DK175658B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af glucoseoxidase i rekombinante systemer - Google Patents

Description

- i - DK 175658 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen *af rekom-binant-DNA-teknik til fremstilling af proteiner til industriel anvendelse. Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse rekombinante vektorer med et poly-nucleotid, der er afledt fra svampe, hvilket polynucleotid koder for glucoseoxidase, og fremstillingen af glucose-oxidase i værtsceller, som er transformeret med rekombinante ekspressionsvektorer, der indeholder polynucleotidet.

Genspejsningsteknikken er med stor succes blevet anvendt i den farmaceutiske industri, og det har resulteret i et antal hidtil ukendt produkter. Det er efterhånden blevet klart, at den samme teknik kan anvendes i stor skala ved fremstilling af enzymer, som er af værdi for andre industrigrene. Fordelene ved at få kommercielt anvendelige processer ved hjælp af gensplejsning forventes bl.a. at være en omkostningsreduktion i forbindelse med enzymproduktionen, en produktion af enzymer i organismer, der i almindelighed betragtres som sikre ("GRAS" = generally recognized as safe) og er egnede til fødevareprodukter, muligheden for at benytte sig af specifikke genetiske modifikationer på genniveau til opnåelse af forbedrede enzymegenskaber som termostabilitet og andre "brugsegenskaber" (performance characteristics), såvel som egenskaber, der vil kunne øge den lethed, hvormed enzymet kan oprenses.

Glucoseoxidase er det enzym, som katalyserer oxidationen af glucose til gluconsyre under samtidig udvikling af hydro-genperoxid. Enzymet finder anvendelse industrielt i mange forskellige forbindelser, bl.a. ved fjernelse af sukker i æg, ved fjernelse af oxygen fra drikkevarer, i fugtige fødevareprodukter, i smags- og lugtstoffer, i hermetisk lukkede fødevarepakninger og ved påvisning og bestemmelse af glucose i opløsninger i industrien og i legemsvæsker som blod og urin.

I DK 175658 B1 I

I 2 I

Glucoseoxidase blev først isoleret fra celler af Asper- I

gillus niger af Muller (Biochemische Zeitschrift, 1928, I

I bind 199, s. 136-170 og fra 1931, bind 232, s. 423-424) og I

blev også ekstraheret fra A. niger af Franke og Deffnér I

(Annalen der Chemie, 1939, b. 541, s. 117-150). Produktio- I

nen af glucoseoxidase fra celler af species af Penicilliuro I

chrysogenum, Penicillium glaucum, Penicillium purpurogenum, I

Aspergillus niger og Aspergillus fumaricus er beskrevet af I

I Baker i US patentskrift nr. 2.482.724. I US patentskrift I

nr. 3.701.715 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling I

af glucoseoxidase ved dyrkning af stammer af genera Asper- I

gillus og Penicillium i et medium med lavt indhold af kul- I

hydrater. Enzymet fra Aspergillus niger (A. niger) er rap- I

porteret oprenset til en høj renhedsgrad, og der angives en I

molekylvægt på omtrent 150.000, et isoelektrisk punkt på I

4,2 og et indhold af flavinadenindinucleotid (FAD) på 2 FAD I

pr mol (Pazur og Kleppe (1964), Biochemistry, b. 3, I

s. 578-583). Aminosyresammensætningen af enzymet fra A. ni- I

H ger, såvel som det, at det er et glycoprotein, er også I

I kendt (Pazur et al, 1965, Arch. Biochem. Biophys, b. Ill, I

s. 351-357. Imidlertid er hverken aminosyresekvensen for I

glucoseoxidase eller nucleotidsekvensen, som koder herfor, I

kendt. I

I Et problem i forbindelse med anvendelsen af glucoseoxidase I

I isoleret fra den oprindelige kilde er, at organismerne, som I

I producerer enzymet, kan være kontaminerende eller omfatte I

I kontaminanter, som er ødelæggende ved visse anvendelser af I

I det ønskede protein. For eksempel anvendes glucoseoxidase I

til kommerciel fremstilling af fødevarer. A. niger, som er I

den vigtigste kilde til det kommercielt fremstillede enzym, I

I er i høj grad allergen og ikke godkendt til anvendelse i I

I fødevarer. Derudover er finoprensningsmetoder relativt I

dyre, da glucoseoxidase primært er et intracellulært enzym. I

Disse problemer kan løses ved fremstilling af glucose- I

I oxidase i rekombinante systemer. I

- 3 - DK 175658 B1

Svampeenzymer er blevet udtrykt fra rekombinante vektorer.

Glucoamylase fra Aspergillus (Innis et al, 1985; Science, b. 228, s. 21-26) og endoglucanase I fra Trichoderma reesei (Van Arsdell' et al, 1987, Biotechnology, b. 5, s. 60-64) er blevet udtrykt i Saccharomyces cerevisiae.

Følgende referencer citeres:

Barr et al, 1986, Biotechniques, b. 4, s. 428 Boel et al, 1984, Embo J., b. 3, s. 1581 Botstein et al, 1979, Gene, b. 8, s. 17

Broach, 1981, Molecular Biology of The Yeast Saccharomyces, b. 1, s. 445

Chang et al, 1977, Nature, b. 198, s. 1056

Chirgwin et al, 1979, Biochemistry, b. 18, s. 5294

Clewell et al, 1969, Proc- Natl.. Acad. Sci. USA, b. 62, s. 1159

Clewell et al, 1972, J. Bacteriol., b. 110, s. 667 Cohen, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 69, s. 2110 ! De Boer et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 292, s. 128

Edge, 1981,. Nature, b. 292, s. 756 j Ehrhart og Hollenberg, 1983, J. Bacteriol., b. 156, s. 625

Gate (red.), 1984, Oligonucleotid Synthesis Glisin, 1974, Biochemistry, b. 13, s. 2633 Glover (red.), 1985, DNA Cloning, b. 1 og 2 Goeddel et al, 1980, Nucleic Acids Res., b. 8, s. 4057 Graham og Van der Eb, 1978, Virology, b. 52, s. 546 Grunstein og Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 73, s. 6961

Haines & Higgins (red.), 1985, Nucleic Acid Hybridization Hammerling et al, 1981, Monoclonal Antibodies and T-cell

Hybridomas

Hess et al, 1968, J. Adv. Enzym Reg., b. 7, s. 149 Hinnen et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 75, s. 1929

Hitzeman, 1980, J. Biol. Chem., b. 255, s. 2073 j

Holland, 1978, Biochemistry, b. 17, s. 4900

I DK 175658 B1 I

- 4 - I

I Holland, 1981, J. Biol. Chem., b. 256, s. 1385 I

Huynh et al, 1985, DNA Cloning, A Practical Approach (red. I

D.M. Glover, IRL Press, s. 47-78) I

Innis et al, 1985, Science, b. 228, s. 21 I

I Jay et al, 1984, J. Biol. Chem., b. 259, s. 6311 I

Kelley og Reddy, 1986, J. Bact., b. 166, s. 269 I

Kennet et al, 1980, Monoclonal Antibodies I

Laemmli, 1970, Nature, b. 227, s. 680 I

Lei et al, 1987, J'. Bacteriol. , b. 169, s. 1987 I

Malikkides og Weiland, 1982, Biotech. Bioeng., b. 24, I

s. 1911 I

Maniatis et al, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual I

Maxam et al, 1980, Methods in Enzymology, b. 65, s. 499 I

Messing et al, 1981, Nucleic Acids Res., b. 9, s. 309 I

I Messing, 1983, Methods in Enzymology, b. 101, s. 20-37 I

Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) I

I Miller og Calos (red.), 1987, Gene Transfer Vectors for I

Mammalian Cells (J.H. I

I Miller og M.P. Calos, I

red., Cold Spring Harbor I

I Laboratory) I

I Nambair et al, 1984, Science, b. 223, s. 1299 I

Pazur og Kleppe, 1964, Biochem., b. 3, s. 578 I

I Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning I

Poznansky et al, 1980, Drug Delivery Systems (R.L.Juliano, I

I red., Oxford, N.Y., 1980) I

Poznansky et al, 1984, Phar. Revs., b. 36, s. 277 . I

Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 74, I

I s. 5463 I

I Schreier et al, 1980, Hybridoma Techniques I

I Scopes, 1987, Protein Purification, Principles and I

Practice, 2. udgave {Springer-Verlag) I

Shimatake et al, 1981, Nature, b. 292, s. 128 I

Taylor et al, 1985, Nucl. Acids Res., b. 13, s. 8749 I

Travis et al, 1985, J. Biol. Chem., b. 260, s. 4384-4389 I

Urdea et al, 1983, Proc. natl. Acad. Sci. USA, b. 80, I

s. 7461 I

I I i I i I

- 5 - DK 175658 B1

Warner, 1984, DNA, b. 3, s. 401

Wood et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 82, s. 1585

Zoller, 1982, Nucleic Acids Res., b. 10, s. 6487

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes encDNA-se-kvens, der koder for glucoseoxidase (GO) fra en fungal kilde eller en svamp af genus Aspergillus, nærmere bestemt fra A. niger. Med kendskab til .denne sekvens kan man i re-kombinante systemer få eksprimeret polypeptider, som stort set er lig med GO, herunder også GO, analoge forbindelser hertil eller fragmenter heraf. Overraskende nok produceres relativt store mængder af enzymet i gærceller og udskilles herfra, når cellerne transformeres med en ekspressionsvektor, der koder for GO, og dyrkes under betingelser, som tillader ekspression af enzymet. Sekretionen kan enten være under kontrol af sekretionssekvenser fra gær eller af præprosekvensen fra GO, som der er kodet for i A. niger.

Den tilvejebragte cDNA-sekvens tillader også isolation af GO-kodningssekvenser fra andre kilder, som også kan anvendes til fremstilling af rekombinant GO. Det kan dreje sig om en hvilken som helst kilde, som naturligt koder for enzymet, men det vil især dreje sig om svampekilder, hvor GO-kodningssekvensen indeholder mindst 8 basepar, navnlig 20, især mindst 40 basepar, som i høj grad er homologe (d.v.s. højst har en uoverensstemmelse svarende til en base i komplementærsekvenserne) med en sammenlignelig sekvens i fig. 5B. Alternativt kan GO, der er isoleret fra en anden kilde end A. niger, have en sekvens på mindst omkring 4 aminosyrer, som er homolog med GO-sekvensen fra A. niger, hvis cDNA-kodningssekvens er vist i fig. 5B.

Polypeptiderne, som er udtrykt i gær, der er transformeret med ekspressionsvektorer, der koder for GO-cDNA, er undersøgt, og man er nået til det overraskende resultat, at

I DK 175658 B1 I

I - 6 - I

H produkterne er hyperglycosylerede, og at hyperglycosy- I

H leringen af disse rekombinant producerede polypeptider ikke I

har nogen eller kun en ringe effekt på den enzymatiske I

aktivitet, sammenlignet med nativt GO, men det rekombinante I

produkt udviser en forbedret termostabilitet. I

H Hvad der også er overraskende er, at fjernelse af kulhy- I

I dratgrupperne fra både rekombinant produceret GO og nativt I

GO tilsyneladende ikke hæmmer den enzymatiske aktivitet. I

I Et andet overraskende resultat er, at mRNA, som koder for I

nativt GO, er relativt sjældent forekommende i celler af I

I A. niger i den logaritmiske fase, skønt nativt GO er I

tilstede i A. niger i relativt stor mængde. I

Også overraskende er det, at en analog forbindelse til GO, I

I d.v.s. et mutein, udviser forbedret termostabilitet sammen- I

I lignet med det native molekyle fra A. niger og med dens I

I rekombinante modpart, som udtrykkes i gær. I

I I overensstemmelse hermed tilvejebringes der ifølge I

I opfindelsen bl.a. en rekombinant vektor omfattende en poly- I

I nucleotidsekvens, der koder for et polypeptid, som stort I

set er lig glucoseoxidase (GO), hvilken rekombinant vektor I

I i alt væsentligt er fri for andre vektorer, som ikke koder I

I for GO. I

I Gennem opfindelsen tilvejebringes også en værtscelle, som I

I er transformeret med et rekombinant polynucleotid I

I omfattende en sekvens, der koder for et polypeptid, som I

stort set er lig med GO. I

I Også ikke-nativt polypeptid, som stort set er lig GO, er I

I omfattet af opfindelsen. I

I Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til fremstilling I

I af et rekombinant polypeptid, som stort set er lig GO, I

I I

- 7 - DK 175658 B1 hvilken fremgangsmåde omfatter, at man (a) tilvejebringer en population af transformerede celler indeholdende en rekombinant vektor, som omfatter en kodningssekvens for et polypeptid, som stort set er lig GO,, hvilken kodningssekvens operationelt er linket til sekvenser, som tillader ekspression af kodningssekvensen i cellerne; (b) at man dyrker denne population af transformerede celler under betingelser, hvor polypeptidet, som stort set er lig GO, eksprimeres; og (c) udvinder dette stort set med GO identiske polypeptid.

Opfindelsen skal i det følgende nærmere beskrives ved hjælp af tegningen, hvor fig. 1 viser aminosyresekvensen for fragmenter af nativt GO fra A. niger, fig. 2 oligonucleotidprober, som er designet ud fra aminosyresekvensen for nativt GO fra A. niger til Screening for kodningssekvenser for GO, fig. 3 den 42-mere probe Long 7 og Long 8 og disses relation til proben Long 6, fig. 4a et restriktionskort for GO-cDNA isoleret fra klon 4, fig. 4b cDNA-sekvensen for GO i klon 4, den heraf afledte aminosyresekvens og placeringen af restriktionsenzymsæderne, fig. 5A et restriktionsenzymkort for komposit-cDNA, der koder for GO fra A. niger, fig. 5B cDNA-sekvensen for komposit-cDNA, der koder for GO fra A. niger, den afledte aminosyresekvens og placeringen af restriktionsenzymsæderne, ' i i

I DK 175658 B1 I

I - 8 - I

H fig. 6 identiteten mellem fragmenter af nativt GO fra I

Η A. niger og sekvenser, der er afledt af komposit-cDNA-ma- I

H terialet, derer vist i fig. 5B, og kodeanvendelsen, I

fig. 7 nucleotidsekvensen for området i 5'-position i I

forhold til GO-genet i A. niger, I

fig. 8 et diagram over konstruktionen af ekspressions- I

vektorerne pAB24AGSGQGO og pAB24AGa^pjiaGO. I

fig. 9 et kort over de væsentlige egenskaber ved I

shuttle-vektoren pAB24, I

fig. 10 en polyacrylamidgel, hvorpå delvis oprenset .rekom- I

binant GO har været underkastet elektroforese, idet GO er I

behandlet både med og uden tilstedeværelse af endogly- I

cosidase Η, I

fig. 11 et kort over pCGO-1, som viser nogle væsentlige I

egenskaber, bl.a. restriktionsenzymsæderne, I

H fig. 12 et kort over pSGO-2, som viser nogle væsentlige I

I egenskaber, bl.a. restriktionsenzymsæderne, I

I fig. 13 en graf over termostabiliteten som funktion af I

I j tiden for GO-polypeptidet eksprimeret i gær fra pAB24AGSGO I

I sammenlignet med nativt GO fra A. niger, I

fig. 14 en graf over termostabiliteten som funktion af I

I tiden for muteinet, der er indkodet i C521S og udtrykt i I

gær, sammenlignet med nativt GO fra A. niger, I

I fig. 15 et kort over restriktionsenzymsæder i klonen I

I pBRpGOXAl1, I

I fig. 16 den delvise nucleotidekvens for et segment af I

I .genomet fra P. amagasakiense i klonen pBRpGOXAll; man ser I

- 9 - DK 175658 B1 også aminosyrerne og de indkodede restriktionsenzymsæder, fig. 17 en sammenligning mellem de aminosyrer, som der er kodet for i det af genomet fra P- amagasakiense afledte fragment, der er indsat i pBRpGOXAll, og aminosyre-sekvensen for GO fra A. niger, der er kodet for i den i fig. 5B viste nucleotidsekvens.

I den følgende beskrivelse af den foreliggende opfindelse vil der blive anvendt en terminologi, der er i overensstemmelse med de herunder angivne definitioner.

Med betegnelsen "glucoseoxidase" menes et polypeptid, som katalyserer oxidationen af glucose til gluconsyre under samtidig udvikling af hydrogenperoxid. Fremgangsmåder til bestemmelse af glucoseoxidaseaktivitet tilhører den kendte teknik, bl.a. kendes en kolorimetrisk analyse, hvor gluco-seoxidaseaktiviteten kobles til et peroxidase-o-dianisidin-system. Denne type analysesystem diskuteres i eksempel IV.

Med betegnelsen "rekombinant polynucleotid" som heri anvendes til at karakterisere et polynucleotid, der kan anvendes ved fremstilling af GO, menes et polynucleotid af genomisk cDNA udelukkende, eller kun delvis, af syntetisk oprindelse, idet der kan være tale om, at det (1) ikke er knyttet til hele det polynucleotid, som det er knyttet til i naturen, heller ikke en del af det, og/eller (2) er linket til et andet polynucleotid, end det, som det i naturen er linket til, eller (3) ikke findes i naturen.

