BRPI0720306A2

BRPI0720306A2 - Sistemas de macrociclização da bis-sufidrila

Info

Publication number: BRPI0720306A2
Application number: BRPI0720306-3A
Authority: BR
Inventors: Huw M Nash
Original assignee: Aileron Therapeutics Inc
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2014-02-04
Also published as: IL199301A; US9175056B2; JP5656407B2; CN101636407A; EP2094721A1; US7960506B2; US8609809B2; US20170296620A1; EP2094721B1; WO2008076904A9; CA2686827C; EP3170835A1; CN101636407B; CA2686827A1; JP2014231516A; JP5931975B2; JP6259861B2; CN105061577A; US20160095896A1; US9675661B2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMAS PARA MACROCICLIZAÇÃO DA BIS-SUFIDRILA".

REFERÊNCIA CRUZADA.

O presente Pedido de Patente reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente dos Estados Ligados N0 60/874.819, arquivado 14 de dezembro de 2006, cujo Pedido de Patente é aqui incorporado pela referên- cia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.

Os peptídios estão se tornando cada vez mais importantes na descoberta de fármaco. Os peptídios não modificados muitas vezes sofrem de pobre estabilidade metabólica, pobre penetrabilidade celular e ligação inespecífica devido à flexibilidade conformacional. Para melhorar essas pro- priedades, os pesquisadores têm gerado peptídios cíclicos e peptidomiméti- cos por vários métodos, incluindo a formação de pontes de dissulfeto, a for- mação de ligação amida, e a formação de ligação carbono-carbono (Jackson et al. (1991), J. Am. Chem. Soe. 113:9391-9392; Phelan et al. (1997), J. Am. Chem. Soe. 119:455-460; Tailor (2002), Biopolimers 66: 49-75; Brunel et al. (2005), Chem. Commun. (20):2552-2554; Hiroshige et al. (1995), J. Am. Chem. Soe. 117: 11590-11591; Blackwell et al. (1998), Angew. Chem. Int. Editor 37:3281-3284; Schafmeister et al. (2000), J. Am. Chem. Soe. 122:5891-5892). As limitações desses métodos incluem a pobre estabilidade metabólica (pontes de dissulfeto e ligação amida), pobre penetrabilidade ce- lular (pontes de dissulfeto e ligação amida), e o uso de metais potencialmen- te tóxicos (ligação carbono-carbono). SUMÁRIO DA INVENÇÃO·

A presente invenção refere-se novos macrociclos peptidomiméti- cos e métodos para sua preparação e uso. Em geral, a síntese desses ma- crociclos peptidomiméticos envolve em (1) sintetizar um peptídio precursor contendo duas porções -SH livres; e (2) contatar o peptídio precursor com um reagente de bis-alquilação para produzir um novo macrociclo peptidomi- mético. Este método geral permite à ligação covalente de pelo menos duas porções de tiolato livres em um peptídio precursor para produzir novos com- postos que exibem propriedades biológicas melhoradas, tais como estabili- dade estrutural, afinidade para um alvo, resistência a degradação proteolítica e penetrabilidade em células. Além disso, este método geral permite à incor- poração rápida e seletiva de uma ampla diversidade de porções no macroci- cio peptidomimético permitindo a geração de uma biblioteca de macrociclos relacionados. Este método geral também permite a incorporação fácil do marcador (por exemplo, isótopo radioativo, quimioluminescência ou marca- dor fluorescente) ou agentes terapêuticos.

Assim, em um aspecto, a invenção fornece um macrociclo pepti- domimético de acordo com a Fórmula (1):

Rt L«v ^La r2

s (Fórmula I),

em que:

cada A, C, D, e E são independentemente um aminoácido natu- ral ou não-natural;

O B é um aminoácido natural ou não-natural, análogo de

R3

VVt

aminoácido, ô , [-NH-L4-CO-], [-NH-L4-SO2-], ou [-NHL4-];

R1 e R2 são independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila não-substituída ou substituída com halogênio;

R3 é o hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, hetero- alquila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou hetero- cicloarila, não-substituída ou substituída com R5;

L1, L2, L3 e L4 são independentemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno ou [-R4-K-R4-Jn, cada um sendo não-substituído ou substi- tuído com R5;

K é O, S1 SO, SO2, CO, CO2, ou CONR3;

cada R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R5 é independentemente halogênio, alquila, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6. uma porção fluorescente, um isótopo radioati- vo ou um agente terapêutico;

cada R6 é independentemente -H1 alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico;

R7 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, não-substituído ou substituído com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo D;

R8 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, não-substituída ou substituída com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo E; ν é um número inteiro de 1 a 1000;

w é um número inteiro de 1 a 1000; χ é um número inteiro de 0 a 10; y é um número inteiro de 0 a 10; ζ é um número inteiro de 0 a 10; η é um número inteiro de 1 a 5; e

x+y+z é pelo menos 3.

Em algumas modalidades o macrociclo peptidomimético com- preende uma α-hélice e R8 é -H. Em algumas modalidades, pelo menos um entre Ri e R2 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalqui- lalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila não-substituída ou substituída com halogênio. Alternativamente, tanto Ri e R2 são independentemente al- quila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroal- quila, ou heterocicloalquila não-substituída ou substituída com halogênio. Em outras modalidades, pelo menos um entre R1 e R2 é alquila não-substituída ou substituída com halogênio ou ambos Ri e R2 são independentemente alquila não-substituída ou substituída com halogênio. Em ainda outras moda- lidades, pelo menos um entre Ri e R2 é metila, ou ambos Ri e R2 são metila. Em algumas modalidades, pelo menos um entre D e E é um a- minoácido natural ou desnatural substituído com um alto lipídio de peso mo- lecular ou hidrocarboneto. Em outras modalidades, pelo menos um entre D e E está ligado a um Iigante adicional que forma o macrociclo da Fórmula [-L1-SL2- S-L3-].

Em alguns casos, uma estrutura secundária do macrociclo pep- tidomimético é mais estável do que uma estrutura secundária corresponden- te de um polipeptídio não macrocíclico correspondente. Em algumas modali- dades, o macrociclo peptidomimético de acordo com a presente invenção também compreende uma α-hélice. Tal α-hélice, por exemplo, compreende de 1 volta a 5 voltas. Tal α-hélice é, por exemplo, mais estável do que uma α-hélice de um polipeptídio não macrocíclico correspondente. Em algumas modalidades, o [-L1-S-L2-S-L3-] se estende de 1 volta a 5 voltas da α-hélice, tal como aproximadamente 1, 2, 3, 4 ou 5 voltas da α-hélice. Por exemplo, o [-L1-S-L2-S-L3-] se estende por aproximadamente 1 volta da α-hélice. Exem- plos de comprimentos de [-LrS-L2-S-L3-] são de aproximadamente 5 A a aproximadamente 9 A por volta da α-hélice. Em algumas modalidades, com- primento de [-LrS-L2-S-L3-] é aproximadamente igual ao comprimento de aproximadamente 5 ligações carbono-carbono a aproximadamente 13 Iiga- ções carbono-carbono, ou de aproximadamente 7 ligações carbono-carbono a aproximadamente 10 ligações carbono-carbono. Em outras modalidades, o macrociclo da presente invenção compreende um anel de aproximadamente 17 átomos a 25 átomos.

Em ainda outras modalidades, o macrociclo peptidomimético da presente invenção compreende uma α-hélice que compreende aproximada- mente 2 voltas. Por exemplo, o comprimento de [-LrS-L2-S-L3-] é aproxima- damente igual ao comprimento de aproximadamente 8 ligações carbono- carbono a aproximadamente 16 ligações carbono-carbono, ou de aproxima- damente 10 ligações carbono-carbono a aproximadamente 13 ligações car- bono-carbono. Em outras modalidades, o macrociclo da presente invenção compreende um anel de aproximadamente 29 átomos a aproximadamente 37 átomos. A presente invenção também fornece um composto de acordo com a Fórmula lia:

r7-n CO2r10

(Fórmula lia),

em que:

Ri é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloal- quilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila;

Li é independentemente alquileno, alquenileno, alquinileno, he- teroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloari- Ieno ou [-R4-K-R4-Jn1 não-substituído ou substituído com R5;

K é O, S, SO1 SO2, CO1 CO2, ou CONR3; R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal-

quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno;

R5 é independentemente halogênio, alquila, -OR6, - N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico; R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilal-

quila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico;

R7 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila; Rg e Rio são independentemente -H ou um grupo de proteção

adequado para a síntese de peptídio;

η é um número inteiro de 1 a 5;

Q é S; e

P é -H, -tritila, p-metoxitritila, -S-sec-butila, ou qualquer outro grupo de proteção adequado para a síntese de peptídio; ou Q e P quando tomados em conjunto formam uma porção capaz de sofrer uma transforma- ção química em um grupo -SH. Em algumas modalidades, R1 é alquila não-substituída ou subs- tituída com halogênio. Em outras modalidades, R1 é alquila não-substituída. Em ainda outras modalidades, R1 é metila. Em ainda outras modalidades, pelo menos um entre R9 e R10 é um grupo protegido adequado para a sín- tese de peptídio.

A presente invenção também fornece um kit compreendendo: (a) Um composto de acordo com a Fórmula Ila e um composto de acordo com a Fórmula IIb:

PQ PQ

Ri

CO2R10 Ra-1 CO2R10

Rs Rs

(Fórmula lia) (Fórmula llb)

em que:

R1 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, heteroal-

quila, ou heterocicloalquila não-substituído ou substituído com halogênio;

R2 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, ou heterocicloalquila não-substituído ou substituído com halogênio;

Li e l_3 são independentemente alquileno, alquenileno, alquinile- no, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, ou hete- rocicloarileno ou [-R4-K-R4-]n, cada um sendo não-substituído ou substituído com R5;

K é O, S, SO1 SO2, CO, CO2, ou CONR3;

R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno;

cada R5 é independentemente o halogênio, alquila, -OR6, - N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, -R6, uma porção fluorescente, um isó- topo radioativo, ou um agente terapêutico;

cada R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma por- ção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico; R7 e Rs são independentemente -Η, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila;

R9 e R-io são cada um independentemente -H ou qualquer grupo de proteção adequado para a síntese de peptídio em fase líquida ou sólida;

Q é S;

P é -H1 -tritila, p-metoxitritila, -S-sec-butila, ou qualquer outro grupo de proteção adequado para a síntese de peptídio em fase líquida ou sólida; ou Q e P quando tomados em conjunto formam uma porção capaz de sofrer uma transformação química em um grupo -SH; η é um número inteiro de 1 a 5; e

(b) um Iigante que forma o macrociclo com a estrutura:

X-L2-Y1

em que

L2 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, ou [-Rii-K-Rn-]n, cada um sendo não-substituído ou substituído com Ri2;

cada Rn é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno;

cada Ri2 é independentemente o halogênio, alquila, - OR13, - N(R6)I3, -SR13, -SOR13, -SO2Ri3, -CO2Ri3, -R13· uma porção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico;

cada Ri3 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma por- ção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico; e XeY são cada um independentemente um grupo reativo capaz

de reagir com um grupo tiol.

Em algumas modalidades, R2 é alquila, alquenila, alquinila, ari- lalquila, cicloalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila não-substituída ou substituída com halogênio. Em modalidades específicas, R1 e R2 são alqui- Ia. Por exemplo, R1 e R2 são metila ou trifluorometila.

Um método para sintetizar um macrociclo peptidomimético, o método compreendendo a etapa de contactar um peptidomimético precursor da Fórmula III:

j? Re J

R1 L1 L3 R2

SH ^ (Fórmula III)

com um composto da Fórmula X-L2-Y1

em que v, w, x, y, ζ, A, B, C, D, E, R1, R2, R7, Rs, Lil L2, e L3 são tal como definido para o composto de acordo com a Fórmula I; e X e Y são cada um independentemente um grupo reativo capaz de reagir com um grupo tiol;

x+y+z é pelo menos 3; e adicionalmente em que a dita etapa de contato resulta em uma ligação covalente que é formada entre os dois grupos tiol na Fórmula III.

Em algumas modalidades, a execução de um método da inven- ção resulta na formação de um macrociclo peptidomimético de acordo com a Fórmula (1) como aqui descrito.

Em certas modalidades, pelo menos um entre Ri e R2 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila não-substituído ou substituído com halogênio. Alternativa- mente, tanto Ri como R2 são independentemente alquila, alquenila, alquini- la, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloal- quila não-substituída ou substituída com halogênio. Em outras modalidades, pelo menos um entre Ri e R2 é alquila não-substituída ou substituída com halogênio ou ambos Ri e R2 são independentemente alquila não-substituída ou substituída com halogênio. Em ainda outras modalidades, pelo menos um entre Ri e R2 é metila, ou ambos Ri e R2 são metila.

Em algumas modalidades, o peptidomimético precursor é ex- pressado em células. O peptidomimético precursor também é purificado, em algumas modalidades, antes da etapa de contato. O macrociclo peptidomi- mético obtido é, em alguns exemplos, purificado depois da etapa de contato, e/ou redobrado depois da etapa de contato.

O método descrito, por exemplo, é executado em solução, ou executado sobre um suporte sólido. A etapa de contato é, em alguns casos, realizada na presença de uma macromolécula alvo que se liga ao peptido- mimético precursor sob condições que favorecem a dita ligação, ou é execu- tado na presença de uma macromolécula alvo que se liga preferivelmente ao peptidomimético precursor sob condições que favorecem a dita ligação. Em algumas modalidades, método descrito é aplicado para sintetizar uma biblio- teca de macrociclos peptidomiméticos.

Em algumas modalidades, um macrociclo peptidomimético pre- parado pelo método da invenção compreende uma α-hélice em solução a - quosa. Em outras modalidades, o macrociclo peptidomimético exibe uma estrutura α-helicoidal aumentada em solução aquosa em comparação com um polipeptídio não macrocíclico correspondente. Em ainda outras modali- dades, o macrociclo peptidomimético exibe estabilidade térmica aumentada, atividade biológica aumentada, a resistência à degradação proteolítica au- mentada, ou a capacidade de penetrar células vivas aumentada em compa- ração com um polipeptídio não macrocíclico correspondente. Em algumas modalidades, as duas porções de tiol do composto de acordo com a Fórmula Ill são cadeias laterais de um aminoácido selecionado do grupo consistindo em L-cisteína, D-cisteína, α-metila L-cisteína, e α-metila D-cisteína. Em cer- tas modalidades do método da invenção, x+y+z é 3, e A, B e C são indepen- dentemente aminoácidos naturais ou não naturais. O método descrito, por exemplo, é executado em um solvente

selecionado do grupo consistindo em solvente prático, solvente aquoso, sol- vente orgânico, e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, solvente é DMF, dicloroetano, NH3, NH3ZMeOH, NH3ZDMF, ou guanidina-HCI aquosa. Em algumas modalidades, solvente é também ser um solvente que favorece a formação de hélice, tal como a água.

Em algumas modalidades dos compostos e métodos aqui descri- tos, L2 é um grupo alquila. Em outras modalidades, XeY são grupos de ha- logênio independentemente escolhidos, tais como Cl-, Br- ou I-. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS. As novas características da invenção são apresentadas com a

particularidade nas reivindicações anexadas. Uma melhor compreensão nas características e vantagens da presente invenção será obtida quanto à se- guinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos que as acom- panham dos quais:

a Figura 1 mostra um espectro MALDI de um macrociclo pepti- domimético da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

Embora as modalidades preferidas da presente invenção te- nham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente como forma de exem- pio. As diversas variações, modificações, e substituições ocorrerão agora aos versados na técnica sem fugir da invenção. Deve se entender que as várias alternativas para as modalidades da invenção aqui descritas podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes rei- vindicações definam o alcance da invenção e que métodos e estruturas den- tro do alcance dessas reivindicações e os seus equivalentes sejam assim abarcados. Definições.

Tal como aqui utilizado, termo "macrociclo" refere-se a uma mo- lécula tendo uma estrutura química incluindo um anel ou ciclo formado por pelo menos 9 átomos covalentemente ligados.

Tal como aqui utilizado, termo "macrociclo peptidomimético" re- fere-se a um composto compreendendo diversos resíduos de aminoácido ligados por diversas ligações de peptídio e pelo menos um Iigante formador de macrociclo que forma um macrociclo entre o carbono α de um resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente ou resíduo de aminoácido de ocorrên- cia não-natural ou resíduo de análogo de aminoácido e o carbono α de outro resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente ou resíduo de aminoácido de ocorrência não-natural ou resíduo de análogo de aminoácido. Os macro- ciclos peptidomiméticos opcionalmente incluem uma ou mais ligações não peptídio entre um ou mais resíduos de aminoácido e/ou resíduos de análogo de aminoácido, e opcionalmente incluir um ou mais resíduos de aminoácido de ocorrência não-natural, ou resíduos de análogos de aminoácidos em adi- ção a qualquer um que forme o macrociclo.

Tal como aqui utilizado, termo "estabilidade" refere-se à manu- tenção de uma estrutura secundária definida em solução por um peptídio ou macrociclo peptidomimético da invenção tal como medido por dicroismo cir- cular, RMN ou outra medição biofísica, ou resistência à degradação proteolí- tica in vitro ou in vivo. Exemplos não-limitantes das estruturas secundárias contempladas na presente invenção são a-hélices, β-dobras, e β-folhas plis- sadas.

Tal como aqui utilizado, termo "estabilidade helicoidal" refere-se à manutenção da estrutura α-helicoidal por um peptídio ou macrociclo pepti- domimético da invenção tal como medido pelo dicroismo circular. Por exem- plo, em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção exibem pelo menos 1,25, 1,5, 1,75 ou 2 vezes aumentada a capacidade teor α-helicoidal, tal como determinado pelo dicroismo circular, em comparação com um polipeptídio não macrocíclico correspondente.

O termo "α-aminoácido" ou simplesmente "aminoácido" refere-se a uma molécula contendo ambos um grupo amina e um grupo carboxila liga- dos a um carbono que é denominado como carbono a. Os aminoácidos a- dequados incluem, sem restrição, tanto os isômeros L- e D- dos aminoácidos que ocorrem naturalmente, bem como dos aminoácidos que ocorrem não- naturalmente preparados pela síntese orgânica ou outras vias metabólicas. A menos que o contexto especificamente indique de outra maneira, o termo aminoácido, tal como aqui utilizado, se destina incluir análogos de aminoáci- do.

O termo "aminoácido que ocorre naturalmente" refere-se a qual-

quer um dos vinte aminoácidos comumente encontrados nos peptídios sinte- tizados na natureza, e conhecidos pelas abreviaturas de uma letra A, R1 N, C1 D, Q, E, G, Η, I, L, Κ, M, F, P, S1 T, W, Y e V.

