JP2001501093A

JP2001501093A - シャペロン断片

Info

Publication number: JP2001501093A
Application number: JP10515422A
Authority: JP
Inventors: フェルシュト，アラン，ロイ; ザーン，ラルフ; マーリーンアルタミラノ，マイリアム
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2001-01-30
Also published as: AU4467497A; US20030078373A1; AU736670B2; WO1998013496A1; EP0928336A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、図7に実質的に示されるGroEL配列の少なくともアミノ酸残基230-271（ただし、残基150-455または151-456の範囲内）、または実質的に相同なシャペロンポリペプチドの対応配列、またはその修飾、突然変異もしくは変異配列（シャペロン活性を有するもの）から選ばれるアミノ酸配列を有するシャペロンポリペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】シャペロン断片本発明は、他のタンパク質のフォールディングや構造上の完全性の維持において活性であるシャペロンポリペプチドに関する。また、本発明は、シャペロンポリペプチドをコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、該シャペロンポリペプチドを発現するように該核酸またはベクターで修飾された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、合成手段または組換え手段によるシャペロンポリペプチドの製造法、該シャペロンポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む医薬組成物、および疾患の治療における又は生物学的に活性な物質のリコンディショニング（reconditioning）におけるシャペロンポリペプチドの用途に関する。また、本発明は、シャペロンポリペプチドに対して反応性の抗体、ならびに医薬および診断におけるその用途に関する。シャペロンは、種々の細胞画分におけるポリペプチド鎖のフォールディングを媒介するのに不可欠な大きな多サブユニットタンパク質集合体であることが、一般に公知である。シャペロンのファミリーが既に同定されており、例えば、シャペロニンhsp60ファミリー（あるいはcpn60クラスのタンパク質として公知である）は構成的に発現され，、具体的には、細菌細胞質中に見出されるもの（GroEL ）、内部共生由来のミトコンドリア中に見出されるもの（hsp60）および葉緑体中に見出されるもの（Rubisco結合タンパク質）が挙げられる。もう1つのシャペロンファミリーは、TF55/TCP1と称され、高温性古細菌および進化的に関連した真核性サイトゾル中で見出される。原核生物、ミトコンドリアおよび葉緑体において見出されるシャペロン間で少なくとも50％の配列同一性が存在することが、アミノ酸配列データの比較から示されている（Ellis R JおよびVan der Vies S M（1991）Ann Rev Biochem 60:321-347）。典型的なシャペロニンは、熱ショックタンパク質のhsp60ファミリーのメンバーであるGroELである。GroELは、各単量体サブユニット（cpn60m）が約57kDの分子量を有する14量体である。該14量体は、それが無ければ間違ったフォールディング（ミスフォールディング）または凝集を引き起こし沈殿すると考えられる多数のタンパク質のin vitroでのフォールディングを促進する。大腸菌（E. coli）由来のGroELの構造は、Braig Kら（1994）Nature 371:578-586において報告されているとおり、Ｘ線結晶学的研究により確認されている。該ホロタンパク質は、中心部の大きな窪み（中心キャビティ）を形成する2個の7員環よリなる円筒状であり、Ellis R JおよびHartl F U（1996）FASEB Journal 10:20-26によると、該中心キャビティは、活性に必須であると一般に考えられている。いくつかの小さなタンパク質は、GroELに結合している場合にはそれらの変性状態からフォールディングすることが示されており（Gray T EおよびFersht A R（1993）J Mol Biol 232:1197-1207;Hunt J Fら（1996）Nature 379:37-45;Weissman J Sら（1996）Cell 84:481-490;Mayhew Mら（1996）Nature 379:420-426;Corrales F JおよびFersht A R（1995）Proc Nat Acad Sci 92:5326-5330）、部分的にフォールディングまたは集合したタンパク質を隔離するためには籠様構造が必要であると主張されている（Ellis R JおよびHartl F U(1996)前掲）。また、大腸菌（E．coli）GroELの全アミノ酸配列が公知であり（Braig Kら（1 994）前掲を参照されたい）、3つのドメインが該ホロシャペロニン（14量体）の各cpn60mに特有のものとされている。これらは、中間ドメイン（アミノ酸残基1- 5、134-190、377-408および524-548）、赤道ドメイン（残基6-133および409-523 ）および頂点ドメイン（残基191-376）である。 GroELの単量体は尿素または圧力により誘導されているが、それらは不活性であり、ロダネーゼのリフォールディングを促進するために中心キャビティを形成するには再会合する必要がある（Mendoza J Aら（1994）J Biol Chem 269:2447- 2451;Ybarra JおよびHorowitz P M（1995）J Biol Chem 270:22962-22967）。 GroELは、以下の2つのメカニズムにより多数のタンパク質のフォールディングを促進する：（1）それは、部分的にフォールディングしたタンパク質に結合することにより凝集を妨げ（Goloubinoff Pら（1989）Nature 342:884-889;Z タンパク質はGroEL上で天然様状態にリフォールディングする（Zahn RおよびR（1993）J Mol Biol 232:1197-1207）、および（2）それは、ミスフォールディングしたタンパク質をフォールディング解除（アンフォールディング）してリフォールディングの再開が可能となる状態にすることにより、該ミスフォールディングタンパク質を連続的にアニーリングさせる（Zahn Rら（1996）Science 271: 642-645）。頂点ドメイン内のいくつかの突然変異は、ポリペプチド結合の減少を引き起こし（Fenton W Aら（1994）Nature 371:614-619）、このことは、このドメインがポリペプチドの結合に関与していることを示唆している。電子顕微鏡検査は、変性タンパク質がGroEL-シリンダーの頂端の内側に結合することを示唆している（Chen Sら（1994）Nature 371:261-264）。赤道ドメインはヌクレオチド結合部位を有することが、ATPγS結合GroELの2.4Åの結晶構造（Boisvert D C ら（1996）Nature Structure Biology 3:170-177）および突然変異誘発研究（Fe nton W Aら（1994）Nature 371:614-619）から示されている。ATPの結合および加水分解は、協同的であり（Bochkareva E Sら（1992）J Biol Chem 267:6796-6 800;Gray T EおよびFersht A R（1991）FEBS Lett 292:254-258）、ポリペプチドに対する親和性を低下させる（Jackson G Sら（1993）Biochemistry 32:2554- 2563）。GroELのサブユニット間の分子内接触のほとんどは、赤道ドメイン間におけるものである。中間ドメインは、残りの2個のドメインを接続し、アロステリック効果を伝達する（Braig Kら（1994）Nature 371:578-586;Braig Kら（199 5）Nature Struct Biol 2:1083-1094）。 GroELの結晶構造は、赤道ドメインまたは中間ドメインと比べて頂点ドメインでは異常に高いＢファクター（B-factor）を示し、該Ｂファクターは該ドメイン内で相当差がある（Braig Kら（1994）Nature 371:578-586;Braig Kら（1995）N ature Struct Biol 2:1083-1094;Boisvert D Cら（1996）Nature Structure Bio logy 3:170-177）。高い総Ｂファクター（overall B-factor）は、不斉単位内の（そして恐らくGroELの結晶全体の）静的障害（static disorder）により生じるらしく、中間ドメイン内のヒンジ様βシートにより生じる剛体運動に起因する。また、高い柔軟性の領域が、コ・シャペロニンGroESの2.8Åの構造内で認められている（Hunt J Fら（1996）Nature 379:37-45）。可動性ループが、頂点ドメインに対するADP依存性結合に直接関与していることが示されている(La ndry S Jら（1993）Nature 364:255-258）。GroESの結合は、GroELのコンホメーション変化およびそれに伴うGroELキャビティの拡大を引き起こし(Chen Sら（19 94）Nature 371:261-264）、この場合、封入されたポリペプチド基質が、凝集の危険性を伴うことなく天然様状態にリフォールディングされうる（Martin Jら（ 1993）Nature 366:228-233;Weissman J Sら（1995）Cell 83:577-587）。 GroELの単量体形態は、部位特異的突然変異誘発により誘導され発現されており、これらはロダネーゼに結合するものの、それらはそのリフォールディングに影響を及ぼさない（White Z Wら（1995）J Biol Chem 270:20404-20409）。 yoshidaら（1993）FEBS 336:363-367は、149個のNH₂末端残基と約93個のCOOH 末端残基とを欠く大腸菌（E．coli）GroELの34kDのタンパク質分解断片（GroEL 150-456）が、GroESとATPとの不存在下で変性ロダネーゼのリフォールディングを促進することを報告している。タンパク質分解断片GroEL 150-456はゲル濾過中に単量体として溶出するが、それは依然として、頂点ドメインと中間ドメインおよび赤道ドメインの有意部分とを含み、その後者がGroELのサブユニット間接触を決定して（Braig Kら（1994）前掲）、中心キャビティの一過性の形成を可能にし、それにより、認められるシャペロンニン活性を与える。いずれにせよ、GroEL 150-456によるロダネーゼのリフォールディングの様式は、ホロタンパク質により生じるものとは非常に異なっている。生産的リフォールディングの収率は低く、フォールディングは時間と共に急速に飽和し、それは GroESおよびATPに影響されない。効率的な遊離およびフォールディングには、AT Pの加水分解が必要である（Landry S Jら（1992）Nature 355:455-457;Gray T E およびFersht A R（1992）FEBS Lett 282:254-258;Jackson GSら（1993）Bioche mistry 32:2554-2563;Todd Mら（1993）Biochemistry 32:8560-8567）。 EP-A-0 650 975（NIPPON OIL CO LTD）は、シャペロニン分子と、テルムス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）から得たGroELシャペロニン60単量体（cpn60m）を使用して変性タンパク質をリフォールディングさせる方法とを開示している。該ホロシャペロニンを、最初に細菌源から抽出し、ついで精製した（ Taguchiら（1991）J Biol Chem 266:22411-22418の方法に従っている）。ついで、該ホロシャペロニンをトリフルオロ酢酸（TFA）で処理し、ついで、得られた変性タンパク質を逆相（rp）HPLCに付すことにより、cpn60mを得た。約57kDのcp n60mを含有するピーク画分を得た。不活性化ロダネーゼの活性の回復をモニターすることにより、cpn60mのリフォールディング活性を溶液中でアッセイしたが、その比活性は、不活性化前のロダネーゼの比活性の約25％に達したにすぎなかった。ロダネーゼのバックグラウンド自発的リフォールディングを差し引くと、わずか約20％のリフオールディング活性にしかならない。 cpn60mに加えて、EP-A-0 650 975は、79位のThr残基まで（但し、この残基は含まない）のＮ末端アミノ酸残基がタンパク質分解により除去されているcpn60m の約50kDのＮ末端欠失断片の用途も開示している。この50kD断片は、溶液中で約 35％（バックグラウンドを差し引くと約30％）のロダネーゼリフォールディング活性を示した。 Taguchi Hら（1994）J Biol Chem 269:8529-8534は、EP-A-0 650 975の発明の基礎となる科学的報告である。一過性に形成したGroELの14量体（ホロシャペロニン）が、シャペロニン単量体が溶液中に存在する場合に存在することが判明した。その結果、これらの調製物のリフォールディング活性は、単量体ではなくホロシャペロニンの存在により生じると理解することができる。これを試験するために、Taguchiらは、cpn60mをクロマトグラフィー樹脂に固定化して、ホロシャペロニン形成の可能性を除外した。cpn60mは、固定化されて真に単量体形態にある場合には、約10％のロダネーゼリフォールディング活性しか示さなかった。ロダネーゼのリフォールディングは、シャペロニン活性を測定するための一般的で簡便なアッセイとなっているが、このアッセイに基づいてリフォールディング活性がこれまで主張されてきたことに重要な疑問を投げかける、アッセイの重大な問題が存在することが認められている。実際には、ロダネーゼは分子シャペロンの不存在下で自発的にリフォールディングし、リフォールディングしたロダネーゼの収率は、ロダネーゼ濃度が減少するにつれて増加する（Taguchiら(1994 )前掲を参照されたい）。したがって、固定化された（真に単量体である）cpn60 mに関してEP-A-0 650 975で報告されているロダネーゼのリフォールディング活性の10％は、ロダネーゼによる活性の自発的な回復に余りにも近いため、cpn60m およびローダネー−ゼは言うまでもなくタンパク質一般に対しても、いずれかの単量体シャペロンニンがリフォールディング活性を有することを証明することはできない。 Alconada AおよびCuezva J M（1993）TIBS 18:81-82は、大腸菌（E．