JP2001510848A

JP2001510848A - フォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）およびシャペロンを用いるリフォールディング方法

Info

Publication number: JP2001510848A
Application number: JP2000504157A
Authority: JP
Inventors: ファーシュト，アラン，ロイ; アルタミラノ，マイリアム，マーレン
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2001-08-07
Also published as: US20030077692A1; CA2292845A1; AU8547498A; EP0998485A1; AU744004B2; WO1999005163A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリペプチドを分子シャペロンおよびフォルダーゼと接触させる工程を含んでなる、ポリペプチドのフォールディングを促進させる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ミニシャペロン(minichaperone)ペプチドとタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの組み合わせを用いて、ポリペプチド、特に不溶性のまたは不正
フォールディングのポリペプチドをリフォールディングさせる方法に関する。好
適な実施形態では、本発明は、ミニシャペロンペプチドおよびタンパク質ジスル
フィドイソメラーゼを固定化させたリフォールディングマトリックスに関する。

【０００２】多くのタンパク質、特に真核細胞から分泌されるタンパク質は、ジスルフィド
結合によって安定化されている。このようなタンパク質の例としては、医療用途
もしくは生物工学用途に使用されるタンパク質が挙げられ、例えば、インターロ
イキン、インターフェロン、抗体およびそのフラグメント、インスリン、トラン
スフォーミング増殖因子、並びに多くの毒素およびプロテアーゼ等である。ジス
ルフィドを含有するタンパク質のフォールディングはin vitroではゆっくりな場
合が多く、本来の鎖のコンフォメーションの獲得と関わっている。最適な条件下
であっても、触媒作用を介さない還元リボヌクレアーゼ(RNase)の酸化的リフォールディングの半減期は約1.5時間であり、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BP
TI)はより一層ゆっくりとリフォールディングする(t_1/2は約8時間)。さらに、通
常は、適切に形成された結合と不適切に形成された結合の各種組み合わせを含む
産物の混合物となる。多くの望ましいタンパク質のリフォールディングは、望ま
しくない産物によって収率が著しく低下し、かつ夾雑物の原因となるため、in v
itroでは非常に困難な場合が多い。

【０００３】シャペロンは、通常、様々な細胞区画においてポリペプチド鎖のフォールディ
ングを仲介するのに必須な大型の多重サブユニットタンパク質構築物であること
が知られている。シャペロンのファミリーは同定されており、例えばシャペロニ
ンhsp60ファミリー(cpn60クラスのタンパク質としても知られている)は構成的に
発現し、例えば細菌細胞質(GroEL)、内部共生に由来するミトコンドリア(hsp60)
および葉緑体(Rubisco結合タンパク質)で見られる。別のシャペロンファミリーはTF55/TCP1と呼ばれ、好熱性古細菌および進化上近しい真核細胞のサイトゾルに見られる。アミノ酸配列データの比較より、原核細胞、ミトコンドリアおよび
葉緑体で見られるシャペロン間では、少なくとも50％の配列同一性があることが
判明している(Ellis R JおよびVan der Vies S M (1991) Ann Rev Biochem 60:
321-347)。

【０００４】典型的なシャペロニンはGroELであり、熱ショックタンパク質のhsp60ファミリ
ーの一員である。GroELは14量体であり、各単量体サブユニット(cpn60m)の分子量は約57kDである。この14量体は、この14量体がなければ不正フォールディング
するかまたは凝集および沈殿してしまう多くのタンパク質をin vitroで容易にフ
ォールディングさせるものである。大腸菌由来のGroELの構造は、Braig Kら(199
4) Nature 371: 578-586に報告されているように、X線結晶学的研究から明らかにされている。ホロタンパク質は円柱状であり、大型の中心腔を形成する2つの7
員環からなる。

【０００５】大腸菌GroELの全アミノ酸配列も公知であり(Braig Kら(1994)前掲)、3つのドメインはホロシャペロニン(14量体)の各cpn60mであるとされている。これらは、
中間ドメイン(アミノ酸残基1〜5、134〜190、377〜408および524〜548)、赤道ド
メイン(残基6〜133および409〜523)並びに頂端ドメイン(残基191〜376)である。

【０００６】 GroELは、多くのタンパク質のフォールディングを2つの機構、即ち、(1)部分的にフォールディングしたタンパク質へ結合して凝集を防止し(Goloubinoff Pら
(1989) Nature 342: 884-889; Zahn RおよびPluckthun A (1992) Biochemistry
31: 3249-3255)、次いでGroEL上で本来に近い状態へリフォールディングさせる(
Zahn RおよびPluckthun A (1992) Biochemistry 31: 3249-3255; Gray T EおよびFersht A R (1993) J Mol Biol 232: 1197-1207)、並びに(2)不正フォールディングしたタンパク質のフォールディングを解いてリフォールディングを再開で
きる状態へ連続的にアニーリングする(Zahn Rら(1996) Science 271:642-645)、
ことによって容易にする。

【０００７】 Yoshidaら(1993) FEBS 336: 363-367には、149個のNH₂末端残基と約93個のCOO
H末端残基を欠く大腸菌GroELの34kDタンパク質分解断片(GroEL 150-456)によって、GroESおよびATPの不在下で変性ロダネーゼのリフォールディングが容易にな
ることが報告されている。このタンパク質分解断片GroEL 150-456はゲル濾過時に単量体として溶離するものの、依然として頂端ドメインと中間および赤道ドメ
インの重要な部分とを含んでおり、これらのうち後者によってGroELのサブユニット間の接点が決まり(Braig Kら(1994)前掲)、中心腔が一時的に形成され、これにより、観察されるシャペロニン活性が説明される。

【０００８】 Taguchi Hら(1994) J Biol Chem 269: 8529-8534には、シャペロニン単量体が
溶液中に存在すれば、一時的に形成されたGroEL14量体(ホロ-シャペロニン)が存
在するものと認められることが報告されている。従って、これらの調製物のリフ
ォールディング活性は、単量体ではなくてホロシャペロニンの存在に因るものと
考えられる。このことを確かめるために、Taguchiらは、cpn60mをクロマトグラフ樹脂へ固定化し、ホロシャペロニン形成の可能性を排除した。固定化され、そ
の結果正確に単量体形態をとると、cpn60mは約10％のロダネーゼリフォールディ
ング活性しか示さなかった。

【０００９】 Alconada AおよびCuezva J M (1993) TIBS 18: 81-82には、GroELの「内部断片」が、大腸菌の改変mRNA安定性(altered mRNA stability; ams)遺伝子産物(Am
s)とGroELの中央部とのアミノ酸配列の類似性に基づいて、シャペロン活性を有し得ることが示唆されている。ams遺伝子座は、23分で大腸菌染色体上に位置し、かつ半減期の増加したmRNAをもたらす温度感受性突然変異である。ams遺伝子はクローニングと発現がなされており、ams突然変異を補足することが判明している。その遺伝子産物は149アミノ酸からなるタンパク質(Ams)であり、見かけの
分子量が17kDである。

【００１０】 Chanda P Kら(1985) J Bacteriol 161: 446-449では、groEオペロンのL遺伝子
の一部に相当する17kDタンパク質断片が大腸菌中で発現されると、ams突然変異体が野生型表現型を復活させることが見出された。この17kD断片は、単離された
機能性シャペロニンタンパク質モジュールであると示唆された。3つのシャペロニンのアミノ酸配列(大腸菌GroEL、Triticum aestivum由来のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ(RUBPC)サブユニット結合タンパク質、およびSaccharomyc
es cerevisiaeのミトコンドリアhsp60)をAmsの配列と比較した。残基307-423は、実質的にAmsおよびGroEL間で一致することが判明した。これらの残基は、GroE
Lの中間ドメインと頂端ドメインの両者のほぼ等価な部分を含んでいる。

【００１１】さらに最近では、GroELの活性部位を詳細に検討し、その活性を、無傷のGroEL
タンパク質の14量体構造から単離して試験する目的で実験が計画されている(Zah
nら(1996) PNAS (USA) 93: 15024-15029; Buckleら(1997) PNAS (USA) 94: 3571
-3579)。機能上活性な単量体ミニシャペロンが産生されている。このミニシャペ
ロンは、溶液の状態(Zahnら、前掲)または固相支持体へ固定化した状態(Altamir
anoら(1997) PNAS (USA) 94: 3576-3578)で活性である。不正フォールディングの、または未フォールディングのポリペプチドをリフォールディングさせるのに
活性なミニシャペロンタンパク質は、本出願人らの同時係属中の国際特許出願PC
T/GB96/0298(1996年12月3日出願)および英国特許出願第9620243.7号(1996年9月2
6日出願)に記載されている。

【００１２】アガロース上に固定化されたミニシャペロン(例えば、GroELの残基191-345もしくは191-376、またはより小さな断片からなるペプチド)は、複数のタンパク質
を伴う非常に効率のよいシャペロニング活性を有する。カラムクロマトグラフィ
ーを用いてリフォールディングクロマトグラフィーを行うことができ、また、よ
り簡便には試薬をバッチ様式で振盪すればよい。

【００１３】分子シャペロン以外にも、細胞内での複合タンパク質フォールディング機構に
は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)等のチオール／ジスルフィド酸化還元酵素が含まれる。in vivoでは、ジスルフィド結合の形成は、真核細胞の小胞体内のPDIによっておよび細菌の周辺細胞質内のDsbAタンパク質によって触媒される(Goldbergerら(1963) J. Biol. Chem. 238: 628-635; Zapunら(1992) P
roteins 14, 10-15)。これらは、また、不正形成されたジスルフィド結合のシャ
フリング(shuffling)も触媒する。PDIは非常に豊富に含まれるタンパク質であり
、小胞体内腔での濃度はほぼmMであると推定されている(Lyles, M.およびGilber
t. H. (1991) Biochemistry 30:619-625)。酸化剤としての高い化学反応性を伴う高局所濃度は、未フォールディングの基質との迅速な二次反応に有利であり、
酸化を初期フォールディングと競合させる。

