CN101636407A - 双巯基大环化系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的拟肽大环化合物及其制备方法和用途，以及氨基酸类似物和大环构成性连接体和在其生产中有用的试剂盒。

Description

双巯基大环化系统
交叉参考
本申请要求2006年12月14日提交的美国临时申请第60/874,819号的优先权，本文引入该申请作为参考。
发明背景
肽在药物发现中变得日益重要。未修饰的肽由于构象的柔性，经常具有较差的代谢稳定性、较差的细胞渗透性和混杂的结合。为了改善这些性质，研究人员已通过包括二硫键形成、酰胺键形成和碳-碳键形成的多种方法产生了环肽和拟肽(peptidomimetic)(Jackson等人(1991)，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392；Phelan等人(1997)，J.Am.Chem.Soc.119：455-460；Taylor(2002)，Biopolymers 66：49-75；Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554；Hiroshige等人(1995)，J.Am.Chem.Soc.117：11590-11591；Blackwell等人(1998)，Angew.Chem.Int.Ed.37：3281-3284；Schafmeister等人(2000)，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892)。这些方法的局限性包括较差的代谢稳定性(二硫键和酰胺键)、较差的细胞渗透性(二硫键和酰胺键)和潜在毒性金属的使用(碳-碳键)。
发明概述
本发明提供了新的拟肽大环化合物(macrocycle)及其制备方法和用途。一般地，这些拟肽大环化合物的合成包括：(1)合成含有2个游离-SH部分的前体肽；和(2)将前体肽与双烷基化试剂接触，以产生新的拟肽大环化合物。这种通用方法允许前体肽中的至少2个游离的巯基(thiolate)部分共价连接，以产生显示改善的生物学性质(如结构稳定性、对靶标的亲和力、对蛋白水解降解作用的耐受和细胞渗透性)的新化合物。另外，这种通用方法允许多种多样的部分快速和选择性地并入拟肽大环化合物中，以允许产生相关大环化合物的文库。这种通用方法也允许容易地并入标记(例如，放射性同位素、化学发光或荧光标记)或治疗剂。
因此，一方面，本发明提供了式(I)的拟肽大环化合物：
Figure G2007800504073D00021
(式I)
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure G2007800504073D00022
-[NH-L4-CO-]、[-NH-L4-SO2-]或[-NH-L4-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的；
L1、L2、L3和L4独立地是亚烷基、亚烯基(alkenylene)、亚炔基(alkynylene)、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基(cycloarylene)、亚杂环芳基(heterocycloarylene)或[-R4-K-R4-]n，每个是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
每个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基(Arylene)或亚杂芳基(heteroarylene)；
每个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的，或作为与D残基所形成环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的，或作为与E残基所形成环状结构的一部分；
v是1-1000的整数；
w是1-1000的整数；
x是0-10的整数；
y是0-10的整数；
z是0-10的整数；
n是1-5的整数；且
x+y+z至少是3。
在某些实施方式中，拟肽大环化合物包含α-螺旋，且R8是-H。在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。或者，R1和R2两个都独立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在其它实施方式中，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基；或者，R1和R2两个都独立地是未取代或被卤素取代的烷基。在其它的实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基，或R1和R2两个都是甲基。
在某些实施方式中，D和E中的至少一个是被高分子量的脂质或烃取代的天然或非天然的氨基酸。在其它实施方式中，D和E中的至少一个连接于另外的式[-L1-S-L2-S-L3-]的大环构成性连接体(macrocycle-forming linker)上。
在某些情况下，拟肽大环化合物的二级结构比相应的非大环多肽的相应的二级结构更稳定。在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物也包含α-螺旋。例如，这样的α-螺旋包含1-5个转角(turn)。例如，这样的α-螺旋比相应的非大环多肽的α-螺旋更稳定。在某些实施方式中，[-L1-S-L2-S-L3-]跨越α-螺旋的1-5个转角，例如α-螺旋的大约1、2、3、4或5个转角。例如，[-L1-S-L2-S-L3-]跨越α-螺旋的大约1个转角。[-L1-S-L2-S-L3-]的示例性的长度是α-螺旋的每个转角大约
Figure G2007800504073D00041
-大约
Figure G2007800504073D00042
在某些实施方式中，[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约5个-大约13个碳-碳键的长度，或大约7个-大约10个碳-碳键的长度。在其它实施方式中，本发明的大环化合物包含大约17-25个原子的环。
在其它的实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包括包含大约2个转角的α-螺旋。例如，[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约8个-大约16个碳-碳键的长度，或大约10个-大约13个碳-碳键的长度。在其它实施方式中，本发明的大环化合物包含大约29-大约37个原子的环。
本发明也提供了式IIa的化合物：
Figure G2007800504073D00043
(式IIa)
其中：
R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基；
L1独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，它们是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
R9和R10独立地是-H或适于肽合成的保护基；
n是1-5的整数；
Q是S；且
P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于肽合成的保护基；或者，Q和P一起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分。
在某些实施方式中，R1是未取代的或被卤素取代的烷基。在其它实施方式中，R1是未取代的烷基。在其它的实施方式中，R1是甲基。在其它的实施方式中，R9和R10中的至少一个是适于肽合成的保护基。
本发明也提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：
a)式IIa的化合物和式IIb的化合物：
Figure G2007800504073D00051
(式IIa)             (式IIb)
其中：
R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
R2是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
L1和L3独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基或亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，每个是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、-R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7和R8独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
R9和R10各自独立地是-H或任何适于液相或固相肽合成的保护基；
Q是S；
P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于液相或固相肽合成的保护基；或者，Q和P一起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分；n是1-5的整数；
和b)下式结构的大环构成性连接体：
X-L2-Y
其中，L2是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R11-K-R11-]n，每个是未取代的或被R12取代的；
每个R11是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R12独立地是卤素、烷基、-OR13、-N(R6)13、-SR13、-SOR13、-SO2R13、-CO2R13、-R13、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R13独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；且
X和Y各自独立地是能够与巯基(thiol group)反应的反应基团。
在某些实施方式中，R2是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在具体的这样的实施方式中，R1和R2是烷基。例如，R1和R2是甲基或三氟甲基。
一种合成拟肽大环化合物的方法，该方法包括将式III的拟肽前体与式X-L2-Y的化合物接触的步骤：
Figure G2007800504073D00071
(式III)
其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1、L2和L3如对于式I的化合物所定义；且X和Y各自独立地是能够与巯基反应的反应基团；
x+y+z至少是3；
而且，进一步，其中，所述接触步骤导致在式III中的两个巯基之间形成共价连接。
在某些实施方式中，进行本发明的方法导致如本文所述的式(I)的拟肽大环化合物的形成。
在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。或者，R1和R2两个都独立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在其它实施方式中，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基；或者，R1和R2两个都独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在其它的实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基，或R1和R2两个都是甲基。
在某些实施方式中，在细胞中表达拟肽前体。在某些实施方式中，在接触步骤之前也纯化拟肽前体。在某些情况下，将获得的拟肽大环化合物在接触步骤之后纯化，和/或在接触步骤之后再折叠。
例如，所述方法在溶液中进行，或在固体载体上进行。在某些情况下，在结合拟肽前体的目标大分子的存在下，在有利于所述结合的条件下进行接触步骤，或者，在优先结合拟肽前体的目标大分子的存在下，有利于所述结合的条件下进行接触步骤。在某些实施方式中，应用所述方法合成拟肽大环化合物的文库。
在某些实施方式中，通过本发明的方法制备的拟肽大环化合物在水溶液中包含α-螺旋。在其它实施方式中，拟肽大环化合物在水溶液中比相应的非大环多肽显示增加的α-螺旋结构。在其它的实施方式中，相比相应的非大环多肽，拟肽大环化合物显示提高的热稳定性、提高的生物学活性、增强的对蛋白水解降解作用的耐受或提高的渗透活细胞的能力。在某些实施方式中，式III的化合物的2个巯基部分是选自L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、α-甲基-L-半胱氨酸和α-甲基-D-半胱氨酸的氨基酸的侧链。在本发明的方法的某些实施方式中，x+y+z为3，且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。
例如，在选自质子溶剂、水溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行所述方法。在某些实施方式中，溶剂是DMF、二氯乙烷、NH3、NH3/MeOH、NH3/DMF或盐酸胍水溶液。在某些实施方式中，溶剂也是有利于螺旋形成的溶剂，例如水。
在本文所述的化合物和方法的某些实施方式中，L2是烷基。在其它实施方式中，X和Y独立地选自如Cl-、Br-或I-的卤素基团。
附图简述
在所附的权利要求书中详细地阐明了本发明的新特征。通过参考下面的阐述利用本发明原理的说明性实施方式的发明详述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，附图中：
图1显示本发明的拟肽大环化合物的MALDI图谱。
发明详述
尽管本文已显示和描述了本发明的优选的实施方式，但本领域的技术人员应当明白只是举例提供这些实施方式。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应该理解：在实施本发明时，可以采用本文所述的本发明的实施方式的各种替代方案。下面的权利要求限定了本发明的范围，并且覆盖这些权利要求的范围之内的方法和结构及其等效方案。
定义
如本文所用，术语“大环化合物”指具有包含由至少9个共价键合的原子形成的环的化学结构的分子。
如本文所用，术语“拟肽大环化合物”指这样的化合物，其包含通过多个肽键和至少一个大环构成性连接体连接的多个氨基酸残基，所述连接体在一个天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基的α碳与另一个天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基的α碳之间形成大环。拟肽大环化合物任选地包括在一个或多个氨基酸残基和/或氨基酸类似物残基之间的一个或多个非肽键，且除了形成大环化合物的任意残基外，还任选地包括一个或多个非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基。
