ES2428869T3

ES2428869T3 - Compuestos de unión, compuestos inmunógenos y peptidomiméticos

Info

Publication number: ES2428869T3
Application number: ES06701606T
Authority: ES
Inventors: Peter Timmerman; Wouter Cornelis Puijk; Jelle Wouter Slootstra; Evert Van Dijk; Robbert Hans Meloen
Original assignee: Pepscan Systems BV
Current assignee: Pepscan Systems BV
Priority date: 2005-01-24
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2013-11-12
Anticipated expiration: 2026-01-24
Also published as: PT1844337E; SI1844337T1; AU2006206848A1; CA2595902C; CY1114441T1; PL1844337T3; CA2595902A1; EP1844337A1; NZ560504A; US7863239B2; JP5372380B2; US20080313749A1; JP2008529482A; WO2006078161A1; DK1844337T3; AU2006206848B2; EP1844337B1

Abstract

Peptidomimético de coriogonadotropina beta, hormona beta estimulante de folículos, hormona beta luteinizante, hormonabeta estimulante de tiroides, o gonadotropina-alfa-1,2, que comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos delbucle de la horquilla beta 3 (B3) de dicha coriogonadotropina beta (CNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSC),hormona beta estimulante de folículos (CTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQC), hormona beta luteinizante(CTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSC), hormona beta estimulante de tiroides(CTYRDFIYRTVEIPGCPLHVHPYFSYPVALSC), o gonadotropina-alfa-1,2 (CVAKSYNRVTVMGGFKVENHTAC), donde dosresiduos de aminoácidos han sido sustituidos por un primer y un segundo residuo de cisteína en el polipéptido, estascisteínas se fijan una a la otra a través de un soporte y donde cualquier residuo de cisteína en la secuencia natural secambia en un residuo que no es reactivo con el soporte, donde: - dicho soporte es una molécula (hetero)aromática, - dicho primer residuo de cisteína unida de soporte se introduce en la posición CysIV+ p localizado p residuos C-terminalesde la posición que corresponde a los aminoácidos CysIV en el bucle B3 tipo salvaje como se identifica en la tabla 13, donde15 5 p 12; - dicho segundo residuo de cisteína fijado al soporte se introduce en la posición CysV-q localizado q residuos N-terminalesde la posición que corresponde a los aminoácidos CysV en el bucle B3 tipo salvaje como se identifica en la tabla 13, donde4 q 12 y donde (p - q) es -3; -2, -1, 0, 1,2 o 3 y - la longitud de dicho polipéptido es desde el aminoácido en la posición CysIV + x a los aminoácidos en la posición CysV + y,donde -5 x 1 y 1 y 6 bajo la condición de que x + y >= -1, 0,1 o 2.

Description

Compuestos de unión, compuestos inmunógenos y peptidomiméticos

[0001] La invención se refiere al campo de la biología. Más específicamente, la invención se refiere a la detección, identificación y/o generación de moléculas de unión.

[0002] Interacciones entre moléculas de unión, que en general son biomoléculas, y sus ligandos correspondientes son fundamentales para la vida. Las células frecuentemente soportan o contienen moléculas receptoras que son capaces de interactuar o unirse de forma específica con otra molécula tal como por ejemplo una hormona, un péptido, un fármaco, un antígeno, una molécula efectora u otra molécula receptora; las enzimas se enlazan con su sustrato; las moléculas de anticuerpos y/o células T se enlazan con un antígeno, el ácido nucleico con proteína, etcétera. Por "interacción o unión" se hace referencia a que la molécula de unión y ligando se aproximan uno al otro en el rango de fuerzas moleculares, y pueden influir cada uno en otras propiedades. Esta aproximación lleva a la molécula de unión y a su ligando a través de varios estadios de reconocimiento molecular que comprenden grados crecientes de intimidad y efecto mutuo: estos se enlazan, sin embargo no siempre irreversiblemente.

[0003] Las moléculas de unión tienen capacidad de unión porque comprenden sitios de unión diferentes que permiten el reconocimiento del ligando en cuestión. El ligando, sucesivamente, tiene un sitio de unión correspondiente, y sólo cuando los dos sitios de unión pueden interactuar esencialmente por complementariedad espacial -- , las dos moléculas se pueden enlazar. Ni que decir tiene que, las moléculas al ser tridimensionales, los sitios de unión son de naturaleza tridimensional, frecuentemente una o más proyecciones o protuberancias de superficie de un sitio de unión corresponden a una o más cavidades o depresiones en la otra, formando una disposición tridimensional cerrada, a veces en una variedad de ajuste inducido. A veces, tal protuberancia comprende un único bucle de la molécula en cuestión, y es sólo esta protuberancia que forma esencialmente el sitio de unión. En este caso frecuentemente se denomina estos sitios de unión como comprendiendo un sitio de unión continuo o lineal, donde una mera parte lineal de la molécula en cuestión es en esencia responsable de la interacción de la unión. Esta terminología es muy usada para describir por ejemplo reacciones de antígenos-anticuerpos donde el antígeno comprende parte de una secuencia de proteína; un péptido lineal. Después frecuentemente se habla de un epítopo continuo o lineal, donde el sitio de unión (epítopo) de la molécula antígena se forma por un bucle de aminoácidos unidos consecutivamente. No obstante, sitios de unión continuos similares (aquí epitopo y sitio de unión se usan de forma intercambiable) se pueden encontrar con interacciones de antígeno-receptor (tal como con un receptor de células T), con interacciones de ligando-receptor tal como con receptores de hormonas y agonistas o antagonistas de los mismos, con interacciones de citocina-receptor o con por ejemplo interacciones de sustrato-enzima o fármaco-receptor, donde una parte lineal de una molécula es reconocida como el sitio de unión.

[0004] Más frecuentemente, no obstante, tal protuberancia o protuberancias y depresiones comprenden varias y distintas partes de la molécula en cuestión, y son las partes combinadas que esencialmente forman el sitio de unión. Comúnmente, se denomina tal sitio de unión que comprende distintas partes de la molécula en cuestión un sitio de unión o epitopo discontinuo o conformacional. Por ejemplo, los sitios de unión en proteínas que tienen no sólo una estructura primaria (la secuencia de aminoácidos de la molécula proteica), sino también estructura secundaria y terciaria (el plegamiento de la molécula en hélices alfa o láminas beta y su forma global), e incluso a veces estructura cuaternaria (la interacción con otras moléculas proteicas) pueden comprender en sus protuberancias o depresiones esenciales aminoácidos o secuencias peptídicas cortas que están apartadas en la estructura primaria pero se pliegan cercanamente entre sí en el sitio de unión. En sitios de unión lineales (continuos) los aminoácidos que median los contactos con el anticuerpo son típicamente localizados dentro de una parte de la estructura primaria normalmente no mayor de 15 aminoácidos de longitud. Los péptidos que cubren estas secuencias tienen afinidades a las proteínas objetivo que están aproximadamente en el rango mostrado por el ligando proteico intacto. En sitios de unión conformacionales (discontinuos) no obstante los residuos clave están en general distribuidos sobre dos o más regiones de unión, que están frecuentemente separadas en la estructura primaria. Tras el plegamiento, estas regiones de unión se pueden unir en la superficie de la proteína para formar un sitio de unión compuesto. Incluso si el sitio de unión completo media una interacción de alta afinidad, los péptidos que cubren sólo una región de unión, como se sintetiza en una exploración lineal de péptidos superpuestos, generalmente tienen afinidades muy bajas que frecuentemente no se pueden medir por ejemplo en ELISA normal o experimento Biacore.

[0005] Debido al papel fundamental que las moléculas de unión y sus ligandos tienen en la vida, hay siempre interés de expansión en la detección, identificación y/o generación de moléculas de unión. La percepción en la naturaleza de sitios de unión por ejemplo proporciona la posibilidad de diseñar compuestos capaces de interferir con la unión entre una molécula de unión y su ligando. Por otra parte, la generación de moléculas de unión que imitan los sitios de unión de moléculas (complejas) se desea para una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, péptidos que imitan un sitio de unión de una molécula proteica se adecuan para usos diagnósticos, profilácticos y/o terapéuticos. Tales péptidos son por ejemplo adecuados para uso como un agonista o antagonista para un par receptor-ligando.

[0006] Por otra parte, siempre hay un creciente interés en la detección, identificación y/o generación de compuestos inmunógenos. Compuestos inmunógenos son especialmente adecuados para obtener anticuerpos y/o células T de interés. Por otra parte, tales compuestos inmunógenos se adecuan para evocar una respuesta inmune en un huésped, esta respuesta inmune proporciona preferiblemente protección parcial o completa contra el desafío posterior con dicho compuesto inmunógeno y/o con un inmunógeno de donde se deriva dicho compuesto inmunógeno. Se generan compuestos preferiblemente inmunógenos que son capaces de proporcionar una respuesta inmune de protección parcial o completa en un huésped contra el desafío posterior con una molécula proteica de interés. Tales compuestos inmunógenos típicamente comprenden una secuencia peptídica que está completamente o en parte derivada de dicha molécula proteica de interés.

[0007] Métodos para seleccionar un compuesto de unión y/o compuesto inmunógeno de interés generalmente implican la producción de una pluralidad de sitios de unión putativos y/o compuestos inmunógenos y posterior incubación con una molécula de interés (tal como por ejemplo un ligando, un anticuerpo y/o una célula T) para encontrar un compuesto capaz de unir específicamente dicha molécula de interés. Un trabajo reciente en el campo de los péptidos es WO 84/03564, relacionado con un método de detección o de determinación de secuencias de aminoácidos antígenamente activas o péptidos en una proteína. Este trabajo, que prevé la así llamada tecnología Pepscan, implica la producción de una pluralidad de péptidos diferentes después de lo cual los péptidos sintetizados se evalúan con la molécula de unión en cuestión. Este método permite la detección de un sitio de unión continuo y/o epítopo continuo en una secuencia proteica o peptídica. La tecnología Pepscan entendida en un sentido amplio provee la evaluación o identificación de péptidos (sin embargo lineales) esencialmente idénticos a, análogos a o que imitan sitios de unión, sitios inmunógenos o ligandos de una naturaleza variada (mimotopes, Geyssen al, Mol. Immunol. 23:709-715,1986).

[0008] La tecnología Pepscan permite la identificación de secuencias peptídicas lineales que interactúan con moléculas receptoras, enzimas, anticuerpos, etcétera, de forma rápida y directa, permitiendo evaluar una gran cantidad de péptidos por su reactividad con la molécula de unión en cuestión con relativamente poco esfuerzo.

[0009] No obstante, la tecnología Pepscan no es adecuada para evaluar sitios de unión conformacionales o discontinuos. Por otra parte, la tecnología Pepscan no es adecuada para obtener péptidos con una característica deseada, dichos péptidos tienen una secuencia de aminoácidos que no es directamente derivada de la secuencia de aminoácidos primaria de una molécula proteica dada.

[0010] En WO 02131610 se describe un método para seleccionar sitios de unión discontinuos. Una biblioteca molecular es generada cuando un primer segmento se mancha muy cerca de un segundo segmento para formar una entidad de prueba. Varias entidades de prueba que comprenden segmentos diferentes son posteriormente seleccionadas por la presencia de un sitio de unión deseado. Este método es conveniente para seleccionar la presencia de una variedad de sitios de unión presentes dentro de un compuesto de interés. Los segmentos que son manchados muy cerca unos de otros son sintetizados o bien derivados de forma aleatoria de una secuencia de aminoácidos conocida de una molécula proteica. No obstante, si los segmentos son sintetizados de forma aleatoria, se necesita sintetizar una cantidad enorme de entidades de prueba siendo un trabajo laborioso y de larga duración. Por otro lado, si los segmentos son directamente derivados de la secuencia primaria de una molécula proteica de interés, se obtiene una colección más bien limitada puesto que no se producen péptidos con una secuencia de aminoácidos que no es derivada directamente de dicha secuencia de aminoácidos primaria de dicha molécula proteica. EP1452868 y Timmerman et al (Chembiochem 2005,6: 821-824) revelan la preparación de péptidos conformacionalmente limitados, que comprende el acoplamiento de una secuencia de aminoácidos a un soporte. Murali et al (Immunologic Res 1998,17: 163 -169) revisa aspectos de diseño basados en su estructura de péptidos terapéuticos immunológicamente activos. EP0467699 divulga un péptido de VIH conformacionalmente limitado para uso en el desarrollo de anticuerpos y vacunas. Meloen et al (Curr Prot Peptide Sci 2003,4: 253 - 260), Timmerman et al (Mol Div 2004,8: 81 -77), y Slootstra et al (Mol Div 1996,1: 87 - 96) se preocupan por el mapeo de epítopos en proteínas usando técnicas de selección Pepscan. Sun et al (Ann Rev Biophys Biomol Struct 1995,24: 269 - 292), Vit et al (Mol Endocrinol 2001,15: 681 - 694), y Darling et al (Biochemistry 2001,40: 577 - 585) se preocupan por las proteínas con nudo de cistina y describen, entre otros, la estructura tridimensional de estas proteínas. WO2003/106487 describe conjugados inmunógenos de VEGF para el uso en la terapia de tumores. WO2003/096488 se preocupa por el uso de péptidos derivados de la subunidad beta de hCG para inducir una respuesta de células T citotóxicas. Talwar et al (Immunol Rev 1999,171: 173 -192) y WO2001/11048 se preocupan por los anticuerpos contra hCG o FSH para el uso en la regulación de la natalidad y en la terapia del cáncer. La presente invención proporciona un peptidomimético de coriogonadotropina beta, hormona beta estimulante de folículos, hormona beta luteinizante, hormona beta estimulante de la tiroides, o gonadotropina-alfa-1,2, que comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos del bucle de la horquilla beta 3 (B3) de dicha coriogonadotropina beta (CNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSC), hormona beta estimulante de folículos (CTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQC), hormona beta luteinizante (CTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSC), hormona beta estimulante de la tiroides (CTYRDFIYRTVEIPGCPLHVHPYFSYPVALSC), o gonadotropina-alfa-1,2 (CVAKSYNRVTVMGGFKVENHTAC), donde dos residuos de aminoácidos han sido sustituidos por un primer y un segundo residuo de cisteína en el polipéptido, estas cisteínas se fijan una a la otra a través de un soporte y donde cualquier residuo de cisteína en la secuencia natural se cambia en un residuo que no es reactivo con el soporte, donde:

-: dicho soporte es una molécula (hetero)aromática,

-: dicho primer residuo de cisteína unida al soporte se introduce en la posición CysIV+ p localizada p residuos C-terminales desde la posición que corresponde al aminoácido CysIV en el bucle B3 tipo salvaje como se identifica en la tabla 13, donde 5 p s 12;

-: dicho segundo residuo de cisteína unido al soporte se introduce en la posición CysV - q localizada q residuos N-terminales desde la posición que corresponde a los aminoácidos CysV en el bucle B3 tipo salvaje como se identifica en en la Tabla 13, donde 4 s q s 12 y donde (p - q) es -3; -2, -1, 0, 1,2 o 3 y

-: la longitud de dicho polipéptido es desde el aminoácido en la posición CysIV + x hasta el aminoácido en la posición CysV + y, donde -5s x s 1 y 1 s y s 6 con la condición de que x + y = -1, 0,1 o 2. Basado en el criterio anterior la invención proporciona un peptidomimético de un elemento de la familia de la hormona beta de glicoproteína (GLHB) o la familia de la hormona alfa de glicoproteína (GLHA) .

[0011] La presente invención proporciona compuestos que son adecuados para selección de la presencia de un sitio de unión y/o sitio inmunógeno de interés. La invención proporciona compuestos que de una parte son al menos en parte basados en una molécula proteica dada, pero por otro lado necesariamente no contienen secuencias que son exactamente similares a (una parte de) la secuencia primaria de dicha molécula proteica. Un peptidomiméctico según la invención se puede preparar con un método donde al menos una secuencia derivada de la secuencia primaria de una molécula proteica de interés se usa para generar y seleccionar sistemáticamente compuestos de unión y/o compuestos inmunógenos. La invención proporciona compuestos inmunógenos y/o compuestos de unión cuyas propiedades son comparables a, o incluso mejores que, un sitio de unión y/o sitio inmunógeno de una molécula proteica original de interés. Un peptidomimético según la invención es conveniente para seleccionar características de unión deseadas y/o características inmunógenas. El uso de un soporte más frecuentemente produce péptidos con una estructura secundaria biológicamente pertinente, en comparación con péptidos libres lineales. Por otra parte, si se usa un soporte preferido, los péptidos producidos no necesitan ser protegidos antes de que se puedan unir al soporte, debido al hecho de que la formación de un primer enlace entre un péptido y un soporte acelera la formación de un segundo enlace entre dicho péptido y dicho soporte. Tal soporte preferido no necesita ser selectivamente funcional. Por lo tanto, se prefiere que las secuencias de aminoácidos seleccionadas se incorporen en péptidos, estos péptidos se acoplan a un soporte sin necesidad de protección voluminosa y procedimientos de desprotección. Dichos péptidos son preferiblemente acoplados a dicho soporte en la solución, más preferiblemente en una solución acuosa. El uso de una solución acuosa proporciona varias ventajas. Por ejemplo, el agua es económica, no tóxica y fácil de eliminar por secado en frío (en comparación a por ejemplo DMF y DMSO). Por otra parte, sales (tampón) se disuelven muy bien en agua y el agua también tiene buenas propiedades de solubilidad para la mayoría de péptidos (salvo aquellos muy hidrofóbicos).

[0012] Una vez que un compuesto con una propiedad de unión deseada y/o propiedad inmunógena es seleccionado, es por ejemplo adecuado para uso como un peptidomimético, un agonista, un antagonista, para preparar una composición inmunógena y/o para obtener más comprensión de las propiedades de una molécula proteica de interés (tal como por ejemplo la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria). Aunque es posible identificar un sitio de unión (discontinuo) y/o epítopo dentro de una molécula proteica de interés, se prefiere proporcionar un compuesto con al menos una característica mejorada, preferiblemente al menos una característica mejorada inmunógena y/o de unión, en comparación con una molécula proteica dada.

[0013] Un método útil para producir un peptidomimético según la invención que es adecuado para evaluar la presencia y/o identificación de un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión comprende:

-: seleccionar al menos un residuo de aminoácido en la secuencia primaria de al menos una molécula proteica, donde dicho residuo de aminoácido seleccionado está localizado preferiblemente al menos dos residuos de aminoácidos desde otros residuos de aminoácidos seleccionados, si los hay;

-: seleccionar al menos una secuencia flanqueante de al menos un residuo de aminoácido seleccionado, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del N-término y/o C-término de dicha al menos una molécula proteica, dicha secuencia flanqueante con una longitud de entre 2 y 48 residuos de aminoácidos; y

-: producir un péptido comprendiendo al menos una de dichas secuencias flanqueantes, dicho péptido teniendo una longitud de al menos 4 y como mucho 60 residuos de aminoácidos.

[0014] Dicha secuencia flanqueante puede incluir dicho residuo de aminoácido seleccionado. No obstante, esto no es necesario.

[0015] Un método para producir un peptidomimético según la invención implica la producción de al menos un peptido preferiblemente una pluralidad de péptidos - que comprende secuencias que son al menos en parte derivadas de una molécula proteica de interés. Preferiblemente esto implica "transposición" sistemática de secuencias flanqueantes (estas secuencias flanqueantes son derivadas de una molécula proteica de interés), dando como resultado una pluralidad de péptidos que son preferiblemente seleccionados por la presencia de un compuesto de unión y/o compuesto inmunógeno de interés. Variando la longitud, especie y/o cantidad de secuencias flanqueantes, una pluralidad de péptidos es producida. La cantidad de péptidos y la extensión de diferencias entre dichos péptidos se elige a voluntad, dependiendo de una aplicación particular.

[0016] Es particularmente útil producir una pluralidad de compuestos y seleccionar dicha pluralidad de compuestos por la presencia de un compuesto con al menos una característica deseada. Dicha pluralidad de compuestos preferiblemente comprende al menos 10, más preferiblemente al menos 100, de la forma más preferible al menos 1000 compuestos para mejorar la posibilidad de generar un compuesto con una característica deseada y preferiblemente dicha pluralidad de compuestos se selecciona por la presencia de un compuesto con una característica inmunógena deseada. Esto por ejemplo se realiza incubando una pluralidad de compuestos de la invención con una molécula de unión tal como un anticuerpo y/o célula T y determinando si al menos un compuesto es capaz de unirse específicamente a dicha molécula de unión.

[0017] En una forma de realización preferida un peptidomimético según la invención está provisto que es capaz de suscitar una respuesta inmune en un huésped. En esta forma de realización al menos un peptidomimético según la invención se administra a un animal no humano y se determina si una respuesta inmune es suscitada. De la forma más preferible, está provisto un peptidomimético según la invención que es capaz de suscitar una respuesta inmune en un huésped, esta respuesta inmune se dirige contra una molécula proteica de interés. Por lo tanto, se provee preferiblemente un peptidomimético según la invención que es capaz de suscitar una respuesta inmune en un huésped, tal como una respuesta celular y/o humoral durante la cual se producen anticuerpos y/o células T, estos anticuerpos y/o células T no son sólo capaces de unirse específicamente a dicho compuesto, sino que son también capaces de unirse específicamente a una molécula proteica de interés. Se descubrió que un peptidomimético según la invención es particularmente eficaz para generar y detectar tales compuestos de unión y/o compuestos inmunógenos. Preferiblemente, un compuesto es en primer lugar seleccionado durante un primer procedimiento de selección usando una molécula de unión tal como un anticuerpo y/o célula T antes de ser administrado a un animal no humano. Por lo tanto, un procedimiento en dos fases es preferido donde un peptidomimético según la invención es seleccionado in vitro en primer lugar, después de lo cual las propiedades inmunógenas de un candidato peptidomimético prometedor según la invención son posteriormente analizadas in vivo.

[0018] Un método para producir un peptidomimético según la invención es aplicable en cualquier molécula proteica dada de interés cuya secuencia primaria es al menos parcialmente conocida. Si se realiza un método para producir un compuesto inmunógeno y/o compuesto de unión, se prefiere seleccionar al menos un residuo de aminoácido a partir de una región expuesta a la superficie de dicha molécula proteica. Esto por supuesto sólo es posible si la estructura (secundaria, terciaria y/o cuaternaria) de dicha molécula proteica es al menos en parte conocida tal método no obstante no se limita a moléculas proteicas con al menos una estructura parcialmente conocida. Es también posible realizar el método con una molécula proteica con estructura (secundaria, terciaria y/o cuaternaria) desconocida. En este caso, por supuesto, residuos de aminoácidos de dicha molécula proteica se seleccionan al azar. Por selección de un residuo de aminoácido se entiende aquí que se considera un residuo de aminoácido. No necesita ser físicamente aislado o sintetizado.

[0019] Una vez un residuo de aminoácido es seleccionado, al menos una secuencia flanqueante de dicho residuo de aminoácido es posteriormente seleccionada. Una secuencia flanqueante es definida como varios residuos de aminoácidos consecutivos que se localizan dentro de cinco, preferiblemente dentro de tres, residuos de aminoácidos de dicho residuo de aminoácido seleccionado en la secuencia primaria de dicha molécula proteica de interés. Preferiblemente, dicha secuencia flanqueante se localiza directamente adyacente a dicho residuo de aminoácido seleccionado. Por lo tanto, si un residuo de aminoácido en la posición n es seleccionada, una secuencia flanqueante localizada en la dirección del N-término preferiblemente termina en la posición de aminoácidos n - 1, mientras una secuencia flanqueante localizada en la dirección del C-término preferiblemente comienza en la posición de aminoácidos n + 1. En un aspecto una secuencia flanqueante incluye dicho residuo de aminoácido seleccionado. Según este aspecto una secuencia flanqueante localizada en la dirección del N-término termina en la posición n, y/o una secuencia flanqueante localizada en la dirección del C-término comienza en la posición de aminoácidos n. Como se utiliza en este caso, una secuencia flanqueante se prevé que "empieza" en su residuo de aminoácido más N-terminal y una secuencia flanqueante se prevé que "termine" en su residuo de aminoácido más C-terminal. La longitud de dichas secuencias flanqueantes es preferiblemente entre 2 y 48 residuos de aminoácidos. Preferiblemente, dicha longitud es entre 4 y 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente entre 4 y 21 residuos de aminoácidos. La longitud de una secuencia flanqueante de un residuo de aminoácido seleccionado que se localiza en la dirección del N-término no necesita necesariamiente ser la misma que la longitud de una secuencia flanqueante del mismo residuo de aminoácido seleccionado que se localiza en la dirección del C-término, aunque esto es por supuesto posible. Por otra parte, secuencias flanqueantes diferentes del mismo residuo de aminoácido seleccionado pueden ser elegidas, dichas secuencias flanqueantes estando en la dirección del N-término y/o C-término, estas secuencias flanqueantes son de diferente longitud. Por lo tanto, en un aspecto un método para producir un peptidomimético según la invención también comprende la selección de al menos dos secuencias flanqueantes del mismo residuo de aminoácido seleccionado, dichas al menos dos secuencias flanqueantes estando en la misma dirección (del N-término o C-término).

[0020] Una vez que se selecciona al menos una secuencia flanqueante, se produce un péptido comprendiendo al menos una de dichas secuencias flanqueantes. Un péptido es definido aquí como un compuesto que comprende al menos dos residuos de aminoácidos consecutivos que son enlazados entre sí a través de un enlace peptídico. Además de residuos de aminoácidos naturales, un péptido de la invención puede comprender residuos de aminoácidos no naturales tales como por ejemplo residuos de D-aminoácidos. Un péptido comprendiendo al menos una de dichas secuencias flanqueantes es producido usando cualquier método conocido en la técnica, tal como por ejemplo síntesis de fase sólida. La longitud de dicho péptido es entre 4 y 50 residuos de aminoácidos. Preferiblemente no obstante, dicho péptido tiene una longitud de entre 6 y 25 residuos de aminoácidos, ya que los péptidos con esta longitud han demostrado proporcionar resultados de la prueba óptimos. También se proporciona por lo tanto un peptidomimético según la invención donde dicho péptido tiene una longitud de como mucho 25 residuos de aminoácidos. Preferiblemente una pluralidad de péptidos con secuencias flanqueantes diferentes es sintetizada, para seleccionar eficazmente un compuesto de unión y/o compuesto inmunógeno deseado.

[0021] Un péptido es preferiblemente acoplado a un soporte para obtener un peptidomimético según la invención con una estructura secundaria biológicamente pertinente. Por otra parte, péptidos unidos a un soporte son generalmente más estables en comparación con péptidos que están libres en solución. Una forma de realización por lo tanto proporciona un método según la invención que comprende contactar un péptido producido con un soporte para formar al menos una conexión entre dicho péptido y dicho soporte. Preferiblemente, al menos dos enlaces entre dicho péptido y un soporte se forman para obtener una estructura limitada y biológicamente pertinente. En una forma de realización particularmente preferida un péptido se acopla a un soporte, donde la formación de una primera conexión entre dicho péptido y dicho soporte acelera la formación de una conexión consecutiva. Esto proporciona la ventaja de que las cadenas laterales reactivas de dicho péptido no necesitan ser protegidas por un grupo protector durante la reacción de acoplamiento entre dicho péptido y dicho soporte. Una vez una primera conexión es formada, la segunda conexión se forma lo bastante rápidamente para evitar la formación de subproductos demasiado desfavorables.

