WO2013118502A1 - Ｄｄｓカプセル用タンパク質およびそれを用いた薬剤とその調整方法 - Google Patents

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隆 乾
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/99—Other intramolecular oxidoreductases (5.3.99)
    • C12Y503/99002—Prostaglandin-D synthase (5.3.99.2)

Definitions

  • the present invention relates to a drug transporter that selectively transports a poorly water-soluble drug to a target place, site, or cell in a living body.
  • Pharmaceutical candidate compounds that act on target receptors discovered by genome drug discovery research generally have a large molecular weight and low solubility in water.
  • many of the currently used drugs are highly hydrophobic and poorly water-soluble.
  • water solubility is increased by chemical modification methods, drug activity is often reduced. If a poorly water-soluble drug having high drug activity can be efficiently transported to the diseased part, clinical application examples of the poorly water-soluble drug can be expanded, and the drug solubility problem that has been difficult for pharmaceutical companies can be solved.
  • DDS drug delivery system
  • Patent Document 1 discloses a complex including a target binding component, a cavity forming component, and a pharmacological compound, wherein the pharmacological compound is present in the cavity of the cavity forming component.
  • the use of the complex disclosed herein is a protein having a cavity that specifically binds to a target such as a receptor expressed by a subject (in particular, NGF family, interleukin, GM-CSF, EGF, FGF, barnase). , T4 lysozyme, TGFb, IgG, etc.), and a drug that can actually be occluded is selected from drugs having a drug effect on the subject in the cavity.
  • NGF neuroblastoma
  • the target overexpressed is the trkA receptor
  • NGF is shown as a protein having a target binding component and a cavity-forming component. No concept is disclosed, and the concept of what is stored and how NGF is occluded is merely shown.
  • Patent Document 2 shows that the lipocalin family, which is a biological product, dissolves poorly water-soluble drugs and can be used as DDS. Since such a lipocalin family is a biologically produced substance, there are no problems with respect to toxicity and rejection (allergic reaction, etc.). Therefore, the safety required for the DDS can be easily cleared.
  • Patent Document 3 further provides a protein in which a binding moiety to a target is linked to the N-terminal or C-terminal of lipocalin-type prostaglandin D synthase. As a result, the binding specificity to the target can be imparted, so that the application to DDS is further favorable.
  • the lipocalin family has a pocket due to its barrel structure, which is like a cup.
  • a sparingly water-soluble medicine can be stored here.
  • a plurality of molecular units can be accommodated.
  • the pocket formed by the barrel structure is always open, and there is a risk of spilling the drug contained during transfer.
  • the present invention has been conceived in view of the above problems, and when a lipocalin family is used as a capsule for DDS, a drug is stored in a pocket formed of a barrel structure, and then the opening of the pocket is disulfide bonded. It can be closed by (SS bond). That is, a drug release control function was given to the DDS capsule.
  • a protein for DDS capsules characterized in that the lipocalin-type prostaglandin D synthase enzyme activity is inactivated and the 34th and 92nd tryptophans from the N-terminus are replaced with cysteine.
  • Lipocalin-type prostaglandin D synthase is a substance produced in the body, and can easily overcome problems generally associated with DDS such as rejection (allergic reaction, etc.) and toxicity.
  • the amino acid sequence has already been analyzed, and can be easily produced by carrying out recombinant synthesis including the target binding site for the target.
  • the present invention enables the pocket formed by the barrel structure to be closed and opened, so that there is little loss in drug delivery, and accurate drug administration to the target site is also possible.
  • the drug carrier of the present invention has a molecule-selective recognition function and can give a new direction in the field of drug development as a “nanocarrier protein” that targets cancer tissues.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing a three-dimensional structure of an L-PGDS mutant and showing a state of opening and closing of an inlet of a barrel structure. It is a figure which shows the result of electrophoresis.
  • FIG. 3 is a diagram showing the yield of each fraction when an L-PGDS mutant is purified. It is a figure showing the absorption characteristic before and after lyophilization
  • FIG. 3 is a graph showing the effect on drug efficacy when L-PGDS holding a drug is lyophilized and thawed again.
  • the lipocalin protein belonging to the lipocalin family is a protein having 140 to 200 amino acid residues and a molecular weight of about 20,000. Moreover, it is known that the structural similarity is very high even though the homology of amino acid sequences is about 20%.
  • the lipocalin family members include retinol binding protein, major urine protein, villin binding protein, ⁇ -lactoglobulin, lobster crustocyanin, odorant binding protein and the like.
  • lipocalin proteins are composed of eight antiparallel ⁇ strands that are continuously hydrogen-bonded, and have a barrel shape surrounding a hydrophobic low-molecular (ligand) binding portion. Seven loops connecting eight ⁇ -strands are six short hairpins and one omega loop, and this omega loop is considered to serve as a lid for the ligand binding part. It also has one ⁇ helix. That is, the structural similarity of these lipocalin families is that they have a ⁇ barrel structure consisting of 8 ⁇ strands, one omega loop, and one ⁇ helix.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the crystal structure of lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS). It has a ⁇ barrel structure (11 to 18) consisting of eight ⁇ strands, one ⁇ helix (19), and one omega loop (H2 helix) (20).
