CN103889437A

CN103889437A - 硫醚、醚和烷基胺连接的氢键替代物肽模拟物

Info

Publication number: CN103889437A
Application number: CN201280051966.7A
Authority: CN
Inventors: P·阿罗拉; A·马洪
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-06-25
Also published as: WO2013033645A1; US20130123196A1; EP3041491A1; AU2012301605A1; IN2014CN02398A

Abstract

本发明中提供了具有稳定的内部受约束的蛋白质二级结构并且所述蛋白质二级结构含有硫醚、醚或烷基胺连接的氢键替代物的肽模拟物及其盐；含有这些肽模拟物的至少一种的组合物，以及这些肽模拟物的制造和使用方法。

Description

硫醚、醚和烷基胺连接的氢键替代物肽模拟物

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年8月31日提交的美国临时申请第61/529,414号的优先权，所述临时申请是以全文引用的方式并入本文中。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在政府支持下根据国家卫生研究院授予的授权号R01GM073943而进行。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本文中的发明实施方案总体上是针对但不限于硫醚、醚以及烷基胺连接的氢键替代物肽模拟物及其盐的设计和/或蛋白靶向特性、这些肽模拟物及其盐、含有这些肽模拟物中的至少一种的组合物、这些肽模拟物的制造方法以及这些肽模拟物的使用方法。

技术背景

蛋白质二级结构包括β片/β发夹、π螺旋、3₁₀螺旋以及α螺旋。

α螺旋是蛋白质二级结构的最常见元件，且广泛参与基本生物过程，包括高特异性蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。能可预见地且特异性地破坏这些相互作用的分子将是无价的分子生物学工具且可能作为药物研发先导物(Kelso等，J. Am.Chem.Soc.126：4828-4842(2004)；Schafmeister等，J. Am.Chem.Soc.，122：5891-5892(2000)；Austin等，J. Am.Chem.Soc.119：6461-6472(1997)；Phelan等，J. Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)；Osapay等，J.Am.Chem.Soc.114：6966-6973(1992)；Kemp等，J. Org.Chem.56：6672-6682(1991)；Jackson等，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)；Ghadiri等，J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；Felix等，Int.J.Pept.ProteinRes.32：441-454(1988))。蛋白质表面上的暴露了的α螺旋还经常参与其他生物分子的识别。由少于十五个残基构成的对应于这些α螺旋区域的肽在从蛋白质环境中切除后典型地不再呈螺旋状。希望可以采取α螺旋结构的短肽(<15个残基)为可用模型，举例来说，用于生物活性分子的设计和用于研究蛋白质折叠的方面。

已经报告了用于制备稳定过的α螺旋的若干种策略(Andrews等，“Forming Stable Helical Peptides Using Natural and Artificial AminoAcids，”Tetrahedron55：11711-11743(1999))。这些方法包括并入非天然氨基酸(Lyu等，“Alpha-helix Stabilization by Natural and UnnaturalAmino Acids with Alkyl Side Chains，”Proc.Nat′lAcad.Sci.88：5317-5320(1991)；Kaul等，“Stereochemical Control of PeptideFolding，”Bioorg.Med. Chem.7：105-117(1999))、加帽基元(Austin等，“Templatefor Stabilization of a Peptide Alpha-helix：Synthesis andEvaluation of Conformational Effects by Circular Dichroism and NMR，”J.Am.Chem.Soc.119：6461-6472(1997)；Lyu等，“Capping Interactionsin Isolated Alpha Helices：Position-dependent Substitution Effects andStructure of a Serine-capped Peptide Helix，”Biochemistry32：421-425(1993)；Chakrabartty等，“Helix Capping Propensities in PeptidesParallel Those in Proteins，”Proc.Nat′lAcad.Sci.U.S.A.90：11332-11336(1993)；Kemp等，“Studies ofN-Terminal TemplatesforAlpha-helix Formation-Synthesis and Conformational-analysis of(2s，5s，8s，11s)-1-acetyl-1，4-diaza-3-keto-5-carboxy-10-thiatricyclo[2.8.1.0(4，8)]tridecane(Ac-Hell-Oh)，”J. Org.Chem.56：6683-6697(1991))、盐桥(Bierzynski等，“A Salt Bridge Stabilizes the Helix Formed by IsolatedC-Peptide of RNase A，”Proc.Nat′lAcad.Sci.U.S.A.79：2470-2474(1982))、金属离子螯合(Kelso等，J.Am.Chem.Soc.，126：4828-4842(2004)；Kelso等，“A Cyclic Metallopeptide Induces Alpha Helicity inShort Peptide Fragments of Thermolysin，”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.42：421-424(2003)；Ruan等，“Metal-ion Enhanced Helicity in SyntheticPeptides Containing Unnatural，Metal-ligating Residues,”J.Am.Chem.Soc.112：9403-9404(1990)；Ghadiri，J.Am.Chem.Soc.，112：1630-1632(1990))以及如二硫化物(Jackson等，“A General Approach to theSynthesis of Short Alpha-helical Peptides，”J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991))、内酰胺(Phelan等，“A General MethodforConstraining Short Peptides to an Alpha-helical Conformation,”J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)；Bracken等，J.Am.Chem.Soc.116：6431-6432(1994)；Osapay等，J.Am.Chem.Soc.，114：6966-6973(1992)；Felix等，Iht.J.Pept.ProteinRes.32：441-454(1988))及烃桥(Schafmeister等，“An All-hydrocarbon Cross-linking SystemforEnhancing the Helicity and Metabolic Stability of Peptides，”J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Blackwell等，“Highly EfficientSynthesis of Covalently Cross-linked Peptide Helices by Ring-closingMetathesis，”Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.37：3281-3284(1998))等共价侧链连接子。用这些策略稳定α螺旋结构典型地视环境而定(Geistlinger等，“An Inhibitor of the Interaction of Thyroid HormoneReceptor Beta and Glucocorticoid Interacting Protein，”J.Am.Chem.Soc.123：1525-1526(2001)；McNamara等，“Peptides Constrained by anAliphatic Linkage between Two C(alpha)Sites：Design，Synthesis，andUnexpected Conformational Properties of an i，(i+4)-Linked Peptide，”Org.Chem.66：4585-4594(2001))。然而，更重要的是，这些策略典型地阻挡标靶α螺旋的溶剂暴露表面，或者限制或替代假定α螺旋的重要侧链官能性。

因而，仍需要识别用于合成如短α螺旋肽等严格保存螺旋表面的高度稳定的内部受约束的肽结构的一般方法。稳定过的α螺旋和螺旋模拟物已经作为模型蛋白质-蛋白质相互作用的强力拮抗剂出现(Edwards和Wilson，Amino Acids1-12(2011)；Patgiri等，Nature Chem.Biol.7：585-87(2011)；Henchey等，J. Am.Chem.Soc.132：941-43(2010)；Moellering等，Nature462：182-88(2009)；Walensky等，Science305：1466-70(2004)；Harrison等，Proc.Nat′lAcad. Sci.USA107：11686-91(2010)；Home等，Proc.Nat′lAcad. Sci.USA106：14751-56(2009)；Home和Gellman，Acc.Chem.Res.41：1399-408(2008)；Seebach和Gardiner,Acc.Chem.Res.41：1366-75(2008)；Cummings和Hamilton，Curr.Opin.Chem.Biol.14：341-46(2010))。先前开发了再现短肽序列中的蛋白质α螺旋的构形的氢键替代物(HBS)方法(Patgiri等，Acc.Chem.Res.41：1289-300(2008))。HBSα螺旋替代形成所附肽链中的所希望螺旋构形的核心的N末端i→i+4氢键起烃键合作用(Chapman等，Biochemistry47：4189-95(2008)；Wang等，Org.Biomolec.Chem.4：4074-81(2006))。HBS方法的关键优点之一为所有氨基酸侧链仍可用于分子识别。已显示HBS螺旋在无细胞测定和基于细胞的测定中结合所选蛋白质标靶(Patgiri等，Nature Chem.Biol.7：585-87(2011)；Henchey等，J. Am.Chem.Soc.132：941-43(2010)；Henchey等，ChemBiochem11：2104-07(2010)；Wang等，Angew.Chem.Int′lEd.47：1879-82(2008))。

使用正式占据螺旋上的第i个位置的N末端4-戊烯酸残基与i+4N-烯丙基之间的闭环烯烃复分解反应来设立HBS肽模拟物的烃键合(Patgiri等，Org.Biomol.Chem.8：1773-76(2010)；Chapman和Arora，Org.Lett.8：5825-28(2006)；Dimartino等，Org.Lett.7：2389-92(2005))。最佳化复分解条件需要高反应温度和催化剂负载，由此可能产生难以纯化的产物混合物。纯化困难已经限制了HBS螺旋的使用。

发明概述

本文中的发明实施方案是针对克服这些和其他缺点。本发明概述中所提供的发明实施方案仅打算为说明性的并且提供本文中所公开的所选发明实施方案的概述。具有说明性和选择性的发明概述不限制任何权利要求的范围，不提供本文中所公开或预期的发明实施方案的整个范围，并且不应被视为限制或约束本公开内容或任何所要求发明实施方案的范围。

本文中提供了具有稳定的内部受约束的蛋白质二级结构并且所述蛋白质二级结构含有硫醚、醚或烷基胺连接的氢键替代物的肽模拟物、其盐(以及含有这些肽模拟物中的至少一种的组合物)。

除非另外指出，否则本文中提供了式I化合物或其盐(以及含有这些化合物中的至少一种的组合物)：

其中：

B为O、S或NR¹；

各R¹独立地为氢、氨基酸侧链、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳基烷基；

R²为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；-(CH₂)_0-1N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或具有下式的部分：

其中：

R²′为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或-(CH₂)_0-1N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；且

m′为零或任何数字；举例来说，m′可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；举例来说，m′可以在例如0到40、0到30、0到20、0至10、0至5、5至40、10至40、20至40、30至40、5至35、10到30或15到25范围内；

