KR20010096177A

KR20010096177A - ＴＶＭＶＮＩａ 프로테아제를 이용한 융합단백질의선택적 절단법

Info

Publication number: KR20010096177A
Application number: KR1020000020138A
Authority: KR
Inventors: 송병두
Original assignee: 송병두
Priority date: 2000-04-17
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2001-11-07

Abstract

본 발명은 재조합 대장균으로부터 발현된 융합단백질에서 특정 단백질을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1)융합짝단백질의 유전자와 특정 단백질의 유전자 사이에 TVMV(Tobacco vein mottling virus) NIa 프로테아제의 기질이 되는 최적의 아미노산 서열을 포함하는 올리고 펩타이드의 유전자를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계, 2) 그에 의해 형질 전환된 대장균으로부터 발현된 단백질을 높은 기질 선택성을 갖는 TVMV NIa 프로테아제로 절단하여 특정 단백질을 절단하는 단계로 구성되며, 본 발명의 방법에 의하면 특정 단백질내의 다른 부위를 자르지 않고 특정 단백질과 융합짝단백질 사이만을 자름으로써 보다 효율적으로 융합단백질에서 특정 단백질을 분리할 수 있다.

Description

ＴＶＭＶＮＩａ 프로테아제를 이용한 융합단백질의 선택적 절단법{Proteolitic Processing of Fusion proteins containing the target sequences by the recombinant TVMV NIa protease}

본 발명은 재조합 대장균으로부터 발현된 융합단백질에서 특정 단백질을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1)융합짝단백질의 유전자와 특정단백질의 유전자 사이에 TVMV(Tobacco vein mottling virus) NIa 프로테아제(27kDa)의 기질이 되는 최적의 아미노산 서열, 발린-아르기닌/라이신-페닐알라닌-글루타민(V-R/K-F-Q)을 포함하는 올리고 펩타이드의 유전자를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계, 2)상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 발현된 단백질을 높은 기질특이성을 갖는 TVMV NIa 프로테아제로 절단하여 특정 단백질을 얻는 단계로 구성되며, 본 발명의 방법에 의하면 특정 단백질내의 다른 부위를 자르지 않고 특정 단백질과 융합짝단백질 사이만을 자름으로써 보다 효율적으로 융합단백질에서 특정 단백질을 분리할 수 있다.

특정 단백질의 물리적, 화학적, 생물학적 성질의 연구 혹은 의학적 응용을 위해서는 그 단백질을 경제적으로 다량 얻을 수 있는 방법이 요구된다. 최근에 들어서 이러한 요구의 해결책으로 대장균을 이용한 이종 단백질의 다량 발현법이 널리 이용되고 있다. 대장균내에서 외래 유전자를 발현시켜 특정 단백질을 다량 얻는 방법은 효과적인 발현 체제임에도 불구하고 삽입되는 외래 유전자가 진핵세포의 유전자인 경우 그로부터 전사된 mRNA들이 이루는 독특한 3차구조 때문에 번역(translation)이 잘 이루어지지 아니하여 발현율이 매우 낮다는 문제점이 있다.

이러한 문제를 극복하기 위해 제조하고자 하는 단백질의 유전자에 대장균에서 잘 발현되는 유전자 단편을 결합하여 발현시킴으로써, 진핵세포에서 발현되었을 때와 마찬가지로 정제대상 단백질의 아미노 말단에 메티오닌이 포함되지 않은 상태로 얻을 수 있고, 발현된 단백질을 바람직하게 폴딩시켜 안정된 3차 구조를 형성하므로써 불안정한 입체 구조로 인한 대장균내에서의 단백질 분해를 제한하여 융합 단백질을 고수율로 제조할 수 있는 방법이 도입되었다.

대장균에서 특정 단백질을 융합단백질의 형태로 발현시키는 경우 특정 단백질을 대량 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 발현된 후 단백질 분리 및 정제를 용이하게 할 수 있다는 이점이 있다. 예를 들면, 특정 단백질 유전자의 아미노말단 쪽에 FLAG단백질, (His)₆, 글루타티온 S-트랜스퍼레이즈(GST) 등의 융합짝단백질(fusion partner)의 유전자를 삽입하여 융합짝단백질이 함께 발현되도록 한 후, 발현된 융합단백질(fusion protein)을 융합짝단백질의 리간드(ligand)를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 발현된 융합단백질을 쉽게 분리 정제할 수 있다.