  • L-PGDS lipocalin-type prostaglandin D synthase
  • L-PGDS is an enzyme that synthesizes PGD 2 using PGH 2 synthesized from arachidonic acid as a substrate by the action of cyclooxygenase.
  • PGD 2 In the central nervous system, PGD 2 exhibits actions such as sleep induction, hypothermia, suppression of lutein hormone secretion, and regulation of pain and odor responses.
  • PGD 2 In peripheral nerves, PGD 2 is released from mast cells as an allergic mediator, It is a substance that exhibits actions such as bronchoconstriction and inhibition of platelet aggregation.
  • L-PGDS also belongs to the lipocalin family, and since the pocket portion formed by the ⁇ barrel structure composed of 8 ⁇ strands has a structure in which a hydrophobic amino acid is arranged inside, it is poorly water-soluble. By storing a sex drug in this pocket, it can be dissolved in water.
  • PNC Protein Nano Capsule
  • L-PGDS is an enzyme in the first place, it is necessary to deactivate the enzyme activity when used as DDS.
  • the 45th cysteine (active center) from the N-terminus is substituted with alanine to deactivate the enzyme activity.
  • the entrance portion of the pocket formed by the barrel structure can be opened and closed. More specifically, in L-PGDS, the 34th and 92nd Trp (tryptophan) residues from the N-terminus are replaced with Cys (cysteine) residues. Cys residues form disulfide bonds as is well known.
  • the disulfide bond is generated when the thiol group portion of cysteine is oxidized. Further, the disulfide bond is cleaved by a reducing agent such as dithiothreitol or mercaptoethanol. That is, after storing a drug in a pocket formed of a barrel structure, the pocket is closed by exposing it to an oxidizing atmosphere to form a drug carrier.
  • a reducing agent such as dithiothreitol or mercaptoethanol
  • FIG. 2 shows predicted views of L-PGDS in which the 34th and 92nd Trp (tryptophan) residues from the N-terminus are replaced with Cys (cysteine) residues and the pocket entrance is open and closed. .
  • L-PGDS is a protein
  • the quality degradation proceeds relatively easily.
  • the lyophilization process is performed after storing the drug in the L-PGDS as described above. It is well known that lyophilization can preserve proteins for a relatively long period of time. Accordingly, it was confirmed whether or not the drug was effective even after the medicine was stored (see Example 2 described later).
  • the L-PGDS after storing the drug returns to the L-PGDS containing the original drug by thawing after lyophilization and storage, and before the lyophilization. It was confirmed that the same drug effect was exhibited.
  • the target binding part may be formed at the N-terminal or C-terminal.
  • the target binding part can be designed according to the target.
  • a peptide sequence NGR (Asn-Gly-Arg) that specifically binds to a membrane protein (CD13) expressed in neovascular endothelial cells
  • an isoAsp-Gly-Arg (isoDGR) motif that recognizes ⁇ v ⁇ 3 integrin may be introduced into the N-terminus or C-terminus of L-PGDS by genetic recombination.
  • Lys-Leu-Pro (KLP) -motif (Cancer Res, 97, 1075-81, 2006) that recognizes peritoneal tumors of gastric cancer, Asn-Val-Val-Arg-Gln that recognizes metastatic cancer cells (NVVRQ) motif (Clin Cancer Res, 14, 5494-502, 2008), Phe-Gln-His-Pro-Ser-Phe-Ile (FQHPSFI) motif (Mol Med, 13, 246-54) that recognizes liver cancer cells , 2007) etc. can also be used suitably.
  • This target binding part is preferably introduced at the end of the lipocalin type prostaglandin D synthase part which is the main body. Further, the N-terminal is more preferable because it is easier to produce a recombinant.
  • Example 1 ⁇ Preparation of L-PGDS mutant having disulfide bond>
  • Purification of a protein capsule having a disulfide bond (Protein Nano Capsule: PNC) produced a transformed clone of E. coli and produced it in large quantities.
  • the vector used for transformation is a plasmid prepared by introducing a lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) base sequence into pGEX-4T-2, a GST fusion protein expression vector, and a double primer PCR method is used. It was made using.
  • Table 1 shows the base sequence of the lipocalion type prostaglandin D synthase (L-PGDS) having a disulfide bond (sequence 1).
  • NGR which is a target binding site for cancer
  • GS is added to the N terminal for convenience of synthesis.
  • the 37th and 95th codes are replaced with TGC encoding cysteine from TGG which is a base sequence encoding Trp residue.
  • the 48th cysteine (active center) from the N-terminus was replaced with Ala (alanine) to inactivate the enzyme activity.
