JP2002534084A - Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの修飾形 - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの修飾形

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JP2002534084A JP2000592405A JP2000592405A JP2002534084A JP 2002534084 A JP2002534084 A JP 2002534084A JP 2000592405 A JP2000592405 A JP 2000592405A JP 2000592405 A JP2000592405 A JP 2000592405A JP 2002534084 A JP2002534084 A JP 2002534084A
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スティーブン・ウェインハイマー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、修飾Ｃ型肝炎ＮＳ３プロテアーゼおよび修飾Ｃ型肝炎ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼに関する。これらタンパク質は高度に可溶性であり、ＮＭＲ分光分析、Ｘ線結晶学、およびインヒビタースクリーニングに有用である。ＤＮＡ構築物もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼの修飾形に関する。このプロ
テアーゼの野生型はＣ型肝炎ウイルスの複製のためにインビボで必須である。本
発明の新規なタンパク質は、該プロテアーゼのインヒビターのスクリーニング、
および該プロテアーゼやプロテアーゼ：インヒビター複合体の構造解析に有用で
ある。
【０００２】 （背景技術） Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、非Ａ非Ｂ肝炎のすべての症例のうちの９
０％の原因であると考えられている（Chooら、1989、Kuoら、1989）。ＨＣＶ感
染は世界中で２〜１５％の発症率であり、ＨＩＶ感染よりも一般的である。米国
だけでも４００万以上の人々がＨＣＶに感染している。ＨＣＶの一次感染はしば
しば無症候性であるが、殆どすべてのＨＣＶ感染は慢性の状態に進行し、この状
態が何十年も持続する。ＨＣＶ感染の２０〜５０％もが最終的に慢性の肝臓疾患
（たとえば、肝硬変）を発症すると思われ、これら症例の２０〜３０％は肝不全
または肝臓癌に導かれるであろう。米国の１２,０００人に達する人々が本年、
ＨＣＶ感染に伴う続発症で死亡するであろう。現在の人口は来る２０年間に年老
いるので、ＨＣＶに伴う罹患率および死亡率は３倍になると予測されている。Ｈ
ＣＶ感染のための安全で有効な治療を開発することは、主たる未克服の医学的必
要性である。
【０００３】 抗ウイルス的介入のための確立された原則は、本質的なウイルスによりコード
された酵素の直接阻害である。ＨＣＶ感染に対する唯一の承認された処置はイン
ターフェロンであるが、これは宿主の免疫応答を変えることにより間接的にＨＣ
Ｖ感染に影響を及ぼすものである。インターフェロン療法は、処置した患者の３
０％以上で持続した（sustained）抗ウイルス応答が生じるため、たいてい、効
力を有しない。ウイルスの複製を直接阻止する安全で有効な抗ウイルス処置は、
インターフェロン療法に比べてＨＣＶ感染に対する公衆衛生に対し一層有利な影
響を及ぼすに違いない。これまで、そのようなＨＣＶの複製のインヒビターは開
示されていない。ＨＣＶ疾患を防ぐための予防接種は、ＨＣＶのワクチン候補の
有効性の欠如のために展望が示されていない。
【０００４】 Ｃ型肝炎ウイルスは、Flaviviridae科のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣ
Ｖゲノムは３０３３アミノ酸からなる単一のポリプロテインをコードし、そのう
ち残基１０２６〜１６５７（６３１アミノ酸）はＮＳ３タンパク質を表す（Choo
ら、1991）。ＨＣＶのＮＳ３タンパク質は、その一次アミノ酸配列が関連してい
る４つの部位で選択的にＨＣＶポリプロテインを開裂する部位特異的なプロテア
ーゼである（Grakouiら、1993a）。これらの開裂は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４
Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含むＨＣＶの成熟非構造（複製性）タンパク質を
生じる（Bartenschlagerら、1993；Grakouiら、1993b；Hijikataら、1993a,b；T
omeiら、1993；Bartenschlagerら、1994；Eckartら、1994；Linら、1994；Manab
eら、1994）。遺伝学的な研究は、関連するウイルス（たとえば、黄熱ウイルス
およびウシ下痢ウイルス）の相同なＮＳ３プロテアーゼがウイルスの複製に絶対
に必須であることを示している（Chambersら、1990；Xuら、1997）。それゆえ、
ＮＳ３プロテアーゼのインヒビターはＨＣＶの複製を阻害し、ＨＣＶ感染に対す
る有効な抗ウイルス処置の発見および開発に有用であるに違いない。
【０００５】 ＮＳ３によるＨＣＶポリプロテインの有効なプロセシングにはまた、ＨＣＶポ
リプロテインのアミノ酸１６５８〜１７１２（５８アミノ酸）であるＮＳ４Ａタ
ンパク質も必要である（Bartenschlagerら、1994；Overtonら、1994；Bartensch
lagerら、1995；Bouffardら、1995；Tanjiら、1995）。ＮＳ４Ａは、ＮＳ３との
ヘテロマー複合体を形成することによりプロテアーゼ活性を刺激する（Bartensc
hlagerら、1995；Linら、1995；Satohら、1995）。ＮＳ４Ａはまた、ウイルス複
製の起りやすい部位であるＥＲ膜へのＮＳ３プロテアーゼの局在化をターゲティ
ングすると考えられている（Hijikataら、1993b；LinおよびRice、1995；Tanji
ら、1995）。ＮＳ３およびＮＳ４Ａの機能性ドメインをマッピングする研究は、
ＮＳ３のプロテアーゼ触媒ドメインがアミノ酸１〜１８１内に存在すること（Ba
rtenschlagerら、1994；Tanjiら、1994；Faillaら、1995；Shojiら、1995）、お
よび該触媒ドメインがＮＳ４Ａと相互作用し、ＮＳ４Ａにより刺激されること（
Hijikataら、1993a；Linら、1994；Bartenschlagerら、1995；Faillaら、1995；
Satohら、1995；Tanjiら、1995）を示している。ＮＳ３の残りの４５０アミノ酸
はヘリカーゼ活性およびＡＴＰアーゼ活性を有する機能性ドメインを含み、これ
らはウイルスゲノムの複製に関与していると思われる（JinおよびPeterson、199
5）。ＮＳ４Ａの機能性研究は、プロテアーゼ刺激活性がＮＳ４Ａのアミノ酸２
１〜３４にマッピングされることをインビトロで示した（Linら、1995；Tomeiら
、1995；Shimizuら、1996）。一方、ＮＳ４ＡのＮ末端側２０アミノ酸は天然で
はほとんど疎水性であり、膜貫通アンカードメインとして機能しているのかもし
れない（LinおよびRice、1995）。
【０００６】 ＮＳ３のプロテアーゼ触媒ドメインの三次元構造は、Ｘ線結晶学により、ＮＳ
４Ａからの補因子とともに、および補因子なしで決定されている（Kimら、1996
；Loveら、1996；Yanら、1998）。これら構造は、Ｓｅｒ−１３９、Ｈｉｓ−５
７およびＡｓｐ−８１を含むカノニカル触媒三つ組（triad）を有するキモトリ
プシン様セリンプロテアーゼドメインとの非常に強い構造的ホモロジーを明らか
にした。しかしながら、ＮＳ３のＮ末端側２８アミノ酸は、ＮＳ４Ａの不在下で
は構造化されないがＮＳ４Ａペプチドの存在下ではこの領域はβ鎖（β-strand
）およびαヘリックス二次構造を取るため、独特であった。共結晶（co-crystal
）構造は、ＮＳ４ＡペプチドがＮＳ３の隣接するβ鎖中に挿入され、該β鎖によ
って部分的に埋没されることを明らかにした。ＮＳ４Ａ結合の結果としてプロテ
アーゼ活性部位の近傍で局所的な再配置も起り、これら再配置はプロテアーゼを
触媒として一層活性にすると考えられている。それゆえ、ＮＳ４ＡはＨＣＶプロ
テアーゼの活性なコンホメーションを安定化すると予測される。
【０００７】 ＮＳ３のＮ末端の近傍には残基１３〜２１にまたがるαヘリックス（αヘリッ
クス０）があり、これはＮＳ４Ａペプチドにより安定化されるようである。この
ヘリックスの外部面は非常に疎水性であり、分枝脂肪族残基のみからなる。その
疎水性の性質のため、この表面はＮＳ３：ＮＳ４Ａ複合体を細胞質膜にアンカー
リングするためにさらなる膜相互作用に関与しているかもしれないと考えられて
いる（Yanら、1998）。
【０００８】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） 組換えＮＳ３プロテアーゼの発現のためのルーチンな方法（たとえば、大腸菌
、バキュロウイルス）は広く用いられている。野生型のＮＳ３プロテアーゼ（完
全長かまたは末端切断したドメイン）を発現するに際して直面する一般的な問題
は、とりわけ大腸菌ベクター系を用いた場合に不溶性または溶解しにくいタンパ
ク質が産生することであった。これまでに記載された最良の系は低レベルの組換
え野生型プロテアーゼを産生しており、該プロテアーゼは溶解しにくい傾向があ
る（Shojiら、1995；Suzukiら、1995；Hongら、1996；Steinkuhlerら、1996）。
これら調製物の多くは酵素的に活性であるため、この方法は活性分析およびイン
ヒビターのスクリーニングのために活性な酵素を生成するには充分であった。し
かしながら、構造研究を行うには、酵素的活性に加えて高溶解度と低凝集性によ
り特徴付けられる高発現酵素が必要である。
【０００９】 天然のＮＳ３プロテアーゼドメインの遺伝的に操作した融合誘導体を構築する
