CN102223891A - 具有改善性质的拟肽大环化合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了与它们相应的多肽相比具有改善性质的生物活性拟肽大环化合物。本发明还提供了制备和使用这些大环化合物的方法，例如在治疗应用中。

Description

具有改善性质的拟肽大环化合物

交叉参考

本申请要求2008年11月24日提交的美国临时申请61/117,508的优先权，本文通过引用引入该申请的全部。

发明背景

重组或合成产生的多肽作为药物具有重要的应用。但是，多肽如短肽通常具有较差的代谢稳定性、较差的细胞穿透性和由于构象柔性所导致的杂乱的结合。已经尝试了多种稳定螺旋肽的方法，例如通过使用分子内交联剂，以通过引入连接氨基酸侧链的二硫键、酰胺键或碳-碳键来维持肽的理想构型。参见例如Jackson等人(1991)，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392；Phelan等人(1997)，J.Am.Chem.Soc.119：455-460；Taylor(2002)，Biopolymers 66：49-75；Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554；Hiroshige等人(1995)，J.Am.Chem.Soc.117：11590-11591；Blackwell等人(1998)，Angew.Chem.Int.Ed.37：3281-3284；Schafmeister等人(2000)，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892；Walensky等人(2004)，Science 305：1466-1470；Bernal等人(2007)，J.Am.Chem Soc.129：2456-2457；于2004年11月5日提交的美国专利申请2005/0250680；美国专利7,192,713 B1(Verdine等人)；于2007年12月14日提交的美国专利申请No.11/957,325；于2008年2月25日提交的美国专利申请No.12/037,041和美国专利5,811,515，这些专利和出版物的内容通过引用方式结合在本文中。仍然强烈需要具有改善的生物性质的治疗性、药物有用的多肽，改善的性质如改善的体内半衰期、在较低的剂量或减少的给药频率时的有效性。

发明概述

本发明解决了这些和其他需要。一方面，本发明提供了相对它们相应的非交联对应物具有改善的药代动力学性质的螺旋拟肽大环化合物。

例如，本发明提供了通过设置一个或多个交联(cross-link)来延长螺旋多肽的体内半衰期的方法。在该方法的一些实施方式中，所述多肽的体内半衰期相对于缺乏所述交联的相应多肽而言平均延长至少50倍。在该方法的其他实施方式中，所述多肽的体内半衰期相对于缺乏所述交联的相应多肽而言延长至少100倍、150倍或200倍。在一些实施方式中，如此选择多肽，使得交联的多肽的表观血清结合亲和力(Kd^*)为1、3、10、70微摩尔或更大。在其他实施方式中，交联的多肽的Kd^*是1至10、70或700微摩尔。在其他实施方式中，如此选择交联的多肽，使得其在人血液中估计的游离分数为0.1-50％或0.15-10％。在一些实施方式中，如此选择多肽，使得在室温和水性条件下，交联的多肽的％螺旋度大于25％、50％或75％。在其他实施方式中，交联的多肽的％螺旋度相对于缺乏所述交联的相应的多肽而言增加至少2倍、5倍或10倍。

在该方法的一些实施方式中，所述多肽包含一个交联。在该方法的其他实施方式中，所述多肽包含两个交联。

在本发明的一些实施方式中，一个交联连接两个α碳原子。在该方法的其他实施方式中，一个交联所连接的一个α碳原子被式R-取代基取代。在该方法的另一实施方式中，一个交联所连接的两个α碳原子被独立的式R-取代基取代。

在本发明方法的一个实施方式中，R-是烷基。例如，R-是甲基。或者，R-和一个交联的任意部分可一起形成环结构。在该方法的另一实施方式中，一个交联是由连续的碳-碳键形成的。例如，一个交联可包含至少8、9、10、11或12个连续的键。在其他实施方式中，一个交联可包含至少7、8、9、10或11个碳原子。

在该方法的另一实施方式中，交联的多肽包含BCL-2家族成员的α螺旋结构域。例如，交联的多肽包含BH3结构域。在其他实施方式中，交联的多肽包含表1、2、3和4中任意序列的至少60％、70％、80％、85％、90％或95％。

在该方法的一些实施方式中，交联的多肽通过能量依赖性过程穿透细胞膜，并结合分子内靶标。

在其他实施方式中，本发明提供了包含一个或多个交联的螺旋多肽，其中该交联的螺旋多肽的体内半衰期大于360分钟。在其他实施方式中，所述多肽的体内半衰期大于500分钟或1000分钟。在另一实施方式中，所述多肽的体内半衰期为500-5000分钟。

在一些实施方式中，所述螺旋多肽包含一个交联。在其他实施方式中，所述螺旋多肽包含两个交联。

在一些实施方式中，一个交联连接两个α碳原子。在其他实施方式中，一个交联所连接的一个α碳原子被式R-取代基取代。在另一实施方式中，一个交联所连接的两个α碳原子被独立的式R-取代基取代。

在本发明方法的一个实施方式中，R-是烷基。例如，R-是甲基。或者，R-和一个交联的任意部分可一起形成环结构。在另一实施方式中，一个交联是由连续的碳-碳键形成的。例如，一个交联可包含至少8、9、10、11或12个连续的键。在其他实施方式中，一个交联可包含至少7、8、9、10或11个碳原子。

在另一实施方式中，交联的多肽包含BCL-2家族成员的α螺旋结构域。例如，交联的多肽包含BH3结构域。在其他实施方式中，交联的多肽包含表1、2、3和4中任意序列的至少60％、70％、80％、85％、90％或95％。

在一些实施方式中，交联的多肽通过能量依赖性过程穿透细胞膜，并结合分子内靶标。

通过引用引入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用方式结合在本文中，就好像各个单独的出版物、专利或专利申请明确地和单独地表明通过引用结合在本文中一样。

附图简述

在所附的权利要求书中详细地阐明了本发明的新特征。通过参考下面的阐述利用本发明原理的说明性实施方式的详细说明和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，附图中：

图1描述了本发明的拟肽大环化合物的序列和相应的非交联的对应物的序列。

图2列出了本发明拟肽大环化合物的体内半衰期。在分别以3mg/kg或10mg/kg的剂量静脉浓注0.6mg/mL或2mg/mL的每种未标记的拟肽大环化合物一次后，测量Sprague Dawley大鼠的半衰期。每种化合物使用三只动物，并通过血液浓度(血浆)的质谱分析确定浓度。

图3a-u表明几种本发明的拟肽大环化合物的血浆浓度曲线。

图4显示本发明的拟肽大环化合物的大鼠表观血清结合亲和力和估计的大鼠血液中的游离分数。

图5显示本发明的拟肽大环化合物在大鼠和猴中的PK分布。

图6显示本发明的拟肽大环化合物在啮齿类和更高等物种中的实际的和预测的PK性质，例如清除率。

图7显示本发明的拟肽大环化合物在222nm的摩尔椭圆率和估计的％螺旋度。

发明详述

如本文所用，术语“大环化合物”指具有包含由至少9个共价键合的原子形成的环或环形的化学结构的分子。

如本文所用，术语“拟肽大环化合物”或“交联的多肽”指包含通过多个肽键接合的多个氨基酸残基和至少一个形成大环的连接体的化合物，所述连接体在第一天然存在的或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)与同一分子中的第二天然存在的或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)之间形成大环。拟肽大环化合物包括其中形成大环的连接体连接第一氨基酸残基(或类似物)的α碳和第二氨基酸残基(或类似物)的α碳的实施方式。拟肽大环化合物任选地包含在一个或多个氨基酸残基和/或氨基酸类似物残基之间的一个或多个非肽键，且除了形成大环化合物的任意残基外，还任选地包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基。

如本文所用，术语“稳定性”指如通过圆二色光谱、NMR或另一种生物物理测量法测量的本发明的拟肽大环化合物在溶液中维持特定的二级结构，或在体外或体内对蛋白水解降解作用具有抗性。本发明所预期的二级结构的非限制性的例子是α-螺旋、β-转角和β-折叠片(pleated sheet)。

如本文所用，术语“螺旋稳定性”指如通过圆二色光谱或NMR测量的本发明的拟肽大环化合物维持α-螺旋结构。例如，在某些实施方式中，相比于对应的非交联的多肽，本发明的拟肽大环化合物如通过圆二色光谱测定的在α-螺旋度方面显示至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。

术语“α-氨基酸”或简称为“氨基酸”指含有结合到被称为α-碳的碳上的氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体以及通过有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文另外特别地指出，本文所用的术语氨基酸意图包括氨基酸类似物。

术语“天然存在的氨基酸”指自然界合成的肽中通常发现的20种氨基酸中的任一种，单字母缩写表示为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。

术语“氨基酸类似物”或“非天然氨基酸”指其结构上类似于氨基酸，且在形成拟肽大环化合物时可代替氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于除了在氨基和羧基之间包括一个或多个额外的亚甲基基团(例如，α-氨基β-羧酸)或以类似的反应性基团取代氨基或羧基(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)以外，在结构上与此处所定义的氨基酸相同的化合物。

“非必需的”氨基酸残基是可从多肽(如BH3结构域或p53 MDM2结合结构域)的野生型序列发生改变而不消除或实质改变其基本的生物学或生物化学活性(例如，受体结合或活化)的残基。“必需的”氨基酸残基是，当从多肽的野生型序列发生改变时，导致多肽的主要生物学或生物化学活性消除或基本消除的残基。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。现有技术已定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，K、R、H)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D、E)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，T、V、I)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，例如，BH3多肽中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基所替代。可接受的置换的其他例子是基于电子等排考虑(例如，正亮氨酸替代甲硫氨酸)或其他性质(如2-噻吩丙氨酸替代苯丙氨酸)的置换。

如本文中使用的与大环化合物或形成大环的连接体相关的术语“元”是指形成或可以形成大环的原子，并且取代基或侧链原子除外。以此类推，环癸烷、1，2-二氟-癸烷和1，3-二甲基-环癸烷都被认为是十元大环化合物，因为氢或氟取代基或甲基侧链没有参与形成大环。

当用作分子结构的一部分时，符号

指单键或者反式或顺式双键。

术语“氨基酸侧链”指连接到氨基酸中的α-碳上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。也包括其他非天然存在的氨基酸侧链，例如，那些天然产生的氨基酸侧链(例如，氨基酸代谢物)或合成制备的氨基酸侧链(例如，α，α二取代的氨基酸)。

术语“α，α二取代的氨基酸”指包含结合到连接两个天然或非天然的氨基酸侧链的碳(α-碳)上的氨基和羧基的分子或部分。

术语“多肽”包括通过共价键(例如，酰胺键)接合的两个或多个天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全长蛋白质(例如，完全加工的蛋白质)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白质的片段或合成的多肽片段)。

如本文所用，术语“大环化试剂”或“形成大环的试剂”指任何可以用于通过介导两个反应性基团之间的反应制备本发明的拟肽大环化合物的试剂。反应性基团可以是，例如，叠氮和炔，在这种情况下，大环化试剂包括但不限于：Cu试剂，如提供反应性的Cu(I)物质的试剂，如CuBr、CuI或CuOTf；以及可以通过加入还原剂(如抗坏血酸或抗坏血酸钠)原位转化为活性Cu(I)试剂的Cu(II)盐，如Cu(CO₂CH₃)₂、CuSO₄和CuCl₂。大环化试剂可以另外地包括，例如，本领域内已知的Ru试剂，如Cp*RuCl(PPh₃)₂、[Cp*RuCl]₄，或可以提供反应性的Ru(II)物质的其他Ru试剂。在其他情况下，反应性基团为末端烯类。在这样的实施方式中，大环化试剂或形成大环的试剂为复分解催化剂，包括但不限于稳定的后过渡金属卡宾络合物催化剂，如VIII族过渡金属卡宾催化剂。例如，这类催化剂为具有+2氧化态、16的电子计数和五配位的Ru和Os金属中心。在Grubbs等人，″Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis″Acc.Chem.Res.1995，28，446-452和美国专利5,811,515中公开了另外的催化剂。在再其他的情况下，反应性基团为巯基。在这样的实施方式中，大环化试剂为，例如，用两个巯基反应性基团(如卤素基团)功能化的连接体。

术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴或碘或其基团。

术语“烷基”指含有指定数目的碳原子的直链或支链烃链。例如，C₁-C₁₀表示该基团中具有1-10(包括端值)个碳原子。在没有指定任何数值时，“烷基”是其中具有1-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。

术语“亚烷基”指二价烷基(即，-R-)。

术语“链烯基”指作为具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链的烃链。链烯基部分含有指定数目的碳原子。例如，C₂-C₁₀表示该基团中具有2-10(包括端值)个碳原子。术语“低级链烯基”指C₂-C₆链烯基链。在没有指定任何数值时，“链烯基”是其中具有2-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。

术语“炔基”指作为具有一个或多个碳-碳叁键的直链或支链的烃链。炔基部分含有指定数目的碳原子。例如，C₂-C₁₀表示该基团中具有2-10(包括端值)个碳原子。术语“低级炔基”指C₂-C₆炔基链。在没有指定任何数值时，“炔基”是其中具有2-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。

术语“芳基”指6碳单环或10碳双环的芳香环系统，其中，各环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。术语“芳基烷基”或术语“芳烷基”指被芳基取代的烷基。术语“芳基烷氧基”指被芳基取代的烷氧基。

“烷基芳基”指其中芳基的氢原子中的一个被如上定义的C₁-C₅烷基取代的如上定义的芳基。烷基芳基的典型例子包括但不限于：2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2-丁基苯基、3-丁基苯基、4-丁基苯基、2-戊基苯基、3-戊基苯基、4-戊基苯基、2-异丙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、2-异丁基苯基、3-异丁基苯基、4-异丁基苯基、2-仲丁基苯基、3-仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。

