NO312246B1 - Gj¶rmutanter med N-glykosyleringsdefekter, fremgangsmåte for fremstilling av gj¶rmutanter, og anvendelse av disse, samtfremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein - Google Patents
Gj¶rmutanter med N-glykosyleringsdefekter, fremgangsmåte for fremstilling av gj¶rmutanter, og anvendelse av disse, samtfremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein Download PDFInfo
- Publication number
- NO312246B1 NO312246B1 NO19932811A NO932811A NO312246B1 NO 312246 B1 NO312246 B1 NO 312246B1 NO 19932811 A NO19932811 A NO 19932811A NO 932811 A NO932811 A NO 932811A NO 312246 B1 NO312246 B1 NO 312246B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dsm
- yeast
- mutants
- god
- glycosylation
- Prior art date
Links
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 65
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 62
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 76
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 61
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 61
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 61
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 30
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 claims description 11
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 11
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 11
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 10
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 10
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 22
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 2
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 abstract 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 24
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 4
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 3
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- LSGOVYNHVSXFFJ-UHFFFAOYSA-N vanadate(3-) Chemical compound [O-][V]([O-])([O-])=O LSGOVYNHVSXFFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZZWJKGOHMNBBHB-UHFFFAOYSA-N 1-(2,3,4-trinitrophenyl)-1h-tetrazol-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[O-][N+](=O)C1=C([N+]([O-])=O)C([N+](=O)[O-])=CC=C1[NH+]1N=NN=C1 ZZWJKGOHMNBBHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102100024023 Histone PARylation factor 1 Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 108010005335 mannoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000005664 protein glycosylation in endoplasmic reticulum Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150106774 9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103561 ALG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000009133 Arylsulfatases Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100026662 Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001044438 Homo sapiens Intraflagellar transport protein 52 homolog Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022470 Intraflagellar transport protein 52 homolog Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108091006036 N-glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000462573 Resupinatus niger Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074417 SSC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004133 Sodium thiosulphate Substances 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical group [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 101150109301 lys2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 108010078692 yeast proteinase B Proteins 0.000 description 1
- -1 α-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
- C12N1/185—Saccharomyces isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Saccharomyces-mutanter med N-glykosyleringsdefekter erholdes ved hjelp av [H]-mannose-suicidalseleksjon, innføring av én eller flere selektive markører, utvelgelse av de stammer som etter transformasjon med plasmidet YEpL/GOD og dyrkning under standardbetingelser utskiller 10 mg/l GOD eller mer i kulturmediet, er allele med ngd-mutasj onene erholdt i Sacciiaro-myces cerevisiae DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 og/eller 7340, og som uttrykker proteiner med en enhetlig karbohydratstruktur.
Description
Foreliggende oppfinnelse angår gjærmutanter med N-glykosyleringsdefekter, så vel som fremgangsmåte for fremstilling av slike gjærmutanter, anvendelse av disse til ekspresjon av hypoglykosylerte proteiner, samt fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein i hypoglykosylert form uten kontaminering med ytre kjede-glykosylering
(GlcNac2, Man50.100) i krav 6.
Et protein kan etter translasjon utstyres med karbo-hydrater på tre forskjellige måter. Man skjelner mellom:
<*> N-glykosylering
- N-glykosidisk binding av karbohydratkjeden til Asn
<*> O-glykosylering
- O-glykosidisk binding av karbohydratkjeden til Thr
eller Ser
<*> Glykosyl-fosfatidyl-inositolanker (GPI)
- Bestanddel av noen membranproteiner,
- GPI-ankeret tjener som innføyelse i fosfolipidmembranen.
Glykosyleringen av proteiner er f.eks. beskrevet i:
- Kukuruzinska, M.A. et al., Ann. Rev. Biochem. 5_6 (1987) 915-944; - Paulson, C.P., TIBS 14 (1989) 272-276; - Warren, C.E., BFE 7 (1990) 392-395; - Ballou, C.E., i Strathern, J.N. et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York, s. 355-360 (1982).
- Kornfeld, R.; Kornfeld, S., Ann. Rev. Biochem. 54 (1985) 631-664 ; - Tanner, W.; Lehle, L., Biochim. Biophys. Acta 906 (1987) 81-99; - Innis, M.A., i: Barr, P.J. et al., Yeast genetic engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, s. 233-246 (1989).
Den O-glykosidiske karbohydratstruktur av gjærproteiner består av en ikke forgrenet mannosekjede på 1-5 mann-oserester. O-glykosyleringen starter i ER (overføring av den første mannoserest) og avsluttes i Golgi-apparatet.
N-glykosyleringen finner sted i to trinn. På et lipidbærerintermediat oppbygges en kjerneenhet av N-acetyl-glukosamin, mannose og glukose som i ER overføres på Asn-rester av "glykoproteiner". Etter bearbeidelse av den proteinbundne kjerneenhet (avspaltning av glukoserestene og en spesifikk mannoserest i ER) blir sukkerstrukturen forlenget i Golgi-apparatet (ytre kjede-glykosylering). Strukturen av den ytre kjede-glykosylering er organismespesifikk.
Ytrekjede-glykosyleringen av utskilte gjærproteiner er av "høy" mannosetype, dvs. at den består av en lang poly-mannose-oligosakkaridkjede. Heterologt utskilte proteiner i gjær utstyres likeledes med denne gjærspesifikke, ytrekjede-glykosylering av "høy" mannosetype, hvilket også betegnes som hyperglykosylering. Den er i mange tilfeller uønsket fordi det derved dannes et heterogent proteinprodukt (karbohydratande1, molekylvekt). På grunn av den heterogene karbohydratandel kan dessuten proteinrensingen vanskeliggjøres. Hyperglykosyler-ingen kan av steriske årsaker forhindre den posttranslatoriske bearbeidelse (f.eks. modning av et "prepro"-protein til nativt protein gjennom proteolytisk avspaltning av prepro-segmentene), henholdsvis redusere spaltningseffektiviteten (Bekkers, A.C.A.P.A. et al., Biochim. Biophys. Acta 1089 (1991) 345-351). Den spesifikke aktivitet (i enheter/vektenhet) av hyperglykosylerte enzymer er dessuten redusert på grunn av den økte karbohydratandel. Den gjærspesifikke "ytre kjede"-glykosylering er dessuten sterkt immunogen, noe som er uønsket ved tera-peutisk anvendelse.
Glukoseoksidasen (GOD) fra Aspergillus niger er en naturlig utskilt N-glykosylert homodimer (molekylvekt/underenhet (UE) : ca. 80 kDa, kofaktor: 1 FAD/UE, 1 SS-bro/UE) . GOD heterologt uttrykt i Saccharomyces cerevisiae, utskilles meget effektivt i mediet. Enzymet er enzymatisk aktivt, men gjennom en ikke enhetlig "ytre kjede"-glykosylering av inntil 150 man-noserester er det imidlertid med hensyn til karbohydratandelen og molekyl vekten heterogent. GOD isolert fra A. niger har i motsetning til dette en forholdsvis enhetlig karbohydratstruktur (kjerneglykosylering). - Kriechbaum, M. et al., FEBS Lett. 255 (1989) 63-66; - Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 3793-3802; - De Baetselier, A. et al., Biotechnology 9 (1991) 559-561; - Whittington, H. et al., Curr. Genet. 18 (1990) 531-536;
- Rosenberg, S., WO 89/12675.
Den uttrykte/utskilte GOD i gjær har dessuten gjennom hyperglykosylering en lavere spesifikk aktivitet (enheter/g enzym) sammenlignet med enzymet isolert fra A. niger. GOD utskilt i A. niger, har en forholdsvis enhetlig karbohydratstruktur "kjernelignende" glykosylering, molekylvekt/UE: ca. 80 kDa) .
De N-glykosyleringsutskilte gjærproteiner er som regel heller ikke enhetlige. Dette er f.eks. kjent for den eksterne S. cerevisiae-invertase (Reddy, V.A. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6978-6985; Ziegler, F.D. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6978-6985). Av invertasens 14 potensielle sekvenskodoner (sekvenskodon, glykosyleringssted, aminosyre-sekvensmotiv: Asn-X-Ser/Thr) blir 13 fullstendig eller partielt glykosylert. Av de 13 benyttede sekvenskodoner blir imidlertid gjennomsnittlig kun 9-10 glykosylert pr. invertaseunderenhet. Et gjennom proteinsekvensen definert sekvenskodon kan
i) alltid være glykosylert,
ii) aldri være glykosylert, eller
iii) kun noen ganger være glykosylert.
Et definert sekvenskodon besitter videre enten en kort oligosakkaridkjede (GlcNAc2Man8.15) eller en lang poly-mannose-oligosakkaridkjede (GlcNAc2ManSo.10o) • Den observerte, heterogene N-glykosylering av invertasen er betinget gjennom: i) kun delvis glykosylering av de potensielt benyttede sekvenskodoner pr. molekyl (f.eks. rent tilfeldig blir kun 3 av 5 potensielt benyttede sekvenskodoner glykosylert) ,
ii) tilstedeværelse av korte kjerne-oligosakkarider og lange
polymannosekjeder (ytre kjede), og
iii) variasjon av kjedelengden for den ytre kjede.
For å erholde glykoproteiner med redusert, henholdsvis manglende karbohydratande1, følgelig med enhetlig karbohydratandel, er følgende fremgangsmåter kjente:
<*> Ekspresjon av genet som koder for glykoproteinet i nærvær
av inhibitorer av glykosyleringen (f.eks. tunikamycin) henholdsvis vesikkeltransporten (f.eks. "Brefeldin A")
<*> Enzymatisk deglykosylering av proteinet in vitro f.eks. med endo F eller/og endo H eller/og N-glykosidase F <*> Fjerning/forandring av glykosyleringssteder gjennom mutagenese på DNA-nivå * Anvendelse av glykosyleringsdefekte vertsstammer.
Gjærmutanter med endret N-glykosylering er kjente. Man skjelner mellom sekresjonsmutanter med blokkert sekresjon og mutanter som utskiller proteiner med endret N-glykosylering. Sekresjonsmutanter besitter en lokalisert blokkering i sekresjonsmaskineriet, hvorved ufullstendig N-glykosylerte proteiner akkumuleres i de tilsvarende celleområder.