[0022] Por lo tanto, se describe un método para producir un peptidomimético según la invención que es conveniente para evaluar la presencia y/o identificar un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión, el método comprendiendo:

-: seleccionar al menos una secuencia flanqueante de al menos un residuo de aminoácido seleccionado, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del N-término y/o C-término de dicha al menos una molécula proteica, dicha secuencia flanqueante con una longitud de entre 2 y 48 residuos de aminoácidos;

-: producir un péptido comprendiendo al menos una de dichas secuencias flanqueantes y al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte, dicho péptido teniendo una longitud de al menos 4 y como mucho 50 residuos de aminoácidos; y

-: contactar dicho péptido con dicho soporte para formar al menos dos enlaces entre dicho péptido y dicho soporte, donde la formación de un enlace acelera la formación de un enlace consecutivo.

[0023] Los péptidos producidos son preferiblemente contactados con soportes para formar al menos dos enlaces entre dicho péptido y dicho soporte, donde la formación de un enlace entre dicho péptido y dicho soporte acelera la formación de un enlace consecutivo entre dicho péptido y dicho soporte. Una vez que un péptido se une a un soporte, su estructura es preferiblemente al menos en parte diferente de la estructura de dicho péptido cuando está libre en la solución. El uso de un soporte produce un peptidomimético según la invención con una estructura secundaria biológicamente pertinente. Por otra parte, el compuesto de péptido-soporte resultante es generalmente más estable en comparación con péptidos libres. Se ha demostrado que la estructura fija de un péptido unido a un soporte es especialmente adecuada cuando dicho péptido unido al soporte debe ser usado como un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión tal como un ligando, agonista o antagonista. Preferiblemente cada péptido de una pluralidad dada de péptidos se acopla a esencialmente la misma clase de soporte, permitiendo la comparación directa entre los péptidos individuales de dicha pluralidad de péptidos. Si se usa la misma clase de soporte, las diferencias entre varios compuestos que comprenden dicho soporte y péptido son más propensas a ser atribuibles a las diferencias entre los péptidos. Un conjunto que comprende una pluralidad de peptidomiméticos según la invención, permite una selección rápida de compuestos prometedores de entre muchos compuestos de prueba.

[0024] En un aspecto se usa un método para producir un peptidomimético según la invención donde dichos al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte son idénticos. Esto proporciona la ventaja de que al menos dos enlaces entre el péptido y un soporte están formados bajo las mismas condiciones de reacción. Por facilidad de unión, se prefiere que el péptido comprenda al menos una funcionalidad SH. Más preferido, dichos al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte son dos funcionalidades SH. Una funcionalidad SH es definida aquí como una parte de un péptido (preferiblemente un residuo de aminoácido) que comprende un grupo sulfhidrilo o tiol (un grupo SH). No obstante, otros grupos son posibles. Es además preferido que dicha al menos una funcionalidad SH sea un residuo de cisteína. De la manera más preferida, dichos al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte son residuos de cisteína. En un aspecto dichos grupos capaces de reaccionar con un soporte se localizan en la primera posición de aminoácidos de dicho péptido y en la última posición de aminoácidos de dicho péptido. En otro aspecto dichos grupos capaces de reaccionar con un soporte los cuales se localizan en la primera posición de aminoácidos y en la última posición de aminoácidos de dicho péptido son residuos de cisteína. En un aspecto, un método para producir un peptidomimético según la invención comprende producir un péptido donde el primer y último residuos de aminoácidos de dicho péptido son cisteínas. Es también posible que al menos uno de dichos grupos capaces de reaccionar con un soporte se localicen en la secuencia peptídica, como se describirá con más detalle en toda esta solicitud.

[0025] Un péptido comprendiendo al menos una secuencia flanqueante se acopla a un soporte para obtener un peptidomimético estable según la invención con actividades biológicas deseadas. En principio, cualquier soporte es conveniente. Preferiblemente no obstante se usa el soporte por el cual la formación de un primer enlace entre un péptido y un soporte acelera la formación de un segundo enlace. En una forma de realización preferida al menos un enlace entre un péptido y un soporte comprende un enlace de tioéter. En un método, un péptido se acopla a un compuesto (hetero)aromático, el cual preferiblemente comprende al menos dos sustituyentes de halógeno bencílico, preferiblemente un halometilareno. Preferiblemente, un péptido se acopla a un bis(bromometil)benceno, un tris(bromometil)benceno, un tetra(bromometil)benceno o un derivado. De la forma más preferible un péptido según la invención se acopla a meta-1,3bis(bromometil)benceno (m-T2), orto-1,2-bis(bromometil)benceno (o-T2), para-1,4-bis(bromometil)benceno (p-T2), meta-1,3bis(bromometil)piridina (m-P2), 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno (T3) o meta-1,3-bis(bromometil)-6- azidobenceno (m-T3-N3).

[0026] Una reacción de sustitución nucleofílica como se describe en WO 2004/077062 se puede realizar para acoplar un péptido según la invención a un soporte. Tal reacción de acoplamiento implica una reacción de sustitución nucleofílica donde una molécula con una funcionalidad nucleofílica libre reacciona con un soporte. Dicha funcionalidad nucleofílica preferiblemente comprende un grupo tiol o sulfhidrilo. Los tioles son nucleófilos eficaces para la sustitución en átomos de carbono saturados. En general no es difícil proporcionar una molécula con una funcionalidad nucleofílica. Por ejemplo, un péptido o peptidomimético es fácilmente funcionalizado con una fracción de tiol por incorporación de un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos peptídica.

[0027] Por supuesto, varias otras funciones nucleofílicas, como aminoácidos con una fracción de alcohol (-OH) o una fracción de amina (-NH), pueden ser de forma similar incorporados en un péptido de la invención. No obstante, debe ser enfatizado que la química requerida para la reacción de acoplamiento de un alcohol o amina en general no permite usar péptidos desprotegidos, a diferencia de un método provisto que usa péptidos funcionalizados con SH. Por lo tanto, un péptido para uso en la invención preferiblemente comprende al menos dos funciones de SH, preferiblemente al menos dos grupos libres de sulfhidrilo de cisteína. Un método para producir un peptidomimético según la invención permite el uso de un péptido desprotegido donde ninguna de las cadenas laterales de aminoácidos son protegidas o tratadas de otra manera para prevenir la participación indeseada en la reacción de acoplamiento. Así, un método para producir un peptidomimético según la invención preferiblemente comprende contactar un péptido esencialmente desprotegido de la invención con un soporte. De manera importante, un método para producir un peptidomimético proporcionado aquí usando un péptido desprotegido ahorra tiempo, esfuerzo y dinero porque no requiere protección en pasos múltiples/pasos de desprotección.

[0028] Un péptido preferiblemente acoplado a un soporte por al menos dos reacciones de sustitución nucleofílicas donde dicho péptido tiene al menos dos funciones nucleofílicas libres que forman dos uniones o enlaces con una molécula de soporte. Por ejemplo, dicho péptido reacciona con dos, o más, átomos de carbono saturados de un soporte, dicho átomo de carbono siendo parte de un grupo reactivo. Una sustitución nucleofílica puede también ser un proceso intermolecular cuando el grupo nucleófilo y de salida son parte de una única molécula o entidad molecular, un soporte es preferiblemente provisto de al menos una molécula a través de al menos una reacción de sustitución nucleofílica intramolecular. Procesos intramoleculares tienen una entropía bastante más favorable que las reacciones intermoleculares análogas porque no es necesario que se unan dos moléculas separadas.

[0029] Una característica común de una reacción nucleofílica que se produce en el carbono saturado, es que el átomo de carbono es casi siempre conectado a un heteroátomo, que es un átomo diferente del carbono o hidrógeno. Además, el heteroátomo es normalmente más electronegativo que el carbono y es también el grupo de salida denominado (L) en la reacción de sustitución. El grupo de salida comienza con el par electrónico por el que estaba originalmente conectado al átomo de carbono. Preferiblemente, se usa un soporte que contiene al menos dos grupos de salida para facilitar la formación de al menos dos enlaces con al menos un péptido. La facilidad con la cual un grupo de salida comienza se puede relacionar con la basicidad de este grupo; bases débiles son en general buenos grupos de salida porque son capaces de alojar el par electrónico eficazmente. La reactividad de un grupo reactivo es en gran medida determinada por la tendencia de un grupo de salida para comenzar. Otro factor que tiene cierto apoyo en la reactividad de un grupo reactivo es la resistencia del enlace entre el grupo de salida y el átomo de carbono, puesto que este enlace debe romperse si se va a realizar la sustitución. Así, preferiblemente, un soporte que comprende al menos dos grupos de salida buenos se usan en un método para la producción de un peptidomimético según la presente invención. Grupos de salida buenos son en general las bases conjugadas de ácidos fuertes. Los grupos de salida más importantes son bases conjugadas de ácidos con valores pKa debajo de 5. Grupos de salida particularmente interesantes incluyen iones de haluro tales como I-, Br-, y Cl-. Un enlace de carbono-halógeno (C-X) en un alquil haluro es polarizado, con una carga positiva parcial en el carbono y una carga negativa parcial en el halógeno. Así, el átomo de carbono es susceptible de ataque por un nucleófilo (un reactivo que lleva un par de electrones) y el halógeno sale como el ión haluro (X), aceptando los dos electrones del enlace C-X. En un aspecto, un grupo reactivo comprende un átomo de carbono susceptible de ataque por un nucleófilo donde dicho grupo reactivo comprende un enlace de carbono-halógeno. Preferiblemente, un soporte que comprende al menos dos de tales grupos reactivos se utiliza para reaccionar con un péptido funcionalizado di-SH como nucleófilo. Se describe un método para producir un peptidomimético según la invención donde un péptido se acopla a un soporte que comprende un halogenoalcano. Halogenoalcanos (también conocidos como haloalcanos o alquil haluros) son compuestos con un átomo de halógeno (flúor, cloro, bromo o yodo) unido a uno o más átomos de carbono en una cadena. Ejemplos son soportes dihalogenados, que comprenden dos átomos de halógeno, y soportes tri- y tetrahalogenados para limitar conformacionalmente la síntesis de constructos de péptidos que consisten en uno o más segmentos de péptidos en bucle. En general, un buen grupo de salida es electronegativo para polarizar el átomo de carbono, es estable con un par extra de electrones una vez que ha salido, y es polarizable, para estabilizar el estado de transición. A excepción del yodo, todos los halógenos son más electronegativos que el carbono. Cloro y bromo tienen electronegatividades bastante similares y polarizan el enlace con el carbono de forma bastante similar. Cuando se ionizan, ambos son bases muy débiles con Br- siendo el más débil uno de los dos. Ión de bromuro es también más polarizable debido a su tamaño más grande. Por lo tanto, un método es ventajosamente practicado usando un soporte que comprende al menos dos átomos de Cl, siendo más preferido el uso de un soporte que comprende al menos un átomo de Cl y al menos un átomo de Br e incluso más preferido el uso un soporte que comprende al menos dos átomos de Br.

[0030] Además, en una reacción de sustitución nucleofílica, la estructura del sustrato tiene una función tan importante como la naturaleza del grupo de salida. Por ejemplo, si un nucleófilo ataca la parte trasera del carbono, la reacción se desarrolla sin obstáculos si el grupo de salida se conecta a un metilo, donde los hidrógenos dejan bastante superficie para atacar al carbono. Como este carbono se vuelve más sustituido, grupos más grandes obstaculizan la trayectoria que el nucleófilo debe seguir para desplazar el grupo de salida. Por estas razones, es también ventajoso que un soporte comprenda al menos dos grupos de halometilo.

[0031] En un aspecto, un soporte comprende un polieno conjugado, también conocido como compuesto aromático, o areno, que dispone de al menos dos grupos reactivos. Un compuesto aromático es plano, con nubes cíclicas de electrones pi deslocalizados por encima y por debajo del plano de la molécula. Preferiblemente, un soporte molecular comprende al menos dos sustituyentes de halógeno bencílico, como por ejemplo grupos halometilo. Ejemplos adecuados incluyen, pero no están limitados, a di(halometil)benceno, tri(halometil)benceno o tetra(halometil)benceno y derivados de los mismos. La ventaja de un sustituyente de halógeno bencílico debe ser principalmente buscada en la estabilidad especial asociada a la resonancia de polienos conjugados conocidos como compuestos aromáticos; un átomo de halógeno bencílico tiene una tendencia incluso más fuerte a dejar un carbono sobre el que se produce una reacción de sustitución nucleofílica.

[0032] La reacción se produce exitosamente con una variedad de compuestos aromáticos que llevan al menos dos grupos de halometilo. Estos grupos se pueden situar en la posición bien orto, meta, o para. El efecto catalítico intramolecular como se ha descrito anteriormente es diferente para cada modo de acoplamiento porque para y metaciclofanos son generalmente más tensados que los ortociclofanos. También se proporcionan todos los otros compuestos (hetero)aromáticos con al menos dos grupos de halometilo en posición orto-,meta-, o para- para la síntesis de un soporte con al menos una estructura de péptido en bucle.

[0033] Soportes moleculares adecuados para el uso en un método para la producción de un peptidomimético según la invención también incluyen compuestos aromáticos policíclicos con estructuras anulares más grandes o más pequeñas. No obstante, un soporte para uso en un método para la producción de un peptidomimético según la invención no se limita a hidrocarburos. En cambio, un método para producir un peptidomimético proporcionado es también adecuadamente practicado usando un soporte aromático heterocíclico - una molécula cíclica con al menos un átomo diferente del carbono en la estructura anular, más frecuentemente nitrógeno, oxígeno o azufre. Ejemplos incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, -3-pirrolina, piridina, pirimidina y derivados de los mismos. El soporte aromático heterocíclico preferido incluye pero de forma no limitativa aquellos que comprenden al menos dos grupos de halometilo. Un soporte preferido es meta-dibromo-piridina.

[0034] Por ejemplo, un método para producir un peptidomimético proporcionado comprende el uso de un soporte que se basa en o que consiste en estructuras de anillos aromáticos múltiples, tales como compuestos de anillos aromáticos fusionados. Dos anillos aromáticos que comparten un enlace de carbono-carbono se dice que están fusionados. Soportes de anillos aromáticos fusionados adecuados incluyen por ejemplo naftaleno, antraceno o fenantreno y derivados de los mismos, a condición de que contengan al menos dos grupos reactivos. Preferiblemente, un soporte de anillo aromático fusionado comprende al menos dos grupos reactivos donde cada grupo contiene un átomo de halógeno bencílico altamente reactivo, por ejemplo un grupo de halometilo.

[0035] Moléculas que comprenden sistemas conjugados o aromáticos múltiples donde los sistemas no comparten un par de átomos de carbono son también útiles como molécula de soporte. Por ejemplo, un soporte comprende un soporte multianillo o de anillo fusionado, por ejemplo se puede evaluar un soporte donde los anillos aromáticos, por ejemplo benceno, se conectan directamente a través de un enlace de carbono-carbono. Alternativamente, dichos anillos se conectan a través de un enlazador que comprende al menos un átomo. Ejemplos de soportes adecuados en un método de la invención se dan en las figuras 4,5 y 6. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar qué versiones de estas moléculas usar. Desde un punto de vista comercial, un soporte adecuado para producir un peptidomimético según la invención está preferiblemente disponible comercialmente a un coste relativamente bajo y se puede obtener en grandes cantidades. Por ejemplo, el soporte de dibromo 1,3-bis(bromometil)benceno está siendo habitualmente vendido por sólo alrededor de 5 euros por gramo.

[0036] Un método como se describe en WO 2004/077062 así permite el acoplamiento simple y directo de un péptido a un soporte donde un primer y segundo grupo reactivo son usados. La formación de un primer enlace acelera la formación de un enlace consecutivo. Por lo tanto, la formación de un primer enlace produce una cascada de reacciones donde la formación de un primer enlace, también referido como un enlace o conexión (química), a través de un primer grupo reactivo aumenta la reactividad de un segundo grupo reactivo, etcétera. Dichas reacciones químicas implican cambios en grupos funcionales mientras el esqueleto molecular del soporte permanece esencialmente invariado. Una ventaja de un método como se describe en WO 2004/077062 es que péptidos esencialmente desprotegidos se pueden acoplar a un soporte y el soporte no necesita ser selectivamente funcionalizado. Por otra parte, un método como se describe en WO 2004/077062 permite el acoplamiento de un péptido en una solución acuosa, mientras que otros procedimientos de acoplamiento conocidos son frecuentemente realizados en solventes orgánicos a través de múltiples ciclos de protección-desprotección. Preferiblemente por lo tanto, se usa un método para producir un peptidomimético según la presente invención, donde un péptido se acopla a un soporte donde la formación de un primer enlace entre dicho péptido y dicho soporte acelera la formación de un segundo enlace entre dicho péptido y dicho soporte. De forma más preferida, se usa un método para producir un peptidomimético según la invención donde dicho péptido se acopla a un soporte en solución. De la forma más preferible, se usa una solución acuosa.

[0037] A continuación se describe un ejemplo esquemático no limitativo. En este ejemplo dos residuos de aminoácidos de una molécula proteica de interés son seleccionados. Dichos residuos de aminoácidos son preferiblemente ambos seleccionados de una región expuesta a la superficie de dicha molécula proteica. Dichos residuos de aminoácidos seleccionados son preferiblemente al menos dos residuos de aminoácidos localizados entre sí de modo que una secuencia flanqueante de un primer residuo de aminoácido seleccionado se puede seleccionar sin incluir un segundo residuo de aminoácido seleccionado. En este ejemplo esquemático, la secuencia primaria de (parte de) una molécula proteica se representa por la secuencia X1 - X24 (X representa cualquier residuo de aminoácido):

Secuencia primaria X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24

[0038] Posteriormente, residuos de aminoácidos X10 y X15 son por ejemplo seleccionados. Luego, las siguientes secuencias flanqueantes son por ejemplo elegidas:

Secuencias flanqueantes de X10: X5 X6 X7 X8 X9 y X11 X12 Secuencias flanqueantes de X15: X13 X14 y X16 X17 X18 X19 X20

[0039] Posteriormente, los péptidos son producidos comprendiendo al menos una de dichas secuencias flanqueantes y al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte. En este ejemplo, dichos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte son dos residuos de cisteína, que son el primer y último residuos de aminoácidos de dicho péptido. Por supuesto, muchos grupos alternativos se pueden usar y las posiciones de dichos grupos dentro de dicho péptido pueden ser variadas.

[0040] En este ejemplo los siguientes péptidos son por ejemplo generados:

Péptidos que comprenden 1 secuencia flanqueante:

[0041]

CX5 X6 X7 X8 X9 C CX11 X12 C CX13 X14 C CX16 X17 X18 X19 X20 C

Péptido que comprende 2 secuencias flanqueantes:

[0042]

CX5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9 C CX5 X6 X7 X8 X9 X11 X12 C CX5 X6 X7 X8 X9 X13 X14 C CX5 X6 X7 X8 X9 X16 X17 X18 X19 X20 C

CX11 X12 X5 X6 X7 X8 X9 C CX11 X12 X11 X12 C CX11 X12 X13 X14 C CX11 X12 X16 X17 X18 X19 X20 C

CX13 X14 X5 X6 X7 X8 X9 C CX13 X14 X11 X12 C CX13 X14 X13 X14 C CX13 X14 X16 X17 X18 X19 X20 C

CX16 X17 X18 X19 X20 X5 X6 X7 X8 X9 C CX16 X17 X18 X19 X20 X11 X12 C CX16 X17 X18 X19 X20 X13 X14 C CX16 X17 X18 X19 X20 X16 X17 X18 X19 X20 C

[0043] Algunos péptidos posibles que comprenden 3 secuencias flanqueantes:

CX5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9C CX5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9X11 X12 C CX5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9X13 X14 C CX5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9X16 X17 X18 X19 X20 C

CX5 X6 X7 X8 X9X11 X12 X5 X6 X7 X8 X9C

CX5 X6 X7 X8 X9X11 X12 X11 X12 C CX5 X6 X7 X8 X9X11 X12 X13 X14 C CX5 X6 X7 X8 X9X11 X12 X16 X17 X18 X19 X20 C

CX5 X6 X7 X8 X9X13 X14 X5 X6 X7 X8 X9 C CX5 X6 X7 X8 X9X13 X14 X11 X12 C CX5 X6 X7 X8 X9X13 X14 X13 X14 C CX5 X6 X7 X8 X9X13 X14 X16 X17 X18 X19 X20 C

CX5 X6 X7 X8 X9X16 X17 X13 X19 X20 X5 X6 X7 X8 X9 C CX6 X6 X7 X8 X9X16 X17 X18 X19 R20 X11 X12 C CX5 X6 X7 X8 X9X16 X17 X18 X19 X20 X13 X14 C CX5 X6 X7 X8 X9X16 X17 X18 X19 X20 X16 X17 X18 X19 X20 C

CX11 X12 X5 X6 X7 X8 X9 X5 X6 X7 X8 X9 C CX11 X12 X6 X6 X7 X8 X9X11 X12 C CX11 X12 X5 X6 X7 X8 X9X13 X14 C CX11 X12 X5 X6 X7 X8 X9X16 X17 X18 X19 X20 C

CX11 X12 X11 X12 X5 X6 X7 X8 X9C CX11 X12 X11 X12 X11 X12 C CX11 X12 X11 X12 X13 X14 C CX11 X12 X11 X12 X16 X17 X18 X19 X20 C etcétera

[0044] Péptidos producidos son posteriormente preferiblemente acoplados a un soporte para generar un peptidomimético según la presente invención. Preferiblemente, una pluralidad de diferentes péptidos se acoplan a soportes para producir una

pluralidad de peptidomiméticos.

[0045] Será evidente que combinaciones adicionales de tres secuencias flanqueantes son posibles en el ejemplo esquemático anteriormente mencionado. Por otra parte, otros péptidos que comprenden más de tres secuencias flanqueantes pueden ser diseñados. No obstante, la longitud total de los péptidos preferiblemente no excede de 50 residuos de aminoácidos.

[0046] Además, varias formas de realización de la invención implican la selección de secuencias flanqueantes de varias longitudes diferentes. Por ejemplo, en el ejemplo esquemático anteriormente mencionado las siguientes secuencias flanqueantes de X10 son por ejemplo seleccionadas:

X1 X2 X3 X4 X6 X6 X7 X8 X9 y/o X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 y/o X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 y/o X4 X5 X6 X7 X8 X9 y/o X5 X6 X7 X8 X9 y/o X6 X7 X8 X9 y/o X7 X8 X9 y/o X8 X9 y/o X9 y/o X11 X12 X13 y/o X11 X12 y/o X11

[0047] Variando la clase, longitud y cantidad de secuencias flanqueantes, péptidos de diferentes tipos y/o longitudes son producidas. Preferiblemente, péptidos entre 4-25 residuos de aminoácidos son generados.

[0048] El número de residuos de aminoácidos seleccionados de una molécula proteica dada es variable y depende de una aplicación particular. En una forma de realización preferida al menos dos residuos de aminoácidos son seleccionados. Un método según la invención es así proporcionado donde al menos dos residuos de aminoácidos en la secuencia primaria de dicha al menos una molécula proteica son seleccionados. En vista de la eficacia, como mucho cinco residuos de aminoácidos son preferiblemente seleccionados. Preferiblemente, tres o cuatro residuos de aminoácidos son seleccionados. En una forma de realización particularmente preferida dos residuos de aminoácidos son seleccionados.

[0049] Claramente es también posible realizar un método para producir un peptidomimético según la invención con un residuo de aminoácido seleccionado de una molécula proteica. En este caso un péptido comprende al menos una secuencia flanqueante de dicho residuo de aminoácido seleccionado que se localiza en la dirección del N-término de dicha molécula proteica y/o al menos una secuencia flanqueante de dicho un residuo de aminoácido seleccionado que se localiza en la dirección del C-término de dicha molécula proteica. Por supuesto, como se indica más arriba, varias secuencias flanqueantes de diferente longitud pueden ser usadas.

[0050] El número y longitud de las secuencias flanqueantes seleccionadas dependen de la aplicación particular. Preferiblemente, un péptido se produce que comprende al menos dos secuencias flanqueantes. Dichas secuencias flanqueantes pueden ser diferentes entre sí, o pueden ser iguales. En un aspecto al menos dos secuencias flanqueantes del mismo residuo de aminoácido seleccionado se incorporan en un péptido. En otro aspecto no obstante un péptido se produce que comprende una secuencia flanqueante de un primer residuo de aminoácido seleccionado y una secuencia flanqueante de un segundo residuo de aminoácido seleccionado.

[0051] En un método para producir un peptidomimético según la invención se produce un péptido que comprende al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte. Preferiblemente dichos grupos comprenden al menos un grupo SH, preferiblemente al menos un residuo de cisteína, porque un grupo SH es especialmente adecuado para el acoplamiento de un péptido a un soporte que comprende una molécula (hetero)aromática. Se prefiere el uso de un soporte que comprende una molécula (hetero)aromática (preferiblemente comprendiendo al menos un sustituyente de halógeno bencílico), como ya se ha indicado más arriba. Si un grupo que comprende al menos un grupo SH (por ejemplo un residuo de cisteína) se usa en una reacción de acoplamiento de un péptido con un soporte, se prefiere que dicho péptido sea al menos en parte desprovisto de otros residuos de cisteína disponibles. Un (residuo) de cisteína disponible es definido como una cisteína cuyo grupo SH es capaz de reaccionar con otro grupo. Por lo tanto, residuos de cisteína cuyo grupo SH no es capaz de reaccionar con otro grupo, por ejemplo porque está provisto de un grupo protector, no están cubiertos mediante el término "cisteína disponible". Si un péptido comprende otras cisteínas disponibles, tales otras cisteínas disponibles podrían reaccionar con el soporte en vez de dicho al menos un grupo que estaba destinado a reaccionar con dicho soporte. De esta manera, enlaces imprevistos entre dicho péptido y dicho soporte podrían ser formados. Además, dichas otras cisteínas disponibles podrían formar un enlace de disulfuro con dicho grupo incluyendo un grupo SH que estaba destinado a reaccionar con dicho soporte. En este caso una reacción de acoplamiento entre dicho péptido y dicho soporte podría también ser distorsionada. Estos problemas son al menos en parte evitados cuando al menos un residuo de cisteína presente en una región flanqueante se sustituye por un grupo que es incapaz de formar un enlace con otras fracciones que contienen grupo sulfhidrilo. En un aspecto, esto se realiza con grupos protectores o miméticos. Por ejemplo, se usa una cisteína que se protege con un grupo protector separable, tal como por ejemplo un Cys(StBu) o, de la forma más preferible, un grupo de cisteína-(acetamidometilo) (Cys(Acm)). Después de la fijación de un péptido a un soporte para producir un peptidomimético según la invención, el grupo protector es fácilmente eliminado, por ejemplo por tratamiento reductivo. Por ejemplo, se usa 1,4-DDT o etano ditiol. Es también posible reemplazar un residuo de cisteína de una secuencia flanqueante por una unidad bioisostérica. Una unidad bioisostérica es definida como una funcionalidad con tamaño similar y propiedades fisicoquímicas.

[0052] De la forma más preferible al menos una cisteína en al menos una de dichas secuencias flanqueantes se sustituye por otro residuo de aminoácido que es no reactiva con el soporte, por ejemplo un residuo de alanina. Por tanto es útil un método para producir un peptidomimético según la invención donde al menos una cisteína en al menos una de dichas secuencias flanqueantes se sustituye por otro residuo de aminoácido. De la forma más preferible todas las cisteínas en todas las secuencias flanqueantes que se incorporan en un péptido se sustituyen por otros residuos de aminoácidos que no son reactivos con el soporte que se usa, para prevenir la fijación de dicho péptido al soporte a través de un grupo diferente de los dos grupos con un grupo SH que se destinan a enlazarse con el soporte.