“酰胺基芳基”指其中芳基的氢原子中的一个被一个或多个-C(O)NH₂基团取代的如上定义的芳基。酰胺基芳基的典型例子包括：2-C(O)NH₂-苯基、3-C(O)NH₂-苯基、4-C(O)NH₂-苯基、2-C(O)NH₂-吡啶基、3-C(O)NH₂-吡啶基和4-C(O)NH₂-吡啶基。

“杂环基烷基”指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被杂环取代的如上定义的C₁-C₅烷基。杂环基烷基的典型例子包括但不限于：-CH₂CH₂-吗啉、-CH₂CH₂-哌啶、-CH₂CH₂CH₂-吗啉和-CH₂CH₂CH₂-咪唑。

“酰胺基烷基”指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被-C(O)NH₂基团取代的如上定义的C₁-C₅烷基。酰胺基烷基的典型例子包括但不限于：-CH₂-C(O)NH₂、-CH₂CH₂-C(O)NH₂、-CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂CH(C(O)NH₂)CH₃、-CH₂CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃、-CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃、-C(CH₃)₂CH₂C(O)NH₂、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₃-CH₃和-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH＝CH₂。

“羟烷基(alkanol)”指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被羟基取代的如上定义的C₁-C₅烷基。羟烷基的典型例子包括但不限于：-CH₂OH、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH(OH)CH₃、-CH₂CH(OH)CH₂CH₃、-CH(OH)CH₃和-C(CH₃)₂CH₂OH。

“羧基烷基”指其中C₁-C₅烷基的氢原子中的一个被-COOH基团取代的如上定义的C₁-C₅烷基。烷基羧基的典型例子包括但不限于：-CH₂COOH、-CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH(COOH)CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH(COOH)CH₂CH₃、-CH(COOH)CH₂CH₃和-C(CH₃)₂CH₂COOH。

本文所用的术语“环烷基”包括具有3-12个碳、优选3-8个碳、更优选3-6个碳的饱和的及部分不饱和的环烃基，其中，环烷基另外任选地被取代。一些环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。

术语“杂芳基”指芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环系统，其如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，各环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基的例子包括：吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基、噻唑基等。

术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指被杂芳基取代的烷氧基。

术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指被杂芳基取代的烷氧基。

术语“杂环基”指非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环系统，其如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，各环的0、1、2或3个原子被取代基取代。杂环基的例子包括哌嗪基(piperazinyl)、吡咯烷基、二氧杂环己基(dioxanyl)、吗啉基(morpholinyl)、四氢呋喃基等。

术语“取代基”指取代任何分子、化合物或部分上的另一个原子或基团(如氢原子)的基团。合适的取代基包括但不限于：卤素、羟基、巯基、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、链烷磺酰基、烷基羰基和氰基。

在某些实施方式中，本发明的化合物包含一个或多个不对称中心，因而作为外消旋体或外消旋混合物、单一的对映异构体、单独的非对映异构体和非对映体混合物存在。除非另外清楚地指出，本发明包括这些化合物的所有这些异构体形式。在某些实施方式中，本发明的化合物也以多种互变异构形式表示，在这些情况下，本发明包括本文所述化合物的所有互变异构形式(例如，如果环系统的烷基化作用导致在多个位置烷基化，那么本发明包括所有这些反应产物)。除非另外清楚地指出，本发明包括这些化合物的所有这些异构体形式。除非另外清楚地指出，本发明包括本文所述化合物的所有晶形。

如本文所用，术语“增加”或“减少”分别意味着导致至少5％的统计上显著的(即，p＜0.1)增加或减少。

如本文所用，提及变量的数值范围意味着表示，本发明可以采用等于该范围内的任何值的该变量实施。因此，对于本身不连续的变量，该变量等于该数值范围内的任何整数值，包括该范围的端点。类似地，对于本身连续的变量，该变量等于该数值范围内的任何实值，包括该范围的端点。举例来说，但不是限制性的，如果变量本身是不连续的，描述为具有0-2之间的值的变量取0、1或2的值；而如果变量本身是连续的，则取0.0、0.1、0.01、0.001的值或≥0且≤2的其他任何实值。

如本文所用，除非另外特别地指出，单词“或”以“和/或”的包含性的含义使用，而非“任一/或”的排它性的含义。

术语“平均”表示对于每个数据点由进行至少3次独立的重复而获得的平均值。

术语“生物活性”包括本发明的大环化合物的结构和功能特性。生物活性是，例如，结构稳定性、α-螺旋性、对于靶标的亲和性、对于蛋白水解降解的抗性、细胞渗透性，细胞内稳定性、体内稳定性或其任何组合。

在下面的附图和描述中阐明了本发明的一种或多种具体实施方式的细节。从说明书、附图和权利要求书中可以清楚地看出本发明的其他特征、目的和优势。

本发明的拟肽大环化合物的生物性质

一方面，本发明提供了通过设置一个或多个交联来延长螺旋多肽的体内半衰期的方法。例如，所述多肽的体内半衰期相对于缺乏所述交联的相应多肽而言平均延长至少50倍。在该方法的其他实施方式中，所述多肽的体内半衰期相对于缺乏所述交联的相应多肽而言延长至少100倍、150倍或200倍。在其他实施方式中，本发明提供了包含一个或多个交联的螺旋多肽，其中该交联的螺旋多肽的体内半衰期大于360分钟。在其他实施方式中，所述多肽的体内半衰期大于500分钟或1000分钟。在另一实施方式中，所述多肽的体内半衰期为500-5000分钟。在另一实施方式中，所述多肽的体内半衰期是在静脉给药后确定的。

在一些实施方式中，如此选择多肽，使得交联的多肽的表观血清结合亲和力(Kd^*)是1、3、10、70微摩尔或更大。在其他实施方式中，交联的多肽的Kd^*是1至10、70或700微摩尔。在其他实施方式中，如此选择交联的多肽，使得其在人血液中估计的游离分数为0.1-50％或0.15-10％。

本发明提供了确定具有理想的血清结合亲和力的交联多肽的方法，包括如下步骤：合成亲本交联多肽的类似物，并在缺乏血清蛋白和存在两种或更多种浓度的血清的条件下进行细胞分析，从而确定每种交联多肽对血清蛋白的表观亲和力并通过数学外推法计算全血中的EC₅₀。

在一实施方式中，使用通过EC50移位分析得到的对血清蛋白的表观Kd值，来提供一种简单而迅速的定量实验化合物结合HSA和其他血清蛋白的倾向的方法。在血清蛋白的存在下的表观EC₅₀(EC′₅₀)与体外分析中所添加的血清蛋白的量之间存在线性关系。该关系由该化合物对血清蛋白的结合亲和力定义，表示为K_d ^*。该术语是实验确定的表观解离常数，可能来自多次实验上难以区分的结合事件的累积效应。该关系的形式在本文中表示为Eq.1，其推导可参见Copeland等人，Biorg.Med Chem Lett.2004，14：2309-2312，该文献的内容通过引用方式结合在本文中。

$\left(1\right)---{{\mathrm{EC}}^{\′}}_{50}={\mathrm{EC}}_{50}+P\left(\frac{n}{1+\frac{{K_d}^{*}}{{\mathrm{EC}}_{50}}}\right)$

相当比例的血清蛋白结合归因于由于血清中该蛋白的浓度非常高(35-50g/L或530-758μM)引起的药物与血清白蛋白之间的相互作用。为了计算这些化合物的K_d值，我们假定添加蛋白后EC₅₀的变化可完全是由于添加的血清中存在的血清白蛋白，其中对于100％血清而言P是700μM，对于10％血清而言P是70μM，等等。我们还进一步进行了简化假设，即所有的化合物以1∶1的化学计量结合血清白蛋白，从而Eq.(1)中的项n被固定一致(at unity)。通过使这些参数处于适当的位置，我们使用Mathematica 4.1(Wolfram Research，Inc.，www.wolfram.com)、通过非线性回归分析，根据随血清(和血清蛋白)浓度增加的EC₅₀值的变化，计算了每种装订肽的K_d ^*值。按照以下方程估算血液中的游离分数，其中[血清白蛋白]_总被设定为700μM，如Trainor，Expert Opin.Drug Disc.，2007，2(1)：51-64所推导，该文献的内容通过引用方式结合在本文中。下式显示了其中血清白蛋白是人血清白蛋白的实施方式：

在一实施方式中，改善的生物活性被测量为提高的细胞穿透性或提高的诱导细胞凋亡的能力。在再另一实施方式中，生物活性被测量为体外分析中被杀死的细胞的数目百分比，在该分析中，培养的细胞暴露于有效浓度的所述多肽中。

在一些实施方式中，如此选择多肽，使得在室温水性条件下，交联多肽的百分螺旋度大于25％、50％或75％。在其他实施方式中，在室温水性条件下，交联多肽的百分螺旋度与缺乏所述螺旋的相应的多肽相比增加至少2倍、5倍或10倍。

本发明的拟肽大环化合物的设计

包含被认为赋予生物活性的螺旋结构的、具有已知一级氨基酸序列的任何蛋白质或多肽是本发明的主题。例如，可以分析多肽的序列，并且可在适当的位置替换包含与大环化试剂反应的基团的氨基酸类似物。适当的位置是这样确定的：通过确定二级结构的哪些分子表面是生物活性所需的，继而通过哪个(哪些)其他表面，本发明的形成大环化合物的连接体在不空间阻断生物活性所需的表面的情况下可以形成大环化合物。该确定是通过如下方式进行的：使用如二级结构和天然结合对应物之间的复合体的X射线结晶学等方法来可视化对活性关键的残基(和表面)；通过二级结构中残基的连续突变来功能识别对活性关键的残基(和表面)；或通过其他方法。用过该确定，适当的氨基酸被氨基酸类似物和本发明的形成大环化合物的连接体取代。例如，对于α螺旋二级结构，螺旋的一个表面(例如沿螺旋轴纵向延伸和绕螺旋周45-135°径向延伸的分子表面)对于用于生物活性的与另一生物分子的体内或体外接触可能是必需的。在该情况下，形成大环化合物的连接体被设计为连接该螺旋的两个α碳，同时在不是活性直接需要的表面的部分中沿着螺旋的表面纵向延伸。

在本发明的一些实施方式，肽序列来自BCL-2蛋白质家族。BCL-2家族定义为存在最多达4个保守的BCL-2同源性(BH)结构域，被称为BH1、BH2、BH3和BH4，所有结构域包括α螺旋片段(Chittenden等人(1995)，EMBO 14：5589；Wang等人(1996)，Genes Dev.10：2859)。抗细胞凋亡蛋白如BCL-2和BCL-X_L在所有BH结构域中显示出序列保守。促细胞凋亡蛋白被分成“多结构域”家族成员(如BAK、BAX)，它们在BH1、BH2和BH3结构域中具有同源性，以及分成“仅BH3-结构域”家族成员(如BID、BAD、BIM、BIK、NOXA、PUMA)，其仅在BH3两性α螺旋片段中包含序列同源性。BCL-2家族成员具有形成同二聚体和异二聚体的能力，这表明竞争性结合和促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白水平之间的比值提示对死亡刺激的易感性。抗细胞凋亡蛋白起到保护细胞不受促细胞凋亡过量(即过度的程序性细胞死亡)的作用。其他的“安全”措施包括调控促细胞凋亡蛋白的转录和维持它们作为非活性构象异构体，这需要蛋白水解激活、脱磷酸化或配体诱导的构象改变来激活促死亡功能。在某些细胞类型中，在质膜接受的死亡信号通过线粒体途径引发细胞凋亡。线粒体通过隔离细胞色素c(激活胱天蛋白酶(caspase)9的胞质复合体的关键成分)可以作为细胞凋亡的守护者，从而导致致命的下游蛋白水解事件。多结构域蛋白如BCL-2/BCL-X_L和BAK/BAX在线粒体膜上起保护者和行刑者的双重作用，它们的活性进一步被BCL-2家族的上游仅BH3成员调控。例如，BID是促细胞凋亡蛋白的仅BH3-结构域家族的成员，并向位于线粒体膜的效应器促细胞凋亡蛋白传递在质膜上接受的死亡信号。BID具有使促细胞凋亡蛋白和抗细胞凋亡蛋白相互作用的能力，且在被胱天蛋白酶8激活后，引发细胞色素c的释放和线粒体的细胞凋亡。缺失和诱变研究确定了，促细胞凋亡家族成员的两性α螺旋BH3片段可作为死亡结构域起作用，且因此可代表与多结构域细胞凋亡蛋白相互作用的关键结构基序。结构研究已显示，BH3螺旋可通过插入由BH1、BH2和BH3结构域的界面形成的疏水沟与抗细胞凋亡蛋白相互作用。激活的BID可被抗细胞凋亡蛋白(如BCL-2和BCL-X_L)结合和隔离，并可引发促细胞凋亡蛋白BAX和BAK的激活，从而导致细胞色素c的释放和线粒体细胞凋亡程序。BAD也是仅BH3结构域的促细胞凋亡家族成员，它的表达引发了BAX/BAK的激活。但是，与BID相反，BAD显示与抗细胞凋亡家族成员BCL-2和BCL-X_L优先结合。而BAD BH3结构域对BCL-2显示出高亲和力的结合，BAD BH3肽不能体外激活细胞色素c从线粒体的释放，表明BAD不是BAX/BAK的直接激活剂。过表达BCL-2的线粒体对BID诱导的细胞色素c的释放具有抗性，但与BAD共治疗可以恢复BID的敏感性。BAD对线粒体凋亡的诱导看起来是由于：(1)来自BCL-2/BCL-XL结合口袋的BAX/BAK激活剂的置换，该激活剂例如BID和BID样蛋白质，或(2)BAD对BCL-2/BCL-XL结合口袋的选择性占位，从而防止抗细胞凋亡蛋白对BID样蛋白质的隔离。因此，已经出现了两类仅BH3-结构域的蛋白质：直接激活线粒体凋亡的BID样蛋白质，和通过占据多结构域抗细胞凋亡蛋白的结合口袋而具有使线粒体对BID样促细胞凋亡剂敏感的能力的BAD样蛋白质。已经公开了适于本文公开的方法的BCL-2家族成员蛋白的不同α螺旋结构域(Walensky等人(2004)，Science 305：1466；和Walensky等人，美国专利公布No.2005/0250680，其全部通过引用方式结合在本文中)。