【００１４】チオール／ジスルフィド酸化還元酵素は様々な種由来のものが公知であり、組
換え技術で作製したポリペプチドのリフォールディングへの使用が提案されてい
る。

【００１５】 WO94/08012 (Research Corp. technologies, Inc.)には、リフォールディング
を容易にするため、チオール／ジスルフィド酸化還元酵素(PDI)と組換え技術で作製されたポリペプチドおよび任意に分子シャペロン(BiP)との同時発現が開示されている。しかしながら、ミニシャペロンとPDIの併用の可能性または同時発現以外のリフォールディングの可能性については何ら教示されていない。さらに
、このような組み合わせの有用性に関するデータも結論も開示されていない。

【００１６】 WO94/02502 (Genetics Institute, Inc.)には、チオレドキシン(例えば、PDI のチオレドキシン様ドメイン)との融合ポリペプチドの発現が開示されており、これにより、可溶性で安定なポリペプチドの収率が向上している。しかしながら
、分子シャペロンとPDIの組合せは論じられていない。

【００１７】 Morjana, N.およびGilbert, H. (1994) Protein Expression and Purificatio
n 5: 144-148では、ウシ肝臓PDIをCNBr-活性化アガロース上へ固定化し、ゲル１
ml当たり4.5mgのタンパク質を含有するカラムを用いて、収率55％で活性RNase A
を酸化かつジスルフィド混合(scrambled)変性状態から得ている。低濃度のPDI (
1mg/mlゲル)では、混合RNaseからリフォールディングされたRNaseの収率は、89 ％まで上昇した。いずれの場合も、バッチ様式では活性が得られなかった。この
結果は一見矛盾しているが、これは、低PDI濃度において見かけの活性が高いためだけでなく、バッチ様式での実験およびクロマトグラフィーでの実験の両者に
おける活性の有無が、推定活性と固定化試薬との関連性の有無の判断基準(test)
となるためである。バッチ様式で活性が認められないことより、カラムクロマト
グラフィーでの活性が固定化材料に起因する可能性はないものの、CNBr-活性化アガロースからの漏出の人為的な結果である可能性が考えられる。さらに、PDI と分子シャペロンの組合せは示唆されていない。

【００１８】リフォールディング機構には、ペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ(PP
I)も含まれる。PPIはペプチジル-プロリル結合のcis-trans異性化を触媒する (S
chmidら(1993) Accessory Folding Proteins, 25-65. Academic Press, Inc, Ne
w York)。ペプチド結合は、ペプチジル-プロリル結合を除けば、天然および変性
ペプチドでは圧倒的にtransコンフォメーションをとり、ペプチジル-プロリル結
合は変性状態では主としてtransであるが、フォールディングされたタンパク質ではcisコンフォメーションをとることができる。観察されるタンパク質フォールディングの速度に対するPPIの効果は、シャペロニンまたはPDIのいずれの場合
よりも著しく小さいようである(Freedman, (1992) Protein Folding, Freeman,
New York; Lorimer, (1993) Accessory Folding Proteins, Academic Press, In
c., New York)。

【００１９】〔発明の概要〕本発明の第1の態様によれば、ポリペプチドを分子シャペロンおよびフォルダーゼ(foldase)と接触させることを含んでなる、ポリペプチドのフォールディングを促進させる方法が提供される。

【００２０】ポリペプチドは、好ましくは未フォールディングのまたは不正フォールディン
グのポリペプチドであり、有利にはジスルフィドを含んでなるものである。分子
シャペロンは、好ましくは分子シャペロンの断片であり、好ましくは任意のhsp-
60シャペロンの断片であり、哺乳動物hsp-60およびGroEL、またはこれらの誘導体からなる群より選択することができる。

【００２１】断片がGroELの断片である場合、無傷のGroEL配列の262位にアラニン残基および／または267位にイソロイシン残基を有さないのが有利である。好ましくは、無傷のGroEL配列の262位にロイシン残基を有し、および／または267位にメチオニン残基を有する。従って本発明は、ポリペプチドのフォールディングを促進さ
せるため、無傷のGroEL配列の262位にロイシン残基および／または267位にメチオニン残基を含んでなるGroEL断片の使用を包含するものである。

【００２２】好適な実施形態では、分子シャペロン断片は、無傷のGroEL配列の断片191-376
、191-345および191-335の少なくとも1つに相同な領域を含んでなる。

【００２３】有利には、フォルダーゼをチオール／ジスルフィド酸化還元酵素およびペプチ
ジルプロリルイソメラーゼからなる群より選択する。

【００２４】好ましくは、チオール／ジスルフィド酸化還元酵素を大腸菌DsbAおよび哺乳動
物PDIまたはこれらの誘導体からなる群より選択する。好ましくは、ペプチジルプロリルイソメラーゼはシクロフィリンである。

【００２５】本発明はさらに、分子シャペロン断片および／またはフォルダーゼを固相支持
体(アガロースであればよい)へ固定化した、上述の方法に関する。従って、本発
明はまた、分子シャペロン断片および／またはフォルダーゼを固定化させた固相
支持体、このような固相支持体で少なくとも一部充填したカラム、およびジスル
フィド含有ポリペプチドを固相支持体へ固定化する方法も提供する。好ましくは
、この方法は以下の工程を含んでなるものである： a)ポリペプチド中のジスルフィドを還元剤で還元し、再酸化を防ぐ条件下で還
元剤を除去し、 b)ポリペプチドのチオール基を可逆的にブロックし、 c)固相を、チオールをブロックしたポリペプチドと非酸性pHにて接触させ、 d)残存する任意の活性基をブロックし、未結合ポリペプチドを洗浄により除去
し、 e)結合ポリペプチド上のチオール基を再生する。さらなる態様では、本発明は、分子シャペロン断片とフォルダーゼの組み合わ
せを、任意に希釈剤、担体または賦形剤と共に含んでなる組成物を提供する。

【００２６】〔発明の詳細な説明〕定義ポリペプチド本明細書中、ポリペプチドは、2個のアミノ酸を連結する少なくとも1個のペプ
チド結合を含んでなる分子である。この用語は、「タンパク質」および「ペプチ
ド」と同義であり、両者ともこのような分子を表すのに当該技術分野で使用され
る。ポリペプチドは他の非アミノ酸成分を含んでいてもよい。本発明の方法によ
ってフォールディングが促進されるポリペプチドは、どのようなポリペプチドで
あってもよい。しかしながら好ましくは、フォールディングを必要とする未フォ
ールディングのまたは不正フォールディングのポリペプチドである。しかしなが
ら、この他に、フォールディング状態を維持すべきフォールディングされたポリ
ペプチドであってもよい(下記参照)。

【００２７】好ましくは、ポリペプチドには少なくとも1個のジスルフィドが含まれる。このようなポリペプチドを、本明細書中では「ジスルフィド含有ポリペプチド」と
呼ぶことができる。

【００２８】ポリペプチドの例としては、医療用途もしくは生物工学用途に使用されるポリ
ペプチドが挙げられ、例えば、インターロイキン、インターフェロン、抗体およ
びそのフラグメント、インスリン、トランスフォーミング増殖因子、並びに多く
の毒素およびプロテアーゼ、並びに分子シャペロン、ペプチジル-プロリルイソメラーゼおよびチオール／ジスルフィド酸化還元酵素が挙げられる。

【００２９】フォールディングの促進本発明は、少なくとも2つの状況を想定している。第1の状況は、フォールディ
ングさせるべきポリペプチドが未フォールディングもしくは不正フォールディン
グの状態、またはこの両者の状態にある場合である。この場合、その正しいフォ
ールディングを本発明の方法によって促進する。第2の状況は、ポリペプチドが実質的に既に正しいフォールディング状態にある、即ち、ポリペプチドの全体も
しくは大部分が、正しくもしくはほぼ間違いなくフォールディングされた場合で
ある。この場合、本発明の方法は、フォールディング状態に有利になるようにフ
ォールディング／未フォールディング平衡に働きかけて、ポリペプチドのフォー
ルディング状態を維持するものである。これにより、実質的に既に正しくフォー
ルディングされたポリペプチドの活性が喪失するのを防ぐ。これらの状況(および他の状況)を、ポリペプチドのフォールディングの「促進」と呼ぶ。

【００３０】接触本発明で使用する試薬は、フォールディングを促進すべきポリペプチドと物理
的に接触させる必要がある。この接触はフリー溶液(free solution)中、in vitr
oまたはin vivoにて、固相支持体に固定化させた1種以上の反応成分との間で行うことができる。好適な態様では、固相支持体(例えば、カラム)に固定化させた
分子シャペロンおよび／またはチオール／ジスルフィド酸化還元酵素と接触させ
る。あるいは、固相支持体をビーズもしくは別のマトリックスの形態とし、フォ
ールディングを促進すべきポリペプチドを含む溶液へ添加してもよい。

【００３１】断片シャペロン分子に当てはめると、断片は、シャペロニン活性を保持するもので
あれば、完全な天然分子シャペロン分子以外のどのようなものでもよい。有利に
は、シャペロニン分子の断片は溶液中で単量体のままである。好適な断片につい
ては後述する。有利には、シャペロン断片は50〜200アミノ酸長であり、好ましくは100〜200アミノ酸長であり、最も好ましくは約150アミノ酸長である。

【００３２】未フォールディング本明細書中、ポリペプチドは、少なくともその一部が正しいまたは望ましい二
次もしくは三次構造を獲得していない場合には、未フォールディングであると考
えられる。ポリペプチドは、少なくともその一部が間違ったまたは望ましくない
二次もしくは三次構造を獲得している場合には、「不正フォールディング」であ
る。

【００３３】固定化永続的な結合、共有結合またはその他の結合。本発明の好適な態様では、用語
「固定化」およびその文法的な語尾変化は、可逆的なチオールブロッキング工程
を含む方法を用いた、分子シャペロンまたは好ましくはフォルダーゼポリペプチ
ドの固相支持体への結合をいう。可逆的なチオールブロッキング工程は、ペプチ
ドがジスルフィドを含む場合には重要である。このような方法の例を本明細書に
記載する。

