final de 50 µ?) y la Tm se determina al medir el cambio en la elipticidad sobre una variación de temperatura (por ejemplo, 4 hasta 95°C) en un espectropolarímetro (por ejemplo, Jasco J-710) utilizando parámetros estándar (por ejemplo, longitud de onda 222 nm; resolución escalonada 0.5 nm; velocidad 20 nm/seg; acumulaciones 10; respuesta 1 seg; ancho de banda 1 nm; aumento de índice de la temperatura: l°C/min; longitud de trayectoria 0.1 cm) .

Análisis de resistencia a proteasa El enlace amida de la estructura peptídica es susceptible a hidrólisis mediante proteasas, haciendo con esto que los compuestos peptidicos sean vulnerables a una degradación rápida in vivo. La formación de hélices peptidicas, sin embargo, típicamente enmascara la estructura amida y por lo tanto puede protegerla de la segmentación proteolítica . Los macrociclos peptidomiméticos de la presente invención se pueden someter a proteolisis con tripsina in vitro para evaluar cualquier cambio en la velocidad de degradación en comparación con un polipéptido no reticulado correspondiente. Por ejemplo, el macrociclo peptidomimético y un polipéptido no reticulado correspondiente se incuban con tripsina agarosa y las reacciones se inactivan en diversos puntos de tiempo mediante centrifugación y posteriormente con inyección en HPLC para cuantificar el sustrato residual mediante absorción ultravioleta a 280 nm. En resumen, el macrociclo peptidomimético y el precursor peptidomimético (5 meg) se incuban con tripsina agarosa (Pierce) (S/E ~125) durante 0, 10, 20, 90, y 180 minutos. Las reacciones se inactivan mediante centrifugación en mesa a alta velocidad; el sustrato restante en el sobrenadante aislado se cuantifica mediante detección de picos a base de HPLC a 280 nm. La reacción proteolítica exhibe cinética del primer orden y la velocidad constante, k, se determina a partir de un gráfica de ln[S] contra tiempo (k =-lXslope) .

Análisis de estabilidad Ex Vivo Los macrociclos peptidomiraéticos con ligadores optimizados poseen, por ejemplo, una vida media ex vivo que es al menos dos veces mayor que la de un polipéptido no reticulado correspondiente, y poseen una vida media ex vivo de 12 horas o más. Para los estudios de estabilidad en suero ex vivo, se pueden utilizar una variedad de análisis. Por ejemplo, un . macrociclo peptidomimético y un polipéptido no reticulado correspondiente (2 meg) se incuban con suero de ratón, rata y/o humano recién preparado (2 mi) a 37°C durante 0, 1, 2, 4, 8 y 24 horas. Para determinar el nivel de compuesto intacto, se puede utilizar el siguiente procedimiento: Las muestras se extraen al transferir 100 µ? de sueros a tubos para centrifugación de 2 mi seguido por la adición de 10 µL de ácido fórmico al 50% y 500 µ? de acetonitrilo¦ y centrifugación a 14,000 rpm durante 10 min a 4±2°C. El sobrenadante luego se transfiere a tubos de 2 mi y se evaporaron en TurboVap bajo N2 < 0.703 kg/cm2 (10 psi) , 37°C. Las muestras se reconstituyeron en 100 µ? de 50:50 acetonitrilo : agua y se someten a análisis LC- S/MS.

Análisis de unión in vitro Para evaluar la unión y afinidad de los macrociclos peptidomiméticos y los precursores peptidomiméticos para proteínas aceptoras, se utiliza un análisis de polarización por fluorescencia (FPA) . La técnica FPA mide la orientación molecular y movilidad utilizando luz polarizada y un indicador fluorescente. Cuando se excitan con luz polarizada, los indicadores fluorescentes (por ejemplo, FITC) unidos a las moléculas con altos pesos moleculares evidentes (por ejemplo, los péptidos marcados con FITC unidos a una proteína mayor) emiten mayores niveles de fluorescencia polarizada debido a sus velocidades de rotación más lentas en comparación con los indicadores fluorescentes unidos a moléculas más pequeñas (por ejemplo, los péptidos marcados con FITC que están libres en solución) .

Por ejemplo, los macrociclos peptidomiméticos tratados con fluorescencia (25 nM) se incuban con la proteína aceptora (25-1000 nM) en tampón de unión (NaCl 140 mM, Tris-HC1 50 mM, pH 7.4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de unión se mide, por ejemplo, mediante polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia (por ejemplo, Perkin-Elmer LS50B) . Los valores Kd se pueden determinar mediante análisis de regresión no lineal utilizando, por ejemplo, el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . Un macrociclo peptidomimético de la invención muestra, en algunos casos, similar o menor Kd que un polipéptido no reticulado correspondiente .

Análisis de desplazamiento in vi tro para caracterizar los antagonistas de las interacciones péptido-proteina Para valorar la unión y afinidad de los compuestos que antagonizan la interacción entre un péptido y una proteina aceptora, se utiliza, por ejemplo, un análisis de polarización por fluorescencia (FPA) utilizando un macrociclo peptidomimético tratado con fluoresceina derivado de una secuencia de precursores peptidomiméticos . La técnica FPA mide la orientación y movilidad molecular utilizando luz polarizada y un indicador fluorescente. Cuando se excitan con luz polarizada, los indicadores fluorescentes (por ejemplo, FITC) unidos a moléculas con altos pesos moleculares evidentes (por ejemplo, los péptidos marcados con FITC unidos a una proteína mayor) emiten mayores niveles de fluorescencia polarizada debido a sus velocidades de rotación menores en comparación con los indicadores fluorescentes unidos a moléculas más pequeñas (por ejemplo, los péptidos marcados con FITC que están libres en solución) . Un compuesto que antagoniza la interacción entre el macrociclo peptidomimético tratado fluoresceina y una proteína aceptora se detectarán en un experimento FPA de unión competitiva.

Por ejemplo, los compuestos antagonistas putativos (1 nM hasta 1 mM) y un macrociclo peptidomimético tratado con fluoresceina (25 nM) se incuban con la proteina aceptora (50 nM) en tampón de unión (NaCl 140 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7.4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de unión al antagonista se mide, por ejemplo, mediante polarización de fluorescencia en un espectrofotómetro de luminiscencia (por ejemplo, Perkin-Elmer LS50B) . Los valores Kd se pueden determinar mediante análisis de regresión no lineal utilizando, por ejemplo, el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) .

Cualquier clase de molécula, tal como las pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, oligonucleótidos o proteínas se pueden examinar como antagonistas putativos en este análisis.

Análisis para la unión de proteína-ligando mediante espectrometría de masas por selección de afinidad Para evaluar la unión y afinidad de los compuestos de prueba para proteínas, se utiliza, por ejemplo, un análisis de espectrometría de masas por selección de afinidad. Los experimentos de unión de proteína-ligando se conducen de acuerdo con el siguiente procedimiento representativo señalado para un experimento control de sistema amplio utilizando un macrociclo peptidomimético 1 µ? más h DM2 5 µ?. Un 1 de alícuota de DMSO de una solución madre 40 µ del macrociclo peptidomimético se disuelve en 19 pL de PBS (solución salina amortiguada con fosfato: 50 mM, pH 7.5 el tampón de fosfato contiene NaCl 150 mM) . La solución resultante se mezcla mediante pipeteo repetido y se clarifica mediante centrifugación a 10 000 g durante 10 min. A una alícuota de 4 L del sobrenadante resultante se agregan 4 µL de hMDM2 10 µ?e? PBS. Cada 8.0 µ]_, de la muestra experimental, de esta forma contiene 40 pmol (1.5 g) de proteína a unas concentración de 5.0 µ? en PBS más el macrociclo peptidomimético 1 µ? y 2.5% de DMSO. Las muestras duplicadas y preparadas para cada punto de concentración se incuban durante 60 min a temperatura ambiente, y luego se congelan a 4°C antes del análisis LC-MS de cromatografía por exclusión por tamaño de inyecciones de 5.0 L. Las muestras que contienen una proteína blanco, los complejos de proteína- ligando, y los compuestos sueltos se inyecta en una columna SEC, donde los complejos se separan del componente sin unir mediante un paso rápido SEC. El eluido de la columna SEC se supervisa utilizando detectores de UV para confirmar que la fracción de proteína de la primea elución, que se eluye en el volumen desocupado de la columna SEC, queda bastante reducida de los componentes sueltos que se conservan en la columna. Después, el pico que contiene la proteína y los complejos de proteina-ligandos se eluye del detector de UV primario, ingresa un ciclo de muestra donde se retira de la corriente de flujo de la etapa SEC y se transfiere directamente a la LC-MS vía un mecanismo de válvula. El ión (M + 3H)3+ del macrociclo peptidomimético se observa mediante ESI- S al m/z esperado, confirmando la detección del complejo de proteína-ligando .

Análisis para los experimentos de titulación de Kd de proteína-ligando Para evaluar la unión y afinidad de los compuestos de análisis para proteínas, se realizó, por ejemplo, un experimento de titulación Kd de proteína-ligando. Los experimentos de titulaciones Kd de proteína-ligando se conducen como sigue: 2 pL de alícuotas de DMSO de una solución madre diluida en serie de macrociclo peptidomimético titulante (5, 2.5, 0.098 mM) se preparan, luego se disuelven en 38 L de PBS. Las soluciones resultantes se mezclan mediante pipeteo repetido y se clarifican mediante centrifugación a 10 000 g durante 10 min. Para 4.0 L alícuotas de los sobrenadantes resultantes, se agregan 4.0 \ih de hMDM2 10 µ? en PBS. Cada 8.0 \i de muestra experimental de esta forma, contiene 40 pmol (1.5 pg) de proteína a una concentración 5.0 µ? en PBS, concentraciones variables (125, 62.5, 0.24 µ?) del péptido titulante, y DMSO al 2.5%. Las muestras por duplicado asi preparadas para cada punto de concentración se incuban a temperatura ambiente durante 30 min, luego se congelan a 4°C antes del análisis SEC-LC-MS de inyecciones de 2.0 uL. El ión (M + H)+1, (M + 2H)2+, (M + 3H)3+, y/o . (M + Na)1+ se observa mediante ESI-MS; los cromatogramas de iones extraídos se cuantifican, luego, se ajustan a las ecuaciones para derivar la afinidad de unión Kd como se describe en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Bínding Affinities and Determine Allosteric vs . Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, . ; Chuang, C. C; Scott, M. P . ; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; también en "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, y N. Nazef. En ass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Homer G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods and Principies in Medicinal Chemistry.