[0053] Preferiblemente, péptidos de varias longitudes diferentes se sintetizan para proporcionar una recogida más diversa de compuestos de unión y/o compuestos inmunógenos potenciales. Interacciones entre moléculas de unión e interacciones inmunógenas son frecuentemente muy específicas. Por lo tanto, no sólo la secuencia de un péptido sino también su longitud es frecuentemente pertinente si una selección para una interacción específica es realizada. Es por lo tanto útil un método para producir un peptidomimético según la invención que comprende producir al menos dos péptidos de diferente longitud. De la forma más preferible, una pluralidad de péptidos con una longitud de entre 6 y 25 residuos de aminoácidos es generada. Si la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria de una molécula proteica de interés es conocida, es además preferido seleccionar al menos un residuo de aminoácido desde una región expuesta a la superficie de dicha molécula proteica.

[0054] Si no obstante la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria de una molécula proteica de interés no es, o sólo parcialmente, conocida se prefiere realizar una selección preliminar. En este caso una pluralidad de péptidos superpuestos es preferiblemente sintetizada los cuales tienen esencialmente la misma longitud. Preferiblemente 2, 3 o 4 grupos de péptidos son sintetizados, donde un conjunto de péptidos comprende péptidos de aproximadamente la misma longitud. Por ejemplo, dos conjuntos de péptidos son producidos donde un conjunto comprende péptidos con una longitud de aproximadamente 8 residuos de aminoácidos y donde el otro conjunto comprende péptidos con una longitud de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos. Por consiguiente, dicha pluralidad de péptidos superpuestos (que es preferiblemente acoplada a un soporte) se evalúa para una funcionalidad deseada (por ejemplo su capacidad de unión a un compuesto de unión de interés tal como por ejemplo un anticuerpo, célula T, ligando o receptor). Si uno o más péptidos resultan ser candidatos prometedores, es preferiblemente determinado desde qué región(es) de dicha molécula proteica dichos candidatos prometedores parecen ser derivados. Una vez dicha(s) región(es) de dicha molécula proteica es/son identificada(s), un segundo procedimiento es preferiblemente seguido. En este segundo procedimiento un método para producir un peptidomimético según la invención es realizado nuevamente. Esta vez al menos un residuo de aminoácido se selecciona que está presente en al menos una de la(s) región(es) mencionada(s) arriba identificada(s) en el primer procedimiento.

[0055] En un aspecto, un péptido que resulta ser un candidato prometedor se combina con un segundo péptido (con fórmula (X)y). Dicho segundo péptido es preferiblemente al menos en parte derivado de la misma molécula proteica. Por ejemplo, si dos residuos de cisteína se usan como grupos que son capaces de reaccionar con un soporte, y si un péptido prometedor encontrado durante una selección se representa como (X)x, los péptidos con la fórmula COOx C(X)y y/o (X)x CMy C son preferiblemente sintetizados. En esta fórmula C es un residuo de cisteína, (X)x representa al menos una secuencia flanqueante y (X)y representa cualquier secuencia derivada de dicha al menos una molécula proteica. Preferiblemente, (X)x y (X)y cada una representan al menos una secuencia flanqueante.

[0056] Los péptidos resultantes son otra vez preferiblemente acoplados a un soporte para producir peptidomiméticos estables según la presente invención. Dichos compuestos de prueba son preferiblemente seleccionados nuevamente para una funcionalidad deseada (por ejemplo su capacidad de unión a un compuesto de unión de interés tal como por ejemplo un anticuerpo, célula T, ligando o receptor). Preferiblemente, dichos compuestos de prueba se evalúan para la misma funcionalidad en comparación con una primera selección durante la cual el péptido prometedor (X)x fue seleccionado. Es especialmente adecuado producir y/o identificar un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión que es al menos en parte derivado de una molécula proteica cuya estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria no es, o sólo parcialmente, conocida. 2, 3 o 4 grupos de péptidos pueden ser sintetizados, donde un conjunto de péptidos comprende péptidos de aproximadamente la misma longitud, y los péptidos resultantes se someten a un primer ensayo de selección usando una molécula de unión de interés. Péptidos que resultan ser candidatos prometedores son posteriormente acoplados a un segundo péptido que es también derivado de dicha molécula proteica cuya estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria no es, o sólo parcialmente, conocida para generar compuestos con la fórmula COOx C(X)y y/o (X)x C(X)y C. Los péptidos resultantes son posteriormente seleccionados nuevamente con un segundo ensayo de selección usando una molécula de unión de interés.

[0057] Un método para producir un peptidomimético según la invención es descrito donde un péptido se produce que comprende el formato C(X)x C(X)y o C(X)y C(X)x y donde C es un residuo de cisteína, (X)x representa al menos una de dichas secuencias flanqueantes y (X)y representa cualquier secuencia derivada de dicha al menos una molécula proteica. Preferiblemente, (X)x y (X)y cada uno representan al menos una de dichas secuencias flanqueantes.

[0058] Péptidos superpuestos son definidos aquí como péptidos derivados de una secuencia primaria de una molécula proteica, donde cada péptido tiene al menos un residuo de aminoácido de dicha secuencia primaria en común con otro péptido. Por ejemplo, una pluralidad de péptidos de longitud n son producidos, donde el primer péptido comienza en la posición 1 y termina en la posición n de la secuencia primaria de dicha molécula proteica. El segundo péptido comienza en la posición 2 y termina en la posición n+1 de la secuencia primaria de dicha molécula proteica. El tercer péptido comienza en la posición 3 y termina en la posición n+2 de la secuencia primaria de dicha molécula proteica, etcétera. Péptidos que tienen esencialmente la misma longitud se definen aquí como péptidos cuyas cantidades de residuos de aminoácidos difieren como mucho 5 residuos de aminoácidos entre sí. Preferiblemente, dichos péptidos tienen exactamente la misma cantidad de residuos de aminoácidos.

[0059] Un péptido útil en la invención preferiblemente comprende al menos dos grupos capaces de reaccionar con un soporte. Si un péptido tiene dos grupos capaces de reaccionar con un soporte, se usa preferiblemente un soporte que tiene dos sitios adecuados para la unión. Las frases "sitios adecuados para la unión" y "sitios de unión" son usadas aquí de forma intercambiable y son definidas como sitios que son capaces de unir un grupo capaz de reaccionar con un soporte, este grupo está presente en un péptido útil para la invención. Dicho grupo tiene preferiblemente una funcionalidad SH, que es preferiblemente usada para una reacción de sustitución nucleofílica. Un ejemplo de un sitio de unión adecuado de un soporte es por lo tanto un carbono saturado que se conecta a un heteroátomo el cual es más electronegativo que el carbono.

[0060] Un ejemplo de un soporte que comprende dos sitios de unión es una molécula aromática que comprende dos sustituyentes de halógeno. Preferiblemente se usa un bis(bromometil)benceno, un (bromometil)(clorometil)benceno o un bis(clorometil) benceno. De la forma más preferible, se usa meta-dibromoxileno (m-T2).

[0061] En una forma de realización un péptido es producido que comprende al menos tres grupos capaces de reaccionar con un soporte. Esto proporciona la ventaja de que al menos dos bucles se forman por un péptido que se liga a un soporte en tres sitios. Cada uno de dichos al menos dos bucles es conveniente para evaluar la presencia de un sitio de unión continuo y/o sitio inmunógeno. Preferiblemente no obstante al menos dos bucles son evaluados juntos para buscar la presencia de un sitio de unión discontinuo y/o sitio inmunógeno. Preferiblemente, cada bucle comprende al menos parte de una secuencia flanqueante, de modo que las características de varias (partes de) secuencias flanqueantes son evaluadas simultáneamente. Por lo tanto, un péptido para uso en la invención preferiblemente comprende al menos dos secuencias flanqueantes y al menos tres grupos capaces de reaccionar con un soporte. Preferiblemente dichos al menos tres grupos capaces de reaccionar con un soporte son residuos de cisteína. Un método para producir un peptidomimético según la invención es por lo tanto proporcionado donde dicho péptido comprende al menos tres residuos de cisteína y al menos dos secuencias flanqueantes.

[0062] Por supuesto, si un péptido para uso en la invención contiene tres grupos capaces de reaccionar con un soporte, se usa preferiblemente un soporte que tiene (como mínimo) tres sitios adecuados para la unión. Por ejemplo se usa una molécula aromática que comprende tres sustituyentes de halógeno. Dicha molécula aromática preferiblemente comprende un tris(bromometil) benceno, un bis(bromometin(clorometil)benceno, un (bromometil)bis(clorometil)benceno o un tris(clorometil) benceno. De la forma más preferible, se usa 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno (T3).

[0063] Asimismo, si un péptido para uso en la invención contiene cuatro grupos capaces de reaccionar con un soporte, se usa preferiblemente una estructura que tiene cuatro sitios adecuados para la unión. Una molécula aromática que comprende cuatro sustituyentes de halógeno es preferiblemente usada. Dicha molécula aromática preferiblemente comprende un tetra(bromometil)benceno, un tris(bromometil)(clorometil)benceno, un bis(bromometil)bis(clorometil)benceno, un (bromometil) tris(clorometil)benceno o un tetra (clorometil) benceno. De la forma más preferible, se usa 1,2,4,5 tetrabromodureno (T4).

[0064] Preferiblemente, se produce un péptido con la fórmula C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)x C. En esta fórmula, C es un grupo capaz de reaccionar con un soporte, preferiblemente un residuo de cisteína, (X)x representa al menos una secuencia flanqueante y (X)y representa cualquier secuencia derivada de una molécula proteica de interés. (X)y es preferiblemente derivada de la misma molécula proteica que (X)x. Preferiblemente, (X)x y (X)y cada uno representa al menos una secuencia flanqueante. La longitud de (X)x y (X)y pueden ser aproximadamente la misma, lo cual significa que la diferencia entre la cantidad de residuos de aminoácidos de (X)x y la cantidad de residuos de aminoácidos de (X)y es cinco o menos. Si tales péptidos se ligan un soporte, dos bucles de esencialmente la misma longitud son producidos. No obstante, esto no es necesario: la longitud de (X)x y (X)y pueden también significativamente diferir entre sí, lo cual significa que la cantidad de residuos de aminoácidos de (X)x y la cantidad de residuos de aminoácidos de (X)y difieren entre sí de más de cinco residuos de aminoácidos. Si tal péptido se acopla a un soporte, se obtienen dos bucles de longitud significativamente diferente.

[0065] Un péptido con la fórmula mencionada arriba, que contiene tres grupos capaces de reaccionar con un soporte, es preferiblemente acoplado a un soporte con tres sitios de unión. Dicho péptido es preferiblemente acoplado a una molécula aromática que comprende tres sustituyentes de halógeno, más preferiblemente a un tris(bromometil)benceno, de la forma más preferible a 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno (T3). Esto por ejemplo resulta en una estructura como se representa en la Figura 7, que es especialmente adecuada para evaluar dos bucles de péptidos en un soporte.

[0066] Una variedad de péptidos con la fórmula C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)xC puede ser producida. Por ejemplo varias secuencias flanqueantes de una molécula proteica de interés son seleccionadas, y dichas secuencias flanqueantes son de forma aleatoria combinadas para producir péptidos con la fórmula C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)x C donde (X)x y (X)y ambos comprenden al menos una secuencia flanqueante. Dichas secuencias flanqueantes son preferiblemente seleccionadas de al menos una región expuesta a la superficie de una molécula proteica de interés. En otro aspecto, un método para producir un peptidomimético según la invención es en primer lugar realizado para producir una pluralidad de péptidos. Dicha pluralidad de péptidos se selecciona con una molécula de unión de interés, tal como por ejemplo un anticuerpo y/o célula T, para identificar al menos un péptido candidato prometedor de la fórmula (X)x con una propiedad inmunógena y/o de unión deseada. Dicho péptido candidato prometedor es posteriormente combinado con otro péptido con la fórmula (X)y para obtener un péptido con la fórmula C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)xC. Dicho péptido con la fórmula (X)y es preferiblemente derivado de la misma molécula proteica que dicho péptido candidato prometedor de la fórmula (X)x. Preferiblemente, una pluralidad de péptidos con la fórmula (X)y es producida comprendiendo péptidos superpuestos que son al menos en parte derivados de la misma molécula proteica que dicho péptido candidato prometedor de la fórmula (X)x. Cada péptido (X)y que incluye un péptido superpuesto es posteriormente acoplado a un péptido candidato prometedor de la fórmula (X)x. Los péptidos resultantes C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)xC son posteriormente seleccionados nuevamente, preferiblemente en la misma clase de ensayo de selección durante el cual el péptido candidato prometedor de la fórmula (X)x fue seleccionado. Si al menos un péptido C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)xC resulta tener una propiedad inmunógena deseada y/o propiedad de unión, dicho péptido es seleccionado.

[0067] Si un péptido con la fórmula C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)xC es al menos en parte privado de una proteína de transmembrana, péptidos (X)x y (X)y son preferiblemente ambos derivados de un dominio de bucle extracelular de dicha proteína de transmembrana y/o del N-término libre. El N-término libre de una proteína de transmembrana es definido aquí como la parte N-terminal lineal de dicha proteína, empezando en el aminoácido 1 y terminando en el primer residuo de aminoácido del primer dominio de transmembrana (principalmente una hélice de transmembrana). Un método para producir un peptidomimético según la invención puede en primer lugar ser realizado donde al menos un residuo de aminoácido presente en un dominio de bucle extracelular y/o el N-término libre de una proteína de transmembrana es seleccionado. Por consiguiente, péptidos producidos que comprenden al menos una secuencia flanqueante presente en dicho dominio de bucle extracelular y/o en dicho N-término libre se seleccionan con una molécula de unión de interés, tal como por ejemplo un anticuerpo y/o célula T, para identificar al menos un péptido candidato prometedor de la fórmula (X)x con una propiedad inmunógena y/o de unión deseada. Dicho péptido candidato prometedor es posteriormente combinado con otro péptido con la fórmula (X)y que comprende al menos una secuencia flanqueante de un dominio de bucle extracelular y/o el N-término libre de dicha proteína de transmembrana para obtener un péptido con la fórmula C(X)xC(X)yC o C(X)yC(X)xC. En un aspecto (X)x y (X)y comprenden al menos una secuencia flanqueante derivada del mismo dominio de bucle extracelular y/o N-término libre. Alternativamente, o adicionalmente, (X)x y (X)y comprenden al menos una secuencia flanqueante derivada de distintos dominios de dicha proteína de transmembrana.

[0068] Si un péptido con la fórmula C(X)x C(X)y C o C(X)y C(X)x C es al menos en parte derivado de una molécula proteica que comprende al menos dos enlaces de cistina interna entre residuos de cisteína, tal como un elemento de la superfamilia de puente de Cys, péptidos (X)x y (X)y preferiblemente ambos comprenden al menos una secuencia flanqueante de uno o más residuos de cisteína de dicha molécula proteica. Preferiblemente, un método para producir un peptidomimético según la invención es realizado donde sólo residuos de cisteína de dicha molécula proteica son seleccionados. Como resultado, se producen péptidos que comprenden sólo (combinaciones de) secuencias flanqueantes de al menos un residuo de cisteína.

[0069] Si la estructura (secundaria, terciaria y/o cuaternaria) de una molécula proteica de interés no se conoce, un conjunto de péptidos superpuestos es preferiblemente generado. Tres grupos capaces de reaccionar con un soporte se pueden colocar en tres sitios dentro de cada péptido superpuesto. El péptido resultante es posteriormente preferiblemente acoplado a un soporte que comprende (como mínimo) tres sitios de unión para proporcionar un peptidomimético según la invención. Preferiblemente, un grupo capaz de reaccionar con un soporte se coloca en el primer residuo de aminoácido de un péptido superpuesto, un grupo capaz de reaccionar con un soporte se coloca en el último residuo de aminoácido de dicho péptido superpuesto y un grupo capaz de reaccionar con un soporte es colocado entre dicho primer y dicho último grupo capaz de reaccionar con un soporte. Dado que dichos grupos capaces de reaccionar con un soporte son preferiblemente residuos de cisteína, un péptido es preferiblemente producido con la fórmula COOx C(X)y C donde (X)x y (X)y son preferiblemente parte del mismo péptido superpuesto. Este péptido C(X)x C(X)y C es preferiblemente producido por sustitución del primer residuo de aminoácido de la secuencia de un péptido superpuesto, el último residuo de aminoácido de la secuencia de dicho péptido superpuesto y un residuo de aminoácido localizado entremedias de dicho primer y último residuos de aminoácidos por una cisteína. Alternativamente, (X)x y (X)y comprenden cada uno un péptido superpuesto. En una forma de realización (X)x y (X)y contienen aproximadamente la misma cantidad de residuos de aminoácidos. En este caso, un conjunto de péptidos superpuestos que consisten en n residuos de aminoácidos es preferiblemente producido, donde n es un número impar. Posteriormente, residuos de aminoácidos 1, (n+1)/2 y n se sustituyen por cisteína. Otros residuos de cisteína disponibles preferiblemente bien son sustituidos por otro residuo de aminoácido o vueltos inactivos (por ejemplo por un grupo protector) de modo que dichos otros residuos de cisteína disponibles no interfieren con la reacción de acoplamiento entre dicho péptido y un soporte. Los péptidos resultantes, C(X)xC(X)yC, son posteriormente preferiblemente acoplados a un soporte que comprende (como mínimo) tres sitios de unión y posteriormente se evalúan por una característica deseada.

[0070] Un péptido con la fórmula C(X)xC(G)nC(X)yC o C(X)yC(G)nC(X)x C puede ser producido. En esta fórmula, C representa un grupo capaz de reaccionar con un soporte, preferiblemente un residuo de cisteína, (G)n representa un separador, (X)x representa al menos una secuencia flanqueante y (X)y representa cualquier secuencia derivada de al menos una molécula proteica. Preferiblemente, (X)x y (X)y cada uno representan al menos una secuencia flanqueante de la misma molécula proteica de interés.

[0071] Por supuesto, es también posible reemplazar el separador por otra secuencia flanqueante (X)z. En este caso, se produce un péptido con fórmula C(X)xC(X)zC(X)yC, C(X)xC(X)yC(X)zC, C(X)yC(X)zC(X)xC, C(X)yC(X) C(X)zC, C(X)zC(X)xC(X)yC y/o C(X)zC(X)yC(X)xC.

[0072] Péptidos con las fórmulas anteriormente mencionadas son especialmente adecuados para acoplamiento a un soporte que comprende (como mínimo) cuatro sitios de unión, o a dos soportes donde cada soporte comprende (como mínimo) dos sitios de unión. Ejemplos esquemáticos no limitativos de compuestos resultantes se representan en las figuras 7 y 8.

[0073] Si dos soportes con al menos dos sitios de unión son usados, tal como por ejemplo dos moléculas m-P2 separadas, es a veces deseado regular qué residuos de cisteína se acoplan al primer soporte y qué residuos de cisteína se acoplan al segundo soporte. Por ejemplo, si se usa un péptido con la fórmula C1(X)xC2(G)nC3(X)yC4, C1 y C2 son frecuentemente destinados a enlazar un primer soporte, mientras que C3 y C4 se destina a enlazar un segundo soporte. Esto es por ejemplo realizado proporcionando dos residuos de cisteína que se destinan a enlazarse con un segundo soporte (por ejemplo C3 y C4) con un grupo protector tal como por ejemplo metoxitritilo (Mmt) o tritilo crit). En una primera reacción de acoplamiento, un péptido que comprende C3 y C4 protegidos se incuba con un primer soporte. Sólo C1 y C2 son ahora capaces de unirse al soporte. Posteriormente, C3 y C4 son desprotegidos. El complejo resultante es ahora incubado con un segundo soporte, que puede ser la misma clase de soporte que dicho primer soporte (aunque esto no es necesario; dicho segundo soporte y dicho primer soporte pueden también ser diferentes uno del otro). Esta vez, C3 y C4 son capaces de unirse con dicho segundo soporte. De esta manera, C1 y C2 se unen al primer soporte, y C3 y C4 se une al segundo soporte. Por supuesto, otras combinaciones son posibles.

[0074] Si un péptido con la fórmula C(X)xC(G)nC(X)yC, C(X)yC(G)nC(X)xC, COOxC(X)ZC(X)yC, C(X)xC(X)yC(X)zC. C(X)y C(X)z C(X)xC, C(X)yC(X)xC(X)ZC, C(X)zC(X)xC(X)yC o C(X)zC(X)yC(X)xC es al menos en parte derivado de una proteína de transmembrana, péptidos (X)x y (X)y y opcionalmente (X)z son preferiblemente derivados de un dominio de bucle extracelular de dicha proteína de transmembrana y/o del N-término libre. Un método para producir un peptidomimético según la invención se puede realizar donde al menos un péptido prometedor con la fórmula (X)x se selecciona durante un primer método de selección como se ha descrito anteriormente, este péptido con la fórmula (X)x comprende al menos una secuencia flanqueante derivada de un dominio de bucle extracelular y/o el N-término libre de una proteína de transmembrana dicho péptido prometedor de la fórmula Q0x es posteriormente combinada con otro péptido con la fórmula (X)y y/o con otro péptido con la fórmula (X)z para obtener un péptido con una fórmula seleccionada del grupo consistiendo en C(X)xC(G)nC(X)yC, C(X)yC(G)nC(X)xC, C(X)xC(X)zC(X)yC, C(X)xC(X)yC(X)zC, C(X)yC(X)zC(X)xC, C(X)yC(X)xC(X)zC, C(X)zC(X)x C(X)yC y C(X)zC(X)yC(X)xC. En un aspecto (X)x y (X)y y, opcionalmente, (X)z comprenden al menos una secuencia flanqueante derivada del mismo dominio de bucle extracelular y/o del N-término libre. Alternativamente, o adicionalmente, (X)x y (X)y y, opcionalmente, (X)z comprenden al menos una secuencia flanqueante derivada de un dominio diferente de dicha proteína de transmembrana.

[0075] Si un péptido con una fórmula seleccionada del grupo que consiste en C(X)xC(G)nC(X)yC, C(X)yC(G)nC(X)xC, C(X)x C(X)zC(X)yC, C(X)xC(X)yC(X)zC, C(X)yC(X)zC(X)xC, C(X)yC(X)xC(X)zC, C(X)zC(X)xC(X)yC y C(X)zC(X)yC(X)xC es al menos en parte derivado de una molécula proteica que comprende al menos dos enlaces de cistina internos entre residuos de cisteína, tal como por ejemplo un elemento de la superfamilia del puente de Cys, péptidos (X)x y (X)y y, opcionalmente, (X)z preferiblemente comprenden al menos una secuencia flanqueante de uno o más residuos de cisteína de dicha molécula proteica. Preferiblemente, un método para producir un peptidomimético según la invención es realizado donde sólo residuos de cisteína de dicha molécula proteica son seleccionados. Como resultado, son producidos péptidos que comprenden sólo (combinaciones de) secuencias flanqueantes de al menos un residuo de cisteína. Preferiblemente se generan péptidos que comprenden al menos una secuencia flanqueante de al menos dos residuos de cisteína de dicha molécula proteica. De la forma más preferible se generan péptidos que comprenden al menos dos secuencias flanqueantes de al menos dos residuos de cisteína de dicha molécula proteica.

[0076] Preferiblemente, un método para producir un peptidomimético según la invención es realizado de la siguiente manera. Una pluralidad de péptidos es producida que comprende una primera cisteína Cys-1 de un puente SS de una molécula proteica, una secuencia flanqueante (X)x de dicha Cys-1, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del C-término y tiene una longitud de x residuos de aminoácidos, seguido de una segunda cisteína C, seguido de n residuos de glicina (G)n, seguido de una tercera cisteína C, seguido de una secuencia flanqueante (X)y del segundo residuo de cisterna Cys-2 de dicho puente SS, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del N-término y tiene una longitud de y residuos de aminoácidos, seguido de la segunda cisteína Cys-2 de dicho puente SS. El péptido resultante contiene la fórmula Cys-1(X)xC(G)nC(X)yCys-2. Una pluralidad de diferentes péptidos es preferiblemente sintetizada donde 0 es más pequeño que o igual a x, n, y y y donde x, n, y y son más pequeños que o igual a 6. Adicionalmente, x+n+y es preferiblemente más pequeño que o igual a 21, de modo que el péptido resultante es más pequeño que o igual a 25 residuos de aminoácidos. Péptidos producidos son posteriormente preferiblemente seleccionados por una característica inmunógena deseada y/o propiedad de unión. Esto es preferiblemente realizado después del acoplamiento de dicho péptido a un soporte que comprende (como mínimo) cuatro sitios de unión o a dos soportes, cada uno comprendiendo (como mínimo) dos sitios de unión. De la forma más preferible, dicho péptido se acopla a un soporte T4 o a dos soportes T2. Si dos soportes son usados, cada soporte que comprende (como mínimo) dos sitios de unión, los dos residuos de cisteína Cys-1 y Cys-2 son preferiblemente acoplados al mismo soporte para formar un bucle. Los otros dos residuos de cisteína son preferiblemente acoplados a otro soporte para formar un bucle. Como ya se ha explicado anteriormente, esto por ejemplo se realiza proveyendo Cys-1 y Cys-2 con un grupo protector mientras que deja los otros dos residuos de cisteína desprotegidos. En este caso, la cisteína desprotegida se acopla a un soporte para formar un bucle. Posteriormente, Cys-1 y Cys-2 se desprotegen y se acoplan a otro soporte.

[0077] Es también posible proporcionar Cys-1 y Cys-2 con un primer especie de grupo protector, tal como por ejemplo Trt, y proporcionar los otros dos residuos de cisteína con una segunda clase de grupo protector, tal como por ejemplo Mmt. Ambas clases de grupos protectores son eliminados usando reactivos diferentes. De esta manera, es posible determinar qué residuos de cisteína son capaces de unirse a un soporte.

