JPH06296482A - Ｎ−グリコシル化の欠損を有する酵母宿主株 - Google Patents
Ｎ−グリコシル化の欠損を有する酵母宿主株Info
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- JPH06296482A JPH06296482A JP5196388A JP19638893A JPH06296482A JP H06296482 A JPH06296482 A JP H06296482A JP 5196388 A JP5196388 A JP 5196388A JP 19638893 A JP19638893 A JP 19638893A JP H06296482 A JPH06296482 A JP H06296482A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 Ｎ−グリコシル化の欠損を有する酵母宿主
株、並びに均質にグリコシル化されたタンパク質を発現
させるための使用に関する。 【構成】 〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択、１個または
数個の選択マーカーの導入、プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯ
Ｄによる形質転換後、標準条件下で培養した後で１０ｍ
ｇ／ｌ以上のＧＯＤを培地に分泌し、サッカロミセス・
セレビシエＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、ＤＳＭ７
１６０および／またはＤＳＭ７３４０のｎｇｄ突然変異
にアレリックであり、そして均質な炭水化物構造をもつ
タンパク質を発現する菌株の選択により得られる、Ｎ−
グリコシル化の欠損を有するサッカロミセス変異株。
株、並びに均質にグリコシル化されたタンパク質を発現
させるための使用に関する。 【構成】 〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択、１個または
数個の選択マーカーの導入、プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯ
Ｄによる形質転換後、標準条件下で培養した後で１０ｍ
ｇ／ｌ以上のＧＯＤを培地に分泌し、サッカロミセス・
セレビシエＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、ＤＳＭ７
１６０および／またはＤＳＭ７３４０のｎｇｄ突然変異
にアレリックであり、そして均質な炭水化物構造をもつ
タンパク質を発現する菌株の選択により得られる、Ｎ−
グリコシル化の欠損を有するサッカロミセス変異株。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−グリコシル化の欠
損を有する酵母宿主株、並びに均質にグリコシル化され
たタンパク質を発現させるためのその使用に関するもの
である。
損を有する酵母宿主株、並びに均質にグリコシル化され
たタンパク質を発現させるためのその使用に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質へ炭水化物を翻訳後に付加さ
せる方法が３通り存在する。これらの方法は次のように
区別されている： ＊Ｎ−グリコシル化 −Ａｓｎへの炭水化物鎖のＮ−グリコシド結合 ＊Ｏ−グリコシル化 −ＴｈｒまたはＳｅｒへの炭水化物鎖のＯ−グリコシド
結合 ＊グリコシル−ホスファチジル−イノシトールアンカー
（ＧＰＩ） −一部の膜タンパク質の成分 −ＧＰＩアンカーはそれらをリン脂質膜に埋め込むのに
役立つ。
せる方法が３通り存在する。これらの方法は次のように
区別されている： ＊Ｎ−グリコシル化 −Ａｓｎへの炭水化物鎖のＮ−グリコシド結合 ＊Ｏ−グリコシル化 −ＴｈｒまたはＳｅｒへの炭水化物鎖のＯ−グリコシド
結合 ＊グリコシル−ホスファチジル−イノシトールアンカー
（ＧＰＩ） −一部の膜タンパク質の成分 −ＧＰＩアンカーはそれらをリン脂質膜に埋め込むのに
役立つ。
【０００３】タンパク質のグリコシル化は例えば次の文
献に記載されている： −Kukuruzinska, M.A. et al., Ann. Rev. Biochem. 56
(1987) 915-944; −Paulson, C.P., TIBS 14 (1989) 272-276; −Warren, C.E., BFE 7 (1990) 392-395; −Ballou, C.E., In: Strathern, J.N., et al., The M
olecular Biology ofthe Yeast Saccharomyces, Cold S
pring Harbor Laboratory, New York, pp. 355-360 (19
82); −Kornfeld, R.; Kornfeld, S., Ann. Rev. Bikchem. 5
4 (1985) 631-664; −Tanner, W.; Lehle, L., Biochim. Biophys. Acta 90
6 (1987) 81-99; −Innis, M.A., In: Barr, P.J. et al., Yeast geneti
c engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, pp. 233-246 (1989). 酵母タンパク質のＯ−グリコシド炭水化物構造は１−５
個のマンノース残基の非分枝マンノース鎖から成ってい
る。Ｏ−グリコシル化はＥＲで始まり（最初のマンノー
ス残基の転移）、そしてゴルジ装置で完了する。
献に記載されている： −Kukuruzinska, M.A. et al., Ann. Rev. Biochem. 56
(1987) 915-944; −Paulson, C.P., TIBS 14 (1989) 272-276; −Warren, C.E., BFE 7 (1990) 392-395; −Ballou, C.E., In: Strathern, J.N., et al., The M
olecular Biology ofthe Yeast Saccharomyces, Cold S
pring Harbor Laboratory, New York, pp. 355-360 (19
82); −Kornfeld, R.; Kornfeld, S., Ann. Rev. Bikchem. 5
4 (1985) 631-664; −Tanner, W.; Lehle, L., Biochim. Biophys. Acta 90
6 (1987) 81-99; −Innis, M.A., In: Barr, P.J. et al., Yeast geneti
c engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, pp. 233-246 (1989). 酵母タンパク質のＯ−グリコシド炭水化物構造は１−５
個のマンノース残基の非分枝マンノース鎖から成ってい
る。Ｏ−グリコシル化はＥＲで始まり（最初のマンノー
ス残基の転移）、そしてゴルジ装置で完了する。
【０００４】Ｎ−グリコシル化は２段階で行われる。Ｎ
−アセチルグルコサミン、マンノースおよびグルコース
のコア単位が脂質キャリアー中間体の上に集成され、こ
れはＥＲにおいて糖タンパク質のＡｓｎ残基に移され
る。タンパク質に結合したコア単位がプロセシング（Ｅ
Ｒでのグルコース残基と特定のマンノース残基の切断）
を受けた後、ゴルジ装置で糖構造が伸長する（“外鎖
（outer chain ）”グリコシル化）。外鎖グリコシル化
の構造は生物に特異的である。
−アセチルグルコサミン、マンノースおよびグルコース
のコア単位が脂質キャリアー中間体の上に集成され、こ
れはＥＲにおいて糖タンパク質のＡｓｎ残基に移され
る。タンパク質に結合したコア単位がプロセシング（Ｅ
Ｒでのグルコース残基と特定のマンノース残基の切断）
を受けた後、ゴルジ装置で糖構造が伸長する（“外鎖
（outer chain ）”グリコシル化）。外鎖グリコシル化
の構造は生物に特異的である。
【０００５】分泌酵母タンパク質の外鎖グリコシル化は
高マンノース型である。すなわち、それは長いポリマン
ノースオリゴ糖鎖から構成される。酵母において異種と
して分泌されるタンパク質もまた、酵母に特異的な高マ
ンノース型の外鎖グリコシル化（高グリコシル化とも呼
ばれる）を受ける。多くの場合に、これは不均質なタン
パク質産物（炭水化物の部分、分子量）の生成をもたら
すので好ましくない。その上、不均質な炭水化物部分は
タンパク質の精製を複雑にするだろう。高グリコシル化
は立体的な理由のために翻訳後プロセシング（例えば、
プレプロセグメントの加水分解切断により天然タンパク
質を形成させる“プレプロ”タンパク質の成熟化）を妨
げたり、切断効率を低下させる（Bekkers, A.C.A.P.A.
et al.,Biochim. Biophys. Acta 1089 (1991) 345-35
1）。さらに、高グリコシル化酵素の比活性（単位／重
量の単位）が炭水化物部分の増加により低下する。その
上、酵母に特異的な外鎖グリコシル化は強い免疫原性を
有し、このことは治療用途にとって望ましくない。
高マンノース型である。すなわち、それは長いポリマン
ノースオリゴ糖鎖から構成される。酵母において異種と
して分泌されるタンパク質もまた、酵母に特異的な高マ
ンノース型の外鎖グリコシル化（高グリコシル化とも呼
ばれる）を受ける。多くの場合に、これは不均質なタン
パク質産物（炭水化物の部分、分子量）の生成をもたら
すので好ましくない。その上、不均質な炭水化物部分は
タンパク質の精製を複雑にするだろう。高グリコシル化
は立体的な理由のために翻訳後プロセシング（例えば、
プレプロセグメントの加水分解切断により天然タンパク
質を形成させる“プレプロ”タンパク質の成熟化）を妨
げたり、切断効率を低下させる（Bekkers, A.C.A.P.A.
et al.,Biochim. Biophys. Acta 1089 (1991) 345-35
1）。さらに、高グリコシル化酵素の比活性（単位／重
量の単位）が炭水化物部分の増加により低下する。その
上、酵母に特異的な外鎖グリコシル化は強い免疫原性を
有し、このことは治療用途にとって望ましくない。
【０００６】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus ni
ger ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は天然
に分泌されるＮ−グリコシル化ホモダイマー（分子量／
サブユニット（ＳＵ）：約８０ｋＤａ、補助因子：１
ＦＡＤ／ＳＵ、１ ＳＳ橋／ＳＵ）である。サッカロミ
セス・セレビシエにより異種として発現されたＧＯＤは
培地中に非常に効率よく分泌される。この酵素は酵素的
に活性であるが、最高１５０個のマンノース残基の均一
でない外鎖グリコシル化のために炭水化物部分と分子量
に関して不均質である。これとは対照的に、Ａ．ニガー
から単離されたＧＯＤは比較的均質な炭水化物構造（コ
アグリコシル化）をもっている。 −Kriechbaum, M. et al., FEBS Lett. 255 (1989) 63-
66; −Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 265 (199
0) 3793-3802; −De Baetselier, A. et al., Biotechnology 9 (1991)
559-561; −Whittington, H. et al., Curr. Genet. 18 (1990) 5
31-536; −Rosenberg, S., WO 89/12675. さらに、酵母から発現／分泌されたＧＯＤは、Ａ．ニガ
ーから単離された酵素と比べて、高グリコシル化のため
に、より低い比活性（単位／ｇ酵素）を示す。 Ａ．ニガーから分泌されたＧＯＤは比較的均質な炭水化
物構造（コア様グリコシル化、分子量／ＳＵ：約８０ｋ
Ｄａ）をもっている。
ger ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は天然
に分泌されるＮ−グリコシル化ホモダイマー（分子量／
サブユニット（ＳＵ）：約８０ｋＤａ、補助因子：１
ＦＡＤ／ＳＵ、１ ＳＳ橋／ＳＵ）である。サッカロミ
セス・セレビシエにより異種として発現されたＧＯＤは
培地中に非常に効率よく分泌される。この酵素は酵素的
に活性であるが、最高１５０個のマンノース残基の均一
でない外鎖グリコシル化のために炭水化物部分と分子量
に関して不均質である。これとは対照的に、Ａ．ニガー
から単離されたＧＯＤは比較的均質な炭水化物構造（コ
アグリコシル化）をもっている。 −Kriechbaum, M. et al., FEBS Lett. 255 (1989) 63-
66; −Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 265 (199
0) 3793-3802; −De Baetselier, A. et al., Biotechnology 9 (1991)
559-561; −Whittington, H. et al., Curr. Genet. 18 (1990) 5
31-536; −Rosenberg, S., WO 89/12675. さらに、酵母から発現／分泌されたＧＯＤは、Ａ．ニガ
ーから単離された酵素と比べて、高グリコシル化のため
に、より低い比活性（単位／ｇ酵素）を示す。 Ａ．ニガーから分泌されたＧＯＤは比較的均質な炭水化
物構造（コア様グリコシル化、分子量／ＳＵ：約８０ｋ
Ｄａ）をもっている。
【０００７】分泌酵母タンパク質のＮ−グリコシル化も
通常均質ではない。このことは例えばＳ．セレビシエの
エクスターナルインベルターゼに関して知られている
（Reddy, V.A. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 69
78-6985; Ziegler, F.D. et al., Biol. Chem. 263 (19
88) 6978-6985 ）。インベルターゼの１４の可能なセク
オン（sequon、グリコシル化部位、アミノ酸配列パター
ン：Asn-X-Ser/Thr ）のうち、１３が完全にまたは部分
的にグリコシル化される。しかし、インベルターゼのサ
ブユニット当たりの使用可能な１３のセクオンのうち、
平均９−１０がグリコシル化されるにすぎない。タンパ
ク質配列により規定されるセクオンは、 i) 常にグリコシル化される、 ii) 決してグリコシル化されない、または iii)ときどきグリコシル化される。
通常均質ではない。このことは例えばＳ．セレビシエの
エクスターナルインベルターゼに関して知られている
（Reddy, V.A. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 69
78-6985; Ziegler, F.D. et al., Biol. Chem. 263 (19
88) 6978-6985 ）。インベルターゼの１４の可能なセク
オン（sequon、グリコシル化部位、アミノ酸配列パター
ン：Asn-X-Ser/Thr ）のうち、１３が完全にまたは部分
的にグリコシル化される。しかし、インベルターゼのサ
ブユニット当たりの使用可能な１３のセクオンのうち、
平均９−１０がグリコシル化されるにすぎない。タンパ
ク質配列により規定されるセクオンは、 i) 常にグリコシル化される、 ii) 決してグリコシル化されない、または iii)ときどきグリコシル化される。
【０００８】さらに、規定されたセクオンは短いオリゴ
糖鎖 (GlcNAc2Man8-15) か、長いポリマンノースオリゴ
糖鎖 (GlcNAc2Man50-100) のいずれかをもっている。イ
ンベルターゼの観察された不均質なＮ−グリコシル化は
次のことが原因で起こる： i) １分子当たりの使用可能なセクオンの部分的グリコ
シル化（例えば、たった３または５の使用可能なセクオ
ンがランダムにグリコシル化される）、 ii) 短いコアオリゴ糖と長いポリマンノース鎖（外鎖）
の存在、および iii)“外鎖”の鎖長の変動。
糖鎖 (GlcNAc2Man8-15) か、長いポリマンノースオリゴ
糖鎖 (GlcNAc2Man50-100) のいずれかをもっている。イ
ンベルターゼの観察された不均質なＮ−グリコシル化は
次のことが原因で起こる： i) １分子当たりの使用可能なセクオンの部分的グリコ
シル化（例えば、たった３または５の使用可能なセクオ
ンがランダムにグリコシル化される）、 ii) 短いコアオリゴ糖と長いポリマンノース鎖（外鎖）
の存在、および iii)“外鎖”の鎖長の変動。
【０００９】炭水化物部分が減少または欠失した、すな
わち均質な炭水化物部分を有する糖タンパク質を得るた
めに、次の方法が知られている： ＊グリコシル化の阻害剤（例えば、ツニカマイシン）ま
たは小胞輸送の阻害剤（例えば、ブレフェルジンＡ）の
存在下での糖タンパク質コード化遺伝子の発現、 ＊例えばエンドＦおよび／またはエンドＨおよび／また
はＮ−グリコシダーゼＦによる in vitro でのタンパク
質の酵素的脱グリコシル化、 ＊ＤＮＡレベルでの突然変異誘発によるグリコシル化部
位の除去／変更、 ＊グリコシル化欠損宿主株の使用。
わち均質な炭水化物部分を有する糖タンパク質を得るた
めに、次の方法が知られている： ＊グリコシル化の阻害剤（例えば、ツニカマイシン）ま
たは小胞輸送の阻害剤（例えば、ブレフェルジンＡ）の
存在下での糖タンパク質コード化遺伝子の発現、 ＊例えばエンドＦおよび／またはエンドＨおよび／また
はＮ−グリコシダーゼＦによる in vitro でのタンパク
質の酵素的脱グリコシル化、 ＊ＤＮＡレベルでの突然変異誘発によるグリコシル化部
位の除去／変更、 ＊グリコシル化欠損宿主株の使用。
【００１０】Ｎ−グリコシル化を変更する酵母変異株は
知られている。分泌を遮断された分泌変異株とＮ−グリ
コシル化が変更されたタンパク質を分泌する変異株とに
区別される。分泌変異株は分泌機構が局在的に遮断され
ており、その結果として不完全にＮ−グリコシル化され
たタンパク質が対応する細胞区画に蓄積する。例えば： ＊R. Schekman によるｓｅｃ変異株（“分泌欠損”）、 −Novick, P. et al., Cell 21 (1980) 205-215; −Schekman, R. and Novick, P., In: Strathern, J.N.
et al., The MolecularBiology of the Yeast Sacchar
omyces. Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork, p
p. 361-398 (1982); ＊S. Ferro-Novick によるｂｅｔ変異株（“輸送の初期
遮断”）、 −Ferro-Novick, S. and Newman A.P., J. Cell. Biol.
105 (1987) 1587-1594; ＊D. Gallwitz によるｙｐｔ１変異株、 −Schmitt, H.D. et al., Cell 47 (1986) 401-412; −Schmitt, H.D. et al., Cell 53 (1988) 635-647; ＊M. Muramatsuによるｓａｒ１変異株、 −Nakano, A. and Muramatsu, M., J. Cell. Biol. 109
(1989) 2677-2691. Ｎ−グリコシル化が欠損している変異株は一般的に機能
する分泌経路をもっている。欠損Ｎ−グリコシル化は例
えば以下の突然変異のような様々な遺伝子欠損により生
じる： ＊炭水化物構築（修飾）酵素系における突然変異、 ＊細胞のタンパク質輸送系（“ソーティング（sorting
）、ターゲッティング（targeting ）”）における突
然変異。
知られている。分泌を遮断された分泌変異株とＮ−グリ
コシル化が変更されたタンパク質を分泌する変異株とに
区別される。分泌変異株は分泌機構が局在的に遮断され
ており、その結果として不完全にＮ−グリコシル化され
たタンパク質が対応する細胞区画に蓄積する。例えば： ＊R. Schekman によるｓｅｃ変異株（“分泌欠損”）、 −Novick, P. et al., Cell 21 (1980) 205-215; −Schekman, R. and Novick, P., In: Strathern, J.N.
et al., The MolecularBiology of the Yeast Sacchar
omyces. Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork, p
p. 361-398 (1982); ＊S. Ferro-Novick によるｂｅｔ変異株（“輸送の初期
遮断”）、 −Ferro-Novick, S. and Newman A.P., J. Cell. Biol.