  • Table 2 also shows the base sequence (sequence 2). In addition, square frames are shown at the 37th, 48th and 95th positions.
  • Tables 3 and 4 show the amino acid sequence and base sequence of a lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) that has a disulfide bond and has no target binding moiety.
  • L-PGDS lipocalin-type prostaglandin D synthase
  • the cysteine introduced with a disulfide bond is the 34th and 92nd positions from the N-terminus
  • the alanine for inactivating the enzyme activity is the 45th position.
  • Target binding sites other than NGR shown in Tables 1 and 2 can be added to the N-terminus and C-terminus of Tables 3 and 4.
  • a mutation can be specifically introduced into the template plasmid by designing two types of primers containing mutations complementary to the double-stranded template plasmid and performing PCR.
  • the base sequence encoding the 37th and 95th Trp residues of L-PGDS is TGG, and a primer for substituting this portion with TGC encoding the Cys residue was designed and PCR was performed. Sequence analysis of the amplified PCR product was performed to confirm substitution of Trp37 and Trp95 with Cys residues.
  • Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) strain was transformed with the obtained vector and cultured while inducing the expression of GST fusion protein according to a conventional method (for example, Patent Document 2).
  • L-PGDS is produced in a form fused with GST.
  • Escherichia coli was added 10 mM of Lysis buffer (10 mM disodium hydrogen phosphate, 1.8 mM dipotassium hydrogen phosphate, 140 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, pH, supplemented with 0.5 mM Phenylmethylsulfide Fluoride (WAKO). 7.5) was crushed by ultrasonic treatment (ULTRASONIC DISUPRTOR, TOMY SEIKO).
  • the E. coli disruption solution was applied to a column packed with Glutathione Sepharose 4B to adsorb the fusion protein.
  • the target protein was cleaved with Thrombin, and the eluate was subjected to gel filtration chromatography in the presence of DTT as a reducing agent to purify the target protein.
  • the target protein is an L-PGDS mutant, it is hereinafter referred to as PNC.
  • Fig. 3 shows the results of SDS PAGE (15% W / V) analysis of the purified PNC.
  • the left A lane is a control.
  • the right lane B is the PNC (L-PGDS mutant) after generation.
  • a single band was confirmed around 19 kDa, which is the estimated molecular weight of PNC.
  • the reducing agent DTT was removed by dialysis, and free thiol was quantified using the DTNB method.
  • the DTNB method utilizes the fact that 5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) becomes 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) when reacted with the SH group of the protein. This is a method for quantifying SH groups. Since TNB absorbs at a wavelength of 412 nm, it can be easily quantitatively analyzed.
  • each PNC fraction was treated with an excess amount of oxidized glutathione (20 mM).
  • oxidized glutathione was mixed with 10 ⁇ M PNC solution (pH 7.4) of each fraction to a final concentration of 20 mM, and allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 12 hours. Thereafter, free thiol groups were quantified by the DTNB method. The results are shown in Table 6. It was confirmed that disulfide bridges were formed in all PNC fractions. This indicates that the opening portion of the L-PGDS is closed by the SS bond as shown in FIG.
  • the L-PGDS mutant according to the present invention can open and close the opening portion by oxidation and reduction, and has a function of holding and releasing the medicine contained in the barrel structure. It can be said.
  • Example 2 Next, it was confirmed that the effect was not reduced even when the drug was stored in L-PGDS, freeze-dried, and thawed again.
  • Diazepam is a poorly water-soluble drug. When this is administered directly (control) orally, it is stored in L-PGDS and orally administered to mice, and further stored in L-PGDS, freeze-dried, thawed again, and orally administered to mice. Were examined for pentobarbital-induced anesthesia time. When diazepam is effective, anesthesia time is prolonged, and the effect can be evaluated by comparing the cases with and without L-PGDS.
  • DZP diazepam
  • PBS phosphate buffer
  • L-PGDS and DZP / L-PGDS complex were lyophilized with liquid nitrogen for 5 hours. L-PGDS and DZP / L-PGDS complex were completely dried after 5 hours of freeze-drying.
  • L-PGDS and DZP / L-PGDS complex were completely lyophilized with liquid nitrogen and then thawed again. Absorption spectra of remelted L-PGDS and DZP / L-PGDS complex were measured. FIG. 5 shows the result.
  • the horizontal axis represents wavelength
  • the vertical axis represents absorption.
  • FIG. 6 shows the measurement result of the CD spectrum.
  • the horizontal axis is the wavelength, and the vertical axis is the molar ellipticity ⁇ .
  • FIG. 6 shows the CD spectra of L-PGDS and DZP / L-PGDS complex before lyophilization and after lyophilization, but the four samples were indistinguishable.
  • FIG. 7 shows the result.
  • the horizontal axis indicates the type of administration agent.
  • the vertical axis is anesthesia time.
  • the PNC of the present invention can be suitably used for DDS, and can also be used as a reagent for reaction by oxidation or reduction.