如本文所用，术语“稳定性”指通过圆二色光谱、NMR或另一种生物物理测量法测定的本发明的肽或拟肽大环化合物在溶液中的特定二级结构的维持，或对体外或体内蛋白水解降解作用的耐受性。本发明所涉及的二级结构的非限制性的例子是α-螺旋、β-转角和β-折叠片(pleated sheets)。
如本文所用，术语“螺旋稳定性”指通过圆二色光谱测定的本发明的肽或拟肽大环对α-螺旋结构的维持。例如，在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物相比相应的非大环多肽，在如通过圆二色光谱测定的α-螺旋度方面显示至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。
术语“α-氨基酸”或简称为“氨基酸”指含有结合到被称为α-碳的碳上的氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文特别地指出，本文所用的术语氨基酸包括氨基酸类似物。
术语“天然存在的氨基酸”指自然界合成的肽中通常发现的20种氨基酸中的任一种，已知单字母缩写为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
术语“氨基酸类似物”指其结构上类似于氨基酸，且在肽或拟肽大环化合物的形成中可代替氨基酸的分子。如本文所定义的，氨基酸类似物包括除了在氨基和羧基之间包括一个或多个另外的亚甲基(例如，α-氨基β-羧酸)或氨基或羧基被类似的反应基团取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)以外，在结构上与氨基酸相同的化合物。
“非必需”氨基酸残基是，可从多肽的野生型序列(例如，BH3结构域或p53 MDM2结合结构域)改变，而不消除或本质上改变其基本的生物学活性或生物化学活性(例如，受体结合或活化)的残基。“必需”氨基酸残基是，当从多肽的野生型序列改变时，导致消除或本质上消除多肽的基本的生物学活性或生物化学活性的残基。
“保守氨基酸取代”是一种这样的取代，其中，用具有类似的侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。现有技术已定义了具有类似的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，K、R、H)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D、E)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，  T、V、I)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，例如，BH3多肽中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基所取代。
如本文中与大环化合物或大环构成性连接体一起使用的术语“元”是指，形成或可以形成大环化合物的原子，并排除取代基或侧链原子。以此类推，环癸烷、1，2-二氟-癸烷和1，3-二甲基-环癸烷都被认为是十元大环化合物，因为氢或氟取代基或甲基侧链没有参与形成大环。
当用作分子结构的部分时，符号
Figure G2007800504073D00111
指单键或反式或顺式双键。
术语“氨基酸侧链”指连接到氨基酸中的α-碳上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。也包括其它非天然存在的氨基酸侧链，例如，那些自然发生的氨基酸(例如，氨基酸代谢物)或合成制备的氨基酸(例如，α，α二取代的氨基酸)的侧链。
术语“多肽”包括通过共价键(例如，酰胺键)连接的两个或多个天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全长蛋白质(例如，完全加工的蛋白质)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白质的片段或合成的多肽片段)。
术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴或碘或其基团。
术语“烷基”指含有指定数目的碳原子的直链或支链烃链。例如，C1-C10表示该基团中具有1-10(包括端值)个碳原子。在没有指定任何数值时，“烷基”是其中具有1-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。
术语“亚烷基”指二价烷基(即，-R-)。
术语“烯基”指作为具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链的烃链。烯基部分含有指定数目的碳原子。例如，C2-C10表示该基团中具有2-10(包括端值)个碳原子。术语“低级烯基”指C2-C6烯基链。在没有指定任何数值时，“烯基”是其中具有2-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。
术语“炔基”指作为具有一个或多个碳-碳叁键的直链或支链的烃链。炔基部分含有指定数目的碳原子。例如，C2-C10表示该基团中具有2-10(包括端值)个碳原子。术语“低级炔基”指C2-C6炔基链。在没有指定任何数值时，“炔基”是其中具有2-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。
术语“芳基”指6个碳的单环或10个碳的双环芳香环系统，其中，每个环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。术语“芳基烷基”或术语“芳烷基”指被芳基取代的烷基。术语“芳基烷氧基”指被芳基取代的烷氧基。
“芳基烷基”指如上定义的芳基，其中，芳基中的一个氢原子已被如上定义的C1-C5烷基取代。芳基烷基的典型例子包括，但不限于：2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2-丁基苯基、3-丁基苯基、4-丁基苯基、2-戊基苯基、3-戊基苯基、4-戊基苯基、2-异丙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、2-异丁基苯基、3-异丁基苯基、4-异丁基苯基、2-仲丁基苯基、3-仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。
“芳基酰氨基”指如上定义的芳基，其中，芳基中的一个氢原子已被一个或多个-C(O)NH2基团取代。芳基酰氨基的典型例子包括：2-C(O)NH2-苯基、3-C(O)NH2-苯基、4-C(O)NH2-苯基、2-C(O)NH2-吡啶基、3-C(O)NH2-吡啶基和4-C(O)NH2-吡啶基。
“烷基杂环”指如上定义的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一个氢原子已被杂环取代。烷基杂环的典型例子包括，但不限于：-CH2CH2-吗啉、-CH2CH2-哌啶、-CH2CH2CH2-吗啉和-CH2CH2CH2-咪唑。
“烷基酰氨基”指如上定义的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一个氢原子已被-C(O)NH2基团取代。烷基酰氨基的典型例子包括，但不限于：-CH2-C(O)NH2、-CH2CH2-C(O)NH2、-CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH(C(O)NH2)CH3、-CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3、-CH(C(O)NH2)CH2CH3和-C(CH3)2CH2C(O)NH2。
“链烷醇(alkanol)”指如上定义的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一个氢原子已被羟基取代。链烷醇基团的典型例子包括，但不限于：-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH(OH)CH3、-CH2CH(OH)CH2CH3、-CH(OH)CH3和-C(CH3)2CH2OH。
“烷基羧基”指如上定义的C1-C5烷基，其中，C1-C5烷基中的一个氢原子已被-COOH基团取代。烷基羧基的典型例子包括，但不限于：-CH2COOH、-CH2CH2COOH、-CH2CH2CH2COOH、-CH2CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH3、-CH2CH2CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH2CH3、-CH(COOH)CH2CH3和-C(CH3)2CH2COOH。
本文所用的术语“环烷基”包括具有3-12个碳、优选3-8个碳、更优选3-6个碳的饱和与部分不饱和的环烃基，其中，环烷基另外任选地被取代。一些环烷基包括，但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。
术语“杂芳基”指芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环系统，如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别有碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，每个环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基的例子包括：吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基、噻唑基等。
术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂芳基”指芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环系统，如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别有碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，每个环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基的例子包括吡啶基、呋喃基、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基、吲哚基、噻唑基等。
术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂环基”指非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环系统，如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别有碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，每个环的0、1、2或3个原子被取代基取代。杂环基的例子包括哌嗪基(piperazinyl)、吡咯烷基、二氧杂环己烷基(dioxanyl)、吗啉基(morpholinyl)、四氢呋喃基等。
术语“取代基”指在烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基的任一个原子上“取代”的基团。合适的取代基包括，但不限于：卤素、羟基、巯基、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、链烷磺酰基、烷基羰基和氰基。
在某些实施方式中，本发明的化合物包含一个或多个不对称中心，因而作为外消旋体或外消旋混合物、单一的对映异构体、单独的非对映异构体和非对映体混合物存在。除非另外清楚地指出，本发明包括这些化合物的所有这样的异构形式。在某些实施方式中，本发明的化合物也显示为多种互变异构形式，在这些例子中，本发明包括本文所述化合物的所有互变异构形式(例如，如果环系统的烷基化导致多个位置烷基化，那么本发明包括所有这些反应产物)。除非另外清楚地指出，本发明包括这样的化合物的所有这样的异构形式。除非另外清楚地指出，本发明包括本文所述化合物的所有晶体形式。
如本文所用，术语“增加”或“减少”分别意味着导致统计上显著的(即，p＜0.1)至少5％的增加或减少。
如本文所用，提及变量的数值范围意味着表示，可以用等于该范围内的任何值的变量实施本发明。因此，对于本身不连续的变量，变量等于该数值范围内的任何整数值，包括范围的端点。类似地，对于本身连续的变量，变量等于该数值范围内的任何实值，包括范围的端点。举例来说，但不是限制，如果变量本身是不连续的，描述为具有0-2之间的值的变量取0、1或2；而且，如果变量本身是连续的，则取0.0、0.1、0.01、0.001的值或其它任何≥0且≤2的实值。
如本文所用，除非特别地指出，单词“或”的使用是“和/或”的包含性的含义，而非“或/或”的排除性的含义。
在下面的附图和描述中阐明了本发明的一种或多种具体实施方式的细节。从说明书、附图和权利要求书可以显而易见地看出本发明的其它特征、目标和优势。
本发明的拟肽大环化合物
本发明提供了式(I)的拟肽大环化合物：
Figure G2007800504073D00151
式I
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure G2007800504073D00152
-[NH-L4-CO-]、[-NH-L4-SO2-]或[-NH-L4-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的；
L1、L2、L3和L4独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，每个是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
每个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的，或作为与D残基所形成环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的，或作为与E残基所形成环状结构的一部分；
v是1-1000的整数；
w是1-1000的整数；
x是0-10的整数；
y是0-10的整数；
z是0-10的整数；和
n是1-5的整数。
在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是3。在本发明的其它实施方式中，x+y+z是3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择A、B、C、D或E中的每一个在本发明的大环化合物或大环化合物前体中的存在。例如，当x是3时，由式[A]x代表的序列包括其中氨基酸不同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala，以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含其是α-螺旋的二级结构，且R8是-H，允许螺旋内的氢键键合。