在其他实施方式中，肽序列来源于结合癌基因蛋白MDM2的肿瘤抑制物p53蛋白。MDM2结合位点位于形成α螺旋的p53肿瘤抑制物的区域内。在美国专利No.7,083,983中，其全部内容通过引用方式结合在本文中，Lane等人公开了负责结合MDM2的p53的区域大致由成熟的人p53蛋白质的氨基酸13-31(PLSQETFSDLWKLLPENNV)代表。本发明还涉及Lane公开的其他修饰的序列。此外，p53与MDM2之间的相互作用已在Shair等人(1997)，Chem.& Biol.4：791中讨论过，该文献的全部内容通过引用方式结合在本文中，p53基因中的突变已被确定几乎存在于所有报告的癌症病例的一半病例中。当对细胞施加应激时，p53被认为管理导致细胞周期停滞和DNA修复或程序性细胞死亡的应答。直接改变p53蛋白功能的p53基因中的突变以及p53可被MDM2中的改变而改变。MDM2蛋白已显示结合p53，并通过与p53的转活结构域结合来破坏转录激活。例如，来自p53的转活结构域的11个氨基酸的肽形成2.5个转角的两性α螺旋，它插入MDM2裂隙中。因此，在一些实施方式中，通过本发明的方法产生的新的α螺旋结构经工程化产生与螺旋受体紧密结合并破坏天然的蛋白质-蛋白质相互作用的结构。然后使用高通量技术筛选这些结构，以识别优化的小分子肽。破坏MDM2相互作用的新的结构可用于多种应用，包括但不限于软组织肉瘤(其在野生型p53的存在下过量表达MDM2)的控制。在一些实施方式中，这些癌症然后被截获MDM2的小分子抑制，从而防止了p53的抑制。此外，在一些实施方式中，MDM2-p53相互作用的小分子破坏者被用作辅助疗法，以帮助控制和调节常规化疗中p53依赖性细胞凋亡应答的程度。

下面给出了用于本发明的合适的肽序列的非限制性示例的列表：

表1

表1列举了靶向BH3结合位点并参与癌症、自身免疫性疾病、代谢性疾病和其他人类疾病的人类序列。

表2

表2列举了靶向BH3结合位点并参与癌症、自身免疫性疾病、代谢性疾病和其他人类疾病的人类序列。

表3

表3列举了靶向MDM2/X的p53结合位点并参与癌症的人类序列。

表4

表4列举了靶向人G蛋白偶联受体并参与多种人类疾病状况的序列(Tyndall等人(2005)，Chem.Rev.105：793-826)。

本发明的拟肽大环化合物

在该方法的一些实施方式中，本发明的多肽包含一个交联。在该方法的其他实施方式中，所述多肽包含两个交联。在该方法的一些实施方式中，一个交联连接两个α碳原子。在该方法的其他实施方式中，一个交联所连接的一个α碳原子被式R-取代基取代。在该方法的另一实施方式中，一个交联所连接的两个α碳原子被独立的式R-取代基取代。在本发明方法的一个实施方式中，R-是烷基。例如，R-是甲基。或者，R-和一个交联的任意部分可一起形成环结构。在该方法的另一实施方式中，一个交联是由连续的碳-碳键形成的。例如，一个交联可包含至少8、9、10、11或12个连续的键。在其他实施方式中，一个交联可包含至少7、8、9、10或11个碳原子。

在该方法的另一实施方式中，交联的多肽包含BCL-2家族成员的α螺旋结构域。例如，交联的多肽包含BH3结构域。在其他实施方式中，交联的多肽包含表1、2、3和4中任意序列的至少60％、70％、80％、85％、90％或95％。在该方法的一些实施方式中，交联的多肽通过能量依赖性过程穿透细胞膜，并结合分子内靶标。

在一些实施方式中，所述螺旋多肽包含一个交联。在其他实施方式中，所述螺旋多肽包含两个交联。

在一些实施方式中，一个交联连接两个α碳原子。在其他实施方式中，一个交联所连接的一个α碳原子被式R-取代基取代。在另一实施方式中，一个交联所连接的两个α碳原子被独立的式R-取代基取代。在本发明方法的一个实施方式中，R-是烷基。例如，R-是甲基。或者，R-和一个交联的任意部分可一起形成环结构。在另一实施方式中，一个交联是由连续的碳-碳键形成的。例如，一个交联可包含至少8、9、10、11或12个连续的键。在其他实施方式中，一个交联可包含至少7、8、9、10或11个碳原子。

在另一实施方式中，交联的多肽包含BCL-2家族成员的α螺旋结构域。例如，交联的多肽包含BH3结构域。在其他实施方式中，交联的多肽包含表1、2、3和4中任意序列的至少60％、70％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方式中，交联的多肽通过能量依赖性过程穿透细胞膜，并结合分子内靶标。

在一些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有式(I)：

其中：

A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；

B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、

[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁和R₂独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；

R₃是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

L是式-L₁-L₂-的形成大环的连接体；

L₁和L₂独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，各自任选地被R₅取代；

各个R₄是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₅独立地是卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；

R₈是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；

各个v和w独立地是1-1000的整数；

各个x、y和z独立地是0-10的整数；u是0-10的整数；和

n是1-5的整数。

在一个例子中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R₁和R₂两者独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R₁和R₂中的至少一个是甲基。在其他的实施方式中，R₁和R₂是甲基。

在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是3。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]_x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构，且R₈是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他的实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于位于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

在一个实施方式中，式(I)的拟肽大环化合物为：

其中，R₁和R₂各自独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。

在相关的实施方式中，式(I)的拟肽大环化合物为：

在其他的实施方式中，式(I)的拟肽大环化合物为下面所示的任一式的化合物：

其中，“AA”代表任何天然或非天然的氨基酸侧链，

为如上定义的[D]_v、[E]_w，n是0至20、50、100、200、300、400或500之间的整数。在某些实施方式中，n为0。在其他的实施方式中，n小于50。

形成大环的连接体L的示例性实施方式如下所示。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有式(II)：

其中：

A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；

B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、

[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁和R₂独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；

R₃是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

L是式

的形成大环的连接体；

L₁、L₂和L₃独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，各自任选地被R₅取代；

各个R₄是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₅独立地是卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；

R₈是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；

各个v和w独立地是1-1000的整数；

各个x、y和z独立地是0-10的整数；u是0-10的整数；和

n是1-5的整数。

在一个例子中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R₁和R₂独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R₁和R₂中的至少一个是甲基。在其他的实施方式中，R₁和R₂是甲基。

在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是3。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E在的各具体值。例如，当x是3时，式[A]_x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构，且R₈是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

形成大环的连接体L的示例性实施方式如下所示。

在其他实施方式中，本发明提供了式(III)的拟肽大环化合物：

其中：

A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；

B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、

[-NH-L₄-CO-]、[-NH-L₄-SO₂-]或[-NH-L₄-]；

R₁和R₂独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；

R₃是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R₅取代的；

L₁、L₂、L₃和L₄独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，各自是未取代的或被R₅取代的；

K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₄是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个R₅独立地是卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R₅取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；

R₈是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R₅取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；

各个v和w独立地是1-1000的整数；

各个x、y和z独立地是0-10的整数；u是0-10的整数；和

n是1-5的整数。

在一个例子中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R₁和R₂独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R₁和R₂中的至少一个是甲基。在其他实施方式中，R₁和R₂是甲基。

在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是3。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择在本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]_x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构，且R₈是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体[-L₁-S-L₂-S-L₃-]的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

例如，大环化合物或大环化合物前体通过溶液相或固相方法合成，且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸。参见，例如，Hunt，Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids中的″The Non-Protein Amino Acids″，由G.C.Barrett编著，Chapman and Hall，1985。在某些实施方式中，巯基部分是氨基酸残基L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、α-甲基-L-半胱氨酸、α-甲基-D-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、D-高半胱氨酸、α-甲基-L-高半胱氨酸或α-甲基-D-高半胱氨酸的侧链。双烷基化试剂具有X-L₂-Y的通式，其中，L₂是连接体部分，且X和Y是被-SH部分替代以与L₂形成键的离去基团。在某些实施方式中，X和Y是卤素如I、Br或Cl。

在其他实施方式中，为了促进细胞摄取，进一步修饰式I、II或III的化合物中的D和/或E。在某些实施方式中，使拟肽大环化合物脂质化(lipidating)或PEG化(PEGylating)有利于细胞摄取、提高生物利用度、增加血液循环、改变药物代谢动力学、降低免疫原性和/或降低需要的给药频率。

在其他实施方式中，式I、II或III的化合物中的[D]和[E]中的至少一个代表包含另外的形成大环的连接体的部分，使得拟肽大环化合物包含至少两个形成大环的连接体。在具体的实施方式中，拟肽大环化合物包含两个形成大环的连接体。

在本发明的拟肽大环化合物中，本文所述的任何形成大环的连接体可以与表1-4所示的任何序列任意组合使用，也可以与本文所述的任何R-取代基任意组合使用。

在某些实施方式中，拟肽大环化合物包含至少一个α-螺旋基序。例如，式I、II或III的化合物中的A、B和/或C包含一个或多个α-螺旋。一般地说，α-螺旋包含3-4个氨基酸残基/圈。在某些实施方式中，拟肽大环化合物的α-螺旋包括1-5圈，因而包含3-20个氨基酸残基。在特定的实施方式中，α-螺旋包括1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在某些实施方式中，形成大环的连接体稳定化包括在拟肽大环化合物内的α-螺旋基序。因此，在某些实施方式中，选择从第一Cα到第二Cα的形成大环的连接体L的长度，以提高α-螺旋的稳定性。在某些实施方式中，形成大环的连接体跨越α-螺旋的1-5个圈。在某些实施方式中，形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约1、2、3、4或5个圈。在某些实施方式中，形成大环的连接体的长度是α-螺旋的每圈大约

或α-螺旋每圈大约

在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约1个圈时，长度等于大约5个-13个碳-碳键、大约7个-11个碳-碳键或大约9个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约2个圈时，长度等于大约8个-16个碳-碳键、大约10个-14个碳-碳键或大约12个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约3个圈时，长度等于大约14个-22个碳-碳键、大约16个-20个碳-碳键或大约18个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约4个圈时，长度等于大约20个-28个碳-碳键、大约22个-26个碳-碳键或大约24个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约5个圈时，长度等于大约26个-34个碳-碳键、大约28个-32个碳-碳键或大约30个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约1个圈时，连接包含大约4个-12个原子、大约6个-10个原子或大约8个原子。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约2个圈时，连接包含大约7个-15个原子、大约9个-13个原子或大约11个原子。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约3个圈时，连接包含大约13个-21个原子、大约15个-19个原子或大约17个原子。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约4个圈时，连接包含大约19个-27个原子、大约21个-25个原子或大约23个原子。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约5个圈时，连接包含大约25个-33个原子、大约27个-31个原子或大约29个原子。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约1个圈时，产生的大环形成包含大约17元-25元、大约19元-23元或大约21元的环。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约2个圈时，产生的大环形成包含大约29元-37元、大约31元-35元或大约33元的环。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约3个圈时，产生的大环形成包含大约44元-52元、大约46元-50元或大约48元的环。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约4个圈时，产生的大环形成包含大约59元-67元、大约61元-65元或大约63元的环。在形成大环的连接体跨越α-螺旋的大约5个圈时，产生的大环形成包含大约74元-82元、大约76元-80元或大约78元的环。

在其他实施方式中，本发明提供了式(IV)或(IVa)的拟肽大环化合物：

其中：

A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；

B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁和R₂独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；

R₃是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

L是式-L₁-L₂-的形成大环的连接体；

L₁和L₂独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，各自任选地被R₅取代；

各个R₄是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₅独立地是卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

v是1-1000的整数；

w是1-1000的整数；

x是0-10的整数；

y是0-10的整数；

z是0-10的整数；和

n是1-5的整数。

在一个例子中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R₁和R₂独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R₁和R₂中的至少一个是甲基。在其他实施方式中，R₁和R₂是甲基。

在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是3。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]_x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构，且R₈是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他的实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

形成大环的连接体L的示例性的实施方式如下所示。

在其他实施方式中，本发明提供了式(V)的拟肽大环化合物：

其中：

A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；

B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、

[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁、R₂和R₈独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；

R₃是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

L是式-L₁-L₂-的形成大环的连接体；

L₁和L₂独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，各自任选地被R₅取代；

各个R₄是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₅独立地是卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

w是1-1000的整数；

x是0-10的整数；

y是0-10的整数；

z是0-10的整数；和

n是1-5的整数。

在一个例子中，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R₁和R₂独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R₁和R₂中的至少一个是甲基。在一实施方式中，R₁是H，R₂是甲基。在其他实施方式中，R₁和R₂是甲基。

在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是3。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]_x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为α-螺旋的二级结构，且R₈是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他的实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为

在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。

形成大环的连接体L的示例性的实施方式如下所示：

拟肽大环化合物的示例性实施方式如下所示：

拟肽大环化合物的制备

本发明的拟肽大环化合物可以通过本领域已知的各种方法中的任何一种来制备。例如，表1、2、3或4中的由“X”表示的任何残基可以被能够与同一分子中的第二残基或这样的残基的前体形成交联连接体的残基置换。

