JPH0279982A - 真核細胞系表現ベクター、及び真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の調節可能な製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はベクター中に調節可能なプロモーターを含有す
る真核細胞系表現ベクター並びにこのようなベクターを
使用する真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は
蛋白質含有生産物の調節可能な製法に関する。

従来の技術 酵母は人間の最も古い培養微生物の１つである。今でも
主としてアルコール醗酵（ワイン。

ビール等）に及びドウ製品の製造の除の”ベーキング助
剤（Ｂａｃｋｈｊｌｆｅ　）”として使われている。そ
れと同時に、酵母は例えばＮＡＤ　、　ＡＴＰ及びグル
タチオンのような低分子物質及び例えばＤＮＡ　、　Ｒ
ＮＡ及びとりわけ酵素２例えばアルコール−デヒドロｒ
ナーゼ、アルデヒド−デヒドロゲナーゼ、アセチル−Ｃ
ｏＡ−シンテターゼ、α−グルコシダーゼ、グリセリン
アルデヒド−３−ボスフエートテヒドロｒナーゼ、グル
コ−２−６−ボスフニートーデヒドロｒナーゼ及びヘキ
ソキナーゼのような高分子物質を単離するための低廉な
原料源として工業的に重要である。

酵母は簡単に培養することができかつ長年の経験から工
業的規模で簡単に醗酵させることができる。下等な真核
生物に含まれる単細胞生物の酵母は真核生物の典型的な
特徴を有するが、遺伝学的実験及び遺伝学的操作に使い
易く、特に組換え体ＤＮＡ工学の点で宿主生物として好
適であり、つまり生物学的に活性なポリペプチド及び蛋
白質の相同及び非相同表現に好適である。

従来、組換体ＤＮＡ工学において最も頻繁に使われる宿
主生体のＥ、コリ中では多数の非相同表現蛋白質は相同
系（すなわち真核細胞中での真核細胞の蛋白質のための
系）で表現されるその天然物とは多くの点で異なりかつ
生物学的に活性ではないか、あるいは不溶性の不活性蛋
白質凝集物（”レフレクタイル　ボディ：ｒｅｆｒａｃ
ｔｊｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ”）として析出する。多く物 の真核生７の蛋白質は、Ｌコリ中では不活性で表現され
、酵母中では溶性かつ活性で形成される。〔Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ
−ｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　　ｐ　３　＊　３
７７〜４１６頁（１９８５年）〕。とりわけこのことは
、酵母が典型的な真俵生物の翻訳後修飾糸２例えば蛋白
質の折りたたみ、蛋白質成熟、グリコジル化及びアセチ
ル化を介して分泌可能でありかつポリペプチド及び蛋白
質中のジスルフィド架橋の形成をｂ」能にすることによ
り惹起されるのであろう。更に、酵母は病原性ではなく
かつＥ、コリとは異なシ毒素及び発熱原性細胞壁成分を
含有していない。

酵母中での相同及び非相同ポリペプチド及び蛋白質の表
現のためには通常プロモーター　表現すべき遺伝子・タ
ーミネータ−及び場合によジブロモ−ターに正に及び／
又は負に影響する調節遺伝子１つ又は複数からなる表現
カセットを使用するシこの表現ユニットは酵母／Ｅ、コ
リーハイブリッドベクター（シャトルベクター）上に存
在する。酵母中での挙動により、ＹＲｐｌＹＥｐ　ｚ　
”Ｔ’及びＹＣｐと呼ばれる４種のシャトルベクターに
類別される。ＹＲｐ−プラスミドは酵母中での自律複製
のために酵母からの染色体複製源（ａｕｔｏｎｏｍｏｕ
ｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ　−ＡＲ
８）を有し、他方ＹＥｐ−プラスミドはこの機能を環状
染色体外酵母−ＤＮＡ　（２μｍ　−ＤＮＡ　）から受
は取る。これらは通常細胞あたり５〜４０個のコピーで
存在する。ＹＣｐ−プラスミドは自律複製配列の他にセ
ントロメアを有し、このために染色体のように挙動する
。ＹＩｐ−プラスミドは染色体酵母域に相同の配列を有
し、相同組換えにより酵母染色体のこの領域に統合され
つる。しかしながら、これらのプラスミドは酵母細胞中
には低いコピー数で存在するので、相同又は非相同蛋白
質を遺伝子操作により製造するためにめまり好適ではな
い。ＹＲｐ−及びＹＥｐ−プラスミドは選択圧なしに、
細胞増殖の際に失なわれる（　Ｎａｔｕｒｅ　、第３０
５巻、１９８３年、第３９１〜３９７頁）、すなわちプ
ラスミドのない細胞は非選択性発酵の際に富化する、そ
れというのもこれらのプラスミドを有さない細胞はその
増殖において有利であり、迅速に成長し、これにより形
質転換細胞の量は発酵の経過において常に減少するため
である。従って、プラスミド含有酵母細胞に関する選択
のためにはプラスミド中に使用した酵母細胞の必須生合
成経過における酵素欠損を補なうか、もしくは細胞に培
地中の薬剤及び化学薬品（メトトレキサート（Ｍｅｔｈ
ｏｔｒｅｘａｔ　）、クロラフ　７　、Ｚ　：　コール
、Ｇ４１８、ヒグロマイシンＢ）の解毒のための酵素活
性を付与する、栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３
、ＬＥＵ２、Ｔ旦Ｐｌ　）及び耐性マーカー（例えは、
ＤＨＦＲ、ＣＡＴ　、ホスホトランスフェラーゼ）を組
み込む。相応する欠損酵母株又は一定の化学薬品を含有
する培地を使用する場合、非形質転換細胞もしくはプラ
スミド欠損細胞は妨たげられて、プラスミド含有細胞の
多い集団が得られる。

酵母表現ベクターの構成のためには主に、例えはへキソ
キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、トリオースホスフ
ェートイソメラーゼ、グリセリンアルデヒド−６−ホス
フニートーテヒドロｒナーゼ、３−ホスホグリセラード
キナーゼ、工／ラ−ｔ’、ｅルベートキナーゼ、ヒルベ
ート−デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナ
ーゼのような強く表現される解糖遺伝子のプロモーター
及びこれに属するターミネータ−を使用する。しかしな
がら、これらは多くの場合構成性に（すなわちこれらは
一定量の遺伝子生産物を生産する）、もしくは非常に弱
く調節されておシ、このことは細胞にとって有毒なポリ
ペプチドや蛋白質の表現を強く妨げるか、もしくは不可
能とすることができる。従って、調節された表現のため
には通常天然の調節されたプロモーター　例えはＧＡＬ
　１−　　ＧＡＬ　１０−ＰＨ０５−ヒートショック−
蛋白質−Ｅα１−及びＣＵＰ　１−プロモーターを使用
する。強い表現及び厳密な調節の組み合わせ（抑制比に
対するできるだけ大きな誘導比もしくは抑制解除比）の
ために、できるだけ強く、構成性のプロモーター、例え
はＧＡＰ−ＤＨ及びＣＹＣ１−プロモーターとＧＡＬ　
１　　、１０−もしくはＡＤＨＩＩ−プロモーターから
の調節部位（ＵＡＳ　、　　ｕｐｓｔｒｅａｍａｃｔｉ
ｖａｔコ□ｎ　５ｉｔｅ”）とからなる合成ノ嶌イブリ
ッドプロモーターが開発された。しかしながら、これら
のプロモーターの表現性及び誘導挙動はなお理想的では
なく、特に、これらが高いコピー数で細胞中に存在する
プラスミド上にある場合は理想的ではない。これらのプ
ロモーターの多くは工業的規模での経済的誘導に関して
欠点を示す。こうして、例えばＰＨ０５−７″ロモータ
ーはホスフェート消耗により抑制解除される。

