JPH03500008A - 組み換え系におけるグルコースオキシダアーゼの産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換え系におけるグルコースオキシダアーゼの産生技術分野 本発明は、工業的使用のだめのタンパク質を産生ずるための組み換えＤＮＡ技術 の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、グルコースオキシダアーゼをエン コードする、菌・かび（ｆｕｎｇｉ）から誘導されたポリヌクレオチドを含有す る組み換えベクター、およびポリヌクレオチドを含有する組み換え発現ベクター に関する。

背景 遺伝子操作の技術は、製薬工業に首尾よく適用されて、ある数の新規な産生物を 生成してきている。同一の技術を、大きい規模で、他の工業にとって価値ある酵 素の生産に適用することができるようになることが増大してきた。遺伝子操作に より′商業的に有用な方法を達成する利益は、次のものを包含するすることが期 待される：酵素の生産においてコストの節約、食物製品に適する安全なものと一 般に認識されている有機体中の酵素の産生、および酵素の性質、例えば、熱安定 性および性能特性、ならびに酵素を精製できる容易さを増加するもの。

グルコースオキシダアーゼは、グルコースをグルコン酸に酸化し、同時に過酸化 水素を生成する反応を触媒する酵素である。この酵素は多くの工業的用途を有し 、このような用途は次のものを包含する二押の脱糖、飲料、湿った食物製品、荒 涼、および気密封止した食物包装物からの酸素の除去、および工業的溶液、およ び体液、例えば、血液および深中のグルコースの検出および推定。

グルコースオキシダアーゼは、最初に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の細胞からムエラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）　［Ｂｕｉｃ ｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｚｅｕｔｓｃｇｒｕｆｔ　（３９２８）、１度旦、１３６− １７０および（１９３１）、２３又、４２３−４２４］により分離され、そして またＡ、ｎｉｇｅｒからフラツグ（Ｆｒａｎｋｅ）およびデフナー（Ｄｅｆｆｎ ｅｒ）［Ａｎｎａｌｅｎ　ｄｅｒ　Ｃｈｅｍｉｅ　（１９３９）、５４上、１１ ７−１５０３により抽出された。ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌ ｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＬペニシリウム・グラウクム（Ｐｅｎｉｃｉｌ ｉｕｍ　ｇｌａｕｃｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉ ｕｍ　ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、アスペルギルス−ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）およびアスペルギルス・７マリクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ｆｕｍａｒｉｃｕｓ）の種の細胞からグルコースオキシダアーゼの産生 は、米国特許第２，４８２，７２４号（Ｂａｋｅｒ）に記載された。アスペルギ ルス属およびペニシリウム属の種を産生ずるグルコースオキシダアーゼを低い炭 水化物を有する培地中で培養する、グルコースオキシダアーゼを調製する方法は 、米国特許第３゜７０１．７１５号に記載された。アスペルギルス・ニガー（Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）（Ａ、ｎｉｇｅｔ）からの酵素は、光度の 純度に精製されてきており、そして報告されているようにほぼ１５０゜０００の 分子量、４．２の等電点、および２ＦＡＤ１モルのフラビンアデニンジヌクレオ チド（ＦＡＤ）含量を有する。、Ｐａｚｕｒおよびに１ｅｐｐｅ　（１９８４） ％　Ｂｉｏｃｈｅｍｓヒｒｙ、５７８−５８３゜Ａ。

ｎｉｇｅｒからの酵素のアミノ酸組成、ならびに糖タンパク質としてのその同定 は、また、知られている。Ｐａｚｕｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９６５）、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、上上土、３５１−３５７゜しかしながら、グ ルコースオキシダアーゼのアミノ酸配列、およびそれをエンコードするヌクレオ チド配列のいずれも知られていない。

その自然源から分離されたグルコースオキシダアーゼを利用するときの問題は、 その酵素を産生ずる有機体は、所望のタンパク質のある種の使用に有害である汚 染物質を有することがあるということである。例えば、グルコースオキシダアー ゼは食物の商業的調製に使用される。しかしながら、商業的に調製される酵素の 主要な源であるＡ、ｎｉｇｅｒは、高度にアレルゲン性であり、そして食物中の 使用のために承認されない。

そのうえ、厳格な精製手順は、グルコースオキシダアーゼが主として細胞内酵素 であるので、比較的効果であることがある。これらの問題は、組み換え系におい てグルコースオキシダアーゼを産生ずることによって解決することができる。

菌・かびの酵素は組み換えベクターから発現されてきた。アスペルギルスからの グルコアミラーゼ［Ｉｎｎ１ｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２２８，２１２６］およびトリコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　 ｒｅｓｓｅｉ）からのエンドヌクレアーゼ１　［Ｖａｎ　Ａｒ５ｄｅｌｌ　ｅｔ 　ａｌ、（１９８７）、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＦ　５．６０−６４１は、サ ツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）中で発現された。

Ｂａｒｒ　ａｔ　ａｌ、　（１９８６）＋　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｃ４ ２８゜Ｂｒｏａｃｈ（１９８１）、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　ＯＦ 　ＴＨＥ　ＹＥＡＳＴ　ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ、　Ｖｏｌ。

１、　ｐ、４４５゜ Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ９７７）、　Ｎａｔｕｒｅ　１９８．１０５６ ゜Ｇａｔｅ、編（１９８４）、　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨ ＥＳＩＳＧｌｉｓｉｎ（１９７４）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３．２６ ３３゜Ｇｌｏｖｅｒ、編（１９８５）、　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ：ＶＯＬ、　 １およびＶＯＬ、　２゜ＧｒｕｎｓｔｓｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（１９７５） 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３゜６９６１ ゜ Ｈａｍｅｓ　＆　Ｈ３ｇｇｉｎｓ、（１９８５）、ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤ　Ｈ ＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ−（１９８１）Ｍ ＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ丁−ＣＥＬＬＨＹＢＲＩＤ ＯＭＡＳ。

Ｈｅ５ｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９６８）、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍ　Ｒｅ ｇ、　ｚ、　１４９゜Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃｅｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡ　７５．１９２９゜Ｈｕｙｎｈ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８５）、　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣ ＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ、編、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ 、　ｐｐ、４７−７８）Ｋｅｎｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）、　ＭＯＮ ＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）、　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯ ＮＩＮＧ　：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ 　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）Ｍｉ　 ］　ＬｅｒおよびＣａ１ｏｓ、編（１９８７）、　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅ ｒ　８よびＭ、Ｐ−Ｃａ１ｏｓ、　ｌ！、、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＬＩＩＤＥ　Ｔｏ　 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ。

Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　ｉｎ　ＤＲＵＧ　ＤＥＬ■Ｖ ＥＲＹ　５ＹＳＴＩＪＳ（Ｒ，Ｌ−Ｊｕｌｉａｎｏ、　編。

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第２版（Ｓｐｒｉｎｇｓｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。

本発明は、アスペルギルス属、よりとくにＡ、ｎｉｇｅｒの菌・かび源からのグ ルコースオキシダアーゼ（ＧＯ）をエンコードするｃＤＮＡ配列を提供する。こ の配列の知識は、ＧＯ，ＧＯの類似体、およびＧＯの断片を包含するＧｏに実質 的に類似するポリペプチドの組み換え系中発現ベクターで形質転換し、そしてそ の酵素の発現を可能とする条件下に増殖するとき、比較的大きい量の酵素が細胞 中で産生されかつ細胞から分泌される。この分泌は酵母菌の分泌配列、またはＡ 、ｎｉｇｅｒ中のエンフードされたＧＯのプレプロ配列の制御下にあることがで きる。

ここに提供されるｃＤＮＡは、また、組み換え体ＧＯの産生に使用こともできる 他の源からのＧｏをエンコードする配列の分離を可能とする。

これらの他の源は任意の由来であることができ、ここで酵素は自然にエンコード されるが、とくに菌・かびの源であり、ここでＧＯをエンコードする配列中なく とも８つの塩基対、好ましくは２０の塩基対、およびさらに好ましくは少なくと も４０の塩基対を含有し、これらは第５Ｂ図における匹敵する配列に対して高度 に相同性である（すなわち、相補的配列中の最大で１つの不一致を有する）。あ るいは、Ａ、ｎｉｇｅｒ以外からの源から分離されたＧＯ配列は、第５Ｂ図にお けるｃＤＮＡ配列においてエンコードされるＡ、ｎｉｇｅｒのＧＯ配列のそれに 相同性である、少なくとも約４のアミノ酸の配列を有することができる。

Ｇｏ　ｃＤＮＡをエンコードする発現ベクターで形質転換された酵母菌中で発現 されたポリペプチドを検査し、そして産生物は超グリコジル化されており、そし て組み換え的に産生されたポリペプチドの超グリコジル化は、自然ＧＯと比較し て、酵素活性にほとんどあるいはまったく影響をおよぼさないが、組み換え産生 物は増加した熱安定性を有するという、驚くべき結果が得られた。

他の驚くべき結果は、組み換え的に産生されたＧｏおよび自然ＧＯの両者からの 炭水化物の除去は酵素活性を明らかに阻害しないということである。

さらに他の驚くべき結果は、自然ＧＯはＡ、ｎｉｇｅｒ中に比較的大量に存在す るが、それをエンコードするｍ　ＲＮ　Ａが長い相の増殖の間Ａ。

ｎｉｇｅｒ中で比較的閲例であるということである。

なお他の驚くべき結果は、Ｇｏの類似体、すなわち、突然変異タンパク質は、Ａ 、ｎｉｇｅｒからの自然分子および酵母菌中で発現された組み換え相手に関して 増加した熱安定性を示すということである。

したがって、本発明の１つの面は、グルコースオキシダアーゼ（ＧＯ）に実質的 に類似するポリペプチドをエンフードするポリヌクレオチド配列からなり、ＧＯ をエンコードしない他のベクターを本質的に含まない組み換えベクターである。

本発明の他の面は、ＧＯに実質的に類似するポリペプチドをエンコードする配列 からなる組み換えポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞である。

本発明のなお他の面は、Ｇｏに実質的に類似する非自然ポリペプチドである。

本発明は、工程： （ａ）形質転換された細胞の集団を準備し、前記細胞はＧｏに実質的に類似する ポリペプチドの解読配列から構成された解読配列を含有し、前記解読配列は前記 細胞中の前記解読配列の発現を可能とする配列に操作的に結合しており、 （ｂ）前記ＧＯに実質的に類似するポリペプチドを発現させる条件下に、前記形 質転換された集団を増殖し、そして（ｃ）前記Ｇｏに実質的に類似するポリペプ チドを回収する、からなる、ＧＯに実質的に類似する組み換えポリペプチドを産 生ずる方法を提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、Ａ、ｎｉｇｅｒからの自然Ｇｏの断片のアミノ酸配列を示す。

第２図は、Ｇｏをエンコードする配列をスクリーニングするだめの、Ａ、ｎｉｇ ｅｒからの自然Ｇｏのアミノ酸配列から設計したオリゴヌクレオチドプローブを 示す。

第３図は、長さ７およびｆさ８の４２マーのプローブ、および長さ６のプローブ に対するそれらの関係を示す。

第４Ａ図は、クローン４から分離されたＧｏ　ｅＤＮＡの制限地図を示す。

第４Ｂ図は、クローン４におけるＧｏのｃＤＮＡ配列、誘導されたアミノ酸配列 、および制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を示す。

第５Ａ図は、Ａ、ｎｉｇｅｒからのＧｏをエンコードする複合ｃＤＮＡの制限酵 素地図を示す。

第５Ｂ図は、Ａ、ｎｉｇｅｒからのＧｏをエンコードする複合ｃＤＮＡのｃＤＮ Ａ配列、誘導されたアミノ酸配列、および制限酵素部位の位置を示す。

第６図は、第５Ｂ図に示す複合ｃＤＮＡから誘導された配列と、Ａ。

ｎ　ｉ　ｇｅ　ｒからの自然ＧＯの断片の同一性、およびコドンの使用を示す。

第７図は、Ａ−ｎｉｇｅｒ！：おけるＧＯ遺伝子に対して５′の領域のヌクレオ チド配列を示す。

第８図は、発現ベクターのｐＡＢ２４ＡＧＳｃｏＧＯおよびｐＡＢ２４ＡＧ１． に、Ｇｏの構成のためのフローチャートを示す。

第９図は、シャトルベクターｐＡＢ２４の有意な特徴の地図である。

第１０図は、ＧＯをエンドグリコシダーゼＨの存在下におよび不存在下に処理し たとき、部分的に精製した組み換えＧＯを電気泳動にかけた、ポリアクリルアミ ドゲルを示す。

第１１図は、制限酵素部位を包含する、いくつかの有意な特徴を示すｐｓＧｏ− ２の地図である。

第１２図は、制限酵素部位を包含する、いくつかの有意な特徴を示すｐ＠Ｇｏ− １の地図である。

第１３図は、Ａ−ｎｉｇｅｒからの自然ＧＯと比較したｐＡＢ２４ＡＧＳＧＯか らの酵母菌中で発現したＧｏポリペプチドの経時的熱安定性を示すグラフである 。

第１４図は、Ａ、ｎｉｇｅｒからの自然ＧＯと比較しＩ；、Ｃ５２１Ｓ中でエン コードされそして酵母菌中で発現された、突然変異タンパク質の経時的熱安定性 を示すグラフである。

第１５図は、クローンｐＢＲｐＧＯＸＡ１１の制限酵素部位の地図である。

第１６図は、クローンｐＢＲｐＧＯＸＡｌ　ｌ中のペニシリウム・アマガサキエ ンセ（Ｐ、ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ）のゲノムのセグメントの部分的ヌクレ オチド配列を示す：また、その中でエンコードされたアミノ酸および制限酵素部 位が示されている。

第１７図は、ｐＢＲｐＧＯＸＡ１１中でＰ、ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅゲノム インサートから誘導されＩ；断片中でエンコードされたアミノ酸と、第５Ｂ図中 にを示すヌクレオチド配列中でエンコードされたＡ。

ｎｉｇｅｒのアミノ酸配列との比較を示す。

発明を実施するだめのモード ｌ、」 本発明を記載するとき、次の用語は下に記載する定義に従って使用する。

二二で使用するとき、用語「グルコースオキシダアーゼ」は、グルコースをグル コン酸に酸化すると同時に過酸化水素を生成する反応を触媒するポリペプチドを 意味する。グルコースオキシダアーゼ活性を決定する手順は、この分野において 知られており、そして、例えば、比色測定アッセイを包含し、ここでグルコース オキシダアーゼ活性をペルオキシダーゼ−〇−ジアニシジン系に結合する。この 型のアッセイ系は実施例！■において論じらている。

ＧＯの産生のために有用なポリヌクレオチドを特性決定するために、ここににお いて使用する用語「組み換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ１半合成 、または合成の由来のポリヌクレオチドを意図し、これはその由来または操作に より：（１）性質がそれに関連するポリヌクレオチドのすべてまたは一部分に関 連しない、および／または（２）性質がそれと結合するもの以外のポリヌクレオ チドへ結合しているか、あるいは（３）性質で存在しない。

ここで使用するとき用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマーの形態 、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオヂドを呼ぶ。

この用語は分子の一次構造のみを呼ぶ。こうして、この用語は二本鎖および一本 鎖ＲＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを包含する。それは、また、例え ば、メチル化、ホスホリル化により、および／またはキャッピング（ｃａｐｐｉ ｎｇ）により修飾した形態のポリヌクレオチド、および修飾しない形態のポリヌ クレオチドを包含する。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動す る、すなわち、それ自身の制御下に複製することができる、任意の遺伝子要素、 例えば、プラスミド、染色体、ウィルスである。

「ベクター」は、他のポリヌクレオチドセグメントを組み込んで、組み込んだセ グメントの複製および／または発現を発生させるレプリコンである。

「制御配列（ｃｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）Ｊは、それらを結合する解読配 列の発現および／または分泌を実施するために必要である、ポリヌクレオチド配 列を呼ぶ。このような制御配列の性質は、宿主有機体に依存して異なる；原核生 物において、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リポソーム結合部 位、およびターミネータ−を包含する：真核生物において、一般に、このような 制御配列はプロモーター、ターミネータ−および、ある場合において、エンハン サ−を包含する。

さらに、原核生物および真核生物の両者において、リーダー配列は宿主細胞から の発現されたポリペプチドの分泌を制御する。用語「制御配列」は、最小におい て、発現にその存在が必要であるすべての成分を包含することを意図し、そして 、まｔ；、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列を包含する ことができる。

「操作可能に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）Ｊは、そのように記 載する成分がそれらの意図する方法で機能することができる関係にある並列の位 置を呼ぶ。解読配列に「操作可能に結合した」制御配列は、解読配列の発現が対 照配列と適合性の条件下にに達成されるような方法で結合される。

「オープンリーディングフレーム」は、ポリペプチドをエンコードするポリヌク レオチド配列の領域である；この領域は解読配列または合計の解読配列を表すこ とができる。

「解読配列」は、適当な調節配列の制御下に配置するとき、ｍＲＮＡに転写され るおよび／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。解読 配列の境界は、５′末端において翻訳開始コドンおよび３°末端における翻訳停 止コドンにより決定される。解読配列は、次のものを包含することができるが、 これらに限定されない＝ｍＲＮＡ。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓおよび組み換えポリヌクレオチド配列。

「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」 、および他の単細胞実在物として培養される微生物またはより高等の真核生物の 細胞系を意味する用語は、互換的に使用し、そして、組み換えベクターまたは他 の転移ポリヌクレオチドのための受容体として使用ことかできるか、あるいは使 用されてきている細胞を意味し、そしてトランスフェクションされたもとの細胞 の子孫を包含する。単一の親細胞はもとの親と形態学またはゲノムまたは合計の ＤＮＡ相補的か、偶発的または積極的な突然変異のｔ；めに、完全に同一である ことは必ずしも必要ではないことが理解される。親に十分に類似する親細胞の子 孫は、関連する性質、例えば、所望のペプチドをエンコードするヌクレオチド配 列の存在により特性決定され、この定義により子孫に包含され、そして上の用語 によりカバーされる。