各种实现拟肽大环化合物制备的方法是本领域已知的。例如，Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Schafmeister & Verdine，J.Am.Chem.Soc.122：5891(2005)；Walensky等人，Science 305：1466-1470(2004)和美国专利7,192,713中描述了式I的拟肽大环化合物的制备。在所引用的参考文献中公开的α，α-二取代的氨基酸和氨基酸前体可以用于拟肽大环化合物前体多肽的合成。在将这样的氨基酸掺入前体多肽中之后，末端烯烃与复分解反应催化剂反应，从而导致拟肽大环化合物的形成。

在其他实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有式IV或IVa。例如，美国专利7,202,332描述了这样的大环化合物的制备方法。

在某些实施方式中，这些拟肽大环化合物的合成包括多步骤的过程，其特征在于：合成含有叠氮部分和炔部分的拟肽前体；接着将拟肽前体与大环化试剂接触以产生三唑连接的拟肽大环化合物。例如，大环化合物或大环化合物前体通过溶液相或固相方法合成，且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸。参见，例如，Hunt，Chemistry  and Biochemistry of the Amino Acids中的″The Non-Protein Amino Acids″，由G.C.Barrett编著，Chapman and Hall，1985。

在某些实施方式中，叠氮连接残基的α-碳，且炔连接在另一个残基的α-碳上。在某些实施方式中，叠氮部分是氨基酸L-赖氨酸、D-赖氨酸、α-甲基-L-赖氨酸、α-甲基-D-赖氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、α-甲基-L-鸟氨酸或α-甲基-D-鸟氨酸的叠氮基类似物。在另一种实施方式中，炔部分是L-炔丙基甘氨酸。在再其他的实施方式中，炔部分是选自以下的氨基酸：L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。

在某些实施方式中，本发明提供了一种合成拟肽大环化合物的方法，该方法包括将式VI或式VII的拟肽前体与大环化试剂接触的步骤：

其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R₁、R₂、R₇、R₈、L₁和L₂如上文对于式(II)所定义；当大环化试剂是Cu试剂时，R₁₂是-H，且当大环化试剂是Ru试剂时，R₁₂是-H或烷基；而且进一步，其中，所述接触步骤导致在式III或式IV中的炔部分和叠氮部分之间形成共价连接。例如，当大环化试剂是Ru试剂时，R₁₂可以是甲基。

在本发明的的拟肽大环化合物中，R₁和R₂中的至少一个是烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在某些实施方式中，R₁和R₂独立地是烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。

例如，R₁和R₂中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R₁和R₂独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R₁和R₂中的至少一个是甲基。在其他实施方式中，R₁和R₂是甲基。大环化试剂可以是Cu试剂或Ru试剂。

在某些实施方式中，在接触步骤之前纯化拟肽前体。在其他实施方式中，在接触步骤之后纯化拟肽大环化合物。在再其他的实施方式中，拟肽大环化合物在接触步骤之后重折叠。本方法可以在溶液中进行，或者，可选择地，本方法可以在固体载体上进行。

本文也预想，在结合拟肽前体或拟肽大环化合物的目标大分子的存在下，在有利于所述结合的条件下进行本发明的方法。在某些实施方式中，在优先结合拟肽前体或拟肽大环化合物的目标大分子的存在下，在有利于所述结合的条件下进行本发明的方法。本方法也可应用于合成拟肽大环化合物的文库。

在某些实施方式中，式VI或式VII的拟肽前体的炔部分是选自以下的氨基酸的侧链：L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。在其他实施方式中，式VI或式VII的拟肽前体的叠氮部分是选自以下的氨基酸的侧链：ε-叠氮基-L-赖氨酸、ε-叠氮基-D-赖氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸、δ-叠氮基-α-甲基-L-鸟氨酸和δ-叠氮基-α-甲基-D-鸟氨酸。

在某些实施方式中，x+y+z为3，且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。在其他实施方式中，x+y+z为6，且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。

在本发明的拟肽大环化合物的一些实施方式中，[D]_v和/或[E]_w包含另外的拟肽大环化合物或大环结构。例如，[D]_v可具有下式：

A、C、D’和E’各自独立地是天然或非天然的氨基酸；

B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、

[-NH-L₃-CO-]、[-NH-L₃-SO₂-]或[-NH-L₃-]；

R₁、R₂和R₈独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；

R₃是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

L₁和L₂独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R₄-K-R₄-]_n，各自任选地被R₅取代；

各个R₄是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；

各个K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂或CONR₃；

各个R₅独立地是卤素、烷基、-OR₆、-N(R₆)₂、-SR₆、-SOR₆、-SO₂R₆、-CO₂R₆、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

各个R₆独立地是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；

R₇是-H、烷基、链烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R₅取代；

v是1-1000的整数；

w是1-1000的整数；和

x是0-10的整数。

在另一实施方式中，[E]_w具有下式：

其中取代基如前段所定义。

在某些实施方式中，接触步骤在选自质子溶剂、水性溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行。例如，溶剂可以选自H₂O、THF、THF/H₂O、tBuOH/H₂O、DMF、DIPEA、CH₃CN或CH₂Cl₂、ClCH₂CH₂Cl或其混合物。溶剂可以是有利于螺旋形成的溶剂。

替换可选择的但等效的保护基团、离去基团或试剂，并按照可选择的序列或顺序进行特定的合成步骤，以产生需要的化合物。用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)包括，例如，那些例如在Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley and Sons(1991)；Fieser和Fieser，Fieser and Fieser′s  Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和Paquette编著，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后续的版本中所述的方法。

例如，通过化学合成方法，如Fields等人，Synthetic Peptides：A  User′s Guide中的第3章，Grant，W.H.编著，Freeman & Co.，New York，N.Y.，1992，第77页中所述的方法，制备本发明的拟肽大环化合物。因此，例如，利用具有通过tBoc或Fmoc化学保护作用的胺的自动化Merrifield固相合成技术，在例如自动肽合成仪(例如，Applied Biosystems(Foster City，CA)，430A、431或433型)上使用侧链保护的氨基酸合成肽。

本文描述的一种产生本文所述的拟肽前体和拟肽大环化合物的方式使用固相肽合成(SPPS)。经由与连接体分子的酸不稳定的键将C-末端氨基酸连接到交联的聚苯乙烯树脂上。这种树脂不溶于用于合成的溶剂，从而使得洗去过量的试剂和副产物相对简单和快速。用在酸中稳定、但可用碱去除的Fmoc基团保护N-末端。如必要的话，用碱稳定的、酸不稳定的基团保护侧链官能团。

例如，通过使用天然的化学连接结合单个的合成肽产生较长的拟肽前体。或者，通过公知的重组DNA和蛋白质表达技术生物合成较长的合成肽。公知的标准手册中提供了这些技术的详细方案。为了构建编码本发明的拟肽前体的基因，逆向翻译氨基酸序列以获得编码该氨基酸序列的核酸序列，优选使用对于将表达该基因的生物体优化的密码子。接下来，通常通过合成编码肽的寡核苷酸和任何调节元件(如果必要的话)制备合成的基因。将合成的基因插入合适的克隆载体，并转染到宿主细胞中。然后在适用于选择的表达系统和宿主的合适条件下表达该肽。通过标准方法纯化并表征该肽。

例如，使用例如高通量多通道组合合成仪(例如，来自CreoSalus，Louisville，KY的Thuramed TETRAS多通道肽合成仪或来自AAPPTEC，Inc.，Louisville，KY的Apex 396型多通道肽合成仪)以高通量的组合方式制备拟肽前体。

提供了下面的合成方案仅用于说明本发明，而并非意在限制本文所述的本发明的范围。为了简化图形，示例性的方案显示了叠氮基氨基酸类似物ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸和ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸，及炔氨基酸类似物L-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸和(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸。因此，在下面的合成方案中，各个R₁、R₂、R₇和R₈是-H；各个L₁是-(CH₂)₄-；且各个L₂是-(CH₂)-。但是，如以上整个发明详述部分所指出的，可以采用许多其他的氨基酸类似物，其中，R₁、R₂、R₇、R₈、L₁和L₂可以独立地选自本文公开的各种结构。

合成方案1：

合成方案1描述了本发明的几种化合物的制备。如Belokon等人(1998)，Tetrahedron Asymm.9：4249-4252所述制备由手性辅剂(S)-2-[N-(N’-苄基脯氨酰基)氨基]苯甲酮(BPB)衍生的席夫碱和氨基酸(如甘氨酸或丙氨酸)的Ni(II)复合体。产生的复合体随后与包含叠氮部分或炔部分的烷基化试剂反应以产生光学异构富集的(enantiomerically enriched)本发明的化合物。如需要，产生的化合物可以进行保护以用于肽合成。

合成方案2：

在如合成方案2所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过溶液相或固相肽合成法(SPPS)来合成。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽前体去保护并从固相树脂上切下。拟肽前体以粗制混合物进行反应，或者在有机溶液或水性溶液中在与大环化试剂(如Cu(I))反应前进行纯化(Rostovtsev等人(2002)，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；Tornoe等人(2002)，J.Org.Chem.67：3057-3064；Deiters等人(2003)，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783；Punna等人(2005)，Angew.Chem.Int.Ed.44：2215-2220)。在一种实施方式中，在有利于α-螺旋形成的条件下进行三唑形成反应。在一种实施方式中，在选自H₂O、THF、CH₃CN、DMF、DIPEA、tBuOH或其混合物的溶剂中进行大环化步骤。在另一种实施方式中，在DMF中进行大环化步骤。在某些实施方式中，在缓冲的水性溶剂或部分水性溶剂中进行大环化步骤。

合成方案3：

在如合成方案3所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过固相肽合成法(SPPS)来合成。拟肽前体作为粗制混合物与树脂上的大环化试剂(如Cu(I)试剂)反应(Rostovtsev等人(2002)，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；Tornoe等人(2002)，J.Org.Chem.67：3057-3064；Deiters等人(2003)，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783；Punna等人(2005)，Angew.Chem.Int.Ed.44：2215-2220)。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将合成的含三唑的拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。在某些实施方式中，在选自CH₂Cl₂、ClCH₂CH₂Cl、DMF、THF、NMP、DIPEA、2，6-二甲基吡啶、吡啶、DMSO、H₂O或其混合物的溶剂中进行大环化步骤。在某些实施方式中，在缓冲的水性溶剂或部分水性溶剂中进行大环化步骤。

合成方案4：

在如合成方案4所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过溶液相或固相肽合成法(SPPS)来合成。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽前体去保护并从固相树脂上切下。拟肽前体作为粗制混合物进行反应，或者在与大环化试剂如Cu(II)试剂(例如Cp*RuCl(PPh₃)₂或[Cp*RuCl]₄)反应前进行纯化(Rasmussen等人(2007)，Org.Lett.9：5337-5339；Zhang等人(2005)，J.Am.Chem.Soc.127：15998-15999)。在某些实施方式中，在选自DMF、CH₃CN和THF的溶剂中进行大环化步骤。

合成方案5：

在如合成方案5所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过固相肽合成法(SPPS)来合成。拟肽前体作为粗制混合物与在树脂上的大环化试剂(如Ru(II)试剂)反应。例如，该试剂可以是Cp*RuCl(PPh₃)₂或[Cp*RuCl]₄(Rasmussen等人(2007)，Org.Lett.9：5337-5339；Zhang等人(2005)，J.Am.Chem.Soc.127：15998-15999)。在某些实施方式中，在选自CH₂Cl₂、ClCH₂CH₂Cl、CH₃CN、DMF和THF的溶剂中进行大环化步骤。

表5示出了几个示例性的拟肽大环化合物。“Nle”代表正亮氨酸并取代甲硫氨酸残基。可以想到使用类似的连接体来基于表1至表4中公开的多肽序列合成拟肽大环化合物。

表5

表5示出了本发明的示例性的拟肽大环化合物。“Nle”代表正亮氨酸。

本发明涉及非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物在合成本文所述的拟肽大环化合物中的用途。适于在合成稳定的包含三唑的拟肽大环化合物中所使用的合成方法的任何氨基酸或氨基酸类似物均可用在本发明中。例如，L-炔丙基甘氨酸被认为是本发明的有用的氨基酸。但是，其他包含不同氨基酸侧链的包含炔烃的氨基酸也可用于本发明中。例如，L-炔丙基甘氨酸在氨基酸α碳和氨基酸侧链的炔烃之间包含一个亚甲基单元。本发明还想到了使用在α碳和炔烃之间具有多个亚甲基单元的氨基酸。氨基酸L-赖氨酸、D-赖氨酸、α-甲基-L-赖氨酸和α-甲基-D-赖氨酸的叠氮类似物也被考虑作为本发明的有用的氨基酸。但是，含有不同氨基酸侧链的其他末端叠氮氨基酸也可用于本发明中。例如，L-赖氨酸的叠氮类似物在氨基酸的α碳和氨基酸侧链的末端叠氮化物之间包含4个亚甲基单元。本发明还考虑使用在α碳和末端叠氮化物之间具有少于或多于4个亚甲基单元的氨基酸。表6示出了一些用于制备本发明的拟肽大环化合物的氨基酸。

表6

表6显示用于制备本发明的拟肽大环化合物的示例性的氨基酸。

在某些实施方式中，氨基酸和氨基酸类似物是D-构型。在其他实施方式中，它们是L-构型。在某些实施方式中，拟肽中包含的某些氨基酸和氨基酸类似物是D-构型，而某些氨基酸和氨基酸类似物是L-构型。在某些实施方式中，氨基酸类似物是α，α-二取代的，如α-甲基-L-炔丙基甘氨酸、α-甲基-D-炔丙基甘氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸和ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸。在某些实施方式中，氨基酸类似物是N-烷基化的，例如，N-甲基-L-炔丙基甘氨酸、N-甲基-D-炔丙基甘氨酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸。