プロモーターはＧＡＬ　１　、１０−上方域活性化部位
（ｕｐｓｔ、ｒｅａｍ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　５ｉｔ
ｅ　）”の影響下に高価な誘導物質ガラクトースを最大
誘導のために必要とする。調節されたＭＦヶ１−プロモ
ーターなａｉｒｔＳ−突然変異体中６７°Ｃでのみ抑制
され、２４°Ｃへの温度低下によシ誘導される。

他のプロモーターは例えは銅のような有毒重金属を誘導
のために必要とする。

従って、実地においては、発酵の終わり１で安価なＣ−
源の使用により抑制解除されるか、又は／及び最適なバ
イオマスにおける定常期において安価な誘導物質により
なお誘導されるようなプロモーターが爵に好適である。

このことは、多くの細胞性遺伝子が定常期に止められ、
これにより表現さ扛た生産物の精製を簡単にすることが
できる（高い比活性）という利点を有する。定常期にお
けるプロテアーゼの高められ表現は例えばプロテアーゼ
欠失酵母株の使用によシ扱うことができる。

良好に調節され、グルコースにより抑制さ枢かつマルト
ースにより誘導可能な酵母プロモーターが、Ｓ、カール
スペルダンシス（Ｓ、　ＣａｒｌＳ−ｂｅｒｇｅｎｓｊ
ｓ　、　ＭＡＬ　ｉ、２．６．４及び６）のマルターゼ
（α−グルコ７ダーゼ）及びＳ、セレビシアエ（Ｓ、　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の、遺伝学的に詳細には特徴
付けされていないマルターゼ下に見い出された。このプ
ロモーターの利点は安いＣ−源（クルコース、マルトー
ス）により大規模でも安価に調節することができるとい
うことである。しかし、従来ＭＡＬ６　Ｓ−α−グルコ
シダーゼだけがクローン化され、その７″ロモ一ター配
列のみが公知である（Ｇｅｎｅ、第４１巻、１９８６年
、第７５〜８４頁）。

しかしながら、プロモーター　“上方活性部位（ｕｐｓ
ｔｒｅａｍ　ａｃｔｊｖａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　）”　
構成遺伝子及びターミネータ−からなる、Ｓ、セレビシ
アエからのクローン化α−グルコシダーゼ遺伝子である
形質転換体はマルトース及び高めた遺伝子量（すなわち
、高めたコピー数で細胞中に存在するプラスミド上にあ
る表現すべき遺伝子）での誘導によシ、僅かな表現のみ
を示すことが判明した。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は真核細胞中での表現のだめの表
現ベクターを提供することであり、該ベクターは簡単で
、かつ安価な方法でその作用を調節することができ、か
つ対数増殖期にも定常期にもできるだけ効果的な遺伝子
表現を可能とするプロモーターを含有する。

課題をｍ決するための手段 −において、このベクターがプロモーターとしてα−グ
ルコシダーゼｐＩ−プロモーター域のＤＮＡ−配列を短
縮形で含有し、この際少なくともヌクレオチド−８６７
の全上方域が、そして最高でもヌクレオチド−１４０の
全上方域が欠失していることを特徴とすることにより解
決する。

すなわち、完全なα−グルコシダーゼｐＩ　−プロモー
ターのかわシに短縮したα−グルコシダーゼｐＩ−プロ
モーターを使用すると、同質及び非同質蛋白質又は蛋白
質含有遺伝子生産物の表現、例えば翻訳後ｓｓｔ、た、
すなわち例えはグリコジル化、アセチル化、ホスホリル
化蛋白質の表現を改良することができるということが意
外にも判明した。この際、α−グルコシダーゼ−ｐＩ−
遺伝子のＡＴＧ−開始コトンのヌクレオチドＡをプロモ
ーター配列の番号付けのための関連点＋１とする。”上
方”という語は挙けた範囲に対してＤＮＡ−配列の５′
−末端の方向にある配列を表わす。α−グルコシダーゼ
ｐＩ−遺伝子の配列を第１ａ図中のそれぞれ最上段に、
それぞれ中段に示したＭＡＬ　６　Ｓ−遺伝子（ＭＡＬ
６Ｓ−マルターゼ）と比較して示した。本発明の有利な
笑施形においてはα−グルコシダーゼ−ｐＩ−プロモー
ター域の一４２７上方域、特に−３８６のＳａｐ　ｌ−
切断位の上方域が欠失している。この際、ヌクレオチド
＋１の上方プロモーター記法の残った部分は場合により
更に例えば置換、欠失及び付加のような部分−又は単独
ヌクレオチド−改変を示してもよい。しかしながら、α
−グルコシダーゼ−プロモーターの最大活性を得るため
に、有利にはヌクレオチド−１０６と−１０９との間の
範囲は変えないで（１００％同質）ヌクレオチド−２３
と−４６との間の範囲でこの配列を第１ａ図に示した配
列に対して少なくとも９５チまで同質にすべきである。

ヌクレオチド＋１〜−１４０の間の範囲は相応する第１
ａ図中の配列に少なくとも９０％まで同質であるのが特
に有利である。

本発明による表現ベクターとは複製源を有し、独立して
増殖することのできるＤＮＡ−分子を表わす必要はなく
、宿主細胞−ＤＮＡ中に組換により組込壕れ、かつその
転写が宿主ＤＮＡの転写と共に行なわれる統合ＤＮＡ−
フラグメントであってもよい。

もう１つの有利な実施形においては、表現ベクターが付
加的に１つ又は複数の正の調節遺伝子を有する。これに
より、α−グルコシダーゼｐＩ−ゾロモー・ターの短縮
ＤＮＡ−配列のブロモ−ター活性？高めることができる
。ＭＡＬ−遺伝子座からの正の調節遺伝子を使用するの
が有利である。この種のＭＡＬｐ−遺伝子は例えばｒネ
テイカ（Ｇｅｎｅｔｉｋａ　）　１９７６年、第１２巻
、第８７〜１００頁に記載されている。構成性であるが
、なおグルコース抑制可能なα−グルコシダーゼプロモ
ーターを生成する突然変異の正の調節遺伝子を組込むの
が有利である。この種の突然変異調節遺伝子はｍａｌｐ
−調節突然変異体の突然変異誘発による復帰細胞の、す
なわち再たび唯一のＣ源としてマルトースで成長する状
態にある突然変異体の単離により得られる。復帰細胞の
所望の表現型（構成性であるが、グルコース抑制可能な
マルターダ）はグルコース生成によシ測定する。引き続
き、突然変異した正の調節遺伝子を公知法によりクロー
ン化し、次いで表現ベクター中に導入する。正の調節遺
伝子としてＭＡＬ　２−８Ｃｐ−遺伝子（第６図参照）
を表現ベクター中に挿入するのが有利である。この遺伝
子は典型的なＭＡＬ２ｐ−遺伝子の突然変異体対立遺伝
子に関してコードする。構成性でるるか更にグルコース
抑制可能な遺伝子表現はこれに由来する（ＭＧＧ、第１
３４巻、１９７４紙第２６１〜２７２頁；　Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、第９巻、１９８５年、亮５
３９〜５４５頁）、更に有利な実施形においては、本発
明による表現ベクターは表現の際に外来遺伝子が短縮α
−グルコシダー−ｖｐｘ−ｙロモーターのコントロール
に従う位置に外来遺伝子の組込みｔ可能とする制限切断
位を付加的に有している。更に有利な実施形においては
、本発明による表現ベクターは外来遺伝子の組込みのた
めに＆　ＩＪ　ＩＪンカー域、丁なわち多数の制限切断
位を有する合成りＮＡ−城を有し、これによシ外来遺伝
子の組込は著しく容易になる。この際、このポリリンカ
ー域も、表現ベクター中に挿入“される外来遺伝子が短
縮α−グルコシダーゼーープロモーターのコントロール
下にある表現ベクター中の位置にある。

