CN102256615A - 拟肽大环化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的拟肽大环化合物以及使用这类大环化合物治疗病毒疾病的方法。

Description

拟肽大环化合物
交叉参考
本申请要求2009年1月14日提交的美国临时申请61/144,706的优先权，本文通过引用引入该申请全文。
发明背景
季节性流感传染在发达国家和发展中国家同样都是主要的健康问题。美国每年有5-20％的人口患上流感，超过200,000人因流感并发症住院治疗，大约36,000人死于流感。在全世界，流感每年引起上千万例呼吸系统疾病和250,000至500,000例死亡。能传染人类的新的禽流感毒株是全球健康的重要关注点，因为这些流感毒株能够引起对其不存在免疫的流行病，可能导致数以百万计的死亡。“禽流感”是指在鸟类中高度传染并且在家禽中造成高死亡率的致病性禽流感亚型。禽流感在家禽和野生鸟类中的爆发正在许多国家发生，迄今为止至少有三个禽流感病毒亚型感染了人类。人类感染禽流感非常少见，大多数病例与在家禽间爆发期间直接接触家禽有关，但是人类的感染如果发生则非常严重：迄今为止，报告的所有人类病例中有一半以上致死。由于1996年在香港首次报告，世界卫生组织已经认真追踪了禽流感和动物至人的流感传播的实例，报告的确诊病例来自中国、印度尼西亚和东南亚、巴基斯坦、伊拉克、埃及及其它地方；在全世界385例导致243例死亡。尽管没有持续的人-人传播的证据，但是可能已经发生了禽流感的人-人扩散的例子。由于所有流感病毒都具有快速突变的能力，因此非常担心禽流感可能能够更容易地传染人类，并变得能够从一个人传染到他人。另外，在世界上禽流感病毒株尚未感染许多人，因此在人群中对这些毒株没有或只有很少的免疫保护，因此，如果发生持续的禽流感病毒传播，流感流行可能容易发生。
三类流感病毒(甲、乙和丙型)引起人类流感，甲型和乙型流感病毒几乎在每个冬天都导致疾病的季节性流行。甲型流感病毒根据病毒表面上的两种蛋白质-血凝素(H)和神经氨酸酶(N)-的特征被分为亚型。存在16个不同的血凝素亚型和9个不同的神经氨酸酶亚型，H1N1和H3N2是人类中发现的最常见的亚型。禽流感病毒是指甲型流感H5N1。甲型流感病毒是反义(3′至5′)单链RNA病毒。其病毒基因组在其RNA中编码11种蛋白质(HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2)，不能直接翻译为蛋白质，而是在翻译之前，该病毒依赖其RNA依赖性RNA聚合酶将其基因组转录为正义RNA。RNA依赖性RNA聚合酶没有哺乳动物对应物，这使得在开发针对该酶的治疗剂时较少产生种选择性的问题。病毒RNA依赖性RNA聚合酶的其它例子包括脊髓灰质炎病毒3Dpol、水疱性口炎病毒L和丙型肝炎病毒NS5b；后者是用于开发丙型肝炎抗病毒治疗的有效靶标。与目前的流感靶标(例如用于达菲(Tamiflu)的神经氨酸酶)不同，流感RNA聚合酶高度保守，因此具有现有药物面临的抗性问题的可能性较低。
最近，研究人员报告了流感蛋白RNA聚合酶的第一个原子分辨率结构细节，该酶是病毒复制的关键酶和流感爆发过程中治疗性干预和预防的新靶标(He，X.，等人.，Nature，2008.454：p.1123-6；Obayashi，E.，等人.，Nature，2008.454：p.1127-31)。流感RNA依赖性RNA聚合酶是三种亚基PA、PB1和PB2的异三聚体，在PA蛋白的“颌”之间具有PB1结合的310-螺旋N-末端区域。PB1螺旋被认为对于复合物形成和核转运是重要的，并且通过干扰聚合酶活性抑制甲型流感病毒复制。最近，也已经证明PB2亚基在病毒聚合酶复合物的活性中起重要作用，例如通过与PB 1亚基接触。参见Sugiyama等人，EMBO Journal，2009，28，1803-1811。然而，关于能够干扰这些蛋白质的结合和活性的化合物所知甚少。通常，仍然需要治疗其中RNA依赖性RNA聚合酶起作用的病毒病的治疗方法，以及能够改变这些聚合酶的活性的组合物和方法。
发明概述
本发明解决了这些和其它需要。在一方面，本发明提供了能够结合病毒RNA依赖性RNA聚合酶的拟肽大环化合物。这种大环化合物可以，例如，能够破坏病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合物的亚基的装配。在一个实施方案中，这种大环化合物可以与序列MDVNPTLLFLKVPAQ或MERIKELRNLM的肽竞争结合所述病毒RNA依赖性RNA聚合酶。在一个实施方案中，本发明的拟肽大环化合物包含与氨基酸序列MDVNPTLLFLKVPAQ(PB1)或MERIKELRNLM(PB2)至少大约60％、80％、90％或95％相同的氨基酸序列。或者，针对其结合PA蛋白的PB1肽结合位点或PB1蛋白的PB2肽结合位点的能力，鉴定并优化所述拟肽大环化合物的氨基酸序列，例如，通过使用PA或PB1靶蛋白的亲和选择或通过基于结构的设计，这种作用机制通过生物物理/结构研究和/或与PB1或PB2肽的竞争置换试验进行证实。在某些实施方式中，拟肽大环化合物包含螺旋，如310螺旋或α-螺旋。在其他实施方式中，拟肽大环化合物包含α，α-二取代的氨基酸。本发明的拟肽大环化合物可以包含连接至少两个氨基酸的α-位的交联连接体(crosslinker)。所述两个氨基酸中的至少一个可以是α，α-二取代的氨基酸。
在一些实施方式中，拟肽大环化合物具有下式：
Figure BPA00001389894800031
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure BPA00001389894800032
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基(cycloaryl)或杂环芳基(heterocycloaryl)，它们任选被R5取代；
L是式-L1-L2-的形成大环的连接体；
L1和L2独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基(cycloarylene)、亚杂环芳基(heterocycloarylene)或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
在其他实施方式中，拟肽大环化合物可以包含连接第一氨基酸的骨架氨基与拟肽大环化合物中的第二氨基酸的交联连接体。例如，本发明提供了式(IV)或(IVa)的拟肽大环化合物：
Figure BPA00001389894800051
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure BPA00001389894800052
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
L1和L2独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
在一些实施方案中，x+y+z为2、3、5或6。
此外，本发明提供了治疗受试者的流感病毒感染的方法，包括向受试者施用本发明的拟肽大环化合物。还提供了预防受试者被流感病毒感染的方法，包括向受试者施用本发明的拟肽大环化合物；或抑制受试者中的流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶的活性的方法，包括向受试者施用这种拟肽大环化合物。
通过引用引入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用方式结合在本文中，就好像各个单独的出版物、专利或专利申请明确地和单独地表明通过引用结合在本文中一样。
附图简述
在所附的权利要求书中详细地阐明了本发明的新特征。通过参考下面的阐述利用本发明原理的说明性实施方式的详细说明和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，附图中：
图1a显示与RNA依赖性RNA聚合酶的PA亚基复合的结合的PB1螺旋。Leu7和Leu10(浅色)是i、i+3大环形成以稳定310螺旋的候选残基。
图1b显示由图1a中的序列衍生的大环化合物。
图2a显示从含RNA依赖性RNA聚合酶的PA亚基的复合物上切下的图1a的序列。
图2b显示从含RNA依赖性RNA聚合酶的PA亚基的复合物上切下的图1b序列衍生的大环化合物。
图3显示本发明的几种拟肽大环化合物的血浆稳定性。
图4显示本发明的几种拟肽大环化合物的体内药代动力学性质。
图5a-5f说明本发明的拟肽大环化合物的体内药代动力学性质。
图6显示为了本发明的几种拟肽大环化合物选择的药代动力学参数。
图7说明本发明的拟肽大环化合物的静脉内和皮下给药模式的药代动力学性质。
发明详述
如本文所用，术语“大环化合物”指具有包含由至少9个共价键合的原子形成的环或环形的化学结构的分子。
如本文所用，术语“拟肽大环化合物”或“交联的多肽”指包含通过多个肽键接合的多个氨基酸残基和至少一个形成大环的连接体的化合物，所述连接体在第一天然存在的或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)与同一分子中的第二天然存在的或非天然存在的氨基酸残基(或类似物)之间形成大环。拟肽大环化合物包括其中形成大环的连接体连接第一氨基酸残基(或类似物)的α碳和第二氨基酸残基(或类似物)的α碳的实施方式。拟肽大环化合物任选地包含在一个或多个氨基酸残基和/或氨基酸类似物残基之间的一个或多个非肽键，且除了形成大环化合物的任意残基外，还任选地包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基。当提及拟肽大环化合物时，“相应的非交联的多肽”理解为涉及具有与大环化合物相同长度并包含对应于大环化合物的野生型序列的相当的天然氨基酸的多肽。
如本文所用，术语“稳定性”指如通过圆二色光谱、NMR或另一种生物物理测量法测量的，本发明的拟肽大环化合物在溶液中维持特定的二级结构，或在体外或体内对蛋白水解降解作用具有抗性。本发明所预期的二级结构的非限制性的例子是螺旋、β-转角和β-折叠片(pleated sheet)。通常，术语“螺旋”或“螺旋的”用来指任何类型的螺旋二级结构，包括310-螺旋、α-螺旋和π-螺旋。
如本文所用，术语“螺旋稳定性”指如通过圆二色光谱或NMR测量的，本发明的拟肽大环化合物维持α-螺旋结构。例如，在某些实施方式中，相比于对应的非交联的大环化合物，本发明的拟肽大环化合物如通过圆二色光谱测定的在螺旋度方面显示至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。
术语“α-氨基酸”或简称为“氨基酸”指含有结合到被称为α-碳的碳上的氨基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体以及通过有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文另外特别地指出，本文所用的术语氨基酸意图包括氨基酸类似物。
术语“天然存在的氨基酸”指自然界合成的肽中通常发现的20种氨基酸中的任一种，单字母缩写表示为A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
术语“氨基酸类似物”或“非天然氨基酸”指其结构上类似于氨基酸，且在形成拟肽大环化合物时可代替氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于除了在氨基和羧基之间包括一个或多个额外的亚甲基基团(例如，α-氨基β-羧酸)或以类似的反应性基团取代氨基或羧基(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)以外，在结构上与此处所定义的氨基酸相同的化合物。
“非必需的”氨基酸残基是可从多肽(如BH3结构域或p53MDM2结合结构域)的野生型序列发生改变而不消除或实质改变其基本的生物学或生物化学活性(例如，受体结合或活化)的残基。“必需的”氨基酸残基是，当从多肽的野生型序列发生改变时，导致多肽的主要生物学或生物化学活性消除或基本消除的残基。
“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。现有技术已定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，K、R、H)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，D、E)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、具有β分支的侧链的氨基酸(例如，T、V、I)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，Y、F、W、H)。因此，例如，多肽中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一种氨基酸残基所替代。可接受的置换的其他例子是基于电子等排考虑(例如，正亮氨酸替代甲硫氨酸)或其他性质(如2-噻吩丙氨酸替代苯丙氨酸)的置换。
如本文中使用的与大环化合物或形成大环的连接体相关的术语“元”是指形成或可以形成大环的原子，并且取代基或侧链原子除外。以此类推，环癸烷、1，2-二氟-癸烷和1，3-二甲基-环癸烷都被认为是十元大环化合物，因为氢或氟取代基或甲基侧链没有参与形成大环。
当用作分子结构的一部分时，符号指单键或者反式或顺式双键。
术语“氨基酸侧链”指连接到氨基酸中的α-碳上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫甲基，天冬氨酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟基苯甲基，等等。也包括其他非天然存在的氨基酸侧链，例如，那些天然产生的氨基酸侧链(例如，氨基酸代谢物)或合成制备的氨基酸侧链(例如，α，α二取代的氨基酸)。
术语“α，α二取代的氨基酸”指包含结合到连接两个天然或非天然的氨基酸侧链的碳(α-碳)上的氨基和羧基的分子或部分。
术语“多肽”包括通过共价键(例如，酰胺键)接合的两个或多个天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全长蛋白质(例如，完全加工的蛋白质)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白质的片段或合成的多肽片段)。
如本文所用，术语“大环化试剂”或“形成大环的试剂”指任何可以用于通过介导两个反应性基团之间的反应制备本发明的拟肽大环化合物的试剂。反应性基团可以是，例如，叠氮和炔，在这种情况下，大环化试剂包括但不限于：Cu试剂，如提供反应性的Cu(I)物质的试剂，如CuBr、CuI或CuOTf；以及可以通过加入还原剂(如抗坏血酸或抗坏血酸钠)原位转化为活性Cu(I)试剂的Cu(II)盐，如Cu(CO2CH3)2、CuSO4和CuCl2。大环化试剂可以另外地包括，例如，本领域内已知的Ru试剂，如Cp*RuCl(PPh3)2、[Cp*RuCl]4，或可以提供反应性的Ru(II)物质的其他Ru试剂。在其他情况下，反应性基团为末端烯烃。在这样的实施方式中，大环化试剂或形成大环的试剂为复分解催化剂，包括但不限于稳定的后过渡金属卡宾络合物催化剂，如VIII族过渡金属卡宾催化剂。例如，这类催化剂为具有+2氧化态、16的电子计数和五配位的Ru和Os金属中心。在Grubbs等人，″Ring Closing Metathesis andRelated Processes in Organic Synthesis″Acc.Chem.Res.1995，28，446-452和美国专利5,811,515中公开了另外的催化剂。在再其他的情况下，反应性基团为巯基。在这样的实施方式中，大环化试剂为，例如，用两个巯基反应性基团(如卤素基团)官能化的连接体。
术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴或碘或其基团。
术语“烷基”指含有指定数目的碳原子的直链或支链烃链。例如，C1-C10表示该基团中具有1-10(包括端值)个碳原子。在没有指定任何数值时，“烷基”是其中具有1-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。
术语“亚烷基”指二价烷基(即，-R-)。
术语“烯基”指作为具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链的烃链。烯基部分含有指定数目的碳原子。例如，C2-C10表示该基团中具有2-10(包括端值)个碳原子。术语“低级烯基”指C2-C6烯基链。在没有指定任何数值时，“烯基”是其中具有2-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。
