KR100190143B1 - 터닙 모자이크 바이러스 c5로부터 분리한 프로테아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포티바이러스(Potyvirus)의 일종인 터닙 모자이크 바이러스 C5 (Turnip Mosaic Virus C5, 이하 TuMV-C5 라고 약칭함)에서 분리한 프로테아제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

상세하게는 본 발명은 TuMV-C5에서 발현되는 다단백질의 성숙 과정에 관여하여 바이러스 증식에 중요한 역할을 하는 NIa 단백질의 C-말단에 있는 프로테아제 및 그의 유전자를 분리하고 이를 대장균에서 발현시켜 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

터닙 모자이크 바이러스 C5로부터 분리한 프로테아제

제1도는 TuMV-C5의 NIa C-말단 27kDa 프로테아제를 암호하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 및 그로부터 유도되는 아미노산 서열을 나타낸다. 프로테아제의 활성 부위에서 예상되는 촉매 3개조는 박스로 나타내고, 기지의 서열과 다른 아미노산은 밑줄로 나타낸다.

제2도는 NIa C-말단 27kDa 프로테아제 발현을 위한 재조합 플라스미드 pGPOPR을 나타낸다. 처음 3개 아미노산과 융합 단백질이 트롬빈으로 소화될 때 추가되는 4개 아미노산을 표시하였다.

제3도는 정제 과정중의 야생형 NIa 27kDa 프로테아제 (레인 1-레인 5)와 정제된 돌연변이 프로테아제 (레인 6-레인 7)를 SDS-PAGE로 분석한다.

제4도는 모노 S 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 27kDa 단백직을 포함하는 피크 3는 특이적 단백질 분해 활성을 나타낸다.

제5도는 Glu-Pro-Thr-Val-Tyr-His-Gln-Thr-Leu-Asn-Glu에 대한 NIa 프로테아제의 분해 활성을 HPLC로 분석한다. a, b와 c는 펩티드 기질과 NIa 프로테아제의 반응 혼합물을 각각 0, 20, 40분씩 배양했을 때의 크로마토그램이고, 8.5분과 12.5분의 보유 시간에서의 피크는 각각 생성물과 기질에 해당한다.

제6도는 [³⁵S] 메티오닌으로 표지한 pTNC의 생체외 해독 산물에 대한 NIa 27kDa 프로테아제의 분해 활성을 나타낸다. 레인 1, 2, 3 은 각각 pGEX-KG, pGPOPR, pMPOPR을 포함하는 대장균 XL1-blue의 유도된 세포 용출액, 레인 4는 GST 융합 프로테아제, 레인 5는 모노 S 크로마토그래피에 의해 정제된 프로테아제, 레인 6은 모노 S 크로마토그래피에 의해 정제된 KSI 융합 프로테아제, 레인 7은 2㎍의 트롬빈을 함께 넣은 결과이다.

제7도는 돌연변이 프로테아제와 결실된 프로테아제의 단백질 분해 활성을 나타낸다. 레인 1은 D81N 돌연변이 프로테아제, 레인 2는 C151S 돌연변이 프로테아제, 레인 3은 30℃에서 48시간 배양한 후의 27kDa 프로테아제, 레인 4는 결실된 돌연변이 프로테아제를 각각 기질과 배양한 후의 산물.

제8도는 헵타펩티드 기질에 대한 NIa 프로테아제의 동적 상수를 결정하기 위한 라인위버-버크 도면을 나타낸다. X-축과 Y-축 단위는 각각 mM^-1와 μmol^-1·mg ·min 이고 각 점은 3번의 독립적 측정에서 얻은 평균 값을 나타낸다.

제9도는 NIa 27kDa 프로테아제의 자가-절단 활성을 SDS-PAGE로 분석한다. 정제된 27kDa 프로테아제는 30℃에서 0, 3, 6, 12, 24, 48 시간 동안 배양하고 D81N과 C151S 돌연변이 프로테아제는 24시간 배양한다.

제10도는 NIa 27kDa 프로테아제의 자가-절단 부위의 확인을 위한 전략도를 나타낸다.

제11도는 TuMV의 NIa 프로테아제가 인지하는 절단 부위들의 헵타펩티드 서열들을 배열한다.

* : NIa 프로테아제의 새로운 내부의 자가-절단 부위

제12도는 배양 시간 경과에 따라 NIa 27kDa 프로테아제의 촉매적 활성이 사라지는 시간 과정을 나타낸다.