Análisis para experimentos de unión competitiva mediante espectrometría de masas por selección de afinidad Para determinar la capacidad de los compuestos de análisis para unirse competitivamente a proteínas, se realizó, por ejemplo, un análisis de espectrometría de masas por selección de afinidad. Se preparó una mezcla de ligandos a 40 µ por componente al combinar 2 ]iL de alícuotas de soluciones madre 400 µ? de cada uno de los tres compuestos con 14 µ?, de DMSO. Luego, 1 µ?. alícuotas de estos 40 µ? por mezcla de componentes se combinan con 1 µ?* de alícuotas DMSO de una solución madre diluida en serie del macrociclo peptidomimético titulante (10, 5, 2.5, 0.078 mM) . Estos 2 µ?_ de muestra se disolvieron en 38 µ?, de PBS. Las soluciones resultantes se mezclaron mediante pipeteo repetido y se clarificaron mediante centrifugación a 10 000 g durante 10 min. A 4.0 µL de alícuotas del sobrenadante resultante se agregaron 4.0 µL de proteína hMDM2 10 µ? en PBS. Cada 8.0 µL de muestra experimental de esta forma, contiene 40 pmol (1.5 g) de proteína a una concentración 5.0 µ? en PBS más el ligando 0.5 µ?, DMSO al 2.5%, y concentraciones variables (125, 62.5, 0.98 µ?) del macrociclo peptidomimético titulante. Las muestras por duplicado así preparadas para cada punto de concentración se incuban a temperatura ambiente durante 60 min, luego se congelan a 4°C antes del análisis de SEC-LC-MS de inyecciones de 2.0 µL. Los detalles adicionales sobre estos y otros métodos se proporcionan en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs . Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C Scott, M. P.; Nash, H. M . J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; también en "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. En ass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hofner G: Wiley- VCH; 2007: 121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors) : Methods and Principies in Medicinal Chemistry.

Análisis de unión en células intactas Es posible medir .la unión de péptidos o macrociclos peptidomiméticos a sus aceptadores naturales en células intactas mediante experimentos de inmunoprecipitación . Por ejemplo, las células intactas se incuban con compuestos tratados con fluoresceina (marcados FITC) durante 4 horas en ausencia de suero, seguido por reemplazo de suero e incubación adicional con variaciones de 4 hasta 18 horas. Las células luego se granulan y se incuban en tampón de lisis (50 mM Tris [pH 7.6], NaCl 150 mM, y un cóctel con CHAPS al 1% e inhibidor de proteasa) durante 10 minutos a 4°C. Los extractos se someten a centrifugación a 14,000 rpm durante 15 minutos y los sobrenadantes se recolectan y se incuban con 10 L de anticuerpo anti-FITC de cabra durante 2 horas, con agitación giratoria a 4°C, seguido de 2 horas adicionales de incubación a 4°C con la proteina A/G Sepharose (50 µL de suspensión en perlas al 50%) . Después de una rápida centrifugación, los gránulos se lavan en tampón de lisis que contiene concentraciones de sal cada vez mayores (por ejemplo, 150, 300, 500 mM) . Las perlas luego se vuelven a equilibrar a NaCl 150 mM antes de la adición del tampón de muestra que contiene SDS y se someten a ebullición. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se someten a electroforesis opcionalmente utilizando geles de Bis-Tris con gradiente al 4%-12% seguido por transferencia en membranas Immobilon-P. Después de bloquear, las inmunotransferencias se incuban opcionalmente con un anticuerpo que detecta FITC y también con uno o más anticuerpos que detectan las proteínas que se unen al macrociclo peptidomimético .

Análisis de penetrabilidad celular Un macrociclo peptidomimético es, por ejemplo, una célula más penetrable en comparación con un macrociclo no reticulado correspondiente. Los macrociclos peptidomiméticos con ligadores optimizados poseen, por ejemplo, penetrabilidad celular que es al menos dos veces mayor que un macrociclo no reticulado correspondiente, y con frecuencia 20% o más del macrociclo peptidomimético aplicado se observará para que haya penetrado la célula después de 4 horas. Para medir la penetrabilidad celular del macrociclo peptidomimético y el macrociclo no reticulado correspondiente, se incuban células intactas con los macrociclos peptidomiméticos tratados con fluoresceina o el macrociclo no reticulado correspondiente (10 µ?) durante 4 horas en medio libre de suero a 37°C, se lavan dos veces con medio y se incuban con tripsina (0.25%) durante 10 min a 37 °C. Las células se lavan nuevamente y se vuelven a suspender en PBS. Se analiza la fluorescencia celular, por ejemplo, al utilizar ya sea un citómetro de flujo FACSCalibur o un lector Cellomics' KineticScan® HCS.

Análisis celulares eficacia La eficacia de ciertos macrociclos peptidomiméticos se determina, por ejemplo, en análisis para extermino de base celular utilizando una variedad de lineas celulares tumorigénicas y no tumorigénicas y células primarias derivadas de poblaciones celulares humanas o de ratón. La viabilidad celular se monitorea, por ejemplo, durante 24-96 horas de incubación con los macrociclos peptidomiméticos (0.5 hasta 50 µ?) para identificar aquellos que exterminan a EC50 <10 µ?. Diversos análisis estándar que miden la viabilidad celular están disponibles comercialmente y se utilizan opcionalmente para evaluar la eficacia de los macrociclos peptidomiméticos . Además, los análisis que miden la activación de Annexin V y caspasa se utilizan opcionalmente para evaluar si los macrociclos peptidomiméticos exterminan células al activar la maquinaria apoptótica. Por ejemplo, se utiliza el análisis Cell Titer-glo que determina la viabilidad celular como una función de la concentración de ATP intracelular .

Análisis de estabilidad in vivo Para investigar la estabilidad in vivo de los macrociclos peptidomiméticos, los componentes, por ejemplo, se administran a ratones y/o ratas mediante IV, IP, P0 o rutas de inhalación a concentraciones que varían de 0.1 hasta 50 mg/kg y los especímenes sanguíneos se extraen a 0' , 5' , 15' , 30' , 1 hora, 4 horas, 8 horas y 24 horas mediante inyección posterior. Los niveles del compuesto en 25 de suero recién preparado se miden mediante LC-MS/MS como anteriormente .

Eficacia in vivo en modelos animales Para determinar la actividad anti-oncogénica de los macrociclos peptidomiméticos de la invención in vivo, los compuestos, por ejemplo, se proporcionan solos (IP, IV, PO, mediante inhalación o vías nasales) o en combinación con dosis sub-óptimas de quimioterapia relevante (por ejemplo, ciclofosfamida, doxorubicina, etopósido) . En un ejemplo, 5 X 106 RS4; 11 células (establecidas a partir de la médula ósea de un paciente con leucemia linfoblástica aguda) que expresan establemente luciferasa, se inyectan mediante la vena de la cola en ratones NOD-SCID 3 horas después de que se hayan sometido a irradiación corporal total. Si se usa sin tratar, esta forma de leucemia es fatal a las 3 semanas en este modelo. La leucemia se monitorea fácilmente, por ejemplo, al inyectar a los ratones con D-luciferina (60 mg/kg) y mediante la formación de imágenes de los animales anestesiados (por ejemplo, Xenogen In Vivo Imaging System, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . La bioluminiscencia corporal total se cuantifica mediante la integración de flujo fotónico ( fotones/seg) mediante el Software Living imagen (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . Los macrociclos peptidomiméticos solos o en combinación con dosis sub-óptimas de los agentes quimioterapéuticos relevantes, por ejemplo, se administran a ratones con leucemias (10 días después de la inyección/dia 1 del experimento, en variación de bioluminiscencia de 14-16) mediante la vena de la cola o rutas IP a dosis que varían de 0.1 mg/kg hasta 50 mg/kg durante 7 hasta 21 días. Opcionalmente, se forman imágenes de los ratones a todo lo largo del experimento cada tercer día y la supervivencia se monitorea diariamente en lo que dura el experimento. Los ratones muertos se someten opcionalmente a necropsia al final del experimento. Otro modelo animal es la implantación en ratones NOD-SCID de DoHH2, una linea celular derivada de linfoma folicular humano, que expresa establemente la luciferasa. Estas pruebas ín vivo, generan opcionalmente, datos farmacocinéticos , farmacodinámicos y de toxicologia .

Ensayos Clínicos Para determinar la conveniencia de los macrociclos peptidomiméticos de la invención para el tratamiento de seres humanos, se realizan ensayos clínicos. Por ejemplo, los pacientes diagnosticados con cáncer y que necesitan de tratamiento se seleccionan y se separan en el tratamiento y uno o más grupos control, en donde al grupo de tratamiento se administra un macrociclo peptidomimético de la invención, mientras que los grupos control reciben un placebo o un fármaco anti-cancerígeno conocido. La seguridad y eficacia del tratamiento de los macrociclos peptidomiméticos de la invención de esta forma se puede evaluar al realizar comparaciones de los grupos de pacientes con respecto a factores tales como la supervivencia y calidad de vida. En este ejemplo, el grupo de pacientes tratados con un macrociclo peptidomimético muestra una supervivencia mejorada a largo plazo en comparación con un grupo control de pacientes tratados con un placebo.

Composiciones farmacéuticas y vías de administración Los macrociclos peptidomiméticos de la invención también incluyen derivados farmacéuticamente aceptables o profármacos de los mismos. Un "derivado farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal, éster, sal de un éster, profármaco u otro derivado farmacéuticamente aceptable de un compuesto de esta invención que, con la administración a un recipiente, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de esta invención. En particular, los derivados farmacéuticamente aceptables favorecidos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de la invención cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, al aumentar la absorción en la sangre de un compuesto administrado oralmente) o que aumenta el suministro del compuesto activo a un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con relación a la especie original. Algunos derivados farmacéuticamente aceptables incluyen un grupo químico que aumenta la solubilidad acuosa o el transporte activo a través de la mucosa gastrointestinal.

En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos de la invención se modifican al unir covalentemente o no covalentemente grupos funcionales adecuados para mejorar las propiedades biológicas selectivas. Estas modificaciones incluyen aquellas que aumentan la penetración biológica en un compartimento biológico determinado (por ejemplo, sangre, sistema linfático, sistema nervioso central) , aumentan la disponibilidad oral, aumentan la solubilidad para permitir la administración mediante inyección, alteran el metabolismo y alteran la velocidad de excreción.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen aquellas derivadas de los ácidos y bases inorgánicas y orgánicas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen acetato, adipato, benzoato, bencensulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromohidrato, yodohidrato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y undecanoato. Las sales derivadas de bases adecuadas incluyen un metal alcalino (por ejemplo sodio) , un metal alcalinotérreo (por ejemplo, magnesio), sales de amonio y N- (alquilo) 4+.

