KR0140973B1

KR0140973B1 - N-글리코실화에 결함이 있는 효모 숙주 균주

Info

Publication number: KR0140973B1
Application number: KR1019930015252A
Authority: KR
Inventors: 레흐레 루드빅; 레네르트 클라우스; 코페츠키 에르하르트
Original assignee: 콜프 융; 뵈링거 만하임 게엠베하
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1998-06-15
Also published as: NO312246B1; AU657230B2; CA2103522C; DE4301932A1; KR940004051A; IL106589A0; FI110006B; EP0582244A2; AU4435493A; NO932811L; IL106589A; US5705616A; CA2103522A1; ATE207955T1; EP0582244B1; JP2984229B2; NZ248323A; NO932811D0; JPH06296482A; JP2675511B2

Abstract

본 발명은 [³H]-만노오스 자멸선택,

하나 또는 여러개의 선택적 마아커의 도입,

플라스미드 YEpL/GOD 를 이용한 형질전환 및 표준조건하에 배양된 후 배양배지로 10mg/ℓ 또는 그 이상의 GOD 를 분히하고, 백주효모균 DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 및/또는 DSM 7340의 ngd 돌연변이에 대립성이고 균일한 탄수화물 구조를 갖는 단백질을 분비하는 균주들의 선택에 의해 얻을 수 있는 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 균주에 관한 것이다.

Description

N-글리코실화에 결함이 있는 효모 숙주 균주

제 1도는 α-글루코시다아제 벡터인 YEp/5c6b3(12466 염기쌍)의 제한 지도이고,

제 2도는 사카로마이세스 세레비시아에서 아스페르길루스 니거 GOD의 분비를 위한 플라스미드를 제조하기 위한 출발 벡터인 YEpL(10717 염기쌍 ; 효모 발현벡터)의 제한 지도이며,

제 3도는 본 발명의 플라스미드 YEpL/GOD(12528 염기쌍)의 제한 지도이다.

본 발명은 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 숙주 균주, 및 균일하게 글리코실화된 단백질의 발현에 상기 균주를 사용하는 방법에 관한 것이다.

단백질의 번역(translation)후에 탄수화물을 제공할 수 있는 방법은 다음의 3가지 방법들로 구별된다 :

* N-글리코실화 : Asn 에 대한 탄수화물 사슬의 N-글로코시드 연결;

* O-글리코실화 : Thr 또는 Ser에 대한 탄수화물 사슬의 O-글리코시드 연결;

*글리코실-포스파티딜-이노시톨 앵커(GPI) :

-일부 막 단백질의 성분

-GPI 앵커는 인지질 막에 GPI를 삽입시키는 작용을 한다.

단백질의 글리코실화는 예컨대 하기 참고 문헌들에 개시되어 있다 :

-Kukuruzinska, M.A. 등, Ann. Rev. Biochem. 56(1987) 915-944;

-Paulson, C.P., TIBS 14 (1989) 272-276;

-Warren, C.E., BFE 7 (1990) 392-395;

-Ballou, C.E., Strathern, J.N., 등, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 355-360 (1982).

-Kornfeld, R.; Kornfeld, S., Ann. Rev. Biochem 54 (1985) 631-664;

-Tanner, W.; Lehle, L., Biochim. Biophys. Acta 906 (1987) 81-99;

-Innis, M.A., Barr, P.J. 등, Yeast genetic engineerign, Butterworths, Stoneham, Mass, pp. 233-246 (1989).

효모 단백잘의 O-글리코시드 탄수화물 구조는 1 내지 5 개의 만노오스 잔기의 분지되지 않은 만노오스 사슬로 구성된다. O-글리코실화는 ER(망상체)에서 시작되어(제 1 만노오스 잔기의 수송) 골지체(Golgi apparatus)에서 완료된다.

N-글리코실화는 2단계로 일어난다. N-아세틸글루코사민, 만노오스 및 글루코오스의 핵심단위체는 지질 담체 중간체 상에서 구성되어, ER에서 당단백질의 Asn 잔기에 전달된다. 단백질에 결합된 핵심 단위체가 공정(ER내에서 글루코오스 잔기와 특정 만노오스 잔기의 절단)처리된 후, 당의 구조는 골지체에서 신장된다(외부 사슬글리코실화). 외부사슬 글리코실화의 구조는 유기체에 특이적인 것이다.

분비된 효모 단백질의 외부사슬 글리코실화는 고도의 몬노오스 타입이다. 즉, 이것은 긴 폴리만노오스 올리고당 사슬로 구성된다. 또한, 효모에서 이종구조로 분비되는 단백질에는 고도의 만노오스 타입의 효모 특이적 외부사슬 글리코실화가 제공되며, 이는 고도의 글리코실화(hyperglycosylation)로 표시된다. 많은 경우에, 이 현상은 이종 단백질 생성물(탄수화물 부분, 분자량)의 형성을 초래하기 때문에 바람직하지 못하다. 더욱이, 상기 이종 탄수화물 부분은 단백질 정제를 복제하게 할 수 있다. 글리코실화는 입체적인 이유로 번역후 프로세싱(예를들면, 천연 단백질을 형성하기 위한 프레프로 세그먼트의 단백질 가수분해성 절단에 의한 프레프로단백질의 성숙)을 지체 또는 방해하거나 절단 효율을 감소시킬 수 있다[Bekkers, A.C.A.P.A. 등, Boichem. Biophys, Acta 1089(1991) 345-351]. 또한, 고도로 글리코실화된 효소들의 비활성(比活性)(유니트/중량 유니트)은 탄수화물의 증가 부분에 의해 저하된다. 더욱이, 효모 특이적 외부사슬 글리코실화는 치료적용에서 바람직하지 못한 강력한 면역원성을 보인다.

아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)로부터 유도되는 글루코오스 옥시다아제(GOD)는 자연적으로 분비되는 N-글리코실화 동종이합체(homodimer)이다 (분자량/하위단위체(SU): 약 80kDa, 보조인자 : 1FAD/SU, 1 ss 브리지/SU). 사카로마이세스 세레비시아에서 이종구조로 발현된 GOD는 배지에서 매우 효과적으로 분비된다. 상기 효소는 효소적으로는 활성이지만, 탄수화물 부분과 분자량에 관해서는, 150개 까지의 만노오스 잔기들의 불균일한 외부 사슬 글리코실화로 인해 이질적이다. 대조적으로, 아스페르길루스 니거로부터 분리된 GOD는 비교적 균일한 탄수화물 구조(코아 글리코실화)를 갖는다[Kriechbaum, M. 등, FEBS Leff 255(1989) 63-66; Frederick, K.R. et al, J. Biol. Chem. 265(1990) 3793-3802; De Baetselier, A. 등, Biotechnology 9(1991) 559-561; Whittington, H. 등, Curr. Genet. 18(199) 531-536; Rosenberg, S., WO89/12675].

또한, 효모에서 발현 및 분비된 GOD는 고도의 글리코실화 때문에 아스페르길루스 니거에서 분리된 효소에 비해 비활성(比活性)(유니트/9 효소)이 더 낮다. 아스케르길루스 니거에서 분비된 GOD는 상대적으로 균일한 탄수화물 구조(코아형 글리코실화, 분자량/SU : 약 80 kDa)를 갖는다.

또한 분비된 효모 단백질의 N-글리코실화는 대체로 균일하지 못하다. 이 현상은 예를들어 외부 사카로마이세스 세레비시아 전화효소(invertase)에 대해 공지되어 있다[Reddy, V.A. 등, J. Biol. Chem. 263(1988) 6978-6985; Ziegler, F.D. 등, Biol Chem. 263(1988) 6978-6985]. 전화효소의 14개의 잠재적인 시쿠온(Sequon, 글리코실화 부위, 아미노산 서열 패턴 : Asn-X-Ser /Thr)중에서 13개가 완전히 또는 부분적으로 글리코실화된다. 그러나, 전화효소 하위단위체 당 사용되는 13 시쿠온 중 평균 9~10개만이 글리코실화된다. 단백질 서열에 의해 규정되는 시코온은 i) 항상 글리코실화 되거나, ii) 전혀 글리코실화되지 않거나, 또는 iii) 단지 때때로 글리코실화될 수 있다. 또한 규정된 시쿠온은 짧은 올리고당 사슬(GlcNAc₂Man_8-15) 또는 긴 폴리만노오스 올리고당 사슬(GlcNAc₂Man_50-100)중 하나를 가진다. 관찰된 전화효소의 이질성 N-글리코실화는 다음의 요인에 의해 유발된다:

i) 분자 당 사용될 수 있는 시쿠온의 단지 부분적 글리코실화(예컨대 사용될 수 있는 3 또는 5개의 시쿠온만이 순전히 무작위로 글리코실화 됨),

ii) 짧은 코아 올리고당 및 긴 폴리만노오스 사슬(외부 사슬)의 존재,

iii) 외부사슬의 사슬 길이 변동.

탄수화물 부분이 감소되었거나 결여된, 즉 탄수화물 부분이 균질한 당단백질을 얻기 위해, 하기의 방법들이 공지되어 있다 :

* 글리코실화 억제제(예컨대 투니카마이신; tunicamycin) 또는 소낭 수송의 억제제(예컨대 브레펠딘 A : Brefeldin A)의 존재하에, 당단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키는 방법,

* 예컨대 엔도 F 글리코시다아제 또는/및 엔도 H 글리코시아다제 또는/및 엔도 N-글로코시다아제 F를 이용하여 단백질을 시험관 조건에서 효소에 의해 탈글리코실화시키는 방법,

* DNA 수준에서 돌연변이를 발생시켜 글리코실화 부위를 제거/변형 시키는 방법, 및

* 글리코실화에 결함이 있는 숙주 균주를 사용하는 방법.