융합단백질이 분리되면, 원하는 단백질을 얻기 위해서 융합단백질의 프로세싱 즉, 융합짝단백질을 잘라낼 필요가 있게 되는데, 종래에는 이러한 단백질 프로세싱에 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide), 트립신(trypsin), 클로스트리페인(clostripain)등이 이용되어 왔다. 이 중, 시아노겐 브로마이드는 메티오닌을, 트립신은 아르기닌 또는 라이신을, 클로스트리페인은 아르기닌을 인식하고 절단하는데, 이들 절단부위는 특정 단백질과 융합짝단백질의 연결부위(junction) 뿐만 아니라, 단백질 내부에도 다수 존재하여 기질선택성이 낮으므로, 이러한 물질들은 매우 제한된 조건하에서만 융합단백질의 프로세싱에 적용 가능하다는 단점이 있다.

이에 최근에는, 보다 기질선택성이 뛰어남이 알려진 단백질 가수분해 효소를 융합단백질 프로세싱에 적용하고자, 융합짝단백질의 유전자와 특정 단백질의 유전자 사이에 단백질 가수분해 효소에 의하여 인식되는 펩타이드를 코딩하는 유전자를 삽입하여 발현시키고, 융합단백질로부터 특정 단백질을 분리하는 방법이 이용되고 있다. 현재 널리 쓰이고 있는 단백질 가수분해 효소로는 트롬빈(thrombin), 엔테로카이네이즈(enterokinase), 혈액 응고 인자인 factor Xa 등을 들 수 있는데, 트롬빈은 아르기닌과 글리신사이를 절단하고, 엔테로카이네이즈는 아미노산 서열 (N)Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(C)을 인식하여 라이신 잔기의 카르복실기(C) 쪽을 절단하며, factor Xa는 아미노산 서열 (N)Ile-Glu-Gly-Arg(C)를 인식하여 아르기닌의 아미노(N) 쪽을 절단한다고 한다고 알려져 있다.

그러나 상기 단백질 가수분해 효소들은 비교적 낮은 기질 선택성을 가지고 있어, 융합단백질의 연결부위 뿐만 아니라 얻고자 하는 특정 단백질 내부까지 절단하는 경우가 종종 있는 바, 이러한 문제점을 해결하기 위해서 보다 높은 기질 선택성을 갖는 단백질 가수분해 효소가 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 TVMV에서 유래한 NIa 프로테아제(27kDa)가 상기 종래의 프로테아제에 비해 높은 기질특이성을 가짐을 확인하고, TVMV NIa 프로테아제를 이용하여 융합단백질에서 특정단백질을 분리하는 방법을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 대장균에서 특정 단백질을 대량 생산하기 위하여 융합단백질을 이용하는 경우 발현된 융합단백질에서 특정 단백질을 선택적으로 분리하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 정제하고자 하는 특정 단백질의 내부 펩타이드 결합을 절단함없이 융합단백질의 연결부위(junction)만을 선택적으로 절단할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

도 1은 포티 바이러스 다중단백질의 구성(위)과 TVMV NIa 프로테아제가 프로세싱하는 7개 부위 각각을 이루는 아미노산 서열(아래)을 나타내는 모식도이고,

도 2a는 다양한 기질 농도에 따른 효소 반응 초기 속도의 시간에 대한 그래프이며; 본 그래프는도 1에 나타낸 절단부위 B에 대한 결과로서, ??는 50μM, ??는 100μM, ??는 200μM, ??는 500μM 에 대한 결과를 나타낸다.

도 2b은 초기 속도의 역수와 기질 농도의 역수의 관계에 대한 이중 반비례 라인위버-버크 그래프이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 1)융합단백질의 유전자와 특정 단백질의 유전자 사이에 TVMV NIa 프로테아제의 기질이 되는 아미노산 서열을 포함하는 올리고 펩타이드의 유전자를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계, 2)상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 발현된 단백질을 높은 기질특이성을 갖는 TVMV NIa 프로테아제로 절단하여 특정 단백질을 얻는 단계로 구성되는 재조합 대장균으로부터 발현된 융합단백질에서 특정 단백질을 분리하는 방법을 제공한다.

또한 TVMV NIa 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 V-R-F-Q 또는 V-K-F-Q을 포함하는 서열이다.

또한 TVMV NIa 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 V-R-F-Q 또는 V-K-F-Q을 포함하며, 아미노 쪽으로 2개, 카르복실 쪽으로 4개의 불특정 아미노산을 더 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

TVMV는 식물 바이러스인포티비리디(Potyviridae) 그룹에 속하는 포티 바이러스(potyvirus)의 하나이다(Shukla,D.D., Ward,C.W.,and Brunt,A.A.et al., the Potyviridae,1994). 포티 바이러스로는 현재까지 약 200여 종이 밝혀져 있으며, 담배 부식 바이러스(TEV), 터닙 모자이크 바이러스(TuMV) 등이 그 예이다.