O termo "análogo de aminoácido" refere-se a uma molécula que é estruturalmente semelhante a um aminoácido e que pode ser substituído por um aminoácido na formação de um peptídio ou macrociclo peptidomimé- tico. Os análogos de aminoácido incluem compostos que são estruturalmen- te idênticos a um aminoácido, tal como definido aqui, exceto pela inclusão de um ou mais grupos metileno adicionais entre a amina e grupo carboxila (por exemplo, a-amino β-carbóxi ácidos), ou para a substituição do grupo amina ou do grupo carbóxi por um grupo reativo similar (por exemplo, a substitui- ção da amina primária com uma amina secundária ou terciária, ou substitui- ção ou grupo carbóxi com um éster).

Um resíduo de aminoácido "dispensável" é um resíduo que pode ser alterado da seqüência do tipo selvagem de um polipeptídio (por exemplo, um domínio BH3 ou o domínio de ligação p53 MDM2) sem abolir ou subs- tancialmente alterar a sua atividade biológica ou bioquímica essencial (por exemplo, ligação com receptor ou ativação). Um resíduo de aminoácido "es- sencial" é um resíduo que, quando alterado da seqüência do tipo selvagem do polipeptídio, resulta na extinção ou substancialmente na extinção da ati- vidade biológica ou bioquímica essencial do polipeptídio. Uma "substituição conservadora de aminoácido" é aquela em

que o resíduo de aminoácido é substituída com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais semelhante foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, K, R, H), cadeias laterais ácidas (por exemplo, D, E), cadeias laterais polares não car- regadas (por exemplo, G, N, Q, S, Τ, Y, C), cadeias laterais não polares (por exemplo, A, V, L, I, P, F, M1 W), cadeias laterais de ramificação beta (por exemplo, Τ, V, I) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, Y, F, W, H). Assim, um resíduo de aminoácido dispensável predito em um polipeptídio BH3, por exemplo, é preferivelmente substituído com outro resíduo de ami- noácido da mesma família de cadeia lateral.

O termo "membro" tal como aqui utilizado, em conjunto com ma- crociclos, ou Iigantes que formam o macrociclo, refere-se aos átomos que formam ou podem formar o macrociclo, e excluem os substituintes ou os á- tomos da cadeia lateral. Por analogia, ciclodecano, 1,2-difluorodecano e o 1,3-dimetila ciclodecano são todos considerados macrociclos de dez mem- bros já que os substituintes hidrogênio, flúor ou a cadeia lateral metila não participam na formação do macrociclo.

O símbolo V^" quando usado como parte de uma estrutura mo- lecular refere-se a uma ligação simples ou uma ligação dupla trans ou eis.

O termo "cadeia lateral de aminoácido" refere-se a uma porção anexada ao carbono α em um aminoácido. Por exemplo, a cadeia lateral do aminoácido alanina é metila, a cadeia lateral do aminoácido fenilalanina é fenilmetila, a cadeia lateral do aminoácido cisteína é tiometila, a cadeia late- ral de aminoácido do aspartato é carboximetila, a cadeia lateral do aminoá- cido tirosina é 4-hidroxifenilmetila, etc. Outras cadeias laterais de aminoácido de ocorrência não-natural são também incluídos, por exemplo, aqueles que ocorrem na natureza (por exemplo, um metabólito de aminoácido) ou aque- les que são produzidos sinteticamente (por exemplo, um α,α-aminoácido dissubstituído).

O termo "polipeptídio" abrange dois ou mais aminoácidos de o- corrência natural ou não-natural ligados por uma ligação covalente (por e- xemplo, uma ligação amida). Os polipeptídios, tal como aqui descrito, inclu- em as proteínas de comprimento total (por exemplo, as proteínas completa- mente processadas) bem como seqüências de aminoácidos mais curtas (por exemplo, fragmentos de proteínas que ocorrem naturalmente ou fragmentos de polipeptídios sintéticos).

O termo "halo" ou "halogênio" refere-se a flúor, cloro, bromo ou iodo ou um radical dos mesmos.

O termo "alquila" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que é uma cadeia reta ou uma cadeia ramificada, contendo o número indicado de átomos de carbono. Por exemplo, C1-C10 indica que o grupo tem de 1 a átomos de carbono (inclusive) no mesmo. Na ausência de qualquer de- signação numérica, "alquila" é uma cadeia (reta ou ramificada) tendo de 1 a (inclusive) átomos de carbono no mesma.

O termo "alquileno" refere-se a uma alquila divalente (isto é,

-R-).

O termo "alquenila" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que é uma cadeia reta ou uma cadeia ramificada tendo uma ou mais duplas ligações de carbono a carbono. A porção alquenila contém o número indica- do de átomos de carbono. Por exemplo, C2-Cio indica que o grupo tem de 2 a 10 (inclusive) átomos de carbono no mesmo. O termo "alquenila inferior" refere-se a uma cadeia de alquenila C2-C6. Na ausência de qualquer desig- nação numérica, "alquenila" é uma cadeia (reta ou ramificada) tendo de 2 a (inclusive) átomos de carbono na mesma.

O termo "alquinila" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que é uma cadeia reta ou cadeia ramificada tendo uma ou mais ligações tri- plas carbono-carbono. A porção alquinila contém o número indicado de áto- mos de carbono. Por exemplo, C2-Ci0 indica que o grupo tem de 2 a 10 (in- clusive) átomos de carbono no mesmo. O termo "alquinila inferior" refere-se a uma cadeia de alquinila C2-C6. Na ausência de qualquer designação nu- mérica, "alquinila" é uma cadeia (reta ou ramificada) tendo de 2 a 20 (inclu- sive) átomos de carbono no mesmo. O termo "arila" refere-se a um sistema de anéis aromáticos mo-

nocíclicos de 6 átomos de carbono, ou bicíclicos de 10 átomos de carbono, em que 0, 1, 2, 3, ou 4 átomos de cada anel são substituídos por um substi- tuinte. Exemplos de grupos arila incluem fenila, naftila e assim por diante. O termo "arilalquila" ou termo "aralquila" referem-se a um alquila substituída com um arila. O termo "arilalcóxi" refere-se a um alcóxi substituído com arila.

"Arilalquila" refere-se a um grupo arila, tal como definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio do grupo arila foi substituído com gru- pos alquila C1-C5, tal como definido acima. Os exemplos representativos de um grupo arilalquila incluem, mas não estão limitados a, 2- metilfenila, 3- metilfenila, 4-metilfenila, 2-etilfenila, 3- etilfenila, 4-etilfenila, 2-propilfenila, 3- propilfenila, 4- propilfenila, 2-butilfenila, 3-butilfenila, 4-butilfenila, 2- pentilfe- nila, 3-pentilfenila, 4-pentilfenila, 2-isopropilfenila, 3-isopropilfenila, 4- isopropilfenila, 2-isobutilfenila, 3-isobutilfenila, 4-isobutilfenila, 2- secbutilfenila, 3-sec-butilfenila, 4-sec-butilfenila, 2-tercbutilfenila, 3-terc- butilfenila e 4-terc-butilfenila.

"Arilamida" refere-se a um grupo arila, tal como definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio do grupo arila foi substituída com um ou mais grupos -C(O)NH2. Os exemplos representativos de um grupo arila- mida incluem 2-C(0)NH2-fenila, 3-C(0)NH2-fenila, 4-C(0)NH2-fenila, 2- C(O)NH2-PiridiI1 3-C(0)NH2-piridil, e 4-C(0)NH2-piridila.

O termo "alquila-heterociclo" refere-se a grupos alquila C1-C5, tal como definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio de grupos alqui- la CrC5 foi substituído com um heterociclo. Os exemplos representativos de um grupo alquila-heterociclo incluem, mas não estão limitados a, -CH2- morfolina, -CH2CH-piperidina, -CH2CH2CH2-morfolina, e - CH2CH2CH- imidazol.

O termo "alquilamida" refere-se a grupos alquila C1-C5, tal como

definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio de grupos alquila Cr C5 foi substituído com um grupo - C(O)NH2. Os exemplos representativos de um grupo alquilamida incluem, mas não estão limitados a, -CH2- C(O)NH2, - CH2CH2-C(O)NH2, -CH2CH2CH2C(O)NH2, - CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, - CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2, - CH2CH(C(O)NH2)CH3,

CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3, - CH(C(O)NH2)CH2CH3 e -C(CH3)2CH2C(O)NH2.

O termo "alcanol" refere-se a grupos alquila CrC5, tal como de- finido acima, em que um dos átomos de hidrogênio dos grupos alquila CrC5 foi substituído com um grupo hidroxila. Os exemplos representativos de um grupo alcanol incluem, mas não estão limitados a, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH2CH2CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3, - CH2CH(OH)CH2CH3, -CH(OH)CH3 e -C(CH3)2CH2OH.

O termo "alquilcarbóxi" refere-se a grupos alquila Cr C5, tal co- mo definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio dos grupos alquila CrC5 foi substituído com um grupo -COOH. Os exemplos representativos de um grupo alquilcarbóxi incluem, mas não estão limitados a, -CH2COOH, -CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2COOH, -CH2CH2CH2CH2COOH,

-CH2CH(COOH)CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH)CH2CH3i -CH(CooH)CH2CH3 e -C(CH3)2CH2COOH. O termo "cicloalquila" tal como aqui empregado inclui grupos de

hidrocarbonetos cíclicos saturados e parcialmente insaturados tendo de 3 a 12 átomos de carbono, preferivelmente de 3 a 8 átomos de carbono, e mais preferivelmente de 3 a 6 átomos de carbono, em que o grupo cicloalquila adicionalmente é opcionalmente substituído. Alguns grupos cicloalquila in- cluem, sem restrição, ciclopropil, ciclobutila, ciclopentil, ciclopentenila, ciclo- hexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila, e ciclo-octila. O termo "heteroarila" refere-se um sistema de anéis aromáticos

monocíclicos de 5 a 8 membros, bicíclicos de 8 a 12 membros, ou tricíclicos de 11 a 14 membros tendo de 1 a 3 heteroátomos se for monocíclico, de 1 a 6 heteroátomos se for bicíclico, ou de 1 a 9 heteroátomos se for tricíclico, os ditos heteroátomos selecionados de O, N, ou S (por exemplo, átomos de carbono e 1 a 3, 1 a 6, ou 1 a 9 heteroátomos de O, N, ou S se monocíclico, bicíclico, ou tricíclico, respectivamente), em que 0, 1,2, 3, ou 4 átomos de cada anel são substituídos por um substituinte. Exemplos de grupos heteroa- rila incluem piridil, furil ou furanil, imidazol, benzimidazolil, pirimidinil, tiofenila ou trienila, quinolinil, indolil, tiazolil, e assim por diante. O termo "heteroarilalquila" ou termo "heteroaralquila" refere-se a

uma alquila substituída com um heteroarila. O termo "heteroarilalcóxi" refere- se a um alcóxi substituído com a heteroarila.

O termo "heteroarila" refere-se a sistemas anelares aromáticos monocíclicos de 5 a 8 membros, bicíclicos de 8 a 12 membros, ou tricíclico de 11 a 14 membros tendo de 1 a 3 heteroátomos se for monocíclico, de 1 a 6 heteroátomos se for bicíclico, ou de 1 a 9 heteroátomos se for tricíclico, os ditos heteroátomos selecionados de O, N, ou S (por exemplo, átomos de carbono e 1 a 3, 1 a 6, ou 1 a 9 heteroátomos de O, N, ou S se monocíclico, bicíclico, ou tricíclico, respectivamente), em que 0, 1, 2, 3, ou 4 átomos de cada anel são substituídos por um substituinte. Os exemplos de grupos hete- roarila incluem piridila, furila ou furanila, imidazol, benzimidazolila, pirimidini- la, tiofenila ou trienila, quinolinila, indolila, tiazolila, e assim por diante.

O termo "heteroarilalquila" ou termo "heteroaralquila" refere-se a uma alquila substituída com um heteroarila. O termo "heteroarilalcóxi" refere- se a um alcóxi substituído com o heteroarila.

O termo "heterociclil" refere-se um sistema de anéis não aromá- ticos monocíclicos de 5 a 8 membros, bicíclicos de 8 a 12 membros, ou tricí- clicos de 11 a 14 membros tendo de 1 a 3 heteroátomos se for monocíclico, de 1 a 6 heteroátomos se for bicíclico, ou de 1 a 9 heteroátomos se for tricí- clico, os ditos heteroátomos selecionados de O, N, ou S (por exemplo, áto- mos de carbono e 1 a 3, 1 a 6, ou 1 a 9 heteroátomos de O, N1 ou S se mo- nocíclico, bicíclico, ou tricíclico, respectivamente), em que 0, 1,2, 3, ou 4 átomos de cada anel são substituídos por um substituinte. Exemplos de gru- pos heterociclila incluem piperazinila, pirrolidinila, dioxanila, morfolinila, te- traidrofuranila, e assim por diante.

O termo "substituintes" refere-se a um grupo "substituído" em um grupo alquila, cicloalquila, arila, heterociclila, ou heteroarila em qualquer á- tomo daquele grupo. Os substituintes adequados incluem, sem restrição, grupos halo, hidróxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquila, alquila, alcarila, arila, aralquila, alcóxi, tioalcóxi, arilóxi, amina, alcoxicarbonila, amida, carbóxi, al- canossulfonila, alquilcarbonila e ciano. Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção

contêm um ou mais centros assimétricos e assim ocorrem como racematos e misturas racêmicas, enanciômeros únicos, diastereoisômeros individuais e misturas diastereoisoméricas. Todas as ditas formas isoméricas desses compostos são incluídas na presente invenção a menos que seja expressa- mente declarado de outra maneira. Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção são também representados em múltiplas formas tau- toméricas, em tais exemplos, a invenção inclui todas as formas tautoméricas dos compostos aqui descritos (por exemplo, se a alquilação de um sistema anelar resultar na alquilação em múltiplos sítios, a presente invenção inclui todos os ditos produtos da reação). Todas as ditas formas isoméricas de tais compostos são incluídas na presente invenção a menos que seja expressa- mente declarado de outra maneira. Todas as formas cristalinas dos compos- tos aqui descritos são incluídas na presente invenção a menos que seja ex- pressamente declarado de outra maneira. Tal como aqui utilizado, os termos "aumento" e "redução" signifi-

cam, respectivamente, causar um aumento ou uma redução com significân- cia estatística (isto é, ρ < 0,1) de pelo menos 5%. Tal como aqui utilizado, a listagem de uma faixa de variação numérica para uma variável é destinada a significar que a invenção pode ser praticada com a variável igual a qualquer um dos valores dentro daquela faixa de variação. Assim, para uma variável que é inerentemente discreta, a variável é igual a qualquer valor numérico inteiro dentro da faixa de variação numérica, incluindo as extremidades da faixa de variação. Similarmente para uma variável que é inerentemente contínua, a variável é igual a qualquer valor real dentro do faixa de variação numérica, incluindo as extremidades da faixa de variação. Como um exemplo, e sem limitações, uma variável que é descrita como possuindo valores entre 0 e 2 toma os valores 0, 1 ou 2 se a variável for inerentemente discreta, e toma os valores 0,0, 0,1, 0,01, 0,001, ou outros valores reais quaisquer > 0 e < 2 se a variável for inerentemente contínua.

Tal como aqui utilizado, a menos que especificamente seja indi- cado de outra maneira, a palavra "ou" é usado no sentido inclusivo de "e/ou" e não o sentido exclusivo de "também/ou".

Os detalhes de uma ou mais modalidades particulares da inven- ção são apresentados nos desenhos anexados e na descrição abaixo. Ou- tras características, os objetivos, e as vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição, dos desenhos e das reivindicações. Macrociclos Peptidomiméticos da Invenção.

A presente invenção fornece macrociclos peptidomiméticos de acordo com a Fórmula (1):

ou não-natural;

B é um aminoácido natural ou não-natural, um análogo de ami-

S--L2-S

Fórmula I

em que:

25

cada A, C1 D, e E é independentemente um aminoácido natural R3

ZwnY^

noácido, H o , [-NH-L4-CO-], [-NH-L4-SO2-], ou [-NH-L4-];

Ri e R2 são independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila não-substituída ou substituída com halogênio;

R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal-

quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, não-substituído ou substituído com R5;

L-i, L2, L3 e L4 são independentemente alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno ou [-R4-K-R4-Jn, cada um sendo não-substituído ou substi- tuído com R5;

K é O, S1 SO1 SO2, CO, CO2, ou CONR3; cada R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R5 é independentemente halogênio, alquila, -OR6, - N(Re)2,

-SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, uma porção fluorescente, um isótopo radioati- vo ou um agente terapêutico;

cada R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico;

R8 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete-

roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, não-substituída ou substituída com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo E;

ν é um número inteiro de 1 a 1000; w é um número inteiro de 1 a 1000;

χ é um número inteiro de 0 a 10; y é um número inteiro de 0 a 10; ζ é um número inteiro de 0 a 10; e η é um número inteiro de 1 a 5.

Em algumas modalidades da invenção, x+y+z é pelo menos 3. Em outras modalidades da invenção, x+y+z é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Cada ocorrência de A, B, C, D ou E em um macrociclo ou precursor de macrociclo da presente invenção é independentemente selecionada. Por exemplo, uma seqüência representada pela Fórmula [A]x, quando χ é 3, abrange modali- dades onde os aminoácidos não são idênticos, por exemplo, Gln-Asp-Ala bem como modalidades onde os aminoácidos são idênticos, por exemplo, Gln-GIn-GIn. Isto se aplica a qualquer valor de x, y, ou ζ nas faixas de varia- ção indicadas.

Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético de a- cordo com a presente invenção compreende uma estrutura secundária que é uma α-hélice e R8 é -H, permitindo a ponte de hidrogênio intra-helicoidal.

Em outras modalidades, comprimento do Iigante que forma o macrociclo [-L1-S-L2-S-L3-] tal como medido partindo de um primeiro Ca até um segundo Ca é selecionado para estabilizar uma estrutura secundária de peptídio desejada, tal como uma α-hélice formada por resíduos do macroci- cio peptidomimético, incluindo mas não necessariamente sendo limitado a, aqueles entre o primeiro Ca e um segundo Ca.