N-글리코실화에 변화가 있는 효모 돌연변이체들은 공지되어 있다. 분비가 차단된 분비 돌연변이체들과 N-글리코실화가 변경된 단백질을 분비하는 돌연변이체들은 서로 구별된다.

분비 돌연변이체들은 분비 기작이 국소적으로 차단되어 있고, 그 결과 불완전하게 N-글리코실화된 단백질이 해당 세포 구획에 축적된다. 이러한 돌연변이체의 실례는 다음과 같다 :

* 알. 쉬크맨(R. Schekman)의 sec 돌연변이체(분비 결함)[Novick, P. 등, Cell 21 (1980) 205-215; Schekman, R. and Novick, P., In: Strathern, J. N. 등, The Molecular Biology fo the Yeast Saccharomyces. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 361-398(1982)];

* 에스. 페로-노빅(S. Ferro-Novick)의 bet 돌연변이체(초기 수송단계에서 차단됨)[Ferron-Novick, S. and Newman A.P., J. Cell. Biol. 105 (1987) 1587-1594] ;

* 디. 갈위츠(D. Gallwitz)의 ypt1 돌연변이체[Schmitt, H.D. 등, Cell 47 (1986) 401-412; Schmitt, H.D. 등, Cell 53(1988) 635-647];

* 엠. 무라마츠(M. Muramatsu)의 sar1 돌연변이체[Nakano, A. and Muramatsu, M., J. Cell Biol. 109(1989) 2677-2691].

N-글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체들은 기능하는 분비 경로를 가지는 것이 보통이다. 결함있는 N-글리코실화는 예컨대 탄수화물 구성(변형) 효소 시스템의 돌연변이, 또는 세포단백질 수송 시스템(분류(soring), 표적화)의 돌연변이와 같은 상이한 유전자 결함에 의해 유발될 수 있다.

분류 및 표적화 돌연변이체에서, 외부 사슬 글리코실화 반응이 일어나는 세포구획인 골지체 또는 골지체의 일부 영역은, 예컨대 단백질이 분비되는 동안 우회된다.

* 시.이. 발로우(C. E. Ballou)의 mnn 돌연변이체(만난(mannan) 결함) [Ballou, L. 등, J. Biol.Chem. 255(1980) 5986-5891; Ballou, C.E., Methods Enzymol. 185(1990) 440-470; Ballou, C.E., In: Strathern, J.N. 등, The Molecular Biology of the Yeast Saccharmyces. Cold Spring Harbor laboratory, New York, pp. 355-360 (1982)];

* 시.이. 발로우(C. E. Ballou)의 vrg 돌연변이체(바나듐산염 내성 글리코실화)[Ballou, L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci 88(1991) 3209-3212];

* 알. 로빈스(R. Robbins)의 alg 돌연변이체(아스파라긴-연관 글리코실화 결함)[Huffaker, T.C. and Rbbins, P.W., Proc. Natl. Acad. Sci 80(1983) 7466-7470; Runge, K.W. and Robbins, P.W., In; Bonventre, P.F. 등, Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. pp. 312-316(1986)];

* 지. 핑크(G. Fink)(D. T. Moir)의 pmr1(ssc1) 돌연변이[Duncan, M. J. and Smith, R. A., EPA 0211208; Fink, G. R., EPA 0382332; Rudolph, H. K. 등, Cell 58(1989) 133-145];

* 에이치. 알. 비. 펠함(H.R.B. Pelham)의 erd1 돌연변이체(망상체 보유 결함) [Hardwick, K. G. 등, EMBO J. 9(1990) 630-632].

분비 경로가 차단된 돌연변이체들은 분명히 생물공학적 목적에 부적당하다(단백질의 동종 및 이종분비).

많은 N-글리코실화 결함 돌연변이체는 조건에 따라 치명적이다. 즉, 이것들은 정상 조건(배양온도 30℃)에서는 생존할 수 없고, 예컨대 돌연변이체 alg1, alg2, alg4, bet1, bet2, 거의 모든 sec 돌연변이체 및 ypt1(저온 민감성)와 같은 온도 민감성(ts) 표현형을 갖는다.

온도 민감성 표현형은, 치면적인 ts 돌연변이가 단지 온도의 변화, 예컨대 온다가 26℃(허용된 성장조건)에서 37℃(비-허용 성장조건)로 변화된 후에만 발현되는 것을 의미한다. 이런 돌연변이체들도 분명히 생물공학적 목적에는 덜 적당하다. 외부사슬 글리코실화가 실질적으로 감소(mnn7, mnn8, mnn10) 또는 결여되었거나 코아 글리코실화가 변형된(mnn9) 돌연변이군은, 세포 성장이 둔화되고, 세포의 형태가 변화하며, 배양중에 이미 용균되어, 상기 돌연변이체들이 삼투압적으로 안정된 배지(약 0.5M의 KCI 또는 1M의 소르비톨이 첨가됨)에서만 성장될 수 있다는 단점을 갖는다.

더욱이, 상기 문헌에 기재된 N-글리코실화 결함 돌연변이체들의 일부(예컨대 alg1)는 세포내에서 부분적으로만 발현(누출(leaky))되는 결함이 있다. 이는 이종 N-글리코실화를 유도한다(야생형 N-글리코실화에 의해 오염).

외부사슬 N-글리코실화 과정이 짧아지거나 배제된 단백질을 발현/분비할 수 있는 효모 균주들은 예컨대 EP-A 0 344 864에 기재되어 있다. 이 출원에 기재된 균주들은 모두 시.이. 발로우에 의해 설명된 mnn9 돌연변이를 기초로 한다. Mnn9 돌연변이 균주들은 성장중에 용균되기 쉬우므로 삼투압적으로 안정되어야 한다(상기 설명 참조).

EP-A 0 314 096에 기재된 효모 균주들도 mnn9 돌연변이를 기초로 한다. 상기 균주들은 삼투압 안정제를 배지에서 생략할 수 있을 정도로 용균 민감성이 개선되었다.

상기 목적을 위해 MNN9 유전자를 클로닝한 다음, 외부에서 조절할 수 있는 프리모터의 제어하에 MNN9 유전자가 있는 균주들을 구성하였다. 이는 예를들면, 필요한 글리코실화된 세포성 숙주 단백질의 합성을 위해, 세포가 배양단계에 있는 동안에 충분한 활성 MNN9 유전자 생성물이 존재하는 것을 가능하게 하고, 이것에 의해 mnn9 돌연변이는 원하는 N-저글리코실화된 단백질이 실제로 생성되는 단계에서만 발현된다.

그러나, 이 방법은 다음의 결점을 갖는다 :

* 세포 배양이 훨씬 더 복잡해진다.

* 원하는 세포 밀도에 도달된 후, 원하는 N-저글리코실화된 단백질의 합성이 유도되기 전에, MNN9 유전자는 예컨대 배양액의 온도 이동에 의해 발현 중지되어야 한다.

* MNN9 유전자가 발현중지된 후에 세포는 mnn9 표현형을 갖게 된다. 즉, 성장이 나빠진다(상기 참조).

* 생성문 합성이 이미 유도되었을 때 MNN9 유전자가 정지되었음에도 불구하고, 여전히 존재하는 활성 MNN9 유전자 생성물이 소량의 원하지 않는 과도하게 글리코실화된 단백질 생성물의 합성물의 합성을 유도할 수 있다.

나아가, 효모 분비 돌연변이체들(과분지 돌연변이체들)은 종종 저글리코실화 당단백질을 분비하는 것으로 알여져 있다. 그러한 실례는 EP-A 0 382 332에 기재되어 있다.

ssc1(pmr1) 돌연변이의 분자상 원인은 ER과 골지체 사이의 소낭 수송과 관련한 D-타입 ATP아제(ATPase)의 비활성화에 근거하는 것으로 추정된다. 세포의 분류(sorting) 메카니즘은 SSC1 유전자의 파괴에 의해 손상되고, 그것은 통상적으로 외부사슬 글리코실화가 일어나는 골지체 부분을 우회하는 또 다른 분비 경로의 개방을 초래하는 것으로 추정된다.

ssc1 돌연변이의 단점은 특히 다음과 같은 것들이다 :

* ssc1 돌연변이는 칼슘 의존성 성장을 유발한다. 돌연변이 균주는 낮은 칼슘 농도에서 성장이 불량하다.

* 증가된 분비(예컨대 프로카이모신(prochymosin), U-PA 및 t-PA)는 유전자 생성물에 좌우된다. α-1 안티트립신의 이종분비 및 동종 효소의 분비(원형질 말단으로 분비되는 전화효소 및 액포안으로 분비되는 알칼리성 포스파타제, 프로테이나아제 B 및 카르복시 펩티다아제 Y)는 증가되지 않는다[Moir, D. T., In: Barr, P. J.; Brake, A. J. 등, Yeast genetic engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, pp. 215-231(1989)].

본 발명의 목적은 상기 결점을 극복하고, 가능한 한 균일하고 낮은 N-글리코실화가 일어나는(예컨대, 외부 사슬 글리코실화가 완전히 또는 부분적으로 없는), 단백질의 이종 및 동종분비를 위해 왕성하게 성장하는 효모 숙주 균주들을 제공하는 것이다. 이는 생물공학분야에서 왕성하게 성장하고 분비하며, 균일한 규정된 N-글리코실화를 지닌 단백질의 동종 및 이종 분비를 위한 효모 숙주가 필요하기 때문이다.