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Abstract

　リポカリンファミリーはバレル構造によってポケットを有しており、いわばコップのような形状をしている。ここに、難水溶性の薬剤を収納することができる。しかも、薬剤によっては、複数個の分子単位を収納することができる。しかしながら、バレル構造によって形成されたポケットは、常に開口しており、移送の途中で内在させた薬物がこぼれてしまうおそれがある。　リポカリンファミリーをＤＤＳ用のカプセルとして利用する際に、バレル構造で形成されたポケット中に薬物を収納した後、ポケットの開口をジスルフィド架橋（Ｓ－Ｓ結合）によって閉じることができるようにするものである。具体的には、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の酵素活性を失活させ、Ｎ末端から３４番目と９２番目のトリプトファンをシステインに置き換えたことを特徴とするＤＤＳカプセル用タンパク質を提供する。

Description

ＤＤＳカプセル用タンパク質およびそれを用いた薬剤とその調整方法
　本発明は、難水溶性の薬剤を、目的となる生体内の場所や部位、細胞に選択的に運搬する薬剤運搬体に関する。
　ゲノム創薬研究により発見された標的受容体へ作用する医薬候補化合物は、総じて分子量が大きく、水に対する溶解度が低い。また、現在使用されている薬剤の中にも疎水性が高く、難水溶性であるものが少なくない。化学修飾法により水溶性は高められるが、薬剤活性が減じられる場合が多い。薬剤活性の高い難水溶性薬剤を効率的に疾患部に輸送できれば、難水溶性薬剤の臨床応用例を拡大し、製薬企業で困難を極めていた薬剤溶解度に対する問題を解決することができる。
　この課題に対して技術面で鍵を握っているのが、難水溶性薬剤を可溶化し標的まで輸送するとともに、その薬剤を細胞内で効率的に機能発現させることのできるドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）の開発である。
　このようなＤＤＳのアイデアはすでに開示されているものがある。特許文献１では、標的結合成分と腔形成成分と薬理学的化合物を含む複合体であって、薬理学的化合物が腔形成成分の腔中に存在する複合体が開示されている。ここで開示されている複合体の使い方は、対象が発現するレセプター等の標的に対して、特異的に結合する腔を有するたんぱく質（特にＮＧＦファミリーやインターロイキン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、バルナーゼ、Ｔ４リゾチーム、ＴＧＦｂ、ＩｇＧ等）を選定し、その腔中に対象に対して薬剤効果を有する薬剤の中から実際に吸蔵させることのできる薬剤を選択する。
　しかしながら、特許文献１では、神経芽細胞腫を対象とし、対象が過剰に発現する標的をｔｒｋＡレセプターとし、標的結合成分と腔形成成分を有するたんぱく質としてＮＧＦを示してあるものの、それ以上の具体的な開示がなく、ＮＧＦに何をどのように吸蔵させるのかという点については、概念が示されているに過ぎない。
　これに対して特許文献２は、生体産生物であるリポカリンファミリーが難水性薬物を溶解させＤＤＳとして利用できることを示している。このようなリポカリンファミリーは、生体産物質であるため、毒性や拒絶反応（アレルギー反応等）といった点に対する課題がない。したがって、ＤＤＳに要求される安全性を容易にクリアすることができる。
　また、特許文献３は、さらに、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素のＮ末端若しくはＣ末端に標的への結合部分を連結した蛋白質を提供している。これによって、標的に対する結合特異性を付与することができるため、さらにＤＤＳへの応用が好適なものとなった。
特表２０００－５０７２１０号 特開２００８－１２０７９３号 特開２０１１－２０７８３０号
　リポカリンファミリーはバレル構造によってポケットを有しており、いわばコップのような形状をしている。ここに、難水溶性の薬剤を収納することができる。しかも、薬剤によっては、複数個の分子単位を収納することができる。しかしながら、バレル構造によって形成されたポケットは、常に開口しており、移送の途中で内在させた薬物がこぼれてしまうおそれがある。
　本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、リポカリンファミリーをＤＤＳ用のカプセルとして利用する際に、バレル構造で形成されたポケット中に薬物を収納した後、ポケットの開口をジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）によって閉じることができるようにするものである。すなわち、ＤＤＳ用カプセルに薬剤放出制御機能を付与した。
　より具体的には、
　リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の酵素活性を失活させ、Ｎ末端から３４番目と９２番目のトリプトファンをシステインに置き換えたことを特徴とするＤＤＳカプセル用タンパク質を提供する。
　リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素は、体内産生物質であり、拒絶反応（アレルギー反応等）や毒性といった一般的にＤＤＳが有する課題を容易に乗り越えることができる。また、すでにアミノ酸配列も解析されており、ターゲットに対する標的結合部を含めて組換え合成を行うことで、容易に産生することができる。さらに、本発明は、バレル構造によって形成されるポケットを閉じたり開いたりすることができるようになるため、薬剤運搬のロスが少なく、また、標的部位への的確な薬剤投与も可能と考えられる。