본 발명은 포티바이러스(Potyvirus)의 일종인 터닙 모자이크 바이러스 C5(Turnip Mosaic Virus C5, 이하 TuMV-C5 라고 약칭함)에서 분리한 프로테아제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

상세하게는 본 발명은 TuMV-C5에서 발현되는 다단백질의 성숙 과정에 관여하여 바이러스 증식에 중요한 역할을 하는 NIa 단백질의 C-말단에 있는 프로테아제 및 그의 유전자를 분리하고 이를 대장균에서 발현시켜 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

포티바이러스는 식물 바이러스로서 거의 모든 주요 농작물, 예를 들어 배추, 감자, 고추, 담배, 토마토 및 화훼 등을 감염시키는 숙주 범위가 넓고 심각한 피해를 주는 바이러스 종이다. 그 예로 비교적 벌레나 세균 등에 의한 이병율이 낮다고 알려진 고랭지에서도 바이러스에 의한 이병률이 높으며, 최근 바이러스에 의한 피해가 확산되고 있다. 농작물에 바이러스가 감염되면 그로부터 초래되는 피해가 매우 심각하다. 10% - 50% 정도로 농작물의 생산성이 감소하고, 상품률이 저하하며, 또한 상품이 된 후에도 품질 관리 등에 치명적인 피해를 준다. 이와 같이 바이러스 이환에 의한 농작물의 피해가 막대함에도 불구하고, 최근까지 항바이러스제로서의 농약은 개발된 예가 거의 없었다.

지금까지 개발된 농약은 제초제, 살충제, 살균제 등의 가시적인 벌레나 숙주 세포와 생명 현상 기작이 다른 박테리아, 곰팡이 등에 대한 방제제가 대부분이었다. 이는 바이러스가 숙주 세포와 생명 현상 기작을 공유하고 있기 때문에 분리·동정이 어려울 뿐만 아니라, 숙주의 손상없이 바이러스만을 공략하는 농약을 만드는데 많은 어려움이 있기 때문이었다. 실제로 항바이러스 농약의 개발은 매우 초기 단계 수준으로서, 미국 몬산토(Monsanto) 회사에서 항바이러스 식물을 개발하여 특허를 받은 예가 있다(US910224, 94년 1월). 이 방법은 감자의 바이러스 게놈 유전자로부터 복제효소(replicase)를 식물에 주입시켜 형질전환된(transgenic) 항바이러스 감자 품종을 만든 것이다. 이는 엄밀한 의미에서 농약의 개발이기 보다는 식물을 형질전환한 것이므로 이 방법을 이용한다면 한 농작물에도 수십 종의 유용 품종을 형질전환하여 유전자를 안정하게 유지시키면서 형질을 유전적으로 이어나가야 한다.

또한 특정 바이러스에만 저항성을 보이므로 많은 바이러스 유전자들을 모두 식물에 주입하여 복제시켜야 하는 단점이 있다.

한편 의약품으로서 항바이러스제에 대한 연구가 진행되고 있으며, 항바이러스제 의약품의 개발 방향은 바이러스의 생존에 필수적인 효소의 작용을 억제시켜 바이러스를 죽이는 방법이 시도되고 있다.

바이러스는 유전자의 구조가 매우 단순하여 생존에 필수적인 극소수의 단백질만을 생산하기 때문에 항바이러스제 개발에서 표적이 될만한 단백질이 몇 가지 되지 않는데, 그 중 프로테아제가 항바이러스제 개발에 많이 이용되고 있다. 그 이유는 바이러스의 단백질은 대부분 다단백질로 전사된 후 프로테아제에 의해 성숙되는 과정을 거치기 때문에, 바이러스에 있어서 프로테아제는 생존에 필수적인 효소이기 때문이다.

또한 바이러스의 프로테아제는 숙주에 있는 프로테아제와는 다른 특성을 가지며, 인식하는 구조가 특이하여 특이성과 선택성이 뛰어날 뿐만 아니라 더욱이 바이러스 복제의 초기 단계에 작용하므로 항바이러스제 개발에 좋은 표적이 될 수 있다.

이에 항바이러스제 개발을 위하여 프로테아제에 대한 연구가 진행되어 왔으며 최근 몇몇 바이러스 저해제들이 의약품으로 개발되었다. 예를 들어 AIDS(acquired immunodeficiency syndrome)를 일으키는 바이러스인 HIV(human immunodeficiency virus)에서 개발된 프로테아제 저해제가 두드러진 항바이러스 효과를 나타탠다. 또한 최근에 개발되고 있는 HIV-1 프로테아제 저해제는 nM이하의 낮은 농도에서도 매우 강력한 저해능과 특이성을 보여준다.

본 발명자들은, 이와 같이 바이러스의 생존에 필수적인 프로테아제를 저해하는 물질을 개발함으로써 항바이러스제 의약품을 개발하고 있는 것에 착안하여, 식물 바이러스의 프로테아제 저해 물질을 찾아내어 농작물에 막대한 피해를 주고 있는 바이러스를 구제하는 농약을 개발하고자 하였다. 특히 식물 바이러스중 가장 많은 피해를 주고 있는 포티바이러스의 일종인 터닙 모자이크 바이러스에 대한 농약을 개발하고자 하였다.