【００３４】好ましくは、保護の前に、DTT (ジチオトレイトール)等の還元剤を用い、再酸
化を防止するため、例えばアルゴン等の不活性ガス下にてジスルフィドを還元す
る。続いて、例えばNCTB (2-ニトロ,5-チオシアノ安息香酸)を好ましくは化学量
論量で用いてポリペプチドをシアニル化(cyanylated)し、高(非酸性)pHにて、例
えばNaHCO₃を用いる制御加水分解にかける。DsbAの場合には、加水分解反応のpH
は好ましくは6.5〜10.5であり(DsbAのpKは4.0)、より好ましくは7.5〜9.5であり
、最も好ましくは約8.5付近である。従ってチオールは可逆的に保護される。

【００３５】次いでポリペプチドを、例えば2.0〜20.0mgポリペプチド/ml固相成分で、好ま
しくは5.0〜10.0mg/ml、最も好ましくは約6.5mg/ml程度で固相成分に接触させる
。高(非酸性)pHにて、例えばNaHCO₃カップリング緩衝液を用いてカップリングを
再度行う。DsbAの場合には、カップリング反応のpHは好ましくは6.5〜10.5であり、より好ましくは7.5〜9.5であり、最も好ましくは約8.5付近である。

【００３６】好ましくは、カップリング後に、残存している活性基をエタノールアミン等で
ブロックすることができ、未カップリングのポリペプチドを洗浄により除去する
。シアノ基を例えばDTEまたはDTTで処理して除去することにより、カップリング
させたポリペプチド上でチオール基を最終的に再生することができる。好適な反応の概略を図1に示す。

【００３７】固相支持体本発明で使用する試薬は、固相支持体上へ固定化することができる。これは、
溶液状態の試薬とは違う(固)相を維持する物質(entity)へ試薬を永続的に結合さ
せることを意味する。例えば固相は、ビーズ、「DNAチップ」、樹脂、マトリックス、ゲル、血管壁を形成する材料等の形態をとることができる。マトリックス
、特にアガロースゲル等のゲルは、簡単にカラムへ充填することができる。固相
固定化の特に有利な点は、ポリペプチドとの接触から容易に試薬を除去できるこ
とである。

【００３８】フォルダーゼ一般的な意味では、フォルダーゼは、タンパク質のフォールディングの促進に
関係する酵素であり、その酵素活性によって、フォールディング中のポリペプチ
ドに含まれる結合の再配列または異性化を触媒するものである。従ってフォルダ
ーゼは、不安定なもしくは不自然な構造状態でポリペプチドに結合し、かつ酵素
の触媒作用による結合の再配列を必要とすることなく正しいフォールディングを
促進する分子シャペロンとは別個のものである。多くのフォルダーゼのクラスが
公知であり、動物、植物および細菌に共通である。例としては、ペプチジルプロ
リルイソメラーゼおよびチオール／ジスルフィド酸化還元酵素が挙げられる。本
発明は、共有結合の再配列によるタンパク質フォールディングを促進し得るフォ
ルダーゼの全てを使用することを包含する。

【００３９】さらに、本明細書では、用語「フォルダーゼ(a foldase)」には１種以上のフォルダーゼが含まれる。一般に本明細書中では、特別な事情がない限り、単数形
で用いても、該当する複数の物質の存在を除外することにはならない。

【００４０】チオール／ジスルフィド酸化還元酵素名前が示すように、チオール／ジスルフィド酸化還元酵素はジスルフィド結合
の形成を触媒し、その結果ジスルフィド含有ポリペプチドのフォールディング速
度を規定することができる。従って本発明は、このような活性を有する任意のポ
リペプチドの使用を包含する。例としては、PDI活性を有している可能性のあるシャペロンポリペプチドまたはその断片が挙げられる(WangおよびTsou, (1998)
FEBS lett. 425:382-384)。真核細胞では、チオール／ジスルフィド酸化還元酵素は、通常PDI (タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ)と呼ばれる。PDIは、新たに合成された分泌タンパク質と直接相互作用し、真核細胞の小胞体(ER)中での
未完成(nascent)のポリペプチドのフォールディングに必要である。ER中に見られるPDI活性を有する酵素としては、哺乳動物PDI(Edmanら, 1985, Nature 317:2
67)、酵母PDI(Mizunagaら, 1990, J. Biochem. 108:848)、哺乳動物ERp59(Mazza
rellaら, 1990, J. Biochem. 265:1094)、哺乳動物プロリル-4-ヒドロキシラーゼ(Pihlajaniemiら, 1987, EMBO J. 6: 643)、酵母GSBP(Lamantiaら, 1991, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4453)および哺乳動物T3BP(Yamauchiら, 1987, Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. 146:1485)、A. niger PdiA(Ngiamら, (1997) Cu
rr. genent. 31:133-138)および酵母EUGI(Tachibanaら, 1992, Mol. Cell Biol. 12, 4601)が挙げられる。原核生物では、大腸菌のDsbAタンパク質といった等価
のタンパク質が存在する。同様の活性を有する他のペプチドとしては、例えば、
T. cruzi由来のp52 (Moutiezら, (1997) Biochem. J. 322:43-48)が挙げられる。これらのポリペプチドおよび機能上等価な他のポリペプチドは、該当する活性
を共有するポリペプチドの誘導体と同様、本発明の範囲内に含まれる(下記参照)
。好ましくは、本発明のチオール／ジスルフィド酸化還元酵素は、哺乳動物PDI または大腸菌DsbAからなる群より選択する。

【００４１】ペプチジル-プロリルイソメラーゼペプチジル-プロリルイソメラーゼは、各種細胞に広く存在する公知の酵素である。例としては、シクロフィリン(例えば、Bergsmaら, (1991) J. Biol. Chem
. 266:23204-23214)、parbulen、SurA (RouviereおよびGross, (1996) Genes De
v. 10:3170-3182)並びにFK506結合タンパク質であるFKBP51およびFKBP52が挙げられる。PPIは、ポリペプチドに含まれるペプチジル-プロリル結合のcis-trans 異性化を引き起こすため、正しいフォールディングを促進する。本発明には、PP
I活性を有する任意のポリペプチドが含まれる。例としては、PPI活性を有してい
る可能性のあるシャペロンポリペプチド、またはその断片が挙げられる(WangおよびTsou, (1998) FEBS lett. 425:382-384)。

【００４２】分子シャペロンシャペロンまたはシャペロニンは、非酵素的手段によってタンパク質フォール
ディングを促進するポリペプチドであり、ポリペプチドのフォールディングにお
いていかなる構造の化学修飾も触媒せず、正しい構造アライメントを容易にする
ことでポリペプチドの正しいフォールディングを促進するものである。分子シャ
ペロンは当該技術分野では周知であり、複数のファミリーが特性付けされている
。本発明は、任意の分子シャペロン分子に適用可能であり、「分子シャペロン」
という用語には、例えば以下の群(但し、これで全てではない)から選択される分
子シャペロンが含まれる：

【００４３】

【表１】

【００４４】同定されているタンパク質フォールディングシャペロンの2つの主要なファミリー、即ち、熱ショックタンパク質60(hsp60)クラスと熱ショックタンパク質70(
hsp70)クラスは、本発明での使用に特に好適である。hsp-60クラスのシャペロン
は、hsp-70クラスのシャペロンとは構造的に異なる。特に、hsp-60シャペロンは
、一方の頂部に他方が積み重なった2つの6量体環からなる安定な骨格を形成する
と考えられ、この骨格は二次構造の部分的にフォールディングしたエレメントと
相互作用する。他方、hsp-70シャペロンは、二量体の単量体であり、ポリペプチ
ドの短い延長領域と相互作用すると考えられている。

【００４５】 hsp70シャペロンは配列および機能について充分に保存されている。hsp-70の類似体には、本来IgGの重鎖結合タンパク質(BiP)として同定された真核細胞hsp7
0相同体が含まれる。BiPは全ての真核細胞において小胞体(ER)の内腔中に位置す
る。大腸菌の原核細胞DnaK hsp70タンパク質シャペロンは、酵母のhsp70 KAR2シ
ャペロンと約50％の配列相同性を共有する(Roseら, 1989 Cell 57:1211-1221)。
さらに、マウスBiPが酵母に存在すると、失われた酵母KAR2遺伝子と機能上置き換わることができる(Normingtonら, 19:1223-1236)。

【００４６】 hsp-60シャペロンは普遍的に保存されており(Zeilstra-Ryallsら, (1991) Ann
. Rev. Microbiol. 45:301-325)、ヒトを含む数多くの種に由来するhsp-60相同体を含む。例えば、例としては、大腸菌GroELポリペプチド、Ehrlichia sennets
u GroEL (Zhangら, (1997) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 18:39-46)、Tricho
monas vaginalis hsp-60 (Boznerら, (1997) J. Parasitol. 83:224-229)、ラッ
トhsp-60 (Vennerら, (1990) NAR 18:5309)、および酵母hsp-60(Johnsonら, (19
89) Gene 84:295-302)が挙げられる。

【００４７】好適な態様では、本発明は、hsp-60ファミリーのポリペプチドの断片に関する
。これらのタンパク質が普遍的に保存されていれば、このファミリーの任意のメ
ンバーを使用することができるが、特に有利な実施形態では、GroEL(例えば、大
腸菌GroEL)の断片を使用する。アガロース固定化カルモジュリンがシャペロニン
グ活性を示さないことも判明している。これは、おそらく、その露出した疎水性
基のためである。

【００４８】 GroELの配列は当該技術分野では学術的なデータベースから入手可能であるが、データベースの配列に一致するGroEL断片は無効である。具体的には、データベースには、262位および267位がアラニンおよびイソロイシンでそれぞれ占めら
れている配列が含まれる。これらの位置にこれらの残基の一方もしくは両方を含
む断片は無効であり、ポリペプチドのフォールディングを促進することはできな
い。これに対し本発明は、262位および267位の少なくとも一方がロイシンおよび
メチオニンでそれぞれ占められているGroELポリペプチドに関する。