在某些实施方式中，使用保护基团(包括但不限于-Fmoc和-Boc)保护氨基酸的-NH部分。在其他实施方式中，在合成拟肽大环化合物之前不保护氨基酸。

在其他实施方式中，合成式III的拟肽大环化合物。下面的合成方案描述这类化合物的制备。为了简化图表，示例性的方案描绘了源自L-或D-半胱氨酸的氨基酸类似物，其中，L₁和L₃都是-(CH₂)-。但是，如以上整个发明详述部分所指出的，可以采用许多其他氨基酸类似物，其中，L₁和L₃可以独立地选自本文公开的各种结构。符号“[AA]_m”、“[AA]_n”、“[AA]_o”代表酰胺键连接部分(如天然或非天然氨基酸)的序列。如前面所述，“AA”的各具体情况与“AA”的任何其他具体情况无关，而且如“[AA]_m”的式子包括(例如)不相同氨基酸的序列以及相同氨基酸的序列。

合成方案6：

在合成方案6中，拟肽前体含有2个-SH部分，而且使用可商购的N-α-Fmoc氨基酸如N-α-Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸或N-α-Fmoc-S-三苯甲基-D-半胱氨酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(″Bioorganic Chemistry：Peptides and  Proteins″，Oxford University Press，New York：1998，本文通过引用引入其完整内容)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-三苯甲基单体。接着通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)对前体拟肽去保护并从固相树脂上切下。前体拟肽作为粗制混合物进行反应，或者在有机溶液或水性溶液中在与X-L₂-Y反应前进行纯化。在某些实施方式中，在稀释条件(即，0.15mmol/L)下进行烷基化反应，以有利于大环化并避免聚合。在某些实施方式中，在有机溶液如液NH₃中(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH₃/MeOH中或NH₃/DMF中(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)进行烷基化反应。在其他实施方式中，在水溶液如pH 8的6M盐酸胍中进行烷基化反应(Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554)。在其他实施方式中，用于烷基化反应的溶剂是DMF或二氯乙烷。

合成方案7：

在合成方案7中，前体拟肽含有2个或多个-SH部分，其中的2个特别地进行保护以允许其选择性地去保护和随后烷基化以形成大环。使用可商购的N-α-Fmoc氨基酸如N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸或N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-D-半胱氨酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成前体拟肽。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(Bioorganic Chemistry：Peptides and Proteins，Oxford University Press，New York：1998，本文通过引用引入其完整内容)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基单体。接着通过标准条件(例如，弱酸如DCM中的1％TFA)选择性地切下拟肽前体的Mmt保护基团。然后前体拟肽在树脂上与有机溶液中的X-L₂-Y反应。例如，该反应在位阻碱(hindered base)如二异丙基乙胺的存在下发生。在某些实施方式中，在有机溶液如液NH₃中(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH₃/MeOH中或NH₃/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)中进行烷基化反应。在其他实施方式中，烷基化反应在DMF或二氯乙烷中进行。接着通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。

合成方案8：

在合成方案8中，拟肽前体含有2个或多个-SH部分，其中的2个进行特别保护以允许其选择性地去保护和随后烷基化以形成大环。使用可商购的N-α-Fmoc氨基酸如N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸、N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-D-半胱氨酸、N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-L-半胱氨酸和N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-D-半胱氨酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成拟肽前体。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(Bioorganic  Chemistry：Peptides and Proteins，Oxford University Press，New York：1998，本文通过引用引入其完整内容)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基或N-α-Fmoc-S-S-叔丁基单体。接着通过已知条件(例如，DMF中的20％的2-巯基乙醇，参考文献：Galande等人(2005)，J.Comb.Chem.7：174-177)选择性地切下拟肽前体的S-S-叔丁基保护基团。然后前体拟肽在树脂上与有机溶液中的摩尔过量的X-L₂-Y反应。例如，反应在位阻碱如二异丙基乙胺的存在下发生。接着通过标准条件(例如，弱酸如DCM中的1％TFA)选择性地切下拟肽前体的Mmt保护基团。然后拟肽前体在树脂上通过有机溶液中的位阻碱的处理而环化。在某些实施方式中，在如NH₃/MeOH或NH₃/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)的有机溶液中进行烷基化反应。接着通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)对拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。

合成方案9：

在合成方案9中，拟肽前体含有2个L-半胱氨酸部分。通过已知的活细胞中的生物表达系统或通过已知的体外无细胞表达方法合成拟肽前体。前体拟肽作为粗制混合物进行反应，或者在有机溶液或水性溶液中在与X-L₂-Y反应前进行纯化。在某些实施方式中，在稀释条件(即，0.15mmol/L)下进行烷基化反应，以利于大环化并避免聚合。在某些实施方式中，在有机溶液如液NH₃中(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH₃/MeOH中或NH₃/DMF中(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)进行烷基化反应。在其他实施方式中，在水溶液如pH 8的6M盐酸胍中进行烷基化反应(Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554)。在其他实施方式中，在DMF或二氯乙烷中进行烷基化反应。在另一实施方式中，在非变性水溶液中进行烷基化；在再另一种实施方式中，在有利于α-螺旋结构形成的条件下进行烷基化。在再另一种实施方式中，在有利于前体拟肽与另一种蛋白质结合的条件下进行烷基化，从而在烷基化过程中诱导结合的α-螺旋构象的形成。

本发明设想了适合与巯基反应的X和Y的各种实施方式。一般地，X或Y各自独立地选自表5所示的一般种类。例如，X和Y是如-Cl、-Br或-I的卤素。本文所述的任何形成大环的连接体可以与表1-4所示的任何序列任意组合使用，也可以与本文表明的任何R-取代基任意组合使用。

表5：能够与巯基反应的反应性基团和产生的连接的例子

(1)X或Y	(2)产生的共价连接
		(3)丙烯酰胺	(4)硫醚
(5)卤化物(例如，烷基或芳基卤化物)	(6)硫醚
		(7)磺酸(sulfonate)	(8)硫醚
(9)氮丙啶(aziridine)	(10)硫醚

(11)环氧化物	(12)硫醚
		(13)卤代乙酰胺	(14)硫醚
(15)马来酰亚胺	(16)硫醚
		(17)磺酸酯(sulfonate ester)	(18)硫醚

表6显示本发明示例性的大环化合物。“N_L”表示正亮氨酸并替换甲硫氨酸残基。可以想到，可以基于表1至表4中公开的多肽序列使用类似的连接体来合成拟肽大环化合物。

表6：本发明的拟肽大环化合物的例子

在该表中示出的例子中，“N_L”代表正亮氨酸。

本发明包括天然存在的和非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物应用于式(III)的拟肽大环化合物的合成中。任何适合用来合成稳定的含双巯基的拟肽大环化合物的合成方法的氨基酸或氨基酸类似物都可以用于本发明中。例如，预计半胱氨酸是本发明中有用的氨基酸。但是，除了半胱氨酸之外，其他含有不同氨基酸侧链的含硫的氨基酸也是有用的。例如，半胱氨酸在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的末端-SH之间含有一个亚甲基单元。本发明也包括使用在α-碳和末端-SH之间具有多个亚甲基单元的氨基酸。非限制的例子包括α-甲基-L-高半胱氨酸和α-甲基-D-高半胱氨酸。在某些实施方式中，氨基酸和氨基酸类似物是D-构型。在其他实施方式中，它们是L-构型。在某些实施方式中，拟肽中包含的某些氨基酸和氨基酸类似物是D-构型，而某些氨基酸和氨基酸类似物是L-构型。在某些实施方式中，氨基酸类似物是α，α-二取代的，如α-甲基-L-半胱氨酸和α-甲基-D-半胱氨酸。

本发明包括其中形成大环的连接体用来连接拟肽前体中的两个或多个-SH部分以形成本发明的拟肽大环化合物的大环化合物。如上所述，形成大环的连接体赋予构象刚性、提高的代谢稳定性和/或提高的细胞渗透性。另外，在某些实施方式中，形成大环的连接稳定拟肽大环化合物的α-螺旋二级结构。形成大环的连接体具有式X-L₂-Y，其中，X和Y是如上定义的相同或不同的部分。X和Y二者都具有允许一个形成大环的连接体-L₂-使含有双巯基的拟肽前体双烷基化的化学特性。如上定义，连接体-L₂-包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基或亚杂环芳基或-R₄-K-R₄-，所有这些都可以任选地被如上定义的R₅基团取代。另外，除了连接含巯基氨基酸的-SH的碳之外，形成大环的连接体-L₂-中的1-3个碳原子任选地被杂原子如N、S或O替代。

形成大环的连接体X-L₂-Y的L₂部分在长度上可以根据尤其是用来形成拟肽大环化合物的两个氨基酸类似物的位置之间的距离而变化。另外，随着形成大环的连接体的L₁和/或L₃部分的长度发生变化，L₂的长度也可以变化以产生具有合适的总长度的连接体以形成稳定的拟肽大环化合物。例如，如果通过向L₁和L₃各添加另外的亚甲基单元来改变所使用的氨基酸类似物，那么L₂在长度上减少等同于大约两个亚甲基单元的长度，以抵消L₁和L₃的长度增加。

在某些实施方式中，L₂是式-(CH₂)_n-的亚烷基基团，其中，n是大约1至大约15之间的整数。例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其他实施方式中，L₂是亚烯基基团。在另外其他的实施方式中，L₂是芳基。

表7显示X-L₂-Y基团的另外的实施方式。

表7.本发明的示例性的X-L₂-Y基团

例如，该表中的X和Y各自独立地是Cl-、Br-或I-。

方案10：

在合成方案10中显示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含至少一个烯烃部分和炔烃部分，且通过液相或固相肽合成(SPPS)、使用市售的N-α-Fmoc保护的氨基酸和氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸的N-α-Fmoc保护形式来合成该前体。肽的游离N末端在6-庚烯酸的标准酰胺键形成条件下被酰化。通过使用钌催化的烯烃复分解反应(如美国专利5,811,515所述)，酰化基团的末端烯烃与内部氨基酸侧链的末端烯烃相交联。然后以常规条件(如强酸如95％TFA)将拟肽前体去保护，并从固相树脂上切下。

预计适用于进行本发明的形成拟肽大环化合物的另外的方法包括以下文献中公开的方法：Mustapa，M.Firouz Mohd等人，J.Org.Chem(2003)，68，第8193-8198页；Yang，Bin等人Bioorg Med.Chem.Lett.(2004)，14，第1403-1406页；美国专利5,364,851；美国专利5,446,128；美国专利5,824,483；美国专利6,713,280和美国专利7,202,332。在这样的实施方式中，使用在α-位置含有另外的R-取代基的氨基酸前体。这种氨基酸在需要的位置被掺入大环化合物前体中，其可以在交联连接体被取代的位置，或者，可选择地，在大环化合物前体序列中的其他位置。然后根据指定的方法实现前体的环化。

分析

例如，本发明的拟肽大环化合物的性质通过使用下面所述的方法进行分析。

测定α-螺旋度的分析

在溶液中，具有α-螺旋结构域的多肽的二级结构在随机卷曲结构和α-螺旋结构之间达到动态平衡，这通常称为“百分螺旋度”。因此，例如，未修饰的促细胞凋亡BH3结构域在溶液中主要是随机卷曲，α-螺旋含量通常低于25％。另一方面，具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非交联多肽至少2倍的α-螺旋度。在某些实施方式中，本发明的大环化合物具有高于50％的α-螺旋度。为了分析本发明的拟肽大环化合物(例如基于BH3结构域的大环化合物)的螺旋度，将化合物溶于水性溶液中(例如，pH 7的50mM磷酸钾溶液或蒸馏水，达到25-50μM的浓度)。使用标准测量参数(例如，温度，20℃；波长，190-260nm；步分辨率(step resolution)，0.5nm；速度，20nm/秒；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上获得圆二色性(CD)谱。通过将平均残基椭圆率(例如，[Φ]222obs)除以模型螺旋十肽的报道值(Yang等人(1986)，Methods Enzymol.130：208)来计算各个肽的α-螺旋含量。

测定熔解温度(Tm)的分析

含有二级结构(如α-螺旋)的本发明的拟肽大环化合物显示出例如比相应的非交联多肽更高的熔解温度。通常，本发明的拟肽大环化合物显示＞60℃的Tm，表明在水溶液中高度稳定的结构。为了分析大环形成对熔解温度的效应，将拟肽大环化合物或未修饰的肽溶于蒸馏水中(例如，到50μM的终浓度)，并且通过使用标准参数(例如，波长，222nm；步分辨率，0.5nm；速度，20nm/秒；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；温度上升速度，1℃/分钟；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上测量椭圆率在一定温度范围(例如，4-95℃)内的变化来测定Tm。

蛋白酶抗性分析

肽骨架的酰胺键易受到蛋白酶的水解，因而致使肽化合物在体内易于快速降解。但是，肽螺旋的形成通常包埋酰胺骨架，从而可以保护其免于蛋白水解裂解。本发明的拟肽大环化合物可以经受体外胰蛋白酶的蛋白水解以评价与相应的非交联多肽相比其降解速度的任何变化。例如，拟肽大环化合物和相应的非交联多肽与胰蛋白酶琼脂糖一起温育，并在各个时间点通过离心终止反应和随后进行HPLC注射以根据280nm处的紫外吸收定量残留的底物。简单地说，拟肽大环化合物和拟肽前体(5mcg)与胰蛋白酶琼脂糖(Pierce)(S/E～125)温育0、10、20、90和180分钟。通过台式离心机高速离心终止反应；通过基于HPLC的在280nm处的峰检测对分离的上清液中残余的底物进行定量。蛋白水解反应显示出一级动力学，且速率常数k由ln[S]相对于时间的曲线确定(k＝-1X斜率)。