본 발명은 바이러스 방제제 농약 개발을 위하여, 바이러스 증식에 주요 단계인 다단백질(polyprotein)의 성숙에서 필수적인 역할을 하는 프로테아제를 제공함을 목적으로 하며, 더하여 프로테아제의 제조 방법을 제공한다. 따라서 본 발명에서는 TuMV의 증식과 관련하여 중요한 역할을 하는 TuMV-C5 NIa 단백질의 C-말단 27kDa 프로테아제를 암호하는 유전자를 클로닝한 후 클론된 유전자를 대장균에서 발현·정제하고, 합성 펩티드와 클로닝된 기질 단백질 및 여러 생화학적 방법을 이용하여 본 프로테아제의 특성을 밝히고자 한다. 또한 궁극적으로는 본 발명의 프로테아제를 식물의 성장에 영향을 크게 미치는 터닙 모자이크 바이러스 및 이와 유사한 바이러스들의 퇴치에 유용한 프로테아제 저해제 개발에 사용하고자 한다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

터닙 모자이크 바이러스(TuMV)는 포티바이러스의 한 종으로 (+) RNA 가닥 바이러스인 피코나바이러스 (Picornavirus)의 수퍼패밀리에 속한다. 포티바이러스의 게놈은 길이가 약 10kb이고 3'-말단이 폴리아데닐화되어 있으며 5'-말단에는 본 바이러스로부터 생성되는 단백질(VPg)이 공유결합으로 연결되어 있다(Ward 와 Shukla, 1991; Dougherty 와 Carrington, 1988). 터닙 모자이크 바이러스의 RNA는 다단백질(polyprotein)로 해독되며 이 다단백질은 3가지 바이러스 프로테아제들에 의해 적어도 9개의 성숙 단백질로 잘려(process)진다. 바이러스의 단백질들 중에 N-말단 단백질(P1)과 헬퍼성분-프로테아제(HC-Pro)는 그들 각각의 C-말단만을 자동촉매적으로 자르고 핵에 포함되는 단백질인 NIa 프로테아제(Nuclear Inclusion a Protease)는 다단백질의 나머지 부위들을 자르는데 관여한다(Carringron et al., 1989; Verchot et al., 1991; Carrington 와 Dougherty, 1987).

포티바이러스의 NIa는 22kDa와 N-말단에 있는 VPg 부위와 27kDa의 C-말단 프로테아제 부위인 2개의 기능 부위를 갖는 단백질로 구성되며, C-말단 프로테아제 부위는 트립신과 유사한 세린 프로테아제 패밀리와 유사한 서열을 갖는다(Dougherty 와 Park, 1991; Murphy et al., 1990; Gorbalenya et al., 1989).

[Ⅰ. TuMV-C5의 NIa의 C-말단 27kDa 프로테아제의 서열 ]

TuMV-C5의 NIa의 C-말단 27kDa 프로테아제 부위의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1과 같다. 이것은 이미 보고된 다른 TuMV의 뉴클레오타이드 서열과 매우 유사함을 알 수 있다 (94% 동일성). 뉴클레오타이드 서열로부터 유도되는 아미노산 서열을 살펴보면, Val⁵⁶, Ile⁹¹, Val¹²⁴, Ala¹⁸⁷, Ser²²³, Gly²²⁴의 6개의 아미노산만이 이미 보고된 서열인 Ile⁵⁶, Va1⁹¹, Ile¹²⁴, Thr¹⁸⁷, Va1²²³, Ser²²⁴과 다르다(제1도 참조, Nicolas 와 Lalibert, 1992).

56, 91, 124, 187의 부위는 소수성 잔기에 의해 점유되고, 나머지 223, 224 부위는 Gly, Val, Ser과 같은 작고 무전하의 측사슬을 지닌 아미노산에 의해 점유된다. 한편 유전자 서열로부터 아미노산 서열을 유도해서 프로테아제 단백질의 일차 서열을 결정하여 분석해 본 결과, TuMV-C5의 프로테아제는 트립신계 프로테아제와 유사한 촉매적 활성을 나타내는 활성부위 3개조(catalytic triad)인 His⁴⁶, Asp⁸¹, Cys¹⁵¹을 갖고 있다(Dougherty et al., 1990).

[Ⅱ. TuMV-C5의 NIa의 C-말단 27kDa 프로데아제의 제조 및 정제 ]

NIa의 C-말단 27kDa 프로테아제는 박테리아 발현 벡터를 이용하여 대장균에서 발현시켜 제조한다. 이용 가능한 발현 벡터에는 pMAL-cRI 또는 pGEX-KG가 있다.

1) pMAL-cRI 발현 벡터를 사용하여 프로테아제를 제조하는 방법을 살펴 보면 다음과 같다. pMAL-cRI에 NIa 27kDa 프로테아제 유전자를 클로닝하여, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein)과의 융합 형태로 프로테아제를 생산하는 pMPOPR을 제조한다. pMPOPR를 사용하여 발현시킨 프로테아제는 세포 용출액을 아밀로스 친화 크로마토그래피로 통과시킨 후 Xa 인자로 소화하여 정제될 수 있다. 그러나 Xa 인자를 사용하여 25℃에서 5시간동안 배양했을 때, 앞에서 생산된 융합 단백질의 1/3만이 잘리워져 27kDa 프로테아제를 생산한다.