Med betegnelsen "polynucleotid" menes en polymer form af nucleotider af en hvilken som helst længde, enten ribo-eller deoxyribonucleotider. Denne betegnelse refererer kun til molekylets primære struktur. Den omfatter altså både dobbelt- og enkeltstrenget DNA, såvel som dobblet- og enkeltstrenget RNA. Den omfatter også modifikationer heraf, som f.eks. er dannet ved methylering, phosphorylering

I DK 175658 B1 I

I I

H og/eller ved capping, samt ikke-modificerede former af I

polynucleotidet. I

Med betegnelsen "replikon" menes et hvilket som helst I

H genetisk element, f.eks. et plasmid, et kromosom, et virus, I

H der opfører sig som en autonom enhed med hensyn til poly- I

nucleotidreplikation i en celle, d.v.s. er i stand til at I

replikere under sin egen kontrol. I

H Med betegnelsen "vektor" menes et replikon, hvortil er I

fastgjort et andet polynucleotidsegment på en sådan måde, I

at dettes replikation og/eller ekspression etableres. I

Med betegnelsen "kontrolsekvens" menes en polynucleotid- I

sekvens, som er nødvendig for at få eksprimeret og/eller I

sekreteret (udskilt) de kodningssekvenser, hvortil den er I

ligeret. Sådanne -kontrolsekvensers natur afhænger af værts- I

organismen; i prokaryoter omfatter de i almindelighed I

promotor, ribosomalt bindingssæde og terminatorer; i euka- I

H ryoter omfatter de i almindelighed promotorer, terminatorer I

I og i visse tilfælde forstærkere (enhancers). Desuden I

kontrollerer i både prokaryoter og eukaryoter leader-se- I

kvenser sekretionen af det eksprimerede polypeptid fra I værtscellen. Det er hensigten med betegnelsen "kontrol- sekvens", at den i det mindste skal omfatte alle de I komponenter, hvis tilstedeværelse er nødvendig for ekspres- I sionén, og at den også kan omfatte flere komponenter, hvis I tilstedeværelse kan være en fordel, f.eks. leader-se- I kvenser. · I Med betegnelsen "operabelt linket" menes en sidestilling I (juxtaposition), hvor de beskrevne komponenter står i for- bindelse med hinanden på en sådan måde, at de kan fungere I på den tilsigtede måde. En kontrolsekvens, som er "opera- belt linket" til en kodningssekvens, er ligeret således, at I man opnår ekspression af kodningssekvensen under I betingelser, som er forligelige med kontrolsekvenserne.

- 11 - DK 175658 B1

Med betegnelsen "åben aflæseramme" menes et område i en polynucleotidsekvens, der koder for et polypeptid; og dette område kan repræsentere en del af en kodningssekvens eller en hel kodningssekvens.

Med betegnelsen "kodningssekvens" menes en polynucleotidsekvens, som transskriberes til mRNA og/eller translateres . til et polypeptid, når det underkastes passende reguleringssekvensers kontrol. Kodningssekvensens grænser er bestemt af en translationsstartkode i 5'-enden og en translationsstopkode i 3'-enden. En kodningssekvens kan omfatte mRNA, cDNA og rekombinante polynucleotidsekvenser, men er ikke begrænset hertil.

Med betegnelserne "rekombinante værtsceller," "værtsceller," "celler," "cellelinier," "cellekulturer" o.l. betegnelser for mikroorganismer eller højere eukaryotiske cellelinier, der dyrkes som encellede enheder, hvilke betegnelser anvendes i flæng, menes celler, som kan anvendes eller har været anvendt som recipienter for rekombinante vektorer eller andre transfer-polynucleotider, bl.a. også transfektioner af den originale celles progen.

Man må forstå, at progenet i en enkelt ophavscelle ikke nødvendigvis m.h.t. morfologi, genomisk DNA eller hele DNA-komplementet er fuldstændig identisk med det oprindelige ophav, på grund af tilfældige eller forsætlige mutationer. Progenet i ophavscellen, som er tilstrækkeligt lig ophavet, kan karakteriseres ved den relevante egenskab, f.eks. ved tilstedeværelsen af en nucleotid-sekvens, der koder for et ønsket peptid, og er indeholdt i progenet ifølge hensigten med denne definition og er omfattet af de ovennævnte betegnelser. .

Med betegnelsen "transformation" menes indsætningen af et exogent polynucleotid i en værtscelle, uanset hvilken fremgangsmåde der anvendes til indsætningen, om det f.eks. er

I DK 175658 B1 I

I - 12 - I

direkte optagning, transduktion eller f-mating. Det exo- I

gene polynucleotid kan forefindes som en ikke-integreret I

vektor, f.eks. et plasmid, eller alternativt kan det være I

H integreret i værtsgenomet. I

H Med betegnelsen "polypeptid" menes aminosyreproduktet af I

en i genomet indkodet sekvens; der hentydes ikke til et I

produkt af en bestemt længde, og derfor er peptider, oligo- I

peptider og proteiner alle omfattet af denne definition på I

et polypeptid. Med betegnelsen refereres heller ikke til I

post-ekspressionelle modifikationer af polypeptidet, f.eks. I

I glycosyleringer, acetyleringer, phosphoryleringer, sialyle- I

I ringer o.l. I

Med betegnelsen "et polypeptid, som stort set er identisk I

I eller lig med glucoseoxidase eller GO" menes ikke-naturligt I

I forekommende former for GO, f.eks. tænkes der på I

post-translationelle modifikationer, bl.a. glycosyleringer, I

phosphoryleringer og lignende, hvor aminosyresekvensen fra I

I nativt GO er bevaret, GO-analoge forbindelser, GO-frag- I

menter, analoge forbindelser til GO-fragmenter og fusions- I

polypeptider, hvor GO eller en hertil analog forbindelse I

eller et fragment heraf er fusioneret eller sammensmeltet I

med et andet polypeptid, som det normalt ikke ér sammen- I

smeltet med i naturen. I

Med betegnelsen "GO-analog" eller "en analog forbindelse I

til GO eller et fragment af GO" menes en forbindelse, hvor I

homologien med nativt GO eller det sammenlignelige fragment I

er større end ca. 70% med hensyn til aminosyresekvens, for- I

trinsvis større end ca. 80%. Omfattet af betegnelsen er I

også analoge forbindelser, hvor en eller flere af de I

naturligt forekommende aminosyrer er substitueret med et I

ikke-naturligt forekommende stof tilhørende den kendte tek- I

nik, f.eks. en ikke-naturligt forekommende aminosyre etc. I

Polypeptider, som er fragmenter af eller analoge til GO, I

kan være "aktive" eller "ikke-aktive." Med et "aktivt" I

-13- DK 175658 B1 polypeptid menes et polypeptid, som med de pågældende ko-faktorer og substrater, katalyserer den reaktion, som j normalt det native enzym isoleret fra Aspergillus kataly- j. serer. Med et "ikke-aktivt" eller "inaktivt" polypeptid menes et polypeptid, som mangler den native aktivitet, eller i hvilket den native aktivitet er ændret væsentligt med hensyn til substratudnyttelse (type eller mængde) og/eller med hensyn til produktdannelse (type. eller mængde), men som i det mindste har den ovennævnte grad af homologi i aminosyresekvens med nativt GO eller med et sammenligneligt fragment af GO. Fremgangsmåder til påvisning ikke-naturligt forekommende former af GO og analoge til GO tilhører den kendte teknik. Ikke-naturligt forekommende former af GO og GO-analoge kan f.eks. påvises ved hjælp af deres binding til og eluering fra et antal kromatografiske materialer og ved hjælp af deres vandring gennem elektro-foresegeler. Desuden kan GO-analoge f.eks. påvises ved sammenligning af aminosyresekvenser.

En type GO-analog er et polypeptid, hvori en eller flere normalt forekommende cystein-grupper er fjernet eller substitueret med andre aminosyrer; denne type polypeptid betegnes et "mutein." Fremgangsmåder til fremstilling af muteiner tilhører den kendte teknik.

Med betegnelsen "hyperglycosyleret GO" menes GO, som indeholder flere kulhydratgrupper, end der er linket til nativt GO. Med betegnelsen "underglycosyleret GO" menes GO, som indeholder færre kulhydratgrupper, end der er linket til nativt GO. Fremgangsmåder til bestemmelse af, hvorvidt et polypeptid indeholder flere eller færre kulhydrater tilhører den kendte teknik, og omfatter bl.a. de mange fremgangsmåder, hvor man overvåger modificerede poly-peptiders forskelle i molekylvægt (f.eks. elektroforese på polyacrylamidgeler i nærvær af SDS, som beskrevet af Laemmli) og vandring gennem søjler, som indeholder moleky-lesiende materialer (f.eks. Sephadex), såvel som fremgangs-

I DK 175658 B1 I

- 14 - I

H måder, der er baseret på affinitet eller mangel på samme I

mellem kulhydratgrupper og materialer, der binder kulhy- I

H drater. I

Med betegnelsen "et vild-type polypeptid" menes et poly- I

peptid, som har en aminosyresekvens, der er identisk med I

den sekvens, der er indkodet i den organismes genom, som I

H er kilden til kodningssekvensen. I

Med betegnelsen "nativt GO" og lignende betegnelser menes I

GO isoleret fra den fungale kilde, som normalt i naturen I

fremstiller det fra et naturligt forekommende genom. I

Med betegnelsen "ikke-nativt polypeptid" menes et I

polypeptid, som produceres i en anden vært end den i natu- I

ren producerende. I

Med betegnelsen "strenge eller stringente betingelser" om I

hybridisering menes betingelser, hvorunder kun 1 fejl I

eller uoverensstemmelse ("mismatch") tillades ved I

I hybridisering af to komplementære sekvenser. Hybridise- I

rings- og vaskebetingelser af varierende stringencitetsgrad I

vil være velkendte for fagfolk og diskuteres f.eks. i I

Maniatis et al, 1982. I

Med betegnelsen "gær" menes ascosporogene gær (Endomy- I

cetales), basidiosporogene gær og gær tilhørende Fungi . I

Imperfecti (Blastomycetes). De ascosporogene gær er inddelt I

I i to familier, Spermophthoraceae og Saccharomycetaceae. I

I Sidstnævnte omfatter fire underfamilier: Schizosaccharo- I

I mycoideae (f.eks. genus Schizosaccharomyces), Nadsonioi- I

I deae, Lipomycoideae og Saccharomycoideae (f.eks. generaene I

I Pichia, Kluyveromyces og Saccharomyces). De basidio- I

I sporogene gær omfatter generaene Leucosporidium, I

I Rhodosporium, Sporidiobolus, Filobasidium og Filobasidi- I

I ella. Gær tilhørende Fungi Imperfecti inddeles i to I

I familier: Sporobolomycetaceae (f.eks. generaene Sporobolo- I

- 15 - DK 175658 B1 myces, Bullera) og Cryptococcaceae (f.eks. genus Candida).

Af særlig interesse for den foreliggende opfindelse er species indenfor generaene Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces og Candida. Af særlig interesse er følgende Saccharomyces species S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis og S. oviformis. Særligt interessante species i genus Kluyveromyces er bl.a.

K. lactis. Da klassifikationen af gær kan ændres i fremtiden, må der .i denne forbindelse henvises til "Biology and Activities of Yeast" (F.A. Skinner, S.M. Passmore & R.R. Davenport (red.), 1980, Soc. App.

.Bacteriol. Symp. Series No. 9), hvis anvisninger er fulgt. Herudover er fagfolk formodentlig inde i gærs biologi og bekendt med gensplejsning af gær, jvf. f.eks. "Biochemistry and Genetics of Yeast" (M. Bacila, B.L. Horecker & A.O.M. Stoppani (red.), 1978,"The Yeasts" (A.H. Rose & J.S. Harrison (red.), 2. udgave 1987) og "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces" (Strathern et al (red.), 1981).

Med betegnelsen "svampe" menes klasserne Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes og Deuteromycetes. Blandt repræsentative grupper af Phycomycetes kan nævnes Rhizopus,

Mucor og akvatiske vandsvampe. Blandt repræsentative grupper af Ascomycetes kan nævnes Neurospora, Penicillium, Aspergillus og de ægte gær, som er nævnt ovenfor. Som eksempel på Basidiomyceter kan nævnes champignon, skimmel og brand.

Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse anvendes, med mindre andet er nævnt, konventionelle metoder indenfor områderne molekylær biologi, mikrobiologi, rekombinant DNA-teknik og enzymologi, og disse vil være velkendt for fagfolk. Metoderne er forklaret detaljeret i litteraturen, se f.eks. Maniatis, Pitsch & Sambrook, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 1982; DNA Cloning, bind I og II, D-N.

I DK 175658 B1 I - 16 -

II Glover (red.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait I

H (red.), 1984; Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins (red.), 1984; Transcription and

Translation, B.D. Hames & S.J. Higgins,(red.), 1984; Animal

Cell Culture, R.I. Freshney (red.), 1986; B. Perbal, A

H Practical Guide to Molecular Cloning, 1984, afhandlingen H Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), især bind 154 H og 155 (Wu og Grossman, hhv. Wu, (red.); Gene Transfer

Vectors for Mammalian Cells, J.H. Miller og M.P. Calos (red.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory;

Immunochemical' Methods in Cell and Molecular Biology, |

Academic Press, London, og Scopes, Protein Purification;

Principles and Practice, 2. udgave, Springer Verlag, 1987.

Ved fremgangsmåder til fremstilling af enzymet ved rekom- binante metoder kan anvendes en nucleotidkonstruktion, der koder for GO. DNA kodende for GO, nærmere bestsmet svampe-GO, specielt GO fra Aspergillus, navnlig fra A. niger, er blevet isoleret fra et cDNA-bibliotek, som er I dannet ved revers transscribering af poly-A+-RNA, der er isoleret fra A. niger i den logaritsmiske vækstfase.

Imidlertid viste der sig et problem i forbindelse med fremstillingen af prober til screening af biblioteket for GO-kodende sekvenser: Der manglede oplysninger både om aminosyresekvensen for svampeenzymet og om den for dette I kodende nucleotidsekvens. Det viste sig desuden nødvendigt I at designe sekvenser, der kunne anvendes til screening for H GO-kodende sekvenser, da man ved forsøg på at sekvensere enzymet isoleret fra A. niger overraskende nok kun fik H sekvensen bestående af de første ti aminosyrer i det native polypeptid.

Med henblik på at designe prober, som ville kunne anvendes I til påvisning af GO-kodende cDNA-sekvenser i et lamb- da-gtlO-bibliotek, er der oprenset oligopeptidfragmenter af I det native enzym fra A. niger, og aminosyresekvensen er I bestemt. På basis af disse sekvenser er oligonucleotid- - 17 - DK 175658 B1 prober designet på to måder. Der er fremstillet prober på 17-23 nucleotider ud fra områderne med lavest degeneration. Alternativt er unikke længere prober baseret på gæt på kode-skævheder (-bias). Sekvenserne for disse prober er vist i fig. 2.

Ved screening af lambda-gtlO - A. niger - cDNA-biblioteket fik man overraskende resultater: For det første kunne ingen af de korte prober bruges til påvisning af kloner med GO-cDNA. Endvidere viste det sig, at skønt to 42-mere prober kunne anvendes med held til påvisning af disse kloner, gjaldt dette ikke en 72-mer probe, hvori de 42-mere prober var indsat som underenheder, på nær et nucleotid.

De 42-mere prober, som kan anvendes til påvisning af GO-cDNA-holdige kloner, er vist i fig. 3.

Ved anvendelse af de 42-mere prober isoleredes kloner af lambda-gtlO, som indeholdt nucleotidsekvenser kodende for GO-polypeptidet eller fragmenter heraf; cDNA-materialet i disse kloner blev subklonet og sekvenseret. Et komposit-cDNA-produkt blev konstrueret ud fra to af de i fig. 5B viste GO-cDNA-sekvenser. Aminosyresekvensen for GO er afledt ud fra den nucleotidsekvens, som koder herfor.

Ud fra sekvensen kan man bestemme, at det færdige protein består af 583 aminosyrer; aminosyresekvensen indeholder kun 3 cysteingrupper og 8 consensus-glycosyleringssæder. Aminosyresekvensen indeholder en præ-pro-sekvens på 22 aminosyrer med et enkelt grundlæggende spaltningssæde i starten af den færdige sekvens.

Det i fig. 5B viste rekombinante polynucleotid koder for GO fra A. niger. Man kan dog med rimelighed antage, at GO fra andre kilder, især fra andre svampe, navnlig fra andre species af Aspergillus, indeholder områder, som er homologe med GO fra A. niger. Områder med homologi kan bestemmes ved sammenligning af aminosyresekvensen for GO fra den anden kilde med sekvensen for GO fra A. niger; i fig. 5B er vist

DK 175658 B1 I

I - 18 - I

H aminosyresekvensen afledt af GO-cDNA-sekvenserne. Hvis I

H ikke aminosyresekvensen for hele polypeptidet kan bestem- I

mes, kan sekvenserne af oligopeptidfragmenter sammenlignes I

med sekvensen af GO fra A. niger. Man kan også sammenligne I

information om kildens kode-skævhed; A. niger’s kode-skæv- I

hed er vist i fig. 6. Ud fra sekvensen i fig. 5B kan man I

al stå designe prober, som kan anvendes ved screening af I

H cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra andre I

H kilder med det formål at påvise GO-kodningssekvenser fra I

disse kilder. En fagmand vil kende til de parametre, som I

man benytter sig af, når man designer prober; i eksemplerne I

belyses nogle af disse. Sædvanligvis vil proberne indeholde I

minds 8 baser, især mindst 20 baser, navnlig mindst 40 I

baser, som er identiske med en sekvens i den i fig. 5B I

viste cDNA-sekvens. Der kan være tale om identitet med I

enten den kodende eller den ikke-kodende streng af cDNA-ma- I

terialet. Disse prober vil under stringente betingelser hy- I

bridisere med den streng af det dobbeltstrengede DNA, som I

indeholder de GO-kodningssekvenser, som man ønsker at I

isolere. Stringente hybridiseringsbetingelser er beskrevet I

I i den kendte teknik, se f.eks. Maniatis et al, 1982, og I

I Methods in Enzymology. Herefter kan de med proberne påviste I

GO-kodningssekvenser klones og isoleres ved anvendelse af I

I fremgangsmåder, som tilhører den kendte teknik. Se f.eks. I

Maniatis, 1982; B. Perbal, 1984, og Glover (red.), 1985. I

I I eksemplerne er isolationen af en sekvens, der koder for I

I en del af GO fra Penicillium, nærmere bestemt P. amaga- I

sakiense, beskrevet. Isolationen er foretaget ved I

anvendelse af en probe, som er afledt af GO-cDNA, der er I

indeholdt i en rekombinant vektor, som beskrives i eksem- I

pierne. Ved anvendelse af det fragment, der koder for GO I

fra Penicillium, til at aflede prober er det muligt fra I

cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker, som er I

dannet ud fra Penicillium-kilden, at aflede hele sekvensen I

af det polynucleotid, der koder for dette svampeenzym. I

i - 19 - DK 175658 B1

Skønt her er beskrevet en fremgangsmåde til ud fra et fremstillet cDNA-bibliotek at fremstille en DNA-konstruktion, der koder for GO fra A. niger,er fremstillingen af sådanne i konstruktioner ifølge opfindelsen ikke begrænset til denne fremgangsmåde. Ved anvendelse af den heri tilvejebragte information om sekvensen kan der anvises andre fremgangsmåder til fremstilling af GO-kodende polynucleo-tidkonstruktioner. For eksempel kan den GO-kodende nucleotidsekvens syntetiseres ved anvendelse af automatisk DNA-syntese, se f.eks. Edge, 1981? Nambair et al, 1984, og Jay et al, 1984. Alternativt kan der syntetiseres oligo-nucleotider indeholdende en del af sekvensinformationen; og disse kan så anvendes som prober til screening af genomiske DNA-biblioteker og cDNA-biblioteker. De grundlæggende principper for fremstilling af oligo- nucleotidprober og DNA-biblioteker, så vel som screeningen heraf ved hjælp af nucleinsyrehybridisering, er velkendte for fagfolk. Se f.eks. . D.P. Glover (red.), 1985; B.D. Hames & S.J. Higgins (red.), 1985; M.J. Gate (red.), 1984; Maniatis et al, 1982, og B. Perbal, 1984.