F.eks.:
* sec-mutanter ("secretion defective") fra R. Schekman,
- Novick, P. et al., Cell 21 (1980) 205-215;
- Schekman, R. og Novick, P., i: Strathern, J.N. et al.,
The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Cold
Spring Laboratory, New York, s. 361-398 (1982);
* bet-mutanter ("blocked early in transport") av S. Ferro-Novick,
- Ferro-Novick, S. og Newman, A.P., J. Cell. Biol. 105
(1987) 1587-1594;
<*> yptl-mutant fra D. Gallwitz,
- Schmitt, H.D. et al., Cell 47 (1986) 401-412:
- Schmitt, H.D. et al., Cell 53 (1988) 635-647;
* sari-mutant fra M. Muramatsu,
- Nakano, A. og Muramatsu, M., J. Cell. Biol. 109 (1989) 2677-2691.
N-glykosyleringsdefekte mutanter disponerer som regel over en funksjonsdyktig sekresjonsvei. Defekt N-glykosylering kan bero på forskjellige gendefekter, som f.eks. mutasjoner
* i det karbohydratoppbyggende (modifiserende) enzymsystem,
* i det cellulære proteintransportsystem (sortering, mål-retting) .
Ved sorterings- og målrettingsmutanter omgås ved sekresjonen av proteiner f.eks. Golgi-apparatet, henholdsvis delområder av Golgi-apparatet, i en "bypass", hvor Golgi-apparatet er den cellestruktur hvori bl.a. reaksjonene ved den ytre kjede-glykosylering finner sted.
* mnn-mutanter ("mannan defective") fra CE. Ballou,
- Ballou, L. et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 5986-5891; - Ballou, C.E., Methods Enzymol. 185 (1990) 440-470; - Ballou, C.E., i: Strathern, J.N. et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Cold Spring Harbor
Laboratory, New York, s. 355-360 (1982);
<*> vrg-mutanter ("vanadat resistant glycosylation") fra
CE. Ballou,
- Ballou, L. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 88 (1991) 3209-3212 ;
<*> alg-mutanter ("asparagine-linked glycosylation defective") fra R. Robbins,
- Huffaker, T.C og Robbins, P.W., Proe. Nati. Acad. Sei.
80 (1983) 7466-7470; - Runge, K.W. og Robbins, P.W., i: Bonventre, P.F. et al., Microbiology, American Society for Microbiology,
Washington, D.C, s. 312-316 (1986);
<*> pmrl (sscl)-mutant fra G. Fink, (D.T. Moir),
- Duncan, M.J. og Smith, R.A., EPA 0 211 208; - Fink, G.R., EPA 0 382 332; - Rudolph, H.K. et al., Cell 58 (1989) 133-145;
<*> erdl-mutant ("endoplasmatic reticulum retention defective") fra H.R.B. Pelham,
- Hardwick, K.G. et al., EMBO J. 9 (1990) 632-630.
Mutanter med en blokkering i sekresjonsveien er selv-sagt ikke egnet for bioteknologiske formål (homolog og heterolog sekresjon av proteiner).
Et flertall av de N-glykosyleringsdefekte mutanter er betinget letale, dvs. at de under normale betingelser (dyrk-ningstemperatur 3 0°C) ikke er levedyktige og besitter en temperatursensitiv (ts) fenotype, som f.eks. mutantene algl, alg2, alg4, betl, bet2, nesten alle sec-mutanter og yptl (kulde-sensitive).
En temperatursensitiv fenotype betyr at den letale ts-mutasjon først kommer til uttrykk etter et temperaturskift fra f.eks. 26°C (tillatte vekstbetingelser) til 37°C (ikke-tillatte vekstbetingelser). Det er forståelig at også disse mutanter er lite egnede for bioteknologiske formål. En mutant-gruppe som er kjennetegnet ved en sterkt redusert (mnn7, mnn8, mnnlO) til nesten fullstendig manglende ytre kjede-glykosylering, henholdsvis modifisert kjerneglykosylering (mnn9), har følgende mangler: celleveksten foregår langsommere, cellene er morfologisk forandret og lyserer allerede under dyrkningen slik at disse mutanter kun kan dyrkes i osmotisk stabiliserte medier
(tilsetning av ca. 0,5 M KCl, hhv. ca. 1 M sorbitol).
I tillegg oppviser noen av de i litteraturen beskrevne N-glykosyleringsdefekte mutanter (f.eks. algl) en defekt som kun delvis kommer til uttrykk i cellene ("leaky"). Dette fører til en heterogen N-glykosylering (kontaminering, overlapping gjennom villtype-N-glykosylering) .
Gjærstammer som er i stand til å uttrykke/utskille proteiner med forkortet, henholdsvis manglende, ytre kjede-N-glykosylering, er f.eks. beskrevet i EP-A 0 344 864. Stammene beskrevet i foreliggende søknad, stammer alle fra mnn9-mutasjonen beskrevet av CE. Ballou. Mnn9-mutantstammene har en tendens til å lysere under veksten og må derfor stabiliseres osmotisk (se ovenfor).
Gjærstammene beskrevet i EP-A 0 314 096, er også likeledes basert på mnn9-mutasjonen. Stammene er slik forbedret med hensyn til lyseømfintlighet at det kan gis avkall på osmotiske stabilisatorer i mediet.
MNN9-genet ble således klonet og en tilsvarende stamme konstruert, hvori MNN9-genet står under kontroll av en "eksternt" regulerbar promotor. Derved oppnås det at det, f.eks. under celledyrkningsfasen, er tilgjengelig tilstrekkelig MNN9-genprodukt til syntese av nødvendige cellulære, glykosylerte vertsproteiner, og at mnn9-mutasjonens ønskede N-hypoglykosylerte proteiner kun kommer til uttrykk i den egent-lige produksjonsfase.
Denne metode har imidlertid følgende mangler:
<*> Celledyrkningen kompliseres i vesentlig grad.
<*> Etter oppnåelse av den ønskede celletetthet må MNN9-genet avkobles, f.eks. gjennom et temperaturskift i kulturen,
før syntesen av de ønskede N-hypoglykosylerte proteiner
induseres.
<*> Etter avkobling av MNN9-genet besitter cellene mnn9-fenotypen, dvs. de vokser dårlig, osv. (se ovenfor). <*> Fremdeles forekommende aktivt MNN9-genprodukt kan til tross for avkobling av MNN9-genet allerede ved indusert produkt-syntese føre til syntese av mindre mengder av de ikke ønskede hyperglykosylerte proteinprodukter.
Det er videre kjent at gjærsekresjonsmutanter (super-sekresjonsmutanter) ofte utskiller hypoglykosylerte glykopro-
teiner. Et slikt eksempel er beskrevet i EP-A 0 382 332.
Den molekylære årsak til sscl (pmrl)-mutasjonen er høyst sannsynlig basert på inaktiveringen av en D-type ATPase som deltar i vesikkeltransporten mellom ER og Golgi-komplekset. Det er antatt at gjennom ødeleggelse av SSC1-genet skades cel-lenes sorteringsmekanisme, hvorved det åpnes en alternativ sekresjonsvei under omgåelse av Golgi-systemet i hvilket den ytre kjede-glykosylering vanligvis finner sted.
Ulempen ved sscl-mutasjonen er spesielt:
<*> sscl-mutasjonen forårsaker en Ca-avhengig vekst. Mutantstammene vokser dårlig ved lav Ca-konsentrasjon. <*> Den forhøyede sekresjon (f.eks. prochymosin, u-PA og t-PA) er avhengig av genproduktet. Den heterologe sekresjon av a-1-antitrypsin og sekresjonen av homologe enzymer (invertase i periplasmaet og alkalisk fosfatase, proteinase B og karboksypeptidase Y i vakuolen) blir ikke forhøyet (Moir,
D.T., i: Barr, P.J.; Brake, A.J. et al., Yeast genetic engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, s. 215-231
(1989)).
Oppgaven ved foreliggende oppfinnelse var å unngå disse ulemper og tilveiebringe godt voksne gjærmutanter som uttrykker proteiner i hypoglykosylert form, fordi det i bioteknologien foreligger et behov for gjærstammer med god vekst og utskillelse for den homologe og heterologe sekresjon av proteiner med enhetlig definert N-glykosylering.
Denne oppgave er løst gjennom gjærmutanter med defekter i N-glykosyleringen (ngd-mutanter, "N-glykosyleringsdefekte") som kan erholdes gjennom [H3] -mannose-suicidalseleksjon, innføring av én eller flere selektive markører (auksotrofibehov og/eller resistenser) og utvalg av de mutanter som etter transformasjon med plasmidet DSM 7038 og dyrkning i fullstendig medium med 2% gjærekstrakt, 4% baktopepton,
Difco, 0,1 mol/l fosfatbuffer, pH 7,0, 1% fruktose og 6% maltose, etter inkubasjon i 3-4 dager under omrøring, utskiller GOD i en mengde på 10 mg/l eller mer og er allel til Saccharomyces cerevisiae DSM 7042, DSM 7160, DSM 7338 og/eller DSM 7340 .
Prinsippet for [3H] -mannose-suicidalseleksjonen ut-gjøres i det vesentlige av: - Mutagenese (av en vi11typestamme, f.eks. X2180-1A;
ATCC 26786)
- Inkubasjon med [3H] -mannose.
- Anrikning av hyperglykosyleringsdefekte mutanter gjennom lagring av cellene ved lave temperaturer, fortrinnsvis ved ca. -80°C, inntil overlevelsesgraden av cellene er sunket med 2-3 tierpotenser fra den opprinnelige verdi, fortrinnsvis er varigheten av lagringen 2 til 4 måneder. - Utvelgelse av mutanter med redusert N-glykosylering ved hjelp av homologt uttrykt invertase. - Analyse ved hjelp av aktivitetsfarging og/eller immun-utfelling av utskilt invertase og bestemmelse av molekylvekten av invertasen, fortrinnsvis ved hjelp av SDS-PAGE. Fra den bestemte molekylvekt kan omfanget av glykosyleringen bestemmes.
[<3>H]-mannose-suicidalseleksjonen er en effektiv metode for fremstilling og isolering av gjærmutanter (Littlewood, B.S., i: Methods of Cell Biology, Prescott, D.M. (red.); Aca-demic Press, New York, (1975), vol. IX, s. 273-285). Ved denne fremgangsmåte forårsakes gjennom tritiummerket mannose, som f.eks. innbygges i cellens glykoproteiner, celledød for en del av gjærcellene. Ved overlevende celler inntreffer eksempelvis en endring i karbohydratmetabolismen og/eller glykoproteinsyn-tesen (Pouyssegur, J., Proe. Nati. Acad. Sei. 77, 2698-2701
(1980); Hirschberg, C.B. et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981), 902-909; Huffaker, T.C. og Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 257
(1982), 3202-3210). For å erholde mutanter som
inneholder en defekt i den ytre kjede-glykosylering av gjær-mannoproteiner, ble [<3>H]-mannose-suicidalseleksjonen utvalgt. Derved ble det utgått fra den antagelse at glykosyleringsdefekte mutanter innebygger mindre radioaktiv mannose enn villtypeceller, og viser dessuten en forhøyet resistens overfor påvirkningen av [<3>H]-mannose. For å unngå uspesifisiteter som skyldes metabolismen av mannose, anvendes fortrinnsvis mannose derivatisert med tritium i posisjon 2.
