JP2019214614A - 精製されたポリペプチド組成物を調製するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】精製されたポリペプチド組成物を調製するための方法の提供。【解決手段】精製されたペプチド模倣大環状分子組成物を調製するための方法であって：ａ）メタセシス反応を受けることができる少なくとも２つの部分を含むペプチド模倣前駆体と、金属を含むメタセシス触媒とを接触させて粗ペプチド模倣大環状分子を作製する工程と；ｂ）該粗ペプチド模倣大環状分子を精製して重量で３０ｐｐｍ未満の該金属を含む精製されたペプチド模倣大環状分子組成物を得る工程とを包含する方法。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、２００８年９月２２日に出願された、米国仮出願第６１／０９９，０９９号（この出願は、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。

ペプチドは、生物学的プロセスで重要である。例えば、ペプチドは、ホルモン、酵素インヒビター、基質、神経伝達物質、神経媒介因子として、および多くの他の機能を果たし得る。ペプチドは、レセプターまたは酵素に結合し得、それによって細胞間の連絡に影響し、かつ代謝、免疫防御および生殖などの生命維持に必要な細胞機能を制御し得る（非特許文献１）。このように、治療剤としての医薬品化学において、および薬学的適用においてペプチドを用いることが興味深い。

治療剤および医薬としての未改変のペプチドの有用性は、いくつかの要因によって制限されている。これらの制限としては、ペプチダーゼ分解に対する感受性などの代謝安定性の不足、細胞透過性の不足、および高次構造の可塑性に起因する結合特性の欠失が挙げられる。これらの制限的な特性を改善する試みが記載されており、これには種々の方法による環状ペプチドおよびペプチド模倣物の生成が挙げられ、方法としてはジスルフィド結合形成、アミド結合形成および炭素−炭素の結合形成が挙げられる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。これらのアプローチはやはり、代謝安定性の不足（ジスルフィド結合およびアミド結合）、細胞透過性の不足（ジスルフィド結合およびアミド結合）、および潜在的に毒性の金属の使用（炭素−炭素結合形成について）を含む要因によってやはり制限される。詳細には、毒性の金属不純物の存在によって、例えば、触媒の形態で、このような金属を要する、化学反応を介して製造されるポリペプチド薬物の臨床使用に対して重大な課題が課される場合がある。従って、ペプチド模倣化合物を精製する方法、およびこのような方法によって生成される純粋な組成物が必要である。

Ｂａｂｉｎｅら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，１３５９ Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９１）１１３：９３９１〜９３９２ Ｐｈｅｌａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９７）１１９：４５５〜４６０ Ｔａｙｌｏｒ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００２）６６：４９〜７５ Ｂｒｕｎｅｌら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００５）（２０）：２５５２〜２５５４ Ｈｉｒｏｓｈｉｇｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９５）１１７：１１５９０〜１１５９１ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．（１９９８）Ｅｄ．３７：３２８１〜３２８４ Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：５８９１〜５８９２

発明の要旨
本発明は、これらおよび他の必要性に取り組む。一局面では、本発明は、精製されたペプチド模倣大環状分子組成物を調製するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ペプチド模倣前駆体を接触させる工程と、粗ペプチド模倣大環状分子を精製して、精製されたペプチド模倣大環状分子組成物を得る工程とを包含する。このような実施形態では、このペプチド模倣前駆体は、粗ペプチド模倣大環状分子を生成するために、メタセシス触媒を用いるメタセシス反応を受けることができる少なくとも２つの部分を含んでもよい。

本明細書に開示される方法によって精製されるペプチド模倣大環状分子組成物は金属を含んでもよい。一実施形態では、この組成物の金属は、重量で約７５、２０、１０、５または１ｐｐｍ未満含む。別の実施形態では、この精製されたペプチド模倣大環状分子組成物は、ヒト被験体などの被験体に対して安全に投与され得る金属濃度を含む。

本発明はまた、第二のアミノ酸に対して第一のアミノ酸を接続する架橋剤を含むペプチド模倣大環状分子と、重量で約０．５ｐｐｍ〜約１、５、１０、２０、または７５ｐｐｍの間の濃度の金属とを含む組成物を提供する。一実施形態では、この組成物は、第一のアミノ酸と第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含むペプチド模倣大環状分子を含み、ここでこのアミノ酸の少なくとも１つはα，α−二置換アミノ酸であり、かつさらにここでこの組成物の金属濃度は重量で約１、５、１０、２０、または７５ｐｐｍ未満である。関連の実施形態では、この組成物は、第一のアミノ酸がα，α−二置換である架橋剤を含む。別の関連の実施形態では、この組成物は第二のアミノ酸がα，α−二置換である架橋剤を含む。

いくつかの実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーのらせん、α−らせん、α−らせんドメイン、またはＢＨ３ドメインを含む。このペプチド模倣大環状分子は、表１、２、３、または４のペプチド配列に対して相同であってもよい。一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子と表１の配列との間の相同性は、少なくとも６０％であっても、または少なくとも８０％であってもよい。

ペプチド模倣大環状分子は好ましくは、第二のアミノ酸に対して第一のアミノ酸を接続する架橋剤を含む。一実施形態では、この第一のアミノ酸と第二のアミノ酸は３つのアミノ酸によって隔てられる。別の実施形態では、この第一のアミノ酸および第二のアミノ酸は６つのアミノ酸によって隔てられる。

一実施形態では、架橋剤は６〜１４個の連続的な結合を含む。別の実施形態では、この架橋剤は８〜１６個の連続的な結合を含む。別の実施形態では、この架橋剤は、８〜１２個の連続的な結合を含む。別の実施形態では、この架橋剤は、１０〜１３個の連続的な結合を含む。

ペプチド模倣大環状分子は好ましくは、らせん構造を含む。このらせん構造はα−らせんの１つ以上のターンを含んでもよい。例えば、架橋剤は、１、２またはそれを超えるターンを含むα−らせんを含んでもよい。一実施形態では、架橋剤は、α−らせんの１ターン〜５ターンにまたがる。別の実施形態では、架橋剤は、α−らせんの１ターンあたり約５Å〜約９Åの長さを含む。

架橋剤の一局面では、第一のアミノ酸のまたは第二のアミノ酸のα位置が置換されてもよい。一実施形態では、この第一のアミノ酸のα位置は、さらに置換される。別の実施形態では、この第二のアミノ酸のα位置はさらに置換される。

一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、約１８原子〜約２６原子の環を含む。別の実施形態では、このペプチド模倣大環状分子は約２９原子〜約３７原子の環を含む。

ペプチド模倣大環状分子は、このペプチド模倣大環状分子で処置された被験体の生理学的ｐＨの５％下かまたは上で正味の正の電荷を担持し得る。一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、約ｐＨ７．４という正味の正の電荷を担持し得る。

ペプチド模倣大環状分子は、ハロゲン、アルキル基、蛍光性部分、アフィニティー標識、標的化部分、または放射性同位体のうちの１つ以上を含む部分を含んでもよい。

ペプチド模倣大環状分子は、治療剤として有用であり得る。一実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、癌の処置のための治療剤として提供される。別の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、臨床治験での評価のもとで治療剤として提供される。

本発明のペプチド模倣大環状分子組成物は金属を含んでもよい。ペプチド模倣大環状分子組成物の合成に使用される金属の濃度および種類は変化し得る。本発明で使用される金属濃度（重量で）の非限定的な例としては、約１ｐｐｍ未満、約２ｐｐｍ未満、約２．５ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約１〜約５、１０、２０、７５ｐｐｍ、または約０．５〜約５、１０、２０もしくは７５ｐｐｍが挙げられる。

一局面では、ペプチド模倣大環状分子の金属はルテニウムまたはオスミウムである。一実施形態では、この組成物は、重量で約１、５、１０、２０、または７５ｐｐｍ未満というルテニウムの総濃度を含む。別の実施形態では、この組成物は、重量で約０．５ｐｐｍ〜約５、１０、２０、または７５ｐｐｍというルテニウムの総濃度を含む。

本発明は、ペプチド模倣大環状分子を作製するために１つ以上のメタセシス反応を使用する。一実施形態では、メタセシス触媒は、ルテニウム触媒またはオスミウム触媒を含む。関連の実施形態では、このメタセシス触媒は、ヨウ素、臭素、塩素、フェニル、カルベン、シクロヘキシル、ホスフィン、トリシクロヘキシルホスフィン、イミダゾール、またはベンジリデンである１つ以上の置換基を含む。一局面では、メタセシス触媒は固体支持体に結合される。

本発明のペプチド模倣大環状分子組成物は、賦形剤を含んでもよい。一実施形態では、このペプチド模倣大環状分子はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む。このペプチド模倣大環状分子組成物は、溶媒の存在または非存在において様々な形態、例えば、粉末、塩、液体、または凍結乾燥された形態で存在し得る。一実施形態では、このペプチド模倣大環状分子組成物は、ペプチド模倣大環状分子の薬学的に受容可能な塩を含む。このペプチド模倣物の薬学的に受容可能な塩は、例えば、塩酸塩または酢酸塩を含んでもよい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
精製されたペプチド模倣大環状分子組成物を調製するための方法であって：
ａ）メタセシス反応を受けることができる少なくとも２つの部分を含むペプチド模倣前駆体と、金属を含むメタセシス触媒とを接触させて粗ペプチド模倣大環状分子を作製する工程と；
ｂ）該粗ペプチド模倣大環状分子を精製して、重量で３０ｐｐｍ未満の該金属を含む精製されたペプチド模倣大環状分子組成物を得る工程と、
を包含する、方法。
（項目２）
前記精製工程がＤＭＳＯでの洗浄工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記精製工程がさらに、例えば、ＨＰＬＣによる少なくとも２回のクロマトグラフィー精製工程を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記精製工程が結晶化を包含しない、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ペプチド模倣大環状分子組成物が重量で２０、１０、５または１ｐｐｍ未満の前記金属を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ペプチド模倣大環状分子が、らせんを含み、例えば、ここで該らせんがα−らせんである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ペプチド模倣大環状分子がＢＣＬ−２ファミリーのメンバーのα−らせんドメインを含み、例えば、ここで該ペプチド模倣大環状分子がＢＨ３ドメインを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ペプチド模倣大環状分子が、表１、２、３または４中の配列のうち少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ペプチド模倣大環状分子が第二のアミノ酸に対して第一のアミノ酸を接続する架橋剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ペプチド模倣大環状分子が約１８原子〜約２６原子の環、または約２９原子〜約３７原子の環を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ペプチド模倣大環状分子がｐＨ７．４で正味の正の電荷を担持する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が３つまたは６つのアミノ酸によって隔てられる、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記架橋剤が、６個と１４個との間の連続的な結合、または８個と１６個との間の連続的な結合を含む、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記架橋剤がα−らせんの１ターン〜５ターンにまたがる、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記架橋剤が前記α−らせんの１ターンあたり約５Å〜約９Åの長さを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第一または第二のアミノ酸のα位置がさらに置換されている、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記ペプチド模倣大環状分子が、治療剤、ハロゲン、アルキル基、蛍光性部分、アフィニティー標識、標的化部分、または放射性同位体のうちの１つ以上を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ペプチド模倣大環状分子組成物が、重量で約０．５ｐｐｍと約１０ｐｐｍとの間の濃度の金属を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記メタセシス触媒がルテニウム触媒またはオスミウム触媒を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記メタセシス触媒が、ヨウ素、臭素、塩素、フェニル、カルベン、シクロヘキシル、ホスフィン、トリシクロヘキシルホスフィン、イミダゾール、またはベンジリデンからなる群より選択される１つ以上の置換基を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記ペプチド模倣前駆体が固体支持体に結合される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記メタセシス触媒が固体支持体に結合される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ペプチド模倣大環状分子組成物が、該ペプチド模倣大環状分子の薬学的に受容可能な塩、例えば、塩酸塩または酢酸塩を含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記ペプチド模倣大環状分子組成物が、被験体に対して安全に投与され得る、項目１に記載の方法。
（項目２５）
αらせんペプチド模倣大環状分子組成物であって：
ａ）第一のアミノ酸と第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含む、α−らせんペプチド模倣大環状分子と；
ｂ）重量で約０．５ｐｐｍと約３０ｐｐｍとの間の濃度のルテニウムまたはオスミウムとを含む、組成物。
（項目２６）
項目２５に記載の組成物であって、さらにここで前記アミノ酸のうち少なくとも１つがα，α−二置換アミノ酸であって、例えば、ここで前記第一または第二のアミノ酸がα，α−二置換である、組成物。
（項目２７）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が３つのアミノ酸によって隔てられる、項目２５に記載の組成物。
（項目２８）
前記架橋剤が６個と１４個との間の連続的な結合、または８個と１２個との間の連続的な結合を含む、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が６個のアミノ酸によって隔てられる、項目２５に記載の組成物。
（項目３０）
前記架橋剤が８個と１６個との間の連続的な結合、または１０個と１３個との間の連続的な結合を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記架橋剤が前記α−らせんの１ターン〜５ターン、例えば、該αらせんの１ターンまたは２ターンにまたがる、項目２５に記載の組成物。
（項目３２）
前記架橋剤の長さが前記α−らせんの１ターンあたり約５Å〜約９Åである、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
前記ペプチド模倣大環状分子がｐＨ７．４で正味の正の電荷を担持する、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
前記ペプチド模倣大環状分子が、治療剤、ハロゲン、アルキル基、蛍光性部分、アフィニティー標識、標的化部分、または放射性同位体のうちの１つ以上を含む、項目２５に記載の組成物。
（項目３５）
前記金属が、メタセシス触媒またはメタセシス触媒の誘導体を含む、項目２５に記載の組成物。
（項目３６）
前記メタセシス触媒が、ヨウ素、臭素、塩素、フェニル、カルベン、シクロヘキシル、ホスフィン、トリシクロヘキシルホスフィン、イミダゾール、またはベンジリデンを含む、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
重量で約３０、２０、１０、５または１ｐｐｍ未満の金属の総濃度を含む、項目２５に記載の組成物。
（項目３８）
前記ペプチド模倣大環状分子がその薬学的に受容可能な塩、例えば、塩酸塩または酢酸塩を含む、項目２５に記載の組成物。

文献の引用
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参照により組み込まれて示されるのと同程度まで、参照により本明細書に援用される。

定義
本明細書において用いる場合、「大環状分子（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ）」という用語は、少なくとも９個の共有結合された原子によって形成されるリングまたはサイクルを含む化学構造を有する分子を指す。

本明細書において用いる場合、「ペプチド模倣大環状分子」または「架橋ポリペプチド」という用語は、同じ分子内の第一の天然に存在するアミノ酸残基、または天然に存在しないアミノ酸残基（またはアナログ）および第二の天然に存在するアミノ酸残基、または天然に存在しないアミノ酸残基（またはアナログ）の間で大環状分子を形成する、複数のペプチド結合および少なくとも１つの大環状分子形成リンカー（または架橋剤）によって結合された複数のアミノ酸残基を含む化合物を指す。ペプチド模倣大環状分子は、大環状分子形成リンカーが、第一のアミノ酸残基（またはアナログ）のα炭素を第二のアミノ酸残基（またはアナログ）のα炭素に連結する実施形態を含む。ペプチド模倣大環状分子は必要に応じて、１つ以上のアミノ酸残基および／またはアミノ酸アナログ残基の間の１つ以上の非ペプチド結合を含み、そして必要に応じて、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸残基またはアミノ酸アナログ残基を、大環状分子を形成する任意のものに加えて、含む。

本明細書において用いる場合、「安定性」という用語は、円二色性、ＮＭＲ、または別の生物物理学的手段によって測定される、本発明のペプチド模倣大環状分子によって溶液中で規定される二次構造の維持、またはインビトロもしくはインビボにおけるタンパク質分解性の分解に対する抵抗性を指す。本発明において企図される二次構造の非限定的な例は、α−らせん、β−ターン、およびβ−プリーツシートである。

本明細書において用いる場合、「らせん（ｈｅｌｉｃａｌ）安定性」という用語は、円二色性またはＮＭＲによって測定される、本発明のペプチド模倣大環状分子によるαらせん構造の維持を指す。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のペプチド模倣大環状分子は、Ｒ−置換基を欠いている対応する大環状分子と比較して、円二色性によって決定されるα−らせん度において、少なくとも１．２５、１．５、１．７５、または２倍の増大を示す。