coli）の改変ｍＲＮＡ安定性（ams）遺伝子産物（Ams）とGroELの中央部分との間のアミノ酸配列類似性に基づき、GroELの「内部断片（internal fragment）」がシャペロン活性を有しうると示唆している。ams遺伝子座は、大腸菌（E．coli）染色体上の23minに位置する温度感受性突然変異であり、増加した半減期を有するｍＲＮＡを与える。ams遺伝子は、既にクローニングされ、発現され、ams突然変異を相補することが示されている。該遺伝子産物は、17kDの見掛け分子量を有する14 9アミノ酸のタンパク質（Ams）である。 Chanda P Kら（1985）J Bacteriol 161:446-449は、groEオペロンのＬ遺伝子の一部に対応する17kDのタンパク質断片が、大腸菌（E．coli）ams突然変異体内で発現されると、野生型表現型を回復させることを見出した。この17kDの断片は、単離された機能的シャペロニンタンパク質モジュールであると示唆された。3 個のシャペロニン〔大腸菌（E．coli）GroEL、トリチクム・アエスチブム（Trit icum aestivum）由来のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（RUBPC）サブユニット結合タンパク質、およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce revisiae）ミトコンドリアhsp60〕のアミノ酸配列が、Amsの配列と比較された。 AmsとGroELとでは、残基307-423が実質的に対応することが判明した。これらの残基は、GroELの中間ドメインおよび頂点ドメインの両方のほとんど同等な部分を含む。 Amsタンパク質と前記シャペロニンとの配列アライメントは、Amsのアミノ末端の5分の4と、大腸菌（E．coli）GroELシャペロニンの中央部分（約5分の1）との間で、顕著な類似性（98％）を示している。Amsアミノ末端領域と残りの2つのシャペロニンとの間の50％の配列類似性は、シャペロニンファミリー間の報告されている同一性に符合する。Amsタンパク質のカルボキシ末端部分は、シャペロニンとの類似性を全く示さなかった（＜10％の相同性）。本発明者らは、ホロシャペロニンを形成するために会合しなくても添加補助因子または他の物質の不存在下で或る範囲の起源由来のタンパク質を効率的かつ再現可能にリフォールディングし再生し再活性化し又はリコンディショニングしうる、一定の配列および構造を有する単純で真に単量体であるシャペロン分子が必要とされていることを認識した。したがって、本発明が解決しようとする課題は、生物学的分子（特にタンパク質）のリフォールディング、再生またはリコンディショニングのための有用かつ効率的な試薬を活性化するように、真に単量体形態であるシャペロンの活性部分または断片を提供することである。もう1つの目的は、そのような単量体形態を最小のサイズで提供することである。第1の態様において、本発明は、図7に実質的に示されるGroEL配列の少なくともアミノ酸残基230-271（ただし、残基150-455または151-456の範囲内）、または実質的に相同なシャペロンポリペプチドの対応配列、またはその修飾、突然変異もしくは変異配列（シャペロン活性を有するもの）から選ばれるアミノ酸配列を有するシャペロンポリペプチドを提供する。 GroELの配列は、前記のとおり当該技術分野で入手可能であり、また、学術的データベースから入手可能である。しかしながら、データベースの配列と合致したGroEL断片は実施不能である。特に、該データベースは、262位および267位がそれぞれアラニンおよびイソロイシンで占拠された配列を含有する。これらの残基の一方または両方をこれらの位置に含む断片は実施不能であり、ポリペプチドのフォールディングを促進する能力を有さない。本発明はむしろ、262位および2 67位の少なくとも1つがそれぞれロイシンおよびメチオニンで占拠されたGroELポリペプチドに関する。該アミノ酸配列は、好ましくは、少なくともアミノ酸残基193-335、好ましくは193-337、より好ましくは191-345、より一層好ましくは191-376（ただし、残基151-455の範囲内である）から選ばれる。したがって、本発明は、GroELアミノ酸残基230-271、230-272、…（以下参照）…230-455、および同様に、残基230-2 71、229-271…（以下参照）…151-271であるポリペプチドを含む。また、残基23 0-271、229-272、…（以下参照）…151-351、151-352、…（以下参照）…151-45 5であるポリペプチドを含む。少なくとも連続残基230-271（ただし、151-455の範囲を超えない）を含む42以上の残基のすべてのアミノ酸配列が、本発明のこの態様の範囲内に含まれる（例えば、171-423または166-406）。非常に好ましい態様において、本発明は、残基191-375、191-345および193-33 5よりなる群から選ばれる断片を提供する。以下の４つの主要特性により、タンパク質を分子シャペロンとして特徴づけることが可能である：（1）タンパク質のリフォールディング中の凝集の抑制、（2 ）タンパク質のアンフォールディング中の凝集の抑制、（3）フォールディングの収率および速度論に対する影響、および（4）ほぼ化学量論的レベルで発揮される効果。シャペロン活性は、実際には、シクロフィリンＡをリフォールディングさせる能力により測定することができるが、他の適当なタンパク質（例えば、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ、またはインドールグリセロールリン酸シンターゼ（IGPS）の突然変異形態（アミノ酸残基49-252））を使用することも可能である。また、ロダネーゼリフォールディングアッセイを用いることも可能である。適当なリフォールディングアッセイの詳細は、後記の具体的な実施例で更に詳しく説明する。第2の態様において、本発明は、シャペロン活性を有し、溶液中で多量体を形成する能力を有さない単量体ポリペプチドを提供する。第3の態様において、本発明は、溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、タンパク質結合活性部位モチーフ：（式中、 1は、アミノ酸残基Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、ＦまたはＡから選ばれ、 2は、Ｌ、Ｉ、Ｐ、ＶまたはＡから選ばれ、 3は、Ｌ、Ｅ、Ｖ、ＨまたはＩから選ばれ、 4は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＱまたはＮから選ばれ、 5は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、ＱまたはＫから選ばれ、 6は、Ｅ、ＤまたはＧから選ばれ、 7は、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＧまたはＬから選ばれ、 8は、Ｔ、Ａ、Ｎ、ＳまたはＶから選ばれ、 9は、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＡから選ばれ、 10は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＦまたはＨから選ばれ、 11は、Ｎ、ＳまたはＬから選ばれ、 12は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＬまたはＳから選ばれ、 13は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、ＦまたはＰから選ばれ、 14は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＤまたはＴから選ばれ、Ｘは、ペプチド結合または少なくとも1つのアミノ酸残基を表す）を含む、または番号が付されているアミノ酸残基1〜14の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とするシャペロンポリペプチドを提供する。本発明は、第4の態様において、溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、（式中、 1は、アミノ酸残基Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、ＦまたはＡから選ばれ、 2は、Ｌ、Ｉ、Ｐ、ＶまたはＡから選ばれ、 3は、Ｌ、Ｅ、Ｖ、ＨまたはＩから選ばれ、 4は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＱまたはＮから選ばれ、 5は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、ＱまたはＫから選ばれ、 6は、Ｅ、ＤまたはＧから選ばれ、 7は、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＧまたはＬから選ばれ、 8は、Ｔ、Ａ、Ｎ、ＳまたはＶから選ばれ、 9は、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＡから選ばれ、 10は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＦまたはＨから選ばれ、 11は、Ｎ、ＳまたはＬから選ばれ、 12は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＬまたはＳから選ばれ、 13は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、ＦまたはＰから選ばれ、 14は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＤまたはＴから選ばれ、Ｘは、少なくとも１つのアミノ酸残基である）から選ばれる少なくとも1つのタンパク質結合活性部位モチーフ部分を含むか、または番号が付されているアミノ酸残基1〜14の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とするシャペロンポリペプチドを提供する。第5の態様において、本発明は、溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、タンパク質結合活性部位モチーフ：（式中、Ｘは、少なくとも1つのアミノ酸残基である）を含むか、または特定されているアミノ酸残基の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とするシャペロンポリペプチドを提供する。第6の態様において、本発明は、溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、（式中、Ｘは、少なくとも1つのアミノ酸残基である）から選ばれる少なくとも1つのタンパク質結合活性部位モチーフ部分を含むか、または特定されているアミノ酸残基の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とするシャペロンポリペプチドを提供する。同類置換は、該ポリペプチドの機能が全体的に実質的に不変のまま維持されるように1個のアミノ酸残基を化学的または機能的に類似した別のアミノ酸残基で置換することである。「リフォールディング」、「再活性化」および「リコンディショニング」なる語は、互いに排他的であることを意図するものではない。例えば、不活性なタンパク質（おそらく尿素を用いて変性されたもの）は、アンフォールディングした構造を有することがある。ついでこの不活性なタンパク質は、本発明のポリペプチドによりリフォールディングされ再活性化されうる。場合によっては、不活性化／変性前のタンパク質と比べて、リフォールディング／再活性化されたタンパク質の比活性が増加することがある。これを、「リコンディショニング」と称する。好ましくは、該活性部位モチーフまたは活性部位モチーフ部分は、保存配列：（式中、括弧内のアミノ酸の記号は、左から右へ読んだ場合に直前の記号の代わりとなるものである）を含む。第7の態様において、本発明は、シャペロン活性を有し、多量体を形成する能力を有さない単量体ポリペプチドであって、・該ポリペプチドが、ATPの不存在下で、50％以上、好ましくは60％以上、よリ好ましくは75％以上のタンパク質リフォールディング活性を有し、・不活性化前の比活性が既知の不活性化タンパク質と該ポリペプチドとを接触させ、ついで該ポリペプチドとの接触後の該タンパク質の比活性を測定することにより、該リフォールディング活性を測定し、・該リフォールディング活性（％）が、であることを特徴とする単量体ポリペプチドを提供する。好ましくは、該シャペロン活性を、シクロフィリンＡのリフォールディングにより測定する。より好ましくは、8Ｍ尿素で変性させたシクロフィリンＡ（100μ Ｍ）を、1μＭの最終濃度になるまで100ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、1 0ｍＭ DTT中に希釈し、ついで少なくとも1μＭの前記ポリペプチドと25℃で少なくとも5分間接触させ、得られたシクロフィリンＡ活性をFischer Gら（1984）Bi omed Biochim Acta 43:1101-1111の方法でアッセイする。該ポリペプチドは、好ましくは、hsp60ポリペプチド、好ましくはGroELポリペプチドである。第8の態様において、本発明は、GroEL残基：またはまたはまたは（d）230-271、229-271、229-272、228-272、228-273、…（以下参照）…194-32 8、194-329 または実質的に相同なシャペロニンの等価な残基、またはその修飾、突然変異もしくは変異配列から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、前記のいずれかのポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、GroELのアミノ酸配列191-345または191-376、より好ましくは193-335または191-337、または実質的に相同なシャペロニンの等価な残基、またはその修飾、突然変異もしくは変異配列を有する。該ポリペプチドは、好ましくは、34kDa未満の分子量を有する。「修飾（体）」には、例えば、化学的に修飾されたポリペプチドが含まれる。「変異（体）」には、例えば、hsp60シャペロニンを保持する生物／細胞の集団内で見出される種類の天然に生じる変異（体）、および天然に生じる多型または突然変異が含まれる。また、「突然変異」は、当業者によく知られている突然変異誘発の方法により人工的に導入することができる。「実質的に相同」である場合、ペプチドは、特定されているGroELアミノ酸配列に対して少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％のアミノ酸配列相同性を有することが可能である。