ことにより、ＨＣＶプロテアーゼの低発現および／または低溶解度に伴う問題を
解決するための努力がなされてきた。最も注目すべきものは、Ｘ線結晶学による
構造決定に適した、ゆっくりと成長する結晶を形成するＮＳ３プロテアーゼ触媒
ドメインの生成である（Loveら、1996；Kimら、1996；Yanら、1998）。これらは
、発現タンパク質の安定な発現および／または溶解度を促進するポリペプチドタ
グ（たとえば、塩基性アミノ酸、ポリヒスチジン）をＮ末端および／またはＣ末
端に融合させることによりＮＳ３の遺伝的に操作した誘導体を構築することを含
む。該プロテアーゼ活性ドメインのＣ末端へのＮＳ４Ａタンパク質の融合（Inou
eら、1998）を含む、大腸菌で発現させたときに部分的に可溶な他のタイプのプ
ロテアーゼ融合物（たとえば、ユビキチン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ
、マルトース結合タンパク質との）が記載されているが、全体としての低い溶解
度の臨界限界を克服するものはこれらのうちのわずか（もしあったとしても）で
ある。ごく最近、ＮＳ４ａセグメントがＮＳ３プロテアーゼのＮ末端側に融合し
た構築物の細菌発現が報告されたが（Taremiら、1998；Pasquoら、1998）、最終
的な調製物の全体としての溶解度は報告されていない。
【００１０】 ＮＭＲ研究には一般に、高レベルで発現され、非常に高度に可溶性で（＞１ｍ
Ｍ）、精製したときに可溶性の凝集物を生成しないタンパク質調製物を必要とす
るので、ＮＳ３調製物の報告は刊行されていない。さらに、酵素インヒビターと
の複合体を形成したＨＣＶプロテアーゼのＸ線構造もこれまで報告されていない
。
【００１１】 （その解決方法） 現在のところ、ＨＣＶ感染の予防または治療に利用できる医薬は知られていな
い。ＨＣＶの複製は、ウイルスによりコードされたＮＳ３プロテアーゼの活性に
依存する。それゆえ、このプロテアーゼ活性に対する特異的なインヒビターの解
明は、ＨＣＶの複製を阻止する医薬の発見に有用であろう。このことは、医化学
のためのリード化合物（leads）として利用できる小分子インヒビターのスクリ
ーニング；およびＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼに結合する化合物がいかに化学的
に修飾されて該ウイルスプロテアーゼの強力なインヒビターを生成するかを見出
すべく、該プロテアーゼと該プロテアーゼに結合する該化合物との複合体の（Ｘ
線結晶学またはＮＭＲによる）三次元構造の分析を含む（これらに限られるもの
ではない）、方法の一つまたは組み合せを用いて達成できる。
【００１２】 本発明は、ＨＣＶ感染を予防または治療する医薬の発見を可能にする。本発明
は、新規な、高度に可溶性で修飾された形態のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを包
含する。さらに詳しくは、本発明は、新規な、高度に可溶性で修飾された形態の
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、および新規な、高度に可溶性で修飾されたＨＣＶ
ＮＳ３−ＮＳ４ａ融合プロテアーゼを包含する。これら新規なタンパク質は、小
分子インヒビターのスクリーニング、およびＸ線結晶学およびＮＭＲ分光分析に
よるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼと該プロテアーゼに結合する化合物との複合体
の三次元構造の分析を極めて容易にする。
【００１３】 本発明は、野生型のＨＣＶプロテアーゼ配列に施した多数の有意な修飾の結果
得られたものである。 本発明の一つの側面は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ中の疎水性のαヘリック
ス０アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への少なくとも一つの置換を含むＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを含む、修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼである。 本発明の他の側面は、ＨＣＶ ＮＳ４ａもしくは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａに融合し
た修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを含む修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロ
テアーゼである。 本発明のさらなる側面は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、ベクタ
ーおよび宿主細胞である。 本発明のさらなる側面は、本発明のタンパク質の製造方法である。
【００１４】 定義 本発明において意図するものを一層明確に記載するため、以下の定義が規定さ
れる。 「ＨＣＶ」とはＣ型肝炎ウイルスをいう。 「ＨＣＶ ＮＳ３」とは、ＨＣＶポリプロテインの残基１０２６〜１６５７に
対応するＨＣＶの野生型株からのＨＣＶポリプロテインのタンパク質断片をいう
（Chooら、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88, 2451-2
455 [1991]において定義されるように）。本明細書を通じてＨＣＶ Ｎ５３の番
号付けの慣習は、ＨＣＶポリプロテインの残基１０２６に対応する残基１（プロ
セシングを受けた成熟ＮＳ３タンパク質断片の最初のアミノ酸残基である）から
開始する。ＨＣＶ ＮＳ３は、プロテアーゼ活性を付与する部分、ヘリカーゼ活
性を付与する部分、およびＡＴＰアーゼ活性を付与する部分を有する。
【００１５】 「ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ」とは、これに限られるものではないが、一般
にＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインに付随する、プロテアーゼ活性を有する
野生型ＨＣＶ ＮＳ３の部分；またはＨＣＶ ＮＳ３に付随するプロテアーゼ活性
を示す野生型ペプチドをいう。 「ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメイン」とは、通常、ＨＣＶ ＮＳ３の残基１
〜１８１を包含するが、時々、Ｎ末端かまたはＣ末端のいずれかの残基の包含ま
たは欠失によって異なっている、プロテアーゼ活性を付与する野生型ＨＣＶ Ｎ
Ｓ３の部分をいう。
【００１６】 「修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ」とは、その配列が野生型ＨＣＶ ＮＳ３プ
ロテアーゼの配列から変化しており、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのプロテアー
ゼ活性を示すペプチドまたはタンパク質をいう。そのような修飾としては、これ
らに限られるものではないが、天然に存在するアミノ酸による置換、天然に存在
しないアミノ酸による置換、保存的なアミノ酸置換、アミノ酸の挿入、アミノ酸
の欠失、およびアミノ酸の付加が挙げられる。アセチル化、メチル化、リン酸化
、カルボキシル化、またはグリコシル化を含む非配列修飾もまた修飾の定義に包
含される。
【００１７】 「ＨＣＶ ＮＳ４ａ」とは、ＨＣＶポリプロテインの残基１６５８〜１７１２
に対応するＨＣＶの野生型株からのＨＣＶポリプロテインのプロテアーゼ刺激性
タンパク質断片（Chooら、Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 88, 2451-2455 [1991]において定義されるように）、プロテアーゼ刺激活性
を示すその断片、またはＨＣＶポリプロテインの残基１６５８〜１７１２に付随
するプロテアーゼ刺激活性を示す野生型ペプチドをいう。完全長のＨＣＶ ＮＳ
４ａは特に残基１〜５８をいい、これは該ポリプロテインの残基１６５８〜１７
１２に対応する。本明細書を通じてＨＣＶ ＮＳ４ａの番号付けの慣習は、ＨＣ
Ｖポリプロテインの残基１６５８に対応する残基１（プロセシングを受けた成熟
ＨＣＶ ＮＳ４ａ断片の最初の残基と同じである）から開始する。
【００１８】 「修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ」とは、その配列が野生型ＨＣＶ ＮＳ４ａの配列から
変化しており、ＨＣＶ ＮＳ４ａのプロテアーゼ刺激活性を示すペプチドまたは
タンパク質をいう。そのような修飾としては、これらに限られるものではないが
、天然に存在するアミノ酸による置換、天然に存在しないアミノ酸による置換、
保存的なアミノ酸置換、アミノ酸の挿入、アミノ酸の欠失、およびアミノ酸の付
加が挙げられる。アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、またはグ
リコシル化を含む非配列修飾もまた修飾の定義に包含される。
【００１９】 「修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ」とは、ＨＣＶ ＮＳ４ａも
しくは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａに融合した修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼをいう。
修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼは最適化リンカー配列を含んで
いてよい。 「ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形」とは、本明細書に記載した本発明の
全体をいい、修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融
合プロテアーゼ、またはその両者を包含する。