2) pGEX-KG 발현 벡터를 사용하여 프로테아제를 제조하는 방법을 살펴보면 다음과 같다. pGEX-KG에 NIa의 27kDa 프로테아제 유전자를 클로닝하여 글루타치온 S-전이효소(GST)와의 융합 형태로 프로테아제를 생산하는 pGPOPR을 제조한다. 플라스미드 pGPOPR은 27kDa 프로테아제를 글루타치온 S-전이효소(GST)의 융합 단백질 형태로 발현한다 (제2도). GST 융합 단백질은 트롬빈에 의해 완전히 소화되어 27kDa 프로테아제를 대량 생산할 수 있으므로 플라스미드 pGPOPR를 사용하여 본 발명의 프로테아제를 발현·정제한다. 본 재조합 플라스미드에서 생산된 GST 융합 단백질을 트롬빈으로 소화하면 프로테아제의 N-말단에서 4개의 아미노산들이, Gly, Ser, Met, Ala, 추가될 수 있다.

TuMV-C5의 NIa 27kDa 프로테아제는 대장균에서 GST 융합 단백질의 형태로 대량 생산된다. 이러한 융합 단백질은 발현이 유도되는 온도가 37℃에서는 인클루젼 체(inclusion body)로 생산되고 27℃로 낮아질 때는 수용성 형태로 생산된다. 2개의 주요한 단백질들(53kDa과 51kDa)이 글루타치온-레진에 특이적으로 결합하는데(제 3도, 레인 3), 53kDa은 GST가 융합된 27kD 프로테아제의 예상크기와 일치한다. 글루타치온-레진에 결합한 융합단백질을 트롬빈으로 소화시키면 GST가 글루타치온-레진에 결합된 상태로 남고 2개의 단백질(27kDa과 25kDa)들이 떨어진다(제3도, 레인 4). 이들 2개의 단백질들은 모노 S 크로마토그래피에 의해 균질하게 정제된다 (제3도, 레인 5 및 제4도). 대략적으로 1L의 박테리아 배양액에서 2㎎의 프로테아제를 정제할 수 있다.

[Ⅲ. TuMV-C5의 NIa C-말단 27kDa 프로테아제의 단백질 분해 활성 ]

NIa 27kDa 프로테아제의 활성을 측정하기 위해서, 합성된 운데카펩티드 (undecapeptide), 노나펩티드(nonapeptide) 또는 생체외 해독 산물(in vitro translation product)을 각각 기질로 사용하여 TuMV-C5에서의 특이적 단백질 분해 활성을 조사한다.

1) 합성 운데카펩티드를 기질로 사용하는 경우

운데카펩티드 기질의 서열은 TuMV의 다단백질에 존재하는 6K₁과 CI 단백질 사이의 헵타펩티드 절단 서열을 포함하는 Glu-Pro-Thr-Val-Tyr-His-Gln-Thr-Leu-Asn-Glu 이다. 프로테아제의 단백질 분해 활성을 측정하는 방법은 펩티드 기질에서 Gln과 Thr 사이를 절단하여 Glu-Pro-Thr-Val-Tyr-His-Gln 과 Thr-Leu-Asn-Glu를 생성시키고, HPLC 분석을 통해 230nm에서 Tyr 잔기를 가지는 펩티드의 흡광도를 측정하는 방법에 의한다. 제5도에서 보듯이 배양 시간에 따라 8.5분의 보유시간에서 생성물의 피크는 증가하고, 12.5분의 보유시간에서 기질의 피크는 감소한다. 기질과 생성물의 피크에서의 분획들을 모아서 그의 분자 질량을 질량 분광측정법으로 분석하면, 이는 각 피크 분획에서 기대했던 질량의 펩티드를 포함함을 알 수 있다.

2) 합성 노나펩티드를 기질로 사용하는 경우

노나펩티드의 서열은 아세틸-Glu-Pro-Thr-Val-Tyr-His-Gln-Thr-Leu-아미드이고, 단백질 분해 활성은 앞서의 운데카펩티드를 사용한 경우와 동일한 방법으로 측정한다.

3) 생체외 해독 산물을 기질로 사용하는 경우

기질로 사용한 생체외 해독 산물을 플라스미드 pTNC로부터 토끼 혈구 용출액(rabbit reticulocyte lysate)을 이용하여 얻는다. 이는 NIb 단백질의 C-말단 절반과 전체 외곽단백질(capsid protein, CP)을 포함하는 분자량 65kDa 단백질이다. 기질로 사용한 65kDa 단백질은 GST 융합 프로테아제, 말토스 결합 단백질 융합 프로테아제 및 정제된 프로테아제의 작용에 의해 32kDa 과 33kDa 단백질로 잘리고(제6도), 이는 NIb와 외곽단백질 사이에서의 절단으로부터 예상된 크기와 일치한다. 본 기질은 세포내 프로테아제 또는 트롬빈에 의해서는 잘리지 않는다(제6도, 레인 1,7). 또한 제7도에서 보듯이 촉매 3개조에서 돌연변이된 프로테아제는 본 기질에 대해 분해 활성이 없으나(레인 1, 2), C-말단이 잘려진 27kDa 프로테아제(레인 3) 및 결실 돌연변이 프로테아제(deletion mutant, Pro△23aa, 레인 4)는 기질을 분해할 수 있다.