Para preparar las composiciones farmacéuticas a partir de los compuestos de la presente invención, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen portadores ya sea sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, tabletas, pildoras, cápsulas, obleas, supositorios y gránulos dispersables . Un portador sólido puede ser una o más sustancias, que también actúa como diluyentes, agentes saborizantes , aglutinantes, conservadores, agentes para desintegración de tabletas, o un material encapsulante . Los detalles o técnicas para la formulación y administración quedan bien descritos en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, la última edición de Remington' s Pharmaceutical Sciences, aack Publishing Co, Easton PA.

En polvos, el portador es un sólido dividido finamente, que es una mezcla con el componente activo dividido finamente. En tabletas, el componente activo se mezcla con el portador que tenga las propiedades de unión necesarias en proporciones adecuadas y compactado en la forma y tamaño deseados.

Los excipientes sólidos adecuados son materiales de relleno con carbohidrato o proteína, que incluyen de manera enunciativa; azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, almidón de maiz, trigo, arroz, papa u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica, y gomas entre las que se incluyen arábiga y tragacanto, asi como proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se agregan agentes desintegrantes o solubilizantes , tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio.

Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo agua, o soluciones de agua/propilenglicol . Para inyección parenteral, las preparaciones líquidas se pueden formular en solución acuosa de polietilenglicol .

La preparación farmacéutica de preferencia está en forma de dosificación unitaria. En esta forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, el envase contiene cantidades discretas de la preparación, tales como tabletas envasadas, cápsulas y polvos en viales o ampolletas. También, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, tableta, oblea o grajea, por si misma, o puede ser el número adecuado de cualquiera de éstos en forma envasada.

Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un macrociclo peptidomimético y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deben estar presentes a niveles de dosificación entre aproximadamente 1 hasta 100%, y de mayor preferencia entre aproximadamente 5 hasta 95% de la dosificación administrada normalmente en un régimen monoterapéutico . En algunas modalidades, los agentes adicionales se administran por separado, como parte de un régimen de dosificación múltiple, a partir de los compuestos de esta invención. Alternativamente, aquellos agentes que forman parte de una forma de dosificación individual, se mezclan junto con los compuestos de esta invención en una composición individual.

Métodos de uso En un aspecto, la presente invención proporciona macrociclos peptidomiméticos novedosos que son útiles en los análisis de unión competitiva para identificar los agentes que se unen a los ligando naturales de las proteínas o péptidos con los cuales se modelan los macrociclos peptidomiméticos. Por ejemplo, en el sistema p53/HDMX, los macrociclos peptidomiméticos marcados con base en p53 se pueden utilizar en un análisis de unión HDMX junto con pequeñas moléculas que se unen competitivamente al HDMX. Los estudios de unión competitivos permiten una evaluación y determinación rápida in vitro de los candidatos farmacológicos específicos para el sistema p53/HDMX.

Estos estudios de unión se pueden realizar con cualquiera de los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente y sus adjuntos de unión.

La invención proporciona además, la generación de anticuerpos contra los macrociclos péptidomiméticos . En algunas modalidades, estos anticuerpos se unen específicamente tanto al macrociclo peptidomimético como a los péptidos precursores, tales como p53, a los cuales se relacionan los macrociclos peptidomiméticos. Estos anticuerpos, por ejemplo, interrumpen la interacción natural proteína-proteína, por ejemplo, la unión entre p53 y HDMX.

En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos para el tratamiento de un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tenga un trastorno asociado con la expresión aberrante (por ejemplo, insuficiente o excesiva) o la actividad de las moléculas, que incluyen p53, HDM2 o HDMX.

En otra modalidad, un trastorno se provoca, al menos en parte, mediante un nivel anormal de p53 o HDM2 o HDMX, (por ejemplo, sobre o sub-expresión) , o por la presencia de p53 o HDM2 o HDMX que exhiben una actividad anormal. Como tal, la reducción en el nivel y/o actividad de p53 o HDM2 o HDMX, o la mejora del nivel y/o actividad de p53 o HDM2 o HDMX, mediante los macrociclos peptidomiméticos derivados de. p53, se utiliza, por ejemplo, para mejorar o reducir los síntomas adversos del trastorno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos para tratar o prevenir una enfermedad incluyendo una enfermedad hiperproliferativa y un trastorno inflamatorio al interferir con la interacción o unión entre los adjuntos de unión, por ejemplo, entre p53 y HDM2 o p53 y HDMX. Estos métodos comprenden administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la invención a un animal de sangre caliente, incluyendo un ser humano. En algunas modalidades, la administración de los compuestos de la presente invención induce la interrupción del crecimiento celular o apoptosis.

En. el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular proveniente de un paciente, que tenga una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el fin de curar, sanar, aliviar, ayudar, alterar, remediar, disminuir, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos de la invención se utilizan para tratar, prevenir y/o diagnosticar cánceres y condiciones neoplásicas. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "cáncer", "hiperproliferativo" y "neoplásico" se refiere a células que tienen la capacidad para crecer de forma autónomo, es decir, un estado anormal o condición caracterizada por la rápida proliferación de un crecimiento celular. Los estados de enfermedades iperproliferativa y neoplásica se pueden categorizar como patológicos, es decir, que caracterizan o constituyen un estado de enfermedad, o se pueden categorizar como no patológicos, es decir, una desviación a partir de lo normal pero no asociada con un estado de enfermedad. El término significa incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastáticos o células transformadas de forma maligna, tejidos u órganos, independientemente del tipo histopatológico o etapa de invasibilidad. Un tumor metastático puede surgir a partir de una multitud de tipos de tumores primarios, incluyendo de manera enunciativa aquellos de origen de mama, pulmón, hígado, colon y ovario. Las células "hiperproliferativas patológicas" se presentan en estados de enfermedad caracterizados por un crecimiento de tumores malignos. Los ejemplos de células hiperproliferativas no patológicas incluyen la proliferación de células asociadas con la reparación de heridas. Los ejemplos de trastornos celulares proliferativos y/o diferenciativos incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, o trastornos metastáticos . En algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos son agentes terapéuticos novedosos para controlar el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el cáncer pulmonar, la · metástasis de estos cánceres y lo semejante.

Los ejemplos de cánceres o condiciones neoplásicas incluyen, de manera enunciativa, un fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de E ing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer prostético, cáncer uterino, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer cutáneo, cáncer cerebral, carcinoma de células escamosas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma , carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatomas, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma , seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer testicular, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neurinoma del acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma o sarcoma de Kaposi.

Los ejemplos de trastornos proliferativos incluyen trastornos neoplásicos hematopoyéticos . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "trastornos neoplásicos hematopoyéticos" incluye las enfermedades que implican células hiperplásicas/neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, que se originan de linajes mieloides, linfoides o eritroides, o células precursoras de los mismos. De preferencia, las enfermedades se originan de leucemias agudas diferenciadas deficientemente, por ejemplo, leucemia, eritroblástica y leucemia megacarioblástica aguda. Los trastornos mieloides ilustrativos adicionales incluyen, de manera enunciativa, leucemia promieloidea aguda (APML) , leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia mielógena crónica (CML) (revisado en Vaickus (1991), Crit Rev. Oncol . /Hemotol 11:267-97); las malignidades linfoides incluyen, de manera enunciativa leucemia linfoblástica aguda (ALL) , que incluye la ALL de linaje B y la ALL de linaje T, la leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia prolinfocitica (PLL) , leucemia de células pilosas (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) . Las formas adicionales de linfomas malignos incluyen, de manera enunciativa linfoma que no es de Hodgkin y variantes del mismo, linfomas de linfocitos T periféricos, leucemia/linforna de linfocitos T en adultos (ATL), linfoma de linfocitos T cutáneos (CTCL) , leucemia linfocítica granular grande (LGF) , enfermedad de Hodgkin y enfermedad de Reed-Stem erg .

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciativos celulares de la mama incluyen, de manera enunciativa, la enfermedad proliferativa de mama, que incluye, por ejemplo, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante y papilomas de conductos pequeños; tumores, por ejemplo, tumores estromales tales como fibroadenoma, tumor de filodos y sarcomas, y tumores epiteliales tales como, papiloma de conductos grandes; carcinoma de la mama que incluye carcinoma in situ (no invasivo) , que incluye carcinoma ductal in situ (incluyendo la enfermedad de Paget) y carcinoma lobular in situ, y carcinoma invasivo (infiltrante), que incluye, de manera enunciativa, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma medular, carcinoma coloidal (mucinoso) , carcinoma tubular, y carcinoma papilar invasivo, y neoplasmas malignos diversos.

Los trastornos en las glándulas mamarias masculinas, incluyen, de manera enunciativa, ginecomastia y carcinoma.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciativos celulares del pulmón incluyen, de manera enunciativa, carcinoma broncogénico, incluyendo síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como, carcinoide bronquial, tumores diversos y tumores metastáticos ; patologías de la pleura, incluyendo derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, tumores neumotorácicos y pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesoteliomas malignos.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciativos celulares del colon incluyen, de manera enunciativa, pólipos no neoplásicos, adenomas, síndromes familiares, carcinogénesis colorrectal, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciativos celulares del hígado incluyen, de manera enunciativa, hiperplasias nodulares, adenomas y tumores malignos, incluyendo carcinoma primario del hígado y tumores metastáticos .

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciativos celulares del ovario incluyen, de manera enunciativa, tumores ováricos tales como, tumores del epitelio celómico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores endometrioides, adenocarcinoma de células aclaradoras, cistadenofibroma, tumor de Brenner, tumores epiteliales superficiales, tumores de células germinales, tales como teratomas maduros (benigno) , teratomas monodérmicos , teratomas malignos inmaduros, disgerminoma , tumor de seno endodérmico, coriocarcinoma, tumores del cordón estromal sexual tales como, tumores de las células teca granulosa, tecomafibromas, androblastomas, tumores de células iliares, y gonadoblastoma, y tumores metastáticos , tales como tumores de Krukenberg.

En modalidades distintas o adicionales, los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente se utilizan para tratar, prevenir o diagnosticar condiciones caracterizadas por muerte celular demasiado activa o muerte celular debida a un ataque fisiológico, etc. Algunos ejemplos de condiciones caracterizadas por muerte celular prematura o no deseada son o, proliferación celular alternativamente no deseada o excesiva incluyen, de manera enunciativa condiciones hipocelulares/hipoplásica, acelulares/aplásicas, o hipercelulares/hiperplásica . Algunos ejemplos incluyen trastornos hematológicos entre los que se incluyen, de manera enunciativa anemia de Fanconi, anemia aplásica, talasemia, neutropenia congénita y mielodisplasia.