系 真核細胞表現°ベクターへの更なる一般的で、公知の要
求に関してはヴインナツカー（Ｌ　Ｌ。

Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ　）著、ｒン・ラント・クローネ（
Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｒｏｎｅ　）　、１９８５年、ケ
ミ−出版（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｊｅ　）、第５及び
８章に記載されている。

調節可能なプロモーターが挿入されている、本発明によ
る表現ベクター中の真核細胞系ＤＮＡとしては、それぞ
れの真核宿主細胞に使用可能なすべてのＤＮＡ−分子、
例えばプラスミド、と−ルス、統合線状ＤＮＡ分子、合
成染色体等である。ＤＮＡがプラスミド又は統合ＤＮＡ
−フラグメントであるのが有利である。ここで、ＤＮＡ
が細胞中に高いコピー数で存在するプラスミドであるの
が特に有利である。酵母細胞中で本発明による表現ベク
ターの発現を実施する場合、ベクターとして細胞中に高
いコピー数で存在する酵母ベクターを使用するのが有利
である。このようなベクターの例はＹＥｐ−及、びＹＲ
ｐ−ベクターである。

この際ＹＥｐ　／　Ｓ　３、ＹＥｐ　／　Ｓ　４及びＹ
Ｅｐ　／　５ｃ６ｂ３が特に有利である。この特に有利
なベクターの製造は例３及び４に記載されている。

同様に、表現すべき遺伝子としてα−グルコンダーゼＰ
Ｉに関する遺伝子を有する本発明による表現ベクターが
特に有利である。

本発明のもう１つの課題は、本発明による真核細胞系表
現ベクターの１つに所望の蛋白質又は遺伝子生産物をコ
ードするＤＮＡ−配列を挿入し、得られたベクターを形
質転換によシ好適な宿主細胞に入れ、該細胞を恒温保持
し、生じた蛋白質又は遺伝子生産物を細胞から又はその
培地から単離することにより、真核宿主細胞中で同質又
は非同質の蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物を調節可
能に製造する方法である。

同質又は非同質蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物を製
造するだめに本発明による真核細胞系表現ベクターを使
用することにより、全α−グルコシダーゼｐＩ−プロモ
ーター域を含有スる表現ベクターを便用する場合より著
しく高い収率が意外にも得られる。所望の蛋白質の表現
は本発明による方法において、有利にグルコースにより
抑制され、マルトースにより誘導される。これにより、
所望の蛋白質の最大表現は宿主細胞の十分なバイオマス
が形成された後はじめて誘導する可能性が生じ、このこ
とにより高い収率が達せられる。

真核細胞系ベクター中にＤＮＡ−配列を挿入する公知法
及び真核細胞の形質転換は例えは前記のヴインナツカー
（Ｅ、　Ｌ、　Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ　）著、ｒン・ラン
ト・クローネ（Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｌｏｎｅ　）、１
９８５年、ケミ−出版（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ　
）、特に第６．５及び８章及びそこに記載されている文
献中に記載されている。

宿主細胞として酵母細胞を使用するのが特に有利な実施
形である。この際、真核細胞系ＤＮＡとして、細胞中に
高いコピー数で存在する酵母プラスミドを有している表
現ベクターを使用することが特に有利である。このよう
な有利な表現ベクターの例はＹＥｐ　／　Ｓろ及びＹＥ
ｐ　／　Ｓ　４である。

更に有利な実施形においては、プロモーター配列に付加
的に正の調節遺伝子、特に有利にＭＡＬ　２−８Ｃｐ−
遺伝子（第６図参照）を有する表現ベクターを使用する
。このような表現ベクターは例えばＹＥｐ　／　５　Ｃ
６ｂろである。

更に有利な実施形においては、表現ベクターに加えて、
細胞中にα−グルコシダーゼｐＩ　−プロモーターを刺
激する、正の調節遺伝子を含有するＤＮＡ−フラグメン
ト又はプラスミドを導入する。このような調節遺伝子は
再び有利にＭＡＬ２−８０ｐ−遺伝子である。

更に有利な実施形においては、自体圧の調節遺伝子（例
えばＭＡＬｐ−遺伝子）を有する宿主細胞を使用し、こ
の際この調節遺伝子が宿主細胞中で過剰表現されている
時、特に有利である。

他の本発明の有利な実施形においては、α−グルコシダ
ーゼＰＩに関するＤＮＡ−配列を本発明による表現ベク
ター中に挿入し、α−グルコシダーゼＰＩを本発明によ
る方法の所望な生産物として単離する。

本発明によシ、容易で廉価な方法で調節することができ
、所望の遺伝子生産物をコードする外来遺伝子をその中
に挿入することのできる表現ベクターを製造することも
、本発明にょシ達せられる。更に、相同及び非相同蛋白
質又は蛋白質含有遺伝子生産物を真核宿主細胞中、荷に
酵母中で製造することを該表現ベクターの使用下に可能
とする方法を創ることが達せられ、この際宿主細胞の増
殖期における最大表机の時点は簡単なしかし効果的な調
節によシ決定される。

実施例 次に実施例につき本発明の詳細な説明する。

Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉ、５ｉａｅ　）がらの
α−グルコシダーゼｐＩ−プロモーター ＤＮＡの操作のためには、マニアティス（Ｍａｎｊａｔ
ｊｓ　）　等によりモレキュラー・クローニング（Ｍｏ
１ｅｃｕ１．ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　；　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｘ　　
Ｃｏ１ｃｌ　　５ｐｒｊｎｃ　　Ｈａｒｂｏｒ、　　　
ＮｅｗＹｏｒｌｃ　）中に記載されている標準法を使用
した。

使用した分子生物学的試薬は製造者の記載に従って使用
した。

Ｓ、セレビシアエをベッグス（Ｂｅｇｇｓ　）の形質転
換法（Ｎａｔｕｒｅ　、第２７５巻、１９７８年、第１
０４〜１０９頁）により形質転換を行なった。

α−グルコシダーゼ比活性の測定 酵母形質転換体及び酵母を最少培地＜　ＹＮＢ（ｙｅａ
ｓｔ　ｎｊｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　、塩／ビタミン混
合物、Ｄｉｆｃｏ社）　０．６７％、ＣＡＡ　（カサミ
ノ酸、蛋白質加水分解物、Ｄ］ｆｃｏ社）０．５％、ア
デニン３０■／ｌ＞及び所望１７）Ｃ−源（２〜６％）
中で培養した。対数増殖期〜後期対数増殖期において培
地５Ｎから細胞をとシ、燐酸塩緩衝液、ｐｉ−１６，８
，１０ミリモル／ｌで１回洗浄し、回転ミキサーで均質
化することによシ砕解し、細胞破片を遠心分離によシ分
離する（ＭＧＧ、第１４５巻、１９７６年、第６２７〜
３６３頁）。

α−グルコシダーゼ比活性の測定はｐ−ニトロフェニル
−α−Ｄ−グルコピラノシドの加水分解（ＭＧＧ、第１
５１巻、１９７７年、第９５〜１０３頁）及びツアーメ
ンホーフ（Ｚａｍｅｎ−ｈｏｆ　）による蛋白質測定（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