105 (1987) 1587-1594; ＊D. Gallwitz によるｙｐｔ１変異株、 −Schmitt, H.D. et al., Cell 47 (1986) 401-412; −Schmitt, H.D. et al., Cell 53 (1988) 635-647; ＊M. Muramatsuによるｓａｒ１変異株、 −Nakano, A. and Muramatsu, M., J. Cell. Biol. 109
(1989) 2677-2691. Ｎ−グリコシル化が欠損している変異株は一般的に機能
する分泌経路をもっている。欠損Ｎ−グリコシル化は例
えば以下の突然変異のような様々な遺伝子欠損により生
じる： ＊炭水化物構築（修飾）酵素系における突然変異、 ＊細胞のタンパク質輸送系（“ソーティング（sorting
）、ターゲッティング（targeting ）”）における突
然変異。
【００１１】ソーティングおよびターゲッティング変異
株では、ゴルジ装置またはゴルジ装置の一部の区域（特
に外鎖グリコシル化反応が起こる細胞区画）が例えばタ
ンパク質の分泌の際にバイパスによって迂回される。 ＊C.E. Ballou によるｍｎｎ変異株（マンナン欠損）、 −Ballou, L. et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 598
6-5891; −Ballou, C.E., Methods Enzymol. 185 (1990) 440-47
0; −Ballou, C.E., In: Strathern, J.N. et al., The Mo
lecular Biology ofthe Yeast Saccharomyces. Cold Sp
ring Harbor Laboratory, New York, pp. 355-360 (198
2); ＊C.E. Ballou によるｖｒｇ変異株（バナジウム酸塩耐
性グリコシル化）、 −Ballou, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (19
91) 3209-3212; ＊R. Robbinsによるａｌｇ変異株（アスパラギン結合グ
リコシル化欠損）、 −Huffaker, T.C. and Robbins, P.W., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 80 (1983) 7466-7470; −Runge, K.W. and Robbins, P.W., In: Bonventre, P.
F. et al., Microbiology, American Society for Micr
obiology, Washington, D.C. pp. 312-316 (1986); ＊G. Fink 、(D.T. Moir) 、によるｐｍｒ１（ｓｓｃ
１）変異株、 −Duncan, M.J. and Smith, R.A., EPA 0211208; −Fink, G.R., EPA 0382332; −Rudolph, H.K. et al., Cell 58 (1989) 133-145; ＊H.R.B. Pelham によるｅｒｄ１変異株（小胞体保持欠
損）、 −Hardwick, K.G. et al., EMBO J. 9 (1990) 630-632. 分泌経路が遮断された変異株は、理解されるように、バ
イオテクノロジーの目的（タンパク質の同種および異種
分泌）には不適当である。
株では、ゴルジ装置またはゴルジ装置の一部の区域（特
に外鎖グリコシル化反応が起こる細胞区画）が例えばタ
ンパク質の分泌の際にバイパスによって迂回される。 ＊C.E. Ballou によるｍｎｎ変異株（マンナン欠損）、 −Ballou, L. et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 598
6-5891; −Ballou, C.E., Methods Enzymol. 185 (1990) 440-47
0; −Ballou, C.E., In: Strathern, J.N. et al., The Mo
lecular Biology ofthe Yeast Saccharomyces. Cold Sp
ring Harbor Laboratory, New York, pp. 355-360 (198
2); ＊C.E. Ballou によるｖｒｇ変異株（バナジウム酸塩耐
性グリコシル化）、 −Ballou, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (19
91) 3209-3212; ＊R. Robbinsによるａｌｇ変異株（アスパラギン結合グ
リコシル化欠損）、 −Huffaker, T.C. and Robbins, P.W., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 80 (1983) 7466-7470; −Runge, K.W. and Robbins, P.W., In: Bonventre, P.
F. et al., Microbiology, American Society for Micr
obiology, Washington, D.C. pp. 312-316 (1986); ＊G. Fink 、(D.T. Moir) 、によるｐｍｒ１（ｓｓｃ
１）変異株、 −Duncan, M.J. and Smith, R.A., EPA 0211208; −Fink, G.R., EPA 0382332; −Rudolph, H.K. et al., Cell 58 (1989) 133-145; ＊H.R.B. Pelham によるｅｒｄ１変異株（小胞体保持欠
損）、 −Hardwick, K.G. et al., EMBO J. 9 (1990) 630-632. 分泌経路が遮断された変異株は、理解されるように、バ
イオテクノロジーの目的（タンパク質の同種および異種
分泌）には不適当である。
【００１２】多くのＮ−グリコシル化欠損変異株はある
条件のもとでは致死的であり、つまりそれらは普通の条
件（培養温度３０℃）下で生きられず、例えば変異株ａ
ｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ４、ｂｅｔ１、ｂｅｔ２、ほ
とんど全てのｓｅｃ変異株およびｙｐｔ１（低温感受
性）のように温度感受性（ｔｓ）表現型を有する。温度
感受性表現型とは、致死ｔｓ突然変異が例えば２６℃
（許容される生育条件）から３７℃（許容されない生育
条件）への温度シフト後にのみ発現されることを意味す
る。これらの変異株も、理解されるように、バイオテク
ノロジーの目的にあまり適していない。実質的に減少し
ている（ｍｎｎ７、ｍｎｎ８、ｍｎｎ１０）か又はほと
んど完全に欠失している外鎖グリコシル化により、ある
いは修飾された“コア”グリコシル化（ｍｎｎ９）によ
り特徴づけられる変異株のグループは次のような欠点を
有する：すなわち、細胞の増殖が遅い；細胞が形態学的
に変化し、培養中すでに溶解するので、これらの変異株
は浸透的に安定化された培地（約０．５Ｍ ＫＣｌまた
は約１Ｍソルビトールの添加）でのみ増殖できる。
条件のもとでは致死的であり、つまりそれらは普通の条
件（培養温度３０℃）下で生きられず、例えば変異株ａ
ｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ４、ｂｅｔ１、ｂｅｔ２、ほ
とんど全てのｓｅｃ変異株およびｙｐｔ１（低温感受
性）のように温度感受性（ｔｓ）表現型を有する。温度
感受性表現型とは、致死ｔｓ突然変異が例えば２６℃
（許容される生育条件）から３７℃（許容されない生育
条件）への温度シフト後にのみ発現されることを意味す
る。これらの変異株も、理解されるように、バイオテク
ノロジーの目的にあまり適していない。実質的に減少し
ている（ｍｎｎ７、ｍｎｎ８、ｍｎｎ１０）か又はほと
んど完全に欠失している外鎖グリコシル化により、ある
いは修飾された“コア”グリコシル化（ｍｎｎ９）によ
り特徴づけられる変異株のグループは次のような欠点を
有する：すなわち、細胞の増殖が遅い；細胞が形態学的
に変化し、培養中すでに溶解するので、これらの変異株
は浸透的に安定化された培地（約０．５Ｍ ＫＣｌまた
は約１Ｍソルビトールの添加）でのみ増殖できる。
【００１３】さらに、文献に記載されたＮ−グリコシル
化欠損変異株の一部（例えば、ａｌｇ１）は細胞中で部
分的にしか発現されない（“漏れやすい”）欠損を有す
る。これは不均質なＮ−グリコシル化（野生型Ｎ−グリ
コシル化の混入による汚染）をもたらす。外鎖グリコシ
ル化が短縮された又は欠失されたタンパク質を発現／分
泌し得る酵母株は、例えば EP-A 0 344 864 に記載され
ている。この出願に開示された菌株は全て C.E. Ballou
によって開示されたｍｎｎ９突然変異に基づいている。
ｍｎｎ９変異株は増殖中に溶解を受けやすく、従って浸
透的に安定化されねばならない（上記参照）。
化欠損変異株の一部（例えば、ａｌｇ１）は細胞中で部
分的にしか発現されない（“漏れやすい”）欠損を有す
る。これは不均質なＮ−グリコシル化（野生型Ｎ−グリ
コシル化の混入による汚染）をもたらす。外鎖グリコシ
ル化が短縮された又は欠失されたタンパク質を発現／分
泌し得る酵母株は、例えば EP-A 0 344 864 に記載され
ている。この出願に開示された菌株は全て C.E. Ballou
によって開示されたｍｎｎ９突然変異に基づいている。
ｍｎｎ９変異株は増殖中に溶解を受けやすく、従って浸
透的に安定化されねばならない（上記参照）。
【００１４】EP-A 0 314 096に記載された酵母株もｍｎ
ｎ９突然変異に基づいている。これらの菌株は、浸透安
定剤を培地に加えなくてもよい程度に溶解感受性に関し
て改良されている。このためにＭＮＮ９遺伝子がクロー
ン化され、その後ＭＮＮ９遺伝子が外部から調節しうる
プロモーターの制御下にある菌株が構築された。これに
より、例えば必要とされる細胞のグリコシル化宿主タン
パク質を合成する細胞培養期の間、十分量の活性ＭＮＮ
９遺伝子産物を存在させることができる。この方法によ
って、ｍｎｎ９突然変異は所望のＮ−低グリコシル化タ
ンパク質の実際の生産期にだけ発現される。
ｎ９突然変異に基づいている。これらの菌株は、浸透安
定剤を培地に加えなくてもよい程度に溶解感受性に関し
て改良されている。このためにＭＮＮ９遺伝子がクロー
ン化され、その後ＭＮＮ９遺伝子が外部から調節しうる
プロモーターの制御下にある菌株が構築された。これに
より、例えば必要とされる細胞のグリコシル化宿主タン
パク質を合成する細胞培養期の間、十分量の活性ＭＮＮ
９遺伝子産物を存在させることができる。この方法によ
って、ｍｎｎ９突然変異は所望のＮ−低グリコシル化タ
ンパク質の実際の生産期にだけ発現される。
【００１５】しかしながら、この方法には次のような欠
点がある： ＊細胞の培養がより一層複雑になる； ＊所望の細胞密度に達した後、目的のＮ−低グリコシル
化タンパク質の合成を誘導する前に、例えば培養物の温
度シフトにより、ＭＮＮ９遺伝子をスイッチ・オフにし
なければならない； ＊ＭＮＮ９遺伝子をスイッチ・オフにした後、細胞はｍ
ｎｎ９表現型を有し、すなわち貧弱な増殖などを示す
（上記参照）； ＊生産物の合成がすでに誘導されている場合、まだ存在
する活性ＭＮＮ９遺伝子産物が、ＭＮＮ９遺伝子のスイ
ッチ・オフにもかかわらず、少量の望ましくない高グリ
コシル化タンパク質産物の合成をもたらす。
点がある： ＊細胞の培養がより一層複雑になる； ＊所望の細胞密度に達した後、目的のＮ−低グリコシル
化タンパク質の合成を誘導する前に、例えば培養物の温
度シフトにより、ＭＮＮ９遺伝子をスイッチ・オフにし
なければならない； ＊ＭＮＮ９遺伝子をスイッチ・オフにした後、細胞はｍ
ｎｎ９表現型を有し、すなわち貧弱な増殖などを示す
（上記参照）； ＊生産物の合成がすでに誘導されている場合、まだ存在
する活性ＭＮＮ９遺伝子産物が、ＭＮＮ９遺伝子のスイ
ッチ・オフにもかかわらず、少量の望ましくない高グリ
コシル化タンパク質産物の合成をもたらす。
【００１６】さらに、酵母の分泌変異株（超分泌変異
株）は、多くの場合、低グリコシル化糖タンパク質を分
泌することが知られている。このような例は EP-A 0 38
2 332に記載されている。ｓｓｃ１（ｐｍｒ１）突然変
異の分子的原因は、おそらくＥＲとゴルジ複合体との小
胞輸送に関与するＤ型ＡＴＰアーゼの失活に基づくもの
であろう。細胞のソーティング機構がゴルジ区画（通
常、外鎖グリコシル化が起こる）を迂回する別の分泌経
路の開通をもたらすＳＳＣ１遺伝子の破壊によって損な
われると推測される。
株）は、多くの場合、低グリコシル化糖タンパク質を分
泌することが知られている。このような例は EP-A 0 38
2 332に記載されている。ｓｓｃ１（ｐｍｒ１）突然変
異の分子的原因は、おそらくＥＲとゴルジ複合体との小
胞輸送に関与するＤ型ＡＴＰアーゼの失活に基づくもの
であろう。細胞のソーティング機構がゴルジ区画（通
常、外鎖グリコシル化が起こる）を迂回する別の分泌経
路の開通をもたらすＳＳＣ１遺伝子の破壊によって損な
われると推測される。
【００１７】ｓｓｃ１突然変異は特に次のような欠点を
有する： ＊ｓｓｃ１突然変異がカルシウム依存性増殖を引き起こ
す。変異株は低カルシウム濃度では貧弱な増殖を示す； ＊上昇した分泌（例えば、プロキモシン、ｕ−ＰＡおよ
びｔ−ＰＡ）が遺伝子産物に依存する。α−１抗トリプ
シンの異種分泌および同種酵素の分泌（インベルターゼ
のペリプラズムへの、およびアルカリ性ホスファター
ゼ、プロテイナーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹ
の液胞への分泌）が上昇しない（Moir, D.T., In: Bar
r, P.J.; Brake, A.J. et al., Yeast genetic enginee
ring, Butterworths, Mass, pp. 215-231 (1989))。
有する： ＊ｓｓｃ１突然変異がカルシウム依存性増殖を引き起こ
す。変異株は低カルシウム濃度では貧弱な増殖を示す； ＊上昇した分泌（例えば、プロキモシン、ｕ−ＰＡおよ
びｔ−ＰＡ）が遺伝子産物に依存する。α−１抗トリプ
シンの異種分泌および同種酵素の分泌（インベルターゼ
のペリプラズムへの、およびアルカリ性ホスファター
ゼ、プロテイナーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹ
の液胞への分泌）が上昇しない（Moir, D.T., In: Bar
r, P.J.; Brake, A.J. et al., Yeast genetic enginee
ring, Butterworths, Mass, pp. 215-231 (1989))。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、これ
らの欠点を回避して、できる限り均質で、できる限り低
いＮ−グリコシル化を有する（例えば、外鎖グリコシル
化の完全なまたは部分的な欠損を有する）タンパク質の
同種および異種分泌のための、よく増殖する酵母宿主株
を提供することにある。なぜなら、バイオテクノロジー
の分野には、均質な規定されたＮ−グリコシル化を有す
るタンパク質の同種および異種分泌のための、よく増殖
しかつよく分泌する酵母菌株の必要性が存在するからで
ある。
らの欠点を回避して、できる限り均質で、できる限り低
いＮ−グリコシル化を有する（例えば、外鎖グリコシル
化の完全なまたは部分的な欠損を有する）タンパク質の
同種および異種分泌のための、よく増殖する酵母宿主株
を提供することにある。なぜなら、バイオテクノロジー
の分野には、均質な規定されたＮ−グリコシル化を有す
るタンパク質の同種および異種分泌のための、よく増殖
しかつよく分泌する酵母菌株の必要性が存在するからで
ある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】この目的は、〔3Ｈ〕−
マンノース自殺選択、１つまたは複数の選択マーカー
（栄養要求性および／または耐性）の導入、およびプラ
スミドＹＥｐＬ／ＧＯＤによる形質転換と２％酵母エキ
ス、４％バクトペプトン、Difco 、０．１ｍｏｌ／ｌリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１％フルクトースおよび６
％マルトースを含む完全培地での培養後、振とうしなが
ら３−４日間インキュベートした後で１０ｍｇ／ｌまた
はそれ以上のＧＯＤを生産しかつサッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＤＳＭ７０４２、
ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３３８および／またはＤＳＭ
７３４０にアレリック（allelic ）である菌株の選択に
より得られる、Ｎ−グリコシル化の欠損を有する酵母変
異株（ｎｇｄ変異株、Ｎ−グリコシル化欠損）により達
成される。
マンノース自殺選択、１つまたは複数の選択マーカー
（栄養要求性および／または耐性）の導入、およびプラ
スミドＹＥｐＬ／ＧＯＤによる形質転換と２％酵母エキ
ス、４％バクトペプトン、Difco 、０．１ｍｏｌ／ｌリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１％フルクトースおよび６
％マルトースを含む完全培地での培養後、振とうしなが
ら３−４日間インキュベートした後で１０ｍｇ／ｌまた
はそれ以上のＧＯＤを生産しかつサッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＤＳＭ７０４２、
ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３３８および／またはＤＳＭ
７３４０にアレリック（allelic ）である菌株の選択に
より得られる、Ｎ−グリコシル化の欠損を有する酵母変
異株（ｎｇｄ変異株、Ｎ−グリコシル化欠損）により達
成される。
【００２０】〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択（suicide s
election ）の原理は本質的に次の段階から成る： −突然変異誘発（野生型菌株、例えばＸ２１８０−１
Ａ；ＡＴＣＣ２６７８６、の突然変異誘発）； −〔3Ｈ〕−マンノースとのインキュベーション； −細胞の生存率がもとの値の１０2 −１０3 に低下する
まで低温（好ましくは約−８０℃）で細胞を貯蔵するこ
とによる高グリコシル化欠損変異株の濃縮（このための
貯蔵期間は２−４か月が好ましい）； −同種として発現されるインベルターゼに基づいたＮ−
グリコシル化が低減した変異株の選択； −分泌されたインベルターゼの活性染色および／または
免疫沈降による分析、および好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによるインベルターゼの分子量の決定（グリコシル化
の程度は測定された分子量から決定できる）。
election ）の原理は本質的に次の段階から成る： −突然変異誘発（野生型菌株、例えばＸ２１８０−１
Ａ；ＡＴＣＣ２６７８６、の突然変異誘発）； −〔3Ｈ〕−マンノースとのインキュベーション； −細胞の生存率がもとの値の１０2 −１０3 に低下する
まで低温（好ましくは約−８０℃）で細胞を貯蔵するこ
とによる高グリコシル化欠損変異株の濃縮（このための
貯蔵期間は２−４か月が好ましい）； −同種として発現されるインベルターゼに基づいたＮ−
グリコシル化が低減した変異株の選択； −分泌されたインベルターゼの活性染色および／または
免疫沈降による分析、および好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによるインベルターゼの分子量の決定（グリコシル化
の程度は測定された分子量から決定できる）。
【００２１】〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択は酵母変異
株の作製および単離に有効な方法である（Littlwood,
B.S., In: Methods of Cell Biology, Prescott, D.M.
(ed),Academic Press, New York, (1975) vol. IX, pp.