4) 프로테아제의 동적 상수(kinetic constant)의 측정

앞서 정제된 NIa 프로테아제의 특성을 라인위버-버크 도면의 분석을 통해 조사한다(제8도). 정제된 NIa 27kDa 프로테아제와 기질로서 운데카펩티드를 사용한 생체외 확인 시스템으로 동적 상수(kinetic constant)를 결정한다. K_m과 V_max값은 3번의 독립적인 측정방법에서 얻어진 데이터의 회귀분석에 의해 각각 1.15±0.16mM과 0.74±0.091μ㏖/㎎/분으로 결정할 수 있다. 이러한 K_m과 V_max값은 TEV의 NIa 프로테아제의 경우의 기질로서 NIb와 CP 단백질 사이의 절단 부위를 포함하는 펩티드를 사용하여 결정된 값보다 각각 17배와 2배 더 높은 것이다(Parks et al., 1995). K_cat과 K_cat/K_m은 프로테아제에 대한 27kDa의 분자량을 사용하여 0.33±0.041 sec^-1와 290^-1M^-1sec^-1으로 각각 계산된다. 이 데이터는 6K₁과 CI 단백질 사이의 절단보다 NIb와 CP 단백질 사이의 절단이 더 효율적일 가능성을 제시한다.

[Ⅳ. NIa의 27kDa 프로테아제의 C-말단 자가-절단 ]

1) NIa 27kDa 프로테아제는 C-말단에서 자가-절단이 일어나 25kDa 단백질을 생성한다.

PMSF, EDTA, 아프로티닌, 벤자미딘, 펩스타틴A, TPCK 같은 프로테아제 저해제를 첨가하여도 NIa 27kDa 프로테아제의 C-말단에서의 분해는 억제되지 않는다. 또한 그 자가-절단 부위의 서열은 TuMV의 다단백질에서 27kDa

프로테아제가 작용하는 것으로 알려진 7개 다른 서열들과도 일치하지 않는다(제11도). 자가-절단의 기능에 대해 조사하기 위하여, 분해 활성을 가질 것으로 예상되는 촉매적 3개조에서 Asp⁸¹, Cys¹⁵¹, Glu²²¹또는 Glu²²⁴을 Asn, Ser, Ile 또는 Arg으로 각각 부위-유도 돌연변이를 유발시키면 27kDa 프로테아제의 단백질 분해 활성이 점 돌연변이에 의해 급격히 감소하고 (제9도), 25kDa 단백질의 생성이 억제된다. 또한 정제된 27kDa과 25kDa 단백질의 N-말단 서열 분석을 통해 N-말단 서열이 동일함을 알 수 있으며 따라서 27kDa 프로테아제가 스스로 C-말단에서 잘리워져 25kDa 단백질이 생성됨을 나타낸다. 실제로 27kDa 프로테아제를 30℃로 모노 S 용출 완충용액에서 배양하면 이는 배양 시간에 따라 점차로 25kDa 단백질로 잘리워져 배양 48시간 후에는 27kDa 단백질의 대부분이 25kDa 단백질로 된다(제9도). 그러나 야생형 프로테아제에 대한 결과와 대조적으로 D81N 돌연변이(Asp⁸¹을 Asn으로 치환) 프로테아제는 24시간 정도 배양하는 동안도 줄지 않으며, 또한 C151S 돌연변이 (Cys¹⁵¹을 Ser으로 치환) 프로테아제의 경우는 24시간 배양후에 극히 적은 양의 25kDa 단백질만이 확인된다.

2) NIa 27kDa 프로테아제의 C-말단에서 일어나는 자가-절단은 시스 방식으로 일어난다.

NIa 27kDa 프로테아제의 C-말단 2/3를 포함하는 단백직(18kDa)을 토끼 혈구 용출액으로 생체외 해독에 의해 제조하고 완전한 NIa 프로테아제 3㎍과 함께 30℃에서 14시간동안 배양한다. NIa 27kDa 프로테아제의 C-말단 2/3가 포함된 단백질은 배양기간 동안 전혀 잘려지지 않았는데, 이는 단백질 절단이 시스 방식으로 일어남을 나타낸다.

3) NIa 27kDa 프로테아제는 C-말단에서 자가-절단이 일어나 25kDa의 단백질을 형성하는데 이 25kDa 단백질은 2차 자가-절단이 일어나 24kDa 단백질을 생성한다.