「形質転換」は、ここで使用するとき、挿入に使用する方法、例えば、直接の吸 収、形質導入、またはｆ接合（ｆ−ｍａ　ｔ　ｉ　ｎｇ）に無関係に、外因性ポ リヌクレオチドを宿主細胞中に挿入することを呼ぶ。外因性ポリヌクレオチドは 、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとし、て述べることができるか、あ るいは宿主ゲノム中に組み込むことができる。

ここで使用するとき、用語「ポリペプチド」は、ゲノム内にエンコードされる配 列のアミノ酸産生物を呼び、そして特定の長さの産生物を呼ばず、こうして、ペ プチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に包含され る。この用語はポリペプチドの発現後の修飾、例えば、グリコジル化、アセチル 化、リン酸化、シアリル化などを意味しない。

用語「グルコースオキシダアーゼまたはＧｏに実質的に類似するポリペプチド」 は、例えば、グリコジル化、リン酸化などを包含する翻訳後の修飾に関して、Ｇ ｏの天然に産出しない形態を呼ぶが、自然Ｇｏ、ＧＯの類似体、ＧＯの断片、Ｇ ｏの断片の類似体、およびＧＯまｔ；は類似体または断片が性質が常態で融合し ない他のポリペプチドに融合されている融合ポリペプチドと同一のアミノ酸配列 を有するもの意味する。「ＧＯの類似体ｊまたは「ＧＯの断片の類似体」は、自 然Ｇｏまたは匹敵する断片からの相同性がアミノ酸配列に関して約７０％より大 きい、好ましくは約８０％より大きいものである。また、この用語内には、天然 に産出するアミノ酸の１または２以上が、この分野において知られている天然に 産出しない物質、例えば、天然に産出しないアミノ酸などにより置換されている 類似体である。ＧＯの断片まｌ；は類似体であるポリペプチドは「活性」である か、あるいはないことができる。「活性」ポリペプチドは、適当なコファクター および基質を使用して、アスペルギルスから分離されｔ：自然酵素により通常触 媒される反応を触媒するものである。「不活性」のポリペプチドは、自然の活性 を欠くか、あるいは自然活性が基質の利用に関して（型または量）および／まｌ ；は産生物の形成に関して（型または量）実質的に変更されているが、自然ＧＯ に対して、あるいはＧＯの匹敵する断片に対して、少なくとも上に示した量のア ミノ酸配列の相同性を有するものである。ＧＯおよびＧＯの類似体の天然に産出 しない形態を検出する方法は、この分野において知られている。

ＧＯおよびＧＯの類似体の天然に産出しない形態は、例えば、種々のクロマトグ ラフィーの物質への結合および溶離の変化により、および電気泳動のゲルを通る 移動により検出することができる。さらに、Ｇｏの類似体は、例えば、アミノ酸 配列の比較により検出することができる。

ＧＯの類似体の１つの型は、ｌまｔ；は２以上の通常存在するシスティン残基が 欠失されているか、あるいは他のアミノ酸で置換されているポリペプチドである ：この型のポリペプチドはここで「突然変異タンパク質」と呼ぶ。突然変異タン パク質を調製する方法は、この分野において知られている。

ここで使用するとき、用語「超グリコジル化ＧＯＪは、自然ＧＯに結合した炭水 化物の量に関して、追加の炭水化物の残基を含有するＧｏを呼ぶ。用語「非超グ リコジル化ＧＯＪは、自然ＧＯの結合した炭水化物の量に関して、少ない炭水化 物残基を含有する。ポリペプチドが多少の炭水化物を含有するかどうかを決定す る技術は、この分野において知られており、そして、例えば、修飾されたポリペ プチドの分子量の差を監視する【例えば、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）が記載す るような、ＳＤＳの存在下にポリアクリルアミドゲルの電気泳動］およびモレキ ュラーシーブ材料［例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）］を含をする カラムを通る移動を監視する種々の技術、ならびに炭水化物基と炭水化物に結合 する材料との間の親和性または親和性の欠如に基づく技術を包含する。

「野生型ペプチド」は、エンコーディング（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）配列の源である 有機体のゲノムにおいてエンコードされる配列と同一のアミノ酸配列を有するも のである。

「自然ＧＯＪなどの用語は、それが通常天然に産出するゲノムから自然に産生さ れる、菌・かび源から分離されたＧＯを意味する。

「非自然ポリペプチド」は、それが自然に産生されるもの以外の宿主において産 生されるポリペプチドを意味する。

ここで使用するハイブリダイゼーシ１ンのための「厳格な条件」は、２つの相補 的のハイプリダイゼーシ１ンにおける１以下の塩基の不一致を可能とする条件で ある。種々の程度の厳格さである／Ｓ４ブリダイゼーシａンおよび洗浄の条件は 、この分野において知られており、そして、例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）ら、（１９８２）において論議されている。

ここで使用するとき、「酵母菌」は、子嚢胞子の酵母菌（Ｅｎｄｏｍｙｅｅｔａ ｌｅｓ）、担子胞子の酵母菌および不完全菌類に属する酵母菌（Ｂｌａｓｔｏｍ ｙｓｅｔｅｓ）を包含する。子嚢胞子の酵母菌は、２つの族、スペルモホラセア ユ（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｏｒａｃｅａｅ）およびサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ）に分割される。後者は２つの亜科、シゾサッ力ロミコイデアエ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）［例えば、シゾサツカロミ セス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属１、ナドソニオイデアエ（ Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リボミコイデアｚ（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａ ｅ）ｊ；よびシゾサッカロミコイデアエ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｏｉｄｅａｅ）［例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセ（Ｋｌｕ ｙｖｅｒｏｍｙｓｅｓ）およびサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） ］から構成されている。担子胞子の酵母菌は、次の属を包含する：レウコスポリ ジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドスポリイイウ（Ｒｈｏｄｏｓｐ ｏｒ　ｉ　ｉ　ｉｕｍ）、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、 フィロバシジウム（Ｆ、ｉ　Ｉｏｂａｓｉｄｉｕｍ）およびフィロバシジエラ（ Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅ’１ｌａ）ｅ不完全菌類に属する酵母菌は、２つの族、 スポロボロミセタセアエ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）［例えば 、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏ　ｌｏｍｙｃｅｓ）属、ブレラ（Ｂｕｌｌ ｅｒａ）］およびクリプトコッカセアエ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）［ 例えば、カンジダ（Ｃｎａｄｉｄａ）属］に分割される。本発明とってとくに興 味あるものは、ビチア（ｐｉｃｈｉａ）属１．タルイベロミセ（Ｋｌｕｙｖｅｒ ｏｍｙｓｅｓ）属、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッ 力ロミコイデアエ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏ　１ｄｅａｅ）属お よびカンジダ（Ｃｎａｄｉｄａ）属の範囲内に入る種である。とくに興味あるも のは、次のとおりである：Ｓ、ｃｅｒｂｉｓｉａｅ、Ｓ、ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅ ｎｓｉｓ、Ｓ。

ｄｊａｓｔａｔＩＣｕＳ％ｓ、ｄｏｕｇｌａｓｉｉ、ＩＳ＋ｋｌｕｙｖｅｒｉ％ Ｓ、ｎｏｒｂｅｎｓｉｓおよびＳ、ｏｖｉ　ｆｏｒｍｉｓｅ　クルイベロミセ（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｓｅｓ）属においてとくに興味ある種は、Ｋ、１ａｃｔｉ ｓを包含する。酵母菌の分類は将来変化することがあるので、酵母菌は、次の文 献に記載されているように定義されるであろう、ＢＩＯＬＧＹ　ＡＮＤ　ＡＣＴ ＩＶＩＴＩＥＳ　ＯＦ　ＹＥＡＳＴ　（Ｆ、Ａ、５ｋｉｎｎｅｒ％Ｓ、Ｍ、Ｐａ ｓｓｍｏｒｅ　＆　Ｒ，Ｒ。

Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ編、１９８０）（Ｓａｃ、Ａｐｐ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｓ ｙｍｐ、５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、９）ｅ前記に加えて、当業者は酵母菌の生物学お よび酵母菌の遺伝学の操作を多分知っている。参照、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ 　ＡＮＤ　ＧＥＮＥＴＩＣ３ＯＦ　ＹＥＡＳＴ（Ｍ、　Ｂａｃｉｌａ、　Ｂ、Ｌ 、　Ｈｏｒｅｃｋｅｒ　＆Ａ、Ｏ，Ｍ、　５ｔｏｐｐａｎｉ編−１９７８）；　 ＴＨＥ　ＹＥＡＳＴＳ（Ａ、Ｈ，ｒｅｓｅ　＆　Ｊ、Ｓ、　Ｈａｒｒｉｓｏｎ編 、第２版、　１９８７）；およびＴＨＥ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　 ＯＦ　ＴＨＥ　ＹＥＡＳＴＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ　 ｅｔ　ａ＋、編１９８１）。

ここで使用するとき、「菌・かび（ｆｕｎｇｉ）」は、フィコミセテス（Ｐｈｙ ｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔ　ｅ　ｓ）　、バ シジオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、およびデウテロミセテス（ Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）を包含する。フイフミセテス（Ｐｈｙｃｏｍｙ ｃｅｔｅｓ）の代表的群は、例えば、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ムコル （Ｍｕ　ｃ　ｏ　ｒ）　、および水生菌類を包含する０アスコミセテス（Ａｓｃ ｏｍｙｃｅｔｅｓ）の代表的群は、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ ｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ）、および前述の真の酵母菌を包含する。バシジオミセテス（Ｂ ａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の例は、例えば、キノコ、キビ菌類、および黒糖 病菌を包含する。

夏　１％Ｕ町１」に）ｉｉ二ｍ 本発明の実施において、特記しない限り、この分野の技量の範囲内である、分子 の生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および酵素学の普通の技術を使用するで あろう。このような技術は、文献中に詳しく説明されている。参照、例えば、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｉｔｓｃｈ　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　ＭＯＬＥＣＵＬＡ ＲＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８２）； 　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ　およびＵ　（Ｄ、Ｎ、　Ｇ ｌｏｖｅｒ編、１９８５）　；０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　ＳＹＮＴＨＥ ＳＩＳ（Ｍ、Ｊ、　Ｇａ１ｔｌＷ、　１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＨ ＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ、Ｄ、　ｎａｍｅｓ　＆　Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉ ｎｓ　Ｉ！、　１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＴＲＡＮＳ ＬＡＴＩＯＮ　（Ｂ−Ｄ、　ｉｆａｍｅｓ　＆　Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編１ ９８４）；　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎ ｅｙ編、　１９８６）；　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ。

Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮ Ｇ（１９８４）：　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｉｓｅ。

ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｉｎｃ、）およびとくにＶｏｌ　、１５４および１５５（ＷｕおよびＧｒｏ ｓｓｍａｎ　、およびＷｕ、編、それぞれ）；　ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥ Ｃ丁ＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒお よびＭ、Ｐ。

Ｃａｌｏｓ編、　１９８７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ）；　ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥ ＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ）。

および５ｃｏｐｅｓ、　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ；　ＰＲＩ ＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ。

第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　１９８７）。

すべての特許、親の出願、および上および下に、ここに述べる刊行物は、ここに 引用によって加える。

ＧＯｔ−エンコードするヌクレオチドは、組み換え方法により酵素を産生ずる方 法において使用することができる。

ＧＯ，より詳しくは薗・かびのＧＯｌなおさらに詳しくはアスペルギルスからの ＧＯｌおよびなおより詳しくはＡ、ｎｉｇｅｒからのＧＯをエンコードするＤＮ Ａは、長期の増殖においてＡ、ｎｉｇｅｒから分離されたポリ−Ａ”ＲＮＡを逆 転写することによってつくられたｃ　ＤＮＡライブラリーから分離した。しかし ながら、Ｇｏをエンコードする配列のためのライブラリーをスクリーニングする ためにグローブを発生は問題となる。アミノ酸配列および菌・かびの酵素をエン コードするヌクレオチド配列の両者についてのデータは欠いていた。そのうえｓ 　Ａ　−ｎ　ｉｇｅｒから分離した酵素の配列決定する試みは、自然ポリペプチ ドの最初のｌＯのアミノ酸の配列のみを生じ、Ｇｏをエンコードする配列につい てスクリーニングするｔ；めに使用することができる配列を設計する他のアプロ ーチの案出を必要としｊ；。

ラムダｇｔｌｏライブラリー中でＧＯをエンコードするｃＤＮＡ配列を検出する ために適当なプローブを設計するｔ；めに、Ａ、ｎｆｇｅｒからの自然酵素のオ リゴヌクレオチド断片を決定した。配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプロー ブを２つの方法で設計した。１７〜２３ヌクレオチドのプローブのプローブは、 最低の同義性の領域がらりくった。

あるいは、独特のより長いプローブはコドンのバイアスの推測にに基づく。これ らのプローブの配列は第２図に示されている。

ラムダｇｔｌＯＡ、ｎｉｇｅｒんｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、驚 くべき結果を生じた。第１に、短いプローブのいずれもＧＯｃＤＮＡを含有する クローンの検出に有用であっｔ；。さらに、２つの４２マーのプローブはこれら のクローンの検出に首尾よく使用することができ、４２マーが１つのヌクレオチ ドを除外したサブセットである７２マーは検出に有用ではなかった。Ｇｏ　ｃＤ ＮＡを含有するクローンを検出するために使用することができる４２マーのプロ ーブは、第３図に示されている。　。

４２マーのプローブを使用して、ＧＯポリペプチド、またはその断片をエンコー ドするヌクレオチド配列を含有するラムダｇｔｌＯのクローンが得られた；これ らのクローン中のｃＤＮＡをサブクローニングし、そして配列決定した。Ｇｏ　 ｃＤＮＡの２つのから構成したアミノ酸配列は、それをエンコードするヌクレオ チド配列から推定した。配列がら、成熟タンパク質が５８３アミノ酸から成るこ とを決定することができる二アミノ酸配列は３つのシスティン残基、および８つ のコンセンサスグリフシル化部位のみを含有する。アミノ酸配列中に、２２アミ ノ酸のプレプロ（ｐ　ｒ　ｅ　ｐ　ｒ　ｏ）配列が存在し、単一の塩基の切断部 位が成熟配列の開始に存在する。

第５Ｂ図に示す組み換えポリヌクレオチドは、Ａ、ｎ　１　ｇｅ　ｒからのＧＯ をエンコードする。しかしながら、他の源、とくに他の菌・かび源、よりとくに アスペルギルスの他の種からＧＯは、Ａ、ｎｉｇｅｒがらのＧＯのそれｊ二相同 性である領域を含有することを推定することができる。

相同性の領域は他の源からのＧｏのアミノ酸配列をＡ、ｎｉｇｅｒからのＧＯの それと比較することによって決定することができる；Ｇｏ　ｃＤＮＡ配列から誘 導されたアミノ酸配列は第５Ｂ図に示されている。全体のポリペプチドのアミノ 酸配列を決定することができない場合、オリゴヌクレオチド断片の配列はＡ、ｎ ｉｇｅｒのＧＯの配列と比較することができる：源のコドンバイアスへの情報は 第６図に表されている。こうして、プローブを第５Ｂ図における配列から設計す ることができ、これらのプローブは他の源からのｃＤＮＡライブラリーまたはゲ ノムのライブラリーのスクリーニングして、これらの源からの配列をエンコード するＧＯを検出する。プローブを設計するためのパラメーターはこの技術におい て平均の技量をもつものにとって知られており、そしであるものは実施例に与え られている。通常、プローブは、第５Ｂ図においてＣＤＮＡ配列中の配列と同一 である、少なくとも８つの塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、およびな をよりとくに好ましくは少なくとも４０塩基を含有するであろう。同一性はｃＤ ＮＡの解読または非解読の鎖とであることができる。これらのプローブは、厳格 な条件下に、分離すべき配列をエンコードするＧｏを含有するＤＮＡ二重らせん の適当な鎖とハイブリダイゼーションするであろう。厳格なハイブリダイゼーシ ョン条件は、この分野において知られており、そして、例えば、マニアチス（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）およびメソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ｌ：おいて論じられている。次 いで、プローブで検出された配列をエンコードするＧｏは、クローンし、そして 当業者に知られている技術を利用することｊこよフて分離することができる。参 照、例えば、Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ　（１９８２）、Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ　（１９８ ４）、およびＧｌｏｖｅｒ編（１９８５）。

ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、より殊にｐ、ａｍａｇａｓａｋｉｅ ｎｓｅからのＧｏの一部分をエンコードする配列の分離は、実施例に記載されて いる。分離はここに記載されている組み換えベクター内に含有されているＧｏ　 ｃＤＮＡがら誘導されるプローブを利用して達成された。ペニシリウムのＧｏを エンコードする断片を利用してプローブを誘導すると、ペニシリウム源からっく っｆ；ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａまたはゲノムのライブラリーからのこの菌・かびの酵素を エンコードするポリヌクレオチドの全体の配列を誘導することが可能である。

ｃＤＮＡライブラリーの発生に基づ（Ａ、ｎｉｇｅｒのＧＯをエンコードするＤ ＮＡ構成体を調製する方法を記載レニが、本発明において、このような構成体の 調製はこの方法に限定されない。ここに提供される配列の情報を利用して、ＧＯ をエンコードするポリヌクレオチドの構成体を調製する他の方法を案出すること ができる。例えば、Ｇｏをエンコードするヌクレオチド配列は自動化しｔニー　 Ｄ　Ｎ　Ａ合成を利用して合成することができる。参照、例えば、Ｅｄｇｅ　（ １９８１）　、Ｎａｍｂａ　ｉ　ｒｅｔ　ａｌ−（１９８４）、およびＪａｙ　 ａｔ　ａｌ、（１９８４）。