상기 목적은 [³H]-만노오스 자멸(suicide)적 선택, 1개 이상의 선택적 마커(영양요구성 요구 및/또는 내성)의 도입 및 플라스미드 YEpL/GOD를 사용한 형질전환 및 2% 효모추출물, 4% 박토펩톤, Difco, 0.1mol/ℓ의 인산염 완충액(pH 7.0), 1% 프룩토오스 및 6% 말토오스를 포함하는 완전배지에서 배양된 후, 진탕하면서 3 내지 4일간 인큐베이션된 후에 GOD를 10mg/ℓ 이상의 양으로 생성하고 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7160, DSM 7338 및/또는 DSM 7340에 대해 대립성(allelic)인 균주들의 선택에 의해 얻어질 수 있는, N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체들(ngd 돌연변이체, N-글리코실화 결함)에 의해 이루어진다.

[³H]-만노오스 자멸적 선택은 하기 단계들로 주로 구성된다.

-야생형 균주(예컨대 X2180-1A; ATCC 26786)의 돌연변이 발생.

-[³H]-만노오스와의 인큐베이션.

-세포의 생존율이 원래 값의 10²내지 10³배로 감소할 때까지 세포를 저온, 바람직하게는 약 -80℃에서 저장함으로써 고도의 글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체의 농축 (이때의 저장기간은 바람직하게는 2 내지 4개월임).

-동종구조로 발현된 전화효소를 토대로 N-글리코실화가 감소된 돌연변이체들의 선택.

-활성 염색 및/또는 면역 침전, 및 바람직하게는 SDS-PAGE에 의한 전화효소의 분자량의 측정에 의한 분비된 전화효소의 분석. 글리코실화 정도는 측정된 분자량으로부터 측정될 수 있다.

[³H]-만노오스 자멸적 선택은 효모 돌연변이체들의 생산 및 분리에 효과적인 방법이다[Littlwood, B.S., Methods of Cell Biology, Prescott, D. M. (ed), Academic Press, New York, (1975) Vol. IX, pp. 273-285]. 이 방법에서 세포의 사멸은, 예컨대 효모세포의 당단백질안으로 통합되는 트리튬으로 표지된 만노오스에 의해 일부의 효모 세포에서 발생된다. 생존하는 세포에서는, 예컨대 탄수화물 대사 및/또는 당단백질 합성에 변화가 있다[Pouyssegur, J., Proc. Natl. Acad. Sci, 77, 2698-2701(1980); Hirschberg, C.B. 등, Mol. Cell. Biol. 1(1981), 902-909; Huffaker, T.C. and Robbins, P.W., J. Boil. Chem. 257(1982), 3202-3210]. [³H]-만노오스 자멸적 선택은 효모의 만노단백질(mannoproteins)의 외부 사슬 글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체를 얻기 위해 선택되었다. 상기 과정에서, 글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체들은 야생형 세포보다 방사성 만노오스를 적게 통합하며, 따라서 [³H]-만노오스에 노출될 때 증가된 내성을 나타낸다. 만노오스의 대사를 토대로 하는 상기 과정에서 비특이성을 피하기 위하여, 위치 2에서 트리튬으로 유도체화된 만노오스를 사용하는 것이 바람직하다.

선택성 마커(영양요구성 마커 및/또는 내성)은 효모 균주를 교배시켜 이배체를 형성(미소조작에 의해 접합체(zygote)를 분리함)하고, 임의로 계속해서 반수체로의 포자형성(4분 염색체 분석)에 의해 도입될 수 있다. 적당한 선택성 마커는 예컨대 영양요구성 마커 ura3, leu2, trp1, lys2, his3, his4 및 ade2 또는 예컨대 구리에 대한 내성을 생성하는 유전자(CUP1 유전자) 또는 G418 (Tn601(903) 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자)이다[Bitter, G.A. 등, Methods Enzymol. 153(1987) 516-543].

N-글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체들은 바람직하게는 NGD29 및/또는 NGD62 유전자에 결함을 가지고 있다.

ngd 표현형은 기질/글루코오스 시약으로서 수크로오스 및 2,3,4-트리니트로 페닐테트라졸륨 클로라이드를 사용하여 천연 PAGE 겔에 의한 전화효소의 활성 염색에 의해 측정될 수 있다.

GOD의 적당한 생성은 표준 조건하에서 배양된 후에 배지로 분비된 GOD의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 이것을 위해서 시험되는 균주(GOD 형질전화체)는 바람직하게는 선택성 예비배양후에 진동시키면서 3 내지 4일동안 완전배지중에서 배양된다. 효모 추출물, 박토펩통, 프룩토오스, 및 말토오스를 중성 pH의 완전배지에 첨가하는 것이 바람직하다.

글루코오스 옥시다아제의 측정은 예컨대 하기 실시예의 일반적 방법에서 설명되는 방법에 따라 수행된다.

본 발명에 따르는 돌연변이체들(대립성 돌연변이체들)은 조사되는 돌연변이체들이 효모 균주 DSM 7042 또는 DSM 7338(ngd 29) 및 DSM 7160 또는 DSM 7340(ngd 62)과 동일한 유전자에서 돌연변이를 가지고 있는지 여부에 대한 분석 시험에 의해 측정될 수 있다.

상기 목적을 위해, 시험되는 각각의 균주는 DSM 7042/7338 군 및 DSM 7160/7340 군으로부터의 효모 균주와 교배되고, 이 방법으로 얻어진 2배체 균주들이 분석되었다.

시험되는 돌연변이(균주)는 돌연변이가 2배체 세포에서 보상되지 않는 경우, 본 발명에 따르는 ngd 돌연변이체(DSM 7042, DSM 7338, ngd 29) 및/또는(DSM 7160, DSM 7340, ngd 62)에 대해 대립성이다.

시험되는 돌연변이(균주)는 돌연변이들이 2배체 세포에서 서로 상보적이고 N-글리코실화와 관련하여 야생형 표현형을 나타내는 경우, 본 발명에 따르는 ngd 돌연변이체(DSM 7042, DSM 7338, ngd 29) 및 (DSM 7160, ngd 62)에 대해 대립성이 아니다.

본 발명에 사용된 바람직한 효모 균주들은 DSM 7042, DSM 7160, DSM 7338 및/또는 DSM 7340 이다. DSM 7338 및/또는 DSM 7340이 특히 바람직하게 사용된다.

또한, 본 발명은 [³H]-만노오스 자멸선택, 하나 또는 그 이상의 선택성 마커(영양요구성 요구 및/또는 내성 유전자들)의 도입, 그리고 플라스미드 YEpL/GOD를 이용한 형질전환 및 2% 효모 추출물, 4% 박토펩톤, 디프코(Difco), 0.1mol/ℓ의 인산염 완충액 (pH 7.0), 1% 프룩토오스 및 6% 말토오스를 함유하고 있는 완전 배지중에서의 발효 후, 진동하게 3 내지 4일 동안 인큐베이션시킨 후에, 10mg/ℓ 이상의 양으로 GOD를 생산하고 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7160, DSM 7338 및/또는 DSM 7340에 대립성인 균주들의 선택에 의한, N-글리코실화에 결함이 있는 사카로마이세스 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본질적으로 균일하게 글리코실화되는 단백질의 생산을 위해 본 발명에 따르는 효모균주를 사용하는 것에도 관련된다. 효모 특이적 당단백질 (예컨대 외부 전화효소, 산 포스파타아제, 엔도글루카나아제 및 세포벽 만노단백질)을 제조하기 위하여, 본 발명에 따르는 효모균주들은 발효되고, 원하는 당단백질은 공지된 방법에 따라 배양 상청액으로부터 또는 세포로부터 분리되어 정제된다.

이종 단백질은 본 발명에 따르는 균주들을, 발현시키고자 하는 당단백질에 대한 유전자를 함유하는 재조합 DNA로 형질전환시킴으로써 얻어진다. 예컨대 글루코오스 옥시다아제, α1-마이크로글로불린, 에리트로포이에틴 및 글루코아밀라아제는 이러한 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 특허청구범위 제 1 항에서 청구되는 효모 돌연변이체들을 단백질을 코드하는 DNA로 형질전환하고, 이러한 형질전환체의 발효, 및 세포 또는 배양 상청액으로부터 상기 단백질의 분리에 의한, 본질적으로 균일하게 글리코실화된 단백질의 발현 및 제조방법과도 관련된다.

특허 절차상의 목적을 위하여, 다음의 유기체를 독일연방공화국 데-3000 브라운 쉬바이크 마쉐로더 베크 1 베에 소재하는 도이체 잠룽 퓌어미크로오르가니즈멘 (Deutsche Sammlung fur Microorganismen(DSM))에 기탁하였다. :

다음의 실시예들에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[실시예]

일반적인 방법

DNA 재조합 기술

표준방법을 사용하여 DNA를 조작하였다[Maniatis, T. 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)]. 사용된 분자 생물학적 시약은 제조업자의 지시에 따라 사용하였다.

효모의 형질전환

사카로마이세스 세레비시아 균주를 참고문헌의 방법에 따라 형질전환 시켰다[Beggs, J.D., Nature 275(1978) 104-109; Ito, H. 등, J. Bacteriol. 153(1983) 163-168 또는 Delorme, E., Applied and Environmental Microbiology 55(1989) 2242-2246]. 글루코오스 옥시다아제를 발현하는 효모 균주에 대한 C 공급원으로서 글루코오스 대신 프룩토오스를 사용하였다.