在其它实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的大环构成性连接体[-L1-S-L2-S-L3-]的长度，以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必定限于位于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的α-螺旋。
在某些实施方式中，拟肽大环化合物包含至少一个α-螺旋基序。例如，式I的化合物中的A、B和/或C包括一个或多个α-螺旋。一般地说，α-螺旋包括3-4个氨基酸残基/转角。在某些实施方式中，拟肽大环化合物的α-螺旋包括1-5个转角，因而是3-20个氨基酸残基。在特定实施方式中，α-螺旋包括1个转角、2个转角、3个转角、4个转角或5个转角。在某些实施方式中，大环构成性连接体稳定化包括在拟肽大环化合物之内的α-螺旋基序。因此，在某些实施方式中，选择从第一Cα到第二Cα之间的大环构成性连接体[-L1-S-L2-S-L3-]的长度，以提高α-螺旋的稳定性。在某些实施方式中，大环构成性连接体跨越α-螺旋的1-5个转角。在某些实施方式中，大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约1、2、3、4或5个转角。在某些实施方式中，大环构成性连接体的长度是α-螺旋的每个转角大约
Figure G2007800504073D00171
或α-螺旋的每个转角大约
Figure G2007800504073D00172
在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约1个转角时，长度等于大约5个-13个碳-碳键、大约7个-11个碳-碳键或大约9个碳-碳键。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约2个转角时，长度等于大约8个-16个碳-碳键、大约10个-14个碳-碳键或大约12个碳-碳键。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约3个转角时，长度等于大约14个-22个碳-碳键、大约16个-20个碳-碳键或大约18个碳-碳键。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约4个转角时，长度等于大约20个-28个碳-碳键、大约22个-26个碳-碳键或大约24个碳-碳键。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约5个转角时，长度等于大约26个-34个碳-碳键、大约28个-32个碳-碳键或大约30个碳-碳键。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约1个转角时，连接包含大约4个-12个原子、大约6个-10个原子或大约8个原子。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约2个转角时，连接包含大约7个-15个原子、大约9个-13个原子或大约11个原子。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约3个转角时，连接包含大约13个-21个原子、大约15个-19个原子或大约17个原子。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约4个转角时，连接包含大约19个-27个原子、大约21个-25个原子或大约23个原子。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约5个转角时，连接包含大约25个-33个原子、大约27个-31个原子或大约29个原子。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约1个转角时，产生的大环构成性包含大约17元-25元、大约19元-23元或大约21元的环。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约2个转角时，产生的大环形成包含大约29元-37元、大约31元-35元或大约33元的环。在大环构成性连接体跨越α-螺旋的大约3个转角时，产生的大环形成包含大约44元-52元、大约46元-50元或大约48元的环。在大环形成连接体跨越α-螺旋的大约4个转角时，产生的大环形成包含大约59元-67元、大约61元-65元或大约63元的环。在大环形成连接体跨越α-螺旋的大约5个转角时，产生的大环形成包含大约74元-82元、大约76元-80元或大约78元的环。
在其它实施方式中，为了促进细胞摄取，进一步修饰D和/或E。例如，在某些实施方式中，脂质化(lipidating)或PEG化(PEGylating)肽可促进细胞摄取、提高生物利用度、增加血液循环、改变药物代谢动力学、降低免疫原性和/或降低需要的给药频率。
本发明的拟肽大环化合物的合成包括多步骤方法，其特征在于(1)合成含有2个游离-SH部分的前体肽或拟肽；和(2)然后将前体与双烷基化试剂接触，以产生2个新共价键。
例如，大环化合物或大环化合物前体可以通过溶液相或固相方法合成，且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸。参见，例如，Hunt，Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids中的″TheNon-Protein Amino Acids″，由G.C.Barrett编著，Chapman and Hall，1985。在某些实施方式中，巯基部分是氨基酸残基L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、α-甲基-L-半胱氨酸、α-甲基-D-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、D-高半胱氨酸、α-甲基-L-高半胱氨酸或α-甲基-D-高半胱氨酸的侧链。双烷基化试剂具有X-L2-Y的通式，其中，L2是连接体部分，且X和Y是被-SH部分取代以与L2形成键的离去基团。在某些实施方式中，X和Y是如I、Br或Cl的卤素。
在一种实施方式中，当与前体肽或拟肽比较时，拟肽大环化合物显示改善的生物学性质，如提高的结构稳定性、提高的对靶标的亲和力、提高的对蛋白水解降解作用的耐受性和/或提高的细胞渗透性。在另一种实施方式中，当与前体肽或拟肽比较时，拟肽大环化合物在水溶液中包含一个或多个α-螺旋，和/或显示提高的α-螺旋度。本方法提供了通过改变X-L2-Y试剂合成拟肽大环化合物库的路线，在某些实施方式中，优化连接体元件L2以改善产生的拟肽大环化合物的生物学性质或药理性质。
在某些实施方式中，大环构成性连接体提高了拟肽大环化合物的细胞渗透性。因此，在某些实施方式中，相对于前体肽或拟肽，大环构成性连接体提高了拟肽大环化合物的总体疏水性。
具有已知的一级氨基酸序列、包含据信赋予生物活性的二级结构的任何蛋白质或多肽是本发明的主题。例如，可以分析多肽序列，且可以在适当的位置取代本发明的包含巯基的氨基酸类似物。通过查明生物活性需要二级结构的哪一个(哪些)分子表面，以及，本发明的大环构成性连接体跨过哪些其它表面可以形成大环化合物而不会在空间上阻断生物活性所需的表面，来确定所述适当的位置。使用如下方法进行这样的确定：如二级结构和天然的结合配偶体之间的复合物的X-射线结晶学分析，以显现对于活性关键的残基(和表面)；通过二级结构中的残基的连续诱变，以在功能上确认对于活性关键的残基(和表面)；或通过其它方法。通过这样的确定，用本发明的氨基酸类似物和大环构成性连接体取代合适的氨基酸。例如，对于α-螺旋的二级结构，生物学活性可能需要螺旋的一个表面(例如，沿螺旋的轴纵向地和围绕螺旋的轴大约45-135°径向地延伸的分子表面)在体内或体外与另一个生物分子接触。在这种情况下，大环构成性连接体设计为连接螺旋的2个α-碳，同时沿活性不直接需要的表面的一部分中的螺旋表面纵向地延伸。
在本发明的某些实施方式中，肽序列源自BCL-2家族的蛋白质。BCL-2家族被定义为存在最多4个被命名为BH1、BH2、BH3和BH4的保守的BCL-2同源性(BH)结构域，所有这些结构域均包括α-螺旋片段(Chittenden等人(1995)，EMBO 14：5589；Wang等人(1996)，Genes Dev.10：2859)。如BCL-2和BCL-XL的抗凋亡蛋白质在所有BH结构域中显示序列保守性。促凋亡蛋白质被分为“多结构域”家族成员(例如，BAK、BAX)，其在BH1、BH2和BH3结构域中具有同源性；和“仅BH3结构域”家族成员(例如，BID、BAD、BIM、BIK、NOXA、PUMA)，其只有在BH3两亲性α-螺旋片段中包含序列同源性。BCL-2家族成员具有形成同型二聚体或杂二聚体的能力，表明竞争性结合和抗凋亡蛋白质与促凋亡蛋白质水平之间的比率决定了对于死亡刺激的敏感性。抗凋亡蛋白质的功能是保护细胞免于促凋亡过量，即，过度的程序性细胞死亡。另外的“安全”措施包括调节促凋亡蛋白质的转录和维持它们作为无活性的构象异构体，这需要蛋白水解活化、脱磷酸化作用或配体诱导的构象变化以激活促死亡功能。在某些细胞类型中，在质膜处接收到的死亡信号经线粒体途径引发细胞凋亡。线粒体通过螯合细胞色素c作为细胞死亡的控制者(gatekeeper)，细胞色素c是活化胱天蛋白酶(caspase)9的胞质复合物的关键成分，导致致死性的下游蛋白溶解事件。如BCL-2/BCL-XL和BAK/BAX的多结构域蛋白在线粒体膜处发挥护卫者和执行者(guardian and executioner)的竞争作用，其活性进一步受上游的BCL-2家族的仅BH3成员的调节。例如，BID是促凋亡蛋白质的“仅BH3结构域家族”中的一个成员，并将在质膜处接收到的死亡信号传递给线粒体膜处的效应物促凋亡蛋白质。BID具有与促凋亡蛋白质和抗凋亡蛋白质相互作用的能力，并且一经胱天蛋白酶8活化，就引发细胞色素c释放和线粒体凋亡。缺失和诱变研究确定，促凋亡家族成员的两亲性α-螺旋BH3片段作为死亡结构域发挥功能，并因此代表与多结构域凋亡蛋白质相互作用的关键结构基序。结构研究已证明BH3螺旋通过插入由BH1、2和3结构域的界面形成的疏水沟与抗凋亡蛋白质相互作用。活化的BID可以被抗凋亡蛋白质(例如，BCL-2和BCL-XL)结合并螯合，并可以引发促凋亡蛋白质BAX和BAK的活化，导致细胞色素c释放和线粒体凋亡程序。BAD也是“仅BH3结构域促凋亡家族”的一个成员，其表达引发BAX/BAK的活化。但是，与BID相反，BAD显示优先结合抗凋亡家族成员BCL-2和BCL-XL。BAD BH3结构域显示与BCL-2的高亲和力结合，而BAD BH3肽则不能在体外活化细胞色素c从线粒体的释放，表明BAD不是BAX/BAK的直接活化剂。过度表达BCL-2的线粒体耐受BID诱导的细胞色素c释放，但与BAD共同处理可以恢复BID敏感性。BAD对线粒体凋亡的诱导似乎是由于：(1)BAX/BAK活化剂，如BID和BID样蛋白质，从BCL-2/BCL-XL结合袋(bindingpocket)中移除；或者(2)BAD选择性占据了BCL-2/BCL-XL结合袋，从而阻止了BID样蛋白质被抗凋亡蛋白质螯合。因此，已经出现两种类型的“仅BH3结构域蛋白质”：直接活化线粒体凋亡的BID样蛋白质，和具有通过占据多结构域抗凋亡蛋白质的结合袋而使线粒体对BID样促凋亡剂敏感的能力的BAD样蛋白质。已经公开了适合本文公开的方法的BCL-2家族成员蛋白质的各种α-螺旋结构域(Walensky等人(2004)，Science 305：1466；和Walensky等人，美国专利公开第2005/0250680号，本文引入其完整内容作为参考)。
在其它实施方式中，肽序列源自结合癌基因蛋白MDM2的肿瘤抑制性p53蛋白。MDM2结合位点位于形成α-螺旋的p53肿瘤抑制剂区域内。在美国专利7,083,983中(本文引入其完整内容作为参考)，Lane等人公开了负责结合MDM2的p53区域大致由成熟人p53蛋白的氨基酸13-31(PLSQETFSDLWKLLPENNV)代表。由Lane公开的其它修饰的序列也包括在本发明中。而且，Shair等人(1997)，Chem.&Biol.4：791已经讨论了p53和MDM2的相互作用，本文引入其完整内容作为参考；而且在报道的全部癌症病例中，实际上有一半已确认了p53基因中的突变。当对细胞施加应激时，据信p53协调导致细胞周期停止和DNA修复或程序性细胞死亡的应答。像直接改变p53蛋白的功能的p53基因中的突变一样，可以通过MDM2中的变化改变p53。已经表明MDM2蛋白结合p53，并通过与p53的反式激活域结合破坏转录激活。例如，源自p53的反式激活域的11氨基酸肽形成插入MDM2裂隙内的2.5个转角的两亲性α-螺旋。因此，在某些实施方式中，由本发明的方法产生的新的α-螺旋结构经人工改造，产生紧密结合螺旋受体并破坏天然的蛋白质-蛋白质相互作用的结构。然后使用高通量技术筛选这些结构，以鉴定最佳的小分子肽。破坏MDM2相互作用的新结构可用于许多应用，包括但不限于，软组织肉瘤(其在野生型p53的存在下过度表达MDM2)的控制。在某些实施方式中，这些癌症然后被截断MDM2的小分子阻止，因而防止了p53的抑制。此外，在某些实施方式中，MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂作为治疗辅剂，用来帮助控制和调节常规化疗中依赖p53的细胞凋亡应答的程度。
下面给出了用于本发明的合适的肽的非限制性的示例性列表：
表11
  名称   序列(黑体部分＝关键的残基)   交联的序列(X＝x-连接残基)
  BH3肽
  BID-BH3   QEDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPP   QEDIIRNIARHLAXVGDXMDRSIPP
  BIM-BH3   DNRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYAR   DNRPEIWIAQELRXIGDXFNAYYAR
  BAD-BH3   NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK   NLWAAQRYGRELRXMSDXFVDSFKK
  PUMA-BH3   EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYER   EEQWAREIGAQLRXMADXLNAQYER
  Hrk-BH3   RSSAAQLTAARLKALGDELHQRTM   RSSAAQLTAARLKXLGDXLHQRTM
  NOXAA-BH3   AELPPEFAAQLRKIGDKVYCTW   AELPPEFAAQLRXIGDXVYCTW