あるいは、配列の情報の一部分を含有するオリゴヌクレオチドは合成することが できる；次いで、これらはプローブとして使用してゲノムのＤＮＡライブラリー およびｃＤＮＡライブラリーにスクリーニングすることができる。オリゴヌクレ オチドプローブおよびＤＮＡライブラリーを調製する基本方法、ならびに核酸ハ イブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは、当業者袋よく知られて いる。参照、例えば、Ｄ。

Ｐ、Ｇｌｏｖｅｒ　（１９８５）；Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ　＆　Ｈ４ｇｇｉｎｓ編 （１９８５）；Ｍ、Ｊ、Ｇａｔｅ編（１９８４）；Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ ｌ、（１９８２）；およびＢ、Ｐｅ　ｒｂａ　ｌ（１９８４）。

いったんＧｏをエンコードする配列が調製まｔ；は分離されると、それを適当な レプリコン中にクローニングしてベクターをつくり、これｊ二よりＧｏ遺伝子を 含有しないベクターを実質的に含有しない組成物を維持することができる（例え ば、ライブラリーから誘導された他のクローン）。

多数のクローニングベクターはこの分野において知られており、そして適当なり ローニングベクターの選択は選択事項である。組み換えＤＮＡのクローニングに 適当なベクターおよびそれらを形質転換することができる細胞の例は、次のもの を包含するニラムダ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）、 ｐＡｃＹｃｌ　７７　（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）、ｐＫＴ２３０　Ｃグラム陰性バク テリア）、ｐＧＶ１１０６　（グラム陰性バクテリア）、ｐＬＡＦＲｌ　（グラ ム陰性バクテリア）、ｐＭＥ２９０（非Ｅ、ｃｏｌｉグラム陰性バクテリア）、 ｐＨＶ１４　（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉおよびＢ、５ｕｂｔ　ｉ　１　ｉｓ）、Ｙ１ｐ ５　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびウシ乳頭腫ウィルス（＃乳動物細 胞）。参照、一般に、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、（１９８２）、Ｂ− Ｐｅｒｂａｌ　（１９８４）、およびＧｌｏｖｅｒ編（１９８５）。

配列を適当なレプリコン中に挿入し、これにより発現ベクターをつくり、適合性 の宿主細胞を生ずる発現ベクターで形質転換し、そして宿主細胞を増殖および発 現をを可能とする条件下に増殖することによって、Ｇｏをエンコードするポリヌ クレオチド配列は発現する。

発現ベクターをつくるとき、ＧＯ解読配列をベクター中に配置して、それを発現 のために、そして可能なならば分泌のｔ；め、適当な対照配列と操作可能に結合 する。最小において、対照配列はプロモーター、転写停止コドンおよび翻訳停止 コドンを包含する。対照配列に関する解読配列の位置および向きは、解読配列が 対照配列の「制御」下に転写されるようなものである：すなわち、プロモーター は解読配列から誘導されたｍ　ＲＮ　Ａの転写を制御し、そして翻訳を停止する ために使用した停止コドンは転写停止コドンから上流に存在するであろう。

対照配列に加えて、宿主細胞の増殖に関してＧＯの発現の調節をを可能とする調 節配列を付加することが望ましいことがある。グルコースを含有する培地中で増 殖した細胞中でＧＯを発現するとき、これはとくに真実である。なぜなら、ＧＯ により形成した過酸化水素は細胞に対して毒性であるからである。調節系の例は 、調節化合物の存在を包含する、化学的または物理学的刺激に応答して遺伝子の 発現を開始または停止さターを包含するであろう。酵母菌において、これは、例 えば、ＡＤＨ２系を包含することができるであろう。実施例において、Ｓ、ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ中のＧｏの発現は調節ハイブリッドプロモーター、ＡＤＨ２／ ＧＡＰ下にある。調節配列の他の例は遺伝子増幅を可能とするものである。真核 生物系において、゛これらはメトトレキセートの存在下に増幅されるジヒドロフ オレートレダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝 子を包含する。これらの場合において、ＧＯをエンコードする配列は調節要素と 縦に並んで配置されるであろう。

調節要素の他の型は、また、ベクター、すなわち、ＧＯをエンコードする配列と 必ずしも縦に並ばないものの中に存在することができる。エンハンサ−配列、例 えば、ＳＶ４０エンハンサ−配列はこの型である。

エンハンサ−配列はその単なる存在により、それに対して末梢の遺伝子の発現を 増大させる。

ＧＯをエンコードする配列の修飾は、そのレプリコン中への挿入の前または後に 、選択した発現系に依存して、望ましいか、あるいは必要であることがある。例 えば、ある場合において、配列を修飾して、それが対照配列へ組み込まれｔ；と き適当な向きを有するようにすることが必要であることがある。ある場合におい て、宿主有機体からポリペプチドを分泌させ、引き続いて分泌シグナルを切断さ せる配列を付加まｔ；は変化させることは望ましいことがある。実施例において 、Ａ、ｎｉｇｅｒＧｏの自然プレプロ配列を存するか、あるいは酵母菌からのア ルファー因子を分泌シグナルとして使用する、発現ベクターをつくつｔ；。さら に、ある場合において、ゲノムライブラリーから分離した配列からイントロンを 除去し、イントロンの配列の切除が不可能であるか、あるいはイントロンを含有 しない解読配列の発現を許さない系、例えば、原核生物系における発現を可能と することが望ましし−ことがある。後者の＠τヨ１ｎｎｉｓ　ａｔ　ａｌ、（１ ９８５）中に論じられてしする。クローニングを利用してヌクレオチド配列を修 飾する技術はこの分野においてよく知られている。それらは、例えば、制限酵素 、またはＢａ１３１（７）Ｊ：うな酵素を使用して過剰のヌクレオチドを除去す ること、およびアダプターとして使用するために化学的合成しｔ；オリゴヌクレ オチドを使用して、失っ！ユヌクレオチドを置換すること、および部位特異的突 然変異を包含する。参照、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　（１９８２）、Ｇｌｏｖ ｅｒ編（１９８５）、およびＨａｍｅ　ｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４） 。

Ｇｏをエンコードする配列の修飾は、また、ＧＯに実質的に類似するポリペプチ ドの合成に必要であることがある。これらのポリペプチドはある操作した方法で その自然源から分離レニ酵素と異なる。例えば、ＧＯの断片が所望の産生物であ る場合、酵素をエンコードする配列を修飾して、欠失すべきアミノ酸に相当する 望ましくない配列を除去する。ＧＯの活性断片が所望の産生物である場合、欠失 した配列はほとんどアミノ末端および／またはカルボキシ末端の領域に存在する であろう。

あるいは、Ｇｏに実質的に類似するポリペプチドは、ポリペプチドの地理および ／または７オルデイング（ｆｏｌｄｉｎｇ）において修飾を引き起こす宿主中で 自然遺伝子を発現させることによって合成することができる。実施例において、 酵母菌中のＡ、ｎｉｇｅｒ　ＧＯをエンコードする組み換え配列の発現が、それ らの活性を維持する超グリコジル化種に導くことが示された。しかしながら、驚 くべきことには、酵母菌が発現したポリペプチドは自然酵素より大きい熱安定性 を有し、商業的方法におけるその実用性を増加することができる。

Ｇｏの類似体を合成することは、また、重要であることがある。このような類似 体は、例えば、それらの特異的活性、および／またはそれらを分泌する容易さ、 および／またはそれらを精製する容易さを変化することがある。例えば、高度に グリコジル化したポリペプチドはしばしば精製が困難である。実施例におけるデ ータは、Ａ、ｎｉｇｅｒから誘導されたＧｏからの炭水化物の除去はポリペプチ ドの酵素活性に影響を及ぼさないという驚くべき結果を提供する。こうして、例 えば、グリコジル化部位の数を変化させることは望ましいことがある。さらに、 ｃｙｓ残基は突然変異して、組み換えおよび／または修飾したポリペプチドの７ オルデイングを促進するか、あるいは他の性質を変更して、より大きい商業的実 用性をもつタンパク質をつくることができる。例えば、節■Ｖ、Ｉにおいて、位 置５２１におけるシスティンのセリンによる置換はＡ、ｎｉｇｅｒから誘導され た酵母菌が発現した組み換えＧＯの熱安定性を増加することが示されている。

ここにおける実施例において、組み換え的に産生され、そしてＧＯの酵素活性を 示しｔ；、野生型Ａ、ｎｉｇｅｒ　Ｇｏの類似体を記載する。

ＧＯの断片の類似体を合成することは、また、重要であることがある。

活性類似体を包含することができる、このような類似体は、倒えば、ＧＯに対す る抗体の産生において有用であろう。

また、疎水性が異なり、膜またはリポソームとの多少の相互作用を可能とするＧ Ｏの類似体または断片を合成することは、また、重要であることがある。これは 疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸とポリペプチドの外部のドメインのあるものに おいて置換するか、あるいはその逆によって達成することができる。疎水性のこ のような変化は、置換すべき特定のアミノ酸をエンコードする配列を修飾するこ とによって達成される。

Ｇｏを食物の製造において使用する場合において、とくにヒトにおいて、アレル ギー反応を生ずるポリペプチドの免疫原領域を除去することが望ましいであろう 。アレルギーを試験する方法はこの分野において知られている。

ＧＯまたはその断片に実質的に類似するが、活性部位において変更を含有するポ リペプチドは、また、合成することができる。この場合において、酵素をエンコ ードする配列を修飾して、活性部位のアミノ酸をエンコードするコドンが変更ま たは欠失されるようにする。

Ｇｏまたはその断片に実質的に類似するポリペプチドは、また、Ｇ。

配列の一部分またはすべてが他のポリペプチドをエンコードする配列に融合され ているポリペプチドを包含する。融合はＧＯポリペプチドまｔ；は断片のＮ末端 まｔ；はＣ末端において起こることができる。融合タンパク質をつくる技術は、 この分野において知られおり、そして、例えば、ポリペプチドをエンコードする オープンリーディングフレームを結合して、それらがフレーム中にあるようにし 、そして融合したタンパク質の発現が単一のプロモーターおよびターミネータ− の調節下にあるようにする。融合は、また、ポリペプチドを後発現する化学的手 段によりつくることができる。ポリペプチドを融合（または結合）する化学的方 法は、この分野において知られている。参照、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ ｎｚｙｍｏｌｏｇＦｓ 上はＧＯがＧｏをエンコードする配列の修飾により修飾することができる方法の 例である。これらの例は網羅的であることを意味せず、そして当業者は有用であ る他の修飾を容易に決定することができる。これらの修飾のすべては、ヌクレオ チド配列の修飾に関して、上および下に引用する技術および参考文献を使用して 達成することができる。

野生型Ｇｏを包含する、Ｇｏに実質的に類似するポリペプチドをエンコードする 配列は、対照配列に結合して発現カセットを形成した後、発現ベクターを形成す るレプリコン中に挿入することができる。あるいは、解読配列は、すでに対照配 列および適当な制限部位を含有する発現ベクター中に、直接クローニングするこ とができる。

ベクター中の対照配列は、それらが形質転換された宿主と適合性であるように選 択して、分子の発現および／または分泌可能とする。これらの対照配列は混合し こ源からのものであることができる。例えば、下に記載する実施例の１つにおい て、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＡ、ｎｉｇｅｒ　Ｇｏの発現は、完全に異種 の配列、すなわち、酵母菌調節した酵母菌プロモーター、ＡＤＨ２／ＧＡＰ、分 泌のｔ；めの酵母菌アルファー因子、および酵母菌ＧＡＰターミネータ−の制御 下にあった。他の実施例において、制御は部分的に異種のみである、すなわち、 分泌はＡ。

ｎｉｇｅｒからのプレプロ配列により調節されるが、発現の残りは酵母菌配列に より制御された。ＧＯが原核生物中で発現される場合、酵素をエンコードする配 列はイントロンを含まないであろう。

原核生物の発現ベクターを構成するために使用できる、ある数のレプリコンはこ の分野において知られている。参照、例えば、米国特許第４゜４４０．８９５号 、米国特許第４，４３６，８１５号、米国特許第４゜４３１．７４０号、米国特 許第４，４３１．７３９号、米国特許第４゜４２８．９４１号、米国特許第４． ４２５．４３７号、米国特許第４゜４１８．１４９号、米国特許第４，４２２， ９９４号、米国特許第４゜３６６．２４６号、および米国特許第４．３４２．８ ３２号。酵母菌の発現ベクターを構成するＩこめに使用できるレプリコンは、こ の分野において知られている。参照、例えば、米国特許第４．４４６．２３５号 ・米国特許８４．４４３．５３９号、米国特許第４．４３０．４２８号・および ここに記載されている実施例。哺乳動物宿主細胞のための発現ゝフタ−を構成す るために使用できるレプリコンの例は、本出願人によるＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、９２１ ．７３０号に記載されており、その開示をここに引用によって加える。

組み換えＧｏを発現するための好ましい系は、酵母菌、好ましくはＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。ここにおける実施例に記載されているように、こ の系は、とくに野生型Ａ、ｎｉｇｅｒの酵素が酵母菌ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモー ター、酵母菌のアルファー因子、および酵母菌ＧＡＰターミネータ−の制御下に あるとき、比較的高いレベルのＧｏを発現する。

選択しｔ；発現系および宿主に依存して、ＧＯｌＧｏの類似体、またはＧＯの断 片を包含するＧｏに実質的に類似するポリペプチドは、前述の発現ベクターによ り形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドを発現する条件下に、増殖させるこ とによって産生される。次いで、合成したポリペプチドを宿主細胞から分離し、 そして精製する。発現系が増殖培地中に酵素を分泌する場合、タンパク質は培地 から直接分泌することができる。組み換え物理的性質が分泌されない場合、それ は細胞リゼイトから分離する。適当な増殖条件および回収方法の選択は、この分 野において知られている。

新しく合成したポリペプチドの分離は、ポリペプチドを検出することができるア ッセイ系に依存する。これらのアッセイ系は当業者にとって明らかである。例え ば、新しく合成されたポリペプチドがＧＯ酵素活性を示す場合、ポリペプチドは 酵素活性についてアッセイすることによって検出することができる。酵素Ｇｏ活 性についてのアッセイは、下の実施例に記載されている。

まｔ；、Ｇｏを包含するＧｏに実質的に類似するポリペプチドに対する抗体を使 用するイムノアッセイにより、新しく合成されたポリペプチドを検出することは 可能である。この場合において、アッセイにおいて使用する抗体の型は特定の既 知のエピトープの期待する存在または不存在を反映する。イムノアッセイの技術 はこの分野においてよく知られており、そしてＡ、ｎｉｇｅｒからのＧＯに対す るポリクローナル抗体は商業的に入手可能である。

発現されたポリペプチドは分離し、そしてその意図する使用のために必要な程度 Ｊ：精製することができる。精製はこの分野ｊ；おいて知られている技術、例え ば、塩分画、イオン交換樹脂のクロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、 遠心などによることができる。参照、例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹ ＭＯＬＯＧＹおよび５ｃｏｐｅ　（１９８７）、タンパク質の種々の精製方法に ついて。

一般に、ＧＯの組み換え体の産生は、汚染するタンパク質を実質的に含まない、 すなわち、少なくとも９０％の純度のその酵素の組成物の実質的な量を提供する 。高いレベルの純度で実質的な量のポリペプチドを得る能力は、組み換え的に産 生されたポリペプチドを培地中に分泌させる、組み換え発現系の結果である。こ うして、普通の技術を組み換え培養に適用することによって、実質的な純度およ び量のＧＯ組成物を得る二とができる。

不発朋の配列のデータによると、ＧＯの産生は組み換え方法に限定されないこと に注意すべきである。また、それは化学的方法、例えば、固相ペプチド合成によ り合成することができる。このような方法はこの分野において知られている。

Ｇｏを包含するＧｏに実質的に類似する組み換えポリペプチドを使用して、ポリ クローナルおよびモノクローナルの両者の抗体を産生ずることができる。ポリク ローナル抗体を望む場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、 ウマなど）を精製したＧｏまたはその断片、またはその類似体、またはその類似 体の断片で免疫化する。免疫化した動物からの血清を集め、そして既知の方法に 従い処理する。ＧＯに対する抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有 する場合、Ｇｏのポリクローナル抗体を免疫親和性により精製することができる 。

ＧＯＪこ対するモノクローナル抗体を、また、当業者は容易ｌ；産生することが できる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体をつくる一般の方法はよく知 られている。参照、例えば、５ｃｈｒｅｉｅｒ　ｅｔａｌ、（１９８０）、Ｈａ ｍｍｒｅｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）、Ｋｅｎｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、（ １９８０）ｅ　Ｇｏに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、種々の 性質、すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニン グすることができる。特定のエピトープに対して向けられたモノクローナル抗体 は、Ｇｏの相互作用を同定するとき有用である。さらに、モノクローナル抗体は 自然または組み換え的に産生されたＧｏを、免疫親和性を使用して、精製すると き有用である。

ＧｏまたはＧＯに実質的に類似するポリペプチドを治療で使用する場合、ポリペ プチド分子を効率的系に結合してＧＯを適当な部位に供給するようにすることが 望ましいことがあり、そしてこれは、まに、ポリペプチドをタンパク質分解から ゛保護し、同時にポリペプチドの制御した供給゛を引き起こす。分子の供給のｔ ；めの系はこの分野において知られており、そして、例えば、Ｐｏｚｎａｓｋｙ 　ｅｔ　ａｔ、（１９８０）において外観されている。薬物供給系は、例えば、 リポソーム、または特定の標的細胞に対して向けられた抗体を包含する。