第６巻、１９５７年、第７０２頁）により行なう。

例　　１ Ｓ、セレビシアエからのα−グルコシダーゼｐＩ　−ｙ
’ロモーターのクローン化及びＳ、カールスペルダンシ
ス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　）からの同質ＭＡ
Ｌ　６　Ｓ−プロモーターとの配列比較Ｓ、セレビシア
エからのα−グルコシダーゼｐＩ−遺伝子を栄養要求性
マルターゼ構成遺伝子突然変異体ＴＣＹ　７０　（α−
ｍａｌｌ　Ｓ−Δｕｒａ３−５７）（ＭＧＧ、第２００
巻、１９８５年、第１〜８頁）、ＤＳＭ　４３１５の相
補性によシ酵母遺伝子プールから公知法により単離する
。α−グルコシダーゼｐＩ−遺伝子を約３．５　ｋＥｐ
の長さのＤＮＡ−フラグメントで、クローニングのため
に使用した酵母−／Ｅ、コリーシャトルベクターＹＲＵ
　７のＢａｎ　ＨＩ−切断付中に統合した。

ＹＲＵ　７は公知酵母ベクターＹＲｐ　７　（ＰＮＡＳ
　、第７６巻、１９７９年、第１０３５〜１０６９頁；
Ｎａｔｕｒｅ　、第２８２巻、１９７９年、第３９〜４
３頁；　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙ
ｍｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｊｏｌ　、第４３巻、１９７９年、第７７〜９０頁；
Ｇｅｎｅ、第１０巻、１９８０年、第１５７〜１６６頁
）から、このＹＲｐ　７のＰｖｕ　ＩＩ−切断位に、酵
母ベクターＹＥｐ　２４　（Ｇｅｎｅ　％第８巻、頁 １９７９年、第１７〜２４℃Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　
Ｈａｒ−ｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏ’
１．、第４３巻、１９７９年、第７７〜９０頁；Ｇｅｎ
ｅＸ　第２９巻、１９８４年、第１１６〜１２４頁；　
Ｎａｔｕｒｅ　Ｘ第２８６巻、１９８０年、第８６０〜
８６５頁）からのＵＲＡ　３−酵母マーカー（Ｈｉｎｄ
　ｌ−フラグメント、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）−ポ
リメラーゼで突出した５′−末端を満たすことによ？）
　１．１　ｋＢｐ　）を挿入することによシ生じる。こ
のα−グルコシダーゼｐＩ−遺伝子、たけ広げたベクタ
ーＹＲｐ／ＧＬＵＣＰＩを寄託しく　ＤＳＭ　４１７３
　Ｐ　）、第２図中に示した。このα−グルコシダーゼ
ｐＩ−道伝子をチエイン切断反応（Ｄｉｄｅｓｏｘｙ　
ｋｅｔｔｅｎ−ａｂｂｒｕｃｈｒｅａｋｔｉｏｎ　；　
ＰＮＡＳ　、第７４巻、１９７７年、第５４６３〜５４
６７頁；　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｊｏｌ、。

第１４６巻、１９８０年、第１６１〜１７８頁）により
配列決定し、Ｓ、カールスペルケゞンシスからのＭＡＬ
　６　Ｓ　−Ｗルターゼ遺伝子（Ｇｅｎｅ　。

第４１巻、１９８６年、第７５〜８４頁）と比較した（
第１ａ図）。

マルターゼ−もしくはα−グルコシダーゼｐＩ−プロモ
ーターは、マルトースの存在でマルターゼ及びマルトー
スペルミアーゼの相関台成をひきおこす、ｆ方向に活性
なプロモーター（分岐プロモーター）である。この分岐
ＭＡＬ６Ｓ−及びα−ＧＬＵＣＰＩ−プロモーターはマ
ルターゼ及びマルトースペルミアーゼに関するＴＡＴＡ
ボックス、ｍＲＮＡ−開始点及び翻訳開始に関して同じ
である。しかしながら、分岐ＭＡＬ６Ｓ−プロモーター
はα−グルコシダーゼｐＩ−プロモーターの約１．２ｋ
Ｂｐと異なり、わずか約８００　Ｂｐからなる。主な差
はそれぞれ１４７ＢｐのＤＮＡ一部分の３回の繰り返し
である（”トリプレット−リピート”　関連点ＡＴＧ−
グルコシダーゼｐＩ　＋　１において位置−４２７〜−
８６７）。同質プロモーター域において更に３３個のＤ
ＮＡ−配列差が見い出された。ターミネータ−域は非常
に僅かな配列差異を示すにすぎない（第１ａ図及び第１
ｂ図）。

例　　２ 完全なα−グルコシダーゼ−ｐＩ−表現カセットヲ有す
るα−グルコシダーゼｐニー表現ベクターの製造 ”上方活性側（ｕｐｓｔｒｅａｍ　ａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎ５ｉｔｅ）”　構成遺伝子及びターミネータ−を備え
る分岐プロモーターからなる完全α−グルコシダーゼ−
ｐＩ−表現カセットを有するプラスミドＹＲｐ　／　Ｇ
ＬＵＣＰＩ　、ＤＳＭ　４１７３　Ｐを制限エンドヌク
レアーゼＳｃａ　Ｉで消化し、約６．６ｋＢｐの長さの
Ｓｃａ　Ｉ　−フラグメントを単離し、かつＹＥＩ）　
２４から単離した５、６１ｃＢｐ長さのＰｖｕＩＩ　／
　８ｍａ　ｌ−ベクターフラグメント（Ｇｅｎｅ。

第８巻、１９７９年、第１７〜２４頁）に結合する。生
じたプラスミドＹＥｐ／　５　Ｃ１６及びＹＥｐ／　５
　Ｃ１７（第６図Ａ及び第３図Ｂ）はα−グルコシダー
ゼ−ｐＩ−表現カセットヲβ−ラクタマーゼ遺伝子に対
して同じ方向で、もしくは対向方向で有する。構造ＹＥ
ｐ　／　５　Ｃ１２（第３図Ｃ）は２つのα−グルコシ
ダーゼｐＩカセットヲβ−ラクタマーゼ遺伝子に対して
同じ方向に順に（タンデム配列に）接続して有する。こ
のベクターはα−グルコシダーゼｐＩの長さ１０６８　
Ｂｐのプロモーター域、構造遺伝子及びターミネータ−
を有し、マルトースペルミアーゼプロモーター及びこれ
に属するＴＡＴＡボックスを有さないことを特徴とする
（第１ｂ図） これらのα−グルコシダーゼｐＩ表現プラスミド（″′
トリプレットーリピートを有するプロモーター”）を有
する酵母株ＴＣＹ　７０　、ＤＳＭ４６１５、（αｍａ
ｌｉｓ−△ｕｒａ　３−５２　）（ＭＧＧ％第２００巻
、１９８５年、第１〜８頁）及びＡＢＹＳＭＡＬ　８１
　（製造は例７参照）　（ｕｒａ　３−５２ｍａｄ　１
Ｓ−Δ１ｙｓ　ｐｒａ　１　　ｐｒｂ　１　　ｐｒｅ　
１　　ｃｐｓ　１）の形質転換体は最少培地（ＹＮＢ　
Ｏ，６７チ、ＣＡＡＯ０５％、アゾ＝７５０ｍ９／ｌ）
上、グルコース２％の抑制条件下に対数増殖期〜後期対
数増殖期においてわずか０．２０／〜の表現値（α−グ
ルコシダーゼ比活性）を達成する。マルトース誘発（マ
ルトース２チを有する最少培地中での過剰供給）によシ
、約ＩＵ／Ｉｎ９の表現値が達せられた（第７図の表）
α−グルコシダーゼ表現に関しては、これらの転質転換
体は高い遺伝子！（″タンデム配列”での２コピー　１
マルチコピー　−プラスミド）にもかかわらず野生型法
（酵母）とほとんど変わらない。