また、勿論、相同性は、該ポリペプチドに関するヌクレオチド配列中に存在していてもよく、これは、特定されているGroELアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも 75％相同であることが可能である。シャペロニンタンパク質のhsp60クラスは、一般には、構造的に相同であり、したがって、該クラスのメンバー間には保存された又は実質的に相同なアミノ酸配列が存在する。GroELは、hsp60シャペロニンタンパク質の一例にすぎず、相同な頂点ドメインを有する他の適当なタンパク質に従うことが可能である。該一覧は、ＯＷＬデータベースリリース28.1からまとめたものである。以下に挙げる配列は、PDB構造pdblgrl.entにおいて頂点ドメイン（残基191-375）に対する明らかな相同性を示している。 OWLは、SWISS-PROT，PIR(1-3)，GenBank（翻訳）およびNRL-3Dを合体させる非リダンダントデータベースである。該ポリペプチドはさらに、ポリアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端ポリアミノ酸配列を含むことが可能であるが、その代わりに又はＮ末端配列に加えてＣ末端配列が存在していてもよい。該ポリアミノ酸配列は、同一または異なるアミノ酸残基から選択することができる。同一アミノ酸残基が反復する場合に特に好ましいポリアミノ酸配列は、ポリヒスチジン配列である。同一または異なるアミノ酸残基よりなるか否かにかかわらず、そのさらなるポリアミノ酸配列は、シャペロニン活性が得られる限り、任意の数のアミノ酸残基を含むことが可能である。そのさらなるポリアミノ酸配列内に含まれうるその他のアミノ酸残基は、生物学系で一般的な約20個の必須アミノ酸または任意のアミノ酸変異体または誘導体のいずれかから選択することが可能であろう。該ポリアミノ酸配列がホモポリマー以外の場合には、それは、2個以上のアミノ酸残基の反復配列を含むことが可能である。該アミノ酸配列は、別の公知タンパク質またはポリペプチドの一部をコードしていてもよく、あるいはそれはランダムであってもよい。また、そのさらなるポリアミノ酸配列は、好ましくは、切断剤により切断可能な切断部位を含む。好ましい切断剤はトロンビンであるが、他の任意の適当な物質でも十分であろう。アミノ酸残基の配列は、勿論、所望の切断剤による切断が可能となるように選択する。そのさらなるポリアミノ酸配列は、好ましくは、17〜39個のアミノ酸を含むが、39個を超えるアミノ酸および17個未満のアミノ酸を用いることも可能である。該ポリペプチドは、支持体に、好ましくは固定化形態で結合させることが可能であり、任意に、クロマトグラフィーマトリックスに固定化してもよく、より好ましくは、アガロース樹脂に固定化する。アガロース樹脂を使用する場合には、それは、好ましくは、ニッケル-ニトリロ-トリ-酢酸（NTA）結合アガロース樹脂である。これは、ポリヒスチジンテイルを有するポリペプチドに対して親和性を有する。本発明のポリペプチドは、組換え手段で得ることができる。別法として、該ポリペプチドは、当該技術分野で公知の標準的なポリペプチド合成法を用いる通常の化学合成により製造することができる。組換え手段で製造する場合には、該ポリペプチドを異種タンパク質またはポリペプチドと融合させることが可能である。本発明者らは、17アミノ酸残基のポリヒスチジンテイルを有する断片sht-GroE L 193-335、sht-GroEL 191-345およびsht-GroEL 191-376、ならびにGroEL 191-3 45が、不活性形態のシクロフィリンＡおよびロダネーゼのフォールディングの強力な促進物質であり、バルナーゼのアンフォールディングを触媒することを見出した。最大のリフォールディング収率は、シクロフィリンＡおよび頂点ドメインの化学量論濃度で得られ、このことは、リフォールディング中のシャペロン断片と基質タンパク質との間の1：1複合体の形成を示している。また、sht-Gr oEL 193-335、sht-GroEL 191-345およびsht-GroEL 191-376の断片は、ニッケル- ニトリロ-トリ-酢酸（NTA）結合アガロース樹脂またはNHSアガロース樹脂に結合している場合、タンパク質シクロフィリンＡおよびインドールグリセロールリン酸シンターゼの不安定化突然変異体のフォールディング収率の増大において活性である。このことは、該単量体がリフォールディング活性を有することを証明しており、また、該固定化タンパク質が機能的に有用であることを示している。 GroELの断片は、組換えＤＮＡ方法またはタンパク質化学、または化学合成の任意の手段により製造することが可能であり、相同なhsp60（cpn60）タンパク質の等価な断片、または任意の天然変異体または任意の変異体は、突然変異誘発により得ることが可能であり、GroELの配列191-376、191-345もしくは193-335を含有する、より大きな断片は、大腸菌（E．coli）から得ることが可能である。第10の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、またはそれにハイブリダイズすることが可能であり、シャペロン活性を有するポリペプチドを任意にコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。該ヌクレオチド配列の好ましい特性は、前記の本発明の態様のポリペプチドの好ましい特性に対応する。したがって、本発明のこの態様は、ＤＮＡ配列のクローニングおよび／または発現で使用するための組換えＤＮＡ分子であって、（a）GroELのアミノ酸残基191-376をコードするヌクレオチド配列、（b）GroELのアミノ酸残基191-345をコードするヌクレオチド配列、（c）GroELのアミノ酸残基193-337をコードするヌクレオチド配列、（d）GroELのアミノ酸残基193-335をコードするヌクレオチド配列、（e）アミノ酸残基：またはまたはから選ばれるGroELのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列、（f）230-271、229-271、229-272、228-272、228-273、・・・（以下参照）・・・194- 328、194-329、または（g）前記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）または（f）のいずれかにハイブリダイズすることが可能であり、シャペロン活性を有する単量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（h）前記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）または（g）に対応する縮重ヌクレオチド配列を含んでなる前記組換えＤＮＡ分子を含む。該核酸配列のさらなる特性としては、前記のとおり、本発明のポリペプチドに関するものを挙げることが可能であり、該核酸配列は、発現されると、これらの特性を有するポリペプチドを与える適当なヌクレオチド配列を有することが可能である。第11の態様において、本発明は、前記の核酸を含んでなるベクターを提供する。第12の態様において、本発明は、前記のベクターまたば核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。第13の態様において、本発明のポリペプチドの製造法であって、該ポリペプチドをコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養し、該ポリペプチドを発現させることを含んでなる前記製造法を提供する。発現は、直接的であっても、あるいは融合産物としてであってもよい。該ポリペプチド産物を融合体として発現させる場合には、該製造法は、好ましくは、発現されたポリペプチド産物を切断に付す工程を含む。該ポリペプチドは、それを発現する形質転換細胞から回収することができる。第14の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドと、任意に希釈剤、担体または賦形剤とを含んでなる医薬製剤を提供する。該ポリペプチドを含んでなる医薬組成物の有効成分は、個々の場合に応じた量で投与された場合に、例えばアルツハイマー病の軽減などにおいて優れた治療活性を示すと意図される。投与方式は、最適な治療応答が得られるように調節することができる。例えば、いくつかに分割された用量を毎日投与することが可能であり、あるいは治療状況の要求により示されるとおりに比例的に用量を減少させることが可能である。該活性化合物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内または坐剤経路、移植（例えば、徐放性分子の使用によるもの）などの簡便な方法で投与することができる。投与経路によっては、有効成分を不活性化しうる酵素、酸および他の天然条件の作用から該成分を保護する物質で該成分をコーティングする必要があるかもしれない。非経口投与以外で該ポリペプチドを投与するためには、該ポリペプチドを、その不活性化を妨げる物質でコーティングするか又は該物質と共に投与することになる。例えば、該ポリペプチドを、アジュバント中で投与したり、酵素阻害剤と共に投与したり、あるいはリポソーム中で投与することができる。アジュバントは、その最広義において用いるものとし、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物を含む。本発明で意図するアジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシンが含まれる。リポソームには、油中水型CGFエマルションおよび通常のリポソームが含まれる。また、該活性化合物は、非経口的または腹腔内に投与することができる。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中ならびに油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるための保存剤を含有する。注射可能な用途に適した医薬形態には、無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射溶液または分散液の用時調製用の無菌散剤が含まれる。いずれの場合においても、該形態は無菌でなければならず、注入が容易になる程度に流体でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、それを細菌、真菌などの微生物の汚染作用から保護する必要がある。該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には要求される粒径の維持により、およびスーパーファクタント（superfactant）の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行なうことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを加えるのが好ましいであろう。注射用組成物の吸収の持続化は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸ナトリウムおよびゼラチンを該組成物中で使用することにより得ることができる。無菌注射用溶液は、該活性化合物の必要量を、前記で列挙した種々の他の成分と共に適当な溶媒中に含有させ、ついで濾過滅菌することにより調製する。一般に、分散液は、塩基性分散媒と必要な他の成分（前記で列挙したもの）とを含有する無菌ビヒクル中に、滅菌された該有効成分を含有させることにより調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌散剤の場合には、好ましい調製方法は、該有効成分および所望の任意の追加的成分の散剤を、予め濾過滅菌されたそれらの溶液から与える真空乾燥および凍結乾燥技術である。該ポリペプチドを、前記のとおりに適切に保護する場合には、不活性希釈剤と共に、または同化可能な可食性担体と共に、それを経口投与することが可能であり、あるいは、それを硬または軟殻ゼラチンカプセル中に封入することが可能であり、あるいはそれを錠削に打錠することが可能であり、あるいはそれを食餌の食物と直接混合することが可能である。治療用の経口投与には、該活性化合物を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエファーなどの形態で使用することができる。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な用量を与える量とすることが可能である。また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下のものを含有することが可能である：トラガカント、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘昧剤；ハッカ、ウィンターグリーン油、チェリー香味剤などの香味剤。投与単位形がカプセル剤である場合には、それは、前記の型の物質に加えて、液体担体を含有することが可能である。種々の他の物質が、コーティングとして、あるいは該投与単位の物理的形態を修飾するために、存在することが可能である。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤を、セラック、糖または両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、該活性化合物、甘味剤としてのショ糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジ香味剤などの着色および香味剤を含有することが可能である。勿論、いずれかの投与単位形の調製で用いるいずれの物質も、医薬上純粋であり、使用量において実質的に無毒性であるべきである。さらに、該活性化合物を、徐放性の調製物および製剤に含有させることが可能である。本明細書で用いる「医薬上許容される担体および／または希釈剤」は、すべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤ならびに吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体および物質の使用は、当該技術分野でよく知られている。通常の任意の媒体または物質が該活性成分に不適合である場合を除き、該治療用組成物中でのそれらの使用が意図される。また、補助的な有効成分を該組成物中に含有させることが可能である。投与の容易化および投薬の均質化のために、非経口組成物を投与単位形に製剤化するのが特に有利である。本明細書で用いる投与単位形は、治療する哺乳動物対象に対する一体化した投薬に適した物理的に分離した単位を意味し、各単位は、所望の治療効果が得られるように算出された所定量の活性物質を、必要な医薬担体と共に含有する。本発明の新規投与単位形の仕様は、（a）該活性物質に特有の特性および達成される個々の治療効果、および（b）身体的健康が損なわれた病態を有する生きた対象における疾患の治療のための活性物質などの化合物の技術に固有の限界により決定され、それらに直接左右される。