ＩＩＩ、一般的方法 源細胞からポリヌクレオチドを抽出し、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラ リーを調製および産生じ、クローンを配列決定するなどのために使用する一般技 術はこの分野において知られており、そしてこれらの技術を記載する実験室のマ ニュアルは入手可能である。しかしながら、一般のガイドとして、このような手 順、およびそれらの実施に有用な材料について現在入手可能ないくつかの源を次 に記載する。

１１１１Ａ、宿主および発現制御配列 原核生物および真核生物の両者の宿主は、表示した宿主と適合性である適当な系 を使用するとき、所望の解読配列の発現のために使用することができる。原核生 物の宿主のうちで、Ｅ、ｃｏｌｉは最もしばしば使用されている。原核生物のた めの発現対照配列は、オペレータ一部分を含有していてもよい、プロモーター、 およびリポソーム結合部位を包含する。原核生物の宿主と適合性の転移ベクター は、例えば、ｐＢＲ３２２、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性を与え るオペロンを含有するプラスミド、および種々のベクター、これらはまた抗体抵 抗性のマーカー与える配列を含有する、から普通に誘導される。普通に使用する 原核生物の対照配列は、次のものを包含する：ペーターラクタマーゼ（ベニシリ ナーゼ）およびラクトースプロモーターｉ（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｍ　１９７７ ）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、 １９８０）、およびラムダ誘導ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リポソーム結合 部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　ｅｔａｌ、、１９８１）およびｔｒｐ！；よびｌａ ｃ　ＵＶ５から誘導されタハイブリッドｔａｃプロモーター（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、１９８３）。解読配列に融合するとき、発現されたポリペプチド を分泌させる配列は、また、知られており、そしてエルウィニア・カロトボラ（ Ｅｒｗｉｎｉａ　Ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）バクテリアのｐｅ　ＩＢ遺伝子（ペク テートリアーゼ）（Ｌｅｉ　ｅｔ　ａｌ−１１９８７）を包含する。前述の系は とくにＥ、ｃｏｌｉと適合性である；しかしながら、必要に応じて、他の原核生 物の宿主、例えば、バチルスまｔ；はシュードモナスの菌株を、対応する対照配 列とともに、使用することができる。

真核生物の宿主は、培養系において酵母菌および哺乳動物の細胞を包含する。Ｓ 、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ、ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓは最も普通に 使用されている酵母菌宿主であり、そして便利な菌）かびの宿主である。酵母菌 の適合性のベクターは、プロトトロフィーを栄養要求変異種にまたは重金属に対 する抵抗性を野生型菌株に与えることによって、首尾よい形質転換体の選択を可 能とするマーカーを有する。

酵母菌の適合性ベクターは、２ミクロンのレプリコン起源（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ 　ａｌ、、１９８３）、ＣＥＮ３およびＡＲ３Ｉの組み合わせ、またはレプリコ ンを確証するための他の手段、例えば、宿主細胞のゲノム中にの適当な断片の組 み込みを生ずる配列を使用することができる。

酵母菌ベクターのための対照配列は、この分野において知られており、そしてグ リコール分解酵素の合成のためのプロモーター（Ｈｅｓｓ　ｅｔ　ａｌｌ、１９ ６８；）（ａｌｌａｎｄ　ａｔ　ａｌｏ、１９８７）を包含し、３ホスホグリセ レートキナーゼのプロモーター（Ｈ４ｔｚｅｍａｎ、１９８０）を包含する。タ ーミネータ−１例えば、エノラーゼ遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ、１９８１）から、 またはグリセルアルデヒド−３ホスフエートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）（参照 、実施例）から誘導されたものを含めることができる。とくに有用な制御系は、 ＧＡＰプロモーターまたはアルコールデヒドロゲナーゼ調節可能なプロモーター 、まｔ；はそのハイブリッド（参照、実施例）、ＧＡＰから誘導されたターミネ ータ−１および分泌を望む場合、酵母菌アルファー因子からのリーダー配列から なるものである。さらに、操作可能に結合した転写調節領域および転写開始領域 は、それらが野生型有機体において自然に関連しないようなものであることがで きる。これらの系は、それぞれ、１９８３年２月２２日、１９８３年８月１２日 、１９８５年７月２９日、１９８６年５月２９日、１９８７年７月１３日、１９ ８７年８月３日、および１９８７年１２月３０日に提出された、Ｕ−Ｓ、Ｓ−Ｎ 、４６８，５８９．５２２，９０９．７６０，１９７．８６８，６３９．０７３ ，３８１．０８１，３０２、および１３９．６８２に詳細に記載されている、そ れらのすべての開示をここに引用によって加える。

発現のための宿主として入手可能な哺乳動物の細胞系は、この分野において知ら れており、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ羅ン（ＡＴＣＣ） から入手可能な多くの免疫化された細胞系を包含し、ＨｅＬａ細胞、チャイニー ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、子供のハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、およ びある数の他の細胞系を包含する。

哺乳動物細胞のための適当なプロモーターは、また、この分野において知られて おり、そしてウィルスのプロモーター、例えば、シミアン・ウィルス４０（ＳＶ ４０）、ロウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）、アデノウィルス（ＡＤ Ｖ）　、およびウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）を包含する。哺乳動物細胞は、ま た、ターミネータ−の配列およびポリＡアデニル化配列を必要とすることがある ：発現を増加するエンハンサ−配列を、また、含めることができ、そして遺伝子 を増幅させる配列はまた望ましいことがある。これらの配列はこの分野において 知られている。

哺乳動物細胞中の複製のために適当なベクターは、ウィルスのレプリコン、また は宿主ゲノム中への適当な配列の組み込みを保証する配列を包含することができ る。

ＩＩＩ、Ｂ１形質転換 形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する任意の既知の方法である ことができ、例えば、ウィルス中のポリヌクレオチドのパッケージングおよび宿 主細胞のウィルスによる形質導入、およびポリヌクレオチドの直接の吸収を包含 する。使用する形質転換の手順は、形質転換すべき宿主に依存する。例えば、Ｇ Ｏをエンコードする発現ベクターによるＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換を 、ここにおける実施例の節において論じる。直接の吸収によるバクテリアの形質 転換は、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理を包含する（Ｃｏｈｅ ｎ（１９８２）；Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ　（１９８２））−直接の吸収による酵母 菌の形質転換は、Ｈｊｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）の方法を使用して実 施することができる。直接の吸収による哺乳動物の形質転換は、Ｇｒａｈａｍお よびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７８）のリン酸カルシウムの沈澱方法、また はその種々の既知の変法を使用して実施することベクターの構成はこの分野にお いて知られている技術を使用する。部位特異的ＤＮＡの切断は、一般にこれらの 商業的に入手可能な酵素の製造業者により特定される条件下に、適当な酵素で処 理することによって実施する。一般に、約１マイクログラムのプラスミドまたは ＤＮＡ配列を１単位の酵素により、約２０マイクロリツトルのＭ配液中で１〜２ 時間３７℃においてインキュベージコンすることによって切断する。制限酵素を 使用するインキュベージコン後、タンパク質ヲフェノール／クロロホルム抽出に より除去し、そして’Ｄ　Ｎ　Ａをエタノール沈澱により回収する。切断した断 片はポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルの電気泳動技術により、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１ことができる。

粘着末端の切断断片は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリポリーゼＩ（クレノー）を使 用して混合物中に存在する適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｃｌ ＮＴＰ）の存在下に平滑末端とすることができる。Ｓｌヌクレアーゼを、また、 使用して、−末鎖ＤＮＡ部分を加水分解することができる。

結合は標準の緩衝液および温度の条件下にＴ４　ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを 使用して実施する：粘着末端の結合は平滑末端の結合より少ないＡＴＰおよび少 ないリガーゼを必要とする。ベクターの断片を結合混合物の一部分として使用す るとき、ベクター断片はしばしばバクテリアのアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡ Ｐ）または仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理して、５″−ホスフェート を除去し、こうしてベクターの再結合を防止する：あるいは、望まない断片の制 限酵素の消化を使用して結合を防止することができる。

結合混合物は適当なりローニング宿主、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉｓおよび、例えば 、抗生物質の抵抗性により選択した、首尾よい形質転換体中に形質転換し、そし て正しい構成体についてスクリーニングする。

ＩＩＩ％Ｄ１所望のＤＮＡ配列の構成 ｃＤＮＡライブラリーから分離したものを包含する、ＤＮＡ配列は、既知の技術 、例えば、Ｚｏｌｌｅｒ　（１９８２）により記載されているような、部位特異 的突然変異により修飾することができる。簡潔的には、修飾すべきＤＮＡをファ ージ中に一本鎖配列としてパッケージングし、そしてプライマーとして、修飾す べきＤＮＡの部分に対して相補的であるかつそれ自身の配列中に含まれる所望の 修飾を有する合成オリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡポリメラーゼで二本鎖 ＤＮＡに転化する。

生ずる二本！１ｌＤＮＡをファージを支持する宿主バクテリア中に形質転換する 。ファージの６鎖の複製を含有する、形質転換されたバクテリアの培養物を、寒 天中に配置してプラークを得る。理論的には、新しいプラークの５０％は突然変 異した配列を有するファージを含有し、そして残りの５０％はもとの配列を有す る。プラークの複製体を、標識した合成プローブに対して、正しい鎖とのハイブ リダイゼーションを許すが、非修飾配列とのハイブリダイゼーションを許さない 温度および条件においてハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーシヨン により同定されｔ；配列を回収し、そしてクローニングする。

１１１、　Ｅ、プローブを使用するハイブリダイゼーシヨンＤＮＡのライブラリ ーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（１９７５）の手順を使用して プロービングすることができる。簡潔的には、この手順において、プロービング すべきＤＮＡをニトロセルロースのフィルター上に固定化し、変性し、モして０ 〜５０％のホルムアミド、０．７５モルのＮａＣ１，７５ミリモルのクエン酸ナ トリウム、０゜０２％（Ｗ／Ｖ）の各ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリド ン、およびフィコール（Ｆｉｃｏｌ　１）、５０ミリモルのリン酸ナトリウム（ ｐＨ６，５）、０．１％のＳＤＳ、および１００マイクログラム／ｍＱ担体の変 性ＤＮＡを含有する緩衝液で予備ハイブリダイゼーションする。

緩衝液中のホルムアミドの百分率、ならびに予備ハイブリダイゼーションおよび 引き続くハイブリダイゼータ１ン工程の時間および温度は、要求される厳格さに 依存する。より低い厳格さの条件を必要とするオリゴマーのプローブは、一般に 、低い百分率のホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼー ション時間で使用する。３０または４０ヌクレオチドを含有するプローブ、例え ば、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａまたはゲノムの配列から誘導されたものは、一般に、より高 い温度、例えば、約４０〜４２℃、および高い百分率、例えば、５０％のホルム アミドを使用する。

予備ハイブリダイゼーション後　５１　１！ｐ標識したオリゴヌクレオチドプロ ーブを緩衝液に添加し、そしてフィルターをこの混合物中でハイブリダイゼーシ ョン条件下にインキュページ震ンする。洗浄後、処理したフィルターをオートラ ジオグラフィーにかけてハイブリダイゼーションしたプローブ上の位置を示す； もとの寒天平板上の対応する位置にあるＤＮＡを所望のＤＮＡ源として使用する 。

ＩＩＩ、Ｆ１構成および配列決定の評価日常のベクターの構成のために、結合混 合物をＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１または他の適当な宿主中に形質転換し、そし て有効な形質転換体を抗生物質の抵抗性または他ｂマーカーにより選択する。次 いで、形質転換体からのプラスミドをＣｌｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９６９ ）の方法に従い、通常クロランフェニコールの増幅（ＣＩ　ｅｗｅ　ｌ　１　（ １９７２））により調製する。ＤＮＡを分離し、そして通常制限酵素の分析およ び／または配列決定により、分析する。配列決定はｍｅｓｓｉｎｇ、ｅｔ　ａｌ 、（１９８１）によりさらに記載されているＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９ ８１）のジデオキシ方法によるか、あるいはＭａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ、（１９８ ０）の方法によることができる。ＧＣにとんだ領域において時には観測される、 バンドの圧縮をともなう問題は、Ｂａｒｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９’８６）に従い Ｔ−デアジグアノシンの使用により克服された。

ＩＶ％衷五堡 本発明の実施例を下に記載する。これらの実施例は例示のみを目的とし、そして 本発明の範囲を限定しない。本発明の開示に照らして、請求の範囲内の多くの実 施態様は当業者にとって明らかとなるであろう。例えば、節」Ｖに記載する手順 は、必要に応じて、反復することができるが、本発明により提供される情報に基 づいて所望のヌクレオチド配列の構成に技術を利用することができるので、必ず しも反復する必要はない。

発現はサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）において例示する：しかしながら、他の系を節１１１Ａにおいて一 層より説明したように利用することができる。

すべてのＤＮＡの操作は、特記しない限り、標準の手順に従って実施した。グル コースオキシダアーゼ以外の酵素は、製造業者の仕様書または供給者の指示に従 い利用した。酵素は、特記しない限り、二ニー・イングランド・バイオラプス（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）またはベセスダ・リサーチ・ラボラ トリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）から入手した。酵母菌は種々の培地を使用して形質転換および増殖し、選択的 培地（ロイシンを含まない酵母菌の窒素に基づ＜）；ＹＥＰＤ培地、１％（Ｗ／ Ｖ）の酵母エキス、２％（Ｗ／Ｖ）のペプトン、および２％（Ｗ／Ｖ）のグルコ ースを含有する：および下に記載するものを包含する。平板培地の場合において 、それは２％（Ｗ／ｖ）の寒天を含有し、そして形質転換のために、３％の上部 の寒天および１モルのソルビトールを含有した。

形質転換に有用なＥ、ｃｏｌｉ菌株は、Ｃｈｉ　１７７６：に１２菌株２９４　 （ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）；ＲＲＩ、ＨＢ　Ｉ　Ｏ１およびＤ１２１０を包 含する。形質転換のために有用な酵母菌菌株は、ＡＢｌｌＯおよびＧＲＦ１８０ を包含する。

酵母菌菌株ＡＢＩＩＯは、遺伝子型Ｍａｔアルファ、ｕｒａ３−５２．１ｅｕ２ −０４、または両者の１ｅｕ２−３および１ｅｕ２−１１２、ｐｅｐ４−３、ｈ ｉｓ４−５８０、ｃ　ｉ　ｒ’をもつ。異なる異種プラスミドを含有するこの菌 株の例は、ＡＴＣＣに１９８４年５月９日に受け入れ番号２０７０９で受託され た。参照、ＥＰＯ’　Ｐｕｂ、Ｎｏ、１６４．５５６゜ 酵母菌菌株ＧＲＦ１８０は、遺伝子型１ｅｕ２’−３，１ｅｕ２−１１２、ｈｉ ｓ３−１１％ｈｉｓ３−１５、ＣＡＮ％　ｃ　ｉ　ｒ’をもつ。この菌株は、そ の内因性の２ミリミクロンのプラスミドの菌株ＧＲＦ１８［欧州特許出願第８５ ８７０１０７０．９号（公開番号０　１８４　５７５）］を、Ｅｒｈａｒｄおよ びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ（１９８３）に記載されているようにｐｃｌ／１または 関係するプラスミドを使用して得ることができる。

ＧＯ活性は、ペルオキシダーゼ−〇−ジアニシジン系をＧＯ触媒反応にカップリ ングすることによって測定した。このカップリングした系に基づ＜Ｇｏについて のアッセイは、シグマ・コーポレーション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ）に上り、およびワーシントン・コーポレーション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ 　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により供給されるＧＯの商用調製物とともに文献に 記載されている。一般に、この反応は水溶液中で緩衝液ｐＨ５，０〜６．０、ベ ーター〇−グルコース、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびＯ−ジアニシ ジンの存在下に実施する。この反応において発生する過酸化水素により染料の酸 化は、４５０ｎｍまたは５００ｎｍにおける光学密度の増加により監視する。Ｇ Ｏ活性のｌ単位は、特定した反応条件下に１分出たり１マイクロモルの過酸化水 素を遊離する酵素の量として定義される。

分離および配列決定 一般に、Ａ、ｎｉｇｅｒからのＧＯをエンコードするｃＤＮＡは、精製したＧＯ のペプチド断片のアミノ酸配列に基づいて発生させたオリゴヌクレオチドプロー ブを使用して、ラムダｇｔｌＯ中で構成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ ングすることによつて得た。

ＩＶ、Ａ％　１％Ａ、ｎｉｇｅｒからのＧｏをエンコードする配列を含有するｃ ＤＮＡライブラリーの調製 ＧＯをエンコードする核酸源を定義するために、アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクシコンから得たＡ、ｎｉｇｅｒの菌株をＧｏの産生についてスクリー ニングした。１つの菌株、とくにＡ、ｎｉｇｅｒ９０２９をｍＲＮＡ源として使 用し、これからｃＤＮＡライブラリーを調製することができた。なぜなら、この 菌株が産生され、そしてＧＯを培地中に分泌することが決定されたからである。

Ｇｏが産生されたかどうかを決定するために、菌株をＹＥＤＰ培地中で増殖させ 、そしてコンデイシーニングした培地中のＧＯ活性を決定した。ＧＯ活性はペル オキシダーゼ−〇−ジアニシジン系をＧＣ系にカップリングすることによって測 定した。

コンディシミニングした培地中のＧＯ存在は、ウェスタン・プロット分析により 、ウサギ抗ＧＯ抗体ｎｏｌｉｍ！物、これはアキュレイト・ケミカルス（Ａｃｃ ｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した、を使用して確証した。

