CN101631801B

CN101631801B - 受体（sstr2）-选择性生长抑素拮抗剂

Info

Publication number: CN101631801B
Application number: CN2007800386522A
Authority: CN
Inventors: J·E·F·瑞维尔; J·尔学艺; J·C·儒贝; H·R·马克夫
Original assignee: Universitaet Bern; Universitaetsspital Basel USB; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Universitaet Bern; Universitaetsspital Basel USB; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2006-10-16
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2027-10-15
Also published as: BRPI0717135B8; CN103288919B; JP2010506943A; SI2076535T1; PL2383289T3; EP2383289A1; BRPI0717135A2; EP2433963B1; JP5295967B2; HK1132515A1; AU2007311137A1; ES2526292T3; EP2076535B1; PL2433963T3; ES2410207T3; EP2433963A1; CN103288919A; US20080260638A1; CA2666642A1; WO2008048942A2

Abstract

SRIF肽拮抗剂相对于其他克隆SRIF受体对SSTR2具有选择性，并以高亲和力结合克隆的人类受体SSTR2，但不活化该受体，具有许多有用功能。因为它们不以显著亲和力结合SSTR1、SSTR3、SSTR4或SSTR5，所以它们的施用避免了潜在不希望的副作用。因为它们阻断受体功能，所以它们可以在治疗上用于阻断某些SSTR2介导的生理效应。通过在这些SSTR2-选择性SRIF拮抗剂掺入放射性碘或类似物，提供了用于药物筛选方法的标记化合物。可选地，为了用于治疗，可以在其N末端偶联、络合或螯合高放射性部分。

Description

受体(SSTR2)-选择性生长抑素拮抗剂

本申请要求2006年10月16日提交的序号为60/829，637的美国临时专利申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

本发明在政府支持下进行，国立卫生研究所授予的资助号为DK-59953。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及与生长抑素相关的肽，以及使用所述肽药物治疗哺乳动物的方法。具体说，本发明涉及缩短的受体-选择性生长抑素肽拮抗剂，以及赋予其受体选择性的所述肽中氨基酸取代和/或添加的加入，本发明涉及含有所述肽的药物组合物，本发明涉及与放射性核素络合或轭合的所述肽，本发明涉及使用所述肽、特别是与螯合剂偶联或以其他方式标记的肽诊断性和治疗性治疗肿瘤性和非肿瘤性哺乳动物疾病的方法，本发明还涉及使用所述肽筛选更有效药物的方法。

发明背景

环状十四肽生长抑素-14(SRIF)最初从下丘脑分离并鉴定为生长激素(GH)从垂体前叶释放的生理抑制剂。它由Guillemin等鉴定并描述于美国专利第3,904,594号。该十四肽在3-和14-位的两个半胱氨酰氨基酸残基的巯基之间具有桥连或环化键。SRIF影响多个细胞过程，还已知抑制某些肿瘤生长。类似物[D-Trp⁸]-SRIF具有氨基酸序列：(环3-14)H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH，公开于美国专利第4,372,884号并据称具有比SRIF大很多倍的抑制GH释放的潜力。

SRIF通过与膜结合的结构上类似的受体家族相互作用而诱发其生物效应。已经克隆了5种SRIF受体并称为SSTR 1-5。全部5种受体以高亲和力结合SRIF和SRIF-28。SSTR2和SSTR5的选择性拮抗剂已经被确认并用于揭示这些受体的不同功能。据信，这两种受体是周缘组织中的主要亚型。据信，SSTR2介导生长激素、高血糖素和胃酸分泌的抑制。美国专利第5,846,934号描述了据称对SSTR2具有一定特异性的类似物。奥曲肽是一种激动剂，显示对SSTR2的一定特异性(参见Yang等，1998，PNAS USA 95：10836)。相反，SSTR5似乎主要参与控制胰岛素和淀粉酶的释放。国际公布第WO 97/11962号描述了据称对SSTR5具有一定特异性的类似物。SSTR3介导胃平滑肌收缩的抑制。美国专利第6,579,967号公开了对SSTR3特异性的生长抑素类似物，其公开内容通过引用并入本文。SSTR4发现于脑下垂体、肺、胃肠道、肾和实质上排除其他SRIF受体的某些肿瘤中；据信，它在被SRIF结合后即被活化。美国公布的专利申请第2002/0137676号公开了使用生长抑素受体选择性配体治疗内皮细胞的方法，所述配体对SSTR1或SSTR4具有特异性。美国专利第5,750,499和7,019,109号公开了对SSTR1有选择性的生长抑素肽类似物，其公开内容通过引用并入本文。公布的美国专利申请第2005/0245438号公开了对SSTR4特异性的受体-选择性生长抑素肽类似物。所有这些发现说明，不同的受体亚型介导SRIF在体内不同的功能。生长抑素受体以病理状态、特别是胃肠道的神经内分泌肿瘤表达。大多数起源于生长抑素靶组织的人类肿瘤保留了它们的生长抑素受体。其首先在生长激素生成腺瘤和TSH生成腺瘤中发现；约一半的非分泌型腺瘤展示生长抑素受体。90％的类癌瘤和大多数胰岛细胞癌(包括它们的转移灶)通常具有高密度的生长抑素受体。然而，仅10％的结肠直肠癌和没有外分泌型胰腺癌含有生长抑素受体。肿瘤中的生长抑素受体可以使用体外结合方法或使用体内成像技术鉴定；后者允许在患者中精确定位肿瘤及其转移灶。因为胃肠胰腺肿瘤中的生长抑素受体是功能性的，所以它们的鉴定可以用来评估类似物抑制患者过量激素释放的治疗效力。

与SSTR2强力结合、同时显示与其他4种受体仅最低结合倾向的生长抑素肽拮抗剂将值得拥有。因此，一直在寻找对SSTR2具有高度选择性但不内化入细胞的生长抑素肽拮抗剂。