2차적 자가-절단 부위를 확인하기 위해 Pseudomonas putida 바이오타입 B 로부터 케토스테로이드 이소머레이즈(KSI)를 NIa 프로테아제의 C-말단에서 3개 아미노산을 제거한 다음 융합하여 이용한다(제10도). 27kDa 프로테아제 또는 KSI 융합 프로테아제를 배양하면 25kDa 단백질은 30℃에서 배양되는 동안 24kDa 단백질로 잘라진다. N-말단 서열을 분석하여 보면, 절단은 C-말단 근처의 Ser²²³와 Gly²²⁴사이에서 일어나서 20개 아미노산이 잘리는 것을 알 수 있다. Gly을 Arg으로 돌연변이시키면 내부 절단이 일어나지 않고 Ser과 Gly의 2개의 아미노산은 앞서 보고된 서열과 다른 아미노산이다(Nicolas 와 Lalibert, 1992, 제1도). 또한 확인된 절단 부위 근처의 아미노산 서열은 TuMV의 다단백질에서 발견되는 NIa 프로테아제에 대한 몇 개의 절단 부위의 서열과 동일성이 없음을 보여준다(제11도).

4) 자가-절단되어 얻어지는 25kDa 단백질도 단백질 분해 활성을 그대로 유지 하고 있다.

20개 아미노산을 지웠을 때의 단백질 분해의 촉매적 활성을 조사하기 위하여, 정제된 27kDa 프로테아제를 30℃에서 배양하고 각 시간 간격에서 나온 시료들의 촉매적 활성을 운데카펩티드를 기질로 사용하여 측정한다. 촉매적 활성은 감소하는 양상을 띠는데 절반-불활성 시간은 130 시간으로 계산된다(제12도). 자가-절단이 48시간내에 거의 완성되는 것을 고려할 때 6K₁과 CI 사이의 절단은 NIa 프로테아제 C-말단에서의 20개 아미노산의 지워짐에 의해 많이 영향받지 않는 것으로 보인다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[Ⅰ. 프로테아제의 제조 ]

실시예 1 TuMV-C5의 cDNA 합성

TuMV-C5 균주는 S. K. Green 박사(Green, S. K. 와 Deng, T. C., 1985, Plant Dis. 69: 28-31)로부터 얻었고 메이스(Maiss)등의 방법에 따라 바이러스의 입자로부터 RNA를 추출하였다. 1㎍의 TuMV RNA로 부터 올리고(dT) 또는 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드 [TUO 1 : 5'-AT TGC CTC TAG TCG ATG-3']를 시발체(primer)로서 cDNA 합성 키트(Pharmacia사 제품)를 사용하여 전체 cDNA를 합성하였다. TUO 1 시발체는 올리고(dT)를 시발체로 사용하여 얻어진 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 고안되었고, TuMV 카나다 타입 게놈 (8488-8504)의 뉴클레오타이드 서열과 일치하였다. TUO 1 시발체를 사용해 합성된 cDNA에 EcoR I/Not I 어댑터(Pharmacia사 제품)를 연결하였다. 어댑터가 붙은 cDNA를 EcoR I으로 소화하고 알칼라인 포스파테이즈로 인산기가 없어진 pUC19에 연결하였다. 연결된 cDNA를 대장균 DH5α에 Gene-Pulse 일렉트로포레이터 (Bio-Rad사 제품)를 사용한 일렉트로포레이션 방법으로 주입하였다. 올리고(dT)를 시발체로 사용하여 합성한 cDNA는 cDNA의 5'-과 3'-말단에서 대략 200개 뉴클레오타이드 정도의 부분 결실이 일어났다. 따라서 cDNA에 Sma I으로 소화하고 알칼라인 포스파테이즈로 탈인산화한 pBluescript SK(-)를 연결하였다. 재조합 플라스미드 cDNA 들을 대장균 DH5α에 일렉트로포레이션 방법으로 주입하였다.

실시예 2 NIa 27kDa 프로테아제 유전자의 클로닝

실시예 1에서 제조한 cDNA 주형과 NIa 27kDa 프로테아제의 N-말단을 특정하는 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드 C-말단을 특정하는 서열번호 4의 올리고 뉴클레오타이드를 시발체로 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)방법을 수행하였다.

밑줄친 뉴클레오타이드는 프로테아제 유전자의 5'-말단과 3'-말단 부위의 서열과 각각 일치하였다. N-말단 시발체는 BamH I과 Nco I에 대한 제한 부위를 포함하도록 C-말단의 시발체는 Kpn I과 Pst I부위를 포함하도록 제조하였다. 증폭된 DNA를 BamH I과 Pst I으로 소화하고 pMAL-cR I (New England Biolabs사 제품)에 서브클론하여 pMPOPR를 제조하였다.

NIa 27kDa 프로테아제 유전자를 플라스미드 pMPOPR을 BamH I 과 HindⅢ로 소화하여 얻은 DNA 조각으로부터 분리하였고 이를 플라스미드 pBluescript SK(-) 와 pGEX-KG 내로 서브클론하여 NIa 27kDa 프로테아제를 발현하는 플라스미드 pSKPOPR 과 pGPOPR를 각각 제조하였다. 플라스미드 pGPOPR을 1996년 3월 4일에 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 제KCTC 0233 BP호).

실시예 3 뉴클레오타이드 서열 결정

앞서 제조된 플라스미드내에 클론된 프로테아제 유전자의 양쪽 가닥 서열을 시쿼네이즈 키트(United States Biochemicals사 제품)를 사용한 디데옥시 뉴클레오타이드 사슬 정지 방법 (dideoxynucleotide chain termination method)에 의해 결정하였다. 프로테아제의 뉴클레오타이드 서열은 제1도에 나타내었다.