273-285）。この方法では、例えば細胞の糖タンパク質
に組み込まれるトリチウム標識マンノースにより酵母細
胞の一部に細胞死が起こる。生存細胞には、例えば炭水
化物の代謝および／または糖タンパク質の合成に変化が
生じる（Pouyssegur, J., Proc. Natl. Acad.Sci. 77,
2698-2701 (1980); Hirschberg, C.B. et al., Mol. Ce
ll. Biol. 1 (1981), 902-909; Huffaker, T.C. and Ro
bbins, P.W., J. Biol. Chem. 257 (1982), 3202-321
0）。〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択は、酵母マンノプロ
テインの外鎖グリコシル化の欠損を含む変異株を得るた
めに選択されたものである。このようにするには、グリ
コシル化欠損変異株が野生型細胞よりも放射活性マンノ
ースを少なく取り込み、かくして〔3Ｈ〕−マンノース
の露出に対して増強された耐性を示すという仮説が存在
した。マンノースの代謝に基づくこの方法の非特異性を
避けるために、トリチウムにより２位で誘導体化された
マンノースを用いることが好ましい。
株の作製および単離に有効な方法である（Littlwood,
B.S., In: Methods of Cell Biology, Prescott, D.M.
(ed),Academic Press, New York, (1975) vol. IX, pp.
273-285）。この方法では、例えば細胞の糖タンパク質
に組み込まれるトリチウム標識マンノースにより酵母細
胞の一部に細胞死が起こる。生存細胞には、例えば炭水
化物の代謝および／または糖タンパク質の合成に変化が
生じる（Pouyssegur, J., Proc. Natl. Acad.Sci. 77,
2698-2701 (1980); Hirschberg, C.B. et al., Mol. Ce
ll. Biol. 1 (1981), 902-909; Huffaker, T.C. and Ro
bbins, P.W., J. Biol. Chem. 257 (1982), 3202-321
0）。〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択は、酵母マンノプロ
テインの外鎖グリコシル化の欠損を含む変異株を得るた
めに選択されたものである。このようにするには、グリ
コシル化欠損変異株が野生型細胞よりも放射活性マンノ
ースを少なく取り込み、かくして〔3Ｈ〕−マンノース
の露出に対して増強された耐性を示すという仮説が存在
した。マンノースの代謝に基づくこの方法の非特異性を
避けるために、トリチウムにより２位で誘導体化された
マンノースを用いることが好ましい。
【００２２】選択マーカー（栄養要求マーカーおよび／
または耐性）は、酵母株を接合させて二倍体を形成させ
（マイクロマニピュレーションによる接合体の単離）、
場合によりその後の半数体への胞子形成（四分子分析）
により導入することができる。適当な選択マーカーは例
えば栄養要求マーカーｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、
ｌｙｓ２、ｈｉｓ３、ｈｉｓ４およびａｄｅ２、または
例えば銅（ＣＵＰ１遺伝子）やＧ４１８（Ｔｎ６０１
（９０３）アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
遺伝子）に対して耐性を生じさせる遺伝子である（Bitt
er, G.A. et al.,Methods Enzymol. 153 (1987) 516-54
3）。
または耐性）は、酵母株を接合させて二倍体を形成させ
（マイクロマニピュレーションによる接合体の単離）、
場合によりその後の半数体への胞子形成（四分子分析）
により導入することができる。適当な選択マーカーは例
えば栄養要求マーカーｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、
ｌｙｓ２、ｈｉｓ３、ｈｉｓ４およびａｄｅ２、または
例えば銅（ＣＵＰ１遺伝子）やＧ４１８（Ｔｎ６０１
（９０３）アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
遺伝子）に対して耐性を生じさせる遺伝子である（Bitt
er, G.A. et al.,Methods Enzymol. 153 (1987) 516-54
3）。
【００２３】Ｎ−グリコシル化欠損変異株はＮＧＤ２９
および／またはＮＧＤ６２遺伝子の欠損を含むことが好
ましい。ｎｇｄ表現型は、基質／グルコース試薬として
スクロースと２，３，４−トリニトロフェニルテトラゾ
リウムクロリドを用いて、天然ＰＡＧＥゲルによるイン
ベルターゼの活性染色により測定し得る。
および／またはＮＧＤ６２遺伝子の欠損を含むことが好
ましい。ｎｇｄ表現型は、基質／グルコース試薬として
スクロースと２，３，４−トリニトロフェニルテトラゾ
リウムクロリドを用いて、天然ＰＡＧＥゲルによるイン
ベルターゼの活性染色により測定し得る。
【００２４】ＧＯＤの十分な生産は、標準条件下での培
養後に培地に分泌されたＧＯＤの活性を測定することに
より判定し得る。このために、試験すべき菌株（ＧＯＤ
形質転換体）を、好ましくは選択的前培養後に、振とう
しながら完全培地中で３−４日間インキュベートする。
完全培地には、中性ｐＨで酵母エキス、バクトペプト
ン、フルクトースおよびマルトースを添加することが好
ましい。
養後に培地に分泌されたＧＯＤの活性を測定することに
より判定し得る。このために、試験すべき菌株（ＧＯＤ
形質転換体）を、好ましくは選択的前培養後に、振とう
しながら完全培地中で３−４日間インキュベートする。
完全培地には、中性ｐＨで酵母エキス、バクトペプト
ン、フルクトースおよびマルトースを添加することが好
ましい。
【００２５】グルコースオキシダーゼの測定は例えば
「一般方法」の実施例に記載した方法に従って行われ
る。本発明による変異株（対立遺伝子変異株）は、試験
すべき変異株が酵母株ＤＳＭ７０４２またはＤＳＭ７３
３８（ｎｇｄ２９）およびＤＳＭ７１６０またはＤＳＭ
７３４０（ｎｇｄ６２）と同じ遺伝子に突然変異をもつ
か否かを分析する試験により判定される。
「一般方法」の実施例に記載した方法に従って行われ
る。本発明による変異株（対立遺伝子変異株）は、試験
すべき変異株が酵母株ＤＳＭ７０４２またはＤＳＭ７３
３８（ｎｇｄ２９）およびＤＳＭ７１６０またはＤＳＭ
７３４０（ｎｇｄ６２）と同じ遺伝子に突然変異をもつ
か否かを分析する試験により判定される。
【００２６】このために、試験すべき各菌株をＤＳＭ７
０４２／７３３８グループとＤＳＭ７１６０／７３４０
グループからの酵母株と接合させ、これにより得られた
二倍体の菌株を分析する。試験すべき突然変異（株）
は、突然変異が二倍体細胞において相補性でない場合、
本発明によるｎｇｄ変異株（ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７
３３８、ｎｇｄ２９）および／または（ＤＳＭ７１６
０、ＤＳＭ７３４０、ｎｇｄ６２）にアレリック（対立
性）である。
０４２／７３３８グループとＤＳＭ７１６０／７３４０
グループからの酵母株と接合させ、これにより得られた
二倍体の菌株を分析する。試験すべき突然変異（株）
は、突然変異が二倍体細胞において相補性でない場合、
本発明によるｎｇｄ変異株（ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７
３３８、ｎｇｄ２９）および／または（ＤＳＭ７１６
０、ＤＳＭ７３４０、ｎｇｄ６２）にアレリック（対立
性）である。
【００２７】試験すべき突然変異（株）は、突然変異が
二倍体細胞において相補性で、Ｎ−グリコシル化に関し
て野生型表現型をもたらす場合、本発明によるｎｇｄ変
異株（ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、ｎｇｄ２９）
および／または（ＤＳＭ７１６０、ｎｇｄ６２）にアレ
リックでない。本発明により用いられる好ましい酵母株
は株ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３３８
および／またはＤＳＭ７３４０である。ＤＳＭ７３３８
および／またはＤＳＭ７３４０を用いることが特に好ま
しい。
二倍体細胞において相補性で、Ｎ−グリコシル化に関し
て野生型表現型をもたらす場合、本発明によるｎｇｄ変
異株（ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、ｎｇｄ２９）
および／または（ＤＳＭ７１６０、ｎｇｄ６２）にアレ
リックでない。本発明により用いられる好ましい酵母株
は株ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３３８
および／またはＤＳＭ７３４０である。ＤＳＭ７３３８
および／またはＤＳＭ７３４０を用いることが特に好ま
しい。
【００２８】本発明はまた、〔3Ｈ〕−マンノース自殺
選択、１つまたは複数の選択マーカー（栄養要求性およ
び／または耐性遺伝子）の導入、プラスミドＹＥｐＬ／
ＧＯＤによる形質転換と２％酵母エキス、４％バクトペ
プトン、Difco 、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）、１％フルクトースおよび６％マルトースを含
む完全培地での培養後、振とうしながら３−４日間イン
キュベートした後で１０ｍｇ／ｌ以上の量のＧＯＤを生
産しかつサッカロミセス・セレビシエＤＳＭ７０４２、
ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３３８および／またはＤＳＭ
７３４０にアレリックである菌株の選択より成る、Ｎ−
グリコシル化の欠損を有するサッカロミセス変異株の作
製方法に関するものである。
選択、１つまたは複数の選択マーカー（栄養要求性およ
び／または耐性遺伝子）の導入、プラスミドＹＥｐＬ／
ＧＯＤによる形質転換と２％酵母エキス、４％バクトペ
プトン、Difco 、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）、１％フルクトースおよび６％マルトースを含
む完全培地での培養後、振とうしながら３−４日間イン
キュベートした後で１０ｍｇ／ｌ以上の量のＧＯＤを生
産しかつサッカロミセス・セレビシエＤＳＭ７０４２、
ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３３８および／またはＤＳＭ
７３４０にアレリックである菌株の選択より成る、Ｎ−
グリコシル化の欠損を有するサッカロミセス変異株の作
製方法に関するものである。
【００２９】本発明はさらに、本質的に均質にグリコシ
ル化されたタンパク質を生産するための本発明の酵母株
の使用に関するものである。酵母特異的糖タンパク質
（例えば、エクスターナルインベルターゼ、酸ホスファ
ターゼ、エンドグルカナーゼおよび細胞壁マンノプロテ
イン）を生産するために、本発明の酵母株を培養し、細
胞または培養上清から公知方法により所望の糖タンパク
質を単離し、精製することができる。
ル化されたタンパク質を生産するための本発明の酵母株
の使用に関するものである。酵母特異的糖タンパク質
（例えば、エクスターナルインベルターゼ、酸ホスファ
ターゼ、エンドグルカナーゼおよび細胞壁マンノプロテ
イン）を生産するために、本発明の酵母株を培養し、細
胞または培養上清から公知方法により所望の糖タンパク
質を単離し、精製することができる。
【００３０】異種タンパク質は、発現すべき糖タンパク
質の遺伝子を含む組換えＤＮＡを用いて本発明の酵母株
を形質転換することにより得られる。例えば、グルコー
スオキシダーゼ、α１−ミクログロブリン、エリトロポ
エチンおよびグルコアミラーゼをこの方法で生産するこ
とができる。本発明はさらに、タンパク質をコードする
ＤＮＡによる請求項１記載の酵母変異株の形質転換、該
形質転換細胞の培養、および細胞または培養上清からの
該タンパク質の単離より成る、本質的に均質にグリコシ
ル化されたタンパク質の発現および生産方法に関するも
のである。
質の遺伝子を含む組換えＤＮＡを用いて本発明の酵母株
を形質転換することにより得られる。例えば、グルコー
スオキシダーゼ、α１−ミクログロブリン、エリトロポ
エチンおよびグルコアミラーゼをこの方法で生産するこ
とができる。本発明はさらに、タンパク質をコードする
ＤＮＡによる請求項１記載の酵母変異株の形質転換、該
形質転換細胞の培養、および細胞または培養上清からの
該タンパク質の単離より成る、本質的に均質にグリコシ
ル化されたタンパク質の発現および生産方法に関するも
のである。
【００３１】特許のために、以下のものが「ドイツ微生
物寄託所（ＤＳＭ）」（Mascheroder Weg 1 B, D-3300
Braunschweig）に寄託された：
物寄託所（ＤＳＭ）」（Mascheroder Weg 1 B, D-3300
Braunschweig）に寄託された：
【００３２】
【表１】
【００３３】
【実施例】以下の実施例は本発明をさらに説明するため
のものである。一般方法 組換えＤＮＡ法 ＤＮＡを操作するために、Maniatis, T. et al., in: M
olecular cloning: Alaboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Y
ork, (1989)に記載されるような標準方法を使用した。
分子生物学的試薬は製造者の指示通りに用いた。酵母の形質転換 サッカロミセス・セレビシエ株は Beggs, J.D.の方法
(Nature 275 (1978) 104-109; Ito, H. et al., J. Bac
teriol. 153 (1983) 163-168 または Delorme,E. (Appl
ied and Environmental Microbiology 55 (1989) 2242-
2246）により形質転換した。グルコースオキシダーゼを
発現する酵母株の炭素源としてグルコースの代わりにフ
ルクトースを使用した。グルコースオキシダーゼ活性の測定 ＧＯＤ活性の測定は、２５℃、１ｍｌの容量で、０．１
８ｍｏｌ／ｌグルコース、１５単位／ｍｌ西洋ワサビペ
ルオキシダーゼおよび１．７５ｍｍｏｌ／ｌＡＢＴＳ
（登録商標）グルコース試薬を含む、酸素を飽和させた
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
中で行った。グルコースオキシダーゼ（５−２０ｍＵ／
ｍｌに希釈したＧＯＤ含有試料１０μｌ）の添加により
反応を開始させ、吸光度／分の変化（ΔＡ／分）を４０
５ｎｍで測定した（ε405 ＝３６．８〔ｍｍｏｌ-1×１
×ｃｍ-1〕）。１単位（Ｕ）のＧＯＤ活性は２５℃で１
分あたりに１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素の量
と定義される。精製したＡ．ニガーＧＯＤの比活性はこ
れらの試験条件下で約２３０Ｕ／ｍｇタンパク質であ
る。
のものである。一般方法 組換えＤＮＡ法 ＤＮＡを操作するために、Maniatis, T. et al., in: M
olecular cloning: Alaboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Y
ork, (1989)に記載されるような標準方法を使用した。
分子生物学的試薬は製造者の指示通りに用いた。酵母の形質転換 サッカロミセス・セレビシエ株は Beggs, J.D.の方法
(Nature 275 (1978) 104-109; Ito, H. et al., J. Bac
teriol. 153 (1983) 163-168 または Delorme,E. (Appl
ied and Environmental Microbiology 55 (1989) 2242-
2246）により形質転換した。グルコースオキシダーゼを
発現する酵母株の炭素源としてグルコースの代わりにフ
ルクトースを使用した。グルコースオキシダーゼ活性の測定 ＧＯＤ活性の測定は、２５℃、１ｍｌの容量で、０．１
８ｍｏｌ／ｌグルコース、１５単位／ｍｌ西洋ワサビペ
ルオキシダーゼおよび１．７５ｍｍｏｌ／ｌＡＢＴＳ
（登録商標）グルコース試薬を含む、酸素を飽和させた
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
中で行った。グルコースオキシダーゼ（５−２０ｍＵ／
ｍｌに希釈したＧＯＤ含有試料１０μｌ）の添加により
反応を開始させ、吸光度／分の変化（ΔＡ／分）を４０
５ｎｍで測定した（ε405 ＝３６．８〔ｍｍｏｌ-1×１
×ｃｍ-1〕）。１単位（Ｕ）のＧＯＤ活性は２５℃で１
分あたりに１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素の量
と定義される。精製したＡ．ニガーＧＯＤの比活性はこ
れらの試験条件下で約２３０Ｕ／ｍｇタンパク質であ
る。
【００３４】タンパク質の測定 タンパク質の測定は標準としてウシ血清アルブミンを用
いてマイクロビウレット法（Zamenhof, S. et al., Met
hods Enzymol. 3 (1957) 696-704）により行った。精製
ＧＯＤ酵素のタンパク質濃度は２８０ｎｍでの光学密度
に基づいて計算し
いてマイクロビウレット法（Zamenhof, S. et al., Met
hods Enzymol. 3 (1957) 696-704）により行った。精製
ＧＯＤ酵素のタンパク質濃度は２８０ｎｍでの光学密度
に基づいて計算し
【００３５】細胞溶解および粗抽出物の単離 ５ｍｌの培地から細胞（約０．１−０．２ｇの酵母、湿
潤重量）を遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｍｏｌ
／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗い、続いてWh
irlmix（Ciriacy, M., Mut. Res. 29 (1975) 315-326）
でホモジナイズすることによりガラスビーズで溶解し
た。その後細胞を２ｍｌの１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）中に再懸濁／抽出し、細胞破片を遠心
により除き、上清を粗抽出物としてさらに処理した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） 可溶性試料（培地上清および細胞溶解液）を１／５倍容
量の５×ＳＤＳ試料緩衝液（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５
０ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤ
Ｓ、１％メルカプトエタノール、１０％グリセロール、
０．００１％ブロモフェノールブルー）と混合し、９５
℃で５分間インキュベートした。細胞破片画分の不溶性
タンパク質は２ｍｌの１×ＳＤＳ試料緩衝液および６−
８ｍｏｌ／ｌの尿素で抽出し、９５℃で５分間加熱して
変性し、遠心により不溶性成分から分離した。その後タ
ンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し（Laemmli, U.K.,
Nature 227 (1970) 680-685）、クーマシーブリリアン
トブルー（Coomassie Brilliant Blue: 登録商標）染料
で染色した。
潤重量）を遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｍｏｌ
／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗い、続いてWh
irlmix（Ciriacy, M., Mut. Res. 29 (1975) 315-326）
でホモジナイズすることによりガラスビーズで溶解し
た。その後細胞を２ｍｌの１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）中に再懸濁／抽出し、細胞破片を遠心
により除き、上清を粗抽出物としてさらに処理した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） 可溶性試料（培地上清および細胞溶解液）を１／５倍容
量の５×ＳＤＳ試料緩衝液（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５
０ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤ
Ｓ、１％メルカプトエタノール、１０％グリセロール、
０．００１％ブロモフェノールブルー）と混合し、９５
℃で５分間インキュベートした。細胞破片画分の不溶性
タンパク質は２ｍｌの１×ＳＤＳ試料緩衝液および６−
８ｍｏｌ／ｌの尿素で抽出し、９５℃で５分間加熱して
変性し、遠心により不溶性成分から分離した。その後タ
ンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し（Laemmli, U.K.,
Nature 227 (1970) 680-685）、クーマシーブリリアン
トブルー（Coomassie Brilliant Blue: 登録商標）染料
で染色した。
【００３６】実施例１ Ｓ．セレビシエからＡ．ニガーＧＯＤを分泌させるため
のプラスミドの構築 酵母発現ベクターＹＥｐＬ（出発ベクター）の構築 プラスミドＹＥｐＬはα−グルコシダーゼベクターＹＥ
ｐ／５Ｃ６ｂ３（Kopetzki et al., Yeast 5 (1989) 11