  NOXAB-BH3   VPADLKDECAQLRRIGDKVNLRQKL   VPADLKDECAQLRXIGDXVNLRQKL
  名称   序列(黑体部分＝关键的残基)   交联的序列(X＝x-连接残基)
  BMF-BH3   QHRAEVQIARKLQCIADQFHRLHT   QHRAEVQIARKLQXIADXFHRLHT
  BLK-BH3   SSAAQLTAARLKALGDELHQRT   SSAAQLTAARLKXLGDXLHQRT
  BIK-BH3   CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRA   CMEGSDALALRLAXIGDXMDVSLRA
  Bnip3   DIERRKEVESILKKNSDWIWDWSS   DIERRKEVESILKXNSDXIWDWSS
  BOK-BH3   GRLAEVCAVLLRLGDELEMIRP   GRLAEVCAVLLXLGDXLEMIRP
  BAX-BH3   PQDASTKKSECLKRIGDELDSNMEL   PQDASTKKSECLKXIGDXLDSNMEL
  BAK-BH3   PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRR   PSSTMGQVGRQLAXIGDXINRR
  BCL2L1-BH3   KQALREAGDEFELR   KQALRXAGDXFELR
  BCL2-BH3   LSPPVVHLALALRQAGDDFSRR   LSPPVVHLALALRXAGDXFSRR
  BCL-XL-BH3   EVIPMAAVKQALREAGDEFELRY   EVIPMAAVKQALRXAGDXFELRY
  BCL-W-BH3   PADPLHQAMRAAGDEFETRF   PADPLHQAMRXAGDXFETRF
  MCL1-BH3   ATSRKLETLRRVGDGVQRNHETA   ATSRKLETLRXVGDXVQRNHETA
  MTD-BH3   LAEVCTVLLRLGDELEQIR   LAEVCTVLLXLGDXLEQIR
  MAP-1-BH3   MTVGELSRALGHENGSLDP   MTVGELSRALGXENGXLDP
  NIX-BH3   VVEGEKEVEALKKSADWVSDWS   VVEGEKEVEALKXSADXVSDWS
  4ICD(ERBB4)-BH3   SMARDPQRYLVIQGDDRMKL   SMARDPQRYLVXQGDXRMKL
1表1所列出的肽序列是针对BH3结合位点的人类序列，并与癌症、自身免疫疾病、代谢疾病和其它人类疾病有关。
表21
  名称   序列(黑体部分＝关键的残基)   交联的序列(X＝x-连接残基)
  BH3肽
  BID-BH3   QEDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPP   QEDIIRNIXRHLXQVGDSMDRSIPP
  BIM-BH3   DNRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYAR   DNRPEIWIXQELXRIGDEFNAYYAR
  BAD-BH3   NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK   NLWAAQRYXRELXRMSDEFVDSFKK
  PUMA-BH3   EEQWAREIGAQLRRMADDLNAQYER   EEQWAREIXAQLXRMADDLNAQYER
  名称   序列(黑体部分＝关键的残基)   交联的序列(X＝x-连接残基)
  Hrk-BH3   RSSAAQLTAARLKALGDELHQRTM   RSSAAQLTXARLXALGDELHQRTM
  NOXAA-BH3   AELPPEFAAQLRKIGDKVYCTW   AELPPEFXAQLXKIGDKVYCTW
  NOXAB-BH3   VPADLKDECAQLRRIGDKVNLRQKL   VPADLKDEXAQLXRIGDKVNLRQKL
  BMF-BH3   QHRAEVQIARKLQCIADQFHRLHT   QHRAEVQIXRKLXCIADQFHRLHT
  BLK-BH3   SSAAQLTAARLKALGDELHQRT   SSAAQLTXARLXALGDELHQRT
  BIK-BH3   CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRA   CMEGSDALXLRLXCIGDEMDVSLRA
  Bnip3   DIERRKEVESILKKNSDWIWDWSS   DIERRKEVXSILXKNSDWIWDWSS
  BOK-BH3   GRLAEVCAVLLRLGDELEMIRP   GRLAEVXAVLXRLGDELEMIRP
  BAX-BH3   PQDASTKKSECLKRIGDELDSNMEL   PQDASTKKXECLXRIGDELDSNMEL
  BAK-BH3   PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRR   PSSTMGQVXRQLXIIGDDINRR
  BCL2L1-BH3   KQALREAGDEFELR   XQALXEAGDEFELR
  BCL2-BH3   LSPPVVHLALALRQAGDDFSRR   LSPPVVHLXLALXQAGDDFSRR
  BCL-XL-BH3   EVIPMAAVKQALREAGDEFELRY   EVIPMAAVXQALXEAGDEFELRY
  BCL-W-BH3   PADPLHQAMRAAGDEFETRF   PADPLXQAMXAAGDEFETRF
  MCL1-BH3   ATSRKLETLRRVGDGVQRNHETA   ATSRKXETLXRVGDGVQRNHETA
  MTD-BH3   LAEVCTVLLRLGDELEQIR   LAEVXTVLXRLGDELEQIR
  MAP-1-BH3   MTVGELSRALGHENGSLDP   MTVGELXRALXHENGSLDP
  NIX-BH3   VVEGEKEVEALKKSADWVSDWS   VVEGEKEXEALXKSADWVSDWS
  4ICD(ERBB4)-BH3   SMARDPQRYLVIQGDDRMKL SMARDPXRYLXIQGDDRMKL
1表2所列出的肽序列是针对BH3结合位点的人类序列，并与癌症、自身免疫疾病、代谢疾病和其它人类疾病有关。
表31
  名称 序列(黑体部分＝关键的残基)   交联的序列(X＝x-连接残基)
  P53肽
  hp53肽_非常短   LSQETFSDLWKLLPEN   XSQEXFSDLWKLLPEN
  hp53肽_短   PPLSQETFSDLWKLLPENN   PPXSQEXFSDLWKLLPENN
  hp53-P27S肽-短   PPLSQETFSDLWKLLSENN   PPXSQEXFSDLWKLLSENN
hp53肽_长   DPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLP   DPSVEPPXSQEXFSDLWKLLPENNVLSPLP
hp53-P27S肽_长   DPSVEPPLSQETFSDLWKLLSENNVLSPLP   DPSVEPPXSQEXFSDLWKLLSENNVLSPLP
  hp53肽_非常短   LSQETFSDLWKLLPEN   LSQETFSDLWXLLPXN
  hp53肽_短   PPLSQETFSDLWKLLPENN   PPLSQETFSDLWXLLPXNN
  hp53-P27S肽-短   PPLSQETFSDLWKLLSENN   PPLSQETFSDLWXLLSXNN
hp53肽_长   DPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLP   DPSVEPPLSQETFSDLWXLLPXNNVLSPLP
hp53-P27S肽_长   DPSVEPPLSQETFSDLWKLLSENNVLSPLP   DPSVEPPLSQETFSDLWXLLSXNNVLSPLP
1表3所列出的肽序列是针对mdm2/x的p53结合位点的人类序列，并与癌症有关。
表41
  名称 序列(黑体部分＝关键的残基) 交联的序列(X＝x-连接残基)
  GPCR肽配体
  名称 序列(黑体部分＝关键的残基) 交联的序列(X＝x-连接残基)
  血管紧张素II   DRVYIHPF   DRXYXHPF
  铃蟾肽(Bombesin)   EQRLGNQWAVGHLM   EQRLGNXWAVGHLX
  缓激肽   RPPGFSPFR   RPPXFSPFRX
  C5a   ISHKDMQLGR   ISHKDMXLGRX
  C3a   ARASHLGLAR   ARASHLXLARX
  α-黑素细胞刺激激素   SYSMEHFRWGKPV   SYSMXHFRWXKPV
1表4所列出的肽序列是针对人类G蛋白偶联受体的序列，并与多种人类疾病有关(Tyndall，J.D.A.等人Chem.Rev.2005，105，793-826)。
本发明的拟肽大环化合物的合成方法
本文公开了合成本发明的拟肽大环化合物的方法。取代可替代的但等效的保护基团、离去基团或试剂，并按照可替代的序列或顺序进行某些合成步骤，以产生需要的化合物。在合成本文所述的化合物中有用的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)包括，例如，那些例如在Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley and Sons(1991)；Fieser和Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和Paquette编著，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后续的版本中所述的方法。
例如，通过如Fields等人，Synthetic Peptides：A User′s Guide中的第3章，Grant，W.H.编著，Freeman&Co.，New York，N.Y.，1992，第77页中所述的化学合成方法，制备本发明的拟肽大环化合物。因此，例如，使用自动化Merrifield固相合成技术，使用侧链保护的氨基酸通过tBoc或Fmoc化学保护胺，例如在自动肽合成仪(例如，AppliedBiosystems(Foster City，CA)，430A、431或433型)上合成肽。
一种产生本文所述的前体肽和拟肽的方法使用固相肽合成(SPPS)。经与连接体分子的酸不稳定键，将C-末端氨基酸连接在聚苯乙烯树脂上。这种树脂不溶于用于合成的溶剂，使得洗去过量试剂和副产物相对简单和快速。用在酸中稳定、但可用碱去除的Fmoc基团保护N-末端。如必需的话，用碱稳定的、酸不稳定的基团保护侧链官能团。
例如，使用天然的化学连接，通过连接各个合成肽产生较长的前体肽。或者，通过众所周知的重组DNA和蛋白质表达技术生物合成较长的合成肽。众所周知的标准手册中提供了这些技术的详细方案。为了构建编码本发明的前体肽的基因，逆向翻译氨基酸序列以获得编码氨基酸序列的核酸序列，优选使用对于待表达该基因的有机体是最佳的密码子。接下来，如果必须的话，典型地通过合成编码肽的寡核苷酸和任何调整元件制备合成的基因。将合成的基因插入合适的克隆载体，并转染到宿主细胞中。然后在适于选择的表达系统和宿主的合适条件下表达该肽。通过标准方法纯化并表征该肽。
例如，以高通量组合方式，例如使用高通量多通道组合合成仪(例如，来自AAPPTEC，Inc.，Louisville，KY的Apex 396型多通道肽合成仪)，制备前体肽和拟肽。
提供以下的描述以说明各种可用于组装本发明化合物的多种方法中的某些方法。但是，这些描述并非意在限制用于制备本发明的化合物的反应或反应次序的范围。
单独提供了下面的合成方案以说明本发明，且并非意在限制本文所述的本发明的范围。为了简化附图，示例性的方案显示了源自L-或D-半胱氨酸的氨基酸类似物，其中，L1和L3都是-(CH2)-。但是，如以上整个发明详述部分所指出的，可以采用许多其它氨基酸类似物，其中，L1和L3可以独立地选自本文公开的各种结构。符号“[AA]m”、“[AA]n”、“[AA]o”代表如天然或非天然氨基酸的酰胺键连接部分的序列。如上所述，“AA”的每次出现独立于任何其它“AA”的出现，而且如“[AA]m”的通式包括(例如)不相同氨基酸的序列以及相同氨基酸的序列。
合成方案1：
Figure G2007800504073D00281
在这第一种通用方法中，拟肽前体含有2个-SH部分，而且使用可商购的如N-α-Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸或N-α-Fmoc-S-三苯甲基-D-半胱氨酸的N-α-Fmoc氨基酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(″Bioorganic Chemistry：Peptides and Proteins″，Oxford University Press，New York：1998，本文引入其完整内容作为参考)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-三苯甲基单体。接着通过标准条件(例如，如95％TFA的强酸)对前体拟肽去保护并从固相树脂上切下。前体拟肽作为粗混合物发生反应，或者经纯化后与X-L2-Y在有机溶液或水溶液中反应。在某些实施方式中，在稀释条件(即，0.15mmol/L)下进行烷基化反应，以有利于大环化(macrocyclization)并避免聚合。在某些实施方式中，在如液态NH3(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH3/MeOH或NH3/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)的有机溶液中进行烷基化反应。在其它实施方式中，在如pH 8的6M盐酸胍(Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554)的水溶液中进行烷基化反应。在其它实施方式中，用于烷基化反应的溶剂是DMF或二氯乙烷。
合成方案2：
Figure G2007800504073D00301