　このように本発明の薬剤運搬体は、分子選択的認識機能を持ち、がん組織を狙い撃つ「ナノキャリア蛋白質」として医薬品開発分野における新しい方向性を与えることができる。
Ｌ－ＰＧＤＳの立体構造を示す図である。 Ｌ－ＰＧＤＳのミュータントの立体構造を示し、バレル構造の入口の開閉の様子を示す概念図である。 電気泳動の結果を示す図である。 Ｌ－ＰＧＤＳのミュータントを精製した際の分画毎の収率を表す図である。 Ｌ－ＰＧＤＳおよび薬剤を保持させたＬ－ＰＧＤＳの凍結乾燥前後の吸収特性を表す図である。 Ｌ－ＰＧＤＳおよび薬剤を保持させたＬ－ＰＧＤＳの遠紫外領域の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの測定結果を表す図である。 薬剤を保持させたＬ－ＰＧＤＳを凍結乾燥させ再度解凍したときの薬効への影響を調べた図である。
　リポカリンファミリーに属するリポカリン蛋白質は、アミノ酸残基が１４０～２００個からなり、分子量が約２万程度の蛋白質である。また、アミノ酸配列の相同性が、２０％程度であるにもかかわらず、その構造上の類似性は非常に高いことが知られている。リポカリンファミリーのメンバーとしては、レチノール結合蛋白質、主要尿蛋白質、ビリン結合蛋白質、β－ラクトグロブリン、ロブスタークラストシアニン、臭物質結合蛋白質などがある。
　これら、リポカリン蛋白質の折りたたみ構造は、連続的に水素結合した８本の逆平行のβストランドからなり、疎水性低分子（リガンド）結合部を囲むようなバレル（樽）型になっている。８本のβストランドをつなぐ７箇所のループは、６箇所が短いヘヤピンで、１箇所がオメガループであり、このオメガループがリガンド結合部の蓋の役割をすると考えられている。また、１本のαヘリックスを有する。すなわち、８本のβストランドからなるβバレル構造と１つのオメガループと、１本のαヘリックスを有する点がこれらリポカリンファミリーの構造上の類似点である。
　図１にリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ－ＰＧＤＳ）の結晶構造の模式図である。８本のβストランドからなるβバレル構造（１１乃至１８）と１つのαへリックス（１９）と１本のオメガループ（Ｈ２へリックス）（２０）を有している。
　そもそも、Ｌ－ＰＧＤＳは、シクロオキシゲナーゼの働きによりアラキドン酸から合成されたＰＧＨ２を基質として、ＰＧＤ２を合成する酵素である。ＰＧＤ２は、中枢神経系において、睡眠誘発、体温低下、黄体ホルモン分泌の抑制、痛みや匂いの応答調節などの作用を示し、末梢神経では、肥満細胞からアレルギーのメディエーターとして放出され、血管拡張、気管支収縮、血小板凝集阻害などの作用を示す物質である。
　そして、Ｌ－ＰＧＤＳはリポカリンファミリーにも属しており、８本のβストランドからなるβバレル構造によって形成されるポケット部分は内側には疎水性アミノ酸が配置された構成になっているので、難水溶性の薬物をこのポケットに収容することにより、水に溶解することができる。このように薬剤運搬が可能なタンパク質をＰＮＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｎａｎｏ　Ｃａｐｓｕｌｅ）と呼ぶ。
　難水溶性の薬剤の水溶可能性については、ポケットの内側のアミノ酸に変異を導入して薬剤毎にポケット内への薬剤の保持特性を調整してもよい。なお、Ｌ－ＰＧＤＳはそもそも酵素であるため、ＤＤＳとして使用する際には、酵素活性を失活させる必要がある。そのためには、Ｎ末端から４５番目のシステイン（活性中心）を、アラニンに置換し、酵素活性を失活させる。
　本発明のＤＤＳ用タンパク質では、バレル構造で形成されたポケットの入口部分を開閉できるようにさせる。より具体的にはＬ－ＰＧＤＳにおいて、Ｎ末端から３４番目と９２番目のＴｒｐ（トリプトファン）残基をＣｙｓ（システイン）残基に置き換える。Ｃｙｓ残基同士はよく知られているようにジスルフィド結合を形成する。
　ジスルフィド結合は、システインのチオール基の部分が酸化されることで生じる。また、ジスルフィド結合は、ジチオスレイトールやメルカプトエタノールといった還元剤で切断される。すなわち、バレル構造で形成されたポケット内に薬剤を収納後、酸化雰囲気に曝すことで、ポケットの入口を閉じ、薬剤キャリアーとする。
　また、細胞中は一般に還元雰囲気であるので、細胞に取り込まれた後は、このジスルフィド結合は切断され、ポケットは開口する。そして、中に収納した薬剤が細胞内で効果を示す。図２には、Ｎ末端から３４番目と９２番目のＴｒｐ（トリプトファン）残基をＣｙｓ（システイン）残基に置き換え、ポケットの入口が開いた状態および閉じた状態のＬ－ＰＧＤＳの予想図を示す。
　ＤＤＳとしてＬ－ＰＧＤＳを利用する際に課題の１つとなるのは、保存性である。Ｌ－ＰＧＤＳは、タンパク質であるため、比較的容易に品質劣化が進む。また、液中保存では液中の水分によって劣化するおそれが高い。そこで、上記のようにＬ－ＰＧＤＳ中に薬剤を収納した後に、凍結乾燥処理を行う。凍結乾燥はタンパク質を比較的長期に保存させることができることはよく知られている。そこで、薬剤を収納した状態であっても、凍結保存後に効果を示すかどうかを確認した（後述する実施例２参照）。
　この結果によれば、薬剤を収納した後のＬ－ＰＧＤＳは、凍結乾燥して保存した後も、解凍することで、元の薬剤を収納したＬ－ＰＧＤＳに戻り、また、凍結乾燥する前と同一の薬剤効果を発揮することを確認できた。
　また、本発明のＤＤＳ用カプセルはすでに知られているように（特許文献３参照）、標的結合部をＮ末端若しくはＣ末端に形成させてもよい。