【００４９】誘導体本発明は、分子シャペロン、ペプチジル-プロリルイソメラーゼおよびチオール／ジスルフィド酸化還元酵素の誘導体に関する。従って好適な態様では、用語
「分子シャペロン」、「ペプチジル-プロリルイソメラーゼ」および「チオール／ジスルフィド酸化還元酵素」には、決まった活性を保持するそれらの誘導体が
含まれる。本発明によって提供される誘導体には、一次転写産物の選択的スプラ
イシングによって生成するmRNAによってコードされるスプライシング変異体、ア
ミノ酸突然変異体、グリコシル化変異体、並びに分子シャペロンまたはフォルダ
ーゼの他の共有結合誘導体(分子シャペロン、ペプチジル-プロリルイソメラーゼ
および／またはチオール／ジスルフィド酸化還元酵素の機能特性を保持するもの
)が含まれる。典型的な誘導体としては、置換、化学的手段、酵素的手段、または他の適切な手段によって共有結合で修飾された、天然アミノ酸以外の部分を有
する分子が挙げられる。このような部分は、酵素または放射性同位元素等の検出
可能な部分であるかもしれない。さらに、特定の種(哺乳動物、他の脊椎動物、酵母、原核生物その他)に見られる分子シャペロンまたはフォルダーゼの自然発生変異体が挙げられる。このような変異体は、同一の遺伝子ファミリーの関連遺
伝子や特定の遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされている可能性があり
、また、分子シャペロンまたはフォルダーゼの選択的スプライシング変異体に該
当する。本発明に使用するポリペプチドの可能な誘導体は後述する。

【００５０】〔好適な実施形態の説明〕本発明は、本発明が意図する所望の用途に応じて多くの形態で実施できる。第
1の形態では、本発明は、タンパク質のフォールディングを容易にするための分子シャペロンとチオール／ジスルフィド酸化還元酵素の併用に関する。分子シャ
ペロンとチオール／ジスルフィド酸化還元酵素を組み合わせることで、タンパク
質フォールディングに対する相乗効果がもたらされ、単なる相加関係から予測さ
れるよりも活性でかつ正しくフォールディングされたタンパク質の量が増加する
。有利には、本発明に従ってタンパク質フォールディングを促進させるために使
用される成分の１種以上を固相支持体上へ固定化する。しかしながら、分子シャ
ペロンとチオール／ジスルフィド酸化還元酵素の両者とも溶液の状態で使用して
もよい。フリー溶液の状態で使用できるが、懸濁液の状態、例えばビーズ(例えば、Sepharoseビーズ)等のマトリックスに結合させたもの、または溶液と接触す
る固相表面(例えば、溶液を内包する瓶や試験管等の内側表面)へ結合させたもの
、であってもよい。

【００５１】第２の形態では、本発明は、分子シャペロンおよびチオール／ジスルフィド酸
化還元酵素とペプチジルプロリルイソメラーゼの併用に関する。ペプチジルプロ
リルイソメラーゼは固相支持体へ結合させた状態または溶液の状態のいずれであ
ってもよい。さらに、溶液に懸濁させたビーズへ結合させることもできる。ペプ
チジルプロリルイソメラーゼは、分子シャペロンのみと併用してもよく、チオー
ル／ジスルフィド酸化還元酵素のみと併用してもよく、また、分子シャペロンお
よびチオール／ジスルフィド酸化還元酵素の両者と併用してもよい。後者の場合
には、3種成分の同時使用から予測される相加効果を上回るさらなる相乗効果が明らかである。特に、凝集タンパク質とは対照的に、単分散タンパク質として回
収されるフォールディングタンパク質の割合が実質的に増加する。

【００５２】第3の形態では、本発明は、タンパク質フォールディングを促進させるための固定化ペプチジルプロリルイソメラーゼの使用に関する。驚くべきことに、ペプ
チジルプロリルイソメラーゼは、タンパク質のフォールディング活性を促進させ
る効果に限界があることが既に観察されているにもかかわらず、未フォールディ
ングのペプチドのフォールディングを促進させるのに有効であることが見出され
た。固定化プロリルペプチジルイソメラーゼを分子シャペロンおよび／またはチ
オールジスルフィド酸化還元酵素と併用することができ、分子シャペロンおよび
／またはチオールジスルフィド酸化還元酵素は上述したような溶液の状態または
固定化された状態であってもよい。

【００５３】以上の形態のいずれか、または特許請求の範囲に記載の他の形態に従って使用
すれば、本発明を用いて様々な状況にてタンパク質を容易にフォールディングさ
せることができる。例えば、本発明を使用して、組換え技術によって作製したポ
リペプチドのリフォールディングを補助することができる。このようなポリペプ
チドは、未フォールディングまたは不正フォールディングの状態で得られる。従
って、組換え技術によって作製したポリペプチドを、タンパク質ジスルフィドイ
ソメラーゼおよび／または分子シャペロンおよび／またはプロリルペプチジルイ
ソメラーゼを含んでなる組成物を固定化させたカラムに通せばよい。

【００５４】別の実施形態では、保存寿命を延長させるために、本発明を使用して、例えば
保存時のタンパク質のフォールディング・コンフォメーションを維持することが
できる。保存条件下では、正しいフォールディングが破壊されるため、多くのタ
ンパク質がその活性を喪失してしまう。フォルダーゼと組み合わせた分子シャペ
ロンが存在することで、未フォールディング状態へ向かうポリペプチドの傾向が
減少または逆転し、その結果保存寿命が非常に伸びる。この実施形態では、ポリ
ペプチド成分(例えば、酵素、組織培養成分)を含んでなる試薬および溶液中に保
存された他のタンパク質性試薬へ本発明を適用することができる。

【００５５】第3の実施態様では、本発明を使用して、保存、変性条件への曝露、またはその他によって不正フォールディングになったタンパク質の正しいフォールディン
グを促進することができる。従って、本発明を使用して、試薬または他のタンパ
ク質を再生させることができる。例えば、再生が必要なタンパク質を、本発明に
従う試薬の組み合わせを固定化させたカラムに通せばよい。あるいは、このよう
な組み合わせを固定化させたビーズを、再生が必要なタンパク質を含んでなる溶
液中に懸濁させてもよい。さらに、本発明の組み合わせの成分を、溶液中で、再
生が必要なタンパク質へ添加してもよい。

【００５６】上述したように、本発明の組み合わせの成分は、分子シャペロンまたはフォル
ダーゼの誘導体を含んでいてもよく、例えば、共通する構造上の特徴を保持した
このようなポリペプチドの変異体が挙げられる。共通する構造上の特徴を保持し
た変異体は、分子シャペロンまたはフォルダーゼの断片でありうる。

【００５７】分子シャペロンまたはフォルダーゼの断片は、これらから誘導されたより小さ
いポリペプチドを含んでなるものである。好ましくは、本発明に従って分子シャ
ペロンまたはフォルダーゼから誘導されたより小さいポリペプチドは、分子シャ
ペロンまたはフォルダーゼの特性を示す独自の特徴を規定するものである。断片
は、理論上、本明細書に記載の分子シャペロンまたはフォルダーゼの活性を保持
する限り、ほぼ任意の大きさでよい。

【００５８】 GroEL/hsp-60ファミリーの分子シャペロンについては、所望の活性を有する断
片の好適なセットを同定している。これらの断片は本出願人らの同時係属国際特
許出願PCT/GB96/02980に記載されており、本質的には、無傷のGroELの少なくともアミノ酸残基230〜271を含む任意の断片または別のhsp-60シャペロンにおける
その等価物を含んでなるものである。好ましくは、断片は、GroELの残基150〜45
5または151〜456または別のhsp-60シャペロンにおけるその等価物を超えてはならない。断片がGroEL断片の場合、上述したような突然変異体GroEL配列を有して
いてはならない。即ち、無傷のGroEL配列の262位にアラニン残基および／または
267位にイソロイシン残基を有していてはならない。

【００５９】有利には、断片は、本明細書で定義したように、GroELの頂端ドメイン、または他の分子シャペロンにおけるその等価物、またはそれらに相同な領域を含んで
なるものである。頂端ドメインは無傷のGroELのアミノ酸191〜376に及ぶ。このドメインは、広範な種およびシャペロン型間で相同であることが判っている。

【００６０】このリストはOWLデータベースリリース28.1に従うものである。以下に列挙する配列は、PDB構造pdb1grl.entにおいて頂端ドメイン(残基191〜376)に対して明
らかな相同性を示すものである。

【００６１】 OWLは、SWISS-PROT、PIR(1-3)、GenBank(翻訳)およびNRL-3Dを併合させた非重
複データベースである。

【００６２】

【００６３】他のデータベースを使用して、または最新版のOWLデータベースを使用してこのような分析を繰り返してもよく、また、HSP70、HSP90もしくはGRPファミリー等の他のシャペロンファミリーの場合も同様である。

【００６４】好ましくは、本発明の分子シャペロンは、先に定義したGroELの頂端ドメインに相当する領域に相同であるか、またはストリンジェントな条件下でこの領域と
ハイブリダイズ可能なものである。

【００６５】非常に好適な実施形態では、断片を無傷のGroEL配列の残基191〜376、191〜34
5および191〜335からなる群より選択する。

【００６６】分子シャペロンまたはフォルダーゼの誘導体は、本明細書に記載の分子シャペ
ロンまたはフォルダーゼの活性を維持する要件を満たすのであれば、それらの突
然変異体(例えば、断片および他の誘導体の突然変異体)をも含んでなるものであ
り、アミノ酸の欠失、付加または置換を含んでいてもよい。従って、5'または3'
末端からの末端切断と同様、分子シャペロンまたはフォルダーゼの性質を実質的
に変更せずに保存的アミノ酸置換を行うことができる。欠失および置換は、さら
に、本発明を構成する分子シャペロンまたはフォルダーゼの断片へも行うことが
できる。突然変異体は、例えば1個以上のアミノ酸の付加、交換および／または欠失をもたらすin vitro突然変異誘発を行った分子シャペロンまたはフォルダー
ゼをコードするDNAから産生される。例えば、分子シャペロンまたはフォルダーゼの置換変異体、欠失変異体または挿入変異体を組換え法によって調製し、該当
する分子シャペロンまたはフォルダーゼの天然型との免疫交差反応性についてス
クリーニングすることができる。