Den velgbare markør (auksotrofimarkør og/eller resistens) kan gjennom krysning av gjærstammene innføres i diploider (isolering av zygotene gjennom mikromanipulering) og eventuelt etter sporulering i haploider (tetradenanalyse). Egnede, velgbare markører er f.eks. auksotrofimarkørene ura3, leu2, trpl, lys2, his3, his4 og ade2, eller genet som gir resistens mot f.eks. kobber (CUPl-gen) eller G418 (Tn601(903) aminoglykosidfosfotransferasegen) (Bitter, G.A. et al., Methods Enzymol. 153 (1987) 516-543).
De N-glykosyleringsdefekte mutanter kan inneholde en defekt i NGD2 9-genet og/eller NGD62-genet.
Ngd-fenotypen kan påvises ved aktivitetsfarging av invertase ved hjelp av native PAGE-geler med sakkarose og 2 , 3,4-trinitrofenyltetrazoliumklorid som substrat/glukosereagens.
Den tilstrekkelige GOD-produksjon kan bestemmes gjennom aktivitetsbestemmelse av GOD utskilt i mediet etter dyrkning under standardbetingelser. Stammen som skal testes (GOD-transformant) inkuberes derved, etter utførelse av en selektiv forkultur, i fullstendig medium i 3-4 dager under omrøring. Det fullstendige medium tilsettes fortrinnsvis gjærekstrakt, baktopepton, fruktose og maltose ved nøytral pH-verdi.
Bestemmelsen av glukoseoksidase utføres eksempelvis etter fremgangsmåten beskrevet i eksemplene under "Generelle metoder".
Egnede mutanter ved foreliggende oppfinnelse (allele mutanter) kan finnes ved hjelp av en test ved hvilken det analyseres om testmutantene oppviser en mutasjon i det samme gen som gjærstammene DSM 7042 eller DSM 7338 (ngd29) og DSM 7160 eller DSM 7340 (ngd62) .
Ved denne test krysses teststammen med en gjærstamme fra gruppen DSM 7042/7338 og gruppen DSM 7160/7340, og de derved erholdte diploide stammer analyseres.
Testmutasjonen (stammen) er allel med ngd-mutantene (DSM 7042, DSM 7338, ngd29) og/eller (DSM 7160, DSM 7340, ngd62) ifølge foreliggende oppfinnelse når mutasjonene ikke kompenseres i diploide celler.
Testmutasjonen (stammen) er ikke allel med ngd-mutantene (DSM 7042, DSM 7338, ngd29) og/eller (DSM 7160, ngd62) ifølge foreliggende oppfinnelse når mutasjonene komplementeres i de diploide celler og fører til en villtypefenotype med hensyn til N-glykosylering.
Foretrukne gjærstammer anvendt ved foreliggende oppfinnelse, er stammene DSM 7042, DSM 7160, DSM 7338 og/eller DSM 7340.
Et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av gjærmutanter med defekter i N-glykosyleringen ved hjelp [3H] -mannose-suicidalseleksjon, innføring av én eller flere selektive markører (auksotrofi og/eller resistensmarkører), utvelgelse av de stammer som etter transformasjon med plasmidet DSM 7038 og fermentering i fullstendig medium med 2% gjærekstrakt, 4% baktopepton, Difco, 0,1 mol/l fosfatbuffer, pH 7,0, 1% fruktose og 6% maltose, etter 3-4 dagers inkubasjon under omrøring utskiller GOD i en mengde høyere enn 10 mg/l i mediet, og som er allele med Saccharomyces cerevisiae DSM 7042, DSM 7160, DSM 7338 og/eller DSM 7340.
Det er foretrukket at det fremstilles Saccharomyces cerevisiae DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 og/eller DSM 7340.
Et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse er anvendelse av gjærmutantene ifølge foreliggende oppfinnelse som vertsorganisme for homolog og heterolog ekspresjon av proteiner. For fremstilling av gjærspesifikke glykoproteiner (f.eks. eksterne invertaser, sure fosfataser, endoglukanaser og celle-veggmannoproteiner) fermenteres gjærstammene ifølge foreliggende oppfinnelse, og det ønskede glykoprotein isoleres og renses fra cellene eller kultursupernatanten etter kjente fremgangsmåter.
Det erholdes derved heterologe proteiner ved at gjærmutanter ifølge foreliggende oppfinnelse transformeres med et rekombinant DNA som inneholder genet for glykoproteinene som skal uttrykkes. På denne måte kan det f.eks. fremstilles glukoseoksidase, al-mikroglobulin, erytropoietin og glukoamylase. Et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein i hypoglykosylert form uten kontaminering med ytre kjede-glykosylering (GlcNac2, Man50.ioo) / gjennom transformasjon av en gjærmutant ifølge krav 1 eller 2 med et annet rekombinant DNA som koder for det rekombinante proteinet, fermentering av mutanten og isolering av proteinet fra cellene eller kultursupernatanten.
Følgende materialer ble deponert; ved Deutschen Sammlung f vir Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1 B, D-3300 Braunschweig:
De etterfølgende eksempler gir en nærmere beskrivelse av foreliggende oppfinnelse.
Eksempler
Generelle metoder
Rekombinant DNA- teknikk
For manipulering av DNA ble det anvendt standard-metoder som beskrevet av Maniatis, T. et al., i: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989). De molekylærbio-logiske reagenser ble anvendt i overensstemmelse med produsen-tens instruksjoner.
G i ærtrans formas i on
Saccharomyces cerevisiae-stamme ble transformert i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Beggs, J.D. (Nature 275 (1978) 104-109; Ito, H. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168 eller Delorme, E. (Applied and Environmental Microbiology 55 (1989) 2242-2246). Som karbonkilde for den glukose-oksidaseuttrykkende gjærstamme ble det anvendt fruktose i stedet for glukose.
Bestemmelse av qlukoseoksidaseaktiviteten
GOD-aktivitetsbestemmelsen ble utført i et volum på
1 ml i 0,1 mol/l kaliumfosfatbuffer, pH 7,0, mettet med oksy-gen, med 0,18 mol/l glukose, 15 enheter/ml pepperrotperoksi-dase og 1,75 mmol/1 "ABTS" glukosereagens, ved 25°C. Reak-sjonen ble startet ved tilsetning av glukoseoksidase (10 pl GOD-holdig probe fortynnet til 5-20 mU/ml), og absorpsjons-endringen/min (AA/min) ved 405 nm ( 6405 = 36,8 [mmol"<1> x 1 x cm" x] ) ble bestemt. 1 enhet (U) GOD-aktivitet er definert som den mengde enzym som oksiderer 1 umol glukose pr. minutt ved 25°C. Den spesifikke aktivitet av den rensede R. niger- GOD er under disse testbetingelser ca. 230 U/mg protein.
Proteinbestemmelser
Proteinbestemmelsene ble utført etter mikrobiuret-metoden (Zamenhof, S. et al., Methods Enzymol. 3 (1957) 696-704) med bovint serumalbumin som standard.
Proteinkonsentrasjonen av renset GOD-enzym ble funnet ved hjelp av den optiske tetthet ved 280 nm (1 OD280 e 1,5 mg/ml renset GOD)
Cellelysis og fremstilling av råekstrakt
Cellene fra 5 ml dyrkningsmedium (ca. 0,1-0,2 g gjær, våtvekt) ble sentrifugert ned. Cellepelleten ble vasket én gang med 10 mmol/1 fosf atbuf fer, pH 7,0, og deretter knust ved homogenisering med glassperler i en hvirvelmikser (Ciriacy, M., Mut. Res. 29 (1975) 315-326). Deretter ble cellene resuspendert/ekstrahert i 2 ml 10 mmol/1 fosfatbuffer, pH 7,0, cellerestene ble frasentrifugert og supernatanten ble videre-
bearbeidet som råekstrakt.
SDS- polyakrylamidqelelektroforese ( SDS- PAGE)
Oppløselige prober (mediesupernatanter og celle-
i lysater) ble tilsatt 1/5 volum av 5xSDS-probebuffer (lxSDS-probebuffer: 50 mmol/1 Tris-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% merkaptoetanol, 10% glyserol, 0,001% bromfenolblått) og inkubert i 5 minutter ved 95°C. Uløselige proteiner fra cellerestfrak-sjonen ble ekstrahert med 2 ml lxSDS-probebuffer og 6-8 mol/l urea, denaturert ved oppvarming i 5 minutter ved 95°C og atskilt fra de uløselige bestanddeler ved sentrifugering. Deretter ble proteinene atskilt ved hjelp av SDS-PAGE (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) og farget med Coomassie-brilliantblått.
i
Eksempel 1
Konstruksjon av plasmider for utskillelse av A . niger- GOD i
S . cerevisiae
Konstruksjon av qjærekspresjonsvektoren YEpL ( basisvektor)
Plasmidet YEpL er basert på aglukosidasevektoren YEp/5C6b3 (Kopetzki et al., Yeast 5 (1989) 11-24; Kopetzki et al., EP-A 0 323 838). Til replikasjon i plasmidet i E. coli
tjener det 2,3 kbp lange EcoRI/PvuII-fragment fra plasmidet pBR322 (plasmidopprinnelse, ampicillinresistensgen). Til replikasjon i gjær inneholder vektoren det 2,2 kbp lange EcoRI-fragment fra gjærens 2 um DNA (subklonet fra E. coli/- gjær-skyttelvektor YEp24). Vektoren inneholder dessuten URA3-og LEU2d-genet for seleksjon av plasmidet i auksotrofe gjærstammer og en aglukosidase-ekspresjonskassett (GLUCPI-gen).
Den består av aglukosidasepromotoren, en polylinker (klonings-sted for ekspresjonsgen) og aglukosidaseterminatoren. MAL2-8cp-genet er dessuten til stede, hvis genprodukt, MAL2-8cp-proteinet, aktiverer aglukosidasepromotoren. aglukosidasepromotoren er hemmet i nærvær av glukose. Den avhemmes etter for-bruk av glukosen og når sin maksimale aktivitet etter tilfør-sel av maltose.