发明内容

发明概述

目前已经发现了有效产生相对于其他克隆的SRIF受体对SSTR2有选择性的SRIF肽类似物的某些修饰。已经发现一类对SSTR2高选择性的生长抑素肽类似物，其是生长抑素的拮抗剂，并且尽管不内化于具有SSTR2受体的细胞，但令人惊讶地以比可比受体-选择性生长抑素肽激动剂大的量被摄取。得到的肽选择性结合至克隆的SSTR2而不活化受体，这些肽类似物被碘化或以其他方式放射标记时将保留其需要的生物性质。因此，这些新肽可用于测定受体SSTR2的组织定位和细胞表达，以及用于调控某些药理功能而无迄今施用SRIF所特有的某些伴随的副作用。这些SRIF肽拮抗剂被放射标记时，可以用于闪烁扫描法以使用SPECT或PET体外或体内定位(即局部化)表达这些受体的肿瘤；或者可使用该领域公知的其他标记，例如荧光标记。当它们包括适合的螯合的该领域已知的放射性核素时，这些类似物可以用作适合治疗此类肿瘤的放射性核素疗法的放射性药物。

本发明的SRIF肽拮抗剂抑制²⁵I-[Tyr¹¹]SRIF和¹²⁵I-[Leu⁸，D-Trp²²，Tyr²⁵]SRIF-28与克隆的人类受体SSTR2的结合，但是它们不强力结合SSTR1、SSTR3、SSTR4或SSTR5。因此，未标记的拮抗剂可以被施用，以从治疗上阻断该受体发挥功能。例如已经通过螯合剂(例如DOTA或DTPA)与^99mTc、¹¹¹In、⁶⁸Ga或⁹⁰Y偶联的(或者为了连接用于诊断或治疗的部分目的而在N末端连接另一络合剂/轭合剂的)这些SRIF拮抗剂不显著结合SSTR1、3、4或5，但有效且可饱和地结合至SSTR2。

优选的SRIF拮抗剂不仅选择性结合SSTR2，而且它们以高亲和力与之结合。选择性结合是指它们表现出的与SSTR2的K_D或IC₅₀是所有4种其他受体的K_D或IC₅₀的约1％或更低。优选的类似物对SSTR2的选择性是任何其他SRIF受体的至少约200倍，更优选至少约500倍。这些SRIF类似物还可容易标记，因此有效用于药物筛选、成像、诊断和放射性核素疗法。例如，带有可检测标记的这些类似物可用于在体内定位所述受体并诊断肿瘤、特别是神经内分泌肿瘤的定位。作为放射性核素治疗剂，它们被认为特别用于抗表达SSTR2受体的肿瘤；而且，它们能够无副作用地实现该用途，即，不会由于与多种SRIF受体相互作用而破坏相邻组织的实质部分。

在一个具体方面本发明提供选择性结合SRIF受体SSTR2而不引发内化入细胞的环状生长抑素(SRIF)肽拮抗剂，所述肽包括氨基酸序列(环3-14)Xaa₁-Xaa₂-D-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅，其中Xaa₁是des-Xaa；Xaa₂是Trp(A)、Phe(B)、Nal或Tyr，其中A是H、Cl、F、Br、Me、NO₂、OMe或N-甲酰基且B是H、卤素、CH₃、NO₂或OCH₃；D-Xaa₃是D-Cys、D-Pen、D-HCys或具有SH侧链的另一种D-异构体α-氨基酸Xaa₄、Xaa₅和Xaa₆是des-Xaa；Xaa₇是APh(Q₁)、Tyr(X)、Ala(噻吩基)或Trp(A)，其中Q₁是Cbm、OH-Cbm、CH₃-Cbm、OCH₃-Cbm、OEt-Cbm、Cbm-Et(OEt)₂或Hor，且X是H或卤素；Xaa₈是D-Trp(A)、Trp(A)、Tyr、D-Tyr、Phe(B)、D-Phe(B)、L或D-BzlHis、L或D-(DNP)His、L或D-Aph(Cbm)；Xaa₉是Lys、N^αMeLys、hLys、N^αMehLys、Orn或N^αMeOrn；Xaa₁₀是Thr、Ser或Val；Xaa₁₁、Xaa₁₂和Xaa₁₃是des-Xaa；Xaa₁₄是Cys、Pen、hCys或具有SH侧链的另一种L-异构体α-氨基酸；并且Xaa₁₅是2Nal、D-2Nal、Aph(Q₂)、D-Aph(Q₂)、(R₁)Cha、(R₁)D-Cha、(R₁)Leu、(R₁)D-Leu、Tyr、D-Tyr、Trp、D-Trp或de s-Xaa；其中R₁是H或C^αMe，且Q₂是Cbm、OH-Cbm、CH₃-Cbm、OCH₃-Cbm或OEt-Cbm。如本领域已知的，含有螯合剂的部分可以在N末端偶联。可选地，含有螯合剂的部分可以在肽的N末端络合(例如生物素-抗生物素蛋白系统)至其补体。

在更具体方面本发明提供选择性结合SRIF受体SSTR2的环状生长抑素(SRIF)类似肽，该肽包括氨基酸序列环(3-14)Xaa₁-Xaa₂-D-Cys-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Cys-Xaa₁₅-NH，其中Xaa₁是des-Xaa；Xaa₂是氯代或硝基Phe；Xaa₄、Xaa₅和Xaa₆是des-Xaa；Xaa₇是Aph(Hor)、Tyr或ITyr；Xaa₈是D-Aph(Cbm)或D-Trp；Xaa₉是Lys、Orn、hLys、N^αMeLys或N^αMeOrm；Xaa₁₀是Thr；Xaa₁₁、Xaa₁₂和Xaa₁₃是des-Xaa；且Xaa₁₅是2Nal或D-Tyr。

在进一步具体方面，本发明提供了在外部对表达SSTR2的人体组织成像的方法，该方法包括：(i)以足以外部成像的量为人类施用包含SRIF肽拮抗剂的组合物，所述SRIF肽拮抗剂相对于其他克隆的SRIF受体对SSTR2具有选择性并以高亲和力结合至克隆的人受体SSTR2但不活化该受体，所述SRIF肽拮抗剂带有可检测标记；和(ii)对人类进行外部成像。