[0078] En otro aspecto se produce un péptido con la fórmula C(X)xC(X)m(G)n(X)pC(X)yC. En esta fórmula, C representa un grupo capaz de reaccionar con un soporte, preferiblemente un residuo de cisteína, (G)n representa un separador, y (X)x, (X)m, (X)p y (X)y cada uno representa al menos una secuencia flanqueante de una molécula proteica de interés. Este péptido es especialmente adecuado para el acoplamiento a dos soportes, donde cada soporte comprende (como mínimo) dos sitios de unión. Preferiblemente, un péptido de esta fórmula es sintetizado usando secuencias flanqueantes de una molécula proteica de interés que comprende (como mínimo) dos puentes SS, donde en la secuencia primaria de dicha molécula proteica la primera cisteína del segundo puente SS está localizado N-terminalmente desde la segunda cisteína del primer puente SS, donde dicha primera cisteína del segundo puente SS y dicha segunda cisteína desde el primer puente SS están preferiblemente localizadas dentro de 6 residuos de aminoácidos entre sí, y donde la posición de cada cisteína de dichos puentes SS en la secuencia primaria de dicha molécula proteica es conocida. Por lo tanto, si la primera cisteína del segundo puente SS se localiza en la posición n, la segunda cisteína desde el primer puente SS está preferiblemente localizado en la posición n+1, n+2, n+3, n+4, n+5 o n+6. Por consiguiente, una pluralidad de péptidos es producida comprendiendo la primera cisteína Cys-1.1 del primer puente SS, una secuencia flanqueante (X)x de dicha Cys-1.1, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del C-término y tiene una longitud de x residuos de aminoácidos, seguido de la primera cisteína Cys-1.2 del segundo puente SS, seguido de una secuencia flanqueante (X)m de dicha Cys-1.2, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del C-término y tiene una longitud de m residuos de aminoácidos, seguido de n residuos de glicina (G)n, seguido de una secuencia flanqueante del tercer residuo de cisteína presente en dicha secuencia primaria - que puede bien ser la segunda cisteína del primer puente SS (Cys-2.1) o la segunda cisteína del segundo puente SS (Cys-2.2) - esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del N-término y tiene una longitud de p residuos de aminoácidos, seguido de dicho tercer residuo de cisteína, seguido de una secuencia flanqueante del cuarto residuo de cisteína presente en dicha secuencia primaria, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del Ctérmino y tiene una longitud de y residuos de aminoácidos, seguido del cuarto residuo de cisteína presente en dicha secuencia primaria, que puede bien ser la segunda cisteína del primer puente SS (Cys-2.1) o la segunda cisteína del segundo puente SS (Cys-2.2). El péptido resultante contiene la fórmula Cys-1.1(X)x Cys-1.2(X)m (G)n (X)p Cys-2.1(X)y Cys-2.2 o Cys-1,1(X)x Cys-1.2(X)m (G)n (X)p Cys-2.2(X)y Cys-2.1.

[0079] Una pluralidad de diferentes péptidos es preferiblemente sintetizada donde 0 es más pequeño que o igual a x, m, n, p y y y donde x, m, n, p y y son más pequeños que o iguales a 6. Adicionalmente, x+m+n+p+y es preferiblemente más pequeño que o igual a 21, de modo que los péptidos resultantes son más pequeños que o igual a 25 residuos de aminoácidos. Péptidos producidos son posteriormente preferiblemente seleccionados para una característica inmunógena deseada y/o propiedad de unión. Esto es preferiblemente realizado después del acoplamiento de dicho péptido a un soporte que comprende (como mínimo) cuatro sitios de unión o a dos soportes, cada uno comprendiendo (como mínimo) dos sitios de unión. De la forma más preferible, dicho péptido se acopla a un soporte T4 o a dos soportes T2. Si dos soportes son usados, cada soporte comprende (como mínimo) dos sitios de unión, los dos residuos de cisteína del primer puenteSS son preferiblemente acoplados al mismo soporte para formar un bucle. Los dos residuos de cisteína del segundo puente SS son preferiblemente acoplados a otro soporte para formar un bucle. Esto es preferiblemente realizado como ya se ha explicado anteriormente. Por ejemplo, los dos residuos de cisteína del primer puente SS se proveen con un grupo protector mientras los otros dos residuos de cisteína se mantienen desprotegidos. En este caso, la cisteína desprotegida se acopla a un soporte para formar un bucle. Posteriormente, los dos residuos de cisteína del primer puente SS se desprotegen y se acoplan a otro soporte.

[0080] Es también posible proporcionar los dos residuos de cisteína del primer puente SS con una primera clase de grupo protector, tal como por ejemplo Trt, y proporcionar los otros dos residuos de cisteína con una segunda clase de grupo protector, tal como por ejemplo Mmt. Ambas clases de grupos protectores son eliminados usando reactivos diferentes. De esta manera, es posible determinar qué residuos de cisteína son capaces de unirse a un soporte.

[0081] En otro aspecto se produce un péptido con la fórmula C(X)m (G)n (X)p C(X)q (G)r (X)s C(X)t (G)u (X)v C. En esta fórmula, C representa un grupo capaz de reaccionar con un soporte, preferiblemente un residuo de cisteína, (G)n, (G)r y (G)q representan un separador y (X)m, (X)p, (X)q, (X)s, (X)t y (X)v cada uno representa al menos una secuencia flanqueante. Este péptido dispone de tres separadores, que permiten la formación de bucles flexibles dentro de dicho péptido. Un péptido según esta fórmula es también especialmente adecuado para acoplamiento a dos soportes, donde cada soporte comprende (como mínimo) dos sitios de unión.

[0082] Preferiblemente un péptido según esta fórmula es sintetizado usando secuencias flanqueantes de una molécula proteica de interés que comprende (como mínimo) dos puentes SS, donde la posición de cada cisteína de dichos puentes SS en la secuencia primaria de dicha molécula proteica no es exactamente conocida y donde en la secuencia primaria de dicha molécula proteica dos residuos de cisteína se localizan dentro de 6 residuos de aminoácidos entre sí. En este caso, no se conoce previamente si la primera cisteína de un segundo puente SS está localizada N-terminalmente o C-terminalmente desde la segunda cisteína de un primer puente SS. Es por lo tanto preferido sintetizar una pluralidad de moléculas de la anterior fórmula mencionada, dicha pluralidad de péptidos comprendiendo combinaciones diferentes de cisteínas y secuencias flanqueantes, para seleccionar un péptido con una propiedad de unión deseada y/o propiedad inmunógena. Un método para producir un peptidomimético según la presente invención preferiblemente comprende seleccionar residuos de cisteína de puentes SS, y secuencias flanqueantes de los mismos, porque un puente SS entre cisteínas de una molécula proteica frecuentemente produce un bucle interno. Tal bucle regularmente resulta estar implicado en la interacción entre dicha molécula proteica y otro compuesto. Por lo tanto, secuencias flanqueantes de residuos de cisteína de puentes SS tienen una mayor posibilidad de estar implicadas con eventos de unión y/o inmunidad en comparación con otras secuencias dentro de una molécula proteica de interés.

[0083] Preferiblemente, una pluralidad de péptidos es producida que comprende una primera cisteína (C1) encontrada en una secuencia primaria, una secuencia flanqueante (X)m de dicha C1, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del C-término y tiene una longitud de m residuos de aminoácidos, seguido de n residuos de glicina (G)n seguida de una secuencia flanqueante (X)p de una tercera cisteína (C3) encontrada en una secuencia primaria, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del N-término y tiene una longitud de p residuos de aminoácidos, seguido de C3, seguido de una secuencia flanqueante (X)q de C3, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del C-término y tiene una longitud de q residuos de aminoácidos, seguido de r residuos de glicina (G)r, seguido de una secuencia flanqueante de un segundo residuo de cisteína (C2) presente en dicha secuencia primaria, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del Ntérmino y tiene una longitud de s residuos de aminoácidos, seguido de C2 que puede por ejemplo ser la segunda cisteína del primer puente SS o la primera cisteína del segundo puente SS, seguido de una secuencia flanqueante de C2 presente en dicha secuencia primaria, esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del C-término y tiene una longitud de t residuos de aminoácidos, seguido de u residuos de glicina (G)u, seguido una secuencia flanqueante del cuarto residuo de cisteína presente en dicha secuencia primaria (C4), esta secuencia flanqueante se localiza en la dirección del N-término y tiene una longitud de v residuos de aminoácidos, seguido del cuarto residuo de cisteína (C4). El péptido resultante es de la fórmula C1(X)m(G)n(X)pC3(X)q(G)r(X)sC2 (X)t(G)u X)vC4

[0084] Una pluralidad de diferentes péptidos es preferiblemente sintetizada donde 0 es más pequeña que o igual a m, n, p, q, r, s, t, u y v y donde m, n, p, q, r, s, t, u y v son más pequeños que o igual a 6. Adicionalmente, m+n+p+q+r+s+t+u+v es preferiblemente más pequeño que o igual a 21, de modo que los péptidos resultantes son más pequeños que o igual a 25 residuos de aminoácidos. Péptidos producidos son posteriormente preferiblemente seleccionados por una característica inmunógena deseada y/o propiedad de unión. Esto es preferiblemente realizado después del acoplamiento de dicho péptido a un soporte que comprende (como mínimo) cuatro sitios de unión o a dos soportes, cada uno comprendiendo (como mínimo) dos sitios de unión. De la forma más preferible, dicho péptido se acopla a un soporte T4 o a dos soportes T2. Si dos soportes son usados, cada soporte comprendiendo (como mínimo) dos sitios de unión, C1 y C3 son preferiblemente acoplados al mismo soporte para formar un bucle. C2 y C4 son preferiblemente acoplados a otro soporte para formar un bucle. Esto es preferiblemente realizado como ya se ha explicado anteriormente. Por ejemplo, C1 y C3 se provee con un grupo protector mientras los otros dos residuos de cisteína se mantienen desprotegidos. En este caso, los C2 y C4 desprotegidos se acoplan a un soporte para formar un bucle. Posteriormente, C1 y C3 se desprotegen y acoplan a otro soporte.

[0085] Es también posible proporcionar C1 y C3 con una primera especie de grupo protector, tal como por ejemplo Trt, y proporcionar C2 y C4 con una segunda clase de grupo protector, tal como por ejemplo. Mmt. Ambas clases de grupos protectores son eliminadas usando reactivos diferentes. De esta manera, es posible determinar qué residuos de cisteína son capaces de unirse a un soporte.

[0086] Claramente es también posible generar otras combinaciones. El ejemplo anteriormente mencionado es por ejemplo modificado de manera que las posiciones de C3, C4 y sus secuencias flanqueantes en el péptido son cambiadas, por ejemplo dando como resultado un péptido con la fórmula

C1(X)m(G)n(X)pC4(X)q(G)r(X)sC2(X)t(G)u(X)vC3

[0087] Un método para producir un peptidomimético según la invención es en principio aplicable en cualquier molécula proteica cuya secuencia primaria es conocida. Preferiblemente, no obstante está provisto un método para producir un peptidomimético según la invención donde dicha molécula proteica es seleccionada del grupo consistiendo en los elementos de las subfamilias de gLHA y gLHB. Se ha descubierto que un método para producir un peptidomimético de la invención es especialmente adecuado para generar compuestos inmunógenos y/o compuestos de unión que son al menos parcialmente derivados de un elemento de dicho grupo.

[0088] Es particularmente preferido usar un método para producir un peptidomimético de la invención para producir un compuesto que es conveniente para evaluar la presencia y/o identificación de un compuesto inmunógeno y/o compuesto de unión que es al menos parcialmente derivado de un elemento de la super-familia del puente de cistina, preferiblemente un elemento de la superfamilia de factor de crecimiento puente de cistina, en particular, un elemento de la subfamilia de gLHA o gLHB.

[0089] Factores de crecimiento representan un grupo relativamente grande de polipéptidos que comparten la propiedad de inducir la multiplicación celular tanto in vivo como in vitro. Aunque el nivel de similitud de secuencias entre factores de crecimiento no es alto, estos se pueden clasificar en superfamilias basándose en sus similitudes funcionales y estructurales.

[0090] Las estructuras de cristal de cuatro factores de crecimiento, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), y gonadotropina coriónica humana (hCG) de cuatro superfamilias separadas reveló que estas proteínas están estructuralmente relacionadas y comparten una topología global común. Estas proteínas muestran muy poca homología secuencial, pero todas tienen una disposición inusual de seis cisteínas enlazadas para formar una conformación "puente de cistina". Las formas activas de estas proteínas son dímeros, bien homo- o heterodímeros. Debido a su forma, resulta tener un requisito intrínseco para los factores de crecimiento del puente de cistina para formar dímeros. Este nivel extra de organización aumenta la variedad de estructuras construidas alrededor de este simple motivo estructural.

[0091] En las estructuras de cristal del factor de crecimiento transformante beta 2 (TGF-beta2), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento nervioso (NGF) y gonadotropina coriónica humana (hCG), 6 residuos conservados de cisteína (CysI a CysVI en el orden de secuencia) forman 3 enlaces disulfuro dispuestos en una topología tipo puente. Los dos enlaces de disulfuro entre CysII y CysV ([CysII-V]) y entre CysIII y CysVI ([CysIII-VI]) forman una estructura tipo anillo de 8 aminoácidos a través de la cual penetra el enlace de disulfuro restante entre CysI y CysIV (ver Figura 1A). Los átomos de azufre (S) de las cisteínas conservadas I a VI que se implican en los enlaces de disulfuro son típicamente referidos como S1 a S6. Dominios de puente de cistina con más de 6 residuos de cisteína pueden ser encontrados. Los residuos de cisteína "extra" son normalmente usados para crear otros enlaces de disulfuro en el dominio de nudo de cistina o enlaces de disulfuro de intercadena, durante la dimerización. No obstante, con base en la homología y topología es siempre posible indicar qué cisteínas representan los seis residuos conservados CysI a CysVI (ver también más abajo).

[0092] Una disposición anudada similar de enlaces de disulfuro ha sido señalada en las estructuras de algunos inhibidores enzimáticos y neurotoxinas que se enlazan con canales de Ca2+ activados por voltaje (McDonald et al.1993,Cell 73 421424). En aquellas secuencias, no obstante, la topología de cistina difiere: Cys[III-VI] penetra en un anillo macrocíclico formado por Cys[I-IV] y Cys[II-V]. Así, las proteínas del puente de cistina caen en 2 clases estructurales: tipo de factor de crecimiento y nudos de cistina tipo inhibidor.

[0093] La superfamilia de factor de crecimiento de nudo de cistina se divide en subfamilias, que incluyen las hormonas de glicoproteína (p. ej. hormona folículo-estimulante (FSH)), las proteínas del factor de crecimiento transformante beta (TGFbeta) (p. ej. proteína morfogenética de hueso 4), las proteínas tipo factor de crecimiento derivado de las plaquetas (tipo-PDGF) (p. ej. factor de crecimiento derivado de plaquetas), factores de crecimiento nerviosos (NGF) (p. ej. factor neurotrófico derivado del cerebro) (ver también tabla 12).

[0094] Todas las estructuras de nudos de cistina de factor de crecimiento tienen una topología similar, con 2 bucles de horquilla beta distorsionados (beta-1 y beta-3) "encima de" el nudo y un único bucle (beta-2) "debajo de" el nudo. El bucle beta-1 se forma por la extensión de aminoácidos entre CysI y CysII; el bucle beta-2 se forma por los aminoácidos entre CysIII y CysIV y el bucle beta-3 se forma por los aminoácidos entre CysIV y CysV (ver Figura 1A). Los tamaños de los bucles de la horquilla (es decir, el número de aminoácidos entre las cisteínas indicadas) pueden variar significativamente entre elementos de la familia.

[0095] Hay tres "huellas" diferentes para la familia de proteínas del nudo de Cys: (1) GFCYSKNOT, (2) GLYCOHORMONE,

(3) NGF. Estas huellas digitales difieren entre sí principalmente en (1) el número y (2) la naturaleza de los aminoácidos alrededor del nudo de Cys. Una huella comprende características de una (sub)familia de proteínas dada y pueden así ser usada para determinar si una proteína dada pertenece a una (sub)familia de proteínas dada.

[0096] Por ejemplo, "NGF" es una huella de 4 elementos que proporciona una firma para los factores de crecimiento nerviosos. La huella fue derivada de una alineación inicial de 5 secuencias: los motivos fueron extraidos de regiones conservadas en la parte C-terminal de la alineación, cada uno incluyendo al menos uno de los 6 residuos Cys implicados en la formación del enlace de disulfuro. Los ,otivos 2 y 3 atraviesan las regiones codificadas por el NGF del modelo de PROSITE (PS00248 [GSR]-CysII-[KRL]-G-[LIV]-[DE]-x(3)-[YW]-x-S-x-CysIII). Los aminoácidos entre corchetes indican los posibles aminoácidos en esta posición. Por ejemplo, el residuo N-terminal de CysII puede ser bien Gly, Ser o Arg. Una x indica cualquier aminoácido. Dos iteraciones usando el algoritmo OWL22.1 fueron requeridas para alcanzar la convergencia, en este punto se identificó un conjunto real comprendiendo 28 secuencias. Una actualización de STPR37_9f identificó un conjunto real de 33 secuencias."

[0097] "GLYHORMONE" es una huella de 4 elementos que proporciona una firma para las hormonas de glicoproteína. La huella fue derivada de una alineación inicial de 8 secuencias: los motivos fueron extraidos de regiones conservadas que cubrían prácticamente toda la longitud de alineación, motivos 2 y 4 incluyendo regiones codificadas por el modelo de PROSITE GLY_HORMONE_ALPHA_1 (PS00779: CysII-x-G-C-CysIn-[FW]-S-[RQS]-A- [FY]-P-T-P), y GLY_HORMONE_ALPHA_2 (PS00780: N-H-T-x-CysV-x-CysVI-x-T-Cys-x(2)-H-K). Dos iteraciones en OWL22.1 fueron requeridas para alcanzar convergencia, en este punto un conjunto real que comprende 23 secuencias fue identificado. Una actualización de STPR37_9f identificó un conjunto real de 34 secuencias."

[0098] "GFCYSKNOT" es una huella de 2 elementos que proporciona una firma para la familia de nudo de cistina del factor de crecimiento. La huella fue derivada de una alineación inicial de 25 secuencias - el motivo 1 cubre el consenso CysII-X-g-X-CysIII (cf. modelos de PROSITE PDGF (PS00249: P-[PSR]-Cys-V-x(3)-R-CysII-[GSTA]-G-Cys-CysIII), TGF BETA (PS00250: [LIVM]-x(2)- P-x(2)-[FY]-x(4)-CysII-x-G-x-CysIII), GLY HORMONE BETA-1 (PS00261: CysII-[STAGM]-g-[HFYL]CysIII-X-[ST ]) y NGF (PS00248 [GSR]-CysII-[KRL]-G-[LIV]-[DE]-x(3)-[YW]-x-S-x-CysIII), el motivo 2 cubre el modelo CysV-X-CysVI . Cuatro iteraciones en OWL26.0 fueron requeridas para alcanzar la convergencia, en este punto un conjunto real que comprende 192 secuencias fue identificado. Diferentes falsos positivos fueron también identificados, la mayoría de los cuales son secuencias (p. ej. metalotioneínas y queratinas) muy sesgadas (ricas en cisteína). Una actualización de STPR37_9f identificó un conjunto real de 198 secuencias.

[0099] La presente solicitud describe un método para diseñar y producir simuladores de cada uno de éstos, al igual que de aquellos elementos de la familia por descubrir.

[0100] Sitios de unión de imitación de proteínas complejas, por ejemplo TNF-alfa, la familia CD (agrupamiento de diferenciación antígena), citocinas, anticuerpos o receptores de superficie celular, mediante péptidos sintéticos es habitualmente una de las áreas más activas en la ciencia de las proteínas y del desarrollo farmacológico. Muchas proteínas ejercen su actividad biológica a través de interacciones implicando regiones relativamente pequeñas de sus superficies expuestas. Moléculas que imitan estos epítopos de superficie son por lo tanto de gran interés, puesto que proporcionan un medio de imitación de la actividad biológica de la proteína entera, por ejemplo la capacidad de una proteína para reconocer determinadas moléculas fisiológicas, tales como proteínas y ADN, en una molécula sintética relativamente pequeña. Péptidos lineales cortos no son ideales para este propósito, debido a su flexibilidad y susceptibilidad inherente a la degradación proteolítica. En cambio, se prefiere constreñir cadenas de péptidos lineales por ciclización en un compuesto de péptido en bucle con estructura(s) secundaria(s) biológicamente pertinente(s).

[0101] La presente invención proporciona una estrategia racionalizada para el diseño de una estructura de péptido en bucle que es conveniente como un péptido mimética de un elemento de la familia del factor de crecimiento del nudo de cistina. El término "péptidomimético" como se utiliza en este caso se refiere a un compuesto peptídico (sintético) que imita la capacidad de un elemento de la familia del nudo de Cys para reconocer determinadas moléculas fisiológicas. La invención además proporciona un método para producir peptidomiméticos al menos parcialmente derivados de una molécula proteica que comprende al menos un enlace de disulfuro (por ejemplo un elemento de la familia del nudo de cistina), estos peptidomiméticos se adecuan para evaluar la presencia y/o identificación de un compuesto inmunógeno y/o compuesto de unión.

[0102] Una molécula proteica de interés por ejemplo comprende un enlace de disulfuro entre dos residuos de cisteína, donde dichos dos residuos de cisteína están localizados al menos 3 y como mucho 21 residuos de aminoácidos entre sí en la secuencia primaria (lo cual significa que la posición de la primera cisteína es x y la posición de la segunda cisteína es x + n, donde 3 =< n =< 21). En este ejemplo, al menos un péptido de la siguiente fórmula es preferiblemente sintetizado: (X)m Cx (X)n-1 Cx+n (X)p donde Cx y Cx+n representan los residuos de cisteína en la posición x y en la posición x + n, respectivamente, (X)m representa una secuencia flanqueante de Cx que consiste en m residuos de aminoácidos y que se localiza en la dirección del N-término, (X)p representa una secuencia flanqueante de Cx+n que consiste en p residuos de aminoácidos y que se localiza en la dirección del C-término, y (X)n-1 representa los n-1 residuos de aminoácidos que están localizados entre dicho primer y dicho segundo residuo de cisteína en la secuencia primaria de dicha molécula proteica. En un aspecto, al menos uno de dichos residuos de aminoácidos que están localizados entre dicho primer y dicho segundo residuo de cisteína es modificado, pero esto no es necesario.

[0103] Como ya se ha explicado antes, Cx y Cx+n son preferiblemente los únicos residuos de cisteína presentes en dicho péptido. Otros residuos de cisteína en la secuencia primaria de dicha molécula proteica que son parte de (X)m, (X)n-1 y/o (X)p son preferiblemente cambiados en otro residuo de aminoácido tal como por ejemplo alanina, o vueltos inactivos, por ejemplo usando grupos protectores, para evitar interacción entre tales residuos de cisteína "adicionales" y Cx y/o Cx+n. Preferiblemente un conjunto de péptidos de la fórmula (X)m Cx (X)n-1 Cx+n (X)p se produce donde las secuencias flanqueantes (X)m y (X)p son al menos en parte de diferente longitud, m y p preferiblemente cumplen la fórmula 0 =< m,p =< 18. Además, m+n+p son preferiblemente menos que, o igual a, 23 para producir un péptido con una longitud de 25 residuos de aminoácidos o menos. Dicho al menos un péptido es posteriormente acoplado a un soporte.

[0104] En otro aspecto de la invención, una molécula proteica de interés comprende un enlace de disulfuro entre dos residuos de cisteína, donde dichos dos residuos de cisteína están localizados más de 21 residuos de aminoácidos entre sí en la secuencia primaria (que significa que la posición de la primera cisteína es x y la posición de la segunda cisteína es x + n, donde n > 21). En este aspecto, una parte de la secuencia primaria de dicha molécula proteica se considera preferiblemente que comienza en el residuo de aminoácido en la posición x +[(n-20)/2] y que termina en el residuo de aminoácido en la posición x +[(n+20)/2] en la secuencia primaria de dicha molécula proteica. Un método para producir un peptidomimético de la invención es así preferiblemente realizado con dicha parte, lo cual significa que al menos un residuo de aminoácido de dicha parte es seleccionado, al menos una secuencia flanqueante de la misma es seleccionada, etcétera. Se describe por lo tanto un método para producir un peptidomimético según la invención donde al menos un residuo de aminoácidos es seleccionado de una secuencia de puente SS de dicha al menos una molécula proteica. Preferiblemente, las dos cisteínas de dicho puente SS se localizan en la posición x y (x + n), donde n > 21, y dicho residuo de aminoácido es preferiblemente seleccionado de una región de dicha secuencia de puente SS comenzando en la posición de aminoácidos x

+ [(n-20)/2] y terminando en la posición de aminoácidos x + [(n+20)/2].

[0105] El siguiente ejemplo no limitativo aclara esto. Si dos residuos de cisteína se localizan en la posición 1 y 31 de la secuencia primaria de una molécula proteica, los siguientes valores son usados: x = 1, x+n = 31, y n=30. Posteriormente, se considera que una secuencia entre dichos dos residuos de cisteína comienza en la posición de aminoácidos 1 +[(30- 20)/2] = 6 y termina en la posición de aminoácidos 1 +[(30+20)/2] = 26. Así, la secuencia entre la posición 6 y 26 en la secuencia primaria de dicha molécula proteica se toma en consideración. Al menos un residuo de aminoácido de dicha secuencia entre la posición 6 y 26 es seleccionado, al menos una secuencia flanqueante de dicho al menos un residuo de aminoácido seleccionado es seleccionado, etcétera. Nuevamente, preferiblemente una pluralidad de péptidos es generada, estos péptidos son preferiblemente de diferente longitud y/o estos péptidos preferiblemente comprenden secuencias flanqueantes diferentes.

[0106] Si n es un número impar, los valores [(n-20)/2] y [(n+20)/2] no serán números enteros. En este caso el valor resultante es redondo. Luego, se toma el primer valor de número entero que es bien más pequeño o más grande que dicho valor. Por ejemplo, si n=35, el valor de [(n-20)/2] es 7.5. En este caso, el valor 7 u 8 es elegido.

[0107] Si una molécula proteica de interés comprende más de un enlace de disulfuro interno, cuando cada enlace de disulfuro está entre dos residuos de cisteína, un método para producir un peptidomimético de la invención es preferido en el que al menos un residuo de cisteína es seleccionado. Un método para producir un peptidomimético según la invención es por lo tanto descrito en el que al menos uno de dichos residuos de aminoácidos seleccionados en la secuencia primaria de dicha al menos una molécula proteica es un residuo de cisteína. Más preferiblemente cada residuo de aminoácido seleccionado es un residuo de cisteína de dicha molécula proteica. Como consecuencia, cada secuencia flanqueante seleccionada es una secuencia flanqueante de un residuo de cisteína. Péptidos son producidos comprendiendo al menos una secuencia flanqueante de al menos un residuo de cisteína. Preferiblemente, diferentes secuencias flanqueantes se combinan en un péptido. De forma más preferida, una pluralidad de péptidos que comprende secuencias flanqueantes de diferente longitud son producidos. Esto es particularmente útil para seleccionar un compuesto de unión y/o compuesto inmunógeno, ya que las secuencias flanqueantes de residuos de cisteína que están normalmente ligadas entre sí a través de enlaces de disulfuro están frecuentemente implicadas con eventos de interacción.

[0108] Un elemento de la familia de nudo de cistina comprende más de un enlace de disulfuro. Al menos tres enlaces de disulfuro están presentes entre tres pares de residuos de cisteína. Por lo tanto, un elemento de la superfamilia de nudo de cistina comprende al menos seis residuos de cisteína (CyaI a CysVI en el orden de secuencia). Si un elemento de la familia de nudo de cistina se considera como una molécula proteica de interés, preferiblemente al menos dos de dichos residuos de cisteína se seleccionan en un método para produccir un peptidomimético según la invención. De la forma más preferible, CysIV y CysV son seleccionados, porque estos residuos de cisteína y los residuos de aminoácidos entre éstos naturalmente forman el bucle de horquilla beta-3 (B3) dentro de una molécula proteica. Los péptidos que imitan dicho bucle se consideran especialmente adecuados como peptidomiméticos de un elemento de la familia de nudo de cistina.

