ES2317941T3 - Identificacion de zonas de union a proteinas. - Google Patents

Abstract

Método para producir una biblioteca de péptidos para la identificación o detección de una zona de unión, que incluye proveer dicha biblioteca de péptidos de una pluralidad de zonas de unión de prueba, y comprende además la generación de al menos una de estas zonas de unión, situando en una fase sólida por lo menos un primer segmento peptídico muy cerca de un segundo segmento peptídico, reflejando el término "muy cerca" la posibilidad de que una supuesta molécula de unión pueda unirse por lo menos con dos de los segmentos situados cerca o partes de los mismos.

Description

Identificación de zonas de unión a proteínas.

La invención se refiere al campo del reconocimiento o detección molecular de zonas de unión discontinuas o conformacionales o epítopos, correspondientes a una molécula de unión o que interactúan con la misma, en particular en relación con interacciones de proteína-proteína o proteína-ligando.

Las interacciones entre moléculas de unión, que son por lo general biomoléculas y sus ligandos correspondientes son fundamentales para la vida. Las células suelen llevar o contener moléculas receptoras que interactúan o se unen a una hormona, a un péptido, un fármaco, un antígeno, una molécula efectora o con otra molécula receptora; las enzimas se unen a su sustrato; las moléculas de anticuerpo se unen a un antígeno, el ácido nucleico una proteína, y así sucesivamente. El término "interactúa o se une a" significa que la molécula de unión y el ligando se acercan entre si dentro del límite de las fuerzas moleculares y pueden influir recíprocamente en sus propiedades. Este acercamiento lleva a la molécula de unión y a su ligando a través de diversas etapas de reconocimiento molecular, que comprenden grados crecientes de proximidad y efecto mutuo: se unen.

Las moléculas de unión tienen esta capacidad de unión ya que comprenden zonas de unión diferentes, que permiten el reconocimiento del ligando en cuestión. El ligando, a su vez, tiene una zona de unión correspondiente, y únicamente cuando las dos zonas de unión pueden interactuar por complementariedad -esencialmente espacial-, las dos moléculas pueden unirse. No hace falta decir que, habida cuenta de que las moléculas tienen tres dimensiones, las zonas de unión son de naturaleza tridimensional, y muchas veces una o más protuberancias o salientes de la superficie de una zona de unión corresponden a una o más cavidades o depresiones en la otra, una disposición tridimensional de "llave y cerrojo", algunas veces en una variedad de ajuste inducido.

Algunas veces esta protuberancia comprende una sola asa de la molécula en cuestión y es únicamente esta protuberancia la que forma prácticamente la zona de unión. En este caso, se suele decir que estas zonas de unión comprenden una zona de unión lineal o continua, donde una simple parte lineal de la molécula en cuestión es esencialmente responsable de la interacción de unión. Esta terminología se suele utilizar para describir p. ej. reacciones anticuerpo-antígeno, donde el antígeno comprende parte de una secuencia proteínica, un péptido lineal. Se suele hablar entonces de epítopo lineal o continuo, donde la zona de unión (epítopo) de la molécula antigénica está formada por un asa de aminoácidos unidos de forma consecutiva. No obstante, este tipo de zonas de unión continuas (aquí, los términos epítopo y zona de unión son intercambiables) se puede encontrar con interacciones receptor-antígeno (como p. ej. con un receptor de célula T), con interacciones receptor-ligando, como receptores hormonales y agonistas o antagonistas de los mismos, con interacciones receptor-citoquina o por ejemplo con interacciones enzima-sustrato o receptor-fármaco, donde una parte lineal de la molécula es reconocida como zona de unión, y así sucesivamente.

Muchas veces sin embargo, esta protuberancia o protuberancias y depresiones comprenden varias partes distintas de la molécula en cuestión, y son las partes combinadas las que forman esencialmente la zona de unión. Por lo general, este tipo de zona de unión que comprende partes diferentes de la molécula en cuestión recibe el nombre de zona de unión discontinua o conformacional o epítopo. Por ejemplo, las zonas de unión que se encuentran sobre proteínas que no tienen solamente una estructura primaria (la secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína) sino también una estructura secundaria y terciaria (el plegado de la molécula en alfa-hélices o beta-hojas y su forma global), y algunas veces incluso una estructura cuaternaria (la interacción con otras moléculas de proteína), pueden comprender en sus protuberancias o depresiones esenciales aminoácidos y secuencias peptídicas cortas que se encuentran muy apartadas en la estructura primaria pero se pliegan estrechamente juntas en la zona de unión.

Debido al papel central que las moléculas de unión y sus ligandos juegan en la vida, existe un interés cada vez mayor por someter a prueba o identificar la naturaleza o características de la zona de unión. En particular, el rápido desarrollo de los sectores emergentes de la biotecnología, como la proteómica dará como resultado, en un próximo futuro, la identificación de cada vez más moléculas de unión y sus ligandos correspondientes. La detección de interacciones proteína-proteína, pero también las interacciones enzima-sustrato (no solamente de enzimas proteínas sino ciertamente también de interacciones basadas en ARN catalítico, por ejemplo) y la identificación de pares de proteína-ácido nucleico y de ácido nucleico-ácido nucleico de la molécula de unión y su ligando correspondiente, despertarán con seguridad más interés por saber dónde se encuentran las zonas exactas de interacción (unión) entre estas moléculas, y cómo se pueden desarrollar compuestos (agonistas, antagonistas, fármacos) que modulen la interacción específica.

No solamente existe interés por la naturaleza exacta de la interacción particular entre molécula de unión y ligando en cuestión, p. ej. con el fin de sustituir o suplementar, siempre que sea necesario, moléculas de unión o ligandos sino también por conocer las características de aproximación de la interacción con el objeto de encontrar o diseñar análogos, agonistas, antagonistas u otros compuestos que imiten una zona de unión o ligando correspondiente.

Se conocen métodos versátiles y rápidos para someter a prueba o identificar epítopos continuos o zonas de unión. La mayoría de las técnicas, sino todas, de detección de ácido nucleico y las bibliotecas moleculares que las utilizan contienen la hibridación de un tramo de ácido nucleico esencialmente continuo con una cadena de ácido nucleico complementaria, que puede ser ADN, ARN o APN. Se ha prestado poca atención a los métodos que permiten una identificación rápida y directa de zonas de unión discontinuas de naturaleza esencialmente de ácido nucleico. Aunque existen muchas de estas zonas, piénsese solo en la falta de comprensión que rodea a las zonas de unión ribosomal, donde las proteínas ribosomales se unen al tARN, de zonas reguladoras, en secuencias promotoras, interacciones entre polimerasas y replicasas entre ADN y ARN, reacciones catalíticas de ARN, y así sucesivamente; no existe ninguna biblioteca molecular que permita un acceso fácil a dichas zonas.

Uno de los primeros trabajos en el campo de los péptidos es el documento WO 84/03564, relativo a un método de detección o determinación de secuencias de aminoácidos antigénicamente activas o péptidos en una proteína. Este trabajo, que proporciona la denominada tecnología Pepscan, en la que se sintetiza una pluralidad de péptidos diferentes ligando con un enlace peptídico un primer aminoácido con un segundo "y sucesivamente" y en una segunda posición, en el formato de la prueba, se liga otro primer aminoácido con un segundo y así sucesivamente, tras lo cual se someten a prueba cada uno de los péptidos sintetizados con la molécula de unión en cuestión, permite la determinación de cualquier determinante antigénico continuo o epítopo continuo de importancia en una proteína o secuencia peptídica. La tecnología Pepscan tomada en sentido amplio, también permite someter a prueba o identificar péptidos (aunque lineales) esencialmente idénticos, análogos a o que imitan zonas de unión o ligandos de diversa naturaleza (mimótopos, Geyssen y colaboradores, Mol. Immunol. 23:709-715, 1986).

La tecnología Pepscan permite la identificación de secuencias peptídicas lineales que interactúan con moléculas receptor, enzimas, anticuerpos y así sucesivamente de forma rápida y directa, permitiendo someter a prueba una gran cantidad de péptidos para comprobar su reactividad con la molécula de unión en cuestión, con relativamente poco esfuerzo. El orden de magnitud de la capacidad de ensayo desarrollada con la tecnología Pepscan (p. ej. debido también a la miniaturización de formatos de prueba, véase p. ej. el documento WO 93/09872) permite además en someter a prueba, aleatoriamente, toda una serie de péptidos, obteniéndose formatos químicos combinatorios automatizados, en los que gran cantidad de moléculas de unión se someten a prueba siguiendo un modelo (si no se desea aleatoriamente) para comprobar su reactividad con una biblioteca molecular de péptidos sintéticos que representan zonas de unión potencialmente continuas o ligandos que permiten la rápida detección de moléculas particularmente relevantes a partir de decenas de millares de combinación de moléculas probadas.

No obstante, para la prueba de zonas de unión discontinuas o conformacionales de una molécula de unión no existe ningún formato similar o tan versátil como la tecnología Pepscan. Los intentos de identificar epítopos discontinuos utilizando la terminología Pepscan resultan lentos o incómodos. En general no basta con extender simplemente la síntesis de los péptidos del test ligando más aminoácidos al péptido existente, y esperando que algunos de los péptidos más largos así formados se plegarán de forma que al menos se presenten dos partes distintas de forma discontinua, que reconocerá una molécula de unión. No es posible en efecto averiguar de forma rápida y directa si la unión discurre efectivamente por una zona de unión discontinua y pudiera ser que una sola asa más larga sea responsable de la
unión.

Algunas posibilidades adicionales ofrece la prueba de secuencias peptídicas sintéticas que han sido diseñadas para comprender dos partes previamente identificadas de una zona de unión, donde cada parte es esencialmente lineal y forma parte de un péptido lineal más grande. Atassi y Zablocki (J. Biol. Chem 252:8784, 1977) han realizado inicialmente unos trabajos que describen cómo unos residuos superficiales espacial o conformacionalmente contiguos (que de otro modo, están separados en la secuencia) de una zona antigénica de lisozima han sido unidos por enlaces peptídico para obtener un solo péptido que no existe en la lisozima pero intenta simular una región superficial de la misma. No obstante, su técnica, denominada síntesis de simulación de superficie requiere el conocimiento detallado de la estructura tridimensional de la proteína en estudio y una identificación química total de los residuos que constituyen la zona de unión, con anterioridad, así como su espaciamiento conformacional preciso y requisitos relacionales.

Del mismo modo, Dimarchi y colaboradores (Science 232: 239-641, 1986) describen un péptido sintético de 38 a 40 aminoácidos de longitud que consiste en dos regiones peptidílicas separadas, previamente identificadas de una proteína de recubrimiento viral. El péptido se sintetizó utilizando una tecnología de síntesis peptídica conocida (Merrifield y colaboradores, Biochemistry 21, 5020, 1982) añadiendo aminoácidos subsiguientes con un enlace peptídico con un péptido creciente, obteniéndose como resultado un péptido en el que las dos regiones peptidílicas están conectadas por un espaciador de diprolina que funciona supuestamente como indicación de un segundo giro estructural secundario, proporcionando por consiguiente de este modo un epítopo de dos partes o zona de unión.