글루코오스 옥시다이제 활성의 측정

GOD 활성의 측정을 25℃에서 0.18mol/ℓ의 글루코오스, 15 유니트/㎖의 양고추냉이 과산화효소 및 1.75mmol/ℓ의 ABTS글루코오스 시약을 함유하고 있는, 산소로 포화된 1.0㎖ 부피의 0.1mol/ℓ의 칼륨 인산염 완충액 (pH 7.0)중에서 수행하였다. 반응은 글루코오스 옥시다아제의 첨가로 시작 되었고(5~20mU/㎖로 희석된 GOD를 함유하고 있는 10㎕의 샘픔), 흡광도의 변화/분(△A/분)을 405nm에서 측정하였다(ε₄₀₅= 36.8[mmol^-1×1×cm^-1]). 1 유니트(U)의 GOD 활성은 25℃에서 1분에 1μmol의 글루코오스를 산화시키는 효소의 양으로서 정의한다. 정제된 아스페루길루스 니거 GOD의비활성(比活性)은 상기 시험조건하에서 약 230U/mg 단백질이다.

단백질 측정

단백질 측정은 표준으로 우혈청 알부민을 사용하여 뷰렛 방법[Zamenhof, S. 등, Methods Enzymol. 3(1957) 696-704]에 의해 수행하였다.

정제된 GOD 효소의 단백질 농도를, 280nm에서의 광학 밀도를 토대로 계산하였다(1 OD₂₈₀= 1.5mg/㎖ 정제 GOD).

세포용균 및 미정제 추출물의 분리

5㎖의 배양 배지로부터 세포(습윤 중량으로 약 0.1-9,2g의 효모)를 원심분리하였다. 세포 펠릿을 10mmol/ℓ의 인산염 완충액(pH 7.0)으로 1회 세척하고, 계속해서 유리 비이드를 넣고 휠믹스(Whirlmix)로 균질화시켜 용균시켰다[Ciriacy, M., Mut. Res. 29(1975) 315-326]. 그 다음으로 세포를 2㎖의 10mmol/ℓ 인산염 완충액(pH 7.0)에 재현탁/추출시키고, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거한 다음, 상청액을 미정제 추출물로서 추가로 처리하였다.

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)

가용성 샘플(배지상청액 및 세포용균물)을 1/5 부피의 5xSDS 샘플완충액(1xSDS 샘플완충액 : 50mmol/ℓ의 Tris HCl, pH 6.8, 1% SDS, 1% 메르캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루)과 혼합시키고, 5분동안 95℃에서 인큐베이션시켰다. 세포 파편 분획의 비-가용성 단백질을 2㎖의 1xSDS 샘플 완충액 및 6-8mol/ℓ의 우레아로 추출하고, 5분간 95℃로 가열함으로써 변성시킨 다음, 원심분리에 의하여 불용성 성분으로부터 분리시켰다. 그 다음, 단백질을 SDS-PAGE[Laemmli, U.K., Nature 227(1970) 680-685]에 의해 분리하고 쿠마찌 형광 블루염료로 염색하였다.

[실시예 1]

사카로마이세스 세레비시아로부터 아스페르길루스 니거 GOD의 분비를 위한 플라스미드의 제조

효모 발현 벡터 YEpL(출발벡터)의 구성

플라스미드 YEpL은 α-글루코시다아제 벡터 YEp/5C6b3[Kopetzki 등, Yeast 5 (1989) 11-24; Kopetzki, 등, EP-A 0 323 838]에 기초한 플라스미드이다. 플라스미드 pBR322로부터의 약 2.3Kbp 길이의 EcoRI/PvuII 단편(플라스미드 기원, 암피실린 내성유전자)은 대장균에서 플라스미드를 복제하기 위해 작용한다. 효모에서의 복제를 위해 상기 벡터는 효모의 2㎛ DNA로부터의 약 2.2Kbp 길이의 EcoRI 단편(대장균/효모 셔틀벡터 YEp24로부터 하위클로닝됨)을 함유한다. 또한 상기 벡터는 영양요구성 효모 균주에서 플라스미드를 선택하기 위하여 URA3 및 LEU2d 유전자를 함유하고, α-글루코시다아제 발현 카세트(GLUCPI 유전자)를 함유한다. 벡터는 α-글루코시다아제 프로모터, 폴리링커(발현시키고자 하는 유전자에 대한 클로닝 부위) 및 α-글루코시다아제 종료암호(terminator)로 구성된다. 또한 MAL2-8cp 유전자가 존재하고, 이것의 유전자 생성물인 MAL2-8cp 단백질은 α-글루코시다아제 프로모터를 활성화시킨다. α-글루코시다아제 프로모터는 글루코오스의 존재하에 억제된다. 이 프로모터는 글루코오스의 소모 후에 다시 활성화되고 말토오스에 의한 유도 후 최대 활성에 도달한다.

1.1 플라스미드 YEp/KL6b3의 구성

α-글루코시다아제 종료암호와 MAL2-8cp 프로모터 사이에 있는 불필요한 약 1.4kbp 길이의 DNA 서열을 플라스미드 YEp/5C6b3(제1도)로부터 결실시켰다.

이 과정을 위해 플라스미드 YEp/5C6b3을 Xho I으로 선형화하고, 5'의 돌출된 단부를 클레노우 중합효소로 채운 다음, 플라스미드를 Mro I으로 재절단하여 8.7kbp 길이의 Mro I/Xho I (블런트 단부) 벡터 단편을 분리하였다. 2번째 제조 과정에서 플라스미드 YEp/5C6b3을 제한 엔도누클라아제 Mro I 및 Sca I 으로 소화시키고, α-글루코시다아제 유전자를 함유하고 있는 2.5Kbp 길이의 Mro I/Sca I 단편을 분리하여 8.7kbp 길이의 Mro I/Xho I (블런트 단부) 벡터 단편과 연결시켰다. 원하는 플라스미드를 제한 지도화에 의해 확인하고, YEp/5C6b3으로 명명하였다.

1.2 플라스미드 YEp/KL-6b3M의 구성

MAL2-8cp 유전자의 5' 비-번역영역의 Ssp I 제한 엔도누클레아제 절단부위에 Mlul-링커 (5'-GACGCGTC-3')를 연결시켰다. 플라스미드 구성 : YEp/KL-6b3M.

1.3 플라스미드 YEp/KL-6b3M-MCS의 구성

α-글루코시다아제의 구조 유전자를 중합효소 사슬연쇄반응(PCR) 기법에 의해 제거하고[Mullis, K.B. and Faloona, F.A., Methods in Enzymol. 155(1987) 335-350], DNA 링커로 대체시켰다(디클로닝 부위, MCS).

상기의 과정을 위해 플라스미드 YEp/KL-6b3M으로부터의 GLUCPI 프로모터 서열을 하기 프라이머쌍(SEQ ID NO.1 및 SEQ ID NO. 2 참조)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 대략 410 bp 길이의 PCR 생성물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다.

플라스미드 YEp/KL-6b3M으로부터의 GLUCPI 종료암호 서열은 하기 프라이머쌍(SEQ ID NO.3 및 SEQ ID NO. 4 참조)을 사용하여 제 2 PCR반응으로 증폭시키고, 대략 860 bp 길이의 PCR 생성물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다.

그 다음, 등몰량(대략 50pg 씩)의 분리된 PCR 단편들을 PCR 반응 혼합물로 조합하여 5분동안 95℃에서 인큐베이션함으로써 ds-DNA를 변성시키고, 반응 혼합물을 60℃로 냉각시켜서 MCS를 함유하는 상보적인 단일 DNA 가닥과 어닐링시킨 다음, 하이브리드된 생성물을 Taq 중합효소를 사용하여 ds-DNA로 전환사키고, 하기 프라이머쌍을 사용하여 제 3 PCR 반응으로 증폭시켰다(SEQ ID NO.1 및 SEQ ID NO. 4 참조).

그 다음, 대략 1.24kbp 길이의 PCR 생성물을 제한 엔도누클레아제 Mrol과 Mlul으로 소화시키고, 약 0.92 kbp 길이의 Mrol/Mlul-GLUPI-프로모터/MCS/GLUCPI 종료암호 단편을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 약 8.55 kbp 길이의 Mrol/Mlul-YEp/KL-6b3M 벡터 단편과 연결시켰다. 원하는 플라스미드 YEp/KL-6b3M-MCS를 제한 지도화에 의해 확인하고, PCR에 의해 합성된 DNA 영역은 서열화에 의해 조사하였다.

1.4 플라스미드 YEpL의 구성

다음의 플라스미드 제조에서 LEU2d 유전자를 플라스미드 YEp/KL-63M-MCS에 삽입시켰다. 이를 위해 플라스미드 YEp/KL-6B3M-MCS를 Cel II와 SnaBl으로 소화시키고, 8.4 kbp 길이의 Cel II/ScaBl-YEp/KL-6b3M-MCS 벡터 단편을 분리하였다. LEU2d 유전자를, 약 2.32 kbp 길이의 CelI/SnaBl 단편으로서 플라스미드 pADH040-2 [Erhart, E. 및 Hollenberg, C.P., J. Bacteriol. 156(1983) 625-635]로부터 분리하여 8.4 kbp 길이의 Cel II/SnaBl-YEp/KL-6b3M-MCS 벡터 단편과 연결시켰다. 원하는 플라스미드 구조 YEpL(DSM 7038)은 제한 지도화에 의해 확인하였다(제 2도 참조).