1. 1 Konstruksjon av plasmidet YEp/ KL6b3
Den unødvendige ca. 1,4 kbp lange DNA-sekvens mellom aglukosidaseterminatoren og MAL2-8cp-promotoren ble delert fra plasmidet YEp/5C6b3 (figur 1).
Plasmidet YEp/5C6b3 ble linearisert med Xhol, de 5'-overhengende ender ble utfylt med Klenow-polymerase, plasmidet ble deretter kuttet med Mrol, og det 8,7 kbp lange Mrol/Xhol-(butte)-vektorfragment ble isolert. I et andre trinn ble plasmidet YEp/5C6b3 oppsluttet med restriksjonsendonukleasene Mrol og Seal, aglukosidasegenet inneholdende det 2,5 kbp lange MroI/Scal-fragment ble isolert og ligert med det 8,7 kbp lange MroI/XhoI(butte)-vektorfragment. Det ønskede plasmid ble identifisert ved hjelp av restriksjonskartlegging og gitt beteg-nelsen YEp/KL-6b3.
1. 2 Konstruksjon av plasmidet YEp/ KL- 6b3M
En Mlul-linker (5'-GACGCGTC-3') ble ligert inn i Sspl-restriksjonsendonukleasespaltningssetet for MAL2-8cp-genets 5'-utranslaterte område. Plasmidkonstruksjon: YEp/KL-6b3M.
1. 3 Konstruksjon av plasmidet YEp/ KL- 6b3M- MCS
Ved hjelp av polymerasekjedereaksjons(PCR)teknikk (Mullis, K.B. og Faloona, F.A., Methods in Enzymol. 155 (1987) 335-350) ble aglukosidasens strukturgen fjernet og erstattet ved hjelp av en DNA-linker (multikloningssete, MCS).
GLUCPI-promotorsekvensen fra plasmidet YEp/KL-6b3M ble amplifisert ved hjelp av PCR under anvendelse av primerparet (se SEKVENS.ID. NR. 1 og SEKVENS.ID. NR. 2)
og det ca. 410 bp lange PCR-produkt ble isolert etter agarosegelelektroforese. I en andre PCR-reaksjon ble GLUCPI-terminatorsekven-sen fra plasmidet YEp/KL-6b3M amplifisert ved anvendelse av primerparet (se SEKVENS.ID. NR. 3 og SEKVENS.ID. NR. 4)
og det ca. 860 bp lange PCR-produkt ble isolert etter agarosegelelektroforese.
Deretter ble ekvimolare mengder (ca. 50 pg) av de isolerte PCR-fragmenter blandet i PCR-reaksjonsblanding, inkubert i 5 minutter ved 95°C for å denaturere ds-DNA, reaksjons-blandingen ble avkjølt til 60°C for å annealere de komplemen-tære MCS-holdige, enkle DNA-tråder, hybridiseringsproduktene ble overført til dsDNA med Taq-polymerase og amplifisert i en tredje PCR-reaksjon under anvendelse av primerparet (se SEKVENS.ID. NR. 1 og SEKVENS.ID. NR. 4).
Deretter ble det ca. 1,27 kbp lange PCR-produkt oppsluttet med restriksjonsendonukleasene Mrol og Mlul, det ca. 0,92 kbp lange Mrol /Mlul -GLUPI -promotor/MCS/GLUCPI - terminator fragment ble isolert etter agarosegelelektroforese og ligert i det ca. 8,55 kbp lange MroI/MluI-YEp/KL-6b3M-vektdrfragment. Det ønskede plasmid YEp/KL-6b3M-MCS ble identifisert ved hjelp av restriksjonskartlegging, og DNA-domenene syntetisert ved hjelp av PCR, ble kontrollert ved DNA-sekvenser ing.
1. 4 Konstruksjon av plasmidet YEpL
I den følgende plasmidkonstruksjon ble LEU2d-genet innføyet i plasmidet YEp/KL-6b3M-MCS. Plasmidet YEp/KL-6B3M-MCS ble oppsluttet med Celll og SnaBI, og det 8,4 kbp lange CelIl/SnaBI-YEp/KL-6b3M-MCS-vektorfragment ble isolert. LEU2d-genet ble isolert som et ca. 2,32 kbp langt CelII/SnaBI-fragment fra plasmidet pADH040-2 (Erhart, E. og Hollenberg, C.P., J. Bacteriol. 156 (1983) 625-635) og ligert med det 8,4 kbp lange CelII/SnaBI-YEp/KL-6b3M-MCS-vektorfragment. Den ønskede plasmidkonstruksjon YEpL (DSM 7038) ble identifisert ved hjelp av restriksjonskartlegging (figur 2).
1. 5 Konstruksjon av plasmidet YEpL/ GOD
Kloningen av det anvendte glukoseoksidasegen (stamme: NRRL-3, ATTC 9029), subkloningen i pBluescript-SK(+)-vektoren, DNA-sekvenseringen og avledningen av GOD-proteinsekvensen er beskrevet i publikasjonen til Kriechbaum, M. et al., (FEBS Lett. 255 (1989) 63-66). GOD-genet ble i 2 delområder (Sall-restriksjonsfragmenter) klonet i pBluescript SK(+).
Plasmidet pSK/GOD-1.8 inneholder et ca. 1,8 kbp langt Sall-fragment som koder for det 5'-utranslaterte område og GOD-strukturgenets N-terminale domene til Sall-spaltnings-stedet i bp-posisjon 164 (bp-posisjon tilsvarende nummerer-ingen av Kriechbaum, M. et al.). Plasmidet pSK/G0D-2.0 inneholder et ca. 2,0 kbp langt Sall-fragment som koder for resten av GOD-strukturgenet fra bp-posisjon 165 til 1853, så vel som det 3'-utranslaterte område nedstrøms for GOD-strukturgenet.
Ved hjelp av PCR-teknikk ble GOD-genets 5'- og 3'-utranslaterte område fjernet, GOD-strukturgenet ble i begge ender utstyrt med enkle restriksjonsendonukleasespaltnings-seter (Bglll, henholdsvis PvuII), og dessuten ble det i GOD-strukturgenets C-terminale kodingsområde innført et enkelt SphI- og Nhel-spaltningssete under erholdelse av en DNA-sekvens som koder for det native GOD-protein. Deretter ble GOD-strukturgenet i en tref ragment liger ing sammensatt fra begge PCR-fragmentene og innføyet i vektoren YEpL. For amplifisering av det N-terminale GOD-strukturgen ble det følgende primerpar anvendt (se SEKVENS. ID. NR. 5 og SEKVENS. ID. NR. 6) og plasmid pSK/GOD-1.8 som templat-DNA.
For amplifisering av det resterende GOD-strukturgen ble det følgende primerpar anvendt (se SEKVENS.ID. NR. 7 og SEKVENS. ID. NR. 8) og plasmid pSK/GOD-2.0 som templat-DNA.
Det ca. 220 bp lange PCR-produkt fra den første reaksjon ble deretter spaltet med Bglll og Sali, og det ca. 130 bp lange BglII/SalI-fragment ble isolert. Det ca. 2,05 kbp lange PCR-produkt fra den andre reaksjon ble oppsluttet med Sali og PvuII, og det ca. 1,7 kbp lange DNA-fragment ble isolert. Deretter ble PCR-fragmentene ligert i det ca. 10,7 kbp lange Bglll/PvuII-YEpL-vektorfragment (trefragmentligering). Det ønskede plasmid YEpL/GOD (figur 3) ble identifisert ved hjelp av restriksjonskartlegging og partielt sekvensert (klonings-overganger).
1. 6 Konstruksjon av plasmidet YEpL/ GOD-( His) 4
Plasmidet inneholder et modifisert GOD-gen som koder for en GOD-enzymvariant som i tillegg inneholder 4 histidin-rester i den C-terminale ende. YEpL/G0D-(His)4 ble fremstilt fra plasmidet YEpL/GOD.
Plasmidet YEpL/GOD ble delvis spaltet med SphI og fullstendig spaltet med PvuII, det ca. 10,7 kbp lange
Sphl/PvuII-fragment ble isolert og ligert med den følgende DNA-linker fremstilt fra 2 oligonukleotider (se SEKVENS.ID. NR. 9 og SEKVENS. ID. NR. 10) gjennom hybridisering.
Det ønskede plasmid YEpL/GOD-(His )4 ble identifisert ved hjelp av kolonihybridisering med radioaktivt merket primer 10 som sonde og ytterligere analysert ved hjelp av restriksjonskartlegging og partiell sekvensering (GOD-strukturgenets C-terminale område).
Eksempel 2
Isolering av qjærvertsstammer med defekt N- qlykosvlering
2. 1 [ fol - mannose- suicidalmutaqenese
Prinsipp:
- Mutagenese (utgangsstamme: X2180-1A, genotype: a SUC2 mal mel gal2 CUP1; ATCC 26786)
- Inkubasjon med [<3>H]-mannose
- Anrikning av hyperglykosyleringsdefekte mutanter gjennom lagring av cellene ved -80°C inntil overlevelsesgraden av cellene er redusert til 2-3 tierpotenser (2-4 måneder)
En gjærstamme som f.eks. X2180-1A (ATCC 26786) dyrkes i YEPD-medium (2% baktopepton, 1% gjærekstrakt, Difco, og 4% glukose), høstes i den logaritmiske vekstfase (ca. 5 x IO<8 >celler), vaskes med 0,1 mol/l natriumfosfat, pH 7, og resuspenderes i 1,5 ml 0,1 mol/l natriumfosfat, pH 7. Cellene muta-geniseres ved tilsetning av 0,1 ml etylmetansulfonat i 1 time ved 25°C. 0,2 ml av de således behandlede celler inkuberes med 10 ml natriumtiosulfat (5% vekt/volum) i 10 minutter, vaskes tre ganger med 0,1 mol/l natriumfosf at, pH 7,0, og resuspenderes i YEPD-medium (2% baktopepton, 1% gjærekstrakt, Difco, og 4% glukose).
Cellene inkuberes ved 28°C under omrøring til det oppnås en OD på 0,6 ved 578 nm. 10<6> celler vaskes med YEP-medium (2% baktopepton, 1% gjærekstrakt, Difco) og resuspenderes i 0,1 ml YEP med 0,1% glukose. 2 mCi [<3>H]-mannose (spesifikk aktivitet 18,5 Ci/mmol) tilsettes, og kulturen inkuberes ved 28°C i 60 minutter. Cellene frasentrifugeres, vaskes med vann og resuspenderes i YEPD som inneholder 25% glyserol og lagres ved -70°C for innvirkning av radioaktiviteten.