在这第二种通用方法中，前体拟肽含有2个或多个-SH部分，特别保护其中的2个以允许其选择性去保护和随后的烷基化以形成大环化合物。使用可商购的如N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸或N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-D-半胱氨酸的N-α-Fmoc氨基酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成前体拟肽。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(″Bioorganic Chemistry：Peptides and Proteins″，Oxford University Press，New York：1998，本文引入其完整内容作为参考)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基单体。接着通过标准条件(例如，如溶于DCM的1％TFA的弱酸)选择性地切下拟肽前体的Mmt保护基团。然后前体拟肽在树脂上与有机溶液中的X-L2-Y反应。例如，该反应在如二异丙基乙胺的受阻碱(hindered base)的存在下发生。在某些实施方式中，在如液态NH3(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH3/MeOH或NH3/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)的有机溶液中进行烷基化反应。在其它实施方式中，烷基化反应在DMF或二氯乙烷中进行。接着通过标准条件(例如，如95％TFA的强酸)将拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。
合成方案3：
Figure G2007800504073D00311
在这第三种通用方法中，拟肽前体含有2个或多个-SH部分，特别保护其中的2个以允许其选择性去保护和随后的烷基化以形成大环化合物。使用可商购的如N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸、N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-D-半胱氨酸、N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-L-半胱氨酸和N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-D-半胱氨酸的N-α-Fmoc氨基酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成拟肽前体。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(″Bioorganic Chemistry：Peptides and Proteins″，Oxford University Press，New York：1998，本文引入其完整内容作为参考)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基或N-α-Fmoc-S-S-叔丁基单体。接着用已知条件(例如，溶于DMF的20％的2-巯基乙醇，参考文献：Galande等人(2005)，J.Comb.Chem.7：174-177)选择性地切下拟肽前体的S-S-叔丁基保护基团。然后前体拟肽在树脂上与有机溶液中的摩尔过量的X-L2-Y反应。例如，反应在如二异丙基乙胺的受阻碱的存在下发生。接着通过标准条件(例如，如溶于DCM的1％TFA的弱酸)选择性地切下拟肽前体的Mmt保护基团。然后拟肽前体在树脂上通过用有机溶液中的受阻碱处理而环化。在某些实施方式中，在如NH3/MeOH或NH3/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)的有机溶液中进行烷基化反应。接着通过标准条件(例如，如95％TFA的强酸)对拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。
合成方案4：
Figure G2007800504073D00321
在这第四种通用方法中，拟肽前体含有2个L-半胱氨酸部分。通过活细胞中已知的生物表达系统或通过已知的体外无细胞表达方法合成拟肽前体。前体拟肽作为粗混合物发生反应，或者经纯化后在有机溶液或水溶液中与X-L2-Y反应。在某些实施方式中，在稀释条件(即，0.15mmol/L)下进行烷基化反应，以利于大环化并避免聚合。在某些实施方式中，在如液态NH3(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.PeptideProtein Res.40：233-242)、NH3/MeOH或NH3/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)的有机溶液中进行烷基化反应。在其它实施方式中，在如pH 8的6M盐酸胍(Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554)的水溶液中进行烷基化反应。在其它实施方式中，在DMF或二氯乙烷中进行烷基化反应。在另一种实施方式中，在非变性水溶液中进行烷基化；在另外一种实施方式中，在有利于α-螺旋结构形成的条件下进行烷基化。在另外一种实施方式中，在有利于前体拟肽与另一种蛋白质结合的条件下进行烷基化，从而在烷基化过程中诱导结合的α-螺旋构象的形成。
设想了适合与巯基反应的X和Y的各种实施方式。一般地，X或Y各自独立地选自表5所示的一般种类。例如，X和Y是如-Cl、-Br或-I的卤素。
表5：能够与巯基反应的反应基团的例子和产生的连接键
  X或Y   产生的共价键
  丙烯酰胺   硫醚
  卤化物(例如，烷基或芳基卤化物)   硫醚
  磺酸酯(sulfonate)   硫醚
  氮丙啶(aziridine)   硫醚
  环氧化物   硫醚
  卤代乙酰胺   硫醚
  马来酰亚胺   硫醚
  磺酸酯(sulfonate ester)   硫醚
表6显示本发明的示例性的大环化合物。对于该表格所示的例子，对应的非大环多肽是BID BH3多肽序列片段DIIRNIARHLAQVGDSMDRSI。“NL”代表正亮氨酸，并取代甲硫氨酸残基。可以想到使用类似的连接体根据表1-表4所公开的多肽序列合成拟肽大环化合物。
表6：本发明的拟肽大环化合物的例子
Figure G2007800504073D00341
表6：本发明的拟肽大环化合物的例子
Figure G2007800504073D00351
对于该表格所示的例子，对应的非大环多肽是BIDBH3多肽序列片段DIIRNIARHLAQVGDSMDRSI。“NL”代表正亮氨酸。
氨基酸类似物
本发明涉及天然存在的和非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物在合成上述拟肽大环化合物中的应用。任何适合于用来合成稳定的含有二巯基的拟肽大环化合物的合成方法的氨基酸或氨基酸类似物都可以用于本发明中。例如，预计半胱氨酸是本发明中有用的氨基酸。但是，含有不同氨基酸侧链的除半胱氨酸之外的含硫氨基酸也可用于本发明。例如，半胱氨酸在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的末端-SH之间含有一个亚甲基单元。本发明也涉及使用在α-碳和末端-SH之间具有多个亚甲基单元的氨基酸。非限制性的例子包括L-高半胱氨酸、D-高半胱氨酸、α-甲基-L-高半胱氨酸和α-甲基-D-高半胱氨酸。在某些实施方式中，氨基酸和氨基酸类似物是D-构型。在其它实施方式中，它们是L-构型。在某些实施方式中，拟肽中包含的某些氨基酸和氨基酸类似物是D-构型，而某些氨基酸和氨基酸类似物是L-构型。在某些实施方式中，氨基酸类似物是α，α-二取代的，如α-甲基-L-半胱氨酸和α-甲基-D-半胱氨酸。在某些实施方式中，氨基酸类似物是N-烷基化的，例如，N-甲基-L-半胱氨酸和N-甲基-D-半胱氨酸。
在本发明中有用的用于形成拟肽大环化合物的其它氨基酸类似物是式IIa的化合物：
Figure G2007800504073D00361
(式IIa)
其中：
R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基；
L1独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，它们是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
R9和R10独立地是-H或适于肽合成的保护基；
n是1-5的整数；
Q是S；且
P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于肽合成的保护基；或者，Q和P一起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分。
在某些实施方式中，氨基酸的-NH或-SH部分受到保护。在其它实施方式中，两个部分都受到保护，例如，用于氨基酸中的-NH和-SH部分的保护基团。这样的-NH保护基团的非限制性的例子是-Fmoc和-Boc。-SH保护基团的非限制性的例子是-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基和-S叔丁基。在其它实施方式中，在合成拟肽大环化合物之前，不保护氨基酸。
表7.本发明的典型的氨基酸
Figure G2007800504073D00381
                                     
Figure G2007800504073D00382
R-α-甲基
N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-L-半胱氨酸           N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-半胱氨酸
Figure G2007800504073D00383
                                  
Figure G2007800504073D00384
                                              R-α-甲基
N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸   N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-半胱氨酸
Figure G2007800504073D00385
                                  
                                               R-α-甲基
N-α-Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸           N-α-Fmoc-S-三苯甲基-半胱氨酸
大环构成性连接体
本发明包括用来连接拟肽前体中的两个或多个-SH部分以形成本发明的拟肽大环化合物的大环构成性连接体。如上所述，大环构成性连接体赋予构象刚性、提高的代谢稳定性和/或提高的细胞渗透性。另外，在某些实施方式中，形成大环的连接稳定化拟肽大环化合物的α-螺旋二级结构。大环构成性连接体为式X-L2-Y，其中，X和Y二者都是如上定义的相同或不同的部分。X和Y二者都具有允许一个大环构成性连接体-L2-将含有二巯基的拟肽前体双烷基化的化学特征。如上定义，连接体-L2-包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基或亚杂环芳基或-R4-K-R4-，所有这些都可以任选地被如上定义的R5基团取代。另外，除了连接含巯基氨基酸的-SH的碳原子之外，大环构成性连接体-L2-中的1-3个碳原子可以任选地被如N、S或O的杂原子取代。
大环构成性连接体X-L2-Y的L2构件在长度上可以根据尤其是用来形成拟肽大环化合物的两个氨基酸类似物的位置之间的距离而变化。另外，当大环构成性连接体的L1和/或L3构件的长度变化时，为了产生具有合适的总长度的连接体以形成稳定的拟肽大环化合物，L2的长度也可以变化。例如，如果通过向L1和L3中的每一个上添加一个另外的亚甲基单元来改变所用的氨基酸类似物，那么L2在长度上减少大约两个亚甲基单元等效长度，以抵消L1和L3的增加的长度。
在某些实施方式中，L2是式-(CH2)n-的亚烷基，其中，n是大约1-大约15之间的整数。例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其它实施方式中，L2是亚烯基。在其它的实施方式中，L2是芳基。
表X显示X-L2-Y基团的其它实施方式。
表8.本发明的X-L2-Y基团的例子
Figure G2007800504073D00401
例如，该表中的X和Y各自独立地是Cl-、Br-或I-。
试剂盒
另一方面，本发明进一步提供了包含本文所述的氨基酸类似物和/或大环构成性连接体的试剂盒。
在一种实施方式中，试剂盒包含：
a)式IIa的化合物和式IIb的化合物：
Figure G2007800504073D00411
其中：
R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
R2是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
L1和L3独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基或亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，每个是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、-R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7和R8独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
R9和R10各自独立地是-H或任何适于液相或固相肽合成的保护基；
Q是S；
P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于液相或固相肽合成的保护基；或者，Q和P一起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分；n是1-5的整数；
和
b)下式结构的大环形成连接体：
X-L2-Y
其中，L2是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R11-K-R11-]n，每个是未取代的或被R12取代的；
每个R11是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R12独立地是卤素、烷基、-OR13、-N(R6)13、-SR13、-SOR13、-SO2R13、-CO2R13、-R13、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R13独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；和
X和Y各自独立地是能够与巯基反应的反应基团。