1.5 플라스미드 YEpL/GOD의 구성

사용된 글루코오스 옥시다아제 유전자(균주 : NRRL-3, ATCC 9029)의 클로닝, p블루스크립트(pBluscript) SK(+) 벡터에서의 하위클로닝, DNA 서열화 및 GOD 단백질 서열의 추론은 참고문헌에 기재되어 있다[Kriechbaum, M. 등, FEBS Lett. 255 (1989) 63-66]. GOD 유전자는 pBluescritp SK(+)의 2개의 부분 영역(Sall 제한 단편)에서 클론하였다.

플라스미드 pSK/GOD-1.8은 5'-비-번역영역 및 염기쌍 위치 164에 있는 Sall 절단부위까지 GOD 구조유전자의 N-말단영역을 코드하는 약 1.8Kbp 길이의 Sall 단편을 함유한다(염기쌍(bp) 위치는 상기 크리쉬바움 등의 문헌에 개시된 번호에 해당된). 플라스미드 pSK/GOD-2.0은 GOD 구조유전자의 아래쪽에 있는 3'-비-번역 영역뿐만이 아니라 bp 위치 165부터 1853 까지의 GOD 구조유전자의 나머지 부분을 코드하는 약 2.0kbp 길이의 Sall 단편을 함유한다.

GOD 유전자의 5'-및 3'-비-번역영역을 PCR 기법에 의하여 제거하고, 이로써 GOD 구조 유전자는 단일의 제한 엔도누클레아제 절단부위(Bgl II 및 Pvu II)를 가지게 되었으며, 또한 천연 GOD 단백질을 코드하는 DNS 서열을 유지하면서 GOD 구조 유전자의 C-말단 코딩 영역에 단일의 SphI 및 NheI 절단부위를 도입시켰다. 계속해서 GOD 구조 유전자를 2개의 PCR 단편으로부터 3-단편 연결로 조립하고, 벡터 YEpL에 삽입시켰다. 하기의 프라이머쌍(SEQ. ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 6 참조)을 사용하여 N-말단 GOD 구조 유전자를 증폭시켰고, 이때 플라스미드 pSK/GOD-1.8을 주형 DNA로서 사용하였다.

하기의 프라이머쌍(SEQ. ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8 참조)을 사용하여 나머지 GOD 구조유전자를 증폭시켰고, 이때 플라스미드 pSK/GOD-2.0을 주형 DNA로서 사용하였다.

제 1 반응의 대략 220bp 길이의 PCR 생성물을 Bgl II와 Sal I으로 다시 절단하여 약 130bp 길이의 Bgl II/Sal I 단편을 분리하였다. 제 2 반응의 약 2.05kbp 길이의 PCR 생성물을 Sal I과 Pvu II로 소화시켜 약 1.7 kbp 길이의 DNA 단편을 분리하였다. 그 다음, PCR 단편을 약 10.7 kbp 길이의 Blg II/Pvu II-VEpL 벡터 단편에 연결시켰다(3-단편 연결). 원하는 플라스미드 YEpL/GOD (제 3도)를 제한 지도화 및 부분서열화(클로닝 연결)에 의해 확인하였다.

1.6 플라스미드 YEpL/GOD-(His)4의 구성

상기 플라스미드는 C-말단에서 4개의 추가의 히스티딘 잔기를 가지는 GOD 효소 변이체를 코드하는 변형 GOD 유전자를 함유한다. YEpL/GOD (His)4는 플라스미드 YEpL/GOD로부터 제조되었다.

이를 위하여 플라스미드 YEpL/GOD를 Sphl으로 부분절단하고 Pvu II로 완전히 절단하여, 대략 10.7kbp 길이의 SphI/PvuII 단편을 분리하고, 혼성화에 의해 2개의 올리고누클레오티드로부터 제조된 하기의 DNA 링커(SEQ. ID NO. 9 및 SEQ ID NO. 10 참조)와 연결시켰다.

원하는 플라스미드 YEpL/GOD-(His)4를, 프로브로서 방사성 표지된 프라이머 10을 사용하여 콜로니 혼성화에 의해 확인하였고, 추가로 제한지도화 및 부분 서열화(GOD 구조유전자의 C-말단영역)에 의해 분석하였다.

[실시예 2]

N-글리코실화에 결함이 있는 효모 숙주 균주의 분리

2.1 [³H]-만노오스 자멸 돌연변이 생성

원리 :

-돌연변이 발생(출발균주 : X2180-1A, 유전자형 :SUC2 mal mel gal2 CUP1 ; ATCC 26786).

-[³H]-만노오스와의 인큐베이션

-세포의 생존률이 10²내지 10³배로 저하될 때까지(2~4개월) 세포를 -80℃에 저장하여 고도의 글리코실화 결함 돌연변이체의 농축

-X2180-1A(ATCC 26786)와 같은 효모 균주를 YEPD 배지(2% 박토펩톤, 1% 효모 추출물, Difco, 및 4% 글루코오스)에서 배양하고, 로그 성장 단계에서(약 5 × 10⁸세포)수확하고, 0.1mol/ℓ 인산나트륨(pH7)으로 세척한 다음, 1.5㎖의 0.1mol/ℓ 인산나트륨(pH7)에 재현탁시킨다. 0.1㎖의 에틸메탄술포네이트를 1시간 동안 25℃에서 첨가하여 세포를 돌연변이시키고, 이 방법으로 처리된 세포 0.2㎖를 10㎖의 티오황산나트륨(5% W/V)과 10분동안 인큐베이션시킨 다음, 0.1mol/ℓ의 인산나트륨(pH 7.0)으로 3회 세척하고, YEPD 배지(2% 박토펩톤, 1% 효모 추출물, Difco 및 4% 글루코오스)에 재현탁시킨다.

세포를 28℃에서, 578nm에서의 OD가 0.6에 도달할 때까지 진동시키면서 인큐베이션한다. 10⁶세포를 YEP 배지(2% 박토펩톤, 1% 효모추출물, Difco)로 세척한 후, 0.1% 글루코오스가 첨가된 0.1㎖의 YEP에 재현탁시킨다. 2 mCi의 [³H]-만노오스(비활성 18.5 Ci/mmol)를 첨가하고, 배양물을 60분동안 28℃에서 인큐베이션한다. 세포를 원심분리하고, 물로 세척한 다음, 25% 글리세롤을 함유한 YEPD에 재현탁시키고, -70℃에서 저장하여 함유된 방사성을 유지시킨다.

약 45 내지 50일 후에 세포의 생존율이 1.5 내지 0.2%로 떨어지면, 세포 분취액을 2% 만노오스가 첨가된 YEP 아가(agar)플레이트상에 플레이팅하고 30℃에서 인큐베이션한다.

2.2 N-글리코실화가 감소된 돌연변이체의 분리

단백질 글리코실화에 결함이 있는 돌연변이를, 먼저 [³H]-만노오스 및 [³⁵S]-메티오닌을 통합시키지 못하는 능력에 대하여 선택한다. 이것을 위해 세포를 YEPD 아가 플레이트상에 성장시키고, 효모 콜로니를 2개의 롯트밴드 필터(Rotband filter)[Schleicher Schull, Dassel, Germany]상에 레프리케이션하고, 상기 필터를 다시 6시간동안 YEPD 플레이트상에서 인큐베이션한다. 그 다음, 하나의 필터를 0.01mCi/㎖의 [³⁵S]-메티오닌이 함유된 YEPD 용액(필터를 적시기에 충분한 정도의 양)에서 인큐베이션하고, 다른 필터는 0.2mCi/㎖의 [³H]-만노오스를 함유하는 YEP로 침지시킨 후 30분동안 인큐베이션한다. 세포/콜로니를 필터상에서 5% 트리클로로아세트산으로 고정화시키고, 물 및 아세톤으로 세척한 후, 자동방사선 사진법에 의해 분석하였다.

2.3 외부 전화효소의 천연 겔 전기영동에 의한 양성클론의 특성확인

사카로마이세스 세레비시아으로부터의 SUC2 유전자는, 조절되고 구획화된 전화효소의 2개의 상이한 형태, 즉, i) 주로 주변세포질에 분비되는 글리코실화된 전화효소와 ii) 다소 짧아진 세포내 비-글리코실화 형태를 코드한다[Carlson, M. 등, Mol. Cell. Boil. 3(1983) 439-447]. 전화효소는 14개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 함유하는데, 이중 평균 9-10개가 전화효소 하위 단위체에 대하여 분비형태로 글리코실화된다. 외부 야생형 전화효소는 천연 겔중에서 불균일한 외부 사슬 글리코실화에 기인하여 확산 밴드로서 이동한다. 대조적으로, 원형질내의 비-글리코실화 형태는 활성 염색후에 날카로운 밴드를 보인다. 따라서, N-글리코실화의 변화는 천연 겔에서의 외부 전화효소의 이동속도 및 밴드의 날카로움(sharpness)에 의해 분석될 수 있다.

효모균주들(X2180-1A 야생형 균주 및 양성클론)을 밤새 5㎖의 YEPS 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, Difco 및 2% 수크로오스)에서 배양시킨 후, 후기 로그성장 단계에서 세포를 수확한 다음, 20mmol/ℓ의 아지드화 나트륨으로 1회 세척하고, 휠믹스내에서 유리 비이드를 사용한 균질화에 의해 용균시켰다. 세포 융균물의 제조, 천연 겔 전기영동, 및 기질/글루코오스 시약으로서 수크로오스와 2,3,4-트리니트로페닐테트라졸륨클로라이드를 사용한 전화효소의 활성염색을 문헌에 기재된 방법에 따라 수행하였다[Ballou C.E., Methods Enzymol. 185(1990) 440-470].