-24; Kopetzki et al., EP-A 0 323 838）を土台にして
いる。プラスミドｐＢＲ３２２由来の約２．３ｋＢｐの
長いＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩフラグメント（プラスミド
起点、アンピシリン耐性遺伝子）は大腸菌中でこのプラ
スミドを複製させるのに役立つ。酵母中での複製のため
に、このベクターは酵母の２μｍＤＮＡ由来の約２．２
ｋＢｐの長いＥｃｏＲＩフラグメントを含む（大腸菌／
酵母シャトルベクターＹＥｐ２４からサブクローニング
した）。さらに、このベクターは栄養要求酵母株におい
てプラスミドを選択するためのＵＲＡ３およびＬＥＵ２
ｄ遺伝子並びにα−グルコシダーゼ発現カセット（ＧＬ
ＵＣＰＩ遺伝子）を含む。それはα−グルコシダーゼプ
ロモーター、ポリリンカー（発現すべき遺伝子のクロー
ニング部位）およびα−グルコシダーゼターミネーター
から成っている。さらに、ＭＡＬ２−８ｃｐ遺伝子が存
在し、この遺伝子産物（ＭＡＬ２−８ｃｐタンパク質）
がα−グルコシダーゼプロモーターを活性化する。α−
グルコシダーゼプロモーターはグルコースの存在下で抑
制される。それはグルコースの消費後に抑制解除され、
そしてマルトースによる誘導後にその最大活性に達す
る。
のプラスミドの構築 酵母発現ベクターＹＥｐＬ（出発ベクター）の構築 プラスミドＹＥｐＬはα−グルコシダーゼベクターＹＥ
ｐ／５Ｃ６ｂ３（Kopetzki et al., Yeast 5 (1989) 11
-24; Kopetzki et al., EP-A 0 323 838）を土台にして
いる。プラスミドｐＢＲ３２２由来の約２．３ｋＢｐの
長いＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩフラグメント（プラスミド
起点、アンピシリン耐性遺伝子）は大腸菌中でこのプラ
スミドを複製させるのに役立つ。酵母中での複製のため
に、このベクターは酵母の２μｍＤＮＡ由来の約２．２
ｋＢｐの長いＥｃｏＲＩフラグメントを含む（大腸菌／
酵母シャトルベクターＹＥｐ２４からサブクローニング
した）。さらに、このベクターは栄養要求酵母株におい
てプラスミドを選択するためのＵＲＡ３およびＬＥＵ２
ｄ遺伝子並びにα−グルコシダーゼ発現カセット（ＧＬ
ＵＣＰＩ遺伝子）を含む。それはα−グルコシダーゼプ
ロモーター、ポリリンカー（発現すべき遺伝子のクロー
ニング部位）およびα−グルコシダーゼターミネーター
から成っている。さらに、ＭＡＬ２−８ｃｐ遺伝子が存
在し、この遺伝子産物（ＭＡＬ２−８ｃｐタンパク質）
がα−グルコシダーゼプロモーターを活性化する。α−
グルコシダーゼプロモーターはグルコースの存在下で抑
制される。それはグルコースの消費後に抑制解除され、
そしてマルトースによる誘導後にその最大活性に達す
る。
【００３７】1.1 プラスミドＹＥｐ／ＫＬ６ｂ３の構
築 α−グルコシダーゼターミネーターとＭＡＬ２−８ｃｐ
プロモーターの間の必要でない約１．４ｋＢｐのＤＮＡ
配列をプラスミドＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３から欠失させた
（図１）。このために、プラスミドＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３
をＸｈｏＩで線状化し、５’突出末端を Klenow ポリメ
ラーゼで修復し、このプラスミドをＭｒｏＩで再度切断
して、８．７ｋＢｐのＭｒｏＩ／ＸｈｏＩ（平滑）ベク
ターフラグメントを単離した。２回目の調製では、プラ
スミドＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３を制限エンドヌクレアーゼＭ
ｒｏＩとＳｃａＩで消化して、α−グルコシダーゼ遺伝
子を含む２．５ｋＢｐのＭｒｏＩ／ＳｃａＩフラグメン
トを単離し、８．７ｋＢｐのＭｒｏＩ／ＸｈｏＩ（平
滑）ベクターフラグメントと連結した。所望のプラスミ
ドを制限マッピングにより同定し、ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ
３と命名した。1.2 プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍの構築 ＭｌｕＩリンカー（5'-GACGCGTC-3'）をＭＡＬ２−８ｃ
ｐ遺伝子の５’非翻訳領域のＳｓｐＩ制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位に連結した。プラスミドの構築：ＹＥｐ
／ＫＬ−６ｂ３Ｍ。1.3 プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳの構
築 α−グルコシダーゼの構造遺伝子を“ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）”法により除去し（Mullis, K.B. and F
aloona, F.A., Methods in Enzymol. 155 (1987) 335-3
50）、ＤＮＡリンカー（多重クローニング部位；ＭＣ
Ｓ）と置き換えた。
築 α−グルコシダーゼターミネーターとＭＡＬ２−８ｃｐ
プロモーターの間の必要でない約１．４ｋＢｐのＤＮＡ
配列をプラスミドＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３から欠失させた
（図１）。このために、プラスミドＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３
をＸｈｏＩで線状化し、５’突出末端を Klenow ポリメ
ラーゼで修復し、このプラスミドをＭｒｏＩで再度切断
して、８．７ｋＢｐのＭｒｏＩ／ＸｈｏＩ（平滑）ベク
ターフラグメントを単離した。２回目の調製では、プラ
スミドＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３を制限エンドヌクレアーゼＭ
ｒｏＩとＳｃａＩで消化して、α−グルコシダーゼ遺伝
子を含む２．５ｋＢｐのＭｒｏＩ／ＳｃａＩフラグメン
トを単離し、８．７ｋＢｐのＭｒｏＩ／ＸｈｏＩ（平
滑）ベクターフラグメントと連結した。所望のプラスミ
ドを制限マッピングにより同定し、ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ
３と命名した。1.2 プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍの構築 ＭｌｕＩリンカー（5'-GACGCGTC-3'）をＭＡＬ２−８ｃ
ｐ遺伝子の５’非翻訳領域のＳｓｐＩ制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位に連結した。プラスミドの構築：ＹＥｐ
／ＫＬ−６ｂ３Ｍ。1.3 プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳの構
築 α−グルコシダーゼの構造遺伝子を“ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）”法により除去し（Mullis, K.B. and F
aloona, F.A., Methods in Enzymol. 155 (1987) 335-3
50）、ＤＮＡリンカー（多重クローニング部位；ＭＣ
Ｓ）と置き換えた。
【００３８】
【化１】
【００３９】このために、プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６
ｂ３ＭからのＧＬＵＣＰＩプロモーター配列をＰＣＲに
より次のプライマー対（配列番号１および配列番号２参
照）：
ｂ３ＭからのＧＬＵＣＰＩプロモーター配列をＰＣＲに
より次のプライマー対（配列番号１および配列番号２参
照）：
【００４０】
【化２】
【００４１】を用いて増幅し、約４１０ＢｐのＰＣＲ産
物をアガロースゲル電気泳動により単離した。プラスミ
ドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３ＭからのＧＬＵＣＰＩターミネ
ーター配列は２回目のＰＣＲ反応で次のプライマー対
（配列番号３および配列番号４参照）：
物をアガロースゲル電気泳動により単離した。プラスミ
ドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３ＭからのＧＬＵＣＰＩターミネ
ーター配列は２回目のＰＣＲ反応で次のプライマー対
（配列番号３および配列番号４参照）：
【００４２】
【化３】
【００４３】を用いて増幅し、約８６０ＢｐのＰＣＲ産
物をアガロースゲル電気泳動により単離した。その後、
等モル量（それぞれ約５０ｐｇ）の単離ＰＣＲフラグメ
ントをＰＣＲ反応混合物中で一緒にし、９５℃で５分イ
ンキュベートしてｄｓ−ＤＮＡを変性させ、この反応混
合物を６０℃に冷却してＭＣＳを含む相補一本鎖ＤＮＡ
をアニーリングさせ、ハイブリダイゼーション産物をＴ
ａｑポリメラーゼを使ってｄｓ−ＤＮＡに変換し、そし
て３回目のＰＣＲ反応で次のプライマー対（配列番号１
および配列番号４参照）：
物をアガロースゲル電気泳動により単離した。その後、
等モル量（それぞれ約５０ｐｇ）の単離ＰＣＲフラグメ
ントをＰＣＲ反応混合物中で一緒にし、９５℃で５分イ
ンキュベートしてｄｓ−ＤＮＡを変性させ、この反応混
合物を６０℃に冷却してＭＣＳを含む相補一本鎖ＤＮＡ
をアニーリングさせ、ハイブリダイゼーション産物をＴ
ａｑポリメラーゼを使ってｄｓ−ＤＮＡに変換し、そし
て３回目のＰＣＲ反応で次のプライマー対（配列番号１
および配列番号４参照）：
【００４４】
【化４】
【００４５】を用いて増幅した。その後、約１．２７ｋ
ＢｐのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＭｒｏＩと
ＭｌｕＩで消化して、約０．９２ｋＢｐのＭｒｏＩ／Ｍ
ｌｕＩ−ＧＬＵＣＰＩプロモーター／ＭＣＳ／ＧＬＵＣ
ＰＩターミネーターフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により単離し、これを約８．５５ｋＢｐのＭｒｏＩ
／ＭｌｕＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍベクターフラグメ
ントと連結させた。所望のプラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６
ｂ３Ｍ−ＭＣＳを制限マッピングにより同定し、ＰＣＲ
で合成したＤＮＡ領域をＤＮＡシークエンシングにより
調べた。
ＢｐのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＭｒｏＩと
ＭｌｕＩで消化して、約０．９２ｋＢｐのＭｒｏＩ／Ｍ
ｌｕＩ−ＧＬＵＣＰＩプロモーター／ＭＣＳ／ＧＬＵＣ
ＰＩターミネーターフラグメントをアガロースゲル電気
泳動により単離し、これを約８．５５ｋＢｐのＭｒｏＩ
／ＭｌｕＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍベクターフラグメ
ントと連結させた。所望のプラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６
ｂ３Ｍ−ＭＣＳを制限マッピングにより同定し、ＰＣＲ
で合成したＤＮＡ領域をＤＮＡシークエンシングにより
調べた。
【００４６】1.4 プラスミドＹＥｐＬの構築 次のプラスミドの構築では、ＬＥＵ２ｄ遺伝子をプラス
ミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳに挿入した。この
ために、プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳを
ＣｅｌＩＩとＳｎａＢＩで消化し、８．４ｋＢｐのＣｅ
ｌＩＩ／ＳｎａＢＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳ
ベクターフラグメントを単離した。ＬＥＵ２ｄ遺伝子は
プラスミドｐＡＤＨ０４０−２（Erhart, E. and Holle
nberg, C.P., J. Bacteriol. 156 (1983) 625-635 ）か
ら約２．３２ｋＢｐのＣｅｌＩＩ／ＳｎａＢＩフラグメ
ントとして単離し、８．４ｋＢｐのＣｅｌＩＩ／Ｓｎａ
ＢＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳベクターフラグ
メントと連結させた。所望のプラスミドＹＥｐＬ（ＤＳ
Ｍ７０３８）を制限マッピングにより同定した（図
２）。
ミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳに挿入した。この
ために、プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳを
ＣｅｌＩＩとＳｎａＢＩで消化し、８．４ｋＢｐのＣｅ
ｌＩＩ／ＳｎａＢＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳ
ベクターフラグメントを単離した。ＬＥＵ２ｄ遺伝子は
プラスミドｐＡＤＨ０４０−２（Erhart, E. and Holle
nberg, C.P., J. Bacteriol. 156 (1983) 625-635 ）か
ら約２．３２ｋＢｐのＣｅｌＩＩ／ＳｎａＢＩフラグメ
ントとして単離し、８．４ｋＢｐのＣｅｌＩＩ／Ｓｎａ
ＢＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳベクターフラグ
メントと連結させた。所望のプラスミドＹＥｐＬ（ＤＳ
Ｍ７０３８）を制限マッピングにより同定した（図
２）。
【００４７】1.5 プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤの構築 用いるグルコースオキシダーゼ遺伝子のクローニング
（菌株：ＮＲＲＬ−３，ＡＴＣＣ９０２９）、pBluescr
ipt SK(+) ベクターへのサブクローニング、ＤＮＡシー
クエンシング、およびＧＯＤタンパク質配列の推定は K
riechbaum, M. らの文献（FEBS Lett. 255 (1989) 63-6
6 ）に記載されている。ＧＯＤ遺伝子はpBluescript SK
(+) に２つの部分領域（ＳａｌＩ制限フラグメント）と
してクローニングした。プラスミドｐＳＫ／ＧＯＤ−
１．８は、５’非翻訳領域およびＢｐ位置１６４（Ｂｐ
位置は Kriechbaum, M. らによる番号付けに対応する）
のＳａｌＩ切断部位までのＧＯＤ構造遺伝子のＮ末端領
域をコードする約１．８ｋＢｐのＳａｌＩフラグメント
を含んでいる。プラスミドｐＳＫ／ＧＯＤ−２．０は、
Ｂｐ位置１６５から１８５３までのＧＯＤ構造遺伝子の
残りおよびＧＯＤ構造遺伝子の下流の３’非翻訳領域を
コードする約２．０ｋＢｐのＳａｌＩフラグメントを含
んでいる。
（菌株：ＮＲＲＬ−３，ＡＴＣＣ９０２９）、pBluescr
ipt SK(+) ベクターへのサブクローニング、ＤＮＡシー
クエンシング、およびＧＯＤタンパク質配列の推定は K
riechbaum, M. らの文献（FEBS Lett. 255 (1989) 63-6
6 ）に記載されている。ＧＯＤ遺伝子はpBluescript SK
(+) に２つの部分領域（ＳａｌＩ制限フラグメント）と
してクローニングした。プラスミドｐＳＫ／ＧＯＤ−
１．８は、５’非翻訳領域およびＢｐ位置１６４（Ｂｐ
位置は Kriechbaum, M. らによる番号付けに対応する）
のＳａｌＩ切断部位までのＧＯＤ構造遺伝子のＮ末端領
域をコードする約１．８ｋＢｐのＳａｌＩフラグメント
を含んでいる。プラスミドｐＳＫ／ＧＯＤ−２．０は、
Ｂｐ位置１６５から１８５３までのＧＯＤ構造遺伝子の
残りおよびＧＯＤ構造遺伝子の下流の３’非翻訳領域を
コードする約２．０ｋＢｐのＳａｌＩフラグメントを含
んでいる。
【００４８】ＧＯＤ遺伝子の５’および３’非翻訳領域
はＰＣＲ法によって除去し、ＧＯＤ構造遺伝子に単一の
制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢｇｌＩＩとＰｖｕ
ＩＩ）を導入し、さらに天然ＧＯＤタンパク質をコード
するＤＮＡ配列を保持しつつＧＯＤ構造遺伝子のＣ末端
コード領域に単一のＳｐｈＩおよびＮｈｅＩ切断部位を
導入した。続いて、ＧＯＤ構造遺伝子を３フラグメント
連結反応により２つのＰＣＲフラグメントから構成し、
ベクターＹＥｐＬに挿入した。Ｎ末端ＧＯＤ構造遺伝子
を増幅するために次のプライマー対（配列番号５および
配列番号６参照）：
はＰＣＲ法によって除去し、ＧＯＤ構造遺伝子に単一の
制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢｇｌＩＩとＰｖｕ
ＩＩ）を導入し、さらに天然ＧＯＤタンパク質をコード
するＤＮＡ配列を保持しつつＧＯＤ構造遺伝子のＣ末端
コード領域に単一のＳｐｈＩおよびＮｈｅＩ切断部位を
導入した。続いて、ＧＯＤ構造遺伝子を３フラグメント
連結反応により２つのＰＣＲフラグメントから構成し、
ベクターＹＥｐＬに挿入した。Ｎ末端ＧＯＤ構造遺伝子
を増幅するために次のプライマー対（配列番号５および
配列番号６参照）：
【００４９】
【化５】
【００５０】を使用し、プラスミドｐＳＫ／ＧＯＤ−
１．８を鋳型ＤＮＡとして使用した。残りのＧＯＤ構造
遺伝子を増幅するために次のプライマー対（配列番号７
および配列番号８参照）：
１．８を鋳型ＤＮＡとして使用した。残りのＧＯＤ構造
遺伝子を増幅するために次のプライマー対（配列番号７
および配列番号８参照）：
【００５１】
【化６】
【００５２】を使用し、プラスミドｐＳＫ／ＧＯＤ−
２．０を鋳型ＤＮＡとして使用した。１回目の反応から
の約２２０ＢｐのＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＳａｌＩで
再度切断し、約１３０ＢｐのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩフラ
グメントを単離した。２回目の反応からの約２．０５ｋ
ＢｐのＰＣＲ産物をＳａｌＩとＰｖｕＩＩで消化し、約
１．７ｋＢｐのＤＮＡフラグメントを単離した。その
後、ＰＣＲフラグメントを約１０．７ｋＢｐのＢｇｌＩ
Ｉ／ＰｖｕＩＩ−ＹＥｐＬベクターフラグメントに連結
させた（３フラグメント連結反応）。所望のプラスミド
ＹＥｐＬ／ＧＯＤ（図３）を制限マッピングにより同定
し、部分的に配列決定を行った（クローニング接合
部）。
２．０を鋳型ＤＮＡとして使用した。１回目の反応から
の約２２０ＢｐのＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＳａｌＩで
再度切断し、約１３０ＢｐのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩフラ
グメントを単離した。２回目の反応からの約２．０５ｋ
ＢｐのＰＣＲ産物をＳａｌＩとＰｖｕＩＩで消化し、約
１．７ｋＢｐのＤＮＡフラグメントを単離した。その
後、ＰＣＲフラグメントを約１０．７ｋＢｐのＢｇｌＩ
Ｉ／ＰｖｕＩＩ−ＹＥｐＬベクターフラグメントに連結
させた（３フラグメント連結反応）。所望のプラスミド
ＹＥｐＬ／ＧＯＤ（図３）を制限マッピングにより同定
し、部分的に配列決定を行った（クローニング接合
部）。
【００５３】1.6 プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈ
ｉｓ）4 の構築 このプラスミドはＣ末端に４個の追加のヒスチジン残基
をもつＧＯＤ酵素変異体をコードする修飾ＧＯＤ遺伝子
を含んでいる。ＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ） 4 はプラ
スミドＹＥｐＬ／ＧＯＤから作製した。このために、プ
ラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤをＳｐｈＩで部分的に切断
し、ＰｖｕＩＩで完全に切断して、約１０．７ｋＢｐの
ＳｐｈＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントを単離し、ハイブリ
ダイゼーションによって２つのオリゴヌクレオチド（配
列番号９および配列番号10参照）から作製した以下のＤ
ＮＡリンカーと連結させた：
ｉｓ）4 の構築 このプラスミドはＣ末端に４個の追加のヒスチジン残基
をもつＧＯＤ酵素変異体をコードする修飾ＧＯＤ遺伝子
を含んでいる。ＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ） 4 はプラ
スミドＹＥｐＬ／ＧＯＤから作製した。このために、プ
ラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤをＳｐｈＩで部分的に切断
し、ＰｖｕＩＩで完全に切断して、約１０．７ｋＢｐの
ＳｐｈＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントを単離し、ハイブリ
ダイゼーションによって２つのオリゴヌクレオチド（配
列番号９および配列番号10参照）から作製した以下のＤ
ＮＡリンカーと連結させた：
【００５４】
【化７】
【００５５】所望のプラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈ
ｉｓ）4 は、放射性標識プライマー１０を用いてコロニ
ーハイブリダイゼーションにより同定し、さらに制限マ
ッピングと部分的シークエンシング（ＧＯＤ構造遺伝子
のＣ末端領域）により分析した。
ｉｓ）4 は、放射性標識プライマー１０を用いてコロニ
ーハイブリダイゼーションにより同定し、さらに制限マ
ッピングと部分的シークエンシング（ＧＯＤ構造遺伝子
のＣ末端領域）により分析した。