En modalidades. distintas o adicionales, los macrociclos peptidomiméticos de la invención que actúan para disminuir la apoptosis se utilizan para tratar los trastornos asociados con un nivel no deseado de muerte celular. De esta forma, en algunas modalidades, los macrociclos peptidomiméticos anti-apoptóticos de la invención se utilizan para tratar trastornos tales como aquellos que conducen a la muerte celular asociada con infección viral, por ejemplo, una infección asociada con la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) . Una amplia variedad de enfermedades neurológicas se caracterizan por la pérdida gradual de conjuntos específicos de neuronas. Un ejemplo es la enfermedad de Alzheimer (AD) . La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la pérdida de neuronas y la sinapsis en la corteza cerebral y ciertas regiones subcorticales . Esta pérdida da por resultado en atrofia total de las regiones afectadas. Tanto las placas amiloides como las marañas neurofibrilares son visibles en los cerebros de aquellos afligidos por la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer se ha identificado como una enfermedad sin despliegue de proteínas, debido a la acumulación de proteínas A-beta y tau plegadas anormalmente en el cerebro. Las placas están constituidas de ß-amiloide. La ß-amiloide es un fragmento proveniente de una proteina mayor denominada proteina precursora amiloide (APP) . La APP es decisiva para el crecimiento neuronal, la supervivencia y reparación de lesiones posteriores. En la AD, un proceso desconocido provoca que la APP se segmente en fragmentos más pequeños mediante enzimas a través de la proteólisis. Uno de estos fragmentos son los fibrilos de ß-amiloide, que forman grupos que se depositan fuera de las neuronas en formaciones densas conocidas como placas seniles. Las placas siguen creciendo en fibras torcidas insolubles dentro de la célula nerviosa, con frecuencia denominadas marañas. La interrupción de la interacción entre el ß-amiloide y su receptor natural, por lo tanto es importante en el tratamiento de la AD. Los macrociclos peptidomiméticos anti-apoptóticos de la invención se utilizan,, en algunas modalidades, en el tratamiento de la AD y otros trastornos neurológicos asociados con la apoptosis celular. Estos trastornos neurológicos incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, retinitis pigmentosa con esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , atrofia muscular espinal, y diversas formas de degeneración del cerebelo. La pérdida de células en estas enfermedades no induce una respuesta inflamatoria, y parece que la apoptosis será el mecanismo de la muerte celular.

Además, varias enfermedades hematológicas están asociadas con una producción disminución de células sanguíneas. Estos trastornos incluyen, anemia asociada con una enfermedad crónica, anemia aplásica, neutropenia crónica, y los síndromes mielodisplásicos . Los trastornos de la producción de células sanguíneas, tales como, el síndrome mielodisplásico y algunas formas de anemia aplásica, están asociados con muerte celular apoptótica aumentada dentro de la médula ósea. Estos trastornos podrían resultar de la activación de genes que estimulan la apoptosis, deficiencias adquiridas en células estromales o factores de supervivencia hematopoyética, o los efectos directos de toxinas y mediadores de respuestas inmunitarias . Dos trastornos comunes asociados con la muerte celular son infartos de miocardio y accidentes cerebrovascular . En ambos trastornos, las células dentro de la zona central de la isquemia, que se produce en caso de pérdida aguda del flujo sanguíneo, parecen morir rápidamente como resultado de una necrosis. Sin embargo, fuera de la zona isquémica central, las células mueren durante un período de tiempo más prolongado y morfológicamente parecen morir por apoptosis. En modalidades distintas o adicionales, los macrociclos peptidomiméticos anti-apoptóticos de la invención se utilizan para tratar todos estos trastornos asociados con muerte celular no deseada .

Algunos ejemplos de trastornos neurológicos que se tratan con los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente incluyen de manera enunciativa la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down, amiloidosis Hemorragia cerebral hereditaria tipo holandés, amiloidosis reactiva, nefropatía amiloide familiar con urticaria y sordera, síndrome de uckle-Wells , mieloma idiopático; mieloma asociado con macroglobulinemia, polineuropatía amiloide familiar, cardiomiopatía amiloide familiar, amiloidosis senil sistémica, amiloide cardíaca aislada, diabetes de aparición en adultos, insulinoma, carcinoma medular, amiloide auricular aislado de la tiroides, amiloidosis familiar, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, polineuropatía amiloidótica familiar, Scrapie, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann Straussler-Scheinker , encefalitis espongiforme bovina, una enfermedad producida por priones, y enfermedad de Huntington.

En otra modalidad, los macrociclos peptidomiméticos descritos en- la presente se utilizan para tratar, prevenir o diagnosticar trastornos inflamatorios. Existen muchos tipos de trastornos inflamatorios. Ciertas enfermedades inflamatorias están asociadas con el sistema inmunitario, por ejemplo, las enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes se originan a partir de una respuesta inmunitaria demasiado activa del cuerpo contra sustancias y tejidos normalmente presentes en el cuerpo, es decir, los auto-antigenos. En otras palabras, el sistema inmunitario ataca sus propias células. Las enfermedades autoinmunes son una principal causa de las enfermedades inmunoprovocadas . La artritis reumatoide es un ejemplo de una enfermedad autoinmune, en la cual el sistema inmunitario ataca las articulaciones, donde provoca inflamación (es decir, artritis) y destrucción. También puede dañar algunos órganos, tales como los pulmones y la piel. La artritis reumatoide puede conducir a la pérdida sustancial del funcionamiento y movilidad. La artritis reumatoide se diagnostica con pruebas sanguíneas, en especial la prueba del factor reumatoide. Algunos ejemplos de enfermedades autoinmunes que se tratan con los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente incluyen, de manera enunciativa, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM) , enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolipidos (APS) , anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno, enfermedad de Bechet, penfigoide ampollar, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , enfermedad de Crohn, dermatomiositis , diabetes mellitus tipo 1, endometriosis , síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS) , enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurativa, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), cistitis intersticial, lupus eritematoso, morfea, esclerosis múltiple, miastenia grave, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, . polimiositis, polimialgia reumática, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis reumatoide, esquizofrenia, escleroderma, síndrome de Sjogren, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes") , arteritis de Takayasu, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

Algunos ejemplos de otros tipos de trastornos inflamatorios que se tratan con los macrociclos peptidomiméticos descritos en la presente incluyen, de manera enunciativa, alergia que incluye rinitis/sinusitis alérgica, alergias cutáneas (urticaria/erupción cutánea, angioedema, dermatitis atópica) , alergias a alimentos, alergias a fármacos, alergias a insectos, y trastornos alérgicos raros tales como, mastocitosis, asma, artritis, incluyendo osteoartritis , artritis reumatoide, espondiloartropatías y, angitis primaria del CNS, sarcoidosis, rechazo al trasplante de órganos, fibromialgia, fibrosis, pancreatitis y enfermedad inflamatoria pélvica.

Los ejemplos de trastornos cardiovasculares (por ejemplo, trastornos inflamatorios) que se tratan o previenen con los macrociclos peptidomiméticos de la invención incluyen, de manera enunciativa, estenosis de la válvula aórtica, aterosclerosis, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, trombosis, aneurisma, insuficiencia cardiaca, enfermedad cardiaca isquémica, angina de pecho, muerte cardiaca súbita, enfermedad cardiaca hipertensiva; enfermedad arterial no coronaria, tal como arteriosclerosis, enfermedad de arterias pequeñas, nefropatía, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, xantomatosis, asma, hipertensión, enfisema y enfermedad pulmonar crónica; o una condición cardiovascular asociada con procedimientos de intervención ("Trauma vascular de procedimiento") , tal como restenosis después de una angioplastia, colocación de una derivación, endoprótesis, injertos por escisión sintéticos o naturales, catéter permanente, dispositivos de válvula u otros implantables . Los trastornos cardiovasculares preferidos incluyen aterosclerosis, infarto de miocardio, aneurisma, y accidente cerebrovascular .

Mientras que se han mostrado y descrito en la presente las modalidades preferidas de la presente invención, será evidente para aquellos expertos en la técnica que estas modalidades se proporcionan a manera de ejemplo únicamente. Muchas variaciones, cambios y sustituciones se presentaran para aquellos expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Se debe entender que las diversas alternativas a las modalidades de la invención descritas en la presente se pueden emplear para práctica la invención. Se pretende que las reivindicaciones más adelante definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras queden dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos por las mismas.

Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de los aminoácidos 6-clorotriptofano Fmoc cuantitativo Gly Ni-S-BPB R=H 6-cloro-3-formil-lH-indol-1-carboxilato de ter- butilo, 1. A una solución agitada de DMF deshidratada (12 niL) se agregó gota a gota POCI3 3.92 mL, 43 mmol, 1.3 equiv) a 0°C bajo argón. La solución se agitó a la misma temperatura durante 20 min antes una solución de 6-cloroindol (5.0 g, 33 mmol, 1 eq.) en D F deshidratada (30 mL) . La mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 2.5 horas adicionales. Se agregó agua (50 mL) y la solución se neutralizó con NaOH acuoso 4M (pH ~8) . El sólido resultante se extrajo por filtración, se lavó con agua y se secó bajo vacio. El material se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución agitada del formilindol crudo (33 mmol, 1 eq.), En THF (150 mi) se agregó sucesivamente Boc20 (7.91 g, 36.3 mmol, 1.1 equiv) y DMAP (0.4 g, 3.3 mmol, 0.1 equiv) a temperatura ambiente bajo N2. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se extrajo en EtOAc y se lavó con HC1 1N, se secó y se concentró para proporcionar formilindol 1 (9 g, 98% durante 2 pasos) como un sólido blanco. XH NMR (CDCI3) d: 1.70 (s, Boc, 9H) ; 7.35 (dd, 1H) ; 8.21 (m, 3H) ; 10.07 (s, 1H) . 6-cloro-3- (hidroximetil ) -lH-indol-l-carboxilato de ter-butilo, 2. A una solución del compuesto 1 (8.86 g, 32 mmol, 1 eq.) en etanol (150 mi) se agregó NaBH (2.4 g, 63 mmol, 2 eq. ) . La reacción se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se vació en dietiléter y agua. Las capas orgánicas se separaron, se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron ' para proporcionar un sólido blanco (8.7 g, 98%). Este material se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional. 1H N R (CDCI3) d: 1.65 (s, Boc, 9H) ; 4.80 (s, 2H, CH2); 7.21 (dd, 1H) ; 7.53 (m, 2H) ; 8.16 (bs, 1H) . 3- (bromometil) -6-cloro-lH-indol-l-carboxilato de ter-butilo, 3. A una solución del compuesto 2 (4.1 g, 14.6 mmol, 1 eq. ) en diclorometano (50 mi) bajo argón se agregó a una solución de trifenilfosfina (4.59 g, 17.5 mmol, 1.2 eq.) en diclorometano (50 mi) a 40°C. La solución de reacción se agitó 30 minutos adicionales a 40°C. Luego se agregó NBS (3.38 g, 19 mmol, 1.3 eq.). La mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El diclorometano se evaporó, se agregó tetracloruro de carbono (100 mi) y la mezcla se agitó durante 1 hora y se filtró. El filtrado se concentró, se cargó en un tapón de sílice y se eluyo rápidamente con EtOAc al 25 de en hexanos. La solución se concentró para proporcionar una espuma blanca (3.84 g, 77%). 1H NMR (CDCI3) d: 1.66 (s, Boc, 9H) ; 4.63 (s, 2H, CH2) ; 7.28 (dd, 1H) ; 7.57 (d, 1H) ; 7.64 (bs, 1H) ; 8.18 (bs, 1H) . ccMe-6Cl-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 4. A S-Ala-Ni-S-BPB (2.66g, 5.2 mmol, 1 eq. ) y KO-tBu (0.87g, 7.8 mmol, 1.5 eq. ) se agregaron 50 mi de D F bajo argón. El compuesto derivado de bromuro 3 (2.68 g, 7.8 mmol, 1.5 eq.) En solución de DMF (5.0 mi) se agregó via una jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución luego se inactivo con ácido acético acuoso al 5% y se diluyó con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, se secó y se concentró. El producto oleoso 4 se purificó mediante cromatografía instantánea (carga sólida) en fase normal utilizando EtOAc y hexanos como eluyentes para proporcionar un sólido rojo (1.78 g, rendimiento al 45%). aMe-6Cl-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 4: M+H cale. 775.21, M+H obs . 775.26; ½ NMR (CDC13) d: 1.23 (s, 3H, aMe) ; 1.56 (m, 11H, Boc + CH2) ; 1.82-2.20 (m, 4H, 2CH2) ; 3.03 (m, 1H, CHa) ; 3.24 (m, 2H, CH2) ; 3.57 y 4.29 (sistema AB, 2H, CH2 (bencilo) , J= 12.8Hz); 6.62 (d, 2H) ; 6.98 (d, 1H) ; 7.14 (m, 2H) ; 7.23 (m, 1H) ; 7.32-7.36 (m, 5H) ; 7.50 (m, 2H) ; 7.67 (bs, 1H) ; 7.98 (d, 2H) ; 8.27 (m, 2H) .