R³为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；-N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或具有下式的部分：

其中：

R³′为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或-N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；且

m″为零或任何数字；举例来说，m″可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；举例来说，m′可以在例如0到40、0到30、0到20、0至10、0至5、5至40、10至40、20至40、30至40、5至35、10到30或15到25范围内；

各R⁴独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳基烷基；且

m、n′以及n″各自独立地为零、一、二、三或四，其中m、n′与n″的总和为二到六，例如为2、3、4、5或6，或3到6，或4到6，或5到6，或2到5，或2到4，或2到3。

除非另外指出，否则本文中提供了式IIA化合物或式IIB化合物或其盐(以及含有这些化合物中的至少一种的组合物)：

其中：

各B独立地为O、S或NR¹；

各R²为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；-(CH₂)_0-1N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或具有下式的部分：

其中：

其中：

R³′为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或-N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；且，

m″为零或任何数字；举例来说，m″可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；举例来说，m″可以在例如0到40、0到30、0到20、0至10、0至5、5至40、10至40、20至40、30至40、5至35、10到30或15到25范围内；

各m独立地为零、一、二、三或四。

除非另外指出，否则本文中提供了一种制备式IA化合物或其盐的方法：

其中：

B为O、S或NR¹；

R³′为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或-N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；

各R⁴独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基或芳基烷基；

且

除非另外指出，否则本文中提供了一种制备以下化合物的方法：IB化合物或其盐：

其中：

B为O、S或NR¹；

R²′为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或-(CH₂)_0-1N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；

m′和m″各自独立地为零或任何数字；举例来说，m′和m″可以各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；举例来说，m′和m″可以各自独立地在例如0到40、0到30、0到20、0到10、0到5、5至40、10至40、20至40、30至40、5至435、10至30或15至25范围内；

且

m、n′以及n″各自独立地为零、一、二、三或四，其中m、n′与n″的总和为二到六，例如为2、3、4、5或6，或3到6，或4到6，或5到6，或2到5，或2到4，或2到3；

或式IC化合物或其盐：

其中：

B为O、S或NR¹；

且

除非另外指出，否则本文中提供了一种用于促进细胞死亡的方法。这种方法包括例如使细胞与完全或部分抑制p53/hDM2相互作用的一种或多种式I化合物或其盐在所述一种或多种化合物或其盐可有效促进细胞死亡的条件下接触。本文中，所述方法可以是例如体外或体内方法。

除非另外指出，否则本文中提供了一种简易且有效的硫醚、醚以及烷基胺连接的氢键替代物肽二级结构及其盐的合成法。传统的烃连接的HBS螺旋已经被证明是一类刺激性蛋白质结构域模拟物；然而，它们的难合成性已经限制了它们的使用。硫醚、醚以及烷基胺键合的简易合成允许回避关键困难反应之一，即闭环复分解反应。已经发现，硫醚连接的HBS(“teHBS”)螺旋与碳连接的HBSα螺旋相比在构形稳定性和蛋白质靶向潜力方面有利，并且希望醚和烷基胺连接的HBS螺旋也将如此。

除非另外指出，否则本文中提供了本文化合物、其盐或含有这些化合物中的至少一种的组合物用以引起或促进细胞死亡的用途。

除非另外指出，否则本文中提供了本文化合物或其盐用以制造用于促进细胞死亡的药物的用途。

除非另外指出，否则本文中提供了一种制造包含任何本文化合物和/或其盐的组合物的方法，所述方法包括例如合并所述本文化合物或其盐与例如赋形剂或媒剂以形成所述组合物，所述组合物可任选地为药学上可接受的组合物。

附图简述

图1是以i→i+4氢键为特征的典型α螺旋与原始HBSα螺旋的烃键合和本发明的teHBSα螺旋的硫醚键合的比较。

图2显示了可以使用本发明的硫醚、醚或烷基胺连接的HBS方法制造的β反平行片(上图)和β片构形(中图(反平行β发夹)和下图(反平行β片大环))。以举例的方式显示了硫醚键。

图3说明了合成经硫醚稳定过的α螺旋期间的硫醚形成。X＝任何离去基；R、R¹＝任何氨基酸侧链；Y＝酰胺、酯或羧酸；阴影环指示固体载体。在图3A中，N末端环化产生13元大环。图3B显示了产生14元大环的C末端和链中间环化。

图4是teHBS1在HPLC纯化之后的质谱。m/z＝1534。

图5A-B是teHBS1的逆相分析型HPLC迹线。图5A是粗肽的迹线。移动相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液-水(梯度＝5-95％，20分钟)。图5B是所述肽在一轮纯化之后的迹线。移动相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液-水(梯度＝10-60％，45分钟)。

图6是teHBS1的圆二色性光谱。208nm和222nm处的双最小值及190nm附近的最大值指示α螺旋。各浓度下的螺旋性百分比经过计算为30％。

图7是利用fl-p53得到的Mdm2_25-117的饱和结合曲线。

图8显示了如何通过共轭加成(方法A)或亲核取代(方法B)反应来合成硫醚、醚以及烷基胺连接的HBS蛋白质二级结构(以举例的方式显示了teHBS1)。

图9是teHBS1和HBS2在10％三氟乙醇/磷酸盐缓冲盐水中的CD光谱。

图10是teHBS1在ACN-d₃/5％DMSO-d₆中的¹H NMR光谱。

图11是teHBS1在DMSO-d₆中的¹H NMR光谱。

图12A-B为针对teHBS1所观测到的短程NOE(图13A)和中程NOE(图13B)。图13C是teHBS1的NOESY相关图。甘氨酸-3残基被N烷基化。实心矩形指示NOE交叉峰的相对强度。空心矩形指示由于信号重叠而无法明确分配的NOE。

图13是如利用荧光偏振测定法确定的teHBS1和HBS2对Mdm2的结合亲和力的图。

以引用的方式并入

本文中所参考的所有专利、专利申请及出版物(包括电子出版物)是以引用的方式并入，就如同具体地且个别地指示各个别专利、专利申请或出版物是以引用的方式并入。

发明详述

一个或多个发明实施方案的细节阐述于附图、权利要求书和本文中的描述中。本文中所公开和涵盖的发明实施方案的其他特征、目标和优点将从描述和图示及权利要求书中显而易见。

如本文中所使用，除非另有明确规定，否则冠词“一个(种)”意指一个(种)或多个(种)。

如本文中所使用，除非另外指出，否则如“含有”、“包括”等术语意指“包含”。

如本文中所使用，除非另外指出，否则术语“或”可以是连词或反意连词。

如本文中所使用，除非另外指出，否则任何实施方案都可以与任何另一实施方案组合。

如本文中所使用，除非另外指出，否则本文中的一些发明实施方案涵盖数值范围。当提供范围时，所述范围包括范围端点。另外，提供所述范围内的每个子范围和值，就如同明确写出。

倘若本文中的术语与以引用方式并入的专利、专利申请或出版物中的术语相冲突，则以本文中的术语为准。

本文中提供了具有稳定的内部受约束的蛋白质二级结构并且所述蛋白质二级结构含有硫醚、醚或烷基胺连接的氢键替代物(HBS)的肽模拟物及其盐(和含有这些肽模拟物中的至少一种的组合物)以及其制造和使用方法。

蛋白质二级结构可以由在不同主链酰胺基之间所观测到的氢键合模式来定义。对肽中螺旋-卷曲转变的分析强调作为螺旋形成中的慢步骤，非常需要将三个连续氨基酸组织到螺旋方向中(Qian和Schellman，J. Chem.Phys.，96：3987-3994(1992)；Lifson和Roig，J.Chem.Phys.，34：1963-1974(1961)；Zimm和Bragg，J. Chem.Phys.，31：526-535(1959)，这些文献是以全文引用的方式并入在此)。希望这些氨基酸残基的预组织能压倒固有成核倾向且引发螺旋形成(Austin等，J. Am.Chem.Soc.，119：6461-6472(1997)；Kemp等，J. Org.Chem.，56：6672-6682(1991))。举例来说，在α螺旋中，第i个氨基酸残基的C＝O与第i+4个氨基酸残基的NH之间的氢键稳定螺旋结构并使其成核(参见以下方案1)。类似的相互作用稳定其他螺旋、β片/β发夹及其他肽二级结构并使其成核。

为了模拟C＝O--H-N氢键，本文中的肽模拟物及其盐可以如方案1中所示并入C_1-5-B-C_1-5-N型共价键。

方案1

如图1中所示(举例来说，使用α螺旋)，如同在基于烃的HBS肽模拟物及其盐的情况下，内部放置交联允许发展蛋白质二级结构，使得暴露表面中没有一个被约束元件阻挡，即，将交联放置在蛋白质二级结构的内侧上既不会改变侧链官能性，也不会阻挡分子的溶剂暴露分子识别表面(参见Sia等，Proc.Nat′lAcad. Sci.USA99：14664-14669(2002))。此外，甚至非常短的肽(即，少于10个氨基酸残基的肽，例如具有约9个或约8个或约7个或约6个或约5个或约4个或约3个残基的肽)都可能被约束在高度稳定的蛋白质二级结构中。

另外，本文的硫醚、醚以及烷基胺连接的HBS肽模拟物及其盐可能比其烃连接的HBS配对物更易于合成且以更高产率合成。

本文中的蛋白质二级结构可以包括而不限于α螺旋、3₁₀螺旋、π螺旋、短杆菌肽螺旋、β片大环以及β发夹。

除非另外指出，否则本文中的稳定的内部受约束的蛋白质二级结构可以含有具有以下部分的硫醚、醚或烷基胺连接的HBS：

其中：

B为O、S或NR¹；

其中：

在本文中，除非另外指出，否则氨基酸侧链可以是来自于天然或非天然氨基酸，包括来自于α氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸、L-氨基酸以及D-氨基酸的任何氨基酸侧链。除非另外指出，否则本文中的氨基酸侧链可以包括例如来自于精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的侧链。