실시예 4 NIa 27kDa 프로테아제의 발현 및 정제

대장균 XL1-blue 에서 0.3mM IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)를 사용하여 실시예 2에서 제조된 pGPOPR내에 클론된 27kDa 프로테아제 유전자를 27℃에서 3시간 동안 유도함으로 발현시켰다. 1리터 배양에서 얻은 세포죽(cell paste)을 50㎖의 차가운(ice-cold) 용해 완충용액 [25mM HEPES-KOH (pH7.9), 100mM KCl, 10% 글리세롤, 2mM EDTA, 2mM DT]에 200㎍/㎖ 라이소자임을 포함시켜 현탁시켰고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포 파쇄후 조 세포 용출액을 17,000×g 로 4℃에서 2차례 30분간 원심 분리하였다. 맑은 세포 용출액을 2㎖의 글루타치온 세파로스 4B 레진(Pharmacia사 제품)과 함께 4℃에서 30분간 배양하였다. 레진을 10배의 트롬빈 소화 완충용액[50mM 트리스염산(pH8.3), 100mM 염화나트륨, 2.5mM 염화칼슘]에 씻고 20㎍의 트롬빈과 함께 배양하였다. 레진에서 떨어져 나온 단백질은 모아 10kDa 분자량을 떨어뜨리는 Centricon 10과 Centriprep 10(Amicon사 제품)을 사용하여 농축시켰다. 농축된 시료는 모노 S 평형 완충용액[50mM HEPES(pH7.6), 10% 글리세롤, 1mM EDTA, 1mM DTT]을 Mono SHR 5/5 컬럼(Pharmacia사 제품)에 넣어 염화나트륨 농도구배(0 - 0.4M)를 사용하여 30분간 1㎖/분의 속도로 용출시켜 정제된 NIa 27kDa 프로테아제를 얻었다.

실시예 5 단백질 서열 결정

단백질을 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 분리하고 PVDF (polyvinylidene difluoride, Bio-Rad사 제품) 막 위에 블럿하였다. 막위의 띠를 50% 메탄올과 1% 아세트산에 녹인 쿠마시 광택블루 R-250으로 염색하여 확인하였다. 각 띠를 잘라 N-말단 아미노산 시퀀싱 반응을 자동 단백질 서열결정기(Applied Biosystems Model 471A)를 이용하여 수행하였다.

[Ⅱ. 프로테아제의 특성 ]

NIa 프로테아제의 단백질 분해 활성 NIa 프로테아제의 단백질 분해 활성을 NIa 프로테아제의 절단 부위를 갖는 기질을 사용하여 확인하였다. 기질로는 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하는 NIb와 CP 단백질의 생체외 해독 산물 또는 6K₁단백질과 기둥형의 인클루젼 단백질(CI)의 절단 부위를 포함하는 합성 운데카펩티드를 사용하였다.

실시예 6 NIb 와 CP 단백질의 생체외 해독 산물을 기질로 하는 단백질 분해 활성의 측정

(6-1) NIb와 CP 단백질의 제조

프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하는 NIb 와 CP 단백질의 생체외 해독 산물을 기질로 사용하기 위해, NIb와 CP 단백질의 유전자를 클로닝하여 pTNC를 제조하였다. 우선 pVT4 와 pVT5인 2개의 클론을 cDNA 도서관으로부터 얻었다. pVT4는 pBluescript SK(-)에 TuMV-C5 게놈의 8144에서 3'-말단까지의 뉴클레오타이드를 포함하였고, pVT5는 pUC19에 6950에서 8504까지의 뉴클레오타이드를 포함하였다. 뉴클레오타이드의 위치는 TuMV 카나다 타입 게놈의 서열을 기초로 하여 결정하였다.

pVT4를 HindⅢ로 소화하였고 8428에서 3'-말단까지의 삽입할 DNA 조각을 전기용출법으로 분리하였다. pVT5를 HindⅢ로 소화하여 벡터와 6950에서 8427까지의 삽입할 DNA 조각을 둘 다 포함하는 DNA를 전기용출법으로 분리하였다. 분리된 양쪽 DNA 조각을 연결하여 pUC19 내에 6950 에서 3'-말단까지의 뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 pVT45를 제조하였다. 이러한 pVT45를 Sac I과 Pst I으로 소화하여 핵에 포함되는 단백질 b(NIb)를 암호하는 유전자의 3'-말단의 절반과 외곽 단백질(CP)의 전체 유전자를 포함하는 약 2kb의 DNA 조각을 얻었다. 이 DNA 조각을 T7 프로모터와 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis Virus)의 5'-말단의 해독되지 않는(nontranslated) 부위를 포함하는 플라스미드 pTM1과 연결하여 pTNC를 제조하였다

NIb 유전자의 3'-말단 절반과 전체 CP 유전자를 포함하는 플라스미드 pTNC는 Sal I으로 소화하여 선형화시키고 T7 RNA 폴리머라제(NEB사 제품)를 사용하여 생체외 전사에 이용하였다. 생체외에서 RNA 전사체를 토끼 혈구 용출액을 사용하여 해독하였고, 생체외에서 합성되는 단백질을 프로메가사에서 추천하는 바와 같이 [³⁵S] 메티오닌으로 표지하였다.