【００５６】実施例２ 欠損Ｎ−グリコシル化を有する酵母宿主株の単離 2.1 〔3Ｈ〕−マンノース自殺突然変異誘発 原理 ： −突然変異誘発（出発菌株：Ｘ２１８０−１Ａ、遺伝子
型：ＳＵＣ２ ｍａｌｍｅｌ ｇａｌ２ ＣＵＰ１；
ＡＴＣＣ２６７８６）； −〔3Ｈ〕−マンノースとのインキュベーション； −細胞の生存率が１０2 −１０3 に低下するまで（２−
４か月）−８０℃で細胞を貯蔵することによる高グリコ
シル化欠損変異株の濃縮。 Ｘ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）のような酵母
株をＹＥＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％酵母エキ
ス、Difco 、および４％グルコース）で培養し、対数増
殖期（約５×１０8 個の細胞）に回収し、０．１ｍｏｌ
／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で洗浄し、１．５ｍｌ
の０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中に再
懸濁した。０．１ｍｌのエチルメタンスルホン酸を添加
して２５℃で１時間、細胞に突然変異を起こさせた。こ
のように処理した細胞０．２ｍｌをチオ硫酸ナトリウム
（５％ｗ／ｖ）１０ｍｌと１０分間インキュベートし、
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で３回洗
浄し、ＹＥＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％酵母エ
キス、Difco 、および４％グルコース）中に再懸濁し
た。
型：ＳＵＣ２ ｍａｌｍｅｌ ｇａｌ２ ＣＵＰ１；
ＡＴＣＣ２６７８６）； −〔3Ｈ〕−マンノースとのインキュベーション； −細胞の生存率が１０2 −１０3 に低下するまで（２−
４か月）−８０℃で細胞を貯蔵することによる高グリコ
シル化欠損変異株の濃縮。 Ｘ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）のような酵母
株をＹＥＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％酵母エキ
ス、Difco 、および４％グルコース）で培養し、対数増
殖期（約５×１０8 個の細胞）に回収し、０．１ｍｏｌ
／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で洗浄し、１．５ｍｌ
の０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中に再
懸濁した。０．１ｍｌのエチルメタンスルホン酸を添加
して２５℃で１時間、細胞に突然変異を起こさせた。こ
のように処理した細胞０．２ｍｌをチオ硫酸ナトリウム
（５％ｗ／ｖ）１０ｍｌと１０分間インキュベートし、
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）で３回洗
浄し、ＹＥＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％酵母エ
キス、Difco 、および４％グルコース）中に再懸濁し
た。
【００５７】細胞は、５７８ｎｍで０．６のＯＤに達す
るまで、振とうしながら２８℃でインキュベートした。
１０6 個の細胞をＹＥＰ培地（２％バクトペプトン、１
％酵母エキス、Difco ）で洗浄し、０．１％のグルコー
スを含む０．１ｍｌのＹＥＰ培地中に再懸濁した。２ｍ
Ｃｉの〔3Ｈ〕−マンノース（比活性１８．５Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）を加え、この培養物を２８℃で６０分間インキ
ュベートした。細胞を遠心し、水で洗い、２５％グリセ
ロールを含むＹＥＰＤ中に再懸濁し、放射能が効力を現
すように−７０℃で貯蔵した。約４５−５０日後、細胞
の生存率が１．５−０．２％に低下したとき、細胞のア
リコートを２％マンノース含有ＹＥＰ寒天プレートにま
き、３０℃でインキュベートした。
るまで、振とうしながら２８℃でインキュベートした。
１０6 個の細胞をＹＥＰ培地（２％バクトペプトン、１
％酵母エキス、Difco ）で洗浄し、０．１％のグルコー
スを含む０．１ｍｌのＹＥＰ培地中に再懸濁した。２ｍ
Ｃｉの〔3Ｈ〕−マンノース（比活性１８．５Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）を加え、この培養物を２８℃で６０分間インキ
ュベートした。細胞を遠心し、水で洗い、２５％グリセ
ロールを含むＹＥＰＤ中に再懸濁し、放射能が効力を現
すように−７０℃で貯蔵した。約４５−５０日後、細胞
の生存率が１．５−０．２％に低下したとき、細胞のア
リコートを２％マンノース含有ＹＥＰ寒天プレートにま
き、３０℃でインキュベートした。
【００５８】2.2 Ｎ−グリコシル化の低下した変異株
の単離 タンパク質グリコシル化の欠損を有する変異株は、初め
に、〔3Ｈ〕−マンノースを取り込まず〔35Ｓ〕−メチ
オニンを取り込む能力について選択した。このために、
細胞をＹＥＰＤ寒天プレートで増殖させ、酵母コロニー
を２枚のロットバンド（Rotband ）フィルター（Schlei
cher & Schull, Dassel,ドイツ）上に移し、再度ＹＥＰ
Ｄプレートで６時間インキュベートした。一方のフィル
ターはその後０．０１ｍＣｉ／ｍｌの〔35Ｓ〕−メチオ
ニンを含むＹＥＰＤの溶液（フィルターを湿らすのに丁
度十分な量）中でインキュベートした。他方のフィルタ
ーは０．２ｍＣｉ／ｍｌの〔3Ｈ〕−マンノースを含む
ＹＥＰを含浸させ、３０分間インキュベートした。５％
トリクロロ酢酸を用いてフィルター上に細胞／コロニー
を固定化し、水とアセトンで洗い、オートラジオグラフ
ィーにより分析した。
の単離 タンパク質グリコシル化の欠損を有する変異株は、初め
に、〔3Ｈ〕−マンノースを取り込まず〔35Ｓ〕−メチ
オニンを取り込む能力について選択した。このために、
細胞をＹＥＰＤ寒天プレートで増殖させ、酵母コロニー
を２枚のロットバンド（Rotband ）フィルター（Schlei
cher & Schull, Dassel,ドイツ）上に移し、再度ＹＥＰ
Ｄプレートで６時間インキュベートした。一方のフィル
ターはその後０．０１ｍＣｉ／ｍｌの〔35Ｓ〕−メチオ
ニンを含むＹＥＰＤの溶液（フィルターを湿らすのに丁
度十分な量）中でインキュベートした。他方のフィルタ
ーは０．２ｍＣｉ／ｍｌの〔3Ｈ〕−マンノースを含む
ＹＥＰを含浸させ、３０分間インキュベートした。５％
トリクロロ酢酸を用いてフィルター上に細胞／コロニー
を固定化し、水とアセトンで洗い、オートラジオグラフ
ィーにより分析した。
【００５９】2.3 エクスターナルインベルターゼの天
然ゲル電気泳動による陽性クローンの特性決定 Ｓ．セレビシエからのＳＵＣ２遺伝子は、２つの異な
る、調節されかつ区画化されたインベルターゼの形態：
i)主にペリプラズムに分泌されるグリコシル化インベル
ターゼ、およびii) 細胞内のやや短い非グリコシル化形
態、をコードしている（Carlson, M. et al., Mol. Cel
l. Biol. 3 (1983) 439-447 ）。インベルターゼは１４
の可能なＮ−グリコシル化部位を含み、分泌形態ではそ
のうちインベルターゼサブユニットあたり平均９−１０
がグリコシル化される。エクスターナル野生型インベル
ターゼは不均質な外鎖グリコシル化のために天然ゲルに
おいて分散バンドとして泳動する。これに対して、細胞
質非グリコシル化形態は活性染色後に鋭いバンドをもた
らす。かくして、Ｎ−グリコシル化の変化は天然ゲルに
おけるエクスターナルインベルターゼの泳動速度とバン
ドの鋭さによって直接分析することができる。酵母株
（Ｘ２１８０−１Ａ野生型株および陽性クローン）を５
ｍｌのＹＥＰＳ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプ
トン、Difco 、および２％スクロース）中で一晩培養
し、細胞を後期対数増殖期に回収し、２０ｍｍｏｌ／ｌ
のアジ化ナトリウムで１回洗い、Whirlmixでホモジナイ
ズしてガラスビーズを用いて溶解した。細胞溶解物の調
製、天然ゲル電気泳動、および基質／グルコース試薬と
してスクロースおよび２，３，４−トリニトロフェニル
テトラゾリウムクロリドを用いたインベルターゼの活性
染色は、Ballou C.E. の方法（Methods Enzymol. 185(1
990) 440-470 ）に従って行った。
然ゲル電気泳動による陽性クローンの特性決定 Ｓ．セレビシエからのＳＵＣ２遺伝子は、２つの異な
る、調節されかつ区画化されたインベルターゼの形態：
i)主にペリプラズムに分泌されるグリコシル化インベル
ターゼ、およびii) 細胞内のやや短い非グリコシル化形
態、をコードしている（Carlson, M. et al., Mol. Cel
l. Biol. 3 (1983) 439-447 ）。インベルターゼは１４
の可能なＮ−グリコシル化部位を含み、分泌形態ではそ
のうちインベルターゼサブユニットあたり平均９−１０
がグリコシル化される。エクスターナル野生型インベル
ターゼは不均質な外鎖グリコシル化のために天然ゲルに
おいて分散バンドとして泳動する。これに対して、細胞
質非グリコシル化形態は活性染色後に鋭いバンドをもた
らす。かくして、Ｎ−グリコシル化の変化は天然ゲルに
おけるエクスターナルインベルターゼの泳動速度とバン
ドの鋭さによって直接分析することができる。酵母株
（Ｘ２１８０−１Ａ野生型株および陽性クローン）を５
ｍｌのＹＥＰＳ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプ
トン、Difco 、および２％スクロース）中で一晩培養
し、細胞を後期対数増殖期に回収し、２０ｍｍｏｌ／ｌ
のアジ化ナトリウムで１回洗い、Whirlmixでホモジナイ
ズしてガラスビーズを用いて溶解した。細胞溶解物の調
製、天然ゲル電気泳動、および基質／グルコース試薬と
してスクロースおよび２，３，４−トリニトロフェニル
テトラゾリウムクロリドを用いたインベルターゼの活性
染色は、Ballou C.E. の方法（Methods Enzymol. 185(1
990) 440-470 ）に従って行った。
【００６０】陽性クローンはインベルターゼの活性染色
に基づいて４つのクラスに分割しうる： １．野生型インベルターゼの移動度をもつ変異株； ２．非グリコシル化インベルターゼもグリコシル化イン
ベルターゼも合成しない変異株； ３．外鎖グリコシル化の欠損を有する変異株（３−４本
のバンドの別個のオリゴマーバンドパターン）； ４．インベルターゼの実質的グリコシル化欠損をもたら
す変異株（野生型インベルターゼよりも速い移動度）。結果 クラス４の変異株は、以下においてｎｇｄ２９（ＤＳＭ
７０４２／７３３８）およびｎｇｄ６２（ＤＳＭ７１６
０／７３４０）と称されるが（ｎｇｄは“Ｎ−グリコシ
ル化欠損”を意味する）、出発菌株Ｘ２１８０−１Ａと
比べて均質にグリコシル化された２量体エクスターナル
インベルターゼを合成した（活性染色後の天然ゲルにお
ける鋭いバンドと移動度の増加）。ｎｇｄ変異株は浸透
的に安定しており、３０℃で培養することができ、培養
期間中凝集しなかった。
に基づいて４つのクラスに分割しうる： １．野生型インベルターゼの移動度をもつ変異株； ２．非グリコシル化インベルターゼもグリコシル化イン
ベルターゼも合成しない変異株； ３．外鎖グリコシル化の欠損を有する変異株（３−４本
のバンドの別個のオリゴマーバンドパターン）； ４．インベルターゼの実質的グリコシル化欠損をもたら
す変異株（野生型インベルターゼよりも速い移動度）。結果 クラス４の変異株は、以下においてｎｇｄ２９（ＤＳＭ
７０４２／７３３８）およびｎｇｄ６２（ＤＳＭ７１６
０／７３４０）と称されるが（ｎｇｄは“Ｎ−グリコシ
ル化欠損”を意味する）、出発菌株Ｘ２１８０−１Ａと
比べて均質にグリコシル化された２量体エクスターナル
インベルターゼを合成した（活性染色後の天然ゲルにお
ける鋭いバンドと移動度の増加）。ｎｇｄ変異株は浸透
的に安定しており、３０℃で培養することができ、培養
期間中凝集しなかった。
【００６１】実施例３ 同種および異種タンパク質発現用のグリコシル化欠損酵
母宿主株の構築 形質転換によって補足し得る１つまたは複数の栄養要求
性を導入するために、F. Shermanらの方法（Methods in
Yeast Genetics: A Laboratory Manual, ColdSpring H
arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1
981) ）に従ってｎｇｄ変異株を適当な実験室株と接合
させ、二倍体株をマイクロマニプュレーションにより単
離した。続いて二倍体株に胞子を形成させ、適当な栄養
要求性（例えば、ｕｒａ３、ｌｅｕ２）とｎｇｄ変異を
有する分離株（segregant ）を単離した。このために、
ｎｇｄ２９変異株をＤＢＹ７４６株（ＭＡＴα ｕｒａ
３−５２ｌｅｕ２−３，−１１２ ｔｒｐ１−２８９ａ
ｈｉｓ３−Δ１；〔ＤＳＭ４３１６〕、ＡＴＣＣ４４
７３３に対応する）と共に、そしてｎｇｄ６２変異株を
ＪＭ１９３５株（ＭＡＴα ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｈｉ
ｓ４，ＤＳＭ７１５６）と共にＹＥＰＤ（１％酵母エキ
ス、２％バクトペプトン、Difco 、および２％グルコー
ス）中で３０℃、６時間インキュベートした。続いて、
接合体をマイクロマニプュレーター（ドイツ、Reutling
en、Bachhofer 社からの de Fonbruneに一致するモデ
ル）を使って単離し、５ｍｌのＹＥＰＤ中で一晩増殖さ
せた。細胞を短時間に遠心し、培地を約０．２ｍｌにデ
カントし、細胞ペレットを残留培地に再懸濁した。細胞
懸濁液を酢酸カリウムプレート（１％酢酸カリウム、
１．５％寒天）にまいた。約５日後、このようにして得
られた子嚢を接種ループを使って滅菌水０．５ｍｌに再
懸濁し、１０μｌのβ−グルクロニダーゼ／アリールス
ルファターゼ混合物（Boehringer Mannheim ）を加え、
室温で１０分間インキュベートした。その後水１０ｍｌ
を加え、子嚢懸濁液を遠心し、上清をデカントした。い
くつかの子嚢の胞子をマイクロマニプュレーターを使っ
て単離し、ＹＥＰＤプレート（１．５％寒天を含むＹＥ
ＰＤ）上で３０℃、３日間インキュベートした。発芽し
た胞子からレプリカプレートを作製し、コロニーを合成
最少培地（０．６７％アミノ酸不含の酵母窒素塩基，Di
fco ；２％グルコース；１．５％寒天および添加物：２
０ｍｇ／ｌ Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｍｅｔ；３０ｍ
ｇ／ｌＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ；５０ｍｇ／ｌ Ｐｈ
ｅ；１００ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，Ａｓｐ；４００ｍｇ／ｌ
Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ並びに２０ｍｇ／ｌアデニン
およびウラシル；これらの添加物の１つがそれぞれの最
少培地において除かれた）に抑えつけ、３０℃で３日間
インキュベートした。ウラシルとロイシンに対する栄養
要求性を有しかつｎｇｄ２９表現型を示す分離体を実施
例2.2 に記載するように分析し、単離した。ｎｇｄ２９
表現型（およびｎｇｄ６２表現型）は試験した全ての四
分子において２：２に分離し、このことは単一の核遺伝
子座の単一の変異を示すものである。
母宿主株の構築 形質転換によって補足し得る１つまたは複数の栄養要求
性を導入するために、F. Shermanらの方法（Methods in
Yeast Genetics: A Laboratory Manual, ColdSpring H
arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1
981) ）に従ってｎｇｄ変異株を適当な実験室株と接合
させ、二倍体株をマイクロマニプュレーションにより単
離した。続いて二倍体株に胞子を形成させ、適当な栄養
要求性（例えば、ｕｒａ３、ｌｅｕ２）とｎｇｄ変異を
有する分離株（segregant ）を単離した。このために、
ｎｇｄ２９変異株をＤＢＹ７４６株（ＭＡＴα ｕｒａ
３−５２ｌｅｕ２−３，−１１２ ｔｒｐ１−２８９ａ
ｈｉｓ３−Δ１；〔ＤＳＭ４３１６〕、ＡＴＣＣ４４
７３３に対応する）と共に、そしてｎｇｄ６２変異株を
ＪＭ１９３５株（ＭＡＴα ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｈｉ
ｓ４，ＤＳＭ７１５６）と共にＹＥＰＤ（１％酵母エキ
ス、２％バクトペプトン、Difco 、および２％グルコー
ス）中で３０℃、６時間インキュベートした。続いて、
接合体をマイクロマニプュレーター（ドイツ、Reutling
en、Bachhofer 社からの de Fonbruneに一致するモデ
ル）を使って単離し、５ｍｌのＹＥＰＤ中で一晩増殖さ
せた。細胞を短時間に遠心し、培地を約０．２ｍｌにデ
カントし、細胞ペレットを残留培地に再懸濁した。細胞
懸濁液を酢酸カリウムプレート（１％酢酸カリウム、
１．５％寒天）にまいた。約５日後、このようにして得
られた子嚢を接種ループを使って滅菌水０．５ｍｌに再
懸濁し、１０μｌのβ−グルクロニダーゼ／アリールス
ルファターゼ混合物（Boehringer Mannheim ）を加え、
室温で１０分間インキュベートした。その後水１０ｍｌ
を加え、子嚢懸濁液を遠心し、上清をデカントした。い
くつかの子嚢の胞子をマイクロマニプュレーターを使っ
て単離し、ＹＥＰＤプレート（１．５％寒天を含むＹＥ
ＰＤ）上で３０℃、３日間インキュベートした。発芽し
た胞子からレプリカプレートを作製し、コロニーを合成
最少培地（０．６７％アミノ酸不含の酵母窒素塩基，Di
fco ；２％グルコース；１．５％寒天および添加物：２
０ｍｇ／ｌ Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｍｅｔ；３０ｍ
ｇ／ｌＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ；５０ｍｇ／ｌ Ｐｈ
ｅ；１００ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，Ａｓｐ；４００ｍｇ／ｌ
Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ並びに２０ｍｇ／ｌアデニン
およびウラシル；これらの添加物の１つがそれぞれの最
少培地において除かれた）に抑えつけ、３０℃で３日間
インキュベートした。ウラシルとロイシンに対する栄養
要求性を有しかつｎｇｄ２９表現型を示す分離体を実施
例2.2 に記載するように分析し、単離した。ｎｇｄ２９
表現型（およびｎｇｄ６２表現型）は試験した全ての四
分子において２：２に分離し、このことは単一の核遺伝
子座の単一の変異を示すものである。
【００６２】ここに記載した接合ＤＢＹ７４６×ｎｇｄ
２９から、菌株ＢＭＹ３−９ＡおよびＮ−ＢＭＹ３−９
Ａ（ＭＡＴα ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２
ｈｉｓ３−１ ｎｇｄ２９；ＤＳＭ７０４２およびＤ
ＳＭ７３３８）並びにＢＭＹ３−９ＣおよびＮ−ＢＭＹ
３−９Ｃ（ＭＡＴα ｌｅｕ２−３，１１２，ｕｒａ３
−５２ ｎｇｄ２９；ＤＳＭ７１９３およびＤＳＭ７３
４１）が得られた。接合ＪＭ１９３５×ｎｇｄ６２から
同様にして、菌株ＢＭＹ１２−２０ＤおよびＮ−ＢＭＹ
１２−２０Ｄ（ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｕｒａ３ ｈｉｓ
４ ｎｇｄ６２；ＤＳＭ７１６０およびＤＳＭ７３４
０）が得られた。
２９から、菌株ＢＭＹ３−９ＡおよびＮ−ＢＭＹ３−９
Ａ（ＭＡＴα ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２
ｈｉｓ３−１ ｎｇｄ２９；ＤＳＭ７０４２およびＤ
ＳＭ７３３８）並びにＢＭＹ３−９ＣおよびＮ−ＢＭＹ
３−９Ｃ（ＭＡＴα ｌｅｕ２−３，１１２，ｕｒａ３
−５２ ｎｇｄ２９；ＤＳＭ７１９３およびＤＳＭ７３
４１）が得られた。接合ＪＭ１９３５×ｎｇｄ６２から
同様にして、菌株ＢＭＹ１２−２０ＤおよびＮ−ＢＭＹ
１２−２０Ｄ（ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｕｒａ３ ｈｉｓ
４ ｎｇｄ６２；ＤＳＭ７１６０およびＤＳＭ７３４
０）が得られた。
【００６３】実施例４ 野生型およびグリコシル化欠損酵母宿主株における天然
Ａ．ニガーＧＯＤとＧＯＤ（Ｈｉｓ）4 変異体の発現／
分泌の比較 Ａ．ニガーからのＧＯＤは天然に分泌されるグリコシル
化２量体酵素である。各サブユニットには８つの可能な
Ｎ−グリコシル化部位（セクオン）と３個のシステイン
残基（そのうちの２個はジスルフィド橋を形成する）が
存在する。Ｓ．セレビシエの野生型株では、発現された
ＧＯＤが培地に分泌され、均質でない外鎖グリコシル化
（高グリコシル化）のために分子量に関して非常に不均
質である（Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 2
65 (1990) 3793-3802; De Baetselier, A. et al., Bio
technology 9 (1991) 559-536 ）。プロセシングされた
（２２アミノ酸長のシグナル配列の切断）Ａ．ニガーＧ
ＯＤタンパク質は６３２７３Ｄａの分子量をもち得る５
８３個のアミノ酸から構成されている（Frederick,K.R.