Fmoc-aMe-6cl-Trp (Boc) -OH, 6. A una solución de HCl/MeOH 3 N (1/3, 15 mL) a 50°C se agregó una solución del compuesto 4 (1.75 g, 2.3 mmol, 1 eq. ) en MeOH (5 mi) gota a gota. El material de partida desapareció en un término de 3-4 horas. La solución ácida luego se enfrió a 0°C con un baño helado y se inactivo con una solución acuosa de Na2C03 (1.21 g, 11,5 mmol, 5 eq.). El metanol se retiró y se agregaron a la suspensión 8 equivalentes más de Na2C03 (1.95 g, 18.4 mmol) . Luego se agregó el níquel que depura la sal disódica dihidratada EDTA (1.68 g, 4.5 mmol, 2 eq. ) y la suspensión se agitó durante 2 horas. Se agregó una solución de Fmoc-OSu (0.84 g, 2.5· mmol. 1,1 eq.) en acetona (50 mi) y la reacción se agitó durante la noche. Después de esto, la reacción se diluyó con dietiléter y HC1 1N. La capa orgánica luego se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró in vacuo. El producto 6 deseado se purificó en fase normal utilizando acetona y diclorometano como eluyentes para proporcionar una espuma blanca (0.9 g, rendimiento al 70%). Fmoc-aMe-6Cl-Trp (Boc)-OH, 6: M + H cale. 575.19, M + H obs . 575,37; 1H RMN (CDCI3) 1.59 (s, 9H, Boc); 1.68 (s, 3H, Me); 3.48 (bs, 2H, CH2); 4.22 (m, 1H, CH) ; 4.39 (bs, 2H, CH2) ; 5.47 (s, 1H, NH) ; 7.10 (m, 1H) ; 7.18 (m, 2H) ; 7.27 (m, 2H) ; 7.39 (m, 2H) ; 7.50 (m, 2H); 7.75 (d, 2H) ; 8.12 (bs, 1H) . 6C1-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 5. A Gly-Ni-S-BPB (4.6 g, 9.2 mmol, 1 eq. ) y KO-tBu (1.14 g, 10.1 mmol, 1.1 eq.) Se agregaron 95 mi de DMF bajo argón. El compuesto 3 derivado de bromuro (3.5 g, 4.6 mmol, 1.1 eq.) en solución de DMF (10 mi) se agregó vía una jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución luego se inactivo con ácido acético acuoso al 5% y se diluyó con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, se secó y se concentró. El producto oleoso 5 se purificó mediante cromatografía instantánea (carga de sólidos) en fase normal utilizando EtOAc y hexanos como eluyentes para proporcionar un sólido rojo (5 g, rendimiento al 71%). 6C1-Trp (Boc) -Ni-S-BPB, 5: M+H cale. 761.20, M+H obs . 761.34; XH NMR CDC13) d: 1.58 (m, 11H, Boc + CH2) ; 1.84 (m, 1H) ; 1.96 (m, 1H) ; 2.24 (m, 2H, CH2).; 3.00 (m, 1H, CHa) ; 3.22 (m, 2H, CH2) ; 3.45 y 4.25 (sistema AB, 2H, CH2 (bencilo) , J= 12.8Hz); 4.27 (m, 1H, CHa) ; 6.65 (d, 2H) ; 6.88 (d, 1H) ; 7.07 (m, 2H) ; 7.14 (m, 2H) ; 7.28 (m, 3H) ; 7.35-7.39 (m, 2H) ; 7.52 (m, 2H) ; 7.96 (d, 2H) ; 8.28 (m, 2H) .

Fmoc-6Cl-Trp (Boc) -OH, 7. A una solución de HCl/MeOH 3 N (1/3, 44 mi) a 50°C se agregó una solución del compuesto 5 (5 g, 6.6 mmol, 1 eq. ) en MeOH (10 mi) gota a gota. El material de partida desapareció en un término de 3-4 horas. La solución ácida luego se enfrió a 0°C con un baño helado y se inactivo con una solución acuosa de Na2C03 (3.48 g, 33 mmol, 5 eq. ) . El metanol se retiró y se agregaron a la suspensión 8' equivalentes más de Na2C03 (5.57 g, 52 mmol). Luego se agregó el níquel que depura la sal disódica dihidratrada de EDTA (4.89 g, 13.1 mmol, 2 eq.) y la suspensión se agitó durante 2 horas. Se agregó una solución de Fmoc-OSu (2.21 g, 6.55 mmol, 1.1 eq. ) en acetona (100 mi) y la reacción se agitó durante la noche. Después de esto, la reacción se diluyó con dietiléter y HCl 1N. La capa orgánica luego se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró in vacuo. El producto 7 deseado se purificó en fase normal utilizando acetona y diclorometano como eluyentes para proporcionar una espuma blanca (2.6g, rendimiento de 69%). Fmoc-6Cl-Trp (Boc) -OH, 7: M+H cale. 561.17, +H obs . 561.37; 1H NMR (CDC13) 1.63 (s, 9H, Boc); 3.26 (m, 2H, CH2) ; 4.19 (m, 1H, CH) ; 4.39 (m, 2H, CH2) ; 4.76 (m, 1H) ; 5.35 (d, 1H, NH) ; 7.18 (m, 2H) ; 7.28 (m, 2H) ; 7.39 (m, 3H) ; 7.50 (m, 2H) ; 7.75 (d, 2H) ; 8.14 (bs, 1H) .

Ejemplo 2: Macrociclos peptidomimético de la invención Los macrociclos peptidomiméticos se sintetizaron, se purificaron y se analizaron como se describió anteriormente y como se describirá más adelante (Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); y la patente de los Estados Unidos No. 7,192,713). Los macrociclos peptidomiméticos se diseñaron para reemplazar dos o más aminoácidos que se presentan en la naturaleza con los correspondientes aminoácidos sintéticos. Las sustituciones se realizaron en las posiciones i y i+4, e i y i+7. La síntesis de péptidos se realizó ya sea manualmente o en un sintetizador automatizado de péptidos (Applied Biosystems, modelo 433A) , utlizando condiciones de fase sólida, resina de la amida guía AM (Novabiochem) , y química para grupo de protección dé cadena prinicpal Fmoc. Para el acoplamiento de los aminoácidos Fmoc protegidos adicionales (Novabiochem) , se emplearon 10 equivalentes de un aminoácido y una proporción molar 1:1:2 de reactivos acoplantes HBTU/HOBt (Novabiochem) /DIEA. Los aminoácidos no naturales (4 equiv) se acoplaron con una proporción molar 1:1:2 de HATU (Applied Biosystems) /HOBt/DIEA. Los términos N de los péptidos sintéticos se acetilaron, mientras que los términos C se amidaron.

La purificación de los compuestos reticulados se alcanzó mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) (Varían ProStar) en una columna C18 de fase inversa (Varían) para proporcionar los compuestos puros. La composición química de los productos puros se confirmó mediante espectrometría de masa LC/MS ( icromass LCT en interfaz con Un sistema Agilent 1100 HPLC) y análisis de aminoácidos (Applied Biosystems, modelo 420A) .

La Tabla 4 muestra una lista de los macrociclos peptidomiméticos de la invención preparados.