Etter ca. 45-50 dager, når overlevelsesgraden av cellene er falt til 1,5-0,2%, utspres aliquoter av cellene på
YEP-agarplater med 2% mannose og inkuberes ved 30°C.
2. 2 Isolering av mutanter med redusert N- qlvkosvlerinq
Mutanter med en defekt i proteinglykosyleringen utvelges deretter med hensyn til deres evne til ikke å innbygge [<3>H]-mannose og innbygge [<35>S]-metionin. Ved dette lar man cellene vokse på YEPD-agarplater, kopierer gjærkoloniene over på 2 rødbåndsfiltere (Schleicher & Schiill, Dassel, Tyskland) og inkuberer filtrene på nytt på YEPD-plater i 6 timer. Et filter inkuberes deretter i en løsning av YEPD (en tilstrekkelig mengde til akkurat å fukte filteret) inneholdende 0,01 mCi/ml [<35>S]-metionin. Det andre filter fuktes med YEP inneholdende 0,2 mCi/ml [<3>H]-mannose og inkuberes i 30 minutter. Cellene/- koloniene fikseres på filteret med 5% trikloreddiksyre, vaskes med vann og aceton og analyseres ved hjelp av autoradiografi.
2. 3 Karakterisering av de positive kloner ved hjelp av nativ qelelektroforese av ekstern invertase
SUC2-genet fra S. cerevisiae koder for 2 forskjellig regulerte og områdeavgrensede invertaseformer, i) en glykosylert invertase som overveiende utskilles i periplasma og ii) en intracellulær, noe forkortet, ikke-glykosylert form (Carlson, M. et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 439-447). Invertasen inneholder 14 potensielle N-glykosyleringssteder av hvilke gjennomsnittlig 9-10 glykosyleres pr. invertaseunderenhet i den utskilte form. Ekstern vi11type-invertase be-veger seg på grunn av ikke-enhetlig ytre kjede-glykosylering som diffuse bånd i native geler. Den cytoplasmatiske, ikke-glykosylerte form gir i motsetning til dette et skarpt bånd etter aktivitetsfarging. En endret N-glykosylering kan således analyseres ved hjelp av vandringshastigheten og båndskarpheten av ekstern invertase i native geler.
Gjærstammene (X2180-1A villtypestamme og positive kloner) ble dyrket over natten i 5 ml YEPS-medium (1% gjærekstrakt, 2% baktopepton, Difco, og 2% sakkarose), cellene ble høstet i den senlogaritmiske vekstfase, vasket én gang med 20 mmol/1 natriumazid og knust ved homogenisering med glassperler i en hvirvelmikser. Fremstillingen av cellelysat, den native gelelektroforese og aktivitetsfarging av invertase med sakkarose og 2,3,4-trinitrofenyltetrazoliumklorid som sub-strat/glukosereagens, ble utført i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Ballou CE. (Methods Enzymol. 185 (1990) 440-470).
De positive kloner lar seg ved hjelp av invertase-aktivitetsfargingen inndeles i fire klasser:
1. Mutanter med villtype-invertasemobilitet.
2. Mutanter som hverken syntetiserer ikke-glykosylerte eller glykosylerte invertaser. 3. Mutanter med defekter i den ytre kjede-glykosylering (distinkt oligomerbåndmønster av 3-4 bånd). 4. Mutanter som fører til en utpreget underglykosylering av invertase (høyere mobilitet enn villtype-invertase).
Resultat
Mutantstammer av klasse 4, i det etterfølgende beteg-net som ngd29 (DSM 7042/7338) og ngd62 (DSM 7160/7340) (ngd betyr: "N-glykosyleringsdefekte"), syntetiserer sammenlignet med utgangsstamme X2180-1A en "enhetlig glykosylert" dimer ekstern invertase (skarpe bånd og forhøyet vandringshastighet i native geler etter aktivitetsfarging). ngd-mutantstammene var osmotisk stabile, kunne dyrkes ved 30°C og aggregerte ikke under dyrkningen.
Eksempel 3
Konstruksjon av qlykosylerinqsdefekte gjærvertsstammer for ekspresjon av homologe og heterologe proteiner
For å innføre én eller flere gjennom transformasjon komplementerbare auksotrofier ble ngd-mutantene krysset med egnede arbeidsstammer i overensstemmelse med metoden ifølge F. Sherman et al. (Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981)), og diploide stammer ble isolert ved hjelp av mikromanipulering. Deretter ble de diploide stammer sporulert, og utskilte stammer med egnede auksotrofier (f.eks. ura3, leu2) og ngd-mutasjon ble isolert.
ngd29-mutanten ble inkubert sammen med stammen DBY746
(MATa ura3-52 leu2-3,-112 trpl-289a his3-Al; [DSM 4316] ekvi-valent med ATCC 44733) og ngd62-mutanten ble inkubert sammen med stammen JM1935 (MATa ura3 leu2 his4, DSM 7156) i 6 timer ved 39°C i YEPD (1% gjærekstrakt, 2% baktopepton, Difco, og 2% glukose). Deretter ble zygoter isolert ved hjelp av en mikro-manipulator (modell: etter de Fonbrune, firma Bachhofer, Reut-1 ingen) og dyrket i 5 ml YEPD over natten. Cellene ble sentrifugert i kort tid, mediet ble dekantert fra til et volum på ca. 0,2 ml, og cellepelleten ble resuspendert i restmediet. Denne cellesuspensjon ble utspredt på en kaliumacetatplate (1% kaliumacetat, 1,5% agar). Etter ca. 5 dager ble de således erholdte sporsekker resuspendert i 0,5 ml sterilt vann ved hjelp av en inokulator, tilsatt 10 ul av en blanding av p-glu-kuronidase og arylsulfatase (Boehringer Mannheim) og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter ble det tilsatt 10 ml vann, sporsekksuspensjonen ble frasentrifugert, og supernatanten ble dekantert. Under mikromanipulatoren ble sporene fra flere sporsekker isolert og inkubert på YEPD-plater (YEPD med 1,5% agar) i 3 dager ved 30°C. På utspirte sporer ble det anbrakt en stempelplate, koloniene ble stemplet over på syntetiske minimumsmedier (0,67% gjærnitrogenbase uten aminosyrer, Difco; 2% glukose, 1,5% agar pluss tilsetninger: 20 mg/l Trp, His, Arg, Met; 30 mg/l Leu, Ile, Lys; 50 mg/l Phe; 100 mg/l Glu, Asp; 400 mg/l Val, Thr, Ser, så vel som 20 mg/l adenin og uracil; én av disse tilsetninger manglet i de enkelte minimumsmedier) og inkubert i 3 dager ved 30°C. Utskilte kolonier med ngd29-fenotype som oppviser auksotrofi for uracil og leucin, ble analysert/isolert som beskrevet i eksempel 2.2. I alle undersøkte prøver ble det utskilt ngd29-fenotypen (likeledes som ngd62-fenotypen) 2:2, noe som taler for en enkelt mutasjon i et enkelt, nukleært sete.
Fra den heri beskrevne krysning DBY746 x ngd29 ble det erholdt stammene BMY3-9A og N-BMY3-9A (MATa leu2-3,112 ura3-52 his3-Al ngd29; DSM 7042 og DSM 7338) og BMY3-9C og N-BMY3-9C (MATa leu2-3, 112, ura3-52 ngd29; DSM 7193 og DSM 7341).
På analog måte ble det fra krysningen JM1935 x ngd62 erholdt stammene BMY12-20D og N-BMY12-20D (MATa leu 2 ura 3 his 4 ngd62; DSM 7160 og DSM 7340).
Eksempel 4
Sammenligning mellom ekspresjon/ sekresjon av nativt A . nlger - GOD og GOD-( His ) 4- varianten i villtype- og glvkosvlerings-defekte gjærvertsstammer
GOD fra A. niger er et naturlig utskilt, glykosylert, dimert enzym. Pr. underenhet foreligger det 8 potensielle N-glykosyleringssteder (sekvenskodoner) og 3 cysteinrester hvor to av disse danner en disulfidbro. GOD uttrykt i S. cerevisiae- vi11typestammer, utskilles i mediet og er med hensyn
til molekylvekten meget heterogen på grunn av en ikke enhetlig ytre kjede-glykosylering (hyperglykosylering) (Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 3793-3802; De Baetselier, A. et al., Biotechnology 9 (1991) 559-561; Whittington, H. et
al., Curr. Genet. 18 (1990) 531-536). Det bearbeidede (avspaltning av en signalsekvens med 22 aminosyrer) GOD-protein fra A. niger består av 583 aminosyrer med en potensiell molekylvekt på 63.273 Da (Frederick, K.R. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 3793-3802).
Plasmidene YEpL/GOD (eksempel 1.5) og YEp/GOD-(His)4 (eksempel 1.6) ble transformert i villtypestammen JM1935 (MATa leu2 ura3 his4 MAL4) DSM 7156 BMY3-9A (DSM 7042 og N-BMY3-9A (DSM 7338) (se eksempel 3), og transformantene ble utvalgt på agarplater med minimumsmedium med 1,5% agarose, 0,67% YNB (gjærnitrogenbase, salt-vitaminblanding, Difco), 0,5% CAA (kasaminosyrer, proteinhydrolysat, Difco) og 2% fruktose som karbonkilde (uracilseleksjon).
4. 1 Dyrkning av GOD- transformanter
For amplifisering av plasmidkopitallet (seleksjon på den plasmidkodede LEU2d-allel; Beggs, J.D., Nature 275 (1978) 104-109; Erhart, E. og Hollenberg, C.P., J. Bacteriol. 156
(1983) 625-635) ble transformantene utspredt på plater med minimumsmedium uten leucin (1,5% agarose, 0,67% YNB, Difco,
60 mg/l adenin og 2% fruktose).
Dyrkning av forkulturer ble utført i leucin-selektivt medium med 0,67% YNB og 4% fruktose, i ristekolber ved 30°C i 48 timer og anvendt til inokulering av ekspresjonskulturer (inokulum: 1-2%). Hovedkulturen (1 liter ristekultur) ble inkubert ved 30°C i fullstendig medium med 2% gjærekstrakt, 4% baktopepton, Difco, 0,1 mol/l fosfatbuffer, pH 7,0, 1% fruktose og 6% mal tose, i 3-4 dager under omrøring. Etter 48 og 72 timer ble prøver uttatt, og celleveksten (bestemmelse av den optiske tettet ved 600 nm OD600), GOD-aktiviteten utskilt i mediet og den resterende GOD-aktivitet i cellene etter celle-lysis ble bestemt etter råekstrakten.