例　　３ 短縮α−グルコシダーゼＰＩ−プロモーターを有するベ
クターの製造 例１に記載したベクターＹＲｐ　／　Ｃ）ＬＵＣＰＩを
制限エンドヌクレアーゼＳｓｐ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ｌで
消化し、約３．Ｑ　ｋＢｐの長さのＳｓｐ　ｌ　／　Ｈ
ｉｎｄ　Ｉ　−フラグメントを単離し、ＹＥＩ）　２４
から単離したＰｖｕ　ｎ　／　Ｓｐｈ　］−ベクターフ
ラグメントに、Ｈｉｎｄ　Ｉ−制限切断位の突出した５
′−末端を満たし、かつｓｐｈ　ｌ−制限切断位の突出
した６′−末端を切断したあと、フレノウ−ポリメラー
ゼで結合する。生じたプラスミドＹＥｐ　／　Ｓ　３及
びＹＥｐ／ｓ　４　（第６図り及び第６図Ｅ）はα−グ
向力方向含有する。これらは、α−グルコシダーゼプロ
モーターが一３８６位（Ｓｓｐ　１−切断位、関連点Ａ
ＴＧα−グルコシターーゼ＋１）で開始し、こうして６
トリプレツトーリピート”が欠失していることを特徴と
する。

短縮プロモーターを再するα−グルコシダーゼｐＩ表現
プラスミドを有する酵母株ＴＣＹ　７０、ＤＳＭ　４３
１５及びＡＢＹＳＭＡＬ　８１　（例７）の形質転換は
グルコースによシ抑制可能であり（グルコース２チを含
有す条最少培地）、かつマルトース２チを含有する最少
培地で最大誘導が達せられる。β−ラクタマーゼ遺伝子
に対して対向方向において、１．５〜２倍高い比表現値
が達せられる（第１表参照）。

例　　４ 短縮α−グルコシダーゼｐＩ−プロモーターをマルター
ゼ調節遺伝子ＭＡＬ　２−８Ｃｐと組合わせて有スるα
−グルコシダーゼｐＩ−表現デラスミ　ドの製造 ツインマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ　）等により単
離さｎ　（ＭＧＧ　、第１３４巻、１９７４年、第２６
１〜２７２頁）、直前にクローン化された１ｖｌＡＬ　
２−８Ｃｐ突然変異体対立遺伝子（Ｃｕｒｒ、　Ｃ）ｅ
ｎ。

第９巻、１９８５年、第５６９〜５４５頁、配列は第６
図参照）は構成性であるが、史にグルコースにより抑制
可能なＭＡＬ　２　Ｓ−マルターゼの合成に作用する。

この突然変異体対立遺伝子を含有するグラスミドｐＲＭ
２、ＤＳＭ　４３１４　ｐ　（Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎ、第
９巻、１９８５年、第５６９頁〜５４５頁）を制限エン
ドヌクレアーゼＳａｌ　Ｉで消化し、突出した５′−末
端をクレノクボリメラーゼで満たし、Ｂａｎ　Ｈ１−リ
ンカ−（ｄ（ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ）　）　？つけ、Ｅ
ａｍ　Ｈｌで後切断し、約３．１　ｋＢｐの長さのＭＡ
Ｌ２−８０ｐ−遺伝子を含有するＢａｍ　Ｈ１−７ラグ
メン）１単離し、例６に記載し、ＢａｍＨｌで消化した
ベクターＹＥｐ　／　Ｓ　４に結合する。このベクター
構造をＹＥｐ／　５　Ｃ６ｂ　３とする（第図Ｆ）。

短縮α−グルコシダーゼｐＩ−プロモーターを有するプ
ラスミド上のＭＡＬ　２−８０ｐ−遺伝子の存在は形質
転換体の成長に影響を与えず、すべての使用した培地上
で（例２参照）１．５〜２倍の表現値（第７囚の表）に
導ひく。更に、選択的にμＬ　２−８０ｐ−遺伝子を形
質転換によシ酵母中に取シ込み、その効果を生じさせる
こともできる。

例　　５ 抑制性基質グルコースの使用によシブラスミドをコード
するα−グルコシダーゼのグルコース抑制及び抑制解除 ＡＢＹＳＭＡＬ　８１−形質転換体における最少培地中
でのグルコース使用によるα−グルコシダーゼｐＩの抑
制解除を例えば種々の異なるα−グルコシタ“−ゼ表机
カセットＹＥｐ／　５　Ｃ１６、ＹＥｐ　／　Ｓ　４及
びＹＥｐ　／　５　Ｃ６ｂ　３に関して抑制解除動力学
（第４図）１−記録することにより測定する。５５０　
ｎｍにおける混濁につき、細膳成長をかつα−グルコシ
ダーゼ比活性を約６０時間の量測定した。同様にグルコ
ース消費の時点を調べた。

α−グルコシダーゼｐＩ−プロモーター構造及びＭＡＬ
　２−８’ｐの存在に依存せずに、グルコース消費の後
α−グルコシダーゼｐＩ−比活性は２０時間で５〜１０
のファクターだけ上昇する（第４図）。プロモーターの
短縮又は／及びＭＡＬ　２−８０ｐ−遺伝子の存在は達
成すべき最大α−グルコシダーゼｐニー比活性を調節す
る。

例　　６ α−グルコシダーゼｐＩ−表現カセットの使用下に、α
−グルコシダーゼのＮ−末端部とＨＩＶ　ｉ−抗原から
なる融合蛋白質の非同質表現α−グルコシダーゼＰＩ−
表現ベクター、ＹＥｐ１５Ｃ６ｂ３（例４）中で、α−
グルコシダーゼＰＩの約８０チに関してコードする、長
さ１．４１ｃＢｐ５．のＢｇｌ　ｌ　−フラグメントを
ＨＩＶ　１−　Ｖトロウィルスのｇｐ　４１−膜蛋白質
の１部をコードする、長さ約３００　ＢｐのＤＮＡ−フ
ラグメントと交換する。このためには長さ約３００　Ｂ
ｐＲｓａ　ｌ　／　Ｈｉｎｄ　ｌ−フラグメント（配列
比較；Ｃｅ１ｌ第４５．１９８６年　第６６７〜６４８
頁の第１−からの１６６８位〜１９４６位のＷＭＪ　−
１の配列）　ｔ−Ｈｌｎｃ　ｌ及びＨｉｎｄ　ｌで消化
したＥ、コリーベクターｐＵ０１８　（Ｍ１３ｍｐ　１
８及びｐＵＣｉ　９配列；Ｇｅｎｅ、第６６巻、１９８
５年、第１０３〜１１９頁）中にサブクローン化する（
構造：　ｐＵＣ１８ＨＲＨ，３００）。ｐＵｃ１８ＨＲ
Ｈ，３００から長さ約３２０　ＢｐのＢａｎ　Ｈｌ　／
Ｈｊｎｄｌ−フラグメントを単離し、長さ約５．２Ｂｐ
のｐＵＲ２７８Ｂａｍ　Ｈ１／　−Ｈｉｎｄ　Ｉ−ベク
ターフラグメントに連結する（　ＥＭＢＯ第２巻、１９
８６年、第１７９１〜１７９４頁中の配列）（構造：　
ｐＵＲ２７８ＨＲＨ，３００）。グラスミドｐＵＲ２７
８ＨＲＨ，３００をＨｉｎｄ　ｌで消化し、突出した５
′−末端を６クレノウ・ポリメラービで満たし、配列ｄ
（ＧＯ（）ＡＴＣＣＣ）のＢａｍ　ＨＩ−リンカ−をつ
ける。その後Ｂａｎ　ＨＩで後切断し、長さ約３００　
ＢｐのＢａｎ　ＨＩ−フラグメントを単離し、長さ約１
１ｋＢｐのＹＥｐ　／　５　Ｃ６ｂ　３−８ｇ１■−ベ
クターフラグメントに連結する。ｇｐ　４１−膜ポリベ
デチドーＤＮＡの正しい方向付けにおいて、α−グルコ
シダーゼのＮ−末端（アミノ酸５０個）、融合位での構
造限定アミノ酸４イ臥ｇｐ　４１−膜蛋白質のアミノ酸
１０１個及びＣ−末端の構造限定アミノ酸３個からなる
分子全豹１８５００Ｄの融合蛋白質が生じる。所望の構
造を、プロテアーゼ欠損酵母表机株ＡＢＹＳＭＡＬ８１
、例７中で表現された融合蛋白質を弁して形質転換及び
培養により（下と比較）、引き続きＳＤＳ　−ｒルミ気
泳動及び人ＨＩＶ　１−血清との免疫反応性によるウェ
スタンプロットにより単離する。融合蛋白質は全蛋白質
の約５チまで表現され、５Ｄｓ−Ｚ’Ｊアクリルアミド
グル中で支配的なバンドとしてクーマシー（ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅ　）−染色により可視となった（第５図）。α
−Ｇｌｕｃ、　ＰＩ　−ｇｐ　４１−融合蛋白質の表現
のためには転質転換体をグルコース２チ及びマルトース
２％を含有する選択培地（ＹＮＢ　Ｏ，６７％、ＣＡＡ
ｏ、５％、アデニン６０■／ｌ）上で培養する。１０〜
２０時間の誘導時間後（グルコース消費後）、細胞を収
獲する。