No obstante, es evidente que cuando ya se tiene que conocer con anterioridad la secuencia de las dos partes relevantes (en este caso solo dos), para proporcionar la zona de unión discontinua deseada, se excluye la posibilidad de proporcionar (de forma deseable de modo aleatorio) toda una serie de zonas de unión discontinuas potenciales para prueba a gran escala. Además, un inconveniente principal de las estrategias antes citadas es que otra vez solo se pueden imitar de forma adecuada epítopos lineales o regiones de unión dominantes de epítopos discontinuos. Para la síntesis más completa para una zona de unión discontinua, todas las partes que intervienen se tienen que disponer en la conformación adecuada para lograr una unión de alta afinidad y por lo tanto se tienen que enlazar partes individuales de zonas de unión discontinuas.

Quince años después, Dimarchi, Reineke y colaboradores (Nature Biotechnology, 17:271-275, 1999) proporcionaron una imitación sintética de una zona de unión discontinua sobre una citoquina y un método para encontrar dicha zona de unión discontinua que permitiera cierta flexibilidad y en cierto modo una mayor escala de prueba, donde unas colecciones peptídicas, posicionalmente direccionables, derivadas de dos regiones separadas de la citoquina se expresaron (displayed) sobre membranas de celulosa continuas y se sustituyeron en el proceso para encontrar el mejor péptido de unión. Tras la selección de los "mejores reactores" de cada región, se combinaron para dar origen a otra colección de péptidos sintéticos (que comprende péptidos denominados duótopos) que se sometieron nuevamente a varias series de sustituciones.

Reineke y colaboradores ofrecen la síntesis de cadenas peptídicas que contienen duótopos, no obstante, seleccionados nuevamente tras la previa identificación de supuestas partes constituyentes con tecnología Pepscan, que sin embargo no permite probar zonas de unión discontinuas de forma rápida y directa.

No obstante, como ya se indicó anteriormente, los dominios proteínicos o pequeñas moléculas que imitan zonas de unión desempeñan un papel creciente en el descubrimiento de fármacos, su diagnóstico y biotecnología. La búsqueda de moléculas particulares que se unen a una zona de unión e imitan o antagonizan la acción de un ligando natural ya ha sido iniciada en varios laboratorios. Como ya se indicó anteriormente, los intentos para encontrar dichas estructuras en bibliotecas moleculares sintéticas suelen fallar debido a la naturaleza esencialmente discontinua y a la completentariedad espacial de la mayoría de las zonas de unión. Por consiguiente, para la mayoría de los casos en los que la zona de unión puede mejorarse esencialmente de forma discontinua, se necesitan medios y métodos para identificar estas zonas, y en particular medios y métodos que permitan probar zonas de unión discontinuas en las que dichas partes no necesitan ser seleccionadas primero mediante una identificación previa como parte contribuyente supuesta o incluso solo provisional de la zona de unión discontinua deseada, sino que presentan únicamente la potencialidad de formar parte de dicha zona por ser una molécula con características más o menos claras per se.

La invención ofrece un método para producir una biblioteca peptídica que supone proveer dicha biblioteca de una pluralidad de entidades de prueba, donde dichas entidades han sido producidas esencialmente por "segment spotting", es decir situando, colocando o uniendo estrechamente al menos dos segmentos (di-, tri, oligo- o multiméricos) de p. ej. ácidos nucleicos o péptidos directa o indirectamente en una fase sólida, como una superficie matriz (array), en lugar de sintetizar secuencialmente moléculas de prueba y observando una molécula o varias replicas de dicha molécula, como entidad individual, lo cual se suele hacer tradicionalmente. En teoría, dichos segmentos se pueden sintetizar secuencialmente muy cerca los unos de los otros, de forma repetitiva, un monómero (p. ej. un nucleótido o un aminoácido) con otro, hasta haber obtenido una molécula (segmento) (esencialmente polimérica) de la longitud deseada. Esencialmente, las bibliotecas de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos que se sintetizan secuencialmente, añadiendo un nucleótido o nucleósido a la vez al tramo en crecimiento, y las bibliotecas de péptidos existentes comprenden péptidos, sintetizados secuencialmente añadiendo un aminoácido a la vez al tramo en crecimiento, hasta haber alcanzado la longitud deseada; sin embargo, en las bibliotecas existentes, no se presta atención a la sinterización de segmentos específicos, muy cercanos entre sí, de forma que juntos puedan representar una supuesta zona de unión. En el caso de ácidos nucleicos, estos monómeros se seleccionan esencialmente de un conjunto limitado de nucleótidos bien conocidos y en el caso de los péptidos estos monómeros se eligen esencialmente a partir de un conjunto bien conocido de aminoácidos. No solamente se utilizan monómeros que se producen de forma natural, sino que se utilizan de forma rutinaria nucleótidos sintéticos, como moléculas de ácido nucleico peptídico (PNA) o aminoácidos que no se presentan de forma natural o incluso D-aminoácidos como monómeros que generan o producen las moléculas esencialmente polímeras, utilizando un método que se ajusta esencialmente a la síntesis secuencial de polímeros a partir de moléculas monómeras en la naturaleza. Se prefiere sin embargo, según la invención, sintetizar los segmentos antes de que se unan a la fase sólida, en estrecha proximidad, es decir que resulta más fácil crear la entidad de prueba deseada, la zona de unión supuesta que consta de dos o más segmentos situados en estrecha proximidad y unidos a la fase sólida, p. ej. la superficie matriz. El término estrechamente unidos, refleja la posibilidad de que una molécula de unión supuesta pueda unirse al menos a dos de los segmentos o partes situados muy cerca el uno del otro, y se definen en unidades angstrom, reflejando, la, en general escala molecular de las zonas de unión; es preferible unir los dos o más segmentos que constituyen la entidad de prueba deseada a una distancia de no más 100 angstrom el uno del otro, evitando la necesidad de ligantes largos, o cuando se utilizan segmentos pequeños son preferibles distancias de menos de 50, o de preferencia de menos de 30 o incluso de menos de 15 angstrom, ya que estas distancias más pequeñas crean por lo general un mejor ajuste para las zonas de unión. La proximidad mínima es de 1-2 angstrom, donde los segmentos se unen p. ej. a grupos trioles protegidos de forma diversa, separados solo de 1 a 2 átomos sobre el polímero, además, la longitud de un ligante flexible será de preferencia 10-100 angstrom, siendo la longitud preferida de los segmentos de aprox. 5-100 angstrom, y la distancia preferida entre las partes superiores de los segmentos es de 0-30 angstrom.

Se pueden acoplar p. ej. dos segmentos, de preferencia en forma de asas, sobre una superficie de (policarbono)-polímero. Con elementos muy espaciados (p. ej. aminoácidos fenilalanina) se permite obtener asas extendidas. Sobre la superficie de (policarbono) p. ej. se acoplan dos tipos (para los tipos adecuados, véase también la figura 1) de cisteínas protegidas (p. ej. cis (trt) y cis (mmt) y p. ej. un elemento espaciador. La cis (mmt) está desprotegida con 1% TFA mientras que la cis (trt) permanece protegida. El primer segmento se acopla a la cis (mmt) desprotegida. Luego se desprotege la segunda cis (trt) con 95% de TFA. Entonces se acopla el segundo segmento a la cis (trt) ahora desprotegida. Si se desea, se pueden unir también segmentos entre si, utilizando métodos químicos adecuados.

Alternativamente, en lugar de unir directamente los segmentos a dicha superficie (aunque a través de grupos de enlace) dichos segmentos se pueden unir primero con un molde que está a su vez unido a las superficies. En una realización preferida, dicho molde es p. ej. un péptido. Por ejemplo se pueden acoplar dos segmentos sobre un molde cíclico que está a su vez acoplado a la superficie polímera. El molde cíclico es por ejemplo un péptido flexible cíclico. El péptido cíclico contiene p. ej. grupos reactivos como cuatro lisinas (mmt) dos cisteínas (trt) y dos cisteínas (butilo). El molde se acopla p. ej. a la resina por medio de un azufre. La invención ofrece por lo tanto una biblioteca molecular que tiene, si bien resulta también adecuada para detectar o examinar zonas de acción continuas, resulta ahora particularmente bien adecuada para detectar o examinar zonas de unión discontinuas, en particular en relación con interacciones de unión molécula-ligando como p. ej. interacciones proteína-proteína, proteína-ácido nucleico y ácido nucleico-ácido nucleico, ahora que al menos dos segmentos diferentes cada uno de los cuales puede representar una parte de una zona de unión discontinua, se observan como una sola entidad, que representa provisionalmente una zona de unión discontinua, posiblemente desconocida hasta ahora, denominada aquí cuerpo de unión.

Dentro de esta descripción, el término cuerpo de unión se utiliza generalmente para prácticamente los constructos de segmentos para todos los péptidos; la tecnología, descrita para combinaciones de todos los péptidos se puede utilizar también por supuesto para combinaciones de ácidos nucleicos o combinaciones de una naturaleza todavía más mixta. Un cuerpo de unión, que es esencialmente una molécula sintética que comprende una zona de unión identificable u obtenible mediante un método según la invención que aquí se describe, es esencialmente una combinación de segmentos peptídico aleatorios (fijados en una molécula o representados como una molécula sobre una superficie de prueba) que actúa como molécula de unión como un anticuerpo. Como en el caso de los anticuerpos, el reconocimiento puede ser más o menos "degenerado" p. ej. la zona de unión sobre la molécula-blanco no necesita ser siempre óptima. El cuerpo de unión puede unirse en principio a cualquier parte de la molécula-blanco. Por ejemplo: para neutralizar la acción de TNF-alfa se puede desarrollar una pequeña molécula que interactúa específicamente con la zona de unión receptora sobre el TNF-alfa; alternativamente, se puede desarrollar un anticuerpo que interactúa con TNF-alfa en un lugar hasta ahora indefinido y neutraliza su acción. Esto muestra que algunas veces la solución son pequeñas moléculas y algunas veces son anticuerpos grandes. Lamentablemente ambas tienen desventajas: las moléculas pequeñas resultan difíciles o imposibles de realizar para grandes zonas de reconocimiento; las moléculas grandes como los anticuerpos resultan más fáciles de desarrollar aunque no se pueden utilizar intracelularmente y presentan todo tipo de desventajas farmacológicas como su inmunogenicidad y su incapacidad para actuar dentro de la
célula.