et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 3793-3802 ）。
プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤ（実施例1.5 ）およびＹＥ
ｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 （実施例1.6 ）を野生型株
ＪＭ１９３５（ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｕｒａ３ｈｉｓ４
ＭＡＬ４）（ＤＳＭ７１５６）、ＢＭＹ３−９Ａ（Ｄ
ＳＭ７０４２）およびＮ−ＢＭＹ３−９Ａ（ＤＳＭ７３
３８）（実施例３参照）に形質転換し、１．５％アガロ
ース、０．６７％ＹＮＢ（酵母窒素塩基、塩ビタミン混
合物、Difco ）、０．５％ＣＡＡ（カザミノ酸、タンパ
ク質加水分解物、Difco ）、および炭素源としての２％
フルクトースを含む最少培地寒天プレート（ウラシル選
択）で形質転換細胞を選択した。
Ａ．ニガーＧＯＤとＧＯＤ（Ｈｉｓ）4 変異体の発現／
分泌の比較 Ａ．ニガーからのＧＯＤは天然に分泌されるグリコシル
化２量体酵素である。各サブユニットには８つの可能な
Ｎ−グリコシル化部位（セクオン）と３個のシステイン
残基（そのうちの２個はジスルフィド橋を形成する）が
存在する。Ｓ．セレビシエの野生型株では、発現された
ＧＯＤが培地に分泌され、均質でない外鎖グリコシル化
（高グリコシル化）のために分子量に関して非常に不均
質である（Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 2
65 (1990) 3793-3802; De Baetselier, A. et al., Bio
technology 9 (1991) 559-536 ）。プロセシングされた
（２２アミノ酸長のシグナル配列の切断）Ａ．ニガーＧ
ＯＤタンパク質は６３２７３Ｄａの分子量をもち得る５
８３個のアミノ酸から構成されている（Frederick,K.R.
et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 3793-3802 ）。
プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤ（実施例1.5 ）およびＹＥ
ｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 （実施例1.6 ）を野生型株
ＪＭ１９３５（ＭＡＴα ｌｅｕ２ ｕｒａ３ｈｉｓ４
ＭＡＬ４）（ＤＳＭ７１５６）、ＢＭＹ３−９Ａ（Ｄ
ＳＭ７０４２）およびＮ−ＢＭＹ３−９Ａ（ＤＳＭ７３
３８）（実施例３参照）に形質転換し、１．５％アガロ
ース、０．６７％ＹＮＢ（酵母窒素塩基、塩ビタミン混
合物、Difco ）、０．５％ＣＡＡ（カザミノ酸、タンパ
ク質加水分解物、Difco ）、および炭素源としての２％
フルクトースを含む最少培地寒天プレート（ウラシル選
択）で形質転換細胞を選択した。
【００６４】4.1 ＧＯＤ形質転換細胞の培養 プラスミドのコピー数を増幅するために（プラスミドコ
ード化ＬＥＵ２ｄ対立遺伝子を選択；Beggs, J.D., Nat
ure 275 (1978) 104-109; Erhart, E. and Hollenberg,
C.P.J., Bacteriol. 156 (1983) 625-635）、形質転換
細胞はロイシンを含まない最少培地プレート（１．５％
アガロース、０．６７％ＹＮＢ、Difco、６０ｍｇ／ｌ
アデニンおよび２％フルクトース）で画線培養した。前
培養は振とうフラスコに入れた０．６７％ＹＮＢと４％
フルクトースを含むロイシン選択培地で３０℃、４８時
間行い、発現培養物に接種するために使用した（接種
物：１−２％）。主培養（１リットルの振とう培養）は
２％酵母エキス、４％バクトペプトン、Difco 、０．１
ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、１％フルクトー
スおよび６％マルトースを含む完全培地中で振とうしな
がら３０℃で３−４日間インキュベートした。４８およ
び７２時間後に試料を採取し、細胞増殖を測定し（６０
０ｎｍでの光学密度の測定、ＯＤ600 ）、そして培地に
分泌されたＧＯＤ活性と細胞に残留するＧＯＤ活性を細
胞溶解後の粗抽出物において測定した。
ード化ＬＥＵ２ｄ対立遺伝子を選択；Beggs, J.D., Nat
ure 275 (1978) 104-109; Erhart, E. and Hollenberg,
C.P.J., Bacteriol. 156 (1983) 625-635）、形質転換
細胞はロイシンを含まない最少培地プレート（１．５％
アガロース、０．６７％ＹＮＢ、Difco、６０ｍｇ／ｌ
アデニンおよび２％フルクトース）で画線培養した。前
培養は振とうフラスコに入れた０．６７％ＹＮＢと４％
フルクトースを含むロイシン選択培地で３０℃、４８時
間行い、発現培養物に接種するために使用した（接種
物：１−２％）。主培養（１リットルの振とう培養）は
２％酵母エキス、４％バクトペプトン、Difco 、０．１
ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、１％フルクトー
スおよび６％マルトースを含む完全培地中で振とうしな
がら３０℃で３−４日間インキュベートした。４８およ
び７２時間後に試料を採取し、細胞増殖を測定し（６０
０ｎｍでの光学密度の測定、ＯＤ600 ）、そして培地に
分泌されたＧＯＤ活性と細胞に残留するＧＯＤ活性を細
胞溶解後の粗抽出物において測定した。
【００６５】野生型株ＤＳＭ７１５６およびグリコシル
化欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／７３３８（ｎｇｄ２９）
におけるＧＯＤの発現／分泌分析 プラスミド：ＹＥｐＬ／ＧＯＤ
化欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／７３３８（ｎｇｄ２９）
におけるＧＯＤの発現／分泌分析 プラスミド：ＹＥｐＬ／ＧＯＤ
【００６６】
【表２】
【００６７】プラスミド：ＹＥｐＬ／ＧＯＤ
【００６８】
【表３】
【００６９】野生型株ＤＳＭ７１５６およびグリコシル
化欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／７３３８（ｎｇｄ２９）
におけるＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 の発現／分泌分析 プラスミド：ＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4
化欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／７３３８（ｎｇｄ２９）
におけるＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 の発現／分泌分析 プラスミド：ＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4
【００７０】
【表４】
【００７１】 プラスミド：ＹＥｐＬ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4
【００７２】
【表５】
【００７３】結果 発現および分泌に関して、ＧＯＤとＧＯＤ−（Ｈｉｓ）
4 変異体との間には有意差が存在しなかった。
4 変異体との間には有意差が存在しなかった。
【００７４】4.2 分泌されたＧＯＤのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ グリコシル化欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／７３３８（ｎ
ｇｄ２９）およびＤＳＭ７１６０／７３４０（ｎｇｄ６
２）から発現された（培地に分泌された）ＧＯＤ−（Ｈ
ｉｓ）4 酵素と、野生型株ＤＳＭ７１５６から発現され
た（分泌された）酵素と、Ａ．ニガーからの精製ＧＯＤ
（Boehringer Mannheim, GFR）はＳＤＳ−ＰＡＧＥとそ
の後のタンパク質染色によってさらに特性決定された。
ＧＯＤを含む野生型株からの培地上清を電気泳動前にＴ
ＣＡ沈殿により１０倍に濃縮した。炭水化物を含まない
ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 酵素はＮ−グリコシダーゼＦを使
って酵素的に調製し、サイズ標準として使用した。Ｎ−グリコシダーゼＦによる酵素的脱グリコシル化 Haselbeck, A. and Hosel, W. (Topics in Biochemistr
y 8 (1988) 1-4）の方法に従って脱グリコシル化を行っ
た。ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 を含む培地上清０．１ｍｌを
トリクロロ酢酸（最終濃度：１０％）で沈殿させ、沈殿
したタンパク質を遠心し、タンパク質ペレットを７０％
エタノールで洗い、真空下で乾燥し、１％ＳＤＳを含む
２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
１０μｌにとり、９５℃で３分間加熱した。室温へ冷却
後、試料を２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）、オクチルグルコシド（最終濃度：０．５
％）および５単位のＮ−グリコシダーゼＦにより０．１
ｍｌに希釈し、３７℃で１−１２時間インキュベート
し、続いて２５μｌの５×ＳＤＳ緩衝液（上記参照）を
加えた。結果 グリコシル化欠損ｎｇｄ変異株から発現されたＧＯＤ酵
素（ＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 ）は、タンパク
質染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約８０ｋＤａの分
子量を有する主要な均質バンドとして可視化される。こ
の実験はＧＯＤ酵素における外鎖グリコシル化の非存在
を示し、均質なコア様グリコシル化を表している。グリ
コシル化に関して、ｎｇｄ変異株はｍｎｎ９様表現型を
有する。対照的に、野生型株から発現されたＧＯＤ酵素
は、およそ８０−２００ｋＤａの分子量範囲に及ぶ非常
に分散したバンドとして認められる。
Ｅ グリコシル化欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／７３３８（ｎ
ｇｄ２９）およびＤＳＭ７１６０／７３４０（ｎｇｄ６
２）から発現された（培地に分泌された）ＧＯＤ−（Ｈ
ｉｓ）4 酵素と、野生型株ＤＳＭ７１５６から発現され
た（分泌された）酵素と、Ａ．ニガーからの精製ＧＯＤ
（Boehringer Mannheim, GFR）はＳＤＳ−ＰＡＧＥとそ
の後のタンパク質染色によってさらに特性決定された。
ＧＯＤを含む野生型株からの培地上清を電気泳動前にＴ
ＣＡ沈殿により１０倍に濃縮した。炭水化物を含まない
ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 酵素はＮ−グリコシダーゼＦを使
って酵素的に調製し、サイズ標準として使用した。Ｎ−グリコシダーゼＦによる酵素的脱グリコシル化 Haselbeck, A. and Hosel, W. (Topics in Biochemistr
y 8 (1988) 1-4）の方法に従って脱グリコシル化を行っ
た。ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 を含む培地上清０．１ｍｌを
トリクロロ酢酸（最終濃度：１０％）で沈殿させ、沈殿
したタンパク質を遠心し、タンパク質ペレットを７０％
エタノールで洗い、真空下で乾燥し、１％ＳＤＳを含む
２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
１０μｌにとり、９５℃で３分間加熱した。室温へ冷却
後、試料を２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）、オクチルグルコシド（最終濃度：０．５
％）および５単位のＮ−グリコシダーゼＦにより０．１
ｍｌに希釈し、３７℃で１−１２時間インキュベート
し、続いて２５μｌの５×ＳＤＳ緩衝液（上記参照）を
加えた。結果 グリコシル化欠損ｎｇｄ変異株から発現されたＧＯＤ酵
素（ＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 ）は、タンパク
質染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約８０ｋＤａの分
子量を有する主要な均質バンドとして可視化される。こ
の実験はＧＯＤ酵素における外鎖グリコシル化の非存在
を示し、均質なコア様グリコシル化を表している。グリ
コシル化に関して、ｎｇｄ変異株はｍｎｎ９様表現型を
有する。対照的に、野生型株から発現されたＧＯＤ酵素
は、およそ８０−２００ｋＤａの分子量範囲に及ぶ非常
に分散したバンドとして認められる。
【００７５】実施例５ オルトバナジウム酸塩またはヒグロマイシンＢを含むＹ
ＥＰＤ寒天プレートでの増殖に基づいたグリコシル化欠
損ｎｇｄ変異株の特性決定 ｍｎｎ８、ｍｎｎ９およびｍｎｎ１０のようなグリコシ
ル化欠損変異株は、オルトバナジウム酸塩に対し増大し
た耐性を、そして抗生物質ヒグロマイシンＢに対し増大
した感受性を示す。耐性／感受性の表現型はＮ−グリコ
シル化欠損変異株の区別／分類を可能にする（Ballou,
L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88(1991) 3209-32
12 ）。試験すべき菌株をＹＥＰＤ培地で一晩培養し
（５ｍｌの回転培養）、菌株／培養物をＹＥＰＤ培地で
正確に０．０５の光学密度（ＯＤ600 ）に調整した。そ
の後各細胞懸濁液２０μｌを、２−１５ｍｍｏｌ／ｌの
オルトバナジウム酸ナトリウムまたは１０−２００μｇ
／ｍｌのヒグロマイシンＢを含むＹＥＰＤ寒天プレート
に点在させた。３０℃で２日間のインキュベーション後
に細胞の増殖を調べた（表参照）。
ＥＰＤ寒天プレートでの増殖に基づいたグリコシル化欠
損ｎｇｄ変異株の特性決定 ｍｎｎ８、ｍｎｎ９およびｍｎｎ１０のようなグリコシ
ル化欠損変異株は、オルトバナジウム酸塩に対し増大し
た耐性を、そして抗生物質ヒグロマイシンＢに対し増大
した感受性を示す。耐性／感受性の表現型はＮ−グリコ
シル化欠損変異株の区別／分類を可能にする（Ballou,
L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88(1991) 3209-32
12 ）。試験すべき菌株をＹＥＰＤ培地で一晩培養し
（５ｍｌの回転培養）、菌株／培養物をＹＥＰＤ培地で
正確に０．０５の光学密度（ＯＤ600 ）に調整した。そ
の後各細胞懸濁液２０μｌを、２−１５ｍｍｏｌ／ｌの
オルトバナジウム酸ナトリウムまたは１０−２００μｇ
／ｍｌのヒグロマイシンＢを含むＹＥＰＤ寒天プレート
に点在させた。３０℃で２日間のインキュベーション後
に細胞の増殖を調べた（表参照）。
【００７６】オルトバナジウム酸ナトリウムまたはヒグ
ロマイシンＢを含むＹＥＰＤ寒天プレート上の酵母細胞
の増殖表現型
ロマイシンＢを含むＹＥＰＤ寒天プレート上の酵母細胞
の増殖表現型
【００７７】
【表６】
【００７８】 1) J. Biol. Chem. 259 (1984) 3805-3811 ＋ 増殖する ± 非常に遅く増殖する − 増殖しない結果 ｍｎｎ９変異株および野生型株の耐性パターンとは相違
する耐性パターンに関して、ｎｇｄ変異株間には差異が
存在する。
する耐性パターンに関して、ｎｇｄ変異株間には差異が
存在する。
【００７９】実施例６ ｎｇｄ変異株の特性決定／同定（対立性検定） 対立性（allelism）検定は遺伝子および遺伝子欠損（突
然変異）を同定する（区別する）のに役立つ。この手法
により、２つの変異株がアレリックである（同一遺伝子
に変異を有する）か否かを分析することが可能である。
ｎｇｄ変異株は互いに、そしてｍｎｎ９変異株に対する
対立性を調べた。対立性検定は遺伝的標準手法を用いて
行った（Sherman, F.; Fink, G.R.; Hicks, J.B., Meth
ods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual. Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y
ork, (1981); Guthrie, C. and Fink, G.R. (eds.), Gu
ide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Metho
dsEnzymol. 194 (1991)を参照されたい）。
然変異）を同定する（区別する）のに役立つ。この手法
により、２つの変異株がアレリックである（同一遺伝子
に変異を有する）か否かを分析することが可能である。
ｎｇｄ変異株は互いに、そしてｍｎｎ９変異株に対する
対立性を調べた。対立性検定は遺伝的標準手法を用いて
行った（Sherman, F.; Fink, G.R.; Hicks, J.B., Meth
ods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual. Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y
ork, (1981); Guthrie, C. and Fink, G.R. (eds.), Gu
ide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Metho
dsEnzymol. 194 (1991)を参照されたい）。
【００８０】原理：互いに補い合う栄養要求性を有す
る、異なる接合型の分析すべき２つの半数体変異株を接
合させ、最少培地プレートで二倍体株を選択する。単離
した株の二倍性は、Huxley, C.らの方法（Trends Gene
t. 6 (1990) 236）に従ってＰＣＲ分析を用いてａおよ
びα接合型に特異的なＤＮＡ配列の存在により確かめ
る。変異が二倍体細胞において相補性でないとき、２つ
の変異株はアレリックで（対立性があり）、つまり同一
遺伝子に変異を有する。変異が二倍体細胞において相補
性でありかつ野生型の表現型を生じるとき、２つの変異
株はアレリックでなく（対立性がなく）、つまり２つの
異なる遺伝子に変異を有する。使用した菌株 ：
る、異なる接合型の分析すべき２つの半数体変異株を接
合させ、最少培地プレートで二倍体株を選択する。単離
した株の二倍性は、Huxley, C.らの方法（Trends Gene