ｃＤＮＡライブラリーは、ＹＥＤＰ培地中の対数期の増殖である、Ａ。

ｎｉｇｅｒ９０２９の菌糸体から分離したポリ−Ａ”ＲＮＡから調製した。第１ に、合計のＲＮＡをＣｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）の手順の変法 により分離した。この方法は、４モルのグアニジウムチオシアネートおよび０． １モルのメルカプトエタノール中で破壊して、タンパク質を変性しかつジサルフ ァイド結合を破壊することを包含する。

次いで、ＲＮＡをＤＮＡおよびタンパク質から、Ｇ１１ｉｓｉｎ（１９７４）に 記載されているように、５．７モルのＣｓＣ１クッションを通す限外濾過により 分離するが、ただしスイングパケットローターと反対１＝垂直のローター（ＶＴ 　ｉ　５０、Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用する。ポリ−Ａ”ＲＮＡの分画は、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）に記載されているよう１；、オリゴｄＴ セルロース上の２回の継代培養を使用して分離した。ポリ−Ａ′″ＲＮＡからの ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの合成およびラムダｇｔｌＯ中のＡ、ｎｉｇｅｒ９ ０２９のポリ＝Ａ′″ＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの発生は、Ｈｕｙｎｔ ｈ　（１９８５）に記載されているように実施する；ｃＤＮＡの合成はランダム プライマーを使用する逆トランスクリブターゼによった。ライブラリーの複合化 は１゜６Ｘ１０’であった。

ジについてラムダｇｔｌｏライブラリーをスクリーニングする！こめに適当なで あるプローブを設計するために、精製したＧｏのオリゴヌクレオチド断片のアミ ノ酸配列を決定した。このプログラムを追跡した。なぜなら、全体のポリペプチ ドのアミノ酸配列を得ようとする試みは不成功に終わり、そして最初のｌＯアミ ノ酸のみの配列を生じたからである。

商業的得られるＧｏは、Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　（１９７０）に記載されている条件 下に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下にポリアクリルアミドゲルの 電気泳動によりさらに精製した。タンパク質をゲルから溶離し、そしてタンパク 質化学において標準の方法である、トリプシンまたは臭化シアン（ＣＮＢｒ）を 使用する消化により断片化した。ＣＮＢｒの消化物は７０％のギ酸であった。ト リプシン消化物はシトラコン酸無水物でＧｏを処理した後突施し、これはりジン 残基を特異的にブロッキングし、トリプシンの特異性を非修飾アルギニン残基に 減少した。タンパク質は典型的には還元し、モしてメルカプトエタノールおよび ヨウド酢酸を使用してカルボキシメチル化し、次いでこれらの処理を実施して存 在するジサルファイド結合を破壊した。

生ずるペプチドをＨＰＬＣにより分離および精製した。ある数の方法を使用した 。アセトニトリルの勾配を使用する中性および酸性の両者の逆相系を使用した。

最初Ｉ：、断片をＢｉｏ−Ｇｅｔ　Ｐ−１０を使用して３０％のギ酸中で大きさ で分離するか、あるいはイオン交換クロマトグラフィーを使用して６モルの原素 緩衝液系中で分離した。ＦＰＬＣＭｏｎｏ−３およびＭｏｎｏ−Ｑカラムを使用 して、配列分析のために断片をさらに分離しｔ；。分析すべきペプチド断片が純 粋であることに確保するために、ＨＰＬＣによる精製は典型的には２回寅施した ；すなわち、精製した断片をＨＰＬＣ手順を反復してさらに精製し１．。ＧＯの ペプチド断片のアミノ酸配列は、製造業者の指示に従い、気相配列決定装置（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。この分析から得ら れた断片の配列は、第１図に示されている。この図面において、括弧はクロマト グラムから読んだときの配列中の不確実性を示し、ただし切断試薬（トリプシン まｌ；はＣＮＢ　ｒ）の特異性から推定したＮ末端におけるＡｒｇまたはＭｅｔ 残基を除外する。

オリゴヌクレオチドプローブを２つの方法で設計した。１７〜２３ヌクレオチド のプローブは、最低の同義性の領域からつくった。あるいは、独特のより長いプ ローブはコドンのバイアスに基づいｔ；。Ａ、ｎｉｇｅＴからのＧＯをエンコー ドする配列を含有するラムダｇｉｌＯライブラリーをスクリーニングするために 設計したプローブは、第２図に示されている。この図面は断片のアミノ酸配列、 および配列から誘導されたプローブを示す。また、オリゴマーのプローブの大き さ、およびより短いプローブについて、同義性の程度を示す。

ラムダｇｔｌｏライブラリーは、上で設計したグローブを使用して、Ｇｏ　ｃＤ ＮＡを含有するクローンについてスクリーニングした。プローブは、Ｕｒｄｅａ 　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）に記載されているようにホスホルアミダイトの化学 を使用する普通の手順に従い、化学的合成によりＮ％した。合成グローブは、” Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３２ｐで標識し た。グローブを標識する方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、（１９Ｂ２） に記載されている。

プローブによるラムダｇｔｌＯライブラリーのスクリーニングは、ｈｕｙｎｈ　 （１９８５）本質的に記載されている通りであった。フィルターを室温において １００．０００ｄｐｍ／ｍｆｆの各プローブ長さ６、長さ７、および長さ８で、 ４ＸＳＳＣ，５０ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８，２ｘデンハルト溶 液、および０．３ｍｇ／ｍ２の超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で一夜ハイブリ ダイゼーシ３ンした。次いで、それらをを４０℃において３．０モルのテトラメ チルアンモニウムクロライド中でＷｏｏｄ　ａｔ　ａｌ−（１９８５）に従い洗 浄し、そして６日間オートラジオグラフィーにかけた。短いプローブのいずれも 、ＧＯｃＤＮＡを含有するクローンの検出に有用でなかった。ライブラリーは、 また、プールとしてプローブ長さ６、長さ７、および長さ８でスクリーニングし た２６日の暴露後、４つの軽二末鎖がスクリーニングした４Ｘ１０’のファージ から得られた。プールで反復スクリーニングすると、これらの４つのクローンは Ｇｏ　ｃＤＮＡについて陽性に止まった０次いで、７アージを３回の反復実験に おいて置換し、そして３つの個々の長いプローブでスクリーニングした。４つの クローンはプローブ長さ７および長さ８とハイブリダイゼーシーンした。しかし ながら、クローンのいずれも長さ６とハイブリダイゼーシ■ンした。この結果は 驚くべきことであった。なぜなら、単一の塩基の変化を除外して、プローブ長さ ７および長さ８は長さ６のサブセットであるからである。（参照、第３図）。

長さ７および長さ８のプローブと結合するｃＤＮＡの２つの陽性のクローンは、 ＤＮＡのサザンブロツテイングの分析により確証であった。

各クローンから分離したＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理し、そしてＭａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）により記載されているように、プローブ長さ７およ び長さ８の混合物を使用して、サザンプロット分析により分析した。各クローン において、単一のバンドのみがプローブと／−１イブリダイゼーシ璽ンした。バ ンド中のｃＤＮＡの大きさは、クローン１〜４について、それぞれ、０．９ｋＢ 、０．９ｋＢ、０．３ｋＢ、および０．７ｋＢであった。

クローン４中のｃＤＮＡが３つの他ののクローン中のそれとオー／（−ラップす る証拠は、クローン４から分離したｃＤＮＡインサートが高し１厳格さの条件下 にクローン１，２および３のＤＮＡインサートとハイブリダイゼーシ胃ンしたこ とを示すことによって得られた。クローン４からのｃＤＮＡインサートをＥｃｏ Ｒｌで切除し、ゲル電気泳動により分離し、モしてニック翻訳により３２Ｐで標 識した。ニック翻訳の方法はＭａｎｉａｔｉｓ　（１９８２）に記載されている 通りであった。他の３つのクローンをＥｃｏＲＩで消化し、１％のアガロースゲ ルの電気泳動にかけ、そしてニトロセルロース上でブロッティングした。ニック 翻訳したクローン４を変性し、モしてｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに ついて前述の条件下ににサザンプロットにハイブリダイゼーシミノしたが、ただ し混合物は５０％のホルムアミドを含有し、そしてインキュベージ１ンを４２℃ において一夜寅施した。次いで、フィルターを６０℃において０．ｌＸ５ＳＣ中 で洗浄し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。

ＩＶ％Ａ、３、Ｇｏ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列クローン１〜４中のｃＤＮＡ は、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７７）の方法により決定した。本質的に 、ｃＤＮＡをクローンからＥｃｏＲＩにより切除し、そしてゲル電気泳動を使用 する大きさの分画により分離しｔ；。ＥｃｏＲＩの制限断片をＭ１３ベクター、 ｍｐｌｇおよびｍｐ１９中にサブクローニングし［Ｍｅｓｓｉｇ（１９８３）］ 、そしてＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ−（１９７７）のジデオキシ鎖の決定方法を 使用して配列決定した。

クローン４からのＤｄｅｌ断片（はぼ７００ｂｐ）のヌクレオチド配列は第４図 に示す。断片の制限酵素地図を第４Ａ図に示す。ヌクレオチド配列、ならびにそ の中でエンコードされるアミノ酸を第４Ｂ図に示す。

制限酵素の部位の位置を、また、第４Ｂ図に示す。クローン４中のＧ。

ｃＤＮＡ断片は、単一のオープンリーディングフレームから成る。アミノ酸配列 の分析により分析されたペプチドの断片の２つはクローン４のＧｏ　ｃＤＮＡ中 でエンコードされるが、ただし２つの３６アミノ酸残基が変更される。断片のア ミノ酸配列は第１図に示されている。

複合ｃＤＮＡは、クローン１８よび２におけるＧｏ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配 列から構成することができ、後者は多分全長のｃＤＮＡクローンである。複合ｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列は第５図に示されている。

第５Ａ図は配列の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。第５Ｂ図はクローンから 誘導された複合ヌクレオチド配列を示し、そして制限酵素部位を示す。また、配 列中でエンフードされるアミノ酸はＭ５Ｅ図に示す。

配列から、成熟タンパク質は５８３アミノ酸から成ることが決定することができ る二アミノ酸配列は３つのシスティン、および８つのコンセンサスグリコジル化 部位のみを含有する。アミノ酸配列において、２２アミノ酸のプレプロ配列が存 在し、単一の基本の切断部位（Ａｒｇ−５ｅｒ）が成熟配列の開始位置に存在す る。

Ｇｏをエンコードする複合ｃＤＮＡが精製したＧｏからのペプチド断片のアミノ 酸配列（参照、節ＩＶＳＡ、２）を複合ｃＤＮＡ中でエンコードされるものと比 較することによって得られた。この比較は第６図に示されており、ここで誘導さ れたアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上にに示されている。精製したＧｏから のペプチド断片中の配列に相当するアミノ酸配列には下線が引かれている。誘導 された配列および精製したＧｏからの断片中の配列における相違は、また、示さ れる。第６図から理解できるように、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ誘導配列と分離されたＧＯ ペプチドのそれらとの間に非常にわずかの差が存在する。

第６図は、また、シグナルペプチドを包含するポリペプチドの分子量、およびＧ Ｏをエンコードするヌクレオチド配列に基づ＜Ａ、ｎｉｇｅｒ中のコドンの使用 についてのデータを表す。

複合ｃＤＮＡ配列から予測することができるように、成熟非グリコジル化Ｇｏは ６３．３００の分子量を有するであろう。成熟ポリペプチドは８つのコンセンサ スグリコジル化部位を含有する。各部位について２ｋＤの炭水化物を仮定すると 、グリコジル化Ｇｏの七ツマ−の分子量は７９ｋＤであろう。これはＧＯモノマ ーの観測される分子量の７５ｋＤと一致する。そのうえ、ｃＤＮＡ配列から誘導 されたアミノ酸の組成は、文献に報告されているアミノ酸組成と一致する。報告 されたアミノ酸組成は、別の実験（示されていない）において確証された。さら に、ここにおける！■に示すように、ｃＤＮＡの発現は活性なグルコースオキシ ダアーゼを生ずる。

ＩＶ、ＢｌＧｏをエンコードするゲノム配列の分離および配列の分析節ＩＶ、Ａ 、２において前述した老すゴヌクレオチドプローブ、および節ＩＶ、Ａ１２に記 載するように分離した、Ｇｏ　ｃＤＮＡのニック翻訳した断片は、Ｅ、ｃｏｌｉ 菌株ＤＨ２中でつくられたｐＢＲ３２２に基づ＜Ａ、ｎｉｇａｒのライブラリー からの、ゲノムのＡ、ｎｉｇｅｒのクローンの分離において使用しｔ：。

ＩＶ％Ｂ％　１％Ａ、ｎｉｇｅｔライブラリーの構成およびＧＯをエンコードす るゲノムのクローンの分離 ゲノムのＤＮＡは、Ｂｏｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）の方法によりＡ、ｎｉ ｇｅｒ９０９２細胞から調製した。ＤＮＡ　（５０マイクログラム）を５ａｕ３ ａで部分的消化を生ずる条件下に処理しく１ｍ１２の体積中の１単位の５ａｕ３ ａ、３７℃において５０分）、そして反応をＥＤＴＡの添加によりクエンチング した。消化したＤＮＡを調製用１％アガロースゲル上で展開し、そして７〜ｌ　 ＯｋＢの大きさの範囲のＤＮＡを分離した。このＤＮＡをＢａｍＨＩで直線化し たｐＢＲ３２２中に結合し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、そしてゲルで 分離した。生ずる結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ中に形質転換しＪそして１０の 太きい平板上に配置した。合計３４０．０００の形質転換体が得られた。プラス ミドＤＮＡは各平板から別々に調製し、はぼ３５，０００の組み換え体を得た。

単一のプールからの６０．０００のコロニーを平板培養し、そして反復実験のニ トロセルロースをつくったｏ　ｃＤＮＡのクローン２からの６００ｂｐのＮｃｏ ｌ−ＥｃｏＲＩの断片をニック翻訳し、そして前述の条件下ににプローブとして 使用した。オートラジオグラフィー後、４つの潜在的なりローンが得られ、その １つの１７ａは後にサザンブロッティングおよび配列の分析により正しいことが 示された。

ゲノムの配列中のイントロンの存在まｔ；は不存在は、制限酵素の消化により得 られたｃＤＮＡおよびゲノムのＤＮＡの大きさを比較することによって決定する ことができる。断片はサザン方法により、ＧＯをエンコードするする配列の検出 にプローブを使用して分析する。

ゲノムのクローン１７ａおよびｃＤＮＡクローンｐＢＲ１ａｍｄａ２Ａの両者を Ｎｃｏｌで消化し、これはｃＤＮＡ中で４回切断し、小さい断片の特定のパター ンを生ずる。両者のアガロースゲルおよびアクリルアミドゲル上の分析後、ＮＣ ０Ｉの制限のパターンは両者のクローンについて同一であることが示された。引 き続いて、クローン１７ａのＤＮＡをＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｓａ　１１、お よびＨｉｎｄｌｌｌで消化した；消化は単独、および対の組み合わせであった。

これらの消化物をアガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてニトロセルロースの フィルターに移した。フィルターをｃＤＮＡの５′半分からの６００ｂｐｆ）Ｎ ｃ。

１−ＥｃｏＲＩ断片で、およびクローン１７ａ中のゲノム配列の３１半分からの ｔｔｏｏｂｐのＥｃｏＲＩ断片でブロービングしｔ；。これらのプローブをニッ ク翻訳により０ｐで標識した。すべての場合において、ゲノムの地図をｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａの地図と一致した。

さらに、Ａ、ｎｉｇｅｒからのゲノムＤＮＡを同一酵素で消化し、ブロッティン グし、そして同一プローブとハイブリダイゼーシヨンしｔ；。

結果はクローン１７ａで見られたのと同一のパターンを生じた。結果が示すよう に、再配置および／または欠失はクローニング手順の間に起こらなかった。

サザンブロッティングによる分析が示したように、プローブにより検出された制 限酵素断片は、Ｇｏ　ｃＤＮＡ、ゲノムのクローン、およびＡ、ｎｉｇｅｒから 分離されたＤＮＡ中のゲノムの配列ｉ：おいて同一大きさであった。これはＧｏ をエンコードするＡ、ｎｉｇｅｒのゲノムＤＮＡがイントロンの配列を欠くとい う驚くべき結果についての証拠を提ＧＯをエンコードする配列の５′末端をフラ ンキングする領域は遺伝子のためのプロモーター配列を含有するすることが、推 定される。この領域およびＧｏのＮＨ２領域をエンコードする隣接する領域は、 ＧＯのゲノムのクローンからのポリヌクレオチド断片として分離され、そして分 離された断片のヌクレオチド配列を決定した。

Ｇｏ遺伝子のプロモーター領域は、ゲノムのクローン１７ａから分離した（参照 、ゲノムのクローンの調製について節ＩＶ、Ｂ、４）。断片をｐＢＲ３２２ベク ターの配列からＥｃｏＲＩおよび５ａｉ１で消化して切断し、そしてほぼ６０９ ｂｐの断片をゲル電気泳動により分離しｔ；。

分離した断片をＨ１３中にクローニングし、そしてジデオキシ鎖停止法により配 列決定しｆ−（参照、節ＩＶＳＡ、３）。この領域の配列を第７図に示す。配列 の制限酵素地図を第７Ａ図に示す：配列、および制限酵素部位を第７Ｂ図に示す 。まｔ；、ゲノムのクローンにおいてエンコードされる、ＧｏのＮＨ，末端領域 のアミノ酸配列を第７Ｂ図に示す。

ＩＶ、Ｃ，酵母菌中のＧｏ　ｃＤＮＡの発現のためのベクターの構成酵母菌中の Ｇｏの産生のための発現ベクターを構成した。これらの発現ベクターにおいて、 Ｇｏをエンコードする３列をＧＯポポリプチドの転写および発現のための配列操 作可能Ｉ：結合した。両者のベクターは調節された転写のためのＡＤＨ２−ＧＡ Ｐのハイブリッドプロモーターを含有する。さらに、分泌を引き起こすために、 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファー因子のリーダー配列まＩ；はＧｏプレプロ 配列を成熟解読配列に融合する。