포티 바이러스는 약 10 kb 길이의 양성 가닥 RNA 게놈을 갖는데, 이 RNA의 3' 말단은 폴리아데닐화되어 있고, 5' 말단에는 본 바이러스로부터 생성되는 단백질(VPg)이 공유결합으로 연결되어 있다(Doughert,W.G.et al.,Ann. Rev. Phytopathol.26, 123-143, 1988; Riechmann, J.L.et al., J. Gen. Virol. 73, 1-16,1992).

포티 바이러스에 의해 식물 숙주가 감염된 후 바이러스 게놈은 단일의 다중단백질(polyprotein)로 번역되는데, 이 다중단백질은 3가지 바이러스 프로테아제들[아미노 말단 단백질(P1), 헬퍼성분-프로테아제(HC-Pro), NIa 프로테아제]에 의해 약 10개 이상의 성숙 단백질들로 나누어 진다(도 1참조)(Dougherty,W.G.et al., Microbiol. Rev., 57, 781-822, 1993).바이러스 단백질들 중 아미노 말단 단백질(P1)과 헬퍼성분-프로테아제(HC-Pro)는 그들 각자의 카르복실 말단을 자가촉매적으로 절단하며, 핵에 포함되는 단백질인 NIa 프로테아제(27 kDa)는 다중단백질의 나머지 부위를 절단하는데 관여한다(Carrington,J.C.,et al., EMBO J., 8, 365-370, 1989; Verchot,J. and Carrington,J.C. et al., Virology, 185, 527-535, 1991; Hellmann,G.M.,et al., Virology,163, 554-562, 1988).

상기 포티 바이러스의 NIa 단백질(49 kDa)은 NIa 인식 절단 부위를 사이에 두고 아미노 말단의 VPg (22 kDa)와 카르복실 말단의 Pro (27 kDa) 두 개의 도메인으로 구성된다(Murphy,J.F.et al., Virology178, 285-288, 1990; Schaad,M.C.et al., J. Virol,70, 7039-7048, 1996). TVMV NIa 프로테아제는 감염초기에는 자기촉매적 절단으로 49 kDa 단백질로 생성되고, 감염 후기에는 재차 자가 절단되어 27 kDa 단백질로 생성됨이 확인되었는데, 재차 자가 절단 후 얻어지는 27 kDa 단백질도 49 kDa 단백질에서와 같은 프로테아제 활성을 그대로 유지하고 있음이 또한 확인되었다(Carrington,J.C.et al., Virology,160, 355-360, 1987a; Carrington,J.C.et al., J. Virol.61, 2540-2548, 1987b; Dougherty,W.G.et al., Virology,183, 449-456, 1991). 즉, NIa 단백질을 구성하는 두 개의 도메인 중 카르복실 말단부 도메인인 Pro(27 kDa)가 상기 프로테아제 활성을 나타내는 것으로, 카르복실 말단의 Pro는 트립신과 유사한 시스테인형 프로테아제이라 알려져 있다(Bazan,J.F.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 7872-7876, 1988; Gorbalenya,A.et al., FEBS Lett.243, 103-114, 1989; Kim,D.H.et al., Virology,226, 183-190, 1996; Kim,D.H.et al., Virology,213, 517-525, 1995;Matthews,D.A.et al., Cell,77, 761-771, 1994).

한편, 포티 바이러스들의 NIa 프로테아제는 특정의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 인식하여 프로세싱을 하며, NIa 프로테아제 활성 정도는 그 특정한 아미노산 서열에 생긴 변이의 영향을 받는다(Carrington,J.C. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 3391-3395, 1988; Dougherty,W.G.et al., Virology,171, 356-364, 1989; Garcia,J.A.et al., Escherichia coli. J. Gen. Virolet.71, 2773-2779, 1990; Garcia,J.A.et al., Escherichia coli. J. Gen. Virol.63, 2457-2460, 1989). 이하표 1은 포티 바이러스들의 NIa 프로테아제가 특이적으로 인식하는 절단부위의 대표적인 서열들을 나타낸 것이다.

p6	p5	p4	p3	p2	p1	포티 바이러스
		V	X	H	Q	PVY, TuMV, PRSV, PepMoV, PPV
		V	X	X	Q	SbMV
		V	R	X	Q	PSbMV
		V	X	H	E	JGMV
E	X	X	Y	X	Q	TEV

(X는 임의의 아미노산을 나타내며, p는 절단부위로부터의 위치를 나타낸다.)