「α−アミノ酸」または単に「アミノ酸」という用語は、α−炭素と呼ばれる炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。適切なアミノ酸としては、限定するものではないが、天然に存在するアミノ酸のＤ−異性体およびＬ−異性体の両方、ならびに有機合成または他の代謝経路によって調製される天然に存在しないアミノ酸が挙げられる。文脈が具体的に別のことを示さない限り、本明細書において使用されるアミノ酸という用語は、アミノ酸アナログを含むものとする。

「天然に存在するアミノ酸」という用語は、自然界において合成されるペプチドにおいて一般に見つけられ、一文字の略語、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶによって公知の２０個のアミノ酸のうちのいずれか１つを指す。

「アミノ酸アナログ」または「非天然アミノ酸」という用語は、アミノ酸に構造的に類似しており、かつペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸の代わりに用いることができる分子を指す。アミノ酸アナログとしては、限定するものではないが、アミノ基とカルボキシル基の間に１つ以上の追加のメチレン基を包含すること（例えばα−アミノβ−カルボキシ酸）を除いて、または同様に反応性の基によってアミノ基もしくはカルボキシ基が置換されること（例えば第二級もしくは第三級アミンでの第一級アミンの置換またはエステルでのカルボキシ基の置換）を除いて、本明細書において規定されるアミノ酸と構造的に同一である化合物が挙げられる。

「非必須」アミノ酸残基は、その必須の生物学的または生化学的活性（例えばレセプター結合または活性化）を消失することも、実質的に改変することもなく、ポリペプチド（例えば、ＢＨ３ドメインまたはｐ５３ ＭＤＭ２結合ドメイン）の野生型配列から改変することができる残基である。「必須」アミノ酸残基とは、ポリペプチドの野生型配列から改変された場合に、結果として、ポリペプチドの必須の生物学的または生化学的活性を消失し、または実質的に消失することになる残基である。

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えばＫ、Ｒ、Ｈ）、酸性の側鎖（例えば、Ｄ、Ｅ）、非荷電極性側鎖（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）、非極性側鎖（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）、β分枝側鎖（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）、および芳香族側鎖（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、ＢＨ３ポリペプチドにおける、予測される非必須アミノ酸残基は、例えば、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と交換される。許容できる置換の他の例は、等比体積の（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）考慮（例えば、メチオニンに対するノルロイシン）または他の特性（例えば、フェニルアラニンに対する２−チエニルアラニン）に基づく置換である。

大環状分子または大環状分子形成リンカーと組み合わせて、本明細書において用いられる「メンバー」という用語は、大環状分子を形成し、または大環状分子を形成することができる原子を指し、そして置換基または側鎖の原子を除外する。類推によって、シクロデカン、１，２−ジフルオロ−デカン、および１，３−ジメチルシクロデカンは全て、水素またはフルオロ置換基またはメチル側鎖が大環状分子の形成に参加しないので、１０員の大環状分子と考えられる。

記号

は、分子構造の一部として用いられる場合、単結合またはトランスもしくはシス二重結合を指す。

「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸におけるα−炭素に結合した部分を指す。例えば、アラニンについてのアミノ酸側鎖は、メチルであり、フェニルアラニンについてのアミノ酸側鎖は、フェニルメチルであり、システインについてのアミノ酸側鎖は、チオメチルであり、アスパルテートについてのアミノ酸側鎖は、カルボキシメチルであり、チロシンについてのアミノ酸側鎖は、４−ヒドロキシフェニルメチルであるなどである。他の天然に存在しないアミノ酸側鎖、例えば、自然界において生じるもの（例えば、アミノ酸代謝物）または合成的に作製されるもの（例えば、α，α二置換アミノ酸）もまた含まれる。

用語「α，α二置換アミノ」酸という用語は、２つの天然または非天然アミノ酸側鎖に結合した炭素（α−炭素）に結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子または部分を指す。

「ポリペプチド」という用語は、共有結合（例えば、アミド結合）によって結合した、２個以上の天然に存在するアミノ酸、または天然に存在しないアミノ酸を包含する。本明細書において記載されるポリペプチドとしては、完全長タンパク質（例えば、完全に処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）タンパク質）およびより短いアミノ酸配列（例えば、天然に存在するタンパク質の断片または合成ポリペプチド断片）が挙げられる。

本明細書において使用される場合、「大環状分子化試薬（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）」または「大環状分子形成試薬」という用語は、２つの反応基の間の反応を媒介することによって、本発明のペプチド模倣大環状分子を調製するために用いられ得る任意の試薬を指す。反応性の基は、例えば、末端のオレフィンである。そのような実施形態において、大環状分子化試薬または大環状分子形成試薬は、第ＶＩＩＩ族遷移金属カルベン触媒などの、安定した後遷移金属カルベン錯体触媒を含むが、これらに限定されないメタセシス（ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ）触媒である。例えば、そのような触媒は、＋２酸化状態を有し、１６の電子数を有し、かつ五配位のＲｕおよびＯｓ金属中心である。追加の触媒は、Ｇｒｕｂｂｓら、「Ｒｉｎｇ Ｃｌｏｓｉｎｇ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、４４６〜４５２頁、米国特許第５，８１１，５１５号、米国特許第６，１１１，１２１号および米国特許第６，９２１，７３５号に示される。さらに他の場合において、反応基は、チオール基である。そのような実施形態において、大環状分子化試薬は、例えば、ハロゲン基などの２つのチオール反応性基で官能化されたリンカーである。

「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素またはその基を指す。

「アルキル」という用語は、示された数の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖である炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ_１〜Ｃ_１０は、基が、その中に１〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。いかなる数の指示もない場合、「アルキル」とは、その中に１〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

「アルキレン」という用語は、二価アルキル（つまり−Ｒ−）を指す。

「アルケニル」という用語は、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖である炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は、示された数の炭素原子を含有する。例えば、Ｃ_２〜Ｃ_１０は、その基が、その中に２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。「低級アルケニル」という用語は、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル鎖を指す。いかなる数の指示もない場合、「アルケニル」とは、その中に２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

「アルキニル」という用語は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖である炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は、示された数の炭素原子を含有する。例えば、Ｃ_２〜Ｃ_１０は、その基が、その中に２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。「低級アルキニル」という用語は、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル鎖を指す。いかなる数の指示もない場合、「アルキニル」とは、その中に２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

「アリール」という用語は、６個の炭素の単環式または１０個の炭素の二環式芳香族環系を指し、ここで各々の環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基によって置換される。アリール基の例としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。「アリールアルキル」という用語または「アラルキル」という用語は、アリールで置換されたアルキルを指す。「アリールアルコキシ（ａｒｙｌａｌｋｏｘｙ）」という用語は、アリールで置換されたアルコキシを指す。

「アリールアルキル」とは、上記に規定されるアリール基であって、そのアリール基の水素原子のうちの１つが、上記に規定されるＣ_１〜Ｃ_５アルキル基で置き換えられているものを指す。アリールアルキル基の代表的な例としては、限定するものではないが、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２−プロピルフェニル、３−プロピルフェニル、４−プロピルフェニル、２−ブチルフェニル、３−ブチルフェニル、４−ブチルフェニル、２−ペンチルフェニル、３−ペンチルフェニル、４−ペンチルフェニル、２−イソプロピルフェニル、３−イソプロピルフェニル、４−イソプロピルフェニル、２−イソブチルフェニル、３−イソブチルフェニル、４−イソブチルフェニル、２−ｓｅｃ−ブチルフェニル、３−ｓｅｃ−ブチルフェニル、４−ｓｅｃ−ブチルフェニル、２−ｔ−ブチルフェニル、３−ｔ−ブチルフェニル、および４−ｔ−ブチルフェニルが挙げられる。

「アリールアミド」とは、上記に規定されるアリール基であって、そのアリール基の水素原子のうちの１つが、１つ以上の−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基で置き換えられているものを指す。アリールアミド基の代表的な例としては、２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−フェニル、３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−フェニル、４−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−フェニル、２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−ピリジル、３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−ピリジル、および４−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−ピリジルが挙げられる。

「アルキルヘテロ環」とは、上記に規定されるＣ_１〜Ｃ_５アルキル基であって、そのＣ_１〜Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つが、ヘテロ環で置き換えられているものを指す。アルキルヘテロ環基の代表的な例としては、限定するものではないが、−ＣＨ_２ＣＨ_２−モルホリン、−ＣＨ_２ＣＨ_２−ピペリジン、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−モルホリン、および−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−イミダゾールが挙げられる。

「アルキルアミド」とは、上記に規定されるＣ_１〜Ｃ_５アルキル基であって、そのＣ_１〜Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つが、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基で置き換えられているものを指す。アルキルアミド基の代表的な例としては、限定するものではないが、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）ＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３−ＣＨ３、および−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ_２が挙げられる。

「アルカノール」とは、上記に規定されるＣ_１〜Ｃ_５アルキル基であって、そのＣ_１〜Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つが、ヒドロキシル基で置き換えられているものを指す。アルカノール基の代表的な例としては、限定するものではないが、−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_３、および−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＯＨが挙げられる。

「アルキルカルボキシ」とは、上記に規定されるＣ_１〜Ｃ_５アルキル基であって、そのＣ_１〜Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つが、−−ＣＯＯＨ基で置き換えられているものを指す。アルキルカルボキシ基の代表的な例としては、限定するものではないが、−ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_３、および−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＯＯＨが挙げられる。

「シクロアルキル」という用語は、本明細書において用いる場合、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、およびより好ましくは３〜６個の炭素を有する飽和環式炭化水素基および部分的に不飽和の環式炭化水素基であって、ここでそのシクロアルキル基が、必要に応じてさらに置換されている環式炭化水素基を包含する。いくつかのシクロアルキル基としては、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。

「ヘテロアリール」という用語は、単環式である場合、１〜３個のヘテロ原子、二環式である場合、１〜６個のヘテロ原子、または三環式である場合、１〜９個のヘテロ原子を有する芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、または１１〜１４員の三環式環系を指し、このようなヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、または三環式である場合、それぞれ、１〜３、１〜６、または１〜９個のＯ、Ｎ、またはＳのヘテロ原子）、ここで各々の環の０、１、２、３、または４個の原子が、置換基によって置換されている。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリル、またはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニル、またはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが挙げられる。

「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。

「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。

「ヘテロシクリル」という用語は、単環式である場合、１〜３個のヘテロ原子、二環式である場合、１〜６個のヘテロ原子、または三環式である場合、１〜９個のヘテロ原子を有する非芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、または１１〜１４員の三環式環系を指し、このようなヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子と、単環式、二環式、または三環式である場合、それぞれ、１〜３、１〜６、または１〜９個のＯ、Ｎ、またはＳのヘテロ原子）、各々の環の０、１、２、または３個の原子は、置換基によって置換される。ヘテロシクリル基の例としては、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル（ｄｉｏｘａｎｙｌ）、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。

「置換基」という用語は、任意の分子、化合物、または部分の上の水素原子などの第２の原子または基を交換する基を指す。適切な置換基としては、限定するものではないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、およびシアノ基が挙げられる。

いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、１つ以上の不斉中心を含有し、従ってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー、ならびにジアステレオマー混合物として存在する。これらの化合物の全てのそのような異性体形態は、別段明確に規定されない限り、本発明に含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の化合物はまた、複数の互変異性形態で表され、そのような事例において、本発明は、本明細書において記載される化合物の全ての互変異性形態を含む（例えば、環系のアルキル化が、複数の部位でアルキル化をもたらす場合、本発明は、全てのそのような反応産物を含む）。そのような化合物の全てのそのような異性体形態は、別段明確に規定されない限り、本発明に含まれる。本明細書において記載される化合物の全ての結晶形態は、明確に規定されない限り、本発明に含まれる。

本明細書において用いる場合、「増加」および「減少」という用語は、統計的に有意に（すなわち、ｐ＜０．１）、それぞれ、少なくとも５％の増加または減少を引き起こすことを意味する。

本明細書において用いる場合、変数についての数値的な範囲の記述は、本発明が、その範囲内の値のうちのいずれかに等しい変数で実行されてもよいことを伝えるように意図される。従って、本質的に不連続の変数については、変数は、その範囲の終点を含む数値的な範囲内の任意の整数値と等しい。同様に、本質的に連続の変数については、変数は、その範囲の終点を含む数値的な範囲内の任意の実際の値と等しい。例として、限定するものではないが、０および２の間の値を有するとして記載される変数は、その変数が本質的に不連続の場合、値０、１、または２をとり、その変数が本質的に連続の場合、値０．０、０．１、０．０１、０．００１、または任意の他の実際の値≧０かつ≦２をとる。

本明細書において用いる場合、具体的に別のことを示されない限り、「または（あるいは、もしくは）」という単語は、「いずれか／または」の排他的な意味ではなく、「および／または」の包括的な意味で用いられる。

「平均して」という用語は、各データポイントについての、少なくとも３回の独立した反復の実行に由来する平均値を表す。

「生物学的活性」という用語は、本発明の大環状分子の構造的および機能的特性を包含する。生物学的活性は、例えば、構造的安定性、α−らせん度、標的に対する親和性、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性、細胞透過性、細胞内安定性、インビボ安定性、またはその任意の組合せである。

本発明の１つ以上の特定の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明において記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書本文および図面からならびに本特許請求の範囲から明白となる。

本発明のペプチド模倣大環状分子
いくつかの実施形態において、本発明のペプチド模倣大環状分子は、式（Ｉ）：

を有し、式中：
Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥはそれぞれ独立して、天然または非天然のアミノ酸であり；
Ｂは、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、

、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
Ｒ_１およびＲ_２は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ_３は、必要に応じてＲ_５で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり；
Ｌは、式−Ｌ_１−Ｌ_２−の大環状分子形成リンカーであり；
Ｌ_１およびＬ_２は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれ、必要に応じてＲ_５で置換され；
Ｒ_４はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり；
Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、またはＣＯＮＲ_３であり；
Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり；
Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり；
Ｒ_７は、必要に応じてＲ_５で置換される、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリール、またはＤ残基を有する環状構造の一部であり；
Ｒ_８は、必要に応じてＲ_５で置換される、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリール、またはＥ残基を有する環状構造の一部であり；
ｖおよびｗは独立して１〜１０００の整数であり；
ｕ、ｘ、ｙおよびｚは独立して０〜１０の整数であり；かつ
ｎは１〜５の整数である。

一例において、Ｒ_１およびＲ_２の少なくとも１つは、非置換であるかまたはハロ−で置換されるアルキルである。別の例において、Ｒ_１およびＲ_２の両方は、独立して、非置換であるかまたはハロ−で置換されるアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ_１およびＲ_２の少なくとも１つは、メチルである。他の実施形態において、Ｒ_１およびＲ_２は、メチルである。

本発明のいくつかの実施形態において、ｘ＋ｙ＋ｚは、少なくとも３である。本発明のいくつかの実施形態において、ｘ＋ｙ＋ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。本発明の大環状分子または大環状分子前駆体における、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの各出現（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）は、独立して選択される。例えば、式［Ａ］_ｘによって表される配列は、ｘが３である場合、アミノ酸が同一でない、例えばＧｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａである実施形態、および、アミノ酸が同一である、例えばＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎである実施形態を包含する。これは、示される範囲におけるｘ、ｙ、またはｚの任意の値に適用される。同様に、ｕが１より大きい場合、本発明の各々の化合物は、同じであるかまたは異なるペプチド模倣大環状分子を包含し得る。例えば、本発明の化合物は、異なるリンカー長または化学組成を含むペプチド模倣大環状分子を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、本発明のペプチド模倣大環状分子は、α−らせんである二次構造を含み、Ｒ_８は、−Ｈであり、らせん内水素結合を可能にする。いくつかの実施形態において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの少なくとも１つは、α，α−二置換アミノ酸である。一例において、Ｂは、α，α−二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの少なくとも１つは、２−アミノイソ酪酸である。他の実施形態において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの少なくとも１つは、

である。

他の実施形態において、第１のＣαから第２のＣαまで測定される大環状分子形成リンカーＬの長さは、第１のＣαから第２のＣαまでの間のものを含むが、必ずしもこれらに限定されない、上記ペプチド模倣大環状分子の残基によって形成されるα−らせんなどの所望の二次ペプチド構造を安定させるために選択される。