Når en GO-kodende sekvens er fremstillet eller isoleret, kan den klones ind i et hvilket som helst egnet replikon, hvorved man får en vektor, og derved kan den bevares i et præparat, som stort set er frit for vektorer, der ikke indeholder GO-genet (f.eks. andre kloner, der er afledt fra biblioteket). Adskillige kloningsvektorer kendes af fagfolk, og man kan frit vælge en passende kloningsvektor.

Som eksempler på passende vektorer til kloning af rekom-binant DNA og hermed transformerbare værtsceller kan nævnes bakteriophag lambda (E. coli), pBR322 (E, coli), pACYCl77 (E. coli), pKT230 (gramnegative bakterier), pGV1106 (gramnegative bakterier), pLAFRl (gramnegative bakterier), pME290 (andre gramnegative bakterier end E. coli), pHVl4 (E. coli og B. subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) og bovin papilloma virus (pattedyrsceller). Se T. Maniatis

DK 175658 B1 I

I 20 I

et al, 1982; B. Perbal, 1984, og Glover (red.), 1985. I

Den GO-kodende polynucleotidsekvens udtrykkes ved ind- I

sætning i et passende replikon, hvorved der dannes en eks- I

pressionsvektor, ved transformation af kompatible værts- I

H celler med den resulterende ekspressionsvektor og ved I

dyrkning af værtscellerne under betingelser, som tillader I

vækst og ekspression. I

Når man danner en ekspressionsvektor, anbringes den GO-ko- I

H dende sekvens således i vektoren, at den er operabelt I

linket til passende ekspressionskontrolsekvenser og even- I

tuelt også sekretionskontrolsekvenser. Kontrolsekvenserne I

må i det mindste omfatte en promotor samt transscriptionel- I

H le og translationelle stopkoder. Placeringen og orien- I

teringen af kodingssekvensen med hensyn til kontrol- I

sekvenserne er således, at kodningsekvensen transscriberes I

under kontrolsekvensens "kontrol;" d.v.s., at promotoren I

vil kontrollere transscriptionen af det mRNA, som afledes I

I af kodningssekvensen, og den stopkode, som anvendes til af- I

slutning af translationen, vil være anbragt før transscrip- I

tionstermineringskoden. I

Ud over kontrolsekvenser kan det være ønskeligt at tilføje I

I reguleringssekvenser, ved hjælp af hvilke ekspressionen af I

I GO reguleres i forhold til værtscellens vækst. Dette er I

I især ønskeligt, når GO skal udtrykkes i celler, som dyrkes I

i glucoseholdigé medier, da det af GO dannede hydrogen- I

I peroxid, kan være toxisk for cellen. Som eksempel på regu- I

I lerende systemer kan nævnes sådanne, hvor genets ekspres- I

sion sættes i gang eller stilles i bero som reaktion på en I

kemisk eller fysisk stimulering, bl.a. tilstedeværelsen af I

en regulatorforbindelse. I prokaryotiske systemer kan I

anvendes lac- og trp-operatorsystemer. I gær kan man f.eks. I

anvende ADH2-systemet. I eksemplerne sker ekspressionen af I

GO i S. cerevisiae under kontrol af den regulerende hybrid- I

promotor ADH2/GAP. Som et andet eksempel på regulator- I

- 21 - DK 175658 B1 sekvenser kan nævnes de sekvenser, som tillader forstærkning af gener (gene amplification). I eukaryote systemer drejer det sig bl.a. om dihydrofolatreductasegenet, som forstærkes i nærvær af methotrexat, og om metallothionein-generne, der forstærkes med tungmetaller. I disse tilfælde ville den GO-kodende sekvens blive anbragt i tandem med det regulerende element.

Der kan også være andre typer af regulatorelementer tilstede i vektoren, d.v.s. sådanne, som ikke nødvendigvis er i tandem med GO-kodningssekvensen. Forstærkersekvenser, f.eks. SV40-forstærkersekvensen, er af denne type. En forstærkersekvens leder ved sin blotte tilstedeværelse til en forøget ekspression af gener, som er distale i forhold hertil.

En modifikation af GO-kodningssekvensen før eller efter dens indsættelse i replikonet kan være nødvendig eller øn- ' skelig, i afhængighed af det valgte ekspressionssystem. For eksempel kan det i visse tilfælde være nødvendigt at modificere sekvensen således, at den er orienteret rigtigt, når den er fastgjort til kontrolsekvenserne. I visse tilfælde kan det være ønskeligt at tilføje eller ændre sekvenser, som forårsager sekretion af polypeptidet fra værtsorganismen, med en efterfølgende spaltning af sekretionssignalet. I eksemplerne er beskrevet ekspressionsvektorer, som enten har den naturlige præ-pro-sekvens for A. niger GO, eller hvor alpha-faktoren fra gær er anvendt som sekretionssignal. Derudover kan det, med henblik på at opnå ekspression i systemer, f.eks. prokaryo-tiske systemer, som ikke kan skære intron-sekvenser væk, eller som ikke tillader ekspression af kodningssekvenser med en eller flere introns, i visse tilfælde være ønskeligt at fjerne introns fra sekvenser, der er isoleret fra geenomiske biblioteker. Et eksempel på det sidstnævnte tilfælde diskuteres i Innis et al, 1985. Fremgangsmåder til

I DK 175658 B1 I

- 22 - I

modifikation af nucleotidsekvenser ved kloning tilhører I

H den kendte teknik. Det drejer sig bl.a. om anvendelsen af I

H restriktionsenzymer eller andre enzymer som f.eks. Bal31 I

H til fjernelse af overskud af nucleotider, om anvendelsen I

H af kemisk syntetiserede oligonucleotider til anvendelse I

som adaptorer til erstatning for tabte nucleotider samt om I

H sæde-styret mutagenisering. Se f.eks. Maniatis et al, I

1982; Glover (red.), 1985, og Hames og Higgins (red.), I

I 1984. I

Modifikation af kodningssekvensen for GO kan også være I

H nødvendig for at opnå syntese af polypeptider, som stort I

set er, lig med GO. Disse polypeptider afviger på en eller I

anden kunstig (engineered) måde fra enzymet som isoleret fra den naturlige kilde. Hvis f.eks. et GO-fragment er det ønskede produkt, må den sekvens, der koder for enzymet, mo- dificeres, så de uønskede sekvenser svarende til de amino- syrer, som man ønsker fjernet, også fjernes. Hvis det ønskede GO-fragment er et aktivt GO-fragment, vil de fjer- nede sekvenser sandsynligvis være i områder i den amino- H og/eller carboxyterminale ende.

Alternativt kan polypeptider, som stort set er lig med GO, syntetiseres ved at udtrykke det native gen i en vært, som foranlediger en modifikation i dannelses- eller foldnings- processen for polypeptidet. I eksemplerne er vist ekspres-

sionen i gær af en rekombinant sekvens, der koder for GO

fra A. niger, hvilket leder til hyperglycosylerede peptider, som har bevaret deres aktivitet. Overraskende I nok er det gæreksprimerede polypeptid mere termostabilt end det native enzym, hvilket kan bevirke en forøget anvendelse af det førstnævnte i kommercielle processer.

I Man kan også være interesseret i at syntetisere GO-analoge forbindelser. Sådanne analoge forbindelser kan f.eks. vari- I ere med hensyn til specifik aktivitet og/eller med den let- I hed, hvormed de eksprimeres og/eller sekreteres og/eller - 23 - DK 175658 B1 oprenses. Det er f.eks. kendt, at højt glycosylerede poly-peptider ofte er vanskelige at oprense. Eksemplerne viser overraskende nok, at fjernelse af kulhydratgrupper fra GO, som er afledt fra A. niger, ikke påvirker polypeptidets enzymatiske aktivitet. Man kan altså f.eks. ønske at variere antallet af glycosyleringssæder. -Desuden kan cys-grupper muteres, så foldningen af de rekombinante og/eller modificerede polypeptider lettes, eller så andre egenskaber ændres, så man får et protein med en større kommerciel anvendelsesmulighed. For eksempel er det vist i afsnit IV.I, at serin i stedet for cystein i position 521 forøger termostabiliteten af det gæreksprimerede, rekombinante GO fra A. niger.

I de efterfølgende eksempler beskrives produktionen af GO-aktive, analoge forbindelser til vild-type GO fra A. niger ved anvendelse af rekombinant DNA-teknik.

Man kan også være interesseret i at syntetisere analoge forbindelser til eller fragmenter af GO. Sådanne analoge forbindelser kan f.eks. være inaktive, analoge forbindelser, der f.eks. kan være nyttige ved produktionen af antistoffer mod GO.

Man kan også være interesseret i at syntetisere .analoge forbindelser til GO eller GO-fragmenter, der afviger med hensyn til hydrofobicitet, og dermed tillader kraftigere eller svagere interaktion med membraner eller liposomer.

Dette kan ske ved at erstatte hydrofile aminosyrer med hydrofobe i nogle af polypeptidets yderområder eller vice versa. Sådanne forandringer i hydrofobicitet sker ved at modificere de sekvenser, der koder for den specifikke aminosyre, der skal substitueres.

I de tilfælde, hvor GO skal anvendes ved fremstilling af levnedsmidler, kan man være interesseret i at fjerne immunogene områder af polypeptidet, der giver anledning til al-

I DK 175658 B1 I

- 24 - I

lergiske reaktioner, navnlig i mennesker. Allergenicitets- I

afprøvninger vil være velkendte for fagfolk. I

I Polypeptider, som stor set er lig GO eller GO-fragmenter, I

men som indeholder et ændret aktivt sæde, kan også synte- I

tiseres. I dette, tilfælde må kodningssekvensen for enzymet I

modificeres, så de koder, der koder for aminosyrerne i det I

aktive sæde, ændres eller fjernes. I

Med polypeptider, som stort set er lig GO eller GO-frag- I

H menter, kan man også mene polypeptider, hvor en del af I

eller hele GO-sekvensen er sammensmeltet med en sekvens,

I der koder for et andet polypeptid. Fusionen eller sammen- I

smeltningen kan ske enten ved den N- eller den C-terminale I

ende af GO-pOlypeptidet eller -fragmentet. Fremgangsmåder

I til fremstilling af fusionsproteiner tilhører den kendte I

teknik, bl.a. kan man f.eks. ligere de åbne aflæserammer, I

I der koder for polypeptiderne, så de er i ramme eller i I

fase, og så ekspressionen af det fusionerede polypeptid er I

I under den regulerende kontrol af en enkelt promotor og I

I terminator. En fusion kan også opnås ad kemisk vej efter I

I ekspression af polypeptiderne. Kemiske metoder til fusio- I

nering (eller linkning) af polypeptider er velkendte for I

I fagfolk. Se f.eks. Methods in Enzymology. I

Ovenfor er nævnt eksempler på måder, hvorpå GO kan modi- I

ficeres ved modifikation af kodningssekvensen for GO. Ek- · I

I semplerne er ikke udtømmende, og fagfolk vil hurtigt kunne I

nævne andre modifikationer, som ville være nyttige. Alle I

I disse vil kunne foretages ved anvendelse af de ovenfor I

I og i det følgende nævnte metoder og referencer, som vedrø- I

rer modifikation af nucleotidsekvenser. I

I Sekvensen, der koder for et polypeptid, som stort set er I

lig GO, bl.a. også vild-type GO, kan ligeres til kontrol- I

I sekvensen, så man får en ekspressionskassette før I

I ' indsætningen i replikon'et, som danner en ekspressions- I

- 25 - DK 175658 B1 vektor. Alternativt kan kodningssekvensen klones direkte ind i en ekspressionsvektor, som allerede indeholder kontrolsekvenserne og et passende restriktionssæde.

Kontrolsekvenserne i vektoren vil blive udvalgt således, at de er kompatible med den transformerede vært, så der åbnes op for ekspression og/eller sekretion af molekylet. Disse kontrolsekvenser kan være af blandet oprindelse. I et af de følgende eksempler er f.eks. ekspressionen af GO fra A. niger i S. cerevisiae underlagt totalt heterologe sekvensers kontrol, nemlig den gær-regulerede gærpromotor ADH2/GAP, gær-alpha-sekretions-faktoren og gær-GAP-termina-toren. I et andet eksempel er kontrolsekvenserne kun delvist heterologe, d.v.s., at sekretionen reguleres af præ-pro-sekvensen fra A. niger, mens resten af ekspressionen kontrolleres af gær-sekvenser. I tilfælde, hvor GO udtrykkes i prokaryotiske systemer, vil kodningssekvensen for enzymet være fri for introns.

Den kendte teknik omfatter en række replikon'er, som kan anvendes til konstruktion af prokaryotiske ekspressionsvektorer, se f.eks. US patentskrifterne nr. 4.440.859, 4.436.815, 4.431.740, 4.431.739, 4.428,941, 4.425.437, 4.418.149, 4.422.994, 4.366.246 og 4.342.832. Også repli- kon’er, som kan anvendes til konstruktion af gærekspressionsvektorer, tilhører den kendte teknik, se f.eks. US patentskrifterne nr. 4.446.235, 4.443.539, 4.430.428 med eksempler. Et eksempel på et replikon, der kan anvendes til konstruktion af en ekspressionsvektor for pattedyrværtsceller, er nævnt i US patentskrift nr. 921.730.

Gær er et foretrukket system til ekspression af rekombinant GO, især S. cerevisiae. Som beskrevet i eksemplerne nedenfor eksprimeres der i dette system relativt høje niveauer af GO, især når sekvensen, der koder for vild-type enzymet fra A. niger er under kontrol af gær-ADH2/GAP-promotoren, gær-alpha-faktoren og gær-GAP-terminatoren..

I DK 175658 B1 I

I -26 - I

Afhængigt af ekspressionssystemet og den valge vært produ- I

ceres der et polypeptid, som stort set er lig GO-polypep- I

tidet, bl.a. også GO selv eller en GO-analog forbindelse I

eller et GO-fragment, ved dyrkning af værtsceller, som er I

transformeret med en ekspressionsvektor som beskrevet I

ovenfor og under betingelser, hvor polypeptidet udtrykkes. I

Herefter isoleres det syntetiserede polypeptid fra værts- I

cellerne og oprenses. Hvis ekspressionssystemet udskiller I

enzymet til vækstmediet, kan proteinet oprenses direkte I

I fra mediet. Hvis det rekombinante polypeptid ikke I

udskilles, isoleres det fra et celle-lysat. Fagfolk vil I

vide at vælge passende vækstbetingelser og udvindings- I

metoder. I

I Isolationen af det nyligt syntetiserede polypeptid er I

' afhængig af et analysesystem til påvisning af polypeptidet. i I

Igen er sådanne analysesystemer velkendte for fagfolk. Hvis | I

I f.eks. det nyligt syntetiserede polypeptid udviser GO-akti- I

I vitet, kan polypeptidet påvises ved at analysere for netop I

I denne enzymatiske aktivitet. I eksemplerne nedenfor er ana- I

lyser for GO-aktivitet beskrevet. I

I Det er også muligt at påvise nyligt syntetiseret polypeptid I

I ved et immunoassay ved anvendelse af antistoffer mod poly- I

I peptider, der er stort set lig med GO, bl.a. også GO. I I

I dette tilfælde vil det anvendte antistofs type afspejle den I

I forventede tilstedeværelse eller det forventede fravær af I

specifikke, kendte epitoper. Immunoassay-teknik vil være I

I velkendt for fagfolk, og polyklonale antistoffer mod GO fra I

I A. niger er kommercielt tilgængelige. I

Det eksprimerede polypeptid kan isoleres og oprenses til en I

I ønsket renhedsgrad. Oprensningsmetoder herfor tilhører den I

I kendte teknik, bl.a. kan nævnes saltfraktionering, kromato- I

grafi på ionbyttersøjler, affinitetskromatografi, centri- I

fugering og lignende. Se f.eks. Methods in Enzymology og I

Scopes, 1987, hvor en række oprensningsmetoder omtales. I

- 27 - DK 175658 B1 I almindelighed kan man ved rekombinant produktion af GO få tilvejebragt betragtelige mængder af præparater, som indeholder dette enzym og stort set ingen kontaminerende proteiner, d.v.s af en renhedsgrad på mindst 90%. Dette at man kan få store mængder af polypeptidet i en høj renhedsgrad, er et resultat af anvendelsen af rekombinante ekspressionssytstemer, som tillader udskillelse af det rekombinant producerede polypepetid til mediet. Ved således at anvende konventionelle fremgangsmåder på rekombinante kulturer kan man få GO-præparater i betragtelig mængde og af en pæn renhedsgrad.

Det skal bemærkes, at produktion af GO med sekvensoplysningerne ifølge den foreliggende opfindelse, ikke er begrænset til rekombinante metoder. GO kan også syntetiseres ad kemisk vej, f.eks. ved fast-fase-peptidsyntese. Sådanne metoder vil være velkendte for fagfolk.

De rekombinante polypeptider, som stort set er lig GO, bl.a. også GO selv, kan anvendes til fremstilling af antistoffer, både polyklonale og monoklonale. Vil man have polyklonale antistoffer, immuniseres et udvalgt pattedyr (f.eks. mus, kaniner, geder, heste, etc.) med oprenset GO eller et fragment heraf eller en analog forbindelse hertil.