본 발명에서는 포티 바이러스들 중 TVMV NIa 프로테아제가 특이적으로 인식하는 아미노산 서열을 이용하여 재조합 대장균으로부터 발현된 융합단백질을 분리하는 방법을 제공하고자 하는 것이므로 TVMV NIa 프로테아제가 특이적으로 인식하는 아미노산 서열을 찾아내는 것이 가장 중요한 일이다.

1)TVMV NIa 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열.

TVMV 단백질에는 NIa 프로테아제에 의하여 프로세싱되는 7개의 보존적 서열이 있는바, 이들을 NIa 프로테아제(27 kDa)와 반응시킨다(도 1참조).

반응 결과, 각 기질에 대한 단백질 분해 속도를 측정하여 절단부위 아미노산 서열에 대한 특이성을 결정하고(도 2a참조), 반응 속도 상수 K_m과 k_cat값이 1/[S]에 대한 초기속도의 이중 반비례 라인위버-버크 그래프(Lineweaver-Burk plot)로부터 산출된다(도 2b참조). 이 때, 도 2b의 그래프 기울기가 K_m/V_max와 같음으로 이로부터 K_m을 결정하고, 동일한 그래프의 y축 좌표로부터 V_max를 정한다. 효소 농도([E₀])를 이용한 식 V_max= [E₀]×k_cat로부터 k_cat을 결정한다.

반응 속도 상수의 분석을 통해, TVVM NIa 프로테아제가 특이적으로 작용하는 가장 선택성이 높은 아미노산 서열은 V-R-F-Q 또는 V-K-F-Q임을 확인하였다.

2) 펩타이드의 크기의 효과의 조사.

TVMV NIa 프로테아제의 효소 활성에 있어서, 절단부위 보존 서열의 구성 뿐 아니라 절단되는 부위를 중심으로 한 양 말단의 아미노산 개수 즉, 기질의 크기가 활성정도에 영향을 줌을 확인하고, 최적 활성을 위해 바람직한 아미노산 개수를 결정하기 위해 절단 부위를 중심으로 아미노 부분과 카르복실 부분에 다양한 개수의 아미노산을 갖는 올리고 펩타이드를 사용하여 상기 프로테아제의 반응성을 시험하였다(표 3참조).

상기 NIa 프로테아제 효소가 최적의 활성으로 작용하기 위해서는, 절단부위를 중심으로 양쪽에 일정 개수의 아미노산이 존재할 것이 요구된다. 특히, 절단부위 보존서열 외에 그 아미노 쪽으로 2개, 카르복실 쪽으로 4개의 불특정 아미노산이 존재하는 경우 가장 바람직하다.

3) 보존서열의 각 아미노산의 기여도의 조사.

NIa 프로테아제의 절단부위 보존서열 중의 아미노산 각각이 상기 효소 활성에 기여하는 정도를 측정하였는데, 절단부위 보존서열 V-R/K-F-Q 중 어느 하나의 아미노산이 그외 다른 아미노산으로 치환된 합성 올리고 펩타이드를 기질로 하여 효소반응을 수행하면, 상기 프로테아제는 그 어느 것도 절단하지 못함을 확인하였다(표 5참조).

즉, 상기 NIa 프로테아제는 아미노산 서열 V-R/K-F-Q만을 인식하며, 이 보존서열에 대해 높은 특이성을 가진다는 것을 알 수 있다.

즉, 27 kDa NIa 프로테아제는 절단부위의 아미노 쪽으로 보존서열인 V-R/K-F-Q를 포함한 6개의 아미노산, 카르복실 쪽으로 4개의 아미노산이 포함된 10개의 아미노산 잔기로 구성된 올리고 펩타이드를 가장 특이적으로 인식한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TVMV NIa 프로테아제의 정제

TVMV NIa 프로테아제의 정제를 위하여, 먼저 TVMV NIa 프로테아제의 유전자를 포함하는 pGEX-KG 벡터인 플라스미드 pGTVP를 대장균 XL-1 blue내로 형질 전환시키고, 27℃에서 0.3 mM 의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside; GIBCO)로 4시간 동안 유전자 발현을 유도하여, 글루타티온과 TVMV NIa 프로테아제가 융합된 융합단백질을 발현시켰다.