クローン２からのＧｏ　ｃＤＮＡ　（参照、節工Ｖ、Ａ、２）を、Ｈｉｎｄｌｌ ｌ−ＢｇｌＩＩ断片としてラムダｇｔｌＯから切除した。いくつかのフランキン グするラムダｇｔｌｏ　ＤＮＡを含有するする、生ずる制限断片を、ｐＢＲ３２ ２のＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨ１部位の間に挿入して、ベクターｐＢＲ−ラ ムグーＧＯ２をつくった。９ＢＲ−ラムグーＧＯ２中でＧＯｃＤＮＡ配列を利用 する発現ベクターの構成・のための概要は、第８図に示す。

Ｇｏをエンコードする配列が制御配列に操作可能に結合している、Ｅ。

ｃｏｌｉ中で複製するプラスミド中に含有される発現カセットを次のようにして 構成しｔ；；そしてこれは酵母菌ＡＤＨ２−ＧＡＰハイブリッドプロモーター、 ＧＡＰターミネータ−１そしてＡ、ｎｉｇｅｒのＣＯ遺伝子から誘導された分泌 を包含する。

ｐＢＲｌａｍｂｄａ−２ａ　ＤＮＡを５ａｌｌで消化し、この５ａｔＩはＧＯ解 読配列のＮ末端からほぼ１２０ｂｐを切断し、モしてｐＢＲ３２２中で１回切断 する。成熟ＧＯ解読配列のＮ末端をエンコードする合成二重らせんを調製し、そ してこの消化物に結合した。二重らせんの配列は、次のとおりでありｔ２二 ５’　ＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴ ＧＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＣＧＡＡＧＧＧ ＡＧＧＡＣＴＧＡＣＴＡＧＧＧＴＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＧ 　３　’ ＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡにＣＴ Ｂｇｌ１１部位は、Ａｒｇ−５ｅｔをエンコードする配列中のサイレント突然変 異により、成熟ＧＯのＮ末端に便利に配置された。結合後、混合物をＢｇｌｌｌ およびＰｓｔｌで消化し、そしてＧｏ　ｃＤＮＡのＮ末端の半分を含有する９８ ０ｂｐの断片をゲル電気泳動により分離した。

Ｇｏ　ｃＤＮＡのＣ末端領域を含有する断片は、ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切除し 、切除した断片をクレノーおよび４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート で処理し、そして合成りｇｌｌｌリンカ−を断片に結合することによって分離し た。リンカ−は次ぎの配列を有した：５″　ＧＡＧＡＴＣＴＣ３’ 生ずる断片をＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＴで消化した。この処理後、９５Ｏｂｐで あるＧｏ　ｃＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離した。

９８０ｂｐの断片および９５０ｂｐの断片を結合した。結合をＰｓｔＩおよびＢ ｇｌｌｌの両者から誘導された粘着末端において起こすことができるので、結合 した断片をＢｇｌｌｌで処理し、こうしてＢｇｌ１１部位を形成することができ る粘着末端を含有するＧｏ　ｃＤＮＡを生成した。

ベクターｐＡＧＰＡ１はｐＡＧＰＡｌの誘導体であり、ここでアルコールデヒド ロゲナーゼ−グリセルアルデヒド−３ホスフエートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２ −ＧＡＰ）の調節可能なプロモーターがグリセルアルデヒド−３ホスフエートデ ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターで置換されている。プラスミドｐＰ ＧＡＰｌは、Ｔｒａｖｉｓ　ａｔａｌ、（１９８５）、ＥＰＯ公開Ｎｏ、１６４ ．５５６、およびまた本出願人に係るＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、７６０，１９７．１９８ ５年７月２９日提出に記載されている；これらの参考文献の開示をここに引用に よって加える。ｐ’ＡＣＡＰＩ　ＩＮ、ＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーターをＧＡＰ プロモーターに結合する。プロモーターはｐＪｓ１０３から分離しｔ；１２００ ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｎｃｏｌ断片である。このプロモーターの構成は、Ｕ、Ｓ、 Ｓ、Ｎ、１３９，６３２．１９８７年１２月３０日に提出された、に記載されて いる、この出願は本出願人に係り、そしてその開示をここに引用によって加える 。ＧＡＰターミネータ−はＰＡＧＡＰＩから誘導された９００ｂｐのＢｇｌｌｌ −Ｂｇｌｌｌ断片である。参配列においてエンコードされる制限酵素部位は括弧 内に示されている。

この断片は問題の遺伝子により置換することができる。

ＧＯのシグナル配列を挿入するために、ｐＡＧＡＰｌをＮｃｏｌおよびＢｇｌ目 で消化し、ホスファターゼで処理し、そしてＧｏプレプロ配列をエンコードする 次の合成二重らせんで結合する：Ｘｈｏ１部位をサイレント突然変異により組み 込んでスクリーニングを促進した。生ずるプラスミド、ｐＡＧＳＧｏ、はプレプ ロ配列の下流にＢｇｌｌＩ部位を含有し、この中にＧｏ　ｃＤＮＡ配列を挿入す ることができた。

ｐＡＧＳ、、中のＧｏ　ｃＤＮＡ断片の挿入は、プラスミドをＢｇｌｌＩ８よび ホスファターゼで消化し、次いでＧｏ　ｃＤＮＡを直線化したプラスミドに結合 することによって達成した。生ずるプラスミドはｐＡＧ　Ｓ　ｃｏ　Ｇ　Ｏと命 名した。

ＩＶ、Ｃ，２、ｐＡＧ、、ｈ、ＧＯにおける発現カセットの構成発現カセットの 構成はＥ、ｃｏｌｉ中で複製するプラスミド中に含有され、ここでＧｏをエンコ ードする配列は制御配列に操作可能に結合しており、ＡＤＨ２−ＧＡＰハイブリ ッドプロモーターおよび分泌シグナルとして酵母菌のアルファ・−因子を含み、 次を除外して、ｐＡＧｓＧｏＧＯの構成（節１ｖ、ｃ、ｌ）に類似する。

Ｇｏ　ｃＤＮＡ断片をその中に結合するプラスミドはｐＣＢＲであり、これはｐ ＡＧＡＰｌに類似し、ただしアルファー因子のリーダーがプロモーターとターミ ネータ−との間に挿入されており、独特Ｂｇｌ１１部位はＫＥＸ２のための二項 基の処理部位に位置する（ｌｙｓ−ａｒｇｓまたは１つの文字のコードに−Ｒ） 　。ｐｃＢＲ中７７）Ｇｏ　ｃＤＮＡ断片の挿入から生ずるプラスミドは、ｐＡ Ｇ、、□、ＧＯである。

ＧＯ配列がＧｏポポリプチドの発現および分泌を制御する配列に操作可能に結合 する、酵母菌の発現ベクターは、ｐＡＧＳＣ，。ＧｏおよびｐＡＧ　−ｌ−ｈ　 −Ｇ　Ｏからの発現カセットをＢａｍＨＩで切除し、そして発現カセットをプラ スミドｐＡＢ２４の独特ＢａｍＨＩ中に挿入することによって構成した。

プラス、ミドＰＡＢ２４　（第９図）は、完全な２ミクロンの配列［Ｂｒｏａｃ ｈ　（１９８１））およびｐＢＲ３２２配列を含をする酵母菌のシャトルベクタ ーである。それは、また、プラスミドＹＥｐ２４から誘導された酵母菌ＵＲＡ３ 遺伝子［Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）］およびププラスミドル Ｃ１／ｌ−ら誘導されｔ；酵母菌ＬＥＵ２ｄ遺伝子を含有する。ＥＰＯ公開Ｎｏ 、１１６．２０１゜プラスミドｐＡＢ２４は、ＹＥｐ２４をＥｃｏＲＩで消化し 、そしてベクターを再結合して部分的２ミクロンの配列を除去した。生ずるプラ スミド、ＹＥｐ２４、□ｔＪｉ％をＣ１ａｌによる消化により直線化し、そして Ｃ１ａｌで直線化した完全な２ミクロンのプラスミドで結合した。次いで、生ず るプラスミド、ｐＣＢｏｕ、をＸｈｏｌで消化し、モしてａａｏｓｂｐのベクタ ーの断片をゲル分離した。この分離したＸｂａｌ断片は、ｐｃ１／ｌから分離し たＬＥＵ２ｄ遺伝子を含有する４４６０ｂｐのＸｂａ　１断片で結合した：ＬＥ Ｕ２ｄ遺伝子の構成はＵＲＡ３遺伝子と同一方向である。

酵母菌の発現ベクターを構成するために、発現カセットをｐＡＧＳＧ。

ＧＯおよびｐＡＧ、、、１．ＧｏからＢａｍＨＩで消化して切除し、そしてプラ スミドｐＡＢ２４を同一制限酵素で直線化し、そしてホスファターゼで消化した 。切除した発現カセットをゲル電気泳動により分離した。

直線化したプラスミドをｐＡＧＳＣ，。ＧＯからの発現カセットで結合してベク ターｐＡ　Ｂ　２４　Ａ　Ｇ　Ｓ　ａａＧ　Ｏを生成するか、あるいはｐＡＧ、 、１゜ＧＯからの発現カセットで結合してベクターｐＡＢ２４ＡＧ−＋ｐ４−Ｇ 。

を生成した。

Ｇｏの産生のための発現ベクターの２つのクローンを分離した、すなわち、ｐＡ Ｂ２４ＡＧＳａｏＧＯ−１０１３よびｐＡＢ２４ＡＧａ＋ｐｙＧ。

−１，ベクターを節ＩＶ、Ｃに記載するように構成した。両者のベクターは調節 した転写のためのＡＤＨ２−ＧＡＰハイブリッドプロモーターを含有し、そして Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファー因子リーダー（ｐＡＢ２４．Ｉ□、ＧＯ） あるいは成熟Ｇｏ解読配列に融合したＧｏプレプロ配列（ｐＡＢ２４ｓｃ。Ｇｏ ）を含有する。しかしながら、Ｇｏをエンコードする配列のヌクレオチド配列の 引き続く分析は、これらのクローン中の突然変異配列の存在を明らかにした。

酵母菌菌株ＧＲＦ１８０を、Ｈｉｎｎｅｎ　（１９７８）の方法により、これら のプラスミドの示したクローンで形質転換し、そしてロイシンのプロトドローフ を選択した。形質転換体を８％のグルコースを含有するロイシン選択的培地中に 接種した。接種物を、２％のグルコースを含有するＹＥＰの発現培地中に初期の Ａ、、。−〇、０５に希釈した。培養物を３０℃において３０Ｏｒｐｍで増殖し た；アリコートを２４時間毎に収穫した。細胞をマイクロ７−グ内で１分間１４ ．ＯＯＯｒｐｍで遠心によりコンディジ１ニングした培地から分離し、そして培 地および細胞抽出物中に存在するグルコースオキシダアーゼ活性を、標準として Ｓｉｇｍａから得られたグルコースオキシダアーゼを使用して決定した。細胞抽 出物を細胞をガラスピーズでかきまぜることによって調製した。すなわち、細胞 の沈澱物を等しい体積の酸洗浄したガラスピーズと、１０ミリモルのトリスを含 有する溶菌緩衝液中で混合し、そしてかきまぜの間の氷上で１分間で５Ｘ１分間 かきまぜた。不溶性細胞破片は４℃においてマイクロ７−グ内で１４．００Ｏｒ ｐｍにおいて遠心により除去した。７２時間の増殖後発現した活性グルコースオ キシダアーゼについての結果は、表１に示す。この表において、記号ｒｎｄＪは 活性は決定されなかったことを意味する。

表１％　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ菌株ＧＲＦ１８０中のＧｏの発現プ５７．ミ ド　ｐＡＢ２４　ｐＡＢ２４ＳｃｏＧＯＩ　ＰＡＢ２４−＋−ｈ−Ｇｏ　１０形 質転換体　１　１２　１２ Ｇｏ活性（マイクログラム／ｍＱの培養物）コンディショ ニングした培地　０　５４　６３　５１　３１細胞抽出物　０　５０　ｎｄ　５ ３　ｎ６表１の抵抗性が示すように、発現ベクター中でエンコードされたＧ。

は酵母菌中で発現され、そして高いレベルのＧｏ活性（〉２５マイクログラム／ ｒ１２）は培地中に分泌さ゛れる。検出可能な活性は、ｐＡＢ２４で形質転換さ れた、対照形質転換体から見いだされなかった。高いレベが分泌され、これらの 形質転換体中のＧｏの合計の合成は非常に高い、すなわち、ある場合において＞ １００マイクログラム／ｍ（ｔであることを示唆する。そのうえ、驚くべきこと には、酵母菌のアルファー因子に関して、Ａ、ｎｉｇｅｒからの分泌シグナルは Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける効率よいポリペプチドの分泌であると思われ る。

同様な手順を使用して、ベクターをＧＲＦ　ｌ　８０およびＡＢＩＩＯの形質転 換に使用したとき、ＧＯの発現を比較した。この比較の結果が示すように、菌株 ＧＲＦ１８０は合計の発現およびＧｏの分泌の両者について菌株ＡＢＩＩＯより 好ましい。

ＩＶ、Ｄ、２、発現されたポリペプチドの特性決定Ｉｖｓ　Ｄｓ　２、ａ、発現 されたポリペプチド中の突然変異の検出節ＩＶ、Ｄ、■において発現されたポリ ペプチド中の突然変異の検出は、発現カセット中のＧｏ遺伝子のＮ末端のＤＮＡ 配列の分析により達成した。配列決定した断片はベクターを５ａｌＩおよび５ａ ｃＩで消化して切除し、そしてそれぞれｐ　Ａ　Ｂ　２４　Ｓ　ｃｏＣＯ＝　１ およびｐＡＢ２４、、、、、Ｇ　Ｏ−１０カら誘導された生ずる７５０ｂｐおよ び−９４０ｂ　ｐの片をゲル電気泳動により分離した。生ずる断片をＭ１３ｍｐ １８中にクローニングし、そしてジデオキシ配列決定にかけた。配列をその中で エンコードされるアミノ酸に翻訳し、そしてこれらをｃＤＮＡ中でエンコードさ れる匹敵する配列と比較した。分析の結果を表２に表し、ここでアミノ酸配列は 標準の１文字のコードで表されている。

表２、いくつかの発現プラスミド中のＧｏのＮ末端の配列ｃＤＮＡ：　Ｒ５ＮＧ 工ＥＡＳＬＬＴＤＰＫＤＶＳＧＲｐＡＢ２４ＡＧｓＧＯＧｏ−１：　Ｒ５ＮＧＩ ＥＤＳＬＬよりＰＥＤＶＳＧＲ表２において、最初のＳ残基は成熟ポリペプチド の最初のアミノ末端残基である。ｃＤＮＡ中でエンコードされるものと異なるア ミノ酸配列には下線が引かれている。これらの突然変異は、発現カセットの構成 の間に使用されたオリゴヌクレオチドリンカー中の不純物から生ずる。

ＩＶ、Ｄ、２．ｂ％ＳＤＳの存在下にポリアクリルアミドゲルの電気泳動による 発現されたＧｏポポリプチドの分析二分子の大きさへのエンドグリコシダーゼＨ の効果 ＩＶ、Ｄ、１からの培地の試料の予備的分析は、ＧＯおよびアルファー因子の分 泌シグナル、産生されたＧＯｌの両者は超グリコジル化されていることを示唆し た。これは発現されたポリペプチドの分子の大きさへのエンドグリコシダーゼＨ （Ｅｎｄｏ）（）の効果を分析することによって、さらに検査した。ＥｎｄｏＨ はベーリンガーーマンハイムから入手し、そして供給者の指示に従って使用した 。この酵素はグリコジル化されたポリペプチドの脱グリコジル化を触媒する。

ＧＯの発現は、発現ベクター、ＩＶ、Ｄ、１に記載されているようなｐ　Ａ　Ｂ 　２４　Ａ　Ｇ　Ｓ　ｃ。Ｇｏ−１０およびｐＡＢ２４ＡＧ−＋ｅｈ−ＧＯ−１ を含有するＧＲＦ１８０の形質転換体中であった。各培地のほぼ１ｍＱのアリコ ートをセントリコン−１Ｏ培地を使用する遠心により１０〜２０倍に濃縮した。

濃縮した培地中のタンパク質は、担体として２％のデオキシコレートを含有する ５０％のＴＣＡの１／２体積（ＴＣＡ／ＤＯＣ）の添加により沈澱させた。タン パク質の沈澱物を５０μｇの水中に再溶解し、そして各試料の１／２をＥｎｄｏ Ｈ（１〜２ｍ単位）で処理した。

各試料の他の１／２を同一条件下でであるが、ＥｎｄｏＨの不存在下にインキュ ベージＢンした。参照として、Ａ、ｎｉｇｅｒからの真性グルコースオキシダア ーゼを同一方法で処理した。第２ＴＣＡ／ＤＯＣの沈澱により試料を濃縮した後 、ポリペプチドをＬａｅｍｍｌ　ｉ　（１９７０）により記載されてる条件下に ＳＤＳを含有する８％のポリアクリルアミドゲル上で展開し、そしてゲル上のポ リペプチドをクーマツシー（Ｃ。

ｏｍａｓｓｉｅ）ブルーの染色により可視化した。

ゲルから決定されるように、酵母菌中で発現されたＧＯは超グリコジル化される 。なぜなら、ＥｎｄｏＨ処理の不存在下に、ポリペプチドは標準のＧＯより少な く移動したからである。しかしながら、ＥｎｄｏＨの処理後、酵母菌産生物は６ ８〜７５ｋＤの見掛けの分子量の二重線として移動した：同一二重線はＥｎｄｏ Ｈ処理した標準のＧｏで観測された。