Der opsamles serum fra det immuniserede dyr, og dette behandles ved anvendelse af velkendte metoder. Hvis serum med polyklonalt antistof mod GO indeholder antistoffer mod andre antigener, kan de polyklonale antistoffer mod GO oprenses ved immunoaffinitet.

Monoklonale antistoffer mod GO kan også let fremstilles af fagfolk. Man følger blot de almene fremgangsmåder til fremstilling af monoklonale antistoffer ved hjælp af hybri-doma'er, se f.eks. Schreier et al, 1980; Hammerling et al, 1981; Kennet et al, 1980. Samlinger af monoklonale antistoffer fremstillet mod GO kan screenes for forskellige egenskaber: f.eks. isotype, epitop, affinitet etc. Mono-

I DK 175658 B1 I

I - 28 - I

klonale antistoffer rettet mod specifikke epitoper er I

nyttige til definition af interaktionerne med GO. Desuden I

er monoklonale antistoffer nyttige ved oprensninger af I

nativt eller rekombinant produceret GO, hvor der anvendes I

metoder baseret på immunoaffinitet. I

Hvis GO eller polypeptider, som stort set er lig GO, I

skal anvendes terapeutisk, kan man ønske at få linket poly- I

peptidmolekylet til et effektivt system til frigivelse af I

GO på rette sted, hvilket system også vil beskytte polypep- I

tidet mod proteolyse og samtidig forårsage en kontrolleret I

frigivelse af polypeptidet. Frigivelsessystemer for mole- I

kyler er kendt af fagfolk, se f.eks. en oversigtsartikel i I

I Poznansky et al, 1980. Frigivelsessystemer for medicin kan I

I f.eks. omfatte liposomer eller antistoffer, som er rettet I

I mod specifikke målceller. I

Generelt anvendelige metoder til ekstraktion af polynucleo- I

H tider fra celler, til fremstilling af og probe-dannelse ud I

I fra cDNA og/eller et genomisk bibliotek, til sekvensering I

I af kloner, til konstruktion af ekspressionsvektorer, I

I transformation af celler o.l. tilhører den kendte teknik, I

og man har adgang til laboratoriemanualer, som beskriver I

I disse metoder. Alligevel angives i det følgende nogle I

I generelle retningslinier vedrørende* tilgængelige referencer I

I og de materialer, som skal anvendes.

I Værter og ekspressionskontrolsekvenser I

I Både prokaryotiske og eukaryotiske værtsceller kan anvendes I

til ekspression af ønskede kodningssekvenser, når der an- I

I vendes passende kontrolsekvenser, som er kompatible med de I

I designerede værter. E. coli er den hyppigst anvendte pro- I

I karyotiske vært. Ekspressionskontrolsekvenser for prokaryo- I

I ter omfatter promotorer, eventuelt med operatordele, og I

I ribosombindingssæder. Transfervektorer, som er kompatible

I med prokaryotiske værter, er i almindelighed afledt af I

9 - 29 - DK 175658 B1 f.eks. pBR322, et plasmid med operon'er, som fremkalder ampicillin- og tetracyklinresistens, og af de forskellige pUC-vektorer, som også indeholder sekvenser, der bevirker fremkomst af antibiotikaresistensmarkører. Disse markører kan med held anvendes til at opnå transformanter ved selektion. Blandt de sædvanligt anvendte prokaryotiske ! kontrolsekvenser kan nævnes beta-lactamase- (penicillina se-) og lactose-promotorsystemet (Chang et al, 1977), tryptophan(trp-)promotorsystemet (Goeddel et al, 1980), det lambda-afledte P -promotorsystem, N-gen-ribosom-

Li bindingssædet (Shimatake et al, 1981) samt den hybride . tac-promotor (De Boer et al, 1983), som er afledt af sekvenser fra trp- og lac-UV5-promotorerne. Der kendes også j sekvenser, som, når de fusioneres med en kodningssekvens, I forårsager sekretion af det eksprimerede polypeptid fra E. coli, bl.a. det bakterielle pelB-gen (pektatlyase) fra Erwinia carotovora (Lei et al, 1987). De foregående systemer er særligt kompatible med E. coli; de kan dog også om ønsket anvendes med andre prokaryotiske værter, som f.eks. stammer af Bacillus eller Pseudomonas med tilsvarende kontrolsekvenser.

j Eukaryotiske værter omfatter dyrkningssystemer med gær og pattedyrsceller. S. cerevisiae og S. carlsbergensis er de hyppigst anvendte gærværter, og det er svampeværter., som er behagelige at arbejde med. Gærkompatible vektorer bærer markører, som tillader succesfuld selektion af transformanter, idet der dannes prototrof-ti1-auxotrof-mutanter eller tungmetalresistente mutanter af vild-type-stammer.

I gærkompatible vektorer kan det 2 mikrometer lange repli-kationsstartsæde (Broach et al, 1983), kombinationen af CEN3 og ARSI eller andre replikationssikrende arrangementer være anvendt, såvel som sekvenser, der vil resultere i inkorporering af et passende fragment i værtscellens genom. Kontrolsekvenser for gærvektorer tilhører den kendte teknik, bl.a. kan nævnes promotorer for syntesen af glyco-lytiske enzymer (Hess et al, 1968; Holland et al, 1978),

DK 175658 B1 I

I

H inclusive promotoren for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman, I

H 1980). Man kan også anvende terminatorer, som f.eks. de I

fra enoiasegenet (Holland, 1981) eller fra glycer- I

aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAP) afledte (se eksem- I

H' pierne). Blandt sarligt nyttige kontrolsystemer kan nævnes ; I

sådanne, som omfatter GAP-promotoren eller deri regulerbare i I

alkoholdehydrogenase-promotor eller hybrider heraf (se ek- I

H semplerne), terminatorer afledt af GAP, og hvis sekretion I

ønskes også leader-sekvenser fra gær-alpha-faktoren. Herud- I

over kan transskriptionsreguleringsområdet og transskrip- I

tionsstartområdet, som er operabelt linket, være af en I

sådan karakter, at de ikke naturligt er forbundet i I

vild-type organismen. Disse systemer er beskrevet i I

detaljer i US patentskrifterne nr. 468.589, 522.909, I

760.197, 868.639, 073.381, 081.302 og 139.682. I

Pattedyrscellelinier som værter for ekspression tilhører I

den kendte teknik, man ka bl.a. anvende mange udødelig- I

gjorte cellelinier, som fås fra American Type Culture I

I Collection (ATCC), bl.a. HeLa-celler, ovarieceller fra ki- I

I nesiske hamstere (CHO-celler; Chinese Hamster Ovary Cells), I

nyreceller fra babyhamstere (BHK-celler; Baby Hamster Kid- I

I ney Cells) og en række andre cellelinier. Blandt passende I

promotorer for pattedyrsceller og tilhørende den kendte I

I teknik kan nævnes virale promotorer som Simian Virus 40 I

I (SV40), Rous Sarcoma Virus (RSV), Adenovirus (ADV) og den I

I Bovine Papilloma Virus (BPV). Også terminatorsekvenser og I

poly-A-adenyleringssekvenser kan være nødvendige for pat- I

tedyrsceller; der kan også være tale om inkorporering af I

forstærkersekvenser, som forøger ekspressionen, og I

sekvenser, som giver anledning til forstærkning af genet I

kan også være ønskede. Sådanne sekvenser tilhører den I

kendte teknik. Passende vektorer til replikation i I

pattedyrsceller kan være virale replikon’er eller sekven- I

ser, som sikrer integration af den pågældende sekvens i I

I I

værtens genonu

• I

- 31 - DK 175658 B1

Transformationer

Transformation kan foretages på en hvilken som helst kendt måde til indføring af polynucleotider i en værtscelle, bl.a. også ved indpakning af polynucleotidet i en virus og transduktion af en værtscelle med dette virus, og ved direkte optagelse af polynucleotidet. Transformationsproceduren afhænger af den vært, som skal transformeres.

For eksempel diskuteres transformationen af S. cerevisiae med ekspressionsvektorer, der koder for GO, i de følgende \ eksempler. Bakteriel transformation ved direkte optagelse sker sædvanligvis ved behandling med calcium- eller rubidiumch-lorid (Cohen, 1972; Maniatis, 1982). Gærtransformation ved direkte optagelse kan udføres ved anvendelse af den af Hinnen et al, 1978, angivne metode. Pattedyrscelletransformation ved direkte optagelse kan foretages ved anvendelse af calciumphosphatpræcipitationsmetoden ifølge Graham og Van der Eb, 1978, eller ved en af de mange kendte modifikationer heraf.

Konstruktion af vektorer

Ved konstruktion af vektorer anvendes fremgangsmåder, som er velkendte for fagfolk. Sæde-specifik DNA-spaltning foretages ved behandling med passende restriktionsenzymer under betingelser, som sædvanligvis er angivet af producenten af disse kommercielt tilgængelige enzymer. I almindelighed spaltes .1 mikrogram plasmid eller DNA-sekvens af 1 enzymenhed i ca. 20 mikroliter pufferopløsning ved inkubation i ! 1-2 timer ved 37°C. Efter inkubation med restriktions enzymet fjernes protein ved ekstraktion med phenol/chloro-form, og DNA udvindes ved præcipitation med ethanol. De spaltede fragmenter kan så separeres ved anvendelse af i i polyacrylamid- eller agarosegelelektroforese, jvf. Methods in Enzymology, 1980, b. 65, s. 499-560, hvor de generelle procedurer er angivet.

DK 175658 B1 I

I ~ 32 - I

H Spaltningsfragmenter med klæbende ender ("sticky ends") kan I

H gøres stumpendede ("be blunt ended") ved anvendelse af I

E. coli DNA-polymerase I (Klenow) i nærvær af de passende I

deoxynucleotidtriphosphater (dNTP'er) i blandingen. Man kan I

også anvende en behandling med Sl-nuclease, hvilket resul- I

terer i hydrolyse af alle enkeltstrengede DNA-dele. I

H Ligeringer foretages ved anvendelse af standardpuffere og I

standardtemperatur med T4-DNA-ligase og ATP, ligeringer af I

klæbende ender kræver mindre ATP og mindre ligase end lige- I

ring af stumpe ender. Når der anvendes vektorfragmenter som I

bestanddel af en ligeringsblanding, behandles disse ofte I

med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) eller alkalisk I

phosphatase fra kalvetarme med henblik på fjernelse af I

5'-phosphatgruppen, hvorved man forhindrer religering af I

vektoren; alternativt kan man benytte sig af en nedbrydning I

med restriktionsenzymer af uønskede fragmenter for at for- I

hindre ligering. I

H Ligeringsblandinger transformeres over i passende klonings- I

værter, som f.eks. E. coli, og transformanter selekteres I

I f.eks. med held ved hjælp af antibiotikaresistens, og der I

screenes efter den korrekte konstruktion. I

I Konstruktion af ønskede DNA-sekvenser I

I Syntetiske oligonucleotider kan fremstilles ved anvendelse I af en automatisk oligonucleotidsyntetisator, som beskrevet I af Warner, 1984. Om ønsket kan de syntetiske strenge 32 mærkes med P ved behandling med polynucleotidkinase i I 32 nærvær af P-ATP, idet der anvendes . standardbetingelser I ved reaktionen.

I DNA-sekvenser som f.eks. de fra cDNA-biblioteker isolerede kan modificeres ved anvendelse af kendt teknik, bl.a. ved sæde-styret mutagenisering, som beskrevet af Zoller, 1982.

Det DNA, som skal modificeres, pakkes ind i en phag som en - 33 - DK 175658 B1 enkeltstrenget sekvens og omdannes til dobbeltstrenget DNA med DNA-polymerase, idet der som primer anvendes et syntetiske oligonucleotid, som er komplementært til den del af DNA-materialet, som skal modificeres, og har den ønskede modifikation inkorporeret i sin egen sekvens. Det resulterende dobbeltstrengede DNA transformeres over i en værtsbakterie, som bærer phagen. Med henblik på at få plak-belægninger spreder man på agarplader kulturer af den transformerede bakterie, som indeholder replikationer af hver streng fra phagen. I teorien indeholder 50% af de nye plak-belægninger phager med den muterede sekvens, og de resterende 50% indeholder originalsekvensen. Replikater af plak-belægningerne bringes til at hybridisere til mærkede, syntetiske prober ved temperaturer og betingelser, som tillader hybridisering med den korrekte streng, men ikke med den ikke- modificerede sekvens. De sekvenser, som er blevet identificeret ved hybridisering, udvindes og klones.

Hybridisering med prober DNA-biblioteker kan "probes" (behandles med prober) ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Grunstein og Hogness, 1975. Kort fortalt går det ud på, at det DNA, som skal probes, immobiliseres på nitrocellulosefiltre, denatureres og præhybridiseres med en puffer . med 0-50% formamid, 0,75M NaCl, 75mM Na-citrat, 0,02% (vægt/vol.).bovint serumalbumin, polyvinylpyrrolidon og Ficoll, 50mM Na-phosphat (pH 6,5), 0,1% SDS og 100 mikrogram/ml denatureret bæ- rer-DNA. Den anvendte formamid-procent i pufferen, såvel som tiden og temperaturen under præhybridiseringen og efterfølgende hybridiseringstrin, afhænger af den nødvendige stringencitet. Oligomere prober, som kræver mindre stringente betingelser, anvendes i almindelighed ved en lavere procentdel formamid, ved lavere temperatur og længere hybridiseringstid. Prober med mere end 30 eller 40 nucleo-tider, som f.eks. de fra cDNA eller genomiske sekvenser afledede, kræver i almindelighed anvendelse af højere tem-

I DK 175658 B1 I

I I

H peratur, f.eks. omkring 40 - 42°C, og en høj procentdel I

H formamid, f.eks. 50%. Efter præhybridisering tilsættes I

32 I

pufferen en 5'- P-mærket oligonucleotidprobe, og filtrene I

H inkuberes i denne blanding under hybridiseringsbetingelser. I

H Efter vask underkastes de behandlede filtre autoradiografi, I

så man kan se placeringen af den hybridiserede probe; til- I

svarende placeret DNA på de originale agarplader anvendes I

som kilden til det ønskede DNA. I

Verifikation af konstruktionen og sekvensering I

I tilfældet med rutineprægede vektorkonstruktioner trans- I

! formeres ligeringsblandinger over i E. coli stammen HB101 I

eller en anden passende vært, og ønskede transformanter I

selekteres ved hjælp af antibiotikaresistens eller med I

I andre markører. Så fremstilles der plasmider ud fra trans- I

I formanterne ved fremgangsmåden ifølge Clewell et al, 1969, I

I sædvanligvis efterfulgt af chloramphenicolforstærkning I

(Clewell, 1972). DNA'et isoleres Og analyseres, I

sædvanligvis ved restriktionsenzymanalysering og/eller se- I

kvensering. Med sekvensering menes dideoxymetoden ifølge I

I Sanger et al, 1977, yderligere beskrevet af Messing et al, I

I 1981, eller den af Maxam et al, 1980, beskrevne fremgangs- I

I måde. Ved anvendelse af T-deazoguanosin ifølge Barr et al, I

1986, elimineres problemer med båndkompression, som man I

I ofte observerer i GC-rige områder. I

I Opfindelsen skal i det følgende beskrives nærmere ved hjælp I

I af nogle eksempler, men der er kun tale om særlige udførel- I

I sesformer for opfindelsen; det er ikke hensigten, at eksem- I

I pierne skal begrænse opfindelsen. For fagfolk vil adskil- I

I lige udførelsesformer indenfor kravenes rammer være indly- I

sende. De i nærværende sektion angivne procedurer kan I

f.eks. om ønsket gentages, men det er ikke nødvendigt, da I

I der findes metoder til konstruktion af de ønskede nucleo- I

I tidsekvenser på basis af den information, som tilveje- I

I bringes med opfindelsen. Ekspressionen eksemplificeres i I

f - 35 - DK 175658 B1

Saccharomyces cerevisiae; imidlertid er også andre systemer tilgængelige, jvf.. ovenstående mere detaljerede gennemgang.

Alle DNA-manipulationer foretages ved hjælp af standardprocedurer, med mindre andet er angivet, se Maniatis et al, 1982. Andre enzymer end glucoseoxidase benyttes som specificeret af producenten eller forhandleren. Enzymer fås, med mindre andet er angivet, enten fra New England Biolabs eller Bethesda Research Laboratories. Gær transformeres og dyrkes ved anvendelse af et antal medier, bl.a. også selektive medier {gær-nitrogen-basis uden leucin); YEPD-mediet med 1% (vægt/vol.) gærekstrakt, 2% (vægt/vol.) pepton og 2% (vægt/vol.) glucose og andre medier, se beskrivelsen nedenfor. Når det drejer sig om plademedier tilsættes 2% (vægt/vol.) agar, og når det gælder transformation 3% topagar med 1M sorbitol.

Blandt E. coli stammer, som kan bruges ved transformation, kan nævnes Chil776; K12 stammen 294 (ATCC nr. 31446); RR1, HB101 og Dl210. Blandt anvendelige gærstammer i forbindelse med transformation kan nævnes AB110 og GRF180.

Gærstammen AB110 er af genotypen Mat alpha, ura3-52, leu2-04 eller både leu2-3 og leu2-112, pep4-3, his4-580, cir°. En prøve af denne stamme med et andet heterologt plasmid er deponeret hos ATCC den 9. maj 1984 med nr.

20709, se EP offentliggørelsesskrift nr. 164.556.

Gærstammen GRF180 er af genotypen leu2-3, leu2-112, his3-ll, his3-15, CAN, cir°. Denne stamme kan fås ved at j "kurere" stammen GRF18 (fås som beskrevet i EP ansøgning nr. 858701070.9, offentliggørelsesskrift nr. 0.184.575) for det endogene 2 millimikrometer plasmid ved at anvende pCl/1 eller et dermed beslægtet plasmid, som beskrevet af Erhard og Hollenberg, 1983.