【００６７】分子シャペロンまたはフォルダーゼの断片、突然変異体および他の誘導体は、
好ましくは天然の分子シャペロンまたはフォルダーゼと実質的な相同性を保持す
るものである。本明細書中では、「相同性」とは、2つの物質が十分な特性を共有しており、起源や機能が類似していることを当業者が判断できることをいう。
好ましくは、相同性を、配列の同一性を表すのに使用する。従って、分子シャペ
ロンまたはフォルダーゼの誘導体は、好ましくは該当する分子シャペロンまたは
フォルダーゼの天然型と実質的な配列同一性を保持するものである。

【００６８】相同性が配列同一性を示す場合、「実質的に相同」とは、直接的な配列アライ
メントおよび比較によって判定して40％を超える配列同一性、好ましくは45％を
超える配列同一性、および最も好ましくは50％以上の配列同一性を意味する。

【００６９】配列相同性(または同一性)は、さらに、任意の適切な相同性アルゴリズム使用
して、例えばデフォルトパラメータを使用しても判定できる。有利には、デフォ
ルト値に設定したパラメータを用いるBLASTアルゴリズムを使用する。BLASTアル
ゴリズムは、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast#help.htmlに詳述されている(引用により本明細書に含まれるものとする)。検索パラメータを以下のように
定義し、有利には規定のデフォルトパラメータに設定する。

【００７０】有利には、BLASTで評価した場合の「実質的な相同性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは10以上のEXPECT値と一致する配列に
相当する。BLAST検索におけるEXPECTのデフォルト閾値は通常10である。

【００７１】 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)は、プログラムblastp、blastn 、blastx、tblastnおよびtblastxによって使用される発見的検索アルゴリズムで
あり、これらのプログラムの有意性は、若干機能を強化させたKarlinおよびAlts
chulの統計的方法(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast#help.htmlを参照)を用いることで、その検索結果に反映される。BLASTプログラムは、例えば、問い合せ配列に対する相同体を同定するよう、配列類似性検索に適合させたものであ
る。このプログラムは、モチーフ型検索(motif-style searching)には通常有用ではない。配列データベースの類似性検索における基本的な点についての検討は
、Altschulら(1994) Nature Genetics 6:119-129を参照されたい。

【００７２】 http://www.ncbi.nlm.nih.govで入手可能な5種類のBLASTプログラムは以下のタスクを実行するものである： blastpは、アミノ酸の問い合せ配列をタンパク質配列データベースと比較し； blastnは、ヌクレオチドの問い合せ配列をヌクレオチド配列データと比較し； blastxは、ヌクレオチドの問い合せ配列(両鎖とも)の6通りのフレームを概念的に翻訳した産物を、タンパク質配列データベースと比較し； tblastnは、タンパク質の問い合せ配列を、6通り全てのリーディングフレーム
(両鎖とも)において機能的に翻訳したヌクレオチド配列データベースと比較し； tblastxは、ヌクレオチドの問い合せ配列の6通りのフレーム翻訳産物を、ヌク
レオチド配列データベースの6通りのフレーム翻訳産物と比較するものである。

【００７３】 BLASTには以下の検索パラメータが使用される： HISTOGRAMは、各検索についてスコアのヒストグラムを表示する。デフォルトあり。(BLASTマニュアルのパラメータHを参照。)

【００７４】 DESCRIPTIONは、報告される一致配列の短い記載の数を既定数へ制限する。デフォルト限界は100記載である。(マニュアルページのパラメータVを参照。)EXPE
CTおよびCUTOFFも参照されたい。

【００７５】 ALIGNMENTSは、高スコアリングセグメント対(high-scoring segment pair; HS
P)が報告されるデータベース配列を既定数へ制限する。デフォルト限界は50であ
る。これよりも多くのデータベース配列が、報告に際して統計学的有意性の閾値
を偶然満たした場合には(下記のEXPECTおよびCUTOFF参照)、統計学的な有意性が
最も高いとされる一致のみを報告する。(BLASTマニュアルのパラメータBを参照。)

【００７６】 EXPECTは、データベース配列に対する一致を報告する統計学的有意性の閾値で
ある。KarlinおよびAltschulの確率モデル(1990)に従うと、デフォルト値は10で
あり、10の一致が単なる偶然で見つかるものと期待される。一致の統計学的な有
意性がEXPECT閾値よりも高い場合には、その一致は報告されない。EXPECT閾値が
低いほど厳しさが増すため、一致はほとんど報告されなくなる。少数値を設定す
ることもできる。(BLASTマニュアルのパラメータEを参照。)

【００７７】 CUTOFFは、高スコアリングセグメント対を報告するスコアをカットオフする。
デフォルト値は、EXPECT値から計算される(上記参照)。HSPの統計学的な有意性が、CUTOFF値に等しいスコアを有するHSPのみの場合の有意性と少なくとも同程度の高さである場合に限り、データベース配列に対してHSPを報告する。CUTOFF 値が高いほど厳しさが増すため、一致はほとんど報告されなくなる。(BLASTマニ
ュアルのパラメータSを参照。)典型的には、EXPECTを用いて有意性の閾値をより
直感的に管理することができる。

【００７８】 MATRIXは、BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXの場合に代替スコア行列を
指定する。デフォルト行列はBLOSUM62である(HenikoffおよびHenikoff, 1992)。
妥当な代替選択肢としては、PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYが挙げられる。BLASTNの場合には代替スコア行列を利用できないため、BLASTNをリクエスト
した場合にMATRIXを指定するとエラー応答が返される。

【００７９】 STRANDはTBLASTN検索をデータベース配列の上部鎖または下部鎖に制限するか、またはBLASTN、BLASTXもしくはTBLASTX検索を問い合せ配列の上部鎖もしくは下部鎖上のリーティングフレームに制限する。

【００８０】 FILTERは、WoottonおよびFederhenのSEGプログラム(1993) Computers and Che
mistry 17:149-163で判定した構成上の複雑度が低い問い合せ配列のセグメント、またはClaverieおよびStates (1993) Computers and Chemistry 17:191-201の
XNUプログラムで判定した短い周期の内部反復からなるセグメント(BLASTNの場合
は、TatusovおよびLipmanのDUSTプログラムで判定；http://www.ncbi.nlm.nih.g
ovを参照)を除去(mask off)する。フィルタリングは、統計学的には有意であるが生物学的には意味のない報告をblast出力から排除できるため(例えば、共通の
酸性領域、塩基性領域またはプロリンに富む領域に対するヒット)、データベース配列に対する特定のマッチングに利用できる問い合せ配列の生物学的により興
味深い領域が残る。

【００８１】フィルタープログラムで見出される複雑度の低い配列を、ヌクレオチド配列で
は文字「N」を用いて置換し(例えば、「NNNNNNNNNNNNN」)、タンパク質配列では
文字「X」を用いて置換する(例えば、「XXXXXXXXX」)。

【００８２】フィルタリングは、問い合せ配列(またはその翻訳産物)に適用されるだけであ
って、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTN
の場合にはDUSTであり、他のプログラムの場合にはSEGである。

【００８３】 SWISS-PROTの配列に適用した場合、SEG、XNUまたはその両方でマスクされる配
列が全くないということは珍しくはないため、フィルタリングによって常に効果
が得られると期待すべきではない。さらに、いくつかの場合では、配列全体をマ
スクすることで、未フィルタリングの問い合せ配列に対して報告されるいずれの
一致の統計学的な有意性も信用できないことは明らかである。

【００８４】 NCBI-giは、受入れ名および／または遺伝子座名の他に、出力に示すべきNCBI
gi識別子を与えるものである。

【００８５】最も好ましくは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTにて得られる単純なBLA
ST検索アルゴリズムを用いて配列比較を行う。

【００８６】あるいは、上述しようなシャペロンまたはフォルダーゼ配列の相補鎖にハイブ
リダイズする能力に応じて配列類似性を規定することもできる。

【００８７】好ましくは、配列は、高ストリンジェンシーでハイブリダイズ可能である。ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸ハイブリッドが安定で
ある条件のことをいう。このような条件は当業者には明らかである。当業者に公
知なように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度(Tm)に反映し、融
解温度は配列相同性が１％減少する毎におよそ１〜1.5℃減少する。一般的には、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的に
は、ハイブリダイゼーション反応は高ストリンジェンシーの条件下で行い、次い
でストリンジェンシーを変えて洗浄する。

【００８８】本明細書中では、高ストリンジェンシーとは、１MのNa+中、65〜68℃にて安定
なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションが可能となる
条件のことをいう。高ストリンジェンシー条件は、例えば、６×SSC、５×Denha
rdt溶液、１％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.1 Na+ピロリン酸塩および非特異的な競合物質としての0.1mg/ml変性サケ精子DNAを含有する水溶液中でのハイブリダイゼーションによって得られる。ハイブリダイゼーションの後、高ストリ
ンジェンシー洗浄を多段階で行い、ハイブリダイゼーション温度で0.2〜0.1×SS
C、0.1％SDS中にて最終洗浄(約30分)を行うことができる。

【００８９】中ストリンジェンシーとは、上述の溶液中ではあるが約60〜62℃でのハイブリ
ダイゼーションに相当する条件のことをいう。この場合、最終洗浄はハイブリダ
イゼーション温度にて１×SSC、0.1％SDS中で行う。

【００９０】低ストリンジェンシーとは、上述の溶液中ではあるが約50〜52℃でのハイブリ
ダイゼーションに相当する条件のことをいう。この場合、最終洗浄はハイブリダ
イゼーション温度にて２×SSC、0.1％SDS中で行う。

【００９１】これらの条件は、様々な緩衝液(例えば、ホルムアミド系緩衝液)と温度を用い
て改変および反復可能であることは明らかである。Denhardt溶液およびSSCは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様、当業者には周知である(例えば、Sambrookら編(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, New York またはAusubelら編(1990) Current Pro
tocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.を参照)。最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さおよびGC含量も関与しているため、
経験的に決定しなければならない。