【００２０】 「天然に存在するアミノ酸」とは、野生型のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼまた
は野生型のＨＣＶ ＮＳ４ａ中の関連部位（referred-to）に存在する２０の標準
Ｌ−アミノ酸のいずれかをいう。 「天然に存在しないアミノ酸」とは、野生型のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼま
たは野生型のＨＣＶ ＮＳ４ａ中の関連部位に存在しない２０の標準Ｌ−アミノ
酸のいずれか、Ｄ−アミノ酸、およびβアミノ酸やγアミノ酸などの合成アミノ
酸をいう。 「保存的なアミノ酸置換」とは、一つのアミノ酸を類似の特性を有する他のア
ミノ酸で置換することをいい、たとえば以下のグループ内の置換をいう：バリン
およびグリシン；グリシンおよびアラニン；バリンおよびイソロイシンおよびロ
イシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；
セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンお
よびチロシン。他の保存的なアミノ酸置換は下記表から採用することができる。
【００２１】 表１ 保存的なアミノ酸置換
【表１】
【００２２】 「疎水性アミノ酸」とは、側鎖が比較的に非極性であるアミノ酸残基をいい、
アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン
、バリンおよびトリプトファンを含むが、これらに限られるものではない。 「親水性アミノ酸」とは、側鎖が比較的に極性であるアミノ酸残基をいい、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン
、セリン、トレオニン、ヒスチジンおよびチロシンを含むが、これらに限られる
ものではない。 「αヘリックス０」とは、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼがＨＣＶ ＮＳ４ａセグ
メントと複合体を形成したときにαヘリックス構造を取る、ＨＣＶ ＮＳ３の残
基Ｌｅｕ１３〜Ｌｅｕ２１からなる配列をいう（Kimら、Cell 87, 343-355 [199
6]またはYanら、Protein Science 7, 837-847 [1998]に規定されているように）
。
【００２３】 「リンカー」とは、修飾ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼまたは修飾ＮＳ３
−ＮＳ４ａ融合プロテアーゼにおいて、ＨＣＶ ＮＳ４ａ配列をＨＣＶ ＮＳ３配
列と連結させているポリペプチド配列をいう。 「最適化リンカー」とは、修飾ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼにおいて、
その結果得られる融合タンパク質が非最適化リンカーに比べて向上した安定性お
よび溶解度特性を有するように、ＮＳ４ａ配列とＮＳ３配列とを連結させるリン
カー配列をいう。 「亜鉛結合性システイン残基」とは、ＨＣＶ ＮＳ３において天然に存在する
システイン残基Ｃｙｓ９７、Ｃｙｓ９９およびＣｙｓ１４５をいう。 「非亜鉛結合性システイン残基」とは、ＨＣＶ ＮＳ３において天然に存在す
るシステイン残基Ｃｙｓ４７、Ｃｙｓ５２およびＣｙｓ１５９をいう。
【００２４】 （従来技術より有効な効果） 本発明の有利さは、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形が活性を完全に保持
しながら、しかも界面活性剤不含条件下での高度に可溶性で（＞３０ｍｇ／ｍｌ
）非凝集性の性質のために生化学実験に充分に供することができることである。
対照的に、野生型のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ（ドメイン）は可溶化するには
界面活性剤が必要である。本発明のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形は界面
活性剤の不在下でも非常に高程度の溶解度を示すので、インヒビターと複合体を
形成したＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのＮＭＲおよびＸ線結晶学的構造決定に充
分に適しており、この薬理学的に重要な酵素を用いた構造ベースの繰返しドラッ
グデザインの努力を容易にする。
【００２５】 上記に記載したように、本発明の一つの側面は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ
中に疎水性のαヘリックス０アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への少なくとも
一つの置換を含む修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼである。 本発明の他の側面は、ＨＣＶ ＮＳ４ａもしくは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａに融合し
た修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを含む修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロ
テアーゼである。
【００２６】 （発明を実施するための最良の形態） αヘリックス０において疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸に置換する種々の組
み合せは、本明細書および特許請求の範囲に記載してある。好ましい態様におい
て疎水性αヘリックス０アミノ酸残基は、Ｌｅｕ１３、Ｌｅｕ１４、Ｉｌｅ１７ 、Ｉｌｅ１８、およびＬｅｕ２１よりなる群から選ばれる。さらに好ましい態様
において、Ｌｅｕ１３はグルタミン酸で置換され、Ｌｅｕ１４グルタミン酸で置
換され、Ｉｌｅ１７はグルタミンで置換され、Ｉｌｅ１８はグルタミン酸で置換
され、Ｌｅｕ２１はグルタミンで置換される（これは図１１中のヘリックス０−
１、配列番号６である）。他のさらに好ましい態様において、Ｌｅｕ１３はグル
タミン酸で置換され、Ｌｅｕ１４はグルタミンで置換され、Ｉｌｅ１７はグルタ
ミンで置換され、Ｉｌｅ１８はリジンで置換され、Ｌｅｕ２１はヒスチジンで置
換される（これは図１１中のヘリックス０−７、配列番号９である）。
【００２７】 本発明の他の好ましい態様において、修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼはさら
にαヘリックス０中以外で疎水性アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への少なく
とも１つの置換を含む。 他の好ましい態様において、修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼはさらに非亜鉛
結合性システイン残基の非システイン残基への少なくとも１つの置換を含む。 好ましい態様において、変化したＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼはＨＣＶ ＮＳ３
のおよそ残基１〜１８１を含む。
【００２８】 修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼである本発明の側面の好まし
い態様において、変化したまたは変化していないＨＣＶ ＮＳ４ａは完全長ＨＣ
Ｖ ＮＳ４ａのおよそ残基２１〜３１を含む。 修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼである本発明の側面において
、好ましい態様はさらに最適化リンカー配列を含むリンカーを含む。さらに好ま
しい態様において、ＮＳ４ａはＮＳ３のアミノ末端に結合される。最も好ましい
態様において、最適化ターン配列はＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（ここで、
ＳｅｒはＮＳ４ａの残基Ｓｅｒ３２に対応し、ＴｈｒはＮＳ３の残基Ｔｈｒ４に
対応する）である。
【００２９】 修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼである本発明の側面の好まし
い態様において、修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａはさらに疎水性アミノ酸残基の親水性ア
ミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む。最も好ましい態様において、残基
３０はアスパラギンに置換される。 本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする単離核酸分子、該核酸分子を
含むベクター、および該ベクターを含む宿主細胞を包含する。本発明のある種の
核酸分子を含有するプラスミドを有する大腸菌細胞は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ユニバーシティー・ブールバ
ール、マナサス、バージニア、２００１１０米国に寄託してあり、ＡＴＣＣ受託
番号は２０４０７０および２０４０７１である。
【００３０】 本発明はまた、本発明の宿主細胞を用いた本発明のタンパク質の製造方法をも
包含する。 本発明は従来技術とは明瞭な差異および改良を示す。刊行された研究は可溶化
タグまたはタンパク質融合パートナーのプロテアーゼへの融合のみに依存するこ
とによりＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを可溶化する試みを記載している（すなわ
ち、Kimら、1996；Yanら、1998；Taremiら、1998）のとは対照的に、本発明では
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのコード領域自体の中でアミノ酸残基を変化させる
のであり、その結果、本明細書においてＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形と