除非另外指出，否则如本文中所使用，术语“烷基”意指可以是直链或支链的脂肪族烃基，其链中具有约1到约6个碳原子。支链意指一个或多个如甲基、乙基或丙基等低级烷基连接到线性烷基链。示范性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基以及3-戊基。除非另外指出，否则本文中的烷基可以含有例如1到6个碳原子、1到4个碳原子、1到3个碳原子、1到3个碳原子、2到6个碳原子、3到6个碳原子、4到6个碳原子、5到6个碳原子，或者1、2、3、4、5或6个碳原子。烷基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用的术语“烯基”意指含有碳-碳双键且可以是直链或支链的脂肪族烃基，其链中具有约2到约6个碳原子，例如约2个、约3个、约4个、约5个或约6个碳原子，或者约3到约6个、约4到约6个、约5到约6个、约2到约5个、约2到约4个或约2到约3个碳原子。优选的烯基在链中具有2到约4个碳原子。示范性烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基以及异丁烯基。烯基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用的术语“炔基”意指含有碳-碳三键且可以是直链或支链的脂肪族烃基，其链中具有约2到约6个碳原子，例如约2个、约3个、约4个、约5个或约6个碳原子，或者约3到约6个、约4到约6个、约5到约6个、约2到约5个、约2到约4个或约2到约3个碳原子。优选的炔基在链中具有2到约4个碳原子。示范性炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基以及正戊炔基。炔基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用，术语“环烷基”是指非芳香族饱和或不饱和单环或多环的环系统，它可以含有例如3到6个碳原子、约3个、约4个、约5个、约6个、约4到约6个、约5到约6个、约3到约5个、约3到约4个、约3个、约4个、约5个或约6个碳原子，并且它可以包括至少一个双键。示范性环烷基包括而不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、反联环丙烷或同联环丙烷。环烷基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用，术语“杂环基”可指稳定的3到18元，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、3至18、5至18、6至18、7至18、8至18、9至18、10至18、11至18、12至18、13至18、14至18、15至18、16至418、17至18、3至17、3至16、3至15、3至414、3至13、3至12、3至411、3至10、3至9、3至8、3至7、3至46、3至5或3至4元环系统，其包含一个或多个碳原子和一到五(例如1、2、3、4或5)个杂原子，各杂原子是个别地从由氮、氧及硫组成的群组中选出。杂环基可以是单环或多环的环系统，它可以包括稠环、桥环或螺环系统；且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化；且环可以部分或完全饱和。代表性单环杂环基包括哌啶、哌嗪、嘧啶、吗啉、硫代吗啉、吡咯烷、四氢呋喃、吡喃、四氢吡喃、氧杂环丁烷等等。代表性多环杂环基包括吲哚、异吲哚、吲哚嗪、喹啉、异喹啉、嘌呤、咔唑、二苯并呋喃、苯并吡喃、咕吨等等。杂环基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用，术语“芳基”是指芳香族单环或多环的环系统，它含有例如6到19个碳原子，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、8到19、10到19、12至19、14至19、16至19、6至17、6至15、6至13、6至11或6到9个碳原子，其中环系统可以任选地经过取代。本发明的芳基包括但不限于如苯基、萘基、茂并芳庚基、菲基、蒽基、芴基、芘基、苯并菲基、屈基以及萘并萘基等基团。芳基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用，“杂芳基”是指包含一个或多个碳原子和一到五个杂原子(例如1、2、3、4或5个杂原子)的芳香族环系统，各杂原子是个别地从由氮、氧及硫组成的群组中选出。杂芳基的实例包括而不限于吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基、噻二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、噻吩并吡咯基、呋喃并吡咯基、吲哚基、氮杂吲哚基、异吲哚基、吲哚啉基、吲哚嗪基、吲唑基、苯并咪唑基、咪唑并吡啶基、苯并三唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、吡唑并吡啶基、三唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹嗪啉基、酞嗪基、苯并三嗪基、色烯基、萘啶基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、喋啶基以及嘌呤基。杂芳基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用，术语“芳基烷基”是指具有式-R^aR^b的部分，其中R^a是如上文所定义的烷基或环烷基且R^b是如上文所定义的芳基或杂芳基。芳基烷基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用的术语“酰基”意指具有式R-羰基的部分，其中R是如上文所定义的烷基、环烷基、芳基或杂芳基。示范性酰基包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基以及丙烯酰基。酰基可经过取代或未经取代。

除非另外指出，否则如本文中所使用，氨基酸可以是任何天然或非天然氨基酸。氨基酸可以是例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。

除非另外指出，否则如本文中所使用的“肽”是两种或更多种天然或非天然氨基酸，包括α氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸、L-氨基酸、D-氨基酸及其组合的任何低聚物。在优选的实施方案中，肽是约5到约30(例如～5到～10、～5到～17、～10到～17、～10到～30或～18到～30)个氨基酸长。肽可以是例如10-17个氨基酸长。肽可以是例如约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个氨基酸长。

除非另外指出，否则如本文中所使用的“标签”包括有助于检测、定量、分离和/或纯化本文化合物或其盐的任何标记部分。合适的标签包括纯化标签、放射性或荧光标记以及酶标签。

如聚组氨酸(His₆-)、谷胱甘肽S转移酶(GST-)或麦芽糖结合蛋白(MBP-)等纯化标签可以辅助化合物纯化或分离，但稍后可被去除，即，在回收后从化合物中裂解。可以使用蛋白酶特异性裂解部位来促进纯化标签的去除。可以进一步纯化所希望的产物以去除已裂解的纯化标签。

其他合适的标签包括如¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹TC等放射性标记。对化合物进行放射性标记的方法在本领域中是已知的且描述于颁予Srinivasan等的美国专利第5,830,431号中。放射性可以例如使用闪烁计数器或自动射线照相术进行检测和定量。或者，可以使化合物与荧光标签结合。合适的荧光标签可以包括而不限于螯合剂(铕螯合剂)、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红素及得克萨斯红。可以例如使用CURRENT PROTOCOLSINIMMUNOLOGY(Coligen等编，1991)中所公开的技术使荧光标记与本文化合物或其盐结合。荧光可以例如使用荧光计进行检测和定量。

举例来说，酶标签总体上催化显色底物的化学变化，所述化学变化可以使用各种技术进行测量。举例来说，酶可以催化底物的颜色变化，所述颜色变化可以用分光光度计测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。合适的酶标签的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；参见例如颁予Weng等的美国专利第4,737,456号)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等等。用于使酶与蛋白质和肽结合的技术描述于O′Sullivan等，Methodsfortge Preparation ofEnzyme-AntibodyConjugatesforUseinEnzyme Immunoassay，METHODS IN ENZYMOLOGY147-66(Langone等编，1981)中。

除非另外指出，否则本文中的靶向部分可以起以下作用：(i)促进化合物的细胞吸收，(ii)使化合物靶向特定细胞或组织类型(例如信号肽序列)，或(iii)使化合物在细胞吸收后靶向具体的亚细胞定位(例如转运肽序列)。

为了促进本文化合物或其盐的细胞吸收，靶向部分可以是细胞穿透肽(CPP)。CPP通过看起来与能量无关的途径易位越过真核细胞的质膜，且已经成功用于细胞内递送分子量是它们自身几倍的大分子，包括抗体、肽、蛋白质及核酸。几种常用的CPP，包括多聚精氨酸、转运蛋白、精蛋白、毛若考辛(maurocalcine)及M918，是适合用于本发明的靶向部分且在本领域中是众所周知的(参见Stewart等，“Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vehiclesfor Biology andMedicine,”Organic BiomolecularChem.6：2242-2255(2008))。另外，制造CPP的方法描述于Hallbrink等的美国专利申请公布第20080234183号中。

此处，举例来说，可用于增强化合物或其盐的细胞吸收的另一个合适的靶向部分可以是如颁予Lin等的美国专利第6,043,339号所公开的“输入胜任”信号肽。举例来说，输入胜任信号肽总体上可以是约10到约50个氨基酸残基长，例如约10、约20、约30、约40、约50、约20到约50、约30到约50、约40到约50、约10到约40、约10到约30、约10到约20或约20到约30个残基长(典型疏水性残基)，从而使化合物或其盐能够从细胞外部穿透细胞膜到达细胞内部。示范性输入胜任信号肽包括得自于卡波西纤维母细胞生长因子的信号肽(参见颁予Lin等的美国专利第6,043,339号)。其他合适的肽序列可以选自SIGPEP数据库(参见von Heijne G，“SIGPEP：A SequenceDatabasefor Secretory Signal Peptides，”Protein Seq.Data Anal.1(1)：41-42(1987))。

除非另外指出，否则本文中的另一个合适的靶向部分可以是能够使本发明化合物靶向特定组织或细胞类型的信号肽序列。信号肽可以包括配位体结合蛋白的至少一部分。合适的配位体结合蛋白包括高亲和力抗体片段(例如Fab、Fab′及F(ab′)₂、单链Fv抗体片段)、纳米抗体或纳米抗体片段、荧光抗体或适配体。其他配位体结合蛋白包括生物素结合蛋白、脂质结合蛋白、外周胞质结合蛋白、凝集素、血清白蛋白、酶、磷酸和硫酸结合蛋白、免疫亲和素、金属硫蛋白或各种其他受体蛋白。对于细胞特异性靶向来说，信号肽优选为细胞特异性膜受体的配位体结合域。因而，当经修饰化合物被经静脉内递送或以其他方式引入血液或淋巴中时，化合物将吸附到标靶细胞，且标靶细胞将内在化所述化合物。举例来说，如果标靶细胞是癌细胞，则化合物可以结合到如颁予Taylor等的美国专利第6,572,856号所公开的抗C3B(I)抗体。或者，化合物可以结合到如颁予Moro的美国专利第6，514，685号所公开的甲胎蛋白受体或如颁予Hosokawa的美国专利第5，837，845号所公开的单克隆GAH抗体。为了使化合物靶向心脏细胞，化合物可以结合到识别弹性蛋白微原纤维界面因子(EMILIN2)的抗体(Van Hoof等，“Identmcation of Cell Surfacefor Antibody-BasedSelection of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes,”JProteom Res9：1610-18(2010))、心脏肌钙蛋白I、连接蛋白43或本领域中已知的任何心脏细胞表面膜受体。为了使化合物靶向肝细胞，信号肽可以包括对肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体具有特异性的配位体域。制备所述嵌合蛋白质和肽的方法描述于颁予Heartlein等的美国专利第5，817，789号中。