【００９２】本発明は、本発明の組み合わせを組成物として投与することを意図したもので
あり、好ましくは、タンパク質の不正フォールディングに関連する疾患の治療を
目的とする。活性な化合物は都合の良い方法、例えば、経口、静脈内(水溶性の場合)、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは坐薬経路または体内埋植(例えば、
緩徐放出分子を使用)で投与できる。投与経路によっては、活性成分を、酵素の作用、酸、および該成分を不活化する可能性のある他の自然条件から保護する材
料で被覆する必要がある場合がある。

【００９３】非経口投与以外で該組み合わせを投与するためには、不活化を防止する材料で
被覆するか、またはこのような材料と一緒に投与する。例えば、該組合せをアジ
ュバント中に含ませて投与してもよく、また、酵素阻害剤と同時にもしくはリポ
ソームに封入して投与してもよい。アジュバントは最も広い意味で使用され、イ
ンターフェロン等の任意の免疫刺激化合物が含まれる。本明細書中で意図するア
ジュバントには、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤(ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn-ヘキサデシルポリエチレンエーテル等)が含まれる。酵素阻害剤としては膵臓トリプシンが挙げられる。

【００９４】リポソームには、水中油中水型CGFエマルション並びに従来慣用のリポソームが含まれる。

【００９５】活性な化合物は、非経口でまたは腹腔内へ投与してもよい。グリセロール、液
体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中で、並びに油中で、分散液を
調製することもできる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物には
微生物の増殖を防止する防腐剤が含まれる。

【００９６】注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液(水溶性の場合)もしくは分散
液、および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。
全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流
動性がなければならない。剤形は、製造および保存条件下で安定でなければなら
ず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護しなければならない。担体は
、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、これらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒である。例えば、レシチン等の被覆を利用す
ることで、分散液の場合には必要な粒径を維持することで、および界面活性剤(s
uperfactant)を使用することで、適切な流動性を維持できる。

【００９７】微生物の作用の防止は、各種抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、ク
ロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール(thirmerosal)等によって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含む
のが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収遅延剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)の組成物に含ませて使用することで達成できる。

【００９８】無菌注射用溶液は、活性な化合物を必要な量で適切な溶媒中にて、必要に応じ
て上述の他の各種成分と共に混合し、濾過滅菌することにより調製する。通常、
分散液は、滅菌活性成分を、基本分散媒および必要な他の成分(上述した成分から選択)を含む無菌ビヒクルへ混入することにより調製する。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合には、好適な調製方法は、真空乾燥法および凍結乾
燥法であり、予め濾過滅菌しておいた溶液から、活性成分と所望の任意の追加成
分からなる粉末が得られる。

【００９９】ポリペプチドの組合せを上述のように適切に保護する場合には、例えば、不活
性希釈剤もしくは吸収性の食用担体と共に経口投与するか、硬質もしくは軟質の
ゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、または治療食の食品に直接
混入すればよい。経口投薬の場合には、活性化合物を賦形剤へ混入し、吸収性錠
剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ剤、ウ
エハース等の状態で使用することができる。このような治療上有用な組成物に含
まれる活性化合物の量は、適切な投与量が得られる量である。

【０１００】錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル等はまた、以下のものを含んでいてもよい
：トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンもしくはゼラチン等
の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモ
デンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；並び
にスクロース、ラクトースもしくはサッカリン等の甘味剤を添加するか、または
ペパーミント、冬緑油もしくはサクランボ着香料等の着香料。投与単位剤形(dos
age unit form)がカプセルの場合には、上述した種類の材料以外に、液体担体を
含んでいてもよい。

【０１０１】他の各種材料は、被覆として存在してもよく、そうでなければ投与単位の物理
的形状を改変してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルをセラック、糖
またはその両方で被覆してもよい。シロップ剤またはエリキシルは、活性化合物
、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパ
ラベン、色素並びにサクランボもしくはオレンジ風味の着香料を含んでいてもよ
い。もちろん、いずれの投与単位剤形の調製に使用する材料はどのようなもので
も製剤学上純粋であり、かつ使用される量で実質的に非毒性でなければならない
。さらに、活性化合物は、徐放性製剤に混入されていてもよい。

【０１０２】本明細書中、「製剤学上許容し得る担体および／または希釈剤」としては、任
意および全ての溶媒、分散媒、被覆、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤並びに吸
収遅延剤等が挙げられる。このような媒体および薬剤を製薬上活性な物質へ使用
することは、当該技術分野で周知である。任意の従来慣用の媒体または薬剤は、
活性成分と適合しない範囲を除けば、治療組成物での使用が考慮される。補足的
な活性成分を組成物に混入することもできる。

【０１０３】投与の容易さと投与量の均一性のためには、非経口組成物を投与単位剤形で製
剤化することが特に有利である。本明細書中、投与単位剤形とは、治療すべき哺
乳動物被検体に対する単位投与(unitary dosage)として適した物理的に離散性の
単位をいい、各単位には、所望の医薬用担体と共に所望の治療効果を発揮するよ
う計算された既定量の活性物質が含まれる。本発明の新規な投与単位剤形の詳細
は、(a)活性物質の独自の特性および達成すべき特定の治療効果、並びに(b)身体
の健康が損なわれる疾患状態にある生体被検体の疾患を治療するためのこのよう
な活性物質を調剤する分野に固有の制限によって決まり、これらに直接依存する
。

【０１０４】投与単位剤形において製剤学上許容し得る適切な担体と共に有効量で簡便かつ
有効に投与を行うため、主な活性成分を調合する。補足的な活性成分を含有する
組成物の場合には、前記成分の通常の用量および投与様式を参照して投与量を決
定する。

【０１０５】さらなる態様では、疾患の治療に使用するために上記のように定義した本発明
の組合せを提供する。従って、タンパク質／ポリペプチドの異常な構造に関連す
る疾患を治療するための医薬製剤の製造に対して、本発明の組み合わせを使用す
る。タンパク質／ポリペプチドの異常な性質は、異常な(例えば、突然変異した)
アミノ酸配列による不正フォールディングまたは未フォールディングに起因する
可能性がある。このタンパク質／ポリペプチドは不安定となり、また、例えばア
ルツハイマー病のように斑(plaque)として沈積する。この疾患はプリオンによっ
て引き起こされると考えられる。本発明のポリペプチド系医薬製剤は、異常な欠
陥もしくは沈積タンパク質を再生または再溶解するように作用するものである。

【０１０６】以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、これは単に例示を目的とす
るものである。

【０１０７】〔実施例１〕＜混合床ミニシャペロン／DsbA／シクロフィリンゲル＞＜ミニシャペロンの発現、精製および固定化＞ミニシャペロン(大腸菌GroEL由来の191-345ペプチド断片)をクローニングし、
17残基N末端ヒスチジン尾部を含む融合タンパク質として大腸菌中で発現させる(
Zahnら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15024-15029)。ミニシャペロン
を既報(Altamiranoら(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 3576-3578)の通
りアガロースゲルビーズ上に固定化する。但し、NHS-活性化Sepharose-4 Fast F
low (Pharmacia Biotech, Sweden)を使用する。本出願人らの先の調製物の場合よりも長いスペーサーアームを有するこの活性化ゲルは、より効率が高く安定で
ある。漏出はゼロにまで減少し、シクロフィリンAをリフォールディングする能力は、6mg基質/ml湿潤ゲル(即ち、既報のリフォールディングゲルの値の1.5倍) まで増加している。

【０１０８】＜ヒトPPIの発現、精製および固定化＞ヒトPPI(ペプチジル-プロリルcis-trans-イソメラーゼ)を、記載の方法(Jasan
offら(1994) Biochemistry 33, 6350-6355)に若干の改変を加えて発現させ、精製する。簡単に言うと、融合タンパク質GST-PPIの遺伝子を保有するプラスミドを使用して大腸菌C41 D3株を形質転換させる(MirouxおよびWalker (1996) J. Mo
l. Biol. 260, 289-298)。細胞を2×TY培地中、34℃で増殖させる。接種材料をA ₆₀₀ =0.5まで増殖させ、0.7mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシドで誘導し、培養物を16時間25℃にて増殖させて回収する。細胞のペレットを緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、pH7.5、100mM NaCl、１％Triton X100および0.2mM PMSF)に再懸濁させ、超音波処理してタンパク質を遊離させ、タンパク質をグルタチオンアガ
ロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーで精製する。次いで結合した
融合タンパク質をカラム上でトロンビンにて処理し、遊離のPPIを得る。トロンビンは溶離液中にも含まれるため、ベンズアミジンアガロースによるアフィニテ
ィークロマトグラフィーで除去する。PPIの純度をSDS-PAGEおよびSuperdex 75カ
ラム(Pharmacia Biotech)を用いるFPLCで確認する。PPIを既述の通りアッセイし
、ミニシャペロンの固定化について上述した通りにNHS-Sepharose 4 Fast Flow へ結合させる。