簡便かつ有効な投与のために、投与単位形として、主要有効成分の有効量を医薬上許容される適当な担体と混合する。補助的有効成分を含有する組成物の場合には、該成分の通常の用量および投与方法を参考にして投与量を決定する。第9の態様において、疾患の治療で使用するための前記の本発明のポリペプチドを提供する。したがって、異常なタンパク質／ポリペプチド構造に関連した疾患の治療用の医薬を製造するための、本発明のポリペプチドの使用を提供する。異常なタンパク質／ポリペプチドの性質は、ミスフォールディングまたはアンフォールディングによるものである可能性があり、そしてこれは、異常な（例えば、突然変異した）アミノ酸配列によるものである可能性がある。該タンパク質／ポリペプチドは、不安定化されるか又はプラークとして（例えば、アルツハイマー病の場合のように）沈着する可能性がある。該疾患は、プリオンにより生じる可能性がある。ポリペプチドに基づく本発明の医薬は、異常な、欠損した又は沈着したタンパク質を再生または再溶解するように作用するであろう。第15の態様において、疾患の治療で使用する本発明の他の態様の核酸分子を提供する。したがって、タンパク質／ポリペプチドの構造に関連した疾患の治療用の医薬を製造するための、本発明の核酸分子の用途を提供する。したがって、単量体ポリペプチドをコードするＤＮＡを個体の細胞／組織内に導入し発現させて、それらの細胞／組織内でシャペロニン活性を得ることによるin vivo遺伝子治療を提供する。第16の態様において、分子（特に、タンパク質またはポリペプチド）の構造を改変するための、本発明のポリペプチドの使用を提供する。構造の改変は、フォールディング、アンフォールディングまたは再溶解によるものであることが可能である。好ましくは、本発明の単量体ポリペプチドと、改変される分子との間の化学量論は、約1：1、好ましくは1：1である。第17の態様において、分子（好ましくは、タンパク質）をリコンディショニングする方法であって、該タンパク質を本発明のポリペプチドと接触させることを含んでなる前記方法を提供する。好ましくは、該タンパク質を、該ポリペプチドとの接触の前に不活性化または変性に付す。該ポリペプチドを、固相、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスに固定化することが可能であり、タンパク質とポリペプチドとの接触は、カラムに充填したマトリックスの吸着床の最上部にタンパク質をのせ、ついで該ポリペプチドをカラムから溶出することにより行なう。したがって、本発明のこの態様は、分子（好ましくは、タンパク質またはポリペプチド）の構造を改変するための、前記ポリペプチドの使用を提供する。構造の改変は、フォールディング、アンフォールディングまたはリフォールディングによるものである。該ポリペプチドと、改変される分子との間の化学量論は、約 1：1となることが可能である。第19の態様において、本発明は、精製における、または収率、比活性もしくは生物学的分子の特性の増強における、好ましくは支持体に結合されている本発明のポリペプチドの使用を提供する。第20の態様において、本発明は、分子（好ましくは、タンパク質）をリコンディショニングまたはリフォールディングするためのキットであって、固相に固定化した前記ポリペプチドと該固相ポリペプチドを収容するための容器とを含んでなる前記キットを提供する。第21の態様において、本発明は、組換え手段によるタンパク質またはポリペプチドの製造における、前記ポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドをタンパク質またはポリペプチドと同時発現させ、それにより該タンパク質またはポリペプチドの収量または特性を改善することを特徴とする前記使用を提供する。第22の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドに対して反応性の抗体を提供する。本発明はまた、疾患の治療における、該抗体の使用を提供する。また、本発明は、タンパク質／ポリペプチドの構造に関連した疾患を治療するための医薬の製造における、該抗体の使用を提供する。第23の態様において、本発明は、疾患を治療する種々の方法、すなわち、本発明のポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、疾患の治療方法を提供する。また、本発明のポリペプチドのシャペロン活性の阻害剤の有効量を投与することを含んでなる、疾患の治療方法を提供する。好ましくは、該阻害剤は抗体である。また、本発明のポリペプチドまたはそのアンタゴニストをコードする構築物を使用する遺伝子治療による、疾患の治療方法を提供する。 GroELの単量体頂点ドメインまたはその断片は、バルナーゼのアミドプロトン交換を触媒し、補因子の不存在下でロダネーゼおよびシクロフィリンＡリフォールディングを促進する。したがって、GroELは、固有のシャペロン活性を有し、これは、そのオリゴマー状態または中心キャビティに限定されるものではない。頂点ドメインのＣ末端αヘリックスは、ポリペプチドの結合に直接関与しているわけではなく、分離したフォールディング単位を形成する。生理的温度で、該Ｃ末端の約50％がアンフォールディングし、該ポリペプチド結合「ドメインコア」の高い移動度の運動が可能になる。頂点ドメイン内の柔軟性は、異なる天然構造を有する広範囲のタンパク質の協同的結合に、また、コ・シャペロニンGroE Sに対する結合の際のGroELのコンフォメーション変化に非常に重要かもしれない。頂点ドメインの「ドメインコア」の結晶構造は、無傷GroEL内の同一領域より6 0％低い総Ｂファクターを有する。該断片の全体的なフォールドは、無傷GroELの対応領域と類似しているが、二次構造の量は、それよりかなり大きい。該断片の構造内には、ポリペプチドおよび／またはGroESの結合に関与する３個の3₁₀ヘリックスが存在する。本発明者らは、大腸菌（E．coli）内でGroELの頂点ドメインを安定な単量体タンパク質として高収率で発現させ、その活性、フォールディングおよび構造を、赤道ドメインおよび中間ドメインから独立して研究することを可能にした。単離された頂点ドメインは、ポリペプチド結合において機能的であり（図2）、それは、そのＣ末端αヘリックスH11およびH12を除去するようにトランケート化されている場合であっても、タンパク質のフォールディングを促進する（図3)。頂点ドメインは、ロダネーゼおよびシクロフィリンＡの自発的リフォールディングを、それぞれ、>15倍および>150倍減速する（図3c〜e）。本発明者らは、頂点ドメインの存在下でのロダネーゼおよびシクロフィリンＡのリフォールディング収率の増加（図3)が、再会合およびキャビティーの形成には余りにも小さすぎることを示した。このことは、中心キャビティーとは無関係な、GroELにおける内在性シャペロン活性の存在を明らかに示している。このことは、頂点ドメインの存在下でのバルナーゼに関するNMR実験と合致する（図2）。マイクロモル濃度のGroE Lの存在は、天然バルナーゼの迅速な会合および遅い回転跳躍（rotational tumb ing）のGroELからの解離のため、バルナーゼの共鳴線をかなり広げる（Zahnら（ 1996）Science 271:642-645）。頂点ドメインおよびバルナーゼが大きな分子サイズの複合体（すなわち、7分子または14分子の頂点ドメインを含有するもの）を形成するとすると、頂点ドメインの存在下でのバルナーゼのNMRスペクトルにおける相当程度の線の広がりが予想されるであろう。しかしながら、これは、Gr oELより8倍高い頂点ドメインの単量体濃度においても、観察されなかった（Zahn ら（1996）Science 271:642-645）。したがって、頂点ドメインとバルナーゼとの複合体は、低分子量であるらしく、おそらく1：1の化学量論を有し、これは、頂点ドメインおよびシクロフィリンＡの結合化学量論と合致するであろう（図3e）。単量体頂点ドメインの内在性シャペロン活性は、無傷GroELの存在下で生理的条件、GroESおよびATPが要求される場合であっても、ロダネーゼのリフォールディングを促進する。本発明者らは、いずれかの特定の仮説に束縛されることを望むものではないが、GroESの役割は、基質に対するGroELの親和性を弱め、凝集傾向に有る状態の早すぎる解離を防ぐことであるらしい。アニーリング活性に関する強固な結合と、フォールディングを可能にする、より弱い結合との間に、平衡が存在していなければならない(Corrales F JおよびFersht A R（1996）Proc Na tl Acad Sci USA 93：4509-4512）。該断片に対するロダネーゼの、より弱い結合は、シャペロニン活性に適したものでなければならず、フォールディングするのに十分に弱くなければならない。これは、頂点ドメインの存在下およびGroEL 、GroESおよびATPの存在下でのロダネーゼのリフォールディングに関して認められている類似した速度定数と合致し（図3b〜d）、類似した結合親和性を示すものである。GroELの複合体構造、およびGroESおよびヌクレオチドによるその基質親和性のモジュレーションは、GroELに対する多種多様な親和性を有する広範囲のタンパク質の有効なフォールディングを可能にするものでなければならない。一般には、そのメカニズムは、いくつかの成分が関与している可能性がある。すなわち、GroESは、GroEL−基質複合体のシス末端に結合し、結合しているポリペプチドを該キャビティ内へ移動させ、ついで解離した及び封入されたポリペプチド鎖が、拡大したフォールディングキャビティ内で天然様状態にリフォールディングし、やがてそれがGroESの解離に際して遊離される。基質タンパク質が天然コンフォメーションを取ることが可能になる前に、フォールディングしていないタンパク質、GroES、ATPおよびGroELの結合および解離の周期が数回繰返されることがある（Huntら（1996）Nature 379:37-45；Weissmanら（1996）Cell 84:48 1-490;Weissman J Sら（1995）Cell 83:577-587;Mayhew Mら（1996）Nature 379 :420-426;Corrales F JおよびFersht A R（1996）Proc Natl Acad Sci 93：4509 -4512）。GroELに対する中程度の親和性を有するポリペプチド、例えばシクロフィリンＡ（図3e）は、GroELに一過性に結合し、補因子を要することなくフォールディングが促進される。ヘリックスH11およびＨ12は、頂点ドメインの「ドメインコア」よりはるかに不安定であり、別個のフォールディング単位を形成する（図4）。生理的温度では、該低融解性ヘリックスの二次構造の約50％がアンフォールディングして、柔軟になる。しかし、in vivoでは該Ｃ末端は分解せず、このことは、該一次構造が、大腸菌（E．coli）プロテアーゼによる分解の影響を受けにくいことを示唆している。該Ｃ末端ヘリックスの低い安定性のため、GroEL環内での「ドメインコア」の移動およびより大きな変動が可能となる。頂点ドメインのこの柔軟な配置は、アンフォールディングしたポリペプチドが各環内のGroELの7個のサブユニットに協同的に結合するのに関与している可能性がある。異なるアミノ酸配列、二次構造および三次構造を有する多種多様なタンパク質に対する結合のために、柔軟性が要求されると理解することができる。また、認められる該Ｃ末端の低い安定性が、GroESの結合の際のGroEL内での大きなコンホメーション変化の一因である可能性があり、これは、中間ドメインのβシートヒンジ領域を介した剛体運動により生じると示唆されている（Braig Kら（1994）Nature 371）。本発明者による頂点ドメインの単量体断片の製造および結晶化は、おそらく、結晶内の有利なパッキング相互作用のため、またはGroEL断片内の柔軟なＣ末端の不存在のため、または両者の組合せのため、GroEL内の同等の領域のＢファクターよりはるかに低いＢファクターを有するGroELのポリペプチド結合部分の三次元構造の決定を可能にした（図5）（Braig Kら（1994）Nature 371:578-586;B raigら（1995）Nature Struct Biol 2:1083-1094;Boisvertら（1996）Nature St ructure Biology 3:170-177）。特に興昧深いのは、頂点ドメイン内の3₁₀ヘリックスの存在である。これらの緊密にパッキングされたヘリックスは、αヘリックスほど一般的ではなく、それらの大多数は非常に短く、96％が4残基未満である。それらは、通常、このコンホメーションを有する可能性がある最終ターンを含有するαヘリックスの末端、または２つのβ鎖の間に見出される。頂点ドメインの3₁₀ヘリックスのすべては、ポリペプチドおよび／またはGroES結合に関与していることが示されている領域内に局在している（Fentonら（1994）Na ture 371:614.619）。3番目の3₁₀ヘリックスは、10残基の特異な長さを有する。同様の長さ（9残基）を有する3₁₀ヘリックスが、カルビン回路の酵素であるアコニターゼ中で見出されている。また、興昧深いことに、該頂点ドメインおよびアコニターゼは、類似したフォールディング（すなわち、αヘリックスに結合した中心βシート）を共有しており、このことは、それらが、基質結合に関する共通のメカニズムを用いていることを示唆している。つぎに、本発明の好ましい実施態様を、以下の添付図面を参照して実施例により詳しく説明する。図１は、Ｎ末端ヒスチジンテイル（ht）を与えるアミノ酸残基（配列番号8）を含む、大腸菌（E．coli）由来のGroELの頂点領域のアミノ酸配列（配列番号9 ）を示す。図2aは、アンフォールディングしたバルナーゼのアミドプロトン交換に対する GroEL 191-345の触媒効果を示す棒グラフである。GroEL断片の不存在下（Ｐ）および存在下（Ｐ＋(Ｇ)）におけるバルナーゼの39個の測定可能なアミドプロトンの保護ファクターの比率を示す。図2bは、17残基のＮ末端ヒスチジンテイルを有するGroEL断片191-345（sht-Gr oEL 191-345）に関する、図2aと同様の棒グラフである。図2cは、17残基のＮ末端ヒスチジンテイルを有するGroEL断片191-376（sht-Gr oEL 191-376）に関する、図2aと同様の棒グラフである。図2dは、GroEL断片191-345に関する、シャペロニンの存在下における実測交換速度定数（k^obs _ex(+Ｇ)）に対するシャペロニンの不存在下における実測交換速度定数（k^obs _ex）のプロットである。全体的（global）、混合および局所的なアミドプロトンを、それぞれ、円、三角および正方形で示す。図2eは、sht-GroEL 191-345に関する、図2dと同様のプロットである。図2fは、sht-GroEL 191-376に関する、図2dと同様のプロットである。図3aは、GroEL、GroES、ATP、sht-GroEL 191-345、sht-GroEL 191-376またはウシ血清アルブミン（BSA）の存在下または不存在下におけるリフォールディング後のロダネーゼの相対酵素活性を示す棒グラフおよび表である。