Ekspres1ons-/ sekresionsanalvse av GOD i villtypestammen DSM 7156 og den qlykosvlerinasdefekte vertsstamme DSM 7042/ 7338 ( nqd29)
Plasmid: YEpL/GOD
Plasmid: YEpL/GOD
Ekspresjons-/ sekresjonsanalvse av GOD-( His) d i villtypestammen DSM 7156 og den glykosvlerings-defekte vertsstamme DSM 7042/ 7338 ( ngd29)
Plasmid: YEpL/GOD-(His)4
Plasmid: YEpL/GOD
Resultat
Med hensyn til ekspresjon og sekresjon ble det for GOD- og GOD-(His)4-variantene ikke funnet noen signifikante forskjeller.
4. 2 SDS- PAGE av utskilt GOD
GOD-(His)4-enzymet uttrykt i (utskilt i mediet) de glykosyleringsdefekte vertsstammer DSM 7042/7338 (ngd29) og DSM 7160/7340 (ngd62), ble sammen med enzymet uttrykt (utskilt) i villtypestammen DSM 7156 og renset GOD fra A. niger (Boehringer Mannheim, Tyskland) nærmere karakterisert ved hjelp av SDS-PAGE og tilsluttende proteinfarging. Den GOD-holdige mediumsupernatant fra villtypestammen ble konsentrert 10 ganger ved hjelp av TCA-utfelling før elektroforesen. Kar-bohydratfritt GOD-(His)4-enzym ble fremstilt enzymatisk med N-glykosidase F og anvendt som størrelsesstandard.
Enzymatisk deglykosylerinq med N- qlykosidase F
Deglykosyleringen ble utført i overensstemmelse med metoden publisert av Haselbeck, A. og Hosel, W. (Topics in Biochemistry 8 (1988) 1-4. 0,1 ml GOD-(His)4-holdig mediumsupernatant ble utfelt med trikloreddiksyre (sluttkonsentrasjon: 10%), de utfelte proteiner ble frasentrifugert, protein-pelleten ble vasket med 70% etanol, tørket i vakuum, blandet med 10 pl 20 mmol/1 kaliumfosfatbuffer, pH 7,2, med 1% SDS og oppvarmet i 3 minutter ved 95°C. Etter avkjøling til romtemperatur ble proben fortynnet til 0,1 ml med 20 mmol/1 kalium-fosfatbuf f er, pH 7,2, oktylglukosid (sluttkonsentrasjon: 0,5%) og 5 enheter N-glykosidase F, inkubert i 1-12 timer ved 37°C og deretter tilsatt 25 pl 5xSDS-buffer (se ovenfor).
Resultat
GOD-enzymene (GOD og G0D-(His4)) uttrykt i de glykosyleringsdefekte ngd-mutantstammer, er synlige som dominante, enhetlige bånd med en molekylvekt på ca. 80 kDa etter proteinfarging i SDS-PAGE-geler. Dette eksperiment viser GOD-enzymets manglende ytre kjede-glykosylering og tyder på en enhetlig kjernelignende glykosylering. ngd-mutantstammene oppviser med hensyn til glykosyleringen en mnn9-lignende fenotype. I motsetning til dette kan GOD-enzymene uttrykt i vi11typestammer, kun påvises som meget diffuse bånd som strekker seg over et molekylvektsområde på ca. 80-200 kDa.
Eksempel 5
Karakterisering av de N- glykosyleringsdefekte nqd- mutanter ved hjelp av dyrkning på YEPD- aqarplater med ortovanadat eller Hygromycin B
Glykosyleringsdefekte mutanter som f.eks. mnn8, mnn9 og mnnlO, viser en forhøyet ortovanadatresistens og en for-høyet sensitivitet overfor antibiotikumet Hygromycin G. Resistens-/sensitivitetsfenotypen muliggjør en atskillelse/grupper-ing av N-glykosyleringsdefekte mutanter (Ballou, L. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 88 (1991) 3209-3212).
Teststammene ble dyrket i YEPD-medium (5 ml trommel-kultur) over natten, og stammene/kulturene ble innstilt på en optisk tetthet (OD600) på nøyaktig 0,05 med YEPD-medium. Deretter ble flekker å 20 ul cellesuspensjon applisert på YEPD-agarplater med 2-15 mmol/1 natriumortovanadat eller 10-200 ug/ml Hygromycin B. Etter 2 dagers inkubasjon ved 30°C ble veksten av celleflekkene evaluert (se tabell).
Vekstfenotype av gjærceller på YEPD- agarplater
med natriumortovanadat eller Hygromycin B
Resultat
ngd-mutantene oppviser forskjeller med hensyn til innbyrdes resistensmønster, i forhold til mnn9-mutanten og villtypestammene.
1) J. Biol. Chem. 259 (1984) 3805-3811
Eksempel 6
Karakterisering/ identifisering av ngd- mutantene ( allelitest)
En allelitest tjener til identifisering (atskillelse) av gener og gendefekter (mutasjoner). Med denne teknikk lar det seg analysere hvorvidt to mutanter er allele (oppviser en mutasjon i det samme gen), ngd-mutantene ble undersøkt innbyrdes og i forhold til mnn9-mutanten med hensyn til alleli.
Allelitestene ble utført ved hjelp av genetiske stan-dar dteknikker (se: Sherman, F.; Fink, G.R.; Hicks, J.B., Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981); Guthrie, C. og Fink, G.R. (red.), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Methods Enzymol. 194 (1991)).
Prinsipp
To haploide mutantstammer av forskjellig paringstype med komplementerende auksotrofibehov krysses, og de diploide stammer utvelges på plater med minimumsmedium. De isolerte stammers diploider bekreftes gjennom tilstedeværelsen av a- og a-paringstypespesifikke DNA-sekvenser ved hjelp av PCR-analyse i overensstemmelse med metoden ifølge Huxley, C. et al.
(Trends Genet. 6 (1190) 236).
To mutanter er allele, dvs. at de har en mutasjon i det samme gen, når mutasjonene ikke komplementerer seg i den diploide celle.
To mutanter er ikke allele, dvs. at de har en mutasjon i to forskjellige gener, når mutasjonene komplementerer seg i den diploide celle og gir en vi 11 type-fenotype.
Anvendte stammer:
SC = syntetisk fullstendig medium (0,67% gjærnitrogenbase uten aminosyrer, Difco; 2% glukose; 1,5% agar pluss tilsetninger: 20 mg/l Trp, His, Arg, Met; 30 mg/l Leu, Ile, Lys; 50 mg/l Phe; 100 mg/l Glu, Asp; 400 mg/l Val, Thr, Ser, samt 20 mg/l adenin og uracil; aminosyrene Ura, His og Trp ble, som angitt i tabellen i kolonnen Diploidseleksjon, utelatt i de enkelte minimumsverdier.
Resultat:
Mutantene ngd29 og ngd62 er innbyrdes forskjellige og forskjellige fra mnn9 (ikke-allel).
Eksempel 7
Isolering av GOD og GOD( His)^ fra villtype- og nyperqlvkosvler-ingsdefekte glærstammer
7. 1 Isolering av GOD-( His) 4 ved hjelp av metallchelatkromato-<g>rafi
Ved denne isoleringsfremgangsmåte ble GOD-varianten GOD-(His)4 isolert fra kulturfiltratet av BMY3-9A/GOD-(His)4-celler og BMY12-20D/G0D-(His )4-celler (hyperglykosyleringsdefekte vertsstammer).
Kulturfiltratet ble titrert med natronlut til pH 7,5 og applisert på en NTA-søyle ekvilibrert med 10 mmol/1 kaliumfosfatbuffer, pH 7,5 (søylevolum 25 ml; NTA-gel fra firmaet Diagen, Diisseldorf; Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411
(1987) 177-184; Hochuli, E. et al., Biotechnology 6 (1988) 1321-1325). Søylen ble vasket med 5-10 søylevolumer 1 mol/l natriumklorid i 10 mmol/1 kaliumfosfatbuffer, pH 7,5, og med 5-10 søylevolumer 10 mmol/1 kaliumfosfatbuffer, pH 7,5. Deretter ble G0D-(His)4-enzymet eluert med 0,1 mol/l imidazol i ekvilibreringsbuf f er, pH 7,5, og de GOD-(His)4-holdige fraksjoner (gule) ble dialysert mot 10 mmol/1 kaliumfosfatbuffer, pH 7,5.
7. 2 Isolering av GOD og GOD- varianter ved ionebytterkromato-grafi på Q- Sepharose ff etter forutgående konsentrering og dialyse
Etter denne fremgangsmåte ble nativt GOD og hypergly-kosylert GOD renset.
100 ml sterilfiltrert kulturfiltrat ble tilsatt 33 g fast ammoniumsulfat (AS-metningskonsentrasjon 55%) under lang-som omrøring, de utfelte proteiner ble sentrifugert fra etter 1-2 timers inkubasjon ved romtemperatur, oppløst i 25 ml 25 mmol/1 kaliumfosfatbuffer, pH 7,5, og dialysert mot den samme buffer (4 x 10 liter, 24 timer, 4°C).
Dialysatet ble deretter applisert på en Q-Sepharose ff-søyle (søylevolum 12 ml) ekvilibrert med 25 mmol/1 kalium-fosfatbuf fer , pH 7,5, og vasket med 5-10 søylevolumer ekvilibreringsbuf fer . Det bundne GOD-enzym ble eluert ved hjelp av en gradient på 0-1 mol/l KC1 i ekvilibreringsbuffer (ca. 10 søylevolumer), og de GOD-holdige (gule) fraksjoner ble sammenslått.
Eksempel 8
Biokjemisk karakterisering av det isolerte GOD- enzym
8. 1 Bestemmelse av den spesifikke GOD- aktivitet
Bestemmelsen av GOD-aktiviteten ble utført som beskrevet i avsnittet Generelle metoder.