Em algumas modalidades, o macrociclo peptidomimético com- preende pelo menos um motivo de α-hélice. Por exemplo, A, B e/ou C no composto de acordo com a Fórmula I incluindo uma ou mais α-hélice s. Co- mo uma característica geral, as a-hélices incluem entre 3 e 4 resíduos de aminoácido por cada volta. Em algumas modalidades, as α-hélices do ma- crociclo peptidomimético inclui de 1 a 5 voltas e, desse modo, de 3 a 20 re- síduos de aminoácido. Em modalidades específicas, a α-hélice inclui 1 volta, 2 voltas, 3 voltas, 4 voltas, ou 5 voltas. Em algumas modalidades, Iigante que forma o macrociclo estabiliza um motivo de α-hélice incluído dentro do macrociclo peptidomimético. Assim, em algumas modalidades, o comprimen- to do Iigante que forma o macrociclo [-LrS-L2-S-L3-] de um primeiro C a um segundo C é selecionado para aumentar a estabilidade de uma α-hélice. Em algumas modalidades, o Iigante que forma o macrociclo se estende de 1 vol- ta a 5 voltas da α-hélice. Em algumas modalidades, o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 1 volta, 2 voltas, 3 voltas, 4 voltas, ou 5 voltas da α-hélice. Em algumas modalidades, comprimento do Iigante que forma o macrociclo é de aproximadamente 5 A a 9 A por cada volta da α-hélice, ou de aproximadamente 6 A a 8 A por cada volta da a- hélice. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximada- mente 1 volta de uma α-hélice, o comprimento é igual a de aproximadamen- te 5 ligações carbono-carbono a 13 ligações carbono-carbono, de aproxima- damente 7 ligações carbono-carbono a 11 ligações carbono-carbono, ou de aproximadamente 9 ligações carbono-carbono. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 2 voltas de uma α-hélice, o comprimento é igual a de aproximadamente 8 ligações carbono-carbono a 16 ligações carbono-carbono, de aproximadamente 10 ligações carbonocar- bono a 14 ligações carbono-carbono, ou de aproximadamente 12 ligações carbono-carbono. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por a- proximadamente 3 voltas de uma α-hélice, o comprimento é igual a de apro- ximadamente 14 ligações carbono-carbono a 22 ligações carbono-carbono, de aproximadamente 16 ligações carbonocarbono a 20 ligações carbono- carbono, ou de aproximadamente 18 ligações carbono-carbono. Onde o Ii- gante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 4 voltas de uma α-hélice, o comprimento é igual a de aproximadamente 20 ligações carbono-carbono a 28 ligações carbono-carbono, de aproximadamente 22 ligações carbonocarbono a 26 ligações carbono-carbono, ou de aproxima- damente 24 ligações carbono-carbono. Onde o Iigante que forma o macroci- clo se estende por aproximadamente 5 voltas de uma α-hélice, o compri- mento é igual a de aproximadamente 26 ligações carbono-carbono a 34 liga- ções carbono-carbono, de aproximadamente 28 ligações carbonocarbono a 32 ligações carbono-carbono, ou de aproximadamente 30 ligações carbono- carbono. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproxima- damente 1 volta de uma α-hélice, a ligação contém de aproximadamente 4 átomos a 12 átomos, de aproximadamente 6 átomos a 10 átomos, ou é de aproximadamente 8 átomos. Onde o Iigante que forma o macrociclo se es- tende por aproximadamente 2 voltas da α-hélice, a ligação contém de apro- ximadamente 7 átomos a 15 átomos, de aproximadamente 9 átomos a 13 átomos, ou é de aproximadamente 11 átomos. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 3 voltas da α-hélice, a ligação contém de aproximadamente 13 átomos a 21 átomos, de aproximadamente átomos a 19 átomos, ou é de aproximadamente 17 átomos. Onde o Iigan- te que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 4 voltas da a- hélice, a ligação contém aproximadamente de 19 átomos a 27 átomos, de aproximadamente 21 átomos a 25 átomos, ou é de aproximadamente 23 átomos. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximada- mente 5 voltas da α-hélice, a ligação contém de aproximadamente 25 áto- mos a 33 átomos, de aproximadamente 27 átomos a 31 átomos, ou é de aproximadamente 29 átomos. Onde o Iigante que forma o macrociclo se es- tende por aproximadamente 1 volta da α-hélice, o macrociclo resultante for- ma um anel contendo de aproximadamente 17 membros a 25 membros, de aproximadamente 19 membros a 23 membros, ou é de aproximadamente 21 membros. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproxima- damente 2 voltas da α-hélice, o macrociclo resultante forma um anel conten- do de aproximadamente 29 membros a 37 membros, de aproximadamente 31 membros a 35 membros, ou é de aproximadamente 33 membros. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 3 voltas da α-hélice, o macrociclo resultante forma um anel contendo de aproximada- mente 44 membros a 52 membros, de aproximadamente 46 membros a 50 membros, ou é de aproximadamente 48 membros. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 4 voltas da α-hélice, o ma- crociclo resultante forma um anel contendo de aproximadamente 59 mem- bros a 67 membros, de aproximadamente 61 membros a 65 membros, ou é de aproximadamente 63 membros. Onde o Iigante que forma o macrociclo se estende por aproximadamente 5 voltas da α-hélice, o macrociclo resultan- te forma um anel contendo de aproximadamente 74 membros a 82 mem- bros, de aproximadamente 76 membros a 80 membros, ou é de aproxima- damente 78 membros.

Em outras modalidades, D e/ou E são adicionalmente modifica- dos para facilitar a absorção celular. Por exemplo, a lipidação ou a "PEGIa- ção" de um peptídio em algumas modalidades facilitam a absorção celular, o aumento da biodisponibilidade, o aumento da circulação sangüínea, alteram a farmacocinética, diminuem a imunogenicidade e/ou reduzem a necessida- de da freqüência de administração.

A síntese dos macrociclos peptidomiméticos da invenção envol- ve um processo de múltiplas etapas que envolvem (1) a síntese de um pep- tídio precursor ou peptidomimético precursor contendo duas porções -SH livres; e (2) então contatar o precursor com um reagente de bis-alquilação para gerar duas novas ligações covalentes.

Os macrociclos ou os precursores de macrociclo são sintetiza- dos, por exemplo, por métodos em fase líquida ou em fase sólida, e ambos podem conter aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não- natural. Ver, por exemplo, a Hunt, "The Non-Protein Amino Acids" em Che- mistry and Biochemistry of the Amino Acids, editado por by G.C. Barrett, Chapman and Hall, 1985. Em algumas modalidades, as porções de tiol estão nas cadeias laterais dos resíduos de aminoácido da L-cisteína, D-cisteína, a- metil-L-cisteína, α-metila-D-cisteína, L-homocisteína, D-homocisteína, a- metil-L-homocisteína ou a-metila-D-homocisteína. O reagente de bis- alquilação é de fórmula geral X-L2-Y em que L2 é uma porção Iigante e X e Y são grupos de saída que são deslocados pelas porções -SH para as Iiga- ções com L2. Em algumas modalidades, XeY são halogênios, tais como I, Br, ou Cl.

Em uma modalidade, o macrociclo peptidomimético exibe pro- priedades biológicas melhoradas, tais como estabilidade estrutural aumenta- da, afinidade aumentada para um alvo, resistência aumentada à degradação proteolítica e/ou aumento na penetrabilidade celular quando em comparação com o peptídio precursor ou peptidomimético precursor. Em outra modalida- de, macrociclo peptidomimético compreende uma ou mais α-hélice s em so- luções aquosas e/ou exibe um grau aumentado de teor α-helicoidal quando em comparação com o peptídio precursor ou peptidomimético precursor. Método fornece uma via em direção à síntese de uma biblioteca de macroci- clos peptidomiméticos variando o reagente X-L2-Y, e em algumas modalida- des o elemento de Iigante L2 é otimizado para melhorar as propriedades bio- lógicas ou farmacológicas do macrociclo peptidomimético resultante.

Em algumas modalidades, Iigante que forma o macrociclo au- menta a permeabilidade celular do macrociclo peptidomimético. Assim, em algumas modalidades, Iigante que forma o macrociclo aumenta a hidrofobi- cidade total do macrociclo peptidomimético em relação ao peptídio precursor ou peptidomimético precursor.

Qualquer proteína ou polipeptídio com uma seqüência de ami- noácido primária conhecida contendo uma estrutura secundária acreditada comunicar a atividade biológica é o paciente da presente invenção. Por e- xemplo, a seqüência do polipeptídio pode ser analisada e a sulfidrila conten- do os análogos de aminoácido da invenção pode ser substituída nas posi- ções adequadas. As posições adequadas são determinadas pesquisando que parte da(s) superfície(s) moleculares) da estrutura secundária que é(são) necessária(s) para a atividade biológica e, desse modo, através de outra(s) superfície(s), os Iigantes de formação de macrociclo da presente invenção podem formar um macrociclo sem bloquear estericamente a(s) su- perfície(s) necessária(s) para a atividade biológica. Tais determinações são realizadas utilizando métodos tais como a cristalografia de raio-X dos com- plexos entre a estrutura secundária e um parceiro de ligação natural para visualizar os resíduos (e as superfícies) críticos para a atividade; pela muta- gênese seqüencial dos resíduos na estrutura secundária para identificar fun- cionalmente os resíduos (e as superfícies) críticos para a atividade; ou por outros métodos. Por tais determinações, os aminoácidos adequados são substituídos com os análogos de aminoácidos e os Iigantes que formam o macrociclo da presente invenção. Por exemplo, para uma estrutura secundá- ria α-helicoidal, uma superfície da hélice (por exemplo, uma superfície mole- cular que se estende longitudinalmente ao longo do eixo do hélice e radial- mente de 45° a 135° aproximadamente em relação ao eixo do hélice) pode ser necessária para entrar em contato com uma outra biomolécula in vivo ou in vitro para a atividade biológica. Em tal caso, um Iigante que forma o ma- crociclo é projetado para ligar dois carbonos-α da hélice enquanto se esten- de longitudinalmente ao longo da superfície da hélice na porção daquela su- perfície não diretamente necessária para a atividade.

Em algumas modalidades da invenção, a seqüência de peptídio é derivada da família BCL-2 das proteínas. A família BCL-2 é definida pela presença de até quatro homologias BCL-2 conservadas (BH) os domínios denominados BH1, BH2, BH3 e BH4, todos incluindo os seguimentos a- helicoidais (Chittenden et al. (1995), EMBO 14:5589; Wang et al. (1996), Genes Dev. 10:2859). As proteínas antiapoptóticas, tal como BCL-2 e BCL-Xl, expõe a conservação de seqüência em todos os domínios BH. As proteínas de próapoptóticas são divididas em membros da família de "multi- domínio" (por exemplo, BAK, ΒΑΧ), que possuem a homologia nos domínios BH1, BH2, e BH3, e nos membros da família "somente domínio BH3" (por exemplo, BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA), contendo a homologia de se- qüência exclusivamente no segmento α-helicoidal no BH3 anfipático. Os membros da família BCL-2 têm a capacidade de formar homodímeros e he- terodímeros, sugerindo que a ligação competitiva e a proporção entre os ní- veis de proteína próapoptóticas e antiapoptóticas ditam a suscetibilidade pa- ra os estímulos da morte. As proteínas antiapoptóticas funcionam para pro- teger as células do excesso de próapoptóticas, isto é, morte celular progra- mada em excesso. As medidas de "segurança" adicionais incluem a trans- crição de regulação da proteína pró-apoptótica e a manutenção delas como conformeros inativos, necessitando ou de ativação proteolítica, ou de desfos- forilação, ou de modificação conformacional induzida pelo Iigante para ativar as funções pró-morte. Em certo tipo de célula, os sinais da morte recebidos na membrana plasmática aciona a apoptose via um caminho mitocondrial. A mitocôndria pode servir como um porteiro da morte celular seqüestrando o citocromo C, um componente crítico de um complexo citossólico que ativa a caspase 9, levando a eventos proteolíticos fatais à jusante. As proteínas de multidomínios como a BCL-2/BCL-XL e a BAK/BAX desempenham papéis de duelo de guardião e executor na membrana de mitocôndria, com as suas atividades adicionalmente reguladas à montante por membros somente de BH3 da família BCL-2. Por exemplo, a BID é membro do Domínio somente de BH3 da família da proteína pró-apoptótica, e transmite o sinal mortal re- cebido na membrana plasmática para a proteína pró-apoptótica do efetor na membrana domitocôndria. A BID tem a capacidade da interação com ambas as proteínas pró e antiapoptose, e durante a ativação por caspase 8, que aciona a liberação do citocromo Cea apoptose do mitocôndria. A elimina- ção e os estudos de mutagênese determinaram que o segmento de BH3 a- helicoidal anfipático dos membros da família de pró-apoptóticas funcionam como um domínio mortal e assim representa um motivo estrutural crítico pa- ra interagir com a proteína apoptótica de multidomínio. Os estudos estrutu- rais demonstraram que o hélice BH3 interage com a proteína antiapoptótica inserindo em uma ranhura hidrofóbica formada pela interface dos domínios BH1, 2 e 3. A BID ativada pode ser ligada e isolada pela proteína antiapoptó- tica (por exemplo, BCL-2 e BCL-XL) e pode provocar a ativação da proteína pró-apoptótica BAX e BAK, levando à liberação do citocromo C e a um pro- grama de apoptose do mitocôndria. BAD é também um domínio somente de BH3 membro da família das pró-apoptóticas cuja expressão provoca a ativa- ção de BAX/BAK. Em contraste com BID, entretanto, BAD expõe ligação preferencial a membros da família antiapoptótica, BCL-2 e BCL-XL. Ao pas- so que o domínio BAD BH3 exibe a elevada ligação de afinidade BCL-2, ao peptídio BAD BH3 é incapaz de ativar a liberação do citocromo C da mito- côndria in vitro, sugerindo que BAD não é um ativador direto de BAX/BAK. A mitocôndria o que sobre-expressado BCL-2 é resistente a liberação citocro- mo C induzido pela BID, mas o cotratamento com BAD pode restaurar a sensibilidade da BID. A indução da apoptose de mitocôndria por BAD parece resultar também: (1) deslocamento de ativadores BAX/BAK, tal como BID e proteínas semelhantes à BID, da bolsa de ligação BCL-2/BCL-XL, ou (2) o- cupação seletiva da bolsa de ligação BCL-2/BCL-XL por BAD para evitar o seqüestro da proteína semelhantes à BID pela proteína antiapoptótica. As- sim, duas classes do domínio somente de BH3 a proteína emergente, prote- ína semelhantes à BID que diretamente ativa a apoptose do mitocôndria, e a proteína semelhantes à BID, que tem a capacidade de sensibilizar a mito- côndria à proteína pró-apoptótica semelhante à BID ocupando os bolsos de ligaçãos da proteína antiapoptótica de multidomínio. Diversos domínios a- helicoidais da proteína membro da família BCL-2 emendável à metodologia aqui descrita, foram descritas (Walensky et al. (2004), Science 305:1466; e Walensky et al., Publicação de Patente dos Estados Unidos N0 US 2005/0250680, as descrições inteiras do qual são incorporadas aqui pela referência).

Em outras modalidades, a seqüência de peptídio é derivada da proteína supressora de tumor p53 que se liga à proteína de oncogene MDM2. O sítio de ligação MDM2 está localizado dentro de uma região do supressor de tumor p53 que forma uma α-hélice. A Patente dos Estados N0 US 7.083.983, o teor inteiro da qual é aqui incorporado pela referência, para Lane et al., descreve que a região da p53 responsável por ligar a MDM2 é representada aproximadamente pelos aminoácidos 13 a 31 (PLSQETFS- DLWKLLPENNV) da proteína madura humana P53. Outras seqüências mo- dificadas descritas por Lane são também contempladas na invenção imedia- ta. Além disso, a interação de p53 e MDM2 foi discutida por Shair et al., (1997), Chem. & Biol. 4:791, o teor integral da qual é aqui incorporado pela referência, e mutações no gene p53 foram identificadas em praticamente metade de todos os casos informados de câncer. Conforme o estresse é imposto em um célula, acredita-se que a p53 orquestra uma resposta que leva a paralização do ciclo da célula e ao reparo do DNA, ou à morte pro- gramada da célula. Bem como as mutações no gene p53 que alteram dire- tamente a função da proteína p53, as p53 podem ser alteradas por modifica- ções na MDM2. A proteína MDM2 foi mostrada ligar a p53 e interromper a ativação transcricional associada com o domínio de transativação de p53. Por exemplo, um derivado de peptídio de 11 aminoácidos do domínio de transativação da p53 forma uma α-hélice anfipática de 2,5 voltas que insere na fenda MDM2. Assim, em algumas modalidades, as novas estruturas de a- hélice geradas pelo método da presente invenção são projetadas para gerar estruturas que se ligam justamente ao receptor da hélice e interrompem inte- rações nativas de proteína a proteína. Essas estruturas são então avaliadas pela utilização de elevadas técnicas de identificação ótima de pequenas mo- léculas de peptídio. As novas estruturas que interrompem a interação MDM2 são úteis para muitas aplicações, incluindo, mas não-limitadas a, controle de sarcomas de tecidos macios (que sobre-expressa a MDM2 na presença do tipo selvagem p53). Estes cânceres são então, em algumas modalidades, refreadas com pequenas moléculas que interceptam a MDM2, previnindo assim a supressão na p53. Adicionalmente, em algumas modalidades, as pequenas moléculas interrompem as interações de MDM2-p53 são usadas como terapia adjuvante para auxiliar o controle e modular a extenção da resposta da apoptose dependente de p53 na quimioterapia convencional.