例　　７ サツカロマイセス株ＡＢＹＳＭＡＬ　８１の製造のため
にハブロイド・サツカロマイセス・セレビシアエ（ｈａ
ｐｌｏｉｄｅ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　）株ＡＢＹＳＤ　−１１（ａ　ｐｒａ　
１　　ｐｒｂ　１　　ｐｒｃ　１ｐｒｄ　１、ｃｐｓ　
ｉ、ａｄｓ　ＩＹＳ　ｈｉｓ　７　）、ＤＳＭ４３２２
（これはプロテアーゼに関してはＡｌＢ及びＤｔ及びカ
ルボキシペプチダーゼＹ及びｓ’ｌ欠失しており、かつ
付加的にアデニン−ヒスチジン−及びリジン−生合成に
おける栄養要求性を有する）とサツカロマイセス・カー
ルスペルダンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａ
ｒＩＳｂｅｒｇｅｎ−ｓｉｓ　）株、ＴＣＹ２８２４−
１Ａ％　　（αｍａｌ　ｉ　Ｓ−Δｕｒａ３−５２ｈｉ
ｓ４）、ＤＳＭ４３１７（これは欠失α−グルコシダー
ゼ−構造遺伝子により及びウラシル−及びヒスチジン−
生合成における栄養要求性により特徴付けられている）
とを交配した。

引き続き、胞子形成を実施し、生じた酵母−分離体をそ
の栄養要求性に関して種々の選択培地上にぬることによ
り、かつそのプロテアーゼ欠失に関して細胞溶解物中の
プロテアーゼ活性の測定により試験した。株ＡＢＹＳＭ
ＡＬ　８１　（ｕｒａ３−　５２、　ｍａｘ　　ｉ　　
ｓ　−ΔＩＹＳ　ｐｒａ　１　　ｐｒｂ　１ｐｒｅ　１
ｃｐｓ　１　）を次の方法によシ同定する。

プロテアーゼ欠失の証明 分離体ｉ　ＹＥＰＤ−培地（酵母抽出物１チ、ペプトン
２チ、グルコース２％）５ａｔ中で培養し、細胞を後期
対数増殖期〜早期定常期までに収獲し、水で２回洗浄し
、ガラス球と共に回転ミキサー上で均質にすることによ
シ砕解する（　ＭＧＧ第１４５巻、１９７６年、第３２
７〜３６３頁）。

該細胞を２０ミリモル／ｌトリス（ＨＣｔ）、ｐＨ７，
０で抽出し、遠心分離後の上澄を粗抽出物として、この
先便用する。プロテアーゼの活性化のためには粗抽出物
’ｔｐ）１５に調整し、２５°Ｃで２４時間恒温保持す
る。

プロテアーゼ欠失欠失（ｐｒｙ　１　）の証明細胞抽出
物による１、２％酸変性ヘモグロビン、−３，０の加水
分解なしく　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第４２
巻、１９７４年、第６２１〜６２６頁）。

１．２％酸変性ヘモグロビンを含有する０、１モル／ｌ
乳酸塩緩衝剤Ｑ、５ｍＡを細胞溶解物（３，１ａｔと共
に２５°Ｃで恒温保持する。６０分後に反応を１０％ト
リクロル酢酸０．５ｍｌで中止し、遠心分離後トリクロ
ル酢酸溶解性生成物を２８３ｎｍで吸光測定するか、又
はマクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ　）及びチェノ（Ｃ
ｈｅｎ　）による改変ホリン測定（Ａｎａｌ　Ｂｊｏｃ
ｈｅｍ、第１０巻、１９６５年、第１７５〜１７７頁）
により測定する。

比活性の計算のためにはツアーメンホーフ（Ｚａｈｍｅ
ｎｈｏｆ　）による蛋白質測定を実施しだ（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、第６巻、１９５７年、第７０２
頁）。

酸変性ヘモグロビンに対する細胞溶解物の加水分解比活
性が野性型との比較において５チより低く低下する時、
プロテアーゼＡ欠失は存在する。

プロテアーゼロー欠失の証明（ｐｒｂ　１　）ｐＨ７に
おける２、４％アゾコール（ＡＺＯＣＯＩＩ　）の、細
胞抽出物による加水分層なしく　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、第４２巻、１９７４年、第６２１〜６
２６頁）。

燐酸塩緩衝液、ｐＨ７，００，１そル／ｌ中の２．４％
アゾコール懸濁液Ｑ、５ｍｌを細胞溶解物Ｑ、１ｍｌと
共に２５℃で振盪下に恒温保持する。

プロテアーゼＢの活性化のために活性測定前に粗抽出物
にナトリウムドデシルスルフェート（最終濃度０．２５
　％　）を混合する。

３０分後に１０　％　）　ＩＪクロル酢酸Ｑ、５ｎｌを
添加して反応を中止し、遠心分離の後、上澄の５５０　
ｎｍにおける吸光度を測定する。

アゾコールに対する細胞溶解物の加水分解比活性が野生
型との比較において５チよシ低くまで低下されている時
、プロテアーゼＢ−欠失が存在する。

プロテアーゼＤ−欠失（ｐｒｄ　１　）の証明アミノペ
プチダーゼＭの存在において、トリス−マレエート緩ｍ
液ｐＨ７，０５０ミリモル／ｌ中の０．５ミリモル／　
７１　　Ｂｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＡ（Ｂｅｎ
ｚｏｙｔ−Ｌ−Ｐｒｏｌｙｔ−Ｌ−ｐｈｅｎｙＡａｔａ
ｎｙｔ−Ｌ−ａｒｇｉｎｙｌ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌ
ｊｄ　）の、細胞抽出物にヨル加水分解なしく　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第２６０巻、１９８５年、第４
５８５〜４５９０頁）。