して好ましいとされるものが得られるのである。
【００３１】 本発明は３０ｍｇ／ｍｌよりも高い溶解度を提供するが、これはあらゆる種類
のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ（野生型または何らかの操作をした）に関して報
告された界面活性剤不含での最も高いレベルである。 出願人は本発明を用いて高品質ＮＭＲスペクトルを回収した。本明細書にはＨ
ＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形およびＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形：
インヒビター複合体の高品質ＮＭＲスペクトルを示してある。これらは、ＨＣＶ
プロテアーゼ（野生型または何らかの操作をした）単独または該プロテアーゼと
インヒビターとの複合体の高品質ＮＭＲスペクトルの最初に報告された例である
。
【００３２】 出願人は本明細書においてＸ線結晶学により決定したＨＣＶ ＮＳ３プロテア
ーゼの修飾形：インヒビター複合体を提示し、本発明のタンパク質がプロテアー
ゼインヒビターとの高品質共結晶を速やかに生成しうることを示している。これ
は、インヒビターとの複合体を形成したＨＣＶプロテアーゼ（野生型または何ら
かの操作をした）を示すＸ線結晶学の最初に報告された例である。本発明のタン
パク質は、プロテアーゼインヒビターとの高品質共結晶を生成することができる
ために特に有用である。タンパク質を用いた構造ベースのドラッグデザインは、
インヒビターとの回折グレードの（diffraction-grade）共結晶を時宜を得た仕
方で生成する能力によってしばしば制限される。本発明のタンパク質のように速
やかに共結晶を生成できるタンパク質は、構造ベースのデザインの仕事の繰返し
プロセスを容易にする。
【００３３】 本発明のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形はまた、ＨＣＶ ＮＳ３の小分子
インヒビターのスクリーニングにも有用である。本発明のタンパク質は界面活性
剤の不在下で調製できるため、界面活性剤の存在下でスクリーニングした場合に
は検出できないであろう化合物インヒビターの同定が可能になる。非融合形態の
修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼはまた、ある化合物がＮＳ３へのＮＳ４ａの結
合を妨害するか否かを調べるのにも用いることができる。
【００３４】 これら可溶性の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ変異体を得るために使用する
一般的な戦略は、タンパク質の溶解度にとって重要と思われるタンパク質の重要
領域を連続的にターゲティングし、これらターゲティング領域を半無作為な仕方
で変異誘発させ、ついで高度の溶解度を示すタンパク質変異体を発現する細菌ク
ローンを選択もしくはスクリーニングすることであった。本発明の好ましい態様
の幾つかを行うのに使用する手順の概略を実施例に示してある。実施例の過程に
おいて、段々に高程度のアミノ酸残基置換（最初の野生型配列と比して）を、低
レベルの凝集と高レベルの溶解度を示すＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形の
産生が達成されるまで生成させた。多くの様々な疎水性から親水性へのＨＣＶ
ＮＳ３プロテアーゼ表面残基置換（天然に存在するものおよび天然に存在しない
もの）を、種々のＮＳ４ａ−ＮＳ３融合リンカー配列と組み合せ、これらプロテ
アーゼ変異体を選択もしくはスクリーニングして所望の溶解度特性を示す修飾タ
ンパク質を見出した。αヘリックス０中の幾つかの完全に保存された疎水性残基
の位置を変異誘発のためにターゲティングした。というのは、これら位置はＨＣ
Ｖ ＮＳ３プロテアーゼの表面上で特に広範な疎水性部分（patch）を構成してい
たからであった。他のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ疎水性表面残基もまた変異誘
発した；特に好適な候補は、その位置が他の野生型ＨＣＶ単離物からのＨＣＶ
ＮＳ３配列の間で変化している残基であった。これら置換および他の置換を記載
し、特許請求の範囲に含めてある。
【００３５】 以下に、特許請求した本発明およびその製造方法を詳細に記載する。記載の順
序は使用した実験プロセスに従っているが、当業者であれば異なる順序で工程を
行ったりおよび／または工程を省いたりして特許請求した本発明を行う仕方を見
出すことができるであろう。
【００３６】 いかなるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼおよびＨＣＶ ＮＳ４ａをも修飾の開始点
として用いることができる。本明細書ではクローニングしたＨＣＶ単離物配列を
変異誘発実験のための開始点として用いた（実施例１、図９、配列番号２）。使
用した発現系は、すべてのコドンを大腸菌中での高レベル発現のために最適化し
てある合成遺伝子を特徴とする。このことは、得られた構築物について観察され
る高レベルの発現を説明するものではあるが、それは本発明にとって本質的なこ
とではなく、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼをコードするいかなるヌクレオチド配
列も（標準遺伝子コードを用いて）これらタンパク質を発現するために用いるこ
とができる。ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼは、プロテアーゼ活性を示す野生型Ｈ
ＣＶ ＮＳ３のあらゆる断片または野生型ＨＣＶ ＮＳ３に付随するプロテアーゼ
活性を示すあらゆる野生型ペプチドを包含する（定義セクションにおいて定義さ
れるように）。また、本明細書に記載するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの修飾形
が大腸菌中で発現されることも必須ではない。これらＨＣＶ ＮＳ３プロテアー
ゼの修飾形を発現するために、あらゆるインビボの発現宿主（細菌、昆虫、植物
、哺乳動物、その他）を用いることができる。また、これら変異体のインビトロ
での産生も可能である。本発明は、あらゆる手段により産生されたＨＣＶ ＮＳ
３プロテアーゼの修飾形を包含するものである。
【００３７】 本発明は、ＨＣＶ ＮＳ４ａの使用を包含する。ＨＣＶ ＮＳ４ａの定義につい
ては定義のセクションを参照。実施例２では、完全長のＨＣＶ ＮＳ４ａ（配列
番号２６）の残基２１〜３１（Ｇ２１Ｓ２２Ｖ２３Ｖ２４Ｉ２５Ｖ２６Ｇ２７Ｒ ２８ Ｉ２９Ｖ３０Ｌ３１）を含むＮＳ４ａ配列をＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの
Ｎ末端に融合させた。この実験でのリンカー配列は、簡単なジペプチド配列アス
パラギン−グリシンであった。様々な他のリンカーを用いることができ、当業者
は他の適当なリンカーを選択することができるであろう。ＮＳ４ａはまたＮＳ３
のＣ末端に融合させることもできる。以前に示されているように（Linら、1995
；Tomeiら、1995；Shimizuら、1996）、残基２１〜３１を含むＮＳ４ａペプチド
は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの活性をインビボで増大させる。実施例２に記
載したリンカーを最初に用いた。しかしながら、実施例５に記載した実験から得
られた最適化リンカー構築物から一層良好な結果（発現および溶解度の点で）が
得られた。他の研究者はごく最近に他のＮＳ４ａ−ＮＳ３リンカーを刊行してい
るが（Taremiら、1998；Pasquoら、1998）、本発明において記載した最適化リン
カーは（本明細書に記載した他の変異と組み合せて）前例のないレベルのプロテ
アーゼ溶解度を付与するものである。
【００３８】 αヘリックス０として知られるＨＣＶ ＮＳ３の第１のαヘリックスは、極め
て疎水性の溶媒に露出された表面を有しており（Yanら、1998）、出願人はこれ
が野生型ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ（図９中の配列番号１など）および修飾し
ていないＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合タンパク質（図１０中の配列番号３など
）の調製物の不溶性の特性に貢献していると考えた。それゆえ、αヘリックス０
の疎水性の溶媒露出残基をより親水性の残基の種類に変えるために、ターゲティ
ング／半無作為変異誘発法を適用した（実施例３および４を参照）。現在のとこ
ろ、知られているＨＣＶのすべての株はαヘリックス０中に５つの疎水性の溶媒
露出残基（Ｌ１３、Ｌ１４、Ｉ１７、Ｉ１８、Ｌ２１）を有しており、本発明に
従ってこれらを単独でまたは組み合せて変化させた。出願人は、５つのすべてを
直列で変異させることを選択した。現在まだ知られていないαヘリックス０中の
他の溶媒露出した疎水性残基を変えることもまた、溶媒に露出されていないαヘ
リックス０中の疎水性残基を変えるのと同様に、本発明に包含される。出願人は
、ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのαヘリックス０に対する変化を
示すが、非融合ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼもまたそのような変化を担うことが
できるため、かくして修飾したＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼもまた本発明に包含
される。
【００３９】 候補変異体の大きなライブラリーからＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの可溶性修
飾形を単離する簡単な方法は、図４に示した分析と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析により誘導された形質転換体の透明な上澄み液中で修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−Ｎ