[0109] Peptidomiméticos que se diseñan y sintetizan con un método para producir un peptidomimético según la presente invención son especialmente adecuados para seleccionar un compuesto inmunógeno y/o compuesto de unión de interés. Por ejemplo, una pluralidad de peptidomiméticos según la presente invención es sintetizada e incubada con una molécula de unión de interés, tal como por ejemplo un anticuerpo o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo, y/o una célula T o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo. Peptidomiméticos unidos son seleccionados y/o identificados. Un método para seleccionar la presencia y/o identidad de un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión de interés es descrito, el método comprendiendo:

-: producir una pluralidad de compuestos que comprende péptidos diferentes con un método según la invención; y

-: evaluar si al menos uno de dichos compuestos es capaz de unir específicamente un anticuerpo o una parte funcional, derivado o análogo del mismo específico para dicha al menos una molécula proteica, o una célula T o una parte funcional, derivado o análogo de la misma específica para dicha al menos una molécula proteica. Dicha pluralidad de compuestos preferiblemente comprende al menos 10, más preferiblemente al menos 100, de la forma más preferible al menos 1000 compuestos para mejorar la posibilidad de que esté presente un compuesto con una característica deseada.

[0110] Una parte funcional de un anticuerpo o una célula T es definida como una parte que tiene las mismas propiedades inmunógenas en especie, no necesariamente en cantidad. Por propiedades inmunógenas se entiende la capacidad para específicamente enlazar un antígeno. Un derivado de un anticuerpo o una célula T se define como un anticuerpo o una célula T que ha sido alterado de manera que las propiedades inmunógenas del derivado resultante son esencialmente las mismas en especie, no necesariamente en cantidad. Un derivado se puede proporcionar de muchas maneras, por ejemplo a través de la sustitución de aminoácidos conservadores. Un experto en la técnica es capaz de generar compuestos análogos de un anticuerpo o una célula T. Esto e por ejemplo se hace a través de la selección de una biblioteca de péptidos. Tal análogo tiene esencialmente las mismas propiedades inmunógenas de dicho anticuerpo o célula T en especie, no necesariamente en cantidad.

[0111] Por ejemplo, las propiedades inmunógenas de un peptidomimético de la invención se evalúan proporcionando a un animal no humano dicho compuesto y determinando si una respuesta inmune es suscitada. Un peptidomimético según la invención es útil en un método para seleccionar la presencia y/o identidad de un compuesto inmunógeno, el método comprendiendo:

-: evaluar si al menos uno de dichos compuestos es capaz de suscitar una respuesta inmune.

[0112] Preferiblemente se evalúa si un péptido de la invención es capaz de suscitar una respuesta inmune contra una molécula proteica de interés. Esto es por ejemplo realizado proveyendo a un animal no humano con un peptidomimético de la invención, obteniendo anticuerpos y/o células T de dicho animal no humano, incubando dichos anticuerpos y/o células T con (un epítopo de) una molécula proteica de interés y determinando si dichos anticuerpos y/o células T comprenden un anticuerpo y/o célula T que es capaz de unir específicamente dicha (epítopo de dicha) molécula proteica de interés.

[0113] Si un peptidomimético de la invención resulta ser un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión de interés, es preferiblemente seleccionado. Un método para producir un peptidomimético según la invención, que comprende además seleccionar un compuesto que incluye un sitio inmunógeno o un sitio de unión de interés es por lo tanto también útil. Dicho compuesto seleccionado es preferiblemente identificado.

[0114] Un compuesto seleccionado puede directamente ser usado como un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión. Alternativamente, un compuesto seleccionado se trata como un compuesto candidato prometedor. Esto significa que una investigación adicional es realizada. Dicho compuesto candidato puede ser además evaluado después de una primera ronda de selección. Por ejemplo, si un compuesto candidato prometedor se selecciona durante un método de selección in vitro, es por ejemplo evaluado adicionalmente in vivo en un animal no humano. Dicho compuesto candidato prometedor se puede modificar y evaluar otra vez por la presencia de al menos una característica mejorada. Esto es por ejemplo realizado con mapeo de red de sustitución, donde una pluralidad de péptidos es sintetizada. En cada péptido al menos un residuo de aminoácido del péptido prometedor original se sustituye por otro residuo de aminoácido. Los péptidos resultantes se evaluan nuevamente para determinar si al menos uno de los péptidos modificados comprende al menos una característica mejorada.

[0115] Un péptido candidato prometedor identificado en una primera selección se puede combinar con otra secuencia peptídica para buscar compuestos con una propiedad inmunógena mejorada y/o propiedad de unión.

[0116] Un método para producir un peptidomimético de la invención es conveniente para la producción y/o identificación de un peptidomimético según la presente invención que incluye una propiedad inmunógena y/o propiedad de unión de interés para producir un peptidomimético. Dicho peptidomimético comprende un péptido acoplado a un soporte. Dicho soporte comprende una molécula (hetero)aromática, más preferiblemente un halometilareno bis(bmmometil)benceno, un tris(bromometil)benceno o un tetra(bromometil)benceno. De la forma más preferible dicho soporte comprende al menos un soporte meta-dibromoxileno (m-T2), al menos un soporte 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno (T3), y/o al menos un soporte 1,2,4,5 tetrabromodureno (T4). Peptidomiméticos según la invención se adecúan para una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, un peptidomimético según la invención se usa para un uso terapéutico. Un peptidomimético según la invención es por ejemplo adecuado para uso como un agonista o un antagonista para un par de unión de ligando-receptor. En una forma de realización un peptidomimético con una propiedad inmunógena deseada está provisto. Un peptidomimético según la invención comprende un péptido inmunógeno unido a un soporte para mejorar la estabilidad y actividad biológica de dicho péptido inmunógeno. En una forma de realización un péptido inmunógeno se liga a una molécula (hetero)aromática, preferiblemente un halometilareno, a través de al menos dos funciones SH ya que tales reacciones de acoplamiento son fácilmente y rápidamente realizadas, incluso en solución acuosa, sin la necesidad de proteger residuos de aminoácidos de dicho péptido inmunógeno (salvo cualquier residuo de cisteína adicional). Por otra parte, el compuesto inmunógeno resultante es estable y el péptido comprende una estructura biológicamente significativa. Particularmente preferido, un péptido inmunógeno acoplado a un bis(bromometil)benceno, un tris(bromometil)benceno o un tetra(bromometil)benceno. De la forma más preferible un compuesto inmunógeno está provisto que incluye un péptido inmunógeno acoplado al menos a un soporte meta-1,3-bis(bromometil)benceno (m-T2), orto-1,2-bis(bromometil)benceno (o-T2), para-1,4bis(bromometil)benceno (p-T2), meta-1,3-bis(bromometil)piridina (m-P2), 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno (T3), meta-1,3bis(bromometil)-5-azidobenceno (m-T3-N3) y/o 1,2,4,5 tetrabromodureno (T4).

[0117] Una composición inmunógena que incluye un peptidomimético según la invención es también descrita. En una forma de realización dicho peptidomimético se acopla a un portador adecuado, por ejemplo una solución de solución salina y/o un portador de proteína tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero (p. ej. BSA o RSA), ovalbúmina, toxina de difteria (DT), partículas tipo virus, o cualquier otro portador adecuado conocido en la técnica. No obstante, el uso de un peptidomimético según la presente invención evita frecuentemente la necesidad de usar un portador. Esto proporciona la ventaja de que se evita una respuesta inmune específicamente dirigida contra tal portador adicional. Una composición inmunógena es descrita comprendiendo un compuesto inmunógeno, este compuesto inmunógeno comprende un péptido inmunógeno unido a un soporte, donde dicha composición inmunógena es (esencialmente) desprovista de un portador adicional. Una composición inmunógena puede comprender un adyuvante adecuado tal como por ejemplo adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund (IFA), una emulsión de aceite en agua o emulsión de doble aceite en agua o un adyuvante de sal de aluminio, Montanide ISA, MF59, hidróxido de aluminio, Titermax, RIBI, saponinas, y/o Covacuna. Una composición inmunógena que comprende un peptidomimético según la invención es preferiblemente administrado por vía oral o por aerosol o es preferiblemente inyectado intramuscularmente, subcutáneamente o a través de inyección transdérmica de alta presión sin aguja. Los rangos de dosis de peptidomiméticos según la invención para ser usados en una aplicación profiláctica y/o terapéutica son diseñados basándose en estudios de dosis crecientes en la clínica en ensayos clínicos para los cuales existen rigurosos requisitos protocolarios y que no necesitan explicación adicional en la presente. Típicamente, dosificaciones de entre 1 Ig a 1 mg por kilogramo de peso corporal son usados.

[0118] Preferiblemente, una composición inmunógena que comprende un peptidomimético según la invención comprende al menos dos peptidomiméticos inmunógenos diferentes según la invención. Dichos al menos dos peptidomiméticos inmunógenos diferentes son preferiblemente capaces de suscitar una respuesta inmune específicamente dirigida contra una molécula proteica de interés. De la forma más preferible dichos al menos dos peptidomiméticos inmunógenos diferentes son capaces de suscitar una respuesta inmune protectora específicamente dirigida contra una molécula proteica de interés en al menos el 50%, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, de la forma más preferible al menos el 95% de los huéspedes. Una respuesta inmune protectora contra una molécula proteica es definida aquí como una respuesta inmune que es capaz de contrarrestar al menos una propiedad de dicha molécula proteica.

[0119] En un aspecto cada uno de dichos peptidomiméticos diferentes de la invención es capaz de suscitar una respuesta inmune protectora contra dicha molécula proteica en al menos el 50%, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, de la forma más preferible al menos el 95% de los huéspedes. En un aspecto no obstante cada peptidomimético individual de la invención no es de por sí esencialmente capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra una molécula proteica de interés, mientras que una combinación de al menos dos peptidomiméticos según la invención es capaz de suscitar una respuesta inmune protectora contra dicha molécula proteica en al menos el 50%, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, de la forma más preferible al menos el 95% de los huéspedes. En este caso una composición inmunógena que comprende al menos dos peptidomiméticos inmunógenos según la invención es particularmente preferida. En un aspecto una composición inmunógena comprende al menos tres peptidomiméticos inmunógenos según la invención.

[0120] Una composición inmunógena que comprende al menos dos peptidomiméticos inmunógenos según la invención es especialmente adecuada para la inmunización contra un autoantígeno. Si una respuesta inmune contra un autoantígeno es deseada, un autoantígeno es preferiblemente, usado que es lo bastante modificado para poder suscitar una respuesta inmune, pero que al mismo tiempo se asemeja bastante al autoantígeno original de modo que una respuesta inmune inducida es capaz de reconocer autoantígenos. La inmunización con tales autoantígenos modificados regularmente no suponen una respuesta inmune eficaz vista la similitud de los autoantígenos modificados con autoantígenos inmodificados. No obstante, una combinación de al menos dos peptidomiméticos inmunógenos según la invención resuelve al menos en parte este problema porque tal combinación es más capaz de suscitar una respuesta inmune protectora.

[0121] En una forma de realización al menos dos péptidos inmunógenos diferentes se unen al mismo soporte. La inmunogenicidad es aumentada, por ejemplo porque los péptidos se fijan en otra conformación, diferentes orientaciones tridimensionales son obtenidas, y/o como resultado de polivalencia.

[0122] Un peptidomimético obtenible por un método para producir un peptidomimético según la presente invención es por ejemplo adecuada para suscitar una respuesta inmune en un animal no humano. Posteriormente, es posible aislar anticuerpos y/o células T capaces de unir específicamente dicho péptido inmunógeno y/o compuesto inmunógeno. Alternativamente, o adicionalmente, un anticuerpo o célula T o parte funcional, derivado y/o análogo del mismo, capaz de unir específicamente un peptidomimético de la invención, es generado ex vivo, por ejemplo incubando células T ingenuas con una célula presentadora de antígeno que ha sido impulsada con un peptidomimético inmunógeno según la invención. Un método para producir un peptidomimético según la invención, es por lo tanto descrito que comprende además seleccionar un compuesto inmunógeno y/o un compuesto de unión de interés, y producir un anticuerpo o célula T o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo capaz de unir específicamente dicho compuesto inmunógeno.

[0123] Un conjunto que comprende un peptidomimético según la invención es especialmente adecuado para seleccionar una prueba para la presencia de moléculas específicas, tal como un ligando o un receptor.

[0124] Un conjunto que comprende un peptidomimético es también especialmente adecuado para seleccionar una prueba para la presencia de anticuerpos y/o células T capaces de unir específicamente dicho peptidomimético según la invención. Por ejemplo, una prueba obtenida de un individuo se selecciona con un conjunto que comprende un peptidomimético según la invención para determinar si dicho individuo comprende anticuerpos y/o células T capaces de unir específicamente una molécula proteica de interés. Si tales anticuerpos y/o células T parecen estar presentes en dicha muestra, esto indica que dicho individuo está sufriendo de, o está en riesgo de sufrir de, un trastorno que implica la presencia de dicha molécula proteica de interés. Dicho (riesgo de) trastorno es por ejemplo provocado por una infección con un patógeno, por la presencia de células malignas, por una enfermedad autoinmune, etcétera.

Descripción detallada

[0125] La investigación de varios elementos de la familia de factor de crecimiento de nudo de cistina ha revelado que los péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos del bucle de la horquilla beta-3 (B3) de un elemento de la familia de crecimiento de nudo de cistina, dichos péptidos con características específicas, son especialmente adecuados para el uso como un peptidomimético. Se proporciona por lo tanto un peptidomimético según la reivindicación 1.

[0126] Se descubrió que estructuras de péptidos en bucle que reúnen estos criterios son adecuadamente usados como simuladores de elementos de la familia del nudo de Cys, como se constata entre otros por la capacidad para inducir una respuesta específica a anticuerpos en un animal.

[0127] Así, para conseguir una estructura de péptido en bucle que se asemeja suficientemente a la conformación nativa del bucle B3, hay un cierto criterio general que debería ser encontrado con respecto a la longitud del polipéptido y a la posición de los residuos de cisteínas dentro del polipéptido a través del cual se fija (cicliza) al soporte. La longitud peptídica también puede depender de la naturaleza del soporte. Este criterio general se refiere a los residuos conservados CysIV y CysV que se sitúan en el "Fondo" del bucle B3 en todos los elementos de los elementos de la familia del factor de crecimiento del nudo de Cys (ver figura 1B). Cabe indicar que, en la proteína nativa, el bucle B3 se forma como resultado de la estructura de nudo compleja y no por un enlace de disulfuro entre CysIV y CysV. En un peptidomimético de la invención, una molécula de soporte limita físicamente un polipéptido para inducir una estructura secundaria que simula el bucle B3. El soporte se fija a cisteínas en el polipéptido mejor que a las extremidades del polipéptido y el peptidomimético puede esquemáticamente ser considerado como molécula en forma de A (ver Figura 1C). Un peptidomimético de la invención es también referido como un soporte químicamente enlazado a un péptido, abreviado como CLIPS.

[0128] Identificación del bucle B3 y de residuos CysIV y CysV de un elemento de la familia de proteína del nudo de Cys dado puede hacerse basándose en la alineación de secuencias de las secuencias de aminoácidos primarias. La tabla 13 muestra tal alineación de varios elementos de la familia del factor de crecimiento de nudo de Cys de diferentes mamíferos. El bucle B3 comienza en el residuo conservado CysIV y termina con el N-terminal de residuo para CysV, aquí también referido como residuo CysV-1. Una vez los residuos CysIV y CysV conservados han sido identificados, las longitudes adecuadas del polipéptido y las posiciones de las cisteínas para unir el polipéptido al soporte pueden ser fácilmente determinadas.

[0129] Tablas 14A-E enumeran las posiciones de los seis residuos Cys conservados (CysI a CysVI) para cinco subfamilias diferentes de la familia del factor de crecimiento del nudo de Cys. Por ejemplo, hCG-alfa contiene diez residuos de cisteína (C-1 a C-10) en las posiciones 7, 12, 28, 31, 32, 59, 60, 82,84 y 87, respectivamente. Basado en la alineación de secuencias, C-2 de hCG corresponde a CysI, C-3 a CysII, C-4 es una cisteína "extra", C-5 corresponde a CysIII, etcétera. Así, en caso de un residuo Cys60 de hCG corresponde a CysIV y residuo Cys82 a CysV. Como otro ejemplo, en la subfamilia GLHB el elemento FSH-beta Cys51 corresponde a CysIV y Cys 82 a CysV. De una forma similar, los residuos CysIV y CysV pueden ser fácilmente identificados para otros elementos de la familia del nudo de Cys.

[0130] El primer y segundo criterios que tienen que ser reúnidos definen las posiciones en las que las cisteínas se deben introducir y a través de las cuales el polipéptido se fija al soporte. La posición de la primera (es decir, cisteína N-terminal basada en la secuencia del bucle B3) y segunda (es decir, Terminal) cisteína se consideran pertinentes para la capacidad del soporte para inducir una estructura secundaria que se asemeja óptimamente a la proteína nativa. El primer residuo de cisteína dentro de dicho polipéptido está localizado C-terminal (o "en sentido descendente") desde la posición de aminoácidos que corresponde al aminoácido CysIV en el bucle B3 de la proteína de tipo salvaje. Esta posición se puede indicar como posición CysIV+ p. La distancia hasta dicha posición CysIV debería no ser inferior a 5 residuos y no superior a 12 residuos. En otras palabras, la posición de la primera cisteína unida al soporte corresponde a la posición CysIV+p, donde 5 s p s 12. El segundo residuo de cisteína unido al soporte está localizado N-terminal (o "en dirección ascendente") desde la posición de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos CysV en el bucle B3 de la proteína de tipo salvaje. Esta posición se puede indicar como posición CysV- q. La distancia hasta dicha posición CysV debería no ser inferior a 4 residuos y no superior a 12 residuos. En otras palabras, la posición de la segunda cisteína unida al soporte corresponde a la posición CysV- q, donde 4 s q s 12. Además, para permitir la unión de ambas cisteínas a un soporte sin alterar la formación de una horquilla, es importante que las cisteínas estén posicionadas aproximadamente opuestas una a la otra. Por esta razón se requiere que (p -q) sea -3; -2, -1, 0, 1,2 o 3. Por ejemplo, las posiciones de las cisteínas a través de las cuales un polipéptido se fija a un soporte corresponden a la posición de aminoácidos CysIV+12 y CysV-10, o a CysIV+11 y CysV-10; CysIV+10 y CysV-8, CysIV+9 y CysV-8, CysIV+8 y CysV-6, CysIV+7 y CysV-5, CysIV+7 y CysV-6, CysIV+7 y CysV-4, CysIV+5 y CysV-4 o CysIV+6 y CysV-4. Posiciones preferidas para las cisteínas son CysIV+10 y CysV-8, CysIV+7 y CysV-6

o CysIV+8 y CysV-6. De la forma más preferible, está provisto un peptidomimético según la invención donde la posición de dicha primera y segunda cisteína corresponden a las posiciones CysrV+10 y CysV-8.

[0131] Preferiblemente, la primera y segunda cisteína se introducen en las posiciones de aquellos aminoácidos que, en la estructura de cristal, están dentro de una distancia de hasta 6Å una de la otra y cuyas cadenas laterales se orientan en la misma dirección. Dichas cadenas laterales que preferiblemente no están expuestas a la superficie aún participan en el llamado núcleo hidrofóbico que mantiene los bucles BI y B3 entre sí.

[0132] El tercer criterio que debería ser cumplido impone una restricción en la longitud del péptido. Según este criterio, la longitud del polipéptido es desde el aminoácido en la posición CysIV + x hasta los aminoácidos en la posición CysV + y, donde -5 s x s 1 donde 1 s y s 6 y bajo la condición de que x + y = -1, 0,1 o 2. En otras palabras, el primer residuo del polipeptídico corresponde al residuo CysIV+ x y el último residuo a CysV+ y. La condición de que x + y = -1, 0,1 o 2 asegura que después de la fijación del polipéptido al soporte las "patas" de la molécula en forma de A (ver Fig. 1C) son más o menos de longitud comparable para asegurar que el primer y último residuo de un polipéptido son residuos "vecinos" en la estructura de horquilla. Por ejemplo, la longitud del péptido es de CysIV +1 a CysV + 1, de CysIV-6 a CysV +6, de CysIV-3 a CysV+4, de CysIV-5 a CysV+4 o de CysIV-2 a CysV+ 4. Preferiblemente, la longitud del polipéptido es de CysIV +1 a CysV

+ 1, de CysIV.2 a CysV+ 4 o de CysIV-5 a CysV+4. En caso de FSHbeta, esto significa que el polipéptido por ejemplo corresponde a la extensión del aminoácido 52 (Cys5 +1) al aminoácido 83 (Cys82+1) o del aminoácido 46 (Cys51-5) al aminoácido 86 (Cys82+4).

[0133] El término "derivado de" se utiliza para indicar que la secuencia polipeptídica no debe ser idéntica a la secuencia de aminoácidos encontrada en el bucle B3 de proteínas de nudo de Cys de origen natural. Más bien, en la mayoría de los casos el polipéptido variará, además de los dos residuos de cisteína que han sido introducidos, en al menos un aminoácido de la secuencia del bucle B3 en las proteínas tipo salvaje de la familia de nudo de Cys. Como se describirá a continuación, se prefiere que cualquier residuo de cisteína en la secuencia natural diferente de las las dos cisteínas en las dos posiciones anteriormente descritas sea cambiado en un residuo que no es reactivo con el soporte para prevenir la fijación del polipéptido al soporte a través de un residuo diferente de dicha primera y segunda cisteínas.

[0134] Con base en el criterio anterior la invención proporciona peptidomiméticos de la familia de GLHA .

[0135] Como se ha mencionado, en un peptidomimético proporcionado aquí una molécula de soporte limita físicamente un polipéptido para inducir una estructura secundaria que imita el bucle B3. Los ejemplos más abajo demuestran la relevancia de la presencia de un soporte en un peptidomimético como se proporciona aquí. Cuando la primera y segunda cisteína se conectan a través de un soporte adecuado, el péptido resultante resulta un inmunógeno muy eficaz. En cambio, cuando la primera y segunda cisteína dentro de una molécula peptídica reaccionan entre sí para formar un puente de disulfuro, la estructura del péptido en bucle resultante puede no usarse para inducir una respuesta inmune específica en un animal de prueba. Es concebible que la restricción física proporcionada por el soporte sea importante para la formación de una estructura de horquilla que simula la estructura secundaria del bucle B3 en los elementos de la familia del nudo de Cys de origen natural.

[0136] Varios tipos de soportes se pueden usar en una estructura de péptido en bucle según la invención. Soportes adecuados son aquellos capaces de reaccionar con la primera y segunda cisteínas en el polipéptido para formar una estructura de péptido en bucle. Una molécula de soporte interesante particular es un compuesto (hetero)aromático, en particular aquellos con al menos dos sustituyentes de halógeno bencílico, tal como un halometilareno. Estos compuestos son altamente reactivos hacia grupos de tiol y rápidamente forman un enlace covalente con péptidos que comprenden un residuo de cisteína. En una forma de realización, un soporte es un bis(halometil)benceno o un tetra(halometil)benceno o un derivado. En una forma de realización preferida, un soporte se selecciona del grupo que consiste en orto-, meta- y paradihalometilbenceno (también conocido como dihaloxileno) y 1,2,4,5 tetra halometilbenceno (también conocido como 1,2,4,5tetrahalodureno). Más preferiblemente, el soporte es meta-dibromoxileno (m-T2) o 1,2,4,5 tetrabromodureno (T4). Debe considerarse que el término "soporte" como se utiliza en este caso se refiere a la molécula no reaccionada que puede utilizarse para preparar un peptidomimético de la invención (p. ej. meta-dibromobenceno) al igual que a la fracción de soporte en el peptidomimético resultante que ha reaccionado con las cisteínas y, en el caso del dibromobenceno, ya no contiene los átomos de halógeno. Métodos para construir un peptidomimético con estos soportes se discuten en WO2004077062.

[0137] Algunas combinaciones de soportes y péptidos fueron observadas que producían peptidomiméticos muy útiles. En una forma de realización, una estructura de péptido en bucle comprende un polipéptido con una longitud de CysIV+1 a CysIV+1 que se fija a un soporte de metadihaloxileno, preferiblemente metadibromoxileno. Una longitud de péptido preferido para fijación a un soporte de tetrahalodureno, por ejemplo a 1,2,4,5 tetrabromodureno es de CysIV.2 a CysV+4.

[0138] Con respecto a la posición de las cisteínas a través de las cuales se forma una estructura de péptido en bucle sobre un soporte, las posiciones particularmente útiles fueron identificadas para subfamilias diferentes de la superfamilia de nudo de Cys de factores de crecimiento.

[0139] Posiciones preferidas de las cisteínas para obtener un simulador de un elemento de la subfamilia de GLBH son CysIV+10 en combinación con CysV-8. En caso de FSH esto corresponde a los residuos 61 y 74. No obstante, para elementos de la familia GLBH, las posiciones CysIV+12 y CysV-10, CysIV+8 y CysV-6 o CysIV+7 y CysV-5 también dan buenos resultados.

[0140] Posiciones preferidas para las cisteínas para obtener un simulador de un elemento que pertenece a la familia GLHA son CysIV+8 y CysV-6 (en el caso de residuos de CG 68 y 76). Otras combinaciones útiles de posiciones de cisteínas para elementos de la familia GLHA incluyen CysIV+6 y CysV-4.

[0141] En una forma de realización, la invención proporciona un simulador de un elemento de la familia GLBH, donde dicho simulador es una estructura de péptido en bucle consistiendo en un polipéptido unido a través de dos cisteínas a un soporte, dicho polipéptido siendo derivado de la secuencia de aminoácidos del bucle de la horquilla beta-3 de dicho elemento, donde la longitud de dicho polipéptido es desde la posición de los aminoácidos CyarV-5 a CysV+4 y donde dicho polipéptido se une a través de una primera cisteína en la posición CysIV+10 y una segunda cisteína en la posición CysV-8 a un soporte de tetrahalometil benceno, preferiblemente tetrabromodureno. En otra forma de realización, dicho polipéptido se une a través de dichas cisteínas a un soporte bifuncional, por ejemplo un dibromobenceno, donde la longitud del péptido es algo más corta, por ejemplo desde el aminoácido CysIV+1 a CysV+1.

[0142] En otra forma de realización, la invención proporciona un simulador de un elemento de la familia de GLBH donde dicho simulador es una estructura de péptido en bucle consistiendo en un polipéptido unido a través de dos cisteínas a un soporte, dicho polipéptido siendo derivado de la secuencia de aminoácidos del bucle de la horquilla beta-3 de dicho elemento, donde la longitud de dicho polipéptido es desde la posición de aminoácidos CysIV-5 a CysV+4 y donde dicho polipéptido se une a través de una primera cisteína en la posición CysIV+10 y una segunda cisteína en la posición CysV-8 a un soporte de tetrahalometil benceno, preferiblemente tetrabromodureno. En otra forma de realización, dicho polipéptido se une a través de dichas cisteínas a un soporte bifuncional, por ejemplo un dibromobenceno, donde la longitud del péptido es algo más corta, por ejemplo de aminoácido CysIV+1 a CyaV+1.

[0143] En otra forma de realización, la invención proporciona un simulador de un elemento de la familia de GLBH donde dicho simulador es una estructura de péptido en bucle consistiendo en un polipéptido unido a través de dos cisteínas a un soporte, dicho polipéptido siendo derivado de la secuencia de aminoácidos del bucle de la horquilla beta-3 de dicho elemento, donde la longitud de dicho polipéptido es de posición de aminoácidos CysIV-5 a CysV+4 y donde dicho polipéptido se une a través de una primera cisteína en la posición CysIV+10 y una segunda cisteína en la posición CysV-8 a un soporte de tetrahalometil benceno, preferiblemente tetrabromodureno. En otra forma de realización, dicho polipéptido se une a través de dichas cisteínas a un soporte bifuncionalizado, por ejemplo un dibromobenceno, donde la longitud del péptido es algo más corta, por ejemplo de aminoácido CysIV+1 a CysV+1.