Las propiedades ventajosas del cuerpo de unión combinan las de las moléculas pequeñas y grandes; los cuerpos de unión comparten las ventajas de ambas. Un cuerpo de unión preferido consiste en segmentos peptídicos aleatorios p. ej. ligeramente sesgados o redistribuidos para parecerse a CDR u otros dominios de unión. En el caso de que sea necesario o deseable, se pueden imitar los CDR utilizando p. ej. 6 segmentos, cada uno de los cuales representa un posible CDR; no obstante, ya se obtiene diversidad con combinaciones de 2, 3 ó 4 segmentos. Los segmentos peptídicos están unidos de preferencia a ambos lados de una supercóntigo (scaffold) o fase sólida. Por consiguiente los cuerpos de unión están constituidos por moléculas con uno, dos o más segmentos peptídicos. Se pueden generar bibliotecas de cuerpos de unión altamente diversificados sobre la base de una combinación sistemática de números relativamente pequeños de segmentos peptídicos aleatorios. Una biblioteca de 100 cuerpos de unión se produce fácilmente utilizando conjuntos (array) de segmentos peptídicos posicionalmente definidos tala como se describe en la presente solicitud. El examen de este tipo de biblioteca con una molécula dada es sencillo, rápido y directo. Los hallazgos se pueden trasladar directamente a la estructura de aminoácido o segmento del cuerpo de unión (debido al conjunto posicionalmente definido). Se puede general fácilmente una biblioteca de 10.000 cuerpos de unión combinando todos los péptidos de bibliotecas más pequeñas entre sí o partiendo de una superficie de soporte sólido más grande. Se puede generar p. ej. fácilmente una biblioteca de un millón de cuerpos de unión combinando todos los péptidos de bibliotecas más pequeñas para obtener cuerpos de unión que contienen tres segmentos. Por consiguiente se puede generar una gran diversidad de cuerpos de unión partiendo de números relativamente pequeños de péptidos aleatorios (p. ej. 10) y combinarse múltiples combinaciones de péptidos para obtener un solo cuerpo de unión (p. ej. 6) para llegar a una diversidad de 1.000.000 o incluso más. Alternativamente, se puede obtener la misma diversidad de cuerpos de unión partiendo de p. ej. 1000 péptidos aleatorios y utilizando solo dos segmentos peptídicos para cada cuerpo de unión. Al igual que ocurre con los anticuerpos, los cuerpos de unión "pueden" madurar. Sobre la base de los hallazgos obtenidos con un conjunto inicial de cuerpos de unión aleatorios (más arriba) se pueden generar nuevas bibliotecas especializadas que contendrán un número elevado de combinaciones mejoradas. Se pueden seleccionar o mejorar las mejores en una tanda adicional utilizando una segunda biblioteca especializada y así sucesivamente. El desarrollo de cuerpos de unión de gran afinidad se obtiene, en química, al unir péptidos con, de preferencia ambos extremos, un scaffold molecular o fase sólida, utilizando un sistema array en el que se define posicionalmente cada cuerpo de unión, y ulteriormente mediante miniaturización adecuada y/o mediante bioinformática, analizar los datos y diseñar cuerpos de unión ulteriormente mejorados o bibliotecas especializadas de cuerpo de unión.

Estos o más segmentos diferentes se pueden elegir por supuesto cada uno, de forma aleatoria, dentro de cualquier conjunto de secuencia di-,tri-, u oligoméricas, como p. ej. de di-, tri-, u oligopéptidos, pero algunas veces puede ser preferible incluir al menos un segmento específico en dicha entidad, específico en el sentido de que ha sido elegido entre segmentos conocidos o partes distintas de biomoléculas, como partes de proteínas, enzimas o fragmentos únicos de las mismas, proteínas involucradas en la regulación reductora o aumento de la traducción, anticuerpos, regiones que determinan la complementariedad (CDR), antígenos, receptores, proteínas de transporte, factores de transcripción o factores involucrados en la regulación reductora o aumento de la transcripción, polimerasas, replicasas, en suma, entre segmentos conocidos o partes distintas de moléculas de unión que se sabe o sospecha que están involucradas en la unión a través de una zona de unión discontinua.

Se pueden conocer ya por supuesto segmentos conocidos o partes de los mismos situados muy cerca, como partes que constituyen una zona de unión discontinua, no obstante, en realidad no es necesario una identificación previa como tal, ya que el examen de estas zonas con una biblioteca molecular según la invención permite una identificación rápida y directa de dichos segmentos constitutivos o partes de los mismos.

Examinando este tipo de biblioteca se puede ver fácilmente cuando las moléculas de la biblioteca difieren solamente en que se eligen segmentos constituyentes de forma superpuesta, por lo cual un primer segmento de una biomolécula distinta se sitúa junto a un segundo y a un tercero y a un cuarto segmento y un segundo se sitúa cerca de un tercero y un cuarto y así sucesivamente si es preciso hasta que todos los segmentos posibles de dicha biomolécula han sido situados muy cerca del otro, de dos en tres (de tres en tres o incluso más) lo cual permite un examen sistemático de las posibles zonas de unión discontinuas presentes en dicha biomolécula.

No obstante no se precisa por supuesto esta forma de superposición ya que unas combinaciones aleatorias de segmentos situados cerca los unos de los otros, proporcionará asimismo información valiosa sobre las zonas de unión.

La invención presenta por lo tanto un método para la producción de una biblioteca de péptidos para la identificación o detección de una zona de unión capaz de interactuar con una molécula de unión, y por consiguiente para la identificación de una molécula como molécula de unión, método que comprende proveer dicha biblioteca de una pluralidad de segmentos derivados de moléculas de unión o sus ligandos, que comprende además situar al menos dos de dichos segmentos en un par, o tres en un trío o más en la pluralidad respectiva, de preferencia una parte mayor de dichos pares, tríos o pluralidades y todavía mejor esencialmente todos estos pares, tríos o pluralidades, situando al menos un primer segmento cerca de un segundo segmento, p. ej. un segmento que comprende un dímero, trímero, oligómero o multímero.

Las bibliotecas existentes, ya sea p. ej. de naturaleza de ácido nucleico, (que contiene un sostén repetitivo de nucleótidos, nucleósidos o ácido nucleico peptídico o combinación de los mismos) o aminoácido (que contiene un sostén repetitivo de aminoácidos), tienen por lo general en común que unas moléculas individuales (o segmentos individuales) o una pluralidad de replicas dedicas moléculas individuales se sitúan y utilizan como la entidad que representa la zona de unión. Estas bibliotecas comprenden moléculas oligoméricas o multiméricas, como tramos de ácidos nucleicos o aminoácidos que han sido producidos por unión secuencia, de forma repetitiva, un monómero, (p. ej. un nucleótido o un aminoácido) con otro, hasta obtener una molécula (esencialmente polimérica) de longitud deseada.

Esencialmente, las bibliotecas de ácido nucleico existentes (comprenden ácidos nucleicos que han sido sintetizados secuencialmente, añadiendo un nucleótido o nucleósido a la vez al tramo en crecimiento, y las bibliotecas de péptidos existentes comprenden péptidos existentes comprenden péptidos que han sido sintetizados secuencialmente, añadiendo un aminoácido a la vez al tramo en crecimiento hasta alcanzar la longitud deseada. Con ácidos nucleicos, estos monómeros se elijen esencialmente dentro de un conjunto limitado de nucleótidos bien conocidos, con péptidos, dicho monómeros se eligen esencialmente dentro de un conjunto bien conocido de aminoácidos. No solo se utilizan monómeros naturales sino que también rutinariamente se usa nucleótidos sintéticos como moléculas de ácido nucleico de péptido (PNA) o aminoácidos no naturales e incluso D-amino-ácidos no naturales e incluso D-aminoácidos, como monómeros donde las moléculas esencialmente poliméricas se generan o producen utilizando un método que se asemeja esencialmente a la síntesis secuencial de polímeros a partir de moléculas monoméricas en la naturaleza. Estos monómeros individuales se sitúan de forma individual, considerándose que un monómero representa la totalidad o casi la totalidad de la zona de unión, sin tener en cuenta las múltiples partes de una zona de unión que constituyen una zona de unión discontinua.

La invención permite reconocer que la utilización esencialmente de segmentos diméricos e incluso más grandes (tri-, oligo-, o multimérico) en combinación, por tanto en pares o en tríos o incluso más, ofrece ventajas claras. No sólo se proporciona un método más rápido para llegar a una molécula o reconocerla como compuesta por varios segmentos sino que también permite una reagrupación rápida y eficiente de segmentos para generar una molécula o repertorio de entidades de prueba para la biblioteca deseada. La invención p. ej. presenta un método en el que se inicia la síntesis con un monómero, muy cerca del cual se sitúa un segundo segmento que comprende un dímero, como un dinucleótido o dipéptido. Aquí, un segmento que comprende un dímero, consiste al menos en un dímero pero también puede ser por ejemplo un trímero o cualquier otro multímero, que une monómeros de cualquier naturaleza, según se necesite. Por supuesto, una vez que se han situado dos segmentos muy cerca el uno de otro, se pueden añadir más
segmentos.

En una realización preferida, para seguir acelerando la síntesis o estar en condiciones de elegir segmentos deseados distintos, la invención presenta un método en el que dicho primer segmento comprende también un dímero, y en otro método todavía más preferido, otros segmentos comprenden también dímeros. La invención se sigue explicando con una descripción detallada en la que varios de los ejemplos se refieren a bibliotecas que comprenden moléculas donde cada uno de dichos segmentos comprende un péptido, como un tri-, penta, octa-, o nonapéptido; no obstante, la invención también habla de utilizar segmentos más largos, p. ej., de una longitud de 10-15, 15-20, 20-30 ó 30-40 aminoácidos o más largos y de naturaleza diversa.

En una realización preferida, como se muestra p. ej. en los ejemplos, la invención presenta un método en el que dicho primer segmento se sitúa o une a la fase sólida mediante un enlace tioéter cerca del segundo segmento mencionado; sin embargo, la invención no se limita por supuesto a ello. Los segmentos de nucleótido/nucleósido pueden estar unidos de forma covalente o ligados cortando y empalmando enzimas o ligasas, o bien superponiendo un primer segmento y el segundo segmento con una cadena de nucleótidos relativamente corta, en parte complementaria de ambos segmentos.

La invención ofrece por lo tanto una biblioteca molecular que permite probar, identificar, caracterizar o detectar una zona de unión continua o discontinua capaz de interactuar con una molécula de unión, donde dicha biblioteca ha sido provista de unas pluralidades (pares, tríos, grupos de cuatro, cinco, seis) de segmentos, y cada pluralidad comprende de preferencia al menos un primer segmento situado muy cerca de un segundo segmento, donde al menos dicho segundo segmento existía previamente como dímero o multímero. De preferencia, cada segmento o parte del mismo tiene la capacidad de ser una parte individual potencial de una zona de unión discontinua, donde de preferencia cada uno de al menos un primero y un segundo segmento o parte de los mismos representa una parte individual potencial de una zona de unión discontinua. Una biblioteca de este tipo puede estar constituida p. ej. por una biblioteca molecular sintética realizada realiza situando químicamente unos segmentos. De preferencia, estos segmentos tienen características distintas, p. ej. de ser esencialmente segmentos que son, comprenden o imitan componentes moleculares de organismos vivos, como (combinaciones de) aminoácidos.

De este modo la invención presenta la síntesis de moléculas que comprenden segmentos separados que representan potencialmente al menos dos partes distintas de una zona de unión discontinua, partes que no han sido necesariamente seleccionadas primero tras la previa identificación de las partes constituyentes potenciales, permitiendo de este modo la comprobación de zonas de unión discontinua de forma directa y rápida.