Ｓ３融合タンパク質変異体の存在について単にスクリーニングすることである。
この方法は面倒であり、本質的に低処理量である。他の遥かに強力な高処理量法
は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの最も可溶性の修飾形をライブラリー中の他の
すべてのクローンの中から選択する系を築くことである。出願人は、そのような
選択スキームを用いてＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのより可溶な修飾形を選択し
た（実施例４および図３を参照）。出願人が記載したのは、プロテアーゼの可溶
性の（または活性な）変異体を選択する一般法の特定の応用である。このスキー
ムは、本発明によって包含されるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのあらゆる修飾形
の溶解度または活性をスクリーニングするのに用いることができる。
【００４０】 αヘリックス０の変異のみを有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテ
アーゼ（実施例４に記載）は完全な酵素活性を保持しており、変異させていない
ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合物に比べて相当に可溶性であった（図４を参照、
レーン３と５を比較せよ）。これら変異体は、酵素アッセイなどのようにタンパ
ク質濃度を比較的低く保持できる実験には有用である。また、これら変異体は、
細菌選択系（図３）をＨＣＶプロテアーゼインヒビターのスクリーニング系とし
て使用するのを可能にする（インヒビターは、これら誘導した細菌のクロラムフ
ェニコール培地中での増殖の低下をきたすであろう）。同様に、融合していない
修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを酵素アッセイに用いることができ、インヒビ
ターのスクリーニングに用いることができる。しかしながら、αヘリックス０の
変異のみを有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼは、タンパク
質ＮＭＲに必要な高タンパク質濃度では依然として凝集する傾向があった（図５
、パネルＡを参照）。一つの懸念は、ＮＳ４ａセグメントとＮＳ３セグメントと
が最適に融合しないことであった。それゆえ、ＮＳ４ａセグメントとＮＳ３セグ
メントとを連結するリンカー配列を最適化することを行った。
【００４１】 リンカー配列を最適化するために多くの異なる方法を用いることができる。一
般に、目標は、２つのタンパク質セグメントの相対的な空間位置が最小の応力と
構造への最小の動揺で保持されるように、ポリペプチドリンカーを用いてこれら
２つのセグメントを首尾よく連結することである。他の重要な観点は、リンカー
が理想的にはそれほどひどくフレキシブルであってはならないことであるが、こ
れはタンパク質を不安定化する傾向があるからである。本発明の場合はＮＳ４ａ
セグメントとＮＳ３セグメントとの所望の相対的な構造位置は知られているので
、構造ベースのアプローチを用いて最適の連結配列を見出した。実施例５に記載
するように、ブルックヘブンプロテインデータベース（Brookhaven Protein Dat
a Base）（ＰＤＢ）中の構造に関する情報を調べ、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ
／ＮＳ４ａペプチド複合体の刊行されたＸ線構造に認められるようにＮＳ４ａ（
残基）セグメントおよびＮＳ３（残基）セグメントと構造が類似の２つのβ鎖を
首尾よく連結させる短いターン配列を見出した。この目的のため、プロテインデ
ータベースファイル１ＪＸＰ.ｐｄｂ（Yanら、Protein Science 7, 837-847 [19
98]）からの座標（coordinates）を用いた。さらに、ＮＳ４ａセグメント内での
表面露出疎水性残基の配列の近接（sequential proximity）（Ｖａｌ３０）は、
異なるリンカー配列を試みながら、この残基の変異の効果を試験する機会を与え
た。
【００４２】 これら試験したもののうちで１つの最適のリンカー配列は、高レベルの発現お
よび溶解度を付与した。この最適のリンカー配列を野生型のαヘリックス０（図
１８中の配列番号２４）と組み合せるとプロテアーゼに溶解度を付与しないが、
この最適化したターンを修飾αヘリックス０（図１３中の配列番号１４）と組み
合せるとプロテアーゼに溶解度を付与する（図４、レーン７と９を比較せよ）。
全体として、プロテアーゼの修飾αヘリックス０／最適化リンカー形態で得られ
るＮＭＲスペクトル（配列番号１４−図５、パネルＢ）は、プロテアーゼの修飾
αヘリックス０／非最適化リンカー形態で得られるもの（配列番号１２−図５、
パネルＡ）よりも優れており、より可溶性で凝集しにくい形態のプロテアーゼを
示していた。
【００４３】 溶媒露出した疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸へのさらなる置換の効果を、配
列番号１４中のある種の表面残基を変えて配列番号１６とすることにより調べた
（実施例６参照）。これら残基の選択は、野生型ＨＣＶ単離物の刊行された配列
からのＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ配列を並べ、刊行されたＮＳ３プロテアーゼ
構造中の溶媒露出された残基位置で天然に生じている疎水性アミノ酸から親水性
アミノ酸への置換を探すことにより行った。これら天然に生じている置換のうち
３つの組み合せ（Ａ４０Ｔ、Ｉ７２Ｔ、Ｐ８６Ｑ）が、溶解度を高める効果を有
することがわかった（図１４中の配列番号１６）。さらに、４つの非亜鉛結合性
システイン残基のうちの３つをアミノ酸置換のためにターゲティングした（図１
５中の配列番号１８）。このプロセスによって得られた他の配列もまた、有用な
結果を生じ得る。ヘリックス０−７配列変異体（図１１−配列番号９を参照）の
２つの変異体をヘリックス０−１配列（図１１−配列番号６を参照）で置換して
配列番号２０および２２を生成した。これら修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合
プロテアーゼ変異体もまた高度に可溶性であった。 プロテアーゼおよびプロテアーゼ：インヒビター複合体の構造研究のための上
記で得られたプロテアーゼ変異体の有用性を示すため、配列番号１８によってコ
ードされる修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを多次元ＮＭＲスペクトル（実施例
８および９）およびＸ線結晶学（実施例１０）により特徴付けた。
【００４４】 実施例８において、プロテアーゼのアポ形のＮＭＲスペクトルを用いて連続的
な骨格アサインメント（assignments）および側鎖ＮＭＲアサインメントを得た
。これらアサインメントは触媒性三つ組残基Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ８１およびＳｅ
ｒ１３９およびこれらに空間的に近接した残基を含んでおり、該タンパク質のア
ポ形のスペクトルが化学シフト摂動（perturbation）マッピングを用いて潜在的
なＮＳ３プロテアーゼインヒビターの付加の効果を分析するための有用な手段で
あることを示している。実施例９に示すように、刊行されたペプチド性ＨＣＶプ
ロテアーゼインヒビターの付加は、活性部位残基を含む残基についてプロテアー
ゼの１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルにおいて多くの化学シフト摂動を
引き起こす。このことは、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼおよびＨＣＶ ＮＳ３プロ
テアーゼ：インヒビター複合体の高品質ＮＭＲスペクトルの最初の刊行である。
本明細書において示すように、修飾プロテアーゼは、該プロテアーゼに結合する
化合物を同定するのに用いることができる高品質のＮＭＲスペクトルを生成する
。この化学シフトマッピング法を用いれば、種々の化合物を該プロテアーゼと混
合した一連のスペクトルを回収することにより、該プロテアーゼに結合する新規
な化合物を同定することができる。
【００４５】 実施例１０は、配列番号１８によってコードされる修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテ
アーゼが刊行されたＨＣＶプロテアーゼインヒビターとともに一夜で共結晶する
ことができ、その結果、２オングストロームまで回折する高品質結晶が得られる
ことを示す。このことはＸ線結晶学によって解析したＨＣＶ ＮＳ３プロテアー
ゼ：インヒビター複合体の最初の刊行であり、本発明の適用によって得られるタ
ンパク質がプロテアーゼインヒビターとの高品質共結晶を速やかに生成しうるこ
とを示している。さらに、高分解能構造は、ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合構築物がデザ
インしたＮＳ４ａ−ＮＳ３ポリペプチドセグメントの相対的な構造的位置付けを
与えることを証明している。
【００４６】 本発明の核酸分子はコドンの使用および分子生物学的方法に関する標準的な知
見、たとえば“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”（第２版、Sambrook
, FritchおよびManiatis 1989、コールド・スプリング・ハーバー・プレス）に
記載されたものを用いて当業者が作製できる。
【００４７】 本発明の核酸を含む本発明のベクターは、当業者が決定した適当なベクターを
用いて作製できる。そのようなベクターとしては、これらに限られるものではな
いが、ｐＢＲ３２２のようなベクター、およびｐＥＴ系列（Novagen）などの発
現ベクターが挙げられる。本発明のベクターは、たとえば“Molecular Cloning,