1ℓ 배양액으로부터 수확된 세포들을 200 μg/mg의 리소자임을 포함한 5 ml의 냉각된 완충액(25 mM HEPES-KOH, 100 mM KCl, 10 % 글리세롤, 2 mM EDTA, 2 mM DTT)에 부유시킨 후, 얼음상에서 초음파 분쇄로 균질화하였다. 그 다음, 17,000??g의 속도로 30 분간 원심분리한 후 상층액을 0.5 ml의 글루타티온 세파로오즈 4B 수지(Pharmacia)와 혼합한 후, 트롬빈(Boeringer-Manheim)을 처리하여, 글루타티온을 제거하고, NIa 프로테아제만을 농도구배(50 mM HEPES-KOH 20 ml 내 0 - 0.1 M NaCl, pH 7.6, 10 % 글리세롤, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)를 이룬 SP-세파로오즈 크로마토그래피(SP-Sepharose fast flow; Pharmacia)에서 순수 정제하였다. 정제된 단백질의 농도를 OD₂₈₀에서 측정하였다.(Gill,S.C.et al.,Analytical Biochemistry,182, 319-369, 1989)

그 결과, SDS-PAGE를 통하여 정제과정동안 자가분해됨 없이 균질한 크기를 유지하고 있음이 확인된 27 kDa의 NIa 프로테아제가 1ℓ당 약 0.5 ㎎가량 정제되었다.

<실시예 2> 정제된 NIa 프로테아제의 기질 특이성 확인.

도 1에 나타난 바와 같이 TVMV NIa 프로테아제의 7개의 절단부위에 대한 NIa 프로테아제의 효소 활성을 확인하기 위하여, 정제된 효소와 다양한 농도(50, 100, 200, 500 μM)의 7가지 절단부위 서열을 포함한 합성 올리고 펩타이드(PeptidoGenic, 순도 95 %이상)를 40 mM HEPES, pH 7.7, 120 mM KCl 및 1 mM DTT내에서 혼합하여, 25℃에서 반응을 수행하였다. 반응 혼합물의 일정량을 반응 시작 후 10분 마다 취하여, 10% 아세트산 12 ㎕로 반응을 정지시켰다. 상기 반응 생성물의 농도를 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴-워터 구배(10-70%)를 사용하여 220 nm에서 HPLC (Shimadzu, Delta Pak C18 column)로 분석하였다.

우선, 기질의 흡광 계수(ε_s)에 대한 생성물의 흡광 계수(ε_p)의 상대적인 비율(ε_p/ε_s)이 HPLC 분석 결과 기질과 생성물에 대한 피크 면적으로부터 계산되었다. 또한, 생성물의 분율[P_fr=P/(P+r*S)]은 생성물(P)과 나머지 기질(S)의 피크 면적으로부터 계산되었다. 생성물의 분율과 초기 기질 농도로부터 계산된 생성물 농도를 시간에 대한 그래프로 작성하였는데, 각 기질 농도에 대한 초기 속도가 3개 시간에 대한 값으로부터 얻어졌으며, 반응 속도 상수 K_m과 k_cat는 이중 반비례 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 그래프로부터 얻어졌다(도 2a 및 도 2b). 특히도 2는도 1의 절단부위 B를 기질로 한 경우의 결과를 예시적으로 나타낸 것이다.

반응 결과 절단부위에 V-R/K-F-Q 이외의 아미노산을 가진 기질 펩타이드는 상기 NIa 프로테아제에 의해 분해되지 않았다. 즉도 1의 절단부위 A,E,V는 상기 프로테아제의 기질로서 바람직하지 못하다. 반응 속도 상수 분석에 따르면 절단부위 B,F에 대한 경우 절단부위 C,D에 대한 경우보다 5 내지 6배 강한 결합(낮은 K_m)을 보였고, 절단부위 F에 대한 k_cat(tunover number)값과 절단부위 C에 대한 k_cat값은 근사치로 확인되었으나, 절단부위 C에 대한 k_cat값은 절단부위 B에 대한 값보다 4배, 절단부위 D에 대한 값보다는 2배 더 큰 값을 보였다. 또한 절단부위 F에 대한 상기 효소반응의 이차 속도 상수(k_cat/K_m)는 절단부위 B,C,D에 대한 값보다 4 내지 10배 더 높았다(표 2).