GO-aktiviteten måles ved at koble peroxidase-o-dianisidin-

I DK 175658 B1 I

I - 36 - I

systemet til de GO-katalyserede reaktioner. Analyser for I

H GO, som er baseret på dette koblede system, er beskrevet i I

litteraturen, som ledsager de kommercielle GO-præparater, I

der fås fra Sigma Corporation og fra Worthington Corpora- I

tion. I almindelighed udføres reaktionen i en vandig I

opløsning i nærvær af puffer med pH 5,0-6,0, beta-D-glu- I

cose, peberrodsperoxidase og o-dianisidin. Oxidationen af I

farve37stoffet med det ved reaktionen dannede hydrogenperoxid I

følges ved at overvåge stigningen i optisk densitet ved I

H 450 nm eller 500 nm. En GO-aktivitetsenhed defineres som I

den mængde enzym, der frigiver et mikromol hydrogenperoxid I

pr. min. under de specificerede reaktionsbetingelser. I

I Fremstilling, isolation og sekvensering af GO-kodende cDNA I

I fra A. niger I

I almindelighed får man GO-kodende cDNA fra A. niger ved I

screening af et cDNA-bibliotek, der er konstrueret i lamb- I

I da-gtl0 med oligonucleotidprober, som er udviklet på basis I

af aminosyresekvensen af peptidfragmenter af oprenset GO. I

I. Fremstilling af et cDNA-bibliotek, som indeholder GO-koden- I

I de sekvenser fra A. niger I

For at vælge en kilde til GO-kodende nucleinsyrer screenes I

I stammer af A. niger fra American Type Culture Collection I

I for GO-produktion. Navnlig en stamme, A. niger 9029, anven- I

des som en kilde til mRNA’er, hvorfra cDNA-biblioteket kan I

fremstilles, da man finder, at denne stamme producerer GO I

I og udskiller det til mediet. For at bestemme, om der produ- I

I ceres GO eller ej, dyrkes stammen i YEPD-mediet, og I

I GO-aktiviteten i de konditionerede medier bestemmes. GO-ak- I

I tiviteten måles ved at koble peroxidase-o-dianisidin-sy- I

stemet til GO-systemet. I

I Tilstedeværelsen af GO i det konditionerede medium bekræf- I

I tes ved Western Blot Analyse under anvendelse af et ka- I

- 37 - DK 175658 B1 nin-anti-GO-antistof, som leveres af Accurate Chemicals.

cDNA-biblioteket fremstilles fra poly-A+-RNA, som isoleres fra mycelium af A. niger 9029 i den logaritmiske vækstfase i YEPD-medium. Første isoleres alt RNA ved en modifikatio.n af fremgangsmåden ifølge Chirgwin et al, 1979. Ved denne fremgangsmåde slås cellerne itu i 4M guanidinthiocyanat og 0,1M mercaptoethanol, hvorved proteinerne denatureres og disulfidbindinger brydes. Så separeres RNA fra DNA og proteiner ved ultracentrifugering gennem en pude af 5,7M CsCl som beskrevet af Glisin, 1974, der anvendes dog en lodret rotor (VTi50, Beckman) i stedet for en svingende skovlrotor. Poly-A+-RNA-fraktionen isoleres som beskrevet af Maniatis et al, 1982, under anvendelse af to passager over oligo-dT-cellulose. Syntesen af cDNA fra poly-A+-RNA og fremstillingen af et cDNA-bibliotek ud fra poly-A+-RNA fra A. niger 9029 i lambda gtlO foregår som beskrevet af Huynh, 1985; cDNA-syntesen foregår ved anvendelse af revers trans-skriptase og tilfældige primer'e. Bibliotekets kompleksitet er 1,6 x 10^.

Fremstilling af prober og screening af biblioteket

Med henblik på at designe prober, som er egnede til screening af lambda gtlO biblioteket for phager indeholdende GO-kodende cDNA (GO-cDNA) bestemmes aminosyresekvensen for oligopeptidfragmenter af oprenset GO. Man går frem på denne måde, da det overraskende nok ikke har været muligt at bestemme aminosyresekvensen for hele polypeptidet, kun- for de første ti aminosyrer.

Kommercielt GO oprenses yderligere ved elektroforese på en polyacrylamidgel i nærvær af natriumdocecylsulphat (SDS) under de af Laemmli, 1970, beskrevne betingelser. Proteinet elueres fra gelen og nedbrydes med trypsin eller med cyano-genbromid (CNBr) til fragmenter; der er her tale om proteinkemiske standardmetoder. CNBr-nedbrydningen foregår i Η

I DK 175658 B1 I

I - 38- I

70% myresyre. Trypsin-nedbrydningen foregår efter behand- I

ling af GO med citrakonsyreanhydrid (citraconic anhydride, I

anhydridet af methylmaleinsyre), som specifikt blokerer I

lysingrupper og reducerer trypsins specificitet til I

ikke-modificerede arginingrupper. Proteinet reduceres I

typisk og carboxymethyleres ved anvendelse af mercapto- I

ethanol og iodeddikesyrre for disse behandlinger, så even- I

I tuelle disulfidbindinger brydes. I

De fremkomne peptider separeres og oprenses ved anvendelse I

af HPLC. Et antal forskellige metoder anvendes. Der anven- I

des både neutrale og sure systemer i omvendt fase med ace- I

I tonitrilgradienter. Til at begynde med separeres frag- I

I menterne efter størrelse ved anvendelse af Bio-Gel PIO i I

30% myresyre, eller de separeres efter ladning ved ionbyt- I

terkromatografi i 6M urinstofpuffersystemer; og til yder- I

ligere separation af fragmenter til sekvensanalyser I

anvendes søjler af typerne PPLC Mono-S og Mono-Q.Med hen- I

H blik på at kunne garantere renheden af peptidfragmentet, I

I ( køres oprensningen på HPLC typisk to gange, d.v.s., at det I

oprensede fragment underkastes en ekstra oprensning ved at I

gentage HPLC-proceduren. GO-peptidfragmenternes aminosyre- I

H sekvens bestemmes ved anvendelse af en gasfase-sekvensator I

I {Applied Biosystems), idet producentens vejledning følges. I

I De fragmentsekvenser,. som er fremkommet ved denne analyse, I

er vist i fig. 1. I figuren angiver parenteserne I

usikkerheder i sekvensen, som den læses fra kromato- I

grammerne, med undtagelse af Arg- eller Met-grupperne ved I

I de N-terminale ender, som er anbragt der ud fra en viden I

I om specificiteten af spaltningsreagenset .{trypsin eller I

I CNBr). I

Der designes oligonucleotidprober på to måder. Prober med I

I fra 17 til 23 nucleotider fremstilles ud fra områder med I

I lavest degeneration. Alternativt baseres unikke længere I

prober på gæt på kode-skævheder {-bias). De designede I

I prober til screening af lambda gtlO biblioteket med GO-ko- I

- 39 - DK 175658 B1 dende sekvenser fra A. niger er vist i fig. 2. I figuren er vist aminosyresekvensen af fragmenterne, og de fra sekvenserne afledte prober. Størrelsen af den oligomere probe er også vist samt, for kortere prober, graden af degeneration.

Lambda gtlO biblioteket screenes for GO-cDNA-holdige kloner ved anvendelse af de ovenfor designede prober. Proberne fremstilles ved kemiske syntese ifølge konventionelle procedurer, hvor der anvendes phosphoramidkemi, som beskrevet i Urdea et al, 1983. De syntetiske prober mærkes 32 med P ved anvendelse af T.-polynucleotidkinase i nærvær 32 4 af P-ATP. Fremgangsmåden til mærkning af prober er beskrevet i Maniatis et al, 1982.

Screeningen af lambda gtlO biblioteket med proberne foregår stort set som beskrevet af Huynh, 1985. Filtrene hybridise-rer natten over ved stuetemperatur med 100.000 dpm/ml af hver af proberne long 6, long 7 og long 8 i 4 x SSC, 50mM Na-phosphat, pH 6,8, 2 x Denhardt's opløsning og 0,3 mg/ml ultralydbehandlet laksesperm-DNA. Så vaskes de ved 47°C i 3,OM tetramethylammoniumchlorid ifølge Wood et al, 1985, og underkastes autoradiografi i 6 døgn. Ingen af de korte prober kunne bruges til påvisning af kloner med GO-cDNA. Biblioteket screenes også med proberne long 6, long 7 og long 8 på blandet (poolet) form; og efter 6 døgns eksponering fås 4 lyse dobbelt-positive fra den screenede 5 4 x 10 phag. Efter gentagne screeninger med pool’en forbliver disse fire kloner GO-cDNA-positive. Så udplades phagen igen in triplika og screenes med de tre individuelle long-prober. De fire kloner hybridiserer med proberne long 7 og long 8. Ingen af klonerne hybridiserer dog med long 6. Dette resultat er overraskende, da proberne long 7 og long 8 med undtagelse af en enkelt baseændring er underkategorier eller -enheder (subsets) af long 6, se fig. 3.

Tilstedeværelsen af cDNA, som binder proberne long 7 og long 8, i de fire positive kloner bekræftes ved Southern

I DK 175658 B1 I

I - 40 - I

Blot Analyse af DNA-materialet. Isoleret DNA fra hver klon I

behandles med ÉcoRI og analyseres ved Southern Blot I

Analyse, som beskrevet af Maniatis ét al, 1982, ved I

anvendelse af en blanding af proberne long 7 og long 8. Kun I

et enkelt bånd i hver klon hybridiserer med proberne. I

Størrelsen af cDNA'erne i båndene svarende til klon 1-4 er I

henholdsvis 0,9 kB, 0,9 kB, 0,3 kB og 0,7 kB. I

Bevis for at cDNA'et i klon 4 er overlappende med cDNA'et i I

de andre tre kloner får man ved at vise, at det indsatte I

H cDNA isoleret fra klon 4 hybridiserer med det indsatte cDNA I

fra klon 1, 2 og 3 under meget stringente betingelser. Det I

indsatte cDNA fra klon 4 skasres. ud med EcoRi, isoleres ved I

32 . I

gelelektroforese og mærkes med P ved nick-translatenng.

Nick-translating er beskrevet af Maniatis, 1982. De andre I

tre kloner nedbrydes med EcoRI, underkastes elektroforese I

på en 1% agarosegel og blottes over på nitrocellulose. Den I

nick-translaterede klon 4 probe denatureres og bringes til I

at hybridisere med det nævnte Southern Blot under de I

H ovenfor ved screeningen af cDNA-biblioteket nævnte beting- I

eiser, idet dog blandingen indeholder 50% formamid, og idet I

H der inkuberes ved 42°C natten over. Så vaskes filteret ved I

I 60°C i 0,1 x SSC og underkastes autoradiografi. I

I Nucleotidsekvensen for GO-cDNA I

I cDNA'erne i klon 1-4 bestemmes ved metoden ifølge Sanger et I

al, 1977. Denne går i det store og hele ud på, at man I

I skærer cDNA'erne ud fra klonerne med EcoRi og isolerer dem I

ved størrelsesfraktionereing ved anvendelse af gelelektro- I

I forese. EcoRI-restriktionsfragmenterne subklones ind i I

I Ml3-vektorerne mpl8 og mpl9 {Messing, 1983) og sekvenseres I

I ved anvendelse af dideoxykædetermineringsmetoden ifølge I

I Sanger et al, 1977. I

I Nucleotidsekvensen for EcoRI-fragmentet (omtrent 700 bp) I

I fra klon 4 er vist i fig. 4. Restriktionsenzymkortet for I

- 41 - DK 175658 B1 fragmentet er vist i fig. 4A. Nucleotidsekvensen, så vel som de aminosyrer, den koder for, er vist i fig. 4B. Restriktionsenzymsædernes placering er også vist i fig. 4B. GO-cDNA-fragmentet i klon 4 består af en enkelt åben aflæseramme. I GO-cDNA fra klon 4 er der kodet for to af de peptidfragmenter, som blev analyseret ved aminosyresekvens-analyse, dog er to af de 36 aminosyrer ændret. Fragmenternes aminosyresekvenser er vist i fig. 1.

Komposit cDNA kan konstrueres ud fra nucleotidsekvenserne for GO-cDNA i klon 1 og 2, hvilken sidste sandsynligvis er en cDNA-klon af fuld længde. Nucleotidsekvensen for det kompositte cDNA er vist i fig. 5. I fig. 5A er vist et restriktionsenzymkort for sekvensen. I fig. 5B er vist den kompositte nucleotidsekvens, der er afledt fra klonerne, samt restriktionsenzymsæderne. Der er også vist de aminosyrer, der er kodet for i sekvensen. Af sekvenserne fremgår det,· at det færdige protein består af 583 aminosyrer; ami-nosyresekvensen indeholder kun 3 cysteingrupper og 8 con-sensus-glycosyleringssæder. Aminosyresekvensen indeholder en præ-pro-sekvens på 22 aminosyrer og har et enkelt basisk spaltningssæde (Arg-Ser) i begyndelsen af den færdige sekvens.

Man får bevist, at den kompositte cDNA-sekvens koder for GO ved at sammenligne aminosyresekvensen for peptidfragmenterne fra oprenset GO (se ovenfor) med de i det kompositte cDNA indkodede aminosyresekvenser. Denne sammenligning er foretaget i fig. 6, hvor den afledte aminosyre-sekvens er vist over nucleotidsekvensen. De aminosyresekvenser, som svarer til sekvenser i peptidfragmenterne fra oprenset GO, er understreget. Afvigelser mellem den afledte sekvens og sekvenserne for fragmenterne af oprenset GO er også angivet- Det fremgår af fig. 6, at der er meget få forskelle mellem de fra cDNA afledte sekvenser og sekvenserne fra de isolerede GO-peptider.

I DK 175658 B1 I

- 42 - I

I fig. 6 er også vist nogle oplysninger om molekylvægten I

H for polypeptidet, inclusive signalpeptidet, og om kodean- I

H vendeisen i A. niger, på basis af den GO-kodende nucleotid- I

sekvens. I

Ud fra sekvensen af det kompositte cDNA kan man forudsige, I

at det færdige, ikke-glycosylerede GO må have en molekyl- I

vægt på omkring 63.300. Det færdige polypeptid indeholder I

8 consensus-glycosyleringssæder. Hvis man antager, at der I

er 2 kD kulhydrat for hvert sæde, vil molekylvægten (MW) I

H for en glycosyleret GO-monomer være 79 kD. Dette er I

konsistent med den observerede molekylvægt for en GO-mono- I

I mer, som er på 75 kD. Endvidere er aminosyre- I

sammensætningen, som den afledes fra cDNA-sekvensen, i I

overensstemmelse med den i litteraturen angivne aminosyre- I

sammensætning. Den rapporterede aminosyresammensætning er I

bekræftet ved separate forsøg (ikke omtalt). Herudover I

giver cDNA'et ved ekspressionen, som omtalt senere, aktivt I

glucoseoxidase. I

I Isolation og sekvensanalyserinq af genomiske sekvenser, der I

I koder for GO I

H De ovenfor beskrevne oligonucleotidprober og de nick-trans- I

laterede fragmenter af GO-cDNA, hvis isolering er beskrevet I

H ovenfor, anvendes til isolering af en genomisk A. niger I

I klon fra et pBR322-baseret A. niger bibliotek, fremstillet I

I i E. coli stammen DH5. I

Konstruktion af A. niger biblioteket og isolering af I

I genomiske kloner, der koder for GO I

I Der fremstilles genomisk DNA fra celler af A. niger 9029 I

ved fremgangsmåden ifølge Boel et al, 1984. Dette DNA (50 I

I mikrogram) behandles med Sau3a under betingelser, hvor der I

I sker en delvis nedbrydning (1 enhed Sau3a i 1 ml i 50 min. I

I ved 37°C), og reaktionen stoppes ved tilsætning af EDTA. I

I I

- 43 - DK 175658 B1

Det nedbrudte DNA køres på en præparativ 1% agarosegel, og DNA i størrelsesområdet 7-10 kB isoleres. Dette DNA ligeres ind i pBR322, som er lineariseret med BamHI, behandlet med alkalisk phosphatase og gelisoleret. Det resulterende lige- rede DNA transformeres ind i E. coli og spredes på 10 store plader. I alt fås 340.000 transformanter. Der fremstilles

pi smid-DNA separat fra hver plade, og man får omkring I

35.000 rekombinanter. 60.000 kolonier fra en enkelt pool udplades og der fremstilles dobbelte nitrocellulosereplika.

Et 600 bp langt NcoI-EcoRI-fragment fra cDNA-klon 2 nick-translateres og anvendes som en probe under de ovenfor omtalte betingelser. Efter autoradiografi får man 4 potentielle kloner, hvoraf den ene, 17a, senere ved Southern Blotting og sekvensanalyse viser sig at være korrekt.

Lsnqdeanalyse af restriktionsfragmenterne åf GO-kodende genomisk DNA

Tilstedeværelsen eller fraværet af intron'er i genomiske sekvenser kan bestemmes ved sammenligning af størrelsen af cDNA-fragmenter og genomisk DNA, som fremkommer ved nedbrydning med restriktionsenzymer. Fragmenterne analyseres ved Southern metoden, idet der anvendes en probe til at påvise sekvenser, som koder for GO.