ＥｎｄｏＨ処理の不存在下に、酵母菌アルファー因子リーダーを含有するベクタ ーから発現および分泌されｔ；ポリペプチドは９０〜１２０ｋＤの見掛けの分子 量を有する。このベクターから発現された材料は、ＧＯ分泌配列を使用して酵母 菌から分泌されたＧＯポポリプチドより低い分子量を有しかつ少ない異質性を有 するように思われる。これは、アルファー因子リーダー配列中に３つの追加のＮ 結合グリコジル化部位が存在するという事実にかかわらず、真実である。こうし て、アルファー因子リーダーの制御下の分泌はより効率であることがある。さら に、ＧＯに融合したアルファー因子リーダーの分子量と一致する見掛けの分子量 の物質がＥｎｄｏＨの処理後観測される場合、これはこの融合タンパク質のＫＥ Ｘ２による処理は非常に効率的であることを示唆する。

ＧＯのプレプロ配列がＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて分泌シグナルとして機 能するという発見は驚くべき結果であることに、注意すべきＧｏの活性へのグリ コジル化の程度の効果を決定するために、酵母菌中で発現されかつそれから分泌 された酵素、ならびにＡ、ｎｉｇｅｒから得られた酵素をＥｎｃｌｏＨで消化し た。Ｇｏの酵素活性へのグリコジル基の除去の効果を評価した。

酵母菌中で発現された分泌されたＧｏポポリプチドが得られ、そしてポリペプチ ドを含有するコンディショニングした培地を節ＩＶ、、Ｄに記載されているよう に濃縮した。濃縮後、各試料を３つのアリコートに分割した。１つのアリフート を使用して初期のＧＯの活性を決定しｌ；。残りの２つのアリコートを、３７℃ において一夜、０．２モルのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６，０，１２％のＳＤＳ 、および１ミリモルのフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含 有する１５０μＣの溶液中でインキュベーションした。１つのアリコートをＥｎ ｃｉｏＨとともにインキュベーションし、そして他方をＥｎｄｏＨの不存在下に インキュベーシヨンした。インキュベーション後、ＧＯ活性を３つのアリコート の各々中で決定した。さらに、アリコートの部分をＴＣＡ／ＤＯＣで沈澱させ、 そしてＳＤＳの存在下に８％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動によりそして した。　結果（示さず）は次のとおりであっｔ；。

ｌ）組み換え酵母菌から分泌されたポリペプチド中のＧＯ活性、ならびにＡ−ｎ ｉｇｅｒからのそれは希釈ＳＤＳ中の３７℃において２０時間安定である。２） Ｅｎｄｏ）（による処理はＧｏ活性のいずれをも不活性化せず、これは未処理試 料のそれの２０％の範囲内であった。３）はそれ自身のプレグロ配列の制御下ｌ ２酵母菌から分泌されたＧｏは、アルファー因子配列の条件下に分泌されたもの よりも非常に高度にグリコジル化される。前者の見掛けの分子量は１００〜２０ ０ｋＤの範囲内であるが、後者のそれは７５〜１５０ｋＤの範囲内である。４） ＥｎｄｏＨで処理後、試料中の活性において変化は見られなかっｌ；（すなわち 、酵母菌中で発現された試料からか、あるいはＡ、ｎｉｇｅｒからの標準のＧｏ から）。ＥｎｄｏＨ処理後最終度生物はＧｏについての炭水化物の含量に関する かぎり本質的に同一の分子であるので、酵母菌中で発現された産生物の超グリコ ジル化は酵素活性について効果をもたないことが結論することができる。

ＧＯ活性がＧｏポポリプチドのグリコジル化の程度に相対的無関係であったとい う結果は、驚くべきことであった。他のタンパク質（例工ば、組織のプラスミノ ゲン活性化剤）のための報告されていることによると、酵母菌中で発現されたポ リペプチドの超グリコジル化は生物学的活性を寅質的に減少する。Ｖ、ＭａｃＫ ａｙ、”５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ 　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ”、Ｂ１０ＬＯＧＩＣＡＬ　ＲＥＳＥＡＣＨＯＮ　ＩＮＤＵ ＳＴＲＩＡＬＹＥＡＳＴＳ、Ｖｏ　１．Ｉ　Ｉ　Ｉ％ｐｐ２７−３６、（ＣＲＣ ＰｒｅｓｓｌＢｏｃａ　Ｒａｔｏｎ％Ｆｌａ）。

野生型グルコースオキシダアーゼの発現ベクターを構成するために、突然変異プ ラスミドからのＳａ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉの１．９ｋｂの断片を分離し、そ して正しいＮ末端の配列をエンコードする新しく合成されたオリゴマーで結合し た。オリゴマーの配列は、発現カセットの構成について上に示した。断片はＢｇ ｌｌｌで消化し、そして正しい遺伝子は発現ベクター中に挿入した。ＤＮＡ配列 の分析は、生ずるベクターがＮ末端に正しい配列を含有することを示しｔ；。

これらのベクターのクローンを分離し、そして分泌制御要素として、それぞれ、 Ａ、ｎｉｇｅｒのプレグロ配列およびアルファー因子配列を含有するベクター１ ｍ−）いてｐＡＢ２４ＡＧｓＧｃｌ、ｌ：びｐＡＢ２４ＡＧ＠Ｇｏ、！：命名す る。ベク’）−ｐＡＢ２４ＡＧＳＧＯは、また、ｐｓｃ。

２（またはｐｓＧｏ−２）　である；ベク’１−ｐＡＢ２４＠Ｇｏ　（ｐＡＢ２ ４．１．に、Ｇｏ）　ｌｅｔ、また、ｐ＠Ｇｏ−１（ｐ−６１ｔＴｈａＧＯ−１ ）と呼ぶ。

ｐｓｃｏ−２およびｐ＠Ｇｏ−１の制限酵素地図をそれぞれ、第１１図および第 １２図に示す。

野生ＷＧＯをエンコードする配列を含有する発現ベクターで形質転換された、Ｓ 、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現されｔ：、Ｇｏ活性の量を決定した。

菌株ＧＲＦ１８０を、クローニングしたＰＡＢ２４ＡＧＳＧＯまたはｐＡＢ２４ ＡＧ＠Ｇｏで形質転換した。形質転換はＨｉｎｎｅｎ　（１９々の形質転換体の 接種培養物を、８％のグルコースを含有する２ｍＱのロイシン選択的培地中で形 質転換体を４８時間増殖することによってつくった。引き続いて、接種物をＡ。

。−０，０５に非選択的培地で希釈し、そして３０℃において３００ｒｐｍで９ ６時間増殖した。増殖後、細胞をコンディショニングした培地からマイクロフー プ中で１分間１４゜００Ｏｒｐｍにおいて遠心により除去し、そして培地中に存 在するＧ。

活性を決定した。

２つの発現ベクターからの酵母菌中で発現され、そしてコンディショニング培地 中に分泌されたグルツースオキシダアーゼ活性の結果を、表３に表す。この表に おいて、Ｇｏ活性はマイクログラム／ｍＱの培養物で表されている。

プラスミド　ｐＡＢ２４　ｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏ　ｐＡＢ２４＠Ｇ。

形質転換体　１　１　２　１２ ＧＯ活性　０　１４８　１７９　２０２　１７０表３に示す結果を表１における ものと比較すると、酵母菌中で発現された野生型ＧＯは突然変異体Ｇｏより高い 比活性を有するか、あるいは酵素は突然変異体よりも高いレベルで発現されるこ とが示唆される。

ＩＶ％Ｇ、２、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動により発現されたポリ ペプチドの特性決定：ＥｎｄｏＨの効果発現ベクターｐＡＢ２４ＡＧｓＧＯｊ； よびｐＡＢ２４ＡＧ＠Ｇｏを含有する酵母菌の形質転換体の培養物を、節ＩＶ、 Ｇ、１に記載するように増殖した。増殖後、細胞を遠心により収穫し、そしてコ ンディショニングした培地中のＧｏ活性を決定した。ｐＡＢ２４ＡＧＳＧＯおよ びｐＡＢ２４ＡＧ＠Ｇｏを含有する形質転換体からの培地は、それぞれ、１９０ μｇ／ｍＱおよび２６０　ｐ　ｇ／ｍＱのＧｏ活性を存した。

ＥｎｄｏＨによる消化前に、ＧＯポポリプチドを部分的に精製した。

培地を０．０１モルのアセテートｐＨ４，５で１０倍に希釈し、モしてＤＥＡＥ −セルロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通過させた。

装入後、カラムを同一緩衝液で洗浄し、次いでＧｏを０．１モルのアセテートｐ Ｈ３，７で溶離した。

部分的精製の前および後の両者に、酵母菌から発現されたＧｏポポリプチドを、 ＥｎｄｏＨで一夜３７℃において消化した。消化の条件は節ＩＶ、Ｈに記載され ている通りであったが、ただし５０μｇのアリコートの試料を消化した；対照試 料をＥｎｄｏＨの不存在下に消化条件下にインキュベーションした。インキュベ ーション後、試料をＴＣＡで沈澱させ、アセトンで３回洗浄してＴＣＡを除去し 、そして１２．５μａの当量のもとの体積の各試料を８％のポリアクリルアミド ゲル上に装入した。ゲルを通す電気泳動はＳＤＳの存在下に還元条件下に、Ｌａ ｅｍｍｌ　ｉ　（１９７０）に記載されているように実施した。ゲル中のポリペ プチドはクーマツシー（Ｃｏ　ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）ブルーで染色すること によって検出した。ゲルの写真を第１０図に示す：種々のレーンにおける試料を 表４に記載する通りであり、この表は試料中のＧｏの量を示す。コノ表において 、十の記号は試料をＥｎｄ　ｏＨで処理したことを意味する。

−の記号は試料をＥｎｄｏＨの不存在下に消化条件下にインキュベーションした ことを意味する。試料の後の括弧中の数字は、ＤＥＡＥ−セルロースのカラムか ら溶離された分画の数を示す。対照として、Ａ、ｎｉｇｅｒからのＧｏをＥｎｄ ｏＨの存在または不存在下に消化条件下にインキュベーションした。

レーン　誘導されたＧｏ　ＥｎｄｏＨＧｏの量Ｃｐｇ）３　ｐＡＢ２４人ＧＳＧ Ｏ（ｍｅｄｉａ）　−２，４４ｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏ（ｍｅｄｉａｌ　＋　２． ４５　ｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏ（ｆｒ、２）　−３，７６ｐ、ｔＪｉｉ２４ＡＧｓ Ｇｏ（ｆｒ、　２　）　＋　３　、７７　ｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏ（ｆｒ、３）　 −８，１８ｐＡＢ２４人ＧＳＧＯ（ｆｒ、３）　＋　８．１９　ｐＡＢ２４ＡＧ ｓＧｏ（ｆｒ、４）　−１，４１０ｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏ（ｆｒ、４）　＋　１ ．４１１　ｐＡＢ２４ＡＧ＠Ｇｏ（ｍｅｄｉａｌ　−３，２１２ｐＡＪ２４ＡＧ ｌ！Ｇｏ（ｍｅｄｉａｌ　＋　３．２１３　ｐＡＢ２４ＡＧ＠Ｇｏ（ｆｒ、２） 　−２，５１４、ｐＡＢ２４ＡＧ＠Ｇｏ（ｆｒ、２）　＋　２．５１５　ｐＡＢ ２４ＡＧ＠Ｇｏ（ｆｒ、３）　−１８，８１６ｐＡＢ２４ＡＧｅＧｏ（ｆｒ、３ ）　＋　１８．８第１０図中のゲル中に示されている結果は、大量のＧｏタンパ ク質が作られていることを確証する。酵母菌の培地の１２μｇのみの当量をレー ン４および１２に含まれ、そして標準に比較して＞＞０．２μｇの酵素はゲル中 に存在するので、活性の結果は正しく、そして２００ｍｇ／Ｑより多いＧＯを分 泌し、そして酵母菌糸中に発現される。

ＩＶ、Ｇ、３、Ａ、ｎｉｇｅｒからの自然ＧＯに比較したｐＡＢ２４ＡＧＳＧＯ から発現されたポリペプチドの熱安定性精製した組み換えＧｏポポリプチドの熱 安定性はｐＡＢ２４ＡＧＳＧＯから酵母菌中で発現され、そしてＡ、ｎｉｇｅｒ から精製した自然ＧＯを熱変性の研究により比較した。

節ＩＶ１Ｇ％　ｌに記載されているようにｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏから発現された 組み換えポリペプチドを、ｐａｚｕｒおよびＫｌｅｐｐｅ　（１９６４）の方法 の変法により精製した。酵母菌細胞を遠心により除去し、そしてコンディショニ ングしたＹＥＰ培地を０．０１モルの酢酸ナトリウムｐＨ４，５で１０倍に希釈 した。この物質を同一緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ　Ｆｌ ｏｗカラム（２０ｍｃ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。次いで、カラムを ３体積の平衡化緩衝液で洗浄し、そして酵素を０．１モルの酢酸ナトリウム（ｐ Ｈ３，７）で溶離した。ＧＯ活性を含有する分画をプールし、そして限外濾過に より濃縮した。Ａ、ｎｉｇｅｒから精製した自然ＧＯはシグマ中コーボレーシＢ ン（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｒｐ、）から得た（型５）。組み換えＧＯおよび自然Ｇｏ の両者を、０．１モルのクエン酸塩−リン酸塩ｐＨ５，５中の０．１ｍｇ／ｍＱ の濃度で、本質的にＭａｌｉｋｋｉｄｅｓおよびＷｅ　ｉ　１　ａｎｃ！　（１ ９８２）に記載されている条件を使用してインキュベーションした。酵素の試料 を６５℃においてインキュベーションし、アリコートを種々の時間に除去し、そ してリン酸塩緩衝液ｐＨ５，５中に１０倍希釈した。次いで、希釈した試料中の 酵素活性を、本質的にＫｅｌｌｅｙおよびＲｅｄｄｙ　（１９８６）の方法によ り、次の修飾を使用して、決定しｔ；。アッセイはｌ−０ｍ１２のＯ，１モルの リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０，０，２ミリモルの０−デアニシジン（Ｓ　 ｉ　ｇｍａ　Ｃｏｒｐ、）、１０μｇのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｂ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈａｅｉｍ　Ｃｏｒｐ＋）および９．５ミリモルの Ｄ−グルコースを含有する、中で実施した。アッセイはＧＯ（１〜３０　ｎ　ｇ ）の添加により開始し、室温において２０分間インキュベーションし、次いで０ ．１ｍｆｆの４ＮのＨ，Ｓｏ、の添加によりクエンチングした。次いで、生ずる 還元した０−ジアニシジンを４００ｎｍにおいてシミズ（Ｓｎｉｍｉｚｕ）ＵＶ −１６０ｍリーダー（７ｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕ　Ｉ　ｔ　ｉ　５ｃａｎ）で測定 した。酵素の量は吸収対酵素の量の標準曲線に関してＧｏのｎｇとして計算しｔ ；。熱安定性の研究の結果を第１３図に示し、ここで残留する酵素活性の百分率 は高温におけるインキュベーションの時間に対してプロットされている（閉じた 正方形、酵母菌中で発現されたＧＯ；閉じたダイヤモンド形、自然Ｇｏ）。

第１３図中のデータが示すように、０．０４／分の擬−次速度定数は自然酵素活 性の崩壊について得られ、これに対して酵母菌中で発現された酵素は０．０１２ ／分の速度定数を有する。こうして、超グリコジル化された、酵母菌中で発現さ れた酵素は、Ａ、ｎｉｇｅｒから自然酵素より実質的に熱安定性である。

Ａ、ｎｉｇｅｒは有意の量のＧｏを産生ずる。前述の研究が示すように、１ｍｇ ／Ｑの有意に多くが発現され、そして比較的低い細胞密度で分泌される。さらに 、タンパク質はＡ、ｎｉｇｅｒの粗製リゼイト中でウェスタン・プロッティング により分泌され、酵素は合計の細胞タンパク質の〉０．１％を表すことを示唆す る。こうして、この酵素について比較的大量のｍＲＮＡが増殖の対数期および／ または静止期の間にＡ。

ｎｉｇｅｒ中に存在するであろうことが期待されるであろう。これらのｍＲＮＡ が検出可能であるかどうかを評価するために、クローン１．２および４からのｃ ＤＮＡ　（節ＩＶ、Ａ、２および節ＩＶ、Ａ、３）を、対数期の増殖の間に分離 したＲＮＡのノザンプロットのためのプローブとして使用した。

ＲＮＡのノザンブロツティングを、本質的にＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ−（１ ９８２）に記載されてい゛るように、次のように実施した。

増殖の対数期にあるＡ、ｎｉｇｅｒから分離したポリ−Ａ”ＲＮＡ　（５μｇ） をグリオキサルで変性し、そして１％のアガロースゲルの電気泳動にかけた。Ｒ ＮＡをニトロセルロースのフィルターに移し、そしてサザンブロッティングにつ いて前述の条件下に、ｃＤＮＡのニック翻訳した１、ｌｋｂのＥｃｏＲＩ断片で プロービングした。グローブでハイブリダイゼーション後、フィルターを６０℃ においてＪＸＳＳＣ中で洗浄した。１週間オートラジオグラフィーにかけた後、 バンドを検出した。

対照寅験は、ＲＮＡが完全であり、そしてゲルからフィルターに効率的に移され たことを示した。

結果が示唆するように、ＧｏをエンコードするｍＲＮＡは対数期においてＡ、ｎ ｉｇｅｒの細胞において非常に稀である。このような大量のＧＯのタンパク質が 合成されるので、この結果は驚くべきことである。