Uma lista de exemplos não-limitantes de peptídios adequados para uso na presente invenção é fornecida abaixo:

TABELA 11

Nome Seqüência (negr = resid, críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) Pepetídios BH3 BID-BH3 QEDIIRNIAR- HLAQVGDSMDRSIPP QEDIIRNIAR- HLAXVGDXMDRSIPP BIM-BH3 DNRPEIWIAQELRRIG- DEFNAYYAR DNRPEIWIAQELR- XIGDXFNAYYAR BAD-BH3 N LWAAQ RYG RE LRRMS- DEFVDSFKK N LWAAQ RYG REL- RXMSDXFVDSFKK PUMA-BH3 EEQWAREIGAQLRR- MADDLNAQYER E EQWAREIG AQ LRXMAD- XLNAQYER Hrk-BH3 RSSAAQLTAARLKALG- DELHQRTM RSSAAQLTAARLKXLGDX; LHQRTM NOXAA-BH3 AELPPEFAAQLR- Kl G DKVYCTW AELPPEFAAQLR- XIG DXVYCTW NOXAB-BH3 VPADLKDECAQLR- RIGDKVNLRQKL VPADLKDECAQLR- XIGDXVNLRQKL Nome Seqüência (negr = resid. críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) BMF-BH3 QHRAEVQIARKLQCIADQ- FHRLHT QHfRAEVQIARKLQXIADXz FHRLHT BLK-BH3 SSAAQLTAARLKALGDE- LHQRT SSAAQLTAARLKXLGDX: LHQRT BIK-BH3 CMEGSDALALRLACIG- DEMDVSLRA CMEGSDALALRLA- XIGDXMDVSLRA Bnip3 DIERRKEVESILKKNSD- WIWDWSS DIERRKEVESILKXNSD- XIWDWSS BOK-BH3 G RLAEVCAVLLRLG DE- LEMIRP GRLAEVCAVLLXLGD- XLEMIRP BAX-BH3 PQDASTKKSECLKRIG- DELDSNMEL PQDASTKKSECLKXIGD- XLDSNMEL BAK-BH3 PSSTMGQVGRQLAIIGD- DINRR PSSTMGQVGRQLAXIGD- XINRR BCL2L1-BH3 KQALREAGDEFELR KQALRXAGDXFELR BCL2-BH3 LS P PWH LALALR- QAGDDFSRR LSPPWHLALALR- XAGDXFSRR BCL-XL-BH3 EVIPMAAVKQALREAG- DEFELRY EVIPMAAVKQALFOÇAGDX; FELRY BCL-W-BH3 PADPLHQAM RAAGDE- FETRF PADPLHQAMRXAGDXFE- TRF MCL1-BH3 ATSRKLETLRRVGDGV- QRNHETA ATSRKLETLRXVGDXV- QRNHETA MTD-BH3 LAEVCTVLLRLGDELEQIR LAE VCTVLLXLG DXLEQIR MAP-1-BH3 MTVGELSRALGHENGS- LDP MTVGELSRALGXENG- XLDP NIX-BH3 WEGEKEVEALKK- SADWVS DWS WEGEKEVEALKX: SADXVSDWS 4ICD(ERBB4)- BH3 SMARDPQRYLVIQGD- DRMKL SMARDPQRYLN^CQGD- XRMKL

1: As seqüências de peptídio listadas na Tabela 1 são seqüências humanas

em que alvo o sítio de ligação BH3 e são implicadas em cânceres, distúrbios autoimunes, doenças metabólicas e outras condições de doenças humanas. TABELA 21

Nome Seqüência (negr = resid. críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) Pepetídios BH3 BID-BH3 QEDIIRNIAR- HLAQVGDSMDRSIPP QEDIIRNIXR- HLXQVGDSMDRSIPP BIM-BH3 DNRPEIWIAQELRRIG- DEFNAYYAR DNRPEIWIXQELXRIG- DEFNAYYAR BAD-BH3 NLWAAQRYGRELRRMS- DEFVDSFKK NLWAAQRYXRELXRMS- DEFVDSFKK PUMA-BH3 EEQWAREIGAQLRR- MADDLNAQYER E EQWAREIXAQ LXRMAD- DLNAQYER Hrk-B H 3 RSSAAQLTAARLKALG- DELHQRTM RSSAAQLTXARL)ÇALGDE- LHQRTM NOXAA-BH3 AELPPEFAAQLR- KIGDKVYCTW AELPPEFXAQLX: KIGDKVYCTW NOXAB-BH3 VPADLKDECAQLR- RIGDKVNLRQKL VPADLKDE)ÇAQL- XRIGDKVNLRQKL BMF-BH3 QHRAEVQIARKLQCIADQ- FHRLHT QHRAEVQIXRKLXCIADQ- FHRLHT BLK-BH3 SSAAQLTAARLKALGDE- LHQRT SSAAQLTXARLJÇALGDE- LHQRT BIK-BH3 CMEGSDALALRLACIG- DEMDVSLRA CMEGSDALXLRLXCIG- DEMDVSLRA Bnip3 DIERRKEVESILKKNSD- WIWDWSS Dl ERRKEVXSILXKNSD- WIWDWSS BOK-BH3 GRLAEVCAVLLRLGDE- LEMIRP GRLAEVXAVIJCRLGDE- LEMIRP BAX-BH3 PQDASTKKSECLKRIG- DELDSNMEL PQDASTKKXECLXRIG- DELDSNMEL BAK-BH3 PSSTMGQVGRQLAIIGD- DINRR PSSTMGQVXRQLXIIGD- DINRR BCL2L1-BH3 KQALREAGDEFELR XQALXEAGDEFELR BCL2-BH3 LSPPWHLALALR- QAGDDFSRR LSPPWHLXLAL2Ç: QAGDDFSRR BCL-XL-BH3 EVIPMAAVKQALREAG- DEFELRY EVIPMAAVXQALXEAGDE- FELRY Nome Seqüência (negr = resid. críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) BCL-W-BH3 PADPLHQAMRAAGDE- FETRF PADPLXQAMXAAGDEFE- TRF MCL1-BH3 ATSRKLETLRRVGDGV- QRNHETA ATSRKXETLXRVGDGV- QRNHETA MTD-BH3 LAEVCTVLLRLGDELEQIR LAEVXTVLXRLGDELEQIR MAP-1-BH3 MTVGELSRALGHENGS- LDP MTVGELXRALXHENGS- LDP NIX-BH3 WEGEKEVEALKK- SADWVSDWS WEGEKEXEALXK- SADWVS DWS 4ICD(ERBB4)- BH3 SMARDPQRYLVIQGD- DRMKL SMARDPXRYLXIQGD- DRMKL

1: As seqüências de peptídio listadas na Tabela 2 são seqüências humanas em que alvo o sítio de ligação BH3 e são implicadas em cânceres, distúrbios autoimunes, doenças metabólicas e outras condições de doenças humanas. TABELA 31

Nome Seqüência (negr = resid. críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) peptídios P53 hp53 pepti- de_veryshort LSQETFSDLWKLLPEN XSQEXFSDLWKLLPEN hp53 pepti- de_short PPLSQETFSDLWKLL- PENN PPXSQEXFSDLWKLLPENN hp53-P27S peptide-short PPLSQETFSDLWKLL- SENN PPXSQEXFSDLWKLLSENN hp53 pepti- de_ Long DPSVEPPLSQETFSDLW- KLLPENNVLSPLP DPS VE PPXSQEXFS DLWKL- LPENNVLSPLP hp53-P27S peptide_ Long DPSVEPPLSQETFSDLW- KLLSENNVLSPLP DPSVEPPXSQEXFSDLWKL- LSENNVLSPLP hp53 pepti- de_veryshort LSQETFSDLWKLLPEN LSQETFSDLWXLLPXN hp53 pepti- de_short PPLSQETFSDLWKLL- PENN PPLSQETFSDLWXLLPXNN Nome Seqüência (negr = resid. críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) hp53-P27S peptide-short PPLSQETFSDLWKLL- SENN PPLSQETFSDLWXLLSXNN hp53 pepti- de_ Long DPSVEPPLSQETFSDLW- KLLPENNVLSPLP DPSVEPPLSQETFSDLWXL- LPXNNVLSPLP hp53-P27S peptide_ Long DPSVEPPLSQETFSDLW- KLLSENNVLSPLP DPSVEPPLSQETFSDLWXL- LSXNNVLSPLP

1: As seqüências de peptídio listadas na Tabela 3 são seqüências humanas que alvejam o sítio de ligação p53 da mdm2/x e são envolvidas com cânce- res.

TABELA 41.

Nome Seqüência (negr = resid. críticos) Seqüência de reticulação (X = resíd Iigante x) Peptídios Iigantes GPCR DRVYIHPF DRXYXHPF Angiotensina Il EQRLGNQWA VGHLM EQRLGNXWA VGHLX Bombesina RPPGFSPFR RPPXFSPFRX Bradiquinina ISHKDMQLGR ISHKDMXLGRX C5a ARASHLGLAR ARASHLXLARX C3a SYSMEHFRWGKPV SYSMXHFRWXKPV Hormônio de es- tímulo do - melanócito

1: As seqüências de peptídio listadas na Tabela 4 são seqüências humanas que alvejam receptores ligados pela proteína G e são envolvidos em diver- sas condições de doenças humanas (Tyndall, J.D.A. et al. Chem. Ver. 2005, 105, 793-826).

Métodos de síntese dos macrociclos peptidomiméticos da invenção.

Os métodos de síntese dos macrociclos peptidomiméticos da

invenção são aqui descritos. Os grupos de proteção alternativos mas equiva- lentes, grupos de partida ou reagentes são substituídos, e determinadas e- tapas de síntese são executadas em seqüências ou ordens alternativas para produzir os compostos desejados. As transformações da síntese química e as metodologias de grupos protetores (proteção e desproteção) úteis para síntese dos compostos aqui descritos incluem, por exemplo, aqueles tal co- mo descrito em Larock1 Comprehensive Organic Transformations, VCH Pu- blishers (1989); Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis1 2d. Ed., John Wiley & Sons (1991); Fieser & Fieser1 Fieser and Fieser's Rea- gents for Organic Synthesis1 John Wiley & Sons (1994); e Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organie Synthesis1 John Wiley & Sons (1995), e edições subsequentes das mesmas.

Os macrociclos peptidomiméticos da invenção são produzidos, por exemplo, por métodos de síntese química, tal como descrito em Fields et al., Capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Fre- eman & Co., Nova York, NY, 1992, p. 77. Desse modo, por exemplo, os pep- tídios são as utilizadas nas técnicas de síntese Merrifield automatizadas em fase sólida com a amina protegida por tBoc ou Fmoc utilizando cadeias Iate- rais protegidas por aminoácidos em, por exemplo, um sintetizador de peptí- dio automatizado (por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Califórnia), Modelos 430A, 431 ou 433).

Uma maneira de produzir os peptídios e peptidomiméticos pre- cursores aqui descritos usa a síntese de peptídio em fase sólida (SPPS). A terminação C do aminoácido é ligada a uma resina de poliestireno reticulada via uma ligação lábil ao ácido com uma molécula de ligante. Esta resina é insolúvel nos solventes usados para a síntese, tornando-o relativamente simples e rápido de serem retirados por lavagem o excesso de reagentes e os subprodutos. A terminação é protegida com o grupo Fmoc1 que é estável no ácido, mas removível pela base. A cadeia lateral grupos funcionais é pro- tegida segundo a necessidade com grupos estáveis à bases, e lábeis aos ácidos.

Os peptídios precursores mais longos são produzidos, por e- xemplo, conjuntando natural de utilização de peptídios sintético individual ligação química. Alternativamente, os peptídios sintéticos mais longos são biossintetizados por DNA recombinante e técnicas de expressão de proteína bem conhecidas. Tais técnicas são fornecidas em manuais padrão bem co- nhecidos com protocolos detalhados. Para construir um gene que codifica um peptídio precursor da presente invenção, a seqüência de aminoácido é reversamente transcrita para obter uma seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácido, preferivelmente com codons que são ótimos para o organismo em que o gene deve ser expressado. Depois, é feito um gene sintético, tipicamente sintetizando oligonucleotídios que codifi- cam o peptídio e quaisquer elementos reguladores, se necessário. O gene sintético é inserido em um vetor de clonagem adequado que é transfectado em uma célula hospedeira. O peptídio então é expressado sob condições adequadas adequadas para o sistema de expressão e o hospedeiro selecio- nado. O peptídio é purificado e caracterizado por métodos padrão.

Os peptídios e os peptidomiméticos precursores são produzidos, por exemplo, em uma elevada quantidade, utilizando um estilo combinatório, por exemplo, um sintetizador combinatorial de policanal e de elevada quanti- dade tratada (por exemplo, Ápice Modelar 396 sintetizador de peptídio multi- canal da AAPPTEC Inc., Louisville, Kentucky).

A discussão abaixo é oferecida para ilustrar alguns dos diversos métodos disponíveis para uso na montagem dos compostos da invenção. Entretanto, a discussão não está destinada a limitar o alcance das reações ou seqüências de reação que são úteis no preparo dos compostos da pre- sente invenção.

Os seguintes esquemas de síntese são fronecidos somente para ilustrar a presente invenção e não estão destinados a limitar o alcance da invenção, tal como aqui descrito. Para simplificar os desenhos, os esquemas ilustrativos descrevem os análogos de aminoácido derivados da L- ou D- cisteína, na qual L1 e L3 são ambos -(CH2)-. Entretanto, como observado em diversas partes da descrição detalhada acima, muitos outros análogos de aminoácido podem ser empregados em que Li e L3 podem ser independen- temente selecionados das diversas estruturas aqui descritas. Os símbolos "[AA]m", "[AA]n", "[AA]0" representam uma seqüência de ligação ligação ami- dadas às porções, tais como aminoácidos naturais ou não naturais. Como descrito anteriormente, cada ocorrência de "AA" é independente de qualquer outra ocorrência de "AA", e uma fórmula, tal como "[AA]m" abrange, por e- xemplo, seqüências de aminoácidos não idênticos bem como seqüências de aminoácidos idênticos. Esquema de Síntese 1:

Trt,.

Vm

FmOC-NXC02H H

R-1

Trtv

Uh3

FmOCvN C02H H

R-Z

β'™

H J

Fmoc^X H

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S

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f^-NxCO3H H

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H íf -Jj

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í R iH

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H

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IAAJn N yf^-- IAAir N 'X^AAK

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S-Trt R = HouMe

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H 9

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H

[AAjn' NX XAA]„ S-Trt SfS

S-Trt R = H ou Me

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S-Trt

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R = H ou Me

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SH

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R SH

R = H ou Me

-IAAI0

R = H ou Me

(AA)s R = H ou Me

[AAIPI-

R SH

H I íaau"NX ÍAA]0

Vr

SrS SH

R = H ou Me

10

Neste primeiro método geral, peptidomimético precursor contém duas porções -SH e é sintetizado pela síntese de peptídio em fase sólida (SPPS) utilizando aminoácidos Ν-α-Fmoc comercialmente disponíveis, tais como Ν-α-Fmoc-Stritila- L-cisteína ou Ν-α-Fmoc-S-tritila-D-cisteína. As ver- sões alfa-metiladas de D-cisteína ou L-cisteína são geradas por métodos conhecidos (Seebach et al. (1996), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:2708- 2748, e referências na mesma) e depois convertido nos monômeros N-a- Fmoc-S-tritila adequadamente protegido por métodos conhecidos ("Bioorga- nic Chemistry: Peptides and Proteins", Oxford University Press, Nova York: 1998, os teores inteiros da qual são aqui incorporados pela referência). O peptidomimético precursor então é desprotegido e clivado da resina de fase sólida por condições padrão (por exemplo, ácido forte, tais como TFA a 95%). O peptidomimético precursor é reagido como uma mistura bruta ou é purificado antes da reação com X-L2-Y em soluções orgânicas ou aquosas. Em algumas modalidades a reação de alquilação é realizada sob condições

diluídas (isto é 0,15 mmol/L) para favorecer a macrociclização e evitar a po- limerização. Em algumas modalidades, a reação de alquilação é realizada em soluções orgânicas, tais como NH3 líquida (Mosberg et al. (1985), J. Am.Chem. Soe. 107:2986- 2987; Szewczuk et al. (1992), Int. J. Peptide Pro- tein Res. 40 :233-242), NH3/MeOH, ou NH3/DMF (Or et al. (1991), J. Org.

Chem. 56:3146-3149). Em outras modalidades, a alquilação é realizada em uma solução aquosa tal como guanidina-HCL 6M, pH 8 (Brunel et al. (2005), Chem. Commun. (20):2552-2554). Em outras modalidades, o solvente usado para a reação de alquilação é DMF ou dicloroetano. Esquema de Síntese 2:

r

Mmt.

Fmoc-

s k

<

r XOiH H

R-1

Mmt „

FmOC-

ft-a

IM

S

hJ

pm0c^NxCOiH H

S-I

IyJPH3

N' vCO1H H

Mmt

S

HsC J

pm0c^xXO2H

H

S-2

>

SPPS

s<jpoite ÜÓÍCÍ3

H0 H0

VMmt x^Mmt R = hoJ^

H £ H I , â

IAAJn ^ (AAJra'"N X EAA]^

\ R R = HouMe

S-Mmt S,R S-Mntt

Hg Hg

íAAIcT

VLt R,S VMmt R = HouMe

IAAJ11

H

iAAJ^Sr^IAA];

suporte ·

\ R

S-Mmt S,S S-Mfrvt

R = H ou Me

10

ÍAA]P

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χ R

H ff Ir

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IAAJn"'' R,R

I ° H

SaMAA^

V S1R V

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H 9 H

IAA]

(AA)0

R = H ou Me

-IAAl0 R = H ou Me

Despr oteçâo R-S-Mmt

IAAJn-

tAAj,,·

H η H ?\

SH

H Q

M

1. XrLj-Y

0

A

R SH

O

--!AAl0

2. Desproteção de outros AAs

O

\

R'R SH

H

sJm

SH H <>

[AAJ0-

R = H ou Me

V V.

