KR101460561B1 - 사카로마이세스 세레비지애 113-8의 대량 생산방법 - Google Patents

사카로마이세스 세레비지애 113-8의 대량 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 113-8의 대량 생산방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 효모를 배지에 접종한 후, 15~21시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 효모의 대량생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 최적 효모를 선발하여 선발된 효모를 최적배지 및 최적 배양의 조건으로 대량생산할 수 있다.

Description

사카로마이세스 세레비지애 113-8의 대량 생산방법{METHOD FOR MASS PRODUCTION OF Saccharomyces cerevisiae 113-8}
본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 113-8의 대량 생산방법 및 이를 이용한 막걸리의 제조에 관한 것이다.
술은 자연적으로 발생되어 지역, 민족, 기후, 풍토 및 문화적 차이에 따라 여러 형태의 개성 있는 술로 발전되었다. 세균, 효모 등의 존재가 발견되기 이전에는 현대적인 발효 기술이 없었으므로, 누룩 등에 존재하는 자생 효모에 의하여 발효주를 제조하였다. 그러나 자생 효모들을 이용하면 우수하고 일정한 발효능을 유지하기가 어려운 문제점이 있었다. 이 문제점을 해결하기 위해, 근대에 들어서는 자생 효모들 중에서 우수한 특성을 갖는 효모를 선별, 분리하여 발효를 수행함으로써, 우수하고 일정한 발효능을 유지하여 우수한 발효주를 생산하기 시작했다.
현재 맥주, 청주 또는 포도주 등 흔히 접할 수 있는 대표적인 발효주들은 모두 엄선된 발효 효모에 의해 발효된 것이며, 계속적으로 새로운 발효 효모를 탐색하는 작업이 이루어지고 있다.
이러한 탐색을 위해서는 실험실에서 선별된 균주들을 일일이 발효시킨 후 각각의 발효능 등의 특성을 측정해야 하므로, 많은 시간과 비용을 필요로 한다. 이에 본 발명자들은 최적 효모를 선발하고 이를 대량생산하여 쉽고 간편하게 발효주를 제조하기 위하여 본 발명에 이르렀다.
본 발명은 발효주 제조를 위한 최적 효모를 선발하고, 이를 대량생산하기 위하여 최적의 배지 및 최적의 배양시간을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 일 구체예에서 효모를 배지에 접종한 후, 15~21시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 효모의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애 113-8(Saccharomyces cerevisiae 113-8. 기탁번호: KCTC12289BP)인 것을 특징으로 하고, 상기 배지는 배지 100 중량부에 대하여 과당(fructose)을 7~11 중량부 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 배지는 배지 100 중량부에 대하여 박토 펩톤(bacto peptone)을 2~4 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 효모를 배지에 접종한 후, 15~21시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 효모의 대량생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애 113-8(Saccharomyces cerevisiae 113-8. 기탁번호: KCTC12289BP)인 것을 특징으로 하고, 상기 배지는 배지 100 중량부에 과당(fructose)을 7~11 중량부 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 배지는 배지 100 중량부에 대하여 박토 펩톤(bacto peptone)을 2~4 중량부 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 효모, 과당(fructose) 및 펩톤(bacto peptone)을 포함하는 배지를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애 113-8(Saccharomyces cerevisiae 113-8. 기탁번호: KCTC12289BP)인 것을 특징으로 하고, 상기 배지는 배지 100 중량부에 대하여 상기 과당(fructose)은 7~11 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 배지는 배지 100 중량부에 대하여 상기 박토 펩톤(bacto peptone)은 2~4 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 113-8 균주는 사카로마이세스 세레비지애 113-8균주를 의미한다.
본 발명의 발효주는 이에 한정하지 않지만, 약주, 탁주, 막걸리, 청주, 포도주 및 과실주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 말한다.