在另一具体方面，本发明提供了照射表达SSTR2的人体肿瘤组织的方法，该方法包括：(i)以足以照射肿瘤组织的量为人类施用包含SRIF肽拮抗剂的组合物，所述SRIF肽拮抗剂相对于其他克隆的SRIF受体对SSTR2具有选择性并以高亲和力结合至克隆的人受体SSTR2但不活化该受体，所述SRIF肽拮抗剂带有可检测标记；和(ii)使所述SRIF肽拮抗剂结合至肿瘤组织。

在另一具体方面，本发明提供在人体内检测组织中具有SSTR2的肿瘤及其转移灶的方法，所述组织在健康状态或慢性炎症的非肿瘤情况下不含有实质量的SSTR2，所述方法包括：(i)以足以外部成像的量为所述人施用包含权利要求1的肽的组合物，所述肽用(a)经适合螯合剂连接的放射性金属同位素或(b)药物金属原子标记，或者用放射性卤素同位素标记，和此后(ii)通过放射性扫描或通过磁共振成像对所述人进行外部成像，以确定其体内相对于本底放射性的靶向部位，以实现所述肿瘤在体内的半定量检测和定位。

本发明进一步提供使用药效团模型筛选对SSTR2高度选择性的配体的方法，所述药效团模型基于被确定是选择性结合所需要的配体特征模式。所述方法可以包括：使用SSTR2受体、本发明配体和候选拮抗剂进行竞争性结合测定，其中所述配体具有适合的可检测标记；测定所述候选拮抗剂取代标记配体的能力；和测试所述候选拮抗剂拮抗SRIF相关活性的能力。

具体实施方式

优选实施方案详述

标准3字母缩写标示α-氨基酸残基，并且其中氨基酸残基具有异构形式，除非另外明确指明，其是所标示氨基酸的L形式，例如Ser＝L-丝氨酸。L或D指特定α-氨基酸的D和L异构体。当本文提及肽位置时，是指天然14-残基生长抑素(SRIF)肽的相应位置。

提供对受体SSTR2具有选择性亲和力的SRIF肽拮抗剂；它们优选还具有对SSTR2的高亲和力，即等于约10纳摩尔或更小的K_D。这些肽包括SRIF的缩短的环状类似物，其中环部分被缩短至仅6个残基，并且其中N末端存在一个残基，并且优选还在C末端加一个残基。换言之，1-，4-，5-，6-，H-，12-和13-位残基从14-残基天然SRIF中缺失，产生七肽，并且优选还在C末端增加残基(即残基15)，产生八肽。

表现出对SSTR2预期特异性的代表性肽拮抗剂的例子由下述氨基酸序列提供，其基于与天然哺乳动物SRIF的14-残基序列一致的编号系统，其中位置1、4-6和11-13的残基优选被去除：(环3-14)Xaa₁-Xaa₂-D-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Xaa₁₄-Xaa₁₅，其中Xaa₁是des-Xaa；Xaa₂是Trp(A)、Phe(B)、Nal或Tyr，其中A是H、Cl、F、Br、Me、NO₂、OMe或N-甲酰基且B是H、卤素、CH₃、NO₂或OCH₃；D-Xaa₃是D-Cys、D-Pen、D-HCys或具有SH侧链的另一种D-异构体α-氨基酸；Xaa₄、Xaa₅和Xaa₆是des-Xaa；Xaa₇是APh(Q₁)、Tyr(X)、Ala(噻吩基)或Trp(A)，其中Q₁是Cbm、OH-Cbm、CH₃-Cbm、OCH₃-Cbm、OEt-Cbm、Cbm-Et(OEt)₂或Hor，且X是H或卤素；Xaa₈是D-Trp(A)、Trp(A)、Tyr、D-Tyr、Phe(B)、D-Phe(B)、L或D-BzlHis、L或D-(DNP)His、L或D-Aph(Cbm)；Xaa₉是Lys、N^αMeLys、hLys、N^αMehLys、Orn或N^αMeOrn；Xaa₁₀是Thr、Ser或Val；Xaa₁₁、Xaa₁₂和Xaa₁₃是des-Xaa；Xaa₁₄是Cys、Pen、hCys或具有SH侧链的另一种L-异构体α-氨基酸；并且Xaa₁₅是2Nal、D-2Nal、Aph(Q₂)、D-Aph(Q₂)、(R₁)Cha、(R₁)D-Cha、(R₁)Leu、(R₁)D-Leu、Tyr、D-Tyr、Trp、D-Trp或des-Xaa；其中R₁是H或C^αMe，且Q₂是Cbm、OH-Cbm、CH₃-Cbm、OCH₃-Cbm或OEt-Cbm。2位的Tyr可以是放射性碘化的，或者络合剂、轭合剂或螯合剂可以直接或经连接体连接至这些肽类似物的任何一个的N末端残基的α-氨基，其能够将放射性核素连接其上。例如，大环螯合剂(例如DOTA)可以通过使其直接结合至Xaa₂或使用连接体加在N末端，所述连接体例如GABA(γ氨基丁酸，参见例如美国专利第6,022,523号)或βAla。

SRIF类似物的一个优选的亚类包括氨基酸序列：(环3-14)Xaa₁-Xaa₂-D-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Lys-Thr-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Xaa₁₃-Cys，其中Xaa₂是取代的Phe；D-Xaa₃是D-Cys；Xaa₇是Aph(Q₁)、Tyr或ITyr；且Xaa₈是D-Trp或D-Aph(Cbm)。应理解，其他Xaa基团在未被指定时则如上文所定义。