　標的結合部については、ターゲットに合わせて設計することができる。例えば、癌細胞の場合は、新生血管内皮細胞に発現する膜蛋白質（ＣＤ１３）に対して特異的に結合するペプチド配列ＮＧＲ（Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）を選択することができる。また、αｖβ３インテグリンを認識するｉｓｏＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ　（ｉｓｏＤＧＲ）モチーフを遺伝子組換えによりＬ－ＰＧＤＳのＮ末端、あるいはＣ末端に導入してもよい。
　また、胃がんの腹膜腫瘍を認識するＬｙｓ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ（ＫＬＰ）－モチーフ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　９７、　１０７５－８１、　２００６）、転移性がん細胞を認識するＡｓｎ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ　（ＮＶＶＲＱ）モチーフ（Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１４、　５４９４－５０２、　２００８）、肝がん細胞を認識するＰｈｅ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ（ＦＱＨＰＳＦＩ）モチーフ（Ｍｏｌ　Ｍｅｄ、　１３、　２４６－５４、　２００７）等も好適に利用できる。
　この標的結合部は本体であるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素部分の末端に導入するのが好ましい。また、Ｎ末端であれば、組換え体を作製する際により簡単であるので、より好ましい。
　（実施例１）
＜ジスルフィド結合を有するＬ－ＰＧＤＳミュータントの作製＞
　次に実施例を示して本発明のＤＤＳカプセル用タンパク質の製造法を示す。ジスルフィド結合を有するタンパク質カプセル（Ｐｒｏｔａｉｎ　Ｎａｎｏ　Ｃａｐｓｕｌｅ：ＰＮＣ）の精製は、大腸菌の形質転換クローンを作製し、大量生成した。形質転換に用いるベクターは、ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターであるｐＧＥＸ－４Ｔ－２にリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ－ＰＧＤＳ）の塩基配列を導入したプラスミドを鋳型とし、ダブルプライマーＰＣＲ法を用いて作製した。
　ジスルフィド結合を有するリポカリオン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ－ＰＧＤＳ）の塩基配列を表１に示す（配列１）。このミュータントは、Ｎ末端およびＣ末端の両方にガンに対する標的結合部であるＮＧＲが付加されている。なお、Ｎ末端には合成の都合上ＧＳが付加される。ここで、３７番目および９５番目のコードはＴｒｐ残基をコードする塩基配列であるＴＧＧからシステインをコードするＴＧＣに置換されている。また、Ｎ末端から４８番目のシステイン（活性中心）はＡｌａ（アラニン）に置き換え酵素活性は失活させるようにした。
　また、表２には、塩基配列も示す（配列２）。また、３７番目、４８番目、９５番目には四角の枠を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、表３および表４には、標的結合部が付加されていないタイプで、ジスルフィド結合を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ－ＰＧＤＳ）のアミノ酸配列と塩基配列を示す。標的結合部をもたないＬ－ＰＧＤＳのミュータントでは、ジスルフィド結合を導入したシステインは、Ｎ末端から３４番目と９２番目であり、酵素活性を失活させるためのアラニンは４５番目である。表３および表４のＮ末端およびＣ末端には、表１及び２で示したＮＧＲ以外の標的結合部を付加することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この方法では、２本鎖鋳型プラスミドと相補的な変異を含む２種類プライマーを設計し、ＰＣＲを行うことにより、鋳型プラスミドに特異的に変異を導入することができる。Ｌ－ＰＧＤＳの３７番目および９５番目のＴｒｐ残基をコードする塩基配列はＴＧＧであり、この部分をＣｙｓ残基をコードするＴＧＣに置換するためのプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。増幅したＰＣＲ産物のシーケンス解析を行い、Ｔｒｐ３７およびＴｒｐ９５のＣｙｓ残基への置換を確認した。
　得られたベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、常法（例えば特許文献２）に従ってＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘導しながら培養を行った。Ｌ－ＰＧＤＳは、ＧＳＴと融合した形で産生される。その後大腸菌は０．５ｍＭのＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　Ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＷＡＫＯ）を添加した１０倍量のＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭリン酸水素ニナトリウム、１．８ｍＭリン酸水素ニカリウム、１４０　ｍＭ塩化ナトリウム、２．７　ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ　７．５）中で超音波処理（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ　ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＭＹ　ＳＥＩＫＯ）により破砕した。