【０１０９】＜DsbAのクローニング、発現および精製＞大腸菌dsbA遺伝子を、その既知の配列に基づくdsbA-FoおよびdsbA-Baプライマ
ーを用いるPCRにより増幅する。シグナルペプチドを含む発現遺伝子全体を増幅し、NcoIおよびBamHIで消化し、高発現プラスミドpCE820へクローニングする(Le
wisら(1993), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 3, 1197-1202)。pM
A14(pCE820-DsbA)を精製し、標準的な配列決定法で配列を確認する。dsbA遺伝子
産物を大腸菌C41 D3株内で過剰産生させると(MirouxおよびWalker, 1996)、ほぼ
独占的に周辺細胞質画分に見られる。細胞を2×TY培地中、37℃で増殖させる。接種材料をA₆₀₀=0.2まで増殖させ、0.7mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシドで
誘導し、培養物を12〜14時間30℃にて増殖させて回収する。細胞タンパク質をス
フェロプラストの状態で分画し、得られる可溶性周辺細胞質の内容物をリゾチー
ム/EDTA法を用いて調製する。スフェロプラストを含有する懸濁液を遠心分離にかける(48,000×g、30分、４℃)。接線フロー系用の10kDaカットオフ膜(Miniset
te, Filtron)を用いるダイアフィルトレーションにより、タンパク質を10mMのMO
PS/NaOH(pH7.0)中で脱塩する。Mono-Q HR 10/10 FPLCカラム(Pharmacia, Biotec
h)を用いるイオン交換クロマトグラフィーにて、浅いKCl勾配(0〜250mM)で溶離させることにより、DsbAタンパク質を精製する。DsbAは約70mM KClにて、SDS-PA
GE(20％ゲル)およびゲル濾過クロマトグラフィー(Superdex 75, Pharmacia Biot
hech)で見られる純度と同程度の95％を超える純度で溶出する。DsbAタンパク質の濃度を280nmにおける吸光度から計算する(天然の酸化型タンパク質の場合の吸
収係数A_{280,1mg/ml/cm}=1.10を用いる)。Wunderlich(1993)に記載の分光蛍光法を
用いて可溶性DsbAタンパク質の活性を判定する。

【０１１０】不活性雰囲気下でのDsbAタンパク質のCys-30の可逆的ブロッキング全ての実験をアルゴン(Ar)雰囲気下のグローブボックス内で行い、溶液試薬は
予めArで飽和しておく。DsbAの活性部位にあるジスルフィド基を5mM DTTにて25m
M MES-K⁺緩衝液(pH6.0)中で1時間還元し、次いで再酸化を防ぐためAr下で透析し
てDTTを除去する。次いでDsbAをAr下、NTCB(安息香酸2-ニトロ-5-チオシアネート)で5mMの最終濃度にてシアニル化する(Altamiroanoら(1989) Arch. Biochim.
Biophys. 269, 555-561; Altamiranoら(1992) Biochemistry 31, 1153-1158)。反応は実際には瞬時に起こり、出発基(departing group)であるアニオン2-ニトロ-5-チオベンゾエートに由来する黄色の外観から明らかである。30分後、反応の程度を412nmにおける吸光度(e₄₁₂=14,140 M^-1cm^-1)を測定することにより評価
すると、化学量論的であることが判明した(Altamiranoら, 1992)。タンパク質を
50mM NaHCO₃緩衝液(pH8.3)／0.5M KCl中でクロマトグラフィーにて脱塩する(脱塩10/10カラム、Pharmacia Biothech)。

【０１１１】NHS-活性化Sepharose-4 Fast Flowゲルへの結合 5mlの湿潤ゲル(Pharmacia Biotech, Sweden製のNHS-活性化Sepharose-4 Fast
Flow)を15倍容量の冷1mM HClで洗浄し、次いで50mM NaHCO₃(pH8.3)／0.5M KCl中
に懸濁させ、転倒型振盪機中で1分間室温にて混合する。チオール基を可逆的にブロックしたDsbAタンパク質をゲル懸濁液へ添加し(7mgタンパク質/mlゲル)、転
倒型振盪機中で2時間室温にて混合する。次いでカップリング緩衝液で洗浄する。2.5MのエタノールアミンをpH8で添加し、室温で4時間混合することにより、残
存する活性基をブロックする。未カップリングのDsbAを、高pHおよび低pHの緩衝
溶液(0.5M NaClを含む0.1M Tris-HCl (pH7.8)、次いで0.5M NaClを含む0.1M酢酸
緩衝液(pH4))で交互に5回洗浄して除去する。最後にゲルの5〜10倍容量のリフォ
ールディング緩衝液(下記参照)でゲルを洗浄し、SH基をDTTで処理して再生する。ゲルの10倍容量のリフォールディング緩衝液でゲルを洗浄する。この後、実験
プロトコールで詳述した通りに固定化DsbAタンパク質を酸化する。この手順のカ
ップリング効率は95％を超えるものである。

【０１１２】リフォールディング実験は全てバッチ様式で行う。使用後、ゲルを5倍容量の保存緩衝液(100mMリン酸ナトリウム(pH8)＋2mM EDTA＋0.5M KCl)で洗浄して再生
する。2mMのEDTAを含有する100mMリン酸ナトリウム(pH7.0)中で4℃にて保存すれ
ば、ゲルは少なくとも1年間は安定である。

【０１１３】混合床ミニシャペロン/DsbAゲル以下の2つのアプローチを使用して、ミニシャペロン、PPIおよび／またはPDI の複合マトリックスを調製する： a)各タンパク質をNHS-Sepharose上へ別々に固定化し、ゲルを入念に混合する；または b)タンパク質を混合し、NHS-アガロース上へ固定化する。

【０１１４】両方の場合のリフォールディングゲルを用いて、まず結果可能な比較を得る。
以下のデータの大部分はb)の場合のゲルを用いた実験から得た。 in vitroでのリフォールディングが非常に困難なジスルフィド架橋を含むタン
パク質のリフォールディングクロマトグラフィーについてこれらのゲルを試験す
るため、次の2つの例を選択した：フォールディングが特に困難なことが分かっているサソリ毒CN5と単鎖抗体。

【０１１５】〔実施例２〕ミニシャペロン/PDIゲル上でのサソリ毒のリフォールディングサソリCentruroides noxiusの毒液から単離される甲殻類に特異的な毒素であるCn5を使用する。このペプチドには66個のアミノ酸残基が含まれ、4個のジスル
フィド架橋(Cys12-Cys65、Cys16-Cys41、Cys25-Cys46およびCys29-Cys48)によっ
て安定化されている。毒性試験より、Cn5は、哺乳動物ではなくて節足動物に対する毒素であることが既に判明している。

【０１１６】リフォールディング条件：純粋な変性毒素のサンプルをDr. L. Possani (Institute of Biotecchnology, Cuernavaca, Mor., Meixco)の研究室より入手した。リフォールディングのプロ
トコールは以下の通りである：１．チオールを還元状態に維持するため、凍結乾燥タンパク質を8M尿素＋0.3M DTEに溶解し、6M GnHCl(pH2.0)に対し23℃で2時間透析する。２．3.5nmolの変性Cn5 (25μg)を、「リフォールディング緩衝液」(100mMリン
酸カリウム緩衝液(pH7.7)、0.5M L-アルギニン、1mM GSH(=グルタチオン)、1mM
GSSG、2mM EDTA)で予め平衡化しておいたゲルスラリー中で200倍に希釈する。混
合物を転倒回転させて静かに混合し、5時間室温にて回転を続ける。

【０１１７】ゲルを小型カラムへ充填し、リフォールディング緩衝液で溶離させる。次いで
加圧下での限外濾過(Amicon cell)によって、緩衝液を5mMリン酸緩衝液(pH7.7) へ変えて濃縮する(最終濃度は5mM)。最終的に調製物を凍結乾燥させる。

【０１１８】同時に、以下の対照と実験とを行う： a)リフォールディング緩衝液のみで1:200に希釈したCn5 b) a)＋ミニシャペロン-アガロース(断片191-345) c) a)＋DsbA-アガロース d) a)＋DsbAおよび断片191-345を含む複合ゲル

【０１１９】 d)のように処理したサンプルのみ、可溶性タンパク質が得られた。このサンプ
ルの毒性を試験したところ、甲殻類Procambarus bouvieriの場合の天然のペプチ
ドと同程度の毒性であることが判明した。

【０１２０】〔実施例３〕ミニシャペロン/PDIゲル上での単鎖組換え抗体(ScFv)のリフォールディング 2つのジスルフィド架橋を有するScFV(31kDa)は、抗ロドプシン特異性(ロドプシンのC末端に対して)を有するマウスのモノクローナルハイブリドーマ系統から
誘導した組換え抗体である。

【０１２１】 Dr. C. Smith Laboratory (University of Florida, Gainesville, FL, USA) から入手した変性タンパク質は、封入体から部分的に精製されたものであり、6M GnHClおよび0.5Mイミダゾールの緩衝液中に収容されている。この緩衝液を6M G
nHClおよび25mM酢酸アンモニウム(pH5.0)へ変え、0.3M DTEを添加して2時間放置
する。サンプルを以下のリフォールディング緩衝液(100mM Tris-HCl、0.5M L-ア
ルギニン、2mM EDTA、8mM GSSG)で希釈し、6個のサンプルへ分割する： A＝対照(リフォールディング緩衝液そのもの) B＝セグメント191-376-アガロース C＝セグメント191-345-アガロース D＝セグメント191-376-アガロース＋DsbA-アガロース E＝セグメント191-345-アガロース＋DsbA-アガロース F＝DsbA-アガロース

【０１２２】ScFvのバッチ様式での再生変性ScFvを6M GnHClおよび0.3M DTTに溶解した溶液を、条件A〜F(上述)下でリ
フォールディング緩衝液にて100倍に希釈する。静かに12時間混合した後、カラムに充填し、リフォールディング緩衝液および150mM NaClで溶離させる。リフォ
ールディング後、サンプルを50mMリン酸緩衝液(pH7.7)および150mM NaClに対して透析し、ウェスタンブロットおよびELISAで試験する。Eに従って得られたScFv
は、両アッセイにおいて顕著に活性が高く、ELISA試験でロドプシン対する特異性を示した。

【０１２３】〔実施例４〕＜2成分ゲル(ミニシャペロン/PDI)および3成分ゲル(ミニシャペロン/PDI/PPI)に
おけるCn5毒素のリフォールディング＞＜固定化DsbAの活性＞これら全ての分析において、可溶性DsbAタンパク質の活性を対照として測定す
る。2通りの方法を使用する。

【０１２４】インスリンの還元 DTTによるインスリンの還元の触媒作用を、Holmgren (1979), J. Biol. Chem. 254, 9627-9632に従ってアッセイする。固定化DsbAタンパク質の場合、DsbAタンパク質を含有する50mlのビーズ(1.2nmol)を2.0mlの反応混合物へ添加する。静
かに10分混合した後、重力によって樹脂を沈降させ、上清の濁度を650nmにて測定する。Hitachi 4000分光蛍光計を用いて350nmにおける散乱光の測定を行う。