[0144] En el caso del polipéptido, la longitud es tal que incluye un residuo CysIV y/o CyaV esto significa que al menos aquellas cisteína(s) no debería(n) estar presente(s) en el polipéptido para evitar una reacción química con el soporte. Se pueden por ejemplo cambiar a un residuo que no es reactivo con el soporte, por ejemplo un residuo de alanina, para prevenir la fijación del polipéptido al soporte a través de una cisteína diferente de las dos cisteínas anteriormente descritas. Asimismo, cualquier otro residuo de cisteína en la secuencia natural debe ser cambiado en un residuo sin cisteína. Por ejemplo, la invención proporciona en un aspecto particular un peptidomimético de FSH consistiendo en un polipéptido derivado del bucle B3 de FSH con la secuencia TFKELViETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH fijada a metadibromobenceno. (ver también ejemplo 3). La longitud polipeptídica corresponde a la extensión de CysIV+1 (Thr52) a CysV+1 (His52). La primera C indicada en negrita corresponde a la posición CysIV+10 (Val61 en FSH) y la segunda C a la posición CysV-8 (Tyr74 en FSH). El residuo Cys66 en FSH no está presente en el polipéptido para prevenir interacción indeseada con el soporte. En el polipéptido derivado de FSH hay una alanina (la primera de los tres residuos de alanina). Los mismos cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia de FSH de origen natural se pueden encontrar en otro peptidomimético de FSH de la invención que consiste en el polipéptido KIQKTATFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAHAGK (que corresponde a CysIV-6 a CysV+4) fijado al soporte 1,2,4,5 tetrabromodureno. No obstante, en este caso también Cys84 en FSH (que corresponde a CysVI) fue cambiado por una alanina de manera que los últimos 6 residuos son AHAGK en vez de CHCGK como se encuentra en FSH.

[0145] Es también posible usar un polipéptido que comprende un aminoácido protegido para evitar reactividad indeseada de dicho aminoácido. En una forma de realización, un polipéptido comprende además de las dos cisteínas destinadas a la fijación al soporte un residuo de cisteína (p. ej. un residuo correspondiente a CysIV) que se protege con el grupo protector separable Cys(StBu). Después de la fijación a un soporte para producir un peptidomimético de la invención, el grupo protector puede fácilmente ser eliminado por tratamiento reductivo, por ejemplo con 1,4-DDT o etano ditiol.

[0146] En otro aspecto, un peptidomimético se prepara fijando un polipéptido a través de dos cisteínas sobre un soporte donde dicho polipéptido es derivado del bucle BS pero donde uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen por una unidad bioisostérica. La sustitución bioisostérica se puede definir como la sustitución de un grupo funcional en una molécula bioactiva por otra funcionalidad teniendo tamaño similar y propiedades fisicoquímicas. Sustituciones bioisostéricas se usan en la industria farmacéutica para optimizar propiedades de candidatos farmacológicos (actividad, selectividad, transporte), para eliminar efectos secundarios indeseados o para diseñar moléculas que son más fáciles de sintetizar. La sustitución bioisoetérica puede tener base fisicoquímica o topológica.

[0147] En otro aspecto adicional, la invención proporciona un peptidomimético para hCG consistiendo en el polipéptido WANYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQAAL fijado a 1,2,4,5 tetrabromodureno como soporte para formar una estructura en bucle que se asemeja al bucle B3 de hCG. Dos cisteínas (indicadas en negrita) fueron introducidas en la secuencia en las posiciones 61 (CysIV+10) y 74 (CysV-8). Cisteínas en las posiciones 51 (CysIV), 66,82 (CysV) y 84 (CysVI) en la proteína de tipo salvaje (ver tabla 13) fueron alteradas en los residuos de alanina. La longitud del polipéptido corresponde a la extensión de CysIV-2 (Val49) a CysV+4 (Leu86) en hCG. También se proporciona un peptidomimético que comprende un polipéptido con la secuencia NYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQ donde el péptido se une a través de las cisteínas indicadas en negrita al soporte m-T2.

[0148] También se proporciona un peptidomimético de FSH que comprende un polipéptido con la secuencia TFKCLVYETVRVPGAAHHADSLYTYPVACQAH fijada al soporte m-T2, un peptidomimético de FSH que comprende un polipéptido con la secuencia TFKELVYETCRVPGDAHHADSLCTYPVATQAH fijada al soporte m-T2, un peptidomimético de FSH que comprende un polipéptido con la secuencia TFKELViETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH fijada al soporte T3, un peptidomimético de FSH que comprende un polipéptido con la secuencia TFKELVYETCRVPGDAHHADKLCTYPVATQAH fijada al soporte m-T2, un peptidomimético de FSH que comprende un polipéptido con la secuencia TFKELVYETCRVPGDAHKADSLCTYPVATQAH fijada al soporte m-T2, y un peptidomimético de hCG que comprende un polipéptido con la secuencia

fijada a dos soportes m-T2. Como se muestra en los ejemplos, estos peptidomiméticos son especialmente adecuados para suscitar antisueros específicos de FSH y hCG.

[0149] Además, la invención se refiere a un método para la preparación de un peptidomimético de la invención. Se proporciona un método para preparar un compuesto de péptido en bucle según la invención, que incluye las etapas de proporcionar el polipéptido y soporte modificados y contactar dicho polipéptido y soporte bajo condiciones que permiten la fijación covalente de dicho polipéptido a dicho soporte, preferiblemente donde dicho contacto se realiza en solución, más preferiblemente en una solución acuosa. Dicho polipéptido modificado tiene una secuencia derivada del bucle B3 de la proteína de interés, donde la longitud del polipéptido reúne los criterios mencionados arriba y donde el polipéptido contiene un primer y un segundo residuo de cisteína en las posiciones como se ha descrito en detalle anteriormente. El polipéptido puede ser un péptido sintético. La síntesis se puede realizar usando síntesis de péptidos de fase sólida estándar o cualquier otra vía de producir polipéptidos. El soporte preferiblemente comprende dos grupos reactivos capaces de formar un enlace covalente con dicha primera y segunda cisteína del polipéptido, así induciendo la formación de una estructura de péptido en bucle. La reacción de acoplamiento es preferiblemente realizada usando un polipéptido con cadenas laterales de aminoácidos desprotegidos. Preferiblemente, la reacción de acoplamiento se realiza en solución, más preferiblemente en una solución acuosa. Información detallada con respecto a la síntesis de una estructura de péptidos en bucle usando unos soportes funcionalizados de halógeno se pueden encontrar en la solicitud de patente internacional WO2004077062.

[0150] En otra forma de realización, una composición de vacuna que comprende un peptidomimético según la invención está provista. Pruebas animales revelaron que una composición que comprende un peptidomimético que satisface el criterio descrito aquí puede inducir la formación de una respuesta inmune específica. Ejemplo 3 muestra que la inyección del polipéptido TFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH derivado de FSH (residuos 52-83) ciclizado sobre un soporte m-T2 en ratas resulta en la producción de anticuerpos que son reactivos con FSH nativa. Buenos resultados fueron también obtenidos con el péptido derivado de FSH KIQKTATFKELViETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAHAGK (residuos 49-86) ciclizado con el soporte T4. La relevancia de la longitud polipeptídica como se describe aquí se demuestra por la gran reducción en la inducción de anticuerpos cuando se usa un péptido con una secuencia desde la primera cisteína (posición CysIV+10) hasta la segunda cisteína (posición CysV-8). Cuando se fija a un soporte, este péptido tiene una estructura en bucle que todavía carece de los extremos libres que representan las "patas" del peptidomimético en forma de A característico de la invención.

[0151] La importancia de ciclización de péptidos sobre un soporte adecuado es evidente del Ejemplo 3 y Fig. 2 que demuestran que el péptido derivado de FSH TFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH ciclizado sobre el soporte m-T2 produce un título de anticuerpo altísimo mientras que el suero de ratas que reciben sólo péptido lineal o péptido que ha sido ciclizado a través de un puente disulfuro entre las dos cisteínas no mostraron reconocimiento significativo de FSH. Además, para este péptido particular el soporte meta-T2 se prefiere a soportes orto- o para-T2.

[0152] Ejemplo 6 describe los resultados de un experimento de vacunación realizado en ratas usando varias composiciones peptídicas como vacuna a base de péptidos. Seis semanas después de la administración de péptidos, el suero de las ratas fue evaluado por la capacidad de reconocer hCG. Con fines de comparación, dos anticuerpos disponibles comercialmente contra hCG fueron incluidos. Las ratas que fueron inyectadas con un peptidomimético según la invención mostraron una buena respuesta específica a anticuerpos de hCG mientras que las ratas inyectadas con la versión lineal o ciclizada por SS del mismo polipéptido no mostraron una respuesta significativa (Fig. 3).

[0153] La invención así también proporciona una vacuna que comprende un compuesto de péptido en bucle según la invención. Los compuestos de péptido inmunógeno se pueden utilizar solo para inducir inmunidad celular. También pueden ser usados, por ejemplo en una composición de vacuna, junto con otras moléculas para inducir la producción de anticuerpos

o una respuesta humoral. El peptidomimético se puede acoplar a un portador, por ejemplo un portador de proteína tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero (p. ej. BSA o RSA), ovalbúmina u otra.

[0154] También se proporciona el uso de una vacuna que comprende un peptidomimético del nudo de Cys de la invención.

[0155] En una forma de realización, una vacuna proporcionada aquí se usa como vacuna de regulación de la natalidad en mamíferos, preferiblemente en seres humanos. Hay habitualmente dos métodos principales de anticoncepción hormonal masculina. Uno se basa en la testosterona (análogos) bien sola o en combinación con la hormona de liberación de gonadotropina (gnRH) (análogos o inmunizaciones), el otro en inmunizaciones contra la hormona estimulante de folículos (FSH). Teóricamente, éste método suprimirá la espermatogénesis sin interferir con la libido. En una forma de realización preferida, la invención proporciona una vacuna anti-FSH para uso en la anticoncepción masculina. Preferiblemente, dicha vacuna anti-FSH no incluye anticuerpos de la hormona anti-luteinizante (LH) (LH siendo responsable de la inducción de testosterona que es necesaria para mantener la libido).

[0156] En otra forma de realización, la invención proporciona el uso de un compuesto peptídico en bucle como un péptido terapéutico en el tratamiento anticáncer. Por ejemplo, está provista una vacuna que se puede usar en la inmunoterapia activa. Por ejemplo, dicha vacuna comprende un compuesto de péptido en bucle que imita la hCG. La hormona hCG se produce naturalmente durante el embarazo y se considera que estimula el crecimiento y protege el desarrollo del embrión de incursión inmunológica (es decir, rechazo). hCG es un marcador bioquímico de malignidad asociado a los principales tipos de cáncer. Se ha mostrado que la expresión de hCG se correlaciona con la agresividad tumoral, es decir, cuanto mayor es la expresión de hCG, más agresivo es el tumor. En ambos casos, la hCG sirve como un factor de crecimiento, promoviendo la división celular rápida. Promueve la implantación e invasión de tejidos, fomenta la angiogénesis, la formulación de vasos sanguíneos y facilita la inmunosupresión, permitiendo al feto o tumor evitar el rechazo. Por lo tanto, una respuesta inmune dirigida contra la hCG estimula una incursión inmunológica contra el tumor y neutraliza los beneficios hormonales proporcionados por la hCG. Como resultado, una vacuna anti-hCG puede ser eficaz para el bloqueo de la fertilidad, y por lo tanto puede también ser eficaz para el tratamiento del cáncer. De hecho, estudios clínicos que usan vacunas de hCG en cáncer indican que una respuesta inmune a la hCG tiene un papel significativo en la supervivencia del paciente.

[0157] En una forma de realización preferida, una vacuna está provista que comprende un peptidomimético de la invención que es capaz de inducir una variedad de respuestas inmunológicas huéspedes (humorales, celulares) contra los factores proangiogénicos en organismos portadores de tumores. Es de interés particular un peptidomimético del sistema VEGFA/VEGFR-2, debido al papel crítico de este sistema en la angiogénesis tumoral (la formación de nuevos vasos sanguíneos al tumor).

[0158] La invención se ejemplifica en los Ejemplos siguientes. Los ejemplos no limitan el ámbito de la invención de ninguna manera.

Breve descripción de los dibujos

[0159]

Figura 1: representación esquemática del bucle B3 de elementos de la familia del factor de crecimiento del nudo de Cys y peptidomiméticos del mismo. Panel A muestra la estructura de bucle general de los varios elementos de la familia de proteínas del nudo de Cys. Panel B muestra el bucle B3 que incluye residuos CysIV y CysV. Panel C muestra el diseño estructural de un peptidomimético de la invención donde dos cisteínas se introducen en el polipéptido de manera que la fijación covalente del polipéptido a través de estas cisteínas hasta un soporte (indicado como T) induce al péptido a adoptar una conformación que se asemeja a la estructura secundaria del bucle B3 en la proteína nativa

Figura 2: resultados de un experimento de vacunación usando peptidomiméticos de FSH. Suero de ratas inmunizado con el compuesto peptídico indicado en el eje X fue analizado usando ELISA para determinar si el péptido puede inducir una respuesta inmune contra FSH nativa. Cuatro diluciones en serie del suero fueron evaluadas (1/10,1/30,1/100, y 1/300). Anticuerpo policlonal 5215 (no. 15) y anticuerpo monoclonal 6602 (no. 16) contra FSH fueron usados como control positivo.

Detalles están descritos en el Ejemplo 3.

Figura 3: resultados de un experimento de vacunación usando peptidomiméticos de hCG. Suero de ratas inmunizado con el compuesto peptídico indicado en el eje X (ver tabla 5 para los diferentes péptidos y soportes usados) fue analizado usando ELISA para determinar si el péptido puede inducir una respuesta inmune contra hCG nativa. Varias diluciones en serie del suero fueron evaluadas. Anticuerpo hCG-B2 (no. 7) fue usado como control positivo. Detalles están descritos en el Ejemplo

6.

Figura 4: soportes aromáticos con orto-, meta-, o para-posicionamiento de dos grupos de halometilo. Hal se refiere a átomos de cloro, bromo, o yodo.

1,2-bis(halometil)benceno y otros regioisómeros 3,4-bis(halometil)piridina (X=N) y otros regioisómeros 3,4-bis(halometil)piridazina (X=N) y otros regioisómeros 4,5-bis(halometil)pirimidina (X=N) y otros regioisómeros 4,5-bis(halometil)pirazina (X=N) y otros regioisómeros 4,5-bis(halometil)-1,2,3-triazina (X=N) y otros regioisómeros 5,6-bis(halometil)-1,2,4-triazina (X=N) y otros regioisómeros 3,4-bis(halometil)pirrol (X=N), furano (X=O), tiofeno (X=S) y otros regioisómeros 4,5-bis(halometil)imidazol (X=N,N), oxazol (X=N,O), tiazol (X=S) y otros regioisómeros 4,5-bis(halometil)-3H-pirazol (X=N,N), isooxazol (X=N,O), isotiazol (X=S) y otros regioisómeros 1,2-bis(bromometilcarbonilamino)benceno (X1 =NH, X2 =O) 2,2'-bis(halometil)bifenileno 2,2"-bis(halometil)terfenileno 1,8-bis(halometil)naftaleno 1,10-bis(halometil)antraceno Bis(2-halometilfenil)metano

Figura 5: soportes aromáticos con orto-, meta-, o para-posicionamiento de tres grupos de halometilo:

1,2,3-tris(halometil)benceno y otros regioisómeros 2,3,4-tris(halometil)piridina (X=N) y otros regioisómeros 2,3,4-tris(halometil)piridazina (X=N) y otros regioisómeros 3,4,5-tris(halometil)pirimidina (X=N) y otros regioisómeros 4,5,6-tris(halometil)-1,2,3-triazina (X=N) y otros regioisómeros 2,3,4-tris(halometil)pirrol (X=N), furano (X=O), tiofeno (X=S) y otros regioisómeros 2,4,5-bis(halometil)imidazol (X=N,N), oxazol (X=N,O), tiazol (X=S) y otros regioisómeros 3,4,5-bis(halometil)-1H-pirazol (X=N,N), isooxazol (X=N,O), isotiazol (X=S) y otros regioisómeros 2,4,2'-tris(halometil)bifenileno 2,3',2"-tris(halometil)terfenileno 1,3,8-tris(halometil)naftaleno 1,3,10-tris(halometil)antraceno Bis(2-halometilfenil)metano

Figura 6: soportes aromáticos con orto-, meta-, o para-posicionamiento de cuatro grupos de bromometilo.

1,2,4,5-tetra(halometil)benceno y otros regioisómeros 1,2,4,5-tetra(halometil)piridina (X=N) y otros regioisómeros 2,4,5,6-tetra(halometil)pirimidina (X1 =X2 =N) y otros regioisómeros 2,3,4,5-tetra(halometil)pirrol (X=NH), furano (X=O), tiofeno (X=S) y otros regioisómeros 2,2'.6,6'-tetra(halometil)bifenileno 2,2",6,6"-tetra(halometil)terfenileno 2,3,5,6-tetra(halometil)naftaleno 2,3,7,8-tetra(halometil)antraceno Bis(2,4-bis(halometil)fenil)metano (X=CH2)

Figura 7: representación esquemática de la síntesis en una única fase de constructos de péptidos de bucle único, doble y triple.

Figura 8: representación esquemática de la síntesis gradual de péptidos en bucle doble a través de reacción inicial de un péptido parcialmente protegido de Cys(Trt) con mP2, seguido de eliminación de los grupos protectores de Trt restantes y reacción posterior con un segundo equivalente de mP2.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Diseño y preparación de compuestos inmunógenos basados en CCR5

Materiales & métodos

Síntesis de péptidos en micromatrices y reacción con soporte m-P2 o T3

[0160] El injerto del soporte de polipropileno con ácido poliacrílico fue realizado irradiando el soporte en una solución de ácido acrílico al 6% que contiene CuSO4 usando radiación gama a una dosis de 12 kGy. El soporte de sólido injertado conteniendo grupos de ácido carboxílico fue posteriormente reaccionado con t-butiloxicarbonil-hexametilenodiamina (Boc-HMDA) usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) con N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y escisión posterior de los grupos Boc usando ácido trifluoroacético (TFA). Los péptidos fueron sintetizados usando química de Fmoc estándar y, después de la acilación, desprotegidos por reacción con TFA (15 ml/g resina) que contiene 13,3% (p) fenol, 5% (v) tioanisol, 2,5% (v) etanoditiol de 1,2, y 5% (v) milliQ-H2O durante 2-4 hrs a TA. Después de lavado 3x con H2O, las micromatrices peptídicas fueron tratadas con exceso de una solución 1.0 mM de bien mP2 o T3 en 20 mM de bicarbonato de amonio (pH 7.8)/acetonitrilo (1:1 v/v) durante 30-60 min. a temperatura ambiente, seguido de 3x lavado con 50% ACN/ H2O. Luego, las micromatrices fueron lavadas con exceso de filtro millipore H2O y sonicadas en el tampón de interrupción (1% SDS/0.1% 6mercaptoetanol (BME) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.2) a 70°C durante 30 min. seguido de sonicación en filtro millipore H2O durante otros 45 min.

Síntesis de Soportes:

[0161] Los soportes están disponibles comercialmente por Aldrich.

Selección de micromatrices con anticuerpos

[0162] Micromatrices fueron pretratadas con PBS durante 30 min. seguido de prerecubrimiento con tampón de incubación (PBS que contiene 5% ovalbúmina, 5% suero de caballo y 1% Tween-80) durante 1 hora. Luego, las micromatrices fueron incubadas con mAb (típicamente 1/1000, diluido en el tampón de incubación) durante toda la noche a 4°C. Después del lavado (3x10min.) con PBS/Tween-80 (0,05%), los péptidos fueron incubados con anticuerpo de conejo anti-ratón marcado con peroxidasa durante 1 h a 25 °C (rampo, 1/1/1000 Dako, Glostrup, Dinamarca) y posteriormente, después lavado nuevamente (3x10min.) con PBS/Tween-80 (0,05%), incubado con el sustrato de peroxidasa 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS; 50 mg en 100 ml 0,1M de tampón (pH 4.0) de ácido cítrico-fosfato de sodio (McIlvaine) que contiene 20 ul 30% H2O2). Después de 1h la absorbancia (a 405 nm) fue medida usando una cámara CCD (XC-77RR, Sony, Japón). mAb unido fue eliminado por sonicación en el tampón de interrupción como se ha descrito anteriormente. Las micromatrices fueron reutilizadas para selección aproximadamente 10-15 veces.

CCR5

[0163] CCR5 es un correceptor de citocina que se usa por VIH para introducción celular. Anticuerpos específicamente dirigidos contra CCR5 por lo tanto serían adecuados para contrarrestar la introducción celular por VIH. No obstante, la inmunización con CCR5 entero es problemática puesto que CCR5 es una proteína de transmembrana. Para poder suscitar anticuerpos específicos de CCR5, compuestos inmunógenos basados en CCR5 son por lo tanto deseados.

[0164] Para diseñar compuestos de prueba adecuados, 4 secuencias CCR5 fueron tenidas en cuenta: un dominio de Ntérmino (Nt) y tres dominios de bucle extracelular extendidos con aproximadamente 1-6 residuos de aminoácido adyacentes de los dominios de transmembrana (N-terminalmente al igual que C-terminalmente). Estos dominios de bucle extracelular son llamados e1, e2 y e3. Las secuencias primarias de los dominios considerados son de la siguiente manera (comenzando N-terminalmente):

Nt: MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIA e1: PFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGL e2: IFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQ e3: NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM

[0165] Los residuos de cisteína forman puentes de C nativos en CCR5 natural.

[0166] El dominio extracelular en el lado N-terminal del residuo Cys en e2 es llamado ECL2A mientras que el dominio

extracelular en el lado C-terminal del residuo Cys en e2 es llamado ECL2B. Asimismo, el dominio extracelular en el lado Nterminal del residuo Cys en e3 es llamado ECL3A mientras que el dominio extracelular en el lado C-terminal del residuo Cys en e3 es llamado ECL3B.

ECL2A: TRSQKEGLHYT ECL2B: SSHFPYSQYQFWK ECL3A: QEFFGLNN ECL3B: SSSNRLDQ

[0167] Posteriormente, varios residuos de aminoácidos se seleccionan en la secuencia primaria de Nt, e1, e2 y e3. Secuencias flanqueantes de estos aminoácidos seleccionados se seleccionan y se producen péptidos que comprenden estas secuencias flanqueantes. Residuos de cisteína se usan como grupos capaces de reaccionar con un soporte.

[0168] Los siguientes péptidos fueron sintetizados:

[0169] Péptidos sintetizados y seleccionados

1 todos los 18 que se superponen a 21-meros lineales que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIA

2 todos los 9 que se superponen a 18-meros lineales que cubren MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

3 todos los 8 que se superponen a 19-meros lineales que cubren Nt

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

4 todos los 7 que se superponen a 20-meros lineales que cubren Nt MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

5 todos los 6 que se superponen a 21-meros lineales que cubren Nt MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

6 todos los 7 que se superponen a 18-meros lineales que cubren e1 PFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGL

7 todos los 6 que se superponen a 19-meros lineales que cubren e1 PFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGL

8 todos los 5 que se superponen a 20-meros lineales que cubren e1 PFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGL

9 todos los 4 que se superponen a 21-meros lineales que cubren e1 PFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGL

10 todos los 13 que se superponen a 18-meros lineales que cubren e2 IFTRSQKEGLHiTCSSHFPYSQYQFWKNFQ

11 todos los 12 que se superponen a 19-meros lineales que cubren e2 IFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQ

12 todos los 11 que se superponen a 20-meros lineales que cubren e2 IFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQ

13 todos los 10 que se superponen a 21-meros lineales que cubren e2

IFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQ

14 todos los 5 que se superponen a 18-meros lineales que cubren e3 NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM

15 todos los 4 que se superponen a 19-meros lineales que cubren e3 NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM

16 todos los 3 que se superponen a 20-meros lineales que cubren e3 NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM

17 todos los 2 que se superponen a 21-meros lineales que cubren e3 NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM

18: todos los 23 que se superponen a 6-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

19: todos los 22 que se superponen a 7-meros en bucle con T2 que cubren

MDiQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

20: todos los 21 que se superponen a 8-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

21: todos los 20 que se superponen a 9-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYD>TIYYTSEPCQKINVK

22: todos los 19 que se superponen a 10-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

23: todos los 18 que se superponen a 11-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

24: todos los 17 que se superponen a 12-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPYDIIVYYTSEPCQKINVK

25: todos los 16 que se superponen a 13-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

26: todos los 15 que se superponen a 14-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

27: todos los 14 que se superponen a 15-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

28: todos los 13 que se superponen a 16-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

29: todos los 12 que se superponen a 17-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

30: todos los 11 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

31: todos los 10 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

32: todos los 9 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

33: todos los 8 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren

MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVK

34: todos los 8 que se superponen a 6-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

35: todos los 7 que se superponen a 7-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

36: todos los 6 que se superponen a 8-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

37: todos los 5 que se superponen a 9-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

38: todos los 4 que se superponen a 10-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

39: todos los 3 que se superponen a 11-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

40: todos los 2 que se superponen a 12-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

41: todos los 1 que se superponen a 13-meros en bucle con T2 que cubren e1 AAAQWDFGNTM

42: todos los 7 que se superponen a 6-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

43: todos los 6 que se superponen a 7-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

44: todos los 5 que se superponen a 8-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

45: todos los 4 que se superponen a 9-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

46: todos los 3 que se superponen a 10-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

47: todos los 2 que se superponen a 11-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

48: todos los 1 que se superponen a 12-meros en bucle con T2 que cubren e2a RSQKEGLHYT

49: todos los 10 que se superponen a 6-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

50: todos los 9 que se superponen a 7-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

51: todos los 8 que se superponen a 8-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

52: todos los 7 que se superponen a 9-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

53: todos los 6 que se superponen a 10-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

54: todos los 5 que se superponen a 11-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

55: todos los 4 que se superponen a 12-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

56: todos los 3 que se superponen a 13-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

57: todos los 2 que se superponen a 14-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

58: todos los 1 que se superponen a 15-meros en bucle con T2 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWK

59: todos los 13 que se superponen a 6-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

60: todos los 12 que se superponen a 7-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

61: todos los 11 que se superponen a 8-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

62: todos los 10 que se superponen a 9-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

63: todos los 9 que se superponen a 10-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

64: todos los 8 que se superponen a 11-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

65: todos los 7 que se superponen a 12-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

66: todos los 6 que se superponen a 13-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

67: todos los 5 que se superponen a 14-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

68: todos los 4 que se superponen a 15-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

69: todos los 3 que se superponen a 16-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

70: todos los 2 que se superponen a 17-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

71: todos los 1 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e3 QEFFGLNNCSSSNRLD

72: todos los 11 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren Nt

MDYQVSSPIYDINYYTSEPAQKINVK

73: todos los 10 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren Nt

MDYQVSSP1YDINYYTSEPAQKINVK

74: todos los 9 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren Nt

MDYQVSSPRYDINYYTSEPAQKINVK

75 todos los 8 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren Nt MDYQVSSPIYDINYYTSEPAQKINVK