Den genomiske klon 17a og cDNA-klonen pBRlambda2A skæres begge med Ncol, der skærer 4 gange i cDNA'et, og der fremkommer et særligt mønster eller billede bestående af små fragmenter. Efter analyse både på agarose- og acrylamid-geler viser det sig, at Ncol-restriktionsmønsteret er det samme for begge kloner. Herefter skæres DNA fra klon 17a med EcoRI, Xhol, Sall og Hindlll; der skæres med disse enzymer alene og i parvise kombinationer. Stumperne underkastes elektroforese på agarosegeler og overføres til nitrocellulosefiltre. Filtrene probes med et 600 bp NcoI-EcoRI- fragment fra 3'-halvdelen af den genomiske sekvens i klon 32 17a. Disse prober ér blevet mærket med P ved nick-trans-

I DK 175658 B1 I

- 44 - I

latering. I alle tilfælde er det genomiske kort kongruent I

H med cDNA-kortet. I

H Desuden skæres genomisk DNA fra A. niger med de samme I

enzymer, blottes og hybridiseres med de samme prober. Som I

resultat får man det samme mønster som ved klon 17a. I

Disse resultater tyder på, at der ikke er forekommet omar- I

H rangementer og/eller deletioner under kloningsproceduren. I

Analysen ved hjælp af Southern Blotting tyder på, at I

restriktionsenzymfragmenterne, som påvises ved hjælp af I

proberne, er af samme størrelse i GO-cDNA-materialet, i de I

H genomiske kloner og i de genomiske sekvenser af DNA, som er I

isoleret fra A. niger. Hermed er det bevist, at genomisk I

GO-kodende DNA fra A. niger overraskende nok mangler I

intronsekvenser. I

Nucleotidsekvenserinq af GO-promotorområdet I

I Det antages, at det område, som udgør en flanke til GO-kod- I

ningssekvensens 5'-ende, indeholder genets promotorsekvens. I

Dette område og det tilstødende område, der koder for GO's I

I NH2~område, isoleres som et polynucleotidfragment fra en I

genomisk klon af GO, og det isolerede fragments nucleo- I

tidsekvens bestemmes. I

I GO-genets promotorområde isoleres fra den genomiske klon I

I 17a (se de følgende afsnit m.h.t. fremxtilling af genomiske I

I kloner). Fragmentet spaltes fra pBR322-vektorsekvenserne I

ved skæring med EcoRI og Sall, og fragmentet på omkring I

I 609 bp isoleres ved gelelektroforese. Det isolerede frag- I

I ment klones ind i Ml3 vektorer og .sekvenseres ved dideoxy- I

I kædetermineringsmetoden (se ovenfor). Dette områdes sekvens I

I er vist i fig. 7. Restriktionsenzymkortet for sekvensen er I

I vist i fig. 7A; sekvensen og restriktionsenzymsæderne er I

vist i fig. 7B. I fig. 7B er også vist aminosyresekvensen I

I for det NH^-terminale område af GO, som er indkodet i den I

I I

- 45 - DK 175658 B1 genomiske klon.

Konstruktion af vektorer til ekspression af GO-cDNA i gær

Der konstrueres to ekspressionsvektorer til produktion af GO i gær. I disse ekspressionsvektorer er GO-kodnings-sekvenserne operabelt linket til sekvenser for transskription og ekspression af GO-polypeptidet. Begge vektorer indeholder den , hybride ADH2-GAP-promotor for reguleret transskription. Desuden er enten alpha-faktor-leader-se-kvensen fra S. cerevisiae eller GO-præ-pro-sekvensen fusioneret med kodningssekvensen for færdigt GO med henblik på at opnå sekretion.

GO-cDNA-materialet fra klon 2 (se ovenfor) skæres ud af lambda gtlO som et Hindlll-BgIII-fragment. Det resulterende restriktionsfragment, som indeholder noget flanke-lambda gtlO-DNA, indsættes mellem Hindlll- og BamHI-sæderne i pBR322, hvorved man får vektoren pBR-lambda-G02. I fig. 8 er vist skemaer over fremstillingen af ekspressionsvektorerne ved anvendelse af GO-cDNA-sekvenserne i pBR-lamb-da-G02.

Konstruktion af en ekspressionskassette i pAGS^GO ---—

En ekspressionskassette i et plasmid, som replikerer i E. coli, og hvor GO-kodningssekvenserne er operabelt linket til kontrolsekvenser, bl.a. den hybride ADH2-GAP-gær-promo-tor, GAP-terminatoren og sekretionssignalet afledt fra GO-genet i A. niger, konstrueres som følger: pBRlambda-2a-DNA skæres med Sall, som skærer omtrent 12 bp fra GO-kodningssekvensens N-terminale ende og en gang i pBR322. Der fremstilles en syntetisk duplex, der koder for den færdige GO-kodningssekvens' N-terminale ende, og denne ligeres til det skårne nucleotid.

i i

I DK 175658 B1 I

- 46 - I

Duplexens sekvens er: I

5’ AGATCTAATGGCATTGAAGCTTCCCTCCTGACTGATCCCAAGGATAGCT I

ATTACCGTAACTTCGAAGGGAGGACTGACTAGGGTTCCTACAGA I

CCGGCCGCACGG 3' I

I GGCCGGCGTGCCAGCT I

Der kan passende anbringes et Bglll-sæde ved det færdige I

GO's N-terminale ende, ved tavse mutationer i den sekvens, I

H der koder .for Arg-Ser. Efter ligering skæres blandingen I

med Bglll og PstI, og der isoleres et 980 bp langt fragment I

I med den N-terminale halvdel af GO-cDNA'et ved gelelektro- I

I forese. I

I Fragmentet, som indeholder det C-terminale område af I

GO-cDNA'et, isoleres ved at skære cDNA'et ud med EcoRI, I

I behandle det udskårne fragment med Klenow og de fire deoxy- I

nucleotidtriphosphater og ligere en syntetisk Bglll-linker I

I til fragmentet. Linkeren har følgende sekvens: I

I 5' GAGATCTC 3' I

I Det resulterende fragment skæres med Bglll og PstI. Efter I

I denne behandling isoleres GO-cDNA-fragmentet, som er på I

950 bp, ved hjælp af gelelektroforese. I

Det 980 bp lange og det 950 bp lange fragment ligeres. Da I

I ligering kan foregå ved de klæbende ender, som skyldes I

I både PstI og Bglll, behandles de ligerede fragmenter med I

I Bglll, og man får GO-cDNA med klæbende ender, der kan I

I danne Bglll-sæder. I

I Vektoren pAGAPl er et derivat af pPGAPl, hvor den reguler- I

I bare alkoholdehydrogenase-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydro- I

genase-promotor (ADH2-GAP) er indsat i stedet for glycer- I

I aldehyd-3-phosphatdehydrogenase-promotoren (GAPDH). Pias- I

- 47 - DK 175658 B1 midet pPGAPl er beskrevet i Travis et al, 1985, i EP offentliggørelsesskrift nr. 164.556 og i US patentansøgning nr. 760.197. I pAGAPl er ADH2-GAP-promotoren linket til GAP-terminatoren. Promotoren er et 1200 bp langt

BamHI-NcoI-fragment, der er isoleret fra pJSl03. Konstruktionen af denne promotor er beskrevet i US patentansøgning nr. 139.632. GAP-terminatoren er et 900 bp langt BglII-BamHI-fragment, som er afledt af pPGAPl. Se EP offentliggørelsesskrift nr.. 164.556. Fragmentet, som linker promotoren og terminatoren sammen er: (Ncol) (Bglll-, tidl. Sall-sæde)

5' CCATGGGAATTCGTTAGGTCGAGATCTCGAC 3’ GGTACCCTTAAGCAATCCAGCTCTAGAGCTG

De i denne sekvens indkodede enzymsæder er vist i parentes.

Dette fragment kan erstattes af gener af interesse.

Med henblik på indsætning af signalsekvensen for GO skæres pAGAPl med Ncol og Bglll, behandles med phosphatase og ligeres med følgende syntetiske duplex, der koder for GO-præ-pro-sekvensen: (Ncol) (Xhol)

5' CATGCAGACTCTCCTTGTCTCGAGCCTTGTGGTCTCCCTCGC GTCTGAGAGGAACAGAGCTCGGAACACCAGAGGGAGCG

(Bglll) TGCGGCCCTGCCACACTACATCA 3 *

ACGCCGGGACGGTGTGATGTAGTCTAG

Xhol-sædet inkorporeres ved anvendelse af tavse mutationer med henblik på assistance ved screeningen. Det resulterende plasmid, pAGS^Q, indeholder et BglIl-sæde efter præ-pro-se-kvensen, hvor GO-cDNA-sekvensen kan indsættes.

Indsættelsen af GO-cDNA-fragmentet i pAGS__ sker ved skæ-

GO

I DK 175658 B1 I

- 48 - I

ring af plasmidet med Bglll og phosphatase og efterfølgende I

.ligering af GO-cDNA'et til det lineariserede plasmid. Det I

resulterende plasmid benævnes pAGS^GO. I

Konstruktion af en ekspressionskassette i pAGa^p^aGO I

Man konstruerer en ekspressionskassette i et plasmid, som I

replikerer i E. coli, i hvilken kassette GO-kodningssekven- I

serne er operabelt linket til kontrolsekvenser, som omfat- . I

ter den hybride gær-promotor ADH2-GAP og alpha-faktoren fra I

gær som et sekretionssignal, på samme måde som pAG^^GO blev I

konstrueret (se ovenfor), bortset fra følgende: I

H Det plasmid, ind i hvilket GO-cDNA-fragmentet ligeres, er I

pCBR, som ligner pAGAPl, bortset fra, at alpha-faktor-lea- I

deren er indsat mellem promotoren og terminatoren med et I

unikt Bglll-sæde ved det dibasiske proces-sæde (processing I

H site) (lys-arg, eller med et-bogstav-kode: K-R) for KEX2. I

Det plasmid, som fremkommer ved indsætning af GO-cDNA-frag- I

mentet i pCBR, kaldes pAG^p^GO. I

H Konstruktion af GO-kodende gærekspressionsvektorer I

I Der konstrueres gærekspressionsvektorer, hvor GO-sekvensen I

er operabelt linket til sekvenser, som kontrollerer I

I ekspressionen og sekretionen af GO-polypeptidet, ved I

I at skære ekspressionskassetterne fra pAG^GO og PAGaiphaG0 I

med BAmHI og ved at indsætte dem i det unikke BamHI-sæde i I

plasmidet pAB24. I

Plasmid pAB24 (Fig. 9) er en gær-shuttle-vektor, som I

indeholder den komplette 2 mikrometer sekvens (Broach, I

1981) og pBR322-sekvenser. Det indeholder også URA3-genet I

fra gær, som er afledt af plasmidet YEp24 (Botstein et al, I

1979) og LEU2d-genet fra gær, som er afledt fra plasmid I

pCl/1, jvf. EP offentliggørelsesskrift nr. 116.201. Plasmid I

pAB24 konstrueres ved at skære YEp24 med EcoRI og religere I

- 49 - DK 175658 B1 vektoren, hvorved den partielle 2 mikrometer sekvens fjernes. Det resulterende plasmid, YEp24dejfcaRi, lineari-seres ved skæring med Clal og ligeres med det komplette 2-mikrometer plasmid, som er blevet lineariseret med Clal.

Det resulterende plasmid, pCBou, skæres så med Xbal, og det 8605 bp lange vektorfragment isoleres på en gel. Det isolerede Xbal-fragment ligeres med et 4460 bp langt Cbal-fragment med LEU2d-genet isoleret fra pCl/1; orienteringen af LEU2d-genet er· i samme retning som URA3-genet.

Med henblik på at konstruere gærekspressionsvektorer udskæres ekspressionskassetterne fra pAGS^GO og pAG^pj^GO me<3 BamHI, og plasmidet pAB24 lineariseres med det samme restriktionsenzym og nedbrydes med phosphatase. De udskårne ekspressionskassetter isoleres ved gelelektrofore-se. Det 1ineariserede plasmid ligeres med begge ekspressionskassetterne fra pAGS^GO, hvorved man får vektoren PAB24AGS....GO, eller med ekspressionskassetten fra

OVJ

pAGa^pkaG0, hvorved man får vektoren pAB24AGa^^aGO.

Ekspression af GO i gær fra pAB24AG5^qGO-10 og fra ΡΑΒ24 , , GO-1 c-alpha-

Med henblik på GO-produktion isoleres kloner af to af ekspressionsvektorerne, nemlig af pAB24AGSGQGO_^Q

pAB24AGa^p^aGO-l. Vektorerne konstrueres som beskrevet ovenfor. Begge vektorer indeholder den hybride ADH2-GAP-promotor til regulering af transskriptionen og enten alpha-faktor-leader’en fra S. cerevisiae (pAB24a^p^aGO) eller GO-præ-pro-sekvensen fusioneret med den færdige GO-kodningssekvens (pAB24SGGGO). Ved efterfølgende analyse af nucleotidsekvenserne for GO-kodnings- sekvensen afsløres imidlertid tilstedeværelsen af mutant-sekvenser i disse kloner.

.

DK 175658 B1 I

I I

Ekspression fra pAB24a^^aGQ-10 og fra pAB24c[c>GO-l I

H Gærstammen GRF 180 transformeres med de angivne kloner af I

disse plasmider ved fremgangsmåden ifølge Hinnen, 1978, og I

H der selekteres for leucin-prototrophe. Leucin-selektive I

medier med 8% glucose podes med transformanterne, og der I

H dyrkes i 48 timer. Der fortyndes til en startværdi for Ag,-Q I

på 0,05 over i YEP-ekspressionsmediet med 2% glucose. Kul- I

turerne ryster ved 30°C og 300 rpm, repræsentative prøver I

udtages hver 24. time. Cellerne separeres fra det konditio- I

nerede medium ved centrifugering i et mikrofuge i 1 min. I

ved 14.000 rpm, og glucoseoxidaseaktiviteten i mediet og i I

celle-ekstrakter bestemmes ved anvendelse af en stan- I

dard-glucoseoxidase fra Sigma. Celle-ekstrakter fremstilles I

H p

ved at behandle cellerne med glaskugler på en Vortex mix- I

er. Nærmere bestemt blandes celle-pellet med samme volumen I

syrevaskede glaskugler i lyseringspuffer med lOmM TRIS, I

R I

pH 8, og behandles på en Vortex mixer i 5x1 min, idet I

der opbevares på is imellem de enkelte behandlinger. Uoplø- I

H selige cellestumper fjernes ved centrifugering ved I

14.000 rpm i en mikrofuge ved 4°C. Resultaterne, aktivitet- I

en af glucoseoxidase, som eksprimeres efter 72 timers dyrk- I

I ning, er vist i tabel 1. I tabellen betyder symbolet I

"i.b.," at aktiviteten ikke er bestemt. I

I TABEL 1 I

Ekspression af GO i S. cerevisiae GRF180 I

Plasmid pAB24 pAB24SQOGO-l pAB24alphaGO“10 I

I Transformant 1 1212 I

I GO-aktivitet {mikrogram/ml kultur) I

I Kond. medium 0 54 63 51 31 I

I Celleekstrakt 0 50 i.b. 53 i.b. I

^1 I

- 51 - DK 175658 B1

Resultaterne i tabel 1 viser, at GO, som er indkodet i ekspressionsvektorerne, eksprimeres i gær, og at der udskilles GO-aktivitet på et højt niveau (mere end 25 mi-krogram/ml) til mediet. Der findes ingen påviselig aktivitet fra kontroltransformanter, der er transformeret med pAB24. På trods af de høje niveauer for udskilt GO-aktivitet udskilles kun omkring 50% af den samlede GO-aktivitet, hvilket altså vil sige, at den samlede syntese af GO i ! disse transformanter er meget høj, i visse tilfælde endda over 100 mikrogram/ml. Desuden synes overraskende nok ; sekretionssignalet fra A. niger, sammenlignet med gær-alpha-faktoren, at være en effektiv kontrolsekvens for sekretion af polypeptidet i S. cerevisiae.

Ved anvendelse af en tilsvarende procedure sammenlignes ekspressionen af GO, når vektorerne anvendes til transformation af GRF180 og ABI10. Resultaterne af denne sammenligning viser, at stammen GRF180 må foretrækkes frem for stammen ABI10, både med hensyn til samlet ekspression og GO-sekretion.

Karakterisering af de eksprimerede polypéptider Påvisning af mutationer i de eksprimerede polypeptider Påvisningen af mutationer i polypeptiderne, hvis ekspression er omtalt ovenfor, sker ved hjælp af DNA-sekvens-ana-lyse på de N-terminale ender af GO-generne i ekspressionskassetterne. Fragmenterne, som sekvenseres, udskæres fra vektorerne med Sall og SacI, og de resterende 750 bp eller 940 bp lange stykker afledt fra henholdsvis pAB24S^_.GO-l og pAB24a^p^aGO-10, isoleres ved gelelektroforese. De resulterende fragmenter klones ind i Ml3mpl8 og underkastes dideoxysekvensering. Sekvenserne translateres til de indkodede aminosyrer, og disse sammenlignes med de tilsvarende i cDNA-materialet indkodede sekvenser. Resultaterne heraf

DK 175658 B1 I

- 52 - I

er vist i tabel 2, hvor aminosyresekvenserne er angivet ved I

H hjælp af standard-et-bogstav-koden. I

TABEL 2 I

H N-terminale GO-sekvenser i ekspressionsplasmider I

I cDNA RSNGIEASLLTDPKDVSGR I

pAB24AGS GO-1 RSNGIEDSLLIDPEDVSGR I

I pAB24AGalphaGO-10 RSRGIKASLLTDPKRVSGR I

I tabel 2 betegner det første "S" den første aminoterminale I

gruppe i det færdige polypeptid. De aminosyresekvenser, som I

afviger fra de i cDNA indkodede, er understreget. Muligvis . I

skyldes disse mutationer urenheder i oligonucleotidlinker- I

ne, som blev anvendt' ved konstruktion af ekspressions- I

I kassetterne. I

Analyse af de eksprimerede GO-polypeptider ved elektro- I

forese på polyacrylamidgeler i nærvær af SDS; Effekten af I

I Endoglycosidase H på molekylstørrelsen I

Foregående analyser af prøver af medierne (se ovenfor) I

tyder på, at det dannede GO, både med GO- og I

I alpha-faktor-leader-udskillelsessignalet, er hyperglycosy- I

leret Dette undersøges yderligere ved analyse af effekten I

I af Endoglycosidase H (EndoH) på de eksprimerede I

I polypeptiders molekylstørrelse. EndoH fås fra I

I Boehringer-Mannheim og anvendes som angivet af - I

I leverandøren. Dette enzym katalyserer deglycosyleringen af I

I glycosylerede polypeptider. I

Ekspressionen af GO foretages i transformanter af GRF180 I

I med ekspressionsvektorerne - pAB24AGS„rtGO-10 og I

bU

I pAB24AGajp^aGO-l, jvf. ovenfor. Efter 72 timers vakst i I

I YEP-medium med 2% glucose opsamles medierne. Repræsentative I

- 53 - DK 175658 B1 prøver på ca. 1 ml fra hvert medium opkoncentreres 10-20

gange ved centrifugering under anvendelse af en R

Centricon-10 membran. Proteinerne i de opkoncentrerede medier præcipiteres ved tilsætning af det halve volumen 50% TCA med 2% deoxycholat som bærer (TCA/DOC). Protein-pellet genopløses i 50 mikroliter vand, og halvdelen af hver prøve behandles med EndoH (1-2 m.enh.). Den anden halvdel af hver prøve inkuberes under samme betingelser, men uden EndoH. Som reference anvendes autentisk glucoseoxidase fra A. niger, der er behandlet på samme måde. Efter en anden TCA/DOC-præcipitation til opkoncentrering af prøverne køres polypeptiderne på en 8% polyacryl-amidgel med SDS under de af Laemmli, 1970, beskrevne betingelser, og polypeptiderne på gelen synliggøres ved farvning med Coomassie Blue.