术语“炔基”指作为具有一个或多个碳-碳叁键的直链或支链的烃链。炔基部分含有指定数目的碳原子。例如，C2-C10表示该基团中具有2-10(包括端值)个碳原子。术语“低级炔基”指C2-C6炔基链。在没有指定任何数值时，“炔基”是其中具有2-20(包括端值)个碳原子的链(直链或支链)。
术语“芳基”指6碳单环或10碳双环的芳香环系统，其中，各环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。术语“芳基烷基”或术语“芳烷基”指被芳基取代的烷基。术语“芳基烷氧基”指被芳基取代的烷氧基。
“烷基芳基”指其中芳基的氢原子中的一个被如上定义的C1-C5烷基取代的如上定义的芳基。烷基芳基的典型例子包括但不限于：2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2-丁基苯基、3-丁基苯基、4-丁基苯基、2-戊基苯基、3-戊基苯基、4-戊基苯基、2-异丙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、2-异丁基苯基、3-异丁基苯基、4-异丁基苯基、2-仲丁基苯基、3-仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。
“酰胺基芳基”指其中芳基的氢原子中的一个被一个或多个-C(O)NH2基团取代的如上定义的芳基。酰胺基芳基的典型例子包括：2-C(O)NH2-苯基、3-C(O)NH2-苯基、4-C(O)NH2-苯基、2-C(O)NH2-吡啶基、3-C(O)NH2-吡啶基和4-C(O)NH2-吡啶基。
“杂环基烷基”指其中C1-C5烷基的氢原子中的一个被杂环取代的如上定义的C1-C5烷基。杂环基烷基的典型例子包括但不限于：-CH2CH2-吗啉、-CH2CH2-哌啶、-CH2CH2CH2-吗啉和-CH2CH2CH2-咪唑。
“酰胺基烷基”指其中C1-C5烷基的氢原子中的一个被-C(O)NH2基团取代的如上定义的C1-C5烷基。酰胺基烷基的典型例子包括但不限于：-CH2-C(O)NH2、-CH2CH2-C(O)NH2、-CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2、-CH2CH(C(O)NH2)CH3、-CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3、-CH(C(O)NH2)CH2CH3、-C(CH3)2CH2C(O)NH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH3、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH3-CH3和-CH2-CH2-NH-C(O)-CH＝CH2。
“羟烷基(alkanol)”指其中C1-C5烷基的氢原子中的一个被羟基取代的如上定义的C1-C5烷基。羟烷基的典型例子包括但不限于：-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH2CH2CH2CH2OH、-CH2CH(OH)CH3、-CH2CH(OH)CH2CH3、-CH(OH)CH3和-C(CH3)2CH2OH。
“羧基烷基”指其中C1-C5烷基的氢原子中的一个被-COOH基团取代的如上定义的C1-C5烷基。烷基羧基的典型例子包括但不限于：-CH2COOH、-CH2CH2COOH、-CH2CH2CH2COOH、-CH2CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH3、-CH2CH2CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(COOH)CH2CH3、-CH(COOH)CH2CH3和-C(CH3)2CH2COOH。
本文所用的术语“环烷基”包括具有3-12个碳、优选3-8个碳、更优选3-6个碳的饱和的及部分不饱和的环烃基，其中，环烷基另外任选地被取代。一些环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。
术语“杂芳基”指芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环系统，其如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，各环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基的例子包括：吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基、噻唑基等。
术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂环基”指非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环系统，其如果是单环，具有1-3个杂原子；如果是双环，具有1-6个杂原子；或如果是三环，具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个O、N或S杂原子)，其中，各环的0、1、2或3个原子被取代基取代。杂环基的例子包括哌嗪基(piperazinyl)、吡咯烷基、二氧杂环己基(dioxanyl)、吗啉基(morpholinyl)、四氢呋喃基等。
术语“取代基”指取代任何分子、化合物或部分上的另一个原子或基团(如氢原子)的基团。合适的取代基包括但不限于：卤素、羟基、巯基、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、链烷磺酰基、烷基羰基和氰基。
在某些实施方式中，本发明的化合物包含一个或多个不对称中心，因而作为外消旋体或外消旋混合物、单一的对映异构体、单独的非对映异构体和非对映体混合物存在。除非另外清楚地指出，本发明包括这些化合物的所有这些异构体形式。在某些实施方式中，本发明的化合物也以多种互变异构形式表示，在这些情况下，本发明包括本文所述化合物的所有互变异构形式(例如，如果环系统的烷基化作用导致在多个位置烷基化，那么本发明包括所有这些反应产物)。除非另外清楚地指出，本发明包括这些化合物的所有这些异构体形式。除非另外清楚地指出，本发明包括本文所述化合物的所有晶型。
如本文所用，术语“增加”或“减少”分别意味着导致至少5％的统计上显著的(即，p＜0.1)增加或减少。
如本文所用，提及变量的数值范围意味着表示，本发明可以采用等于该范围内的任何值的该变量实施。因此，对于本身不连续的变量，该变量等于该数值范围内的任何整数值，包括该范围的端点。类似地，对于本身连续的变量，该变量等于该数值范围内的任何实值，包括该范围的端点。举例来说，但不是限制性的，如果变量本身是不连续的，描述为具有0-2之间的值的变量取0、1或2的值；而如果变量本身是连续的，则取0.0、0.1、0.01、0.001的值或≥0且≤2的其他任何实值。
如本文所用，除非另外特别地指出，单词“或”以“和/或”的包含性的含义使用，而非“任一/或”的排它性的含义。
术语“平均”表示对于每个数据点由进行至少3次独立的重复而获得的平均值。
术语“生物活性”包括本发明的大环化合物的结构和功能特性。生物活性是，例如，结构稳定性、螺旋性(包括例如α-螺旋性)、对于靶标的亲和性、对于蛋白水解降解的抗性、细胞渗透性，细胞内稳定性、体内稳定性或其任何组合。
在下面的附图和描述中阐明了本发明的一种或多种具体实施方式的细节。从说明书、附图和权利要求书中可以清楚地看出本发明的其他特征、目的和优势。
拟肽大环化合物的设计
通常，制备靶向蛋白质或与蛋白质相互作用的拟肽大环化合物，该蛋白质是病毒感染或在宿主细胞内复制所需要的。这样的病毒可以是，例如，属于病毒正黏病毒科的流感病毒。该家族也包括索戈托病毒和佐立病毒。流感病毒已知有几个类型和亚型，它们感染人类和其它物种。甲型流感病毒感染人、鸟、猪、马、海豹和其它动物，但是野生鸟类是这些病毒的天然宿主。甲型流感病毒分为亚型，并根据病毒表面上的两种蛋白质-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)-命名。例如，“H7N2病毒”表示具有HA 7蛋白和NA 2蛋白的甲型流感病毒亚型。类似地，“H5N1”病毒具有HA 5蛋白和NA 1蛋白。有16个已知的HA亚型和9个已知的NA亚型。HA和NA蛋白的许多不同的组合是可能的。只有一些甲型流感病毒亚型(即H1N1、H1N2和H3N2)目前在人类中循环。其它亚型最常发现于其它动物种中。例如，H7N7和H3N8病毒在马中引起疾病，H3N8最近也证明在狗中引起疾病(http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm)。
本发明的抗病毒剂可以用来保护高危群体(医院单位、照顾老年人的机构、免疫抑制个体)，并且具体问题具体分析。抗病毒剂的潜在应用是限制未来流行的扩散和严重程度，无论是由禽流感H5N1引起的还是由其它流感病毒毒株引起的。H5和H7亚型的甲型禽流感病毒，包括H5N1、H7N7和H7N3病毒，已经与高致病性联系在一起，人感染这些病毒从轻度(H7N3，H7N7)到重度和致死性疾病(H7N7、H5N1)。低致病性病毒感染引起的人类疾病已有记录，包括非常轻的症状(例如结膜炎)到流感样疾病。已感染人类的低致病性病毒的例子包括H7N7、H9N2和H7N2(http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm)。
乙型流感病毒通常在人类中发现，但是也可以感染海豹。不同于甲型流感病毒，乙型流感病毒没有根据亚型分类。乙型流感病毒可以在人类中引起发病率和死亡率，但其流行的严重程度通常低于甲型流感病毒。尽管乙型流感病毒能够引起人流行病，但是它们不引起大范围流行(http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm)。
丙型流感病毒在人类中引起轻度疾病，并且不引起流行或大范围流行。这些病毒也可以感染狗和猪。这些病毒没有根据亚型分类(http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm)。
流感病毒在细胞表面受体特异性和细胞嗜性方面彼此不同，但是它们采用相同的进入途径。绘制这些途径以及确定与流感病毒传播、进入、复制、生物合成、装配或离开有关的宿主细胞蛋白质允许开发对抗已有的和新出现的流感毒株的一般药物。也可以证明这些药物对采用类似途径的无关病毒也有用。例如，除对抗流感病毒外，这些药物可以保护呼吸道上皮细胞对抗许多不同的病毒。
在一个实施方式中，针对的病毒是腺病毒。腺病毒最常引起呼吸系统疾病；腺病毒感染引起的呼吸系统疾病的症状从普通的感冒综合征到肺炎、哮吼和支气管炎。免疫系统受损的患者特别易患腺病毒感染的严重并发症。在第二次世界大战期间在征募新兵之间首先发现的急性呼吸道疾病(ARD)可能由拥挤和压力条件下的腺病毒感染引起。腺病毒是中等大小的(90-100nm)、无包膜的、含有双链DNA的二十面体病毒。有49种免疫学上不同的类型(6个亚属：A至F)能够引起人类感染。腺病毒对化学试剂或物理因素和不利的pH条件特别稳定，从而允许在体外有较长的存活期。一些腺病毒如AD2和Ad5(C种)的感染性进入利用网格蛋白介导的胞吞作用和巨胞饮。其它腺病毒如Ad3(B种)的感染性进入利用动力蛋白依赖的胞吞作用和巨胞饮。
在一个实施方式中，针对的病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。RSV是婴儿和1岁以下儿童中最常见的细支气管炎和肺炎的病因。疾病最常见的是从发热、流鼻水、咳嗽和有时哮鸣开始。在第一次RSV感染过程中，25％至40％的婴儿和年幼儿童具有细支气管炎或肺炎的体征或症状，0.5％至2％需要入院治疗。大多数儿童在8-15天内从疾病中恢复过来。因为RSV感染而住院的大多数儿童不到6个月大。RSV也引起伴随一生的反复感染，通常结合有中度到重度感冒样症状；但是，严重的下呼吸道疾病可能在任何年龄发生，特别是在老年人中或心脏、肺或免疫系统受损者中。RSV是反义的、包膜的RNA病毒。病毒体的形状和大小是可变的(平均直径为120-300nm)，在环境中不稳定(在环境表面只存活几个小时)，并且容易被肥皂和水和消毒剂灭活。
在一个实施方式中，针对的病毒是人副流感病毒(HPIV)。作为年幼儿童中下呼吸道疾病的常见原因，HPIV仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。类似于RSV，HPIV可引起伴随一生的反复感染，通常表现为上呼吸道疾病(例如感冒和/或咽喉痛)。HPIV也可引起具有反复感染的严重的下呼吸道疾病(例如，肺炎、支气管炎和细支气管炎)，特别是在老年人中，和在免疫系统受损的患者中。4种HPIV中的每一个都具有不同的临床和流行病学特征。HPIV-1和HPIV-2的最有区别性的特征是哮吼(即，喉气管支气管炎)；HPIV-1是儿童中的哮吼的首要原因，而HPIV-2较少被检测到。HPIV-1和。HPIV-2都可引起其它上呼吸道和下呼吸道疾病。HPIV-3更常与细支气管炎和肺炎相关。HPIV-4很少被检测到，可能是因为它引起严重疾病的可能性较低。HPIV的潜伏期通常为1-7天。HPIV是反义、单链RNA病毒，在它们的表面上具有融合和血凝素-神经氨酸酶糖蛋白“刺突”。HPIV有4个血清型(1到4)和2个亚型(4a和4b)。病毒体大小(平均直径为150-300nm)和形状不等，并且在环境中不稳定(在环境表面上存活数小时)，并且容易用肥皂和水灭活。
在一个实施方式中，针对的病毒是冠状病毒。冠状病毒是属于冠状病毒科的动物病毒属。冠状病毒是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称性的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小从大约16到31kb，对于RNA病毒来说特别大。名称“冠状病毒”来自于拉丁文corona，意思是冠，因为在电子显微镜下病毒包膜被小球状结构的特有的环加冕。这种形态实际上是由病毒刺突包膜突起形成的，它们是位于病毒表面的蛋白质，并且决定宿主嗜性。冠状病毒归类于巢状病毒目，名称来自于拉丁文nidus，意思是巢，因为该目中的所有病毒在感染过程中都产生3′共末端的巢套亚基因组mRNA。对所有冠状病毒的总体结构具有贡献的蛋白质是刺突、包膜、膜和核壳。在SARS的特殊情况中，S上的确定的受体结合域介导病毒向其细胞受体血管紧张素转化酶2的附着。
在一个实施方式中，针对的病毒是鼻病毒。鼻病毒(来自希腊语rhin，意思是“鼻”)是细小RNA病毒科的一个属的病毒。鼻病毒是在人类中最常见的病毒传染原，以及普通感冒的病原体。有超过105种病毒血清型引起感冒症状，鼻病毒负责全部病例中的大约50％。鼻病毒具有长度为7.2-8.5kb的单链正义RNA基因组。在基因组的5′末端是病毒编码蛋白质，类似于哺乳动物mRNA，具有3′聚-A尾。结构蛋白在基因组的5′区编码，而非结构蛋白位于末端。对于所有细小RNA病毒这是相同的。病毒颗粒本身没有被膜，并且在结构上是二十面体。
病毒蛋白(或与病毒传染性有关的宿主细胞蛋白)的任何二级结构能够形成本发明的方法的基础。例如，包含螺旋二级结构的病毒蛋白可以用来根据所述螺旋设计拟肽大环化合物。
在一个实施方式中，本发明的拟肽大环化合物基于流感病毒的PB1或PB2序列设计。PB1序列在所有已知的甲型流感病毒株中高度保守，它引起的抗药性可能低于目前护理标准中所观察到的。对来自NCBI数据库的2,485个甲型流感病毒株的PB1的前25个N末端氨基酸进行的比对(Ghanem，2007)证明在PB1的PA相互作用域中具有明显的序列保守性。因此，基于PB1序列的抗病毒治疗可以阻断大多数，如果不是全部的话，甲型流感病毒株。另外，根据PB1的这些极少变化对拟肽大环化合物的序列修饰可以使PB1抑制剂的抗病毒混合物能够消除由于逃脱突变体引起的抗性。
下面给出了适合大环化的序列以及用于本发明的大环肽的非限制性示例列表：
表1a.本发明的示例性的PB1拟肽大环化合物
Figure BPA00001389894800181
Figure BPA00001389894800191
Figure BPA00001389894800201
表1b.本发明示例性的PB2拟肽大环化合物
Figure BPA00001389894800202
本发明的拟肽大环化合物
在一些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有式(I)：
Figure BPA00001389894800212
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure BPA00001389894800213
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