除非另外指出，否则本文中的另一个合适的靶向部分是转运肽，它在被标靶细胞或组织内在化后指导化合物的细胞内区室化。举例来说，为了转运到内质网(endoplasmic reticulum，ER)，化合物可以结合到ER转运肽序列。许多所述信号肽在本领域中是已知的，包括信号肽MMSFVSLLLVGILFYATEAEQLTKCEVFQ(SEQ ID NO：1)。其他合适的ER信号肽包括酶17β-羟基类固醇脱氢酶11型的N末端内质网靶向序列(Horiguchi等，“Identmcation and Characterization of theER/Lipid Droplet-Targeting Sequence in17β-hydroxysteroidDehydrogenase Type11，”Arch.Biochem.Biophys.479(2)：121-30(2008))或Reed等的美国专利申请公布第20080250515号中所公开的任何ER信号肽(包括编码ER信号肽的核酸序列)。另外，除非另外指出，否则本文化合物或其盐可以含有ER滞留信号，如滞留信号KEDL(SEQ ID NO：2)。修饰本文化合物或其盐以并入用于将化合物定位到ER的转运肽的方法可以如Reed等的美国专利申请公布第20080250515号中所描述来进行。

为了转运到细胞核，在本文中，除非另外指出，否则本文化合物及其盐可以例如包括核定位转运信号。合适的核转运肽序列在本领域中是已知的，包括核转运肽PPKKKRKV(SEQ ID NO：3)。举例来说，其他核定位转运信号包括酸性纤维母细胞生长因子的核定位序列和如颁予Lin等的美国专利第6,043,339号所公开的转录因子NF-KBp50的核定位序列。本领域中已知的其他核定位肽序列也适合用于本文化合物及其盐。

用于靶向线粒体的合适转运肽序列包括例如MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL(SEQ ID NO：4)。Wipf的美国专利申请公布第20070161544号中公开了适合使本文化合物及其盐选择性地靶向线粒体的其他合适的转运肽序列。

如本领域技术人员应显而易见，当R²和/或R³是所述化学式的一个部分时，除非另外指出，否则可以通过改变m′和/或m″的值来调节式I化合物及其盐的总体大小，m′和m″独立地为零或任何数字。典型地，m′和m″独立地为0到约三十(例如0到～18、0到～10、0到～5、～5到～30、～5到～18、～5到～10、～8到～30、～8到～18、～8到～10、～10到～18或～10到～30)。在本文中，除非另外指出，否则m′和m″可以独立地为4-10。在本文中，除非另外指出，否则m′和m″可以独立地为5-6。

如熟练技术人员应显而易见，除非另外指出，否则式I化合物及其盐可以包括不同的螺旋构形范围，这取决于m、n′及n″的值。这些螺旋构形包括3₁₀螺旋(例如m＝0且n′+n″＝2)、α螺旋(例如m＝l且n′+n″＝2)、π螺旋(例如m＝2且n′+n″＝2)及短杆菌肽螺旋(例如m＝4且n′+n″＝2)。在一个优选实施方案中，螺旋大环骨架中的原子数可以是12-15或13或14。

在本文中，除非另外指出，否则式I化合物或其盐可以是式IA化合物(即，在N末端环化的螺旋)或其盐、式IB化合物(即，在肽中间环化的螺旋)或其盐，或式IC化合物(即，在C末端环化的螺旋)或其盐：

除非另外指出，否则本文中提供了式IIA化合物(即，β片大环)或式IIB化合物(即，β发夹)或其盐：

其中：

各B独立地为O、S或NR¹；

其中：

其中：

各m独立地为零、一、二、三或四。

在本文中，除非另外指出，否则本文化合物及其盐包括图2中所示的那些。图2显示了经由硫醚键加以约束的示范性β片。如本领域技术人员将显而易见，还预期经由醚键或烷基胺键加以约束的类似化合物。

除非另外指出，否则本文化合物及其盐可以根据本文中描述的方法来制备。

除非另外指出，否则本文中提供了一种制备式IA化合物或其盐的方法。这种方法阐述于以下表1中。

表1.用于产生式IA化合物的示范性方法.

D：NR¹或O

LG¹：羧基活化基(例如二烷基碳化二亚胺、羟基苯并三唑)或卤化物(例如氯化物、溴化物)

LG²：任何离去基(例如卤素、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯)

LG³：不存在、固相合成表面、烷基/芳基酯或烷基/芳基酰胺

R：氨基酸侧链

PG¹：用于保护胺的保护基

PG²：不存在或用于保护它所连接的R¹的保护基

PG³：如果D为NR¹，则是用于保护胺的保护基；如果D为O，则是用于保护醇的保护基

PG⁴：如果B为O，则是用于保护醇的保护基；如果B为S，则是用于保护硫醇的保护基；如果B为NR⁴，则是用于保护胺的保护基

PG¹、PG²及PG³是不同的

PG¹、PG²及PG⁴是不同的

Y：H、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基或固相合成表面

-D′-Y′：如果Y为固相合成表面，则是H；否则为-D-H或H

Z：CR¹ ₂＝CR⁴-或X-CR¹ ₂-(CR⁴ ₂)_n″-

B、m、n′、n"、R¹、R²、R³以及R⁴：如上文所定义

除非另外指出，否则本文中提供了一种制备式IB化合物或式IC化合物或其盐的方法。这种方法阐述于以下表2中。

表2.用于产生式IB化合物和式IC化合物的示范性方法.

AA、AA′、B、D、LG¹、LG²、LG³、m、n′、n"、R、R¹、R²、R³、R⁴、PG¹、PG²、PG³、PG⁴、Y、-D′-Y′以及Z：如上文所定义

在本文中，除非另外指出，否则离去基可以置换为带有成键电子的稳定物质，从而使一种化合物与另一种偶合。适合于本文方法的离去基在本领域中是众所周知的，且包括而不限于标准溶液或固相肽合成中所采用的那些。本文中的离去基可以是例如甲苯磺酰化或甲磺酰化醇、Br、I或Cl。

除非另外指出，否则保护基在本文中主要起保护或掩蔽官能团的反应性的作用。适合于保护胺基的保护基在本领域中是众所周知的，包括而不限于氨基甲酸脂、酰胺、N-烷基和N-芳基胺、亚胺衍生物、烯胺衍生物以及N-杂原子衍生物，如THEODORA W.GREENE和PETER G M.WUTS，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS494-615(1999)所描述。除非另外指出，否则本文中的合适的保护基可以包括例如叔丁氧基羰基(“Boc”)、9-芴基甲氧基羰基(“Fmoc”)、苄氧羰基(“Cbz”)及三苯甲基。适合于保护醇的保护基在本领域中也是众所周知的。合适的醇保护基包括而不限于硅烷醚、酯及烷基/芳基醚。适合于保护硫醇基的保护基在本领域中也是众所周知的。合适的硫醇保护基包括而不限于芳基/烷基硫醚和二硫化物。如本领域技术人员应显而易见，在进行本文所述的方法时，Asn、Asp、Gln、Glu、Cys、Ser、His、Lys、Arg、Trp或Thr的氨基酸侧链典型地将需要但不必总是受到保护。适合于保护这些氨基酸侧链的保护基在本领域中也是众所周知的。对官能团进行保护和脱保护的方法取决于所选保护基而变化；然而，这些方法在本领域中是众所周知的且描述于THEODORA W.GREENE和PETER G M.WUTS，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS372-450和494-615(1999)中。

除非另外指出，否则本文中的方法可以在溶液中和/或在固相合成表面上进行。合适的固相合成表面包括例如粒子、链、沉淀物、凝胶、片、桶、球体、容器、毛细管、衬垫、切片、膜、板、载片、盘、薄膜等。这些表面可以由多种材料制造，包括聚合物、塑料、陶器、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、薄膜或其复合物。衬底优选为平坦的，但可以呈现多种替代表面构形。合适的表面包括而不限于树脂、聚合物膜(例如纤维素、硝化纤维素、丙烯酰胺)、无机薄膜(例如氧化铝、氧化锆)、陶器薄膜、人造薄膜、金表面、硅烷表面及碳表面(例如碳纳米管、碳巴克球)。本领域技术人员在回顾本公开内容后将显而易见其他表面材料。

经硫醚稳定的α螺旋的合成

举例来说，下文和实施例1-11中描述了使用Fmoc固相合成制备含有经由硫醚键约束的HBS螺旋的肽模拟物及其盐的工艺。如本领域技术人员应显而易见，这种工艺可以经过修改以便使用其他合成方法来制备硫醚连接的HBS螺旋以及用于制备本文中的其他硫醚连接的HBS蛋白质二级结构及醚和烷基胺连接的HBS蛋白质二级结构。

举例来说，可以如图3中所示，通过在亲电子性碳中心处对硫醇进行亲核性攻击来实现硫醚形成。希望环化肽在与线性未受约束肽同系物相比时对蛋白质标靶具有改良的结合亲和力且在生理条件下具有更大的稳定性。这种方法能够用于Fmoc固相合成。