一般为本申请目的，除具体实施例外的说明书中提及Trp和D-Trp应理解为包括未取代的残基以及其中在Trp的5-位或6-位进行单个氢取代的残基，这样的取代基选自氯、氟、溴、甲基、硝基和甲氧基，且铝、氟和溴是优选的，或者甲酰基取代吲哚N的氢。Nal指在β-碳原子上被萘基取代的丙氨酸的异构体，与萘的连接优选在环的2-位或者任选在1-位。Aph指氨基苯基丙氨酸，其中氨基优选连接至苯环的4-位，但在2-或3-位的连接一般是等同的。Aph(Cbm)指4-脲基-苯丙氨酸。Aph(OH-Cbm)指4-(3-羟基)-脲基-苯丙氨酸。Aph(CH₃-Cbm)指4-(3-甲基)-脲基-苯丙氨酸。Aph(OCH₃-Cbm)指4-(3-甲氧基)-脲基-苯丙氨酸。Aph[(EtO)2Et-Cbm]指4-{3-[2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙基]}-脲基-苯丙氨酸。ITyr指碘化的L-酪氨酸，例如3-碘-Tyr。Cpa指氯代-Phe且优选4ClPhe。Aph(Hor)指4-[(2，6-二氧-六氢-嘧啶-4-羰基)-氨基]-苯丙氨酸。SRIF指14-残基环肽生长抑素。Cha指环己基丙氨酸，且Pen指青霉胺(β-巯基缬氨酸)。hLys或hCys指侧链具有另外一个CH₂基团的α-氨基酸。

C末端通常被酰胺化，尽管是等同的，例如可以使用Gly-OH。N末端可以各种方式修饰而对结合亲和力无显著负面影响，认为这些环状肽中所有这些修饰被包括为本整体发明的肽的一部分。例如，可以进行多种添加，优选以络合剂或轭合剂形式(Z)添加至N末端氨基酸，然后Z可以用于将需要的部分结合至肽或提供标记。一般而言，这样的部分Z可以选自基于DOTA和DTPA的螯合剂、基于NOTA的螯合剂、羰基、2-肼基尼克酰胺(HYNIC)、N₄-螯合剂、去铁胺和N_xS_y-螯合剂，全部任选与放射性同位素、用于卤代的酪氨酸(Tyr)、荧光染料和生物素络合。Cpa还可用作氚化前体。例如，可以连接螯合剂，例如DTPA、DOTA、HYNIC和P₂S₂-COOH；优选螯合剂可以包括p-NH₂-Bz-DOTA(2-p-氨基苄基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)和DOTA-p-NH₂-苯胺[1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(对氨基苯胺)]。可选地，螯合剂可以按需要经适合连接体(L)共价连接至N末端；适合的连接体L包括酪氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、聚乙二醇、脂肪酸及其衍生物、β-丙氨酸、5-氨基戊酸、肌氨酸和gluceronic acid。当Tyr出现在N末端时，其可以被放射性碘化或者以其他方式标记。具有不超过约20个氨基酸的酰基也可以存在于N末端，因为N末端残基也可以按需要用大部分酰化而不损失特异性。

本发明类似肽结合SSTR2的选择性已经通过测试它们与五种不同克隆的人SRIF受体的相互作用得到证明，下文将非常详细地描述。一般而言，表达受体的重组细胞经洗涤和匀化以制备本领域已知的适合缓冲液中的粗蛋白匀浆。在典型分析中，细胞匀浆中一定量的蛋白被放入小体积的适当pH下的适当分析缓冲液。候选物质(例如可能的SRIF激动剂和拮抗剂)以合宜浓度被加至混合物，监测候选物质与受体多肽的相互作用。本发明肽基本上仅强力结合至SSTR2，并且它们的结合表现出高亲和力。

受体结合分析针对克隆的SRIF受体进行，竞争性分析用于产生指示从50％结合位点替换饱和浓度的测量靶配体所必须的竞争性配体的浓度的IC₅₀值。

根据本发明一个方面，手术期间检测健康情况下不含有实质量的SSTR2的人体组织中恶性肿瘤的方法，包括：(i)以足以被γ检测探针检测的量为这样的人施用包含SSTR2-选择性肽的组合物，所述肽例如用¹¹¹Tc、¹⁶¹Tb、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹²³I或¹²⁵I放射性标记，和(ii)在使活性物质在所述肿瘤中被结合并摄取后以及在血液清除放射性后，使这样的人接受在机体相关区域使用γ检测探针的放射检测技术。

本发明SRIF拮抗剂对SSTR2是高度选择性的，并且它们以比对SSTR2仅部分特异性的早期SRIF肽激动剂更大量被摄取。更重要的是，SRIF拮抗剂被认为可用于使用放射疗法抵抗表达SSTR2的癌症，其中放射疗法的成功直接取决于肿瘤摄取放射的量；因此，它们预期比已知激动剂更有效用于肿瘤放射疗法。当然，它们也被认为特别用于闪烁扫描法以测定表达SSTR2的细胞和组织在全身的分泌，通过放射性扫描或通过磁共振的外部成像的使用允许在体内半定量检测。它们进一步用于选择性阻断由SSTR2介导的某些药理效应，在过去20年已经确定了SRIF的许多效应。

更具体说，这些放射性拮抗剂被认为特别用于治疗性治疗人体组织中的恶性肿瘤，所述组织在健康情况下不含油实质量的SSTR2。这样的SSTR2-选择性肽拮抗剂以包括有效用于闪烁扫描法或抗击或控制肿瘤的量的组合物施用，并且可以用选自下述组的同位素标记：¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹¹¹In、¹¹³mIn、⁷¹As、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁹mTc、¹⁶⁹Er、¹²¹Sn、¹²⁷Te、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、⁶⁶Ga₃、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²Ga、¹²⁷Te、¹⁹⁵Pt、²¹¹At、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、¹⁶¹Tb、¹⁰⁹Pd、¹⁶⁵Dy、¹⁴⁹Pm、¹⁵¹Pm、¹⁵³Sm、¹⁵⁷Gd、¹⁵⁹Gd、¹⁶⁶Ho、¹⁷²Tm、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁰⁵Rh、¹¹¹Ag、¹²⁴I和¹³¹I。