L是式-L1-L2-的形成大环的连接体；
L1和L2独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
在一个例子中，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R1和R2两者独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基。在其他的实施方式中，R1和R2是甲基。
在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是2。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。类似地，当u大于1时，本发明的各个化合物可以包括相同或不同的拟肽大环化合物。例如，本发明的化合物可以包括包含不同的连接体长度或化学组成的拟肽大环化合物。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为螺旋的二级结构，且R8是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他的实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为
Figure BPA00001389894800231
在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于位于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的螺旋。
在一个实施方式中，式(I)的拟肽大环化合物为：
Figure BPA00001389894800232
其中，R1和R2各自独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的。
在相关的实施方式中，式(I)的拟肽大环化合物为：
Figure BPA00001389894800241
形成大环的连接体L的示例性实施方式如下所示。
Figure BPA00001389894800242
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有式(II)：
Figure BPA00001389894800251
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure BPA00001389894800252
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
L是式的形成大环的连接体；
L1、L2和L3独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
在一个例子中，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R1和R2独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基。在其他的实施方式中，R1和R2是甲基。
在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是2。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为螺旋的二级结构，且R8是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为
在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的螺旋。
形成大环的连接体L的示例性实施方式如下所示。
Figure BPA00001389894800271
Figure BPA00001389894800281
在其他实施方式中，本发明提供了式(III)的拟肽大环化合物：
Figure BPA00001389894800282
                式(III)
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、[-NH-L4-CO-]、[-NH-L4-SO2-]或[-NH-L4-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代的；
L1、L2、L3和L4独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自是未取代的或被R5取代的；
K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们是未取代的或被R5取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
在一个例子中，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R1和R2独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基。在其他实施方式中，R1和R2是甲基。
在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是2。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择在本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为螺旋的二级结构，且R8是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为
Figure BPA00001389894800301
在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体[-L1-S-L2-S-L3-]的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的螺旋(包括但不限于310螺旋或α-螺旋)。
例如，大环化合物或大环化合物前体通过溶液相或固相方法合成，且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸。参见，例如，Hunt，Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids中的″TheNon-Protein Amino Acids″，由G.C.Barrett编著，Chapman and Hall，1985。在某些实施方式中，巯基部分是氨基酸残基L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、α-甲基-L-半胱氨酸、α-甲基-D-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、D-高半胱氨酸、α-甲基-L-高半胱氨酸或α-甲基-D-高半胱氨酸的侧链。双烷基化试剂具有X-L2-Y的通式，其中，L2是连接体部分，且X和Y是被-SH部分替代以与L2形成键的离去基团。在某些实施方式中，X和Y是卤素如I、Br或Cl。
在其他实施方式中，为了促进细胞摄取，进一步修饰式I、II或III的化合物中的D和/或E。在某些实施方式中，使拟肽大环化合物脂质化(lipidating)或PEG化(PEGylating)有利于细胞摄取、提高生物利用度、增加血液循环、改变药物代谢动力学、降低免疫原性和/或降低需要的给药频率。
在其他实施方式中，式I、II或III的化合物中的[D]和[E]中的至少一个代表包含另外的形成大环的连接体的部分，使得拟肽大环化合物包含至少两个形成大环的连接体。在具体的实施方式中，拟肽大环化合物包含两个形成大环的连接体。
在本发明的拟肽大环化合物中，本文所述的任何形成大环的连接体可以与表1-4所示的任何序列任意组合使用，也可以与本文所述的任何R-取代基任意组合使用。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含至少一个螺旋基序，如310或α-螺旋基序。例如，式I、II或III的化合物中的A、B和/或C包含一个或多个螺旋。一般地说，螺旋包含3-4个氨基酸残基/圈。在某些实施方式中，拟肽大环化合物的螺旋包括1-5个圈，因而包含3-20个氨基酸残基。在特定的实施方式中，螺旋包括1个圈、2个圈、3个圈、4个圈或5个圈。在某些实施方式中，形成大环的连接体稳定化包括在拟肽大环化合物内的螺旋基序。因此，在某些实施方式中，选择从第一Cα到第二Cα的形成大环的连接体L的长度，以提高螺旋的稳定性。在某些实施方式中，形成大环的连接体跨越螺旋的1-5个圈。在某些实施方式中，形成大环的连接体跨越螺旋的大约1、2、3、4或5个圈。在某些实施方式中，形成大环的连接体的长度是螺旋的每圈大约
Figure BPA00001389894800311
或螺旋每圈大约
Figure BPA00001389894800312
在形成大环的连接体跨越螺旋的大约1个圈时，长度等于大约5个-13个碳-碳键、大约7个-11个碳-碳键或大约9个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约2个圈时，长度等于大约8个-16个碳-碳键、大约10个-14个碳-碳键或大约12个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约3个圈时，长度等于大约14个-22个碳-碳键、大约16个-20个碳-碳键或大约18个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约4个圈时，长度等于大约20个-28个碳-碳键、大约22个-26个碳-碳键或大约24个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约5个圈时，长度等于大约26个-34个碳-碳键、大约28个-32个碳-碳键或大约30个碳-碳键。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约1个圈时，连接包含大约4个-12个原子、大约6个-10个原子或大约8个原子。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约2个圈时，连接包含大约7个-15个原子、大约9个-13个原子或大约11个原子。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约3个圈时，连接包含大约13个-21个原子、大约15个-19个原子或大约17个原子。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约4个圈时，连接包含大约19个-27个原子、大约21个-25个原子或大约23个原子。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约5个圈时，连接包含大约25个-33个原子、大约27个-31个原子或大约29个原子。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约1个圈时，产生的大环形成包含大约17元-25元、大约19元-23元或大约21元的环。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约2个圈时，产生的大环形成包含大约29元-37元、大约31元-35元或大约33元的环。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约3个圈时，产生的大环形成包含大约44元-52元、大约46元-50元或大约48元的环。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约4个圈时，产生的大环形成包含大约59元-67元、大约61元-65元或大约63元的环。在形成大环的连接体跨越螺旋的大约5个圈时，产生的大环形成包含大约74元-82元、大约76元-80元或大约78元的环。
在其他实施方式中，本发明提供了式(IV)或(IVa)的拟肽大环化合物：
Figure BPA00001389894800331
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure BPA00001389894800332
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
L是式-L1-L2-的形成大环的连接体；
L1和L2独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
在一个例子中，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R1和R2独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基。在其他实施方式中，R1和R2是甲基。
在本发明的某些实施方式中，x+y+z至少是1。在本发明的其它实施方式中，x+y+z至少是2。在本发明的其他实施方式中，x+y+z是3、4、5、6、7、8、9或10。独立地选择本发明的大环化合物或大环化合物前体中A、B、C、D或E的各具体值。例如，当x是3时，式[A]x代表的序列包括其中氨基酸不相同的实施方式，例如，Gln-Asp-Ala；以及其中氨基酸相同的实施方式，例如，Gln-Gln-Gln。这适用于指定范围内的x、y或z的任意值。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物包含为螺旋的二级结构，且R8是-H，从而允许螺旋内的氢键键合。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。在其他的实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为
Figure BPA00001389894800341
在其他实施方式中，选择如从第一Cα到第二Cα测量的形成大环的连接体L的长度以稳定希望的二级肽结构，如由拟肽大环化合物的残基(包括但不是必须限于第一Cα和第二Cα之间的残基)形成的螺旋(包括310螺旋或α-螺旋)。
形成大环的连接体-L1-L2-的示例性的实施方式如下所示。
Figure BPA00001389894800351
拟肽大环化合物的制备
本发明的拟肽大环化合物可以通过本领域已知的各种方法中的任何一种来制备。例如，表1中的由“X”表示的任何残基可以被能够与同一分子中的第二残基或这样的残基的前体形成交联连接体的残基置换。
各种实现拟肽大环化合物制备的方法是本领域已知的。例如，Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Schafmeister& Verdine，J.Am.Chem.Soc.122：5891(2005)；Walensky等人，Science305：1466-1470(2004)和美国专利7,192,713中描述了式I的拟肽大环化合物的制备。在所引用的参考文献中公开的α，α-二取代的氨基酸和氨基酸前体可以用于拟肽大环化合物前体多肽的合成。例如，“S5-烯烃氨基酸”是(S)-α-(2’-戊烯基)丙氨酸，和“S8-烯烃氨基酸”是(S)-α-(2’-辛烯基)丙氨酸。在将这样的氨基酸掺入前体多肽中之后，末端烯烃与复分解反应催化剂反应，从而导致拟肽大环化合物的形成。
在其他实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有式IV或IVa。例如，美国专利7,202,332描述了这样的大环化合物的制备方法。
在某些实施方式中，这些拟肽大环化合物的合成包括多步骤的过程，其特征在于：合成含有叠氮部分和炔部分的拟肽前体；接着将拟肽前体与大环化试剂接触以产生三唑连接的拟肽大环化合物。这类方法例如在2008年2月25日提交的美国申请12/037,041中有描述。例如，大环化合物或大环化合物前体通过溶液相或固相方法合成，且可以包含天然存在的和非天然存在的氨基酸。参见，例如，Hunt，Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids中的″The Non-ProteinAmino Acids″，由G.C.Barrett编著，Chapman and Hall，1985。
在某些实施方式中，叠氮连接残基的α-碳，且炔连接在另一个残基的α-碳上。在某些实施方式中，叠氮部分是氨基酸L-赖氨酸、D-赖氨酸、α-甲基-L-赖氨酸、α-甲基-D-赖氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、α-甲基-L-鸟氨酸或α-甲基-D-鸟氨酸的叠氮基类似物。在另一种实施方式中，炔部分是L-炔丙基甘氨酸。在再其他的实施方式中，炔部分是选自以下的氨基酸：L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。