Af gelerne afgøres det, at i gær eksprimeret GO er hyper-glycosyleret, da polypeptiderne i fravær af EndoH-behand-ling vandrer kortere end standard-GO- Efter behandling med EndoH vandrer gærprodukterne som en dublet med en tilsyneladende molekylvægt på 68-70 kD; samme dublet observeres med EndoH-behandlet standard-GO.

I fravær af EndoH-behandling har det fra vektoren med gær-alpha-faktor-leader'en eksprimerede og udskilte polypeptid en tilsyneladende MW på 90-120 kD. Det fra denne vektor eksprimerede materiale har en lavere MW og synes at være mindre heterogent end det GO-polypeptid, som udskilles fra gær ved anvendlese af GO-sekretions-sekvensen. Dette endda selvom der er 3 N-linkede glycosyleringssæder i alpha-fak-tor-leader-sekvensen. Således kan sekretion under al-.pha-faktor-leader'ens kontrol være mere effektiv. Desuden observerer man efter behandling med EndoH lidt, om overhovedet noget, materiale af en tilsyneladende MW, som er konsistent med molekylvægten for alpha-faktor-leader'en fusioneret med GO; og dette tyder jo på, at behandling (processing) af dette fusionsprotein ved hjælp af KEX2 er

I DK 175658 B1 I

I I

meget effektiv. I

Det skal bemærkes, at den observation, at præ-pro-sekvensen ' I

for GO fungerer som et sekretionssignal i S. cerevisiae, er I

meget overraskende. I

I Effekten af EndoH på GO-aktiviteten I

For at bestemme effekten af glycosyleringsgraden på GO-ak- I

tiviteten skæres det enzym, som er blevet eksprimeret i og I

udskilt fra gær, så vel som enzymet fra A. niger, med I

B EndoH. Effekten af fjernelsen af glycosylgrupper på den en- I

zymatiske GO-aktivitet måles. I

De udskilte GO-polypeptider, som er udtrykt i gær, frem- I

stilles, og de konditionerede medier med polypeptiderne I

| opkoncentreres, som beskrevet ovenfor. Efter opkoncentre- I

ring inddeles hver prøve i 3 ens delprøver. En delprøve I

B anvendes til at bestemme den initielle GO-aktivitet. De re- I

sterende to prøver inkuberes ved 37°C natten over i 150 mi- I

B kroliter opløsning med 0,2M natriumcitrat, pH 6, 0,12% SDS I

og lmM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF). En prøve inkube- I

B res med EndoH, og den anden inkuberes uden EndoH. Efter I

B inkubation bestemmes GO-aktiviteten i hver af de tre I

B prøver. Desuden præcipiteres dele af prøverne med TCA/DOC I

B og analyseres ved elektroforese på 8% polyacrylamidgeler i I

fl nærvær af SDS. I

fl Man får følgende (ikke-viste) resultater: 1) GO-aktivi- I

fl teten af de polypeptider, som udskilles fra rekombinant I

gær, så vel som fra A. niger, er stabil ved 37°C i I

I 20 timer i fortyndet SDS. 2) Behandling med EndoH inak- I

B tiverer ikke noget af GO-aktiviteten, som holder sig inden I

I for 20% af den ubehandlede prøves aktivitet. 3) GO, som er I

B udskilt fra gær under kontrol af sin egen præ-pro-sekvens, I

fl er langt mere tungt glycosyleret end det GO, som udskilles I

B under kontrol af alpha-faktor-sekvensen. Den tilsyneladende I

i l - 55 - DK 175658 B1 MW for det førstnævnte er af størrelsesordenen 100-200 kD, mens den for det sidstnævnte er af størrelsesordenen 75-150 kD. 4} Ingen ændring observeres i aktiviteten af j nogen af prøverne (hverken de gæreksprimerede eller stan- dard-GO fra A. niger) efter behandling med EndoH. Da slutproduktet efter EndoH-behandling er stort set det samme molekyle med hensyn til kulhydratindhold for GO'er, kan man konkludere, at hyperglycosyleringen af det gæreksprimerede produkt ikke har nogen effekt på enzymaktiviteten.

At GO-aktiviteten er relativt uafhængig af glycosylerings-graden for GO-polypeptidet er overraskende. Det er nemlig rapporteret for andre proteiner (f.eks. for vævsplasmino-genaktivator), at hyperglycosylering af det gæreksprimerede polypeptid reducerer den biologiske aktivitet væsentligt, jvf. V. MacKay, "Secretion of Heterologous Proteins in Yeast," in Biological Research On Industrial Yeasts, b.

II, s. 27-36, CRC Press, Boca Raton, Fla.

Konstruktion af gærekspressionsvektorer, der koder for vild-type-GO, og ekspression af vild-type-enzymet

Med henblik på konstruktion af vild-type-glucoseoxidase-ekspressionsvektorer isoleres 1,9 kb lange SalI-BglII-fragmenter fra mutantplasmiderne, og disse ligeres med nyligt ; syntetiserede oligomere, der koder for den korrekte N-ter minale sekvens. Oligomersekvenserne er de ovenfor under konstruktion af ekspressionskassetter viste. Fragmenterne skæres med Bglll, og det korrigerede gen indsættes i ekspressionsvektorerne. DNA-sekvensanalyse af insertionerne viser, at de resulterende vektorer indeholder den korrekte sekvens i de N-terminale ender.

Der er isoleret kloner af hver af disse vektorer, de benævnes pAB24AGSGO og pAB24AGCGO, og de indeholder som sekre-tionskontrolelementer henholdsvis A. niger præ-pro-sekven-sen og alpha-faktor-sekvensen. Vektoren pAB24AGSGO kaldes

I DK 175658 B1 I

I - 56 - I

I også pSG02 (eller pSGO-2); vektoren pAB24CGO (pAB24alphaGO) I

kaldes også pCGO-1 (p-alpha-GOl). I fig. 11 og 12 er vist I

restriktionsenzymkort for henholdsvis pSGO-2 og pCGO-1. I

Ekspression af vild-type-GO i gær og karakterisering af de I

eksprimerede polypeptider I

Ekspression af GO i transformanter af S. cerevisiae I

GO-aktiviteten, som eksprimeres i S. cerevisiae, der er I

transformeret med ekspressionsvektorer indeholdende I

sekvenser, som koder for vild-type-GO, bestemmes. I

Stammen GRF180 transformeres med begge de klonede geereks- I

pressionsvektorer pAB24AGSGO og pAB24AGCGO. Der trans- I

formeres som beskrevet af Hinnen, 1970, og der selekteres I

for leucinprototrofe. Der fremstilles podningskulturer af I

de enkelte transformanter i 2 ml leucinselektive medier I

med 8% glucose i løbet af 48 timer. Herefter fortyndes pod- . I

ningskulturerne til Α^,.^ = 0,05 med ikké-selektive medier, I

I og der dyrkes i 96 timer ved 30°C og 300 rpm. Herefter I

I fjernes cellerne fra de konditionerede medier ved centri- I

fugering i en mikrofuge i 1 min ved 14.000 rpm, og mediets I

I GO-aktivitet bestemmes. I

I I tabel 3 er vist resultatet af aktivitetsbestemmelsen for I

glucoseoxidase eksprimeret i gær fra to ekspressions- I

vektorer og udskilt til de konditionerede medier. GO-akti- I

viteten er udtrykt i mikrogram/ml kulturvæske. I

DK 175658 B1 - 57 -TABEL 3

Ekspression af vild-type-qlycoseoxidase i transformanter af GRF180 med gaerekspressionsvektorerne pAB24AGSGO eller

PAB24AGCGO

Plasmid pAB24 pAB24AGSGO pAB24AGCGO

Transformant 1 12 12 GO-aktivitet 0 148 179 202 170

En sammenligning mellem de i tabel 1 og 3 viste resultater giver som resultat, at enten har vild-type-GO, som er eks-primeret i gær, en højere specifik aktivitet end mutant-GO, eller også eksprimeres enzymet på et højere niveau end mutanterne.

Karakterisering af de eksprimerede polypeptider ved

elektroforese på SPS-polyacrylamidgeler: Effekten af EndoH

Kulturer af gærtransformanter med ekspressionsvektorerne pAB24AGSGO og pAB24AGCGO dyrkes som beskrevet ovenfor. Herefter fjernes cellerne ved centrifugering, og GO-aktivi-teten i de konditionerede medier bestemmes. Medier fra transformanter med pAB24AGSGO og pAB24AGCGO har GO-aktivi-teter på henholdsvis 190 mikrogram/ml og 260 mikrogram/ml.

Før nedbrydning med EndoH oprenses GO-polypeptiderne delvist. Medierne fortyndes 10 gange med 0,01M acetat, pH 4,5, og ledes gennem søjler med DEAE-cellulose af typen Fast Flow (Pharmacia). Efter opladning af søjlerne vaskes de med den samme puffer, og så elueres GO med 0,1M acétat, pH 3,7.

De GO-polypeptider, som er eksprimeret fra gær, nedbrydes både før og efter den delvise oprensning, med EndoH natten

DK 175656 B1 I

I

over ved 37°c. Nedbrydningsbetingelserne er som beskrevet I

H ovenfor, dog bruges 50 mikroliters repræsentative prøver; I

kontrolprøver inkuberes under nedbrydningsbetingelserne i I

fravær af EndoH. Efter inkuberingen præcipiteres prøverne I

H med TCA, vaskes 3 gange med acetone til fjernelse af TCA, I

og den mængde prøve, som er ækvivalent til 12,5 mikroliter I

af det originale volumen, påføres en 8% polyacrylamidgel. I

Gelen underkastes en elektroforese i nærvær af SDS under , I

reducerende betingelser, som beskrevet af Laemmli, 1970. _ j I

Polypeptiderne i gelen påvises ved farvning med Coomassie 1 I

Blue. I fig. 10 er vist et fotografi af gelen; prøverne i 1 I

de forskellige spor er som beskrevet i tabel 4, som også I

angiver mængden af GO i prøven. I tabellen angiver et "+," I

at prøven er behandlet med EndoH; mens et angiver, at I

prøven er inkuberet under nedbrydningsbetingelser, men uden I

I EndoH. Tallet i parentes efter prøven angiver fraktionsnum- I

meret ved eluering fra DEAE-cellulose-søjlen. GO fra I

A. niger inkuberes til kontrol under nedbrydningsbetingel- I

I serne i nærvær eller fravær af EndoH. I

DK 175658 B1 - 59 -TABEL 4

Effekten af nedbrydning med EndoH på vandringen af vild-type-GO eksprimeret i gær

Spor GO afledt fra EndoH GO-mængde mikrogram M Markører 1 A. niger ~ 0,2 2 A.niger + 0,2 3 pAB24AGSGO (medium) - 2,4 4 pAB24AGSGO (medium) + 2,4 5 pAB24AGSGO (fr. 2) - 3,7 6 pAB24AGSGO (fr. 2) + 3,7 7 pAB24AGSGO (fr. 3) - 8,1 8 pAB24AGSGO (fr. 3) + 8,1 9 pAB24AGSGO (fr. 4) - .1,4 i 10 pAB24AGSGO (fr. 4) + 1,4 11 pAB24AGCGO (medium) - 3,2 12 pAB24AGCGO (medium) + 3,2 13 PAB24AGCGO (fr. 2) - 2,5 14 pAB24AGCGO (fr. 2) + 2,5 15 PAB24AGCGO (fr. 3) - 18,8 16 pAB24AGCGO (fr. 3) + 18,8

Gelen i fig. 10 bekræfter, at der fremstilles store mængder GO-protein. Da den ækvivalente mængde til kun 12 mikro-liter gærmedium er anbragt i spor 4 og 12, og da der er meget mere end 0,2 mikrogram enzym, sammenlignet med standarden, i gelen, er aktivitetsresultaterne korrekte, og der sekreteres og eksprimeres i gærsystemerne mere end 200 mg/liter GO.

Termostabilitet af det fra pAB24AGSGO eksprimerede poly-peptid sammenlignet med nativt GO fra A. niger

I DK 175658 B1 I

- 60 - I

Termostabiliteten af de oprensede, rekombinante GO-poly- I

peptider, der eksprimeres i gær fra pAB24AGSGO, og af I

nativt GO oprenset fra A. niger sammenlignes ved termiske I

denatureringsstudier- I

I Det rekombinante polypeptid, som eksprimeres fra pAB24AGSGO I

I som beskrevet ovenfor, oprenses ved en modifikation af den I

H af Pazur og Kleppe, 1964, nævnte fremgangsmåde. Gærcellerne I

fjernes ved centrifugering,, og det konditionerede YEP-me- I

I dium fortyndes 10 gange med 0,01M natriumacetat, pH 4,5. I

Dette materiale overføres til en søjle med DEAE Sepharose I

I af typen Fast Flow (Pharmacia, 20 ml), som er ækvilibreret I

I med den samme puffer. Herefter vaskes søjlen med 3 volume- I

ner ækvilibreringspuffer, og enzymet elueres med Ο,ΙΜ I

I natriumacetat (pH 3,7). Fraktioner med GO-aktivitet pooles I

og opkoncentreres ved ultrafiltrering. Nativt Go oprenset I

I fra A. niger fås fra Sigma Corp. (Type 5). Både rekombinant I

I GO og nativt GO inkuberes i en koncentration på 0,1 mg/ml i I

I 0,1M citrat-phosphat-puffer, pH 5,5, idet stort set de af I

Malikkides og Weiland, 1982, beskrevne betingelser anven- I

des. Enzymprøver inkuberes ved 65°C, der udtages prøver til I

forskellige tidspunkter, som fortyndes 10 gange i phosphat- I

I puffer, pH 5,5. Herefter bestemmes enzymaktiviteten i de I

I fortyndede prøver ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge I

Kelley og Reddy, 1986, dog med følgende modifikationer: I

I Analyserne foretages i et volumen poå 1,0 ml 0,1M natrium- I

I phosphatpuffer, pH 7,0, med 0,2mM o-dianisidin (Sigma I

Corp.), 10 mikrogram peberrodsperoxidase (Boehringer-Mann- I

heim Corp.) og 9,5mM D-glucose. Analysen starter ved I

I tilsætning af GO (1-30 ng), der inkuberes ved stuetempe- I

I ratur i 20 min-, hvorefter reaktionen stoppes ved I

I tilsætning af 0,1 ml 4N H2S04- Det resulterende reducerede I

I o-dianisidin måles så ved 400 nm på et spektrofotometer af I

I typen Shimazu Model UV-160 eller ved 405 nm på en ELISA-af- I

I læser (Titertek Multiscan). Enzymmængderne beregnes som ng I

I GO i forhold til en standardkurve over absorbansen som I

I funktion af enzymmængden. Resultaterne af termostabilitets- I

I

- 61 - DK 175658 B1 studierne er vist i fig. 13, hvor enzymaktivitetsprocenten er plottet imod inkubationstiden ved den forhøjede temperatur {kvadratformede punkter vedrører GO udtrykt i gær; "diamant-formede" punkter vedrører nativt GO fra A. niger).

Tallene i fig. 13 viser, at der opnås en pseudo-første-or-dens hastighedskonstant på 0,04 min ^ for det native enzyms aktivitetstab, hvorimod det i gær udtrykte enzym har en hastighedskonstant på 0,012 min ^. Altså er det i gær eksprimerede enzym, som er hyperglycosyleret, væsentligt mere termostabilt end det native enzym fra A. niger.

Måling af GO-mRNA-niveau A. niger producerer væsentlige mængder GO. De ovenfor beskrevne undersøgelser viser, at der eksprimeres og sekreteres væsentligt mere end 1 mg/1 ved ret små celletætheder.

Desuden har man påvist proteinet i rå lysater af A. niger ved Western Blotting, hvilket leder til den konklusion, at enzymet repræsenterer mere end 0,1% af det samlede celleprotein. Man skulle derfor forvente, at relativt store I mængder mRNA for dette enzym ville være tilstede i A. niger under den logaritmiske vækstfase og/eller den stationære vækstfase. For at finde ud af om disse mRNA.'er kan påvises i eller ej, anvendes cDNA fra klon 1, 2 og 4 (se ovenfor) som prober ved Northern Blotting af RNA, der er isoleret fra den logaritmiske vækstfase.

Northern Blotting af RNA-materialet foregår som beskrevet i det følgende, stort set ifølge Maniatis et al, 1982.

Poly A+ RNA (5 mikrogram) isoleret fra A. niger i den loga- ritmiske vækstfase denatureres med glyoxal og underkastes elektroforese på en 1% agarosegel. RNA-materialet overføres til et nitrocellulosefilter og probes med det nick-trans-laterede 1,1 kb lange EcoRI-fragment af cDNA ved anvendelse af de ovenfor under Southern Blotting beskrevne

I DK 175658 B1 I

I I

betingelser. Efter hybridisering med proben vaskes filtrene I

ved 60°C il x SSC. Efter autoradiografi i 1 uge påvises I

ingen bånd. Kontrolforsøg viser, at RNA-materialet er I

H intakt og effektivt er overført fra gelen til filteret. I

Disse resultater viser, at GO-kodende mRNA'er er meget I

H sjældne i celler af A. niger i den logaritmiske vækstfase. I

Dette resultat er overraskende, da der produceres så store I

mængder GO-protein. Det kan forklare vanskeligheden ved at I

få fat i nucleotidsekvensen, der koder for GO, ud fra et I

I cDNA-bibliotek. I

Glucoseoxidase-analoge, som er muteiner I

Muterede sekvenser, der koder for glucoseoxidase, hvor hver I

af de tre cystein-koder i position 164, 206 og 521 er sub- I

stitueret med serin (-koder), fremstilles ved sæde-styret I

mutagenisering, stort set ved anvendelse af metoden ifølge I

Eckstein, som beskrevet i Taylor et al, 1985. I

Først fremstilles et derivat af pAB24AGSGO, hvor den 3'-ik- I

I ke-translaterede GO-sekvens er deleteret. For at opnå dette I

H subklones 3'-halvdelen af GO-genet fra cDNA-klon 4 (beskre- I

vet i fig. 4) ind i Ml3mpl9 som et Pstl-EcoRI-fragment. Der I

anvendes to tilstødende primer'e, så der i alt indføres 7 I

I mutationer i GO-genets 3'-ende. De tilstødende primer-ser I

I kvenser er vist nedenfor (mutationerne ér understreget, re- I

striktionsenzymsæderne vist over primer-sekvensen og de I

I indkodede aminosyrer i parentes under primer-sekvensen). I

I XHOI Bglll I

I 5’ CGGATGCTATCCTCGAGGATTATGCTTCCATGCAGTAAGATCT 3’ I

I (DAILEDYASMQ Stop). I

- 63 - DK 175658 B1

Det resulterende PstI-BglII-fragment, der omfatter 3'-halvdelen af GO-cDNA-materialet, ligeres med et

BglII-PstI-fragment fra pAB24AGSGO, som omfatter 5'-halvdelen af genet, og disse ligeres ind i det samme plasmid, der forinden har været behandlet med Bglll og phosphatase-behandlet. Det resulterende plasmid er pSG03.