본 발명에 따른 발효주는 1) 전분질 원료(예를 들어, 찹쌀), 누룩 및 본 발명 균주에 물을 첨가하여 밑술을 제조하는 단계; 2) 상기 1)단계에서 수득한 밑술에 증자한 전분질 원료, 누룩 및 물을 추가로 첨가하여 발효시키는 담금단계; 3) 상기 2)단계에서 수득한 발효액을 여과하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상기 1) 또는 2)단계 이후에 동충하초, 적하수오, 발효홍삼, 대추, 감초 등의 식물 약재, 매실, 포도 등의 과실 등 여러 가지 성분이 첨가될 수도 있다. 예를 들어, 상기 밑술을 제조하는 단계는 5~30℃에서 2~20일간 발효시켜 수행될 수 있으며, 상기 담금단계는 5~30℃에서 2~30일간 수행될 수 있다. 다만, 본 발명에 따른 발효주의 제조 방법은 이러한 구체적 방법들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 최적 효모를 선발하여 선발된 효모를 최적배지 및 최적 배양의 조건으로 대량생산할 수 있다.
도 1은 발효제(누룩)에 따른 균체의 생육 표준곡선을 나타낸 그래프이다.
도 2는 균주의 배지 종류 및 배양 시간에 따른 생육정도를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 균주의 선별 및 동정
1-1. 균주 1차 선별
전국에서 수집한 누룩 300점으로부터 분리한 효모 1,000여 균주를 대상으로 알코올 생산능력은 입국 당화액 10mL을 듀람관을 포함한 시험관에 넣고 25℃에서 3일 동안 발효 정도를 관찰하였다. 입국 당화액은 입국과 물을 1 : 3(w/v)으로 혼합하여 62℃에서 5시간 동안 교반하여 제조하였고 6,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 14°brix로 희석하여 사용하였으며 효모는 PDA배지에서 29℃, 24시간으로 2차 계대 배양한 후 멸균한 0.85% NaCl에 현탁하여 2×107/㎖ 농도로 접종하여 사용하였다. 이렇게 접종한 균체의 CO2 gas 생성 속도를 비교 및 측정하였으며, gas생성이 인정된 것은 알코올 발효성이 있는 것으로 판정하였다. 향 생성능력은 7일 동안 발효한 후 관능적으로 비교하였다.
1-2. 균주 2차 선별
1차 선별된 206균주를 대상으로 300mL 용량으로 입국과 물을 1 : 3(w/v)으로 혼합하여　 25℃에서 7일 동안 발효시켜 알코올 함량, pH, 산도, 고형분 함량 및 향 생성능력을 비교하였다.
1-3. 균주 3차 선별
2차 선별된 25균주를 대상으로 1,500mL 용량으로 막걸리를 제조하였다. 발효제로는 sp300의 누룩을 사용하였다. 멥쌀, 발효제, 효모(0.02%), 물을 넣고 25℃에서 2일 동안 발효하여 밑술을 제조한 후 멥쌀과 물을 추가로 첨가하여 덧술을 제조한 후 5일 동안 발효하였고 급수율은 200%였다. 제조한 막걸리의 알코올 함량, 관능특성 그리고 향기성분 등을 분석하였다.
1-4. 발효제별 균주 선별
3차 선별된 10균주를 대상으로 누룩을 이용하여 막걸리를 제조하였다. 멥쌀, 발효제, 효모(0.02%), 물을 넣고 25℃에서 2일 동안 발효하여 밑술을 제조한 후 멥쌀과 물을 추가로 첨가하여 덧술을 제조한 후 5일 동안 발효하였고 급수율은 200%였다. 이러한 방법으로 제조한 막걸리의 알코올 함량 및 이화학 분석, 유기산 함량, 관능특성과 향기성분 분석 그리고 미생물 동정 결과를 바탕으로 각 발효제별로 막걸리 제조에 적합한 3균주를 선발하였다.
누룩을 발효제로 사용하는 경우에는 113-8균주가 적합한 것으로 나타났다. 선발된 균주와 적합한 발효제로 제조한 막걸리의 관능결과 누룩과 113-8균주로 담금한 막걸리는 탄산미, 신향, 단맛과 쓴맛을 나타내었다.