在某些实施方式中，本发明提供了一种合成拟肽大环化合物的方法，该方法包括将式V或式VI的拟肽前体与大环化试剂接触的步骤：
Figure BPA00001389894800361
Figure BPA00001389894800371
其中，v、w、x、y、z、A、B、C、D、E、R1、R2、R7、R8、L1和L2如上文对于式(II)所定义；当大环化试剂是Cu试剂时，R12是-H，且当大环化试剂是Ru试剂时，R12是-H或烷基；而且进一步，其中，所述接触步骤导致在式III或式IV中的炔部分和叠氮部分之间形成共价连接。例如，当大环化试剂是Ru试剂时，R12可以是甲基。
在本发明的的拟肽大环化合物中，R1和R2中的至少一个是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在某些实施方式中，R1和R2独立地是烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素取代的。在某些实施方式中，A、B、C、D或E中的至少一个为α，α-二取代的氨基酸。在一个例子中，B是α，α-二取代的氨基酸。例如，A、B、C、D或E中的至少一个为2-氨基异丁酸。
例如，R1和R2中的至少一个是未取代的或被卤素取代的烷基。在另一个例子中，R1和R2独立地是未取代的或被卤素取代的烷基。在某些实施方式中，R1和R2中的至少一个是甲基。在其他实施方式中，R1和R2是甲基。大环化试剂可以是Cu试剂或Ru试剂。
在某些实施方式中，在接触步骤之前纯化拟肽前体。在其他实施方式中，在接触步骤之后纯化拟肽大环化合物。在再其他的实施方式中，拟肽大环化合物在接触步骤之后重折叠。本方法可以在溶液中进行，或者，可选择地，本方法可以在固体载体上进行。
本文也预想，在结合拟肽前体或拟肽大环化合物的目标大分子的存在下，在有利于所述结合的条件下进行本发明的方法。在某些实施方式中，在优先结合拟肽前体或拟肽大环化合物的目标大分子的存在下，在有利于所述结合的条件下进行本发明的方法。本方法也可应用于合成拟肽大环化合物的文库。
在某些实施方式中，式V或式VI的拟肽前体的炔部分是选自以下的氨基酸的侧链：L-炔丙基甘氨酸、D-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-5-己炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(R)-2-氨基-2-甲基-7-辛炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸和(R)-2-氨基-2-甲基-8-壬炔酸。在其他实施方式中，式V或式VI的拟肽前体的叠氮部分是选自以下的氨基酸的侧链：ε-叠氮基-L-赖氨酸、ε-叠氮基-D-赖氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸、δ-叠氮基-α-甲基-L-鸟氨酸和δ-叠氮基-α-甲基-D-鸟氨酸。
在某些实施方式中，x+y+z为2，且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。在其他实施方式中，x+y+z为3或6，且A、B和C独立地是天然或非天然的氨基酸。
在某些实施方式中，接触步骤在选自质子溶剂、水性溶剂、有机溶剂及其混合物的溶剂中进行。例如，溶剂可以选自H2O、THF、THF/H2O、tBuOH/H2O、DMF、DIPEA、CH3CN或CH2Cl2、ClCH2CH2Cl或其混合物。溶剂可以是有利于螺旋形成的溶剂。
替换可选择的但等效的保护基团、离去基团或试剂，并按照可选择的序列或顺序进行特定的合成步骤，以产生需要的化合物。用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)包括，例如，那些例如在Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；Greene和Wuts，Protective Groups in Organic  Synthesis，第2版，John Wiley and Sons(1991)；Fieser和Fieser，Fieser and  Fies er′s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和Paquette编著，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wileyand Sons(1995)及其后续的版本中所述的方法。
在一些实施方案中，本发明的拟肽大环化合物具有结构：
Figure BPA00001389894800391
以上所示的流感PB1拟肽大环化合物也被分别称为SP-8、SP-16、SP-13和SP-41。在其它实施方式中，本发明的拟肽大环化合物具有结构：
Figure BPA00001389894800401
拟肽大环化合物的制备
例如，通过化学合成方法，如Fields等人，Synthetic Peptides：A  User′s Guide中的第3章，Grant，W.H.编著，Freeman & Co.，New York，N.Y.，1992，第77页中所述的方法，制备本发明的拟肽大环化合物。因此，例如，利用具有通过tBoc或Fmoc化学保护作用的胺的自动化Merrifield固相合成技术，在例如自动肽合成仪(例如，Applied Biosystems(FosterCity，CA)，430A、431或433型)上使用侧链保护的氨基酸合成肽。
本文描述的一种产生本文所述的拟肽前体和拟肽大环化合物的方式使用固相肽合成(SPPS)。经由与连接体分子的酸不稳定的键将C-末端氨基酸连接到交联的聚苯乙烯树脂上。这种树脂不溶于用于合成的溶剂，从而使得洗去过量的试剂和副产物相对简单和快速。用在酸中稳定、但可用碱去除的Fmoc基团保护N-末端。如必要的话，用碱稳定的、酸不稳定的基团保护侧链官能团。
例如，通过使用天然的化学连接结合单个的合成肽产生较长的拟肽前体。或者，通过公知的重组DNA和蛋白质表达技术生物合成较长的合成肽。公知的标准手册中提供了这些技术的详细方案。为了构建编码本发明的拟肽前体的基因，逆向翻译氨基酸序列以获得编码该氨基酸序列的核酸序列，优选使用对于将表达该基因的生物体优化的密码子。接下来，通常通过合成编码肽的寡核苷酸和任何调节元件(如果必要的话)制备合成的基因。将合成的基因插入合适的克隆载体，并转染到宿主细胞中。然后在适用于选择的表达系统和宿主的合适条件下表达该肽。通过标准方法纯化并表征该肽。
例如，使用例如高通量多通道组合合成仪(例如，来自CreoSalus，Louisville，KY的Thuramed TETRAS多通道肽合成仪或来自AAPPTEC，Inc.，Louisville，KY的Apex 396型多通道肽合成仪)以高通量的组合方式制备拟肽前体。
提供了下面的合成方案仅用于说明本发明，而并非意在限制本文所述的本发明的范围。为了简化图形，示例性的方案显示了叠氮基氨基酸类似物ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸和ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸，及炔氨基酸类似物L-炔丙基甘氨酸、(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸和(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸。因此，在下面的合成方案中，各个R1、R2、R7和R8是-H；各个L1是-(CH2)4-；且各个L2是-(CH2)-。但是，如以上整个发明详述部分所指出的，可以采用许多其他的氨基酸类似物，其中，R1、R2、R7、R8、L1和L2可以独立地选自本文公开的各种结构。
合成方案1：
Figure BPA00001389894800421
合成方案1描述了本发明的几种化合物的制备。如Belokon等人(1998)，Tetrahedron Asymm.9：4249-4252所述制备由手性辅剂(S)-2-[N-(N’-苄基脯氨酰基)氨基]苯甲酮(BPB)衍生的席夫碱和氨基酸(如甘氨酸或丙氨酸)的Ni(II)复合物。产生的复合物随后与包含叠氮部分或炔部分的烷基化试剂反应以产生光学异构富集的(enantiomerically enriched)本发明的化合物。如需要，产生的化合物可以进行保护以用于肽合成。
合成方案2：
Figure BPA00001389894800431
在如合成方案2所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过溶液相或固相肽合成法(SPPS)来合成。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽前体去保护并从固相树脂上切下。拟肽前体以粗制混合物进行反应，或者在有机溶液或水性溶液中在与大环化试剂(如Cu(I))反应前进行纯化(Rostovtsev等人(2002)，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；Tornoe等人(2002)，J.Org.Chem.67：3057-3064；Deiters等人(2003)，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783；Punna等人(2005)，Angew.Chem.Int.Ed.44：2215-2220)。在一种实施方式中，在有利于螺旋形成的条件下进行三唑形成反应。在一种实施方式中，在选自H2O、THF、CH3CN、DMF、DIPEA、tBuOH或其混合物的溶剂中进行大环化步骤。在另一种实施方式中，在DMF中进行大环化步骤。在某些实施方式中，在缓冲的水性溶剂或部分水性溶剂中进行大环化步骤。
合成方案3：
Figure BPA00001389894800451
在如合成方案3所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过固相肽合成法(SPPS)来合成。拟肽前体作为粗制混合物与树脂上的大环化试剂(如Cu(I)试剂)反应(Rostovtsev等人(2002)，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；Tornoe等人(2002)，J.Org.Chem.67：3057-3064；Deiters等人(2003)，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783；Punna等人(2005)，Angew.Chem.Int.Ed.44：2215-2220)。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将合成的含三唑的拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。在某些实施方式中，在选自CH2Cl2、ClCH2CH2Cl、DMF、THF、NMP、DIPEA、2，6-二甲基吡啶、吡啶、DMSO、H2O或其混合物的溶剂中进行大环化步骤。在某些实施方式中，在缓冲的水性溶剂或部分水性溶剂中进行大环化步骤。
合成方案4：
Figure BPA00001389894800461
在如合成方案4所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过溶液相或固相肽合成法(SPPS)来合成。然后通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽前体去保护并从固相树脂上切下。拟肽前体作为粗制混合物进行反应，或者在与大环化试剂如Cu(II)试剂(例如Cp*RuCl(PPh3)2或[Cp*RuCl]4)反应前进行纯化(Rasmussen等人(2007)，Org.Lett.9：5337-5339；Zhang等人(2005)，J.Am.Chem.Soc.127：15998-15999)。在某些实施方式中，在选自DMF、CH3CN和THF的溶剂中进行大环化步骤。
合成方案5：
Figure BPA00001389894800481
在如合成方案5所示的用于合成拟肽大环化合物的一般方法中，拟肽前体包含叠氮部分和炔部分，且使用可商购的氨基酸N-α-Fmoc-L-炔丙基甘氨酸及氨基酸(S)-2-氨基-2-甲基-4-戊炔酸、(S)-2-氨基-6-庚炔酸、(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚炔酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸的N-α-Fmoc保护的形式通过固相肽合成法(SPPS)来合成。拟肽前体作为粗制混合物与在树脂上的大环化试剂(如Ru(II)试剂)反应。例如，该试剂可以是Cp*RuCl(PPh3)2或[Cp*RuCl]4(Rasmussen等人(2007)，Org.Lett.9：5337-5339；Zhang等人(2005)，J.Am.Chem.Soc.127：15998-15999)。在某些实施方式中，在选自CH2Cl2、ClCH2CH2Cl、CH3CN、DMF和THF的溶剂中进行大环化步骤。
本发明包括使用非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物合成本文所述的拟肽大环化合物。任何适合于用来合成稳定的含三唑的拟肽大环化合物的合成方法的氨基酸或氨基酸类似物都可以用于本发明中。例如，预计L-炔丙基甘氨酸是本发明中有用的氨基酸。但是，含有不同氨基酸侧链的其他含炔的氨基酸也可用于本发明中。例如，L-炔丙基甘氨酸在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的炔之间含有一个亚甲基单元。本发明也包括使用在α-碳和炔之间具有多个亚甲基单元的氨基酸。同样，氨基酸L-赖氨酸、D-赖氨酸、α-甲基-L-赖氨酸和α-甲基-D-赖氨酸的叠氮类似物也认为是本发明的有用氨基酸。但是，含有不同的氨基酸侧链的其他末端叠氮氨基酸也可以用于本发明中。例如，L-赖氨酸的叠氮类似物在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的末端叠氮基之间含有4个亚甲基单元。本发明也包括使用在α-碳和末端叠氮基之间具有少于或多于4个亚甲基单元的氨基酸。表2显示一些可用于制备本发明的拟肽大环化合物的氨基酸。
表2
Figure BPA00001389894800501
表2显示用于制备本发明的拟肽大环化合物的示例性的氨基酸。
在某些实施方式中，氨基酸和氨基酸类似物是D-构型。在其他实施方式中，它们是L-构型。在某些实施方式中，拟肽中包含的某些氨基酸和氨基酸类似物是D-构型，而某些氨基酸和氨基酸类似物是L-构型。在某些实施方式中，氨基酸类似物是α，α-二取代的，如α-甲基-L-炔丙基甘氨酸、α-甲基-D-炔丙基甘氨酸、ε-叠氮基-α-甲基-L-赖氨酸和ε-叠氮基-α-甲基-D-赖氨酸。在某些实施方式中，氨基酸类似物是N-烷基化的，例如，N-甲基-L-炔丙基甘氨酸、N-甲基-D-炔丙基甘氨酸、N-甲基-ε-叠氮基-L-赖氨酸和N-甲基-ε-叠氮基-D-赖氨酸。
在某些实施方式中，使用保护基团(包括但不限于-Fmoc和-Boc)保护氨基酸的-NH部分。在其他实施方式中，在合成拟肽大环化合物之前不保护氨基酸。
在其他实施方式中，合成式III的拟肽大环化合物。这类方法例如在2007年12月17日提交的美国申请11/957,325中有描述。下面的合成方案描述这类化合物的制备。为了简化图表，示例性的方案描绘了源自L-或D-半胱氨酸的氨基酸类似物，其中，L1和L3都是-(CH2)-。但是，如以上整个发明详述部分所指出的，可以采用许多其他氨基酸类似物，其中，L1和L3可以独立地选自本文公开的各种结构。符号“[AA]m”、“[AA]n”、“[AA]o”代表酰胺键连接部分(如天然或非天然氨基酸)的序列。如前面所述，“AA”的各具体情况与“AA”的任何其他具体情况无关，而且如“[AA]m”的式子包括(例如)不相同氨基酸的序列以及相同氨基酸的序列。
合成方案6：
Figure BPA00001389894800521