在某些实施方式中，试剂盒包含一个或多个容纳一种或多种如本文所述的天然存在的氨基酸或氨基酸类似物的容器。在其它实施方式中，试剂盒包含一个或多个容纳一种或多种如本文所述的大环构成性连接体的容器。在其它的实施方式中，试剂盒包含一个或多个容纳一种或多种如本文所述的氨基酸或氨基酸类似物的容器，以及一个或多个容纳一种或多种如本文所述的大环构成性连接体的容器。
例如，在某些实施方式中，试剂盒包含一个容纳至少一种如本文所述的含有-SH部分的氨基酸或氨基酸类似物的容器，该氨基酸任选地受到保护并适于本文所述的合成。在某些实施方式中，氨基酸或氨基酸类似物选自L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、L-N-甲基半胱氨酸、D-N-甲基半胱氨酸、L-高半胱氨酸、D-高半胱氨酸、L-N-甲基高半胱氨酸、D-N-甲基高半胱氨酸、α-甲基-L-半胱氨酸、α-甲基-D-半胱氨酸、α-甲基-L-高半胱氨酸、α-甲基-D-高半胱氨酸、L-青霉胺、D-青霉胺、L-N-甲基青霉胺、D-N-甲基青霉胺及其所有用于液相或固相肽合成的适当保护的形式。
在某些实施方式中，试剂盒包含容纳与适合本文所述的拟肽大环化合物合成的固体载体结合的至少一种天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或氨基酸类似物的容器。
在某些实施方式中，试剂盒包含容纳上述的大环构成性连接体的容器。在某些实施方式中，试剂盒进一步包含一个或多个容纳本文所述的大环化反应所必需的试剂的容器，所述试剂如三氟乙酸、液氨、NH3/MeOH、NH3/DMF、巯基乙醇、如三乙胺或二异丙基乙胺的受阻碱和盐酸胍。
在某些实施方式中，试剂盒包含一个容纳本发明的含有反应性-SH基团的氨基酸类似物的容器，以及一个容纳本发明的大环形成连接体的容器。任选地，试剂盒进一步包含一个或多个容纳大环化反应所必需的试剂的容器。在其它实施方式中，试剂盒包含两个容器，其中每一个容纳一种不同的本发明的含有反应性-SH基团的氨基酸类似物。任选地，试剂盒进一步包含一个或多个容纳大环化反应所必需的试剂和/或本发明的大环构成性连接体的容器。
测定
例如，通过使用下面所述的方法，分析本发明的拟肽大环化合物的性质。在某些实施方式中，相对于相应的非大环多肽，本发明的大环化合物具有提高的性质。相应的非大环多肽是，例如，拟肽大环的前体，如可转变为所述大环化合物的式III的化合物。或者，相应的非大环多肽是多肽序列，如具有与本发明的大环化合物重叠的实际序列的天然多肽序列。相应于大环多肽的天然多肽的许多例子如表1、2、3和4所示。
一般地，相应的非大环多肽也可以是标记的天然多肽或拟肽前体。例如，在下面所述的一些试验中如果必需的话，使用例如通过荧光标记或放射性标记进行的这样的标记。在这些试验中，典型地通过类似的或功能上相当的方法标记大环化合物和相应的非大环多肽。
测定α-螺旋度的试验
未修饰的促凋亡BH3结构域的百分螺旋度在溶液中主要是随机卷曲，具有通常低于25％的α-螺旋含量。另一方面，例如，具有最佳连接体的拟肽大环化合物具有高于相应的非大环多肽至少2倍的α-螺旋度。在某些实施方式中，本发明的大环化合物具有高于50％的α-螺旋度。为了测定本发明的拟肽大环例如基于BH3结构域的大环化合物的螺旋度，将化合物溶于pH 7的50mM磷酸钾水溶液或蒸馏水中，至25-50μM的浓度。在20℃下，使用下面的标准测量参数，用旋光分光计(例如，Jasco J-710)获得圆二色性(CD)光谱：波长，190-260nm；步距分辨率(step resolution)，0.5nm；速度，20nm/秒；累积次数，10；响应，1秒；带宽，1nm；路径长度，0.1cm。通过将平均残基椭圆度[Φ]222obs除以报道的模型螺旋十肽的[Φ]222obs，计算每个肽的α-螺旋含量(Yang等人(1986)，MethodsEnzymol.130：208)。
测定熔解温度(Tm)的试验
含有如α-螺旋的二级结构的本发明的拟肽大环化合物显示例如比相应的非大环多肽更高的熔解温度。典型地，本发明的拟肽大环化合物显示＞60℃的Tm，代表在水溶液中非常稳定的结构。拟肽大环化合物和未修饰的肽以50μM的终浓度溶于蒸馏水中，并且通过使用下面的标准测量参数，用旋光分光计(例如，Jasco J-710)测量在一定温度范围(4-95℃)内的椭圆度变化来测定Tm：波长，222nm；步距分辨率，0.5nm；速度，20nm/秒；累积次数，10；响应，1秒；带宽，1nm；温度升高速度，1℃/分钟；路径长度，0.1cm。
蛋白酶耐受性分析
肽骨架的酰胺键对于蛋白酶的水解是敏感的，因而致使肽化合物在体内易于快速降解。但是，肽螺旋的形成一般掩蔽酰胺骨架，从而可以保护其免于蛋白水解裂解。将本发明的拟肽大环化合物进行体外胰蛋白酶的蛋白水解，以评价与相应的非大环多肽相比其降解速度的任何变化。拟肽大环化合物和相应的非大环多肽与胰蛋白酶琼脂糖一起温育，并在各个时间点通过离心终止反应，随后注入HPLC以根据280nm处的紫外吸收定量残留的底物。简单地说，拟肽大环化合物和前体肽(5mcg)与胰蛋白酶琼脂糖(Pierce)(S/E～125)温育0、10、20、90和180分钟。通过台式离心机离心终止反应；通过基于HPLC的在280nm处的峰检测，对分离出的上清液中残余的底物进行定量。蛋白水解反应显示一级动力学，且由ln[S]相对于时间的曲线图确定速率常数k(k＝-1X斜率)。
体外稳定性分析
具有最佳连接体的拟肽大环化合物具有(例如)高于相应的非大环多肽至少2倍的体外半衰期，且具有12小时或更长的体外半衰期。对于体外血清稳定性研究，将拟肽大环化合物和相应的非大环多肽(在特定实例中，相应的天然多肽)(2mcg)与新鲜的小鼠、大鼠和人血清(2mL)在37℃下温育0、1、2、4、8和24小时。为了测定完整化合物的水平，使用下面的步骤：如下提取样品：将100μl的血清转移到2ml离心管中，接着加入10μL的50％甲酸和500μL乙腈，并在4±2℃下以14,000RPM离心10分钟。然后将上清液转移到新鲜的2ml管，并在N2＜10psi、37℃在Turbovap上蒸发。在100μL的50∶50乙腈∶水中重构样品，并送交LC-MS/MS分析。
体外结合分析
为了评价拟肽大环化合物和前体肽与受体蛋白质的结合和亲和力，例如使用荧光偏振测定(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子定向和迁移率。当用偏振光激发时，由于其相比附着在较小分子上的荧光示踪剂(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)具有较慢的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂(例如，FITC)(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)发射较高水平的偏振荧光。
例如，在室温下，荧光标记的(fluoresceinated)拟肽大环化合物(25nM)与受体蛋白质(25-1000nM)在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中温育30分钟。例如，用Perkin-ElmerLS50B发光分光光度计通过荧光偏振测定结合活性。使用GraphpadPrism软件通过非线性回归分析确定Kd值。本发明的拟肽大环化合物显示例如与相应的非大环多肽类似的或更低的Kd。
在该试验中可以使用如BCL-2、BCL-XL、BAX或MCL1的对于BH3-肽的受体蛋白质。在该试验中也可以使用如MDM2或MDMX的对于p53肽的受体蛋白质。
表征肽-蛋白质相互作用的拮抗剂的体外置换试验
为了评价拮抗肽(例如，BH3肽或p53肽)和受体蛋白质之间的相互作用的化合物的结合和亲和力，例如，使用利用荧光标记的来源于前体肽序列的拟肽大环化合物的荧光偏振测定(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子定向和迁移率。当用偏振光激发时，由于其相比附着在较小分子上的荧光示踪剂(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)具有较慢的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂(例如，FITC)(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)发射较高水平的偏振荧光。在竞争性结合FPA实验中检测拮抗荧光标记的拟肽大环化合物和受体蛋白质之间的相互作用的化合物。
例如，在室温下，假定的拮抗剂化合物(1nM-1mM)和荧光标记的拟肽大环化合物(25nM)与受体蛋白质(50nM)在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中温育30分钟。例如，用Perkin-Elmer LS50B发光分光光度计通过偏振荧光测定拮抗剂的结合活性。使用Graphpad Prism软件通过非线性回归分析确定Kd值。
可以在该试验中作为假定的拮抗剂检验任一类型的分子，如有机小分子、肽、寡核苷酸或蛋白质。在该试验中可以使用如BCL-2、BCL-XL、BAX或MCL1的对于BH3-肽的受体蛋白质。在该试验中可以使用如MDM2或MDMX的对于p53肽的受体蛋白质。
完整细胞中的结合分析
可以在完整细胞中通过免疫沉淀实验测定肽或拟肽大环化合物与其天然受体的结合。例如，完整的细胞与荧光标记的(FITC-标记的)化合物在不含血清的情况下温育4小时，接着置换血清，并进一步温育4-18小时。然后使细胞沉淀，并在4℃下、在裂解缓冲液(50mM Tris[pH 7.6]、150mM NaCl、1％CHAPS和蛋白酶抑制剂混合物)中温育10分钟。以14,000rpm离心提取物15分钟，收集上清液，与10μl山羊抗-FITC抗体温育2小时，在4℃旋转接着进一步与蛋白A/G Sepharose(50μl的50％珠浆)温育2小时。快速离心之后，在具有增加的盐浓度(例如，150、300、500mM)的裂解缓冲液中洗涤沉淀物。在加入含有SDS的样品缓冲液和煮沸之前，以150mM NaCl再平衡小珠。离心后，任选地使用4％-12％梯度Bis-Tris凝胶对上清液进行电泳，接着转移到Immobilon-P膜上。封闭之后，任选地将印迹与检测FITC的抗体温育，也与一种或多种检测结合拟肽大环化合物的蛋白质的抗体温育，所述蛋白质包括BCL2、MCL1、BCL-XL、A1、BAX、BAK、MDM2或MDMX。
细胞渗透性分析
相比相应的非大环多肽，拟肽大环化合物例如具有更好的细胞渗透性。在某些实施方式中，拟肽大环化合物比相应的非大环多肽具有更好的细胞渗透性。具有最佳连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非大环多肽至少2倍的细胞渗透性，并且，通常观察到20％或更多的应用的肽在4小时后已渗透入细胞。为了测定拟肽大环化合物和相应的非大环多肽的细胞渗透性，在37℃下在不含血清的培养基中，将完整的细胞与荧光标记的拟肽大环化合物或相应的非大环多肽(10μM)温育4小时，用培养基洗涤2次，并在37℃下与胰蛋白酶(0.25％)温育10分钟。再次洗涤细胞并将其再悬浮于PBS中。例如，通过使用FACSCalibur流式细胞仪或Cellomics’
Figure G2007800504073D00481
HCS读数仪分析细胞荧光。
细胞效力分析
例如，在基于细胞的杀伤试验中，使用各种致瘤和非致瘤的细胞系和源自人类或小鼠细胞群体的初级细胞，测定某些拟肽大环化合物的效力。例如，在与拟肽大环化合物(0.5-50μM)一起培养的24-96小时期间监测细胞的存活，以鉴定那些以EC50＜10μM杀死细胞的化合物。测定细胞存活力的几种标准测定工具是可商购的，并任选地用来评价拟肽大环化合物的效力。另外，测定膜联蛋白V和胱天蛋白酶活化的试验任选地用来评价拟肽大环化合物能否通过激活凋亡机制杀死细胞。
体内稳定性分析
为了研究拟肽大环化合物的体内稳定性，例如，向小鼠和/或大鼠通过IV、IP、PO或吸入方式以0.1-50mg/Kg的浓度施用化合物，并在注射后0′、5′、15′、30′、1小时、4小时、8小时和24小时抽取血样。然后通过上述LC-MS/MS测定25μL新鲜血清中的完整化合物的水平。
动物模型中的体内效力
为了确定某些拟肽大环化合物在体内的抗癌活性，单独(IP、IV、PO、通过吸入或鼻途径)施用化合物，或与亚最佳剂量的相关化疗药物(例如，环磷酰胺、阿霉素、依托泊苷)联合施用化合物。在一个实例中，在NOD-SCID小鼠遭受全身辐射3小时后，通过尾静脉向它们注射稳定表达萤光素酶的5x106 RS4；11细胞(从急性淋巴母细胞性白血病患者的骨髓建立)。如果不予治疗，在这种模型中，这种形式的白血病在3周内是致命的。例如，通过对小鼠注射D-萤光素(60mg/kg)，并使麻醉的动物成像(例如，Xenogen In VivoImaging System，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)，容易地监测白血病。通过Living Image Software(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)，经积分(integration)光子通量(photonic flux)(光子/秒)定量全身生物发光。例如，通过尾静脉或IP途径以0.1mg/kg-50mg/kg的剂量向白血病小鼠单独施用拟肽大环化合物或与亚最佳剂量的相关化疗药物联合施用(注射之后10天/实验的第1天，14-16的生物发光)，进行7-21天。任选地，在整个实验过程中，每隔一天对小鼠成像，并在实验期间每天监测其存活。在实验结束时任选地对死亡的小鼠进行尸体检查。另一种动物模型是将源自人类滤泡性淋巴瘤的细胞系DoHH2移植到稳定表达萤光素酶的NOD-SCID小鼠中。这些体内试验任选地产生初步的药物代谢动力学、药效学和毒理学数据。
临床试验
为了确定本发明的拟肽大环化合物对于治疗人类的适用性，进行临床试验。例如，选择诊断为癌症并需要治疗的患者，并将他们分成治疗组和一个或多个对照组，其中，对治疗组施用本发明的拟肽大环化合物，而对照组接受安慰剂或一种已知的抗癌药。这样，通过对患者组就如生存和生活质量的因素进行比较，评价本发明的拟肽大环化合物的治疗安全性和有效性。在这个实例中，相比用安慰剂治疗的患者对照组，用拟肽大环化合物治疗的患者组显示提高的长期生存。
药物组合物和给药途径
本发明的拟肽大环化合物也包括其药学上可接受的衍生物或前药。“药学上可接受的衍生物”指本发明的化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、前药或其它衍生物，其在向接受者施用后能够提供(直接或间接地)本发明的化合物。尤其有利的药学上可接受的衍生物是那些当向哺乳动物施用时提高本发明的化合物的生物利用度的衍生物(例如，通过提高口服化合物的血液吸收)，或相对于母体化合物增加活性化合物向生物区室(例如，脑或淋巴系统)的递送的衍生物。一些药学上可接受的衍生物包括增加水溶性或跨过胃肠粘膜的主动转运的化学基团。
在某些实施方式中，通过共价或非共价地连接合适的官能团修饰本发明的拟肽大环化合物，以提高选择性的生物学性质。这样的修饰包括那些提高向特定生物区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物学渗透性、提高口服利用性、增加溶解性以允许注射施用、改变代谢以及改变排泄率的修饰。