양성 클론들은 전화효소 활성염색을 토대로 4 부류로 나누었다 :

1. 야생형 전화효소 이동성을 가지고 있는 돌연변이체.

2. 비-글리코실화 또는 글리코실화 전화효소를 생산하지 않는 돌연변이체.

3. 외부 사슬 글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체(3~4밴드의 구별되는 올리고머 밴드 패턴).

4. 전화효소의 실질적인 언더(under)-글리코실화를 유도하는 돌연변이체(야생형 전화효소보다 더 큰 이동성).

결과

하기에서 ngd 29(DSM 7042/7338) 및 ngd 62(DSM 7160/7340)로 표시되는 제 4 부류의 돌연변이 균주(ngd는 N-글리코실화 결함을 의미한다)는, 출발균주 X2180-1A에 비교하여 균일하게 글리코실화된 이합체 외부 전화효소를 합성하였다(활성염색 후, 천연 겔에서 예리한 밴드 및 증가된 이동 속도). ngd 돌연변이 균주들은 삼투압적으로 안정하였고, 30℃에서 배양될 수 있었으며 배양중에 응집되지 않았다.

[실시예 3]

동종 및 이종 단백질의 발현을 위한 글리코실화 결함 효모 숙주 균주의 제조

형질전환에 의해 상보될 수 있는 하나 또는 여러개의 영양요구성을 도입하기 위하여, ngd 돌연변이체들을, 에프. 쉐르만 등에 의해 발표된 방법에 따라 적당한 실험 균주와 교배시키고[F. Sherman 등, Methods in Yeast Genetics : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1981)], 2배체 균주를 미소조작에 의해 분리하였다. 계속해서 이배체 균주들을 아포형성시키고, 적당한 영양요구성(예컨대 ura3, leu2)과 ngd 돌연변이를 가지는 분리물(segregants)을 분리하였다.

이를 위하여, ngd 29 돌연변이체를 균주 DBY 746(MAT α ura 3-52 leu2-3, -112 trp1-289a his3-△1; ATCC 44733과 동등한 [DSM 4316])과 함께, 그리고 ngd 62 돌연변이체를 JM1935균주(MAT α ura3 leu2 his4, DSM7156)와 함께 6시간동안 30℃로 YEPD(1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, Difco, 및 2% 글루코오스)에서 인큐베이션하였다. 계속해서 접합자(zygotes)를 미소조작기구(Bachhofer Company, Reutlingen, Germany의 de Fonbrune에 의한 모델)에 의하여 분리하고, 빔새 5㎖의 YEPD에서 성장시켰다. 세포를 간단히 원심분리하고, 배지를 약 0.2㎖정도 남기고 기울여 따라버린 후, 세포 펠릿을 잔류 배지에 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 아세트산 칼륨 플레이트(1% 아세트산 칼륨, 1.5% 아가)상에 플레이팅하였다. 약 5일 후, 이 방법으로 얻어진 자낭들을 접종루프를 사용하여 0.5㎖의 멸균수에 재현탁시키고, 10㎕의 β-글루쿠로니다아제/아릴 술파타아제 혼합물(Boehringer Mannheim)을 첨가하여 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 계속해서 10㎖의 물을 첨가하고, 자낭(ascus) 현탁액을 원심분리한 후, 상청액을 경사 분리하였다. 여러 자낭들의 포자들을 미소 조작하에 분리하여 YEPD 플레이트(1.5% 아가가 첨가된 YEPD)상에서 3일동 30℃에서 인큐베이션하였다. 레프리카 플레이트를 발아한 포자로부터 준비하였고, 콜로니를 합성 최소배지(아미노산이 없는 0.67%의 효모 질소염기, Difco; 2% 글루코오스, 1.5% 아가와 첨가물 : 20mg/ℓ의 Trp, His, Arg, Met; 30mg/ℓ의 Leu, Ile, Lys; 50mg/ℓ의 Phe; 10mg/ℓ의 Glu, Asp; 400mg/ℓ의 Val, Thr, Ser 및 20mg/ℓ의 아데닌 및 우라실; 이들 첨가물중 하나는 개별적인 최소배지 각각에서 생략되었다)상에 프레싱하고, 3일동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 우라실과 로이신에 대한 영양요구성을 가지는 ngd29 표현형을 가지는 분리물을 실시예 2.2 에서 설명된 바와 같이 분석/분리하였다. ngd29 표현형(ngd62 표현형까지)은 모든 조사된 4배체에서 2 : 2 로 분리되었고, 이것은 단일한 핵내 유전자좌에서 단일 돌연변이가 일어났음을 의미한다.

상술된 바와같이 DBY 746과 ngd29 를 교배시켜서 균주 BMY3-9A 및 N-BMY3-9A (MAT α leu2-3,112 ura3-52 his3-1 ngd29; DSM7042 및 DSM7338)와 BMY3-9C 및 N-BMY3-9C(MAT α leu2-3, 112, ura3-52 ngd 29; DSM7193 및 DSM7341)를 얻었다. 유사한 방식으로 JM1935 x ngd62 교배로부터 균주 BMY12-20D 및 N-BMY12-20D(MAT α leu2 ura3 his4 ngd62; DSM7160 및 DSM7340)를 얻었다.

[실시예 4]

야생형 및 글리코실화 결함 효모 숙주균주들에서 천연 아스페르길루스 니거 GOD 와 GOD(His)₄변이체의 발현/분비의 비교

아스페르길루스 니거로부터의 GOD는 천연적으로 분비되는 글리코실화된 2합체 효소이다. 이 효소에는 8개의 잠재적인 N-글리코실화 부위(시쿠온) 및 3개의 시스테인 잔기가 있으며, 이중 2개가 이황화물 가교를 형성하며, 형성된 가교는 각 하위 단위체상에 존재한다. 사카로마이세스 세레비시아 야생형 균주에서, 발현된 GOD는 배지로 분비되고 불균일한 외부 사슬 글리코실화(고도의 글리코실화)로 인하여 분자량에 관해서는 이종성이다[Frederick, K.R. 등, J. Biol. Chem 265(1990) 3793-3802; De Baetselier, A 등, Biotechnology 9(1991) 559-561; Whittington, H. 등, Curr. Genet. 18(1990) 531-563]. 프로세스된(22 아미노산 길이의 신소서열의 절단) 아스페르길루스 니거 GOD 단백질은 가능한 분자량이 63273 Da인 583개의 아미노산으로 구성된다[Frederick, K.R. 등, J. Biol. Chem 265(1990) 3793-3802].

플라스미드 YEpL/GOD(실시예 1.5) 및 YEp/GOD-(His)4(실시예 1.6)를 야생형 균주 JM1935(MAT α leu2 ura3 his4 MAL4, DSM 7156) BMY3-9A(DSM 7042) 및 N-BMY3-9A(DSM 7338)에서 형질전환시키고 (실시예 3 참조), 형질전환체들을 1.5% 아가로오스, 0.67% YNB (효모 질소염기, 염 비타민 혼합물, Difco), 0.5% CAA(카사미노산, 단백질 가수분해물, Difco) 및 탄소공급원으로서 2% 프룩토오스를 포함하고 있는 최소배지 아가 플레이트상에서 선택하였다(우라실 선택).

4.1 GOD 형질 전환체의 배양

플라스미드 복사수를 증폭시키기 위하여(LEU2d 대립유전자를 코드하는 플라스미드의 선택; Beggs, J.D. Nature 275(1978) 104-109; Erhart, E. 및 Hollenberg, C.P. J., Bacteriol. 156(1983) 625-635) 형질전환체들을 로이신이 없이 최소배지 플레이트(1.5% 아가로오스, 0.67% YNB, Difco, 60mg/ℓ의 아데닌 및 2%의 프룩토오스)상에 스트리킹하였다.

예비배양은 진동 플라스크중의, 0.67% YNB 및 4% 프룩토오스를 함유하고 있는 로이신 선택배지에서, 30℃에서 48시간동안 수행하며, 발현 배양물을 접종하기 위해 사용하였다(접종물 : 1-2%). 주 배양물(1ℓ의 진동 배양물)을 30℃에서 2% 효모 추출물, 4% 박토펩톤, Difco, 0.1mol/ℓ의 인산염 완충액, pH 7.0, 1% 프룩토오스 및 6% 말토오스를 함유하는 완전배지중에서 3 내지 4일동안, 진동시키면서 인큐베이션하였다. 48시간 및 72시간 후에 샘플을 취하여 세포성장을 측정하였고(600nm에서의 광학밀도 측정, OD₆₀₀), 배지로 분비된 GOD 활성 및 세포에 잔류하는 GOD 활성을, 세포용균후 미정제 추출물에서 측정하였다.

야생형 균주 DSM7156 및 글리코실화 결함 숙주 균주 DSM 7042/7338 (ngd29)에서의 GOD의 발현/분비 분석

야생형 균주 DSM7156과 글리코실화 결함 숙주 균주 DSM 7042/7338 (ngd29)에서의 GOD-(His)₄의 발현/분비 분석

결과

발현 및 분비와 관련하여 GOD와 GOD-(His)₄변이체 사이에는 아무런 차이도 발견되지 않았다.