t. 6 (1990) 236）に従ってＰＣＲ分析を用いてａおよ
びα接合型に特異的なＤＮＡ配列の存在により確かめ
る。変異が二倍体細胞において相補性でないとき、２つ
の変異株はアレリックで（対立性があり）、つまり同一
遺伝子に変異を有する。変異が二倍体細胞において相補
性でありかつ野生型の表現型を生じるとき、２つの変異
株はアレリックでなく（対立性がなく）、つまり２つの
異なる遺伝子に変異を有する。使用した菌株 ：
【００８１】
【表７】
【００８２】ＳＣ＝合成完全培地（０．６７％アミノ酸
不含酵母窒素塩基、Difco ；２％グルコース；１．５％
寒天および添加物：２０ｍｇ／ｌ Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ａ
ｒｇ，Ｍｅｔ；３０ｍｇ／ｌ Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙ
ｓ；５０ｍｇ／ｌ Ｐｈｅ；１００ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，
Ａｓｐ；４００ｍｇ／ｌ Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ並び
に２０ｍｇ／ｌアデニンおよびウラシル；アミノ酸Ｕｒ
ａ、ＨｉｓおよびＴｒｐが「二倍体の選択」の欄に表示
したように個々の最少培地において除かれた）。結果 ：変異株ｎｇｄ２９およびｎｇｄ６２は互いに異な
り、かつｍｎｎ９と相違している（非アレリック）。
不含酵母窒素塩基、Difco ；２％グルコース；１．５％
寒天および添加物：２０ｍｇ／ｌ Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ａ
ｒｇ，Ｍｅｔ；３０ｍｇ／ｌ Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙ
ｓ；５０ｍｇ／ｌ Ｐｈｅ；１００ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，
Ａｓｐ；４００ｍｇ／ｌ Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ並び
に２０ｍｇ／ｌアデニンおよびウラシル；アミノ酸Ｕｒ
ａ、ＨｉｓおよびＴｒｐが「二倍体の選択」の欄に表示
したように個々の最少培地において除かれた）。結果 ：変異株ｎｇｄ２９およびｎｇｄ６２は互いに異な
り、かつｍｎｎ９と相違している（非アレリック）。
【００８３】実施例７ 野生型および高グリコシル化欠損酵母株からのＧＯＤお
よびＧＯＤ−（Ｈｉｓ） 4 の単離 7.1 金属キレートクロマトグラフィーによるＧＯＤ−
（Ｈｉｓ）4 の単離 ＧＯＤ変異体のＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 は、ＢＭＹ３−９
Ａ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 細胞およびＢＭＹ１２−２０
Ｄ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 細胞（高グリコシル化欠損宿
主株）の培養濾液からこの単離法を使って単離した。培
養濾液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に滴定し、１０
ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡
化したＮＴＡカラム（カラム容量２５ｍｌ；Diagen社
（Dusseldorf）からのＮＴＡゲル；Hochuli, E. et a
l., J. Chromatography 411 (1987) 177-184；Hochuli,
E. et al., Biotechnology 6 (1988) 1321-1325）にか
けた。このカラムを５−１０倍カラム容量の１０ｍｍｏ
ｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５中の１ｍｏｌ
／ｌ塩化ナトリウムで洗浄し、さらに５−１０倍カラム
容量の１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．５で再度洗浄した。その後、ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4
酵素を平衡化緩衝液、ｐＨ７．５中の０．１ｍｏｌ／ｌ
イミダゾールで溶離し、ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 含有画分
（黄色）を１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．５に対して透析した。
よびＧＯＤ−（Ｈｉｓ） 4 の単離 7.1 金属キレートクロマトグラフィーによるＧＯＤ−
（Ｈｉｓ）4 の単離 ＧＯＤ変異体のＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 は、ＢＭＹ３−９
Ａ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 細胞およびＢＭＹ１２−２０
Ｄ／ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 細胞（高グリコシル化欠損宿
主株）の培養濾液からこの単離法を使って単離した。培
養濾液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に滴定し、１０
ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡
化したＮＴＡカラム（カラム容量２５ｍｌ；Diagen社
（Dusseldorf）からのＮＴＡゲル；Hochuli, E. et a
l., J. Chromatography 411 (1987) 177-184；Hochuli,
E. et al., Biotechnology 6 (1988) 1321-1325）にか
けた。このカラムを５−１０倍カラム容量の１０ｍｍｏ
ｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５中の１ｍｏｌ
／ｌ塩化ナトリウムで洗浄し、さらに５−１０倍カラム
容量の１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．５で再度洗浄した。その後、ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4
酵素を平衡化緩衝液、ｐＨ７．５中の０．１ｍｏｌ／ｌ
イミダゾールで溶離し、ＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 含有画分
（黄色）を１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７．５に対して透析した。
【００８４】7.2 予め濃縮および透析を行った後のＱ
−セファロースｆｆでのイオン交換クロマトグラフィー
によるＧＯＤおよびＧＯＤ変異体の単離 天然ＧＯＤおよび高グリコシル化ＧＯＤはこの方法に従
って精製した。固体の硫酸アンモニウム３３ｇ（硫酸ア
ンモニウムの飽和濃度５５％）を滅菌濾過した培養濾液
１００ｍｌにゆっくり攪拌しながら加え、室温で１−２
時間インキュベーション後に沈殿したタンパク質を遠心
し、２５ｍｌの２５ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ７．５に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透
析した（４×１０リットル、２４時間、４℃）。続い
て、透析物を２５ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、
ｐＨ７．５で平衡化したＱ−セファロースｆｆカラム
（カラム容量１２ｍｌ）に加え、５−１０倍カラム容量
の平衡緩衝液で再度洗浄した。結合したＧＯＤ酵素を平
衡化緩衝液（約１０倍カラム容量）中の０−１ｍｏｌ／
ｌ塩化カリウムの勾配で溶離し、ＧＯＤ含有画分（黄
色）をプールした。
−セファロースｆｆでのイオン交換クロマトグラフィー
によるＧＯＤおよびＧＯＤ変異体の単離 天然ＧＯＤおよび高グリコシル化ＧＯＤはこの方法に従
って精製した。固体の硫酸アンモニウム３３ｇ（硫酸ア
ンモニウムの飽和濃度５５％）を滅菌濾過した培養濾液
１００ｍｌにゆっくり攪拌しながら加え、室温で１−２
時間インキュベーション後に沈殿したタンパク質を遠心
し、２５ｍｌの２５ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ７．５に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透
析した（４×１０リットル、２４時間、４℃）。続い
て、透析物を２５ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、
ｐＨ７．５で平衡化したＱ−セファロースｆｆカラム
（カラム容量１２ｍｌ）に加え、５−１０倍カラム容量
の平衡緩衝液で再度洗浄した。結合したＧＯＤ酵素を平
衡化緩衝液（約１０倍カラム容量）中の０−１ｍｏｌ／
ｌ塩化カリウムの勾配で溶離し、ＧＯＤ含有画分（黄
色）をプールした。
【００８５】実施例８ 単離したＧＯＤ酵素の生化学的特性決定 8.1 比ＧＯＤ活性の測定 ＧＯＤ活性の測定は「一般方法」の項で記載したように
行った。Ａ．ニガー、Ｓ．セレビシエ（野生型）およびＳ．セレ
ビシエ（高グリコシル化欠損変異株）において発現され
たＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 の比活性
行った。Ａ．ニガー、Ｓ．セレビシエ（野生型）およびＳ．セレ
ビシエ（高グリコシル化欠損変異株）において発現され
たＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 の比活性
【００８６】
【表８】
【００８７】Ａ．ニガー： Ａ．ニガー由来のＧＯＤ、
純度II（Boehringer Mannheim ） ＷＴ ： Ｓ．セレビシエ野生型 ｎｇｄ２９： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ２９変異株 ｎｇｄ６２： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ６２変異株
純度II（Boehringer Mannheim ） ＷＴ ： Ｓ．セレビシエ野生型 ｎｇｄ２９： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ２９変異株 ｎｇｄ６２： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ６２変異株
【００８８】8.2 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量の測定 精製したＧＯＤ酵素を１／５倍容量の５×ＳＤＳ試料緩
衝液（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％メルカプトエ
タノール、１０％グリセロール、０．００１％ブロモフ
ェノールブルー）と混合し、９５℃で５分間インキュベ
ートした。その後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分離し（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-68
5）、クーマシーブリリアントブルー染料で染色した。Ａ．ニガー、Ｓ．セレビシエ（野生型）およびＳ．セレ
ビシエ（高グリコシル化欠損変異株）において発現され
たＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後の分子量／サブユニット
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量の測定 精製したＧＯＤ酵素を１／５倍容量の５×ＳＤＳ試料緩
衝液（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％メルカプトエ
タノール、１０％グリセロール、０．００１％ブロモフ
ェノールブルー）と混合し、９５℃で５分間インキュベ
ートした。その後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分離し（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-68
5）、クーマシーブリリアントブルー染料で染色した。Ａ．ニガー、Ｓ．セレビシエ（野生型）およびＳ．セレ
ビシエ（高グリコシル化欠損変異株）において発現され
たＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後の分子量／サブユニット
【００８９】
【表９】
【００９０】Ａ．ニガー： Ａ．ニガー由来のＧＯＤ、
純度II（Boehringer Mannheim ） ＷＴ ： Ｓ．セレビシエ野生型 ｎｇｄ２９： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ２９変異株 ｎｇｄ６２： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ６２変異株
純度II（Boehringer Mannheim ） ＷＴ ： Ｓ．セレビシエ野生型 ｎｇｄ２９： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ２９変異株 ｎｇｄ６２： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ６２変異株
【００９１】8.3 炭水化物部分の測定（アントロン反応） 異なる生物および酵母株からのＧＯＤ酵素の炭水化物部
分は Ashwell, G.の方法（Methods Enzymol. 3 (1957)
84）に従って測定した。このために、０．５ｍｌの精製
ＧＯＤ酵素（濃度２０−１００Ｕ／ｍｌ水）を５ｍｌの
アントロン試薬と混合し、この溶液を２５℃で５分間イ
ンキュベートし、その後沸騰水浴中で１５分間加熱し
た。試料を２５℃に冷却した後、吸光度を試薬ブランク
に対して６３０ｎｍで測定した。ＧＯＤ試料中の炭水化
物の部分は、同時に設定した５、２５、７５および１０
０μｌ／ｍｌのマンノース標準溶液を用いて作成された
マンノース検量線により測定した。 アントロン試薬の調製：濃硫酸６６ｍｌを水３４ｍｌで
慎重に希釈する。８０℃に冷却後、アントロン５０ｍｇ
とチオ尿素１ｇを硫酸中に溶解する。このアントロン試
薬は４℃で２週間保存できる。Ａ．ニガー、Ｓ．セレビシエ（野生型）およびＳ．セレ
ビシエ（高グリコシル化欠損変異株）において発現され
たＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 の炭水化物部分
分は Ashwell, G.の方法（Methods Enzymol. 3 (1957)
84）に従って測定した。このために、０．５ｍｌの精製
ＧＯＤ酵素（濃度２０−１００Ｕ／ｍｌ水）を５ｍｌの
アントロン試薬と混合し、この溶液を２５℃で５分間イ
ンキュベートし、その後沸騰水浴中で１５分間加熱し
た。試料を２５℃に冷却した後、吸光度を試薬ブランク
に対して６３０ｎｍで測定した。ＧＯＤ試料中の炭水化
物の部分は、同時に設定した５、２５、７５および１０
０μｌ／ｍｌのマンノース標準溶液を用いて作成された
マンノース検量線により測定した。 アントロン試薬の調製：濃硫酸６６ｍｌを水３４ｍｌで
慎重に希釈する。８０℃に冷却後、アントロン５０ｍｇ
とチオ尿素１ｇを硫酸中に溶解する。このアントロン試
薬は４℃で２週間保存できる。Ａ．ニガー、Ｓ．セレビシエ（野生型）およびＳ．セレ
ビシエ（高グリコシル化欠損変異株）において発現され
たＧＯＤおよびＧＯＤ−（Ｈｉｓ）4 の炭水化物部分
【００９２】
【表10】
【００９３】Ａ．ニガー： Ａ．ニガー由来のＧＯＤ、
純度II（Boehringer Mannheim ） ＷＴ ： Ｓ．セレビシエ野生型 ｎｇｄ２９： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ２９変異株 ｎｇｄ６２： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ６２変異株
純度II（Boehringer Mannheim ） ＷＴ ： Ｓ．セレビシエ野生型 ｎｇｄ２９： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ２９変異株 ｎｇｄ６２： Ｓ．セレビシエ高グリコシル化欠損ｎｇ
ｄ６２変異株
【００９４】文献： Bekkers, A.C.A.P.A.; Franken, P.A.F.; Van den Berg
h, C.J.; Verbakel, J.M.A.; Verheij, H.M.; De Haas,
G.H.:「サッカロミセス・セレビシエによりブタ膵臓ホ
スホリパーゼＡ２を効率よく生産するための遺伝子工学
の使用」Biochim.Biophys. Acta 1089, 345-351 (199
1). Ballou, L; Cohen, R.E.; Ballou, C.E.: 「末端切断型
炭水化物外鎖を有するマンノプロテインを生産するサッ
カロミセス・セレビシエ変異株」 J. Biol. Chem. 255,
5986-5991 (1980). Ballou, C.E.: 「酵母の細胞壁および細胞表面」 In: S
trathern, J.N.; Jones,E.W.; Broach, J.R. (eds.), T
he Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, M
etabolism and Gene Expression（酵母サッカロミセス
の分子生物学、代謝および遺伝子発現）, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York, pp. 335-360 (1982). Ballou, L; Alvarado, E.; Tsai, P.; Dell, A.; Ballo
u, C.E.:「サッカロミセス・セレビシエｍｎｎ７変異株
クラスにおけるタンパク質のグリコシル化欠損」J. Bio
l. Chem. 264, 11857-11864 (1989). Ballou, C.E.: 「無条件のタンパク質グリコシル化欠損
を伴うサッカロミセス・セレビシエｍｎｎ変異株の単
離、特性決定および特性」 Methods Enzymol. 185,440-
470 (1990). Ballou, L; Hitzeman, R.A.; Lewis, M.S.; Ballou, C.