76 todos los 13 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e3 MDYQVSSPIYDINYYTSEPA-G-SSSNRLD

77 todos los 12 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e3 MDYQVSSPIYDINYYTSEPA-G-SSSNRLD

78 todos los 11 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e3 MDYQVSSPIYDINYYTSEPA-G-SSSNRLD

79 todos los 10 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e3 MDYQVSSPIYDINYYTSEPA-G-SSSNRLD

80 todos los 4 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e1 QKINVK-GG-AAAQWDFGNTM

81 todos los 3 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e1 QKINVK-GG-AAAQWDFGNTM

82 todos los 2 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e1 QKFNVK-GG-AAAQWDFGNTM

83 todos los 1 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e1 QKINVK-GG-AAAQWDFGNTM

84 todos los 2 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren Nt+ECL3A QKINVK-GG-QEFFGLNNC

85 todos los 1 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren Nt+ECL3A QKINVK-GG-QEFFGLNNC

86 todos los 10 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2a AAAQWDFGNTM-GGG-RSQKEGLHYTC

87 todos los 9 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren el+e2a AAAQWDFGNTM-GGG-RSQKEGLHYTC

88 todos los 8 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2a AAAQWDFGNTM-GGG-RSQKEGLHYTC

89 todos los 7 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2a AAAQWDFGNTM-GGG-RSQKEGLHYTC

90 todos los 7 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2b AAAQWDFGNTM-GGG-SSHFPYSQYQFWK

91 todos los 11 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2b AAAQWDFGNTM-GGG-SSHFPYSQYQFWK

92 todos los 10 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2b AAAQWDFGNTM-GGG-SSHFPYSQYQFWK

93 todos los 9 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e1+e2b AAAQWDFGNTM-GGG-SSHFPYSQYQFWK

94 todos los 9 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e1+e3 AAAQWDFGNTM-GGGG-QEFFGLNNC

95 todos los 8 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren e1+e3 AAAQWDFGNTM-GGGG-QEFFGLNNC

96 todos los 7 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e1+e3 AAAQWDFGNTM-GGGG-QEFFGLNNC

97 todos los 6 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e1+e3 AAAQWDFGNTM-GGGG-QEFFGLNNC

98 todos los 9 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e2a+e2b RSQKEGLHYT-A-SSHFPYSQYQFWK

99 todos los 8 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren e2a+e2b RSQKEGLHYT-A-SSHFPYSQYQFWK

100 todos los 7 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e2a+e2b RSQKEGLHYT-A-SSHFPYSQYQFWK

101 todos los 6 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e2a+e2b RSQKEGLHYT-A-SSHFPYSQYQFWK

102 todos los 14 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e1 CSSHFPYSQYQFWK-GGG-AAAQWDFGNTMC

103 todos los 13 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e1 CSSHFPYSQYQFWK-GGG-AAAQWDFGNTMC

104 todos los 12 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e1 CSSHFPYSQYQFWK-GGG-AAAQWDFGNTMC

105 todos los 11 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e1

CSSHFPYSQYQFWK-GGG-AAAQWDFGNTMC

106 todos los 17 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e3 CSSHFPYSQYQFWK-GG-QEFFGLNNASSSNRLD

107 todos los 16 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e3 CSSHFPYSQYQFWK-GG-QEFFGLNNASSSNRLD

108 todos los 15 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e3 CSSHFPYSQYQFWK-GG-QEFFGLNNASSSNRLD

109 todos los 14 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e2b+e3 CSSHFPYSQYQFWK-GG-QEFFGLNNASSSNRLD

110 todos los 15 que se superponen a 18-meros en bucle con T2 que cubren e3+el QEFFGLNNASSSNRLD-GGG-AAAQWDFGNTM

111 todos los 14 que se superponen a 19-meros en bucle con T2 que cubren e3+el QEFFGLNNASSSNRLD-GGG-AAAQWDFGNTM

112 todos los 13 que se superponen a 20-meros en bucle con T2 que cubren e3+e1 QEFFGLNNASSSNRLD-GGG-AAAQWDFGNTM

113 todos los 12 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren e3+el QEFFGLNNASSSNRLD-GGG-AAAQWDFGNTM

114 todos los 9 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e3b MDYQVSSPIYDINYYTSEC-G-CSSSNRLD

115 todos los 36 que se superponen a 21-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e3b DYQVSSPIYDINYYTSEPC-G-CSSSNRLDQAMQ

116 19 a 21-meros en bucle con T2 que cubren Nt+e1 QKINVK-GG-CAAAQWDFGNTMC

117 18 a 21-meros en bucle con P2P2 que cubren e AAAQWDFGNTM izquierda y e2a SQKEGLHYT derecha C------1-G-1------C

118 21-meros en bucle con P2P2 que cubren e1 AQWDFGN izquierda y e2a SSHFPYSQYQFWKN derecha C-----1-G-1------C

119 21-meros en bucle con P2P2 que cubren e HYAAAQWDFGNTM izquierda y e2a SSHFPYSQYQFWKN derecha C-----1-G-1------ C

120 21-meros en bucle con P2P2 que cubren Nt SEPCQKINVK izquierda y e3 QEFFGLNNCSSSN derecha C----1-G-1------C

121 péptidos 16 a 20-meros en bucle con T3 que cubren e1 AAAQWDFGNTM izquierda y e2a RSQKEGLHYT derecha

122 péptidos 20-meros en bucle con T3 que cubren e1 AQWDFGNTM izquierda y e2b SSHFPYSQYQFWKNF derecha

123 péptidos 20-meros en bucle con T3 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWKNF izquierda y e1 AAAQWDFGNTM derecha

124 péptidos 20-meros en bucle con T3 que cubren e2b SSHFPYSQYQFWKNF izquierda y e3 QEFFGLNNASSSNRLDQ derecha

125 péptidos 20-meros en bucle con T3 que cubren e1 YAAAQWDFGNTM izquierda y e3 QEFFGLNNASSSNRLDQ derecha,GCG en el medio

126 péptidos 20-meros en bucle con T3 que cubren e3 QEFFGLNNASSSNRLDQ izquierda y e1 YAAAQWDFGNTM derecha,GCG en el medio

127 péptidos 21-meros en bucle con T3 que cubren e2 SLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTL

128 péptidos 21-meros en bucle con T3 que cubren Nt DYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYS

[0170] En la primera serie de péptidos (primera fila de la tabla anterior), los aminoácidos C-terminales ,K,I,N,V,K,Q,I, y A de la secuencia Nt fueron seleccionados. Posteriormente, secuencias flanqueantes N-terminales con una longitud de 21 residuos de aminoácidos fueron seleccionadas. Por lo tanto, MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQ fue una secuencia flanqueante de K, DYQVSSPIYDINYYTSEPCQK fue una secuencia flanqueante de I, YQVSSPIYDINYYTSEPCQKI fue una secuencia flanqueante de N, etcétera. Posteriormente, los péptidos fueron producidos conteniendo una de estas secuencias flanqueantes.

[0171] Asimismo, en la segunda serie de péptidos (segunda fila de la tabla anterior), los aminoácidos C-terminales P, C, Q, K,I,N,V y K de la secuencia Nt fueron seleccionados. Posteriormente, secuencias flanqueantes N-terminales con una longitud de 18 residuos de aminoácidos fueron seleccionadas. Por lo tanto, MDYQVSSPIYDINYYTSE fue una secuencia flanqueante de P, DYQVSSPIYDINYYTSEP fue una secuencia flanqueante de C, YQVSSPIYDINYYTSEPC fue una secuencia flanqueante de Q, etcétera. Posteriormente, los péptidos fueron producidos conteniendo una de estas secuencias flanqueantes.

[0172] Los péptidos de las primeras 17 series de péptidos (filas 1-17 de la tabla anteriormente mencionada) no se unieron a

un soporte y resultaron ser menos adecuados en comparación con péptidos unidos a soportes.

[0173] En la 18ª serie de péptidos todos los aminoácidos, salvo los primeros 6 aminoácidos N-terminales, fueron seleccionados y las secuencias flanqueantes N-terminales con una longitud de 6 aminoácidos fueron seleccionadas. Posteriormente, los péptidos fueron producidos conteniendo una de estas secuencias flanqueantes y dos residuos de cisteína. Los péptidos fueron acoplados a un soporte P2 a través de sus dos residuos de cisteína. Cabe indicar que, si una secuencia flanqueante comprendía un residuo de cisteína que no estaba destinada al acoplamiento, la cisteína fue sustituida por alanina. Los péptidos de las series 19-75 fueron producidos de forma similar.

[0174] En las series 76-116 las secuencias flanqueantes derivadas de dos dominios diferentes de CCR5 fueron combinadas. Por ejemplo, en las series 76-79, las secuencias flanqueantes derivadas de Nt fueron combinadas con secuencias flanqueantes derivadas de e3. Asimismo, en la serie 80-83, secuencias flanqueantes derivadas de Nt fueron combinadas con secuencias flanqueantes derivadas de e1, etcétera. Los péptidos resultantes fueron acoplados a P2 a través de dos residuos de cisteína.

[0175] En las series 117-120, dos soportes P2 fueron usados. Se produjeron péptidos comprendiendo dos secuencias flanqueantes, donde una secuencia flanqueante derivada de e1 fue combinada con una secuencia flanqueante derivada de e2a (filas 117-119 de la tabla anterior) y una secuencia flanqueante derivada de Nt fue combinada con una secuencia flanqueante derivada de e3 (fila 120 de la tabla anterior). Residuos de cisteína estuvieron presentes al principio y al final de cada secuencia flanqueante (por lo tanto, había cuatro cisteínas en total). Si una secuencia flanqueante comprendía un residuo de cisteína que no estaba destinado al acoplamiento, la cisteína fue sustituida por alanina. Posteriormente, los péptidos fueron acoplados a dos soportes P2, usando los cuatro residuos de cisteína anteriormente mencionados. (Los residuos de cisteína se representan en la tabla anterior como C y 1) Las dos cisteínas representadas como C fueron ambas acopladas a un soporte T2 y los dos residuos de cisteína representados como 1 fueron ambos acoplados a otro soporte.

[0176] En las series 121-128, un soporte T3 fue usado. Los péptidos fueron producidos comprendiendo dos secuencias flanqueantes derivadas de distintos dominios CCR5. Tres residuos de cisteína fueron incorporados en los péptidos para acoplarlos a un soporte T3 .

Ensayo de selección

[0177] Los péptidos producidos fueron incubados con el anticuerpo 2D7 anti-CCR5 comercialmente disponible .

Resultados

[0178] Compuestos prometedores que fueron capaces de unir Ab 2D7 con una afinidad alta se representan más abajo.

2D7 (1 Ig/ml) 2D7 (10 Ig/ml) 2D7 (0.1 Ig/ml 447 CQKEGLHiTC 2706 2943 261 443 CQKEGLHYC 2636 3090 148 449 CSQKEGLHYTC 2606 2889 99 1160 CWDFGNTMCQKEGLHYTC 2469 2765 315 450 CRSQKEGLHYTC 2364 2852 107 702 CNTMGGGRSQKEGLHYTC 1580 2787 68 1159 CQWDFGNTCQKEGLHYTC 1153 2636 213 719 CFGNTMGGGRSQKEGLHYT C 678 2819 113 1158 CAQWDFGNCQKEGLHYTC 416 2377 132

[0179] Todos los compuestos de la tabla anterior comprenden péptidos unidos a P2 o T3. Todos los compuestos fueron capaces de unir anticuerpo 2D7.

[0180] Conclusión: con este ejemplo mostramos que un método según la invención es conveniente para identificar simuladores de CCR5, capaces de unir 2D7, mientras que péptidos lineales no fueron capaces de unir 2D7. Tales péptidos son además usados en experimentos de inmunización para suscitar anticuerpos específicos de CCR5 capaces de neutralizar la infección por VIH.

Ejemplo 2: Diseño y preparación de compuestos inmunógenos basados en interleuquina 5

[0181] Para diseñar compuestos adecuados, cinco series de compuestos fueron generadas. Los compuestos fueron posteriormente incubados con un anticuerpo disponible comercialmente capaz de unir específicamente IL5 (anticuerpo 39D10): Serie 1

[0182] Secuencias superpuestas de 18-meros de la secuencia IL5 entera fueron generadas. Los péptidos no fueron acoplados a un soporte. Ninguno de estos péptidos fue capaz de unir 39D10 con afinidad aceptable.

Serie 2

[0183] Secuencias superpuestas de 13-meros de la secuencia IL5 entera fueron generadas. Los péptidos fueron producidos conteniendo una secuencia de 13-meros y un residuo de cisteína N-terminal y C-terminal. Si un 13-mero comprendía un residuo de cisteína que no estaba destinado al acoplamiento, la cisteína fue sustituida por alanina. Posteriormente, los péptidos fueron acoplados a un soporte P2 a través de sus residuos de cisteína N-terminal y C-terminal. Los compuestos resultantes fueron posteriormente incubados con Ab 39D10. Algunos compuestos fueron capaces de unirse, pero ningún compuesto favorable fue encontrado.

[0184] En serie 3 - serie 5, las dos secuencias siguientes de interleuquina 5 fueron tenidas en cuenta:

Parte-1 KKKSGEERRRVNQFLDY Parte-2, LIANETLRIPVPVHKNH

[0185] Cabe indicar que los cuartos residuos de aminoácidos de la parte-1, la serina, es un residuo de cisteína en IL5 humano natural. Para evitar el acoplamiento de los soportes a esta cisteína, la cisteína fue sustituida por serina.

Serie 3

[0186] En esta serie, las primeras tres secuencias de aminoácidos y los últimos tres residuos de aminoácidos de la parte-1 y parte-2 fueron seleccionados. Posteriormente, las secuencias flanqueantes C-terminal y N-terminal con una longitud de entre 14 y 16 residuos de aminoácidos fueron seleccionadas. Los péptidos fueron producidos con una secuencia flanqueante y un residuo de cisteína N-terminal y C-terminal. Posteriormente, los péptidos fueron acoplados a un soporte P2 a través de sus residuos de cisteína N-terminal y C-terminal. Los compuestos resultantes fueron posteriormente incubados con Ab 39D10. Algunos compuestos que comprenden una secuencia flanqueante de la parte-1 fueron capaces de unir Ab 39D10.

Serie 4

[0187] En esta serie, las secuencias flanqueantes derivadas de la parte-1 fueron combinadas con secuencias flanqueantes derivadas de la Parte-2. 21-meros fueron producidos según las siguientes secuencias esquemáticas:

CXXXXXXXXCXXXXXXXXC CXXXXXXXCXXXXXXXXXC CXXXXXXCXXXXXXXXXXC CXXXXXCXXXXXXXXXXXC CXXXXCXXXXXXXXXXXXXXC CXXXCXXXXXXXXXXXXXC CXXXKXXXXXXCXXXXXXXC CXXXXXXXXXCXXXXXXXC CXXXXXXXXXXCXXXXXXC CXXXXXXXXXXXCXXXXXC CXXXXXXXXXXXXCXXXXC CXXXXXXXXXXXXXCXXXC

donde la primera extensión de X residuos representa una secuencia flanqueante derivada de la parte-1 y la segunda extensión de X residuos representa una secuencia flanqueante derivada de la parte-2. Por lo tanto, las longitudes de las secuencias flanqueantes difieren pero la longitud total del péptido resultante es la misma (21 residuos de aminoácidos). Los péptidos fueron acoplados a un soporte T3. Los compuestos resultantes fueron posteriormente incubados con Ab 39D10. Varios compuestos fueron encontrados con alta afinidad de enlace a Ab 39D10. Estos compuestos se describen a continuación con más detalle.

Serie 5

[0188] También en esta serie las secuencias flanqueantes derivadas de la parte-1 fueron combinadas con secuencias flanqueantes derivadas de la parte-2. En esta serie los péptidos resultantes (con una secuencia flanqueante derivada de la parte-1 y una secuencia flanqueante derivada de la parte-2) fueron de diferente longitud. Los péptidos fueron acoplados a T3 a través de tres residuos de cisteína y posteriormente incubados con Ab 39D10. Los resultados están perfilados a continuación con más detalle.

Resultados

[0189] Los siguientes cuatro péptidos, acoplados a T3, resultan tener una afinidad alta a Ab 39D10:

1. AC-CEERRRVCANETLRIPVPCGSC: (T3) 1:1500

2. AC-CSGEERRRVCANETLRIPCGSC: (T3) 1:1500

3. AC-CEERRRVNQCANETLRIPCGSC: (T3) 1:2000

4. AC- CGEERRRCIANETLRIPCGSC: (T3) 1:4000

[0190] Todos los cuatro péptidos contienen una secuencia parcial de la parte-1 y una secuencia parcial de la parte-2.

[0191] Estos cuatro péptidos fueron usados en los experimentos de inmunización para evaluar si son capaces de suscitar anticuerpos contra IL5 humana entera. Los péptidos, que son todos derivados de IL5 humana, resultaron ser capaces de suscitar anticuerpos que mostraban reacción cruzada fuerte con IL5 humana entera con títulos de anticuerpos de 1:1500,1: 2000 y 1:4000 (calculado según valores de OD que fueron el 50 % de los valores de ODmax).

Conclusión

[0192] Péptidos que comprenden combinaciones de secuencias flanqueantes derivadas de distintas regiones resultan parecerse más cercanamente a un epítopo de IL5 nativa. Estos péptidos fueron encontrados con un método de selección según la invención.

EJEMPLO 3: Diseño y preparación de peptidomiméticos de FSH y uso de los mismos como vacuna de péptido.

[0193] En este experimento, polipéptidos correspondientes al bucle B3 de FSH fueron diseñados, donde dos residuos de aminoácidos han sido sustituidos por un primer y un segundo residuo de cisteína en el polipéptido, estas cisteínas se fijan una a la otra a través de un soporte, donde:

-: dicho primer residuo de cisteína unida al soporte se introduce en la posición CysIV+ p localizada p residuos C-terminales desde la posición que corresponde a los aminoácidos CysIV en el bucle B3 de tipo salvaje, donde 5 s p s 12;

-: dicho segundo residuo de cisteína unido al soporte se introduce en la posición CysV - q localizado q residuos N-terminales de la posición que corresponde a los aminoácidos CysV en el bucle B3 tipo salvaje, donde 4 s q s 12 y donde (p - q) es -3; 2, -1, 0, 1, 2 o 3 y

-: la longitud de dicho polipéptido es desde el aminoácido en la posición CysIV + x al aminoácido en la posición CysV + y, donde -5 s x s 1 y 1 s y s 6 bajo la condición de que x + y = -1, 0, 1 o 2.

[0194] Péptidos fueron sintetizados por síntesis del péptido de fase sólida usando una resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmocaminometil)-fenoxi (RinkAmide) (BACHEM; Alemania) en un sintetizador Syro (MultiSynTech, Alemania). Todos los aminoácidos fueron comprados y usados como N-alfa-(Fmoc) protegido con funciones de cadenas laterales protegidas como grupos N-T-Boc (KW), O-t-Bu (DESTY), N-Trt (HNQ), S-Trt (C), o N-Pbf (R). Un protocolo de acoplamiento usando un exceso de plegamiento de 6,5 veces de HBTU/HOBt/aminoácido/DIPEA (1:1:1:2) en NMP con una activación de 30 min. usando acoplamientos dobles fue empleado. Péptidos acetilados fueron divididos de la resina por reacción con TFA (15 mL/g resina) conteniendo 13,3% (p) fenol, 5% (v) tioanisol, 2,5% (v) 1,2-etanodiol, y 5% (v) milliQ-H2O durante 2-4h a temperatura ambiente, y posteriormente precipitados con éter dietílico (al menos 3x el volumen de TFA). Péptidos crudos fueron purificados por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RPC), bien en un "DeltaPack" (25 o 40 x 100 mm diámetro interno, 15 micrómetros de tamaño de partícula, 100 A de tamaño de poro; Waters, EEUU) o en un "XTERRA" (50 x 4.6 mm diámetro interno, 2.5 micrómetros de tamaño de partícula Waters, EEUU) Columna C18 preparatoria RP-18 con un gradiente AB lineal de 1-2% B/min donde solvente A fue 0.05% TFA en agua y solvente B fue 0.05% ACN. El peso molecular de ión primario correcto de los péptidos fue confirmado por espectrometría de masas de ionización por pulverización de electrones en una Micromasa ZQ (Micromass, Países Bajos) o un espectrómetro de masas VG Quattro II (VG Organic, UK). Los polipéptidos fueron bien ciclizados sobre un T2 (1h reacción de péptido y 1.05 equivalente de T2 en 20% acetonitrilo (ACN)/80% bicarbonato de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente), o soporte T4 (1h reacción de péptido y 0.5 equivalente de T4 en 60% ACN/40% bicarbonato de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente) o directamente ciclizado a través de oxidación de SS de las cisteínas. Los soportes fueron obtenidos de Sigma-Aldrich. Además, una versión lineal del polipéptido que carece de las cisteínas fue preparada (ver tabla 4). Posteriormente, ratas Wistar hembra fueron inmunizadas en el día 0 con 400 uL de un ~2.5 mg/mL del péptido o constructo de péptido-T en PBS/CFA 1:1 (v/v) (PBS = solución salina tamponada con fosfato, CFA = Adjuvante Completo de Freund), seguido de un impulsor (misma cantidad y concentración) a 4 semanas. Posteriormente, los títulos peptídicos fueron determinados después de 6 semanas para controlar la respuesta inmunológica y finalmente las ratas fueron desangradas después 8 semanas y los antisueros fueron recogidos. Antisueros fueron analizados en un ELISA de unión de FSH (Greiner, PS; GDA-recubrimiento con 1 ug/mL de FSH (Biotrend)) usando sulfonato de 2,2'-azina-di(etilbenztiazolina) (ABTS) en la combinación con un suero de cabra-anti-rata marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo. Anticuerpos pAb 5215 (Biogenesis) y mAb 6602 (Medix Biochemicals) fueron incluidos en el análisis como controles positivos.

Tabla 4A

Muestra no.: Polipéptidoa Soporteb

1: *CRVPGDAHHADSLC# m-T2

2: *CRVPGDAHHADSLC# T4

3: *CVRVPGAAHHADSLYC# m-T2

4: *CVRVPGAAHHADSLYC# T4

5: *YETCRVPGDAHHADSLCTYP# m-T2

6: *YETCRVPGDAHHADSLCTYP# T4

7: *TFEELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH# m-T2

8: T4

9: *CYTRDLVYKDPARPKIQKTC# T4

10: m-T2

11: *TQAHCGKADSDSTDC# T4

12: *TFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH# Ninguno; SS ciclizado

13: *TFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH# T4

14: *TFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQAH# Ninguno; lineal

a secuencia del polipéptido se da en una abreviatura de una letra. * denota N-término y # denota C- término. b m-T2 se refiere a meta-bis(bromometil)benceno y T4 se refiere a 1,2,4,5 tetrabromodureno.

10 [0195] Los resultados mostrados en la Figura 2 demuestran la relevancia de fijar un polipéptido derivado de B3 a un soporte ya que ni el péptido correspondiente ciclizado a través de oxidación de SS ni el polipéptido lineal son inmunógenos por ellos mismos.

[0196] A continuación, los mismos resultados se representan con más detalle en tablas 4B y 4C. Varios valores, tales como 15 las posiciones de CLIPS p y q, están indicados.

Tabla 4B. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con péptidos derivados de FSH de diferente longitud y región de superficie + actividades de neutralización correspondientes en el ensayo de estímulo de FSH.

No.: Secuencia peptídica + CLIPS Posiciones de CLIPS (p,q) AA's en FSH (x; y) título AB (10 semanas) 2 ratasb ensayo de estimulación de FSH Neutr.c

1: *CRVPGDAHHADSLC# + m-T2 10, 8 10; -8 <1 (2x) -(2x)

2: *CVRVPGAAHHADSLYC# + m-T2 9,7 9; -7 <1 (2x) -(2x)

3: *YETCRVPGDAHHADSLCTYP# + m-T2 10,8 7; -5 <1 (2x) - (2x)

4: 10,8 1, 1 <1, 4,0 - 1/64

5: 10,8 .5. 4 <1 (2x) -(2x)

6: *CRVPGDAHHADSLC# + T4 10,8 10,-8 <1 (2x) - (2x)

7: *CVRVPGAAHHADSLYC# + T4 9, 7 9; -7 <1 (2x) - (2x)

8: *YETCRVPGDAHHADSLCTYP# + T4 10,8 7; -5 <1 (2x) - (2x)

9: 10,8 -5, 4 3,0; 2,5 1/1/16

10: *QYTRDLVYKDPARPKIQKTQ# + T4 -19, 31 -19, - 31 <1 (2x) - (2x)

11: *TQAHCGKADSDSTDC# + T4 33; -12 29,-12 <1 (2x) - (2x)

a: aminoácidos impresos en negrita son sustituyentes para residuos Cys nativos en estas posiciones, aminoácidos

impresos subrayados indican los residuos Cys en los que los CLIPS están fijados. btítulos de anticuerpos se dan como valores -10log de la dilución de suero en la que la OD en ELISA de unión sigue siendo >3x la OD anterior (1/10 dilución = 1,1/100=2,1/1000=3,1/10 000=4, etc.). cda la dilución máxima de suero purificado (columna de protG) en la que el bloqueo completo de la bioactividad inducida por FSH sigue siendo observado (a 6 ng/mL estímulación celular de FSH).

Tabla 4C. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con péptidos derivados del bulce FSH- 3 icw. CLIPS diferentes (en la posición CysIV+p, CysV-q; longitud: CysIV+x, CysV+y) y actividades de neutralización correspondientes en bioensayo celular Y1.

No.: Secuencia peptídica + CLIPS posiciones de CLIPS (p; q) AA's en FSH (x; y) título AB(10 semanas) 2 ratasb ensayo de estimulación de FSH Neutr.c

1: 10,8 10; -8 3.0; <1 1/1/16;

2: 10, 8 10; -8 <1 (2x) - (2x)

3: 10, 8 10; -8 <1 (2x) - (2x)

4: n.a. 10,-8 <1 (2x) - (2x)

a aminoácidos impresos en negrita son sustituyentes para residuos Cys nativos en estas posiciones, aminoácidos impresos subrayados indican los residuos Cys en los que los CLIPS están fijados. btítulos de anticuerpos se dan como valores -10log de la dilución de suero en la que la OD en ELISA de unión sigue siendo >3x la OD anterior (1/10 dilución = 1,1/100=2,1/1000=3,1/10 000=4, etc.). cda la dilución máxima de suero purificado (columna de protG) en la que el bloqueo completo de la bioactividad inducida por FSH sigue siendo observado (a 6 ng/mL estímulación celular de FSH).

5 [0197] Los resultados claramente demuestran que es posible generar compuestos inmunógenos derivados del bucle beta3 de FSH (ver compuestos 4 y 9 en la tabla 4B y compuesto 1 en la tabla 4C). Los compuestos inmunógenos dan lugar a la producción de anticuerpos FSH específicos.