N末端硫醚环化肽

当R¹是除甘氨酸以外的任何氨基酸侧链时，预计可以如方案2中所示，经由福山-光延反应(Fukayama-Mitsunobu reaction)，用含硫醇的受保护醇(例如(S-单甲氧基三苯甲基)-2-巯基乙醇)来进行硫醇的引入。当R¹是甘氨酸时，可以使离去基连接到α碳的乙酸衍生物(例如溴乙酸)与N末端氨基酸残基偶合，随后与过量含硫醇的受保护伯胺(例如(S-单甲氧基三苯甲基)-2-巯基乙醇)反应。

方案2

Fmoc-氨基酸与仲胺偶合可以如方案3中所示，通过用一种或多种肽偶合试剂(例如三光气与弱碱，例如含2,4,6-三甲基吡啶的四氢呋喃；二异丙基碳化二亚胺和1-羟基-7-氮杂苯并三唑)预活化，随后进行微波照射来实现。在室温下使用一种或多种肽偶合试剂(例如二异丙基碳化二亚胺和1-羟基-7-氮杂苯并三唑)来附加末端亲电子性(例如3-溴丙酸)残基。选择性去除保护基(例如单甲氧基三苯甲基)可以用脱保护剂(例如二氯甲烷：三氟乙酸：三异丙基硅烷(93：2：5))来实现。可以使用Ellman比色测试证实成功去除保护基。环化可以通过加入碱(例如含1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯的二甲基甲酰胺)，随后在室温下振荡(例如15分钟)来实现。阴性Ellman测试和指示硫醇基转化成硫醚的质谱可用以证实环化反应完毕(关于teHBS1的质谱，参见图4)。

方案3

完全脱保护和从树脂上裂解得到粗环化产物，所述粗环化产物可以利用逆相HPLC进行进一步纯化(参见图5A-B，例如teHBS1的纯化)。

可以利用圆二色性光谱(CD)评定α螺旋性。208和222nm处的最小值及190nm附近的最大值指示典型α螺旋(关于teHBS1的CD，参见图6)。

C末端和肽中间硫醚环化肽

用于引入C末端和肽中间硫醚键合的方法类似于引入N末端硫醚约束，有些许差异。亲电子试剂是二肽类似物(例如5)且必须预先合成，例如，如方案4中所示。为了合成二肽类似物，可以使用氨基保护基(例如Cbz)以便与可能会与Fmoc不相容的强碱性试剂相容。氨基保护基可以使用标准方案去除且利用标准Fmoc合成实现肽延长。

方案4

由于卤代仲烷的反应性，环化必须在肽延长之前实现，如方案5中所示。

方案5

除非另外指出，否则本文中提供了一种用于促进细胞死亡的方法。这种方法可以包括例如使细胞与完全或部分抑制p53/hDM2的一种或多种式I化合物或其盐(或含有这些化合物中的至少一种的组合物)在所述一种或多种化合物或其盐(或含有这些化合物中的至少一种的组合物)可有效促进细胞死亡的条件下接触。

合适的p53/hDM2抑制剂包括teHBS1。

已知p53/hDM2相互作用终止细胞凋亡且导致不受控制的生长(癌症的一个特征)。teHBS1模拟结合hDM2的p53蛋白的一部分，且有望阻断p53/hDM2相互作用并诱导癌细胞的细胞凋亡活性(Chene，P，“Inhibiting the p53-MDM2Interaction：An Important Target ForCancer Therapy，”Nat.Rev. Cancer3：102-109(2003)；Chene等，“Studyof the Cytotoxic Effect of a Peptidic Inhibitor of the p53-HDN2Interaction in Tumor Cells，”FEBSLett.529：293-297(2002)；Garcia-Echeverria等，“DiScovery of Potent Antagonists of theInteraction between Human Double Mminute2and Tumor Suppressorp53，”J. MedicinalChemistry43：3205-3208(2000)；Kritzer等，“Helicalβ-Peptide Inhibitors of the p53-hDM2Interaction,”J.Am.Chem.Soc.126：9468-9469(2004)；Kussie等，“Structure ofthe MDM2OncoproteinBound to the p53Tumor Suppressor Transactivation Domain，”Science274：948-953(1996)；Vassilev等，“In Vivo Activation of the p53Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2，”Science303：844-848(2004)；Yin等，“Terphenyl-based Helical Mimetics ThatDisrupt the p53/HDM2Interaction，”Angew Chem.Int.Ed.44：2704-2707(2005))。

除非另外指出，否则使细胞与本文中的一种或多种化合物或其盐(或含有这些化合物中的至少一种的组合物)接触可以在体外或体内进行。

当接触是在体内进行时，接触可以包括给予受试者以本文化合物或其盐(或含有这些化合物中的至少一种的组合物)。所述受试者可以是人类。所述受试者可能有需要。所述受试者可以是非人类动物。除非另外指出，否则本文化合物、其盐或含有这些化合物中的至少一种的组合物可以例如经口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、通过鼻内滴注或通过施用到粘膜(如鼻、咽及支气管粘膜)而给予。它们可以单独或与合适的药物载剂一起给予，且可以呈固体或液体形式，如片剂、胶囊剂、粉末剂、溶液、悬浮液或乳液。

本文中的任选活性化合物可以口服给予，例如与惰性稀释剂一起，或与可吸收的可食用载剂一起，或者可以将它们封闭在硬壳或软壳胶囊中，或者可以将它们压入片剂中，或者可以将它们直接与膳食中的食物合并。为了进行口服治疗给予，可以将这些活性化合物与赋形剂合并且以片剂、胶囊剂、酏剂、悬浮液、糖浆等形式使用。所述组合物和制剂应含有至少0.1％任选活性化合物。这些组合物中的本文化合物(任选活性)或其盐的百分比当然可以变化，且可以方便地为单元重量的约2％到约60％、约4％、约5％、约8％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。所述治疗有用组合物中的(任选活性)化合物或其盐的量使得将会获得合适的剂量。制备根据本发明的优选组合物，使得口服剂量单位含有约1到约250mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg或约250mg(任选活性)化合物或其盐。

所述片剂、胶囊剂等还可以含有粘合剂，如黄蓍树胶、刺槐、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸；润滑剂，如硬脂酸镁；及甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精。当所述剂量单位形式是胶囊剂时，除以上类型的材料以外，它还可以含有液体载剂，如脂肪油。

可以存在各种其他材料作为包衣或用以改变剂量单位的物理形式。举例来说，片剂可以涂有虫胶、糖或两者。除活性成分以外，糖浆还可以含有作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料及如樱桃味或橙味等调味剂。

本文中的这些化合物及其盐(以及含有这些化合物中的至少一种的组合物)还可以经肠胃外给予。可以通过在水中适当地与如羟丙基纤维素等表面活性剂混合来制备这些化合物的溶液或悬浮液。还可以制备在含甘油、液体聚乙二醇及其混合物的油中的分散液。说明性油为石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、豆油或矿物油。总体来说，水、生理盐水、葡萄糖水溶液及相关糖溶液以及如丙二醇或聚乙二醇等二醇是优选的液体载剂，特别是对于可注射溶液来说。在一般存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。

适合于可注射用途的药物形式包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液和无菌粉末剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的且必须是达到容易注射程度的流体。它在制造和存储条件下必须是稳定的且必须经防腐处理以防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。所述载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇)、其合适混合物及植物油的溶剂或分散介质。

本文中的化合物及其盐还可以呈气雾剂形式直接给予到气道。为了作为气雾剂使用，呈溶液或悬浮液形式的本文化合物及其盐可以跟合适的挥发剂(例如烃挥发剂，如丙烷、丁烷或异丁烷)与常规助剂一起包装在加压气雾剂容器中。本发明的材料还可以呈不加压形式(如在喷雾器或雾化器中)给予。

当使用这种方法来治疗受试者或有需要的受试者时，可以使用上述给药模式和形式使细胞与一种或多种式I化合物或其盐或含有这些化合物中的至少一种的组合物接触。

可以参考以下实施例进一步说明本文中的发明实施方案。尽管本文中已经显示并描述了发明实施方案，但仅以举例方式提供所述实施方案。本领域技术人员现在应能在不背离本文中所公开的本发明的情况下想到许多变化、改变和替代。以下实施例是说明性的且不应被视为极限性的。

实施例

实施例1-合成teHBS1

硫醚衍生的氢键替代物肽模拟物teHBS1是根据方案6来制备，如实施例2-11中所描述。

方案6

实施例2-一般材料和方法

使用市售等级的试剂和溶剂而不进行进一步纯化，除非有所指示。所有Fmoc氨基酸、肽合成试剂及Rink酰胺MBHA树脂是获自Novabiochem(San Diego，USA)。所有其他试剂都是获自Sigma-A1drich(St.Louis，USA)。利用4.6×150mm(分析规模)或21.4×150mm(制备规模)的Waters C18Sunfire柱，使用配备有SystemGold168二极管阵列检测器的Beckman Coulter HPLC来进行逆相HPLC实验。分析型和制备型HPLC的典型流动速率分别是1mL/min和8mL/min。在所有情况下，都使用0.1％三氟乙酸水溶液和乙腈缓冲液。在Bmker AVANCE400MHz光谱仪上获得单体的质子和碳NMR谱。在Bruker AVANCE500MHz光谱仪上记录HBS肽的质子NMR谱。在LC/MSD TOF(Agilent Technologies)上获得高分辨率质谱(HRMS)。在Agilent1100系列LC/MSD(XCT)电喷雾阱上获得LCMS数据。