本发明的标记SRIF类似物还被认为用于药物筛选分析，以筛选与SSTR2高亲和力结合并可能是高选择性拮抗剂的新的有效的肽和非肽药剂。使用对受体SSTR2选择性的本发明配体，可以获得重组生成的受体的基线活性。然后使用SSTR2、标记配体和候选物进行竞争性结合以确定其相对结合亲和力。可选地，受体功能抑制剂或修饰剂(即，拮抗剂)的有前景的候选物可以直接加入测试混合物以测试这种候选物对受体的作用。通过比较在候选物质存在或不存在下的受体活性程度，则可以获得有关候选物质对受体正常功能的作用信息，并因此确定其与已知SSTR2选择性类似物相比较作为激动剂或拮抗剂的功能。下述实施例中描述的环状SRIF肽是拮抗剂，并且它们用于介导SSTR2的正常功能。

本发明的肽可通过经典液相合成方法合成，但是酰胺化的肽优选通过固相技术合成，如在本领域公知的甲基二苯甲胺(MBHA)树脂或BHA树脂上。具有游离羧基C末端的肽优选按照美国专利第7,019,109号的教导合成。具有酰胺化的C末端的肽可以按照美国专利第5,874,227号合成。固相合成以在C末端开始的链中逐步添加氨基酸的方式进行，方式提出于那些美国专利的任何一个中，其公开内容通过引用并入本文。本领域公知的侧链保护基优选包括为具有特定反应性侧链的任何氨基酸的部分，并任选可用于其他情况，例如当这种氨基酸偶联至构建于树脂上的链上时的Trp。这样的合成提供完全保护的中间体肽树脂。一般而言，在氧化产生Cys侧链之间二硫键之前分离保护剂并使肽从树脂支持体裂解。

本发明的SRIF类似物一般在小于100毫克/千克体重的水平上是有效的。对于延长作用，可能需要使用约0.1至约2.5毫克/千克体重的剂量水平。这些类似物可溶于水并因此可以相对浓缩的施用溶液制备。

下述实施例示例说明实施本发明各个特征的多种SRIF肽拮抗剂的提供。在每种肽中，位置3和14的半胱氨酸通过环化二硫键结合。

实施例1

合成生长抑素类似物DOTA-des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，Tyr⁷，D-4Aph(Cbm)⁸]-SRIF-2Nal-NH₂，具有结构：

使用采用BOC策略的固相方法以逐步方式在MBHA树脂上合成八肽，大体上如’277专利实施例II所述。Boc-D-4Aph(Cbm)-OH如Jiang早期公布所述预制备并在位置8偶联。

通过HF从树脂裂解肽并同时去除侧链保护剂(除了来自Lys的Fmoc)后，通过添加10％碘甲醇溶液直至得到的溶液保持橙色，然后搅拌40分钟并用抗坏血酸淬灭，肽在75％乙酸中被氧化产生二硫键。粗肽通过制备型RP-HPLC纯化，使用从基线％B(洗脱剂A＝0.1％TFA，洗脱剂B＝60％CH₃CN，40％A)以100ml/min的流速1％B/1min增量的线性梯度。然后通过向干N，N-二甲基酰胺(DMF，3.5ml)中的纯化肽(32mg-20μM)添加在DMF(1ml)中的DOTA-NHS.3TFA.HPF₆(Macrocyclics，Dallas，TX)(198mg，-20μM)和N，N’-二异丙基乙胺(DIPEA)(36μl，-22μM)，在N末端偶联作为螯合剂的DOTA。混合物在室温搅拌过夜。反应过程之后是分析HPLC，MS分析显示，已经获得了想要的产物，纯DOTA-des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，Tyr⁷，D-4Aph(Cbm)⁸，Lys(Fmoc)⁹]-SRIF-2Nal-NH₂。反应结束后，通过添加20％哌啶的DMF溶液4ml并等待30分钟而实现从Lys⁹侧链去除Fmoc保护基。DOTA-des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，Tyr⁷，D-4Aph(Cbm)⁸]-SRIF-2Nal-NH₂，使用上述相同条件通过制备型RP-HPLC去盐。最终环状DOTA-肽-轭合物的纯度通过分析型CZE测定。其是94％纯的。

MS分析显示，1583.72Da的[M+H]⁺质量与1583.62Da计算质量很相当。该肽在下文称为1号肽。

实施例2

重复实施例1中描述的初始合成，有两处改变；4Aph(Cbm)和D-Trp用于7-和8-位以提供八肽-树脂；des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，4Aph(Cbm)⁷，D-Trp⁸，Lys(Fmoc)⁹]-SRIF-2Nal-MBHA树脂。

通过HF从树脂裂解肽为酰胺并同时去除侧链保护剂(除了来自Lys的Fmoc)后，通过添加10％碘甲醇溶液直至得到的溶液保持橙色，然后搅拌40分钟并用抗坏血酸淬灭，肽在75％乙酸中被氧化产生二硫键。粗肽通过制备型RP-HPLC纯化，使用从基线％B(洗脱剂A＝0.1％TFA，洗脱剂B＝60％CH₃CN，40％A)以100ml/min的流速1％B/1min增量的线性梯度。然后通过向干N，N-二甲基酰胺(DMF，3.5ml)中的纯化肽(34mg-24μM)添加在DMF(150μl)中的DOTA-NHS.3TFA.HPF₆(Macrocyclics，Dallas，TX)(24mg，24.2μM)和N，N’-二异丙基乙胺(DIPEA)(40μl，24μM)，在N末端偶联作为螯合剂的DOTA。混合物在室温搅拌过夜。反应过程之后进行分析HPLC，反应结束后，向反应混合物添加1ml哌啶以从Lys⁹侧链去除Fmoc保护基，持续30分钟，产生DOTA-des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，4Aph(Cbm)⁷，D-Trp⁸]-SRIF-2Nal-NH₂，其具有下式：

该肽使用上述相同条件通过制备型RP-HPLC去盐。最终环状DOTA-肽-轭合物的纯度通过分析型CZE测定为约98％纯。MS分析显示1606.50Da的[M+H]⁺质量，与计算值1606.64Da很相当。其被称为2号肽。