Spesifikk aktivitet av GOD og G0D-( His) 1 uttrykt i A . niger , S . cerevisiae ( villtype) og S . cerevisiae ( hyperglykosyleringsdefekte mutanter)
8. 2 Molekylvektbestemmelse ved hjelp av SDS- polyakrylamidgel-elektroforese ( SDS- PAGE)
Det rensede GOD-enzym ble tilsatt 1/5 volum 5xSDS-probebuffer (lxSDS-probebuffer: 50 mmol/1 Tris-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% merkaptoetanol, 10% glyserol, 0,001% bromfenolblått) og inkubert i 5 minutter ved 95°C. Proteinene ble deretter atskilt ved hjelp av SDS-PAGE (Laemmli, U.K., Nature 227
(1970) 680-685) og farget med Coomassie brilliantblått R.
Molekylvekt/ underenhet etter SDS- PAGE av GOD og GOD ( His) d uttrykt i A . niger , S . cerevisiae ( villtype) og S . cerevisiae
( hyperglykosyleringsdefekte mutanter)
8. 3 Bestemmelse av karbohydratandelen ( antronreaksjon)
Karbohydratandelen av GOD-enzymet fra forskjellige organismer, hhv. gjærstammer, ble bestemt i overensstemmelse med metoden ifølge Ashwell, G. (Methods Enzymol. 3 (1957) 84).
0,5 ml renset GOD-enzym (konsentrasjon 20-100 U/ml i H20) blandes med 5 ml antron-reagens, oppløsningen inkuberes i 5 minutter ved 25°C og oppvarmes deretter i 15 minutter i kok-ende vannbad. Etter avkjøling av proben til 25°C bestemmes ekstinksjonen ved 630 nm mot en reagensblindprøve. Ved hjelp av en samtidig oppstilt mannose-kalibreringskurve med mannose-standardløsninger på 5, 25, 75 og 100 ug/ml mannose finnes karbohydratandelen i GOD-proben.
Fremstilling av antron-reagenset:
66 ml konsentrert svovelsyre fortynnes forsiktig med 34 ml vann. Etter avkjøling til 80°C oppløses 50 mg antron og
1 g tiourea i svovelsyren. Antron-reagenset er holdbart i
2 uker ved 4°C.
Karbohvdratandel av GOD og GOD-( His^ uttrykt i R . niger ,
S . cerevisiae ( villtype) og S . cerevisiae ( hyperglykosvler-ingsdefekte mutanter)
Publikasjoner:
Bekkers, A.C.A.P.A.; Franken, P.A.F.; Van den Bergh, C.J.; Verbakel, J.M.A.; Verheij, H.M.; De Haas,G.H.: The use of genetic engineering to obtain efficient produc-tion of porcine pancreatic phospholipase A2 by Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta 1089, 345-351
(1991).
Ballou, L.; Cohen, R.E.; Ballou,C.E.: Saccharomyces cerevisiae mutants that make mannoproteins with a trun-cated carbohydrate outer chain. J. Biol. Chem. 255, 5986-5991 (1980).
Ballou, C.E.: Yeast cell wall and cell surface. I; Strathern, J.N.; Jones, E.W.; Broach, J.R. (red.), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s. 335-360 (1982).
Ballou, L.; Alvarado, E.; Tsai, P.; Dell, A; Ballou, C.E.: Protein glycosylation defects in the Saccharomyces cerevisiae mnn7 mutant class. J. Biol. Chem. 264, 11857-11864 (1989).
Ballou, C.E.: Isolation characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mmn mutants with noncondi-tional protein glycosylation defects. Methods Enzymol. 185, 440-470 (1990).
Ballou, L.; Hitzeman, R.A.; Lewis, M.S.; Ballou, C.S.: Vanadate-resistant yeast mutants are defective in protein glycosylation. Proe. Nati. Acad. Sei. 88, 3209-3212
(1991).
Beggs, J.D.: Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid. Nature 275, 104-109 (1978).
Carlson, M.; Taussig, R.; Kustu, S.; Botstein, D.: The secreted form of invertase in Saccharomyces cerevisiae is synthesized from mRNA encoding a signal seguence. Mol. Cell. Biol. 3, 439-447 (1983).
Ciriacy, M.: Genetics of alcohol dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. I. Isolation and genetic analysis of adh-mutants. Mut. Res. 29, 315-326 (1975).
De Baetselier, A.; Vasavada, A.; Dohet, P.; Ha-Ti, V.; De Beukelaer, M.; Erpicum, T.; De Clerk, L.; Hanotier, J.; Rosenberg, S.: Fermentation of yeast producing A. niger glucose oxidase: scale up, purification and characterization of the recombinant enzyme. Biotechnology 9, 559-561 (1991).
Delorme, E.: Transformation of Saccharomyces cerevisiae by electroporation. Applied and Environmental Microbiology 55, 2242- 2246 (1989).
Dijken, J.P. van; Veenhuis M.: Cytochemical localization of glucose oxidase in peroxisomes of Aspergillus niger. European J. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 9, 275 - 283 (1980)
Erhart, E.; Hollenberg, C.P.: The presence of a defective LEU2 gene on 2uDNA recombinant plasmids of Saccharomyces cerevisiae is responsible for curing and high copy number. J. Bacteriol. 156, 625-635 (1983).
Frederick, K.R.; Tung, J.; Emerick, R.S.; Masiarz, F.R.; Chamberlain, S.H.; Vasavada, A.; Rosenberg, S.; Chakraborty, S.; Schopter, L.M.; Massey, N.: Glucose oxidase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem. 265, 3793-3802 (1990).
Hadwick, K.G.; Lewis, M.J.; Semenza, J.; Dean, N.; Pelham, H.R.B.: ERDl, a yeast gene required for the retention of luminal endoplasmic reticulum proteins, affeets glycoprotein processing in the Golgi apparatus. EMBO J. 9, 623-630 (1990).
Haselbeck, A.; Hosel, W.: Studies on the effect of the incubation conditions, various detergents and protein concentration on the enzymatic activity of N-glycosidase F (glycopeptidase F) and endoglycosidase F. Topics in Biochemistry 8, 1- 4 (1988).
Hochuli, E.; Doebeli, H.; Schacher, A.: New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J. Chromatography 411, 177-184 (1987).
Hochuli, E.; Bannwarth, W.; Doebeli, H.; Genz, R.; Stueber, D.: Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsobent. Biotechnology 6, 1321-1325 (1988).
Huffaker, T.C.; Robbins, P.W.: Yeast mutants deficient in protein glycosylation. Proe. Nati. Acad. Sei. 80, 7466-7470 (1983).
Innis, M.A.: Glycosylation of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. I: Barr, P.J.; Brake, A.J.; Valenzuela, P. (red.), Yeast genetic engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, s. 233-246 (1989).
Ito, H.; Jukuda, A.; Murata, K.; Kimura, A: Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983).
Kopetzki, E.; Buckel, P.; Schumacher, G.: Cloning and characterization of baker's yeast alpha glucosidase: overexpression in a yeast strain devoid of vacuolar proteinases. Yeast 5, 11-24 (1989).
Kornfeld, R.; Kornfeld, S.: Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Ann. Rev. Biochem. 54, 631-664
(1985).
Kukuruzinska, M.A.; Bergh, M.L.E.; Jackson, B.J.: Protein glycosylation in yeast. Ann. Rev. Biochem. 56, 915-944 (1987).
Kriechbaum, M.; Heilmann, H,J.; Wientjes, F.J.; Hahn, M.; Jany, K.-D.; Gassen, H.G.; Sharif, F.; Alaeddinoglu, G.: Clonig and DNA seguence analysis of the glucose oxidase gene from Aspergillus niger NRRL-3. FEBS Lett. 255, 63-66 (1989).
Laemmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970).
Maniatis, T. et al., I: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989).
Moir, D.T.: Yeast mutants with increased secretion efficiency. I; Barr, P.J.; Brake, A.J.; Valenzuela, P.
(red.), Yeast genetic engineering, Butterworths, Stoneham, Mass, s. 215-231 (1989).
Mullis, K.B.; Faloona, F.A.: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 355-350 (1987).
Nakano, A.; Muramatsu, M.: A novel GTP-binding protein, Sarpl, is involved in transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. J. Cell. Biol. 109, 2677-2691 (1989).
Newman, A.P.; Ferro-Novick, S.: Characterization of new mutants in the early part of the yeast secretory pathway isolated by [3H]mannose suicide selection. J. Cell. Biol. 105, 1587-1594 (1987).
Novick, P.; Field, C; Schekman, R.: Identification of 23 complementation groups required for post-translatio-nal events in the yeast secretory pathway. Cell 21, 205-215 (1980).
Paulson, C.P.: Glycoproteins: what are the sugar chains for? TIBS 14, 272-276 (1989).
Rudolph, H.K., Antebi, A.; Fink, G.R.; Buckley, C.M.; Dorman, T.E.; LeVitre, J.; Davidow, L.S.; Mao, J.; Moir, D.T.: The yeast secretory pathway is perturbed by mutations in PMR1, a member of a Ca2+ ATPase family. Cell 58, 133-145 (1989).
Reddy, V.A.; Johnson, R.S.; Biemann, K.; Williams, R.S.; Ziegler, F.D.; Trimble, R.B.; Maley, F.: Characterization of glycosylation sites in yeast external invertase. I. N-linked oligosaccharide content of the individual seguons. J. Biol. Chem. 263, 6978-6985
(1988).
Runge, K.W.; Robbins, P.W.: Saccharomyces cerevisiae mutants in the early stages of protein glycosylation.
I: Bonventre, P.F.; Morello, J.A.M.; Silver, S.D.; Wu, H.C. (red.), Microbiology-1986. American Society for Microbiology, Washington, D.C. s. 312-316 (1986).
Schekman, R.; Novick, P.: The secretory process and yeast cell-surface assembly. I: Strathern, J.N.; Jones, E.W.; Broach, J.R. (red.), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s. 361-398 (1982).
Schmitt, H.D.; Wagner, P.; Pfaff, E.; Gallwitz, D.: The ras-related YPTl gene product in yeast: a GTP-binding protein that might be involved in microtubule organiza-tion. Cell 47, 401-412 (1986).
Schmitt, H.D.; Puzichia, M.; Gallwitz, D.: Study of a temperature-sensitive mutant of the ras-related YPTl gene product in yeast suggests a role in the regulation of intracellular calcium. Cell 53, 635-647 (1988).
Sherman, F.; Fink, G.R.; Hicks, J.B.: Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1981).
Tanner, W.; Lehle, L.: Protein glycosylation in yeast. Biochim. Biophys. Acta 906, 81-99 (1987).
Warren, C.E.: Glycosylation- considerations for protein engineering. BFE 7, 392-395 (1990).