A Laboratory Manual”（第２版、Sambrook, FritchおよびManiatis 1989、コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス）に記載されているような標準的な分子
生物学的方法を用いて調製できる。
【００４８】 細菌、昆虫、植物、哺乳動物その他のようなあらゆる適当な宿主細胞を用いる
ことができる。タンパク質の発現および回収の条件は、たとえば、Methods in E nzymology , Vol. 306 (1999), p.19-42中のProtein Expression in Mammalian a
nd Insect Cell Systems, S. GeisseおよびH. P. Kocherに記載されている方法
を用いて当業者が決定できる。 本明細書中に引用したすべての文献を参照のため本明細書中に引用する。
【００４９】 実施例 以下の実施例は、本発明のある種の態様の製造および使用の仕方を説明するも
のである。これら実施例、発明の詳細な説明、および本明細書中に引用した文献
から、当業者は本発明のこれらの態様および他の態様の製造の仕方を容易に認識
することができる。これら実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、本発
明の範囲は特許請求の範囲によって記載される。
【００５０】 以下の実施例ではＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの標準的な残基番号付け（定義
において概略を示したように）を用いている。そのＮ末端に配列を付加する場合
もＮＳ３の番号付けはそのままであり、付加するＮ末端残基はしばしばマイナス
の番号付けとなる。示したすべてのタンパク質配列を図６に並べてある。
【００５１】実施例１ −親のＨＣＶプロテアーゼＤＮＡ配列 その後のすべての修飾の基礎として用いたＨＣＶ ＮＳ３コードＤＮＡは、配
列番号２（図９）に示すＨＣＶプロテアーゼ（残基１〜１８１）をコードする合
成遺伝子である。残基１〜１８１は、ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子産物のプロテアーゼ
活性を示す部分を含む。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のより長い断片を用いること
もできた。この合成遺伝子は、すべてのコドンが大腸菌中での高レベル発現のた
めに最適化されるように構築した。この構築物のタンパク質コード配列を配列番
号１（図９）に示す。このＨＣＶプロテアーゼタンパク質は大腸菌株ＢＬ２１（
ＤＥ３）（Novagen）中でベクターｐＥＴ２４ａ（Novagen）から発現させたとき
に高レベルで産生されるが、抽出物を分画した場合には該プロテアーゼは不溶性
の画分に存在する（データは示していない）。
【００５２】実施例２ −野生型ＮＳ４ａの親ＮＳ３へのリンカーを用いた融合 完全長ＨＣＶ ＮＳ４ａ配列の以下の部分をコードするプラスミドを構築した
：ＮＳ４ａ残基２１〜３１；Ｇ２１Ｓ２２Ｖ２３Ｖ２４Ｉ２５Ｖ２６Ｇ２７Ｒ２ ８ Ｉ２９Ｖ３０Ｌ３１（配列番号２６）。ＮＳ４ａ配列のこの部分をＨＣＶ Ｎ
Ｓ３プロテアーゼ配列（ＮＳ３ ＨＣＶプロテアーゼ配列５〜１８３）のアミノ
末端に融合した。ＮＳ４ａセグメントがＮＳ３セグメントにリンカー（Ａｓｎ
Ｇｌｙ、ａｋａ ＮＧ）により融合するように融合物を構築し、ＮＳ４ａ−ＮＳ
３融合部位にタンパク質配列...ＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＮＧＡＹＡＱＱ...を生
成した（図１０中の配列番号３を参照）。
【００５３】 ＮＳ４ａ−リンカー−ＮＳ３融合プロテアーゼのための発現プラスミドを、以
下の３つのＤＮＡ調製物の３方向（three-way）ライゲーションにより構築した
： （１）発現プラスミドのためのベクターはｐＥＴ２８ａ（Novagen）を改変した
ものであり、ｐＥＴ２８ａプラスミドＤＮＡをＸｈｏＩおよびＳａｌＩで二重消
化し、ついでライゲートして該ベクター中の両部位を破壊したものであった。得
られた改変ベクター（ｍｐＥＴ２８ａ）をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化
した。
【００５４】 （２）２つの合成５'リン酸化オリゴヌクレオチド（ＮＳ４ａセグメントおよび
リンカーセグメントをコード）をアニールしてＮｄｅＩおよびＸｈｏＩの粘着末
端を生成させた。
【化１】
【００５５】 （３）配列番号１からのＮＳ３コードＤＮＡを、ＸｈｏＩ部位をコードするサイ
レント変異を生成する下記オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅した。得られ
たＰＣＲ断片をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【化２】
【００５６】 この３方向ライゲーションのプラスミド生成物はＮＳ４ａ−ＮＳ３融合タンパ
ク質をコードする（図１０中の配列番号３；配列番号３を参照）。この融合タン
パク質は大腸菌中で発現させたときに高レベルで産生されるが、抽出物を分画し
た場合には該融合タンパク質は不溶性の画分に存在する（図４、レーン２＆３を
参照）。
【００５７】実施例３ −αヘリックス０の疎水性の溶媒露出残基を親水性の残基で置換した修
飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの大きなライブラリーの生成 実施例２で得たＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ配列（配列番号３）をＰＣＲ増幅
し、ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片として他の発現ベクター中に移した。この改変した
発現ベクター（図３に示す）はｐＥＴ２１（Novagen）に由来するものであり、
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ部位を挿入した改変Ｔｅｔリプレッサーを含む。こ
のベクターをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断し、上記ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片と
ライゲーションすると該プラスミドベクター中のｐＥＴ２１由来マルチプルクロ
ーニングサイト内のＸｈｏＩ部位が破壊された。
【００５８】 αヘリックス０中の５つの疎水性の溶媒露出残基（Ｌ１３、Ｌ１４、Ｉ１７、
Ｉ１８、およびＬ２１）を、偏（biased）コドン法を用いたターゲティング半無
作為突然変異誘発のために選抜した（Kamtekarら、Science 262, p1680-1685 [1
993]）。この方法において、「ＶＡＶ」コドン（Ｖ＝Ｇ、ＣまたはＡ）はすべて
親水性残基タイプ（Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＬｙｓ）
をコードする６つの可能なコドンの混合物をコードする。
【００５９】 ターゲティング半無作為突然変異誘発を、このオリゴヌクレオチド配列をＨＣ
Ｖ ＮＳ３プロテアーゼ配列のＰＣＲ増幅のための５'プライマーとして用いて行
った：
【化３】 上記においてＶ＝（ＧまたはＣまたはＡ）である。 ３'プライマーは、ＮＳ３プロテアーゼ終止コドンおよびＥｃｏＲＩ部位の下
流の部位で開始する（prime）ように用いた。ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化し、本実施例の最初に記載したＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ開裂ＨＣＶ
ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ発現ベクター中にライゲートした。
【００６０】 このようにして、変異した異なる親水性αヘリックス０配列を有する７７７６
（＝６５）の可能な独特の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのラ
イブラリーが得られた。ライゲーション混合物の一部を大腸菌株ＭＣ１０６１（
ＡＴＣＣ５３３８）中にエレクトロポレーションした。５０,０００を超える形
質転換体をプールし、プラスミドＤＮＡを単離した。 このライブラリーの構築のためのベクターとして用いたプラスミドは図３に図
解で表してあり、実施例４に記載する変異体選択実験と関連している。他の選択
もしくはスクリーニング法（誘導した形質転換体のホモジネートのＳＤＳ ＰＡ
ＧＥ分析によるスクリーニング［図４に記載したような］など）を用いる場合に
は、他のプラスミドベクターが適しているであろう。
【００６１】実施例４ −可溶性の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの細菌選択 細菌の選択系は図３に図解で表してある。この系は、変異誘発したＨＣＶプロ
テアーゼ遺伝子をコードするプラスミド（この場合、αヘリックス０変異を有す
る修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ）並びに修飾したＴｅｔリプ
レッサーをコードする遺伝子を特徴とする。Ｔｅｔリプレッサーの修飾は、Ｔｅ
ｔリプレッサータンパク質の溶媒露出ループ内へのＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ
開裂部位導入である。このプラスミドを有する株はまた、染色体上にコードされ
たＴｅｔプロモーターの制御下のクロラムフェニコールアセチラーゼトランスフ
ェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ−クロラムフェニコール耐性を付与する）をも有してい
る。ＩＰＴＧによる修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの（ｌａｃ