　大腸菌破砕液をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂを充填したカラムに供し、融合タンパク質を吸着させた。そしてＴｈｒｏｍｂｉｎにより目的タンパク質を切断し、溶出液を還元剤であるＤＴＴ存在下においてゲルろ過クロマトグラフィーに供し、目的タンパク質を精製した。ここで目的タンパク質はＬ－ＰＧＤＳのミュータントであるので、以後ＰＮＣと呼ぶ。
　精製後のＰＮＣのＳＤＳ　ＰＡＧＥ（１５％　Ｗ／Ｖ）分析の結果を図３に示す。左側Ａのレーンはコントロールである。右側Ｂのレーンが生成後のＰＮＣ（Ｌ－ＰＧＤＳのミュータント）である。ＰＮＣの推定分子量である１９ｋＤａ付近に単一のバンドが確認できた。
　＜ＤＤＳカプセルへの薬剤収納とポケットの開口＞
　次に上記の方法で得たＰＮＣの開口部分の開閉について説明する。精製過程におけるゲル濾過クロマトグラフィーの結果を図４に示した。横軸は溶出体積を示し、縦軸は、２８０ｎｍにおける吸収を表す。
　ＰＮＣ分画ごとに透析によって還元剤ＤＴＴを除去し、ＤＴＮＢ法を用いて遊離型チオールの定量を行った。ＤＴＮＢ法とは、５，５’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＴＮＢ）が、タンパク質のＳＨ基と反応すると５－ｔｈｉｏ－２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＮＢ）になることを利用して、タンパク質中のＳＨ基を定量する方法である。ＴＮＢは４１２ｎｍの波長で吸収が生じるため容易に定量分析ができる。
　まず、分画毎の５　μＭ　ＰＮＣ溶液（ｐＨ　７．４）に１００％　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを終濃度１０％になるように混合した。氷中にて３０分静置し、遠心分離（１６，０００×ｇ，３０分）によってタンパク質を回収し、沈殿を得た。沈殿に１０％ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを１　ｍｌ加えて遠心分離（１６，０００×ｇ，３０分）を行い、沈殿を得た。
　その後、６　Ｍ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ／５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、撹拌して沈殿を溶解し、室温（２５　℃）にて１５分静置した。そして、終濃度１００　ｍＭになるようにＤＴＮＢを加えて、室温（２５　℃）にて１時間静置した。遊離型チオール濃度は、放出されたＴＮＢの吸収波長である４１２ｎｍの吸光度を測定して求めた（ＴＮＢのモル吸光係数ε４１２　＝　１３，６００　Ｍ－１　ｃｍ－１）。
　各分画の遊離チオール量を表５に示す。分画１（Ｆ１）においては約８７％のＰＮＣが架橋形成されていない開口状態（ｏｐｅｎｆｏｒｍ：図２（ａ）参照）であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　次に、ジスルフィド架橋形成の促進のため、それぞれのＰＮＣ分画を過剰量の酸化型グルタチオン（２０ｍＭ）で処理した。
　具体的には、各分画の１０　μＭ　ＰＮＣ溶液（ｐＨ　７．４）に酸化型グルタチオンを終濃度２０ｍＭとなるように混合し、室温（２５　℃）にて１２時間静置した。その後、ＤＴＮＢ法による遊離型チオール基の定量を行った。結果を表６に示す。全てのＰＮＣ分画においてジスルフィド架橋が形成されているのが確認された。これは図２（ｂ）のようにＬ－ＰＧＤＳの開口部分がＳ－Ｓ結合で閉じたことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上のように本発明に係るＬ－ＰＧＤＳのミュータントは、酸化および還元によって開口部分を開閉することが可能であり、バレル構造で形成された内部に収納した薬剤の保持および放出機能を有したものと言える。
　（実施例２）
　次にＬ－ＰＧＤＳ中に薬剤を収納した状態で、凍結乾燥し、再度解凍しても効果が低下することがないかを確認した。
　ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ　（ＤＺＰ））は、難水溶性薬剤である。これを直接（コントロール）経口投与した場合、Ｌ－ＰＧＤＳに収納してマウスに経口投与した場合、さらにＬ－ＰＧＤＳに収納して凍結乾燥後、再度解凍させてからマウスに経口投与した場合のそれぞれについて、ペントパルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）誘導性麻酔時間を調べた。ジアゼパムが効いていると、麻酔時間が長くなるので、Ｌ－ＰＧＤＳの有無の場合を比較することで効果を評価することができる。
　＜凍結乾燥によるＬ－ＰＧＤＳへの影響＞
　実験に用いたＬ－ＰＧＤＳは、ジスルフィド架橋ができるようにしたミュータントではない。しかし、開口の有無にかかわらず、Ｌ－ＰＧＤＳで凍結乾燥の影響がなければ、ミュータントにおいても、凍結乾燥による影響はないと考えられる。