절단부위	K_m(mM)	k_cat(s^-1)	10^-3×k_cat/K_m(M^-1s^-1)
A	-	-	-
B	0.098±0.009	0.03±0.001	0.31±0.04
C	0.59±0.21	0.12±0.04	0.26±0.16
D	0.49±0.097	0.06±0.01	0.13±0.05
E	-	-	-
F	0.092±0.002	0.11±0.01	1.3±0.4
V	-	-	-

결과적으로, 각 절단부위 서열을 포함하는 기질들 중, 절단 부위 A,E와 V를 포함한 기질들은 재조합 TVMV NIa 프로테아제에 의해 프로세싱되지 않았다. 이것은 상기 효소의 활성 도메인의 구조가 서열 V-R-F-Q에 특이적이고, 분자의 공간적 배치의 효과 뿐아니라 분자의 전기적 상호작용이 기질 판별에 관여하므로, 상기 보존 서열에 다른 아미노산을 포함하고 있는 기질과의 결합이 약하여, 효소 활성이 결여된 것이라 할 수 있다. 상기의 보존서열 V-R/K-F-Q과 비교하여, 절단 부위 A는 염기성 잔기 Lys/Arg 대신에 산성 잔기인 Glu를 갖고, 절단 부위 E는 무극성 방향족 잔기인 Phe 대신 프로틱(protic) 잔기인 Thr을 갖으며, 절단 부위 V는 Lys/Arg 및 Gln 대신에 각각 무극성 지방족 잔기인 Ala 및 산성 잔기인 Glu를 갖는 결과, 상기 프로테아제가 인식하는 절단부위 서열로는 바람직하지 못한 것으로 밝혀졌다.

반면, 절단부위 B,C,D,F를 포함한 기질들은 모두 상기 프로테아제에 의해 프로세싱됨을 확인할 수 있었으나,표 2의 결과를 분석함으로써, 절단부위 F가 TVMV NIa 프로테아제의 기질로서 가장 바람직함을 알 수 있었다.

<실시예 3> 절단부위 보존서열을 포함하는 펩타이드의 크기에 대한 NIa 프로테아제의 활성 정도 조사.

실시예 2에서 가장 바람직한 기질로 확인된 NIb 와 coat 단백질 사이의 절단부위 올리고 펩타이드의 크기를 표준으로 하여, 절단부위의 아미노 및 카르복실 쪽의 아미노산의 수를 다르게 하여 각각 상기 NIa 프로테아제와 반응시켰다. 그 결과로 기질 펩타이드의 크기에 대한 상기 효소의 특이성을 조사하였다(표 3).

위치p10

p9

p8

p7

p6

p5

p4

p3

p2

p1

p1'

p2'

p3'

p4'

p5'

p6'

기질 1

E

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E

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Q

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기질 2

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기질 3

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L

R

E

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R

F

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T

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기질 4

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E

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R

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V

D

A

기질 5

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V

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Q

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T

V

D

A

기질 6

V

R

F

Q

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D

A

반응 결과, 카르복실 쪽의 아미노산 수의 6에서 4로의 감소는 K_m이나 k_cat값에 큰 영향을 주지 않았으나, 4에서 2로의 감소로 기질에 대한 외적 친화도(K_m)가 약간 증가되었고 k_cat는 약 4배 감소되었다. 그리고 아미노 부분의 아미노산의 수가 10에서 6으로 점차적으로 변화함에 따라서는 K_m과 k_cat의 값에 크게 변화가 없었으나, 6에서 4로 변화한 경우에는 k_cat가 약 30배, K_m이 약 3배 감소하였다(표 4).

	K_m(mM)	k_cat(s^-1)	10^-3×k_cat/K_m(M^-1s^-1)
기질 1	0.48±0.12	0.045±0.010	0.094±0.005
기질 2	0.27±0.027	0.21±0.02	0.78±0.14
기질 3	0.36±0.06	0.15±0.02	0.42±0.13
기질 4	0.31±0.09	0.13±0.3	0.42±0.25
기질 5	0.66±0.04	0.19±0.01	0.29±0.04
기질 6	0.20±0.01	0.006±0.0002	0.030±0.003

일부 잔기가 결실된 펩타이드 기질에 대한 민감성의 감소는 상기 효소가 기질을 인식하는데 기질의 적당한 크기를 요구하는 까닭이거나, 상기 절단부위를 중심으로 한 특정 아미노산의 결실이 미치는 영향일 수 있다. 결과적으로 상기 NIa 프로테아제가 최적의 활성을 갖기 위해서는, 절단되는 부위를 둘러싸고 아미노 쪽과 카르복실 쪽에 일정 개수의 아미노산이 필요함을 알 수 있었다. 이에 따라 상기표 3에서 위치 p6, p5 그리고 p2' 내지 p4'의 서열은 보존적이지 않은 반면 위치 p4 내지 p1의 아미노산 서열은 보존적이므로, 상기 효소는 후자의 서열은 특이적으로, 전자의 서열은 비특이적으로 인식하는 메카니즘을 갖고 있다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4> 절단 부위 보존 서열 V-R/K-F-Q의 각 아미노산의 기질 특이성에 대한 기여도 분석.