La invención permite por lo tanto identificar ahora zonas de unión discontinuas de moléculas receptoras que interactúan o se fijan en una zona de contacto con una hormona, un péptido, un fármaco, un antígeno, una molécula efector o cualquier otra molécula receptor, de enzimas, que se unen con su sustrato, de moléculas de anticuerpo que se unen con una zona de unión en un antígeno, ácido nucleico, que se una con proteína, y así sucesivamente.

De este modo se sintetiza una pluralidad de cuerpos de unión diferentes situando un primer segmento cerca de un segundo y así sucesivamente, y en una segunda posición en la prueba o formato de librería se une otro primer segmento a un segundo y así sucesivamente, tras lo cual, los cuerpos de unión sintetizados se comprueban cada uno de ellos con la molécula de unión en cuestión, permitiendo la determinación de un determinante antígeno discontinuo o epítopo discontinuo de importancia en, p. ej. un ácido nucleico, una proteína o una secuencia peptídica.

Dicho segmento peptídico comprende al menos dos aminoácidos y puede ser en principio tan largo como se desee, conteniendo p. ej. un centenar de aminoácidos o incluso más. En la realización práctica preferida, dicho segmento peptídico comprende de 3 a 30, de preferencia de 4 a 20, incluso más, de preferencia de 5 ó 6 de 12 a 15 aminoácidos, como p. ej. 9 ó 12 aminoácidos. Los segmentos separados no tienen que ser necesariamente de igual longitud.

Además, los segmentos peptídicos que se tienen que situar juntos o al menos muy cerca el uno del otro se pueden elegir de forma aleatoria o bajo la guía de una o varias secuencias conocidas, proteínicas o peptídicas. La selección aleatoria proporciona una biblioteca aleatoria según la invención. La selección de secuencias proteínas o peptídicas conocidas resuelta p. ej. útil cuando se desea averiguar si una zona de unión discontinua está constituida por varias zonas o partes presentes en proteínas o péptidos distintos, p. ej. en un complejo proteínico al que se puede unir una molécula de unión particular. La selección de varios segmentos peptídicos de una secuencia proteínica o peptídica conocida resulta útil cuando se desea averiguar si una zona de unión discontinua está compuesta por zonas o partes distintas presentes en una proteína o péptido, p. ej. en una proteína plegada a la que se puede unir una molécula de unión particular. La selección de segmentos peptídicos se puede realizar seleccionando péptidos de superposición de una secuencia conocida. Los péptidos de superposición pueden tener p. ej. todos un solo aminoácido o dos en común, de preferencia con superposición de forma contigua o pueden superponerse con solamente uno o varios aminoácidos. Para un examen rápido de las zonas de unión discontinuas en una proteína conocida resulta p. ej. útil elegir segmentos nonapeptídicos de dicha secuencia proteínica, uno de los cuales tiene p. ej. un solapamiento de 5 aminoácidos con otro segmento peptídico. Igualmente útil resulta no obstante seleccionar segmentos tripeptídicos de dicha secuencia que tiene una superposición de un solo aminoácido, y utilizar tres e incluso más segmentos en la construcción de la supuesta molécula de la zona de unión a la que se puede unir la molécula de unión que se va a probar.

Los segmentos se pueden fijar p. ej. químicamente a la fase sólida por medio de uniones o enlaces químicos. Las uniones o enlaces químicos se pueden formar utilizando varias combinaciones de estrategias de p. ej. química de péptidos o de nucleótidos y reacciones selectivas de ligado conocidas en el estado de la técnica. La química del ligado ha sido publicada por ejemplo por grupos de Kent (Ph. E. Dawson et al., Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation, Science 266 (1994) 776-779), Tam (J.P. Tam et al., Peptide Synthesis using Unprotected Peptides trhough Orthogonal Coupling Methods, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 92 (1995) 12485-12489; C.F. Liu et al., Orthogonal Ligation of Unprotected Peptide Segments through Pseudoproline Formation for the Synthesis of HIV-1 Protease Analogs, J. Am. Chem. Sco. 118 (1996) 307-312; L. Zhang & J.P. Tam Thiazolidone Formation as a General and Site-specific Conjugation Method for Synthetic Peptides and Proteins, Analytical Biochemistry 233 (1996) 87-93), and Mutter (G. Tuchscherer & M. Mutter, Protein Design as a Challenge for Peptide Chemists, J. Peptide Science 1 (1995) 3-10; S.E. Cervigni et al., Template-assisted Proteins Design: Chimeric TASP by Chemoselective Ligation, Peptides: Chemistry Structure and Biology, P.T.P. Kaumaya & R.S. Hodges eds, Mayflower (1996) 555-557).

Las posibles estrategias para la formación de uniones que ofrece de preferencia la invención son, por ejemplo:

1. Dicha unión de un segmento o varios con una fase sólida se forma utilizando un agente de ligado homofuncional o heterofuncional (S.S. Wong: Chemistry of Proteins Conjugation and Cross-Linking, CRC Press Inc, Boca Ratón, Florida USA 1991). En esta construcción, se utiliza un grupo reactivo en un segmento para que reaccione con una parte del agente de ligado bifuncional, facilitando de este modo la reacción de la segunda parte del agente de ligado con un grupo reactivo de una fase sólida, o viceversa. Por ejemplo, un ligante como MBS (N-hidroxisuccinimida éster del ácido m-maleinimidobenzoico) se puede utilizar para hacer reaccionar a través de su éster activo (succinimida) con un grupo amino de un segmento y a través de su grupo maleinimida con un grupo tiol libre de una fase sólida, o viceversa. En esta estrategia, cuando se procede al ligado no deberá haber de preferencia en el segmento ningún otro grupo amino o tiol libre. Para ello, los grupos amino o tiol que tienen que involucrase en la reacción pueden desproteger selectivamente, p. ej. utilizando un grupo protector de cadena lateral que se puede escindir con un reactivo suave como un ácido trifluoracético al 1%, que deja intactos otros grupos de protección de cadena
lateral.

2. Dicha unión se forma introduciendo un aminoácido modificado en la síntesis de uno o más segmentos. Los aminoácidos se pueden modificar p. ej. introduciendo un grupo especial en la cadena lateral o en el grupo alfa-amino. Una modificación en el grupo alfa-amino conduce a una amida o a un péptido modificado de sostén (véase p. ej. Gillon et al. Biopolymers, 31:745-750, 1991). Por ejemplo, este grupo puede ser un grupo maleinimido en el grupo amino de cadena lateral de lisina. Al final de la síntesis de péptidos este grupo reaccionará de forma rápida y selectiva con un grupo tiol de una fase sólida. Tam et al. (PNAS 92:12485-12489, 1995) describieron una síntesis de un péptido con un residuo de lisina que se había modificado en la cadena lateral con un residuo de serina protegido. Tras la desprotección y la oxidación selectiva utilizando periodato, la función alfa-amino, beta-hidroxi de las serinas se convierte en una función aldehído que se puede ligar selectivamente con otra superficie que lleva tiol. También se pueden utilizar para situar segmentos uniones de sostén peptídico a través de grupos unidos a los grupos amida del péptido (Bitan et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1501-1510, 1997; Bitan and Gilon Tetrahedon, 51:10513-10522, 1995; Kaljuste and Unden, Int. J. Pept. Prot. Res. 43:505-511, 1994).

3. Otro modo más de formar dicha unión consiste en sintetizar un segmento, como un péptido, con un término N-modificado. Por ejemplo se puede introducir al final de la síntesis un grupo alfa-haloacetamido N-terminal. Este grupo reacciona de forma rápida y selectiva con una fase sólida que contiene tiol. Por ejemplo, el primer segmento se sintetiza con una bromoacetamida N-terminal y la fase sólida se provee de una cisteína. Aunque la mayoría de los grupos alfa-haloacetamida, como cloro-, bromo-, o yodoacetamida, reaccionarán con grupos tioles, en aquellos casos en los que se requiere un ensamblado rápido, se prefiere el grupo bromoacetamida debido a su facilidad de introducción y reacción rápida y selectiva con grupos tioles.

Además, la invención ofrece la posibilidad de direccionar el enlace en cualquier posición del primero y/o segundo segmento o el consecutivo. Por ejemplo para los segmentos peptídicos se sintetizan conjuntos de péptidos en los cuales una cisteína o lisina modificada de cadena lateral, ambos residuos de aminoácidos en una reacción preferida pueden unirse selectivamente con otro segmento, pasa, uno a uno, de la posición aminoácido N-terminal a la posición aminoácido C-terminal. Las combinaciones de estas posibilidades conducirán nuevamente a bibliotecas como las ofrecidas por la invención. En otra realización preferida, dichos segmentos se unen al menos dos veces muy cerca de dicha fase sólida, de preferencia uniendo los extremos respectivos de los segmentos a la superficie de forma que los segmentos en asa se fijen a la fase sólida. En esta realización preferida se fijan a la fase sólida pares (o pluralidades mayores) de segmentos en asa, que se presentan como cuerpos de unión.

En una realización preferida, la invención presenta una biblioteca en la que dichas pluralidades se pueden direcciones de forma posicionar o espacial, p. ej. en forma de matriz (array) si se desea con la ayuda de localización y/o reconocimiento informático de un par específico o un trío (o una pluralidad mayo) o un conjunto de pluralidades dentro de las dimensiones (p. ej. plano o superficie) del soporte o fase sólida de la biblioteca utilizada. En una matriz, estas pluralidades se pueden direccionar p. ej. por sus posiciones en una rejilla o matriz.