一実施形態において、式（Ｉ）のペプチド模倣大環状分子は：

である。

ここで、Ｒ_１およびＲ_２は各々独立して、独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルである。

関連する実施形態において、式（Ｉ）のペプチド模倣大環状分子は：

である。

他の実施形態において、式（Ｉ）のペプチド模倣大環状分子は、下記に示される任意の式の化合物：

であり、
式中、「ＡＡ」は、任意の天然または非天然アミノ酸側鎖を表し、かつ

は、上記で定義した［Ｄ］_ｖ、［Ｅ］_ｗであり、ｎは、０および２０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００の間の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、０である。他の実施形態において、ｎは、５０未満である。

大環状分子形成リンカーＬの例示的な実施形態は、下記に示される。

本発明のペプチド模倣大環状分子の例示的な実施形態は以下に示される：

式ＩＶ／ＩＶａ
他の実施形態において、本発明は、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）のペプチド模倣大環状分子

を提供し、
式中：
Ａ、Ｃ、ＤおよびＥはそれぞれ独立して、天然または非天然のアミノ酸であり；
Ｂは、天然もしくは非天然のアミノ酸、アミノ酸アナログ、

、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、または［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
Ｒ_１およびＲ_２は独立して、非置換であるかもしくはハロ−で置換される、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであるか、あるいはＥ残基を有する環状構造の一部であり；
Ｒ_３は、必要に応じてＲ_５で置換される、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり；
Ｌ_１およびＬ_２は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれ、必要に応じてＲ_５で置換され；
Ｒ_４はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり；
Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、またはＣＯＮＲ_３であり；
Ｒ_５はそれぞれ、独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり；
Ｒ_６はそれぞれ、独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位体、または治療剤であり；
Ｒ_７は、必要に応じてＲ_５で置換される、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、もしくはヘテロシクロアリールであり；
ｖおよびｗは独立して１〜１０００の整数であり；
ｕ、ｘ、ｙおよびｚは独立して０〜１０の整数であり；かつ
ｎは１〜５の整数である。

一例では、Ｒ_１およびＲ_２の少なくとも１つは、非置換であるかまたはハロ−で置換されるアルキルである。別の例において、Ｒ_１およびＲ_２の両方とも、独立して、非置換であるかまたはハロ−で置換されるアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ_１およびＲ_２の少なくとも１つは、メチルである。他の実施形態において、Ｒ_１およびＲ_２は、メチルである。

式ＩＶまたはＩＶａの化合物のいくつかの実施形態において、ｘ＋ｙ＋ｚは１である。本発明のいくつかの実施形態において、ｘ＋ｙ＋ｚは２である。本発明の他の実施形態において、ｘ＋ｙ＋ｚは、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。本発明の大環状分子または大環状分子前駆体における、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの各出現は、独立して選択される。例えば、式［Ａ］_ｘによって表される配列は、ｘが３である場合、アミノ酸が同一でない、例えばＧｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａである実施形態、および、アミノ酸が同一である、例えばＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎである実施形態を包含する。これは、示される範囲におけるｘ、ｙ、またはｚの任意の値に適用される。

いくつかの実施形態において、本発明のペプチド模倣大環状分子は、α−らせんである二次構造を含み、Ｒ_８は、−Ｈであり、これによってらせん内水素結合が可能になる。いくつかの実施形態において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの少なくとも１つは、α，α−二置換アミノ酸である。一例において、Ｂは、α，α−二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの少なくとも１つは、２−アミノイソ酪酸である。他の実施形態において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの少なくとも１つは、

である。

他の実施形態において、第１のＣαから第２のＣαまで測定される大環状分子形成リンカーＬの長さは、第１のＣαから第２のＣαまでの間のものを含むが、必ずしもこれらに限定されない、上記ペプチド模倣大環状分子の残基によって形成されるα−らせんなどの所望の二次ペプチド構造を安定させるために選択される。

大環状分子形成リンカーＬの例示的な実施形態は、下記に示される。

本発明のペプチド模倣大環状分子の設計
生物学的活性を付与すると考えられる二次構造を含む既知の一次アミノ酸配列を有する任意のタンパク質またはポリペプチドは、ペプチド模倣前駆体として有用である。例えば、ポリペプチドの配列は、分析されてもよく、そして大環状分子化試薬と反応性の基を含むアミノ酸アナログを適切な位置で置換してもよい。適切な位置は、二次構造のどの分子表面（単数または複数）が生物学的活性に必要であり、従ってそれのまたがる本発明の大環状分子形成リンカーの他のどの表面（単数または複数）が生物学的活性に必要な表面（単数または複数）を立体的にブロックすることなく大環状分子を形成し得るかを確認することによって決定される。このような決定は、活性に重要な残基（および表面）を可視化するための、二次構造と天然の結合パートナーとの間の複合体のＸ線結晶学的分析（または他の構造的方法）などの方法を用いて；活性に重要な残基（および表面）を機能的に特定するための、二次構造における残基の連続的な変異誘発によって；または他の方法によって行われる。このような決定によって、適切なアミノ酸を、本発明のアミノ酸アナログおよび大環状分子形成リンカーで置換する。例えば、α−らせん二次構造については、らせんの一表面（例えば、らせんの軸にそって長軸方向におよびらせんの軸に対して放射状に４５〜１３５°に伸びる分子表面）が、生物学的活性についてインビボまたはインビトロで別の生体分子と接触する必要があり得る。このような場合に、大環状分子形成リンカーは、活性に直接必要でないその表面の部分においてらせんの表面にそって長軸方向に伸びながら、そのらせんの２つのα−炭素を連結するように設計される。

いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、ＢＣＬ−２ファミリーのタンパク質由来である。ＢＣＬ−２ファミリーは、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、およびＢＨ４（その全てがα−らせんセグメントを含む）と命名される、最大４個までの保存されたＢＣＬ−２相同性（ＢＨ）ドメインの存在によって規定される（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎら、（１９９５），ＥＭＢＯ １４：５５８９；Ｗａｎｇら、（１９９６），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：２８５９）。抗アポトーシス性タンパク質、例えば、ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−Ｘ_Ｌは、全てのＢＨドメインで配列保存を示す。プロアポトーシス性タンパク質は、「マルチドメイン」ファミリーのメンバー（例えば、ＢＡＫ、ＢＡＸ）（ＢＨ１、ＢＨ２、およびＢＨ３ドメインにおける相同性を保有する）、および「ＢＨ３−ドメインのみ」のファミリーのメンバー（例えば、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ）（ＢＨ３両親媒性α−らせんセグメントにおいて排他的に配列相同性を含む）に分けられる。ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーは、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成する能力を有しており、このことは、プロアポトーシスタンパク質レベルと抗アポトーシスタンパク質レベルとの間の競合的結合および比が死刺激に対する感受性を決定づけることを示唆している。抗−アポトーシス性タンパク質は、過剰なプロアポトーシス、すなわち、過剰なプログラムされた細胞死から細胞を保護するように機能する。追加の「保障（ｓｅｃｕｒｉｔｙ）」の指標としては、プロアポトーシス性タンパク質の転写を調節すること、およびそれらを不活性なコンフォーマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）として維持すること、タンパク質分解活性化、脱リン酸化またはリガンド誘導性の高次構造変化（死促進機能を活性化するため）のいずれかを必要とすることが挙げられる。特定の細胞の種類では、原形質膜で受けた死シグナルは、ミコトンドリア経路を介してアポトーシスを誘発する。ミトコンドリアは、致死的な下流のタンパク質分解事象をもたらす、カスパーゼ９を活性化する細胞質性の複合体の重要な成分であるチトクロムｃを隔離することによって細胞死の門番役として機能し得る。マルチドメインタンパク質、例えば、ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−Ｘ_ＬおよびＢＡＫ／ＢＡＸは、ミトコンドリア膜で保護者（ｇｕａｒｄｉａｎ）および死刑執行人（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ）という対決的役割を果たし、ここでそれらの活性はＢＣＬ−２ファミリーの上流のＢＨ３−のみのメンバーによってさらに調節される。例えば、ＢＩＤは、プロアポトーシス性タンパク質のＢＨ３−ドメインのみのファミリーのメンバーであり、かつ原形質膜で受け取られる死シグナルを、ミトコンドリア膜でエフェクタープロアポトーシス性タンパク質に伝達する。ＢＩＤは、プロアポトーシス性タンパク質および抗アポトーシス性タンパク質の両方と相互作用する能力を有し、かつカスパーゼ８による活性化の際に、チトクロムｃ放出およびミトコンドリアのアポトーシスを誘発する。欠失および変異誘発研究によって、プロアポトーシス性ファミリーのメンバーの両親媒性α−らせんＢＨ３セグメントが、死ドメインとして機能し得、従ってマルチドメインアポトーシス性タンパク質との相互作用のための重要な構造的モチーフを示し得ることが確認された。構造的研究によって、ＢＨ３らせんは、ＢＨ１、２および３のドメインのインターフェースによって形成される疎水性の溝（ｇｒｏｏｖｅ）へ挿入することによって抗アポトーシス性タンパク質と相互作用し得ることが示されている。活性化されたＢＩＤは抗アポトーシス性タンパク質（例えば、ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−Ｘ_Ｌ）に結合しかつこれによって隔離され得、そしてプロアポトーシス性タンパク質ＢＡＸおよびＢＡＫの活性化を誘発し得、これによってチトクロムｃ放出およびミトコンドリアのアポトーシスプログラムがもたらされる。ＢＡＤはまた、ＢＨ３−ドメインのみのプロアポトーシス性ファミリーのメンバーであり、その発現がＢＡＸ／ＢＡＫの活性化を誘発する。しかし、ＢＩＤとは対照的に、ＢＡＤは抗−アポトーシス性ファミリーのメンバーである、ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−Ｘ_Ｌに対する優先的な結合を示す。ＢＡＤ ＢＨ３ドメインは、ＢＣＬ−２に対する高い親和性を示すが、ＢＡＤ ＢＨ３ペプチドは、インビトロでミトコンドリアからのチトクロムｃ放出を活性化できず、このことは、ＢＡＤがＢＡＸ／ＢＡＫの直接の活性化因子ではないということを示唆している。ＢＣＬ−２を過剰発現するミトコンドリアは、ＢＩＤ誘導性チトクロムｃ放出に抵抗性であるが、ＢＡＤとの同時処置（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）では、ＢＩＤ感受性が回復され得る。ＢＡＤによるミトコンドリアのアポトーシスの誘導は、以下のいずれかから生じると考えられる：（１）ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ結合ポケット由来の、ＢＩＤおよびＢＩＤ−様タンパク質などのＢＡＸ／ＢＡＫ活性化因子の置換、または（２）抗アポトーシス性タンパク質によるＢＩＤ−様タンパク質の隔離を妨げるＢＡＤによるＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ結合ポケットの選択的占有。従って、ＢＨ３−ドメインのみのタンパク質のうち２つのクラスでは、ミトコンドリアアポトーシスを直接活性化するＢＩＤ−様タンパク質、およびマルチドメイン抗アポトーシス性タンパク質の結合ポケットを占有することによるＢＩＤ−様プロアポトーシスに対してミトコンドリアを感受性にする能力を有するＢＡＤ−様タンパク質が出現した。本明細書に開示される方法論を受け入れやすいＢＣＬ−２ファミリーメンバータンパク質の種々のα−らせんドメインが開示されている（Ｗａｌｅｎｓｋｙら、（２００４），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６；およびＷａｌｅｎｓｋｙら．，米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号（その開示全体が参照によって本明細書に援用される））。

他の実施形態では、ペプチド配列は、発癌遺伝子タンパク質ＭＤＭ２に結合する腫瘍抑制因子ｐ５３タンパク質に由来する。ＭＤＭ２結合部位は、αらせんを形成するｐ５３腫瘍抑制因子の領域内に局在する。米国特許第７，０８３，９８３号（その内容全体が参照によって本明細書に援用される）では、Ｌａｎｅらは、ＭＤＭ２に対する結合を担うｐ５３の領域が、成熟ヒトＰ５３タンパク質のアミノ酸１３〜３１（ＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮＶ）によってほぼ示されることを開示している。Ｌａｎｅによって開示される他の修飾された配列も本発明で想定される。さらに、ｐ５３およびＭＤＭ２の相互作用は、その内容全体が参照によって本明細書に援用されるＳｈａｉｒら、（１９９７），Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．４：７９１で考察されており、かつｐ５３遺伝子における変異は、全ての報告された癌症例のうち実質的に半分で特定されている。細胞にストレスが課される場合、ｐ５３は、細胞周期停止およびＤＮＡ修復、またはプログラムされた細胞死のいずれかをもたらす応答を統合する（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ）と考えられる。ｐ５３タンパク質の機能を直接変更するｐ５３遺伝子における変異と同様、ｐ５３はＭＤＭ２における変化によって変更され得る。ＭＤＭ２タンパク質は、ｐ５３に結合し、かつｐ５３のトランス活性化ドメインと会合することによって転写活性化を破壊することが示されている。例えば、ｐ５３のトランス活性化ドメイン由来の１１アミノ酸のペプチドは、ＭＤＭ２の裂け目に挿入する２．５ターンの両親媒性α−らせんを形成する。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生成される新規なα−らせん構造を操作して、らせんアクセプターに対して緊密に結合し、かつ天然のタンパク質−タンパク質相互作用を破壊する構造を作製する。次いで、これらの構造を、ハイスループット技術を用いてスクリーニングして、最適の低分子ペプチドを特定する。ＭＤＭ２相互作用を破壊する新規な構造は、限定するものではないが軟部組織肉腫（野生型ｐ５３の存在でＭＤＭ２を過剰発現する）の制御を含む多くの適用に有用である。次いで、これらの癌は、いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２を妨害する低分子で抑制されて保持され、それによってｐ５３の抑制が妨げられる。さらに、いくつかの実施形態では、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の低分子攪乱物質をアジュバント療法に用いて、従来の化学療法においてｐ５３依存性アポトーシス応答の程度を制御および調節することを補助する。

本発明における使用のための適切なペプチド配列の非限定的な例を下の表１〜４に示す。

ペプチド模倣大環状分子および大環状分子前駆体の調製
概して、本発明のペプチド模倣大環状分子の調製における最初の工程は、メタセシスを受けることができる部分を有するアミノ酸を含むペプチド模倣前駆体の合成である。このペプチド模倣前駆体は、その合成後に精製されてもよいし、精製されなくてもよい。次の工程は、このペプチド模倣前駆体と、環を閉じる（ｒｉｎｇ−ｃｌｏｓｉｎｇ）メタセシス触媒などの大環状分子形成試薬とを接触させて２つのアミノ酸の間の少なくとも１つの架橋を含む粗ペプチド模倣大環状分子を生成する工程である。引き続き、この粗ペプチド模倣大環状分子を精製して、不純物および金属、例えば、触媒由来の金属残渣を除去する。

粗ペプチド模倣大環状分子または大環状分子前駆体を、任意の種々の公開された方法によって調製してもよい。所望のペプチド模倣前駆体を合成するための標準的な脱保護およびカップリング反応は公知である。それらは、例えば、液相法または固相法によって合成されてもよく、かつ天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方を含んでもよい（例えば、Ｈｕｎｔ，「Ｔｈｅ Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，編集Ｇ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９８５を参照のこと）。化学合成方法、例えば、Ｆｉｅｌｄｓら．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅの第３章，編集Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２，ｐ．７７に記載の方法を用いてもよい。従って、例えば、ペプチドは、例えば、自動化ペプチドシンセサイザーで側鎖が保護されたアミノ酸を用いてｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかによって保護されたアミンによる固相合成の自動化Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を用いて合成する（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ），Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ，４３１、または４３３）。

液相ペプチド合成カップリングプロトコールの１例としては、ペプチドカップリング剤としてのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の使用が挙げられる。（その内容全体が参照によって本明細書に援用される、Ｍ．Ｂｏｒｄａｎｓｋｙ，Ｐｅｔｐｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐｐ．５５〜１４６を参照のこと）。他のペプチド合成技術は、本明細書に引用する「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」に詳細に考察されている。

本明細書に記載されるペプチド模倣前駆体およびペプチド模倣大環状分子を作製する１方式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いる。Ｃ−末端アミノ酸を、リンカー分子と酸不安定性結合を介して、架橋されたポリスチレン樹脂に結合する。この樹脂は、合成に用いられる溶媒には不溶性であり、それによって、過剰な試薬および副産物を比較的簡便でかつ速く洗い流す。Ｎ−末端は、酸に安定であるが塩基で除去可能なＦｍｏｃ基で保護される。側鎖官能基は、必要に応じて、塩基安定性で、酸不安定性の基で保護される。