Tabla 4 En las secuencias mostradas anteriormente y en otros lugares, se utilizan las siguiente abreviaturas: "Nle" representa norleucine, "Aib" representa ácido 2-aminoisobutirico", "Ac" representa acetilo, y "pr" representa propionilo. Los aminoácidos presentados como "$" son aminoácidos de olefina y alfa-Me S5-pentenil-alanina conectados mediante un reticulante i hasta i+4 de carbono puro que comprende un doble enlace. Los aminoácidos representados como "$r5" son aminoácidos de olefina y alfa- e R5-pentenil-alanina conectados mediante un reticulante de i hasta i+4 de carbono puro que comprende un doble enlace. Los aminoácidos representados como "$s8" son aminoácidos de olefina y alfa-Me S8-octenil-alanina conectados mediante un reticulante de i hasta i+7 de carbono puro que comprende un doble enlace. Los aminoácidos representaron como" $r8" son aminoácidos de olefina y alfá-Me R8-octenil-alanina conectados mediante un reticulante de i hasta i+7 de carbono puro que comprende un doble enlace. "Ahx" representa a un ligador de aminociclohexilo . Los reticulantes son reticulantes lineales de carbono puro que comprenden ocho a once átomos de carbono entre los carbonos alfa de cada aminoácido. Los aminoácidos representados como "$/" son aminoácidos de olefina y alfa-Me S5-pentenil-alanina que no están conectados mediante un reticulante. Los aminoácidos representaron como "$/r5" son aminoácidos de olefina y alfa-Me R5-pentenil-alanina que no están conectados mediante ningún reticulante. Los aminoácidos representaron como "$/s8" son aminoácidos de olefina y alfa-Me S8-octenil-alanina que no están conectados mediante ningún reticulante. Los aminoácidos representaron como" $/r8" son aminoácidos de olefina y alfa-Me R8-octenil-alanina que no están conectados mediante ningún reticulante. Los aminoácidos representados como "Amw" son aminoácidos alfa-Me triptofano. Los aminoácidos representados como "Aml" son aminoácidos alfa-Me leucina. Los aminoácidos representaron como "2ff" son aminoácidos 2-fluoro-fenilalanina . Los aminoácidos representaron como "3ff" son aminoácidos 3-fluoro-fenilalanina . Los aminoácidos representados como "St" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de olefina y pentenil-alanina que no están reticuladas. Los aminoácidos representaron como "St//" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de olefina pentenil-alanina que no están reticuladas. Los aminoácidos representaron como "%St" son aminoácidos que comprenden dos cadenas laterales de olefina pentenil-alanina cada una de las mismas está reticulada con otro aminoácido según se indica vía las reticulaciones de hidrocarburo totalmente saturado.

Por ejemplo, los compuestos representados como SP- 72, SP-56 y SP-138 tienen las siguientes estructuras: Por ejemplo, los compuestos adicionales tienen las siguientes estructuras: ?? 121 Ejemplo 3: Unión de competición ELISA (HDM2 & HDMX) La proteina p53-His6 (30 nM/pocillo) se recubrió durante la noche a temperatura en los pocilios de una placa Immulon de 96 pocilios. El día del experimento, las placas se lavaron con IX PBS-Tween 20 (0.05%) utilizando un lavaplatos de ELISA automático, bloqueado con bloqueo en Micro pocilio ELISA durante 30 minutos a temperatura ambiente; el agente bloqueador en exceso se extrajo por lavado mediante el lavado de las placas con IX PBS-Tween 20 (0.05%). Los péptidos se diluyeron a partir de concentraciones de DMSO 10 mm a concentraciones de trabajo de 50 µ? en agua estéril, se realizaron diluciones adicionales en DMSO a 0.5% para mantener la concentración de DMSO constante a través de las muestras. Los péptidos se agregaron a los pocilios a concentraciones deseadas 2X en volúmenes de 50 µ?, seguidos por la adición de proteina diluida de GST-HDM2 o GST-HMDX (concentración final: 10 nM) . Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas, las placas se lavaron con PBS-Tween 20 (0.05%) antes de agregar 100 µ? del anticuerpo anti-GST conjugado con HRP [Hypromatrix, INC] diluido a 0.5 g/ml en tampón de estabilización con HRP. Después de 30 minutos de incubación con el anticuerpo de detección, las placas se lavaron y se incubaron con 100 µ? por pocilio de solución de sustrato TMB-E hasta 30 minutos; las reacciones se detuvieron utilizando HC1 1M y la absorbancia se midió a 450 nm en un lector de micro-placas. Los datos se analizaron utilizando el software Graph Pad PRIS .

Ejemplo 4: Análisis de viabilidad celular SJSA-1 Las células SJSA1 se sembraron a la densidad de 5000 células/100 µ?/pocillos en placas de 96 pocilios un ' día antes del análisis. En el día del estudio, las células se lavaron una vez con medio Opti-MEM y se agregaron a las células 90 µ? del medio Opti-MEM. Los péptidos se diluyeron a partir de concentraciones de DMSO 10 mm a concentraciones de trabajo de 500 µ? en agua estéril, las diluciones adicionales se realizaron en DMSO al 0.5% para mantener la concentración de DMSO constante a través de las muestras. La variación final de concentración µ? será 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.56, 0.8 y 0 µ? en 100 µ? de volumen final por pocilio para los péptidos. La mayor concentración final de DMSO fue del 0.5% y se utilizará' como el control negativo. Se utilizó un análisis de base celular de Cayman Chemical (-)-Nutlin-3 (10 mM) como control positivo. Nutlin se diluyó utilizando el mismo esquema de dilución que el de los péptidos, se agregaron 10 µ? de las concentraciones deseadas 10X al pocilio adecuado para alcanzar las concentraciones deseadas finales. Las células luego se incubaron con los péptidos durante 20-24 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con C02 al 5%. Después del ' periodo de incubación, se midió la viabilidad celular utilizando reactivos Promega Cell Titer-Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 5:' Análisis de sobre-regulación SJSA-1 p21 Las células SJSA1 se sembraron a la densidad de 0.8 millones de células/2 ml/pocillo en placas de 6 pocilios un día antes del análisis. En el día del estudio, las células se lavaron una vez con medio Opti-MEM y se agregaron a las células 1350 µ? del medio Opti-MEM. Los péptidos se diluyeron a partir de concentraciones de DMSO 10 mm a concentraciones de trabajo de 500 µ? en agua estéril, las diluciones adicionales se realizaron en DMSO a 0.5% para mantener la concentración de DMSO constante a través de las muestras. La mayor concentración final DMSO fue 0.5% y se utilizó como el control negativo. Se utilizó un análisis de base celular de Cayman Chemical (-)-Nutlin-3 (10 m ) como control positivo. Nutlin se diluyó utilizando el mismo esquema de dilución que el de los- péptidos, se agregaron 150 µ? de las concentraciones deseadas 10X al pocilio adecuado hasta alcanzar las concentraciones deseadas finales. Las células luego se incubaron con los péptidos durante 18-20 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Después del periodo de incubación, las células se recolectaron, se lavaron con. IX PBS (sin Ca++/Mg++) y se lisaron en tampón para lisis celular IX (tampón 10X de Cell Signaling technologies diluido a IX y suplementado con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) en hielo durante 30 min. Los lisados se sometieron a centrifugación a velocidad de 13000 rpm en una micro-centrifuga a 40C durante 8 minutos; los sobrenadantes aclarados se recolectaron y se almacenaron a -80°C hasta un uso adicional. El contenido total de proteína de los lisados se midió utilizando un kit para detección para de proteínas BCA y los estándares BSA de Thermofisher . 25 µg de la proteína total se utilizaron para el análisis ELISA para detección de p21. Cada condición se ajustó por triplicado para la placa ELISA. El protocolo de análisis ELISA se siguió de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 25 µg de la proteína total se utilizaron para cada pocilio, y cada pocilio se ajustó por triplicado. Los datos se analizaron utilizando el software Graph Pad PRISM.

Ejemplo 6: Análisis GRIP de p53 El análisis para redistribución de p53-Hdm2 y Scientific* . Biolmage monitoreó la interacción de las proteínas con Hdm2 y la translocación celular de p53 marcada con GFP en respuesta a los compuestos farmacológicos u otros estímulos. Las células CHO-hIR recombinantes expresaron establemente . la p53 (1-312) humana fusionada al término C de la proteína fluorescente verde intensificada (EGFP) y PDE4A4-Hdm2 (1-124), una proteína de fusión entre PDE4A4 y Hdm2 (1-124). Los mismos proporcionaron un sistema de análisis listo para utilizarse para medir los efectos de las condiciones experimentales sobre la interacción de p53 y Hdm2. Con una plataforma HCS se realizó la formación de imágenes y análisis .

Las células se mantuvieron regularmente en medio F12 de Ham suplementado con penicilina-estreptomicina al 1%, 0.5 mg/ml de geneticina, 1 mg/ml de zeocina y FBS al 10%. Las células se sembraron en placas de 96 pocilios a la densidad de 7000 células/100 µ? por pocilios 18-24 horas antes de ejecutar el análisis utilizando medios de cultivo. Al siguiente día, los medios se refrescaron y se agregó a las células PD177 a la concentración final de 3 µ? para activar la formación de focos. Los pocilios control se mantuvieron en solución de PD-177. 24 horas después de la estimulación con PD177, las células se lavaron una vez con medio Opti- EM y se agregaron a las células 50 µ? del medio Opti-MEM suplementado con PD-177 (6 µ?) . Los péptidos se diluyeron a partir de concentraciones de DMSO 10 mM a concentraciones de trabajo de 500 µ? en agua estéril, se realizaron diluciones adicionales en DMSO al 0.5% para mantener la concentración de DMSO constante a través de las muestras. La mayor concentración final de DMSO fue 0.5% y se utilizó como el control negativo. Como control positivo se utilizó análisis de base celular Cayman Chemical (-)-Nutlin-3 (10 mm) . Nutlin se diluyó utilizando el mismo esquema de dilución que el de los péptidos. Se agregaron 50 µ? de concentraciones deseadas 2X al pocilio adecuado para alcanzar las concentraciones finales deseadas. Las células luego se incubaron con los péptidos durante 6 horas a 37 °C en atmósfera humidificada con Co2 al 5%. Después del periodo de incubación, las células se fijaron al activar suavemente los medios y al agregar 150 µ? de solución fijadora por pocilio durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron 4 veces con 200 µ? de PBS por pocilio cada vez. Al término del último lavado, se agregó 100 µ? de 1 µ? de solución de tinción Hoechst. Las placas selladas incubadas durante al menos 30 minutos en la oscuridad, se lavaron con PBS para eliminar el exceso de tinción y se agregó PBS a cada pocilio. Las placas se pueden almacenar a 4°C en la oscuridad hasta 3 dias. Se formaron imágenes de la translocación de p53/HDM2 utilizando un módulo de translocación molecular en un instrumento Cellomics Arrayscan utilizando un objetivo lOx, el filtro de XF-100 se ajustó para Hoechst y GFP. Los parámetros de salida fueron Mean-CircRINGAvelntenRatio (la proporción de las intensidades de fluorescencia promedio de los núcleos y el citoplasma, (promedio de pocilio) . El número mínimante aceptado de células por pocilio utilizado para el análisis de imágenes se ajustó a 500 células.

Ejemplo 7: Análisis de unión directa hD 2 con polarización por fuorescencia (FP) .