テスト原理： Ｂｚ−Ｐｒｏ＋Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＡ Ｐｈｅ＋Ａｒｇ＋４−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｏ、５モ
ル／ｌトリスーマレエート緩衝液、…７．０．０．０３
ＪＩＩＪを１Ｑ　ｍｍｏｔ／　ｌ　　Ｂｚ−ｐ７ｇ−Ｎ
Ａ　（ジメチルスルホキシド中に溶解）０．０１５紅、
アミノペプチダーゼ１０μ１（４０μｇ、２４０　ｍＵ
　）、水０−１４５ｍｇ及び粗抽出物０．１ａｔと混合
し、試薬空値に対して４０５　ｎｍで吸光変化を測定す
る。

Ｂｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＡに対する加水分解
比活性が野性桑株と比較して１０チより低く低下する時
、プロテアーゼＤ−欠失が存在する。

カルボキシペプチダーゼＹ−欠失（ｐｒｃ　１　）の証
明 ペン・戸イルーＬ−チロシンー４−ニトロアニリド、Ｐ
Ｈ７，０，５ミリモル／ｌの、細胞抽出物による加水分
解なしく　Ａｇｒ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第３５巻
、１９７１年、第６５８〜６６６頁）。

デオキシコレートで活性化した（最終濃度０．５　％　
）粗抽出物０．１　ｍｔ金０．１−Ｅｌｋ／　ｌ燐酸塩
緩衝液、ｐＨ７，０，１０ｆｆｉｔ及び３ミリモル／ｌ
ベンソイルーＬ−チロシン−４−ニトロアニリド（ジメ
チルホルムアミド中に溶ｍ）０．２１１と２５°Ｃで恒
温保持した。１０分後に反応を１ミリモル／ｌ塩化水銀
１μで中止し、遊離したｐ−ニトロアニリンに４１０ｎ
ｍで測定した。

ペンソイル−Ｌ−チロシン−４−ニトロアニリドに対す
る加水分解比活性が野性桑株と比較して５チより低くま
で低下した時、カルボキシペプチダーゼＳ−欠失は存在
する。

カルボキシペプチダーゼＳ−欠失（ｃｐｓ　１　）の証
明 ｐＨ７，４におけるＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　（ベンジ
ルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−ロイシン）の、細
胞抽出物による加水分解、引き続くＬ−アミノ酸オキシ
ダーゼ−ペルオキシダーゼテストにおける遊離したロイ
シンの分析において加水分解なしく　Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｊｏｃｈｅｍ、第７３巻（１９７７）、第５５３〜５
５６頁） 試験液（Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ０．２５〜７ｍｌ、
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ０．４ｒｎＩ２／批及び
ＭｎＣ４２ｏ、ｓミリモｋ　／　ｌ　）　Ｑ、５　ｍｔ
、２７．５ミリモｈ　／　ｌ　Ｃｂｚ−Ｇａｙ−Ｌｅｕ
溶液０．４１ｎｌ　（０，２モル／１ｆｉ４酸緩価液、
ｐｉ−１７，０中に溶解）、ｏ−ジアニシジンジヒドロ
クロリド（２〜７ｍｌ、　Ｈ２Ｏ中に溶’Ｍ）　０．０
５ｍ１−、　２２　ミ’Ｊ　％ル／　ｌフェニルメチル
スルホニルフルオＩＪ　）’　０．０５　ｍｔｋＵ透析
した細胞溶ｍ物０．１　ＭＥ　（透析：０．１モル／ｌ
イミタｆ−ルクｏリド、ｐＨ５，３，２４時間、２５°
Ｃ）ｋ混合し、４０５　ｎｍで吸光変化を測定。

Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕに対する加水分解比活性が野性
桑株との比較において５％より低く低下する時、カルボ
キシペプチダーゼＹ−欠失が存在する。

前記の証明によシ、株ＡＢＹＳＭＡＬ　８１はプロテア
ーゼＡ、Ｂ及びカルボキシペプチダーゼＹ及びＳに関し
て欠失していることが確認された。

マルトース利用−栄養要求性の証明 酵母窒素塩基（ＹＮＢ、塩−ビタミン混合物、ｐｉ　ｆ
ｃｏ社）０．６７％、カサアミノＦＲ（ＣＡＡ　、蛋白
質加水分解物、Ｄｊｆｃｏ社）０．５％、マルトース２
％　（Ｋ−のＣ−源）、ウラ”ｋ２０ｍ９／１及びアデ
ニン３０ｍ９／ｌを含有する合成完全培地Ｉ上に成長せ
ず。

ウラシル栄養要求性の証明 ＹＮＢ　Ｏ，６７％、ＣＡＡｏ、５％、グルコース２％
（唯一のＣ−源）及びアデニン３０■／ｌ’（含有する
合成完全培地Ｕ上で成長せず。

リジン−栄養要求性の証明 ウラシル（２０■／ｌ）を含有するがリジンは含有しな
い合成完全培地１　（ＣＡＡ　Ｑ、５％のかわりにリジ
ンを含有しないアミノ酸混合物を使用）上で成長せず。