De mutationer, hvor Ser-koder indsættes i stedet for Cys-koder, foretages ved anvendelse af følgende primer'e: GOC164S: 5' ATTAATCACCATGGCTCGAGGCATTGAAGTA 3’ GOC206S: 5' GGGGTCACCGGATCCGAAATCTTT 3' GOC521S: 5’ CGGCATCATGGAACTAGTACCCACGCC 3' 5'-halvdelen af ekspressionskassetten fra plasmid pAB24AGSGO subklones ind i M13mpl9 som et AhaIII-PstI-frag-mént. De første to primer'e (GOC164S og GOC206S) anvendes med denne skabelon (template); GOC521S-primer'en anvendes på den ovenfor beskrevne skabelon, der blev anvendt til fremstilling af pSG03. Efter kloning bruges primer'ne som ! probér til isolering af plaks indeholdende de muterede sekvenser; i positive plaks sekvenseres alle insertioner til kontrol af, at kun de ønskede mutationer er foregået. Mutantgenerne rekonstrueres så ind i ekspressionsvektorer, som er analoge til pSG03, bortset fra at disse vektorer indeholder nucleotidsekvenserne med de definerede mutationer. Vektorerne med mutationer ved Cysl64, Cys206 og Cys521 benævnes henholdsvis pSG03C164S (eller C164S), pSGO3C206S (eller C206S) og pSG03C521S (eller C521S).

Ekspression af GO-mutein-kodende Ekspressionsvektorer i gær

Ekspressionen af GO-muteinerne indkodet i pSG03C164S, pSGO3C206S og pSG03C521S og af vild-type-genet i pSG03 foretages i transformanter af gærstammen GRF180. Transforma-

I DK 175658 B1 I

I I

H tion og ekspression foregår stort set som beskrevet I

ovenfor, bortset fra at der anvendes de nævnte vektorer. I

Virkningen på ekspressionen og/eller sekretionen og/eller I

aktiviteten af de mutationer, som ændrer de native cystein- I

grupper i position 164, 206 og 521 til serin, er vist i I

I tabel 5. I

I TABEL 5 I

Udskilt GO-aktivitet fra mutein-kodende vektorer I

Ekspressionsvektor Udskilt GO-aktivitet

{mikrogram/ml) I

I pSG03 300 I

I : pSG03C164S under 10 I

I pSGO3C206S under 10 I

I pSG03C521S 100 I

I Som det fremgår af resultaterne, kan man ikke påvise I

I udskilt GO-aktivitet fra ekspressionen af pSG03C164S og I

I pSGO3C206S. Niveauet for udskilt GO-aktivitet fra ekspres- I

I i sion af pSG03C521S er noget mindre end fra ekspression af I

I pSG03. Heraf konkluderes, at Cysl64 og Cys206 er nødvendi- I

ge for ekspression/sekretion og/eller aktivitet af GO. I

Termostabilitet af det i C521S indkodede mutein I

I Termostabiliteten af det polypeptid, som eksprimeres fra I gær, der er transformeret med pSG03C521S, sammenlignes med

I I termostabiliteten af nativt GO fra A. niger. Termostabili- I

tetsundersøgelserne foretages stort set som tidligere be- I

skrevet. Resultatet, procentvis restaktivitet efter inku- I

bation ved forhøjet temperatur plottet som funktion af ti- I

den, er vist i fig. 14 (nativt enzym er angivet med kvadra- I

ter, pSG03C521S-indkodet polypeptid med diamanter). På I

basis heraf estimeres hastighedskonstanten for inakti- I

- 65 - DK 175658 B1 veringen til at være under 0,01 min *. Når man sammenligner termostabiliteten af dette mutein med termostabiliteten af nativt GO fra A. niger og af det i pAB24AGSGO indkodede polypeptid, finder man, at pSG03C521S-muteinet er det mest termostabile af de tre GO-enzymer.

Isolation af GO-kodende, genomisk DNÅ fra Penicillium

Man får genomisk, GO-kodende DNA fra P. amagasakiense som følger: P. amagasakiense (fra ATCC) dyrkes i YEP-mediet, og der fremstilles DNA, stort set beskrevet i Boel et al, 1984. Det isolerede DNA skæres med en række restriktionsenzymer, nemlig EcoRI, Hindlll, BamHI, Sall, PstI og Xhol, og blottes over på nitrocellulose. Blottet probes med et 1,9 kb langt BglIl-fragment med tilfældig prime fra A. niger GO-genet, der findes i plasmid pAB24AGSGO. Der hybri-diseres med en blanding indeholdende proben i 20% formamid og 10% dextransulfat ved 42°C natten over. Filteret vaskes så ved 50°C med en opløsning af 1 x SSC og 0,1% natrium-dodecylsulfat (SDS) og underkastes autoradiografi natten over. Autoradiografiet viser et enkelt specifikt bånd i hvert spor, hvilket leder til den konklusion, at et enkelt gen med homologi til A. niger GO-genet er til stede i geno-met fra P. amagasakiense. Specielt ses et BamHI-fragment og et Hindlll-fragment på henholdsvis 2,4 og 1,9 kb.

Men henblik på kloning af BamHI-fragmentet skæres 20 mikrogram Penicillium-DNA med restriktionsenzymet, og fra gelen isoleres fragmenter, som bedømt efter elektroforese ligger i størrelsesområdet mellem 2,3 og 2,6 kb. DNA-materialet herfra ligeres ind i pBR322, som forinden er behandlet med BamHI og phosphatase. Ved transformation af en prøve af det 4 ligerede plasmid-DNA ind i E. coli HB101 fås omkring 10 ampicillinresistente kolonier, hvoraf 85% på forhånd bedømmes til at være rekombinante på grund af deres test-fænotype. De potentielt rekombinante kolonier overføres i duplikat til nitrocellulosefiltre og bringes til at hybri-

DK 175658 B1 I

I - 66 - I

disere med den ovenfor beskrevne GO-probe fra pAB24ASGO. I

Hybridiseringen foregår ved 37°C med 10% formamid og I

10% dextransulfat. Filtrene vaskes ved 50°C i ern opløsning I

af 1 x SSC og 0,1% SDS, hvorefter de autoradiograferes i 3 I

døgn. Seks potentielt positive kloner identificeres, opsam- I

les, og deres plasmid-DNA præpareres. Fem af disse kloner I

indeholder BamHI-insertioner på 2,3 - 2,6 kb, og en efter- I

følgende Southern Blot Analyse viser, at tre af dem er ens. I

Et repræsentativt plasmid, hvis restriktionsenzymkort er I

vist i fig. 15, benævnes pBRpGOXAll. I

Sekvensering af BamHl-insertionen i pBRpGOXAll foregår som I

følger: Isoleret plasmid-DNA skæres med BamHI, der isoleres I

fragmenter på omtrent 2,5 kb og skæres videre med Hindlll. I

Blandingen af fragmenter ligeres så ind i Ml3, og DNA fra I

potentielt rekombinante plaks underkastes sekvensana- I

I lyse. Den resulterende sekvens fra en sådan en klon, I

I pBRAll, er vist i fig. 16, hvor man kan se, at der er en I

I åben aflæseramme (ORF = open reading frame) igennem hele I

H det 445 bp lange fragment. I

En sammenligning af aminosyrerne, som erindkodet i det I

I 445 bp lange fragment afledt af genomet fra P. amagasakien- I

I se og indsat i pBRpGOXAll med aminosyresekvensen for GO I

I fra A. niger, som indkodet i den i fig. 5B viste nucleotid- I

I sekvens, er vist i fig. 17. Som det er foreslået i denne I

figur, starter den formodede Penicillium GO-klon ved amino- I

I syre nr. 64 i sekvensen fra A. niger. Desuden synes I

I proteinerne at være omkring 52% identiske på aminosyreni- I

I veau. I

I Deponering af biologisk materiale I

En polynucleotidkonstruktion med GO-cDNA fra klon 2 er I

deponeret i American Type Culture Collection (ATCC), 12301 I

Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, hvor den opbeva- I

res som angivet i Budapest-Traktatens bestemmelser. Efter I

- 67 - DK 175658 B1 godkendelse og udstedelse af det til nærværende ansøgning svarende amerikanske patent, vil alle restriktioner vedrørende tilgængeligheden af denne deponering uigenkaldeligt blive fjernet, og i patentets gyldighedstid vil man kunne få adgang til denne deponering, hvis man får tilladelse fra direktoratet, jvf. 37 CFR og 35 USC 1.22. Deponeringen vil blive opretholdt i tredive (30) år, regnet fra deponeringsdatoen, eller i fem (5) år efter sidste forespørgsel, eller i USA patentets ikraftværelsestid, hvad der nu er længst tid. Nedenfor er angivet deponeringsnummer og dato.

Deponeret materiale ATCC-nr. Deponeringsdato pBR-lambda-2a 67731 16 JUN 1988 pSG03C521S 40619 16 JUN 1989 pBRpGOXAl1 68012 16 JUN 1989 ‘

Deponeringen er sket for at give fagfolk lejlighed til at kunne rekvirere materialet. Det er ikke fordi udøvelsen af den nærværende opfindelse kræver at man kan få fat i det deponerde materiale, og det betyder heller ikke, at ækvivalente udførelsesformer ikke tilhører den kendte teknik set i lyset af denne opfindelse. Med offentlighedens adgang til denne deponering er der ikke samtidig givet tilladelse til licenstagning, til anvendelse eller salg af det deponerede materiale under dette eller noget andet patent.

I Nucleinsyresekvensen for det deponerede materiale fremgår af nærværende skrift og er gældende hvis i modstrid med nogle andre af de heri beskrevne sekvenser.

Fagfolk vil vide, at opfindelsen som belyst i den foregående detaljerede beskrivelse selvfølgelig kan ændres og modificeres indenfor kravenes rammer.

Industriel anvendelighed

Med tilvejebringelsen af rekombinante polynucleotider, som Η

DK 175658 B1 I

Η I

I - 68 - I

H koder for GO, åbnes der op for at anvende metoder, som er I

baseret på ekspression af polypeptidet i rekombinante . I

systemer. Disse metoder og rekombinante systemer er særligt I

nyttige, da de tillader produktion i stor skala af det I

ønskede produkt. Der åbnes også op for produktion af I

polypeptiderne i systemer, hvorfra de lettere og billigere I

kan oprenses, da der kan konstrueres ekspressionsvektorer, I

som leder til produktets udskillelse til mediet. Hermed I

forbedres den kommercielle tilgængelighed af GO og/eller I

prisen på GO falder; og GO anvendes til mange industrielle I

formål, f.eks. til påvisning og bestemmelse af glucose i I

industrielle opløsninger og i legemsvæsker som blod og I

urin. I

H Desuden kan man ved fremgangsmåder, hvor rekombinante I

systemer kodende for GO anvendes, opnå produktion af GO i I

I systemer, som er forenelige med produktets påtænkte anvend- I

I else. For eksempel anvendes GO til afsukring af æg, I

I fjernelse af oxygen fra drikkevarer, fugtige eller vand- I

I holdige fødevareprodukter, aromastoffer og hermetisk I

I lukkede fødevarepakninger. Det ville være en fordel at I

kunne producere GO-polypeptidet i gær, som er godkendt til I

H anvendelse ved fødevareprodukter, da man ellers, hvis I

I polypeptidet produceres i sin native kilde, A. niger, som I

I ikke er godkendt til fødevareprodukter og er kraftigt I

I allergen, må gennem en meget Omfattende oprensning. I

Desuden kan man med disse fremgangsmåder og rekombinante I

I systemer ifølge opfindelsen producere GO-analoge forbind- I

eiser og GO-fragmenter, som kunne finde kommerciel anvend- I else ved påvisningsprocedurer. For eksempel kunne GO-fusi- I onsproteiner anvendes i stedet for et mærket antistof eller I konjugat i en analyse af sandwich-typen. Molekylet kunne fusioneres til en epitop, som genkendes af et antistof, der I skal påvises. Tilstedeværelsen af antistof-epitop-komplek- I set ville kunne bestemmes ved påvisning af den enzymatiske I aktivitet af tilstedeværende glucoseoxidase. Med en kobling - 69 - DK 175658 B1 til pebrrodsperoxidase ville man kunne få en kolorimetrisk procedure til påvisning af antistoffets tilstedeværelse.

GO-fusionsproteiner ville også med fordel kunne anvendes medicinsk. For eksempel er hydrogenperoxid toxisk for mange bakterier og celler. Det må være muligt at målrette enzymet til specifikke patogener og/eller celler ved at fusionere GO og antistoffer, som skulle kunne genkende disse specifikke målceller.

Inaktive polypeptider, som er fragmenter af GO eller GO-analoge, kan anvendes til at rejse antistoffer mod GO, både polyklonale og monoklonale. Disse antistoffer er nyttige ved oprensning af GØ og polypeptider, som stort set er lig GO, ved immunoaffinitetsprocedurer.

Claims (12)

1. Rekombinant vektor omfattende en polynukJeotidsekvens, der koder for et polypeptid, som I udviser glucoseoxidase (GO) aktivitet, hvori polynukleotidet koder for et polypeptid, der vælges i I 5 den gruppe, som udgøres af det i fig. 5B gengivne polypeptid og dets muterede version, som I omfatter serin i stedet for cystein ved sekvensens aminosyrerest nummer 521, således som det I vises i fig. 5B. ' I Hi 2. Rekombinant vektor ifølge krav 1, som er en ekspressionsvektor, der yderligere omfatter en I I | 10 kontrolsekvens, som er operationelt knyttet til den sekvens, der koder for det polypeptid, der I H udviser GO-aktivitet. I

3. Rekombinant vektor ifølge krav 2, hvori sekvenserne, som tillader ekspression af den ko- I H dende sekvens, tillader ekspression i gær. I I 15 I

4. Rekombinant vektor ifølge krav 3, som yderligere omfatter en sekvens, som bevirker sekre- I tion af polypeptidet i mediet. I I 11

5. Rekombinant vektor ifølge krav 4, hvori kontrolsekvenserne udgøres af en regulerbar, glyce- I 20 raldehyd-3-phosphatdehydrogenase-alkoholdehydrogenase (GAP/AOH) hybridpromotor, glyce- I I. raldehyd-3-phosphat (GAP) terminatoren og' en sekretionsfremmende kontrolsekvens, som I H vælges fra en sekvens, der koder for en alfa-faktor fra gær, og en sekvens, der koder for GO- I I preprosekvensen fra A. niger. I

6. Rekombinant vektor ifølge krav 5, som vælges fra I (i) pAB24AGSqoGO vektoren, som fremstilles i overensstemmelse med det side 48-49 og i I fig. 8 anførte, I ii) pAB24AGalfaGO vektoren, som fremstilles i overensstemmelse med det side 48-49 og i I fig. 8 anførte, I 30 (iii) pAB24AGSGO vektoren med det alternative navn pSGO-2 med en struktur som beskre- I vet i fig. 12; I (iv) pAB24AG@GO vektoren med det alternative navn pSGO-1 med en struktur som beskre- I vet i fig. 11; I (v) pSG03C521S vektoren, som fremstilles i overensstemmelse med det side 62-63 anførte. I

35 I

7. Værtscelle, som er transformeret med et rekombinant polynukleoiid, som omfatter en I sekvens, der koder for et polypeptid, som udviser glucoseoxidase (GO) aktivitet, hvori polynu- I kléotidet koder for et polypeptid, der vælges i den gruppe, som udgøres af det i figur 5B gengiv- I DK 175658 B1 ne polypeptid og dets muterede version, som omfatter serin i stedet for cystein ved sekvensens aminosyrerest nummer 521. således som det vises i figur 5B.

8. Værtscelle ifølge krav 7, hvori værtscellen er en gærcelle. 5

9. Værtscelle ifølge krav 8, hvori gæren hører til slægten Saccharomyces, transformeret med vektoren ifølge krav 3 eller 4.

10. Ikke-oprindeligt polypeptid, som udviser GO-aktivitet, idet polypeptidet vælges i den 10 gruppe, som udgøres af det i fig. 5B gengivne polypeptid og dets muterede version, som omfatter serin i stedet for cystein ved sekvensens aminosyrerest nummer 521, således som det vises i fig. 6, og som desuden er hyperglycosyleret i forhold til oprindeligt GO.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant polypeptid ved ekspression af et polynu-15 kleotid, hvori polypeptidet udviser glucoseoxidase (GO) aktivitet, og hvori polynukleotidet koder for et polypeptid, som vælges i den gruppe, der udgøres af det i fig. 5B gengivne polypeptid og . dets muterede version, som omfatter serin i stedet for cystein ved sekvensens aminosyrerest nummer 521, således som det vises i fig. 6, idet fremgangsmåden omfatter: (a) tilvejebringelse af en population af transformerede celler omfattende en rekombinant 20 vektor, som udgøres af en kodningssekvens for polypeptidet operationelt knyttet til se kvenser, som tillader ekspression af kodningssekvensen i cellerne; (b) dyrkning af populationen af transformérede celler under betingelser, hvorved den muterede version udtrykkes; og (c) udvinding af polypeptidet. 25

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, hvori cellerne er bakterieceller eller gærceller. 1 Polypeptid som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge krav 12.