図3bは、GroEL、GroESおよびATPの存在下におけるロダネーゼのリフォールディング速度論を示すプロットである。図3cは、種々の濃度のsht-GroEL 191-345の存在下におけるロダネーゼのリフォールディング速度論を示すプロットである。図3dは、種々の濃度のsht-GroEL 191-376の存在下におけるロダネーゼのリフォールディング速度論を示すプロットである。図3eは、特定の濃度のsht-GroEL 191-376、sht-GroEL 191-345およびGroELのリフォールディング速度論を比較するプロットである。図4aは、222nmでの遠紫外線円二色性によりモニターしたsht-GroEL 191-376（上側の軌跡）およびsht-GroEL 191-345（下側の軌跡）の熱変性の軌跡である。図4bは、示差走査熱量測定法により熱変性をモニターした、図4aと同様の軌跡である。図5aは、sht-GroEL 191-345の構造を三次元的に示す。図5bは、sht-GroEL 191-345のバックボーン構造を三次元的に示す。図5cは、ヘリックスH8およびH9に沿って眺めたsht-GroEL 191-345の電子密度を三次元的に示す。図6は、リフォールディング緩衝液で展開される固定化GroEL 191-345のカラムからの変性突然変異体IGPSの溶出を示す軌跡である。図７は、Ｎ末端メチオニンから番号づけされている、大腸菌（E．coli）由来のGroELのアミノ酸配列（配列番号10）を示す。図8は、GroELの一部のアミノ酸配列（配列番号11）を示す（結合性ペプチドに関与する残基が強調されている）。図9a〜cは、比較のために互いに整列させた、公知cpn60ファミリーメンバーの部分アミノ酸配列を含む。実施例1：GroELの頂点ドメインおよびその種々の断片のクローニングおよび発現 GroELの頂点ドメイン（GroEL 191-376）と該頂点ドメインの種々のＣ末端トランケート化断片とを、操作されたトロンビン切断部位を含有するＮ末端ヒスチジンテイルをコードするpRSET Aベクター（Invitrogen）のポリリンカー部位内に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりクローニングする。該ヒスチジンテイルは、36アミノ酸（Invitrogen）または17アミノ酸を含む。該PCR反応には、B amHIおよびCeoRI制限酵素部位を有するそれぞれのGroEL断片に隣接する２個のプライマーと共に、鋳型としてプラスミドpOF39（Fayet Ｏら（1989）J Bacteriol 171:1379-1385）を使用する。これは、pRSET Aのポリリンカー内へのPCR断片のクローニングを可能にする。PCRは、望ましくないランダム突然変異の危険性を減少させるためにPfu（Stratagene）で行なう。該反応は、25μｌの容量中、400 nMのプライマーおよび200μＭのデオキシヌクレオシド-5'-三リン酸により25サイクルで行なう。アニーリング温度は65℃である。以下のプライマーを該PCTで使用して、GroELの頂点領域とその種々の断片とをコードするＤＮＡを得た：5フランキング：5'-CGG ATC CGA AGG TAT GCA GTT CGA CCG（配列番号1）；3'フランキング(s)ht-GroEL 191-376，5'-CGA ATT CTT AAA CGC CGC CTG CCA GTT TCG （配列番号2）；3'フランキング(s)ht-GroEL 191-345,5'-CGA ATT CTT AAC GGC CCT GGA TTG CAG CTT C（配列番号3）；3'フランキングht-GroEL 191-337，5'-C GA ATT CTT AAC CCA CGC CAT CGA TGA TAG TGG TG（配列番号4）；3'フランキングht-GroEL 191-328，5'-CGA ATT CTT AGT CTT TGT TGA TCA CAA CAC GTT TAG C CT GAC（配列番号5）；3フランキングht-GroEL 191-322，5'-CGA ATT CTT AAC G TT TAG CCT GAC CCA GGT CTT CCA（配列番号6）；3'フランキングht-GroEL 191- 298，5'-CGA ATT CTT AAC CGC CAG TCA GGG TTG CGA TAT C（配列番号7）。大腸菌（E．coli）TG2細胞内でのGroELの断片の発現および精製には、以下のプロトコールを用いる。図1に関しては、使用する発現ベクターは、36アミノ酸を含みトロンビン切断部位（垂直の矢印）を含有するＮ末端ヒスチジンテイル（ ht）をコードしている。あるいは、17アミノ酸を含有する、このヒスチジンテイルより短い形態（sht）を使用する。産生する融合タンパク質（すなわち、ht-Gr oEL 191-298、ht-GroEL191-322、ht-GroEL 191-328、ht-GroEL 191-3 37、ht-GroEL 191-345、ht-GroEL 191-376、sht-GroEL 191-345およびsht-GroEL 191-376)のＮ末端およびＣ末端は、長方形の矢印で示されている。 2リットルのL-ブロス培地およびアンピシリンに、それぞれのプラスミドを含有するTG2細胞の一晩培養物を１：100で播く。0.3のＡ₆₀₀にて、最終濃度0.2mM のイソプロピル-1-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシドおよび10ファージ/細胞の感染多重度のM13/T7-ファージで発現を誘導する。該細胞を、誘導の8時間後に集め、遠心分離し、200mlの緩衝液Ａ（50mM Tris-HCl ｐＨ8.2，300mM NaCl）に再懸濁する。超音波処理および遠心分離の後、可溶性タンパク質画分を20mlのニッケル-NTA アガロース樹脂に加え、10分間攪拌する。該樹脂を200mlの緩衝液Ａで洗浄し、融合タンパク質を含有するヒスチジンテイルを、200mMイミダゾールを含有する5 0mlの緩衝液Ａで溶出する。溶出されたタンパク質を、80％硫酸アンモニウムで沈殿させ、4mlの緩衝液Ｂ（50mM Tris-HCl ｐＨ8.2，150mM塩化ナトリウム）に再溶解し、HiLoad 26/60 Superdex 75カラム（Pharmacia）上にローディングし、それを緩衝液Ｂで平衡化する。ht-GroEl 191-376をトロンビンで切断した後、ゲル濾過を行なうことにより、断片GroEL 191-345を得る。該切断反応は、ニッケル-NTAカラムから溶出したタンパク質溶液に250μｌのトロンビン（Sigma，1U /μｌ）を加えた後、緩衝液Ｂ中で数日間行なう。定量的アミノ酸分析、Ｎ末端配列決定および質量分析により、該GroEL断片を分析する。図１では、ボックスおよび矢印により、それぞれαヘリックス（灰色）または 3₁₀ヘリックス（白色）およびβシート構造に関して二次構造が示されている。残基191-336の二次構造の帰属は、PROCHECK（Laskowski R Aら，（1993）JAppl Cryst 26:283-291）ならびにKabschおよびCander（Kabsch WおよびSander C（19 83）Biopolymers 22:2577-2637）のアルゴリズムを用いて、sht-GroEL 191-345 の結晶構造（表1および図5）に基づいて行なう。αヘリックスの番号付け及び残基337〜376の二次的帰属は、Braigら（Braig Kら(1995)Nature Struct Biol 2:1 083-1094）に従う。 GroELのポリペプチド結合性部分のシャペロン活性、フォールディングおよび結晶構造の研究を可能にするために、GroELの機能的頂点ドメインと該頂点ドメインの種々の機能的断片とを大腸菌（E．coli）内で発現させる。特に、Gro ELの頂点ドメイン（GroEL 191-376）と該頂点ドメインの種々の断片（図1）とを、Ｎ末端ヒスチジンテイルを含有する融合タンパク質として大腸菌（E．coli）内で発現させ、これにより、ニッケル-ニトリロ-トリ-酢酸（NTA）結合アガロース樹脂を用いる直接的な精製が可能となる。39アミノ酸のヒスチジンテイル（ht ）または17アミノ酸のヒスチジンテイル(sht)は、6個のヒスチジン残基の配列およびトロンビン切断部位を含有する。該頂点ドメインは、Ｃ末端αヘリックスH1 1およびH12を欠くそれより小さい断片と同様、培養物1リットル当たり>20mgの精製タンパク質で発現される。さらに、残基329の前のトランケート化は、頂点ドメインの相当の不安定化を招く。ヒスチジンテイルを含有せずその２つのヘリックスを有さない断片GroEL 191-345は、精製されたht-GroEL 191-376のトロンビン切断により得られる。該頂点領域および単量体断片は、シャペロン活性を有することが判明している。速紫外（UV）領域および近紫外領域におけるsht-GroEL 191-376、sht-GroEL 1 91-345およびGroEL 191-345の円二色性（CD）は、それぞれ、天然様の二次構造および三次構造を示した。頂点ドメインと、345位でトランケート化された断片とは、マイクロモル濃度において、超遠心分離による測定で単量体である。しかしながら、GroEL 191-345の核磁気共鳴（NMR）スペクトルにおける線幅は、17kD のタンパク質に関して予想されるものより大きいが、安定なダイマーに関するものより小さく（データは示していない）、このことは、NMRの時間 R of Proteins and Nucleic Acids(Wiley，New York，1986)）。該頂点ドメインにおいては、低い親和性の自己認識が存在するらしい。実施例2：アンフォールディングしたバルナーゼに対するGroEL 191-345、sht-Gr oEL 191-345およびsht-GroEL 191-376の結合交換実験は、Zahnら（1996）Science 271：642-645に記載のとおり、20mMイミダゾール緩衝液中、33℃で行なう。バルナーゼの濃度は、2.4mMである。結果を図2a、2bおよび2cに示す。局所的または全体的に交換するアミドプロトン、および両方のメカニズムの混合により交換するアミドプロトン（Perrettら（1995）Biochemistry 34:9288-9298およびClarkeら（1993）Proc Natl Acad Sc i USA 90:9837-9841）を、それぞれ白色、黒色および灰色の棒線で示す。Trp71 のインドールのNHプロトンを、71sで示す。同じ実験を、それぞれ図2d、2eおよび2fに示す。図2d中のデータは、k^obs _ex(+ Ｇ)＝Ck^obs _ex（式中、Ｃは、EX2メカニズムの交換がGroEL断片により触媒される場合の係数である）に適合する。バルナーゼの全体的、局所的および混合アミドプロトンに関するＣの値は、10、5および1である。図2eおよび2fのデータは、ｋ^obs _ex (+Ｇ)＝Ck^obs _ex＋k^obs _ex(Ｇ.Ｕ.)（式中、k^obs _ex(Ｇ.Ｕ.)は、GroEL断片の存在下におけるバルナーゼの全体的な交換に関する実測EX1速度定数である）に適合する。図2d、2eおよび2fは、バルナーゼのアミドプロトン交換のメカニズムを示すものである。図2aおよび2dにおいて、GroEL断片濃度は、その最終濃度の推定値が示されているにすぎない。使用した高い初期タンパク質濃度では、GroE L 191-345は、交換実験中に結晶化する傾向にあった。図2a、2bおよび2cは、天然バルナーゼのアミドプロトン（これは、その完全なアンフォールディング状態からしか交換しないことが知られている（Perrettら，（1995）Biochemistry 37:9288-9298））の交換を、フォールディング条件下でGroEL断片が触媒することを示す。したがって、無傷のGroEL（Zahnら（1996） Science 271:642-645）と同様に、該頂点ドメインは、アンフォールディングしたバルナーゼに高い親和性で結合し、ヘリックスH11およびH12は、ポリペプチド結合に必須ではない（図2aおよび2b）。Ｎ末端ヒスチジンテイルの存在は、結合活性を損なわない（図2bおよび2c）。 pD6.6における交換のメカニズムはEX2であるが（図2d）、より高いpDではEX1 に変化する（図2eおよび2f）。EX2メカニズム（Hvidt AおよびNielsen S O（196 6）Advan Protein Chem 21:287-386）においては、実測速度定数は、交換に関する固有速度定数（これは、pDに依存する）に制限される。EX2メカニズムの判断基準は、再保護（すなわち、リフォールディングまたば解離反応）に関する速度定数が固有速度定数よりはるかに大きいことである。逆に固有交換が再保護よりはるかに速い場合には、該メカニズムはEX1になり（Hvidt Aおよび Neilsen S O（1996）前掲）、該実測速度定数は、脱保護された（unprotected）状態の形成に関する速度定数に単純に等しくなる。したがって、交換挙動から（そして、ヒスチジンテイルの存在が結合に影響を及ぼさないと仮定すると）、該頂点ドメインからのバルナーゼの解離に関する速度定数は約2s^-1であり、これが無傷のGroELからの値より5倍大きいとは決して言えない（Zahnら（1996）前掲）。実施例3：ロダネーゼのリフォールディング GroEL，GroES、ATP、sht-GroEL 191-345およびsht-GroEL 191-376を使用して、Horowitz（Horwitz P M，Protein Stability and Folding（Shirley B A編）3 61-368(Humana Press，1995)）に記載のとおりに、ロダネーゼのリフォールディングアッセイを行なう。より詳しくは、ロダネーゼ（9μＭ）を、8M尿素および1mMβ-メルカプトエタノールの存在下、25℃で45分間アンフォールディングさせる。アンフォールディングしたロダネーゼ3μｌを、50mM Tris-HCl（ｐＨ7.8）、50mMチオ硫酸ナトリウム、10mM MgCl₂、10mM KClを含有する標準緩衝液250μｌの最終容量に希釈することにより、リフォールディングを開始させる。示されているとおりに、GroE L GroES、ATP、頂点ドメイン（またはそのＣトランケート化形態）およびウシ血清アルブミン（BSA）を、それぞれ、2.5μＭ（単量体）、2.5μＭ（単量体）、２mM、2.5μＭおよび45μｇ/ml（GroEL断片と同じ重量濃度）の最終濃度で加える。 25℃で50分間のインキュベーションの後、該リフォールディング混合物からの 25μｌを、1mlの50mM Na₂S₂O₃、50mM KCNおよび40mMリン酸カリウム緩衝液（pH8 .6）に加えることにより、ロダネーゼ活性を測定する。15分のインキュベーションの後、0.5mlの18％ホルムアルデヒドを加えることにより、該反応を停止させる。1.5mlの硝酸第二鉄試薬(（400gのFeNO₃.9H₂）、800mlの65％HNO₃を最終容積 3dm³でPerrettら（1995）前掲に記載のとおりに調製したもの）と最終容量3dm³ で混合することにより、発色させる。