1-5. 균주의 동정
균주의 동정에는 미생물 동정에 주로 사용되고 있는 18s rDNA sequencing 방법을 이용하여 실시하였다. 동정은 sequencing 전문 기관인 ‘마크로젠’에 의뢰하여 진행하였으며 진행방법은 순수분리가 확인된 균주를 배지에 배양하여 각각의 whole genomic DNA를 분리 한 후 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR증폭에 사용된　 primer는 효모의 증폭에 주로 사용하는 ITS1 (TCCGTAGGTGAAC CTGCGG)과 ITS4 (TCCTC CGCTTATTGATATGC)를 이용하여 증폭하였다. PCR조건은　95℃에서 5분, 94℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분, 72℃에서 10초의 사이클을 총 35회 반복하였다. PCR prodect의 분석은 ABI 3730XL sequencing 기계를 이용하였다. 분석이 된 염기서열을 BioEdit seqencing 프로그램을 이용하여 alignment시킨 후 그 결과를 NCBI의 data base와 비교하여 동정하였다.
18s RNA sequencing에 의한 동정 결과, 균주는　사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것으로 나타났다.
실시예 2. 균주의 대량 배양
2-1. 탄소원의 선정
효모의 대량 배양 조건 확립 및 배지 조성을 위한 탄소원의 선발 실험은 다음과 같이 실시되었다. 30℃에서 24시간 동안 PDA에 배양한 균주 1colony를 PDB 100mL에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 120rpm으로 진탕배양하였다. 이렇게 키운 균주의 배양액 1.0mL을 탄소원의 조성을 달리한 배지(표 1)에 접종 후 25℃에서 120rpm으로 24시간 동안 배양하였다.
배지 제조에 탄소원으로 사용된 시약은 glucose(C6H12O6, Sigma-ALDRICH, USA), fructose(C6H12O6, Sigma-ALDRICH, USA), sucrose(C12H22O11, Sigma-ALDRICH, USA), high fructose syrup(DAESANG, Korea), molasses(EVERMIRACLE, Korea)다.
Medium Composition
Blank 1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 0.1% MgSO4·7H2O, 0.5% KH2PO4 -
Control 3% glucose,
Glucose 3,6,9% glucose
Fructose 3,6,9% fructose
Sucrose 3,6,9% sucrose
H.F.S ,6,9% high fructose syrup
Molasses 3,6,9% molasses
탄소원의 종류와 함량을 달리한 상기 표 1의 배지에서 균의 생육도 및 건조 균체량을 관찰하였다(표 2).
Strains 113-8 Control대비 증가%
Medium Growth(660nm) Dry cell(g/L) Growth(660nm) Dry cell(g/L)
Blank 0.291　 1.98　 - -
Control 1.701　 7.85　 - -
Glucose 　3% 1.701　 7.85　 100% 100%
6% 2.259　 10.17　 133% 130%
9% 2.612　 11.64　 154% 148%
Fructose 　3% 1.956　 8.91　 115% 114%
6% 2.446　 10.95　 144% 139%
9% 2.671　 11.89　 157% 151%
Sucrose 3% 1.911　 8.73　 112% 111%
6% 2.526　 11.28　 149% 144%
9% 2.647　 11.79　 156% 150%
H.F.S1 ) 3% 1.386　 6.54　 81% 83%
6% 2.137　 9.67　 126% 123%
9% 2.382　 10.68　 140% 136%
Molasses 3% 1.075　 5.25　 63% 67%
6% 1.539　 7.18　 90% 91%
9% 1.923　 8.77　 113% 112%
1): high fructose syrup
113-8균주는 glucose, fructose 그리고 high fructose syrup을 첨가하여 균을 배양한 경우 유사한 경향을 보였는데 그 첨가량이 3%에 비하여 6,9%에서 높게 나타났으며, 12%이상을 첨가할 경우 건조 균체량은 감소하는 경향을 나타내었다. sucrose를 첨가한 배지에서는 건조균체량이 6, 9%에서 각각 11.25, 11.79g/L로 탄소원의 첨가량이 6%이상인 경우 생육에 미치는 영향은 미비한 것으로 나타났다. Molasses는 9%를 첨가하였을 경우 glucose, fructose 그리고 sucrose 3%를 첨가한 것과 같은 효과를 나타내어 탄소원으로 사용시 다른 탄소원에 비하여 첨가량에 비하여 그 효과는 미비힌 것으로 나타났다. 113-8균주의 생육에 적합한 탄소원은 fructose>sucrose>glucose>high fructose syrup>molasses 순으로 나타났으며 fructose 9%를 첨가한 배지가 생육에 가장 최적임을 알 수 있었다.