　まず、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に１００μＭのＬ－ＰＧＤＳを用意した。そして、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に３３０μＭのジアゼパム（ＤＺＰ）を収納した１００μＭのＬ－ＰＧＤＳを用意した。これをＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘと呼ぶ。Ｌ－ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘを液体窒素で５時間凍結乾燥した。５時間の凍結乾燥でＬ－ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘは完全に乾燥した。
　完全に乾燥したＬ－ＰＧＤＳおよびＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘを超純水で溶解し、ｐＨ７．４における吸収スペクトルを測定した。また、２５　℃、ｐＨ　７．４において、遠紫外領域の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。
　Ｌ－ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘは、液体窒素によって完全に凍結乾燥させた後、再融解した。再融解したＬ－ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘの吸収スペクトルを測定した。図５にその結果を示す。
　図５は、横軸は波長であり、縦軸は吸収を表す。グラフ中には４つの曲線が示されている。それぞれＬ－ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳの吸収スペクトルで、凍結乾燥前後において全く一致したので凍結乾燥前と凍結乾燥後の区別がつかないほどであった。
　また、図６には、ＣＤスペクトルの測定結果を示す。横軸は波長であり、縦軸はモル楕円率θである。図６には、凍結乾燥前と凍結乾燥後のＬ－ＰＧＤＳとＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘのＣＤスペクトルが記載されているが、区別がつかないほど４つのサンプルは一致した。
　これらの結果から、凍結乾燥によるＬ－ＰＧＤＳの構造変化は生じないことが明らかになった。また、凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘのＤＺＰ濃度は凍結乾燥前と一致することが判明した。
　＜凍結乾燥がＬ－ＰＧＤＳのＤＤＳ能力に及ぼす影響＞
　Ｃａｒｂｏｘｙ　ｍｅｔｈｙｌ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　（ＣＭＣ）、ＤＺＰ／ＣＭＣ懸濁液　（５００　μＭ　ＤＺＰ）、凍結乾燥前と凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘ　（５００　μＭ　ＤＺＰ、　２４０　μＭ　Ｌ－ＰＧＤＳ）をマウスに経口投与し（１０　ｍｌ／ｋｇ）、３０分後にｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ（３５　ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。マウスが正向反射を消失してから回復するまでの正向反射消失時間を麻酔時間として測定した。
　さらに、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘの凍結乾燥による影響を調べるために、凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘをマウスに経口投与し、ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌによる麻酔時間への影響を調べた。図７にその結果を示す。図７は横軸が投与剤の種類である。また縦軸が麻酔時間である。その結果、凍結乾燥後のＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘ投与群は、凍結乾燥前のＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘ投与群と麻酔時間が一致した。
　以上の結果から、ＤＺＰ／Ｌ－ＰＧＤＳ　ｃｏｍｐｌｅｘは凍結乾燥による保存が可能であることが明らかになった。
　本発明のＰＮＣはＤＤＳに好適に利用することができるほか、酸化若しくは還元による反応の試薬などにも利用することができる。
　１１～１８　βストランド
　１９　αヘリックス
　２０　オメガループ（Ｈ２へリックス）

Claims (8)

  1. 　リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の酵素活性を失活させ、Ｎ末端から３４番目と９２番目のトリプトファンをシステインに置き換えたことを特徴とするＤＤＳカプセル用タンパク質。
  2. 　さらにＮ末端およびＣ末端にＮＧＲを結合させたことを特徴とする請求項１に記載されたＤＤＳカプセル用タンパク質。
  3. 　配列１に示すＤＤＳカプセル用タンパク質。
  4. 　配列３に示すＤＤＳカプセル用タンパク質。
  5. 　請求項１乃至４のいずれかのＤＤＳカプセル用タンパク質と、前記ＤＤＳカプセル用タンパク質中に組み込まれた薬成分からなる薬剤。
  6. 　前記薬剤は凍結乾燥された請求項５に記載された薬剤。
  7. 　配列１のアミノ酸配列に基づいてタンパク質を合成する工程と、前記タンパク質を還元溶液中で薬成分と混合する工程と、前記還元溶液を中和する工程と、を含む薬剤の調製方法。
  8. 　前記中和された還元溶液を凍結乾燥する工程をさらに含む請求項７に記載された薬剤の調製方法。

     
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