−Ｔ７制御下での）誘導後、該株は、該プロテアーゼ活性が存在する場合にはク
ロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）となり（修飾Ｔｅｔリプレッサーの開裂はＣ
ＡＴの発現を可能にする）、または融合プロテアーゼ活性が存在しない場合には
クロラムフェニコール感受性（ＣｍＳ）のままである（修飾Ｔｅｔリプレッサー
の開裂はなく、それゆえＣＡＴの抑制が存在する）。
【００６２】 この場合、発現された野生型ＨＣＶプロテアーゼは本来的に活性であるが、発
現されたプロテアーゼの不溶性の特性によって該活性がマスキングされ、その結
果、ＣｍＳの表現型となる。もしも変異誘発した形質転換体のプールの中でより
可溶性の活性な変異プロテアーゼが発現されたら、プロテアーゼの本来的な活性
は該変異体酵素の可溶性の性質によってマスキングされることはなく、この変異
体プロテアーゼを有する菌体はＣｍＲとなる。
【００６３】 この選択系での親のＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ（配列番号３
）の発現は、１μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む寒天プレート上で非常
にゆっくりとしか増殖しない大腸菌細胞を生成した。αヘリックス０変異体のラ
イブラリー（実施例３に記載）を大腸菌選択株に形質転換した。αヘリックス０
変異誘発した修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼをコードする多く
のプラスミドは、誘導した形質転換大腸菌細胞に対し、低レベルのクロラムフェ
ニコール（１〜３μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）を含むプレート上での向
上した増殖能を付与した。しかしながら、１２の形質転換体は非常に高レベルの
クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むプレート上で増殖した。これら
高度にＣｍＲの形質転換体をコロニー精製し、発現された変異体ＨＣＶ ＮＳ４
ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの溶解度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した（
図４に記載のものと同様）。これら形質転換体のうちの６つは他のものよりも可
溶性のプロテアーゼを示したので、プラスミドＤＮＡを調製し、シークエンシン
グした。これら単離物からの配列の関連する部分（ＮＳ３αヘリックス０セグメ
ントにより）を配列番号６〜１１（図１１を参照）に列記してある。
【００６４】 図４に示すように（レーン４＆５）、ヘリックス０−１配列を有する修飾ＨＣ
Ｖ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ（配列番号６および配列番号１２を参照
）の発現は可溶性画分に存在するタンパク質を生成したが、野生型のαヘリック
ス０配列を有する融合タンパク質は不溶性であった（レーン２＆３）。同様の溶
解度の向上は、他の５つのシークエンシングした変異体でも得られた。
【００６５】 同様の発現系を含む大腸菌細胞はＡＴＣＣに寄託してあり、ＡＴＣＣ受託番号
２０７０４７を得ている。ＡＴＣＣに提出した細胞と本発明で使用した細胞とは
、ＡＴＣＣ細胞がＣＭＶプロテアーゼおよびＴｅｔリプレッサー内のＣＭＶプロ
テアーゼ開裂部位を含むプラスミドを有する点、およびＣＡＴ遺伝子が染色体上
ではなく第二のプラスミド上に存在する点が異なる。当業者であればＡＴＣＣに
寄託した細胞のＣＭＶプロテアーゼ配列をＨＣＶプロテアーゼ配列で置換し、Ｔ
ｅｔリプレッサー遺伝子内にコードされたＣＭＶ開裂部位をＨＣＶプロテアーゼ
開裂部位に変えることにより、ＡＴＣＣに寄託した該細胞から本発明に有用な細
胞を作製することができるであろう。本発明に有用な細胞は、ＣＡＴ遺伝子を染
色体上ではなく第二の適合性のプラスミド上に有していてよい。
【００６６】 ＡＴＣＣ受託番号２０７０４７を有する細胞および本明細書で言及した細菌選
択系は、１９９９年１月８日に出願した米国特許出願第６０／１１５,２７０号
および本願と同日付けにて出願した米国特許出願第 （両出願を参照の
ため本明細書中に引用する）に一層詳細に記載されている。
【００６７】実施例５ −ＮＳ４ａ中の変化を含む修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテア
ーゼにおけるリンカーの最適化 プロテインデータバンクからの構造上の情報を用い、堅固な（tight）ターン
により連結された２つのβ鎖（残基ＮＳ４ａ残基Ｇ２７−Ｒ２８−Ｉ２９−Ｖ３ ０ −Ｌ３１およびＮＳ３残基Ａ５−Ｙ６−Ａ７−Ｑ８−Ｑ９に構造的に相同）を
有する構造上で特徴のあるタンパク質を同定した（Insight IIプログラム、Mole
cular Simulations Inc.におけるサーチループ（Searchloop）機能）。３つの異
なるターンタイプが同定され（ブルックヘブンプロテインデータベース（ＰＤＢ
）により、ファイル１ＯＰＢ［残基４５〜４８］、１ＬＩＤ残基１０９〜１１２
］、および１ＥＵＲ［残基１７７〜１８４］と例示）、これら３つのターンタイ
プの各々の８〜１２変異体をコードする３セットの縮重二本鎖オリゴヌクレオチ
ドを合成した。
【００６８】 ターンオリゴ＃１：
【化４】 ターンオリゴ＃２：
【化５】 ターンオリゴ＃３：
【化６】 上記において、Ｗ＝（Ａ,Ｔ）；Ｋ＝（Ｇ,Ｔ）；Ｍ＝（Ａ,Ｃ）；Ｒ＝（Ａ,Ｇ）
；Ｙ＝（Ｃ,Ｔ）
【００６９】 これら変異体（全部で２０の可能な配列の可能性）を、配列番号１３中のＥａ
ｇＩおよびＸｈｏＩ部位を用いて上記３つのオリゴを別個にサブクローニングす
ることにより実施例４からの最適化構築物中に導入した。 リンカー配列に加えて、ＮＳ４ａ配列内の単一の溶媒露出残基（Ｖａｌ３０）
を、このリンカー変異体の系列でイソロイシンかまたはアスパラギンのいずれか
とした。この残基位置は、ＨＣＶの野生型単離物では常に疎水性残基（通常、Ｖ
ａｌまたはＩｌｅ）である。それゆえ、この位置でのＡｓｎ置換は天然に存在し
ない置換である。対照的に、ＮＳ３残基７（Ａｌａ７）に対応する残基をアラニ
ンかまたはセリンのいずれかとしたが、これら残基タイプはともにＨＣＶの種々
の野生型単離物の該位置に存在する。セリンはアラニンよりも親水性であるので
、この溶媒露出位置のセリンはさらに溶解性を付与するであろう。
【００７０】 無作為に選んだ（picked）変異体修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテア
ーゼのプロテアーゼ発現レベルおよび溶解度を、誘導した細胞溶解液の可溶性画
分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりモニターした（図４の凡例で概略を示したのと
同じ手順）。１つのリンカー変異体（ターンオリゴ＃１の変異体の導入により得
られたもの）が、タンパク質発現レベルおよび溶解度の両者に関して残りのリン
カー変異体よりも明らかに良好であった。このリンカー配列（...Ｇ−４Ｒ−３
Ｉ−２Ｎ−１Ｌ０Ｓ１Ｇ２Ｄ３Ｔ４Ａ５Ｙ６Ａ７Ｑ８Ｑ９Ｔ１０...）およびそ
れから得られる修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼを配列番号１４
に示す。これはＮＳ４ａセグメント内にアスパラギン変異を導入しており（この
融合構築物では−１の番号、ＮＳ４ａ配列では３０の番号）、ＮＳ３位置７にア
ラニンを保持している。
【００７１】 図６は、配列番号１、３、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の
タンパク質配列のアラインメントを示す。図６からわかるように、配列番号１４
のリンカーセグメントは配列番号３および１２に用いた最初のリンカーに比べて
２残基だけ長い。 最適化ターン配列だけではＮＳ４ａ−ＮＳ３融合物に溶解性を付与するのに充
分ではない。このことは図４のレーン６＆７において認めることができ、野生型
のαヘリックス０と組み合せた最適化ターン（配列番号２４）は高い溶解性を付
与していない。αヘリックス０変異体の存在のみが、最適化ターン配列を伴って
または伴わずに（それぞれ、図４のレーン４＆５および８＆９を参照）、上澄み
液画分中の高レベルの融合プロテアーゼを可能とする。
【００７２】 しかしながら、図４に示す実験は発現されたタンパク質が可溶性画分に分画さ
れるか否かを示すのみである。構造研究のための構築物の安定性のより詳細な分
析をＮＭＲ（タンパク質の凝集状態を評価できる）を用いて行った。配列番号１
２および配列番号１４の１５Ｎ−標識タンパク質について１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱ
Ｃ ＮＭＲスペクトルを回収した。図５に示すように、配列番号１４のタンパク
質（パネルＢ−最適化リンカーと組み合せた変異体αヘリックス０）は配列番号
１２から製造したタンパク質（パネルＡ−非最適化リンカーと組み合せた変異体
αヘリックス０）に比べて高品質のＨＳＱＣスペクトルを生じる（ＮＭＲの線幅
および２Ｄピークの解析により判断されるように）。この分析は、実験５からの
最適化リンカーが修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの全体の溶解
度および非凝集性に有利に寄与することを示している。
【００７３】実施例６ −修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ中への天然に存在す
る疎水性残基の親水性残基への置換および非亜鉛結合性残基の非システインアミ
ノ酸への変化の導入 刊行された種々のＨＣＶ単離物（示していない）のＨＣＶ ＮＳ３部分のタン
パク質配列のアラインメントを検討したところ、これら種々の単離物で多くの残
基位置が変わっていることが示された。とりわけ、多数の溶媒露出表面残基位置
が、疎水性−親水性の特性において異なる多数の異なる天然に存在するアミノ酸