Una realización preferida de la invención permite además aumentar gradualmente la síntesis en lo que respecta al número de constructos sobre p. ej. un soporte sólido por centímetro cuadrado. Para facilitar la generación del mayor número posible de constructos, que contienen p. ej. entidades de prueba (pares, tríos o pluralidades mayores) que comprenden al menos dos segmentos peptídicos de una proteína, se realizan varios millares de constructos peptídicos. Por ejemplo, cuando se necesitan todos los constructos en los cuales ambos segmentos tienen p. ej. 12 aminoácidos de largo, derivados de una proteína pequeña con una longitud de 100 residuos de aminoácido, se fabrican ya 89 x 89 = 7921 constructos peptídicos, si los segmentos están unidos únicamente a la fase sólida, p. ej. a través del término C para el primer segmento y el término N del segundo segmento, o viceversa, o ambos, utilizando solamente un tipo de unión. Para una proteína con una longitud de 1000 residuos de aminoácidos se fabrican al menos 989 x 989 = 978121 constructos. Para probar de forma eficaz con ELISA estos números de constructos, se prefieren altas densidades de constructos en el soporte sólido. La invención ofrece altas densidades de constructo en un soporte sólido, donde p. ej. (una capa de) un primer segmento con un grupo bromoacetamida en el término N se sintetiza sobre una superficie de al menos 1 cm^{2}. En otra parte de la superficie, se puede aplicar otro primer segmento. En cada una de estas superficies funcionarizadas por péptido del soporte se sitúan o cuadriculan un conjunto de p. ej. 10, de preferencia 50 y todavía mejor 100, o más segundos segmentos peptídicos que contienen un grupo tiol libre, de forma posicional o espacialmente direccionable, dando, tras el acoplamiento, otros tantos pares peptídicos diferentes. La situación se puede realizar p. ej. utilizando tecnología piezo "drop-on-demand" o utilizando válvulas de solenoide en miniatura. La cuadriculación se puede realizar p. ej. utilizando un conjunto de agujas individuales que recogen cantidades inferiores al microlitro de solución de segmento de una placa de microvalvulación, que contiene soluciones que comprenden los segundos segmentos. Tras la reacción de unión, la desprotección subsiguiente y el abundante lavado del soporte para eliminar los péptidos no acoplados dan al menos una densidad de pares de constructos peptídicos de 10 a 50, e incluso de 100 a 200 o hasta 50-1000 pares situados por cm^{2}. Esta densidad permite examinar el mayor número posible de pares peptídicos o cuerpos de unión derivados de dichas proteínas par unirse a un anticuerpo. Por ejemplo: en una realización preferida, se realizan de 20000 a 100.000 constructos sobre 1000 cm^{2}; por lo general se examinan las uniones de la superficie con ELISA, con 100 ml de una solución anticuerpo que contiene 1-10 \mug de anticuerpo/ml. Por ejemplo, la detección por fluorescencia indirecta o directa asigna constructos de unión de anticuerpos. La selección por fluorescencia directa con métodos de detección de escaneo confocal p. ej. permite la detección de anticuerpos sobre puntos generados con gotitas de solución peptídica de un orden inferior al nanolitro, permitiendo obtener densidades de constructo todavía más elevadas. Se pueden fabricar de forma similar bibliotecas de ácido
nucleico.

Además, la invención presenta un soporte sólido que comprende una biblioteca según la invención, soporte sólido que permite la presentación de una zona de unión conformacional o discontinua potencial o epítopo de una molécula de unión, habiéndose provisto dicho soporte sólido de una pluralidad de entidades de prueba, donde cada par o trío o pluralidad mayor de estas entidades de prueba o cuerpos de unión constituyen un representante posible de dicha zona de unión o epítopo y p. ej. comprende al menos un primer péptido o un nucleótido unido p. ej. de forma covalente con una fase sólida y un segundo péptido o nucleótido.

En una realización preferida, dicho soporte sólido comprende por lo menos una densidad de punto o mancha (p. ej. supuesta zona de unión, entidad de prueba, o par de segmento) del orden de 10, 20, 50 o incluso 100, 200 o hasta 500 o incluso 1000 puntos por cm^{2}, donde, de preferencia dichos puntos o manchas se pueden direccionar de forma posicional o espacial.

La invención presenta además un método para examinar, es decir, comprobar, identificar, caracterizar o detectar una zona de unión discontinua capaz de interactuar con una molécula de unión, que comprende el examen de una biblioteca como la que ofrece la invención con moléculas de unión, las cuales son p. ej. anticuerpos, receptores solubles, que contienen una cola Fc-o una etiqueta para la detección, receptores sobre células, moléculas biotiniladas o moléculas fluorescentes.

En particular, la invención ofrece un método para descubrir una zona de unión discontinua capaz de interactuar con una molécula de unión, que comprende el examen de una biblioteca según la invención con por lo menos una entidad de prueba y la detección de la unión entre un elemento de dicha biblioteca y la citada entidad de prueba. En una realización preferida, dicha unión se detecta inmunológicamente, utilizando p. ej. técnicas ELISA.

Al detectar la unión a una entidad de prueba específica (denominada aquí también cuerpo de unión) de dicha biblioteca, la invención ofrece dicho elemento o cuerpo de unión, una molécula sintética que comprende dicho cuerpo de unión o entidad de prueba o par o pluralidad mayor de segmentos (en forma de asa) que comprenden una zona de unión discontinua identificable o identificada, obtenible o que se puede obtener mediante un método según la invención. La invención ofrece por tanto la utilización de una biblioteca según la misma, la utilización de un soporte sólido o fase sólido o superficie matriz provistas de uno o más cuerpos de unión o entidades de pruebas según la invención, o la utilización de un método según la invención para identificar u obtener una molécula sintética que comprende una zona de unión discontinua o una molécula de unión capaz de unirse a la misma. Debido a que se proporcionan ahora zonas de unión discontinuas, esta molécula sintética se puede utilizar ventajosamente in vitro o in vivo para encontrar una molécula de unión y para efectuar y/o afectar la unión a una molécula de unión, p. ej. interactuar o unirse a moléculas receptoras que normalmente interactúan o se unen a una hormona, un péptido, un fármaco, un antígeno, una molécula efector, un agonista, un antagonista o a otra molécula receptora; a enzimas que normalmente se unen con su sustrato; a moléculas de anticuerpo, ácido nucleico, proteína, en suma, a biomoléculas. La invención se explica en la descripción detallada que no supone ninguna limitación a la
misma.

Leyenda de las figuras

Figura 1

6 cisteínas diferentes que se pueden utilizar para acoplar bromo en condiciones diferentes.

Figura 2. (observación con colorante oscuro)

Análisis de dos péptidos diferentes para mostrar el efecto ventajoso de la unión por ambos lados (two-sided) y la formación de asas. En la izquierda, el péptido tiene un amino terminal Br. En la derecha, el péptido tiene un amino terminal Br y un C-terminal lisina-Br (sintetizado en la forma descrita en la leyenda de la figura 4B).

La prueba se realizó en una configuración mini-pocillo (3 \mul cada pocillo) la superficie se funcionaliza con grupos tiol (grupos -SH). Los péptidos se acoplaron a la superficie utilizando el grupo bromo (Br) del péptido. Se utilizaron concentraciones diferentes de péptido para acoplar a la superficie. Se utilizaron dos conjuntos de péptidos, uno con un grupo Br y el otro (difiere únicamente del péptido anterior en una mitad adicional lisina +Br-acetilo en la zona C-terminal del péptido) con dos grupos Br. La unión se determinó utilizando concentraciones de anticuerpo diferidas en una configuración ELISA.

Figura 3

Proximidad de segmentos tras el acoplamiento sobre soporte líquido. A la izquierda: a una distancia mínima de 2 angstrom se acoplaron ligantes de 15 angstrom. Los segmentos se acoplaron a estos ligantes. La flexibilidad de los ligantes permite que los términos de los dos segmentos se muevan dentro de distancias de 0-30 angstrom. A la derecha: las distancias entre los ligantes pueden variar entre 2 y 50 o más. Se muestra como ejemplo 9 angstrom. Esto permite que los términos de los dos segmentos se muevan dentro de distancias de 0-40 angstrom.

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Figura 3B

Representación esquemática de la forma en que se unen los dos segmentos como asas a la superficie polímera del policarbono. Las distancias preferidas, al menos en el caso de cuerpos de unión derivados de CDR, entre las partes superiores de las asas son 0-30 angstrom, algo similar a la del CDR en un anticuerpo.

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Figura 4

Representación esquemática de la forma en que se pueden acoplar dos segmentos sobre la superficie polímera (policarbono). El gráfico muestra 4 ejemplos. En el ejemplo 1, se acoplan dos segmentos lineales. En el 2, se acoplan dos segmentos en asa. En el 3, se acoplan dos segmentos en asa. En el 4 se acoplan dos segmentos en asa. Con elementos especialmente espaciados (p. ej. fenilalanina aminoácidos) se obtienen asas extendidas. En la superficie de policarbono se acoplan dos tipos de cisteína protegida (cis (trt) y cis (mmt) y p. ej. un elemento espaciador. El cis (mmt) se desprotege con 1% TFA mientras que el cis (trt) permanece protegido. El primer segmento se acopla al cis (mmt) desprotegido. Luego se desprotege el segundo cis (trt) con 95% TFA. Seguidamente se acopla el segundo segmento al cis (trt) que se encuentra ahora desprotegido.

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Figura 4B

Representación esquemática de la forma en que se pueden acoplar dos segmentos sobre una plantilla cíclica, que está a su vez acoplada a la superficie polímera. La plantilla cíclica es un péptido flexible cíclico. El péptido cíclico contiene cuatro lisinas (mmt), dos cisteínas (trt) y dos cisteínas (butilo). El péptido se acopla a la resina mediante un azufre sensible a 1% TFA. En el término amino se fija un bromo, según lo descrito anteriormente. El procedimiento es el siguiente: el péptido sintetizado se trata con 1% TFA. Esto da como resultado la desprotección de las lisinas y el desacoplamiento del péptido de la resina. Las cisteínas permanecen protegidas. Después de elevar el pH hasta 8 se unen los términos N- y C- del péptido a través del S y el Br. Seguidamente se acopla al Br el -NH2 de las lisinas desprotegidas. El péptido cíclico resultante, con cuatro Br y todavía 4 cisteínas protegidas se acopla a los ligantes por medio del Br. Se acoplan dos segmentos péptidos a la plantilla cíclica acoplada a las cisteínas-ligante. Primero se desprotegen las dos cisteínas (trt) con 95% TFA. Luego se acopla el primer segmento. Seguidamente se desprotegen las dos cis (butilo) con NaBH4. Luego, se acopla el segundo segmento.

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Figura 4C

Representación esquemática de cómo se pueden acoplar dos segmentos sobre otros dos segmentos que están acoplados a la superficie polímera. Con -SH libre sobre la superficie se acoplan dos segmentos a la superficie por medio de un Br terminal N y terminal C. El Br N terminal se sintetiza en la forma descrita anteriormente. El Br C terminal se une a una lisina C terminal en la forma descrita en la figura 4B. Ambos segmentos contienen cisteínas protegidas sobre las cuales se acoplan otros segmentos en la forma descrita también en la figura 4B.

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Figura 5

Representación esquemática de matriz-escaneo con dos segmentos. Sobre la superficie polímera se acopla una mezcla de cis (mmt) y cis (trt). Tras 1% TFA se desprotege el cis (mmt). Luego en cada cuadrado se acopla un péptido por medio de Br de uno o dos terminales. Por consiguiente péptido 1 en cuadrado 1, péptido 2 en cuadrado 2, etc., hasta péptido 100 en cuadrado 100. Luego se desprotege el cis (trt) con 95% TFA. Luego, en cada cuadrado se observan/sitúan 100 péptidos diferentes. Por consiguiente, péptido 1 a 100 en cuadrado 1, péptido 1 a 100 en cuadrado 2, etc. hasta péptido 1 a péptido 100 en cuadrado 100.

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Figura 6

Ensayo de unión de todos los 30-meros de superposición que cubren la secuencia lineal de hFSHR con el 40-mero hFSH-péptido sintético biotinilado biotin-EKEEARFCISINTTWAAGYAYTRDLVYKDPARPKQKTAT-CONB2. Los péptidos 30-meros se observaron/situaron en la forma descrita y los péptidos 40-meros se sintetizaron utilizando química FMOC standard. Los diversos péptidos 30-meros se incubaron con un 1 microgramo/ml de hFSH-péptido. Después de lavar los péptidos se incubaron con estreptavidin-peroxidasa, y después de lavar con sustrato de peroxidasa H_{2}O_{2}.