(6-2) 단백질 분해 활성의 측정

조세포 용출액 또는 정제액에서의 TuMV의 NIa 프로테아제 활성을 NIa 프로테아제의 절단 부위를 갖는 다단백질을 기질로 사용하여 확인하였다.

생체외 해독 산물을 확인 완충용액[20mM HEPES(pH7.4), 10mM 염화마그네슘, 0.5Mm DTT, 10mM 염화칼슘]에서 Nla 프로테아제에 대한 반응 기질로 사용하였다. 기질과의 반응 산물을 10% SDS-PAGE 로 분석하였고 겔을 건조시켜 X-선 필름(아그파사 제품)에 노출시켰다(제6도).

실시예 7 NIa 프로테아제의 동적 상수 결정

NIa 프로테아제의 촉매적 기작과 효소적 성질을 이해하기 위해 앞서 정제된 프로테아제로 합성된 운데카펩티드 기질에 대한 K_m과 V_max값을 측정하였다. 위에 기술된 확인 조건에서 기질 농도 0.029mM에서 1.75mM 범위에서 정제된 프로테아제의 활성을 측정하여 얻은 라인위버-버크 도면를 분석하여 K_m과 V_max값을 결정하였다(제8도). 각 기질 농도에 대한 정제된 프로테아제의 최종 농도는 반응 혼합액에서 62.5㎎/1 이었다. 프로테아제 농도는 브래드포드 확인 키트(피어스사 제품)를 사용하여 결정되었다.

플라스미드 pTNC에서 나온 생체외 해독산물을 기질로 사용하는 NIa 27kDa 프로테아제 활성의 확인 시스템은 매우 효과적이므로 식물에서의 바이러스 퇴치와 관련하여 프로테아제 저해제 개발에 매우 유용하게 응용될 수 있다.

본 발명의 터닙 모자이크 바이러스는 포티바이러스의 일종으로서 진화적인 측면에서 이 그룹에 속하는 여러 바이러스 종과 유전자 상의 유사성이 매우 높고, 프로테아제의 인식 부위의 서열 등이 매우 유사하므로, 터닙 모자이크 바이러스의 프로테아제를 이용하면 궁극적으로 상당히 넓은 스펙트럼을 가진 광범위 항바이러스제 농약 개발이 가능하다. 다시 말하자면, 가깝게는 TuMV 뿐만 아니라 같은 포티바이러스 일종이면서 담배 농사에 중요한 영향을 주는 바이러스인 TEV 등을 포함하여 여러 가지 바이러스 증식을 억제하는 프로테아제 저해제 농약 개발에 본 발명의 프로테아제가 적용될 수 있다.

[서열표]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 729

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형 태 : 직쇄상

서열의 종류 : cDNA

기원

생물명 : 터닙 모자이크 바이러스 (Turnip Mosaic Virus)

주 명 : C5

서 열 :

[서열표]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 17

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형 태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

서열

AT TGC CTC TAG TCG ATG

[서열표]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 36

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형 태 : 잭쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

서열

CCC AGG ATC CAT GGC GAG TAA CTC CAT GTT CAG AGG

[서열표]

서열번호 : 4

서열의 길이 : 38

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형 태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

서열

TGC ACT GCA GGT ACC TCA TTG TGC GTA GAC TGC CGT GC

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 터닙 모자이크 바이러스(TuMV-C5) 의 Nla 프로테아제.
2. 제1항에 있어서, 터닙 모자이크 바이러스의 NIa 프로테아제로서 27kDa인 것을 특징으로 하는 TuMV-C5의 NIa 프로테아제.
3. 제2항에 있어서, 27kDa 프로테아제에서 C-말단 절단이 일어나서 얻어지는 25kDa인것을 특징으로 하는 TuMV-C5의 Nla 프로테아제.
4. 제3항에 있어서, 25kDa 프로테아제에서 C-말단 절단이 반복적으로 일어나서 얻어지는 24kDa인 것을 특징으로 하는 TuMV-C5의 Nla 프로테아제.
5. 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 NIa 프로테아제 유전자, 그 유전자의 일부분 또는 그의 변형된 유전자를 벡터에 도입하여 제조하는 것을 특징으로 하는 Nla 프로테아제 발현 플라스미드.
6. 제5항에 있어서, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 NIa 프로테아제 유전자를 pGEX-KG 벡터에 도입하여 제조하는 것을 특징으로 하는 제2도의 제한지도를 갖는 NIa 프로테아제 발현 플라스미드 pGPOPR.
7. 제6항의 플라스미드로 대장균을 형질전환시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 형질전환체 (수탁번호 KCTC 0233 BP).
8. 제5항의 발현 플라스미드로 대장균을 형질 전화시키고, 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 NIa 프로테아제의 제조방법.