实施例3

重复实施例1中提出的合成，省去C末端的2Nal并用4Aph(Hor)替代Tyr⁷。按照G.Jiang，J.Stalewski等，(2001).″GnRHantagonist：A new generation of long acting analoguesincorporating urea functions at positions 5and 6″，J.Med. Chem.44(3)：453-467早先公布中描述的预制备Boc-4Aph(Hor)-OH。按照实施例1进行肽的裂解、去保护、环化和纯化。纯化的环状肽具有下式：

根据CZE其纯度为约98％。其被称为3号肽。MS分析显示1525.68Da的[M+H]⁺质量，与计算值1525.58Da很相当。

实施例4

重复实施例1中提出的合成，具有一个改变，使用pNO₂-Phe替代N末端的pCl-Phe。按照实施例1进行肽的裂解、去保护、环化和纯化。纯化的环状肽具有下式：

根据CZE其纯度为约98％。其被称为4号肽。MS分析显示1594.17Da的[M+H]⁺质量，与计算值1594.65Da很相当。

实施例5

重复实施例1中描述的初始合成，具有一个改变；使用Aph(Hor)替代7位的Tyr以提供八肽-树脂：des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，4Aph(Hor)⁷，D-Aph(Cbm)⁸，Lys(Fmoc)⁹]-SRIF-2Nal-MBHA树脂。然后按照实施例2进行反应产生DOTA-des-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[Cpa²，D-Cys³，4Aph(Hor)⁷，D-Aph(Cbm)⁸]-SRIF-2Nal-NH₂，，其具有下式：

最终环状DOTA-肽-轭合物的纯度通过分析型CZE测定为约98％纯。其被称为5号肽。MS分析显示1722.56Da的[M+H]⁺质量，与计算值1722.65Da很相当。

实施例6

重复实施例5中提出的合成，用D-Tyr替代C末端的2Nal。按照实施例1进行肽的裂解、去保护、环化和纯化。纯化的环状肽具有下式：

根据CZE其纯度为约98％。其被称为6号肽。MS分析显示1688.83Da的[M+H]⁺质量，与计算值1688.64Da很相当。

实施例7

重复实施例4中提出的合成，用D-Tyr替代C末端的2Nal。按照实施例1进行肽的裂解、去保护、环化和纯化。纯化的环状肽具有下式：

根据CZE其纯度为约98％。其被称为7号肽。MS分析显示1560.63Da的[M+H]⁺质量，与计算值1560.83Da很相当。

实施例8

重复实施例7中描述的合成，具有两个改变；在7位使用Ityr并在8位使用D-Trp以提供八肽-树脂：de s-AA^{1，4，5，6，11，12，13}[pNO₂-Phe²，D-Cys³，ITyr⁷，D-Trp⁸，Lys(Fmoc)⁹]-SRIF-D-Tyr-MBHA树脂。

从树脂裂解肽为酰胺并进行大体上如实施例2所述反应之后，获得具有下式的肽：

最终环状DOTA-肽-轭合物的纯度通过分析型CZE测定为约98％纯。其被称为8号肽。MS分析显示1667.74Da的[M+H]⁺质量，与计算值1667.52Da很相当。

体外生物分析：体外测试了各种生物抑素类似物的效应，它们结合分离克隆的、CHO-K1细胞和CCL39细胞上表达的受体的能力。在37℃下含有5％CO₂的增湿空气中，CHO-K1细胞培养于Ham’s F-12培养基，CCL39细胞培养于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基/Ham’s F-12(1∶1)混合物。

编码多种生长抑素受体亚型的基因的分子克隆允许这些受体在哺乳动物细胞中的个体表达并鉴定它们各自的药理学特征。被称为SSTR1至SSTR5的五种这样的受体亚型已经被克隆并被报道和描述于Raynor等，Molecular Pharmacology，43，838-844(1993)和Raynor等，Molecular Pharmacology，44，385-392(1993)。这些参考文献描述了可以用于确定特定SRIF类似物是否特异性结合5种受体型的一种或多种的结合分析。因为目前已经大体上鉴定了这些受体型的药理学特征，所述结合研究的结果信息以及这些受体在体内的独特分布模式信息说明，每种受体亚型可以介导不同但交错的SRIF药理效应。因此，特异性结合受体SSTR2的化合物例如可以用于调节特定的SRIF生理功能，而不可能具有其他SRIF受体介导的另一种SRIF生理功能所产生的不想要的效应。

细胞用冰冷0.05M Tris-HCl(pH 7.4)洗涤两次并刮入冰冷0.05M Tris-HCl(pH 7.4)，离心收集，使用旋转器/定子/系统在相同缓冲液中匀化。4℃下120g离心5分钟后，收集上清液并在4℃下48,000g再次离心30分钟。得到的沉淀重悬于冰冷Tris缓冲液，转入微量离心管，在4℃下20,000g离心15分钟。抽掉上清液后，膜沉淀-80℃保存。

对固定在显微镜载玻片上的所述膜沉淀的20μm厚冷冻切片进行受体放射自显影，然后-20℃保存。对于每种测试化合物，使用强亲和力结合所有五种受体的通用生长抑素配体放射性配体¹²⁵I-[Leu⁸，D-Trp²²，Tyr²⁵]-生长抑素28进行完整的替代实验。使用范围0.1-1000nM的渐增的未标记肽浓度。使用相同的渐增浓度平行运行未标记的生长抑素-28，作为对照。使用本领域已知的计算机辅助图像处理系统量化数据后计算IC₅₀值。浓度为100nM时，1号肽对SRIF-28放射性配体与SSTR1、SSTR3、SSTR4和SSTR5结合的影响最小。相比之下，它特异性结合SSTR2，替代放射性配体与人SSTR2的结合，IC₅₀值约1.8nM。