S.: 「バナジウム酸塩耐性酵母変異株はタンパク質グリ
コシル化を欠失している」 Proc. Natl. Acad. Sci. 8
8, 3209-3212 (1991). Beggs, J.D.:「複製ハイブリッドプラスミドによる酵母
の形質転換」 Nature 275, 104-109 (1978). Carlson, M.; Taussig, R.; Kustu, S.; Botstein, D.:
「サッカロミセス・セレビシエの分泌型インベルターゼ
はシグナル配列をコードするｍＲＮＡから合成される」
Mol. Cell. Biol. 3, 439-447 (1983). Ciriacy, M.:「サッカロミセス・セレビシエにおけるア
ルコールデヒドロゲナーゼの遺伝学 Ｉ．ａｄｈ変異体
の単離および遺伝的分析」 Mut. Res. 29, 315-326 (19
75). De Baetselier, A.; Vasavada, A.; Dohet, P.; Ha-Ti,
V.; De Beukelaer, M.;Erpicum, T.; De Clerk, L.; H
anotier, J.; Rosenberg, S.:「Ａ．ニガーのグルコー
スオキシダーゼを産生する酵母の発酵：組換え酵素のス
ケールアップ、精製および特性決定」 Biotechnology
9, 559-561 (1991). Delorme, E.:「エレクトロポレーションによるサッカロ
ミセス・セレビシエの形質転換」 Applied and Environ
mental Microbiology 55, 2242-2246 (1989). Dijken, J.P. van; Veenhuis M.:「アスペルギルス・ニ
ガーのペルオキシソームにおけるグルコースオキシダー
ゼの細胞化学的局在化」 European J. Appl. Microbio
l. Biotechnol. 9, 275-283 (1980). Erhart, E.; Hollenberg, C.P.: 「サッカロミセス・セ
レビシエの２μＤＮＡ組換えプラスミド上の欠損ＬＥＵ
２遺伝子の存在はキュアリングと高コピー数の原因とな
る」 J. Bacteriol. 156, 625-635 (1983). Frederick, K.R.; Tung, J.; Emerick, R.S.; Masiarz,
F.R.; Chamberlain, S.H.; Vasavada, A.; Rosenberg,
S.; Chakraborty, S.; Schopter, L.M.; Massey, N.:
「アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシダー
ゼ」 J. Biol. Chem. 265, 3793-3802 (1990). Hadwick, K.G.; Lewis, M.J.; Semenza, J.; Dean, N.;
Pelham, H.R.B.:「小胞体タンパク質の保持に必要な酵
母遺伝子ＥＲＤ１はゴルジ装置での糖タンパク質プロセ
シングに影響する」 EMBO J. 9, 623-630 (1990). Haselbeck, A.; Hosel, W.: 「インキュベーション条
件、種々の界面活性剤およびタンパク質濃度がＮ−グリ
コシダーゼＦ（グリコペプチダーゼＦ）およびエンドグ
リコシダーゼＦの酵素活性に及ぼす影響に関する研究」
Topics in Biochemistry 8, 1-4 (1988). Hochuli, E.; Doebeli, H.; Schacher, A.: 「隣接ヒス
チジン残基を含むタンパク質およびペプチドに選択的な
新規金属キレート吸着剤」 J. Chromatography 411, 17
7-184 (1987). Hochuli, E.; Bannwarth, W.; Doebeli, H.; Genz, R.;
Stueber, D.: 「新規金属キレート吸着剤を用いる組換
えタンパク質の精製を容易にするための遺伝的手法」 B
iotechnology 6, 1321-1325 (1988). Huffaker, T.C.; Robbins, P.W.:「タンパク質グリコシ
ル化を欠失している酵母変異株」 Proc. Natl. Acad. S
ci. 80, 7466-7470 (1983). Innis, M.A.:「サッカロミセス・セレビシエ内での異種
タンパク質のグリコシル化」 In: Barr, P.J.; Brake,
A.J.; Valenzuela, P. (eds.), Yeast geneticenginee
ring, Butterworths, Stoneham, Mass, pp. 233-246 (1
989). Ito, H.; Jukuda, A.; Murata, K.; Kimura, A.:「アル
カリカチオンで処理した完全酵母細胞の形質転換」 J.
Bacteriol. 153, 163-168 (1983). Kopetzki, E.; Buckel, P.; Schumacher, G.: 「パン酵
母αグルコシダーゼのクローニングおよび特性決定：液
胞プロテイナーゼを欠いた酵母株での過剰発現」Yeast
5, 11-24 (1989). Kornfeld, R.; Kornfeld, S.: 「アスパラギン結合オリ
ゴ糖の組立て」 Ann. Rev. Biochem. 54, 631-664 (198
5). Kukuruzinska, M.A.; Bergh, M.L.E.; Jackson, B.J.:
「酵母のタンパク質グリコシル化」 Ann. Rev. Bioche
m. 56, 915-944 (1987). Kriechbaum, M.; Heilmann, H.J.; Wientjes, F.J.; Ha
hn, M.; Jany, K.D.; Gassen, H.G.; Sharif, F.; Alae
ddinoglu, G.: 「アスペルギルス・ニガーＮＲＲＬ−３
由来のグルコースオキシダーゼ遺伝子のクローニングお
よびＤＮＡ配列解析」 FEBS Lett. 255, 63-66 (1989). Laemmli, U.K.:「バクテリオファージＴ４の頭部の組立
て中の構造タンパク質の切断」 Nature 227, 680-685
(1970). Maniatis, T. et al., In: Molecular cloning: A labo
ratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, New York, (1989). Moir, D.T.: 「分泌効率の増大した酵母変異株」 In: B
arr, P.J.; Brake, A.J.; Valenzuela, P. (eds.), Yea
st genetic engineering, Butterworths, Stoneham, Ma
ss, pp. 215-231 (1989). Mullis, K.B.; Faloona, F.A.:「ポリメラーゼ連鎖反応
による in vitro 特異的ＤＮＡ合成」 Methods Enzymo
l. 155, 355-350 (1987). Nakano, A.; Muramatsu, M.:「新規ＧＴＰ結合タンパク
質ｓａｒｐ１は小胞体からゴルジ装置への輸送に関与す
る」 J. Cell. Biol. 109, 2677-2691 (1989). Newman, A.P.; Ferro-Novick, S.: 「〔3H〕マンノース
自殺選択により単離された酵母分泌経路の初期の新規変
異体の特性決定」 J. Cell. Biol. 105, 1587-1594 (19
87). Novick, P.; Field, C.; Schekman, R.:「酵母分泌経路
の翻訳後現象に必要な２３の相補性グループの同定」 C
ell 21, 205-215 (1980). Paulson, C.P.:「糖タンパク質：糖鎖は何のためにある
のか？」 TIBS 14, 272-276 (1989). Rudolph, H.K.; Antebi, A.; Fink, G.R.; Buckley, C.
M.; Dorman, T.E.; LeVitre, J.; Davidow, L.S.; Mao,
J,; Moir, D.T.:「酵母分泌経路はＣａ2+ＡＴＰａｓｅ
ファミリーの一員であるＰＭＲ１の突然変異により乱さ
れる」 Cell 58,133-145 (1989). Reddy, V.A.; Johnson, R.S.; Biemann, K.; Williams,
R.S.; Ziegler, F.D.;Trimble, R.B.; Maley, F.:
「酵母エクスターナルインベルターゼのグリコシル化部
位の特性決定 Ｉ．個々のセクオンのＮ−結合オリゴ糖
含有量」 J. Biol.Chem. 263, 6978-6985 (1988). Runge, K.W.; Robbins, P.W.: 「タンパク質グリコシル
化の初期段階におけるサッカロミセス・セレビシエ変異
株」 In: Bonventre, P.F.; Morello, J.A.M.; Bilver,
S.D.; Wu, H.C. (eds.), Microbiology-1986. America
n Society for Microbiology, Washington, D.C. pp. 3
12-316 (1986). Schekman, R.; Novick, P.: 「分泌プロセスおよび酵母
細胞表面組立て」 In: Strathern, J.N.; Jones, E.W.;
Broach, J.R. (eds.), The Molecular Biologyof the
Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expressio
n, Cold SpringHarbor Laboratory, New York, pp. 361
-398 (1982). Schmitt, H.D.; Wagner, P.; Pfaff, E.; Gallwitz,
D.: 「酵母のｒａｓ関連ＹＰＴ１遺伝子産物：微小管構
成に関与しうるＧＴＰ結合タンパク質」 Cell 47,401-4
12 (1986). Schmitt, H.D.; Puzichia, M.; Gallwitz, D.:「酵母の
ｒａｓ関連ＹＰＴ１遺伝子産物の温度感受性変異体の研
究は細胞内カルシウム調節の役割を示唆する」 Cell 5
3, 635-647 (1988). Sherman, F.; Fink, G.R.; Hicks, J.B.: Methods in Y
east Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory , Cold Spring Harbor, New York, (1
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Dodsworth, N.; Peberdy, J.; Dobson, M.; Hinchliff
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スおよびサッカロミセス・セレビシエ内でのアスペルギ
ルス・ニガーのグルコースオキシダーゼ遺伝子の発現」
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スターナルインベルターゼのグリコシル化部位の特性決
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炭水化物外鎖を有するマンノプロテインを生産するサッ
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の分子生物学、代謝および遺伝子発現）, Cold Spring
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クラスにおけるタンパク質のグリコシル化欠損」J. Bio
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を伴うサッカロミセス・セレビシエｍｎｎ変異株の単
離、特性決定および特性」 Methods Enzymol. 185,440-
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コシル化を欠失している」 Proc. Natl. Acad. Sci. 8
8, 3209-3212 (1991). Beggs, J.D.:「複製ハイブリッドプラスミドによる酵母
の形質転換」 Nature 275, 104-109 (1978). Carlson, M.; Taussig, R.; Kustu, S.; Botstein, D.:
「サッカロミセス・セレビシエの分泌型インベルターゼ
はシグナル配列をコードするｍＲＮＡから合成される」
Mol. Cell. Biol. 3, 439-447 (1983). Ciriacy, M.:「サッカロミセス・セレビシエにおけるア
ルコールデヒドロゲナーゼの遺伝学 Ｉ．ａｄｈ変異体
の単離および遺伝的分析」 Mut. Res. 29, 315-326 (19
75). De Baetselier, A.; Vasavada, A.; Dohet, P.; Ha-Ti,
V.; De Beukelaer, M.;Erpicum, T.; De Clerk, L.; H
anotier, J.; Rosenberg, S.:「Ａ．ニガーのグルコー
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ケールアップ、精製および特性決定」 Biotechnology
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ミセス・セレビシエの形質転換」 Applied and Environ
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ガーのペルオキシソームにおけるグルコースオキシダー
ゼの細胞化学的局在化」 European J. Appl. Microbio
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レビシエの２μＤＮＡ組換えプラスミド上の欠損ＬＥＵ
２遺伝子の存在はキュアリングと高コピー数の原因とな
る」 J. Bacteriol. 156, 625-635 (1983). Frederick, K.R.; Tung, J.; Emerick, R.S.; Masiarz,
F.R.; Chamberlain, S.H.; Vasavada, A.; Rosenberg,
S.; Chakraborty, S.; Schopter, L.M.; Massey, N.:
「アスペルギルス・ニガー由来のグルコースオキシダー
ゼ」 J. Biol. Chem. 265, 3793-3802 (1990). Hadwick, K.G.; Lewis, M.J.; Semenza, J.; Dean, N.;
Pelham, H.R.B.:「小胞体タンパク質の保持に必要な酵
母遺伝子ＥＲＤ１はゴルジ装置での糖タンパク質プロセ
シングに影響する」 EMBO J. 9, 623-630 (1990). Haselbeck, A.; Hosel, W.: 「インキュベーション条
件、種々の界面活性剤およびタンパク質濃度がＮ−グリ
コシダーゼＦ（グリコペプチダーゼＦ）およびエンドグ
リコシダーゼＦの酵素活性に及ぼす影響に関する研究」
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チジン残基を含むタンパク質およびペプチドに選択的な
新規金属キレート吸着剤」 J. Chromatography 411, 17
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Stueber, D.: 「新規金属キレート吸着剤を用いる組換
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ring, Butterworths, Stoneham, Mass, pp. 233-246 (1
989). Ito, H.; Jukuda, A.; Murata, K.; Kimura, A.:「アル
カリカチオンで処理した完全酵母細胞の形質転換」 J.
Bacteriol. 153, 163-168 (1983). Kopetzki, E.; Buckel, P.; Schumacher, G.: 「パン酵
母αグルコシダーゼのクローニングおよび特性決定：液
胞プロテイナーゼを欠いた酵母株での過剰発現」Yeast
5, 11-24 (1989). Kornfeld, R.; Kornfeld, S.: 「アスパラギン結合オリ
ゴ糖の組立て」 Ann. Rev. Biochem. 54, 631-664 (198
5). Kukuruzinska, M.A.; Bergh, M.L.E.; Jackson, B.J.:
「酵母のタンパク質グリコシル化」 Ann. Rev. Bioche
m. 56, 915-944 (1987). Kriechbaum, M.; Heilmann, H.J.; Wientjes, F.J.; Ha
hn, M.; Jany, K.D.; Gassen, H.G.; Sharif, F.; Alae
ddinoglu, G.: 「アスペルギルス・ニガーＮＲＲＬ−３
由来のグルコースオキシダーゼ遺伝子のクローニングお
よびＤＮＡ配列解析」 FEBS Lett. 255, 63-66 (1989). Laemmli, U.K.:「バクテリオファージＴ４の頭部の組立
て中の構造タンパク質の切断」 Nature 227, 680-685
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による in vitro 特異的ＤＮＡ合成」 Methods Enzymo
l. 155, 355-350 (1987). Nakano, A.; Muramatsu, M.:「新規ＧＴＰ結合タンパク
質ｓａｒｐ１は小胞体からゴルジ装置への輸送に関与す
る」 J. Cell. Biol. 109, 2677-2691 (1989). Newman, A.P.; Ferro-Novick, S.: 「〔3H〕マンノース
自殺選択により単離された酵母分泌経路の初期の新規変
異体の特性決定」 J. Cell. Biol. 105, 1587-1594 (19
87). Novick, P.; Field, C.; Schekman, R.:「酵母分泌経路
の翻訳後現象に必要な２３の相補性グループの同定」 C
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のか？」 TIBS 14, 272-276 (1989). Rudolph, H.K.; Antebi, A.; Fink, G.R.; Buckley, C.
M.; Dorman, T.E.; LeVitre, J.; Davidow, L.S.; Mao,
J,; Moir, D.T.:「酵母分泌経路はＣａ2+ＡＴＰａｓｅ
ファミリーの一員であるＰＭＲ１の突然変異により乱さ
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R.S.; Ziegler, F.D.;Trimble, R.B.; Maley, F.:
「酵母エクスターナルインベルターゼのグリコシル化部
位の特性決定 Ｉ．個々のセクオンのＮ−結合オリゴ糖
含有量」 J. Biol.Chem. 263, 6978-6985 (1988). Runge, K.W.; Robbins, P.W.: 「タンパク質グリコシル
化の初期段階におけるサッカロミセス・セレビシエ変異
株」 In: Bonventre, P.F.; Morello, J.A.M.; Bilver,
S.D.; Wu, H.C. (eds.), Microbiology-1986. America
n Society for Microbiology, Washington, D.C. pp. 3
12-316 (1986). Schekman, R.; Novick, P.: 「分泌プロセスおよび酵母
細胞表面組立て」 In: Strathern, J.N.; Jones, E.W.;
Broach, J.R. (eds.), The Molecular Biologyof the
Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expressio
n, Cold SpringHarbor Laboratory, New York, pp. 361
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D.: 「酵母のｒａｓ関連ＹＰＴ１遺伝子産物：微小管構
成に関与しうるＧＴＰ結合タンパク質」 Cell 47,401-4
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Ｈ耐性セクオンの位置決定」 J. Biol. Chem. 263, 697
8-6985 (1988).
【００９５】
（iii）配列の数：１０ （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号１：
【００９６】
【化８】
【００９７】（２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号２：
【００９８】
【化９】
【００９９】（２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号３：
【０１００】
【化10】
【０１０１】（２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号４：
【０１０２】
【化11】
【０１０３】（２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号５：
【０１０４】
【化12】
【０１０５】（２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号６：
【０１０６】
【化13】
【０１０７】（２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号７：
【０１０８】
【化14】
【０１０９】（２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号８：
【０１１０】
【化15】
【０１１１】（２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号９：
【０１１２】
【化16】
【０１１３】（２）配列番号10の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号10：
【０１１４】
【化17】
【図１】制限酵素切断部位を示したプラスミドＹＥｐ／
５Ｃ６ｂ３の模式図である。
５Ｃ６ｂ３の模式図である。
【図２】制限酵素切断部位を示したプラスミドＹＥｐＬ
の模式図である。
の模式図である。
【図３】制限酵素切断部位を示したプラスミドＹＥｐＬ
／ＧＯＤの模式図である。
／ＧＯＤの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 エルハルト コペッツキー ドイツ連邦共和国 Ｄ−82377 ペンツバ ーク カストナーホフシュトラーセ 21
Claims (7)
- 【請求項１】 〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択、１つま
たは複数の選択マーカー（栄養要求性および／または耐
性）の導入、プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤによる形質転
換と２％酵母エキス、４％バクトペプトン、Difco 、
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１％フ
ルクトースおよび６％マルトースを含む完全培地での培
養後、振とうしながら３−４日間インキュベートした後
で培地中に１０ｍｇ／ｌまたはそれ以上のＧＯＤを分泌
しかつサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、ＤＳＭ７
１６０および／またはＤＳＭ７３４０にアレリックであ
る菌株の選択により得られる、Ｎ−グリコシル化の欠損
を有する酵母変異株。 - 【請求項２】 酵母変異株ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３
３８、ＤＳＭ７１６０およびＤＳＭ７３４０。 - 【請求項３】 〔3Ｈ〕−マンノース自殺選択、１つま
たは複数の選択マーカー（栄養要求性および／または耐
性）の導入、プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤによる形質転
換と２％酵母エキス、４％バクトペプトン、Difco 、
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１％フ
ルクトースおよび６％マルトースを含む完全培地での培
養後、振とうしながら３−４日間インキュベートした後
で培地中に１０ｍｇ／ｌまたはそれ以上のＧＯＤを分泌
しかつサッカロミセス・セレビシエＤＳＭ７０４２、Ｄ
ＳＭ７３３８、ＤＳＭ７１６０および／またはＤＳＭ７
３４０にアレリックである菌株の選択より成る、請求項
１または２記載の酵母変異株の作製方法。 - 【請求項４】 サッカロミセス・セレビシエＤＳＭ７０
４２、ＤＳＭ７３３８、ＤＳＭ７１６０および／または
ＤＳＭ７３４０を作製するための請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 タンパク質の同種および異種発現用の宿
主生物としての請求項１または２記載の酵母変異株の使
用。 - 【請求項６】 目的のタンパク質をコードする組換えＤ
ＮＡによる請求項１または２記載の酵母変異株の形質転
換、該細胞の培養、および該細胞または培養上清からの
目的タンパク質の単離により得られる低グリコシル化組
換えタンパク質。 - 【請求項７】 タンパク質をコードするＤＮＡによる請
求項１または２記載の酵母変異株の形質転換、該形質転
換細胞の培養、および該細胞または培養上清からの該タ
ンパク質の単離より成る、本質的に均質にグリコシル化
されたタンパク質の発現および生産方法。
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