2-2. 질소원의 선정
효모의 대량 배양 조건 확립을 위한 배지 조성 위한 질소원의 선발 실험은 1차로 각 균주별로 최적 탄소원이 선정된 후에 실시하였다. 30℃에서 24시간 동안 PDA에 배양한 균주 1colony를 PDB 100mL에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 120rpm으로 진탕배양하였다. 이렇게 키운 균주의 배양액 1.0mL을 질소원의 조성을 달리한 배지(표 3)에 접종 후 25℃에서 120rpm으로 24시간 동안 배양하였다.
배지제조에 질소원으로 사용된 시약은 yeast extract(Difco, USA), bacto-peptone(Difco, USA), urea(NH2CONH2, Junsei Chemical Co Ltd, Japan), casein(Wako Pure Chemical Industries Ltd, Japan) , tryptone(Difco, USA), ammonium nitrate(NH4NO3, Fisher Scientific, PA, USA), ammonium sulfate((NH4)2SO4 , Junsei Chemical Co Ltd, Japan)다.
Medium Composition
Blank 0.1% MgSO4·7H2O, 0.5% KH2PO4 - 3% glucose
Control


효모별로 1차 선발된 최적 탄소원		 1% yeast extract, 2% bacto-peptone,
Y.E 1,3,5% yeast extract
B.P. 1,3,5% bacto-peptone
Urea 1,3,5% urea
Casein 1,3,5% casein
Tryptone 1,3,5% tryptone
A.N. 0.1,0.3,0.5% NH4NO3
A.S. 0.1,0.3,0.5%　 (NH4)2SO4
각 효모별로 최적 탄소원의 설정 실험 결과 선정된 탄소원(fructose 9%)과 함량을 달리한 7가지 질소원을 사용한 배지에서의 생육도와 건조 균체량을 관찰하였다(표 4).
Strains 113-8 Control 대비 증가%
Medium Growth(660nm) Dry cell(g/L) Growth(660nm) Dry cell(g/L)
Blank 0.327　 2.14　 - -
Control 2.543　 11.36　 - -
Y.E. 1% 2.208　 9.96　 87% 88%
2% 2.554　 11.40　 100% 100%
5% 2.567　 11.46　 101% 101%
B.P 1% 2.023　 9.19　 80% 81%
3% 2.629　 11.72　 103% 103%
5% 2.399　 10.76　 94% 95%
Urea　 1% 1.023　 5.03　 40% 44%
3% 0.101　 1.19　 4% 10%
5% 0.045　 0.96　 2% 8%
Casein 1% 2.322　 10.44　 91% 92%
3% 1.933　 8.82　 76% 78%
5% 1.853　 8.49　 73% 75%
Tryptone 1% 1.986　 9.04　 78% 80%
3% 2.217　 10.00　 87% 88%
5% 2.204　 9.94　 87% 88%
A.N. 0.1% 0.392　 2.40　 15% 21%
0.3% 0.443　 2.62　 17% 23%
0.5% 0.403　 2.45　 16% 22%
A.S. 0.1% 0.300　 2.02　 12% 18%
0.3% 0.321　 2.11　 13% 19%
0.5% 0.352　 2.24　 14% 20%
최적 탄소원으로 fructose 9%가 선정된 113-8의 경우 무기질소원으로는 각각 NH4NO3가 적합한 것으로 나타났다. 113-8은 NH4NO3 첨가량이 0.3%가 초과되는 경우 생육이 저해되는 것으로 나타났다.