【０１２５】混合RNAse Aのジスルフィド交換アッセイ還元RNAse (rRNAse)および混合酸化RNAse (sRNAse)を得、LylesおよびGilbert
, (1991) Biochemistry 30, 613-619に従ってリフォールディングアッセイを行う。

【０１２６】＜Cn5毒素の精製＞サソリCentruroides noxius Hoffmann由来の可溶性毒液を、既述(Garciaら (1
997) Comparative Biochemistry and physiology B-Biochemistry & Molecular
Biology 116, 315-322)の通り3段階の連続クロマトグラフ工程によって精製する
。

【０１２７】＜Cn5サソリ毒素のバッチ様式での再生＞変性および還元されたCn5 凍結乾燥Cn5毒素(250mg)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8)で調製した100ml
の6M塩化グアニジニウム(guanidinium chloride)へ溶解する。次いで、0.1M DTT
で還元し、3時間23℃にて放置して反応を確実に完了させる。次いで、チオール基を還元状態に維持するため、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH3；リン酸で調整) で調製した6M塩化グアニジニウムに対して毒素を透析する。還元および変性され
たCn5毒素の蛍光およびCDスペクトルは、変性タンパク質の場合の典型的なスペクトルである。遊離のスルフヒドリルをDTNB(5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸)で測定してCn5の定量的な還元を確認したところ、１鎖当たり8個のシステイン残基が見出された。

【０１２８】＜リフォールディングマトリックスおよびCn5毒素のフォールディング＞ 2成分リフォールディングマトリックスは、ミニシャペロンおよびDsbAの1:1混
合物であり、3成分リフォールディングマトリックスは、同一濃度のミニシャペロン、DsbAタンパク質およびPPIを混合して得られる。リフォールディングゲルは両方とも、100mMリン酸カリウム、0.5M L-アルギニン、1mM GSSG(グルタチオンの酸化形態)、1mM GSH(グルタチオンの還元形態)および2mMナトリウムEDTAを用いて調製したpH8の緩衝液(リフォールディング緩衝液)で平衡化する。全ての場合で、変性および還元されたCn5を非常にゆっくりと添加して混合し、2成分ま
たは3成分のリフォールディングマトリックスの再懸濁液で100倍に希釈し、20℃
で静かに混合を続ける。4時間後、次いでゲル懸濁液を遠心分離し、上清を分離する。ゲルペレットを、0.5M KClを含有するリフォールディング緩衝液で洗浄す
る。最終的に調製物を濃縮し、リフォールディング緩衝液を水または50mM酢酸ア
ンモニウム緩衝液(pH5.5)で置換するためにクロマトグラフィーによって脱塩し、次いで凍結乾燥させる。生物学的アッセイの場合には、毒素を水に溶解させる
。

【０１２９】使用した3種のリフォールディングタンパク質(ミニシャペロンまたはDsbAまた
はPPI)の各々を個別に試験し、また、リフォールディング緩衝液を単独で用いて
対照実験を行う(表２)。

【０１３０】＜リフォールディングされたCn5およびその変性状態のCD研究＞分光分解能が0.2nmのJasco (Easton, MD) Model J-720分光計を使用してCDスペクトルを得る。285nmにおけるモル吸光係数が34.5M^-1cm^-1であり、290.5nmにおけるモル楕円率が2.36M^-1cm^-1である(1S)-(+)-10-樟脳-スルホン酸(Aldrich) を使用してCD検量を行う。0.05mg/mlの酵素濃度(25mMリン酸カリウム緩衝液中；
pH8)を使用し、0.1cmの応力の残留していないキュベット内で室温にてCDスペクトルを記録する。

【０１３１】Cn5のバイオアッセイ Lourival D. Possani (Departamento de Reconocimiento Estructural, Insti
tuto de Biotecnologia, UNAM PO Box 510-3, Cuernavaca, MOR, 62250, Mexico
)の研究室において、陸生甲殻類であるArmadillidium vulgare (ワラジムシ)に対して死亡率試験を行う。

【０１３２】＜天然Cn5のLD₅₀測定＞各々6匹の動物からなる5つの群を使用する。対照群に5μlの水を注射する。異
なる量の毒素(3、3.3、3.6および4μg/100mg体重)を5μlを超えない容量で水に再懸濁し、残りの4つの群へ注射する。10μlのHamiltonTMシリンジを使用して、
各動物の下側の最終体節(last underside segment)に注射する。生存比率を24時
間以内に評価する。

【０１３３】リフォールディングされた毒素の活性を試験するために、上述と同一の条件下
で6匹の動物に5μgずつ注射する。

【０１３４】〔結果の要約〕結果を表２にまとめる。リフォールディング緩衝液単独では、5％未満の再生C
n5毒素しか調製できない。PPI-アガロースでは、約10％の可溶性タンパク質が得
られるが、その大部分は凝集してしまう。DsbA-アガロースでは、10〜15％の可溶性タンパク質が得られるが、そのうちのわずか30％しか単分散でない。ミニシ
ャペロンおよびDsbAからなる2成分リフォールディングマトリックスでは、高収率のタンパク質が得られ、そのうちの74％が単分散であり、100％生物学的に活性であって天然毒素のスペクトルを有する。3成分マトリックスでは、98％の収率の可溶性タンパク質が得られ、そのうちの89％が単分散であり、100％生物学的に活性であって天然スペクトルを有する。

【０１３５】

【表２】

【０１３６】⁰ NHS-活性化Sepharose 4-Fast Flow¹ 100mMリン酸カリウム(pH8)、0.25M L-アルギニン、1mM GSSG、1mM GSH、2mM ED
TA² ミニシャペロン-アガロースおよびDsbA-アガロースの等モル比混合床カラム³ ミニシャペロン-アガロース＋DsbA-アガロース＋PPI-アガロースの等モル比混合床カラム⁴ 判定不可^a モル吸光係数A₂₇₆=18 080 M^-1cm^-1を使用してBradfordアッセイにより、溶解
状態を保っているタンパク質を測定した。^b ゲル濾過クロマトグラフィーで評価

【図面の簡単な説明】

【図１】ジスルフィド含有ペプチドを固相支持体へ固定化させる方法を示す流れ図であ
る。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月１９日（２０００．１．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９８１４３１４．２ (32)優先日平成10年７月２日(1998．7．2) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アルタミラノ，マイリアム，マーレンイギリス国シービー２２キュージーケンブリッジ，ヒルズロード 302 Ｆターム(参考） 4H045 AA20 CA11 CA40 DA76 DA83 DA89 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリペプチドを分子シャペロンおよびフォルダーゼと接触させることを含んでなる、ポリペプチドのフォールディングを促進させる方法
。
【請求項２】前記ポリペプチドが未フォールディングまたは不正フォールディングのポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記ポリペプチドがジスルフィドを含んでなる、請求項２記載の方法。
【請求項４】前記分子シャペロンがシャペロニン活性を有する分子シャペロンの断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】前記分子シャペロンがhsp-60シャペロニンの断片であり、哺乳動物hsp-60およびGroEL、またはこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】前記断片が、無傷のGroEL配列の262位にアラニン残基および／または267位にイソロイシン残基を有さないGroELの断片である、請求項５
記載の方法。
【請求項７】前記GroELの断片が、無傷のGroEL配列の262位にロイシン残基および／または267位にメチオニン残基を有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】前記分子シャペロン断片が、無傷のGroEL配列の断片191-3
76、191-345および191-335の少なくとも一つに相同な領域を含んでなる、請求項
５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】前記フォルダーゼが、チオール／ジスルフィド酸化還元酵
素およびペプチジル-プロリルイソメラーゼからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】前記チオール／ジスルフィド酸化還元酵素が、大腸菌DsbA
および哺乳動物PDI、またはこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】前記ペプチジル-プロリルイソメラーゼが、シクロフィリン、parbulen、SurAおよびFK506結合タンパク質からなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】ポリペプチドを、分子シャペロン並びにチオール／ジスル
フィド酸化還元酵素およびペプチジル-プロリルイソメラーゼの両者と接触させることを含んでなる、請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】前記分子シャペロン断片および／または前記フォルダーゼ
が、固相支持体上に固定化されている、請求項１〜12のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項１４】前記固相支持体がアガロースである、請求項13記載の方法
。
【請求項１５】分子シャペロンおよび／またはフォルダーゼを固定化させ
た固相支持体。
【請求項１６】請求項15記載の固相支持体で少なくとも一部充填したカラ
ム。
【請求項１７】ジスルフィド含有ペプチドを固相支持体上へ固定化する方
法であって、 a)ポリペプチド中のジスルフィドを還元剤で還元し、再酸化を防ぐ条件下で還
元剤を除去し、 b)ポリペプチドのチオール基を可逆的にブロックし、 c)固相を、チオールをブロックしたポリペプチドと非酸性pHにて接触させ、 d)残存する任意の活性基をブロックし、未結合ポリペプチドを洗浄により除去
し、 e)結合ポリペプチド上のチオール基を再生する工程を含んでなる前記方法。
【請求項１８】前記工程c)をpH7.5〜9.5で行う、請求項17記載の方法。
【請求項１９】請求項17または18記載の方法によって得られる、請求項15
記載の固相支持体または請求項16記載のカラム。
【請求項２０】請求項17または18に記載の方法によって得られる固相支持
体上に固定化されたチオール／ジスルフィド酸化還元酵素。
【請求項２１】請求項17または18に記載の方法によって得られる固相支持
体上に固定化されたペプチジル-プロリルイソメラーゼ。
【請求項２２】ポリペプチドのフォールディングを促進させるための、分
子シャペロンおよびフォルダーゼの使用。
【請求項２３】前記分子シャペロンの断片および／または前記フォルダー
ゼが、固相支持体上に固定化されている、請求項22記載の使用。
【請求項２４】ポリペプチドのフォールディングを促進させるための、無
傷のGroEL配列の262位にロイシン残基および／または267位にメチオニン残基を含んでなるGroELの断片の使用。
【請求項２５】分子シャペロンおよびフォルダーゼの組合せを含んでなる
組成物。