ヒスチジン−及びアデニン−原栄養性の証明ウラシルＣ
２０ｍＱ／ｌ）’ｃ金含有、アデニンを含有せず、かつ
ヒスチジンを含有しないＣＣＡＡ　０．５　％の刀＼わ
りにヒスチジン不含アミノ酸混合物を使用した）包成完
全培地■上での成長。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はＭＡＬ６Ｓマルターゼ遺伝子に比較したα−
グルコシダーゼｐＩ−遺伝子のＤＮＡ配列を示す図を表
わし、第１ｂ図はＭＡＬ６Ｓとの比較におけるＧＬＵＣ
ＰＩのプロモーター構成を示す（Ｃｏｈｅｎ等著、Ｍ（
）Ｇ　）第２００巻、第１〜８頁、１９８５年、ＨＯｎ
ｇ及びＨａｒｍｕｒ著、Ｇｅｎｅ　％第４１巻、第７５
〜８４頁（１９８６年）参照）図である。第２図はプラ
スミドＹＲｐ　／　ＧＬＵＣＰＩの概略図であり、第６
図は例中で製造したベクター構造を概略的に示す図であ
り、Ａ−ＦはそれぞれｙＥｐ　／　５　Ｃ１６、ＹＥＩ
）　／　５　Ｃ１７、ＹＥｐ１５Ｃ１２、ＹＥｐ　／　
Ｓ　３、ｙｇｐ　／　Ｓ　４及びＹＥｐ１５Ｃ６１）３
を表わす。図面中の数値はＥｃ　ｏＲＩ消化による制限
フラグメントの大きさに関連する。 第４図は囚真正α−グルコシダーゼープロモーター、（
Ｂ）短Ｍ形α−グルコシダーゼープロモーター及び（Ｃ
）短縮形で、ＭＡＩ、２−８Ｃｐ刺激α−グルコシダー
ゼプロモーターの調節における、グルコース最小培地中
でのＡＢＹＳＭＡＬ　８１形質転換体のα−グルコシダ
ーゼｐＩの抑制解除曲線を示す図である。 第５図は宿主株ＡＢＹＳＭＡＬ　８１中で表現されたα
−グルコシダーゼｐＩ　−ｅｎｖ−融合蛋白質の５ＤＳ
−ポリアクリルアミドグル電気泳動分析を示す図であり
、Ａ及びＢはそれぞれクーマシー染色及び免疫プロット
分析によるものである。 第６図はＩＪＡＬ　２−８Ｃｐ−遺伝子のＤＮＡ−配列
を示す図である。第７図は酵母α−グルコシダーゼ−形
質転換体の挙動に関する表を示す図である。 図面の浄書（内容に変更なし） ＜−−−−−−−−−−−−マルトスＡＦＩｋ１７−妃
１ＣＯＮＳ。 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−ＧＡＴ　ＣＴＣＡＴＣＴＭＧＣＯＮＳ。 ＧＡＴＡＣＣＭＴＡ　ＣＧＡＡＴＡＧＡＣＣＴＴＧＧＣ
ＴＡＴＡＧ　ＴＡＡＧＴＴＧＣＡＴ一−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−°−−−−−−−−−−−−″
−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−
土Ｃ０Ｎ５゜ Ａ　ＧＴＴ−ＭＧＴＴＴ　ＡＣＡＧＧＡＴＴＴＡ　ＴＣ
ＣＧＧＡＡ−ＴＴ　ＴＴＣＧ−ＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡ
ＣＭＴ　Ｔ−ＭＧＭＴＴＧＣＯＮＳ。 ＣＧＴＡＡＧＡＴＧＡ　ＧＴＡＧＴＴＣＣＴＴ　ＣＣＴ
ＣＭＴＴＣＴ　ＴＣＴＴ−ＣＡＧＣ／ＬＬＩＮ）。 Ａｔ、ＬへＬ（，１八ＵＡ　　ＩにＧＡＧＡＡＩＣＡ　
　ＣＧＡＴＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＣＡＡＴＴＡ　　ＣＧ
ＡＧＡＴＴＴＧＣＩｉＡＬらＡＩ　Ｉに［ｉ　　（：Ｌ
ＡＡＡＧＩＡＣＣＧＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＭＧＣ
ＴＧ　　ＴＴＡＡＣＡＴＴＧＣＣ０Ｎ５゜ ＧＧＣＧＡＡＧＡＭ　　ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧ　　ＣＣ
ＴＣＣＣＡＡＧＡ　　ＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴ　　ＣＴＴ
ＴＡＴＣＴＴＴ　　ＴＡＴＴＣＴＴＧＧＡ　　ＡＡＴＴ
ＡＴＧＡＴＧ　　ＡＴＡＣＴＧＡＣＧＴ　　【１ＣＣＩ
ＣＣＡＧＡ　　Ｇ１１ｌｌらＡＡＡＵＣＯＮＳ。 ＣＡＴＧＧＧＭＧＧ　ＴＡＧＭＴＣＴＡＣＣＴＣＧＴＣ
ＡＡＡＴ　ＡＡＡＡＴＴＡＣＪＡ　ＧＣＡＣＴＧＴＴＧ
Ａ　ＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴ　ＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧ　Ｇ
ＧＴＡＡＡＴＧＴＧ　ＴＴＴＴＴＣＴＡＣＡ、ＴＧＡ−
ＣＣ−ＣＧＴニＭ　　ＡＴＴＡＴＴＭＴＧ　　ＭＧＣＡ
ＴＡＡＧＡ　　ＡＧＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ
ＣＧ　　ＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡ　　ＡＧＧＧＡＧＡＡＧ
ＡＣＯＮＳ。 ＴＣＡＴＴＡＴＧ−Ｔ　ＡＴＴＴＡＧＣＧＴＧ　ＴＡＴ
ＡＴＡＡＡＴＧ　ＴＧＭＴＴＣＬＵＣＰＩ ＭＣＣＴＧＴＧＣＴ　ＧＧＴＡＴＴＭＴＧ　ＣＴＧＧＭ
ＴＧＴＣＴＴＧＣＴＭＧＭ　ＴＣＡＴＡＣＭＧＧ　ＴＧ
ＧＴＡＧＴＴＴＴ　ＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡ　ＧＡＡＡＡ
ＧＡＡＡＡ　ＧＧＡＣＴＡＧＡＴＡ　ＴＡＡＡＩ猜ＧＴ
ＧＡＬｕＣＰＩ ：１ ＭＴＧＭＴＡＴＡ　ＡＧＡＴＡＧＣＧＴＴ　ＡＡＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴデ ＩＰｖｕＩＩｌ Ｆｉｇ、４ （↓）グ°νレコースｊけ ＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴ　ｉ’ｃｃｃｒｃＭｃＡＡＣＭＣ
τＣＡＧＡ　ＡｃｃＡＡＡｃＴｒＴＡＣＴＡＴ１ゴＡＣ
Ｔ　ＴＣＴｒＡＴＣＡＣＡＴＣＣ （ＴｒＣＡＣＡＡＣＡ　ＧＡＩ℃Ｃα１℃Ｔ　ＴＣＣＣ
ＣＣＴｒＣＡ手 続。 補 正 書（方式）−鉢碍苓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、調節可能なプロモーターを真核細胞系ＤＮＡ中に挿
   入して有する真核細胞系表現ベクターにおいて、プロモ
   ーターとしてα−グルコシダーゼｐＩ−プロモーター域
   のＤＮＡ−配列を短縮形で含有し、この際少なくとも該
   ヌクレオチド−８６７の全上方域が、そして最高で該ヌ
   クレオチド−１４０の全上方域が欠失していることを特
   徴とする真核細胞系表現ベクター。 ２、α−グルコシダーゼｐＩ−プロモーター域の短縮Ｄ
   ＮＡ−配列においてヌクレオチド−４２７の全上方配列
   が欠失している請求項１による真核細胞系表現ベクター
   。 ３、α−グルコシダーゼｐＩ−プロモーター域の短縮Ｄ
   ＮＡ−配列においてヌクレオチド−３８６の全上方配列
   が欠失している請求項１による真核細胞系表現ベクター
   。 ４、付加的に正の調節遺伝子（ＭＡＬｐ−Ｇｅｎ）、特
   にＭＡＬ２−８＾Ｃｐ−遺伝子を含有する請求項１から
   ６までのいずれか１項記載の真核細胞系表現ベクター。 ５、表現すべき外来遺伝子としてα−グルコシダーゼＰ
   Ｉに関する遺伝子を含有する請求項１から４のいずれか
   １項記載の表現ベクター。 ６、表現ベクターＹＥｐ／Ｓ３である請求項１による真
   核細胞系表現ベクター。 ７、表現ベクターＹＥｐ／Ｓ４である請求項１による真
   核細胞系表現ベクター。 ８、表現ベクターＹＥｐ／５Ｃ６ｂ３である請求項１に
   よる真核細胞系表現ベクター。 ９、真核宿主細胞中で相同及び非相同蛋白質又は蛋白質
   含有遺伝子生産物を調節可能に製造する方法において、
   請求項１から４による真核細胞系表現ベクター中に所望
   の蛋白質又は遺伝子生産物をコードするＤＮＡ−配列を
   挿入し、得られたベクター又は請求項５から８の１項に
   記載の表現ベクターを形質転換により好適な宿主細胞中
   に導入し、該細胞を培養し、生じた蛋白質又は遺伝子生
   産物を細胞又はその培地から単離することを特徴とする
   真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含
   有遺伝子生産物の調節可能な製法。 １０、請求項１から３及び６又は７による表現ベクター
   を使用し、かつ該宿主細胞中に、正の調節遺伝子、特に
   ＭＡＬ−２−８＾Ｃｐ−遺伝子を含有する、プラスミド
   又は統合ＤＮＡ−フラグメントを導入することを特徴と
   する請求項９による方法。 １１、所望の遺伝子生産物としてα−グルコシダーゼＰ
   ＩのＤＮＡ−配列を挿入する請求項９又は１０記載の方
   法。