某些SRIF类似物抑制¹²⁵I-[Leu⁸，D-Trp²²，Tyr²⁴]SRIF-28与各种克隆人SRIF受体结合的潜力示于下表，其中IC₅₀值以纳摩尔浓度给出。括号中的数字表示特定结合试验进行的次数。

表

而且，所有被测试并报告于上表中的肽显示没有明显的内化入细胞，同时拮抗奥曲肽诱导的内化。1号肽和4至8号肽在体内表现出非常好的结合性质和优良的肿瘤靶向性质，即在4h和24h大量摄取入sst2肿瘤，以及优良的肿瘤：肾脏比率；因此，肿瘤摄取可以被过量的冷肽阻断。

本发明肽不仅提供更选择性结合SSTR2的配体，而且提供了标记肽(例如放射性标记的1号肽形式)促进药物筛选甚至更有效拮抗剂的用途。筛选分析是本领域公知的，其采用直接来自重组宿主的受体多肽SSTR2，可以用于鉴定用于按需要阻断或模拟的生长抑素的某些方面、同时消除可能产生于其他受体活化或阻断的不希望的激素方面的物质。就这点而言，如果需要放射性配体用于筛选目的，则Tyr可以在N末端添加而替代DOTA，或者Tyr可以用于2位而替代Cpa，或者适合的放射性配体可以通过DOTA螯合剂连接。候选化合物的竞争性结合分析可以首先以该方式对SSTR2进行以寻找高结合亲和力；然后通过筛选多种SRIF受体，可以确认是否如预期仅对该受体选择性结合。本发明的非放射性标记肽可以用于治疗所有已知表达SSTR2的器官的疾病，包括肺、胃肠道和肾。

因为如上所示，向SRIF类似物的N末端添加没有表现出负面影响选择性结合，应该清楚，这些化合物可以与放射性核素络合以使这些物质运载至希望凋亡的肿瘤或其他组织。例如，如上文所述，可以使用适合的螯合剂(例如DOTA或DTPA或其他)使SRIF类似物与高放射性金属络合。用于螯合放射性金属原子的适合螯合基团的一些例子是四齿螯合剂或基团，衍生自：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺戊乙酸(DTPA)、环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-0，0’-双(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、N，N-双(羟基苄基)-乙二胺-N，N’-二乙酸(HBED)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N’”-四乙酸(DOTA)、羟基乙基二胺三乙酸(HEDTA)、1，4，8，11-四氮杂环-十四烷-N，N’，N″，N’″-四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA。其他螯合剂以及放射性物质公开于WO 95/22341和WO 04/082722以及美国专利公布2004/0242842和2005/0070470，其公开内容通过引用并入本文。优选的螯合剂衍生自EDTA和DOTA。一些适合的盐是¹¹¹In-8-羟基喹啉盐和^99mTc-酒石酸盐，其一般可以在对肽拮抗剂无害的条件下以简单方式生成，并且^99mTc(CO)₃可以经Tyr或适合的三齿螯合剂偶联。

如果需要，SRIF拮抗剂的溶解度可以通过以下方式提高：使用亲水化合物(例如氢乳清酸(Hor)或类似物)对N末端氨基酰化，或者与适合异氰酸酯(例如异氰酸甲酯或异氰酸异丙酯)反应以在N末端产生脲部分。其他试剂也可以是N末端连接的，如本领域已知的，这将增加SRIF拮抗剂作用的持续时间。

这些SRIF拮抗剂或其非毒性盐与药学或兽医学可接受的载体混合生成药物组合物，可以静脉内、皮下、肌肉内、经皮(例如鼻内)、脑髓内或口服施用至动物，包括人和其他哺乳动物。被设计用于检测人类组织中的恶性肿瘤(包括其转移)的这样的药物组合物可以包括：药学可接受的载体物质和任选的药学可接受佐剂，作为活性物质的足以外部成像、γ检测探针检测或抗击或控制肿瘤的量的标记肽拮抗剂。肽拮抗剂应该至少约90％纯，并且优选应该具有至少约98％的纯度；然而，更低的纯度是有效的，并且可以很好地用于非人的哺乳动物。该纯度指想要的肽构成存在的所有类似肽和肽片段的所述重量％。对人的施用应该根据医师判断以抗击特定肿瘤和癌症或介导其中SSTR2受体发挥控制功能的其他状态，例如偶联至酪氨酸磷酸酶以便可以刺激该酶以介导SRIF的抗增殖效应。需要的剂量将随待治疗的特定状态、状态的严重度和需要治疗的持续时间而改变。

最近已确定，肿瘤经常表达几种类型的肽受体(Reubi，J.C；Waser，B.Concomitant expression of several peptide receptors in neuroendocrine tumours：molecular basis for in vivomultireceptor tumour targeting.Eur.J.Nucl.Med.Molec.Imaging 2003，30，781-793.)。这样的多种肽受体组可以包括sst2受体以及蛙皮素受体、CCK受体、VIP受体、GLP-1受体、神经紧张肽受体、胰泌素受体、神经介素B受体和CRF受体等。在这种情况下，SSTR2拮抗剂与这些各种受体的一种或多种放射性标记的拮抗剂作为混合物组合的施用应该非常明显提高所述肿瘤的体内靶向。

这样的肽拮抗剂经常以药学或兽医学可接受的非毒性盐形式施用，所述盐形式例如酸加成盐或金属络合物，例如与锌、铁、钙、钡、镁、铝或类似金属的络合物。所述非毒性盐的示例有盐酸盐、溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、鞣酸盐、草酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、藻酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐等。

可能需要在延长的时期递送这些SRIF拮抗剂，例如从单次施用持续一周至一年的时期，可以如本领域公知的使用缓释、贮藏或植入剂量形式。例如，剂量形式可以含有在体液中具有低溶解度的化合物的药学上可接受的非毒性盐，例如与多元酸的酸加成盐；与多价金属阳离子的盐；或两种盐的组合。相对不溶的盐可以配制成凝胶，例如硬脂酸铝凝胶。适合的缓释贮藏注射制剂也可以含有SRJF拮抗剂或其盐，分散或包封入缓慢降解的非毒性或非抗原性聚合物，例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物，例如美国专利3,773,919所描述的。