より長いペプチド模倣前駆体は、例えば、天然の化学連結反応（ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を用いて、個々の合成ペプチドを結合することによって作製される。あるいは、さらに長い合成ペプチドは、周知の組み換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術によって生合成される。このような技術は、詳細なプロトコールを含む周知の標準的なマニュアルに示される。ペプチド模倣前駆体をコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードする核酸配列（好ましくは遺伝子が発現される生物体にとって最適であるコドンを有する）を得る。次に、代表的には、ペプチドおよび必要に応じて任意の調節性エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって、合成遺伝子が作製される。この合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、このペプチドを、選択された発現系および宿主に適した適切な条件下で発現させる。このペプチドを標準的な方法によって精製し、かつ特徴付ける。

このペプチド模倣前駆体はまた、例えば、ハイスループット多チャンネルコンビナトリアルシンセサイザー（例えば、ＣｒｅｏＳａｌｕｓ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹのＴｈｕｒａｍｅｄ ＴＥＴＲＡＳマルチチャンネルペプチドシンセサイザー、またはＡＡＰＰＴＥＣ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹのＭｏｄｅｌ Ａｐｅｘ ３９６マルチチャンネルペプチドシンセサイザー）を用いて、ハイスループットのコンビナトリアル方式で、例えば、作製され得る。

いくつかの実施形態では、アミノ酸の−ＮＨ部分は、限定するものではないが−Ｆｍｏｃおよび−Ｂｏｃを含む保護基を用いて保護される。他の実施形態では、アミノ酸は、ペプチド模倣大環状分子の合成の前に保護されていない。

特定の合成技術の選択は、合成される特定の構造に依存する。代替的だが等価な保護基、脱離基または試薬を置換し、かつ特定の合成工程を別の順番または順序（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｒ ｏｒｄｅｒｓ）で行って、所望の化合物を作製する。本明細書に記載される化合物を合成するのに有用な合成化学の形質転換および保護基の方法論（保護および脱保護）としては、例えば、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；ＦｉｅｓｅｒおよびＦｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；ならびにＰａｑｕｅｔｔｅ，編集，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、およびそれらのその後の版が挙げられる。

ペプチド模倣前駆体およびペプチド模倣大環状分子のバリエーションが想定され得る。いくつかの実施形態では、配列残基におけるバリエーションが可能である。例えば、ペプチド模倣大環状分子および大環状分子前駆体の調製は、同じ分子の第二の残基またはこのような残基の前駆体との架橋を形成し得る残基を有する表１、２、３または４の「Ｘ」で示される任意の残基の置換を含んでもよい。

ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣前駆体は、天然および非天然の両方のアミノ酸を含んでもよい。天然のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。他の一般にはあまりみられない天然のアミノ酸、例えば、セレノシステインおよびピロリジンも用いられてもよい。７００を超える公知の非天然のアミノ酸が存在し、その任意のアミノ酸が本発明における使用のためのペプチド前駆体に含まれてもよい。これらとしては、また、天然および非天然のアミノ酸のアナログが挙げられる（例えば、Ｓ．Ｈｕｎｔ，Ｔｈｅ Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ：Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，編集Ｇ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９８５を参照のこと）。非天然のアミノ酸のいくつかの例は、Ｌ−プロパルギルグリシン、β−アラニン、Ｄ−アラニン、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、Ｄ−グルタミン酸、γ−アミノ酪酸、β−シアノアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、α−アミノ酪酸、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、およびスタチンである。ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣前駆体はまた、ε−（３，５−ジニトロベンゾイル）−リジンなどのπスタッキングが可能なアミノ酸を含んでもよい。

使用に適切なペプチド模倣前駆体はまた、ヒドロキシル化されるか、リン酸化されるか、スルホン酸化されるか、グリコシル化されるか、ジスルフィド結合されるか、そうでなければ誘導体化されるアミノ酸を含むように誘導体化されてもよい。このアミノ酸はまた、官能基を含んでもよい。官能基の非限定的な例としては、アルキル、アルコール、チオール、ケトン、アルデヒド、エステル、エーテル、アミン、イミン、アミド、ニトロ酸（ｎｉｔｒｏ ａｃｉｄ）、カルボン酸、ジスルフィド、カーボネート、カルボアルコキシ酸（ｃａｒｂｏａｌｋｏｘｙ ａｃｉｄ）、イソシアネート、カルボジイミド、カルボアルコキシおよびハロゲン官能基が挙げられる。

他の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸（例えば、α−メチルまたはα−ビニルアミノ酸）を、架橋剤形成のための前駆体として利用する。α−メチル，α−アルキルオレフィンアミノ酸の合成およびいくつかの例は、米国特許第７，１９２，７１３号に考察される。例えば、ヨウ化メチルおよびテトラメチルジシリルアジドナトリウムを用いて、市販のラクトンを処理して、メチル化ラクトンを生成してもよい。テトラメチルジシリルアジドカリウムを存在させてのヨウ化ホモアリルでの引き続く処理によって、ホモアリルオキサジノンを得る。ナトリウム金属還元、酸加水分解およびＦｍｏｃ−ＮＨＳでの保護によって、ペプチド模倣物の合成における使用のための保護されたα−メチル、α−アルキルオレフィンを生成してもよい。

いくつかの実施形態では、種々のホモアリル試薬を利用して、異なる長さのオレフィン鎖を有するアミノ酸を生成してもよく、これはさらに、限定するものではないが、２〜３例を挙げれば、分枝したまたは直鎖のアルキル部分、ヒドロキシル部分、チオール部分、アミン類、カルボキシル部分および置換または非置換のアリール部分を含む部分で官能化されてもよい。

いくつかの実施形態では、アミノ酸およびアミノ酸アナログは、Ｄ−立体配置（Ｄ−ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のものである。他の実施形態では、それらはＬ−立体配置のものである。別の実施形態では、Ｄ立体配置およびＬ立体配置の組み合わせを有する天然および非天然のアミノ酸を用いてもよい。

ペプチド模倣大環状分子および前駆体は、１つ以上の部分、例えば、蛍光性部分、アフィニティー標識、標的化部分、または放射性同位体を含んでもよい。例えば、大環状分子または前駆体のアミノ末端は、さらに、標識、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはビオチン結合体化されたリジンと誘導体化して、それぞれ、細胞透過性研究および生化学的アッセイのための標識されたペプチド模倣大環状分子を生成してもよい。他の有用なバリエーションとしては、限定するものではないが、精製および濃度決定目的のためのＵＶ標識として機能する、大環状分子または前駆体のＣ末端に対して付加されたトリプトファンなどの蛍光アミノ酸、あるいは細胞透過を潜在的に容易にするための大環状分子または前駆体の全体的ｐＩを増大するためのＮ末端グルタミン酸の除去が挙げられる。ペプチド模倣大環状分子および前駆体に有用な他の部分は、治療剤を含む。治療剤の非限定的な例としては、低分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。

細胞取り込みを容易にするため、いくつかの実施形態では、本発明の化合物におけるＤおよび／またはＥはさらに修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチド模倣大環状分子を脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｉｎｇ）またはＰＥＧ化することで、細胞取り込みを容易にし、バイオアベイラビリティを増大させ、血液循環を増大させ、薬物動態を変更し、免疫原性を減少させ、および／または投与に必要な頻度を低下させる。他の実施形態では、本発明の化合物中の［Ｄ］および［Ｅ］のうち少なくとも１つは、ペプチド模倣大環状分子が少なくとも２つの大環状分子形成リンカーを含むような追加の大環状分子−形成リンカーを含む部分に相当する。特定の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２つの大環状分子−形成リンカーを含む。

ペプチド模倣大環状分子および前駆体のために、本明細書に記載される任意の大環状分子−形成リンカーは、表１〜４に示される任意の配列との、およびまた本明細書に示される任意のＲ−置換基との任意の組み合わせで用いてもよい。

いくつかの実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、少なくとも１つのα−らせんモチーフを含む。例えば、本発明の化合物におけるＡ、Ｂおよび／またはＣは、１つ以上のα−らせんを含む。一般的な事柄として、α−らせんは１ターンあたり３〜４個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド模倣大環状分子のα−らせんは、１〜５個のターン、そして従って、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、そのα−らせんは、１ターン、２ターン、３ターン、４ターン、または５ターンを含む。いくつかの実施形態では、大環状分子−形成リンカーは、このペプチド模倣大環状分子内に含まれるα−らせんモチーフを安定化する。従って、いくつかの実施形態では、この大環状分子−形成リンカーＬの第一のＣαから第二のＣαまでの長さは、α−らせんの安定性を増大するように選択される。いくつかの実施形態では、この大環状分子−形成リンカーは、α−らせんの１ターン〜５ターンにまたがる。いくつかの実施形態では、この大環状分子−形成リンカーは、α−らせんのおよそ１ターン、２ターン、３ターン、４ターン、または５ターンにおよぶ。いくつかの実施形態では、この大環状分子−形成リンカーの長さは、α−らせんの１ターンあたりおよそ５Å〜９Å、またはα−らせんの１ターンあたりおよそ６Å〜８Åである。ここでこの大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ１ターンにまたがる場合、この長さはおよそ５個の炭素−炭素結合〜１３個の炭素−炭素結合、およそ７個の炭素−炭素結合〜１１個の炭素−炭素結合、またはおよそ９個の炭素−炭素結合に等しい。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ２ターンにまたがる場合、この長さはおよそ８個の炭素−炭素結合〜１６個の炭素−炭素結合、およそ１０個の炭素−炭素結合〜１４個の炭素−炭素結合、またはおよそ１２個の炭素−炭素結合に等しい。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ３ターンにまたがる場合、この長さはおよそ１４個の炭素−炭素結合〜２２個の炭素−炭素結合、およそ１６個の炭素−炭素結合〜２０個の炭素−炭素結合、またはおよそ１８個の炭素−炭素結合に等しい。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ４ターンにまたがる場合、この長さはおよそ２０個の炭素−炭素結合〜２８個の炭素−炭素結合、およそ２２個の炭素−炭素結合〜２６個の炭素−炭素結合、またはおよそ２４個の炭素−炭素結合に等しい。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ５ターンにまたがる場合、この長さはおよそ２６個の炭素−炭素結合〜３４個の炭素−炭素結合、およそ２８個の炭素−炭素結合〜３２個の炭素−炭素結合、またはおよそ３０個の炭素−炭素結合に等しい。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ１ターンにまたがる場合、この連結は、およそ４原子〜１２原子、およそ６原子〜１０原子、またはおよそ８原子を含む。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ２ターンにまたがる場合、この連結は、およそ７原子〜１５原子、およそ９原子〜１３原子、またはおよそ１１原子を含む。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ３ターンにまたがる場合、この連結は、およそ１３原子〜２１原子、およそ１５原子〜１９原子、またはおよそ１７原子を含む。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ４ターンにまたがる場合、この連結は、およそ１９原子〜２７原子、およそ２１原子〜２５原子、またはおよそ２３原子を含む。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ５ターンにまたがる場合、この連結は、およそ２５原子〜３３原子、およそ２７原子〜３１原子、またはおよそ２９原子を含む。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ１ターンにまたがる場合、この得られた大環状分子は、およそ１７員〜２５員、およそ１９員〜２３員、またはおよそ２１員を含む環を形成する。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ２ターンにまたがる場合、この得られた大環状分子は、およそ２９員〜３７員、およそ３１員〜３５員、またはおよそ３３員を含む環を形成する。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ３ターンにまたがる場合、この得られた大環状分子は、およそ４４員〜５２員、およそ４６員〜５０員、またはおよそ４８員を含む環を形成する。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ４ターンにまたがる場合、この得られた大環状分子は、およそ５９員〜６７員、およそ６１員〜６５員、またはおよそ６３員を含む環を形成する。この大環状分子−形成リンカーがα−らせんのおよそ５ターンにまたがる場合、この得られた大環状分子は、およそ７４員〜８２員、およそ７６員〜８０員、またはおよそ７８員を含む環を形成する。

例えば、式Ｉのペプチド模倣大環状分子の調製は、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１〜５８９２（２０００）；Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ ＆ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５８９１（２００５）；Ｗａｌｅｎｓｋｙら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６〜１４７０（２００４）；米国特許第７，１９２，７１３号；およびＰＣＴ出願ＷＯ２００８／１２１７６７に記載される。引用される参考文献に開示されるα，α−二置換アミノ酸およびアミノ酸前駆体は、ペプチド模倣大環状分子前駆体ポリペプチドの合成に使用され得る。このようなアミノ酸の前駆体ポリペプチドへの組み込み後、末端オレフィンをメタセシス触媒と反応させて、ペプチド模倣大環状分子の形成をもたらす。

他の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、式ＩＶまたは式ＩＶａのものである。このような大環状分子の調製のための方法は、例えば、その全体が本明細書に援用される米国特許第７，２０２，３３２号に記載される。

本発明のペプチド模倣大環状分子では、Ｒ_１およびＲ_２のうちの少なくとも１つは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであって、非置換であるか、またはハロ−で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２の両方は、独立してアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであって、非置換であるか、またはハロ−で置換されている。いくつかの実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つはα，α−二置換アミノ酸である。一例では、Ｂはα，α−二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうち少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。

例えば、Ｒ_１およびＲ_２のうち少なくとも１つはアルキルであって、非置換であるか、またはハロ−で置換されている。別の実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２の両方が独立してアルキルであって、非置換であるか、またはハロ−で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２のうち少なくとも１つはメチルである。他の実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２はメチルである。大環状分子化試薬は、Ｃｕ試薬であっても、またはＲｕ試薬であってもよい。

いくつかの実施形態では、ペプチド模倣前駆体は、接触工程の前に精製される。他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、接触工程の後に精製される。さらに他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は接触工程の後に再折り畳みされる。この方法は、溶液中で行われてもよく、あるいは、この方法は固体支持体上で行われてもよい。

また本明細書で想定されるのは、このような結合に好ましい条件下で、ペプチド模倣前駆体またはペプチド模倣大環状分子に対して結合する標的高分子を存在させて本発明の方法を行うことである。いくつかの実施形態では、この方法は、このような結合に好ましい条件下で、ペプチド模倣前駆体またはペプチド模倣大環状分子に対して優先的に結合する標的高分子を存在させて行われる。この方法はまた、ペプチド模倣大環状分子のライブラリーを合成するために適用され得る。

いくつかの実施形態では、接触工程は、プロトン性溶媒、水性溶媒、有機溶媒、およびそれらの混合物からなる群より選択される溶媒中で行う。例えば、この溶媒は、Ｈ_２Ｏ、ＴＨＦ、ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ、ｔＢｕＯＨ／Ｈ_２Ｏ、ＤＭＦ、ＤＩＰＥＡ、ＣＨ_３ＣＮもしくはＣＨ_２Ｃｌ_２、ＣｌＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌまたはそれらの混合物からなる群より選択されてもよい。この溶媒は、らせん形成に好ましい溶媒であり得る。

環を閉じるメタセシス触媒
架橋されるアミノ酸部分として２つのオレフィンを含む実施形態のために、環を閉じるオレフィンメタセシスを用いて、環化反応を行ってもよい。一実施形態では、オレフィンメタセシス反応は、環を閉じるオレフィンメタセシス反応を包含する。環を閉じるオレフィンメタセシスは、オレフィンメタセシス反応を利用して大環状分子を形成する。この反応では、鎖内の２つの二重結合が接続される。

ペプチド模倣大環状分子を生成するのに有用である適切な触媒としては、ペプチド模倣前駆体の環を閉じるメタセシスを触媒し得る任意の触媒が挙げられる。適切な触媒の非限定的な例としては、米国特許第５，３１２，９４０号；同第５，３４２，９０９号；同第５，８１１，５１５号；同第６，１１１，１２１号；同第６，９２１，７３５号；欧州特許第１１８０１０８号Ｂ１（その各々が参照によって本明細書に援用される）に考察されるルテニウムおよびオスミウムカルベン錯体が挙げられる。適切な触媒としては、安定化された、後期遷移金属カルベン錯体触媒、例えば、第ＶＩＩＩ族遷移金属カルベン触媒（ＲｕおよびＯｓ金属カルベン触媒を含む）が挙げられる。ＲｕおよびＯｓ金属カルベン触媒については、ＲｕおよびＯｓ金属の中心は、＋２酸化状態にあり、１６という電子数を有し、かつ五配位である。他の適切な環を閉じるメタセシス触媒が利用されてもよい。メタセシス反応の考察は、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｇｒｕｂｂｓら，「Ｒｉｎｇ Ｃｌｏｓｉｎｇ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８，４４６〜４５２；Ｈｏｖｅｙｄａら，「Ｒｕ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ Ｃａｒｂｅｎｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｉｎｎｏｃｅｎｔ Ｃｕｒｉｏｓｉｔｙ ｔｏ Ｕｎｉｑｕｅｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｅｆｉｎ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ」，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｃｈｅｍ．２：８〜２３（２００４）；Ｔｒｎｋａら，「Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｌ２Ｘ２Ｔｕ＝ＣＨＲ Ｏｌｅｆｉｎ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ：Ａｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｓｕｃｃｅｓｓ Ｓｔｏｒｙ」，Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：１８〜２９（２００１）に見ることができる。