R

R,$

-L2-

R

e clivagem R = H ou Me

IAAJt3

cR Ir

'SH R,S SH R = H ou Me

(AAlo

R = H ou Me

H 9 HJ [aaj„ ·--N (AAirTfvl yi^ (AA)0 \ R S.S (*

IAAJn

SfS

R = H ou Me

O η O

A J.X ΙΛΛ1,-

" (AAJrj; X -JAAJ0

·, R VR R = HouMe

SH S1S SH

Neste segundo método geral, peptidomimético precursor contém duas ou mais porções -SH1 das quais duas são especialmente protegidos para permitir a sua desproteção seletiva e alquilação subsequente para for- mação de macrociclo. O peptidomimético precursor é sintetizado pela sínte- se de peptídio em fase sólida (SPPS) utilização Ν-α-Fmoc aminoácidos co- mercialmente disponível, tais como Ν-α-Fmoc-S-p-metoxitritila-L-cisteína ou Ν-α-Fmoc-S-pmetoxitritila-D-cisteína. As versões alfa-metilada de D-cisteína ou L-cisteína são geradas por métodos conhecidos (Seebach et al. (1996), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:2708-2748, e referências no mesmo) e de- pois convertido nos monômeros Ν-α-Fmoc-S-p-metoxitritila adequadamente 10

15

protegidos por métodos conhecidos (Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins, Oxford University Press, New York: 1998, os teores inteiros da qual são aqui incorporados pela referência). Os os grupos protetores Mmt do pre- cursor peptidomimético são então seletivamente clivados por condições pa- drão (por exemplo, ácido brando, tais como TFA a 1 % em DCM). O pepti- domimético precursor então é reagido na resina com X-L2-Y em uma solução orgânica. Por exemplo, a reação se realiza na presença de uma base impe- dida, tal como di-isopropil etilamina. Em algumas modalidades, a reação de alquilação é realizada em soluções orgânicas, tal como NH3 líquido (Mos- berg et al. (1985), J. Am.Chem. Soe. 107:2986-2987; Szewczuk et al. (1992), Int. J. Peptide Protein Res. 40 :233-242), NHs/MeOH, ou NH3/DMF (Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56:3146-3149). Em outras modalidades, a reação de alquilação é realizada em DMF ou dicloroetano. O macrociclo peptidomimé- tico então é desprotegido e clivado da resina de fase sólida por condições padrão (por exemplo, ácido forte, tais como TFA de 95 %). Esquema de Síntese 3:

X

<

Pmoc-

R

N COsH H

R-3

S

vCOiH

V

R-A

R = H ou Me

SPPS

[AAjn

O

IAA!,

\ R S-Mmt r^

W R = H°UMe

Desproteção R-S-S-tBu

[AAfcl-

K

O

A

S-Wrrii

R = H ou Me

X-I2-Y

IMk'

P H 9 {SMpoftel * μ A Λ «á«b /

{AAlm X ^mZ R _ . \R S-Mmt r^r SH

R = H ou Me

1. Desproteção R-S-Mmt

2. ciclização

R = H ou Me

Clivagem e m° H

desproteção N 1 N U

—- ÍAAt X^(AA)0

\ R R.R \R

S- S R = H ou Me

Neste terceiro método geral, o peptidomimético precursor con- tém duas ou mais porções -SH1 das quais duas são especialmente protegi- das para permitir a sua desproteção seletiva e alquilação subsequente da formação do macrociclo. O peptidomimético precursor é sintetizado pela sín- tese de peptídio em fase sólida (SPPS) utilização Ν-α-Fmoc comercialmente disponível aminoácidos, tais como Ν-α-moc -S-p-metoxitritila-L-cisteína, N-a- Fmoc-S-pmetoxitritila- D-cisteína, Ν-α-Fmoc-S-S-sec-butila-L-cisteína, e N- α-Fmoc-S-S-sec-butila-D-cisteína. As versões alfametilada de D-cisteína ou L-cisteína são geradas por métodos conhecidos (Seebach et al. (1996), An- gew. Chem. Int. Editor. Engl. 35:2708-2748, e referências no mesmo) e de- pois convertido nos monômeros Ν-α-Fmoc-S-p-metoxitritila ou N-a-Fmoc-S- S-sec-butila adequadamente protegido por métodos conhecidos (Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins, Oxford University Press, Nova York: 1998, os teores inteiros da qual são aqui incorporados pela referência). O grupo protetor S-S-tButil do peptidomimético precursor é seletivamente clivado por condições conhecidas (por exemplo, 20% 2-mercaptoetanol em DMF, refe- rência: Galande et al. (2005), J. Comb. Chem. 7:174-177). O peptidomiméti- co precursor então é reagido na resina com um excesso de molar de X-L2-Y em uma solução orgânica. Por exemplo, a reação se realiza na presença de uma base impedida, tal como di-isopropil etilamino. O Mmt o grupo protetor do peptidomimético precursor então é seletivamente clivado por condições padrão (por exemplo, ácido brando, tal como TFA a 1 % em DCM). O pepti- domimético precursor então é ciclizado na resina pelo tratamento com uma base impedida em soluções orgânicas. Em algumas modalidades, a reação de alquilação é realizada em soluções orgânicas, tal como NH3/MeOH ou NH3/DMF (Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56:3146-3149). O macrociclo pep- tidomimético então é desprotegido e clivado da resina em fase sólida por condições padrão (por exemplo, ácido forte, tal como TFA a 95 %). Esquema de Síntese 4:

1. Síntese biológica de peptídeo

2. Purificação do peptídeo

Neste quarto método geral, o peptidomimético precursor contém duas porções de L-cisteína. O peptidomimético precursor é sintetizado por sistemas biológicos de expressão conhecidos em células vivas ou por méto- dos de expressão conhecidos, sem célula, in vitro. O peptidomimético pre- cursor é reagido como uma mistura bruta ou é purificado antes da reação com X-L2-Y em soluções orgânicas ou aquosas. Em algumas modalidades a reação de alquilação é realizada condições sob diluídas (isto é 0,15 mmol/L) para favorecer a macrociclização e evitar a polimerização. Em algumas mo- dalidades, a reação de alquilação é realizada em soluções orgânicas, tal como NH3 líquido (Mosberg et al. (1985), J. Am.Chem. Soe. 107:2986- 2987; Szewczuk et al. (1992), Int. J. Peptide Protein Res. 40:233-242), NH3/MeOH, ou NH3/DMF (Or et al. (1991), J. Org. Chem. 56:3146-3149). Em outras mo- dalidades, a alquilação é realizada em uma solução aquosa tal como guani- dina-HCL 6M, pH 8 (Brunel et al. (2005), Chem. Commun. (20):2552-2554). Em outras modalidades, a alquilação é realizada em DMF ou dicloroetano. Em outra modalidade, a alquilação é realizada para não desnaturar as solu- ções aquosas, e em ainda outra modalidade a alquilação é realizada sob condições que favorecem a formação da estrutura α-helicoidal. Em ainda outra modalidade, a alquilação é realizada sob condições que favorecem a ligação do peptidomimético precursor com outra proteína, de modo a induzir a formação da conformação α-helicoidal ligada durante a alquilação.

Várias modalidades para XeY são visualizadas que são ade- quados para reagir com grupos tiol. Em geral, cada um X ou Y pode ser in- dependentemente selecionado da categoria geral mostrada na Tabela 5. Por exemplo, XeY são haletos, tais como -Cl, -Br ou -I. Tabela 5:

Exemplos de Grupos Reativos Capazes de Reação com Grupos tiol e as Ligações Resultantes.

XouY Ligação Covalente Resultante Acrilamida Tioéter Haleto (p.ex. de alquila ou de arila) Tioéter Sulfonato Tioéter Aziridina Tioéter Epóxido Tioéter XouY Ligação Covalente Resultante Haloacetamida Tioéter Maleimida Tioéter Éster sulfonato Tioéter

A Tabela 6 mostra exemplos de macrociclos de acordo com a invenção. Para os exemplos mostrados nesta tabela, um polipeptídio não macrocíclico correspondente é o fragmento de seqüência de polipeptídio BID BH3, DIIRNIARHLAQVGDSMDRSI. "NL" representa a norleucina e substitui um resíduo de metionina. É visualizado que Iigantes semelhantes são usa- dos para sintetizar macrociclos peptidomiméticos baseados nas seqüências de polipeptídio descritas da Tabela 1 até a Tabela 4.

TABELA 6: Exemplos de Macrociclos Peptidomiméticos da Invenção

Ac-D11RNIARHLA'"'

H NL

O

H

-VGD'

H

,N„

NtDRSJ-MH2 MW = 2449

Γ H

hI h ji

Ao-OllRNIARHLAr^N^ ^VGD-^N^' ^NlDRSI-NH2 \ H / H

O

MW = 2435

Ac-DURNl ARHLA^

H N.

O

H -N

O

VGD-x X -NlDRSI-NH2 MW - 2497

? H

Ac-DIIRNIARHLA^r*X^VGOx" X^NlDRSI-NH2 MW = 2503

/ H

H 9 H y

Ac-DIIRNlARHLA'-'NX^ -VGD'''NX "NLDRSi-NH2

O

\

H

MW s 2447

V TABELA 6: Exemplos de Macrociclos Peptidomiméticos da Invenção

H O

Ac-DWRNIARHLA^X^VGD \ H

H ° N.

NLDRSI-NH2 MW = 2447

H

Ac-DIIRNIARHLA-"

Hj H J

- VGDX^N1DRSI-NHa

\ CH3

/

CHa

AoDIlRNlÃRHLA"*"

H N,

\ CH3 S

H V

VGD-^n X ^NiDRSI-NH2 / CHá

H M.

Ac- Dl! RNtARHLA^" " χ -VGD \ CH3

s—\

P H P

Γ CH-> T CHt

DRSI-NH2

/

H O H O

Ac-DIIRNIARHLA^ N

\ CH3

s-

/ s

H

CH3

AoDHRNIARHUr'NX^^VGD^N>^J^NLDRSI-NH2

^ CH^

S—λ

/

H

H O

I

Ae-DHRNIARHLA^N^ -VGD^n \ CHd ;

CH3

O

MW = 2477

MW = 2463

MW = 2525

-NiDRSI-NH2 MW = 2531

MW = 2475

NlDRSI-NHj MW = 2475

Para os exemlos mostrados nessa tabela, um polipeptídio não mcrocíclico correspondente, é a sequencia de fragmentos de peptídios BID BH3, Dl- IRNIARHLAQVGDSMDRSI. "NL" representa a norleucina._

Análogos de Aminoácido.

A presente invenção contempla o uso tanto de aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não-natural e análogos de aminoácido na síntese dos macrociclos peptidomiméticos descritos acima. Podem ser usados quaisquer aminoácido ou análogo de aminoácido acessível aos mé- todos sintéticos empregados para a síntese da bissulfidrila estável contendo macrociclos peptidomiméticos na presente invenção. Por exemplo, a cisteína é contemplada como um aminoácido útil na presente invenção. Entretanto, aminoácidos contendo enxofre diferentes da cisteína contendo uma cadeia lateral de aminoácido diferente é também útil para a invenção. Por exemplo, a cisteína contém uma unidade de metileno entre o carbono α do aminoáci- do e o -SH terminal da cadeia lateral de aminoácido. A invenção também contempla o uso de aminoácidos com múltiplas unidades de metileno entre o carbono α e o -SH terminal. Os exemplos não-limitantes incluem a L- homocisteína, Dhomocisteína, α-metil-L-homocisteína e a-metil-D- homocisteína. Em algumas modalidades os aminoácidos e os análogos de aminoácido estão na configuração D. Em outras modalidades eles estão na configuração L. Em algumas modalidades, alguns aminoácidos e análogos de aminoácido contidos no peptidomimético estão na configuração D en- quanto alguns aminoácidos e análogos de aminoácido estão na configuração L. Em algumas modalidades os análogos de aminoácido são α,α- dissubstituídos, tal como α-metil-Lcisteína e α-metila-D-cisteína. Em algu- mas modalidades os análogos de aminoácido são N-alquilted, por exemplo, N-metila-L-cisteína e N-metila-D-cisteína.

Outros análogos de aminoácidos úteis da presente invenção pa- ra formar macrociclos peptidomiméticos são os compostos de acordo com a Fórmula lia:

PQ

Ks (Fórmula lia),

em que:

R1 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloal- quilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila;

Li é independentemente alquileno, alquenileno, alquinileno, he- teroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloari- Ieno ou [-R^K-R4-Jn1 não-substituído ou substituído com R5;

K é O1 S, SO1 SO2, CO, CO2, ou CONR3;

R5 é independentemente o halogênio, alquila, -OR6, -N(R6)2, - SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, uma porção fluorescente, um isótopo radioati- vo ou um agente terapêutico;

R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilal- quila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico;

R7 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila;

R9 e R10 são independentemente -H ou um grupo de proteção adequado para a síntese de peptídio;

η é um número inteiro de 1 a 5;

Q é S; e

Pé -H, -tritila, p-metoxitritila, -S-sec-butila, ou qualquer outro

grupo de proteção adequado para a síntese de peptídio; ou Q e P quando tomados em conjunto formam uma porção capaz de sofrer uma transforma- ção química em um grupo -SH.

Em algumas modalidades as porções -NH ou -SH do aminoácido são protegidas. Em outras modalidades tanto as porções são protegidas, por exemplo grupos protetores para quaisquer porções -NH e -SH em aminoáci- dos. Os exemplos não-limitantes de tais grupos protetores de -NH são - Fmoc e -Boc. Os exemplos não-limitantes de grupos protetores de -SH são - tritila, p-metoxitritila, e -S-sec-butila. Em outras modalidades, aminoácido não é protegido antes da síntese do macrociclo peptidomimético. TABELA 7. Exemplos de aminoácidos da invenção.

X

FfTioc,

H

N CO2H H

N-a-Fmoc-S-S-t-Bu-L-cisteina

MmL

Fmoc,

H

N XO2H H

N-a-Fmoc-S-p-metoxitritil-L-cisteina

Trt,

Fmoc^

H

N CO2H H

N-a-Fmoc-S-tritil-L-cisteina

/

Fmoc s

N XO2H H

R-a-metila N-a-Fmoc-S-S-t-Bu-cisteina

Mmtv

FmOC-N- -CO2H H

R-a-metila N-a-Fmoc-S-p-metoxitritil-cisteina

TrtL

\ -P*"®3

FmOC-N^C02H H

R-a-metila N-a-Fmoc-S-tritil-cisteina

Liqantes que Formam o Macrociclo.

A presente invenção inclui Iigantes que formam o macrociclo u- sados para ligar duas ou mais porções -SH nos peptidomiméticos precurso- res para formar os macrociclos peptidomiméticos da invenção. Tal como descrito acima, os Iigantes que formam o macrociclo comunicam a inflexibili- dade conformacional, aumentam a estabilidade metabólica e/ou aumentam a penetrabilidade celular. Além disso, em algumas modalidades, as ligações que formam o macrociclo estabilizam a estrutura α-helicoidal secundária dos macrociclos de peptidomimético. Os Iigantes que formam o macrociclo estão na fórmula X-L2-Y, em que tanto X e Y são as mesmas porções ou diferen- tes, que foram definidas acima. Ambas XeY têm as características quími- cas que permitem a um Iigante que forma o macrociclo -L2- bis-alquilado o conteúdo de bis-sulfidrila do peptidomimético precursor. Tal como definido acima, o Iigante -L2- inclui alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquile- no, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, ou heterocicloarileno, ou -R4-K-R4-, todos os quais podem ser opcionalmente substituídos com um grupo R5, tal como definido acima. Além disso, de 1 a 3 átomos de carbono dentro dos Iigantes que formam o macrociclo -L2-, diferentes dos carbonos ligados ao -SH da sulfidrila contendo aminoácido, são opcionalmente substi- tuídos com um heteroátomo, tal como N, S ou O.

O componente L2 do Iigante que forma o macrociclo XL2- Y pode ser variado no comprimento dependendo de, entre outras coisas, a distância entre as posições dos dois análogos de aminoácido usados para formar o macrociclo peptidomimético. Além disso, como os comprimentos de Li e/ou 10 os componentes de L3 do Iigante que forma o macrociclo são variados, o comprimento de L2 também pode ser variado para criar um Iigante de com- primento total apropriado para formar um macrociclo peptidomimético está- vel. Por exemplo, se os análogos de aminoácido usados são variados acres- centando uma unidade de metileno adicional a cada um dos comprimentos 15 de Li e L3, o L2 é reduzido no comprimento pelo equivalente de aproxima- damente duas unidades de metileno para compensar os comprimentos au- mentados de Li e L3.

Em algumas modalidades, L2 é um grupo alquileno da fórmula -(CH2)n-, onde n é um número inteiro entre aproximadamente 1 e aproxima- damente 15. Por exemplo, n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outras moda- lidades, L2 é um grupo alquenileno. Em ainda outras modalidades, L2 é um grupo arila.

A Tabela X mostra modalidades adicionais de grupos XL2-Y. Kits.

Em outro aspecto, a presente invenção adicionalmente fornece kits compreendendo análogos de aminoácido e/ou Iigantes que formam ma- crociclo tal como aqui descrito. Em uma modalidade o kit contém

a) um composto de acordo com a Fórmula Ila e um composto de acordo com a Fórmula Nb: PO PQ

Rs

IIa Xtb

em que

R1 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, heteroal- quila, ou heterocicloalquila não-substituída ou substituída com halogênio;

R2 é -H1 alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, ou heterocicloalquila não-substituído ou substituído com halogênio;

Li e L3 são independentemente alquileno, alquenileno, alquinile- no, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, ou hete- rocicloarileno ou [-R4-K-R4-Jn, cada um sendo não-substituído ou substituído com R5;

K é O1 S, SO, SO2, CO, CO2l ou CONR3;

R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R5 é indepen- dentemente o halogênio, alquila, -OR6, -N(Re)2, -SR6, -S0R6, -SO2R6, - CO2R6, -R6, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico;

cada R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma por- ção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico;

R7 e R8 são independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila;

QéS;

P é -H, -tritila, p-metoxitritila, -S-sec-butila, ou qualquer outro grupo de proteção adequado para a síntese de peptídio em fase líquida ou sólida; ou Q e P quando tomados em conjunto formam uma porção capaz de sofrer uma transformação química em um grupo -SH; n é um número inteiro de 1 a 5; e

b) um Iigante que forma o macrociclo da estrutura:

X-L2-Y

em que L2 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquile- no, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, ou [-R11-K-Rn-In, cada um sendo não-substituído ou substituído com Ri2;

cada R11 é alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno;

cada Ri2 é independentemente o halogênio, alquila, - OR13, -

N(Re)i3, -SR13, -SOR13, -SO2R13, -CO2R13, -R13. uma porção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico;

cada R13 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma por- ção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico; e

XeY são cada um independentemente um grupo reativo capaz de reagir com um grupo tiol.

Em algumas modalidades, o kit compreende um ou mais reser- vatórios mantendo um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ou 20 análogos de aminoácido tal como aqui descrito. Em outras modalidades, o kit compreende um ou mais reservatórios mantendo um ou mais Iigantes que formam o macrociclo tal como aqui descrito. Em ainda outras modalidades, o kit compreende um ou mais reservatórios mantendo um ou mais aminoáci- dos ou análogos de aminoácido tal como aqui descrito, bem como um ou 25 mais reservatórios mantendo um ou mais Iigantes que formam o macrociclo tal como aqui descrito.

Por exemplo, em algumas modalidades, o kit compreende um reservatório mantendo pelo menos um análogo de aminoácido ou aminoáci- do, tal como descrito acima, tendo uma porção -SH, o aminoácido opcional- 30 mente protegido e adequado para a síntese aqui descrita. Em algumas mo- dalidades, análogo de aminoácido ou aminoácido é selecionado do grupo consistindo em L-cisteína, D-cisteína, L-N-metilcisteína, D-N-metilcisteína, L- homocisteína, D-homocisteína, L-N-metil-homocisteína, D-N-metil- homocisteína, a-metil-L-cisteína, α-metila-D-cisteína, a-metil-L- homocisteína, α-metila-D-homocisteína, L-penicilamina, D-penicilamina, 1-N- metilpenicilamina, D-Nmetilpenicilamina e todas as formas adequadamente protegidas para a síntese de peptídio em fase líquida ou sólida.

Em algumas modalidades, o kit compreende um reservatório mantendo pelo menos um aminoácido que ocorre naturalmente, um aminoá- cido de ocorrência não-natural, ou análogo de aminoácido ligado a um su- porte sólido compatível com a síntese descrita aqui para macrociclos pepti- domiméticos.