113-8의 경우 yeast extract는 첨가량이 증가함에 따라 건조 균체량 또한 비례하여 증가하였고, 5% 첨가한 배지에서 11.46g/L를 보였으나, bactopeptone 3%를 첨가한 배지에서의 건조 균체량이 11.72g/L로 더 높은 함량은 나타내었다. Urea와 casein은 1%를 첨가한 경우 각각5.03, 10.44g/L를 보였으나 그 이상의 첨가는 오히려 균체의 생육이 저해되는 것으로 나타났으며 1～5%를 첨가한 tryptone 배지에서의 건조 균체량은 9.04～10.00g/L를 보였다.
2-3. 배양시간의 선정
효모의 대량 최적 배양 조건 확립을 위한 배양시간 설정 실험은 다음과 같이 진행되었다. 선정된 균주 배양액 1mL(one loop in PDA/100mL in PDB)을 각각의 최적 배지 50mL에 접종하여 25℃에서 진탕배양하며 3시 간격으로 흡광도를 통한 생육정도 및 건조 균체량을 측정하였다.
균주의 생육정도 측정 및 건조 균체량 측정방법은 다음과 같다. 액체 배지로부터 회수한 균체를 원심분리(3000rpm, 2hr)하여 pellet을 증류수로 2회 세척 후 80℃에서 항량이 될 때까지 건조하였다. 이렇게 건조된 균체를 증류수에 현탁시킨 후 spectrophotometer를 사용하여 660nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선으로부터 배양액의 건조 균체량을 산출하였다(도 1).
막걸리의 제조 시 발효제로 누룩을 사용하는 경우 가장 적합한 효모인 113-8균주의 배지 종류와 배양시간에 따른 건조 균체량으로 나타낸 생육 정도를 도 2에 나타내었다.
배양 9시간 까지는 control 배지에서의 생육이 최적배지에서보다 더 활발한 것으로 나타나 건조 균체량 또한 더 높게 나타났으나, 배양 12시간부터는 최적배지에서의 생육이 활발해져 18시까지 급격하게 증가하였으며 그 후의 변화는 미비하게 나타났다. 각 배지에서 건조 균체량이 최대치를 나타낸 것은 control 배지에서는 배양 21시간에 8.28g/L, 최적배지에서는 배양 18시에 11.48g/L인 것으로 나타났다. 따라서 113-8균주는 최적배지를 사용하여 18시간 배양하는 것이 생육에 가장 적합한 조건임을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12289BP 20121015

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 113-8(Saccharomyces cerevisiae 113-8, 기탁번호: KCTC12289BP)의 대량생산방법:
    a) 배지 100 중량부에 대하여 과당(fructose) 7~11 중량부 및 박토 펩톤(bacto peptone) 2~4 중량부를 포함하는 배지에 사카로마이세스 세레비지애 113-8을 접종하는 단계; 및
    b) 15~21시간 동안 배양하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 하기 단계를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 113-8(Saccharomyces cerevisiae 113-8, 기탁번호: KCTC12289BP)의 배양방법:
    a) 배지 100 중량부에 대하여 과당(fructose) 7~11 중량부 및 박토 펩톤(bacto peptone) 2~4 중량부를 포함하는 배지에 사카로마이세스 세레비지애 113-8을 접종하는 단계; 및
    b) 15~21시간 동안 배양하는 단계.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 배지 100 중량부에 대하여 과당(fructose) 7~11 중량부 및 박토 펩톤(bacto peptone) 2~4 중량부를 포함하는, 사카로마이세스 세레비지애 113-8(Saccharomyces cerevisiae 113-8, 기탁번호: KCTC12289BP) 배양을 위한 배지.
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KR20120111211A (ko) * 2011-03-31 2012-10-10 매일유업주식회사 제빵용 효모의 대량생산방법

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한국미생물·생명공학회지 14(2) 125-131, 1986년
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