金属中心は、アニオン性リガンドおよび中性または電子供与リガンドを含むリガンド環境を有し得る。このアニオン性リガンドは、その閉殻（ｃｌｏｓｅｄ ｓｈｅｌｌ）中の金属中心から取り除かれた場合、電子配置が負の電荷を有する任意のリガンドであってもよい。リガンドの非限定的な例としては、ハロゲン含有基；アルキル；アリール；アルケニル；アルキルアリール；アリールアルキル；ヒドロカルボキシ；アミド類、リン化物類；硫化物類；シリルアルキル類；ジケトン類；水素化ホウ素類（ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅｓ）；およびカルボン酸塩類；ホスフィン、スルホン酸化ホスフィン、亜リン酸塩、ホスフィナイト、ホスホナイト、アルシン、スチビン、エーテル、アミン、アミド、イミン、スルホキシド、カルボキシル、ニトロシル、ピリジン、およびチオエーテルが挙げられる。金属カルベン触媒の溶解度は、疎水性のリガンドまたは親水性のリガンドのいずれかの選択で制御され得る。触媒は、種々の官能基および種々の溶媒の存在下で安定性を示し得、従って、水性溶媒、プロトン性溶媒、もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中で行われる触媒性反応で多くは有用であり得る。

Ｒｕカルベン触媒の例としては限定するものではないが、Ｃｐ^＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ_３）_２または［Ｃｐ^＊ＲｕＣｌ］_４（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、（２００７），Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．９：５３３７〜５３３９；Ｚｈａｎｇら、（２００５），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１５９９８〜１５９９９）が挙げられる。他の例としては、以下の一般式：

の触媒であって
式中：ＭがＯｓおよびＲｕからなる群より選択され；ＲおよびＲ^１が独立して水素および官能基からなる群より選択され；ＸおよびＸ^１は、アニオン性リガンドであり；かつＬおよびＬ^１は中性の電子供与体である触媒が挙げられる。さらに詳細には、ＬおよびＬ^１は、式ＰＲ^３Ｒ^４Ｒ^５のホスフィンであってもよく、ここでＲ^３は二級アルキルおよびシクロアルキルからなる群より選択され、かつＲ^４およびＲ^５は独立して、アリール、Ｃ_１−Ｃ_１０一級アルキル、二級アルキルおよびシクロアルキルから選択される。Ｎ−複素環リガンド、例えば、イミダゾリンおよびトリアゾリンリガンド（例えば、Ｇｒｕｂｂｓ’触媒，第二世代）もまた適切である。他の例としては、Ｓｔｒｅｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＺａｎｎａｎ Ｐｈａｒｍａ，Ｌｔｄ．が販売するメタセシス触媒が挙げられる。

一般式の特定の実施形態では、限定するものではないが、以下の触媒が挙げられる：

追加の触媒は、その全体が参照によって援用されている、米国特許第６，４０７，１９０号；欧州特許第９９３４６５号、米国特許第６，６３５，７６８号、ＣＮ１９０７９９２Ａ、米国特許出願第２００７／００４３１８０号Ａ１に記載されている。

濾過によって除去することを可能にする、ポリマー支持体または無機支持体に結合されたメタセシス触媒が考察されている（例えば、Ｋ．Ｃ Ｈｕｌｔｚｓｃｈ，Ｊ．Ａ Ｊｅｒｎｅｌｉｕｓ，Ａ．Ｈ ＨｏｖｅｙｄａおよびＲ．Ｒ Ｓｃｈｒｏｃｋ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１（２００２），ｐ．５８９；Ｍ Ａｈｍｅｄ，Ａ．Ｇ．Ｍ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｃ Ｂｒａｄｄｏｃｋ，Ｓ．Ｍ ＣｒａｍｐおよびＲ．Ａ Ｐｒｏｃｏｐｉｏｕ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４０（１９９９），ｐｐ．８６５７〜８６６２；Ｄ．Ｐ．Ａｌｌｅｎら．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１１、１２６１〜１２６４（２００９）；またはＭ．Ｒ．Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９，３０３〜３２１（２００９）およびその中の引用文献を参照）。この種類の触媒の非限定的な例は以下である：

適切な触媒は、米国特許第５，３１２，９４０号；同第６，９２１，７３５号；Ｐ．Ｓｃｈｗａｂら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，１００（１９９６）；Ｄ．Ｐ．Ａｌｌｅｎら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１１、１２６１〜１２６４（２００９）；またはＭ．Ｒ．Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９，３０３〜３２１（２００９）およびその中の引用文献（参照によって本明細書に援用される）に記載の方法などの種々の異なる方法によって調製され得る。

メタセシス反応は、例えば、約２５℃〜１１０℃の温度で、または約５０℃の温度で行われてもよい。メタセシス反応は、有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、トルエン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、テトラヒドロフランで行ってもよい。

本明細書に開示される反応は、例えば、固体支持体上で行われてもよい。適切な固体支持体としては、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管（ｔｕｂｉｎｇ）、スフェア（ｓｐｈｅｒｅｓ）、容器、毛細管（キャピラリー）、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、ディスク、膜などが挙げられる。これらの固体支持体は、ポリマー、プラスチック、セラミックス、ポリサッカライド、シリカ、またはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、またはそれらの複合材（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）を含めて広範な種々の材料から作製され得る。この基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は好ましくは、平坦であるが、種々の別の表面構造をとってもよい。例えば、この基板は、高くなった領域または低くなった領域を備えてもよく、その上で合成が行われる。この基板およびその表面は好ましくは、剛直な支持体を形成し、その上で本明細書に記載される反応が行われる。他の基板材料も用いられてもよい。

ペプチド模倣大環状分子の精製
一般には、本発明のペプチド模倣大環状分子を、精製工程の組み合わせを用いて精製する。本発明のいくつかの実施形態では、ペプチド模倣大環状分子前駆体を固相支持体上で合成する。環化後、固相支持体を単離して、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物などの溶媒の溶液中に懸濁してもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含んでもよい。特定の実施形態では、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液を用いる。この溶液を１、６、１２または２４時間の期間インキュベートして、その後に樹脂を、例えば、ジクロロメタンまたはＮＭＰを用いて洗浄してもよい。一実施形態では、この樹脂をＮＭＰで洗浄する。振盪しながらその溶液中への不活性ガスのバブリングを行ってもよい。

いくつかの実施形態では、このインキュベーション工程の後に、溶媒の存在下でのスカベンジャーによる処理が続く。触媒が固相（例えば、樹脂、ビーズ）に結合されるならば、濾過を用いて、反応混合物からの固相分離によって触媒を回収してもよい。

例示的なスカベンジャーとしては、プロピルアミン、ジアミノエタン、Ｎ１−（２−アミノエチル）エタン−１、２−ジアミン、トリチオシアヌル酸、エタンジチオール、チオフェノール、ジエチルチオ尿素、トリフェニルホスフィンオキシド、または２−メルカプトニコチン酸が挙げられる。インキュベーションは、室温でまたはより高い温度、例えば、３５、５０、または６５℃で行ってもよい。スカベンジャー処理工程は、例えば、１回、２回または３回繰り返してもよい。いくつかの実施形態では、このスカベンジャー処理を分けるか、または同じもしくは異なる溶媒を用いる追加の洗浄工程を続ける。

他のスカベンジャーは、商業的な源（例えば、Ｒｅａｘａ、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能である。金属スカベンジャーの非限定的な例は、Ｄｅｇｕｓｓａ ＡＧ由来のＤｅｌｏｘａｎ金属スカベンジャー、例えば、Ｄｅｌｏｘａｎ ＴＨＰ ＩＩおよびＤｅｌｏｘａｎ ＭＰである。これらは、マクロ多孔性有機官能（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｏｒｇａｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ポリシロキサン類であり、かつ活性な薬学的成分および化学プロセスからＰｄ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ａｇ、Ａｕ、Ｚｎ、Ｃｕおよび他の遷移金属を除去し得る。Ｄｅｌｏｘａｎ ＴＨＰ ＩＩは官能基としてチオ尿素を担持するが、Ｄｅｌｏｘａｎ ＭＰはチオール官能性を担持する。これらのスカベンジャーは、バッチモードで用いられてもよいし、または管状栓流方式（ｔｕｂｕｌａｒ ｐｌｕｇ−ｆｌｏｗ ｍｏｄｅ）で用いられてもよい。バッチリアクターでは、Ｄｅｌｏｘａｎ金属スカベンジャーを、反応混合物に添加し、攪拌し、濾過して取り除く。管状の栓流リアクター方式の操作では、Ｄｅｌｏｘａｎ金属スカベンジャーを、固定ベッドのカラムに入れて、濾過工程を排除する。

種々の官能性を使用する金属特異的スカベンジャーは、ペプチド模倣大環状分子を精製するために適切である。官能性を有するスカベンジャーの非限定的な例としては、チオ尿素官能性を有する多孔性ビーズである、ＲｅａｘａのＱｕａｄｒａＰｕｒｅスカベンジング樹脂、例えば、ＱｕａｄｒａＰｕｒｅ ＴＵが挙げられる。用いられ得るＲｅａｘａの他の非限定的なスカベンジング生成物としては、ＱｕａｄｒａＰｕｒｅ ＩＤＡ（イミノジアセテート官能性を有するビーズ）、ＡＭＰＡ（アミノメチルホスホン酸官能性を有するビーズ）、ＢＺＡ（ベンジルアミン官能性を有するビーズ）、ＢＤＺ（イミダゾール官能性を有するビーズ）、ＥＤＡ（アミン官能性を有するビーズ）、ＤＥＴ（チオール官能性を有するビーズ）、ＩＭＤＡＺ（イミダゾリルプロピルアミノ官能性を有するビーズ）、ＭＰＡ（メルカプトフェニルアミノ官能性を有するビーズ）、ＡＥＡ（アミノエチルアミノ官能性を有するビーズ）、ＡＫ（活性化ケトン官能性、例えば、２，４−ブタンジオンを有するビーズ）が挙げられる。

追加の金属スカベンジャーとしては、所定の多孔性を有する球状のシリカビーズに基づき、かつ水溶液または有機溶液中で、そしてバッチ過程または流れ過程（ｆｌｏｗ ｐｒｏｃｅｓｓ）で用いられ得る、商品名ＱｕａｄｒａＳｉｌとして製造されるＲｅａｘａ化合物が挙げられる。特定の例としては、ＱｕａｄｒａＳｉｌ ＡＰ（アミノプロピル官能性を有するビーズ）、ＭＰ（メルカプトプロピル官能性を有するビーズ）、ＭＴＵ（メチルチオ尿素官能性を有するビーズ）、ＴＡ（トリアミン官能性を有するビーズ）が挙げられる。

Ｅｎｇｅｌｈａｒｄが供給するような他の金属−スカベンジング剤も用いられ得る。これらの剤は、シリカ、アルミナおよび活性炭を含めて無機基材（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から調製される自由流動粉末（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ ｐｏｗｄｅｒｓ）であり、かつ種々の金属をスカベンジできる。それらは、水性溶媒および有機溶媒を用いて固定ベッドまたはスラリー適用のために設計される。スカベンジャーの別の例は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＭａｔｔｈｅｙのＳｍｏｐｅｘ（登録商標）であって、線維性の金属スカベンジングシステムである。Ｓｍｏｐｅｘ−１１１は、パラジウム、白金、ロジウムおよび銅を除去し得るスチリル・チオール−グラフトのポリオレフィンファイバーである。同様に、Ｓｍｏｐｅｘ−１０５は、陰イオン性白金族の金属および錯体をピックアップし得るビニルピリジン−グラフトのポリオレフィンファイバーであり、かつＳｍｏｐｅｘ−１０２は、ニッケル、鉄またはクロムというカチオンのスカベンジングのためのアクリル酸−グラフトのファイバーである。０．３−ｍｍ−長のＳｍｏｐｅｘファイバーは機械的にかつ化学的に極めて安定である。ポリマー結合したキレートホスフィン、例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ：４５（２００４），３１４１−３１４２（参照によって本明細書に援用される）に考察されるものもまた、スカベンジャーとして適切である。追加のスカベンジャー試薬としては、ＳｉｌｉａＢｏｎｄ ＤＭＴ（ジメルカプトトリアジン）、およびトリス（ヒドロキシメチル）ホスフィンが挙げられる。

この第一の洗浄工程後、粗ペプチド模倣大環状分子を、固体支持体からペプチド模倣大環状分子を分離することによって調製する。次いでこの粗ペプチド模倣大環状分子調製物を、さらに精製に供する。大環状分子、およびメタセシス反応から生じる副産物を、クロマトグラフィー（例えば、クロマトグラフィー、例えば、逆相ＨＰＬＣ）または濾過を含む任意の適切な技術を用いて回収または分離してもよい。いくつかの実施形態では、このペプチド模倣大環状分子を、１、２、または３回の逆相ＨＰＬＣ工程に供する。例えば、２回の逆相ＨＰＬＣ工程を用いる。一実施形態では、少なくとも１回のこのＨＰＬＣ工程を、Ｈ_２Ｏおよび／またはアセトニトリル中の希ＴＦＡ（例えば、０．０５〜０．５％）などの酸性溶媒を用いて行う。あるいは、テトラエチルアンモニウムホスフェート（ＴＥＡＰ）を酸性のｐＨで、バッファー系として用いてもよい。一実施形態では、この酸性の溶媒は、希ＴＦＡを含む。別の実施形態では、この溶媒はＴＥＡＰを含む。本発明の方法の一実施形態では、２回の逆相ＨＰＬＣ工程を用い、ここでは第一工程では、希ＴＦＡを溶媒として用い、第二の工程では、Ｈ_２Ｏおよび／またはアセトニトリル（ＴＦＡなし）を溶媒として用いる。本発明の方法の別の実施形態では、２回の逆相ＨＰＬＣ工程を用い、ここでは両方の工程とも希ＴＦＡを溶媒として用いる。さらに別の実施形態では、２回の逆相ＨＰＬＣ工程を用い、ここでは１つの工程は希ＴＦＡを溶媒として用いるが、別の工程ではＴＥＡＰを溶媒として用いる。さらに別の実施形態では、少なくとも１回の逆相ＨＰＬＣ精製工程を、Ｈ_２Ｏおよび／またはアセトニトリル中の希ギ酸を溶媒として用いて行う。別の局面では、本発明は高純度（例えば、３０、２０、１０、５もしくは１ｐｐｍ未満のＲｕまたはＯｓ含量）のペプチド模倣大環状分子を得るための結晶化工程を行うことを必要としない粗ペプチド模倣大環状分子を精製する方法を提供する。

別の局面では、本発明は、不純物のレベルを測定および評価する方法を提供する。不純物の分析に用いられ得る装置の非限定的な例としては、分析技術、例えば、核誘導結合プラズマ分析（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＣＰ）、核誘導結合プラズマ質量分析（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＣＰ−ｍｓ）、磁気共鳴分光法、赤外線分光法、質量分析法、ガスクロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィーが挙げられる。

不純物を評価するために、分析的装置の特異性をいくつかの方法で評価する。一実施形態では、本発明の組成物に関連する不純物のレベルを、食品医薬品局が公開した規制のガイドラインに関与する方法によって評価する。例えば、不純物の評価に用いられる装置の陽性試験については、公知の不純物の第一の分析物を、不純物の量が未知であるその第一の分析物と類似の構造である第二の分析物と比較して用いる。装置の同様の試験をまた、その装置の分析能力を計測するために、不純物の検出を潜在的に妨げる第三の剤の存在下で行う。滴定を用いて、活性成分に対する不純物の割合に関する薬物放出についての薬物動態学的パラメーターを得るためにアッセイしてもよい。組成物の放出および活性に関して、賦形剤の影響（ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｐｉｅｎｔ）について不純物の試験を行って、ペプチド模倣大環状分子組成物に対する不純物の影響を評価する。他の分析試験としては、不純物のレベルに比例してのこのペプチド模倣大環状分子組成物におよぼす熱、光、熱、湿度、酸／塩基加水分解、および酸化の影響が挙げられる。