Em algumas modalidades, o kit compreende um reservatório mantendo um Iigante que forma o macrociclo tal como descrito acima. Em algumas modalidades, o kit adicionalmente compreende um ou mais reser- vatórios mantendo reagentes necessários para as reações de macrocicliza- 15 ção aqui descritas, tais como ácido trifluoroacético, amônia líquida, NHa/MeOH, NH3/DMF, mercaptoetanol, bases impedidas, tais como trietila- mina ou di-isopropil etilamino, e guanidina HCI.

Em algumas modalidades, o kit compreende um reservatório mantendo um análogo de aminoácido da invenção incluindo um grupo -SH 20 reativo em combinação com um reservatório mantendo um Iigante que forma o macrociclo da presente invenção. Opcionalmente, o kit adicionalmente compreende um ou mais reservatórios mantendo os reagentes necessários para a reação de macrociclização. Em outras modalidades, o kit compreende dois reservatórios, cada um dos quais mantém um análogo de aminoácido 25 diferente da invenção incluindo um grupo -SH reativo. Opcionalmente, o kit adicionalmente compreende um ou mais reservatórios mantendo os reagen- tes necessários para a reação de macrociclização e/ou um Iigante que forma o macrociclo da presente invenção.

Ensaios.

As propriedades dos macrociclos peptidomiméticos da invenção

são analisadas, por exemplo, usando os métodos descritos abaixo. Em al- gumas modalidades, um macrociclo da presente invenção melhorou as pro- priedades em relação a um polipeptídio não macrocíclico correspondente. Um polipeptídio não macrocíclico correspondente é, por exemplo, precursor de um macrociclo peptidomimético, tal como um composto de acordo com a Fórmula Ill que é convertido no dito macrociclo. Alternativamente, um poli- 5 peptídio não macrocíclico correspondente é uma seqüência de polipeptídio, tal como uma seqüência de polipeptídio natural que tem a sobreposição de seqüência substancial com o macrociclo da presente invenção. Os exemplos numerosos de polipeptídios naturais correspondente ao polipeptídio macro- cíclico são mostrados nas Tabelas 1, 2, 3 e 4.

Em geral, um polipeptídio não macrocíclico correspondente tam-

bém pode ser um polipeptídio natural marcado ou peptidomimético precur- sor. Tal marcação, por exemplo, por um marcador fluorescente ou radioativo, é usada se necessário em alguns ensaios descritos abaixo. Em tais ensaios, tanto o macrociclo e o polipeptídio não macrocíclico correspondente são tipi- 15 camente marcador por métodos semelhantes ou funcionalmente equivalen- tes.

Ensaio para Determinar o Teor Alfa-Helicoidal.

O teor helicoidal percentual dos domínios BH3 próapoptótico não modificados são predominantemente novelos aleatórios em solução, com 20 teor α-helicoidal normalmente abaixo de 25 %. Os macrociclos peptidomimé- ticos com Iigantes otimizados, por outro lado, possuem, por exemplo, um teor alfa-helicoidal que é pelo menos duas vezes maior do que aquela de um polipeptídio não macrocíclico correspondente. Em algumas modalidades, os macrociclos da invenção possuirão um teor alfa-helicoidal maior do que 25 50%. Para analisar o teor alfa-helicoidal de macrociclos peptidomiméticos da invenção, tais como macrociclos baseados no domínio BH3, os compostos são dissolvidos em solução aquosa de fosfato de potássio a 50 mM em pH

7, ou H20 destilada, em concentrações de 25 a 50 μΜ. Os espectros de di- croismo circular (CD) são obtidos sobre um espectropolarímetro (por exem- pio, Jasco J-710) a 20 0C utilizando os seguintes parâmetros de medição padrão: comprimento de onda: 190 a 260 nm; resolução de passo: 0,5 nm; velocidade: 20 nm/s; acúmulos: 10; resposta: 1 s; largura de banda: 1 nm; comprimento de percurso: 0,1 cm. O teor α-helicoidal de cada peptídio é cal- culado dividindo a elipticidade residual média [O]222obs pela relatada [<í>]222obs para um modelo de decapeptídio helicoidal (Yang et al. (1986), Methods Enzymol. 130:208)).

5 Ensaio para Determinar a Temperatura de Fusão (Tm).

Um macrociclo peptidomimético da invenção compreendendo uma estrutura secundária, tal como uma α-hélice exibe, por exemplo, uma temperatura de fusão mais alta do que um polipeptídio não macrocíclico cor- respondente. Tipicamente os macrociclos peptidomiméticos da invenção e- 10 xibem um Tm de > 60°C representando uma estrutura elevadamente estável em soluções aquosas. Os macrociclos peptidomiméticos e os peptídios não modificados são dissolvidos em H2O destilada na concentração final de 50 μΜ e o Tm é determinado medindo a modificação na elipticidade em um fai- xa de variação de temperatura (de 4 0C a 95 °C) sobre um espectropolaríme- 15 tro (por exemplo, Jasco J-710) utilizando os seguintes parâmetros de medi- ção: comprimento de onda: 222 nm; resolução de passo: 0,5 nm; velocidade: 20 nm/s; acúmulos: 10; resposta: 1 s; largura de banda: 1 nm; taxa de au- mento de temperatura: 1 °C/min; comprimento de percurso: 0,1 cm.

Ensaio de Resistência à Protease.

A ligação amida da cadeia principal de peptídio é suscetível à

hidrólise por proteases, formando assim compostos peptídicos vulneráveis à rápida degradação in vivo. A formação da hélice de peptídio, entretanto, tipi- camente enterra a cadeia principal de amida e por isso pode protegê-lo da clivagem proteolítica. Os macrociclos peptidomiméticos da presente inven- 25 ção são submetidos a proteólise de tripsina in vitro para avaliar qualquer modificação na taxa de degradação em comparação com um polipeptídio não macrocíclico correspondente. O macrociclo peptidomimético e um poli- peptídio não macrocíclico correspondente são incubados com o agarose de tripsina e as reações são extintas em vários pontos de tempo por centrifuga- 30 ção e subsequente injeção em HPLC para quantificar o substrato residual pela absorção ultravioleta em 280 nm. Resumidamente, o macrociclo pepti- domimético e o peptídio precursor (5 pg) são incubados com a agarose de tripsina (Pierce) (S/E -125) para 0, 10, 20, 90, e 180 minutos. As reações são extintas pela centrifugação em disco de alta velocidade; o substrato res- tante no sobrenadante isolado é quantificado pelo pico de detecção a 280 nm baseado em HPLC. A reação proteolítica exibe uma cinética de primeira 5 ordem e a taxa constante, k, é determinada a partir da representação gráfica de ln[S] contra o tempo (k = -1 x inclinação).

Ensaio de Estabilidade Ex-Vivo.

Os macrociclos peptidomiméticos otimizados com Iigantes pos- suem, por exemplo, uma meia-vida ex-vivo que é pelo menos duas vezes 10 maior do que aquela de um peptídio de polipeptídio não macrocíclico corres- pondente, e possui uma meia-vida ex-vivo de 12 horas ou mais. Para os es- tudos de estabilidade ex-vivo em soro, um macrociclo peptidomimético e um polipeptídio não macrocíclico correspondente (para um exemplo específico, um polipeptídio natural correspondente) (2 pg) são incubados com soro fres- 15 co de camundongo, de rato e humano (2 mL) a 37 °C, por 0, 1, 2, 4, 8, e 24 horas. Para determinar o nível de composto intacto, seguinte procedimento é usado: as amostras são extraídas transferindo 100 μΙ de soro para tubos de centrífuga de 2 ml seguido da adição de 10 μί de ácido fórmico a 50 % e 500 μΙ_ de acetonitrila e centrifugação em 14.000 RPM por 10 min a 4 ± 2 °C. 20 Os sobrenadantes são então transferidos para tubos limpos de 2 ml e evapo- rados em um Turbovap sob N2 < 68,95 kPa, 37 °C. As amostras são recons- tituídas em 100 pL de acetonitrila:água = 50:50 e submetidas á análise LCMS/ MS.

Ensaios de Ligação In vitro.

Para avaliar a ligação e a afinidade de macrociclos peptidomimé-

ticos e peptídios precursores ao receptor de proteína, é estruturado, por e- xemplo um ensaio de polarização de fluorescência (FPA). A técnica FPA mede a orientação e a mobilidade molecular utilizando a Iuz polarizada e um traçador fluorescente. Quando excitado com Iuz polarizada, os traçadores 30 fluorescentes (por exemplo, FITC) ligado a moléculas com altos pesos mole- culares aparentes (por exemplo, os peptídios marcados com FITC ligaram a uma grande proteína) emitem níveis mais elevados da fluorescência polari- zada devido as suas taxas mais lentas de rotação em comparação com tra- çadores fluorescentes ligados a moléculas menores (por exemplo, peptídios marcados com FITC que estão livres em solução).

Por exemplo, macrociclos peptidomiméticos fluoresceinados (25 5 nM) são incubados com a proteína receptora (25 a 1000 nM) em um tampão de ligação (140 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4) durante 30 minutos na temperatura ambiente. Atividade de ligação é medida, por exemplo, por pola- rização de fluorescência sobre um espectrofotômetro de luminescência Per- kin-Elmer LS50B. Os valores de Kd são determinados pela análise de re- 10 gressão não-linear utilizando o software Graphpad Prism. Um macrociclo peptidomimético da invenção exibe, por exemplo, um Kd similar ou inferior a um polipeptídio não macrocíclico correspondente.

As proteínas receptoras de peptídios BH3, tais como BCL-2, BCL-XL, BAX ou MCL1 podem ser usadas neste ensaio. A proteína recepto- ra de peptídios p53, tais como MDM2 ou MDMX podem ser usadas nesse ensaio.

Ensaios de Deslocamento in vitro para Caracterizar Antagonistas de Intera- ções entre Proteína e Peptídio.

Para avaliar a ligação e a afinidade de compostos que antagoni- zam a interação entre um peptídio (por exemplo, um peptídio BH3 ou um peptídio p53) e uma proteína receptora, é usado um ensaio de polarização de fluorescência (FPA) utilizando um derivado de macrociclo peptidomiméti- co fluoresceinado de uma seqüência de peptídio precursor está usada, por exemplo. A técnica FPA mede a orientação molecular e a utilização de mobi- lidade polarizou o traçador leve e fluorescente. Quando excitado com traça- dores leves, fluorescentes polarizados (por exemplo, FITC) ligado a molécu- las com altos pesos moleculares evidentes (por exemplo, os peptídios FITC- marcados ligaram a uma grande proteína) emitem níveis mais elevados da fluorescência polarizada devido as suas taxas mais lentas da rotação com- parando com traçadores fluorescentes ligados a moléculas menores (por exemplo, os peptídios FITC-marcados livres em solução). Um composto que contrai a interação entre o macrociclo peptidomimético fluoresceinado e uma proteína receptora será detectado em uma ligação competitivo experimento de FPA.

Por exemplo, os compostos de antagonista putativos (1 nM a 1 mM) e um macrociclo peptidomimético fluoresceinado (25 nM) são incuba- 5 dos com a proteína receptora (50 nM) no tampão de ligação (140 mM NaCI, 50 Tris-HCI de Mm, pH 7,4) durante 30 minutos na temperatura ambiente. O antagonista da atividade de ligação é medido, por exemplo, por polarização de fluorescência sobre um espectrofotômetro de luminescência Perkin-Elmer LS50B. Os valores de Kd são determinados pela análise de regressão não- 10 linear utilizando o software Graphpad Prism.

Qualquer classe de molécula, tal como pequenas moléculas or- gânicas, peptídios, oligonucleotídios ou proteína pode ser avaliada como antagonistas putativos neste ensaio. A proteína receptora de BH3-peptídios, tais como BCL2, BCL-XL, BAX ou MCLi pode ser usada neste ensaio. A pro- 15 teína receptora de peptídios p53, tais como MDM2 ou MDMX pode ser usa- da neste ensaio.

Ensaios de Ligação em Células Intactas.

É possível medir a ligação de peptídios ou macrociclos peptido- miméticos aos seus receptores naturais em células intactas por experimen- tos de imunoprecipitação. Por exemplo, as células intactas são incubadas com compostos fluoresceinados (marcados com FITC) por 4 horas na au- sência do soro, seguido por substituição com soro e incubação adicional que varia de 4 a 18 horas. As células são então peletizadas e incubadas no tam- pão de Iise (Tris 50 mM [pH 7,6], NaCI 150 mM, CHAPS a 1 % e coquetel de inibidor de protease) durante 10 minutos a 4 0C. Os extratos são centrifuga- dos em 14.000 rpm durante 15 minutos e os sobrenadantes coletados e in- cubados com 10 pL de anticorpo de cabra anti-FITC por 2 horas, que centri- fugam a 4 0C seguidos por incubação adicional de 2 horas a 4 0C com prote- ína Sefarose A/G (50 pL em lama de contas a 50 %). Depois da centrifuga- ção rápida, as pelotas são lavadas no tampão de Iise contendo concentração crescente de sal (por exemplo, 150, 300, 500 mM). Os pérolas são então reequilibradas em 150 mM NaCI antes da adição do tampão de mostra con- tendo SDS e da ebulição. Depois da centrifugação, os sobrenadantes são opcionalmente submetidos à eletroforese utilizando um gradiente de 4 % a 12 % géis de Bis-Tris, seguidos por transferência em membranas Immobilon- P. Depois do bloqueio, os blots são opcionalmente incubados com um anti- 5 corpo que detecta FITC e também com um ou mais anticorpos que detectam as proteínas que se ligam ao macrociclo peptidomimético, incluindo BCL2, MCL1, BCLXL, Al, BΑΧ, BAK, MDM2 ou MDMX.

Ensaios de Permeabilidade Celular.

Um macrociclo peptidomimético é, por exemplo, mais permeável à célula em comparação com um polipeptídio não macrocíclico correspon- dente. Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos são mais permeáveis à célula do que alguns dos polipeptídios não macrocíclicos cor- respondentes. Os macrociclos peptidomiméticos com Iigantes otimizados possuem, por exemplo, uma permeabilidade celular que é pelo menos duas vezes maior do que um polipeptídio não macrocíclico correspondente, e se observará muitas vezes que mais do que 20 % do peptídio aplicado terá pe- netrado a célula depois de 4 horas. Para medir a permeabilidade celular de macrociclos peptidomiméticos e polipeptídios não macrocíclicos correspon- dentes, as células intactas são incubadas com macrociclos peptidomiméticos fluoresceinados ou polipeptídios não macrocíclicos correspondentes (10 μΜ) por 4 horas em meios livres de soro a 37 °C, lavado duas vezes com meios e incubado com tripsina (0,25 %) por 10 min a 37 °C. As células são lavadas novamente e resuspensas em PBS. A fluorescência celular é analisada, por exemplo, usando um citômetro de fluxo FACSCaIibur ou um Leitor KineticS- can da Cellomics® HCS.

Ensaios de Eficácia Celular.

A eficácia de certos macrociclos peptidomiméticos é determina- da, por exemplo, pela utilização de ensaios a base de extermínio de células usando uma variedade de linhagem celular de células tumorigênicas e célu- 30 Ias não tumorigênicas e células primárias derivadas de populações de célu- las humanas ou de camundongo. A viabilidade celular é monitorada, por e- xemplo, durante 24 a 96 horas de incubação com macrociclos peptidomimé- ticos (de 0,5 a 50 μΜ) para identificar aqueles que exterminam em EC50 <10 μΜ. Vários ensaios padrão que medem a viabilidade celular estão comerci- almente disponíveis e são opcionalmente usados para avaliar a eficácia dos macrociclos peptidomiméticos. Além disso, os ensaios que medem Annexin 5 Vea ativação da caspase são opcionalmente usados para avaliar se os ma- crociclos peptidomiméticos exterminam células ativando o mecanismo apop- tótico.

Ensaio de Estabilidade in vivo.

Para investigar a estabilidade in vivo dos macrociclos peptido- miméticos, os compostos são, por exemplo, administrados a camundongos e/ou rato por IV, IP, PO ou rotas de inalação em concentrações variando de

0,1 a 50 mg/kg e as amostras de sangue são retiradas em 0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 4 horas, 8 horas e pós-injeção de 24 horas. Os níveis do composto intacto em 25 pL do soro fresco são então medidos por LC- MS/MS como mostrado acima.

Eficácia em Modelos Animais in vivo.

Para determinar a atividade de antioncogênica de certos macro- ciclos peptidomiméticos in vivo, os compostos são, por exemplo, ministrados sozinhos (IP, IV, PO, por inalação ou vias nasais) ou em combinação com 20 doses subótimas de quimioterápicos relevantes (por exemplo, ciclofosfami- da, doxorubicina, etoposídio). Em um exemplo, 5 x 106 células RS4;11 (es- tabilizadas a partir da medula óssea de um paciente com a leucemia Iinfo- blástica aguda) que expressam a Iuciferase de modo estável são injetadas pela veia de cauda em camundongos de NOD-SCID 3 horas depois de eles 25 terem sido submetidos à irradiação de corpo total. Se deixados não tratados, é formada uma leucemia é fatal depois de 3 semanas nesse modelo. A leu- cemia é rapidamente monitorada, por exemplo, injetando os camundongos com D-Iuciferina (60 mg/kg) e visualizando os animais anestesiados (por e- xemplo, Sistema Xenogen de Visualização In vivo, Caliper Life Science, 30 Hopkinton, Massachusetts). A bioluminescência de corpo total é quantificada pela integração do fluxo fotônico (fótons/s) pelo software da Living Image (Caliper Life Science, Hopkinton, Massachusetts). Os macrociclos peptido- miméticos sozinhos ou em combinação com doses subótimas de agentes quimioterápicos relevantes são, por exemplo, administrados a camundongos leucêmicos (10 dias depois da injeção/1 dia do experimento, em biolumines- cência de 14 a 16) por veia da cauda ou via IP em doses variando de 5 0,1 mg/kg a 50 mg/kg durante 7 a 21 dias. Opcionalmente, os camundongos são visualizados em todas as partes do experimento dia sim, dia não, e a sobrevivência é monitorada diariamente por toda a duração do experimento. Os camundongos que sucumbem são opcionalmente submetidos à necrop- sia no fim do experimento. Outro modelo dos animais é a implantação de 10 DoHH2, uma linhagem celular derivada do Iinfoma folicular humano, em ca- mundongos NOD-SCID que expressam a Iuciferase de modo estável. Esses testes in vivo opcionalmente geram preliminarmente a farmacocinética, a farmacodinâmica e os dados de toxicologia.

Provas Clínicas.