体外稳定性分析

具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非交联多肽至少2倍的体外半衰期，且具有12小时或更长的体外半衰期。对于体外血清稳定性研究，可以使用多种分析方法。例如，将拟肽大环化合物和/或相应的非交联多肽(2mcg)各与新鲜的小鼠、大鼠和/或人血清(如1-2mL)一起在37℃下温育0、1、2、4、8和24小时。不同大环化合物浓度的样品可通过用血清系列稀释制备。为了测定完整化合物的含量，可以使用下面的程序：通过将100μl的血清转移到2ml离心管中，接着加入10μL的50％甲酸和500μL乙腈并在4±2℃下以14,000RPM离心10分钟来提取样品。然后将上清液转移到新的2ml管中，并在N₂＜10psi、37℃下在Turbovap上蒸发。样品在100μL的50∶50乙腈∶水中重构，并进行LC-MS/MS分析。等同或类似的体外稳定性测试方法是已知的，并可用于确定血清中大环化合物的稳定性。

体外结合分析

为了评价拟肽大环化合物和拟肽前体与受体蛋白(acceptor protein)的结合和亲和力，使用例如荧光偏振分析(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附着在具有高表观分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如，FITC)与附着在较小分子上(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)的荧光示踪剂相比具有较慢的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。

例如，在室温下，荧光标记的(fluoresceinated)拟肽大环化合物(25nM)与受体蛋白(25-1000nM)在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测量结合活性。可以使用例如Graphpad Prism软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。在某些情况下，本发明的拟肽大环化合物显示出与相应的非交联多肽类似的或更低的Kd。

BH3肽的受体蛋白如BCL-2、BCL-X_L、BAX或MCL1可例如用于本分析中。p53肽的受体蛋白如MDM2或MDMX也可用在本分析中。

鉴定肽-蛋白质相互作用的拮抗剂的体外置换分析

为了评价拮抗肽(如BH3肽或p53肽)与受体蛋白之间的相互作用的化合物的结合和亲和力，例如，使用利用源自拟肽前体序列的荧光标记的拟肽大环化合物的荧光偏振分析(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附着在具有高表观分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如，FITC)与附着在较小分子(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂相比具有较低的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。拮抗荧光标记的拟肽大环化合物与受体蛋白之间的相互作用的化合物在竞争性结合FPA实验中进行检测。

例如，在室温下，假定的拮抗剂化合物(1nM-1mM)和荧光标记的拟肽大环化合物(25nM)与受体蛋白(50nM)一起在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测量拮抗剂的结合活性。使用例如Graphpad Prism软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。

在该分析中任一类型的分子(如有机小分子、肽、寡核苷酸或蛋白质)可以作为假定的拮抗剂进行检验。BH3肽的受体蛋白如BCL-2、BCL-X_L、BAX或MCL1可用于本分析中。p53肽的受体蛋白如MDM2或MDMX也可用在本分析中。

完整细胞中的结合分析

有可能通过免疫沉淀实验测量肽或拟肽大环化合物与完整细胞中其天然受体的结合。例如，完整的细胞与荧光标记的(FITC-标记的)化合物在无血清的情况下温育4小时，接着进行血清置换和进一步温育4-18小时。然后使细胞沉淀，并在4℃下、在裂解缓冲液(50mM Tris[pH 7.6]、150mM NaCl、1％的CHAPS和蛋白酶抑制剂混合物)中温育10分钟。以14,000rpm离心提取物15分钟，收集上清液，并与10μl山羊抗-FITC抗体一起温育2小时，在4℃下旋转，接着在4℃下进一步与蛋白A/G Sepharose(50μl的50％微球浆(bead slurry))温育2小时。快速离心之后，在含有增加的盐浓度(例如，150、300、500mM)的裂解缓冲液中洗涤沉淀物。随后在加入含有SDS的样品缓冲液和煮沸之前，以150mM NaCl再平衡微球。离心之后，使用4％-12％梯度的Bis-Tris凝胶任选地对上清液进行电泳，接着转移到Immobilon-P膜上。封闭之后，任选地将印迹与检测FITC的抗体一起温育，也与一种或多种检测与拟肽大环化合物结合的蛋白质(包括BCL2、MCL1、BCL-XL、A1、BAX、BAK、MDM2或MDMX)的抗体一起温育。

细胞渗透性分析

相比于相应的非交联的多肽，拟肽大环化合物例如具有更好的细胞透过性。在一些实施方式中，拟肽大环化合物与相应的非交联的多肽相比具有更好的细胞透过性。具有优化连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非交联的多肽至少2倍的细胞渗透性，并且通常观察到20％或更多的应用的拟肽大环化合物在4小时后已渗透入细胞。为了测量拟肽大环化合物和相应的非交联的多肽的细胞渗透性，在37℃下在不含血清的培养基中将完整的细胞与荧光标记的拟肽大环化合物或相应的非交联的多肽(10μM)一起温育4小时，用培养基洗涤2次，并在37℃下与胰蛋白酶(0.25％)温育10分钟。再次洗涤细胞并将其再悬浮于PBS中。例如，通过使用FACSCalibur流式细胞仪或Cellomics’KineticScan

HCS阅读仪分析细胞荧光。

细胞效力分析

例如，在基于细胞的杀伤分析中，使用多种致瘤和非致瘤的细胞系及源自人类或小鼠细胞群体的原代细胞测定某些拟肽大环化合物的效力。例如，在与拟肽大环化合物(0.5-50μM)一起温育的24-96小时期间监测细胞的存活力，以鉴定那些以EC₅₀＜10μM杀死细胞的化合物。测量细胞存活力的几种标准分析方法是可通过商业途径得到的，并任选地用来评价拟肽大环化合物的效力。另外，测量膜联蛋白V(Annexin V)和胱天蛋白酶(caspase)活化的分析方法任选地用来评价拟肽大环化合物是否通过激活凋亡机制杀死细胞。例如，使用Cell Titer-glo分析来确定随细胞内ATP浓度变化的细胞活力。

体内稳定性分析

为了研究拟肽大环化合物的体内稳定性，例如，向小鼠和/或大鼠通过IV、IP、PO或吸入途径以0.1-50mg/kg的浓度施用化合物，并在注射后0′、5′、15′、30′、1小时、4小时、8小时和24小时抽取血样。然后如上通过LC-MS/MS测量25μL新鲜血清中的完整化合物的含量。

动物模型中的体内效力

为了确定本发明的拟肽大环化合物在体内的抗致癌活性，例如，化合物单独施用(IP、IV、PO、通过吸入或鼻途径)或与亚最佳剂量的相关化学治疗剂(例如，环磷酰胺、阿霉素、依托泊苷)联合施用。在一个实施例中，在NOD-SCID小鼠遭受全身辐射3小时后，通过尾静脉注入稳定表达萤光素酶的5x10⁶RS4；11细胞(从急性淋巴细胞性白血病患者的骨髓建立)。如果不予处理，在这一模型中这种形式的白血病在3周内是致命的。例如，通过对小鼠注射D-萤光素(60mg/kg)并对麻醉的动物成像(例如，Xenogen In Vivo Imaging System，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)很容易地监测该白血病。通过Living Image Software(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)进行光子通量(photonic flux)(光子/秒)的积分(integration)对全身生物发光量进行定量。例如，拟肽大环化合物单独或与亚最佳剂量的相关化学治疗剂联合通过尾静脉或IP途径以0.1mg/kg-50mg/kg的剂量在7-21天的时间内向白血病小鼠施用(注射/实验的第1天之后10天，14-16的生物发光范围)。任选地，在整个实验过程中每隔一天对小鼠成像，并在实验期间每天监测其存活。在实验结束时任选地对死亡的小鼠进行尸体检查。另一种动物模型是将稳定表达萤光素酶的DoHH2(源自人类滤泡性淋巴瘤的细胞系)植入到NOD-SCID小鼠中。这些体内试验任选地产生初步的药代动力学、药效学和毒理学数据。

临床试验

为了确定本发明的拟肽大环化合物对于人类治疗的适用性，进行了临床试验。例如，选择出诊断为患有癌症并需要治疗的患者并将他们分成治疗组和一个或多个对照组，其中，对治疗组施用本发明的拟肽大环化合物，而对照组接受安慰剂或已知的抗癌药物。这样，可以通过对患者组就诸如生存率和生活质量的因素进行比较来评价本发明的拟肽大环化合物的治疗安全性和有效性。在这个例子中，相比于用安慰剂治疗的患者对照组，用拟肽大环化合物治疗的患者组显示提高的长期生存率。

药物组合物和给药途径

施用方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、大脑内、阴道内、透皮、直肠、经吸入或局部施用到耳、鼻、眼睛或皮肤。

本发明的拟肽大环化合物也包括其药学上可接受的衍生物或前药。“药学上可接受的衍生物”指本发明的化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、前药或其他衍生物，其在向接受者施用后能够提供(直接或间接地)本发明的化合物。当向哺乳动物施用时，尤其有利的药学上可接受的衍生物可以提高本发明的化合物的生物利用度(例如，通过提高口服施用的化合物进入血液的吸收)，或相对于母体物质增加活性化合物向生物区室(例如，脑或淋巴系统)的递送。一些药学上可接受的衍生物包含提高水溶性或跨过胃肠粘膜的主动转运的化学基团。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物通过共价或非共价地连接的合适的官能团修饰，以提高选择性的生物学性质。这样的修饰包括那些提高进入特定生物区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物学渗透性、提高口服利用度、增加溶解性以允许注射施用、改变代谢以及改变排泄率的修饰。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包括那些由药学上可接受的无机和有机酸和碱衍生的盐。合适的酸式盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐(undecanoate)。由合适的碱衍生的盐包括碱金属盐(例如，钠盐)、碱土金属盐(例如，镁盐)、铵盐和N-(烷基)₄ ⁺盐。

为了由本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体包括固体或液体载体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以作为稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料发挥作用。在科学文献和专利文献中详细描述了配制和给药技术的细节，参见，例如，最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Maack Publishing Co，Easton PA。

在粉剂中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性成分混合。在片剂中，活性成分与具有必要粘合性质的载体按照适当的比例混合，并压制成需要的形状和大小。

合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶和黄蓍胶；以及蛋白质，如明胶和胶原蛋白。如果需要的话，加入崩解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。

液体形式的制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如，水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可以在聚乙二醇水溶液中配制成溶液。本文所用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内和皮下施用的给药模式。

药物制剂优选为单位剂型。在这样的形式中，制剂细分为含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，该包装包含不连续量的制剂，如包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。另外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可以是适当数目的包装形式的这些剂型中的任一种。

当本发明的组合物包含拟肽大环化合物和一种或多种另外的治疗剂或预防剂的组合时，该化合物和另外的药剂都应该以通常在单一治疗方案中施用的剂量的大约1-100％的剂量水平，更优选大约5-95％的剂量水平存在。在某些实施方式中，另外的药剂作为多剂量方案的一部分与本发明的化合物分开施用。或者，这些药剂是单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明的化合物混合在一起。

使用方法

一方面，本发明提供了新的拟肽大环化合物，其可在竞争性结合分析中用于鉴别结合拟肽大环化合物模拟的蛋白质或肽的天然配体的物质。例如，在p53 MDM2系统中，基于p53的标记的稳定的拟肽大环化合物与竞争结合MDM2的小分子一起用于MDM2结合分析中。竞争结合研究允许在体外快速评价并确定对于p53/MDM2系统特异性的药物候选物。同样，在BH3/BCL-X_L抗细胞凋亡系统中，基于BH3的标记的拟肽大环化合物能够与竞争结合BCL-X_L的小分子一起用于BCL-X_L结合分析中。竞争结合研究允许在体外快速评价并确定对于BH3/BCL-X_L系统特异性的药物候选物。本发明进一步提供了抗拟肽大环化合物的抗体的生成。在某些实施方式中，这些抗体特异性地结合拟肽大环化合物和衍生出该拟肽大环化合物的p53或BH3拟肽前体。例如，这样的抗体分别破坏p53/MDM2或BH3/BCL-XL系统。

在其他方面，本发明提供了治疗处于患与BCL-2家族成员的异常(例如，不足或过量)表达或活性(例如外来或内在细胞凋亡途经异常)有关的疾病的危险中(或易感)或患有所述疾病的受试者的预防方法和治疗方法。据认为，一些BCL-2类型疾病至少部分是由于一个或多个BCL-2家族成员的异常水平(如过度表达或不足表达)引起的，或是由于存在一个或多个显示异常活性的BCL-2家族成员引起的。这样，BCL-2家族成员的水平和/或活性的降低或者BCL-2家族成员的水平和/或活性的提高用来例如缓解或减轻疾病的不利症状。

另一方面，本发明提供了通过干扰肿瘤细胞中的p53和MDM2之间的相互作用或结合来治疗或预防过度增生性疾病的方法。这些方法包括向包括人类的温血动物或者向包含野生型p53的肿瘤细胞施用有效量的本发明的化合物。在某些实施方式中，本发明的化合物的施用诱导细胞生长停滞或细胞凋亡。在其他或进一步的实施方式中，本发明被用于治疗具有升高的MDM2水平的疾病和/或肿瘤细胞。MDM2的升高的水平在本文中是指通过ELISA和类似分析测定，比包含多于正常拷贝数(2)的mdm2的细胞中存在的MDM2水平更高的MDM2水平或每细胞大于大约10,000个MDM2分子的MDM2水平(Picksley等人(1994)，Oncogene 9，2523 2529)。

如本文所用，术语“治疗”定义为向患者应用或施用治疗剂，或者向从患者分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者患有疾病、疾病症状或具有患病倾向，目的是治愈、恢复、减轻、解除、改变、矫正、缓解、改善或影响疾病、疾病症状或患病倾向。