Whittington, H.; Kerry-Williams, S.; Bidgood, K.; Dodsworth, N. Peberdy, J.; Dobson, M.; Hinchliffe, E.; Ballance, D.J.: Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in A. niger, A. nidulans and Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 18, 531-536
(1990).
Zamenhof, S.: Preparation and assay of deoxyribonucleic acid from animal tissue. Methods Enzymol. 3, 696-704
(1957).
Ziegler, F.D.; Maley, F.; Trimble, R.B.: Characterization of glycosylation sites in yeast external invertase.
II. Location of the endo-betta-N-acetylglucosaminidase H-resistant sequons. J. Biol. Chem. 263, 6978-6985
(1988).
Claims (6)
1. Gjærmutanter med N-glykosyleringsdefekter, karakterisert ved at disse gjærmutanter uttrykker proteiner i hypoglykosylert form uten kontaminering med ytre kjede-glykosylering (GlcNac2, Man50.100 ) , som oppnås ved [<3>H]-mannose-suicidal seleksjon, innføring av én eller flere selektive markører (auxotrofi- og/eller resistensmarkører), utvelgelse av de stammer som etter transformasjon med plasmidet DSM 7038 inneholdende glukoseoksidasestrukturgenet fra gjærstammen ATCC 9029 og fermentering i fullstendig medium med 2 % gjærekstrakt, 4 % baktopepton, Difco, 0,1 mol/l fosfat-buffer, pH 7,0, 1 % fruktose og 6 % maltose, etter 3-4 dagers inkubasjon under omrøring utskiller 10 mg/l glukoseoksidase eller mer i mediet, og som er allele med Saccharomyces cerevisiae DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 og/eller DSM 7340.
2. Gjærmutanter,
karakterisert ved at de er DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 og DSM 7340.
3. Fremgangsmåte for fremstilling av gjærmutanter ifølge krav 1 og 2,
karakterisert ved [3H] -mannose-suicidalseleksjon, innføring av én eller flere selektive markører (auksotrofi- og/eller resistensmarkører), utvelgelse av de stammer som etter transformasjon med plasmidet DSM 7038 inneholdende glukoseoksidasestrukturgenet fra gjærstammen ATCC 9029 og fermentering i fullstendig medium med 2% gjærekstrakt, 4% baktopepton, Difco, 0,1 mol/l fosfatbuffer, pH 7,0, 1% fruktose og 6% maltose, etter 3-4 dagers inkubasjon under omrøring utskiller 10 mg/l glukoseoksidase eller mer i mediet, og som er allele med Saccharomyces cerevisiae DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 og/eller DSM 7340.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,
karakterisert ved at det fremstilles
Saccharomyces cerevisiae DSM 7042, DSM 7338, DSM 7160 og/eller DSM 7340.
5. Anvendelse av gjærmutantene ifølge krav 1 eller 2 som en vertsorganisme for homolog og heterolog ekspresjon av proteiner.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein i hypoglykosylert form uten kontaminering med ytre kjede-glykosylering (GlcNac2, Man50.100) ,
karakterisert ved transformasjon av en gjærmutant ifølge krav 1 eller 2 med et annet rekombinant DNA som koder for det rekombinante protein, fermentering av mutanten og isolering av proteinet fra celler eller fra kultursupernatanten .
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4226094 | 1992-08-07 | ||
| DE4301932A DE4301932A1 (de) | 1992-08-07 | 1993-01-25 | Hefewirtsstämme mit Defekten in der N-Glycosylierung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO932811D0 NO932811D0 (no) | 1993-08-06 |
| NO932811L NO932811L (no) | 1994-02-08 |
| NO312246B1 true NO312246B1 (no) | 2002-04-15 |
Family
ID=25917284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19932811A NO312246B1 (no) | 1992-08-07 | 1993-08-06 | Gj¶rmutanter med N-glykosyleringsdefekter, fremgangsmåte for fremstilling av gj¶rmutanter, og anvendelse av disse, samtfremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5705616A (no) |
| EP (1) | EP0582244B1 (no) |
| JP (2) | JP2675511B2 (no) |
| KR (1) | KR0140973B1 (no) |
| AT (1) | ATE207955T1 (no) |
| AU (1) | AU657230B2 (no) |
| CA (1) | CA2103522C (no) |
| DE (2) | DE4301932A1 (no) |
| FI (1) | FI110006B (no) |
| IL (1) | IL106589A (no) |
| NO (1) | NO312246B1 (no) |
| NZ (1) | NZ248323A (no) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2750434B1 (fr) * | 1996-06-26 | 1998-08-21 | Applic De Rech Et De Conseils | Produit de stabilisation proteique des vins |
| US6566122B1 (en) | 2000-06-16 | 2003-05-20 | Academia Sinica | Super-secreting saccharomyces cerevisiae strains |
| US6803225B2 (en) * | 2000-06-30 | 2004-10-12 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology | Protein glycosylation modification in Pichia pastoris |
| KR100473658B1 (ko) * | 2002-10-25 | 2005-03-10 | 드림바이오젠 주식회사 | 위치 선택적 수식법에 의한 혼성형 단백질 치료제 개발을 위한 형질전환 효모 시스템 |
| US7507573B2 (en) | 2003-11-14 | 2009-03-24 | Vib, Vzw | Modification of protein glycosylation in methylotrophic yeast |
| CN101313216A (zh) * | 2005-09-22 | 2008-11-26 | 普洛茨股份有限公司 | 酵母突变体中产生的糖基化多肽及其使用方法 |
| KR101460561B1 (ko) * | 2012-11-20 | 2014-11-13 | 한국식품연구원 | 사카로마이세스 세레비지애 113-8의 대량 생산방법 |
| WO2017170418A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 株式会社カネカ | エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド及びその製造方法 |
| CN107988177B (zh) * | 2016-10-26 | 2021-08-20 | 潍坊康地恩生物科技有限公司 | 葡萄糖氧化酶突变体 |
| CN108118037B (zh) * | 2016-11-28 | 2021-08-31 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5135854A (en) * | 1987-10-29 | 1992-08-04 | Zymogenetics, Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
| AU625392B2 (en) * | 1987-10-29 | 1992-07-09 | Zymogenetics Inc. | Methods of regulating protein glycosylation |
| NZ229260A (en) * | 1988-06-03 | 1994-02-25 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus, expression cassette for pre-s domain, host cells and |
| US5094951A (en) * | 1988-06-21 | 1992-03-10 | Chiron Corporation | Production of glucose oxidase in recombinant systems |
| EP0382332A3 (en) * | 1989-01-06 | 1990-11-14 | Collaborative Research Inc. | Improved supersecreting mutants of saccharomyces cerevisiae |
| CA2022109A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced expression of heterologous proteins in recombinant hosts in a non-growth media |
| DE4301904A1 (de) * | 1992-08-07 | 1994-02-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hypoglycosylierte recombinante Glucoseoxidase |
-
1993
- 1993-01-25 DE DE4301932A patent/DE4301932A1/de not_active Withdrawn
- 1993-08-02 AU AU44354/93A patent/AU657230B2/en not_active Ceased
- 1993-08-02 DE DE59310233T patent/DE59310233D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-02 AT AT93112338T patent/ATE207955T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-08-02 EP EP93112338A patent/EP0582244B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-04 IL IL10658993A patent/IL106589A/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-08-04 NZ NZ248323A patent/NZ248323A/en unknown
- 1993-08-06 KR KR1019930015252A patent/KR0140973B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 JP JP5196388A patent/JP2675511B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-08-06 CA CA002103522A patent/CA2103522C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-06 NO NO19932811A patent/NO312246B1/no unknown
- 1993-08-06 FI FI933487A patent/FI110006B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-05 US US08/461,593 patent/US5705616A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-31 US US08/651,323 patent/US5798226A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-04-09 JP JP9090937A patent/JP2984229B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL106589A0 (en) | 1993-12-08 |
| KR940004051A (ko) | 1994-03-14 |
| EP0582244B1 (de) | 2001-10-31 |
| EP0582244A2 (de) | 1994-02-09 |
| NO932811D0 (no) | 1993-08-06 |
| US5798226A (en) | 1998-08-25 |
| JP2675511B2 (ja) | 1997-11-12 |
| AU657230B2 (en) | 1995-03-02 |
| ATE207955T1 (de) | 2001-11-15 |
| IL106589A (en) | 2005-07-25 |
| KR0140973B1 (ko) | 1998-06-15 |
| EP0582244A3 (de) | 1995-03-15 |
| JPH1052277A (ja) | 1998-02-24 |
| DE59310233D1 (de) | 2001-12-06 |
| FI110006B (fi) | 2002-11-15 |
| CA2103522C (en) | 1998-07-07 |
| AU4435493A (en) | 1994-02-24 |
| NZ248323A (en) | 1994-12-22 |
| CA2103522A1 (en) | 1994-02-08 |
| JPH06296482A (ja) | 1994-10-25 |
| NO932811L (no) | 1994-02-08 |
| FI933487A (fi) | 1994-02-08 |
| US5705616A (en) | 1998-01-06 |
| FI933487A0 (fi) | 1993-08-06 |
| DE4301932A1 (de) | 1994-02-10 |
| JP2984229B2 (ja) | 1999-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5052899B2 (ja) | 遺伝子発現法 | |
| US8969064B2 (en) | Gene expression technique | |
| US20130244277A1 (en) | Gene Expression Technique | |
| US9926570B2 (en) | Host cells and methods of use | |
| JP2024053044A (ja) | 微生物におけるタンパク質のグリコシル化の修飾 | |
| US5602018A (en) | Hypoglycosylated recombinant glucose oxidases | |
| MXPA03004853A (es) | Metodos y composiciones para produccion sumamente eficiente de proteinas heterologas en levadura. | |
| NO312246B1 (no) | Gj¶rmutanter med N-glykosyleringsdefekter, fremgangsmåte for fremstilling av gj¶rmutanter, og anvendelse av disse, samtfremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant protein | |
| CA2295190C (en) | Improved protein expression strains | |
| Kang et al. | Expression and secretion of human serum albumin in the yeast Saccharomyces cerevisae | |
| KR20040004089A (ko) | 당외쇄 합성 결손 한세눌라 폴리모르파 변이주 및 그를이용한 재조합 당단백질의 제조 방법 | |
| Gorgens | Quantitative yeast physiology and nitrogen metabolism during heterologous protein production | |
| JPH0279982A (ja) | 真核細胞系表現ベクター、及び真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の調節可能な製法 | |
| McMahon | Cloning and expression of the bacillus licheniformis a-amylase gene in saccharomyces cerevisiae |