Figura 7

Representación esquemática del desarrollo de imitaciones sintéticas de zonas de unión discontinuas en el hTSHR y hTSH. En células tiroides del receptor hTSH- se une a hTSH. Los anticuerpos autoinmunes de pacientes de Graves y Hashimoto también se unen al receptor hTSH. Examinando todos los 30-meros de superposición de hTHS se identifican segmentos de la zona de unión discontinua para hTSHR (según lo descrito para FSH, véase leyenda figura 6). Examinando dos los 30-meros de superposición de hTSHR se identificaron segmentos de las zonas de unión discontinuas para anticuerpos de Graves y Hashimoto. Modelando y utilizando plantillas sintéticas, se combinan los segmentos individuales para obtener una combinación sintética discontinua.

Figura 8

Representación esquemática de una matriz que comprende imitaciones sintéticas de zonas de unión discontinuas o cuerpos de unión. Los cuerpos de unión se eligen y mejoran fabricando matrices que contienen una multiplicidad de cuerpos de unión espacialmente direccionables en la superficie sólida (o alternativamente, en un scaffold molecular separado). Las matrices se pueden incubar con blanco (target) para comprobar la existencia de cuerpos de unión que se unen al blanco que interesa. Los cuerpos de unión iniciales se pueden mejorar haciendo matrices de seguimiento compuestas por múltiples variantes de los cuerpos de unión iniciales, p. ej. reagrupando secuencia. Si se alcanza la especificidad y/o afinidad deseadas, los cuerpos de unión pueden producirse sobre un scaffold y producir y utilizar sueltos.

Figura 9

Representación esquemática del desarrollo de limitaciones sintéticas de zonas de unión discontinuas o cuerpos de unión derivadas de secuencias CDR. Se construyen cuerpos de unión posicionando sobre una fase sólida o superficie de matriz, (de preferencia una superficie (policarbono)-polímero) o sobre scaffolds predefinidos o plantillas. Los cuerpos de unión se pueden derivar de las Regiones de Determinación de Complementariedad (CDR) de anticuerpos o de cualquier otro motivo proteínico que se sepa se une a otras moléculas, de preferencia con una afinidad elevada.

Figura 10

Pepscan lineal standard en todos los 12-meros sintéticos de superposición que cubren la secuencia lineal de hTNF con anticuerpo monoclonal 210 (R&D Systems, MAB210, clone 1825.12, through ITK Diagnopstics Uithoorn, Países Bajos). Se identificó un pequeño pico con la secuencia IKSPCQRET PEG. En el eje y se encuentran valores de densidad óptica (OD) obtenidos utilizando un sistema de cámara ccd. Rampo, peroxidasa, conejo-anti-ratón (DAKO).

Figura 11

Listado parcial de péptidos sintetizados para asa-asa 15-mero Matrix-scan. Se sintetizaron todos los péptidos-asa 15-meros de superposición que cubren la secuencia lineal del factor de necrosis tumor humano (hTNF), es decir 145 hTNF asa-péptidos en total. Z es un cis-butilo. El término amino de todos los péptidos contiene un grupo bromo (+).

Figura 12

Configuración del asa-asa 15-mero Matrix-scan. Representación esquemática de Matrix-scan con dos segmentos de asa. Sobre la superficie polímera se acopla una mezcla de cis (mmt) y cis (trt). Después de 1% TFA, se desprotege el cis (mmt). Luego en cada cuadrado se acopla un péptido por medio de su grupo bromo N-terminal (+). Por consiguiente péptido-1 en cuadrado 1, péptido 2 en cuadrado 2, etc., hasta péptido 145 en cuadrado 145. Luego se desprotege el cis (trt) con 95% TFA. Seguidamente en cada cuadrado 145 se sitúan simultáneamente 145 péptidos diferentes. Por consiguiente, péptido 1 a 145 en cuadrado 1, péptido 1-145 en cuadrado 2, etc., hasta péptido 1 a péptido 145 en cuadrado 145. Se utilizaron algunos cuadrados adicionales para controles (epítopos lineales).

Figura 13

Resultado del asa-asa 15-mero Matrix-scan con anti-hTNF mAb 210 (10 \mug/ml). Se observan los resultados obtenidos con los 145 cuadrados. Los cuadrados 66, 67 y 92-96 están rotulados de forma clara (péptidos-asa acoplados primero). En la parte superior también se rotulan otros cuadrados (las manchas representan el primer péptido acoplado después del segundo péptido de asa). Cuadrados identificados:

Sq-65: +FKGQGCPSTHVLLTZ; Sq-66: +KGQGCPSTHVLLTHZ; Sq-67: +CQGCPSTHVLLTHTZ; Sq-87:
+SYQTKVNLLSAIKSZ; Sq-88: +YQTKVNLLSAIKSPZ; Sq-94: +LLSAIKSPCQRETPZ; Sq-95: +LSAJKSPCQ
RETPZ; Sq-127: +LEKGDRLSAEINRPZ; Sq-128: +EKGDRLSAEINRPDZ. Péptido-65: +FKGQGCPSTHVLLTZ; Péptido-70: +CPSTHVLLTHTISRZ; Péptido-72: +STHVLLTHTISRIAZ; Péptido-77: +LTHTISRIAVSYQTZ; Péptido-94: +LLSAIKSPCQRETPZ; Péptido-95: +LSAIKSPCQRETPZ; Péptido-99: +KSPCQRETPEGAEAZ; Péptido-126: +QLEKGDRLSAEINRZ; Péptido-129: +KGDRLSAEINRPDYZ. El eje y tiene unidades arbitrarias.

Figura 14

Resultado del asa-asa 15-mero Matrix-scan con mAb 210 (10 \mug/ml) con detalles de cuadrados 65 y 127. Se rotulan la combinación de péptido-asa 65 con péptidos-asa 94, 95, combinaciones de péptido-asa 65 con 126-127, combinaciones de péptido-asa 127 con péptidos 65-77 y combinaciones de péptido-asa 127 con péptidos-asa 94-96. El eje y utiliza unidades arbitrarias.

Figura 15

Representación tridimensional de los péptidos asa-asa de unión identificados con mAb-210 (10 gg/ml). Se muestran las tres regiones identificadas (péptidos 65-69, 94-96 y 126-127): GQGCPSTHVLLTHTIS (VLLT está rotulado); SAIKSPCQRE (KSOC está rotulado); KGDRLSAEINR (SA está rotulado).

Figura 16

Resultado del asa-asa 15 mero Matrix-scan de regiones CDR asa-asa de anticuerpos con lisozima-biotina (100 \mug/ml, in triplo). Utilizando 1 \mug/ml de lisozima-biotina no se observa ninguna unión (no mostrada). Los controles de estreptavidina-peroxidasa solamente entre las pruebas fueron negativos (no mostrado).

Péptidos A, B, C, D, E y F: péptido-A: +ARETDYRLDYZ (HCDR3 de 1fdl.pdb); péptido-B: +ARGDGNYGYZ (HCDR3 de 1mlb.pdb); péptido-C: +LHGNYDFDGZ (HCDR3 de hfl.pdb); péptido-D: +ANWDGDYZ (HCDR de 3hfm.pdb); péptido-E: +ARRYGNSFDYZ (HCDR3 de 1qfm.pdb); péptido-F: +ARQGTAAQPYWYZ (HCDR3 de 1qfw.pdb) (1fdl.pdb, 1mlb.pdb, 3hfl.pdb y 3hfm.pdb son anticuerpos que se unen a la lisozima; 1qfw.pdb son dos anticuerpos que se unen a la coriogonadotrofina humana). Todos los péptidos tienen un grupo bromo amioterminal (+) y una lisina-mmt carboxiterminal (Z).

Péptidos 1 a 27: péptido-1: +RASGNIHNYLAZ (LCDR1 de 1fdl.pdb); péptido-2: +RAS1SISINNLHZ (LC
DR1 de 1mlb.pdb); péptido-3: +SASSSVNYMYZ (LCDR1 de 3hfl.pdb); péptido-4: +RAS1-SIGNNLHZ (LCDR1 de 3hfm.pdb); péptido-5: +RASESVDSYNGNSZ (LCDR1 de qfw.pdb); péptido-6: +ASESVDSYGNSFZ (LCDR1 de 1qfw.pdb); péptido-71: +SESVDSYGNSFMZ (LCRD1 de 1qfw.pdb); péptido-8: +ESVDSYGNSFMQZ (LCDR1 de 1qfw.pdb); péptido-10: +ASESVDSYGBSFMZ (LCDR1 de 1qfw.pdb); péptido-12: +RASESVDSYGNSFMZ (LC
DR1 de 1qfw.pdb); péptido-13: +ASESVDSYGNSFMQZ (LCDR1 de 1qfw.pdb); péptido-14: +RASESVDSYGNSF
MQZ (LCDR1 de 1qfw.pdb); péptido-16: +LLVYYTTTLADGZ (LCDR2 de 1fdl.pdb); péptido-20: +LLITRASN
LESGZ (LCDR2 de 1qfw.pdb); péptido-21: LLIFGASNRESGZ (LCDR2 de 1qfw.pdb); péptido-22: +QHFWSTPRTZ (LCDR3 de 1fdl.pdb); péptido-23: +QQSNSWPRTZ (LCDR3 de 1mlb.pd); péptido-24: +QQWGRNPTZ (LCDR3 de 3hf1.pdb); péptido-25: +QQSNSWPYTZ (LCDR3 de 3hfm.pdb); péptido-26: +QQSDEYPYMYTZ (LCDR3 de 1qfw.pdb); péptido-27: +CQTYNHPYTZ (LCDR3 de 1qfw.pdb (1fdl.pcd, 1mlb.pdb, 3hfl.pdb y 3hfm.pdb son anticuerpos que se unen a la lisozima; 1qfw.pdb son dos anticuerpos que se unen a la coriogonadotrofina humana). Todos los péptidos tienen un grupo bromo amioterminal (+) y lisina-mmt carboxiterminal (Z).

El péptido asa-asa, +LHGNYDFDGZ +SESVDGNSFMQZ (asa de HCDR3 de 3hfl.pdb con asa de LCDR1 de 1qfw.pdb) con la actividad de unión más elevada se indica mediante una flecha.

Figura 17

Resultado de pepscan ELISA con dos anticuerpos diferentes sobre asas de péptido único o doble acopladas a mini tarjetas pepscan según lo descrito anteriormente. Acoplado a cuadrado A: asa péptido-l; acoplado a cuadrado B: primer asa péptido-1 seguido de asa péptido-2; acoplado a cuadrado-C: asa-péptido-2; acoplado a cuadrado-D: primer asa péptido-2 seguido de asa péptido-1. Asa péptido-1: +KSYNRVTVMGGFKVEZ-conh2; asa péptido-2: +LQENPFFSQPGAPILZ-conh2. El eje y corresponden a los valores de densidad óptica (OD) obtenidos utilizando un sistema cámara ccd. Ambos péptidosasa se derivan de la hormona estimulante del folículo humana (hFSH).