不純物を測定および評価する別の局面は、測定の直線性である。いくつかの範囲の濃度を用いて、ほとんどのデータポイントからのデータポイントの合理的な誤差限界または偏差内の数学的直線性にとって無理のない（ａｆｆｏｒｄａｂｌｅ）範囲で不純物の評価を行う。データポイントの数学的変換、例えば、回帰分析を適用して、測定の直線性を確認してもよい。

本発明での不純物の影響についての試験において、許容可能な不純物のうち±２０％を試験に供する。また、本発明の濃度範囲については、その生産の範囲のうち７０％〜１３０％を含む組成物を不純物についての試験に供する。

不純物を定量するには、このプロセスに由来する化学物質のレベル、その生産の環境、および活性成分の分解を評価する。一実施形態では、質量分光装置を用いて、試験サンプルの化学的プロフィールを得る。データの正確性および信頼性を達成するために、特定の範囲をカバーする最小で３つの濃度レベルにわたって最小で９個の決定を用いて不純物評価を繰り返してもよい（例えば、総分析手順のうちの各々で、３濃度／３反復）。正確性は、サンプル中の分析物の既知の添加量のアッセイによる回収パーセントとして、または平均値と容認される（ａｃｃｅｐｔｅｄ）真の値との間の相違として信頼区間とともに報告され得る。また、再現性を保証するために、盲検サンプルを研究室間の試験に供してもよい。さらに、ベースラインのシグナル対ノイズのレベルを、ブランクサンプルに比較して、既知濃度の活性成分に対して測定してもよい。不純物を評価するとみなされる他のバリエーションの非限定的な例としては、分析溶液の安定性および抽出時間が挙げられる。液体クロマトグラフィーの場合には、このような例としては、移動相におけるｐＨの変動の影響、移動相の組成における変動の影響、異なるカラム（異なるロットおよび／または供給者）、温度および流速が挙げられる。ガスクロマトグラフィーの場合には、代表的なバリエーションの例は、異なるカラム（異なるロットおよび／または供給者）、温度および流速である。

アッセイ
本発明のペプチド模倣大環状分子の特性は、例えば、下に記載される方法を用いることによってアッセイされる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、本明細書に記載の置換基を欠く対応するポリペプチドに対して生物学的特性が改善されている。

α−ヘリシティを決定するためのアッセイ
溶液中で、α−らせんドメインを有するポリペプチドの二次構造は、ランダムコイル構造とα−らせん構造との間の動的平衡に到達し、「ヘリシティパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｈｅｌｉｃｉｔｙ）」として表される場合が多い。従って、例えば、未改変のプロアポトーシス性ＢＨ３ドメインは大部分が、溶液中で通常２５％未満のα−らせん含量を有するランダムコイルである。一方、最適化されたリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応するＲ置換基を欠く大環状分子のそれよりも少なくとも２倍高いα−ヘリシティを有する。いくつかの実施形態において、本発明の大環状分子は、５０％より高いα−ヘリシティを有する。本発明のペプチド模倣大環状分子（例えば、ＢＨ３ドメインベースの大環状分子）のヘリシティをアッセイするために、上記化合物を、水性溶液（例えば、ｐＨ７の５０ｍＭのリン酸カリウム溶液、または蒸留水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｈ_２Ｏ）、２５〜５０μＭの濃度まで）に溶解する。標準的な測定パラメーター（例えば、温度、２０℃；波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；光路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）、０．１ｃｍ）を用いて、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１０）において円二色性（ＣＤ）スペクトルを得る。平均残基楕円率（例えば、［Φ］２２２ｏｂｓ）をらせんデカペプチドモデル（Ｙａｎｇら（１９８６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３０：２０８）について報告されている値で割ることによって、各ペプチドのα−らせん含量を計算する。

融解温度（Ｔｍ）を決定するためのアッセイ
α−らせんなどの二次構造を含む本発明のペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応するＲ置換基を欠く大環状分子よりも高い融解温度を示す。代表的には、本発明のペプチド模倣大環状分子は、水性溶液中で高度に安定な構造を表す６０℃超のＴｍを示す。融解温度に対する大環状分子形成の影響をアッセイするために、ペプチド模倣大環状分子または非改変ペプチドを、蒸留水中に溶解（例えば、５０μＭの最終濃度で）し、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１０）において標準的なパラメーター（例えば、波長２２２ｎｍ；ステップ解像度、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；温度上昇速度：１℃／分；光路長、０．１ｃｍ）を用いて、ある温度範囲（例えば、４〜９５℃）にわたって楕円率の変化を測定することによって、Ｔｍを決定する。

プロテアーゼ耐性アッセイ
ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解を受けやすく、そのためペプチド性化合物は、インビボでの急速な分解に対して脆弱になる。しかし、ペプチドらせん形成は、代表的にはアミド骨格を埋没させ、従って、タンパク質分解性の切断からアミド骨格を保護することができる。本発明のペプチド模倣大環状分子をインビトロのトリプシンタンパク質分解に供して、対応するＲ置換基を欠く大環状分子と比較した分解速度の変化について評価し得る。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応するＲ置換基を欠く大環状分子を、トリプシンアガロースでインキュベートし、遠心分離によって種々の時点で反応をクエンチして、その後ＨＰＬＣ注入して、２８０ｎｍでの紫外線吸収により残存基質を定量する。簡潔に述べると、ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣物前駆体（５μｇ（ｍｃｇ））を、トリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ約１２５）で０、１０、２０、９０、および１８０分間インキュベートする。高速での卓上遠心分離によって反応をクエンチし、ＨＰＬＣによる２８０ｎｍでのピーク検出によって単離した上清中の残存している基質を定量する。タンパク質分解反応は一次反応速度式（ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示し、時間に対するｌｎ［Ｓ］（ｋ＝−１Ｘ勾配）のプロットから速度定数、ｋを決定する。

エキソビボ安定性アッセイ
最適化されたリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応するＲ置換基を欠く大環状分子のそれよりも少なくとも２倍高いエキソビボ半減期を有し、かつ１２時間以上のエキソビボ半減期を有する。エキソビボの血清安定性研究には、種々のアッセイを用いてもよい。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応するＲ置換基を欠く大環状分子（２μｇ）を、新鮮なマウス血清、ラット血清および／またはヒト血清（２ｍＬ）とともに、３７℃で０、１、２、４、８、および２４時間インキュベートする。インタクトな化合物のレベルを決定するために、以下の手順を用いてもよい：１００μｌの血清を２ｍｌの遠心管に移すこと、その後に１０μＬの５０％ギ酸および５００μＬのアセトニトリルを添加し、４±２℃で１０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離することによって、サンプルを抽出する。次いで上清を新しい２ｍｌのチューブに移し、ＴｕｒｂｏｖａｐにおいてＮ_２＜１０ｐｓｉ下、３７℃でエバポレートさせる。サンプルを１００μＬのアセトニトリル：水（５０：５０）中で再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析にかける。

インビトロ結合アッセイ
アクセプタータンパク質に対するペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣物前駆体の結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を用いる。ＦＰＡ技術は、偏光および蛍光トレーサーを用いて分子の配向および運動性を測定する。偏光によって励起されると、高い見かけの分子量を有する分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きなタンパク質に結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、より小さい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較してそのより遅い回転速度のために、より高いレベルの偏光蛍光を発する。

例えば、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ）ペプチド模倣大環状分子（２５ｎＭ）を、結合緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）中で、アクセプタータンパク質（２５〜１０００ｎＭ）と一緒に室温で３０分間インキュベートする。結合活性を、例えば、ルミネッセンス分光光度計（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０Ｂ）において蛍光偏光によって測定する。Ｋｄ値は、例えば、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、非線形回帰分析によって決定し得る。本発明のペプチド模倣大環状分子は、場合によっては、対応するＲ置換基を欠く大環状分子と同様のまたはそれより低いＫｄを示す。

ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−Ｘ_Ｌ、ＢＡＸまたはＭＣＬ１などのＢＨ３−ペプチドについてのアクセプタータンパク質は、例えば、このアッセイで用いられ得る。ＭＤＭ２またはＭＤＭＸなどのｐ５３ペプチドについてのアクセプタータンパク質もまたこのアッセイで用いられてもよい。

ペプチド−タンパク質相互作用のアンタゴニストを特徴付けるためのインビトロ置換アッセイ
ペプチド（例えば、ＢＨ３ペプチドまたはｐ５３ペプチド）とアクセプタータンパク質との間の相互作用をアンタゴナイズする化合物の結合および親和性を評価するために、例えば、ペプチド模倣物前駆体配列に由来するフルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子を利用する蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を用いる。このＦＰＡ技術は、偏光および蛍光トレーサーを用いて分子の配向および運動性を測定する。偏光によって励起されるとき、高い見かけの分子量を有する分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きなタンパク質に結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、より小さい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較してそのより遅い回転速度のために、より高いレベルの偏光蛍光を発する。フルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子とアクセプタータンパク質との間の相互作用をアンタゴナイズする化合物は、競合的結合ＦＰＡ実験において検出される。

例えば、推定アンタゴニスト化合物（１ｎＭ〜１ｍＭ）およびフルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子（２５ｎＭ）を、結合緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）中で、アクセプタータンパク質（５０ｎＭ）と一緒に室温で３０分間インキュベートする。アンタゴニスト結合活性を、例えば、ルミネッセンス分光光度計（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０Ｂ）において蛍光偏光によって測定する。Ｋｄ値は、例えば、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて非線形回帰分析によって決定することができる。

有機低分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質などの任意のクラスの分子を、このアッセイにおいて推定アンタゴニストとして検査してもよい。ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＡＸまたはＭＣＬ１などのＢＨ３−ペプチドについてのアクセプタータンパク質がこのアッセイで用いられてもよい。ＭＤＭ２またはＭＤＭＸなどのｐ５３ペプチドについてのアクセプタータンパク質がこのアッセイで用いられてもよい。

インタクトな細胞における結合アッセイ
インタクトな細胞における、それらの天然アクセプターに対するペプチドまたはペプチド模倣大環状分子の結合は、免疫沈降実験によって測定することが可能である。例えば、インタクトな細胞を、血清の非存在において、フルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ）（ＦＩＴＣ標識）化合物とともに４時間インキュベートし、その後血清補充（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を行い、さらに４〜１８時間の範囲でインキュベートする。次いで細胞をペレットにして、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．６］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＣＨＡＰＳおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で、１０分間４℃でインキュベートする。抽出物を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離にかけ、上清を回収して１０μｌのヤギ抗ＦＩＴＣ抗体と４℃で回転させながら２時間インキュベートし、その後さらに４℃で２時間、プロテインＡ／Ｇセファロース（５０μｌの５０％ビーズスラリー）とインキュベートする。短時間の遠心分離の後、ペレットを、漸増する塩濃度（例えば、１５０、３００、５００ｍＭ）を含有する溶解緩衝液中で洗浄する。次いで、ビーズを、１５０ｍＭのＮａＣｌで再平衡化させて、その後ＳＤＳ含有サンプル緩衝液の添加および煮沸を行う。遠心分離後、上清を必要に応じて、４％〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて電気泳動し、その後Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンに移す。ブロッキング後、必要に応じて、ブロットを、ＦＩＴＣを検出する抗体と、また、ペプチド模倣大環状分子に結合するタンパク質（ＢＣＬ２、ＭＣＬ１、ＢＣＬ−ＸＬ、Ａ１、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＭＤＭ２またはＭＤＭＸを含む）を検出する１つ以上の抗体とともに、インキュベートする。

細胞透過性アッセイ
ペプチド模倣大環状分子は、例えば、Ｒ−置換基を欠く対応する大環状分子に比較して、さらに細胞透過性である。いくつかの実施形態では、このペプチド模倣大環状分子は、Ｒ−置換基を欠く対応する大環状分子よりも細胞透過性である。最適化されたリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は例えば、Ｒ−置換基を欠く対応する大環状分子よりも少なくとも２倍大きい細胞透過性を保有し、かつ適用した（ａｐｐｌｉｅｄ）ペプチド模倣大環状分子のうち２０％以上が４時間後に細胞を透過したことが観察される場合が多い。ペプチド模倣大環状分子およびＲ−置換基を欠く対応する大環状分子の細胞透過性を測定するために、インタクトな細胞を、フルオレセイン化したペプチド模倣大環状分子またはＲ−置換基を欠く対応する大環状分子（１０μＭ）とともに４時間、無血清培地中で３７℃でインキュベートし、培地を用いて２回洗浄し、トリプシン（０．２５％）とともに１０分間３７℃でインキュベートする。細胞を再度洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁する。細胞の蛍光を、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター、またはＣｅｌｌｏｍｉｃｓ’ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒのいずれかを用いることによって分析する。

細胞効力アッセイ
特定のペプチド模倣大環状分子の効力は、例えば、ヒトまたはマウス細胞集団に由来する種々の腫瘍形成性および非腫瘍形成性の細胞系統ならびに初代細胞を用いる細胞ベースの死滅アッセイにおいて決定される。細胞生存率を、例えば、ペプチド模倣大環状分子（０．５〜５０μＭ）による２４〜９６時間のインキュベーションにわたってモニターして、ＥＣ５０＜１０μＭで死滅させるペプチド模倣大環状分子を特定する。細胞生存率を測定するいくつかの標準的なアッセイが市販されており、ペプチド模倣大環状分子の効力を評価するために必要に応じて用いられる。さらに、ペプチド模倣大環状分子がアポトーシス機構を活性化することによって細胞を死滅させるか否かを評価するために、アネキシンＶおよびカスパーゼ活性化を測定するアッセイが必要に応じて用いられる。例えば、細胞内ＡＴＰ濃度の関数として細胞生存率を決定するＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−ｇｌｏアッセイが用いられる。

インビボ安定性アッセイ
ペプチド模倣大環状分子のインビボ安定性を検討するために、化合物を、例えば、マウスおよび／またはラットに、ＩＶ、ＩＰ、ＰＯまたは吸入経路によって０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で投与し、注入後０分、５分、１５分、３０分、１時間、４時間、８時間および２４時間で血液検体を採取する。次いで２５μＬの新鮮血清中のインタクトな化合物のレベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって上記のとおり測定する。

動物モデルにおけるインビボ効力
インビボでの本発明のペプチド模倣大環状分子の抗腫瘍形成活性を決定するために、化合物を、例えば、単独で（ＩＰ、ＩＶ、ＰＯ、吸入または鼻腔内経路によって）または最適以下の用量の関連する化学療法（例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）と組み合わせて投与する。一例において、ルシフェラーゼを安定に発現する５×１０^６個のＲＳ４；１１細胞（急性リンパ芽球性白血病患者の骨髄から樹立した）を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの尾静脈内に、全身照射を受けてから３時間後に注入する。治療しないまま放置した場合、この形態の白血病はこのモデルにおいて３週間以内に死に至る。白血病は、例えば、マウスにＤ−ルシフェリン（６０ｍｇ／ｋｇ）を注入し、麻酔をかけた動物をイメージングする（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）ことによって、容易にモニターされる。全身の生物発光を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）による光子フラックス（光子／秒）の積分によって定量する。単独のまたは最適以下の用量の関連する化学療法剤と組み合わせたペプチド模倣大環状分子を、例えば、白血病マウス（注入の１０日後／実験の１日目、１４〜１６の生物発光範囲内）に尾静脈またはＩＰ経路で０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で７〜２１日間投与する。必要に応じて、実験中１日おきにマウスをイメージングし、実験期間中、毎日生存をモニターする。死亡したマウスを必要に応じて、実験終了の時点で解剖する。別の動物モデルは、ルシフェラーゼを安定に発現する、ヒト濾胞性リンパ腫に由来する細胞系統ＤｏＨＨ２の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへの移植である。これらのインビボ試験では必要に応じて、予備的な薬物動態的、薬力学的および毒性データを作成する。