절단 부위 서열 V-R/K-F-Q 중 어느 하나의 아미노산이 Gly으로 치환된 4가지의 펩타이드를 기질로 하여 농도 2.0μM의 NIa 프로테아제 효소를 24 시간동안 반응시켜, 고감도 플로레스카민 방법(fluorescamine method; Udenfriend, S.et al.,Science,178, 871-872, 1972)에 의해 생성된 산물을 검사하였다(표 5). 5mg/ml의 플로레스카민 용액 3 ㎕를 반응 혼합물 50 ㎕와 2% SDS 3 ㎕가 혼합된 냉각 반응 혼합물에 가한 후, 475 nm(λex=386 nm) 에서의 흡광도를 스펙트로플루오로미터를 이용하여 측정하였다(Shimadzu RF-5301PC).

고감도 플루오로레스카민 방법이나 4배 정도 높은 농도의 효소를 이용하여 시험하였으나 단백질 분해 반응 산물이 전혀 검출되지 않았다.

이러한 결과로 보아, NIa 프로테아제가 절단부위 보존서열을 구성하는 개개 아미노산의 변이에 민감함을 보여주는 것이므로, 세포 외 반응에서 상기 프로테아제는 절단부위의 아미노 쪽 4개의 아미노산 서열, V-R/K-F-Q 만을 선택적으로 인식함을 확인하였다.

V

R

F

Q

기질 1

L

R

E

T

V

R

F

G

S

D

T

V

기질 2

L

R

E

T

V

R

G

Q

S

D

T

V

기질 3

L

R

E

T

V

G

F

Q

S

D

T

V

기질 4

L

R

E

T

G

R

F

Q

S

D

T

V

<실시예 5> 재조합 대장균으로부터 발현된 융합단백질에서 특정 단백질의 분리

(5-1) GST-인터루킨2 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조

유전자 은행으로부터 얻은 인터루킨-2 생산균주(KCTC 8258P)로부터 플라스미드를 분리한 후 이를 주형으로 하여 133개의 아미노산 서열을 암호하는 인터루킨-2유전자를 PCR로 증폭하였다.

PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25mM dNTPs; 50mM KCl; 10mM (NH₄)₂SO₄; 20mM Tris-HCl(pH8.8); 2mM MgSO₄; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100ng, 각각의 시발체 50pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 95℃/30sec (denaturation), 52℃/30sec (annealing), 72℃/60sec (elongation)로 총 30회 수행하였다. 증폭된 DNA를 제한효소로 처리하여 GST 융합 단백질을 발현할 수 있는 pGEX(2T) 벡터에 삽입하여, pGST-IL2로 명명하였다.

(5-2) NIa 프로테아제의 절단부위 보존서열을 포함하는 GST-인터루킨2 융합단백질 발현 플라스미드의 제조

플라스미드 pGST-IL2에 NIa 프로테아제가 특이적으로 인식하는 NIa 프로테아제의 절단부위 보존서열을 끼워넣기 위하여 NIa 프로테아제의 절단부위 보존서열을포함하는 올리고펩타이드를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.

합성된 상기 올리고뉴클레오타이드를 벡터 pGST-IL2에 삽입시켜, 재조합 플라스미드를 제조하였으며 이를 pGST-NIa-IL2로 명명하였다.

(5-3) GST-NIa-IL2 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 발현벡터 pGST-NIa-IL2를 대장균 BL/DE3에 형질전환시켜 엠피실린이 50㎕/ml 첨가된 LB 배지에서 37℃에서 밤새 배양한 후 그 배양액 10ml를 1리터의 LB 배지에 넣어 주고 계속 배양하였다. 37℃에서 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.4 정도가 될 때 최종농도 0.4mM가 되도록 아이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가하였다. IPTG를 첨가한지 약 4시간 후에 배양을 멈추고 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다.