それはｃＤＮＡライブラリーからのＧＯをエンコードするヌクレオチド配列を得 ることＩ：８ける困難を説明しうる。

位置１６４．２０６、および５２１に村ける３つのシスティンのコドンの各々が セリンで置換されｔ；、グルコースオキシダアーゼをエンコードする突然変異し た配列を、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）に記載されているように、 本質的にＥｃｋｓｔｅｉｎの方法を使用する部位特異的突然変異により調製した 。

まず、ＧＯの３′非非翻訳列が欠失されているｐＡＢ２４ＡＧＳＧＯの誘導体を 調製した。これを達成するために、ｃＤＮＡクローン４からの３′の半分のＧｏ 遺伝子（第４図に記載されている）を、Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片としてＭ１３ ｍｐ１９中にサブクローニングした。２つの隣接するプライマーを使用して、合 計７つの突然変異をＧＯ遺伝子の３″末端に導入した。隣接するプライマー配列 は次の通りであった（突然変異には下線を付しである、制限酵素部位はプライマ ー配列より上に示されており、そしてその中でエンコードされるアミノ酸はプラ イマー配列より下ｊ二括弧で示されている）：ＧＯｃＤＮＡの３′の半分を包含 する生ずるＰｓｔｌ−Ｂｇｌｌｌ断片を、遺伝子の５°の半分からなるｐＡＢ２ ４ＡＧＳＧＯからのＢｇｌｌｌ−Ｐｓｔｆ断片と結合し、そしてこれらをＢｇｌ ［で処理しそしてリン酸化した同一プラスミド中に結合した。生ずるプラスミド はｐｓＧＯ３である。

ＳｅｒコドンがＣｙｓコドンと置換されている突然変異体を、次のプライマーを 使用して作った： ＧＯＣ１６４Ｓ：　５’　ＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＴＴ ＧＡＡＧＴＡ　３’ＧＯＣ２０６Ｓ＋　５’　ＧＧＧＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣ ＧＭＡＴＣＴＴＴ　３’ＧＯＣ５２１Ｓ：　５’　ＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧＭＣ ＴＡＧＴＡＣＣｃＡＣＧＣＣ３’。

プラスミドｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏからの発現カセットの５′半分を、ＡｈａｌＩ Ｉ−ＰｓｔＩ断片としてＭｌ　３ｍｐ　ｌ　９中にサブクローニングした。最初 の２つ（ＧＯＣ１６４ＳおよびＧＯＣ２０６Ｓ）をこの鋳型とともに使用した。

ＧＯＣ５２１Ｓプライマーを鋳型上で使用し、前述のように、これをｐｓＧＯ３ の発生のために使用した。りａ−ユング後、プライマーを引き続いてプローブと して使用して、突然変異した配列を含有するプラークを分離した；陽性の全体の インサートを配列決定して、所望の突然変異体のみが得られることを評価した。

次いで、突然変異体をｐＳＧＯ３に類似する発現ベクター中に再構成したが、た だしこれらのベクターは規定された突然変異をもつヌクレオチドの配列を含有し た。

Ｃｙｓ１６４、Ｃｙｓ２０６、およびＣｙｓ５２１を含有するベクターを、それ ぞれ、ｐｓＧ０３ｃ１６４Ｓ　（また、Ｃ１６４Ｓと呼ぶ）、ｐＳＧ０３Ｃ２０ ６Ｓ　（また、Ｃ２Ｑ６Ｓと呼ぶ）およびｐＳＣ；０３Ｃ５２１Ｓ（また、Ｃ５ ２１Ｓと呼ぶ）と命名する。

ＩＶ、Ｉ、２、酵母菌中の発現ベクターをエンコードするＧＯ然変異タンパク質 の発現 ｐｓｃｏ３ｃ１６４ｓ、ｐｓＧＯ３ｃ２０６ｓおよびｐｓＧＯ３ｃ５２１５中で エンコードされるＧＯ突然変異タンパク質の発現、およびｐＳＧＯ３中の野生製 遺伝子の発現は、酵母菌菌株ＧＲＦ１８０の形質転換体中で実施した。形質転換 および発現は本質的に節ＩＶ、Ｄに記載されている通りであったが、ただし上に 列挙したベクターを使用した。位置１６４，２０６および５２１における自然シ スティン残基えおセリンに変化する突然変異の発現および／または分泌および／ または活性への（μｇ／ｍり ｐｓＧＯ３３００ ＰＳＧＯ３Ｃ１６４Ｓ　（１０ ｐｓＧＯ３ｃ２０６ｓ　ｃｌ。

ｐｓＧＯ３ｃ５２１ｓ　１００ 結果から理解されるように、ｐｓＧＯ３ｃ１６４ｓおよびｐｓＧＯ３Ｃ２０６Ｓ の発現から分泌されたＧｏ活性は検出できなかった。ｐＳＧ０３Ｃ５２１Ｓの発 現から生ずる分泌されたＧｏ活性のレベルは、ｐｓＧＯ３の発現のそれに関して 多少減少した。これらの結果から結論されるように、Ｃｙｓ１６４およびＣｙｓ ２０６はＣＯの発現／分泌および／または活性のために必要である。

熱安定性を、Ａ、ｎｉｇｅｒからの自然Ｇｏのそれと比較した。熱安定性の研究 は、本質的に節ＩＶ、Ｇ、３に記載されているように実施した。

結果を、高温におけるインキュベーション後に残る活性の百分率対時間としてプ ロットして、第１４図に示す（自然酵素、正方形；ポリペプチドをエンコードし たｐｓＧＯ３ｃ５２１　Ｓ、ダイヤモンド形）。結果に基づいて、不活性のため の速度定数の推定は０．０１／分より小さい。

この突然変異タンパク質とＡ、ｎｉｇｅｒからの自然ＧＯの熱安定性ならびにｐ ＡＢ２ＪＡＧＳＧＯ中でをエンコードされたポリペプチドのそれとの比較は、ｐ ｓＧ０３ｃ５２１ｓ突然変異タンパク質が３つのＧ。

酵素のうちで最も熱安定性であることを示唆する。

ＧＯをエンコードするゲノムＤＮＡを、次のようにしてＰ、ａｍａｇａｓａｋｉ ｅｎｓｅから得た。Ｐ＋ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ：アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクションから得た）をＹＥＰ培地中で増殖し、そしてＤＮＡを本 質的にＢｏｅｌ　ｅｔ　ａｔ、（１９８４）に記載されているように調製した。

分離したＤＮＡを種々の制限酵素・すなわち、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｂ ａｍＨＩ％５ａｌｌ、ＰｓｔＩ、およびＸｈｏｌで消化し、そしてニトロセルロ ースへプロッティングしｔ；。プロットをプラスミドｐＡＢ２ＪＡＧＳＧＯ中に 存在するＡ。

ｎｉｇｅｒのＧｏのランダムプライム標識したＬ　９ｋＢのＢｇｌ、ＩＩ断片で ブロービングした。ハイブリダイゼーションは２０％のポルムアミドおよび１０ ％のデキストラン硫酸中にプローブを含有する混合物で、４２℃において一夜実 施した。次いで、フィルターを５０℃においてｌＸ５ＳＣ，０，１％のドデシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液で洗浄し、そして−夜オートラジオグラフィー にかけた。オートラジオグラフは各レーン中の単一の特異的バンドを示し、Ａ、 ｎｉｇｅｒのＧｏ遺伝子に対して相同性である単一の遺伝子はＰ、ａｍａｇａｓ ａｋｉｅｎｓｅゲノム中に存在することが示唆された。とくに、それぞれ、２． ４ｋＢおよびｌ−９ｋＢのＢａｍＨＴ断片およびＨｉｎｄｌｌ！断片が見られた 。

ＢａｍＨＩ断片をクローニングするために、２０μｇのペニシリウムＤＮＡを制 限酵素で消化し、そして２゜３〜２．６ｋＢの大きさの範囲で電気泳動された断 片をゲルから分離した。この調製におけるＤＮＡを、Ｂａｍ４１１で処理しかつ リン酸化したｐＢＲ３２２中に結合した。分離したプラスミドＤＮＡのアリコー トをＥ−（ｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換すると、はぼ１０１のアンピシリ ン抵抗性コロニーが産生じ、その８５％はそれらの試験表現型のｔ；めに組み換 え体であることが予測された。潜在的に組み換え体のコロニーを２回の反復実験 においてニトロセルロースのフィルターに移し、そしてｐＡＢ２４ＡＧｓＧｏか らの前述のＧｏプローブとハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーショ ンは３７℃においてで１０％のホルムアミドおよび１０％のデキストラン硫酸で 実施した。フィルターを５０℃においてＩｘｓｓｃ、ｏ−１％のＳＤＳの溶液中 で洗浄し、そして３日間オートラジオグラフィーにかけた。６つの潜在的に陽性 のクローンが同定され、取り上げ、そしてそれらのプラスミドＤＮＡを調製した 。これらのクローンの５つは２゜３〜２．６に８０′）ＢａｍＨＩインサートを 含有し、そして引き続くサザンプロット分析はそれらの３つが同一であることを 示した。代表的プラスミド、その制限酵素地図は第１５図にに示す、をｐ　Ｂ　 Ｒｐ　ＧＯＸＡ　１１と命名する。

ｐＢＲｐＧＯＸＡｌ　ｌ中のＢａｍＨＩインサートの配列決定は、次のようにし て達成した。分離したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、はぼ２．５ｋＢ の断片を分離し、そしてさらにＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで消化した。次いで、断片の 混合物をＭ１３中に結合し、そして潜在的に組み換え体のプラークからのＤＮＡ を配列分析した。１つのこのようなりローンから生ずる配列、ｐＢＲＡｌ　１、 を第１６図に示し、ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は全体の４ ４５ｂｐの断片を通じて明らかである。

第５Ｂ図に示すヌクレオチド配列中でをエンコードするされたＡ、ｎｉｇｅｒの ＧＯのアミノ酸配列と、ｐＢＲｐＧＯＸＡｌ　１中のＰ、ａｍａｇａｓａｋｉｅ ｎｓｅゲノムのインサートから誘導された４４５ｐｂの断片中でエンコードされ るアミノ酸との比較を第１７図に示す。図面において、整列した配列が示唆する ように、推定上のペニシリウムのＧｏのクローンはＡ、ｎｉｇｅｒ配列中のアミ ノ酸６４において開始する。

さらに、タンパク質はアミノ酸レベルにおいて約５２％同一であるように思われ る。

圭重室的物質の受託 クローン２のＧｏ　ｃＤＮＡを含有するポリヌクレオチドの構成体は、アメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（米国マリイランド州 ロックビレ、パークロランドライブ１２３０１）に受託され、そしてブダペスト 条約の規定に従い維持されるいるであろう。米国特許として許されかつ発行され ると、この受託物の入手可能性へのすべての制限は最終的に除去されるであろう ；そしてこの受託物へのアクセスは前述の出願が係属している間の３７ＣＦＲ１ ，１４およぶ３５　ＵＳＣ１，２２の下に権限を与えられコミッショナーにより 決定されたものにとって可能であろう。受託物は受託日から３０年間、あるいは 受託の最後の要求から５年間、あるいは米国特許の効力のある間、これらのうち でより長い期間にわたって、維持されるであろう。

受は入れ番号および受託日を下に列挙する。

受託された物質　ＡＴＣＣＮｏ、　鷺丘旦ｐＢＲ−１ａｍｂ、ｄａ−２ａ　６７ ７３１　１９８８年６月１６日ｐｓＧＯ３ｃ５２１ｓ　４０６１９　１９８８年 ９月１６日ｐＢＲｐＧＯＸＡ１１　６８０１２　１９８８年９月１６日この受託 物は当業者の便利のために提供される。このような受託物は本発明の実施のため に要求されることは許容されず、また同等の実施態様は本発明の開示をかんがみ てこの分野の技量の範囲内ではない。この受託物の公衆の入手可能性は、この特 許または他の特許の下に受託物をつくり、使用または販売するライセンスの許諾 ではない。受託された物質の核酸配列は、本発明の開示に引用によって加え、そ してここに記載する配列と衝突する場合コントロールされる。

以上の発明は例示の目的で多少詳述したが、変化または変更は添付する請求の範 囲の範囲内で当業者により実施することができることが明らＧｏをエンコードす る組み換えポリヌクレオチドの提供は、組み換え系中のポリペプチドの発現に基 づく方法を可能とする。これらの方法および組み換え系は、所望の産生物の大規 模の生産可能とするので、とくに有用である。それらは、また、系中のポリペプ チドの産生可能とし、この系からより容易にかつより経済的に精製することがで きる。なぜなら、産生物を培地中に分泌させる発現ベクターを構成することがで きるからである。これはその多くの商業的目的で、例えば、工業的溶液、および 体液、例えば、血液および尿中のグルコースの検出および推定のために、Ｇｏの 入手可能性を増加しおよび／またはコストを減少するであろう。

さらに、ＧＯをエンコードする組み換え系を利用する方法は、発現された産生物 の意図する使用と適合性である系におけるＧｏの産生を可能とする。例えば、Ｇ Ｏは卵の脱糖、飲料、湿った食物製品、香料、および気密封止した食物パッケー ジからの酸素の除去において使用される。

食物製品中の使用のために承認された酵母菌中のＧＯポポリプチドの産生は有利 である。なぜなら、食物製品のために承認されていす、そして高度にアレルゲン 性である自然源、Ａ、ｎｉｇｅｒ中でポリペプチドを産生ずるときより、厳格な 精製の必要性は少ないであろう。

そのうえ、これらの方法および組み換え系は、検出手順において商業的使用を見 いだすことができる、Ｇｏの類似体およびＧｏの断片の産生を可能とする。例え ば、ＧＯの融合産生物はサンドインチ型のアッセイにおいて標識した抗体または 接合体の代わりに使用することができる。

分子は検出すべき抗体により認識されるエピトープに融合することができる。抗 体−エピトープ複合体の存在は、存在するグルコースオキシダアーゼの酵素活性 の検出により決定されるであろう。セイヨウワサビペルオキシダーゼのアッセイ にカップリングするとき、これは比色測定手順を使用して抗体の存在を検出する ことができる。

ＧＯのし合タンパク質は、また、医学的手順において有益である。例えば、過酸 化水素は種々のバクテリアおよび細胞に対して毒性である。

特定の病原体および／または細胞に対する酵素を、これらの特定の標的を認識す る抗体に対してＧＯを融合することによって、標的することができる。

Ｇｏの断片またはＧＯの類似体である不活性のポリペプチドを使用して、ポリク ローナル抗体およびモノクローナル抗体の両者のＧＯに対する抗体をレイズする ことができる。これらの抗体はＧｏおよびＧｏに実質的に類似するポリペプチド を免疫親和手順により精製するｔ；めに有用である。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルコースオキシダアーゼ（ＧＯ）に実質的に類似するポリペプチドをエン コードするポリヌクレオチド配列からなり、ＧＯをエンコードしない他のベクタ ーを本質的に含まない組み換えベクター。 ２、ポリペプチドはＧＯである、上記第１項記載の組み換えベクター。 ３、ポリペプチドはＧＯの突然変異タンパク質である、上記第１項記載の組み換 えベクター。 ４、ＧＯはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）か らのものであり、そして突然変異タンパク質はアミノ酸残基５２１においてシス テインの代わりにセリンを含有する、上記第３項記載の組み換えベクター。 ５、ＧＯに実質的に類似するポリペプチドをエンコードする配列に操作的に結合 した発現のための制御配列をさらに含む発現ベクターである、上記第１項記載の 組み換えベクター。 ６、解読配列を発現させる配列は酵母菌中の発現を可能とする、上記第５項記載 の組み換えベクター。 ７、ｐＡＢ２４ＡＧＳｃｏＧＯ、ｐＡＢ２４ＡＧａｌｐｂｎＧＯ、ｐＡＢ２４Ａ ＧＳＧＯ、ｐＡＢ２４＠ＧＯ、およびｐＳＧＯ３Ｃ５２ｌＳから選択される、上 記第６項記載の組み換えベクター。 ８、ＧＯに実質的に類似するポリペプチドをエンコードする配列からなる組み換 えポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。 ９、宿主細胞は酵母菌の細胞である、上記第８項記載の宿主細胞。 １０、酵母菌は上記第６項記載または上記第７項記載のベクターで形質転換され た、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である、上記第９項記載 の宿主細胞。 １１、ＧＯに実質的に類似する非自然ポリペプチド。 １２、ＧＯは自然ＧＯに関して超グリコシル化されている、上記第１１項記載の ポリペプチド。 １３、ＧＯはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ１１ｕｓ　ｎｉｇｅｒ） またはベニシリウム・アマガサキニンセ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｍａｇａ ｓａｋｉｅｓｅ）からのものである、上記第１１項記載のポリペプチド。 １４、突然変異タンパク質である、上記第１１項記載のポリペプチド。 １５、ＧＯはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ） からのものであり、そして突然変異タンパク質はアミノ酸残基５２１におけるシ ステインがセリンで置換されている、上記第１４項記載のポリペプチド。 １６、工程： （ａ）形質転換された細胞の集団を準備し、前記細胞はＧＯに実質的に類似する ポリペプチドの解読配列から構成された解読配列を含有し、前記解読配列は前記 細胞中の前記解読配列の発現を可能とする配列に操作的に結合しており、 （ｂ）前記ＧＯに実質的に類似するポリペプチドを発現させる条件下に、前記形 質転換された集団を増殖し、そして（ｃ）前記ＧＯに集質的に類似するポリペプ チドを回収する、からなる、ＧＯに実質的に類似する組み換えポリペプチドを産 生する方法。 １７、上記第１６項記載の方法により産生されたポリペプチド。