São realizadas provas clínicas para determinar a estabilidade

dos macrociclos peptidomiméticos da invenção para tratamento de seres humanos. Por exemplo, os pacientes diagnosticados com câncer e com ne- cessidade de tratamento são selecionados e separados para tratamento e um ou mais grupos de controle, enquanto ao grupo de tratamento é adminis- 20 trado um macrociclo peptidomimético da invenção, os grupos de controle recebem um placebo ou um fármaco anticâncer conhecida. A segurança de tratamento e a eficácia dos macrociclos peptidomiméticos da invenção po- dem ser assim avaliadas executando as comparações dos grupos de pacien- tes em relação a fatores, tais como sobrevivência e qualidade de vida. Neste 25 exemplo, grupo de pacientes tratados com macrociclo peptidomimético mos- traram sobrevivência de longo prazo melhorada em comparação com os pa- cientes do grupo de controle tratados com um placebo.

Composições Farmacêuticas e Vias de Administração.

Os macrociclos peptidomiméticos da invenção também incluem derivados farmaceuticamentes aceitávéis ou prodrogas dos mesmos. Um "derivado farmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal, éster, sal de um éster, profármaco ou outro derivado de um composto da presente inven- ção farmaceuticamente aceitável que, durante a administração a um recep- tor, é capaz de fornecer (direta ou indiretamente) um composto da presente invenção. Os derivados farmaceuticamente aceitávéis particularmente favo- recidos são aqueles que aumentam a biodisponibilidade dos compostos da 5 invenção quando administrados a um mamífero (por exemplo, aumentando absorção no sangue de um composto administrado oralmente) ou que au- mentam a liberação do composto ativo composto a um sítio biológico (por exemplo, cérebro ou sistema linfático) em relação às espécies originais. Al- guns derivados farmaceuticamente aceitávéis incluem um grupo químico que 10 aumenta a solubilidade aquosa ou o transporte ativo através da mucosa gas- trointestinal.

Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção são modificados por ligações covalentes ou não-covalentes a gru- pos funcionais apropriados para melhorar propriedades biológicas seletivas. 15 Tais modificações incluem aquelas que aumentam a penetração biológica em um dado sítio biológico (por exemplo, sangue, sistema linfático, sistema nervoso central), aumentam a disponibilidade oral, aumentam a solubilidade para permitir a administração por injeção, alteram o metabolismo, e alteram a taxa de excreção.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presen-

te invenção incluem os derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitávéis. Os exemplos de sais ácidos adequados in- cluem acetato, adipato, benzoato, benzenossulfonato, butirato, citrato, diglu- conato, dodecilsulfato, formato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, 25 hexanoato, hidrocloreto, hidrobrometo, hidroiodeto, lactato, maleato, malona- to, metanossulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fos- fato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartarato, tosi- Iato e undecanoato. O derivado de sais de bases adequadas incluem sais de metal alcalino (por exemplo, sódio), metal alcalino terroso (por exemplo, 30 magnésio), amônio e N-(alquila)4+.

Para preparar composições farmacêuticas dos compostos da presente invenção, os veículos farmaceuticamentes aceitávéis incluem veí- culos sólidos ou líquidos. Os sólidos formam preparações incluindo pó, com- primidos, pílulas, cápsulas, marcas, supositórios, e grânulos dispersíveis. Um veículo sólido pode ser uma ou várias substâncias, que também atuam como diluentes, agentes aromatizantes, ligantes, preservativos, agentes de 5 desintegração de pílulas, ou um material de encapsulação. Os detalhes das técnicas de formulação e administração são bem descritos na literatura cien- tífica e na literatura de Patentes, ver por exemplo, a última edição do Re- mington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA.

Na forma de pó, o veículo é um sólido finamente dividido, que é em uma mistura com o componente ativo finamente dividido. Em pílulas, componente ativo é misturado com o veículo tendo as propriedades de liga- ção necessárias nas proporções adequadas, e compactado no formato e tamanho desejados.

Os excipientes sólidos adequados são carboidrato ou cargas de 15 proteína incluindo, mas são não-limitados ao açúcar, incluindo lactose, saca- rose, manitol, ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata, ou outras plan- tas; celulose, tal como metila celulose, hidroxipropil metilcelulose, ou carbo- ximetilcelulose de sódio; e gomas que incluem a arábica e de tragacanto; bem como proteínas, tal como gelatina e colágeno. Se desejável, são adi- 20 cionados agentes de solubilização ou de desintegração, tal como o polivinil pirrolidona reticulado, ágar-ágar, ácido algínico, ou um sal dos mesmos, tal como o alginato de sódio.

As preparações em forma líquida incluem soluções, suspensões, e emulsões, por exemplo, em água ou soluções de água/propileno glicol. Para a injeção parenteral, as preparações líquidas podem ser formuladas em solução na solução aquosa de polietileno glicol.

A preparação farmacêutica está preferivelmente na forma de uma unidade de dosagem. Em tal forma a preparação é subdividida em uni- dades de dose contendo as quantidades adequadas do componente ativo. A 30 forma de uma unidade de dosagem pode ser uma preparação embalada, uma embalagem contendo as quantidades separadas da preparação, tais como pílulas, cápsulas, e pó embalados em frascos ou ampolas. Também, a forma de uma unidade de dosagem pode ser uma cápsula, pílula, cachete, ou a própria drágea, ou pode ser um número apropriado de quaisquer des- sas formas em embalagens.

Quando as composições da presente invenção compreendem 5 uma combinação de um macrociclo peptidomimético e um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais, tanto o composto como o agente adi- cional devem estar presentes a níveis de dosagem de entre aproximada- mente 1 % a 100 %, e mais preferivelmente entre aproximadamente 5 % a 95 % da dosagem normalmente administrada em um regime de monoterapi- 10 a. Em algumas modalidades, os agentes adicionais são administrados sepa- radamente, como parte de um regime de múltiplas doses dos compostos do presente invenção. Alternativamente, aqueles agentes fazem parte de uma forma de dosagem única, misto em conjunto com os compostos da presente invenção em uma composição única.

Métodos de Uso.

Em um aspecto, a presente invenção fornece novos macrociclos peptidomiméticos que são úteis em ensaios competitivos de ligação para identificar os agentes que se ligam aos Iigantes naturais das proteínas ou peptídios sobre os quais os macrociclos peptidomiméticos são modelados. 20 Por exemplo, no sistema p53 MDM2, os macrociclos peptidomiméticos esta- bilizados marcados cm base no p53 são usados em um ensaio de ligação de MDM2 junto com pequenas moléculas que competitivamente se ligam à MDM2. Os estudos de ligação competitiva levam em conta uma rápida avali- ação in vitro e a determinação dos fármacos candidatos específicos para o 25 sistema p53/MDM2. Do mesmo modo, no sistema antiapoptótico BH3/BCL- XL os macrociclos peptidomiméticos marcados a base de BH3 podem ser usados em um ensaio de ligação BCL-Xl juntamente com pequenas molécu- las que competitivamente se ligam à BCL-XL. Os estudos de ligação compe- titivos levam em conta a rápida avaliação in vitro e a determinação de fárma- 30 cos candidatos específicas para o sistema BH3/BCL-Xl. A invenção adicio- nalmente fornece a geração de anticorpos contra os macrociclos peptidomi- méticos. Em algumas modalidades, estes anticorpos especificamente ligam tanto os macrociclos peptidomiméticos e o p53 ou peptídio precursor BH3 do qual os macrociclos peptidomiméticos são derivados. Tais anticorpos, por exemplo, rompem os sistemas p53/MDM2 ou BH3/BCL-XL, respectivamen- te.

5 Em outros aspectos, a presente invenção fronece ambos os mé-

todos profiláticos e terapêuticos para tratar um paciente em risco de (ou sus- cetível a) um distúrbio ou tendo um distúrbio associado com uma expressão ou atividade aberrante (por exemplo, insuficiente ou excessiva) de um mem- bro da família de BCL-2 (por exemplo, anormalidades das vias apoptóticas 10 extrínsecas ou intrínsecas). Acredita-se que alguns distúrbios do tipo BCL-2 sejam causados, pelo menos em parte, por um nível anormal de um ou mais membros da família de BCL-2 (por exemplo, sobre ou sub expressado), ou pela preença de um ou mais membros da família de BCL-2 exibindo ativida- de anormal. Como tal, a redução do nível e/ou da atividade do membro da 15 família BCL-2 ou aumento do nível e/ou da atividade do membro da família BCL-2, é usado, por exemplo, para melhorar ou reduzir os sintomas adver- sos do distúrbio.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tra- tamento ou prevenção de doenças hiperproliferativas interferindo com a inte- ração ou a ligação entre a p53 e a MDM2 em células tumorais. Estes méto- dos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de um com- posto da invenção a um animal de sangue quente, incluindo um ser humano, ou a células tumorais contendo o tipo selvagem p53. Em algumas modalida- des, a administração dos compostos da presente invenção induz a paraliza- ção do crescimento celular ou a apoptose. Em outras modalidades adicio- nais, a presente invenção é usada para tratar uma doença e/ou células tu- morais compreendendo níveis elevados de MDM2. Os níveis elevados de MDM2 tal como aqui utilizados referem-se a níveis MDM2 maiores do que os encontrados em células contendo mais do que o número normal de cópias (2) de mdm2 ou acima de aproximadamente 10.000 moléculas de MDM2 por célula tal como medido por ELISA ou ensaios semelhantes (Picksley et al. (1994), Oncogene 9, 2523 2529). Tal como aqui utilizado, termo "tratamento" é definido como uma aplicação ou uma administração de um agente terapêutico a um paciente, ou aplicação ou administração de um agente terapêutico a um tecido isolado ou uma linhagem celular de um paciente, tendo uma doença, sintoma da doen- 5 ça ou uma predisposição à uma doença, com o objetivo de curar, sarar, ali- viar, suavizar, alterar, remediar, melhorar, aumentar ou afetar a doença, os sintomas da doença ou a predisposição à doença.

Em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos da invenção são usados para tratar, evitar, e/ou diagnosticar cânceres e condi- ções neoplásicas. Tal como aqui utilizado, os termos "câncer", "hiperprolife- rativo" e "neoplásico" referem-se a células tendo a capacidade para cresci- mento autônomo, isto é, um estado ou condição anormal caracterizada pelo crescimento celular que se prolifera rapidamente. Os estados de doenças hiperproliferativas e neoplásicas podem ser categorizados como patológicos, isto é, caracterizando ou constituindo um estado de doença, ou podem ser categorizados como não patológicos, isto é, como um desvio da normalidade mas não associado com um estado de doença. O termo tem o significado de incluir todo o tipo de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastásicos ou células malignamente transformadas, tecidos, ou órgãos, independente do tipo histopatológico ou estágio de invasividade. Um tumor metastásico pode surgir de uma multidão de tumores do tipo primário, incluindo mas não-limitado aos de origem mamária, de pulmão, de fígado, do cólon e ovariana. As células "patológicas hiperproliferativas" ocorrem em estados doentios caracterizados pelo crescimento de tumor maligno. Os e- xemplos de células hiperproliferativas não patológicas incluem a proliferação celular associada com a cura de um ferimento. Exemplos de distúrbios celu- lares proliferativos e/ou diferenciais incluem o câncer, por exemplo, carcino- ma, sarcoma, ou distúrbios metastásicos. Em algumas modalidades, os ma- crociclos peptidomiméticos são novos agentes terapêuticos para controle do câncer de mama, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de pulmão, da metástase de tais cânceres e assim por diante.

Os exemplos de cânceres ou condições neoplásicas incluem, mas não estão limitados a, um fribrosarcoma, miossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, condroma, angiosarcoma, endoteli- ossarcoma, lifoangiossarcoma, linfoangioendoteliossarcoma, sinovioma, me- sotelioma, tumor de Ewing1 leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, câncer 5 gástrico, câncer esofageano, câncer retal, câncer pancreático, câncer ovari- ano, câncer de próstata, câncer uterino, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer do cérebro, carcinoma celular escamoso, carcionoma de glândula sebácia, carcionoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistoadeno- carcionoma, carcinoma da medula, carcinoma broncogênico, carcinoma ce- 10 Iular renal, hepatoma, carcinoma do tubo biliar, cotiocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm1 câncer cervical, câncer testicular, carcinoma de célula pequena do pulmão, carcionoma de célula não pequena do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependinoma, pinealoma, hemangiolas- 15 toma, neuroma do aparelho auditivo, oligodendroglioma, meningioma, mela- noma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, ou sarcoma de Kaposi.

Os exemplos de distúrbios proliferativos incluem distúrbios neo- plásicos hematopoiéticos. Tal como aqui utilizado, termo "distúrbios neoplá- sicos hematopoiéticos" inclui doenças envolvendo as células hiperplásti- cas/neoplásicas de origem hematopoiética, por exemplo, resultantes de li- nhagens mieloide, Iinfoide ou eritroide, ou células precursoras das mesmas. Preferivelmente, as doenças resultam de Ieucemias agudas pobremente di- ferenciadas, por exemplo, leucemia eritroblástica e leucemia megacarioblás- tica aguda. Exemplos de distúrbios mieloides adicionais incluem, mas não estão limitados a, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielogeno- sa aguda (AML) e leucemia mielogenosa crônica (CML) (revisto em Vaickus (1991), Crit. Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97); as malignidades Iinfoides in- cluem, mas não estão limitadas à leucemia linfoblástica aguda (ALL) incluin- do a linhagem B-ALL e a linhagem T-ALL, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia de célula ciliada (HLL) e macroglobu- Iinemia de Waldenstrom (WM). As formas adicionais de Iinfomas malignos incluem, mas não estão limitadas aos Iinfomas não Hodgkin e variantes dos mesmos, Iinfomas periféricos da celula T, leucemia/linfoma da célula T adul- ta (ATL), Iinfoma da célula T cutânea (CTCL), leucemia linfocítica granular ampla (LGF), doença de Hodgkin e doença de Reed- Stemberg.

5 Exemplos de distúrbios proliferativos e/ou diferenciativos celula-

res da mama incluem, mas não estão limitados a, doenças proliferativas da mama incluindo, por exemplo, hiperplasia epitelial, adenose esclerosante, e pequenos papilomas tubulares; tumores, por exemplo, tumores estromais, tais como fibroadenoma, tumor filodes e sarcomas, e tumores epiteliais, tais 10 como grande papiloma tubular; incluindo o carcinoma de mama in situ (não invasivo) incluindo a carcinoma ductal in situ (incluindo a doença de Paget) e

o carcinoma Iobular in situ, e invasivo (infiltração) incluindo o carcinoma, mas não-limitado a, ao carcinoma ductal invasivo, carcinoma Iobular invasivo, carcinoma medular, carcinoma colóide (mucinoso), carcinoma tubular, e car- 15 cinoma papilar invasivo, e neoplasmas malignos diversos. Os distúrbios de mama masculina incluem, mas não estão limitados a, ginecomastia e carci- noma.

Exemplos dos distúrbios celulares proliferativos e/ou diferenciati- vos do pulmão incluem, mas não estão limitados a, carcinoma broncogênico, 20 incluindo síndromes paraneoplásicas, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendócrinos, tais como carcinoide bronquial, tumores diversos, e tumo- res metastásicos; patologias da pleura, incluindo efusões pleurais inflamató- rias, efusões pleurais não-inflamatórias, pneumotórax, e tumores pleurais, incluindo tumores fibrosos solitários (fibroma pleural) e mesotelioma maligno. 25 Exemplos dos distúrbios celulares proliferativos e/ou diferenciati-

vos do cólon incluem, mas não estão limitados a, pólipos não neoplásicos, adenomas, síndromes familiais, carcinogenose coloretal, carcinoma colore- tal, e tumores carcinoides.

Exemplos de distúrbios celulares proliferativos e/ou diferenciati- vos do fígado incluem, mas não estão limitados a, hiperplasias nodulosas, adenomas, e tumores malignos, incluindo o carcinoma primário do fígado e tumores metastásicos. Exemplos de distúrbios celulares proliferativos e/ou diferenciati- vos do ovário incluem, mas não estão limitados a, tumores ovarianos tal co- mo, tumores do epitélio celômico, tumores serosos, tumores mucinosos, tu- mores do endométrio, adenocarcinoma da célula clara, cistoadenofibroma, 5 tumor de Brenner, tumores do epitélio liso; tumores de células germinativas, tais como teratomas maduros (benigno), teratomas monodérmicos, terato- mas malignos imaturos, disgerminoma, tumor endodermal de mama, corio- carcinoma; tumores estromais de corda sexual tal como, tumores da célula teca granulosa, tecomafibromas, androblastomas, tumores da célula hill, e 10 gonadoblastoma; e tumores metastásicos, tais como tumores de Kruken- berg.

Em outras modalidades adicionais, os macrociclos peptidomimé- ticos aqui descritos são usados para tratar, evitar ou diagnosticar condições caracterizadas por morte celular demasiadamente ativa ou morte celular de- 15 vido a agressão fisiológica, etc. Alguns exemplos de condições caracteriza- das pela morte celular prematura, ou não desejada, são ou a proliferação celular alternativamente não desejada ou excessiva incluindo, mas não es- tando limitados a, condições hipocelulares/hipoplásicas, acelula- res/aplásicas, ou condições hipercelulares/hiperplásticas. Alguns exemplos 20 incluem distúrbios hematológicos incluindo mas não-limitados a, anemia fan- coni, anemia aplástica, talaessemia, neutropenia congênita, mielodisplasia.

Em modalidades diferentes ou adicionais, os macrociclos pepti- domiméticos da invenção que atuam para reduzir a apoptose são usados para tratar distúrbios associados com um nível indesejável da morte celular. 25 Assim, em algumas modalidades, os macrociclos peptidomiméticos antia- poptóticos da invenção são usados para tratar distúrbios, tais como aqueles que levam à morte celular associada com a infecção viral, por exemplo, in- fecção associada com a infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). A grande diversiadade de doenças neurológicas é caracterizada pela 30 perda gradual de conjuntos específicos de neurônios, e os macrociclos pep- tidomiméticos antiapoptóticos da invenção são usados, em algumas modali- dades, no tratamento desses distúrbios. Tais distúrbios incluem o Mal de Alzheimer, a doença de Parkinson, esclerose amiotrófica lateral (ALS), retini- te pigmentosa, atrofia muscular espinal, e várias formas da degeneração cerebelar. A perda celular nestas doenças não induz a uma resposta infla- matória, e a apoptose parece ser o mecanismo da morte celular. Além disso, 5 diversas doenças hematológicas são associadas com uma produção reduzi- da de células sanguíneas. Estes distúrbios incluem a anemia associada com uma doença crônica, anemia aplástica, neutropenia crônica, e as síndromes mielodisplásicas. Os distúrbios da produção de células do sangue, tais como síndromes mielodisplásicas e algumas formas da anemia aplásica, associ- 10 am-se com a morte celular apoptótica aumentada dentro da medula óssea. Estes distúrbios podem resultar da ativação de genes que promovem a a- poptose, deficiências adquiridas das células estromais ou fatores de sobrevi- vência hematopoiéticos, ou os efeitos diretos de toxinas e mediadores de respostas imunes. Dois distúrbios comuns associados com a morte celular 15 são o infarto do miocárido e o derrame. Em ambos os distúrbios, as células dentro da área central da isquemia, que é produzida no caso da perda aguda do fluxo de sangue, parecem morrer rapidamente em conseqüência da ne- crose. Entretanto, do lado de fora da zona isquêmica central, as células mor- rem em um período do tempo mais demorado e morfologicamente parecem 20 morrer por apoptose. Em modalidades diferentes ou adicionais, os macroci- clos peptidomiméticos antiapoptpticos da invenção são usados para tratar todos os tais distúrbios associados com a morte celular indesejável.