상기의 재조합 대장균 세포 침전물에 완충용액(25mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA, 0.2N NaCl)을 가하여 현탁시킨 후 얼음 중탕안에서 초음파분쇄기(Ultrasonic homogenizer 4710 : Cole-Parmer, USA)로 세포를 파괴시켜 얻은 세포 균질액을 고속 원심분리기(Beckman J2-21M, Rotor JA-14)로 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 가용성 단백질이 녹아 있는 상층액을 얻었다.

융합단백질의 분리 및 정제를 위해서 글루타치온 세파로스 4B 칼럼(Glutathione Sepharose 4B column)을 사용하였는데, 먼저 평활화한 글루타치온 세파로스 4B 칼럼(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 상기에서 얻은 세포균질액의 상층액을 통과시킨 후, 인산염 완충용액을 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거하였다. 그 다음 글루타치온 용출 완충용액(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM 환원된 글루타치온)을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2ml의 속도로 용출시켜 흡착되어 있던 단백질들을 수집하였다. 수집된 단백질을 13.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 단백질이 고순도로 정제되었음을 확인하였다.

(5-4) GST-NIa-IL2 융합 단백질에 대한 TVMV NIa 프로테아제 기질특이성

NIa 프로테아제의 기질특이성을 상기 (5-3)에서 정제된 GST-NIa-IL2 기질 단백질을 사용하여 확인하였다.

GST-NIa-IL2 기질 단백질은 절단부위 보존서열 V-R-F-Q을 포함하는 올리고펩타이드의 아미노 말단에 GST 단백질이 붙어 있으며, 카르복시 말단에는 인터루킨 2 단백질을 함유하고 있어서 기질이 NIa 프로테아제에 의해 특이적으로 분해되면 인터루킨 2 단백질이 GST 단백질과 분리되며,이를 SDS-PAGE 상에서 관찰하여 활성정도를 측정하게 된다.

정제된 NIa 프로테아제 효소와 10 μM의 GST-NIa-IL2 기질 단백질을 40 mM HEPES, pH 7.7, 120 mM KCl 및 1 mM DTT내에서 혼합하여, 25℃에서 1시간 반응을 수행하고 동량의 10% 아세트산으로 반응을 정지시켰다.

13.5%의 SDS-PAGE 상에서 전개된 단백질 패턴을 분석한 결과 인터루킨 2 단백질과 약 29 KD 크기의 GST 단백질을 확인하였으며, 이로써 상기 NIa 프로테아제 효소가 기질단백질의 절단부위 보존서열 V-R-F-Q를 특이적으로 인식하여 절단함을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따라, TVMV NIa 프로테아제를 이용하여 재조합 대장균에서 합성된 융합단백질로부터 특정 단백질을 선택적으로 절단하는 방법을 적용함으로써 보다경제적이고 효율적으로 단백질을 정제 분리할 수 있으며, 본 발명에서 제공되는 최적의 절단부위 보존서열을 포함한 올리고 펩타이드를 융합단백질의 연결부위(junction)로 이용함으로써 정제하고자 하는 단백질의 내부가 절단되는 것을 최소화하여 단백질 생산 수율을 향상시킬 수 있다.

Claims

특정 단백질의 유전자와 융합짝단백질 유전자 사이에 TVMV NIa 프로테아제가 기질 특이적으로 인식하는 아미노산 서열의 유전자를 갖는 융합유전자 컨스트럭트.
제 1항에 있어서, TVMV NIa 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 V-R-F-Q을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합유전자 컨스트럭트.
제 1항에 있어서, 상기 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 제 2항의 아미노산 서열을 포함하며, 절단되는 펩타이드 결합의 아미노 쪽으로 2개, 카르복실 쪽으로 4개의 불특정 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합유전자 컨스트럭트.
제 1항에 있어서, TVMV NIa 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 V-K-F-Q을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합유전자 컨스트럭트.
제 1항에 있어서, 상기 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 제 4항의 아미노산 서열을 포함하며, 절단되는 펩타이드 결합의 아미노 쪽으로 2개, 카르복실 쪽으로 4개의 불특정 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합유전자 컨스트럭트.
1) 특정 단백질 유전자와 융합짝단백질 유전자 사이에 TVMV NIa 프로테아제가 기질특이적으로 인식하는 특정한 아미노산의 유전자를 갖는 제 1항의 융합유전자 컨스트럭트를 만들고,

2) 상기 융합유전자 컨스트럭트를 대장균내에서 발현시켜 융합단백질을 만들고,

3) TVMV NIa 프로테아제를 이용하여 상기 융합단백질에서 원하는 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균으로부터 발현된 융합단백질에서 특정 단백질을 분리하는 방법.