在合成方案6中，拟肽前体含有2个-SH部分，而且使用可商购的N-α-Fmoc氨基酸如N-α-Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸或N-α-Fmoc-S-三苯甲基-D-半胱氨酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(″Bioorganic Chemistry：Peptides and  Proteins″，Oxford University Press，New York：1998，本文通过引用引入其完整内容)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-三苯甲基单体。接着通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)对前体拟肽去保护并从固相树脂上切下。前体拟肽作为粗制混合物进行反应，或者在有机溶液或水性溶液中在与X-L2-Y反应前进行纯化。在某些实施方式中，在稀释条件(即，0.15mmol/L)下进行烷基化反应，以有利于大环化并避免聚合。在某些实施方式中，在有机溶液如液NH3中(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH3/MeOH中或NH3/DMF中(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)进行烷基化反应。在其他实施方式中，在水性溶液如pH 8的6M盐酸胍中进行烷基化反应(Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554)。在其他实施方式中，用于烷基化反应的溶剂是DMF或二氯乙烷。
合成方案7：
在合成方案7中，前体拟肽含有2个或多个-SH部分，其中的2个特别地进行保护以允许其选择性地去保护和随后烷基化以形成大环。使用可商购的N-α-Fmoc氨基酸如N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸或N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-D-半胱氨酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成前体拟肽。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(Bioorganic Chemistry：Peptides and Proteins，Oxford UniversityPress，New York：1998，本文通过引用引入其完整内容)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基单体。接着通过标准条件(例如，弱酸如DCM中的1％TFA)选择性地切下拟肽前体的Mmt保护基团。然后前体拟肽在树脂上与有机溶液中的X-L2-Y反应。例如，该反应在位阻碱(hindered base)如二异丙基乙胺的存在下发生。在某些实施方式中，在有机溶液如液NH3中(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.PeptideProtein Res.40：233-242)、NH3/MeOH中或NH3/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)中进行烷基化反应。在其他实施方式中，烷基化反应在DMF或二氯乙烷中进行。接着通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)将拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。
合成方案8：
Figure BPA00001389894800561
在合成方案8中，拟肽前体含有2个或多个-SH部分，其中的2个进行特别保护以允许其选择性地去保护和随后烷基化以形成大环。使用可商购的N-α-Fmoc氨基酸如N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-L-半胱氨酸、N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基-D-半胱氨酸、N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-L-半胱氨酸和N-α-Fmoc-S-S-叔丁基-D-半胱氨酸通过固相肽合成法(SPPS)来合成拟肽前体。通过已知方法(Seebach等人(1996)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：2708-2748以及其中的参考文献)产生D-半胱氨酸或L-半胱氨酸的α-甲基化形式，然后通过已知方法(Bioorganic  Chemistry：Peptides and Proteins，Oxford University Press，New York：1998，本文通过引用引入其完整内容)将其转化为适当保护的N-α-Fmoc-S-对甲氧基三苯甲基或N-α-Fmoc-S-S-叔丁基单体。接着通过已知条件(例如，DMF中的20％的2-巯基乙醇，参考文献：Galande等人(2005)，J.Comb.Chem.7：174-177)选择性地切下拟肽前体的S-S-叔丁基保护基团。然后前体拟肽在树脂上与有机溶液中的摩尔过量的X-L2-Y反应。例如，反应在位阻碱如二异丙基乙胺的存在下发生。接着通过标准条件(例如，弱酸如DCM中的1％TFA)选择性地切下拟肽前体的Mmt保护基团。然后拟肽前体在树脂上通过有机溶液中的位阻碱的处理而环化。在某些实施方式中，在如NH3/MeOH或NH3/DMF(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)的有机溶液中进行烷基化反应。接着通过标准条件(例如，强酸如95％TFA)对拟肽大环化合物去保护并从固相树脂上切下。
合成方案9：
Figure BPA00001389894800571
在合成方案9中，拟肽前体含有2个L-半胱氨酸部分。通过已知的活细胞中的生物表达系统或通过已知的体外无细胞表达方法合成拟肽前体。前体拟肽作为粗制混合物进行反应，或者在有机溶液或水性溶液中在与X-L2-Y反应前进行纯化。在某些实施方式中，在稀释条件(即，0.15mmol/L)下进行烷基化反应，以利于大环化并避免聚合。在某些实施方式中，在有机溶液如液NH3中(Mosberg等人(1985)，J.Am.Chem.Soc.107：2986-2987；Szewczuk等人(1992)，Int.J.Peptide Protein Res.40：233-242)、NH3/MeOH中或NH3/DMF中(Or等人(1991)，J.Org.Chem.56：3146-3149)进行烷基化反应。在其他实施方式中，在水性溶液如pH 8的6M盐酸胍中进行烷基化反应(Brunel等人(2005)，Chem.Commun.(20)：2552-2554)。在其他实施方式中，在DMF或二氯乙烷中进行烷基化反应。在另一实施方式中，在非变性水性溶液中进行烷基化；在再另一种实施方式中，在有利于螺旋结构形成的条件下进行烷基化。在再另一种实施方式中，在有利于前体拟肽与另一种蛋白质结合的条件下进行烷基化，从而在烷基化过程中诱导结合的螺旋构象的形成。
本发明设想了适合与巯基反应的X和Y的各种实施方式。一般地，X或Y各自独立地选自表5所示的一般种类。例如，X和Y是如-Cl、-Br或-I的卤素。本文所述的任何形成大环的连接体可以与表1-4所示的任何序列任意组合使用，也可以与本文表明的任何R-取代基任意组合使用。
表3：能够与巯基反应的反应性基团和产生的连接的例子
  X或Y   产生的共价连接
  丙烯酰胺   硫醚
  卤化物(例如，烷基或芳基卤化物)   硫醚
  磺酸(sulfonate)   硫醚
  氮丙啶(aziridine)   硫醚
  环氧化物   硫醚
  卤代乙酰胺   硫醚
  马来酰亚胺   硫醚
  磺酸酯(sulfonate ester)   硫醚
本发明包括天然存在的和非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物应用于式(III)的拟肽大环化合物的合成中。任何适合用来合成稳定的含双巯基的拟肽大环化合物的合成方法的氨基酸或氨基酸类似物都可以用于本发明中。例如，预计半胱氨酸是本发明中有用的氨基酸。但是，除了半胱氨酸之外，其他含有不同氨基酸侧链的含硫的氨基酸也是有用的。例如，半胱氨酸在氨基酸的α-碳和氨基酸侧链的末端-SH之间含有一个亚甲基单元。本发明也包括使用在α-碳和末端-SH之间具有多个亚甲基单元的氨基酸。非限制的例子包括α-甲基-L-高半胱氨酸和α-甲基-D-高半胱氨酸。在某些实施方式中，氨基酸和氨基酸类似物是D-构型。在其他实施方式中，它们是L-构型。在某些实施方式中，拟肽中包含的某些氨基酸和氨基酸类似物是D-构型，而某些氨基酸和氨基酸类似物是L-构型。在某些实施方式中，氨基酸类似物是α，α-二取代的，如α-甲基-L-半胱氨酸和α-甲基-D-半胱氨酸。
本发明包括其中形成大环的连接体用来连接拟肽前体中的两个或多个-SH部分以形成本发明的拟肽大环化合物的大环化合物。如上所述，形成大环的连接体赋予构象刚性、提高的代谢稳定性和/或提高的细胞渗透性。另外，在某些实施方式中，形成大环的连接稳定拟肽大环化合物的螺旋二级结构。形成大环的连接体具有式X-L2-Y，其中，X和Y是如上定义的相同或不同的部分。X和Y二者都具有允许一个形成大环的连接体-L2-使含有双巯基的拟肽前体双烷基化的化学特性。如上定义，连接体-L2-包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基或亚杂环芳基或-R4-K-R4-，所有这些都可以任选地被如上定义的R5基团取代。另外，除了连接含巯基氨基酸的-SH的碳之外，形成大环的连接体-L2-中的1-3个碳原子任选地被杂原子如N、S或O替代。
形成大环的连接体X-L2-Y的L2部分在长度上可以根据尤其是用来形成拟肽大环化合物的两个氨基酸类似物的位置之间的距离而变化。另外，随着形成大环的连接体的L1和/或L3部分的长度发生变化，L2的长度也可以变化以产生具有合适的总长度的连接体以形成稳定的拟肽大环化合物。例如，如果通过向L1和L3各添加另外的亚甲基单元来改变所使用的氨基酸类似物，那么L2在长度上减少等同于大约两个亚甲基单元的长度，以抵消L1和L3的长度增加。
在某些实施方式中，L2是式-(CH2)n-的亚烷基基团，其中，n是大约1-大约15之间的整数。例如，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其他实施方式中，L2是亚烯基基团。在更其他的实施方式中，L2是芳基。
表4显示X-L2-Y基团的另外的实施方式。
表4.本发明的示例性的X-L2-Y基团
例如，该表中的X和Y各自独立地是Cl-、Br-或I-。
预计适用于进行本发明的形成拟肽大环化合物的另外的方法包括以下文献中公开的方法：Mustapa，M.Firouz Mohd等人，J.Org.Chem(2003)，68，第8193-8198页；Yang，Bin等人Bioorg Med.Chem.Lett.(2004)，14，第1403-1406页；美国专利5,364,851；美国专利5,446,128；美国专利5,824,483；美国专利6,713,280和美国专利7,202,332。在这样的实施方式中，使用在α-位置含有另外的R-取代基的氨基酸前体。这种氨基酸在需要的位置被掺入大环化合物前体中，其可以在交联连接体被取代的位置，或者，可选择地，在大环化合物前体序列中的其他位置。然后根据指定的方法实现前体的环化。
在一些实施方式中，希望改变得到的拟肽大环化合物的构型。例如，当更希望是310螺旋构型时，可以对大环化合物进行额外的取代或修饰，以诱导或偏向这种构型，如用2-氨基异丁酸(Aib)取代本发明的序列中的一个或多个氨基酸。参见，例如，Boal等人，J.Am.Chem.Soc.2007，129，6986-6987。在一个实施方式中，本发明的螺旋大环化合物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的Aib取代。
分析
例如，本发明的拟肽大环化合物的性质通过使用下面所述的方法进行分析。在一些实施方式中，本发明的拟肽大环化合具有相对于缺乏本文所述的取代基的相应的多肽改善的生物学特性。
测定螺旋度的分析
在溶液中，具有螺旋结构域的多肽的二级结构在随机卷曲结构和螺旋结构之间达到动态平衡，这通常称为“百分螺旋度”。因此，例如，未修饰的螺旋结构域在溶液中可主要是随机卷曲，螺旋含量通常低于25％。另一方面，具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非交联多肽至少2倍的螺旋度。在某些实施方式中，本发明的大环化合物具有高于50％的螺旋度。为了分析本发明的拟肽大环化合物的螺旋度，将化合物溶于水性溶液中(例如，pH 7的50mM磷酸钾溶液或蒸馏水，达到25-50μM的浓度)。使用标准测量参数(例如，温度，20℃；波长，190-260nm；步分辨率(stepresolution)，0.5nm；速度，20nm/秒；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上获得圆二色性(CD)谱。通过将平均残基椭圆率(例如，[Φ]222obs)除以模型螺旋十肽的报道值(Yang等人(1986)，Methods Enzymol.130：208)来计算各个肽的螺旋含量。
测定熔解温度(Tm)的分析
含有二级结构(如螺旋)的本发明的拟肽大环化合物显示出例如比相应的非交联多肽更高的熔解温度。通常，本发明的拟肽大环化合物显示＞60℃的Tm，表明在水溶液中高度稳定的结构。为了分析大环形成对熔解温度的效应，将拟肽大环化合物或未修饰的肽溶于蒸馏水中(例如，到50μM的终浓度)，并且通过使用标准参数(例如，波长，222nm；步分辨率，0.5nm；速度，20nm/秒；累积，10；响应，1秒；带宽，1nm；温度上升速度，1℃/分钟；路径长度，0.1cm)在分光偏振计(例如，Jasco J-710)上测量椭圆率在一定温度范围(例如，4-95℃)内的变化来测定Tm。
蛋白酶抗性分析
肽骨架的酰胺键易受到蛋白酶的水解，因而致使肽化合物在体内易于快速降解。但是，肽螺旋的形成通常包埋酰胺骨架，从而可以保护其免于蛋白水解裂解。本发明的拟肽大环化合物可以经受体外胰蛋白酶的蛋白水解以评价与相应的非交联多肽相比其降解速度的任何变化。例如，拟肽大环化合物和相应的非交联多肽与胰蛋白酶琼脂糖一起温育，并在各个时间点通过离心终止反应和随后进行HPLC注射以根据280nm处的紫外吸收定量残留的底物。简单地说，拟肽大环化合物和拟肽前体(5mcg)与胰蛋白酶琼脂糖(Pierce)(S/E～125)温育0、10、20、90和180分钟。通过台式离心机高速离心终止反应；通过基于HPLC的在280nm处的峰检测对分离的上清液中残余的底物进行定量。蛋白水解反应显示出一级动力学，且速率常数k由ln[S]相对于时间的曲线确定(k＝-1X斜率)。
体外稳定性分析
具有优化的连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非交联多肽至少2倍的体外半衰期，且具有12小时或更长的体外半衰期。对于体外血清稳定性研究，可以使用多种分析方法。例如，将拟肽大环化合物和相应的非交联多肽(2mcg)与新鲜的小鼠、大鼠和/或人血清(2mL)一起在37℃下温育0、1、2、4、8和24小时。为了测定完整化合物的含量，可以使用下面的程序：通过将100μl的血清转移到2ml离心管中，接着加入10μL的50％甲酸和500μL乙腈并在4±2℃下以14,000RPM离心10分钟来提取样品。然后将上清液转移到新的2ml管中，并在N2＜10psi、37℃下在Turbovap上蒸发。样品在100μL的50∶50乙腈∶水中重构，并进行LC-MS/MS分析。
体外结合分析
为了评价拟肽大环化合物和拟肽前体与受体蛋白(acceptorprotein)的结合和亲和力，使用例如荧光偏振分析(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附着在具有高表观分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如，FITC)与附着在较小分子上(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)的荧光示踪剂相比具有较慢的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。
例如，在室温下，荧光标记的(fluoresceinated)拟肽大环化合物(25nM)与受体蛋白(25-1000nM)在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测量结合活性。可以使用例如Graphpad Prism软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。在某些情况下，本发明的拟肽大环化合物显示出与相应的非交联多肽类似的或更低的Kd。
鉴定肽-蛋白质相互作用的拮抗剂的体外置换分析