在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物用来治疗、预防和/或诊断癌症和肿瘤性病症。如本文所用，术语“癌症”、“过度增殖的”和“肿瘤性的”指具有自发生长能力的细胞，即，以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或疾病。过度增殖性的和肿瘤性的疾病状态可以分类为病理性的，即，表现或构成疾病状态；或者可以分类为非病理性的，即，偏离正常但与疾病状态无关。该术语意味着包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性的组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理类型或侵入的阶段无关。转移性肿瘤可以由许多原发性肿瘤类型产生，包括但不限于：乳腺、肺、肝、结肠和卵巢源的肿瘤类型。“病理性过度增殖”细胞出现于以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态中。非病理性过度增殖细胞的例子包括与创伤修复有关的细胞增殖。细胞增殖和/或分化疾病的例子包括癌症，例如，癌瘤、肉瘤或转移性疾病。在某些实施方式中，拟肽大环化合物是用于控制乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、这些癌症的转移等的新的治疗剂。

癌症或肿瘤病症的例子包括但不限于：纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食道癌、直肠癌、胰癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。

增殖性疾病的例子包括造血系统肿瘤性疾病。如本文所用，术语“造血系统肿瘤性疾病”包括涉及造血系统起源的(例如，源自骨髓、淋巴或红细胞谱系的)增生性/肿瘤性细胞或其前体细胞的疾病。优选地，疾病起因于分化不良的急性白血病，例如，成红细胞白血病和急性巨核母细胞性白血病。另外的示例性的骨髓疾病包括但不限于：急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)(综述见于Vaickus(1991)，Crit Rev.Oncol./Hemotol.11：267-97)；淋巴恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，包括B-谱系ALL和T-谱系ALL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。其他形式的恶性淋巴瘤包括但不限于：非何杰金氏淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞性淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、何杰金氏病和里德-斯特恩伯格病。

乳腺的细胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：增殖性乳腺疾病，包括，例如，上皮细胞增生、硬化性腺病和小管乳头状瘤；肿瘤，例如，如纤维腺瘤、叶状肿瘤和肉瘤的基质肿瘤，和如大管乳头状瘤的上皮肿瘤；乳腺的癌，包括原位(非侵袭性)癌(包括原位导管癌(包括佩吉特病)和原位小叶癌)和侵袭性(浸润性)癌(包括但不限于，侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、髓样癌、胶样(粘液)癌、管状癌和侵袭性乳头状癌)；和混杂性的恶性肿瘤。男性乳房疾病包括但不限于男性乳房发育症和癌。

肺的细胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：支气管癌，包括副肿瘤综合征、细支气管肺泡癌、神经内分泌肿瘤，例如，支气管类癌瘤、混杂性的肿瘤和转移的肿瘤；胸膜的病状包括炎性胸腔积液、非炎性胸腔积液、气胸和胸膜肿瘤(包括孤立性纤维性肿瘤(胸膜纤维瘤)和恶性间皮瘤)。

结肠的细胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：非肿瘤性息肉、腺瘤、家族性综合征(familial syndromes)、结肠直肠癌形成、结肠直肠癌和类癌肿瘤。

肝的细胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：结节性增生、腺瘤和恶性肿瘤，包括肝的原发癌和转移性的肿瘤。

卵巢的细胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：卵巢肿瘤，例如，体腔上皮肿瘤、浆液性肿瘤、粘液瘤、子宫内膜样瘤、透明细胞腺癌、囊腺纤维瘤、布伦纳瘤、表面上皮性肿瘤；生殖细胞瘤，例如，成熟(良性)畸胎瘤、单胚层畸胎瘤、不成熟的恶性畸胎瘤、无性细胞瘤、内胚窦瘤、绒膜癌；生殖索-间质肿瘤(sex cord-stomal tumors)，例如，粒层-卵泡膜细胞瘤、泡膜细胞纤维瘤(thecomafibromas)、男性母细胞瘤(androblastomas)、希尔细胞瘤(hill cell tumors)和性腺母细胞瘤；和如克鲁肯贝格瘤的转移瘤。

在其他或进一步的实施方式中，本文所述的拟肽大环化合物用于治疗、预防或诊断以过度活跃的细胞死亡或由于生理损害导致的细胞死亡等为特征的状态。特征为过早的或不希望的细胞死亡或者不需要的或过度的细胞增殖的状态的一些例子包括但不限于细胞减少的/细胞减生的、非细胞的/再生障碍的或过多细胞的/增生性的状态。一些例子包括血液系统疾病，包括但不限于范可尼贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血(thalaessemia)、先天性中性白细胞减少、脊髓发育不良。

在其他或进一步的实施方式中，起到减少细胞凋亡的作用的本发明的拟肽大环化合物用于治疗与不需要的细胞死亡水平有关的病症。因此，在某些实施方式中，本发明的抗凋亡的拟肽大环化合物用来治疗诸如那些与病毒感染(例如，与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染有关的感染)有关的导致细胞死亡的病症。许多种神经系统疾病特征在于特定集合的神经元的逐渐损失，且在一些实施方式中，在这些疾病的治疗中，使用本发明的抗细胞凋亡的拟肽大环化合物。这些疾病包括阿尔茨海默氏症、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、视网膜色素变性、脊髓性肌萎缩症和各种形式的小脑变性。这些疾病中的细胞损失不引发炎症反应，且细胞凋亡似乎是细胞死亡的机制。此外，许多血液系统疾病与血细胞产生的减少有关。这些病症包括与慢性疾病有关的贫血、再生障碍性贫血、慢性中性粒细胞减少和骨髓发育异常综合征。血细胞产生的病症(如骨髓发育异常综合征和某些形式的再生障碍性贫血)与骨髓内的凋亡性细胞死亡的增加有关。这些病症可能由促进细胞凋亡的基因活化、基质细胞或造血存活因子的获得性缺陷、或毒素和免疫应答介质的直接作用而产生。与细胞死亡有关的两种常见的病症是心肌梗塞和中风。在这两种病症中，缺血(血流急性丧失事件中产生的)中心区域中的细胞似乎由于坏死而迅速死亡。然而，在缺血中心区域以外，细胞在更长的时期内死亡，且形态上表现为由于细胞凋亡而死亡。在其他或进一步的实施方式中，本发明的抗凋亡的拟肽大环化合物用于治疗所有与不希望的细胞死亡有关的病症。

使用本文所述的拟肽大环化合物治疗的免疫疾病的一些例子包括但不限于器官移植排斥、关节炎、狼疮、IBD、克罗恩氏病、哮喘、多发性硬化症、糖尿病等。

用本文所述的拟肽大环化合物治疗的神经病症的一些例子包括但不限于阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、荷兰型遗传性脑出血的淀粉样变性、反应性淀粉样变性、伴有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样肾病、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells Syndrome)、特发性骨髓瘤；巨球蛋白血症相关的骨髓瘤、家族性淀粉样多发性神经病、家族性淀粉样心肌病、分离的心脏淀粉样蛋白(Isolated Cardiac Amyloid)、全身性老年淀粉样变性、成人发病型糖尿病、胰岛瘤、分离的前房淀粉样蛋白(Isolated Atrial Amyloid)、甲状腺的髓样癌、家族性淀粉样变性、具有淀粉样变性的遗传性脑出血、家族性淀粉样变性多发性神经病(Familial Amyloidotic Polyneuropathy)、瘙痒病、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jacob Disease)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克(Gerstmann Straussler-Scheinker)综合征、牛海绵状脑炎、朊病毒介导的疾病和亨廷顿氏病。

使用本文描述的拟肽大环化合物治疗的内分泌疾病的一些例子包括但不限于糖尿病、甲状腺功能减退、垂体功能减退、甲状旁腺功能减退、性腺功能减退等。

用本文所述的拟肽大环化合物治疗或预防的心血管病症(例如，炎性病症)的一些例子包括但不限于动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、血栓形成、动脉瘤、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛、心源性猝死、高血压性心脏病；非冠状血管疾病如小动脉硬化、小血管疾病、肾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高脂血症、黄瘤症、哮喘、高血压、肺气肿和慢性肺疾病；或与介入过程(“过程性血管创伤”)相关的心血管病症，如血管成形术和分流管、支架、合成或天然的切除移植物、留置导管、阀或其他可植入装置的放置之后的再狭窄。优选的心血管疾病包括动脉粥样硬化、心肌梗塞、动脉瘤和中风。

实施例

下面的部分提供本发明的示例性实施例。

实施例1.本发明的拟肽大环化合物的合成

α螺旋BID、BIM和p53拟肽大环化合物如前所述被合成、纯化和分析(Walensky等人(2004)Science 305：1466-70；Walensky等人(2006)Mol Cell 24：199-210；Bernal等人(2007)J.Am Chem Soc.9129，2456-2457)，并在下面表述。用于本研究中的大环化合物如图1所示。对应的未交联的多肽表示本发明的拟肽大环化合物的天然对应物。

包含烯烃侧链的α，α-二取代的非天然氨基酸根据Williams等人(1991)J.Am.Chem.Soc.113：9276；Schafmeister等人(2000)J.Am.Chem Soc.122：5891和Verdine等人PCT WO 2008/121767所述合成。拟肽大环化合物是通过使用相应的合成氨基酸替换两个或更多个天然存在的氨基酸(参见图1)设计的。在i和i+4或i和i+7位置进行置换。大环化合物通过固相肽合成、然后通过它们的含烯烃侧链进行基于烯烃复分解的合成氨基酸交联而产生。

在所示序列中使用了以下的缩写：“Nle”代表正亮氨酸，“Aib”代表2-氨基异丁酸，“Ac”代表乙酰基，且“Pr”代表丙酰基。“$”表示的氨基酸是由包含一个双键的全碳i至i+4交联体连接的α-Me S5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。“$r5”表示的氨基酸是由包含一个双键的全碳i至i+4交联体连接的α-Me R5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。“$s8”表示的氨基酸是由包含一个双键的全碳i至i+7交联体连接的α-Me S8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。“$r8”表示的氨基酸是由包含一个双键的全碳i至i+7交联体连接的α-Me R8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。“St”表示的氨基酸连接两个全碳交联体(S-5/R-5双-戊烯基氨基酸)。“Hep”表示的氨基酸是烯烃交联的N末端庚烯酸。交联体是在各个氨基酸的α碳之间包含8或11个碳原子的线性全碳交联体。

非天然氨基酸(5-碳烯属氨基酸的R和S对映异构体和8-碳烯属氨基酸的S对映异构体)由核磁共振(NMR)光谱法(Varian Mercury 400)和质谱法(Micromass LCT)进行鉴定。肽的合成使用固相条件、rink amide AM树脂(Novabiochem)和Fmoc主链保护基化学作用手动地或在自动肽合成仪(Applied Biosystems，model 433A)上进行。对于天然的Fmoc保护的氨基酸(Novabiochem)的偶联，使用10当量的氨基酸和1∶1∶2摩尔比的偶联试剂HBTU/HOBt(Novabiochem)/DIEA。非天然的氨基酸(4当量)利用1∶1∶2摩尔比的HATU(Applied Biosystems)/HOBt/DIEA进行偶联。在固相中，使用溶于脱气二氯甲烷中的10mM的Grubbs催化剂(Blackewell等人1994，同上)(Strem Chemicals)进行烯烃复分解反应，并在室温下反应2小时。通过三氟乙酸介导的去保护和切割实现复分解的化合物的分离，通过醚沉淀产生粗产物，和在反相C18柱(Varian)上进行高效液相(HPLC)(Varian ProStar)以产生纯化合物。通过LC/MS质谱(Micromass LCT，与Agilent 1100 HPLC系统连接)和氨基酸分析(Applied Biosystems，420A型)确认纯产物的化学组成。

实施例2.N末端交联的SP-18和SP19大环化合物的合成

从4-(2’4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰基氨基甲基交联的聚苯乙烯树脂(Rink AM树脂)开始在Thuramed Tetras自动多通道肽合成仪上延长肽。使用基于芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护的标准固相方案，并使用2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)作为偶联剂(5eq)偶联氨基酸(5eq)。在自动化方法中，对于所有的氨基酸使用双偶联，除了对于α甲基化的Fmoc保护的烯烃氨基酸使用较长的反应时间进行单偶联以外。将最终的氨基酸添加到肽中以后，除去Fmoc基团，并使用10％DIEA中的乙酸酐对游离胺进行酰化。如上在树脂(0.5mmol，基于初始树脂上样)上组装线性肽，从而引入理想的Fmoc保护的烯烃氨基酸。偶联最后一个氨基酸后，通过上述方法使用6-庚烯酸(5eq)酰化N末端。用DCM洗涤树脂。减压干燥树脂，并在Grubbs I催化剂的无水DCM溶液(20mL，4mg/mL，0.02mmol)中吸收。18小时候，过滤反应物，用DCM洗涤树脂。重复烯烃复分解步骤，直到起始物被全部消耗。同时从树脂上切下环化的肽，并通过使用三氟乙酸(TFA)(93.5％)、水(2.5％)、三异丙基硅烷(TIPS)、(2.5％)和乙二硫醇(EDT)(2.5％)的溶液(15mL)处理树脂来除去侧链上的保护基。4小时后加入冷的二乙基醚(200mL)。离心混合物，并倾倒上清液。将沉淀悬浮在1∶1的乙腈/水(50mL)中并冷冻干燥。使用C₁₈反向HPLC纯化粗制肽，以乙腈和水(含0.1％TFA)作为流动相。合并包含理想的肽的级分。在50∶50 乙腈∶HCl(水溶液)(60mN，然后10mN)中冷冻干燥该级分两次，并在50∶50 乙腈∶水中冷冻干燥该级分一次，得到无色固体的SP18或SP19(SP18：16mg，SP19：32mg)。