Alguns exemplos de distúrbios imunológicos que são tratados com os macrociclos peptidomiméticos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, rejeição de transplante de órgão, artrite, lupus, IBD, doença de Crohn, asma, esclerose múltipla, diabete, etc.

Alguns exemplos de distúrbios neurológicos que são tratados com os macrociclos peptidomiméticos aqui descritos incluem mas não estão limitados ao, mal de Alzheimer, Síndrome de Down, Hemorragia Cerebral 30 Hereditária tipo Dutch, Amiloidose, Amiloidose Reativa, Nefropatia Amiloide Familial com Urticária e Surdez, Síndrome de Muckle-Wells, Mieloma Idiopá- tico; Mieloma associado com macroglobulinemia, Polineuropatia Amiloide Familial, Cardiomiopatia Amiloide Familial1 Amiloide Cardíaca Isolada, Ami- Ioidose Senila Sistêmica, Ataque de Diabete Adulta, Insulinoma1 Amiloide Isolada Atrial, Carcinoma Medular da Tireóide, Amiloidose Familial, Hemor- ragia Cerebral Hereditária com Amiloidose, Polineuropatia Amiloidótica Fa- 5 milial, Scrapie, doença de Creutzfeldt- Jacob, Síndrome de Gerstmann S- traussIer-Scheinker, Encefalite Esponjosa Bovina, doença mediada por prí- ons, e a Doença de Huntington.

Alguns exemplos de distúrbios endocrinológicos que são tratado com os macrociclos peptidomiméticos aqui descritos incluem, mas não estão limitados à, diabete, hipotiroidismo, hipopituitarismo, hipoparatiroidismo, hi- pogonadismo, etc.

Exemplos de distúrbios cardiovasculares (por exemplo, distúr- bios inflamatórios) que são tratados ou evitados com os macrociclos pepti- domiméticos da invenção incluem, mas não estão limitados a, aterosclerose, 15 infarto do miocárdio, derrame, trombose, aneurisma, insuficiência cardíaca, doença isquêmica do coração, angina pectoris, parada cardíaca súbita, do- ença hipertensiva do coração; doença de vasos não coronarianas, tais como arteriolosclerose, doença de pequenos vasos, nefropatia, hipertrigliceridemi-

a, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, xantomatose, asma, hipertensão, enfi- 20 sema e doença pulmonar crônica; ou uma condição cardiovascular associa- da com procedimentos interventionistas ("trauma vascular de procedimen- tos"), tal como a reestenose depois de angioplastia, colocação de uma deri- vação, stent, enxertos de excisão sintéticos ou naturais, cateter intracardía- co, válvula ou outros dispositivos implantáveis. Os distúrbios cardiovascula- 25 res preferidos incluem a aterosclerose, infarto do miocárcio, aneurisma e derrame.

Exemplos.

A seguinte seção fornece exemplos ilustrativos da presente in- venção.

Exemplo 1.

Síntese de um macrociclo peptidomimético.

A molécula de alvo é o peptídio de BID-BH3 com os aminoáci- dos 12 e 16 substituído pela cisteína (ver a Tabela 1 e a Tabela 6). Os tióis de cadeia lateral de Cisteína são então derivados com 1,4-dibromobutano para formar o bistioéter macrociclo peptidomimético.

,S-CCH2V- S

Ac-OiIRNfARHLA-tHN " >,— VGD-NIeDRSk- NH3

Γ í

Seguindo a estratégia geral de síntese de peptídio descrita, o 5 precursor peptidomimético é um polipeptídio com a seqüência DIIAR- HLACVGDCNLDRSI (onde "NL" ou "Nle" representam a norleucina) sinteti- zado em escala de 0,2 mmol em um sintetizador PTI-Ranin PS3 de canal único utilizando os seguintes ciclos de ligação de cada aminoácido: Desproteção: Piperidina a 20 % em DMF 2x7 min.

Lavagem: DMF 6 x 0,5 min.

Ligação: 5 vezes excesso de cada aminoácido, TBTU e DIEA em DMF

1 x 20 min.

Lavagem: DMF 2 x 0,5 min.

Ligação: 5 vezes excesso de cada aminoácido, TBTU e DIEA em DMF 1 x 20 min.

Lavagem: DMF 6 x 0,5 min.

O polipeptídio precursor foi acetilado na amina terminal por tra- tamento com anidrido acético 1 mM e di-isopropil etilamino (DIEA) a 1 mM em dimetilformamida (DMF) durante 45 minutos. A síntese foi feita sobre 20 resina de amida de rinque (substituição 0,6 mMol/g) com os tióis de cys9 e cys13 protegidos com grupos p-metoxitritila (Mmt). Os grupos Mmt são sele- tivamente desprotegidos com 1 % TFA/4 % TIS em diclorometano (DCM) e o polipeptídio foi alquilado durante a noite na temperatura ambiente usando 50 equivalentes molares de 1,4-dibromobutano e 13 equivalentes molares de di- 25 isopropil etilamina (DIEA) em dicloroetano. O peptídio foi então clivado da resina pelo tratamento com TFA a 94 %, Tl a 2 %, Anisol a 2 %, H20 por 3 horas seguido por filtração, concentração por evaporação rotativa e precipi- tação com o éter dietílico. O peso molecular esperado do produto macrociclo peptidomimético final é de 2448,91. O peso molecular observado foi de 2445,5 por MÀLDÍ MS (ver Figura 1).

Diversas modalidades da invenção foram descritas. No entanto, entender-se-á que as várias modificações podem ser feitas sem partir do espírito e o alcance da invenção. Consequentemente, outras modalidades estão dentro do alcance das seguintes reivindicações.

Claims

1. Macrociclo peptidomimético de acordo com a Fórmula (I): <formula>formula see original document page 72</formula> em que: cada A, C1 D, e E são independentemente um aminoácido natu- ral ou não-natural; B é um aminoácido natural ou não-natural, análogo de aminoá- cido <formula>formula see original document page 72</formula> Ri e R2 são independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halogênio; R3 é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, heteroal- quila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquilalquila, cicloarila, ou heteroci- cloarila, não-substituída ou substituída com R5; Li, L2, L3 e L4 são independentemente alquileno, alquenileno, alquinileno, hetroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno ou [-R4-K-R4-Jn, cada um sendo não-substituído ou substi- tuído com R5; K é O, S, SO, SO2, CO, CO2, ou CONR3; cada R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, hetroalquileno, ci- cloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R5 é independentemente halogênio, alquila, -0R6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, uma porção fluorescente, um isótopo radioati- vo ou um agente terapêutico; cada R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico; R7 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, não substituído ou substituído com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo D; R8 é -H1 alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, cicloalquilalquila, heterocicloalquila, cicloarila, ou heterocicloarila, não-substituída ou substituída com R5, ou parte de uma estrutura cíclica com um resíduo E; v é um número inteiro de 1 a 1000; w é um número inteiro de 1 a 1000; x é um número inteiro de 0 a 10; y é um número inteiro de 0 a 10; z é um número inteiro de 0 a 10; n é um número inteiro de 1 a 5; e x+y+z é pelo menos 3.

2. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que: pelo menos um dos Ri e R2 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não- substituída ou substituída com halogênio.

3. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que Ri e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, arilalqui- la, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não- substituída ou substituída com halogênio.

4. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que: pelo menos um dos Ri e R2 é alquila, não-substituída ou substituída com halogênio.

5. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que Ri e R2 são independentemente alquila, não-substituída ou substitu- ída com halogênio.

6. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que: pelo menos um dos R1 e R2 é metila.

7. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que R1 e R2 são metila.

8. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que: pelo menos um dos D e E é um aminoácido natural ou não-natural substituído com um lipídio ou hidrocarboneto de alto peso molecular.

9. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que: pelo menos um dos D e E é anexado a um Iigante adicional que forma o macrociclo de acordo com a fórmula [-LrS-L2-S-L3-].

10. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 1, em que: uma estrutura secundária do macrociclo peptidomimético é mais estável do que uma estrutura secundária correspondente de um polipeptídio não macrocíclico correspondente.

11. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação I, em que o macrociclo peptidomimético compreende uma a-hélice.

12. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação II, em que: a α-hélice compreende de 1 volta a 5 voltas.

13. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 11, em que: a α-hélice é mais estável do que uma α-hélice de um polipeptí- dio não macrocíclico correspondente.

14. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 11, em que: [-Li-S-L2-S-L3-] abarca de 1 volta a 5 voltas da a-hélice.

15. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 11, em que: [-Li-S-L2-S-L3-] abarca aproximadamente 1, 2, 3, 4 ou 5 voltas da a-hélice.

16. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 11, em que o comprimento de [-Li-S-L2-S-L3-] é de aproximadamente 5 A a aproximadamente 9 Â por cada volta da a-hélice.

17. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 11, em que: [-LrS-L2-S-L3-] abarca aproximadamente 1 volta da a-hélice.

18. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 17, em que o comprimento de [-LrS-L2-S-L3-] é aproximadamente igual ao comprimento de aproximadamente 5 ligações carbono-carbono a aproxima- damente 13 ligações carbono-carbono.

19. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 17, em que o comprimento de [-LrS-L2-S-L3-] é aproximadamente igual ao comprimento de aproximadamente 7 ligações carbono-carbono a aproxima- damente 10 ligações carbono-carbono.

20. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação17, em que o macrociclo compreende um anel de aproximadamente 17 áto- mos a 25 átomos.

21. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 11, em que: a α-hélice compreende aproximadamente 2 voltas.

22. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 21, em que o comprimento de [-Li-S-L2-S-L3-] é aproximadamente igual ao comprimento de aproximadamente 8 ligações carbono-carbono a aproxima- damente 16 ligações carbono-carbono.

23. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 21, em que o comprimento de [-LrS-L2-S-L3-] é aproximadamente igual ao comprimento de aproximadamente 10 ligações carbono-carbono a aproxi- madamente 13 ligações carbono-carbono.

24. Macrociclo peptidomimético de acordo com a reivindicação 21, em que o macrociclo compreende um anel de aproximadamente 29 áto- mos a aproximadamente 37 átomos.

25. Composto de acordo com a Fórmula lia: <formula>formula see original document page 75</formula> (Fórmula lia); em que: Ri é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloal- quilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila; Li é independentemente alquileno, alquenileno, alquinileno, he- troalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloari- Ieno ou [-R4-K-R4-Jn, não-substituído ou substituído com R5; K é O, S, SO, SO2, CO, CO2, ou CONR3; R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, hetroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; Rs é independentemente halogênio, alquila, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -SO2R6, -CO2R6, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico; R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilal- quila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo ou um agente terapêutico; R7 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila; Rg e R10 são independentemente -H ou um grupo de proteção adequado para síntese de peptídio; n é um número inteiro de 1 a 5; Q é S; e P é -H, -tritila, p-metoxitritila, -S-t-butila, ou outro grupo de prote- ção qualquer adequado para síntese de peptídio; ou Q e P quando tomados em conjunto formam uma porção capaz de sofrer a transformação química em um grupo -SH;

26. Composto de acordo com a reivindicação 25, em que Ri é alquila, não-substituída ou substituída com halogênio.

27. Composto de acordo com a reivindicação 25, em que Ri é alquila não-substituída.

28. Composto de acordo com a reivindicação 25, em que Ri é metila.

29. Composto de acordo com a reivindicação 25, em que: pelo menos um dos Rg e R10 é um grupo protegido adequado para síntese de peptídio.

30. Kit compreendendo: a) um composto de acordo com a Fórmula Ila e um composto de acordo com a Fórmula llb: <formula>formula see original document page 77</formula> em que: Ri é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, heteroal- quila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halogênio; R2 é -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, hete- roalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halogê- nio; Li e L3 são independentemente alquileno, alquenileno, alquinile- no, hetroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, ou hete- rocicloarileno ou [-R4-K-R4-Jn, cada um sendo não-substituído ou substituído com R5; K é O, S, SO, SO2, CO, CO2, ou CONR3; R4 é alquileno, alquenileno, alquinileno, hetroalquileno, cicloal- quileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada R5 é independentemente halogênio, alquila, -OR6, -N(R6)2, -SR6, -SOR6, -S02R6, -C02R6, -R6, uma porção fluorescente, um isótopo ra- dioativo, ou um agente terapêutico; cada R6 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma por- ção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico; R7 e R6 são independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, ou heterocicloalquila; R9 e R-io são cada um independentemente -H ou grupo de prote- ção qualquer adequado para síntese de peptídio de fase líquida ou sólida; QéS; Pé -H, -tritila, p-metoxitritila, -S-t-butila, ou outro grupo de prote- ção qualquer adequado para síntese de peptídio de fase líquida ou sólida; ou QeP quando tomados em conjunto formam uma porção capaz de sofrer a transformação química em um grupo -SH; n é um número inteiro de 1 a 5; e b) um Iigante formador do macrociclo de acordo com a estrutura: X-L2-Y; em que L2 é alquileno, alquenileno, alquinileno, hetroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, cicloarileno, heterocicloarileno, ou [-R11- K-Rn-]n, cada um sendo não-substituído ou substituído com Ri2; cada R-ι 1 é alquileno, alquenileno, alquinileno, hetroalquileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, ou heteroarileno; cada Ri2 é independentemente halogênio, alquila, -OR13, - N(Re)13, -SR13, -SOR13, -SO2R13, -CO2R13, -R13, uma porção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico; cada R13 é independentemente -H, alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquilalquila, heteroalquilalquila, heterocicloalquila, uma por- ção fluorescente, um isótopo radioativo, ou um agente terapêutico; e XeY são cada um, independentemente, um grupo reativo capaz de reagir com um grupo tiol.

31. Kit de acordo com a reivindicação 30, em que R2 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, heteroalquila, ou heterocicloalqui- la, não-substituída ou substituída com halogênio.

32. Kit de acordo com a reivindicação 30, em que R1 e R2 são alquila.

33. Kit de acordo com a reivindicação 30, em que R1 e R2 são metila.

34. Método para síntese de um macrociclo peptidomimético, o método compreendendo a etapa de contatar um precursor peptidomimético de acordo com a fórmula III: <formula>formula see original document page 78</formula> com um composto de acordo com a fórmula X-L2-Y1 em que v, w, x, y, z, A, B, C, D, E, R1, R2, R7, R8, L1, L2, e L3 são definidos tal como na reivindicação 1; e X e Y são cada um independentemente um grupo reativo capaz de reagir com um grupo tiol; x+y+z é pelo menos 3; e adicionalmente em que a dita etapa de contato resulta em uma ligação covalente sendo formada entre os dois grupos tióis na Fórmula III.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que: pelo me- nos um dos R1 e R2 é alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, ci- cloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou subs- tituída com halogênio.

36. Método de acordo com a reivindicação 34, em que R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila, alquinila, arilalquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalquila, ou heterocicloalquila, não-substituída ou substituída com halogênio.

37. Método de acordo com a reivindicação 34, em que pelo me- nos um dos R1 e R2 é alquila, não-substituída ou substituída com halogênio.

38. Método de acordo com a reivindicação 34, em que R1 e R2 são independentemente alquila, não-substituída ou substituída com halogê- nio.

39. Método de acordo com a reivindicação 34, em que pelo me- nos um dos R1 e R2 é metila.

40. Método de acordo com a reivindicação 34, em que R1 e R2 são metila.

41. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o precur- sor peptidomimético é expressado em células.

42. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o precur- sor peptidomimético é purificado antes da etapa de contato.

43. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético é purificado depois da etapa de contato.

44. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético é reduplicado depois da etapa de contato.

45. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o método é realizado em solução.

46. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o método é realizado em um suporte sólido.

47. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a etapa de contato é realizada na presença de uma macromolécula alvo que se liga ao precursor peptidomimético sob condições que favorecem a dita ligação.

48. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a etapa de contato é realizada na presença de uma macromolécula alvo que se liga preferivelmente ao precursor peptidomimético sob condições que favorecem a dita ligação.

49. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o método é aplicado para sintetizar uma biblioteca de macrociclos peptidomiméticos.

50. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético compreende uma α-hélice em solução aquosa.

51. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético exibe uma estrutura α-helicoidal aumentada em solu- ção aquosa em comparação com um polipeptídio não macrocíclico corres- pondente.

52. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético exibe uma estabilidade térmica aumentada em compa- ração com um polipeptídio não macrocíclico correspondente.

53. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético exibe uma atividade biológica aumentada em compa- ração com um polipeptídio não macrocíclico correspondente.

54. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético exibe uma resistência à degradação proteolítica au- mentada em comparação com um polipeptídio não macrocíclico correspon- dente.

55. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético exibe uma capacidade aumentada de penetrar em cé- lulas vivas em comparação com um polipeptídio não macrocíclico corres- pondente.

56. Método de acordo com a reivindicação 34, em que as duas porções tióis do composto de acordo com a fórmula Ill são cadeias laterais de um aminoácido selecionado do grupo consistindo em L-cisteína, D- cisteína, α-metila L-cisteína, e α-metila D-cisteína.

57. Método de acordo com a reivindicação 34, em que x+y+z é 3, e A, B e C são independentemente aminoácidos naturais ou não naturais.

58. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a etapa de contato é realizada em um solvente selecionado do grupo consistindo em solvente prótico, solvente orgânico, solvente aquoso, e misturas dos mes- mos.

59. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o solven- te é DMF, dicloroetano, NH3, NH3ZMeOH, NH3ZDMF, ou guanidina-HCI aquo- sa.

60. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o solven- te é um solvente que favorece a formação de hélice.

61. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o macro- ciclo peptidomimético tem a Fórmula (I): <formula>formula see original document page 81</formula>