为了评价拮抗肽与受体蛋白之间的相互作用的化合物的结合和亲和力，例如，使用利用源自拟肽前体序列的荧光标记的拟肽大环化合物的荧光偏振分析(FPA)。FPA技术使用偏振光和荧光示踪剂测量分子取向和分子迁移率。当用偏振光激发时，由于附着在具有高表观分子量的分子(例如，与大蛋白质结合的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂(例如，FITC)与附着在较小分子(例如，在溶液中游离的FITC标记的肽)上的荧光示踪剂相比具有较低的旋转速度，附着在具有高表观分子量的分子上的荧光示踪剂发射较高水平的偏振荧光。拮抗荧光标记的拟肽大环化合物与受体蛋白之间的相互作用的化合物在竞争性结合FPA实验中进行检测。
例如，在室温下，假定的拮抗剂化合物(1nM-1mM)和荧光标记的拟肽大环化合物(25nM)与受体蛋白(50nM)一起在结合缓冲液(140mM NaCl、50mM Tris-HCL，pH 7.4)中温育30分钟。例如，用发光分光光度计(例如，Perkin-Elmer LS50B)通过荧光偏振测量拮抗剂的结合活性。使用例如Graphpad Prism软件(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)通过非线性回归分析来确定Kd值。
在该分析中任一类型的分子(如有机小分子、肽、寡核苷酸或蛋白质)可以作为假定的拮抗剂进行检验。
完整细胞中的结合分析
有可能通过免疫沉淀实验测量肽或拟肽大环化合物与完整细胞中其天然受体的结合。例如，完整的细胞与荧光标记的(FITC-标记的)化合物在无血清的情况下温育4小时，接着进行血清置换和进一步温育4-18小时。然后使细胞沉淀，并在4℃下、在裂解缓冲液(50mM Tris[pH 7.6]、150mM NaCl、1％的CHAPS和蛋白酶抑制剂混合物)中温育10分钟。以14,000rpm离心提取物15分钟，收集上清液，并与10μl山羊抗-FITC抗体一起温育2小时，在4℃下旋转，接着在4℃下进一步与蛋白A/G Sepharose(50μl的50％微球浆(bead slurry))温育2小时。快速离心之后，在含有增加的盐浓度(例如，150、300、500mM)的裂解缓冲液中洗涤沉淀物。随后在加入含有SDS的样品缓冲液和煮沸之前，以150mM NaCl再平衡微球。离心之后，使用4％-12％梯度的Bis-Tris凝胶任选地对上清液进行电泳，接着转移到Immobilon-P膜上。封闭之后，任选地将印迹与检测FITC的抗体一起温育，也与一种或多种检测与拟肽大环化合物结合的蛋白质的抗体一起温育。
细胞渗透性分析
相比于相应的非交联的大环化合物，拟肽大环化合物例如具有更好的细胞渗透性。具有优化连接体的拟肽大环化合物具有例如高于相应的非交联的大环化合物至少2倍的细胞渗透性，并且通常观察到20％或更多的应用的拟肽大环化合物在4小时后已渗透入细胞。为了测量拟肽大环化合物和相应的非交联的大环化合物的细胞渗透性，在37℃下在不含血清的培养基中将完整的细胞与荧光标记的拟肽大环化合物或相应的非交联的大环化合物(10μM)一起温育4小时，用培养基洗涤2次，并在37℃下与胰蛋白酶(0.25％)温育10分钟。再次洗涤细胞并将其再悬浮于PBS中。例如，通过使用FACSCalibur流式细胞仪或Cellomics’KineticScan
Figure BPA00001389894800651
HCS阅读仪分析细胞荧光。
体内稳定性分析
为了研究拟肽大环化合物的体内稳定性，例如，向小鼠和/或大鼠通过IV、IP、PO或吸入途径以0.1-50mg/kg的浓度施用化合物，并在注射后0′、5′、15′、30′、1小时、4小时、8小时和24小时抽取血样。然后如上通过LC-MS/MS测量25μL新鲜血清中的完整化合物的含量。
体外流感病毒复制抑制测试
该流感抗病毒评价分析检测了指定剂量-反应浓度的化合物的作用。参见Noah，J.W.，W.Severson，D.L.Noah，L.Rasmussen，E.L.White，and C.B.Jonsson，Antiviral Res，2007.73(1)：p.50-9。在该分析中使用Madin Darby犬肾(MDCK)细胞测试化合物在防止流感感染诱导的细胞病变效应(CPE)中的效能。每次实验中包括利巴韦林或达菲(Tamiflu)作为阳性对照化合物。将MDCK细胞的亚汇合的培养物接种到96孔板上分析细胞生存力(细胞毒性)和抗病毒活性(CPE)。24小时后向细胞添加药物。在指定的时间，CPE孔也接受100个组织培养感染剂量(100TCID50s)的滴定的流感病毒。72小时后检测细胞生存力。使病毒诱导的CPE降低25％(IC25)、50％(IC50)和90％(IC90)的有效化合物浓度通过利用半对数曲线拟合的回归分析计算。细胞生存力利用CellTiter-Glo(Promega)评价。也计算使细胞数减少50％和90％(分别为TC50和TC90)的药物的毒性浓度。也计算选择性(治疗)指数(SI＝TC/IC)。
体内流感病毒复制抑制测试
可以进行本发明化合物的体内测试，包括在哺乳动物如大鼠或雪貂上进行测试。因为雪貂(Mustela putorius furo)对人甲型和乙型流感病毒感染天然敏感，并且它们的疾病类似于人类流感，因此这些动物已经广泛用作流感病毒发病机理和免疫研究的模型。参见Sidwell，R.W.和D.F.Smee，Antiviral Res，2000.48(1)：p.1-16；和Colacino，J.M.，D.C.DeLong，J.R.Nelson，W.A.Spitzer，J.Tang，F.Victor，和C.Y.Wu，Antimicrob Agents Chemother，1990.34(11)：p.2156-63。雪貂也是选择用于研究禽流感病毒H5N1在哺乳动物中的发病机理的模型。也参见Zitzow，L.A.，T.Rowe，T.Morken，W.-J.Shieh，S.Zaki和J.M.Katz，Pathogenesis of Avian Influenza A(H5N1)Viruses in Ferrets.2002.p.4420-4429。PB1订合肽的活性可以与作为阳性对照的利巴韦林或奥司他韦进行比较。
简要地说，通过血凝抑制分析确定对于当前循环人甲型或乙型流感病毒为血清学阴性的年轻成年雄性或雌性雪貂(每个治疗组5只雪貂)在感染前至少4天在BSL-3+动物待检区隔离，将它们关在生物清洁便携层流清洁室(Lab Products，Seaford，Del.)中的笼子中。在感染前，每天两次测量基线温度，持续至少3天。雪貂用氯胺酮(25mg/kg)、赛拉嗪(2mg/kg)和阿托品(0.05mg/kg)经肌肉注射麻醉，并用施用至鼻孔的病毒/mi磷酸缓冲液(PBS)鼻内(i.n.)感染。对照动物用相同稀释度(1∶30)的非传染性尿囊液假感染。订合肽在病毒感染后1小时通过静脉内或腹膜内施用。每日两次用直肠温度计或皮下植入的温度发射器(BioMedic DataSystems，Inc.，Seaford，Del.)测量温度，将感染前的温度值平均以获得每只雪貂的基线温度。在每个时间点对每只动物计算温度变化(摄氏度)。评价打喷嚏(麻醉前)、食欲不振、呼吸困难和活动水平等临床指征。也利用一个评分系统评估活动水平，并且基于对一组内每只动物的每日评分，计算相对不活动指数。直肠温度和活动评分用来评估流感感染的严重性和订合肽预防流感症状的能力。
测定病毒聚合酶复合物装配和活性的抑制
可以利用生物分子荧光互补技术(“BiFC”)分析本发明的化合物。在该技术中，荧光蛋白(例如GFP或其衍生物)的N-和C-末端片段与相互作用蛋白融合。荧光团的两个非功能性半部分在细胞中表达后由于特异性蛋白质相互作用而紧密靠近，这启动了片段折叠为活性蛋白质，并在蛋白质-蛋白质复合物的位点导致可检测的荧光信号。因此，通过BiFC，可以显示、量化PB1和PA亚基之间的特定相互作用并定位在活细胞内。通过用本发明的化合物破坏PB1-PA相互作用，BiFC信号将减少，表明存在潜在的针对PB1-PA复合物装配的抑制剂。参见Hemerka等人，J.Virol.2009，3944-3955。
药物组合物和给药途径
本发明的拟肽大环化合物也包括其药学上可接受的衍生物或前药。“药学上可接受的衍生物”指本发明的化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、前药或其他衍生物，其在向接受者施用后能够提供(直接或间接地)本发明的化合物。当向哺乳动物施用时，尤其有利的药学上可接受的衍生物可以提高本发明的化合物的生物利用度(例如，通过提高口服施用的化合物进入血液的吸收)，或相对于母体物质增加活性化合物向生物区室(例如，脑或淋巴系统)的递送。一些药学上可接受的衍生物包含提高水溶性或跨过胃肠粘膜的主动转运的化学基团。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物通过共价或非共价地连接的合适的官能团修饰，以提高选择性的生物学性质。这样的修饰包括那些提高进入特定生物区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物学渗透性、提高口服利用度、增加溶解性以允许注射施用、改变代谢以及改变排泄率的修饰。
本发明的化合物的药学上可接受的盐包括那些由药学上可接受的无机和有机的酸和碱衍生的盐。合适的酸式盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐(undecanoate)。由合适的碱衍生的盐包括碱金属盐(例如，钠盐)、碱土金属盐(例如，镁盐)、铵盐和N-(烷基)4 +盐。
为了由本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体包括固体或液体载体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，其也可以作为稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料发挥作用。在科学文献和专利文献中详细描述了配制和给药技术的细节，参见，例如，最新版本的Remington′s PharmaceuticalSciences，Maack Publishing Co，Easton PA。
在粉剂中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性成分混合。在片剂中，活性成分与具有必要粘合性质的载体按照适当的比例混合，并压制成需要的形状和大小。
合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶和黄蓍胶；以及蛋白质，如明胶和胶原蛋白。如果需要的话，加入崩解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。
液体形式的制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如，水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可以在水性聚乙二醇溶液中配制成溶液。
药物制剂优选为单位剂型。在这样的形式中，制剂细分为含有适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，该包装包含不连续量的制剂，如包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。另外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者可以是适当数目的包装形式的这些剂型中的任一种。
当本发明的组合物包含拟肽大环化合物和一种或多种另外的治疗剂或预防剂的组合时，该化合物和另外的药剂都应该以通常在单一治疗方案中施用的剂量的大约1-100％的剂量水平，更优选大约5-95％的剂量水平存在。在某些实施方式中，另外的药剂作为多剂量方案的一部分与本发明的化合物分开施用。或者，这些药剂是单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明的化合物混合在一起。
使用方法
一般地，本发明公开了可用于治疗病毒疾病的拟肽大环化合物。例如，来自于PB1螺旋序列的拟肽大环化合物或选择性结合PA蛋白的PB1肽结合位点的拟肽大环化合物可以选择性抑制流感RNA依赖性RNA聚合酶。来源于PB2螺旋序列的拟肽大环化合物或选择性结合PB1蛋白的PB2肽结合位点的拟肽大环化合物可以选择性抑制流感RNA依赖性RNA聚合酶。当在感染后的治疗窗口内给药时，这些拟肽大环化合物可以减轻流感感染的严重性或持续时间。当预防性给药时，这些拟肽大环化合物可以防止被流感病毒感染，由此降低流感的扩散和减少大规模流行。
一方面，本发明提供了新的拟肽大环化合物，其可在竞争性结合分析中用于鉴别结合拟肽大环化合物模拟的蛋白质或肽的天然配体的物质。例如，在PB1/PA系统中，基于PB1的标记的拟肽大环化合物与竞争结合PA的小分子一起用于PA结合分析中。竞争结合研究允许在体外快速评价并确定对于PB1/PA系统特异性的药物候选物。可以使用本文公开的任何拟肽大环化合物及其结合伴体进行这种结合研究。
在其他方面，本发明提供了治疗已感染流感病毒或处于流感病毒感染的危险中或易被流感病毒感染的受试者的预防方法和治疗方法。这些方法包括向包括人类的温血动物施用有效量的本发明的化合物。在某些实施方式中，本发明的化合物的施用阻止流感病毒的增殖或传播。
如本文所用，术语“治疗”定义为向患者应用或施用治疗剂，或者向从患者分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者患有疾病、疾病症状或具有患病倾向，目的是治愈、恢复、减轻、解除、改变、矫正、缓解、改善或影响疾病、疾病症状或患病倾向。
在某些实施方式中，本发明的拟肽大环化合物用来治疗由流感病毒引起的疾病。同其它病毒一样，流感病毒的复制包括6个阶段：传播、进入、复制、生物合成、装配和离开。进入通过胞吞作用发生，复制和vRNP装配在核中发生，并且病毒从质膜芽生。在感染的患者中，病毒针对呼吸道上皮细胞。
此处所述的方法也可用于开发和/或鉴定用于治疗由病毒引起的感染的药剂，所述病毒例如是：Abelson白血病病毒、Abelson鼠白血病病毒、Abelson病毒、急性喉气管支气管炎病毒、Adelaide River病毒、腺相关病毒群、腺病毒、非洲马病病毒、非洲猪瘟病毒、AIDS病毒、艾刘蒂貂病细小病毒、α逆转录病毒、甲病毒、ALV相关病毒、Amapari病毒、口蹄疫病毒、呼肠病毒、虫媒病毒、虫媒病毒C、虫媒病毒A组、虫媒病毒B组、沙粒病毒组、阿根廷出血热病毒、阿根廷出血热病毒、动脉病毒、星状病毒、Ateline疱疹病毒组、Aujezky病病毒、奥拉病毒、Ausduk病病毒、澳洲蝙蝠狂犬病病毒、禽腺病毒、禽幼红细胞增多症病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、禽造白细胞组织增生病毒、禽淋巴瘤病毒、禽成肌细胞病病毒、禽副黏液病毒、禽肺脑炎病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽肉瘤病毒、禽C型逆转录病毒组、禽嗜肝DNA病毒、禽痘病毒、B病毒、B19病毒、Babanki病毒、狒狒疱疹病毒、杆状病毒、Barmah森林病毒、贝巴鲁病毒、Berrimah病毒、β逆转录病毒、双rna病毒、Bittner病毒、BK病毒、黑港渠病毒、蓝舌病毒、玻利维亚出血热病毒、Boma病病毒、羊边境病病毒、博纳病病毒、牛α-庖疹病毒1、牛α-庖疹病毒2、牛冠状病毒、牛短暂热病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛造白细胞组织增生病毒、牛乳头炎病毒、牛乳头瘤病毒、牛脓疱口炎病毒、牛细小病毒、牛合胞体病毒、牛C型肿瘤病毒、牛病毒性腹泻病毒、Buggy Creek病毒、弹状病毒群、布尼亚维拉病毒超级组、布尼亚病毒、伯基特淋巴瘤病毒、布汪巴热、CA病毒、杯状病毒、加利福尼亚脑炎病毒、骆驼痘病毒、金丝雀痘病毒、犬科疱疹病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬疱疹病毒、犬微小病毒(canine minute virus)、犬细小病毒、Cano Delgadito病毒、山羊关节炎病毒、山羊脑炎病毒、山羊疱疹病毒、羊痘病毒、心病毒、豚鼠疱疹病毒1型、猕猴科疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒2型、水疱性口炎-印度病毒、环状病毒、水道猫鱼病毒、查里维勒河病毒、水痘病毒(chickenpox virus)、切昆贡亚病毒、黑猩猩疱疹病毒、白鲑里奥病毒、马苏鲑病毒、水泡性口炎病毒印第安纳2C株(Cocal