10 EJEMPLO 4: Diseño y preparación de peptidomiméticos de FSH y uso de los mismos como vacuna de péptido.

[0198] En este experimento, un conjunto de polipéptidos correspondiente al bucle ß3 de FSH, que difiere en la longitud y configuración quiral de los residuos de cisteína para fijación de CLIPS, fueron diseñados y sintetizados como se ha descrito anteriormente. Los polipéptidos fueron ciclizados sobre un m-T2 (1h reacción de péptido y 1.05 equivalente de m-T2 en 20%

15 acetonitrilo /80% bicarbonato de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente). Posteriormente, ratas Wistar hembra fueron inmunizadas en el día 0 con 400 uL de un ~2.5 mg/mL del péptido o constructo de péptido-T en PBS/CFA 1:1 (v/v) (PBS = solución salina tamponada con fosfato, CFA = Adyuvante completo de Freund), seguido de un impulsor (misma cantidad y concentración) en 4 semanas. Posteriormente, los títulos anti-péptidos fueron determinados después de 6 semanas para controlar la respuesta inmune y finalmente las ratas fueron desangradas después de 10 semanas y los

20 antisueros recogidos. Los antisueros fueron analizados en un ELISA de unión de FSH (Greiner, PS; GDA-recubrimiento con 1 g/ml de FSH (Biotrend)) usando sulfonato de 2,2'-azina-di(etilbenztiazolina) (ABTS) en combinación con un suero de cabra-anti-rata marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo. Anticuerpos pAb 5215 (Biogenesis) y mAb 6602 (Medix Biochemicals) fueron incluidos en el análisis como controles positivos.

25 Tabla 7. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con varios péptidos de CLIPS m-T2 en bucle FSH- 3 (posición de CLIPS fijados a CysIV+p, CysV-q) de longitud variable (CyslV+x; CysV+y) y actividades de neutralización correspondientes en bioensayo de células Y1.

No.: Secuencia peptídica + CLIPS posiciones de CLIPS (p; q) AA's en FSH (x; y) título AB 10 semanas) 2 ratasb ensayo de estimulación de FSH Neutr.c

1: 10, 8 1, 1 3,0; 4,0 1/250,1/500

6: 10, 8 1, 1 3,5; <1 1/1/125

a aminoácidos impresos en negrita son sustituyentes para residuos Cys nativos en estas posiciones, aminoácidos impresos subrayados indican los residuos Cys en los que los CLIPS están fijados. btítulos de anticuerpos se dan como valores -10log de la dilución de suero en la que la OD en ELISA de unión sigue

siendo >3x la OD anterior (1/10 dilución = 1,1/100=2,1/1000=3,1/10 000=4, etc.). cda la dilución máxima de suero purificado (columna de protG) en la que el bloqueo completo de la bioactividad inducida por FSH sigue siendo observado (a 6 ng/mL estímulación celular de FSH).

[0199] De la tabla 7 se concluye que un compuesto que comprende el péptido TFKELVYETCRVPGDAHHADSLCTYPVATQAH unido al soporte T2 es preferido.

5 [0200] Por otra parte, un compuesto que comprende el péptido TFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH unido al soporte T3 es preferido.

EJEMPLO 5: Diseño y preparación de peptidomiméticos estructuralmente optimizados de FSH y uso de los mismos como vacuna de péptido.

10 [0201] En este experimento, un conjunto de polipéptidos correspondiente al bucle ß3 de FSH fueron estructuralmente optimizados usando datos de unión de Ab de un estudio de análisis de sustitución seleccionado con 5828 y 6602 de mAb. Los polipéptidos fueron ciclizados sobre un m-T2 (1h reacción de péptido y 1.05 equivalente de m-T2 en 20% acetonitrilo/80% de bicarbonato de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente). Posteriormente, ratas Wistar hembra

15 fueron inmunizadas en el día 0 con 400 uL de un ~2.5 mg/mL del constructo de péptido de CLIPS en PBS/CFA 1:1 (v/v) (PBS = solución salina tamponada con fosfato, CFA = Adyuvante completo de Freund), seguido de un impulsor (misma cantidad y concentración) en 4 semanas. Posteriormente, los títulos de anti-péptidos fueron determinados después de 6 semanas para controlar la respuesta inmune y finalmente las ratas fueron desangradas después de 10 semanas y los antisueros recogidos. Antisueros fueron analizados en un ELISA de unión de FSH (Greiner, PS; recubrimiento de GDA con 1

20 Ig/mL de FSH (Biotrend)) usando sulfonato de 2,2'-azina-di(etilbenztiazolina) (ABTS) en combinación con un suero de cabra-anti-rata marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo. Anticuerpos pAb 5215 (Biogenesis) y mAb 6602 (Medix Biochemicals) fueron incluidos en el análisis como controles positivos.

Tabla 8. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con varios péptidos de CLIPS m-T2 en bucle 25 FSH- 3 + actividades de neutralización correspondientes en bioensayo celular de Y1.

No.: Secuencia peptídica + CLIPS, posiciones de CLIPS (P q) AA's en FSH (x; y) título de AB-(10 semanas) 2 ratasb ensayo de estimulación de FSH Neutr.c

1: 10, 8 1, 1 1,6, 3,0 1/2:1/4

2: 10, 8 1, 1 3,5, 2,0 1164, 112

3: 10,8 1, 1 >4.5 <1 1/1/1000

a aminoácidos impresos en negrita son sustituyentes para residuos Cys nativos en estas posiciones, aminoácidos impresos subrayados indican los residuos Cys en los que los CLIPS están fijados. btítulos de anticuerpos se dan como valores -10log de la dilución de suero en los que la OD en ELISA de unión sigue siendo >3x la OD anterior (1/10 dilución = 1,1/100=2,1/1000=3,1/10 000=4, etc.). cda la dilución máxima de suero purificado (columna de protG) en la que el bloqueo completo de la bioactividad inducida por FSH sigue siendo observado (a 6 ng/mL estímulación celular de FSH).

[0202] De tabla 8 se concluye que un compuesto que comprende el péptido TFKELVYETCRVPGDAHHADKLCTYPVATQAH unido al soporte T2 es preferido.

30 Por otra parte, un compuesto que comprende un péptido TFKELVYETCRVPGDAHKADSLCTYPVATQAH unido al soporte T2 es preferido.

EJEMPLO 6: Diseño y preparación de peptidomiméticos de h-CG y uso de los mismos como vacuna de péptido.

35 [0203] En este experimento, polipéptidos correspondientes al bucle B3 de hCG fueron diseñados y sintetizados como se ha descrito anteriormente. Los polipéptidos fueron bien ciclizados sobre un T2 (1h de reacción de péptido y 1.05 equiv de T2 en 20% ACN/80% bicarb de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente), o soporte T4 (1h reacción de péptido y 0.5 equiv. de T4 en 60% ACN/40% bicarb de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente) o directamente ciclizado a través de oxidación de SS de las cisteínas. Además, una versión lineal del polipéptido que carece de cisteínas fue

40 preparada (ver tabla 5). Ratas fueron inmunizadas con los varios péptidos o constructos de péptido como se describe para el imitador del péptido de FSH en el ejemplo 1. Anticuerpo comercial CG-B2 contra hCG (obtenido de Imgen) fue incluido en el análisis como controles positivos para convalidar el recubrimiento de hCG (obtenido de Biotrend) en la superficie de ELISA.

Tabla 9A

Muestra no.: Polipéptidoa Soporteb

1: *NYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQ# m-T2

2: *NYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQ# Ninguno; ciclizado de SS

3: *NYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQ# T4

4: *NYRDVRFESIRLPGAPRGVNPVVAVALSAQ# Ninguno; lineal

5: *VVANYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQAAL# m-T2

6: *VVANYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQAAL# T4

a secuencia del polipéptido se da en una abreviatura de una letra. * denota N-término y # denota C-término. b m-T2 se refiere a meta-dibromobenceno; T4 se refiere a 1,2,4,5 tetrabromodureno.

5 [0204] Los resultados mostrados en la Figura 3 demuestran la relevancia de fijar un polipéptido derivado de B3 a un soporte ya que ni el péptido correspondiente ciclizado a través de oxidación SS ni el polipéptido lineal son inmunógenos por ellos mismos.

10 [0205] A continuación, los mismos resultados se representan con más detalle en la tabla 9B. Varios valores, tales como las posiciones de CLIPS p y q, son indicados.

Tabla 9B. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con péptidos derivados del bucle hCG- 3 icw. CLIPS diferentes + actividades de neutralización correspondientes en bioensayo de hCG.

No.: Secuencia peptídica + CLIPS CLIPSposiciones (p; q) AA's en hCG (x; y) Título AB (10 semanas) 2 ratasb ensayo de estimulación de hCG Neutr.

2: 10, 8 1, 1 4.0; <1 - (2x)

4: 10, 8 1, 1 <1, 1,0 -(2x)

5: 10, 8 1, 1 <1 (2x) -(2x)

6: n.a. 1, 1 <1 (2x) - (2x)

7: 10, 8 1, 1 <1 (2x) - (2x)

8: 10, 8 1, 1 3.0; <1 - (2x)

a aminoácidos impresos en negrita son sustituyentes para residuos Cys nativos en estas posiciones, aminoácidos impresos subrayados indican los residuos Cys en el que los CLIPS están fijados. b títulos de anticuerpos se dan como valores -10 log de la dilución de suero en los que la OD en ELISA de unión sigue siendo >3x la OD anterior (1/10 dilución = 1,1/100=2,1/1000=3,1/10 000=4, etc.). "+" significa que el suero diluido 10 veces es capaz de bloquear la estimulación inducida por hCG (1 y 5 ng/mL de hCG); "-" significa que ningún efecto de bloqueo de hCG fue observado.

15 EJEMPLO 7: Diseño y preparación de peptidomiméticos de hCG y uso de los mismos como vacuna de péptido.

[0206] En este experimento, un conjunto de polipéptidos correspondientes al bucle �3 de hCG, que difieren en longitud y posiciones de los residuos de cisteína para fijación de CLIPS, fueron diseñados y sintetizados como se ha descrito 20 anteriormente. Los polipéptidos fueron ciclizados sobre un m-T2 (1h reacción de péptido y 1.05 equivalente de T2 en 20% acetonitrilo /80% bicarbonato de amonio (20 mM), pH 7.8 a temperatura ambiente). Posteriormente, ratas Wistar hembra fueron inmunizadas en el día 0 con 400 uL de un ~2.5 mg/mL del péptido o constructo de péptido-T en PBS/CFA 1:1 (v/v) (PBS = solución salina tamponada con fosfato, CFA = Adyuvante completo de Freund), seguido de un impulsor (misma cantidad y concentración) en 4 semanas. Posteriormente, los títulos anti-peptídicos fueron determinados después de 6

25 semanas para controlar la respuesta inmune y finalmente las ratas fueron desangradas después 10 semanas y los antisueros recogidos. Antisueros fueron analizados en ELISA de unión de FSH (Greiner, PS; recubrimiento de GDA con 1 g/ml de hCG (Biotrend)) usando sulfonato de 2,2'-azina-di(etilbenztiazolina) (ABTS) en combinación con un suero de cabraanti-rata marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo. Anticuerpo B2 fue incluido en el análisis como control positivo.

Tabla 10. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con péptidos de CLIPS de m-T2 de bucle de hCG- 3 (CLIPS a CysIV+p, CysV-q) de diferente longitud peptídica (CysIV+x; CysV+y) y actividades de neutralización correspondientes en bioensayo de hCG.

No.: Secuencia peptídica + CLIPS posiciones de CLIPS (p; q) AA's en hCG (x; y) título de AB (9 semanas) 2 ratasb ensayo de estimulación de hCG Neutr.c

5: *NYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQ# + m-T2 8,6 1, 1 1.9 (2x) - (2x)

6: 8,6 0, 2 <1 (2x) - (2x)

7: 8,6 -1,3 <1, 1,9 - (2x)

8: 8,6 1, 1 <1 (2x) - (2x)

8: 8,6 8,6 1, 1 1,1 2,9, 1,8 +,

a Aminoácidos impresos en negrita son sustituyentes para residuos Cys nativos en estas posiciones, aminoácidos impresos subrayados indican los residuos Cys en el que los CLIPS están fijados. b títulos de anticuerpos se dan como valores -10log de la dilución de suero en la que la OD en la ELISA de unión sigue siendo >3x la OD anterior (1/10 dilución = 1,1/100=2,1/1000=3,1/10 000=4, etc.). "+" significa que el suero diluido 10 veces es capaz de bloquear la estimulación inducida por hCG (1 y 5 ng/mL de hCG); "-" significa que ningún efecto de bloqueo de hCG fue observado.

[0207] De la tabla 10 se concluye que un compuesto que comprende el péptido

unido al soporte T2 es preferido.

EJEMPLO 8: Diseño y preparación de peptidomiméticos de VEGF-A y uso del mismo como vacuna de péptido.

10 [0208] En este experimento, un conjunto de polipéptidos correspondiente al bucle ß6 vuelta en ß5 de VEGF-A (correspondiente al bucle �3 de FSH en hCG), que difiere en la longitud y posiciones de los residuos de cisteína para fijación de CLIPS, fueron diseñados y sintetizados como se ha descrito anteriormente. Los polipéptidos fueron ciclizados sobre un m-T2 (1h reacción de péptido y 1.05 equivalente de T2 en 20% acetonitrilo /80% bicarbonato de amonio (20 mM),

15 pH 7.8 a temperatura ambiente). Posteriormente, ratas Wistar hembra fueron inmunizadas en el día 0 con 400 uL de un ~2.5 mg/mL del péptido o constructo de péptido de CLIPS en PBS/CFA 1:1 (v/v) (PBS = solución salina tamponada con fosfato, CFA = Adyuvante completo de Freund), seguido de un impulsor (misma cantidad y concentración) en 4 semanas. Posteriormente, los títulos peptídicos fueron determinados después de 6 semanas para controlar la respuesta inmune y finalmente las ratas fueron desangradas después de 9 semanas y los antisueros fueron recogidos. Antisueros fueron

20 analizados en ELISA de unión de VEGF (Greiner, PS; recubrimiento de GDA con �0,1 g/ml de VEGF-A usando sulfonato de 2,2'-azina-di(etilbenztiazolina) (ABTS) en combinación con un suero de cabra-anti-rata marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo. mAb 293 fue incluido en el análisis como control positivo.

Tabla 11. Respuestas de anticuerpos de experimentos de vacunación con VEGF bucle 6 vuelta 5 péptidos CLIPS 25 de m-T2 con posición de CLIPS diferente (CysIV+p; CysV-q) y longitud de péptido diferente (CysIV+x, CysV+y, y actividades de neutralización correspondientes en el ensayo de proliferación de VEGF.

No.: Secuencia peptídica + CLIPSa posiciones de CLIPS (p; q) AA's en VEGF (x; y) título AB (9 semanas) 2 ratasb ensayo de prolif. de VEGF Neutr.c

1: n.a. 5; -3 >1.8 (2x) - (2x)

2: 8, 6 5; -3 >2.8 (2x) + (2x)

3: 10, 8 5; -3 >2.8 (2x) +,

4: 12, 10 5; -3 >2.8;< 1.8 +,

5: 13, 11 5; -3 >1.8;< 1.8 nd

6: *EESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHN# n.a. 4; -2 >2.8;< 1.8 -(2x)

7: 8,6 4; -2 >2.8 (2x) +,

8: 10, 8 4; -2 >2.8;< 1.8 +,

9: 12, 10 4; -2 >1.8;< 1.8 nd

10: 13,11 4; -2 <1.8 (2x) Nd

b títulos de anticuerpos se dan como número de diluciones en 10 veces para las cuales la OD (ELISA de unión m-Ab) >3x la OD anterior. c "+" significa que el suero diluido 10 veces es capaz de bloquear la proliferación celular inducida por adición de 20 ng/mL de VEGF; "-" significa que ninguna inhibición de la proliferación celular fue observada a 20 ng/mL de VEGF.

[0209] De la tabla 11 se concluye que un compuesto que comprende el péptido ESNCTMQIMRIKPHQGQHIGEMSCLQH unido al soporte T2 es preferido. Por otra parte, un compuesto que comprende el péptido EESNCTMQIMRIKPHQGQHIGEMSCLQHN unido al soporte T2 es preferido.

[0210] Conclusión: posiciones de CLIPS 8,6 (p=8 y q = 6) en 10,8 (p=10 y q=8) son preferidas.

Tabla 12: visión de conjunto de Sub-familias de proteína de nudo de Cys

Familia de Hormona-a de Glicoproteína

Hormona de glicoproteína (o gonadotropina)- 1,2(GLHA-1,2)

Familia de Hormon-j de Glicoproteína

Coriogonadotropina- ( -CG) Gonadotropina-1,2 (GTH-I,II) Hormona folículo-estimulante (o folitropina)- (fish-) Hormona Luteinizante - (o lutropina)- ( -LH) Hormona estimulante de la tiroides (o tirotropina)- (TSH) Precursor tipo proteína 2 asociado con Contactina (CTA-2)

Precursor beta-5 de la hormona de glicoproteína (GPB-5)

Familia de factor de crecimiento nervioso

Factor de crecimiento nervioso (NGF) Neurotrofina-3,4,5,7 (NT-3,4,5,7; HDNF) Factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF)

Familia PDGF

Factor de crecimiento derivado de las plaquetas A,B-1,2 (PDGF-A,B-1,2) Proteína sis transformante relacionada con PDGF (TSIS_MSAV, P28SIS) factor de crecimiento de placenta (PLGF) Factor de crecimiento endotelial vascular A,B,C,D,H (VGEF-A,B,C,D,H) Toxina de factor de crecimiento endotelial vascular (TXVE, SVVEGF, ICPP)

Superfamilia de factor de crecimiento transformante

Factor de crecimiento transformante beta 1-5 (TGF 1-5) Activina- (Inhibina-) Subunidad CLPX de unión de ATP de proteasa de CLP dependiente de ATP (CLPX)

Proteína morfogenética de hueso 2-8,10,15 (BMP 2-8,10,15) 60A Precursor de proteína (proteína de barco con fondo de vidrio, 60A) CET-1 Caenorphabditis Elegans

Precursor de proteína decapentaplégica (DECA) Precursor de proteína DVR1 (proteína del hemisferio vegital VG1) Precursor de Dorsalina-1 (DSL1) XNR-1,2,4 (Xenopus Laevis)

5 Brachydanio Rerio ZNR-1 (pez zebra) VG1-Gallus Gallus (pollo) Precursor nodal de proteína morfogenética de hueso placental (NODA) Proteína de enfermedad de Norrie (NDP) Factor de diferenciación de próstata (PDF)

10 Factor de diferenciación de crecimiento (embrioniario) 1-9 (GDF-1-9) Precursor de factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF) precursor de factor-b determinante de derecha-izquierda (proteína lefty-b, LFTB) Factor estimulante de Megacariocitos (MSF) Precursor de mucina-2 (mucina-2 intestinal)

15 Factor inhibidor muelleriano (MIS) Precursor de neurturina (NRTN) Precursor de persefina (PSPN)

Esclerostina (SOST) Precursor de proteína Screw (SCW) 20 Precursor Univin (UNIV)

[0211] Tabla 14: Posición de cisteínas conservadas en varios elementos de la familia de proteína de nudo de Cys. Los números entre paréntesis se refieren a las bases de datos Pfam de alineamientos múltiples de dominios de proteína o regiones de proteína conservadas. Las primeras columnas enumeran todos los residuos de cisteínas encontrados en la

25 proteína. La segunda columna da la designación de los seis residuos de cisteínas conservadas (CysI a CysVI). Las otras columnas indican la posición del aminoácido correspondiente (empezando desde el N-término) para elementos de subfamilia individuales.

Tabla 14A: Subfamilia de hormona alfa de glicoproteínas (PF00236)

hCG-a

C-1: 7

C-2: CysI 10

C-3: CysII 28

C-4: 31

C-5: CysIII 32

C-6: 59

C-7: CyrIV 60

C-8: CysV 82

C-9: CysVI 84

C-10: 87

Tabla 14B: Subfamilia de hormona beta de glicoproteínas (PS00689/PS00261)

hCG-beta: FSH-beta

C-1: CysI 9 3

C-2: 23 17

C-3: 26 20

C-4: CysII 34 28

C-5: CysIII 38 32

C-6: CysIV 57 51

C-7: 72 66

C-8: CysV 88 82

C-9: CysVI 90 84

C-10: 93 87

C-11: 100 94

C-12: 110 104

Tabla 14C: subfamilia de NGF (PF00243)

NGF: BDNF

C-1: CysI 15 13

C-2: CysII 58 58

C-3: CysIII 68 68

C-4: CysIV 80 80

C-5: CysV 108 109

C-6: CysVI 110 111

Tabla 14D: subfamilia de PDGF (PF00341)

PDGF: PLGF VEGF-A

C-1: CysI 16 35 26

C-2: 43 60 51

C-3: CysII 49 66 57

C-4: 52 69 60

C-5: CysIII 53 70 61

C-6: CysIV 60 77 68

C-7: CysV 97 111 102

C-8: CysVI 99 113 104

Tabla 14E: Subfamilia de TGF

TGF-B2: BMP2 BMP7 GDNF GDF-15

1C-1: 7 - - - 9

C-2: CysI 15 14 38 42 16

C-3: 16 - - 17

C-4: CysII 44 43 67 69 46

C-5: CysIII 48 71 73 50

C-6: 77 78 103 102 79

C-7: CysIV 8 79 104 103 80

C-8: CysV 109 111 136 132 111

C-9: CysVI 111 113 138 134 113

Claims

REIVINDICACIONES

1. Peptidomimético de coriogonadotropina beta, hormona beta estimulante de folículos, hormona beta luteinizante, hormona beta estimulante de tiroides, o gonadotropina-alfa-1,2, que comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos del bucle de la horquilla beta 3 (B3) de dicha coriogonadotropina beta (CNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSC), hormona beta estimulante de folículos (CTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQC), hormona beta luteinizante (CTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSC), hormona beta estimulante de tiroides (CTYRDFIYRTVEIPGCPLHVHPYFSYPVALSC), o gonadotropina-alfa-1,2 (CVAKSYNRVTVMGGFKVENHTAC), donde dos residuos de aminoácidos han sido sustituidos por un primer y un segundo residuo de cisteína en el polipéptido, estas cisteínas se fijan una a la otra a través de un soporte y donde cualquier residuo de cisteína en la secuencia natural se cambia en un residuo que no es reactivo con el soporte, donde:

-

dicho soporte es una molécula (hetero)aromática,

-

dicho primer residuo de cisteína unida de soporte se introduce en la posición CysIV+ p localizado p residuos C-terminales de la posición que corresponde a los aminoácidos CysIV en el bucle B3 tipo salvaje como se identifica en la tabla 13, donde 5 s p s 12;

-

dicho segundo residuo de cisteína fijado al soporte se introduce en la posición CysV—q localizado q residuos N-terminales de la posición que corresponde a los aminoácidos CysV en el bucle B3 tipo salvaje como se identifica en la tabla 13, donde 4 s q s 12 y donde (p — q) es -3; -2, -1, 0, 1,2 o 3 y

-

la longitud de dicho polipéptido es desde el aminoácido en la posición CysIV + x a los aminoácidos en la posición CysV + y, donde -5 s x s 1 y 1 s y s 6 bajo la condición de que x + y = -1, 0,1 o 2.
2.

Peptidomimético según la reivindicación 1, donde la longitud del polipéptido es de CysIV +1 a CysV + 1, de CysIV-5 a CysV +6, de CysIV-3 a CysV+4, de CysIV-5 a CysV+4 o de CysIV-2 a CysV+ 4, preferiblemente donde la longitud del polipéptido es de CysIV +1 a CysV + 1, de CysIV-2 a CysV+ 4 o de CysIV-5 a CysV+ 4.
3.

Peptidomimético según la reivindicación 1 o 2, donde la posición de dicha primera y segunda cisteína corresponde a las posiciones CysIV+12 y CysV-10, o a CysIV+11 y CysV-10; CysIV+10 y CysV-8, CysIV+9 y CysV-8, CysIV+8 y CysV-6, CysIV+7 y CysV-5, CysIV+7 y CysV-6, CysIV+7 y CysV-4, CysIV+5 y CysV-4 o CysIV+6 y CysV-4, preferiblemente en las posiciones CysIV+10 y CysV-8, CysIV+7 y CysV-6 o CysIV+8 y CysV-6.
4.

Peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la posición de dicha primera y segunda cisteína corresponde a las posiciones CysIV+10 y CysV-8.
5.

Peptidomimético según la reivindicación 1 - 4, donde el soporte usado para preparar dicho peptidomimético es una molécula (hetero)aromática que comprende al menos dos sustituyentes de halógeno bencílico.
6.

Peptidomimético según la reivindicación 5, donde dicho soporte es un halometilareno.
7.

Peptidomimético según la reivindicación 5, donde dicho soporte es seleccionado del grupo que consiste en orto-, meta- y para-dihaloxileno y 1,2,4,5 tetrahalodureno, preferiblemente metadibromoxileno (m-T2) o 1,2,4,5 tetrabromodureno (T4).
8.

Peptidomimético según la reivindicación 5, donde la longitud del polipéptido es de CysIV+1 a CysV + 1 y donde dicho soporte es metadihaloxileno, preferiblemente metadibromoxileno.
9.

Peptidomimético según la reivindicación 5, donde la longitud del polipéptido es de CysIV-2 a CysV + 4 y donde dicho soporte es 1,2,4,5 tetrahalodureno, preferiblemente 1,2,4,5 tetrabromodureno.
10.

Peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la posición de dicha primera cisteína corresponde a la posición de aminoácidos CysIV+ 10 y donde la posición de dicha segunda cisteína corresponde a la posición CysV-8, preferiblemente donde dicho polipéptido es derivado del bucle B3 de un elemento de la subfamilia GLHB.
11.

Peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la posición de dicha primera cisteína corresponde a la posición de aminoácidos CysIV+ 8 y donde la posición de dicha segunda cisteína corresponde la posición CysV-6, preferiblemente donde dicho polipéptido es derivado del bucle B3 de un elemento de la subfamilia GLHA.
12.

Peptidomimético seleccionado del grupo de peptidomiméticos consistiendo en el polipéptido TFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAH unido a través de las cisteínas para soporte m-T2, el polipéptido KIQKTATFKELVYETCRVPGAAHHADSLCTYPVATQAHAGK unido a través de las cisteínas al soporte T4, el polipéptido TFKCLVYETVRVPGAAHHADSLYTYPVACQAH unido a través de las cisteínas al soporte m-T2, el polipéptido TFKELVYETCRVPGDAHHADSLCTYPVATQAH unido a través de las cisteínas al soporte m-T2, el polipéptido TFKELVYETCRVPGDAHHADKLCTYPVATQAH unido a través de las cisteínas al soporte m-T2, el polipéptido

TFKELVYETCRVPGDAHKADSLCTYPVATQAH unido a través de las cisteínas al soporte m-T2, el polipéptido NYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQ fijado al soporte m-T2, el polipéptido VVANYRDVRFESCRLPGAPRGVNPVCSYAVALSAQAAL fijado al soporte m-T2 y el polipéptido

5 unido a través de las cisteínas a dos soportes m-T2.
13. Método para preparar un peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que incluye las etapas de proporcionar un polipéptido y un soporte y contactar dicho polipéptido y soporte bajo condiciones que permiten la fijación covalente de dicho polipéptido a dicho soporte, preferiblemente donde dicho contacto se realiza en solución, más

10 preferiblemente en una solución acuosa.
14. Composición de vacuna que comprende un peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
15.

Composición de vacuna según la reivindicación 14, donde dicho peptidomimético se acopla a un portador, 15 preferiblemente hemocianina de lapa californiana (KLH).
16. Peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso como un medicamento.
17.

Peptidomimético según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso en la terapia anticáncer o en la prevención del 20 embarazo.