本发明的化合物的药学上可接受的盐包括那些由药学上可接受的无机酸和无机碱以及有机酸和有机碱衍生的盐。合适的酸式盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐(undecanoate)。由合适的碱衍生的盐包括碱金属盐(例如，钠盐)、碱土金属盐(例如，镁盐)、铵盐和N-(烷基)4 +盐。
为了由本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体包括固体或液体载体。固态制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以作为稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料发挥作用。在科学文献和专利文献中详细描述了配制和给药技术，参见，例如，最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences，MaackPublishing Co，Easton PA。
在粉剂中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性成分混合。在片剂中，活性成分与具有必需的结合性质的载体按照适当的比例混合，并压制成需要的形状和大小。
合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶和黄蓍胶；以及蛋白质，如明胶和胶原蛋白。如果需要的话，加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
液态制剂包括溶液、悬浮液和乳状液，例如，水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射液，液体制剂可以在聚乙二醇水溶液中配制。
药物制剂优选为单位剂型。制剂以这样的形式再分为含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，该包装含有分散量的制剂，如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。另外，单位剂型本身可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂，或者可以是包装形式的适量的其中任一种。
当本发明的组合物包含拟肽大环化合物和一种或多种另外的治疗剂或预防剂的组合时，该化合物和另外的药物应该以在单一治疗方案中正常施用的剂量的大约1-100％的剂量水平存在，更优选大约5-95％。在某些实施方式中，另外的药物作为多剂量方案的一部分，与本发明的化合物分开施用。或者，这些药物是单一剂型的部分，在单一组合物中与本发明的化合物混合。
使用方法
一方面，本发明提供了新的拟肽大环化合物，其在竞争性结合试验中可用于确认可结合作为模建拟肽大环化合物的基础的蛋白质或肽的天然配体的物质。例如，在p53MDM2系统中，基于p53的标记的稳定化的拟肽大环化合物与竞争性结合MDM2的小分子一起在MDM2结合试验中使用。竞争性结合研究允许快速体外评价并确定对于p53/MDM2系统特异性的药物候选物。同样地，在BH3/BCL-XL抗凋亡系统中，基于BH3的标记的拟肽大环化合物可以与竞争性结合BCL-XL的小分子一起在BCL-XL结合试验中使用。竞争性结合研究允许快速体外评价并确定对于BH3/BCL-XL系统特异性的药物候选物。本发明进一步提供了针对拟肽大环化合物的抗体的产生。在某些实施方式中，这些抗体特异性地结合拟肽大环化合物和衍生出拟肽大环化合物的p53或BH3前体肽。例如，这样的抗体分别破坏p53/MDM2或BH3/BCL-XL系统。
在其它方面，本发明提供了处理处于与异常(例如，不足或过量)BCL-2家族成员表达或活性(例如，外来或内在的凋亡途径异常)有关的疾病的危险(或对所述疾病敏感)或患有所述疾病的受试者的预防方法和治疗方法。据信，某些BCL-2型疾病至少部分上由一种或多种BCL-2家族成员的异常水平(例如，过度表达或不足表达)引起，或由一种或多种显示异常活性的BCL-2家族成员的存在引起。这样，例如，BCL-2家族成员的水平和/或活性的降低，或，BCL-2家族成员的水平和/或活性的提高，用来改善或减少疾病的不利症状。
另一方面，本发明提供了通过干扰肿瘤细胞中的p53和MDM2之间的相互作用或结合来治疗或预防过度增生性疾病的方法。这些方法包括向包括人类的温血动物或向含有野生型p53的肿瘤细胞施用有效量的本发明的化合物。在某些实施方式中，本发明的化合物的施用诱导细胞生长停止或凋亡。在其它或进一步的实施方式中，本发明用来治疗疾病和/或包含升高的MDM2水平的肿瘤细胞。本文所用的升高的MDM2水平是指，通过ELISA和类似的试验测定，高于在含有超过mdm2的正常拷贝数(2)的细胞中发现的水平的MDM2水平，或高于每个细胞大约10,000个MDM2分子的MDM2水平(Picksley等人(1994)，Oncogene 9，2523-2529)。
如本文所用，术语“治疗”定义为向患者应用或施用治疗剂，或者向从患者分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者患有疾病、疾病的症状或具有患病倾向，目的是治愈、恢复、减轻、解除、改变、矫正、缓解、改善或影响疾病、疾病的症状或患病倾向。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物用来治疗、预防和/或诊断癌症和肿瘤疾病。如本文所用，术语“癌”、“过度增生性”和“肿瘤的”指具有自主生长能力的细胞，即，以快速增加的细胞生长为特征的异常状态或疾病。过度增生性和肿瘤疾病状态可以分类为病理的，即，表现或构成疾病状态；或者可以分类为非病理的，即，偏离正常但与疾病状态无关。该术语意味着包括全部类型的癌性生长或致癌过程、转移性的组织或恶性转化的细胞、组织或器官，不管组织病理类型或侵入的阶段如何。转移性肿瘤可以源
自许多原发性肿瘤类型，包括但不限于：乳腺、肺、肝、结肠和卵巢原发的肿瘤。“病理性过度增生性”细胞出现于以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态中。非病理性过度增生性细胞的例子包括与创伤修复有关的细胞的增殖。细胞增生性和/或分化性疾病的例子包括癌症，例如，癌、肉瘤或转移性疾病。在某些实施方式中，拟肽大环化合物是用于控制乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、这些癌症的转移等的新的治疗剂。
癌症或肿瘤疾病的例子包括但不限于：纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食道癌、直肠癌、胰癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯肿瘤、子宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。
增生性疾病的例子包括造血肿瘤性疾病。如本文所用，术语“造血肿瘤性疾病”包括涉及造血起源的(例如，源自骨髓、淋巴或红细胞谱系的)增生性/肿瘤细胞或其前体细胞的疾病。优选地，疾病起因于分化不良的急性白血病，例如，成红细胞白血病和急性巨核母细胞性白血病。其它示例性的骨髓疾病包括但不限于：急性前髓样(promyeloid)白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)(综述见于Vaickus(1991)，Crit Rev.Oncol./Hemotol.11：267-97)；淋巴恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，包括B-谱系ALL和T-谱系ALL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。其它形式的恶性淋巴瘤包括但不限于：非何杰金氏淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞性淋巴瘤(CTCL)、大颗粒状淋巴细胞性白血病(LGF)、何杰金氏病和里德-斯特恩伯格病。
乳房的细胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于：增生性乳房疾病，包括，例如，上皮细胞增生、硬化性腺病和小导管乳头状瘤；肿瘤，例如，如纤维腺瘤、叶状肿瘤和肉瘤的基质肿瘤，和如大导管乳头状瘤的上皮肿瘤；乳癌，包括原位(非侵袭性)癌，包括原位导管癌(包括佩吉特病)和小叶原位癌；和侵袭性(浸润性)癌，包括但不限于，浸润性导管癌、浸润性小叶癌、髓样癌、胶样(粘液)癌、小管癌和浸润性乳头状癌，和混杂性的恶性肿瘤。男性乳房疾病包括但不限于男性乳房发育症和癌。
肺的细胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于：支气管原癌，包括类肿瘤综合征、细支气管肺泡癌、神经内分泌肿瘤，例如，支气管类癌、混杂性的肿瘤和转移的肿瘤；包括炎性胸腔积液、非炎性胸腔积液、气胸的胸膜病状，和包括孤立性纤维性肿瘤(胸膜纤维瘤)和恶性间皮瘤的胸膜肿瘤。
结肠的细胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于：非肿瘤息肉、腺瘤、家族性综合征(familial syndromes)、结肠直肠癌形成、结肠直肠癌和类癌肿瘤。
肝的细胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于：结节性增生、腺瘤和恶性肿瘤，包括肝的原发癌和转移性的肿瘤。
卵巢的细胞增生性和/或分化性疾病的例子包括但不限于：卵巢肿瘤，例如，体腔上皮瘤、浆液瘤、粘液瘤、子宫内膜样瘤、透明细胞腺癌、囊腺纤维瘤、布伦纳瘤、表面上皮性肿瘤；生殖细胞瘤，例如，成熟(良性)畸胎瘤、单胚层畸胎瘤、不成熟的恶性畸胎瘤、无性细胞瘤、内胚窦瘤、绒膜癌；性索-间质肿瘤(sex cord-stomaltumors)，例如，粒层-卵泡膜细胞瘤、泡膜细胞瘤(thecoma)、纤维瘤(fibromas)、男性母细胞瘤(androblastomas)、小山细胞瘤(hillcell tumors)和性腺母细胞瘤；和如克鲁肯贝格瘤的转移瘤。
在其它或进一步的实施方式中，本文所述的拟肽大环化合物用来治疗、预防或诊断以过度活跃的细胞死亡或由于生理损伤造成的细胞死亡等为特征的疾病。以成熟前或不希望的细胞死亡或者不希望的或过度的细胞增殖为特征的疾病的一些例子包括但不限于细胞减少性/细胞减生性、无细胞性/发育不全性、或细胞过多性/增生性疾病。一些例子包括血液系统疾病，包括但不限于：范科尼贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血(thalaessemia)、先天性中性白细胞减少、脊髓发育不良。
在其它或进一步的实施方式中，发挥减少凋亡作用的本发明的拟肽大环化合物用来治疗与不希望的细胞死亡水平相关的疾病。因此，在某些实施方式中，本发明的抗凋亡拟肽大环化合物用来治疗如导致与病毒感染相关的细胞死亡的疾病的疾病，例如，与人免疫缺陷病毒(HIV)感染有关的感染。各种神经系统疾病的特征为特定神经元组的逐渐损失，在某些实施方式中，本发明的抗凋亡拟肽大环化合物用于治疗这些疾病。这样的疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩和各种形式的小脑变性。这些疾病中的细胞损失不包括炎症反应，而且凋亡似乎是细胞死亡的机制。另外，许多血液系统疾病与血细胞的产生减少相关。这些疾病包括与慢性病相关的贫血、再生障碍性贫血、慢性中性白细胞减少和骨髓发育异常综合征。血细胞产生障碍，如骨髓发育异常综合征和某些形式的再生障碍性贫血，与骨髓内的凋亡性细胞死亡增加相关。这些疾病可能起因于促进凋亡的基因的激活、基质细胞或造血成活因子的获得性缺陷或毒素和免疫应答介质的直接效应。两种与细胞死亡相关的常见疾病是心肌梗塞和中风。在这两种疾病中，在血流急性损失的情况下产生的中心缺血区的细胞似乎由于坏死而快速死亡。但是，在中心缺血区之外，细胞死亡的时间延长，从形态学上看似乎死于凋亡。在其它或进一步的实施方式中，本发明的抗凋亡拟肽大环化合物用来治疗所有这些与不希望的细胞死亡相关的疾病。
用本文所述的拟肽大环化合物治疗的免疫障碍的一些例子包括但不限于：器官移植排斥、关节炎、狼疮、IBD、局限性回肠炎、哮喘、多发性硬化、糖尿病等。
用本文所述的拟肽大环化合物治疗的神经系统疾病的一些例子包括但不限于：阿尔茨海默病、唐氏综合征、荷兰型遗传性脑出血淀粉样变性病、反应性淀粉样变性病、伴有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样蛋白肾病、默-韦综合征、特发性骨髓瘤；巨球蛋白血症相关的骨髓瘤、家族性淀粉样多发性神经病、家族性淀粉样心肌病、孤立性心脏淀粉样变性(Isolated Cardiac Amyloid)、全身性老年淀粉样变性病、成年人发作的糖尿病、胰岛瘤、孤立性心房淀粉样变性(Isolated Atrial Amyloid)、甲状腺髓样癌、家族性淀粉样变性病、伴有淀粉样变性的遗传性脑出血、家族性淀粉样多发性神经病变、痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、格-施-沙综合征、牛海绵状脑炎、朊病毒介导的疾病和亨廷顿舞蹈病。
用本文所述的拟肽大环化合物治疗的内分泌疾病的一些例子包括但不限于：糖尿病、甲状腺机能减退、垂体机能减退、甲状旁腺机能减退、性腺机能减退等。
用本文所述的拟肽大环化合物治疗或预防的心血管疾病(例如炎性疾病)的例子包括但不限于：动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、血栓形成、动脉瘤、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛、心源性猝死、高血压性心脏病；非冠状血管疾病，例如，小动脉硬化、小血管病、肾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高脂血症、黄瘤病、哮喘、高血压、肺气肿和慢性肺病；或者与介入操作(“手术性血管创伤”)相关的心血管疾病，例如，血管成形术后再狭窄、设置旁路(shunt)、放置支架、合成或天然的切除移植物、留置导管、瓣膜或其它可植入装置。优选的心血管疾病包括动脉粥样硬化、心肌梗塞、动脉瘤、中风。
实施例
下面的部分提供了本发明的说明性的实施例。
实施例1.拟肽大环化合物的合成
目标分子是氨基酸12和16被半胱氨酸取代的BID-BH3肽(参见表1和表6)。用1，4-二溴丁烷衍生化半胱氨酸侧链巯基，以形成二硫醚拟肽大环化合物。
Figure G2007800504073D00571
按照所述的通用的肽合成策略，拟肽前体是在PTI-Ranin PS3单通道合成仪上以0.2mmol的规模合成的序列为DIIARHLACVGDCNLDRSL(其中，“NL”或“Nle”代表正亮氨酸)的多肽，合成中对于每种氨基酸使用下面的偶联循环。
去保护  DMF中的20％的哌啶，2x7分钟
洗涤   DMF，6x0.5分钟
偶联   每种氨基酸5倍过量，DMF中的TBTU和DIEA，1x20分钟