El análisis se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir hDM2 (local, 41 kD) en tampón de FP (tampón con alto contenido de sal-Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7.5) para producir 10 µ? de solución madre de trabajo. 2. Agregar 30 µ? de 10µ? de la solución madre de proteina en el pocilio Al y Bl de la microplaca HE negra de 96 pocilios (Molecular Devices) . 3. Llenar en 30 µ? de tampón de FP en una columna A2 hasta A12, B2 hasta B12, Cl hasta C12, y DI hasta D12. 4. Dilución en serie de 2 ó 3 veces de la concentración de proteina de Al, Bl en A2, B2; A2, B2 hasta A3, B3; hasta alcanzar la concentración de un solo dígito nM en el último punto de dilución. 5. Diluir 1 mM (en DMSO al 100%) de péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 µ? (dilución 1:10). Luego, diluir a partir de 100 µ? hasta 10 µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con tampón de FP de 10 µ? hasta 40 nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que será una concentración 10 nM en el pocilio (dilución 1:4). Mantener el péptido marcado con FAM diluido en la oscuridad hasta utilizarse. 6. Agregar 10 µ? de 10 mM del péptido marcado con FAM en cada pocilio e incubar, y leer a diferentes puntos de tiempo. Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 es -13.38 nM.

Ejemplo 8: Análisis de polarización por fuorescencia competitiva para hDM2 El análisis se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir hDM2 (local, 1kD) en tampón de FP (tampón con alto contenido de sal-Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7.5) para producir 84 nM (2X) de solución madre de trabajo. 2. Agregar 20 µ? de 84 nM (2X) de la solución madre de proteina en cada pocilio de una microplaca HE negra de 96 pocilios (Molecular Devices) . 3. Diluir 1 mM (en DMSO al 100%) del péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 µ? (dilución 1:10). Luego, diluir de 100 M hasta 10 µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con tampón de FP de 10 M hasta 40 nM (dilución 1:250) . Esta es la solución de trabajo que será una concentración 10 nM en el pocilio (dilución 1:4) . Mantener el péptido marcado con FAM diluido en la oscuridad hasta utilizarse . 4. Producir una placa de dosificación del péptido sin marcar con tampón de FP iniciando con 1 µ? (final) del péptido y realizando diluciones en serie de 5 veces durante 6 puntos utilizando el siguiente esquema de dilución.

Diluir 10 mM (en DMSO al 100%) con DMSO hasta 5 mM (dilución 1:2). Luego, diluir de 5 mM hasta 500 µ? con H20 (dilución 1:10) y luego diluir con tampón de FP de 500 µ? hasta 20µ? (dilución 1:25). Elaborar diluciones en serie de 5 veces proveniente de 4 µ? (4X) durante 6 puntos. 5.. Transferir 10 µ? de los péptidos no marcados diluidos en serie a cada pocilio que se llenó con 20 µ? de 84 nM de proteina. 6. Agregar 10 µ? de 10 nM (4X) del péptido marcado con FAM en cada pocilio e incubar durante 3 horas para lectura.

Los resultados de los ejemplos 7 y 8 se proporcionan en datos HDM2 en las figuras 7A, 7B, 7C y 7D.

Ejemplo 9: Análisis de unión directa hDMX en polarización por fuorescencia (FP) El análisis se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir hDMX (local, 40kD) en tampón de FP (tampón con alto contenido de sal-Nacl 200 mM, CHAPS 5mM, pH 7.5) para producir 10 µ? de solución madre de trabajo. 2. Agregar 30 µ? de 10 µ? de la solución madre de proteina en el pocilio Al y Bl de una microplaca HE negra de 96 pocilios (Molecular Devices) . 3. Llenar en 30 µ? de tampón de FP en una columna A2 hasta A12, B2 hasta B12, Cl hasta C12, y DI hasta D12. 4. Dilución en serie de 2 ó 3 veces de la concentración de proteina de Al, Bl en A2, B2; A2, B2 hasta A3, B3; ... hasta alcanzar la concentración de un solo dígito nM en el último punto de dilución. 5. Diluir 1 mM (en DMSO al 100%) del péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 µ? (dilución 1:10).

Luego, diluir de 100 µ? hasta 10 µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con tampón de FP de 10 µ? hasta 40 nM (dilución 1:250). Esta es la solución de trabajo que será la concentración 10 nM en el pocilio (dilución 1:4). Mantener el péptido marcado con FAM diluido en la oscuridad hasta utilizarse . 6. Agregar 10 µ? de 10 nM del péptido marcado con FAM en cada pocilio e incubar, y leer a diferentes puntos de tiempo .

Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 es -51 nM.

Ejemplo 10: Análisis de polarización por fluorescencia competitiva para hDMX El análisis se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: 1. Diluir hDMX (local, 40kD) en tampón de FP (tampón con alto contenido de sal-Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, pH 7.5) para producir 300 nM (2X) de solución madre de trabajo. 2. Agregar 20 µ? de 300 nM (2X) de la solución madre de proteina en cada pocilio de una microplaca HE negra de 96 pocilios (Molecular Devices). 3. Diluir 1 mM (en DMSO al 100%) del péptido lineal marcado con FAM con DMSO hasta 100 (dilución 1:10). Luego, diluir de 100 µ? hasta 10 µ? con agua (dilución 1:10) y luego diluir con tampón de FP de 10 µ? hasta 40 nM (dilución 1:250) . Esta es la solución de trabajo que será una concentración 10 nM en el pocilio (dilución 1:4) . Mantener el péptido marcado con FAM diluido en la oscuridad hasta utilizarse. 4. Elaborar una placa de dosificación del péptido sin marcar con el tampón de FP iniciando con 5 µ? (final) del péptido y realizar diluciones en serie de 5 veces durante 6 puntos utilizando el siguiente esquema de dilución. 5. Diluir 10 mM (en DMSO al 100%) con DMSO hasta 5mM (dilución 1:2) . Luego, diluir de 5 mM hasta 500 µ? con H2O (dilución 1:10) y luego diluir con tampón de FP de 500 µ? hasta 20 µ? · (dilución 1:25) . Elaborar 5 diluciones en serie de 5 veces de 20 µ? (4X) durante 6 puntos. 6. Transfer 10 µ? de los péptidos no marcados diluidos en serie hasta cada pocilio que se llenó con 20 µ? de 300 nM de1 proteína. 7. Agregar 10 µ? de 10 nM (4X) del péptido marcado con FAM en cada pocilio e incubar durante 3 horas para lectura.

Los resultados de los ejemplos 9 y 10 se proporcionan en los datos HDMX en las figuras 7A, 7B, 7C y 7D.

Ejemplo 11: Análisis de viabilidad celular El análisis se realizó bajo el siguiente protocolo general: Colocación en placa de la célula: Tratar con tripsina, contar y sembrar las células a las densidades predeterminadas en placas de 96 pocilios un día antes del análisis. Después se utilizaron las densidades celulares por cada linea celular en uso: · SJSA-1: 7500 células/pocilio RKO: 5000 células/pocilio RKO-E6: 5000 células/pocilio HCT-116: 5000 células/pocilio S -480: 2000 células/pocilio MCF-7: 5000 células/pocilio En- el día del estudio, reemplazar los medios con medio recién preparado con FBS al 11% (medio para análisis) a temperatura ambiente. Agregar 180 µ? de los medios para análisis por pocilio. Los pocilios control sin células, recibieron 200 µ? de medios.

Dilución de péptidos: todas las diluciones se realizaron a temperatura ambiente y se agregaron a las células a temperatura ambiente.

• Preparar 10 mM de concentraciones de los péptidos en DMSO. Diluir en serie la concentración utilizando un esquema de dilución 1:3 para obtener 10, 3.3, 1.1, 0.33, 0.11, 0.03, 0.01 mM de soluciones utilizando DMSO como diluyentes. Diluir los péptidos diluidos en DMSO en serie 33.3 veces utilizando agua estéril. Esto proporciona una variación de¦ concentraciones de trabajo 10X. También preparar una mezcla de DMSO/agua estéril (DMSO al 3%) para los pocilios control.

• De esta forma, la variación µ? de la concentración de trabajo será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?. Mezclar bien en cada paso de dilución utilizando multicanal .

• La fila H tuvo controles. H1-H3 recibirán 20 ul de los medios de análisis. H4-H9 recibirán 20 ul de un vehículo de DMSO-agua al 3%. H10-H12 tendrán un control de medio solo sin células.

• Control positivo: el inhibidor de molécula pequeña HDM2, Nutlin-3a (10 mm) se utilizó como control positivo. Nutlin se diluyó utilizando el mismo esquema de dilución que el de los péptidos.

Adición de las concentraciones de trabajo a las células : Agregar 20 µ? de la concentración deseada 10X al pocilio adecuado hasta alcanzar las concentraciones finales en un volumen total de 200 µ? en el pocilio. (20 µ? del péptido 300 µ? + 180 µ? de células en los medios = 30 µ? de concentración final en 200 µ? de volumen en los pocilios.) Mezclar suavemente unas cuantas veces utilizando pipeta. De esta forma, la variación de concentración final utilizada será 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03 y 0 µ? (para péptidos potentes que incluyeron diluciones adicionales) .

• Los controles incluyen pocilios que no obtuvieron péptidos pero que contuvieron la misma concentración de DMSO que los pocilios que contuvieron los péptidos, y los pocilios que NO CONTUVIERON CÉLULAS.

Incubar durante 72 horas a 37 °C en atmósfera humidificada con C02 al 50%.

• La viabilidad de las células se determinó utilizando un reactivo MTT de promedio en Promega. La viabilidad de las células SJSA-1, RKO, RK0-E6, HCT-116 se determinó en el día 3, las células MCF-7 en el día 5 y las células SW-480 en el día 6. Al término del tiempo de incubación designado, permitir que las placas retornen a la temperatura ambiente. Eliminar 80 µ? de los medios de análisis de cada pocilio. Agregar 15 µ? del reactivo MTT descongelado a cada pocilio.

Permitir incubar la placa durante 2 horas a 37 °C en atmósfera humedecida de C02 al 5% y agregar 100 µ? del agente de solubilización de acuerdo con el protocolo del fabricante. Incubar con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente y leer en un lector multiplaca Biotek Synergy para la absorbancia 570 nM.

• Analizar la viabilidad celular contra los controles DMSO utilizando herramientas de análisis GraphPad PRISM. reactivos : • Medio de cultivo celular Invitrogen Placas tratadas con cultivo celular de aclaramiento de 96 pocilios i.Falcon (Nunc 353072) DMSO (la Sigma D 2650) PMI 1640 (Invitrogen 72400) MTT (Promega G4000) Instrumentos: Lector multiplacas para lectura de absorbancia (Synergy 2) Los resultados del Ejemplo 11 se proporcionan en los datos SJSA-1 EC50 en las figuras 7A, 7B, 7C y 7D.

Ejemplo 12. Análisis ELISA de P21 El análisis se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: Colocación en placas de las células : • Tratar con tripsina, contar y sembrar células SJSA1 a la densidad de 7500 células/100 µ?/pocillo en placas de 96 pocilios un día antes del análisis.

• En el dia del estudio, reemplazar los medios con RPMI-FBS al 11% recién preparado (medios para análisis) . Agregar 90 µ? de los medios para análisis por pocilio. Los pocilios control sin células, recibieron 100 µ? de los medios .