实施例3-S-(4-甲氧基三苯甲基)-2-氨基乙硫醇的合成

如下合成S-(4-甲氧基三苯甲基)-2-氨基乙硫醇(“S1”(Riddoch等，BioconjugateChem.17：226-35(2006)))。将半胱胺盐酸盐(1.75g，16.2mmol)和4-甲氧基三苯甲基氯(5g，16.2mmol)溶解于DMF(25mL)与二氯甲烷(25mL)的混合物中且在室温下在氩氛围下搅拌14、时。在真空中浓缩反应混合物且用水(150mL)稀释，然后用乙醚(3×50mL)萃取。合并有机层，用盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥并且蒸干，得到无色油(5.5g，15.7mmol，97％)。¹H NMR(400MHz；CDCl₃)δ2.26(2H，t，J6.6Hz)，2.53(2H，t，J6.6Hz)，3.70(3H，s)，6.72(4H，m)，7.11(1H，m)，7.16-7.25(7H，m)，7.30-7.34(2H，m)。¹³CNMR(100MHz；CDCl₃)δ36.24，41.09，55.23，65.62，113.11，126.56，127.85，129.41，130.69，137.30，145.53，158.06。

实施例4-C末端的制备

使Knorr酰胺树脂(0.69mmol/g；362mg，0.25mmol)在DMF(5mL)中膨胀10分钟，随后通过用3mL含20％哌啶的NMP加以处理(5分钟，然后20分钟)来去除Fmoc基团。然后用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和DMF(3×5mL)洗涤树脂。利用由含Fmoc-Ser(OtBu)-OH(409mg，1.25mmol)、HBTU(474mg，1.25mmol)和N，N-二异丙基乙胺(218μL，1.25mmol)的DMF(3mL)制备的预活化Fmoc-Ser(OtBu)-OH处理游离胺。振荡2小时之后，用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和DMF(3×5mL)洗涤树脂。使用含20％哌啶的NMP从Fmoc-Ser(OtBu)官能化树脂中去除Fmoc基团(5分钟，然后20分钟)，且对其他氨基酸残基重复以上程序(Riddoch等，BioconjugateChem.17：226-35(2006))。

实施例5-硫醇的添加

为了包括乙-2-硫醇基，利用由含2-溴乙酸(347mg，2.5mmol)、DIC(391μL，2.5mmol)和HOAt(170mg，1.25mmol)的DMF(3mL)制备的预活化2-溴乙酸处理游离胺。振荡1小时之后，用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和DMF(3×5mL)洗涤树脂。利用溶解于DMF(3mL)中的S1(873mg，2.5mmol)处理溴乙酰基。振荡30分钟之后，用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和DMF(3×5mL)洗涤树脂。使用氯醌测试来监测反应进展。

实施例6-氨基酸残基的添加

利用预活化Fmoc-Glu(OtBu)-OH处理仲胺S2(方案6)且在微波条件下加热到55℃后持续60分钟。预活化Fmoc-Glu(OtBu)-OH是由含Fmoc-Glu(OtBu)-OH(532mg，1.25mmol)、DIC(196μL，1.25mmol)和HOAt(85mg，0.63mmol)的DMF(3mL)制备。使用氯醌测试监测所述反应。随后使用上文关于Fmoc-Ser(OtBu)-OH与树脂的偶合所概述的方法并入Fmoc-Gln(Trt)残基。

实施例7-亲电体的添加

去除Fmoc基团之后，利用由含丙烯酸(86μL，1.25mmol)、DIC(196μL，1.25mmol)和HOAt(85mg，0.63mmol)的DMF(3mL)制备的预活化丙烯酸处理游离胺以获得3。振荡1小时之后，用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和DMF(3×5mL)洗涤树脂。使用3-溴丙酸(191mg，1.25mmol)代替丙烯酸以便合成4。

实施例8-选择性S-4-甲氧基三苯甲基脱保护

使树脂(0.25mmol)在DCM(3mL)中膨胀，随后利用含2％TFA和5％TIPS的DCM(5mL)处理。振荡15分钟之后，用DCM(3×5mL)洗涤树脂。重复这种脱保护程序(典型地三次)直到反应溶剂不再呈黄色为止。然后用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和DMF(3×5mL)洗涤树脂。使用Ellman测试来证实游离硫醇的存在(Ellman，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77(1959)；Badyal等，Tetrahedron Lett.42：8531-33(2001))。

实施例9-经由方法A进行环化

使游离硫醇官能化树脂3在DMF(3mL)中膨胀，随后加入适当的碱且使用Ellman测试在表3中所示的条件下监测反应。反应是在25℃下进行。

表3.利用3的迈克尔加成反应的树脂上环化条件.

碱	当量	反应时间(小时)	针对硫醇的Ellman测试
				三乙胺	5	16	弱阳性
二异丙基乙胺	5	16	弱阳性
				正丁胺	5	16	阴性
DBU	5	12	阴性

实施例10-经由方法B进行的环化

使游离硫醇官能化树脂4在DMF(3mL)中膨胀，随后加入适当的碱且使用Ellman测试在表4中所示的条件下监测反应。反应是在25℃下进行。

表4.利用4的取代反应的树脂上环化条件.

碱	当量	反应时间	针对硫醇的Ellman测试
				三乙胺	5	30分钟	弱阳性
N,N-二-异丙基乙胺	5	30分钟	弱阳性
				正丁胺	5	2小时	阴性

DBU

5

10分钟

阴性

实施例11-一般脱保护和裂解

使经过干燥的树脂结合环化肽悬浮于3.8ml裂解混合物(TFA/H₂O/TIPS；95％/2.5％/2.5％；体积/体积/体积)中且轻轻搅拌2小时。过滤裂解混合物且用TFA(2×1ml)洗涤树脂。丢弃树脂且使用旋转蒸发器浓缩滤液。向浓缩过的滤液中缓慢加入冷乙醚(5mL)且利用离心(5,000g，5分钟)分离所得沉淀物。倾析出上清液且用乙醚(2×5mL)洗涤沉淀物，在每次洗涤之后随后使用离心(5,000g，5分钟)进行分离。将剩余固体溶解于0.1％TFA/水(体积/体积)与乙腈的混合物中。将这种粗肽溶液冷冻且冻干，得到粗环化肽。

实施例12Mdm2融合蛋白的表达和纯化

通过在42℃下在含有含His₆标签化Mdm2_25-117融合蛋白的pET-14B载体的培养基中使细菌热休克30秒使胜任的BL21DE3pLySS大肠杆菌细胞转型。使细胞在含氨苄青霉素的琼脂板(50mg/mL)上生长，且在37℃下使用单一培养物接种含氨苄青霉素(50mg/mL)的LB培养基的100mL过夜培养物。利用25mL过夜培养物接种500mL极品肉汤(4L烧瓶)且在30℃下孵育5小时(紫外线吸收＝1,600nm)，随后利用0.4mM IPTG诱导蛋白质表达。在30℃下将烧瓶再孵育4.5小时。通过在3700g下离心45分钟来收集细胞且丢弃上清液。使细胞再悬浮于50mL结合缓冲液(5mM NaH₂PO₄、30mMNaCl、0.5mM咪唑及0.2mM BME、

蛋白酶抑制剂混合物，pH7.9)中，且通过在冰中进行超声处理使其溶解(8×15秒脉冲，30分钟)。在4℃下在3700g下将细胞再离心40分钟，且允许含有所希望的Mdm2融合蛋白的所得上清液在4℃下在振荡下结合镍珠2小时。利用洗提缓冲液(5mM NaH₂PO₄、30mM NaCl、25mM咪唑及0.2mM BME)从珠粒上洗提蛋白质。使用

Ultra离心过滤器(3kD截止值)来浓缩蛋白质且通过SDS-PAGE分析加以表征。

实施例13-蛋白结合研究

使用基于荧光偏振的竞争性结合测定，利用经荧光素标记的p53肽(fl-p53)来确定肽对N末端His₆标签化Mdm2_25-117的相对亲和力。利用DTX880多模式检测器(Beckman)在25℃下进行偏振实验，其中激发波长和发射波长分别是485nm和525nm。所有样品都是在96孔板中在含0.1％Pluronic F-68(Sigma)的透析缓冲液中制备。针对各肽所报告的结合亲和力(KD)值是三次个别实验的平均值，并且是通过在GraphPad Prism4.0上拟合实验数据与S形剂量反应非线性回归模型来确定。Mdm2蛋白质的浓度是利用280nm处的UV吸收度来确定。

在竞争实验之前，通过监测荧光探针结合Mdm2_25-117时的偏振来确定fl-p53对Mdm2_25-117的亲和力(图7)。向fl-p53于Mdm2_25-117透析缓冲液中的15nM溶液中加入递增浓度(0nm到4μM)的Mdm2_25-117蛋白，得到了图7中所示的饱和结合曲线。将获自这个结合曲线的IC₅₀值拟合到方程式(1)中以计算p53/Mdm2复合物的解离常数(K_D1)(Roehrl等，Biochemistry43：16056-66(2004))。

K_D1＝(R_T*(1-F_SB)+L_ST*F_SB ²)/F_SB-L_ST(1)

其中：

R_T＝Mdm2蛋白的总浓度

L_ST＝p53荧光肽的总浓度

F_SB＝已结合的p53荧光肽的分数

确定fl-p53的K_D1为129±38nM。对于竞争实验来说，将适当浓度(10nm到100μM)的teHBS或HBS肽模拟物加入到300nMMdm2和15nM FluP53的溶液中。在25℃下将所得混合物孵育60分钟，随后利用偏振来测量fl-p53的解离度。将IC₅₀拟合到方程式(2)中以计算teHBS1和HBS2的K_D2值(Roehrl等，Biochemistry43：16056-66(2004)，所述文献以全文引用的方式合并在此)。

K_D2＝K_D1*F_SB*((L_T/L_ST*F_SB ²-(K_D1+L_ST+R_T)*F_SB+R_T))-1/(1-F_SB)) (2)