洗涤   DMF，2x0.5分钟
偶联   每种氨基酸5倍过量，DMF中的TBTU和DIEA，1x20分钟
洗涤   DMF，6x0.5分钟
通过用溶于二甲基甲酰胺(DMF)的1mM的乙酸酐和1mM的二异丙基乙胺(DIEA)处理45分钟将前体多肽在氨基末端乙酰化。在具有对甲氧基三苯甲基(Mmt)保护的cys9和cys13巯基的Rink酰胺树脂(0.6mMol/g的取代)上进行合成。用二氯甲烷(DCM)中的1％TFA/4％TIS将Mmt基团选择性地去保护，并在室温下使用二氯乙烷中的50摩尔当量的1，4-二溴丁烷和13摩尔当量的二异丙基乙胺(DIEA)对多肽烷基化过夜。然后通过用94％TFA、2％TIS、2％苯甲醚、2％H2O处理3小时从树脂切下肽，接着过滤、经旋转蒸发浓缩并用二乙醚沉淀。最终的拟肽大环产物的预期的分子量是2448.91。通过MALDI MS实测的分子量是2445.5(见图1)。
已经描述了本发明的许多实施方式。尽管如此，应当理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其它实施方式也在下面的权利要求书的范围之内。

Claims (61)

1.式(I)的拟肽大环化合物：
Figure A2007800504070002C1
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、-[NH-L4-CO-]、[-NH-L4-SO2-]或[-NH-L4-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的；
L1、L2、L3和L4独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，每个是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
每个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的，或作为与D残基所形成环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的，或作为与E残基所形成环状结构的一部分；
v是1-1000的整数；
w是1-1000的整数；
x是0-10的整数；
y是0-10的整数；
z是0-10的整数；
n是1-5的整数；且
x+y+z至少是3。
2.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述R1和R2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。
3.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述R1和R2独立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。
4.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。
5.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述R1和R2独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。
6.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述R1和R2中的至少一个是甲基。
7.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述R1和R2是甲基。
8.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述D和E中的至少一个是被高分子量的脂质或烃取代的天然或非天然的氨基酸。
9.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述D和E中的至少一个连接于另外的式[-L1-S-L2-S-L3-]的大环构成性连接体上。
10.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物的二级结构比相应的非大环多肽的相应的二级结构更稳定。
11.如权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环包含α-螺旋。
12.如权利要求11所述的拟肽大环化合物，其中，所述α-螺旋包含1-5个转角。
13.如权利要求11所述的拟肽大环化合物，其中，所述α-螺旋比相应的非大环多肽的α-螺旋更稳定。
14.如权利要求11所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]跨越α-螺旋的1-5个转角。
15.如权利要求11所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]跨越α-螺旋的大约1、2、3、4或5个转角。
16.如权利要求11所述的拟肽大合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]的长度是α-螺旋的每个转角大约5-大约9
Figure A2007800504070004C2
。
17.如权利要求11所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]跨越α-螺旋的大约1个转角。
18.如权利要求17所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约5个-大约13个碳-碳键的长度。
19.如权利要求17所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约7个-大约10个碳-碳键的长度。
20.如权利要求17所述的拟肽大环化合物，其中，所述大环化合物包含大约17-25个原子的环。
21.如权利要求11所述的拟肽大环化合物，其中，所述α-螺旋包含大约2个转角。
22.如权利要求21所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约8个-大约16个碳-碳键的长度。
23.如权利要求21所述的拟肽大环化合物，其中，所述[-L1-S-L2-S-L3-]的长度近似等于大约10个-大约13个碳-碳键的长度。
24.如权利要求21所述的拟肽大环化合物，其中，所述大环化合物包含大约29-大约37个原子的环。
25.式IIa的化合物：
Figure A2007800504070005C1
其中：
R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基；
L1独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，它们是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
R9和R10独立地是-H或适于肽合成的保护基；
n是1-5的整数；
Q是S；且
P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于肽合成的保护基；或者，Q和P一起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分。
26.如权利要求25所述的化合物，其中，所述R1是未取代的或被卤素取代的烷基。
27.如权利要求25所述的化合物，其中，所述R1是未取代的烷基。
28.如权利要求25所述的化合物，其中，所述R1是甲基。
29.如权利要求25所述的化合物，其中，所述R9和R10中的至少一个是适于肽合成的保护基。
30.一种试剂盒，包含：
a)式IIa的化合物和式IIb的化合物：
Figure A2007800504070006C1
其中：
R1是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
R2是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的；
L1和L3独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基或亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，每个是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、-R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7和R8独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基或杂环烷基；
R9和R10各自独立地是-H或任何适于液相或固相肽合成的保护基；
Q是S；
P是-H、-三苯甲基、对甲氧基三苯甲基、-S叔丁基或任何其它适于液相或固相肽合成的保护基；或者，Q和P一起形成能够经化学转化成为-SH基团的部分；n是1-5的整数；
和
b)下式结构的大环构成性连接体：
X-L2-Y
其中，L2是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R11-K-R11-]n，每个是未取代的或被R12取代的；
每个R11是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
每个R12独立地是卤素、烷基、-OR13、-N(R6)13、-SR13、-SOR13、-SO2R13、-CO2R13、-R13、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
每个R13独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；和
X和Y各自独立地是能够与巯基反应的反应性基团。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述R2是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。
32.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述R1和R2是烷基。
33.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述R1和R2是甲基。
34.一种合成拟肽大环化合物的方法，该方法包括将式III的拟肽前体与式X-L2-Y的化合物接触的步骤：
Figure A2007800504070008C1
其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1、L2和L3如权利要求1所定义；且X和Y各自独立地是能够与巯基反应的反应性基团；
x+y+z至少是3；
而且，进一步，其中，所述接触步骤导致在式III中的两个巯基之间形成共价连接。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述R1和R2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。
36.如权利要求34所述的方法，其中，所述R1和R2独立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。
38.如权利要求34所述的方法，其中，所述R1和R2独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。
39.如权利要求34所述的方法，其中，所述R1和R2中的至少一个是甲基。
40.如权利要求34所述的方法，其中，所述R1和R2是甲基。
41.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽前体在细胞中表达。
42.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽前体在接触步骤之前纯化。
43.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物在接触步骤之后纯化。
44.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物在接触步骤之后再折叠。
45.如权利要求34所述的方法，其中，所述方法在溶液中进行。
46.如权利要求34所述的方法，其中，所述方法在固体载体上进行。
47.如权利要求34所述的方法，其中，所述接触步骤在结合所述拟肽前体的目标大分子的存在下在有利于所述结合的条件下进行。
48.如权利要求34所述的方法，其中，所述接触步骤在优先结合所述拟肽前体的目标大分子的存在下在有利于所述结合的条件下进行。
49.如权利要求34所述的方法，其中，所述方法应用于合成拟肽大环的库。
50.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物在水溶液中包含α-螺旋。
51.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物在水溶液中比相应的非大环多肽显示增多的α-螺旋结构。
52.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物相比相应的非大环多肽，显示提高的热稳定性。
53.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物相比相应的非大环多肽，显示提高的生物学活性。
54.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物相比相应的非大环多肽，显示增强的对蛋白水解降解作用的耐受。
55.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物相比相应的非大环多肽，显示提高的渗透活细胞的能力。
56.如权利要求34所述的方法，其中，式III的化合物的2个巯基部分是选自L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、α-甲基-L-半胱氨酸和α-甲基-D-半胱氨酸的氨基酸的侧链。
57.如权利要求34所述的方法，其中，x+y+z是3，且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。
58.如权利要求34所述的方法，其中，所述接触步骤在选自质子溶剂、水溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行。
59.如权利要求34所述的方法，其中，所述溶剂是DMF、二氯乙烷、NH3、NH3/MeOH、NH3/DMF或盐酸胍水溶液。
60.如权利要求34所述的方法，其中，所述溶剂是有利于螺旋形成的溶剂。
61.如权利要求34所述的方法，其中，所述拟肽大环化合物具有式(I)：
Figure A2007800504070010C1
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