Descripción detallada Síntesis de constructos peptídicos

Se injertó, por ejemplo con ácido poliacrílico, un soporte de polipropileno o polietileno, u otro material adecuado. A modo de ejemplo, se irradió, utilizando radiación gamma a una dosis de 12 kGy un soporte de polipropileno en una solución de ácido acrílico en agua al 6%, que contenía CuSO_{4}. El soporte sólido injertado que contenía grupos de ácido carboxílico se funcionalizó con grupos amino acoplando t-butiloxicarbonilhexametilendiamina (Boc-HMDA), utilizando diciclohexilcarbodiimida (DCC) con N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y segmentación ulterior de los grupos Boc utilizando ácido trifluoracético. Seguidamente se funcionalizó la superficie con Cys aminoácidos (si se prefiere una mezcla de dichos aminoácidos protegidos de forma diferente) utilizando química Fmoc standard. Como ejemplos de grupos Cys protegidos de forma diferente se puede citar Cys (Trt) y Cys (mmt). Después de quitar el FMOC se acetiló el grupo amino. La desprotección de la cadena lateral se puede realizar en la forma descrita. Se utilizó química de síntesis de péptido Fmoc standard unir péptidos (segmentos) sobre el soporte sólido amino funcionarizado. Tras la segmentación del grupo Fmoc del último aminoácido y el lavado; se acopló ácido bromoacético utilizando DCC o DCC/HOBt. Se puede acoplar un segundo ácido bromoacético (en la misma etapa) a la superficie cuando se encuentra presente p. ej. un residuo de lisina (Lys) en el péptido: la química de protección de cadena lateral de Lys (utilizando FMOC-Lys(MTT)-OH) permite que solo se libere el grupo amino de la cadena lateral Lys (con 1% de ácido trifluoracético en diclorometano) mientras que los otros aminoácidos siguen estando protegidos. Posteriormente, si solo se utilizó DCC el péptido contenía un grupo de bromoacetamida reactiva de tiol. No obstante, si se utilizó DCC/HOBt para acoplar el ácido bromoacético, el péptido no contenía esencialmente el grupo bromo, sino otro grupo reactivo capaz de reaccionar eficazmente con grupos tiol, formando así el mismo enlace tioéter entre los segmentos. Acoplamiento/ligadura de un segundo péptido después de un péptido acoplado o sintetizado en un soporte sólido: se pueden acoplar péptidos bromo funcionalizados al soporte sólido (cuando se encuentra presente un tiol) en una solución acuosa que contiene tampón de bicarbonato sódico a aprox. pH 7-8. Se sintetizaron péptidos en "pins" de polietileno injertados con poli-hidrometilmetacrilato (poli-HEMA). Este polímero injertado se obtuvo por radiación gamma de "pins" de polietileno en una solución de HEMA al 20% en metanol/agua 80/20 ó 70/30 a una dosis de 30-50 kGy. El soporte funcionalizado se puede utilizar para la síntesis de 1 \mumol de péptido/cm^{2} después del acoplamiento de \beta-alanina y un ligante Fmoc-2,4.dimetoxi-4'-(carboximetiloxi)-benzhidrilamina (Rink) labil ácido. Los péptidos se sintetizaron utilizando química Fmoc standard y el péptido se desprotegió y segmentó de la resina utilizando ácido trifluoracético con captores (scavengers). El péptido segmentado que contenía un residuo de cisteína a una concentración de aprox. 1 mg/ml se hizo reaccionar con el soporte sólido descrito anteriormente en un tampón de bicarbonato sódico/agua a un pH aproximado de 7-8, formando así un constructo parcialmente protegido de dos péptidos cada uno, al menos una vez unido de forma covalente por medio de un enlace tioéter al soporte sólido. El constructo descrito anteriormente se desprotegió según procedimientos standard utilizando combinaciones de ácido trifluoracético/scavengers (captor). Los constructos desprotegidos sobre el soporte sólido se lavaron abundantemente utilizando tampones rompedores que contiene dodecilsulfato sódico y \beta-mercaptoetanol, y limpieza ultrasónica, y se utilizaron utilizando directamente en ELISA. Una limpieza subsiguiente en los tampones destruidos permite realizar pruebas repetidas de anticuerpos en ELISA.

Según estos métodos, un biblioteca de constructos, que consiste p. ej. en un segmento dodecapeptídico acoplado a través de su residuo de cisteína añadida en terminal C después de un segundo segmento bromoacetilado N-terminal que permite escanear una secuencia proteínica p. ej. mediante etapas de un solo residuo de aminoácido. El péptido de bromoacetamida se unió covalentemente a un soporte sólido de ácido polipropilen/poliacrílico funcionalizado en pocillos de 3 \mul, según lo descrito anteriormente. Las secuencias que contienen cisteína se sintetizan sobre "pins" de polietileno funcionalizados y se separan de los mismos. Sobre una superficie de un soporte sólido se sintetizan péptidos en la forma descrita anteriormente. Sobre este soporte funcionalizado peptídico se sitúa un segundo segmento peptídico que contiene un grupo tiol libre utilizando tecnología "piezo Drop-on-demand", con un dispositivo de microdosificación y piezo auto pipeta (Auto Drop-Micropitte AD-K-501) (Microdrop Gesellschaft für Mikrodosier Sistema GmbH. La observación/situación o cruadiculación se realizó alternativamente utilizando válvulas de solenoide miniatura (INKX 0502600A; the Ice Company) o "pins" de cuadriculación de fondo de precisión endurecidos (Genomic Solutions, diámetros 0,4, 0,6, 0,8 ó 1,5 mm). La ulterior desprotección del constructo y lavado abundante para eliminar el péptido no acoplado dio como resultado constructos de cuerpos de unión en las áreas observadas. Los constructos peptídicos generados con gotitas de solución de péptido, del orden de nanolitros, se unen a suficientes anticuerpos para su detección, utilizando en este caso detección por fluorescencia indirecta. Las manchas generadas con 0,25 nl-50 ml son inferiores a 1 mm^{2}. Por consiguiente, en esta configuración, la densidad del cuerpo de unión puede llegar a tener 100-1000 manchas por cm^{2} y utilizando un equipo más pequeño las densidades pueden ser incluso
mayores.

En resumen, se introduce una función tiol sobre un soporte sólido amino-funcionalizado. Esto se puede hacer por reacción directa de los grupos amino con, p. ej. iminotiolano o acoplando Fmoc-Cys(Trt)-OH, seguido de segmentación de Fmoc utilizando piperidina, acetilación y desprotección de tritilo utilizando mezclas de TFA/scavenger (captores). Este soporte sólido tiol-funcionalizado se puede hacer reaccionar p. ej. con un bromoacetamida-péptido que contiene un residuo de cisteína protegido. Después de acoplar el primer péptido, la cisteína se puede desproteger utilizando p. ej. una mezcla TFA/scavenger. Los grupos tiol libres hasta ahora no utilizados se pueden usar para acoplar un segundo bromoacetamida-péptido, que contiene a su vez una cisteína protegida. Este procedimiento puede repetirse para realizar constructos de segmentos. Se pueden usar varios tipos de escaneos en combinación con este escaneo multisegmento.

Ejemplos de uso

Las proteínas y péptidos se pueden examinar utilizando cualquier tipo de molécula de unión, p. ej. biomoléculas como anticuerpo, receptores solubles, que contienen un final Fc o una etiqueta para la detección, moléculas biotiniladas o moléculas fluorescentes. Los segmentos alternativos pueden ser por ejemplo carbohidratos, aminoácidos no naturales, PNA, ADN, lípidos, moléculas que contienen imitaciones de enlace peptídico.

Ejemplo de TSH

El diseño y la síntesis de imitaciones sintéticas de zonas de unión discontinuas de proteínas grandes como TSH o TSHR es lo que actualmente se desea. Con vistas a este objetivo, las imitaciones de proteínas basadas en plantillas han proporcionado una nueva herramienta potente para la investigación básica. La tecnología que aquí se ofrece nos permite mapear zonas de unión discontinuas, acoplarlas sobre una plantilla sintética y controlar y seguir en detalle las características estructurales y funcionales.

Fundamental para este enfoque es la posibilidad de sintetizar y probar 100.000 péptidos sintéticos en formato matriz. Esto es posible con las tecnologías que aquí se ofrecen. Estas incluyen la síntesis péptido-matriz y nuevas tecnologías en la química de las plantillas. Mediante química se acoplan todo tipo de grupos sintéticos sobre dos o más posiciones diferentes en estas plantillas, permitiendo la reconstrucción de las zonas de unión discontinuas y la síntesis de imitación. El desarrollo de métodos que permiten mapear zonas de unión discontinuas entre proteínas grandes constituye uno de los objetivos principales de la investigación. Se adoptaron diversas estrategias con éxito moderado. Las técnicas que más éxito han tenido hasta la fecha incluyen la cristalografía por rayos X, bibliotecas combinatorias en espectrometría de masas. Ofrecemos un nuevo enfoque en el que intervienen matrices peptídicas. La tecnología de matriz peptídicas se ha utilizado durante mucho tiempo para identificar los péptidos lineales cortos que intervienen en la unión. Todos los péptidos lineales de superposición (12-15 meros) de una proteína dada se sintetizan sobre un soporte sólido como plástico y papel y se incuban con la proteína-blanco, por lo general un anticuerpo. Estos péptidos que han sido reconocidos son los denominados epítopos lineales. No se pudieron detectar epítopos discontinuos. No obstante, la tecnología de matriz peptídica en su primera fase constituyo el fundamento de métodos que identifican epítopos discontinuos de forma sistemática. Esto permite acoplar sobre una superficie matriz cualquier parte de una proteína (p. ej. un péptido de 15 aminoácidos de largo) a continuación de otra parte de una proteína (p. ej. un péptido de 15 aminoácidos de largo en cualquier orientación. Estas matrices con todas las combinaciones posibles de péptidos nos mostraron que era posible realizar una definición precisa de epítopos discontinuos (figura 2). Nos centramos ahora en los epítopos discontinuos que intervienen en la enfermedad de Graves y de Hashimoto, aunque también se aplica a otras. Las patologías de la tiroides son patologías autoinmunes contra la tiroides. Los anticuerpos se unen a epítopos discontinuos sobre el receptor de tirotropina en la glándula tiroides. La hiperactivación (Graves) o el bloqueo (Hashimoto) de la glándula tiroides conduce a problemas graves de salud. El mapeo de las regiones de unión de anticuerpo así como de la región de unión de TSH contribuye enormemente a la compresión de ambas enfermedades. Posteriormente se utilizarán imitaciones hTSH y hTSHR de estos epítopos discontinuos en todas las herramientas de diagnóstico que permiten descubrir de forma temprana las enfermedades de Graves y Hashimoto. Los estudios sobre hormona de estimulación del folículo humano (hFSH) y su receptor (hFSHR) han revelado zonas de unión discontinuas. Se probaron 40-meros biotinilados que cubren varias regiones de hFSH en un ensayo de unión péptido-matriz como el que aquí se ofrece sobre todos los 30-meros de superposición que cubren la secuencia lineal de hFSHR, uno de los 40-meros claramente unidos a una región receptora (fig. 1). Sobre la base de estos resultados, un estudio similar sobre el par hTSH/hSHR, hTSHR, un par hormona-receptor estructuralmente muy similar al par hFSH/hFSHR proporciona péptidos que se pueden utilizar como herramientas de diagnóstico para las enfermedades de Graves y/o Hashimoto. Los pacientes con enfermedad de Graves y Hashimoto desarrollan anticuerpos contra sus propios receptores de tiroides lo cual conduce a hipertiroidismo o hipotiroidismo respectivamente. Aunque la población de anticuerpos de receptor de antitirotropina es heterogénea, la mayoría de los anticuerpos de Graves se unen al término N del receptor mientras que la mayoría de anticuerpos de Hashimoto se unen al término C del receptor. En nuestro estudio, se prueban paneles de suero de Graves y Hashimoto, a) para la unión en un péptido-matriz al conjunto de 30 meros de superposición que cubren el receptor hTSH; b) en un ensayo de competición en el que la unión de TSH-péptidos de 40 meros biotinilados con el receptor hTSH entra en competencia con los sueros de Graves y Hashimoto. Así se mapean zonas de unión discontinuas. Tras el mapeo de las zonas de unión discontinuas, se diseñan y sintetizan imitaciones sintéticas. Una estrategia primaria para la síntesis de este tipo de imitaciones sintéticas es la síntesis de plantillas sobre las cuales se puede reconstruir el epítopo discontinuo. La utilización de plantillas facilita la posibilidad de añadir varias partes del epítopo discontinuo. De este modo, se perderá difícilmente información específica de unión, con una elevada flexibilidad de los constructos peptídicos. La fijación de péptidos a las estructuras de la plantilla imitarán de forma muy similar los epítopos discontinuos nativos. Recientemente se han realizado grandes progresos en este sector. Utilizando plantillas estables como estructura sobre la cual acoplar fragmentos de reconocimiento, se pueden obtener péptidos con la actividad deseada.