図3aは、GroEL（2.5μＭの単量体）、GroES（2.5μＭの単量体）、ATP（2 mM）、sht-GroEL 191-345（2.5μＭ）、sht-GroEL 191-376（2.5μＭ）またはウシ血清アルブミン（BSA;45μｇ/ml）の存在下（＋）または不存在下（−）でのリフォールディング（8M尿素（Ｕ）から）の後の、ロダネーゼ（0.1μＭ）の相対酵素活性を示す。100％の活性は、天然ロダネーゼ（Ｎ）単独で得られる。図3bは、GroEL．GroESおよびATPの存在下（・）におけるロダネーゼのリフォールディング速度論を示す。最終濃度は、図2aと同じである。100％の活性は、天然ロダネーゼ（Ｏ）で得られる。図3cおよび3dは、それぞれ、0.18μＭ（）、2.5μＭ（・）、または5μＭ（Ｏ）sht-GroEL 191-345およびsht GroEL 191-376の存在下におけるロダネーゼのリフォールディング速度論を示す。図3aは、アンフォールディングしたロダネーゼ（Ｕ）単独の対照で示されるバックグラウンドリフォールディングより約37.5％高いshtGroEL 191-345に関する約42.5％のロダネーゼのリフォールディング活性を示す。図3bの結果は、比較のためのものであり、GroEL、GroESおよびATPのリフォールディング活性の時間経過を示している。図3cは、sht-GroEL 191-345の種々の濃度におけるロダネーゼのリフォールディング速度論を示す。約50％のリフォールディング活性が約25分の時点で得られる。図3dは、sht-GroEL 191-376に関する図3cと同様の図面であり、25分後に約40 ％のリフォールディング活性を示している。チオシアナートと第二鉄イオンとの間で形成した複合体の460nmでの吸光度から、酵素活性を得る。結果は、3個の異なる独立したアッセイの平均に対応する。標準誤差の棒線を示す。b〜dは、aと同様であるが、リフォールディング反応を停止するために、GroEL活性を阻害する10mMトランス-1,2-シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸（CDTA）または該頂点ドメインを飽和させる0.5mg/mlのカゼインの存在下でロダネーゼ活性をアッセイする。最大リフォールディング収率は、頂点ドメインとロダネーゼとのモル比が1以上の場合に得られ、それから、>1×10^-7Mの解離平衡定数が推定される。実施例4：シクロフィリンＡのリフォールディングシクロフィリンＡを用いて、sht-GroEL 191-345およびsht-GroEL 191-376のシャペロン活性を試験する。8M尿素変性タンパク質（100μＭ）を100mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.0）、10mM DTT中に1μＭの最終濃度にまで希釈することにより、シクロフィリンＡのリフォールディングを開始させる。リフォールディング緩衝液中のGroELおよび頂点ドメインの最終濃度は、それぞれ、7μＭおよび4μ Ｍまたは1μＭである。リフォールディング温度は25℃である。示されている時間のインキュベーションの後、文献記載（Fischer Gら（1984）Biomed Biochim Acta 43:1101-1111）のとおりにシクロフィリン活性を測定する。シクロフィリンＡの自発的リフォールディングは、約30％の収率になるまで生じ、1分以内に終了する。標準誤差は5％である。図3eは、7μＭのGroEL単量体（Ｏ）、4μＭ sht-GroEL 191-345（・）、4μＭ sht-GroEFL 191-376（）または1μＭ sht-GroEL 191-376（）の存在下における 1μＭシクロフィリンＡのリフォールディングを示す。100％活性は、天然シクロフィリンＡで得られる。図3eは、不活性化されたシクロフィリンＡの100％のリフォールディングが、sht-GroEL 191-345またはsht-GroE 191-376で達成され、これが、GroELで認められるものと同等であることを示している。シャペロンの不存在下では、シクロフィリンＡは低収率でしかりフォールディングしないが、GroEL単量体の存在下では、一過性の複合体の形成のためリフォールディングが促進される（Zahnら（1996）FEBS Lett 380:152-156を参照されたい）。シクロフィリンＡのリフォールディングに関して同様の速度定数が、無傷GroEL単量体の存在下およびGroEL断片の存在下で見出され、これは、4倍以内であればシャペロン濃度に依存しない（図3e）。最大リフォールディング収率が、シクロフィリンＡおよび頂点ドメインの化学量論濃度で得られ、このことは、リフォールディング中にシャペロン断片と基質タンパク質との間の1：1複合体が形成することを示している。実施例5：sht-GroEL 191-376およびsht-GroEL 191-345の熱変性 222nmの遠紫外円二色性（UV-CD）でモニターする熱変性を、Neslab RTE- 100水浴に接続したJascc:J720分光旋光計上で、1ｍｍの経路長の恒温化キュベット(Helma)を用いて行なう。該温度を、50℃/時間の直線比率で増加させる。該タンパク質濃度は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中40μＭである。データは、変性の中間温度であるT_mを求めるための変性曲線（Pace，ＣＮ（1990）Tr ends Biotechnol 8:93-98）に適合する。また、熱変性は、示差走査熱量測定法（DSC）によりモニターし、該測定は、6 0℃/時間の概念走査速度でMicrocal MC-2D装置を用いて、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）中、88±５μＭのタンパク質濃度で行なう。サンプルの調製およびデータの分析は、既に記載されているとおりに（Johnson C MおよびFersh t A R（1995）Biochemistry 34:6795-6804）行なう。両タンパク質は、再走査サンプル上で得た吸熱の範囲から判断した場合、それらの熱アンフォールディングにおいて少なくとも50％の可逆性を示す。より高い可逆性レベルは、より低い濃度で得られるか、あるいは主要アンフォールディング遷移に近い温度で走査を停止することにより得られる。sht-GroEL 191-376で認められる低い温度の遷移は、50℃未満の温度に限定された走査で完全に可逆的である。図4aは、遠UV-CDの結果を示し、図4bは、DSCの結果を示す。各図において、sh t-GroEL 191-376は上側の軌跡、sht-GroEL 191-345は下側の軌跡である。該Ｃ末端ヘリックスは柔軟であることが判明している。該頂点ドメインと345 位でトランケート化されている断片とは、加熱または尿素により可逆的に変性し、該変性は、Ｎ末端ヒスチジンテイルに影響されない。34℃および67℃に、２つの協同的フォールディング遷移が存在する。45℃では、該頂点ドメインのCDスペクトルは、該トランケート化ドメインのものと同一である。したがって、該Ｃ末端αヘリックスは、より低温で、かつ、「ドメインコア」から独立して融解するに違いない。sht-GroEL 191-376中の追加的な31アミノ酸の第2の協同的遷移が、 DSCにより確認される：（図4b）。また、比色データは、単量体としての該頂点ドメインのアンフォールディングと実質的に合致する。生理的温度では、ヘリックスH11およびH12の約50％が、アンフォールディングしたコンホメーションで存在し、したがって柔軟性を有する。実施例6：GroEL断片の結晶化および回折研究 22％ PEG 4000、100mM Tris-HCl（ｐＨ8.5）および200mM LiSO₄よりなる貯蔵器に対して平衡化したsht-GroEL 191-345（23mg ml^-1）、11％PEG4000、50mM Tr is-HCl（ｐＨ8.5）および100mM LiSO₄を最初に含有する懸滴から、結晶を得る。 Daresbury，UKのSynchrotron Radiation Source（SRS）のステーション9.6において30cmのMar Researchイメージプレート検出器を用いて、毛管を配置した結晶から4℃でＸ線データを集める（λ＝0.87Å）。特に示さない限り、すべてのデータの処理、データの整理編集、電子密度の合成および構造分析は、CCP4ソフトウェア（Daresbury Laboratory，Warrington，UK）を用いて行なう。回折データのインデクシングおよび強度測定は、MOSFLMプログラムセットLeslie A C．W（J oint CCP4 and ESF-EACMB Newsletter on Protein Crystallography No26（Dare sbury Laboratory，Warrington，UK，1992)）で行なう。該構造は、プログラムAMORE（Navaza J（1994）Acta Crystallogr A 50:157-1 63）とGroELの精密化された構造の残基191〜345よりなる検索モデル(Braigら（1 995）Nature Struct Biol 2:1083-1094）とを用いて、通常の分子置換法（molec ular replacement methods）により導く。該不斉単位は、51％の溶媒含量に相当する1個のタンパク質分子を含有する。モデルの再構築および精密化は、Ｏ（Jonesら（1991）Acta Crystallogr A 47 :110-119）で行ない、該構造は、EnghおよびHuberのパラメーター（Engh R AおよびHuber R（1991）Acta Crystallogr A 47:392-400）を用いて、X-PLO NMR（Yale Univ Press，New Haven，CT，1992)）を用いて行なう。本モデルは、 8個の水分子を含有するものであり、Ｃ末端からの残基302〜307および残基337〜 345において電子密度が不十分であるか又は存在しないためにモデル化できなかったことを除き、完全なものである。また、Ｎ末端Hisタグに関する電子密度は、認められない。許容されないバックボーンφΨ角を有する残基はなかった。表 1に、結晶データを要約する。 ^★括弧内に記載の値は、最高分解殻（highest resolution shell）に関するものである。^† 同じ反射の繰返し測定の強度間での一致を示し、これは、Σ(I_h,i−<I_h>)/Σi_h,i （式中、I_h,iは個々の値であり、<I_h>は反射ｈの強度の平均値である）で定義することができる。^‡ 自由Ｒファクターは、10％データを該精密化から省略して算出する（DATAMAN （Kleywegt，G.J.およびJones，t.A．Acta．crystallogr．D 50，178-185(1994) ）を用いて調製した試験セット）。実施例7：sht-GroEL 191-345の三次元構造図5aは、MolScript（KraulisP J(1991)J Appl Crystallogr 24:946-95 0）およびRaster3D（Merrit E AおよびMurphy M E P（1994）Acta Crystallogr D 50:869-873）で描いた二次構造の表示を示す。ヘリックスは、Braigら（Braig ら（1995）Nature Struct Biol 2:1083-1094）のとおりに表示されている。ＮおよびＣは、該モデルのＮ末端（残基191）およびＣ末端（残基336）を意味する。図5bは、主要鎖原子のＢファクターに従い着色化（colour-coded）し(青（20 Å²）から赤（60Å²））、図5aと同じ配向で、プログラムＯ（Jonesら（1991）A cta Crystallogr A 47:110-119）で描いたバックボーンの表示である。図5cは、ヘリックスH8およびH9に沿って眺めた、精密化座標を用いて算出された電子密度の代表的領域を示す。 sht-GroEL 191-345の結晶は、1不斉単位当たり1分子を有する三方晶系空間群P 3₁21で成長し、51％の溶媒含量を与える。「ドメインコア」の三次元構造は、分子置換により導かれ、8.0Åと2.5Åとの間の全データに関して21.4％のＲファクターおよび29.1％の自由Ｒファクターに精密化される（表1）。電子密度地図の定性を、図5cに示す。全体的には、sht-GroEL 191-345は、無傷GroELタンパク質の対応領域と同じフォールディングを有し（図5a）、βサンドイッチを形成する2個の直交βシートが、3個のαヘリックスに隣接している。該構造は、該無傷タンパク質の頂点ドメインより秩序正しく、より良く解像されており（図5b）、GroEL構造の残基191 -336に関する平均Ｂファクターが97Å²であるのに対して、その平均Ｂファクターは42Å²である。残念なことに、結晶構造との比較にNMR構造の平均形態を用いることが誤りにつながりうるのと同様に、GroEL構造中のそのような異常に高い無秩序性のため、構造的比較の解釈が困難になり、本発明者らは、ここではそれを行なっていない。本質的には、該構造は、比較的柔軟ならせん領域およびループ領域に隣接した十分に秩序正しいβサンドイッチ骨格として説明することができる。特に、ほとんどのβ鎖、αヘリックスおよびループ構造のβファクターは、それぞれ約20、40および60Å²である（図5b）。相当に無秩序な2つの領域が存在する。まず第１に、αヘリックスH11の最初の半分に対応するＣ末端残基337-3 45に関しては、電子密度が認められない。これは、前記のフォールディング実験の結果と一致する。第2に、残基302-307に関する電子密度は、非常に不十分であり、断片的である。この領域は、無傷GroELの構造中の最も無秩序なセグメント部分である（Braigら（1995）Nature Struct Biol 2:1083-1094 ）。GroEL断片のαヘリックスおよびβシートの二次構造の含量（図1）は、無傷 GroELの対応領域と比べて、それぞれ48％および74％高い。この新規構造中には、二次構造の４個の追加的セグメントが存在する（図1および5a）。残基299-301 は、短いβ鎖を形成し、残基201-205、229-232および308-317は、3₁₀ヘリックスを形成している。，実施例8:IGPS（49-252）（残基1-48を欠くインドールグリセロールリン酸シンターゼ）のリフォールディングクロマトグラフィー６個のヒスチジン残基を含有する17残基のＮ末端テイルを有する断片GroEL(19 1-345)またはGroEL(191-376)を、大腸菌（E．coli）内で発現させて、それらの精製が、Ni-NTA樹脂を用いて可能となるようにする（アガロースによりキレート化される該Ni²⁺は、該ヒスチジンタグに結合する）。まず、予備的な目的のために、精製されたGroEL(191-345)またはGroEL(191-376)を、それらのヒスチジンタグにより固定化するために、同じ樹脂を使用する。