4.2 분비된 GOD의 SDS-PAGE

글리코실화에 결함이 있는 숙주 균주 DSM 7042/7338(ngd29) 및 DSM 7162/7340(ngd62)에서 발현된(배지로 분비된) GOD-(His)₄효소 및 야생형 균주 DSM 7156에서 발현된(분비된) 효소와 아스페르길루스 니거로부터 정제된 GOD (Boehringer Mannheim, GFR)를 SDS-PAGE와 단백질 염색에 의해 추가로 특성확인하였다. GOD를 함유하는 야생형 균주로부터의 배지 상청액을 TCA 침전법에 의해 10배로 농축시킨 후 전기영동하였다. 탄수화물이 없는 GOD-(His)₄효소를 N-글로코시다아제 F를 사용하여 효소적으로 제조하였고, 크기 표준으로서 사용하였다.

N-글로코시다아제 F를 이용한 효소적 탈글리코실화

하셀벡크와 화셀에 의해 발표된 방법[Haselbeck, A. and Hsel, W., Tpics in Biolchemistry 8(1988) 1-4]에 따라 탈글리코실화를 수행하였다. GOD-(His)₄를 함유하고 있는 0.1㎖의 배지 상청액을 트리클로로아세트산으로(최종농도 : 10%) 침전시키고, 침전된 단백질을 원심분리한 후, 단백질 펠릿을 70% 에탄올로 세척한 다음 진공건조시키고, 1% SDS를 함유하고 있는 10㎕의 20mmol/ℓ 인산칼륨 완충액(pH7.2)에 취한 다음, 3분동안 95℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후 샘플을 20mmol/ℓ의 인산칼륨 완충액(pH7.2)으로 0.1ml로 희석하고, 옥틸글루코시드(최종농도 : 0.5%) 및 5유니트의 N 글로코시다아제 F를 첨가하여 1 내지 12시간동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 계속해서 25㎕의 5xSDS 완충액(상기 참조)을 첨가하였다.

결과

글리코실화에 결함이 있는 ngd 돌연변이 균주에서 발현된 GOD 효소(GOD 및 GOD-(His)₄)는, 단백질 염색 후 SDS-PAGE 겔에서 분자량이 약 80KDa인 우세한 균일 밴드로서 나타난다. 이 실험은 GOD 효소에서 외부 사슬 글리코실화가 일어나지 않았음을 보여주고, 이것은 균일한 코아형 글리코실화를 의미한다. 글리코실화와 관련하여 ngd 돌연변이 균주들은 mnn9-유사 표현형을 갖는다. 대조적으로, 야생형 균주에서 발현된 GOD 효소들은 약 80 내지 200 kDa의 분자량 범위에 걸쳐 매우 확산된 밴드로서만 인지할 수 있다.

[실시예 5]

오르토바나듐산염 또는 하이그로마이신 B가 첨가된 YEPD 아가 플레이트상의 성장을 토대로 한 N-글리코실화 결함 ngd 돌연변이체의 특성확인

mnn8, mnn9 및 mnn10과 같은 글리코실화에 결함이 있는 돌연변이체들은, 오르토 바나듐산염에 대한 증가된 내성과 항생물질인 하이그로마이신 B에 대한 증가된 민감성을 나타낸다. 내성/민감성 표현형은 N-글리코실화 결함 돌연변이체의 구별/분류를 가능하게 한다[Ballou, L.등, Proc. Natl. Acad. Sci. 88(1991) 3201-3212].

조사할 균주들을 밤새 YEPD 배지(5㎖의 롤러배양)에서 밤새 배양하고, YEPD 배지를 사용하여 균주/배양물의 광학밀도(OD₆₀₀)를 정확하게 0.05로 조정하였다. 그 다음, 20㎕씩의 각 세포현탁액을, 2 내지 15mmol/ℓ의 오르토바나듐산 나트륨 또는 10 내지 200㎍/㎖의 하이그로마이신 B를 함유하는 YEPD 아가 플레이트 상에 스폿팅하였다. 이 세포를 30℃에서 2일동안 인큐베이션한 후에 세포 스폿트의 성장을 평가하였다(하기 표 참조).

오르토바나듐산 나트륨 또는 하이그로마이신 B가 첨가된 YEPD 아가 플레이트상에서의 효모세포의 성장 표현형

¹⁾J. Biol. Chem. 259(1984) 3805-3811

결과

내성패턴과 관련하여 ngd 돌연변이체는 mnn9 돌연변이체 및 야생형 균주와 상이하였다.

[실시예 6]

ngd 돌연변이체의 특성확인/확인(대립성 시험)

대립성 시험은 유전자 및 유전자 결함(돌연변이)을 확인(상기 유전자와 유전자 결함 사이의 구별)하기 위한 것이다. 이 기법으로 2개의 돌연변이체가 대립성(동일 유전자내에 돌연변이가 있음)인지의 여부를 분석하는 것이 가능하다. ngd 돌연변이체들을 상호간에, 그리고 mnn9 돌연변이체에 대해 대립성에 대해 조사하였다.

대립성 시험을 유전학 표준기법에 의하여 수행하였다[Sherman, F.; Fink, G. R.; Hicks, J.B., Methods in Yeast Genetics : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1981); Guthrie, C. and Fink, G.R. (eds.), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Methods Enzymol. 194(1991) 참조].

원리 :

상호간에 상보되는 영양요구성을 가진 2개의 상이한 접합(pairing) 타입의 반수체 돌연변이균주를 교배하고, 2배체 균주들을 최소배지 플레이트상에서 선택한다. 분리된 균주들의 2배수체성을, 헉스리 등의 방법[Huxley, C. 등, Trends Gnent. 6(1990) 236]에 따라 PCR 분석법을 사용하여 a 및 α 접합타입에 특이적인 DNA 서열의 존재에 의하여 확인한다.

2개의 돌연변이체들은, 돌연변이들이 2배체 세포에서 서로 보상되지 않는 경우 대립성이다. 즉, 동일 유전자에서 돌연변이가 일어난 것이다.

2개의 돌연변이체들은, 돌연변이들이 2배체 세포에서 보상되고 그 결과 야생형 표현형이 나타나는 경우에는 대립성이 아니다. 즉, 2개의 상이한 유전자에서 돌연변이가 일어난 것이다.

SC=합성완전배지(아미노산이 없는 0.67% 효모질소염기, Difco; 2% 글루코오스; 1.5% 아가와 첨가물 : 20mg/ℓ의 Trp, His, Arg, Met; 30mg/ℓ의 Leu, Ile, Lys; 50mg/ℓ의 Phe; 100mg/ℓ의 Glu, Asp; 400mg/ℓ의 Val, Thr, Ser 및 20mg/ℓ의 아데닌 및 우라실; 아미노산 Ura, His 및 Trp은 상기 표의 선택 이배체란에서 언급된 개별적인 최소배지에서 생략된다).

결과 :

돌연변이체 ngd29 및 ngd62는 서로 상이하며 mnn9 (비-대립성)와도 상이하다.

[실시예 7]

야생형 및 고도의 글르코실화에 결함이 있는 효모 균주들로부터 GOD 및 GOD-(His)₄의 분리

7.1 금속킬레이트 크로마토그래피에 의한 GOD-(His)₄의 분리

GOD 변이체 GOD-(His)₄를 BMY3-9A/GOD-(His)4 세포 및 BMY12-20D/GOD-(His)4 세포(고도의 글리코실화에 결함이 있는 숙주 균주)의 배양여과물로부터 상기 분리기법을 사용하여 분리하였다.

배양여과물을 수산화나트륨으로 pH7.5로 적정하고, 10mmol/ℓ의 인산칼륨 완충액, pH7.5로 평형화된 NTA 컬럼(컬럼 부피 25㎖; 독일 뒤셀도르프 소재의 Diagen company 제품인 NTA 겔; Hochuli, E. 등, J. Chromatography 411 (1987) 177-184; Hochuli, E. 등, Biotechnology 6(1988) 1321-1325)에 적용하였다. 컬럼을 5 내지 10 컬럼부피의 10mmol/ℓ의 인산 칼륨 완충액(pH 7.5) 중의 1mol/ℓ의 염화나트륨 및 5 내지 10컬럼 부피의 10mmol/ℓ의 인산칼륨 완충액(pH 7.5)으로 재세척하였다. 그런 다음, 평행 완충액(pH 7.5) 중의 0.1mol/ℓ의 이미다졸로 GOD-(HIS)₄효소를 용출시키고, GOD-(His)₄을 함유하는 분획(황색)을 10mmol/ℓ의 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)에 대해 투석하였다.

7.2 사전농축 및 투석 후 Q-세파로오스 ff 상에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 GOD 및 GOD 변이체의 분리

이 방법에 따라 천연 GOD 및 고도의 글리코실화된 GOD를 정제하였다.

33g의 고형 황산암모늄(AS 포화농도 55%)을 100㎖의 멸균여과된 배양여과물에, 서서히 교반시키면서 첨가하고, 실온에서 1 내지 2시간 인큐베이션한 후에 침전된 단백질을 원심분리시켜 얻은 후, 25㎖의 25mmol/ℓ의 인산 칼륨 완충액(pH 7.5)에 녹인 다음, 동일한 완충액에 대해 투석하였다(4 × 10ℓ, 24시간, 4℃).

계속해서, 투석물을 25mmol/ℓ의 인산칼륨 완충액(pH 7.5)으로 평형시킨 높은 Q-세파로오스 ff컬럼(컬럼부피 12㎖)에 적용시킨 다음, 5 내지 10 칼럼부피의 평형화 완충액으로 재세척하였다. 결합된 GOD 효소를, 평형화 완충액(약 10 칼럼부피)중의 0 에서 1몰/ℓ KCl 구배에 의해 용출시켜서, GOD 함유 분획(황색)을 모았다.