其中：

K_D1＝荧光探针fl-p53的K_D

R_T＝Mdm2蛋白的总浓度

L_T＝HBS肽的总浓度

L_ST＝p53荧光肽的总浓度

F_SB＝已结合的p53荧光肽的分数

实施例14-CD光谱

使用1mm长细胞和5nm/min扫描速度在配备有温度控制器的AVIV202SF CD光谱仪上记录CD光谱。所述光谱是对10次扫描求取平均值，从与样品类似的条件中减去基线。所述样品是在含10％三氟乙醇的0.1×磷酸盐缓冲盐水(13.7mM NaCl、1mM磷酸盐、0.27mM KCl，pH7.4)中制备，最终肽浓度为50μM。利用在6.0M盐酸胍水溶液中在275nm处的酪氨酸残基的紫外线吸收来确定展开肽的浓度。由222nm处的平均残基CD确定各肽的螺旋含量，针对氨基酸数目修正[θ]₂₂₂(°cm²·dmol^-1)。由比率[θ]₂₂₂/[θ]_max计算螺旋性百分比，其中k＝4.0且n＝肽中的氨基酸残基数目时，[θ]_max＝(-44000+250T)(1-k/n)＝-23,400(Luo和Baldwin，Biochemistry36：8413-21(1997)；Shepherd等，J. Am.Chem.Soc′y127：2974-83(2005)；Wang等，J. Am.Chem.Soc′y128：9248-56(2006))。

实施例15-2D NMR光谱

所有实验都是在BrukerAVANCE500MHz光谱仪上在25℃下进行。通过将2mg肽溶解于400μL PBS缓冲液(pH3.5)和100μLTFE-d₃中来制备teHBS1的样品。通过加入1M HCl将溶液的pH值调节到3.5。采用1D质子光谱或2D TOCSY光谱(当重叠严重时)来读取酰胺质子的化学位移。利用3919Watergate脉冲序列实现溶剂抑制。所有2D光谱都是通过在States-TPPI模式下对t1域中的64次扫描和128个增量求取平均值，通过收集t2域中的4092个复杂数据点来进行记录。所有TOCSY实验都是利用80ms混合时间在6000Hz旋转锁频率下进行，且所有NOESY都是利用300ms混合时间进行。使用Bruker TOPSPIN程序处理并分析数据。将原始自由感应衰减(FID)填零以获得2048×2048个实际数据点的最终矩阵。在两个维度上都应用90°正弦平方窗口函数。

实施例1-15的讨论

研究使用硫醚键合(图1中的teHBS)作为传统HBS的所有烃键合的替代物。若干种肽环化策略已经开发出了使用对卤代伯烷进行亲核取代的硫醚形成(Roberts等，Tetrahedron Lett.39：8357-60(1998)；Lung等，Lett.Peptide Sci.6：45-49(1999)；Roberts和Ede，J. Peptide Sci.13：811-21(2007)；Brunel和Dawson，Chem.Comm.20：2552-54(2005))。设想取代反应或共轭加成反应将提供获得teHBS螺旋的简便方法。影响这些反应所需的条件是温和的，且已经显示所得硫醚键合在生物系统中是稳定的(Tugyi等，J. Peptide Sci.11：642-49(2005))。在本文中，描述了模拟p53活化域的teHBSα螺旋的有效合成。利用圆二色性光谱和2D NMR光谱检查teHBS p53螺旋在水性缓冲液中的溶液构形，且利用荧光偏振竞争测定研究它针对标靶Mdm2的潜力。实施例12-15中所描述的研究表明，硫醚键合使螺旋构形成核且靶向蛋白质受体以及烃系统。

teHBS1，作为先前所报告的HBS螺旋的类似物(“HBS2”(Patgiri等，Acc.Chem.Res.41：1289-300(2008)；美国专利第7,202,332号))，旨在比较两种系统的螺旋性和蛋白结合能力(表5)。HBS2模拟p53活化域且已经显示以高亲和力和选择性靶向Mdm2(Henchey等，ChemBiochem11：2104-07(2010))。p53与Mdm2的相互作用密切涉及调节程序性细胞死亡的关键过程(Joerger和Fersht，Annu.Rev.Biochem.77：557-82(2008))。已经利用若干种不同类型的合成抑制剂来靶向这种复合物(Murray和Gellman，Biopolymers88：657-86(2007)；Gemperli等，J.Am.Chem.Soc′y127：1596-97(2005)；Bemal等，J.Am.Chem.Soc′y129：2456-57(2007)；Lee等，J.Am.Chem.Soc′y133：676-79(2011)；Shangary和Wang，Clin.CancerRes.14：5318-24(2008)；Campbell等，Org.Biomol.Chem.8：2344-51(2010)；Yin等，Angew.Chem.Int′lEd.44：2704-07(2005))，从而使它成了用于抑制剂设计的模型蛋白质-蛋白质相互作用。

表5.HBS和teHBS p53螺旋的生物物理学数据的汇总.

^aX分别表示HBS和teHBS大环中的戊烯酸和硫代丙酸残基。

^b从圆二色性光谱研究获得的值。

^c得自于荧光偏振竞争测定。

如图8中所示，评估用于teHBSα螺旋固相合成的两种不同的方法：迈克尔加成反应(方法A)和亲核取代法(方法B)。如实施例1-7中所描述来合成前体肽3和4。与肽3和4以及模型四肽序列一起测试各种碱和溶剂，以确定最佳环化条件。举例来说，在独立的反应容器中用5当量三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、正丁胺或DBU在DMF中处理肽3或4，且使用定性树脂上Ellman测试周期性地监测各反应(Ellman，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77(1959)；Badyal等，TerrahedronLett.42：8531-33(2001))。12小时之后，仅DBU催化的反应指示3完全消耗硫醇；然而，粗反应物的HPLC迹线显示复杂的产物混合物(图8)。对于方法B和肽4，再次观察到DBU是最有效的碱。在这种情况下，HPLC和质谱分析指示所希望的产物的产率得到了显著提高。

鉴别出有效的合成方法之后，利用NMR和圆二色性光谱检查teHBS1的构形。在含10％三氟乙醇的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行圆二色性研究。如对于典型α螺旋所希望，在208nm和222nm附近观测到双最小值且在190nm附近观测到最大值(图9)。在222nm处，利用平均残基椭圆率估计teHBS1的螺旋性百分比为54％，但所述评定典型地低估了短肽的螺旋含量(Wang等，J.Am.Chem.Soc.128：9248-56(2006)；Shepherd等，J.Am.Chem.Soc.127：2974-83(2005)；Chin等，Proc.Nat′lAcad. Sci.USA99：15416-21(2002))。显然，teHBS1的CD谱指示它与HBS2具有相似的构形稳定性(图9)。HBS2的螺旋含量经计算为48％。

接下来利用NMR光谱获得原子水平的肽构形的详细分析。初始1D¹H NMR光谱是在含5％d₆-DMSO(用以实现溶解)的d₃-ACN中获取。在这种溶液中观测到两组NMR峰，如图10中所示。当仅在d₆-DMSO中获取光谱时，观测到单组峰，如图11中所示，表明d₃-ACN/d₆-DMSO中存在两种缓慢平衡构形异构体或肽聚集。在含20％三氟乙醇(TFE)的1mM PBS(pH3.5)中，再次观测到两种构形异构体，其中主要构形异构体以10：1的比率存在。对在这种溶液中获得的NMR光谱的分析集中于主要构形异构体。

teHBS1的2D TOCSY和NOESY光谱使得能够完全指定指纹区。对于teHBS1，观测到连续NN个(i和i+1)NOESY交叉峰，即螺旋结构标记，如NOESY相关图(参见图12C)中所示，但光谱重叠妨碍了一些关键交叉峰的指定。NOESY光谱还显示了若干个不连续中程NOE，例如dαN(i，i+3)和dαN(i，i+4)，从而提供了螺旋结构的真凭实据(图12A-B)(KENT

NMR OF PROTEINS ANDNUCLEIC ACIDS(1986))。³J_NHCHα偶合常数提供了φ角的量度标准且提供了关于肽和蛋白质中的局部构形的详尽细节(KENT

NMR OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS(1986))。对于α螺旋，³J_NHCHα值典型地介于4Hz与6Hz之间的范围内

且这个范围内的三个或更多个偶合常数系列指示α螺旋结构(KENT

NMR OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS(1986))。如表6中所示，除Q1、F4、S5和S12以外，³J_NHCHα偶合常数和计算φ角与α螺旋的期望值一致。尽管F4和S5的较大值有点反常，但Q1的值不出所料，因为它位于大环内。S12的φ角表明C末端附近的挠性较大。

表6.³J_NHαCH偶合常数和计算的φ角度.