virus)、银鲑里奥病毒、性交疹病毒、科罗拉多壁虱热病毒、科蜱病毒、哥伦比亚SK病毒、感冒病毒、羊传染性口疮病毒、绵羊接触性脓疱皮炎病毒、冠状病毒、科里帕塔病毒、伤风病毒、牛痘病毒、柯萨奇病毒、CPV(胞浆多角体病毒)、蟋蟀麻痹病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、2-格鲁布相关病毒、隐病毒、呼肠病毒、巨细胞病毒、巨细胞病毒组、胞浆多角体病毒、鹿乳头瘤病毒、δ逆转录病毒、登革热病毒、浓核病毒、依赖病毒、佐立病毒、diplorna病毒、果蝇C病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭肝炎病毒1、鸭肝炎病毒2、轮状病毒、杜温哈格病毒、羽翼畸形病毒DWV、东方马脑炎病毒、东方马脑脊髓炎病毒、EB病毒、埃博拉病毒、埃博拉样病毒、埃柯病毒(echo virus)、艾可病毒(echovirus)、艾可病毒10、艾可病毒28、艾可病毒9、鼠痘病毒、EEE病毒、EIA病毒、EIA病毒、脑炎病毒、脑心肌炎组病毒、脑心肌炎病毒、肠道病毒、酶升高病毒、酶升高病毒(LDH)、流行性出血热病毒、流行性出血病病毒、EB病毒、马α-庖疹病毒1、马α-庖疹病毒4、马疱疹病毒2、马流产病毒、马动脉炎病毒、马脑病病毒、马传染性贫血病毒、马麻疹病毒、马鼻肺炎病毒、马鼻病毒、Eubenangu病毒、欧洲驼鹿乳头瘤病毒、欧洲猪瘟热病毒、沼泽病毒、Eyach病毒、猫疱疹病毒1、猫嵌杯样病毒、猫纤维肉瘤病毒、猫疱疹病毒、猫免疫缺陷病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫白血病/肉瘤病毒、猫白血病病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、猫肉瘤病毒、猫合胞体病毒、纤丝病毒、弗兰德尔斯病毒、黄病毒、口蹄疫病毒、摩根堡病毒、四角汉坦病毒、鸟腺病毒1、鸡痘病毒、弗林德病毒、γ逆转录病毒、GB肝炎病毒、GB病毒、德国麻疹病毒、盖塔病毒、长臂猿白血病病毒、腺热病毒、山羊痘病毒、金体美蝙鱼病毒、枯叶蛾病毒、鹅细小病毒、颗粒体症病毒、格罗斯病毒、地松鼠乙型肝炎病毒、虫媒病毒A组、瓜纳瑞托病毒、豚鼠巨细胞病毒、豚鼠C型病毒、汉坦病毒(Hantaan virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、文蛤呼肠孤病毒、野兔纤维瘤病毒、HCMV(人巨细胞病毒)、血吸附病毒2型、日本血凝集病毒、出血热病毒、亨德拉病毒、亨尼波病毒、嗜肝DNA病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒组、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、δ肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、非甲非乙肝炎病毒、肝炎病毒、肝炎病毒(非人)、肝因性脑脊髓炎呼肠孤病毒3型、嗜肝病毒、灰仓鹭乙型肝炎病毒、疱疹B病毒、单纯疱疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、疱疹病毒、疱疹病毒7、蜘蛛猴疱疹病毒、人疱疹病毒、疱疹病毒感染、松鼠猴疱疹病毒、猪疱疹病毒、水痘疱疹病毒、高地J病毒、Hirame弹状病毒、猪霍乱病毒、人腺病毒2、人α-庖疹病毒1、人α-庖疹病毒2、人α-庖疹病毒3、人嗜B淋巴细胞病毒、人β庖疹病毒5、人冠状病毒、人巨细胞病毒组、人泡沫病毒、人γ疱疹病毒4、人γ疱疹病毒6、人甲型肝炎病毒、人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型、人疱疹病毒3型、人疱疹病毒4型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型、人免疫缺陷病毒2型、人乳头瘤病毒、人类T细胞白血病病毒、人类T细胞白血病病毒I型、人类T细胞白血病病毒II型、人类T细胞白血病病毒III型、人类T细胞淋巴瘤病毒I型、人类T细胞淋巴瘤病毒II型、人嗜T淋巴细胞病毒1型、人嗜T淋巴细胞病毒2型、人类嗜T淋巴细胞病毒I型、人类嗜T淋巴细胞病毒II型、人类嗜T淋巴细胞病毒III型、姬蜂病毒、婴儿胃肠炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、传染性造血组织坏死病毒、传染性胰腺坏死病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、流感病毒pr8、昆虫虹彩病毒、昆虫病毒、虹彩病毒、日本乙型脑炎病毒、日本脑炎病毒、JC病毒、胡宁病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、克麦罗沃病毒、基尔汉大鼠病毒、克拉马斯病毒、科隆各病毒、朝鲜出血热病毒、孔巴病毒、Kysanur森林病病毒、Kyzylagach病毒、La Crosse病毒、乳酸脱氢酶升高病毒、乳酸脱氢酶病毒、拉戈斯蝙蝠病毒、长尾猴病毒、兔细小病毒、拉沙热病毒、拉沙病毒、潜伏大鼠病毒、LCM病毒、Leaky病毒、慢病毒、兔病毒、白血病病毒、白血病病毒(leukovirus)、粗糙皮肤病病毒、淋巴结病相关病毒、淋巴细胞隐病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、淋巴增生病毒组、马丘波病毒、假狂犬病病毒、哺乳动物B型肿瘤病毒组、哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒组、哺乳动物D型逆转录病毒、乳腺瘤病毒、Mapuera病毒、马尔堡病毒、马尔堡样病毒、Mason Pfizer猴病毒、哺乳动物腺病毒、马亚罗病毒、ME病毒、麻疹病毒、曼那角病毒、门哥病毒(Mengo virus)、门哥病毒(Mengovirus)、米德尔堡病毒、挤奶工结节病毒、水貂肠炎病毒、小鼠细小病毒、MLV相关病毒、MM病毒、莫科拉病毒、软疣痘病毒、传染性软疣病毒、猴B病毒、猴痘病毒、单负病毒目(Mononegavirales)、麻疹病毒(Morbillivirus)、茫特埃尔贡蝙蝠病毒、小鼠巨细胞病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠K病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、小鼠细小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠脑脊髓灰质炎病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠肉瘤病毒、小鼠痘病毒、莫桑比克病毒、穆坎布病毒、粘膜病病毒、腮腺炎病毒、鼠β疱疹病毒1、鼠巨细胞病毒2、鼠巨细胞病毒组、鼠脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒、鼠白血病病毒、鼠诱发结节病毒、鼠多瘤病毒、鼠肉瘤病毒、鼠巨细胞病毒、墨累河谷脑炎病毒、黏液瘤病毒、正黏病毒、新城疫病毒(Myxovirus multiforme)、腮腺炎粘液病毒、内罗毕绵羊病病毒、内罗毕病毒、Nanirna病毒、那立发病毒、Ndumo病毒、Neethling病毒、纳尔逊湾病毒、嗜神经病毒、新世界沙粒病毒(New World Arenavirus)、新生儿肺炎病毒、新城疫病毒、尼帕病毒、非致细胞病病毒、诺沃克病毒、核多角体病毒(NPV)、乳头颈病毒(nipple neck virus)、奥尼翁尼翁病病毒(O′nyong′nyong virus)、Ockelbo病毒、致癌病毒、致癌病毒样颗粒、致癌RNA病毒、环状病毒(Orbivirus)、羊传染性口疮病毒(Orf virus)、奥罗波克病毒、正嗜肝DNA病毒、正黏病毒科、正痘病毒、正呼肠病毒、Orungo、绵羊乳头瘤病毒、羊卡他性热病毒、猫头鹰猴疱疹病毒、巴尼亚姆病毒、乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒、乳多空病毒、副流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、副粘病毒、副痘病毒、副痘苗病毒、细小病毒、细小病毒B19、细小病毒组、瘟病毒、白蛉病毒、海豹瘟热病毒、细小脱氧核糖核酸病毒、细小核糖核酸病毒、猪巨细胞病毒-鸽痘病毒、皮里病毒、皮春纳病毒、小鼠肺炎病毒、肺炎病毒、脊髓灰质炎病毒(poliomyelitis virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、多DNA病毒、多面形病毒、多瘤病毒、多瘤病毒(polyoma virus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、牛多瘤病毒、长尾猴多瘤病毒、Polyomavirus hominis 2、Polyomavirus maccacae 1、Polyomavirusmuris 1、Polyomavirus muris 2、Polyomavirus papionis 1、Polyomaviruspapionis 2、Polyomavirus sylvilagi、Pongine herpesvirus疱疹病毒1、猪流行性腹泻病毒、猪血凝脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪C型病毒、痘病毒(pox virus)、痘病毒(poxvirus)、天花病毒(poxvirus variolae)、希望山病毒、原病毒、假牛痘病毒、假性狂犬病病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔肾空泡病毒(rabbit kidneyvaculolating virus)、兔乳头状瘤病毒、狂犬病病毒、浣熊细小病毒、浣熊痘病毒、Ranikhet病毒、大鼠巨细胞病毒、大鼠细小病毒、大鼠病毒、Rauscher病毒、重组痘苗病毒、重组病毒、里奥病毒、呼肠孤病毒1型、呼肠孤病毒2型、呼肠孤病毒3型、爬虫C型病毒、呼吸道感染病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道病毒、网状内皮组织增殖病病毒、弹状病毒、鲤鱼弹状病毒(Rhabdovirus carpia)、弹状病毒(Rhadinovirus)、鼻病毒、壶菌病毒(Rhizidiovirus)、立夫特山谷热病毒、Riley病毒、牛瘟病毒、RNA肿瘤病毒、罗斯河病毒、轮状病毒、麻疹病毒、劳斯肉瘤病毒、风疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒、俄罗斯秋季脑炎病毒、SA 11猿猴病毒、SA2病毒、Sabia病毒、鹭山病毒、猴疱疹病毒1型、唾液腺病毒、白蛉热病毒组、圣德吉姆巴病毒、SARS病毒、SDAV(唾泪腺炎病毒)、海豹痘病毒、西门利克森林病毒、汉城病毒、绵羊痘病毒、肖普纤维瘤病毒、肖普乳头状瘤病毒、猴泡沫病毒、猿猴甲型肝炎病毒、猿猴人免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、猿猴副流感病毒、猿猴T细胞嗜淋巴细胞病毒、猿猴病毒、猿猴病毒40、单纯疱疹病毒、辛诺瓦病毒、辛德毕斯病毒、天花病毒、南美出血热病毒、麻雀痘病毒、泡沫病毒、松鼠纤维瘤兔痘病毒、松鼠猴逆转录病毒、SSV 1病毒组、I型STLV(猴T-亲淋巴细胞病毒)、STLV(猴T-亲淋巴细胞病毒)II型、STLV(猿猴T亲淋巴细胞病毒)III型、牛丘疹口炎病毒、豚鼠唾腺巨细胞病毒、猪suidalpha疱疹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对于一些病毒，已经在阐述宿主细胞感染过程涉及的步骤中取得了大量进展，并可以使用本发明的拟肽大环化合物针对这些步骤中的任一个。例如，在二十世纪八十年代初期开始的实验证明，流感病毒遵从逐步的、胞吞进入程序，与其它病毒如甲病毒和弹状病毒具有共同的元素(Marsh和Helenius 1989；Whittaker 2006)。这些步骤包括：1)开始附着到细胞表面上的含唾液酸糖缀合物受体上；2)病毒颗粒诱导信号发生；3)通过依赖网格蛋白和不依赖网格蛋白的细胞机制的胞吞作用；4)酸诱导的、血凝素(HA)-介导的从晚期内体的穿透；5)酸激活的M2和基质蛋白(M1)依赖的衣壳脱壳；和6)vRNP的胞质内转运和核输入。这些步骤在分选受体形成、囊泡形成机制、激酶介导的调节、细胞器酸化及最有可能在细胞骨架活性方面依赖于宿主细胞的帮助。
流感病毒向细胞表面的附着通过HA1亚基与细胞表面糖蛋白和携带寡糖部分和末端唾液酸残基的糖脂的结合发生(Skehel和Wiley2000)。唾液酸与下一个糖连接的键对种特异性有贡献。禽毒株(包括H5N 1)偏好a-(2，3)-连接而人毒株偏好a-(2，6)-连接(Matrosovich 2006)。在上皮细胞中，优先发生与顶表面上微绒毛的结合，并且在这些延伸的基部发生胞吞作用(Matlin 1982)。受体结合是否诱导使细胞准备被侵入的信号尚不清楚，但是可能是因为有效进入需要蛋白激酶C的激活和磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)的合成(Sieczkarski等人.2003；Whittaker 2006)。
胞吞内化在结合后的数分钟内发生(Matlin 1982；Yoshimura和Ohnishi 1984)。在组织培养细胞中，流感病毒利用三种不同类型的细胞过程：1)预先存在的网格蛋白包被的凹窝，2)病毒诱导的网格蛋白包被的凹窝，和3)没有可见的包被的囊泡中的胞吞作用(Matlin 1982；Sieczkarski and Whittaker 2002；Rust等人.2004)。使用荧光病毒的视频显微镜检查显示了病毒颗粒，这些病毒颗粒在细胞周围经历肌动蛋白介导的快速运动，随后负端指导地、微管介导地转运至细胞的核周区。活细胞成像表明病毒颗粒首先进入可移动的外周早期内体亚群，在发生穿透之前这些内体携带病毒颗粒较深地进入细胞质(Lakadamyali等人.2003；Rust等人.2004)。胞吞过程通过蛋白质和脂质激酶、蛋白酶体以及Rabs和遍在蛋白依赖的分选因子调节(Khor等人.2003；Whittaker 2006)。
膜穿透步骤通过低pH介导的三聚亚稳定HA的活化以及这种1型病毒融合蛋白向可膜融合构象的转化介导(Maeda等人.1981；White等人.1982)。这在内化后大约16分钟发生，pH阈值在不同株之间在5.0-5.6的范围内变化。靶膜是中间或晚期内体的限制膜。融合机制已经广泛研究(Kielian和Rey 2006)。此外观察到除了脂双层膜和功能性酸化系统以外，融合本身似乎不需要任何宿主细胞成分(Maeda等人.1981；White等人.1982)。诸如抗溶酶体弱碱、羧酸离子载体和质子泵抑制剂等试剂抑制穿透步骤(Matlin 1982；Whittaker 2006)。
为了使引入的vRNP能够进入核，衣壳必须解装配。这一步骤涉及病毒内部的酸化，它是通过金刚胺敏感的M2-通道，引起M1从vRNP上的解离(Bukrinskaya等人.1982；Martin和Helenius 1991；Pinto等人.1992)。vRNP个体向核孔复合物的转运以及向核内的转移依赖于细胞核转运受体(O′Neill等人.1995；Cros等人.2005)。病毒RNA的复制(正链和负链的合成)以及转录在与核中染色质紧密缔合的复合体中发生。显然尽管许多步骤由病毒聚合酶催化，但是也涉及细胞因子，包括RNA聚合酶激活因子、陪伴分子HSP90、hCLE和人剪接因子UAP56。病毒基因表达在转录水平上受到复杂的细胞控制，这是依赖于细胞激酶的控制系统(Whittaker 2006)。
流感病毒颗粒的最终装配在质膜的芽生过程中发生。在上皮细胞中，芽生只在顶部膜区域发生(Rodriguez-Boulan 1983)。首先，后代vRNP在核质内被转运到核包膜，然后从核转运到细胞质，最后它们在细胞外周积累。从核离开基于病毒蛋白NEP和M1，及多种细胞蛋白质，包括CRM1(一种核输出受体)、胱天蛋白酶和可能的某些核蛋白陪伴分子。磷酸化通过调节M1和NEP合成，也通过MAPK/ERK系统，在核输出中起作用(Bui等人.1996；Ludwig 2006)。G蛋白和蛋白激酶信号传导与流感病毒从感染的宿主细胞芽生有关(Hui E.和Nayak D，2002)。
合成了病毒的三种膜蛋白，并使其折叠，在ER内装配为寡聚体(Doms等人.1993)。它们通过高尔基复合体，通过其碳水化合物部分的修饰和蛋白质水解切割经历成熟。到达质膜后，它们在芽生过程中与M1和vRNP缔合，导致包含全部8种vRNP并且除脂质外不包含大多数宿主细胞成分。
流感传染与几种信号级联的激活有关，包括MAPK途径(ERK、JNK、p38和BMK-1/ERK5)、IkB/NF-kB信号模块、Raf/MEK/ERK级联和程序性细胞死亡(Ludwig 2006)。这些导致多种限制感染进展的效应，如IFNb的转录激活、凋亡性细胞死亡，以及阻断病毒从晚期内体逃离(Ludwig 2006)。
实施例1.