臨床試験
ヒトの治療に対する本発明のペプチド模倣大環状分子の適合を決定するために、臨床試験を行う。例えば、癌と診断されかつ治療を必要とする患者を選択して、治療群および１つ以上のコントロール群に分け、治療群には本発明のペプチド模倣大環状分子を投与し、一方コントロール群には、プラセボ、または公知の抗癌剤を与える。従って、本発明のペプチド模倣大環状分子の治療の安全性および効力は、生存およびクオリティー・オブ・ライフなどの因子に関して患者群の比較を行うことによって評価することができる。この例において、ペプチド模倣大環状分子で治療した患者群は、プラセボで治療した患者コントロール群と比較して長期生存の改善を示す。

医薬組成物および投与経路
本発明のペプチド模倣大環状分子はまた、薬学的に受容可能な誘導体またはそのプロドラッグも含む。「薬学的に受容可能な誘導体」とは、レシピエントへの投与の際、本発明の化合物を（直接的または間接的に）提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、エステルの塩、プロドラッグまたは他の誘導体を意味する。特に好ましい薬学的に受容可能な誘導体は、哺乳動物に投与される場合、本発明の化合物のバイオアベイラビリティを増加させる（例えば、経口投与された化合物の血液中への吸収を増加させることによって）か、またはその親種と比較して生物学的区画（例えば、脳またはリンパ系）への活性な化合物の送達を増加させるものである。いくつかの薬学的に受容可能な誘導体は、水溶解度（ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）または胃腸粘膜の能動輸送を増大する化学基を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のペプチド模倣大環状分子は、選択的な生物学的特性を増強するために、適切な官能基を共有結合または非共有結合で結合することによって改変される。そのような改変としては、所与の生物学的コンパートメント（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透性を増大させる、経口の利用可能性を増加させる、可溶性を増大させて注入による投与を可能にする、代謝を変化させる、および排泄率を変化させる改変が挙げられる。

本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩としては、薬学的に受容可能な無機の酸および塩基に由来する塩ならびに有機の酸および塩基に由来する塩が挙げられる。適切な酸塩（ａｃｉｄ ｓａｌｔ）の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモエート、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、アンモニウム塩およびＮ−（アルキル）_４ ^＋塩が挙げられる。

本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されるペプチド模倣大環状分子またはその薬学的に受容可能な塩；追加の剤、例としては、例えば、モルフィンまたはコデイン；および任意の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含む。本発明の別の組成物は、本明細書に記載されるペプチド模倣大環状分子またはその薬学的に受容可能な塩；および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含む。本明細書に描写される組成物は、本明細書に描写されるペプチド模倣大環状分子、ならびに、もし存在すならば、ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーが媒介する障害またはその症状を含めて、疾患または疾患の症状の調節を達成するために有効な量の追加の治療剤を含む。

「薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバント」という用語は、本発明の化合物と一緒に患者に投与され得、かつその化合物の治療量を送達するために十分な用量で投与される場合、その薬理学的活性を破壊せず、毒性ではないキャリアまたはアジュバントを指す。

本発明の薬学的組成物中で用いられ得る薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクルとしては限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達システム（ｓｅｌｆ−ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）（ＳＥＤＤＳ）、例えば、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、薬学的な剤形で用いられるサーファクタント、例えば、Ｔｗｅｅｎｓまたは他の類似のポリマー送達マトリクス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ポリアクリレート、ワックス（ろう状物質）、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー類（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐｏｌｙｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅ−ｎｅ−ｂｌｏｃｋ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。シクロデキストリン、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンもまた、本明細書に記載される式の化合物の送達を増強するのに有利に用いられ得る。

本発明の化合物から医薬組成物を調製するために、薬学的に受容可能なキャリアとしては固体または液体のいずれかのキャリアが挙げられる。固体形態の調製物としては、粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性粒剤が挙げられる。固体キャリアは、希釈剤、着香剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても機能する１つ以上の物質であってもよい。処方および投与のための技術に関する詳細は、科学文献および特許文献において十分に記述されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡの最新版を参照のこと。

粉末剤においては、キャリアとは、微粉化した（ｆｉｎｅｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ）活性成分と混合されている微粉化した固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合特性を有するキャリアと適切な割合で混合され、所望の形状および大きさに圧縮される。

適切な固体賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）であり、これには、限定するものではないが、糖、例としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または別の植物由来のデンプン；セルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が挙げられる。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのこれらの塩のような崩壊剤または可溶化剤を加える。

液体形態の調製物としては、液剤、懸濁剤、および乳剤、例えば、水または水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口注入用に、液体調製物は、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液に処方することができる。

本明細書に記載されるペプチド模倣大環状分子は、例えば、注射によって、静脈内に、動脈内に、皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹腔内に、筋肉内にもしくは皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）；または経口で、口腔内に、経鼻で、経粘膜で、局所に、眼科調製物中で、もしくは吸入によって、体重１ｋｇあたり約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇにわたる投与量で、または特定の薬物の要件に応じて投与されてもよい。本明細書の方法は、所望のまたは言及された効果を得るために有効な量の化合物または化合物の組成物の投与を想定する。代表的には、本発明の薬学的組成物は、１日あたり約１回〜約６回、あるいは連続的注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）として投与される。このような投与は、持続的な治療または緊急の治療（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｒ ａｃｕｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ）として用いられ得る。単位剤形を作製するためにキャリア物質と組み合され得る活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与方式に依存して変化する。代表的な調製物は、約５％〜約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含む。あるいは、このような調製物は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含む。

上記で言及されたよりも低用量または高用量が必要である場合もある。任意の特定の患者についての特定の投与量および処置レジメンは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、併用薬、疾患、状態または症状の重篤度および経過、患者の、疾患、状態または症状に対する傾向、および処置する医師の判定を含む種々の要因に依存する。

患者の状態の改善の際、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持用量を必要に応じて投与してもよい。引き続き、投与量もしくは投与の頻度、またはその両方とも、その症状の関数として、その改善された状態が保持されるレベルまで低減されてもよい。しかし、患者は、疾患症状の任意の再発の際に、長期間の間歇的な処置を必要とする場合もある。

本発明の薬学的組成物は、経口で、非経口で、吸入スプレーによって、局所に、直腸に、経鼻で、口腔内に、膣に、または移植片リザーバーを介して、好ましくは経口投与または注射による投与によって投与され得る。本発明の薬学的組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含んでもよい。ある場合には、処方物のｐＨは、処方された化合物またはその送達形態の安定性を向上する薬学的に受容可能な酸、塩基またはバッファーで調節され得る。本明細書に用いられる非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）、くも膜下腔内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技術を包含する。

薬学的組成物は、無菌の注射用調製物の形態、例えば、無菌の注射用水性懸濁液または油性懸濁液であってもよい。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など）および懸濁剤を用いて当該分野で公知の技術によって処方され得る。この無菌の注射用調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口で受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射用の溶液または懸濁液であってもよい。とりわけ、使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油が溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的には、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含めて任意の無刺激性の固定油が使用され得る。脂肪酸、例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体が注射可能な調製物に有用であり、天然の薬学的に受容可能な油状物、例えば、オリーブ油またはキャスター・オイル（ヒマシ油）、特にそのポリオキシエチル化（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ）バージョンも同様である。これらの油状溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコールの希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは類似の分散剤（エマルジョンおよび／または懸濁液などの薬学的に受容可能な剤形の処方物中で通常用いられる）を含んでもよい。他の通常用いられるサーファクタント、例えば、Ｔｗｅｅｎ類またはＳｐａｎ類および／または他の類似の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ向上剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）（薬学的に受容可能な固体、液体または他の剤形の製造に通常用いられる）もまた、処方の目的のために用いられ得る。

本発明の薬学的組成物は、限定するものではないが、カプセル、錠剤、エマルジョン、および水性懸濁液、分散物および溶液を含めて任意の経口で受容可能な剤形で経口投与されてもよい。経口使用のための錠剤の場合、通常用いられるキャリアとしては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムも代表的には添加される。カプセル形態での経口投与に有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性の懸濁液および／またはエマルジョンが経口で投与される場合、活性成分は油相に懸濁されていてもまたは油相に溶解されていてもよく、乳化剤および／または懸濁剤と組み合される。必要に応じて、特定の甘味料および／または香味料および／または着色料を添加してもよい。

本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、本発明の化合物と、室温では固体だが、直腸温度では液体であり、従って直腸では溶けて活性成分を放出する適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製され得る。このような物質としては、限定するものではないが、ココアバター、蜜ろう、およびポリエチレングリコールが挙げられる。

本発明の薬学的組成物は、鼻エアロゾルによって投与されても、または吸入によって投与されてもよい。このような組成物は、薬学的処方物の当該分野で周知の技術に従って調製され、そして食塩水中の溶液として調製されてもよく、これは、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進因子、フルオロカーボンおよび／または当該分野で公知の他の可溶化剤または懸濁剤を使用する。

薬学的調製物は、好ましくは単位剤形である。このような形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に小分割される。単位剤形は、バイアルまたはアンプル中に、小分けされた錠剤、カプセル、および粉末など、個別量の調製物を収容しているパッケージであるパッケージ調製物であってもよい。また、単位剤形は、それ自体カプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはロゼンジであってもよく、または、適切な数の任意のこれらのパッケージ化形態であってもよい。

本発明の組成物が本明細書に記載の式の化合物と１つ以上のさらなる治療剤または予防剤の組合せを含む場合、化合物およびさらなる薬剤の両方は、単独療法レジメンにおいて通常投与される投薬量の約１〜１００％、およびより好ましくは約５〜９５％の投薬量レベルで存在するべきである。さらなる薬剤は、反復投与レジメンの一部として、本発明の化合物とは別々に投与され得る。あるいは、これらの薬剤は１つの剤形の一部であり得、１つの組成物中で本発明の化合物と一緒に混合される。

使用の方法
一局面では、本発明は、ペプチド模倣大環状分子がモデリングされる、タンパク質またはペプチドの天然のリガンド（単数または複数）に結合する剤を特定するために競合的結合アッセイで有用な新規なペプチド模倣大環状分子を提供する。例えば、ｐ５３ ＭＤＭ２の系では、ｐ５３に基づく標識され安定化されたペプチド模倣大環状分子を、ＭＤＭ２に競合的に結合する低分子と一緒にＭＤＭ２結合アッセイで用いる。競合的な結合研究によって、ｐ５３／ＭＤＭ２の系に特異的である薬物候補の迅速なインビトロでの評価および決定が可能になる。ＢＨ３／ＢＣＬ−Ｘ_Ｌ抗−アポトーシスの系においてと同様、ＢＨ３に基づく標識されたペプチド模倣大環状分子を、ＢＣＬ−Ｘ_Ｌに対して競合的に結合する低分子とともにＢＣＬ−Ｘ_Ｌ結合アッセイに用いてもよい。競合的結合研究によって、ＢＨ３／ＢＣＬ−Ｘ_Ｌ系に特異的な薬物候補を迅速にインビトロで評価および決定することが可能になる。本発明はさらに、ペプチド模倣大環状分子に対する抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、これらの抗体はペプチド模倣大環状分子およびｐ５３またはＢＨ３ペプチド模倣前駆体（ペプチド模倣大環状分子が由来する）の両方に対して特異的に結合する。このような抗体は、例えば、それぞれ、ｐ５３／ＭＤＭ２またはＢＨ３／ＢＣＬ−ＸＬ系を破壊する。

他の局面では、本発明は、異常な（例えば、不十分なまたは過剰な）ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーの発現または活性（例えば、外因性または内因性のアポトーシス経路異常）に関連する障害のリスクがある（またはそれに罹りやすい）かまたはその障害を有する被験体を処置する予防方法および治療方法の両方をもたらす。いくつかのＢＣＬ−２型の障害は、少なくとも一部は、異常なレベルの１つ以上のＢＣＬ−２ファミリーのメンバー（例えば、過剰発現または過小発現）によって、または異常な活性を呈する１つ以上のＢＣＬ−２ファミリーのメンバーの存在によって生じると考えられる。そのようなものとして、ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーのレベルおよび／または活性の減少、あるいはＢＣＬ−２ファミリーのメンバーのレベルおよび／または活性の増強を、例えば、その障害の有害な症状を緩和または軽減するために用いる。

別の局面では、本発明は、腫瘍細胞におけるｐ５３とＭＤＭ２との間の相互作用または結合を妨害することによって過剰増殖性疾患を処置または予防するための方法をもたらす。これらの方法は、ヒトを含む温血動物に対して、または野生型ｐ５３を含む腫瘍細胞に対して本発明の化合物の有効量を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の化合物の投与は、細胞増殖停止またはアポトーシスを誘導する。他の実施形態またはさらなる実施形態では、本発明を用いて、ＭＤＭ２レベルが上昇している疾患および／または腫瘍細胞を処置する。本明細書で用いられるＭＤＭ２のレベルの上昇とは、ＥＬＩＳＡおよび類似のアッセイによって測定した場合、ｍｄｍ２の正常なコピー数（２）よりも多くを含む細胞で見出されるＭＤＭ２レベルよりも大きいか、または１細胞あたりＭＤＭ２が約１０，０００分子を超える、ＭＤＭ２レベルを指す（Ｐｉｃｋｓｌｅｙら、（１９９４），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９，２５２３ ２５２９）。

本明細書において使用される場合、「処置」という用語は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を、回復させる、治癒する、軽減する、緩和する、変化させる、治す、改善する、好転させる、または影響を与えるという目的で、その疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有する患者への治療剤の適用もしくは投与、または、その患者から単離した組織もしくは細胞系統への治療剤の適用もしくは投与として定義される。

いくつかの実施形態において、本発明のペプチド模倣大環状分子を用いて、癌および腫瘍性の状態を処置、予防、および／または診断する。本明細書において用いる場合、「癌」、「過剰増殖性」および「腫瘍性」という用語は、自律的増殖能、すなわち、急速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状況または状態を有する細胞のことをいう。過剰増殖性疾患および腫瘍性疾患の状況は、病的なもの、すなわち、疾患状況を特徴付けているかまたは構成しているものとして分類してもよいし、または非病的なもの、すなわち、正常な状況から逸脱しているが疾患状況を伴わないものとして分類してもよい。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性のステージに関係なく、全てのタイプの癌増殖または腫瘍形成過程、転移組織または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。転移性腫瘍は、乳房、肺、肝臓、結腸および卵巣の起源の腫瘍を含むがこれらに限定されない、複数の原発性腫瘍型から生じる可能性がある。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴付けられる疾患状況において発生する。非病的な過剰増殖性細胞の例としては、創傷回復に伴う細胞の増殖が挙げられる。細胞増殖性障害および／または分化性障害の例としては、癌、例えば、癌腫、肉腫、または転移性障害が挙げられる。いくつかの実施形態において、ペプチド模倣大環状分子は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、そのような癌の転移などを制御するための新規な治療剤である。

癌または腫瘍形成病態の例としては、限定するものではないが、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮癌、皮脂腺腺癌（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ ｇｌａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状膠細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、またはカポジ肉腫が挙げられる。

増殖性障害の例としては、造血性新形成障害が挙げられる。本明細書において用いられる場合、「造血性新形成障害」という用語は、造血起源の、例えば、骨髄系、リンパ系または赤血球系、またはこれらの前駆体細胞から生じる、過形成／新形成細胞を伴う疾患を包含する。好ましくは、その疾患は、低分化急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。さらなる例示的な骨髄障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ（１９９１）、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７〜９７に概説されている）が挙げられるがこれらに限定されず；リンパ性悪性疾患としては、限定するものではないが、Ｂ細胞系ＡＬＬおよびＴ細胞系ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンストロームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。悪性リンパ腫のさらなる形態としては、限定するものではないが、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびＲｅｅｄ−Ｓｔｅｍｂｅｒｇ病が挙げられる。

乳房の細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、限定するものではないが、増殖性乳房疾患、例としては、例えば、上皮過形成、硬化性腺症、および小管乳頭腫；腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、および肉腫などの間質性腫瘍、ならびに大管乳頭腫などの上皮腫瘍；上皮内腺管癌（ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）（パジェット病を含む）および上皮内小葉癌を含む上皮内（非侵襲性）癌を含む乳房の癌、ならびに、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状癌、および侵襲性乳頭状癌を含むがこれらに限定されない侵襲性（浸潤性）癌、ならびに混合型悪性新生物が挙げられる。男性乳房における障害としては、女性化乳房および癌腫を含むがこれらに限定されない。