[실시에 8]

분리된 GOD 효소의 생화학적 특성확인

8.1 GOD 비활성(比活性)의 측정

GOD 활성의 측정은 상기 일반적 방법 단원에서 설명한 바와같이 수행한다.

아스페르길루스 니거, 사카로마이세스 세레비시아(야생형) 및 사카로마이세스 세레비시아(고글리코실화 결함 돌연변이체)에서 발현된 GOD 및 GOD-(His)₄의 비활성

A. niger ; 아스페르길루스 니거로부터의 GOD, 순도 II(Boehringer Mannheim)

WT ; 사카로마이세스 세레비시아 야생형

ngd29 ; 사카로마이세스 세레비시아 고글코실화 결함 ngd29 돌연변이체

ngd62 ; 사카로마이세스 세레비시아 고글코실화 결함 ngd62 돌연변이체

8.2 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분자량 측정

정제된 GOD 효소를 1/5 부피의 5xSDS 샘플완충액(1xSDS 샘플완충액 : 50mmol/ℓ의 Tris-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 1% 메르캅토에탄옥, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루)과 혼합하여 5분동안 95℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 단백질을 SDS-PAGE[Laemmli, U.K., Nature 227(1970) 680-685]에 의해 분리하고, 쿠마찌 형광 블루(Coomassie Brilliant Blue)염료로 염색하였다.

아스페르길루스 니거, 사카로마이세스 세레비시아(야생형) 및 사카로마이세스 세레비시아(고글리코실화 결함 돌연변이체)에서 발현된 GOD 및 GOD-(His)₄의 SDS-PAGE 후의 분자량/하위단위

WT ; 사카로마이세스 세레비시아 야생형

8.3 탄수화물 부분의 측정(안트론 반응)

상이한 유기체들 및 효모균주들로부터의 GOD 효소의 탄수화물 부분을 애쉬웰의 방법[Ashwell, G., Methods Enzymol. 3(1957) 84]으로 측정했다.

이것을 위해 0.5㎖의 정제된 GOD 효소(H₂O 중의 농도 20-100U/㎖)를 5㎖의 안트론 시약과 혼합하고, 이 용액을 5분동안 25℃에서 인큐베이션한 후, 15분동안 끓는 물에서 중탕가열하였다. 그런 다음 25℃로 냉각시키고, 630nm에서 시약 블랭크(blank)에 대한 흡광도를 측정하였다. GOD 샘플중의 탄수화물 부분을 만노오스 표준용액 5, 25, 75 및 100 ㎍/㎖에 대해 동시에 작성된 만노오스 보정곡성에 의해 측정하였다.

안트론 시약의 제조 ;

66㎖의 진한 황산을 조심스럽게 34㎖의 물로 희석한다. 이것을 80℃로 냉각시킨 후, 50mg의 안트론과 1g의 티오우레아를 황산에 녹인다. 이 안트론 시약은 4℃에서 2주동안 보관할 수 있다.

아스페르길루스 니거, 사카로마이세스 세레비시아(야생형) 및 사카로마이세스 세레비시아(고도의 글리코실화 결함 돌연변이체)에서 발현된 GOD와 GOD-(His)4의 탄수화물 부분

WT ; 사카로마이세스 세레비시아 야생형

참고문헌 (간행물) :

서열표

(iii) 서열의 수 : 10

(2) SEQ ID NO : 1에 대한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 1 :

ATTTCTCCTT ATTGCGCGCT T 21

(2) SEQ ID NO : 2에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 48 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 2 :

TCTATTCAGC TGTCGACATA GATCTTATGT AATTTAGTTA CGCTTGAC 48

(2) SEQ ID NO : 3에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 50 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 3 :

AGATCTATGT CGACAGCTGA ATAGATAAAA TTAGTGCGGA CTTTTTTTTA50

(2) SEQ ID NO : 4에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 4 :

GTCATTTGTA AAGTAAAATT CCAA24

(2) SEQ ID NO : 5에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 5 :

GCCCGGTACC AGATCTATGC AGACTCTCCT TGTGAGCT38

(2) SEQ ID NO : 6에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 6 :

TCTAGAACTA GTGGATCCCC C21

(2) SEQ ID NO : 7에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 20 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 7 :

GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA20

(2) SEQ ID NO : 8에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 45 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 8 :

ATATATCAGC TGTCACTGCA TGCTAGCATA ATCTTCCAAG ATAGC45

(2) SEQ ID NO : 9에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 21 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 9 :

CAGCACCACC ACCACTGACA G21

(2) SEQ ID NO : 10에 관한 사항 :

(i) 서열특성 :

(A) 길이 : 25 염기쌍

(B) 타입 : 핵산

(C) 가닥 : 단일

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열표시 : SEQ ID NO : 10 :

CTGTCAGTGG TGGTGGTGCT GCATG25

Claims

(a) 효모숙주를 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 및 DSM 7340으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주로 돌연변이시키는 단계; (b) [³H]-만노오스 자멸적 선택을 이용하여 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체를 선택하는 단계; (c) 영양요구성, 내성, 또는 영양요구성 및 내성 유전자로 이루어지는 1종 이상의 선택성 마커를 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체에 도입하는 단계; (d) 플라스미드 YEpL/GOD를 사용하여 상기 효모 돌연변이체를 형질 전화시키는 단계; (e) 2% 효모 추출물, 4% 펩톤, 0.1mol/ℓ 인산염 완충액(pH 7.0), 1% 프룩토오스 및 6% 말토오스를 포함한 완전배지에서 상기 형질전환된 효모 돌연변이체를 발효시키는 단계; 및 (f) 진동 상태로 3일 내지 4일간 인큐베이션시킨 후, 배지에 10mg/ℓ이상의 GOD를 분비하는 형질전환된 효모 돌연변이체를 선택하는 단계에 의해 수득가능한 N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체로서, 상기 형질전환된 효모 돌연변이체는 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 및 DSM 7340으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 균주와 교배시 외부 사슬의 N-글리코실화에 결함이 있는 2배수체를 생성하고, 야생형 균주에서 발현시 외부 사슬 글리코실화를 갖는 형태로 발현되는 단백질을 발현시키는 DNA로 상기 2배수체를 형질전환시켰을 때, 외부 사슬 글리코실화를 갖는 형태의 단백질에 의한 오염없이, 저글리코실화된 형태의 단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하는, N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체는 미생물 기탁번호 DSM 7042로 기탁된 균주임을 특징으로 하는, N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체.
(a) 효모숙주를 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 및 DSM 7340으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주로 돌연변이시키는 단계; (b) [³H]-만노오스 자멸적 선택을 이용하여 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체를 선택하는 단계; (c) 영양요구성, 내성, 또는 영양요구성 및 내성 유전자로 이루어지는 1종 이상의 선택성 마커를 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체에 도입하는 단계; (d) 플라스미드 YEpL/GOD를 사용하여 상기 효모 돌연변이체를 형질 전화시키는 단계; (e) 2% 효모 추출물, 4% 펩톤, 0.1mol/ℓ 인산염 완충액(pH 7.0), 1% 프룩토오스 및 6% 말토오스를 포함한 완전배지에서 상기 형질전환된 효모 돌연변이체를 발효시키는 단계; 및 (f) 진동 상태로 3일 내지 4일간 인큐베이션시킨 후, 배지에 10mg/ℓ이상의 GOD를 분비하는 형질전환된 효모 돌연변이체를 선택하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체의 제조방법으로서, 상기 형질전환된 효모 돌연변이체는 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 및 DSM 7340으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 균주와 교배시 외부 사슬의 N-글리코실화에 결함이 있는 2배수체를 생성하고, 야생형 균주에서 발현시 외부 사슬 글리코실화를 갖는 형태로 발현되는 단백질을 발현시키는 DNA로 상기 2배수체를 형질전환시켰을 때, 외부 사슬 글리코실화를 갖는 형태의 단백질에 의한 오염없이, 저글리코실화된 형태의 단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하는, N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체는 사카로마이세스 세레비시아 DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 및 DSM 7340으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체의 제조방법.
단백질의 동종 발현 및 이종 발현을 시키기 위해 숙주 유지체로서 사용하기 위한, 제 1 항에 따르는 미생물 기탁번호 DSM 7042로 기탁된 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체의 용도.
제 1 항에 있어서, 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체는 미생물 기탁번호 DSM 7338로 기탁된 균주임을 특징으로 하는, N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체는 미생물 기탁번호 DSM 7160로 기탁된 균주임을 특징으로 하는, N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체는 미생물 기탁번호 DSM 7340로 기탁된 균주임을 특징으로 하는, N-글리코실화에 결함이 있는 형질전환된 효모 돌연변이체.
단백질의 동종 발현 및 이종 발현을 시키기 위해 숙주 유기체로서 사용하기 위한, 제 1 항에 따르는 미생물 기탁번호 DSM 7338로 기탁된 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체의 용도.
단백질의 동종 발현 및 이종 발현을 시키기 위해 숙주 유기체로서 사용하기 위한, 제 1 항에 따르는 미생물 기탁번호 DSM 7160로 기탁된 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체의 용도.
단백질의 동종 발현 및 이종 발현을 시키기 위해 숙주 유기체로서 사용하기 위한, 제 1 항에 따르는 미생물 기탁번호 DSM 7340로 기탁된 N-글리코실화에 결함이 있는 효모 돌연변이체의 용도.