治疗有效量的肽拮抗剂应该在医师指导下施用，药物组合物通常含有与常规药学或兽医学可接受的载体结合的肽。治疗有效量被认为是经计算达到预期效果的预定量。所需剂量将随特定治疗和所需治疗的持续时间而变化；然而，预期约10微克至约1毫克/千克体重/每天的剂量将用于治疗性治疗。可能特别有利的是施用诸如早期所述的贮藏或长效形式的化合物。治疗有效量通常是SRIF拮抗剂以生理学可接受组合物外周施用(例如静脉内)时足以实现其约0.1μg/ml至约100μg/ml、优选约1μg/ml至约50μg/ml、更优选至少约2μg/ml和通常5至10μg/ml的血浆浓度的量。在这些量中，它们可以用于按需要影响胃分泌。

当组合物用于成像或治疗性治疗时，放射性标记化合物和/或短半衰期的放射性核素的差贮存期限可能要求使用者在临床医院或实验室进行放射性核素标记反应。在这种情况下，各种反应成分可以所谓“试剂盒”形式提供给使用者。进行预期反应所必需的操作应该尽可能简单以使使用者能够从试剂盒制备放射性标记的组合物，使用正常是一次性的设施。因此，制备放射性药物组合物、检测和定位组织中的恶性肿瘤及其转移灶的试剂盒可以包括(i)SSTR2选择性肽、惰性药学可接受载体和/或配制剂，以及任选佐剂，(ii)放射性金属同位素的盐或螯合物溶液，和(iii)带有使试剂盒中存在的成分反应的指令的使用说明书。

优选地，用作所述试剂盒的肽拮抗剂已经通过与螯合剂(例如上文定义的螯合剂)的反应而衍生。得到的肽轭合物提供以简单方式紧固连接放射性核素的设施。用于修饰肽的适合螯合剂详细描述于上文。含N的二乙酸或聚乙酸或它们的衍生物(例如上文提到的化合物)已经被证实主要适合连接各种金属放射性核素(例如¹¹¹In和^113mIn)至肽分子。提供给使用者的试剂盒还可以包括其他上述成分以及使用说明书，而具有有限的贮存期限的放射性核素的盐或螯合物溶液可以分开提供给使用者。

例如，制备用^99mTc、¹⁸⁶Re或¹⁸⁸Re标记的放射性药物组合物的试剂盒可以包括上文(i)和(ii)中所述的成分以及还原剂和按需要的螯合剂，和(iii)使用说明书，有使试剂盒成分与高锝酸盐溶液形式的^99mTc或与高铼酸盐溶液形式的¹⁸⁶Re或¹⁸⁸Re反应的指令。如果需要，试剂盒的各种成分可以混合，条件是它们是相容的。试剂盒应该包括还原高锝酸盐或高铼酸盐的还原剂，例如连二亚硫酸盐、金属还原剂或稳定络合物的还原剂，例如SnCl₂、酒石酸盐锡(II)、膦酸锡(II)或焦磷酸锡(II)、或葡庚酸锡(II)。高锝酸盐溶液和高铼酸盐溶液可以简单地从适合销售者获得。试剂盒本身存在放射性核素时，与肽的络合物生成反应可以简单地通过使中性介质组分混合并使它们反应而产生。为此目的，如前所述，放射性核素可以与结合比较弱的螯合剂的螯合物形式的肽反应。

当试剂盒包括上文所述的衍生肽并预期用于制备标记有^99mTc、Re或Re的放射性药物组合物时，放射性核素将优选以高锝酸盐溶液和高铼酸盐溶液的形式单独添加。在这种情况下，试剂盒将包括适合的还原剂和按需要的螯合剂，前者还原高锝酸盐或高铼酸盐。作为还原剂，可以使用例如连二亚硫酸盐或金属还原剂。所述成分可以任选被混合，条件是它们是相容的。其中混合的成分优选冻干的单组份试剂盒特别适合由使用者与放射性溶液反应。可以使用金属还原剂，例如Sn(II)、Ce(III)、Fe(II)、Cu(I)、Ti(III)或Sb(III)；Sn(II)。上述试剂盒的肽组分可以作为溶液提供，例如以生理盐水溶液或一些缓冲溶液的形式，但是优选以干状态存在，例如为冻干状态。当作为注射液体组分使用时，应该是无菌的，其中当干状态的组分时，使用者应该优选使用无菌生理盐水溶液作为溶剂。如果需要，上述组分可以用适合的稳定剂以常规方式稳定化，所述稳定剂例如抗坏血酸、龙胆酸或这些酸的盐。

尽管已经参考构成发明人目前已知的最佳实施方式的优选实施方案描述了本发明，但应理解，可以做出对于本领域普通技术人员而言明显的各种变化和调整，而不背离所附权利要求中提出的本发明范围。尽管权利要求以肽序列方式不同地限定了本发明，但应理解，这预期包括公知为其完全等同物和最频繁施用的其非毒性的盐。

上文提出的所有专利和公布的专利申请的公开内容明确通过引用并入本文。本文使用的温度是℃，所有比率按体积计。液体物质的百分比也是按体积计。

本发明的各种特征在所附权利要求中被强调。

Claims

1.一种选择性结合SRIF受体SSTR2的环状生长抑素(SRIF)类似肽，该肽具有以下氨基酸序列之一，其中C末端被酰胺化：

2.权利要求1所述的肽，其中存在连接至Cpa的部分(Z)，部分(Z)选自基于DOTA的螯合剂、基于DTPA的螯合剂、基于NOTA的螯合剂、羰基化合物、2肼基尼克酰胺、N₄-螯合剂、去铁胺和N_xS_y-螯合剂。

3.权利要求2所述的肽，其中DOTA螯合剂与Cpa共价连接。

4.药物组合物，包括根据权利要求1的肽和至少一种药学上可接受的载体的混合物。