^aJ值(Hz)。

^b使用Karplus方程式计算。

^c得自于由于298K下存在重叠共振而在313K下获取的1D¹HNMR光谱的偶合常数。

CD和NMR数据表明，硫醚氢键替代物可以有效地使所连接的肽序列中的螺旋构形成核。为了确定硫醚键合不干扰这些人造螺旋靶向它们的同源蛋白质受体的能力，在荧光偏振竞争测定中比较teHBS1与HBS2结合Mdm2的能力(图13)(Henchey等，C力emBiochem11：2104-07(2010))。发现两种人造螺旋以类似亲和力靶向Mdm2；teHBS1和HBS2的计算K_d值分别是224±20和232±34nM。

除非另外指出，否则本文中的盐(任选地为药学上可接受的盐)包括例如本文化合物中所存在的酸性或碱性基团的盐。举例来说，酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟碱酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、丁二酸盐、顺丁烯二酸盐、龙胆酸盐、反丁烯二酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、葡糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(例如1，1′-亚甲基双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。本文中的某些化合物可以与各种氨基酸(包括本文中所公开的任何氨基酸)形成药学上可接受的盐。合适的碱盐包括但不限于铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐及二乙醇胺盐。关于药学上可接受的盐的综述，参见BERGE等，66J.PHARM.SCI.1-19(1977)。

尽管本文中已经描绘和描述了优选实施方案，但相关领域技术人员应显而易见，可以在不背离本发明精神的情况下进行各种修改、添加、替代等等，且这些因此被视为处于如所附权利要求书所定义的本发明范围内。

Claims

1.一种肽模拟物或其盐，其具有稳定的内部受约束的蛋白质二级结构，所述蛋白质二级结构包含硫醚、醚或烷基胺连接的氢键替代物。

2.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是从由以下各项组成的群组中选出：α螺旋、3₁₀螺旋、π螺旋、短杆菌肽螺旋、β片大环以及β发夹。

3.根据权利要求2所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是α螺旋。

4.根据权利要求2所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是3₁₀螺旋。

5.根据权利要求2所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是π螺旋。

6.根据权利要求2所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是短杆菌肽螺旋。

7.根据权利要求2所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是β片大环。

8.根据权利要求2所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构是β发夹。

9.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构包含醚连接的氢键替代物。

10.根据权利要求9所述的肽模拟物或其盐，其中所述醚连接的氢键替代物具有以下部分：

11.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构包含硫醚连接的氢键替代物。

12.根据权利要求11所述的肽模拟物或其盐，其中所述硫醚连接的氢键替代物具有以下部分：

13.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述蛋白质二级结构包含烷基胺连接的氢键替代物。

14.根据权利要求13所述的肽模拟物或其盐，其中所述烷基胺连接的氢键替代物具有以下部分：

15.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述肽模拟物是式I化合物：

其中：

B为O、S或NR¹；

其中：

m′为零或任何数字；

其中：

m″为零或任何数字；

m、n′以及n″各自独立地为零、一、二、三或四，其中m、n′与n″的总和为二到六。

16.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中B为O。

17.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中B为S。

18.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中B为NR¹。

19.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中m、n′与n″的总和为2。

20.根据权利要求19所述的肽模拟物或其盐，其中m为0，且n′与n″的总和为2。

21.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中m、n′与n″的总和为3。

22.根据权利要求21所述的肽模拟物或其盐，其中m为1，且n′与n″的总和为2。

23.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中m、n′与n″的总和为4。

24.根据权利要求23所述的肽模拟物或其盐，其中m为2，且n′与n″的总和为2。

25.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中m、n′与n″的总和为6。

26.根据权利要求25所述的肽模拟物或其盐，其中m为4，且n′与n″的总和为2。

27.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中所述肽模拟物是式IA化合物：

28.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中所述肽模拟物是式IB化合物：

29.根据权利要求15所述的肽模拟物或其盐，其中所述肽模拟物是式IC化合物：

30.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述肽模拟物是式IIA化合物：

其中：

各B独立地为O、S或NR¹；

其中：

m′为零或任何数字；

其中：

m″为零或任何数字；

各m独立地为零、一、二、三或四。

31.根据权利要求30所述的肽模拟物或其盐，其中B为O。

32.根据权利要求30所述的肽模拟物或其盐，其中B为S。

33.根据权利要求30所述的肽模拟物或其盐，其中B为NR¹。

34.根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐，其中所述肽模拟物是式IIB化合物：

其中：

各B独立地为O、S或NR¹；

各R₂为氢；烷基；烯基；炔基；环烷基；杂环基；芳基；杂芳基；芳基烷基；氨基酸；肽；靶向部分；标签；-OR⁵，其中R⁵为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；-(CH₂)_0-1N(R⁵)₂，其中各R⁵独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基、酰基、肽、靶向部分或标签；或具有下式的部分：

其中：

m′为零或任何数字；

其中：

m″为零或任何数字；

各m独立地为零、一、二、三或四。

35.根据权利要求34所述的肽模拟物或其盐，其中B为O。

36.根据权利要求34所述的肽模拟物或其盐，其中B为S。

37.根据权利要求34所述的肽模拟物或其盐，其中B为NR¹。

38.一种制备式IA化合物或其盐的方法：

其中：

B为O、S或NR¹；

m″为零或任何数字；且

m、n′以及n″各自独立地为零、一、二、三或四，其中m、n′以及n″的总和为二到六；

所述方法包括：

提供式III化合物：

其中：

各AA独立地为具有下式的部分：

其中各PG²独立地不存在或为用于保护它所连接的R¹的保护基；

各AA′独立地为具有下式的部分：

其中各PG²独立地不存在或为用于保护它所连接的R¹的保护基：

D为NR¹或O；

LG³不存在、为固相合成表面、烷基/芳基酯或烷基/芳基酰胺；且

Y为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基或固相合成表面；以及

使所述式III化合物在可有效产生式IA化合物的条件下反应。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述提供式III化合物包括：

提供式IV化合物：

其中：

如果B为O，则PG⁴是用于保护醇的保护基，如果B为S，则是用于保护硫醇的保护基，且如果B为NR⁴，则是用于保护胺的保护基；且

Z为CR¹ ₂＝CR⁴-或X-CR¹ ₂-(CR⁴ ₂)_n″-，其中X为卤素；以及

使所述式IV化合物与碱在可有效产生式III化合物的条件下反应。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述提供式IV化合物包括：

提供式V化合物：

其中PG¹是用于保护胺的保护基；

提供式VI化合物：

其中LG¹是羧基活化基或卤化物；以及

使所述式V化合物与所述式VI化合物在可有效产生式IV化合物的条件下反应。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述提供式V化合物包括：

提供式VII化合物：

提供一种或多种式VIII′化合物：

PG¹-AA′-LG¹VIII′，

其中LG¹是羧基活化基或卤化物；以及

使所述式VII化合物与所述一种或多种式VIII′化合物在可有效产生式V化合物的条件下反应。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述提供式VII化合物包括：

(i)提供式IX化合物：

PG¹-[AA]_m″-D-Y-LG³IX，

其中PG¹是用于保护胺的保护基；

或提供式X化合物：

PG³-D-Y-LG³X，

其中如果D为NR¹，则PG³是用于保护胺的保护基，且如果D为O，则是用于保护醇的保护基；

(ii)提供式XI化合物：

(iii)任选地提供式XII化合物：

其中LG¹是羧基活化基或卤化物且LG²是离去基；以及

(iv)使所述式IX化合物或所述式X化合物与所述式XI化合物和任选所述式XII化合物在可有效产生式VII化合物的条件下反应。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述提供式IX化合物包括：

提供式X化合物；

提供一种或多种式VIII化合物：

PG¹-AA-LG¹ VIII，

其中LG¹是羧基活化基或卤化物；以及

使所述式X化合物与所述一种或多种式VIII化合物在可有效产生式IX化合物的条件下反应。

44.一种制备以下化合物方法：式IB化合物或其盐：

其中

B为O、S或NR¹；

m′和m″独立地为零或任何数字；且

m、n′以及n″各自独立地为零、一、二、三或四，其中m、n′与n″的总和为二到六；

或式IC化合物：

其中

B为O、S或NR¹；

m′为零或任何数字；且

所述方法包括：

(i)提供式III′化合物：

其中：

各AA独立地为具有下式的部分：

各AA′独立地为具有下式的部分：

D为NR¹或O；

LG³不存在、为固相合成表面、烷基/芳基酯或烷基/芳基酰胺；

如果D为NR¹，则PG³是用于保护胺的保护基，且如果D为O，则是用于保护醇的保护基；且

Y为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、芳基烷基或固相合成表面；

或式XIII化合物：

其中：

各AA独立地为具有下式的部分：

各AA′独立地为具有下式的部分：

D为NR¹或O；

PG¹是用于保护胺的保护基；

各PG²独立地不存在或为用于保护它所连接的且不同于PG²的R¹的保护基；且

(ii)使所述式III′化合物或所述式XIII′化合物在可有效产生式IB化合物或式IC化合物的条件下反应。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述提供式XIII化合物包括：

提供式III′化合物；

提供一种或多种式VIII化合物：

PG¹-AA-LG¹ VIII，

其中LG¹是羧基活化基或卤化物；以及

使所述式III′化合物与所述一种或多种式VIII化合物在可有效产生式XIII′化合物的条件下反应。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述提供式III′化合物包括：

提供式IV′化合物：

其中：

LG²是离去基；且

如果B为O，则PG⁴是用于保护醇的保护基，如果B为S，则是用于保护硫醇的保护基，且如果B为NR⁴，则是用于保护胺的保护基；以及

使所述式IV′化合物与碱在可有效产生式III′化合物的条件下反应。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述提供式IV′化合物包括：

提供式V化合物：

其中PG¹是用于保护胺的保护基；

提供式XIV化合物：

以及

使所述式V化合物与所述式XIV化合物在可有效产生式IV′化合物的条件下反应。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述提供式V化合物包括：

提供式VII化合物：

提供一种或多种式VIII′化合物：

PG¹-AA′-LG¹ VIII′，

其中LG¹是羧基活化基或卤化物；以及

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述提供式VII化合物包括：

(i)提供式IX化合物：

PG¹-[AA]_m″-D-Y-LG³IX，

其中PG¹是用于保护胺的保护基；

或提供式X化合物：

PG³-D-Y-LG³X，

(ii)提供式XI化合物：

(iii)任选地提供式XII化合物：

其中LG¹是羧基活化基或卤化物且LG²是离去基；以及

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述提供式IX化合物包括：

提供式X化合物；

提供一种或多种式VIII化合物：

PG¹-AA-LG¹ VIII，

其中LG¹是羧基活化基或卤化物；以及

51.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐。

52.根据权利要求51所述的组合物，其还包含赋形剂或媒剂。

53.一种制备组合物的方法，其包括合并至少一种根据权利要求1所述的肽模拟物或其盐与赋形剂或媒剂。

54.一种用于促进细胞死亡的方法，其包括使细胞与完全或部分抑制p53/hDM2的一种或多种根据权利要求1所述的化合物或其盐在所述一种或多种化合物或其盐可有效促进细胞死亡的条件下接触。