肺の細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、限定するものではないが、気管支原性癌、例としては、腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞癌、神経内分泌腫瘍、例えば、気管支カルチノイド、混合型腫瘍、および転移性腫瘍；肋膜の病理、例としては、炎症性胸水、非炎症性胸水、気胸、および胸膜腫瘍、例としては、孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）および悪性中皮腫が挙げられる。

結腸の細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、限定するものではないが、非新形成ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸がん、およびカルチノイド腫瘍が挙げられる。

肝臓の細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、限定するものではないが、結節性過形成、腺腫、ならびに悪性腫瘍、例としては、肝臓の原発性がんおよび転移性腫瘍が挙げられる。

卵巣の細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、限定するものではないが、卵巣腫瘍、例えば、体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫（ｃｙｓｔａｄｅｎｏｆｉｂｒｏｍａ）、ブレンナー腫瘍、表層上皮腫瘍；胚細胞腫瘍、例えば、成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫（ｍｏｎｏｄｅｒｍａｌ ｔｅｒａｔｏｍａ）、未熟型悪性奇形腫、未分化胚細胞種、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌；性索間質性腫瘍、例えば、顆粒膜夾膜細胞腫、莢膜細胞腫線維腫（ｔｈｅｃｏｍａｆｉｂｒｏｍａ）、アンドロブラストーマ、ヒル（ｈｉｌｌ）細胞腫瘍、および性腺芽腫；ならびに転移性腫瘍、例えば、クルーケンベルグ腫瘍が挙げられる。

他の実施形態またはさらなる実施形態では、本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子を用いて、過活動性細胞死または生理的傷害などによる細胞死によって特徴付けられる病態を処置、予防または診断する。早発性のまたは望ましくない細胞死によって特徴付けられる病態、またはあるいは望ましくないまたは過剰な細胞増殖のいくつかの例としては、限定するものではないが、細胞低形成性（ｈｙｐｏｃｅｌｌｕｌａｒ）／低形成性、無細胞性／無形成性、または細胞過形成性（ｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ）／過形成性の病態が挙げられる。いくつかの例としては、血液系の障害、例としては、限定するものではないが、ファンコニ−貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症、骨髄異形成が挙げられる。

他の実施形態またはさらなる実施形態において、アポトーシスを減少させるように作用する本発明のペプチド模倣大環状分子を用いて、望ましくないレベルの細胞死に関連する障害を処置する。従って、いくつかの実施形態において、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子を用いて、ウイルス感染、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染に関連する感染に伴う細胞死を引き起こすものなどの障害を処置する。広範な神経系の疾患が、特定のセットのニューロンの逐次の消失によって特徴付けられ、いくつかの実施形態において、本発明の抗アポトーシス性ペプチド模倣大環状分子を、これらの障害の処置に用いる。そのような障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）色素性網膜炎、脊髄性筋委縮症、および種々の形態の小脳変性症が挙げられる。これらの疾患における細胞消失は、炎症応答を引き起こさず、アポトーシスが細胞死の機構であるようである。加えて、いくつかの血液系疾患が、血球の産生減少と関連している。これらの障害としては、慢性疾患に伴う貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少症、および骨髄異形成症候群が挙げられる。骨髄異形成症候群および一部の形態の再生不良性貧血などの血球産生の障害は、骨髄内のアポトーシス細胞死の増加と関連している。これらの障害は、アポトーシスを促進する遺伝子の活性化、間質細胞もしくは造血性生存因子の後天性欠乏、または毒素および免疫応答のメディエーターの直接的作用に起因する可能性がある。細胞死と関連する２つのよく見られる障害は、心筋梗塞および脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）である。両方の障害において、急激な血流の喪失という事象において生じる虚血の中心部内の細胞は、壊死の結果として急速に死滅するように見える。しかしながら、中心虚血領域の外部では、細胞はより長い期間にわたって死滅し、形態学的にはアポトーシスによって死滅するように見える。他の実施形態またはさらなる実施形態では、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子を用いて、望ましくない細胞死に関連する全てのこのような障害を処置する。

本明細書に記載されるペプチド模倣大環状分子で処置される免疫学的障害のいくつかの例としては、限定するものではないが、器官移植片拒絶、関節炎、狼瘡、ＩＢＤ、クローン病、喘息、多発性硬化症、糖尿病などが挙げられる。

本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で処置される神経障害のいくつかの例としては限定するものではないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型遺伝性脳出血アミロイドーシス、反応性アミロイドーシス、蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイド腎症、マックルウェルズ症候群、特発性骨髄腫；マクログロブリン血症随伴性骨髄腫、家族性アミロイド多発性神経炎、家族性アミロイド心筋症、孤立性心アミロイド、全身性老人性アミロイドーシス、成人発症糖尿病、インスリノーマ、孤立性心房性アミロイド、甲状腺の髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、家族性アミロイド性多発性ニューロパシー、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマンストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、プリオン媒介疾患、およびハンチントン病が挙げられる。

本明細書に記載されるペプチド模倣大環状分子で処置される内分泌学的な障害のいくつかの例としては限定するものではないが、糖尿病、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下症、副甲状腺機能低下症、性腺機能低下症などが挙げられる。

本発明のペプチド模倣大環状分子で処置または予防される心臓血管障害（例えば、炎症性障害）の例としては、限定するものではないが、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、発作（ｓｔｒｏｋｅ）、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、心臓突然死、高血圧性心疾患；細動脈硬化症、小血管疾患、腎症、高グリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧症、気腫および慢性肺疾患などの非冠動脈疾患；あるいは新脈管形成術後の再狭窄、シャント、ステント、合成もしくは天然切除移植片、留置カテーテル、弁または別の移植可能なデバイスの留置などの介入処置を伴う心臓血管状態（「処置による血管外傷」）が挙げられる。好ましい心臓血管障害としては、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、動脈瘤、および発作が挙げられる。

実施例１
ペプチド模倣大環状分子の合成
ペプチド模倣大環状分子は、Ｗａｌｅｎｓｋｙら、（２００４），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１４６６；およびＷａｌｅｎｓｋｙら．，米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号に記載されるように固体支持体上で調製した。この手順を以下のようにさらに示す。

直鎖状ペプチドの合成のための一般的手順： 合成用に使用する市販のＦｍｏｃ−アミノ酸を用い（Ｃｒｅｏｓａｌｕｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、以下のように直交性に保護した：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ。ＨＣＴＵ（２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート）を、全ての天然のアミノ酸についての一次カップリング剤として用い、かつＨＡＴＵ（２−（７−Ａｚａ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）を、α，α−二置換アミノ酸に用いた。直鎖状ペプチドの合成は、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で固相ペプチド化学反応を用いて、０．６５ｍｍｏｌ／ｇの充填物（ｌｏａｄｉｎｇ）で行った。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、ＮＭＰ中の２５％ピペリジンを用いて達成した。ＮＭＰ中の５当量のアミノ酸、５当量のＨＣＴＵ、および１０当量のジイソプロピルエチルアミンを用いて、その樹脂についてアミノ酸のカップリングを行った。アミノ酸−ＨＡＴＵまたはＨＣＴＵ−ＤＩＰＥＡ（ＮＭＰ中）を２．５：２．５：５の比として、ＨＡＴＵまたはＨＣＴＵを用いて、α，α−二置換アミノ酸をその樹脂上のその充填物についてカップリングさせた。代表的なカップリング時間は、１時間であった。最終のＮ−末端アシル化は、５当量の無水酢酸および１０当量のジイソロピルエチルアミンで達成した。

上記の配列では、以下の命名法を用いる：
＄ α−Ｍｅ Ｓ５オレフィンアミノ酸
＄ｒ８ α−Ｍｅ Ｒ８オレフィンアミノ酸 。

直鎖状ペプチドのメタセシスのための一般的手順：ジクロロメタン中に４ｍｇ／ｍＬの濃度でビス（トリシクロヘキシルホスフィン）ベンジリジンルテニウム（ＩＶ）ジクロライド（Ｇｒｕｂｂｓ触媒）を含有する溶液であって、その樹脂上のその充填物について１５モル％に等しい総容積である、溶液。４時間後、樹脂を濾過して、ジクロロメタンで洗浄した。メタセシスは、必要に応じて繰り返し、ＨＰＬＣで分析されるとおり＞９５％のメタセシスを達成した。

実施例２
ペプチド模倣大環状分子の精製
樹脂に結合したらせんペプチドからのルテニウムのスカベンジングのための一般的手順：ＮＭＰ中で膨潤した樹脂上でらせんメタセシス化ペプチド（ｈｅｌｉｃａｌ ｍｅｔａｔｈｅｓｉｚｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む懸濁液に、ＤＭＳＯを添加して１：１のＮＭＰ−ＤＭＳＯ混合物を得た。得られた混合物を１６時間振盪して、濾過し、３つに分けたＮＭＰで（ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＭＰ）、３つに分けたジクロロメタンでおよび３つに分けたジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。

樹脂からのペプチドの切断のための一般的手順：樹脂を９０：５：５のトリフルオロ酢酸−水−トリイソプロピルシランを含有する溶液で処理した。４時間後、樹脂を濾過して、得られた溶液を冷（−７８℃）ジエチルエーテル中に注いだ。得られた固体を収集し、１：１のアセトニトリル−水に溶解して、凍結および凍結乾燥した。

切断されたペプチドの一般的な精製手順：方法Ａ。凍結乾燥された粗ペプチドを、３：１のＤＭＳＯ−アセトニトリル中に最終濃度０．１Ｍまで溶解して、０．４５μｍのナイロンシリンジフィルターを通過させた。その化合物を、室温でＶａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ Ｃ１８（２５０ｍｍ×５０ｍｍ，１０μｍ）カラムを用いる、逆相ＨＰＬＣによって１ｍｍｏｌのバッチに精製した。Ｈ_２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸というＨＰＬＣ移動相を用い、５０ｍＬ／分の速度で流す。８０分にわたる４５〜６５％のＢという溶出勾配を用いた。方法Ｂ。凍結乾燥した粗ペプチドを、０．１Ｍという最終濃度まで３：１のＤＭＳＯ−アセトニトリル中に溶解して、０．４５μｍのナイロンシリンジフィルターを通過させた。その化合物を、室温でＶａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ Ｃ１８（２５０ｍｍ×５０ｍｍ，１０μｍ）カラムを用いる、逆相ＨＰＬＣによって１ｍｍｏｌのバッチに精製した。Ｈ_２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸というＨＰＬＣ移動相を用い、５０ｍＬ／分の速度で流した。室温でＶａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ Ｃ１８（２５０ｍｍ×５０ｍｍ，１０μｍ）カラムを用いて、酸が存在しない精製を行った。ＨＰＬＣ移動相Ａ）Ｈ_２ＯおよびＢ）アセトニトリルを用い、５０ｍＬ／分の速度で流した。その化合物を充填し、９５：５でのアイソクラチックな１０カラム体積で持続させ、その後に１分あたり１％の勾配で溶出した。純粋な画分を単離し、合わせて、最後に凍結乾燥を行なった。方法Ｃ。粗材料（ｃｒｕｄｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）を、Ｃ８媒体１２０Å、１０μｍを用いて精製した。精製プロセスの第一段階で、ｐＨ２．３のＴＥＡＰをバッファー系として用いた。精製プロセスの第二段階では、０．１％のＴＦＡをバッファー系として用いた。生成物の濃度および塩交換を、希釈ＨＣｌを用いて行った。方法Ｄ。粗材料を室温でＶａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ Ｃ１８（２５０ｍｍ×５０ｍｍ，１０μｍ）カラムを用いる、ＨＰＬＣによって精製した。Ｈ_２Ｏ中の０．１％ギ酸およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸というＨＰＬＣ移動相を用い、５０ｍＬ／分の速度で流した。

「Ｗ／Ｏ精製」とは、ＤＭＳＯスカベンジングもＨＰＬＣ精製もなしでの分析を示す。「１×ＨＰＬＣ」とは、ＤＭＳＯスカベンジングを行なわないでＨＰＬＣカラム（方法Ａ）を単回通過させたことえを示す。「ＤＭＳＯのみ」とは、切断前にＮＭＰ中の２５％のＤＭＳＯでの１６時間のインキュベーションを示す。「ＤＭＳＯ＋１×ＨＰＬＣ」は、１６時間のＤＭＳＯ洗浄後の単回精製（方法Ａ）を示し、そして「ＤＭＳＯ＋２×ＨＰＬＣ」とは、ＤＭＳＯ洗浄後の２回の連続したＨＰＬＣ精製を示し；方法Ｂおよび方法Ｃは、それぞれ上記および注記されている。「ＮＤ」は「未検（ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）」を表す。

シリカベースの樹脂結合スカベンジャーで、切断されたらせんペプチドをスカベンジするための一般的手順：１：１の水−アセトニトリル溶液中にＤＭＳＯ洗浄ペプチドを含有する溶液に、５当量のＳｉ−ＤＭＴ（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ，ｐａｒｔ ＃ Ｒ７９０３０Ｂ）樹脂を添加して、５０℃で１６時間振盪した。得られた混合物を濾過して、樹脂を３ｍＬの１：１水−アセトニトリル溶液で洗浄した。得られた溶液を凍結して、凍結乾燥し、白色固体を得た。

「ＤＭＳＯ^＊」とは、ＮＭＰ中の２５％ＤＭＳＯを用いての樹脂上での１６時間のインキュベーションを示し、そして「ＤＭＳＯ＋Ｓｉ−ＤＭＴ」は、ＤＭＳＯ洗浄後、５０℃で５当量のＳｉ−ＤＭＴ樹脂とのペプチドの１６時間のインキュベーションを示す。

ポリスチレンベースの樹脂結合スカベンジャーで、切断されたらせんペプチドをスカベンジするための一般的手順：１４６ｐｐｍという出発Ｒｕカウントを有する、ＤＭＳＯ−洗浄したペプチドおよび単回通過させて精製した（方法Ｄ）ペプチドをＤＭＦ中に含有する溶液に、５当量のＰＳ−ＴＭＴ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ，ｐａｒｔ ＃ ＰＬ３５２７）または５当量のＰＳ−チオ尿素（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ，ｐａｒｔ＃ ＰＬ３５０Ｂ）樹脂を添加し、室温で１６時間振盪した。得られた混合物を濾過して、樹脂をＤＭＦで洗浄した。得られた溶液を減圧下で濃縮し、１：１の水−アセトニトリルに溶解し、凍結および凍結乾燥して、白色の固体を得た。

「ＰＳ−ＴＭＴ」は、ＤＭＦ中１６時間での５当量のＰＳ−ＴＭＴ樹脂を示す。「ＰＳ−チオ尿素」は、ＤＭＦ中１６時間での５当量のＰＳ−チオ尿素を示す。

樹脂結合メタセシス触媒を用いる保護されたペプチドのメタセシスのための手順：非ステープル（ｕｎｓｔａｐｌｅｄ）ペプチドの合成を酸不安定性Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＦｍｏｃ−合成ストラテジーを用いて行った。得られた樹脂を１％のＴＦＡ−ジクロロメタン（１０×２分）で処理し、その溶液をメタノール中の１０％ピリジンで処理した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。クロマトグラフィーを、ジクロロメタンから９：１のジクロロメタン−メタノールの勾配溶出を用いるフラッシュシリカゲルで行った。所望の生成物を含む画分を収集して、減圧下で濃縮した。得られたペプチドをジクロロメタン中に溶解して、５モル％のＳｉ−結合したメタセシス触媒で処理した（Ｄａｒｙｌ Ｐ．Ａｌｌｅｎ，Ｍａｔｔｈｅｗ Ｍ．Ｖａｎ ＷｉｎｇｅｒｄｅｎおよびＲｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｇｒｕｂｂｓ Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００９，１１（６），１２６１〜１２６４頁）。

得られた混合物を１６時間振盪した。その混合物を濾過して、シリカ結合した触媒をジクロロメタンで洗浄した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。得られた生成物を、２０ｍＬの９０：５：５のトリフルオロ酢酸−水−トリイソプロピルシラン溶液で処理した。４時間後、樹脂を濾過して、この得られた溶液を２５０ｍＬの冷（−７８℃）ジエチルエーテル中に注いだ。

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載しているが、このような実施形態が例示目的のみで提供されていることは当業者には明らかであろう。多くの変形、改変および置き換えが、本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替は、本発明の実践に使用可能であると理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義しており、そして本特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物が本発明の範囲に包含されるものとする。

Claims (1)

1. 本明細書中に記載される発明。