Otros ejemplos Ejemplos de utilización Mapeo de epítopo discontinuo sobre Factor de Necrosis Tumoral humana (hTNF) (Figs. 10-15)

El anticuerpo monoclonal mAb-210 producido contra hTNF se probó en péptidos lineales y de asa (mAb-210 se compró a R&D Systems, MAB210, clon 1825.12, a través de ITK Diagnostics Uithoorn, Países Bajos). En primer lugar se probó en pepscan en todos los 12-meros lineales de superposición que cubren hTNF. Esto dio como resultado una secuencia "minor peak around" IKSPCQRETPEG (fig. 10). A continuación se probó en pepscan matrix-scan sobre péptidos asa-asa doble 15-mero (tal como se describe en las figuras 3 y 4 y se explica en las figs. 11 a 12). Se rotularon dos regiones de asa: secuencia peptídica GQGCPSTHVLLT (cuadrado 65 a 67) y SAIKSPCQRE (cuadrados 92 a 96) (fig. 13, 14). Además, en varios cuadrados se identificaron manchas de péptido de asa correspondientes a la secuencia GQGCPSTHVLLT (manchas 65-67); SAIKSPCQRE (manchas 92-96) y KGDRLSAEINR (manchas 126-129) (fig. 14). Estas tres regiones, ilustradas en la figura 15 sobre el modelo tridimensional de hTNF están situadas en un lado de la molécula hTNF y forman una gran región de epítopo discontinuo.

Identificación de imitaciones sintéticas de anticuerpos (cuerpos de unión) (fig. 16)

A partir de seis anticuerpos diferentes se sintetizó la región HCDR3 (región determinante complementaria tres de la cadena pesada de anticuerpo) como péptidos-asa sintéticos. Como ejemplo se eligieron cuatro anticuerpos anti-lisozima y dos anticuerpos anti-coriogonadotropina diferentes 1fdl.pdb (D1.3), 1mlb.pdb (D44.1), 3hfl.pdb (HyHel-5), 3hfm.pdb (HyHel-10) todos antilisozima, y 1gfw.pdb, dos coriogonadotropinas antihumanas, una anti-alfa y una anti-beta. Los péptidos de asa sintéticos se acoplaron a las minitarjetas en la forma descrita anteriormente. Las coordenadas tridimensionales (pdb.files) se extrajeron del banco de datos proteínico (PDB) en www.rcsb.org (RCSB, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics) (Berman et al., 2000, The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235-242); Bernstein et al. 1977. El banco de datos proteínico: archivo informático para estructuras macromoleculares, J. Mol. Biol. 112:535-542).

Junto con cada uno de los seis péptidos se acoplaron otros 27 péptidos de asa diferentes a la mini tarjeta según lo descrito en la figura 3B: por consiguiente el grupo-1 era un asa de HCDR3 de 1fdl.pdb acoplado a continuación de 27 asas diferentes que cubren LCDR1, LCRD2, o LCDR3, el grupo 2 era un asa de 1mlb-pdb después de 27 asas diferentes que cubren LCDR1, LCRD2 o LCDR3, etc. etc. (región determinante complementaria LCDR de la cadena ligera del anticuerpo). Los 27 péptidos de asa diferentes representaban LCDR1, LCDR2 o LCDR3 de los mismos anticuerpos descritos anteriormente (1fdl.pdb, 1mlb.pdb, 3hfl.pdb, 3hfm.pdb o 1qfw.pdb).

El resultado se muestra en la figura 16 (6 grupos con 27 péptidos acoplados asa-asa). Los seis péptidos acoplados asa-asa con la máxima actividad de unión fueron: +LHGNYDFDGZ +SESVDSYGNSFMQZ (asa de HCDR3 de 3hfl.pdb y asa de LCDR1 1qfw.pdb, respectivamente) (ver fig. 16); +LHGNYDFDGZ + RASESVDSYGNSFMQZ (asa de HCDR3 de 3hfl.pdb y asa de LCDR1 1qfw.pdb, respectivamente); +LHGNYDFDGZ + RASESVDYGNFZ (asa de HCDR3 de 3hfl.pdb y asa de LCDR1 1qfw.pdb, respectivamente); LHGNYDFDGZ + ASESVDSYGNSFZ (asa de HCDR3 de 3hf1.pdb y asa de LCDR1 1qfw.pdb, respectivamente); +LHGNYDFDGZ + LLVYYTTTLADGZ (asa de HCDR3 de 3hfl.pdb y asa de LCDR2 1fdl.pdb, respectivamente).

El par de péptidos asa-asa, +LHGNYDFDGZ + SESVDSYGNSFMQZ (asa de HCDR3 de 3fl.pdb con asa de LCDR1 de 1qfw.pdb, respectivamente) que tiene la actividad de unión más elevada se indica mediante una flecha (fig. 16). Este par de péptidos asa-asa se deriva de un anticuerpo anti-lisozima y un anticuerpo antihumano coriogonadotropina. Los resultados de la figura 16 muestran que los pares particulares de CDR sintéticos presentan mejor unión a la lisozima que otros pares, especialmente el grupo-C. Por consiguiente, se pueden utilizar combinaciones de asa-asa de asa sintéticas que representan diferentes CDR de anticuerpo (diferente), no necesariamente derivados del anticuerpo original que en este ejemplo es un anticuerpo anti-lisozima, para identificar compuestos sintéticos iniciales que imitan anticuerpos.

Construcción de imitación de doble asa de un epítopo discontinuo (fig 17)

Se acoplaron dos péptidos que constituyen dos partes separadas de un epítopo discontinuo a la superficie de una minitarjeta, en la forma descrita anteriormente en la leyenda de la figura 12 (ver fig. 3A y 4 (ejemplo-4). Se acopló un cis (mmt) solo o en combinación con un cis (trt) (en una proporción de 1:1) y/o val (mmt) (el cis y val en una proporción de 1:1, 1:3, 1:9, etc.). De esta forma se acopló un péptido (cuadrados A y C) o se acoplaron dos péptidos con valinas crecientes entre las cisteínas (cuadrados B y D) (ver fig. 4B (ejemplo-4), fig. 17). Estas cuatro configuraciones se incubaron con dos anticuerpos diferentes.

El anticuerpo 1 reconoció cuando los péptidos de asa individuales se acoplaron como asas individuales, únicamente péptido-2 de asa. El anticuerpo 2 reconoció cuando los anticuerpos de asa individuales se acoplaron como asas individuales, solamente péptido-1 de asa. Cuando los dos péptidos de asa se combinan el anticuerpo 1 mostró una actividad de unión más elevada con el péptido 1 que en el acoplamiento primero. Cuando los dos péptidos de asa se combinaron el anticuerpo 2 no mostró ninguna actividad de unión más elevada.

Los resultados mostrados en la figura 17 indican que el par particular de asas sintéticas de un epítopo discontinuo muestra una unión mejorada con un anticuerpo particular. Por consiguiente, se pueden utilizar combinaciones de asas sintéticas que forman parte de un epítopo discontinuo, para identificar compuestos sintéticos iniciales que imitan epítopos discontinuos.

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Bibliografía citada en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante, es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente europea. Aunque se ha puesto mucho cuidado en recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 8403564 A [0009]

\bullet WO 9309872 A [0010]

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Claims (8)

1. Método para producir una biblioteca de péptidos para la identificación o detección de una zona de unión, que incluye proveer dicha biblioteca de péptidos de una pluralidad de zonas de unión de prueba, y comprende además la generación de al menos una de estas zonas de unión, situando en una fase sólida por lo menos un primer segmento peptídico muy cerca de un segundo segmento peptídico, reflejando el término "muy cerca" la posibilidad de que una supuesta molécula de unión pueda unirse por lo menos con dos de los segmentos situados cerca o partes de los mismos.

2. Método según la reivindicación 1, donde dicha fase sólida comprende una superficie matriz.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde al menos el citado primer segmento se une por medio de un enlace tioéter a dicha fase sólida.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde cada uno de los, por lo menos uno, primero y/o segundo segmento o parte de los mismos representa una parte potencial de una zona de unión discontinua.

5. Método para examinar una zona de unión capaz de interactuar con una molécula de unión, que comprende el examen de una biblioteca de péptidos obtenida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con por lo menos una molécula de unión potencial, y que detecta la unión entre una zona de unión de prueba de dicha biblioteca y la citada molécula de unión potencial.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la zona de unión es una zona de unión discontinua.

7. Utilización de una biblioteca obtenida por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un soporte sólido que comprende una biblioteca obtenida por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un método según la reivindicación 5 ó 6, para identificar u obtener una molécula sintética que comprende una molécula sintética que comprende una zona de unión.

8. Utilización de una biblioteca obtenida con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un soporte sólido que comprende una biblioteca obtenida mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un método según la reivindicación 5 ó 6 para la identificación u obtención de una molécula de unión capaz de unirse a una zona de unión.