ついで、CNBr活性化を介して、該精製断片をアガロースに共有結合させる（Axen Rら（1967）Nature 1302-13 04）。その固定化されたGroEL断片は、シクロフィリンＡのリフォールディングを高い効率で促進することが判明している。 GroEL(GroEL（191-376)）の頂点ドメインと該頂点ドメインの「コア」（GroEL (191-345)）とを、クローニングし、17残基のＮ末端ヒスチジンテイルを含有する融合タンパク質として大腸菌（E．coli）内で発現させる。該断片を、2つの方法により固定化する。Ａ）Ni-NTA樹脂に結合した固定化頂点ドメイン Ni-NTA樹脂（ＱIAGENから入手）は、セファロースCL-6Bに結合した高い表面濃度のニトリロ-トリ-酢酸（NTA）リガンドよりなるキレート化された吸着剤である。該ＮＴＡは、Ni²⁺イオンの配位圏内の６個のリガンド結合部位のうちの4個を占拠し、該Ｎ末端テイル内の6個のヒスチジンとの自由な相互作用のために2 個の部位を解放する。該タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれか一方に位置する1以上の6×Hisアフィニティータグを含有するタンパク質は、ある親和性（Ｋ_d=10^-13Ｍ，ｐＨ7.8）でNi-NTA樹脂に結合する。6×His/Ni-NT A相互作用の安定性は、6M塩酸グアニジン、8M尿素などの強い変性剤、または低レベルのβ-メルカプトエタノール（1〜10mM）の存在には影響されない。3.5mL のNi-NTA樹脂を、5mMβ-メルカプトエタノールを含有する0.1Mリン酸カリウム（ｐＨ7.8）で平衡化させる。アフィニティーゲルを飽和させるために、該GroELドメインを加え（ゲル3.5mL当たリタンパク質21mg）、穏やかに混合しながら室温で30分間インキュベートする。該ゲルを、FPLCに適したカラム（5×100mm、Phar maciaから入手）に充填し、開始緩衝液で十分に洗浄する。Ｂ）CNBr活性化セファロース4Bに結合した固定化頂点ドメイン立体効果を最小限に抑え、頂点ドメイン内の結合部位の構造を維持するために、結合前に、該活性化ゲルの制御化された加水分解により該ゲルの結合能を減弱させる。300mgの凍結乾燥粉末を、50mMのNaHCO₃（ｐＨ8.3）に懸濁し、同じ緩衝液で洗浄し、ガラス濾過器（G3）上で再膨潤させ、ついで該緩衝液に懸濁し、エンドオーバーエンド（end-over-end）シェーカー中、室温で４時間混合する。結合緩衝液（0.1M NaHCO₃ ｐＨ8.3および0.5M NaCl）に溶解した頂点ドメインを、該ゲル懸濁液（10mgタンパク質/mLゲル）に加え、エンドオーバーエンドシェーカー中、室温で6時間混合する。ついで、それを該結合緩衝液で洗浄する。2.5M エタノールアミン（ｐＨ8）を加え、室温で4時間振とうすることにより、残りの活性基を遮蔽する。未結合の頂点ドメインを、高および低ｐＨの緩衝溶液（0.5M NaClを含有するTris-HCl 0.１M ｐＨ7.8）、ついで酢酸緩衝液（0.1M,ｐＨ4および0.5M NaCl）の交互の5サイクルの洗浄により除去する。最後に、該ゲルを、 5mM 2-メルカプトエタノールを含有するｐＨ7.8の0.1Mリン酸カリウム（リフォールディング緩衝液）で洗浄する。Ｃ）NHS-セファロースに結合した固定化頂点ドメインリガンドの結合： NHS活性化セファロース（5ml）を、HiTrap NHS活性化カラムから取り出し、ブフナー漏斗を使用して1mM HCl（氷冷）で十分に洗浄（50ml）する。ついで該結合溶液（ミニシャペロン）を、所望の濃度（10mg/ml）で該スラリーに加える。結合溶液： NaHCO₃（ｐＨ9）、0.5M NaCl中のミニシャペロン（10mg/ml）を穏やかに混合し、ついで硫酸ナトリウムの飽和溶液を、それがちょうど曇り始めるまで（該濃度が沈降点に到達する直前まで）加える。支持体と反応させる際、該反応管を室温で約20時間回転させることにより穏やかに攪拌する必要がある。固定化され、いずれかのクエンチング反応が完了したら、該支持体を、まず結合緩衝液で、ついで高塩（1M NaCl）緩衝液で十分に洗浄して、タンパク質／タンパク質相互作用により該支持体に結合している可能性があるリガンドを除去する。余分な基を、室温で少なくとも４時間または一晩、1Mエタノールアミンで遮蔽し、該セファロースを重炭酸塩緩衝液（0.1M，ｐＨ9.2）および酢酸緩衝液（0.1 M，ｐＨ4.0）で洗浄した後、リフォールディング緩衝液中での最終洗浄を行なう。該固定化断片を、クロマトグラフィーカラム中で使用する（図6）。尿素中の変性タンパク質を、該カラムに加え、リフォールディング緩衝液で展開する。該タンパク質を通常の結合カラムから溶出させ、その通過を遅延させ、該ピークを保持時間により特徴づげる。インドールグリセロールリン酸シンターゼ（IGPS）のいくつかの突然変異体を大腸菌（E．coli）内で発現させ、封入体として単離する。尿素中に高濃度で溶解後、それらを再生させる際に、これらは再沈殿し、低いタンパク質濃度で行なうと、非天然コンホメーションの可溶性物質が生じる。最初の48アミノ酸残基を欠く突然変異体IGPS(49-252)（1×22kDa）を、100％の結合活性を有する物質の92％の収率で、GroEL(191-345)カラム上のクロマトグラフィー上で得る。「リフォールディングクロマトグラフィー」なる語は、該カラムの通過によるリフォールディングの現象を説明するために用いることがある。より詳しくは、Ni-NTAアガロース（3.0mL）上に固定化したht-GroEL191-345のカラムに、20μＬの8M尿素に溶解した2nmolのIGPS（49-252）をローディングし、Waters 625 LC HPLC系を用いてリフォールディング緩衝液（5mM 2-メルカプトエタノールを含有する0.1Mリン酸カリウム（ｐＨ7.8））で該カラムを展開する。図6では、Ｋ_av=(Ｖ_e-Ｖ_o)/(Ｖ_t-Ｖ_o)（式中、Ｖ_tは該カラム中のゲルの全容積、Ｖ_oはゲル粒子内部容積、Ｖ_eは該ピークの最大時の容積である）で示される2つのピークが認められる。Ｋ_avの値は、該タンパク質が該支持体と相互作用することを示す。ピーク1はＫ_av＝1.0（全面積の9.6％）を有し、ピーク２はＫ_av＝1.7（90.4％）を有する。ピーク2のタンパク質は、1.2mL中に回収され、1.85nmolのトランケート化IGPS（92.5％の収率）を含有する。それは、1. 0の化学量論で、天然a/bタンパク質、および結合性³H-rCdRP（トリチウムで標識され還元された1[(2-カルボキシフェニル)アミノ]-1-デオキシリブロース5-ホスファート）（IGPSの特異的阻害剤）に特徴的な円二色性を示す。最初に変性したシクロフィリンは、２つのピークでクロマトグラフィー分離される（Ｋ_av＝0.38 で不活性、Ｋ_av1.43で活性）。実施例9：Ni-NTAアガロースゲル上でのシクロフィリンＡのバッチ式再生この実験では、物質のバッチ式混合を用いる。8M尿素中の変性シクロフィリンの溶液を、リフォールディング緩衝液中のNi-NTA固定化GroEL(191-345)で100倍希釈する（後記表IIを参照されたい）。穏やかに30分間混合した後、該シクロフィリンを、84％の収率（タンパク質）で回収する。対照実験（表II）では、該タンパク質を8M尿素中で変性させ、該リフォールディング緩衝液のみに加えるか、またはGroEL断片に結合していないアガロースと混合する。該対照実験は、変性前の出発物質の活性の20％しか有さないシクロフィリンを与えた。該変性実験に使用するシクロフィリンは、本発明者らが予め得た最も純粋なサンプルの活性の 88％を有する。GroEL(191-345)-アガロース樹脂（共有結合している）から得た物質の比活性は、先の最も純粋なサンプルの126％である。さらに、活性の全回復は、最初に存在していたものより25％高い。したがって、該固定化GroEL断片は、不活性物質を活性物質に変換することにより、シクロフィリンＡを「リコンディショニング」した。より詳しくは、200μＬのゲル（含水、沈降体積）の懸濁液を、リフォールディング緩衝液（100mMリン酸緩衝液(pH7.8)および5mM2-メルカプトエタノール）と混合して、990μＬの容量を得る。10μＬのシクロフィリン（リフォールディング緩衝液＋8Ｍ尿素中の100μＭのストック溶液、＝1nmolのシクロフィリンＡ）を加え、該懸濁液を、上下式混合器（up-down mixer）中、室温で30分間混合する。該ゲル懸濁液を遠心して、上清（〜800μＬ）を分離する。該ゲルペレットをミニプレップカラム内で洗浄し、該溶出液を該懸濁液に加えて、約900μＬを得る。該タンパク質濃度を、Ａ₂₈₀nmで測定する。シクロフィリン活性を、文献記載（Makino Yら（1993）FEBS Lett 336:363-367）のとおりに該上清中で測定する。変性前のサンプルは、本発明者らが予め得た天然シクロフィリンの最大活性の比活性の88％を有する。該対照は、Niを含まないアガロース単独である。結果を、以下の表IIに示す。この方法を、実験室で使用する他のタンパク質に適用する。グルコサミン6-リン酸デアミナーゼ（6×30kDa）（Oliva Gら（1995）Structure 3:1323-1332）は、通常、尿素変性からの再生後に、10％未満の活性を回復するにすぎない。GroE L(191-345)-アガロースでのバッチ式処理では、100％の収率が得られる。さらに、50％グリセロール／水中の溶液中での−20℃で5年間の保存で全ての活性を喪失しているサンプルもまた、尿素に溶解後のこの処理で100％の活性を回復した。実施例10：ペプチドに対する結合に関与するGroELの残基 17残基のＮ末端テイルを有するGroEL 191-376のＸ線結晶構造は、一方の分子のテイルの7残基が、他方の活性部位内で結合することを示す。残基230-271は、結合部位内に存在する。すべての残基を表IIIに示す。表JJJにおいて、大きな太字の、下線を付した残基は、ht GroEL 191-376のＸ線結晶構造により、タンパク質結合に関与することが判明した残基である。該Ｘ線結晶構造は、193-336が合理的に安定であることを示す。193-337断片をクローニングし、発現させたところ、それが安定であることが判明した。したがって、残基191および192は存在していなくてもよい。実施例11：最小ミニシャペロン断片の構築および試験 GroELの頂点ドメインのＮ末端およびＣ末端でトランケート化された種々の断片（断片193-335を含む）を、操作されたトロンビン切断部位を含むＮ末端ヒスチジンテイル（17アミノ酸；「sht」）をコードするpRSET Aベクター（Invitr ogen）のBamHIおよびEcoRI部位中にPCRによりクローニングする（Zahnら，（199 6）PNAS（USA）93:15024-15029）。製造業者（Applied Biosystems）の指示に従い蛍光ジデオキシチェーンターミネーターを用いるPCRサイクルの配列決定により、プラスミドの構築を確認する。配列決定反応は、Applied Biosystems 373 A Automated DNA Sequencer上で分析する。大腸菌（E．coli）BLR（DE3）細胞内でのミニシャペロンの過剰発現および精製は、既に記載されているの（Zahnら，前掲）と実質的に同様にして行なう。sh t-GroEL(193-335)をBLR（DE3）細胞内で過剰発現させて、培養1リットル当たり〜100mgの精製タンパク質を得る。該GroEL断片を、定量アミノ酸分析、Ｎ末端配列決定および質量分析により分析する。タンパク質濃度を、Gill ＆ vonHippel ，（1989）Anal．Biochem．182:319-326から算出した吸光係数を用いて276nmの吸光度により測定する。該断片間の会合の程度を評価するために、DynaPro-801T C Molecular Sizing装置（Protein Solutions，Inc.，Charlottesville,VA，USA ）で25℃にて動的光散乱実験を行なう。使用したタンパク質濃度は、50mM Tris- HCl、150mM NaCl（ｐＨ8.2）緩衝液中でμＭの範囲である。ゲル濾過により精製したsht-GroEL(193-335)は、動的光散乱実験により測定した場合、μＭの濃度で単量体である。ロダネーゼおよびシクロフィリンＡのリフォールディングアッセイを、前記のとおり行なう。sht-GroEL 193-335は、ロダネーゼおよびシクロフィリンＡのフォールディングのシャペロン化(chaperoning)において、sht-GroEL(191-345)およびsht-GroEL(191-376)と同程度にin vitroで活性である。実施例１２：cn60ファミリーメンバーのコンセンサス結合配列のアライメント図９は、PDB構造pdb1grl.entにおけるGroELの頂点ドメイン（残基191-375）に対する明らかな相同性を含有するOWLデータベースリリース28.1中の配列を示す。OWLは、SWISS-PROT，PIR(1-3)，GenBank（翻訳）およびNRL-3Dを合体させる非リダンダントデータベースである。コンセンサス配列＝ペプチド結合部位（結晶構造分析およびポリペプチド結合研究により同定されたもの）を含有する残基23 0-271（それも含む）。Ｘ＝ミニシャペロンのＸ線結晶構造中のペプチド結合部位内の残基。GroEL大腸菌（E．coli）シャペロン配列をイタリックで示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ザーン，ラルフイギリス国シービー２１イーダブリュケンブリッジ，レンスフィールドロード，デパートメントオブケミストリー，ユニバーシティーオブケンブリッジ，エムアールシーユニットフォープロテインファンクションアンドデザイン (72)発明者アルタミラノ，マイリアムマーリーンイギリス国シービー２２キュージーケンブリッジ，ヒルズロード 302

Claims