图1和图2显示PB1螺旋衍生的序列MDVNPTLLFLKVPAQ的可能的结合模式。本发明的拟肽大环化合物从相应的未交联的多肽序列MDVNPTLLFLKVPAQ开始制备，并将第7和第10个氨基酸替换为α，α-二取代的氨基酸(例如S5烯烃氨基酸)。进行烯烃复分解反应，产生如图2b所示的包含i至i+3交联的拟肽大环化合物。
实施例2.
拟肽大环化合物如前所述(Schafmeister等人.(2000)，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892；Walensky等人(2004)Science 305：1466-70；Walensky等人(2006)Mol Cell 24：199-210；Bernal等人(2007)J.AmChem Soc.9129，2456-2457)并且如下所述合成、纯化和分析。用于本研究中的大环化合物如表5所示。相应的未交联的多肽表示本发明的拟肽大环化合物的天然对应物。
根据Williams等人(1991)J.Am.Chem.Soc.113：9276；Schafmeister等人(2000)J.Am.Chem Soc.122：5891和Verdine等人PCT WO2008/121767的方法合成含有烯烃侧链的α，α-二取代的非天然氨基酸。通过用相应的合成氨基酸替代2个或更多天然氨基酸来设计拟肽大环化合物。在i和i+3、i和i+4、i和i+6和i和i+7位进行置换。大环化合物通常通过固相肽合成，然后合成的氨基酸经由它们的含烯烃侧链通过基于烯烃复分解的交联而生成。
在所示序列中，使用以下缩写：“Nle”代表正亮氨酸，“Aib”代表2-氨基异丁酸，“Ac”代表乙酰基，“Pr”代表丙酰基。表示为“$”的氨基酸是通过包含一个双键的全碳i至i+4交联连接体连接的α-Me S5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。表示为“$r5”的氨基酸是通过包含一个双键的全碳i至i+4交联连接体连接的α-Me R5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。表示为“$s8”的氨基酸是通过包含一个双键的全碳i至i+7交联连接体连接的α-MeS8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。表示为“$r8”的氨基酸是通过包含一个双键的全碳i至i+7交联连接体连接的α-Me R8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。“Ahx”表示氨基环己基连接体。交联连接体是在每个氨基酸的α碳之间包含8或11个硕原子的直链全碳交联连接体。表示为“$/”的氨基酸是不通过任何交联连接体连接的α-Me S5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。表示为“$/r5”的氨基酸是不通过任何交联连接体连接的α-Me R5-戊烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。表示为“$/s8”的氨基酸是不通过任何交联连接体连接的α-Me S8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。表示为“$/r8”的氨基酸是不通过任何交联连接体连接的α-Me R8-辛烯基-丙氨酸烯烃氨基酸。
非天然氨基酸(5-碳烯属氨基酸的R和S对映异构体和8-碳烯属氨基酸的S对映异构体)由核磁共振(NMR)光谱(Varian Mercury 400)和质谱(Micromass LCT)进行鉴定。肽的合成使用固相条件、rink amideAM树脂(Novabiochem)和Fmoc主链保护基化学作用手动地或在自动肽合成仪(Applied Biosystems，model 433A)上进行。对于天然的Fmoc保护的氨基酸(Novabiochem)的偶联，使用10当量的氨基酸和1∶1∶2摩尔比的偶联试剂HBTU/HOBt(Novabiochem)/DIEA。非天然的氨基酸(4当量)利用1∶1∶2摩尔比的HATU(Applied Biosystems)/HOBt/DIEA进行偶联。在固相中，使用溶于脱气二氯甲烷中的10mM的Grubbs催化剂(Blackewell等人1994，同上)(Strem Chemicals)进行烯烃复分解反应，并在室温下反应2小时。通过三氟乙酸介导的去保护和切割实现复分解的化合物的分离，通过醚沉淀产生粗产物，和在反相C18柱(Varian)上进行高效液相(HPLC)(Varian ProStar)以产生纯化合物。通过LC/MS质谱(Micromass LCT，与Agilent 1100HPLC系统连接)和氨基酸分析(Applied Biosystems，420A型)确认纯产物的化学组成。
合成的肽包括正亮氨酸替代甲硫氨酸以避免具有不希望的硫醚氧化的问题。在几种肽中，脯氨酸残基被2-氨基异丁酸残基(Aib)代替，以提高螺旋度，也研究了Glu至Arg置换对细胞穿透性的影响。合成肽的N末端被乙酰化，而C末端被酰胺化。表5显示制备的本发明拟肽大环化合物的列表。
表5.本发明的PB1拟肽大环化合物
Figure BPA00001389894800801
Figure BPA00001389894800811
实施例3.
几种PB1拟肽大环化合物的体外血清稳定性如下检测：将其以5000ng/mL(2μM，MW＝2500)与新鲜人血清在37℃孵育，在0、0.5、1、2、4、6和24小时采样。在每个时间点一式两份急冻样品，直到分析，然后通过将100μl血清转移到2ml离心管中，然后添加10μL 50％甲酸和500μL乙腈，并于4±2℃以14,000RPM离心10分钟进行提取。蛋白质沉淀后，将上清液转移到新的2ml试管，并在Turbovap上在N2和＜10psi，37℃下蒸发。样品在100μL 50∶50乙腈/水中重建，通过LC-MS/MS分析定量。每种化合物的反应进行标准化，以估计浓度随时间降低的百分比；结果显示在图3中。
实施例4.
在大鼠中通过单次静脉内给药测试几种PB1拟肽大环化合物的PK性质。研究的存活期部分在ViviSource Laboratories(Waltham，MA)进行。向一对颈静脉插管的雄性Sprague-Dawley大鼠施用在含有5％PEG-400和2％右旋糖的水中配制的3mg/kg订合肽的单个静脉内剂量。静脉内剂量通常良好耐受，并且动物在研究期内显示健康。在直到24小时的13个采样时间采集血样，然后将血浆样品在干冰上运至TandemBioanalytical Facilities，Inc.(Woburn，MA)进行该研究的分析阶段。
在血浆样品定量前，通过将50μl氢氧化铵(14.5M铵)、1mL 1∶1乙腈/甲醇溶液和50μl内标与各50μl血浆样品混合制备样品提取物。将混合物离心以从固体沉淀物分离上清液，上清液在40℃在流动氮气下干燥。干燥的样品提取物在50μl含有0.1％(v/v)三氟乙酸的1∶1水/甲醇溶液中重建。血浆样品提取物通过液相色谱-质谱法分析，其中使用API 5000(Applied Biosystems)仪器，在500℃温度下以正离子化模式采用多反应监测检测模式(MRM)工作。用于液相色谱的分析柱为Varian Metasil C18，50mmx2mm，移动相A(0.1％甲酸水溶液)和B(0.1％甲酸的乙腈溶液)以0.5ml/min的流速泵送。血浆提取物的定量通过线性回归分析进行，该分析使用在正常大鼠血浆中稀释的纯参考标准订合肽准备8条在20-10,000ng/ml工作浓度上的校准曲线。校准标准以与样品提取物相同的方式提取，并在样品提取物之前和之后分析。
药代动力学参数采用非房室模型计算，其中使用Microsoft Excel的PK函数插件。终末消除半衰期计算为ln(2)/(λz)，其中速率常数(λz)计算为在2-12hr内log-浓度相对于时间数据的估计斜率乘以-1。在0-24小时时间点的AUC值(hr*ng/ml)通过统计矩和线性梯形近似法计算，24小时浓度值除以(λz)，相加，以将AUMC和AUC值外推至无限长的时间。总体清除率(每kg体重)以剂量除以AUC计算。稳态分布体积(Vss)以清除率和平均停留时间的积计算(MRT＝AUC/AUMC)。PK结果在图4、5a-5f中作为图形显示，确定的PK参数的表如图6所示。
也进行实验以比较不同给药方式。皮下注射拟肽大环化合物并与静脉内给药进行比较。两组各两只动物皮下注射3mg/kg剂量。在规律的时间点(例如5、20分钟、1、2、4、8、12和48小时)采集血浆，如上所述分析样品。结果在图7中作图。
虽然本文已显示和描述了本发明的优选实施方式，对于本领域的技术人员显而易见的是，这些实施方式只是以举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域的技术人员可以想到许多变型、改变和替换。应该理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明的实施方式的各种替代方式。意图的是下列权利要求限定本发明的范围，且这些权利要求范围内的方法和结构及其等效形式也包括在本发明内。

Claims (23)

1.一种能够结合病毒聚合酶的拟肽大环化合物。
2.权利要求1的拟肽大环化合物，其中，所述聚合酶是RNA依赖性RNA聚合酶。
3.权利要求2的拟肽大环化合物，其中，所述大环化合物能够破坏病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合物的亚基的装配。
4.权利要求1的拟肽大环化合物，其中，所述病毒是流感病毒。
5.权利要求2的拟肽大环化合物，其中，所述大环化合物能够与序列MDVNPTLLFLKVPAQ或MERIKELRNLM的肽竞争结合所述病毒RNA依赖性RNA聚合酶。
6.权利要求2的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与氨基酸序列MDVNPTLLFLKVPAQ或MERIKELRNLM至少大约60％相同。
7.根据权利要求2所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与氨基酸序列MDVNPTLLFLKVPAQ或MERIKELRNLM至少大约80％相同。
8.根据权利要求2所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物的氨基酸序列与氨基酸序列MDVNPTLLFLKVPAQ或MERIKELRNLM至少大约90％相同。
9.根据权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物包含螺旋。
10.根据权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物包含310螺旋。
11.根据权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物包含α，α-二取代的氨基酸。
12.根据权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物包含连接至少两个氨基酸的α-位的交联连接体。
13.根据权利要求12所述的拟肽大环化合物，其中，所述两个氨基酸中的至少一个是α，α-二取代的氨基酸。
14.根据权利要求12所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物具有下式：
Figure FPA00001389894700021
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure FPA00001389894700022
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
L是式-L1-L2-的形成大环的连接体；
L1和L2独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与D残基构成的环状结构的一部分；
R8是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
15.根据权利要求1所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物包含连接第一氨基酸的骨架氨基与拟肽大环化合物中的第二氨基酸的交联连接体。
16.根据权利要求15所述的拟肽大环化合物，其中，所述拟肽大环化合物具有式(IV)或(IVa)：
Figure FPA00001389894700031
其中：
A、C、D和E各自独立地是天然或非天然的氨基酸；
B是天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物、
Figure FPA00001389894700032
[-NH-L3-CO-]、[-NH-L3-SO2-]或[-NH-L3-]；
R1和R2独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、杂烷基或杂环烷基，它们是未取代的或被卤素-取代的，或者是与E残基构成的环状结构的一部分；
R3是氢、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
L1和L2独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚环芳基、亚杂环芳基或[-R4-K-R4-]n，各自任选地被R5取代；
各个R4是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基；
各个K是O、S、SO、SO2、CO、CO2或CONR3；
各个R5独立地是卤素、烷基、-OR6、-N(R6)2、-SR6、-SOR6、-SO2R6、-CO2R6、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
各个R6独立地是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、荧光部分、放射性同位素或治疗剂；
R7是-H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、杂烷基、环烷基烷基、杂环烷基、环芳基或杂环芳基，它们任选被R5取代；
v和w独立地是1-1000的整数；
u、x、y和z独立地是0-10的整数；且
n是1-5的整数。
17.治疗受试者的流感感染的方法，包括向受试者施用权利要求2所述的拟肽大环化合物。
18.预防受试者的流感感染的方法，包括向受试者施用权利要求2所述的拟肽大环化合物。
19.抑制受试者中的流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶活性的方法，包括向受试者施用权利要求1所述的拟肽大环化合物。
20.权利要求14的拟肽大环化合物，其中x+y+z＝2。
21.权利要求14的拟肽大环化合物，其中x+y+z＝3。
22.权利要求14的拟肽大环化合物，其中x+y+z＝5。
23.权利要求14的拟肽大环化合物，其中x+y+z＝6。
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