实施例3.样品和标准曲线的制备：

对于体内血浆稳定性研究，将50μL于DMSO中的10mM各大环化合物与9950μL的大鼠血浆(1∶200 v/v)合并，并涡旋混合(4分钟)。用大鼠血浆连续稀释该储备液，得到9个标准(20-20,000或100-50,000ng/mL范围)。用空白血浆10∶1或5∶1稀释高浓度(早期的时间点)的测试样品。将所有的样品(包括血浆空白)与血浆内标肽1∶1 v/v合并。

实施例4.药代动力学分析

将本发明的拟肽大环化合物溶解在5％的DMSO/D5W中制备IV剂量制剂，获得10mg/Kg/剂量。在这些研究中使用插管的Crl:CD

(SD)雄性大鼠(7-8周龄，Charles River Laboratories)。经股静脉插管施用静脉剂量，动物每次注射给药10mL/kg剂量。在10个时间点(用药后0.0833，0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时)采集用于药代动力学分析的血液。最后的样品采集后杀死动物(不用验尸)。

在～4℃下离心(～1500xg)全血样品10分钟。在血液收集/离心的30分钟内制备血浆并转移至新鲜的试管中，该试管被冷冻并储存在黑暗中～-70℃直到它们准备用于LC-MS/MS分析。

样品的提取例如通过以下步骤来实现：向100μL的血浆(样品或标准)中加入10μL的50％蚁酸、然后涡旋10秒钟。加入500μL的乙腈，然后涡旋2分钟，并在～4℃下以14,000rpm离心10分钟。将上清液转移到干净的试管中，在37℃下以＜10psi在turbovap上进行蒸发。LC-MS/MS分析前，使用100μL的50∶50 乙腈∶水重建样品。

从血浆浓度数据计算血浆浓度峰值(C_max)、达到血浆浓度峰值所需的时间(t_max)、血浆终末半衰期(t_1/2)、血浆浓度时间曲线下的面积(AUC)、分布的清除率和容积。使用WinNonlin版本4.1(Pharsight Corp)，通过非房室分析，完成所有的药代动力学的计算。对本发明的拟肽大环化合物的该分析的结果示于图2中。

使用以下的LC-MS/MS方法。简而言之，使用的LC-MS/MS仪器是API 365(Applied Biosystems)。分析柱是Phenomenex Synergi(4μ，Polar-RP，50mmx2mm)，流动相A(0.1％蚁酸水溶液)和B(0.1％蚁酸的甲醇溶液)以0.4ml/min的流速泵流，以获得以下的梯度：

时间(min)	％B
		0	15
0.5	15
		1.5	95
4.5	95
		4.6	15
8.0	停止

MRM：814.0-374.2(正离子化)

实施例5.对血清蛋白的表观亲和力的测定(Kd ^* )。

通过EC50偏移分析测量血清蛋白的表观kd值提供了定量实验化合物结合血清白蛋白和其他血清蛋白的倾向的简单而快速的方法。在存在血清蛋白的情况下的表观EC₅₀(EC′₅₀)和添加到体外分析中的血清蛋白的量之间存在线性关系。该关系通过该化合物对血清蛋白的结合亲和力定义，表示为Kd^*。该项是经实验确定的表观解离常数，其可从多个实验上不可区分的结合事件的累积效应产生。这一关系的形式在这里以Eq.(1)表示，其推导可见Copeland等人，Biorg.Med Chem Lett.2004，14：2309-2312。

$\left(1\right)---{{\mathrm{EC}}^{\′}}_{50}={\mathrm{EC}}_{50}+P\left(\frac{n}{1+\frac{{K_d}^{*}}{{\mathrm{EC}}_{50}}}\right)$

很大比例的血清蛋白结合可以归因于药物与血清白蛋白的相互作用，这是由于该蛋白在血清中的浓度非常高(35-50g/L或530-758μM)。为了计算这些化合物的Kd值，我们假定加入蛋白时EC50的偏移可完全归因于加入的血清中存在的血清白蛋白，其中对于100％的血清，P为700μM，对于10％的血清，P是70μM，等等。我们还做出了简化假设，即所有的化合物与血清白蛋白以1∶1的化学计量比结合，从而Eq.(1)中的项n被固定一致(unity)。通过使这些参数处于适当的位置，我们使用Mathematica 4.1(Wolfram Research，Inc.，www.wolfram.com)、通过Eq.1的非线性回归分析由随着血清(和血清蛋白)浓度的增加的EC50值变化计算各个交联多肽的Kd^*值。通过将Eq.1中的P设定为700μM[血清白蛋白]来估算全血中的EC′50值。

使用如由Trainor，Expert Opin.Drug Disc.，2007，2(1)：51-64推导的以下等式来估算血液中的游离分数，其中血清白蛋白总浓度(例如[HSA]_总)被设定为700μM。下式可以使用任意类型的血清白蛋白，包括大鼠血清白蛋白：

实施例6.α螺旋度的确定

两小瓶(1.0mg)的各个样品溶解在50％乙腈/50％水中，终浓度为1.0mg/ml。将100μL或约0.1mg的各个样品等分到各个小瓶中。取三份30μL的样品用于氨基酸分析。所有的样品冷冻干燥过夜，然后存储在-20℃。将样品稀释到几个不同的浓度(1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml)，然后将其置于不同通路长度的小室内(1.0mm、2.0mm、5.0mm和10.0mm)。视觉观察所有样品的残渣，在5℃下扫描各个样品，以确定对于稳定性理想的通路长度和浓度。样品以0.05mg/ml在20mM磷酸pH 2.0缓冲液中可溶。在10.0mm CD小室内，在该缓冲液条件(温和缓冲液-20mM磷酸pH2.0)下进行所有的扫描和温度熔解(temperature melt)。使用Spectra Manager软件包，在Jasco J-815分光偏振计上运行所有的样品。将样品溶解在2.0mL温和缓冲液(表示为0％TFE)或包含5％、10％、15％、20％或50％的三氟乙醇(TFE)的缓冲液(来自Sigma-Aldrich，目录T63002)中。在5℃下从250nm至190nm运行CD扫描。每0.2nm收集数据。每个CD扫描前运行适当的缓冲液空白，并从各运行中减去缓冲液。在5℃-80℃下运行温度熔解后紧接着进行80℃-5℃的逆向熔解。每0.2度收集数据。在Agilent 1100 HPLC上使用AccQ Tag系统(Waters，Milford，MA)进行氨基酸分析。简而言之，通过向各等分试样中加入200uL的6M HCl并在110℃加热样品24小时来水解肽等分试样。然后真空干燥样品，并将得到的残留物重新悬浮在200uL的200mM HCl中。使用AccQ Tag Chemistry试剂盒中提供的试剂，用喹啉部分衍生化20uL水解产物中的各游离氨基酸。使用HPLC、定制梯度和定制柱来分离用于各水解产物样品的单个氨基酸，并在254nm通过UV测量各个氨基酸的丰度。乙酸钠缓冲液pH 5.05和60/40(v/v)乙腈/水是运行缓冲液。通过将各个峰的面积与各氨基酸的量已知的一组标准相比，确定各个水解产物样品中存在的各氨基酸的绝对量。使用各肽的序列，通过样品中丙氨酸或亮氨酸的量来确定肽的浓度。将所有的数据输入并储存在Excel文档中，其中计算了百分螺旋度、摩尔椭圆率或AAA的浓度。通过将各交联肽在0％TFE中的摩尔椭圆率(222nm)除以亲本肽在50％TFE中的摩尔椭圆率(222nm)(假定亲本肽在50％TFE中是100％螺旋的)，得到水溶液中的百分螺旋度。

虽然本文已显示和描述了本发明的优选实施方式，对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施方式只是以举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员可以想到许多变型、改变和替换。应该理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明的实施方式的各种替代方式。意图的是下列权利要求限定本发明的范围，且这些权利要求范围内的方法和结构及其等效形式也包括在本发明内。

Claims (71)

1.一种通过设置一个或多个交联来延长螺旋多肽的体内半衰期的方法，其中所述多肽的体内半衰期与缺乏所述交联的相应多肽相比延长至少50倍。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述螺旋多肽的体内半衰期平均延长至少50倍。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述螺旋多肽的体内半衰期延长至少100倍。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述螺旋多肽的体内半衰期延长至少150倍。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述螺旋多肽的体内半衰期延长至少200倍。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述交联中的至少一个连接两个α碳原子。

7.如权利要求1所述的方法，其中一个交联所连接的一个α碳原子被式R-取代基取代。

8.如权利要求7所述的方法，其中一个交联所连接的两个α碳原子被独立的式R-取代基取代。

9.如权利要求7所述的方法，其中R-是烷基。

10.如权利要求7所述的方法，其中R-是甲基。

11.如权利要求1所述的方法，其中一个交联设置在所述螺旋多肽中。

12.如权利要求1所述的方法，其中两个交联设置在所述螺旋多肽中。

13.如权利要求1所述的方法，其中一个交联是由连续的碳-碳键形成的。

14.如权利要求1所述的方法，其中一个交联包含至少8个连续的键。

15.如权利要求1所述的方法，其中一个交联包含9个连续的键。

16.如权利要求1所述的方法，其中一个交联包含12个连续的键。

17.如权利要求1所述的方法，其中一个交联包含至少7个碳原子。

18.如权利要求1所述的方法，其中一个交联包含至少10个碳原子。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述交联的多肽包含BCL-2家族成员的α螺旋结构域。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述交联的多肽包含BH3结构域。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述交联的多肽包含表1、2、3或4中一序列的至少60％。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述交联的多肽包含表1、2、3或4中一序列的至少80％。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述交联的多肽通过能量依赖性过程穿透细胞膜并结合细胞内靶标。

24.如权利要求1所述的方法，其中选择所述交联的多肽，使得所述交联的多肽的表观血清结合亲和力(Kd^*)是1微摩尔或更高。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述交联的多肽的Kd^*是1-700微摩尔。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述交联的多肽的Kd^*是1-70微摩尔。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述交联的多肽的Kd^*是1-10微摩尔。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述交联的多肽的Kd^*是3、10、70微摩尔或更高。

29.如权利要求1所述的方法，其中选择所述交联的多肽，使得其估计的人血液中的游离分数为0.1-50％。

30.如权利要求1所述的方法，其中选择所述交联的多肽，使得其估计的人血液中的游离分数为0.15-10％。

31.一种包含一个或多个交联的螺旋多肽，其中所述交联的螺旋多肽的体内半衰期比缺乏所述交联的相应多肽长至少50倍。

32.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的螺旋多肽的体内半衰期比缺乏所述交联的相应多肽长至少100倍。

33.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的螺旋多肽的体内半衰期比缺乏所述交联的相应多肽长至少150倍。

34.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的螺旋多肽的体内半衰期比缺乏所述交联的相应多肽长至少200倍。

35.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联中的至少一个连接两个α碳原子。

36.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联所连接的一个α碳原子被式R-取代基取代。

37.如权利要求36所述的多肽，其中一个交联所连接的两个α碳原子被独立的式R-取代基取代。

38.如权利要求36所述的多肽，其中R-是烷基。

39.如权利要求36所述的多肽，其中R-是甲基。

40.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联设置在所述螺旋多肽中。

41.如权利要求31所述的多肽，其中两个交联设置在所述螺旋多肽中。

42.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联是由连续的碳-碳键形成的。

43.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联包含至少8个连续的键。

44.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联包含9个连续的键。

45.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联包含12个连续的键。

46.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联包含至少7个碳原子。

47.如权利要求31所述的多肽，其中一个交联至少包含10个碳原子。

48.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽包含BCL-2家族成员的α螺旋结构域。

49.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽包含BH3结构域。

50.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽包含表1、2、3或4中一序列的至少60％。

51.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽包含表1、2、3或4中一序列的至少80％。

52.如权利要求31所述的多肽，其中所述多肽通过能量依赖性过程穿透细胞膜并结合细胞内靶标。

53.如权利要求31所述的多肽，其中所述多肽被卤素、烷基、荧光部分、亲和性标记、靶向部分或放射性同位素中的一个或多个取代。

54.如权利要求31所述的多肽，其中所述多肽提供治疗效果。

55.如权利要求31所述的多肽，其中所述多肽是药学上可接受的盐的形式。

56.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽的表观血清结合亲和力(Kd^*)是1微摩尔或更高。

57.如权利要求56所述的多肽，其中所述交联的多肽的Kd^*是1-700微摩尔。

58.如权利要求56所述的多肽，其中所述交联的多肽的Kd^*是1-70微摩尔。

59.如权利要求56所述的多肽，其中所述交联的多肽的Kd^*是1-10微摩尔。

60.如权利要求56所述的多肽，其中所述交联的多肽的Kd^*是3、10、70微摩尔或更高。

61.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽估计的人血液中的游离分数为0.1-50％。

62.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽估计的人血液中的游离分数为0.15-10％。

63.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的多肽，与药学上可接受的稀释剂或载体组合或结合。

64.如权利要求1所述的方法，其中如此选择所述交联的多肽，使得在室温水性条件下所述交联的多肽的％螺旋度是25％或更大。

65.如权利要求1所述的方法，其中如此选择所述交联的多肽，使得在室温水性条件下所述交联的多肽的％螺旋度是50％或更大。

66.如权利要求1所述的方法，其中如此选择所述交联的多肽，使得在室温水性条件下所述交联的多肽的％螺旋度是75％或更大。

67.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽的体内半衰期是在静脉给药后确定的。

68.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽在室温水性条件下的百分螺旋度比缺乏所述交联的相应多肽的百分螺旋度高至少2倍。

69.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽在室温水性条件下的百分螺旋度比缺乏所述交联的相应多肽的百分螺旋度高至少5倍。

70.如权利要求31所述的多肽，其中所述交联的多肽在室温水性条件下的百分螺旋度比缺乏所述交联的相应多肽的百分螺旋度高至少10倍。

71.如权利要求31所述的多肽，其中所述多肽的体内半衰期是在静脉给药后确定的。

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