【特許請求の範囲】１．図７に実質的に示されるGroEL配列の少なくともアミノ酸残基230-271（ただし、残基150-455または151-456の範囲内）、または実質的に相同なシャペロンポリペプチドの対応配列、またはその修飾、突然変異もしくは変異配列（シャペロン活性を有するもの）から選ばれるアミノ酸配列を有するシャペロンポリペプチド。２．シャペロン活性を有し、溶液中で多量体を形成する能力を有さない単量体ポリペプチド。３．溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、タンパク質結合活性部位モチーフ：（式中、 1は、アミノ酸残基Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、ＦまたはＡから選ばれ、 2は、Ｌ、Ｉ、Ｐ、ＶまたはＡから選ばれ、 3は、Ｌ、Ｅ、Ｖ、ＨまたはＩから選ばれ、 4は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＱまたはＮから選ばれ、 5は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、ＱまたはＫから選ばれ、 6は、Ｅ、ＤまたはＧから選ばれ、 7は、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＧまたはＬから選ばれ、 8は、Ｔ、Ａ、Ｎ、ＳまたはＶから選ばれ、 9は、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＡから選ばれ、 10は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＦまたはＨから選ばれ、 11は、Ｎ、ＳまたはＬから選ばれ、 12は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＬまたはＳから選ばれ、 13は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、ＦまたはＰから選ばれ、 14は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＤまたはＴから選ばれ、Ｘは、ペプチド結合または少なくとも1つのアミノ酸残基を表す）を含むか、または番号が付されているアミノ酸残基1〜14の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とする前記シャペロンポリペプチド。４．溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、（式中、 1は、アミノ酸残基Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、ＦまたはＡから選ばれ、 2は、Ｌ、Ｉ、Ｐ、ＶまたはＡから選ばれ、 3は、Ｌ、Ｅ、Ｖ、ＨまたはＩから選ばれ、 4は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＱまたはＮから選ばれ、 5は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｒ、Ｔ、ＱまたはＫから選ばれ、 6は、Ｅ、ＤまたはＧから選ばれ、 7は、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＧまたはＬから選ばれ、 8は、Ｔ、Ａ、Ｎ、ＳまたはＶから選ばれ、 9は、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＡから選ばれ、 10は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＦまたはＨから選ばれ、 11は、Ｎ、ＳまたはＬから選ばれ、 12は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＬまたはＳから選ばれ、 13は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、ＦまたはＰから選ばれ、 14は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＤまたはＴから選ばれ、Ｘは、少なくとも1つのアミノ酸残基である）から選ばれる少なくとも1つのタンパク質結合活性部位モチーフ部分を含むか、または番号が付されているアミノ酸残基1〜14の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とする前記シャペロンポリペプチド。５．溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、タンパク質結合活性部位モチーフ：（式中、Ｘは、少なくとも1つのアミノ酸残基である）を含むか、または特定されているアミノ酸残基の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とする前記シャペロンポリペプチド。６．溶液中で単量体のままであり、タンパク質をリフォールディングし再活性化し又はリコンディショニングする能力を有するシャペロンポリペプチドであって、（式中、Ｘは、少なくとも1つのアミノ酸残基である）から選ばれる少なくとも1つのタンパク質結合活性部位モチーフ部分を含むか、または特定されているアミノ酸残基の1以上が同類置換を受けているその機能的変異体を含むことを特徴とする前記シャペロンポリペプチド。７．該活性部位モチーフまたは活性部位モチーフ部分が、保存配列：（式中、括弧内のアミノ酸の記号は、左から右へ読んだ場合に直前の記号の代わりとなるものである）を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載のシャペロンポリペプチド。８．シャペロン活性を有し、多量体を形成する能力を有さない単量体ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ATPの不存在下で、50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは75％以上のタンパク質リフォールディング活性を有し、不活性化前の比活性が既知の不活性化タンパク質と該ポリペプチドとを接触させ、ついで該ポリペプチドとの接触後の該タンパク質の比活性を測定することにより、該リフォールディング活性を測定し、該リフォールディング活性（％）が、であることを特徴とする前記単量体ポリペプチド。９．該シャペロン活性を、シクロフィリンＡのリフォールディングにより測定する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。 10．8Ｍ尿素で変性させたシクロフィリンＡ（100μＭ）を、1μＭの最終濃度になるまで100ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.0）、10ｍＭ DTT中に希釈し、ついで少なくとも１μＭの前記ポリペプチドと25℃で少なくとも5分間接触させ、得られたシクロフィリンＡ活性をFischer Ｇら（1984）Biomed Bio chim Acta 43:1101-1111の方法でアッセイする、請求項９に記載のポリペプチド。 11．hsp60ポリペプチド、好ましくはGroELポリペプチドである、請求項１〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。 12．GroEL残基：またはまたはまたは（d）230-271、229-271、229-272、228-272、228-273、…（以下参照）…19 4-328、194-329 または実質的に相同なシャペロニンの等価な残基、またはその修飾、突然変異もしくは変異配列から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。 13．前記の選ばれるアミノ酸配列が、GroELの230-271、191-345、191-376、193- 335および193-337、実質的に相同なシャペロニンの等価な残基、ならびにその修飾、突然変異または変異配列よりなる群から選ばれる、請求項８に記載のポリペプチド。 14．さらに、ポリアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端ポリアミノ酸配列を含む、請求項１〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。 15．該ポリアミノ酸配列がポリヒスチジン配列である、請求項14に記載のポリペプチド。 16．該ポリアミノ酸配列が、切断剤（好ましくは、該切断剤はトロンビンである）により切断可能な切断部位を含む、請求項14または請求項15に記載のポリペプチド。 17．前記のさらなるポリアミノ酸配列が、2〜500、好ましくは5〜100、より好ましくは17〜39の範囲のアミノ酸残基数を含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載のポリペプチド。 18．固定化された形態であり、任意に、クロマトグラフィーマトリックス、好ましくはアガロース樹脂に固定化されている、請求項１〜17のいずれか一項に記載のポリペプチド。 19．該アガロース樹脂が、ニッケル-ニトリロ-トリ-酢酸（NTA）結合アガロース樹脂である、請求項18に記載のポリペプチド。 20．異種タンパク質または異種ポリペプチドと融合している、請求項１〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。 21．請求項１〜20のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。 22．請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、またはそれにハイブリダイズすることが可能であり、シャペロン活性を有するポリペプチドを任意にコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。 23．核酸配列のクローニングおよび／または発現で使用するための組換え核酸分子であって、（a）GroELのアミノ酸残基191-376をコードするヌクレオチド配列、または（b）GroELのアミノ酸残基191-345をコードするヌクレオチド配列、または（c）GroELのアミノ酸残基193-337をコードするヌクレオチド配列、または（d）GroELのアミノ酸残基193-335をコードするヌクレオチド配列、または（e）アミノ酸残基：またはまたはから選ばれるGroELのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列、（f）230-271、229-271、229-272、228-272、228-273、…（以下参照）…19 4-328、194-329、または（g）前記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）または（f）のいずれかにハイブリダイズすることが可能であり、シヤペロン活性を有する単量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（h）前記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）または（g）に対応する縮重ヌクレオチド配列を含んでなる前記組換え核酸分子。 24．請求項22または請求項23に記載の核酸を含んでなるベクター。 25．請求項22もしくは請求項23に記載の核酸または請求項24に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 26．請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造法であって、該ポリペプチドをコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養し、該ポリペプチドを発現させることを含んでなる前記製造法。 27．該核酸が、請求項22または請求項23に記載の核酸である、請求項26に記載のポリペプチドの製造法。 28．発現されたポリペプチド産物を切断に付す、請求項26または請求項27に記載の製造法。 29．請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドと、任意に希釈剤、担体または賦形剤とを含んでなる医薬製剤。 30．疾患の治療で使用するための、請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド。 31．タンパク質／ポリペプチドの構造に関連した疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。 32．疾患の治療で使用するための、請求項22または請求項23に記載の核酸分子。 33．タンパク質／ポリペプチドの構造に関連した疾患を治療するための医薬の製造における、請求項22または請求項23に記載の核酸分子の使用。 34．分子（好ましくは、タンパク質）をリコンディショニングする方法であって、該タンパク質を、請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含んでなる前記方法。 35．該タンパク質を、該ポリペプチドとの接触の前に不活性化または変性に付す、請求項34に記載の方法。 36．該ポリペプチドを固相に固定化する、請求項34または請求項35に記載の方法。 37．該ポリペプチドが、固相、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスに固定化され、タンパク質とポリペプチドとの接触が、カラムに充填したマトリックスの吸着床の最上部にタンパク質をのせ、ついで該ポリペプチドを該カラムから溶出することにより行なわれる、請求項33または請求項34に記載の方法。 38．分子の構造を改変するための、請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。 39．該分子がタンパク質またはポリペプチドであり、構造の改変がフォールディング、アンフォールディングまたはリフォールディングによるものである、請求項38に記載の使用。 40．該ポリペプチドと、改変される分子との間の化学量論が、約1：1である、請求項38または請求項39に記載の使用。 41．精製における、または収率、比活性もしくは生物学的分子の特性の増強における、好ましくは支持体に結合されている請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。 42．分子（好ましくは、タンパク質）をリコンディショニングまたはリフォールディングするためのキットであって、固相に固定化された請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドと、該固相ポリペプチドを収容するための容器とを含んでなる前記キット。 43．組換え手段によるタンパク質またはポリペプチドの製造における、請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドを該タンパク質またはポリペプチドと同時発現させ、それにより該タンパク質またはポリペプチドの収量または特性を改善することを特徴とする前記使用。 44．請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドに対して反応性の抗体。 45．疾患の治療で使用するための、請求項44に記載の抗体。 46．タンパク質／ポリペプチドの構造に関連した疾患を治療するための医薬の製造における、請求項44に記載の抗体の使用。 47．請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を投与する、疾患の治療方法。 48．請求項１〜21のいずれか一項に記載のポリペプチドのシャペロン活性の阻害剤の有効量を投与することを含んでなる、疾患の治療方法。 49．該阻害剤が抗体である、請求項48に記載の方法。 50．請求項１〜20のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアンタゴニストをコードする構築物を使用する遺伝子治療による、疾患の治療方法。