Dilución de Péptido: Preparar concentraciones 10 mM de los péptidos en DMSO. Diluir en serie la concentración utilizando un esguema de dilución 1:3 para obtener soluciones 10, 3.3, 1.1, 0.33, 0.11, 0.03, 0.01 mM utilizando DMSO como diluyentes. Diluir los péptidos diluidos en DMSO en serie 33.3 veces utilizando agua estéril. Esto proporciona la variación de concentraciones de trabajo 10X. También prepar una mezcla de DMSO/agua estéril (DMSO al 3%) para los pocilios control.

• De esta forma el µ? de la variación de concentración de trabajo será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?. Mezclar bien en cada paso de dilución utilizando multicanal . • la fila H tuvo controles. H1-H3 recibirá 10 ul de los medios de análisis. H4-H9 recibirá 10 ul del vehículo de DMSO-agua al 3%. H10-H12 tendrá el control de medio solo sin células.

• Control positivo: el inhibidor de molécula pequeña HD 2, Nutlin-3a (10 mra) se utilizó como control positivo. Nutlin se diluyó utilizando el mismo esquema de dilución que el de los péptidos.

Adición de las concentraciones de trabajo a las células: Agregar 10 µ de la concentración deseada 10X al pocilio adecuado hasta alcanzar las concentraciones finales en un volumen total de 100 µ? en el pocilio. (10 µ? de péptido 300 µ? + 90 µ? de células en los medios = 30 µ? de concentración final en 100 µ? de volumen en los pocilios.) De esta forma, la variación de concentración final utilizada será 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?.

• Los controles incluirán pocilios que no obtuvieron péptidos pero que contuvieron la misma concentración de DMSO como la de los pocilios que contuvieron los péptidos y los pocilios que NO CONTUVIERON CÉLULAS. • 20 horas después de la incubación, aspirar los medios; lavar las células con PBS IX (sin Ca++/Mg++) y lisar en 60 µ? de tampón para lisis celular IX (tampón 10X de Cell Signaling technlogies diluido a IX y suplementado con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) en hielo durante 30 minutos.

• Someter a centrifugación las placas a una velocidad de 5000 rpm a 4°C durante 8 minutos; recolectar los sobrenadantes aclarados y congelar a -80°C hasta un uso adicional .

Estimación de las proteinas : • El contenido total de proteinas de los lisados se midió utilizando un kit para detección de proteinas BCA y los estándares BCA de Thermofisher . Típicamente, se esperaron aproximadamente 6-7 µg de proteina por pocilio.

• Utilizar 50 µ? del lisado por pocilio para ajustar el ELISA p21.

ELISA de p21 total humano: Se siguió el protocolo de análisis ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 50 µ? del lisado por cada pocilio, y cada pocilio se ajustó por triplicado.

Reactivos : • -Análisis de base célula (-)-Nutlin-3 (10 mm) : Cayman Chemicals, catálogo #600034 • -OptiME , Invitrogen catálogo #51985 • -Tampón de lisis para señalización celular (10X) , tecnología de señalización celular, Catálogo #9803 • -Tabletas (mini) del coctel inhibidor de proteasa, Roche Chemicals, catálogo #04693124001 -Tableta del coctel inhibidor de fosfatasa, Roche Chemicals, catálogo #04906837001 -Kit para ELISA de p21 total humana, R&D Systems, DYC 1047-5 -Solución STOP (HC1 1 ) , Cell Signaling Technologies, Catálogo #7002 Instrumentos: Microcentrifuga Eppendorf 5415D y lector de multiplacas para la lectura de absorbancia (Synergy 2) · Los resultados del ejemplo 12 se proporcionan en los datos de p21 en las figuras 7A, BA, 7C y 7D.

Ejemplo 13: Análisis para detección de caspasa 3: El análisis se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo general: Colocación en placas de células: tratar con tripsina, contar y sembrar células SJSA1 a la densidad de 7500 células/100 µ?/pocillo en placas de 96 pocilios un día antes del análisis. En el dia del estudio, reemplazar los medios con RPMI-FBS al 11% recién preparado (medios para análisis) . Agregar 180 µ en los medios para análisis por pocilio. Los pocilios control sin células, recibieron 200 µ de medios.

Dilución de péptido: Preparar concentraciones 10 mM de los péptidos en DMSO. Diluir en serie la concentración utilizando el esquema de dilución 1:3 para obtener 10, 3.3, 1.1, 0.33, 0.11, 0.03, 0.01 mM de soluciones utilizando DMSO como diluyentes. Diluir los péptidos diluidos en DMSO en serie 33.3 veces utilizando agua estéril. Esto proporciona una variación de concentraciones de trabajo 10X. También preparar una mezcla de DMSO/agua estéril (DMSO al 3%) para los pocilios control.

• De esta forma, los µ? de variación de las concentraciones de trabajo será 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?. Mezclar bien en cada paso de dilución utilizando multicanal. Agregar 20 ul de la concentración de trabajo 10X a los pocilios adecuados. la fila H tiene controles. H1-H3 recibirán 20 µ? de los medios para análisis. H4-H9 recibirán 20 µ? de vehículo de DMSO-agua al 3%. H10-H12 tendrán el control con medio sólo sin células.

· Control positivo: inhibidor de moléculas pequeñas HDM2, Nutlin-3a (10 mM) se utilizó como control positivo. Nutlin se diluyó utilizando el mismo esquema de dilución que el de los péptidos.

Adición de las concentraciones de trabajo a las células: • Agregar 10 uM de la concentración deseada 10X al pocilio adecuado hasta alcanzar las concentraciones finales en un volumen total de 100 uM en el pocilio. (10 µ? del péptido 300 µ? + 90 µ? de células en los medios = concentración final 30 µ? en un volumen de 100 µ? en los pocilios). De esta forma, la variación de concentración final utilizada será 30, 10, 3, 1, 0.3 y 0 µ?.

• Los controles incluirán pocilios que no obtuvieron péptidos pero que contuvieron la misma concentración de DMSO que la de los pocilios que contuvieron los péptidos, y los pocilios que NO CONTUVIERON CÉLULAS. • 48 horas después de la incubación, aspirar 80 µ? de los medios de cada pocilio; agregar 100 µ? del reactivo para análisis de Caspasa 3/7Glo (sistema para análisis Promega Caspase 3/7 glo, G8092) por pocilio, incubar con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.

• Leer en un lector de multiplacas Synergy Biotek para luminiscencia.

· Los datos se analizaron como la activación de caspasa 3 sobre las células tratadas con DMSO.

Los resultados del Ejemplo 13 se proporcionan en los datos p21 en las figuras 7A, 7B, 7C y 7D.

INCORPORACIÓN COMO REFERENCIA Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia al mismo grado que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se hubiera indicado especifica e individualmente para estar incorporada como referencia.

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un macrociclo peptidomimético caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las Tablas 1, 2, 3 ó 4.

2. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético es al menos aproximadamente 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las Tablas 1, 2, 3 ó 4, y el macrociclo no contiene un triazol o un tioéter.

3. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético es al menos aproximadamente 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las Tablas 1, 2, 3 ó 4.

4. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético es al menos aproximadamente 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las Tablas 1, 2, 3 ó 4.

5. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del macrociclo peptidomimético se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos en las Tablas 1, 2, 3 ó 4.

6. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético comprende una hélice.

7. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético comprende una hélice a.

8. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético comprende un aminoácido a, a-disustituido.

9. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético comprende un reticulante que enlaza las posiciones a a al menos dos aminoácidos.

10. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos es un aminoácido a, oí-disustituido .

11. El macrociclo peptidomimético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene la fórmula: Fórmula I en donde : cada A, C, D y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y D y E independiente opcionalmente incluyen un grupo de remate; B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido, [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituido con halo-; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituidos opcionalmente con R5; L es un ligador formador de macrociclos de la fórmula -L1-L2-; Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, o [-R4-K-R4-] n, cada uno sustituido opcionalmente con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02 o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -S02R5, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5, o parte de una estructura cíclica con un residuo D; R8 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R¾, o parte de una estructura cíclica con un residuo E, v y w son independientemente números enteros de 1- 1000; u es un número entero de 1-10; x, y y z son independientemente números enteros de 0-10; y n es un número entero de 1-5.

12. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque L no incluye un tioéter o un triazol.

13. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético comprende un reticulante que enlaza un grupo amino estructural de un primer aminoácido a un segundo aminoácido dentro del macrociclo peptidomimético.

14. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el macrociclo peptidomimético tiene la fórmula (IV) o (IVa): Fórmula (IV) Fórmula (IVa] en donde: cada A, C, D, y E es independientemente un aminoácido natural o no natural, y D y E independiente y opcionalmente incluyen un grupo de remate; B es un aminoácido natural o no natural, un análogo de aminoácido,wO [-NH-L3-CO-] , [-NH-L3-S02-] o [-NH-L3-] ; Ri y R2 son independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroalquilo o heterocicloalquilo, sin sustituir o sustituido con halo-; o parte de una estructura cíclica con un residuo E; R3 es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilalquilo, cicloarilo, o heterocicloarilo, sustituidos opcionalmente con R5; Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno , cicloarileno , heterocicloarileno, o [ -R4-K-R4- ] n, cada uno sustituido opcionalmente con R5; cada R4 es alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno o heteroarileno; cada K es 0, S, SO, S02, CO, C02, o C0NR3; cada R5 es independientemente halógeno, alquilo, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -S0R6, -S02R5, -C02R6, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; cada R6 es independientemente -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, una porción fluorescente, un radioisótopo o un agente terapéutico; R7 es -H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, cicloarilo o heterocicloarilo, sustituido opcionalmente con R5; v y w son independientemente números enteros de 1-1000; u es un número entero de 1-10; x, y y z son independientemente números enteros de 0-10; y n es un número entero de 1-5.

15. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque Li y L2 ya sea solos o en combinación no incluyen un tioéter o un triazol.

16. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 11, caractrizado porque Li y L2 son independientemente, alquileno, alquenileno o alquinileno.

17. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Li y L2 son independientemente C3-Ci0alquileno o alquenileno.

18. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque Li y L2 son independientemente, C3-C6alquileno o alquenileno.

19. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Ri y R2 son H.

20. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Ri y R2 son independientemente alquilo.

21. El macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque R{ y R2 son metilo .

22. Un método para trtamiento de cáncer en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1.

23. Un método para modular la actividad de p53 y/o HDM2 y/o HDMX en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1.

24. Un método para antagonizar la interacción entre p53 y HD 2 y/o entre las proteínas p53 y HDMX en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto un macrociclo peptidomimético de conformidad con la reivindicación 1.