残基タイプを取ることができる。これら残基には、Ａｌａ３９（時にはＳｅｒ）
、Ａｌａ４０（時にはＴｈｒ）、Ｐｒｏ６７（時にはＳｅｒ）、Ｉｌｅ７２（時
にはＴｈｒ）、およびＰｒｏ８６（時にはＧｌｎ）が含まれる。
【００７４】 非必須システイン残基の置換は、タンパク質が酸化によってジスルフィド結合
した多量体を形成する傾向を低減することにより該タンパク質の生化学的特性を
改善する試みにおいて時に利用される方法である（たとえば、Yamazakiら、Prot
ein Science [1996] 5, 495-506）。予備実験は、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ内
の４つの非亜鉛結合性システインの各々の置換が酵素活性に対して最小の影響し
か及ぼさないことを示した（データは示していない）。タンパク質配列アライン
メントを検討したところ、所定の配列内で非亜鉛結合性システイン残基のうちの
２つ（Ｃｙｓ４７およびＣｙｓ５２）が、システインのペアとして一緒に現れる
か、またはともに非システイン残基タイプに変化している（ＨＣＶ ＮＳ３プロ
テアーゼ配列内でのそれらの空間的な配置と考え合わせると、この事実はこのペ
アがジスルフィド結合を形成しやすいことを示している）ことが示された。第３
の非亜鉛結合性システイン残基（Ｃｙｓ１５９）もまた、変異誘発のためにター
ゲティングした（この位置は検討した種々のＨＣＶ単離物で変異していないけれ
ども）。
【００７５】 この情報を用い、疎水性残基タイプの代わりに親水性残基タイプを置換する傾
向にて、選択した溶媒露出残基位置で代わりの残基タイプをコードする６つのオ
リゴヌクレオチドをデザインした。さらに、４つの非亜鉛結合性システイン残基
のうちの３つ（Ｃｙｓ４７、Ｃｙｓ５２およびＣｙｓ１５９）を非システイン残
基に変えた。表面オリゴ＃１（Ｐ８６Ｑ） ：
【化７】 表面オリゴ＃２（Ｐ６７Ｐ／Ｓ；Ｉ７２Ｑ）：
【化８】 表面オリゴ＃３（Ａ３９Ａ／Ｓ；Ａ４０Ｔ）：
【化９】 Ｃｙｓオリゴ＃１（Ｃ１５９Ｓ／Ｔ）：
【化１０】 Ｃｙｓオリゴ＃２（Ｃ４７Ｓ／Ｔ；Ｃ５２Ｌ／Ｍ）：
【化１１】 Ｃｙｓオリゴ＃３（Ａ３９Ａ／Ｓ；Ａ４０Ｔ；Ｃ４７Ｓ／Ｔ；Ｃ５２Ｌ／Ｍ）：
【化１２】 上記において、Ｗ＝（Ａ,Ｔ）；Ｋ＝（Ｇ,Ｔ）；Ｍ＝（Ａ,Ｃ）；Ｒ＝（Ａ,Ｇ）
【００７６】 Muta-Gene Phagemidキット（BioRad）を用い、dutung法（Kunkle, 1985）によ
り部位特異的変異を配列番号１３中に導入した。上記６つのオリゴヌクレオチド
を種々の組み合せで用いることにより変異体を生成させ、異なる変異の組み合せ
を有する別個のクローンセットを作製した。無作為に選んだ変異ＮＳ４ａ−ＮＳ
３融合プロテアーゼ変異体の発現レベルおよび溶解度を、誘導した細胞溶解液の
可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりモニターし（図４に示した分析と同様
）、上昇したプロテアーゼ溶解度を示したクローンの幾つかをシークエンシング
した。Ａ４０Ｔ、Ｉ７２Ｔ、Ｐ８６Ｑ変異体が溶解度に対して最も顕著な陽性効
果を有することがわかった。
【００７７】 これら変異を実施例５で生成した最適化リンカー配列と組み合せるため、Ａ４
０Ｔ、Ｉ７２Ｔ、Ｐ８６Ｑ表面変異体をコードするＤＮＡ配列を、Ｃ４７Ｓ、Ｃ
５２Ｌ、およびＣ１５９Ｓシステイン変異体を伴わずにおよび伴って配列番号１
５中にサブクローニングし、それぞれ配列番号１６（図１４）および配列番号１
８（図１５を参照）に示すタンパク質を作製した。図５のパネルＣに示した配列
番号１８から作製したタンパク質の２Ｄ １Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペク
トルは、このプロテアーゼ変異体が高度に非凝集性であり、高分解能ＮＭＲ構造
分析に適していることを明らかに示している。配列番号１９（これは配列番号１
８をコードするＤＮＡ配列である）を含むプラスミドを有する大腸菌細胞はＡＴ
ＣＣに寄託してあり、ＡＴＣＣ受託番号２０７０４０が付与されている。
【００７８】 配列番号１８に示したものと同様にして、実施例４で同定した他のαヘリック
ス０変異体配列を置換したさらなる修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテア
ーゼを構築した。変異体αヘリックス０−７（図１１において配列番号９として
同定）を置換し、配列番号２０（図１６を参照）および配列番号２２（図１７を
参照）を得た。配列番号２２は、さらに天然に起るアミノ酸置換（Ｃ１６Ｔ）を
含む他は配列番号２０と同じである。発現させたとき、これら修飾ＨＣＶ ＮＳ
４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼはともに配列番号１８に匹敵する溶解度を有し、
予測されるように、配列番号１８ホモログとは若干ことなるイオン交換媒体上で
のクロマトグラフィー特性を示した。２Ｄ １Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペ
クトルは、これらタンパク質変異体が配列番号１８のプロテアーゼと同様に折り
畳まれることを確認した（データは示していない）。配列番号２３（これは配列
番号２２をコードするＤＮＡ配列である）を含むプラスミドを有する大腸菌細胞
はＡＴＣＣに寄託してあり、ＡＴＣＣ受託番号２０７０４１が付与されている。
【００７９】実施例７ −大腸菌での発現および精製 すべての構築物を、ｐＥＴプラスミドベクター（Novogen）の一つを用いて大
腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）中で発現させた。タンパク質の発現は、
ｐＥＴ２８ａベクターを用いてポリヒスチジンタッグを付したタンパク質として
行うか、またはｐＥＴ２９ａベクターを用いてタッグなしのタンパク質として行
った。おそらく最適化した細菌コードの使用および大量の過剰産生のため、これ
ら構築物の発現は、予測された完全長のタンパク質産物の他に翻訳のリードスル
ー（readthrough）タンパク質産物という結果となった（〜１０−２０％）。３
つの終止コドンのセット（ＴＡＡ ＴＡＡ ＴＧＡ）を含むように発現ベクターを
修飾するとリードスルー産物が排除される結果となる（データは示していない）
。 ｐＥＴ２９ａベクター系（タグなし）での配列番号１９の発現から産生される
修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼについて、以下の２つの精製法
の概略を示す。しかしながら、当業者であれば容易に、本発明のＨＣＶ ＮＳ３
プロテアーゼの修飾形を精製するためにこれら手順を改変することができるであ
ろう。
【００８０】方法１ 配列番号１９からのタグなし変異体の発現を、最小細菌増殖培地中、菌体密度
がＯＤ６００＝１.０に達したときに０.３ｍＭ ＩＰＴＧで誘導させて行った。
培養液の誘導と同時にＺｎＣｌ２を最終濃度３０μＭで加え、菌体を２０℃に２
０時間移した。 遠心分離後、菌体のペレットを２５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７.５、０.５Ｍ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２中に再浮遊させ、菌体を高圧
ホモジナイザー（ＲＡＮＮＩモデル８.３０Ｈ）に通して破砕した。ホモジネー
トを１５,０００（SorvallモデルＳＳ３４ローター）ｒｐｍにて３０分間清澄化
し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ（
）を上澄み液に加えた。
【００８１】 室温で１０分間インキュベートした後、上澄み液を２５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液
、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２で２回希釈し、２５ｍＭリン酸Ｎａ ｐ
Ｈ７.５、０.２Ｍ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２で平衡化し
たMacro-Prep Sカラム（Bio-Rad、樹脂１ｋｇ）に適用した。ＯＤ２８０〜０.１
までカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を０.５Ｍ ＮａＣｌの同緩衝液で
溶出した。 溶出液をAmicon YM5膜上で濃縮し、２５ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ７.５、０.２Ｍ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＣｌ２で平衡化したSuperdex 30 26/6
0カラムに適用した。ＮＳ３ピークのフラクションをＳＰ Sepharose 26/10に適
用した。緩衝液ＡはSuperdex 30カラムと同じ緩衝液であった。緩衝液Ｂは１Ｍ
ＮａＣｌの同緩衝液である。タンパク質のピークは０.５〜０.６Ｍ ＮａＣｌで
溶出される。
【００８２】 結晶化のため、精製したタンパク質を０.５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＭＥＳ（
２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸）、ｐＨ６.５，１０％（ｖ／ｖ）グリ
セリン、２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中に交換し、５ｍＭ（〜１００ｍ
ｇ／ｍｌ）に濃縮できた。ＮＭＲ分光分析のため、このタンパク質を２５ｍＭリ
ン酸ナトリウムｐＨ６.５、５０ｍＭ硫酸ナトリウム、２ｍＭ重水素化ＤＴＴ、
および１０％Ｄ２Ｏ中に交換し、少なくとも３ｍＭに濃縮できた。 調製物の完全さ（integrity）は質量分析法により確認された。この精製法を
用いると、最終的な収量は一般に培養液１リットル当たり５０〜６５ｍｇの純粋
なタンパク質である。
【００８３】方法２ 結晶学のためのタンパク質のため、以下の改変プロトコールが容易に結晶化す
る（一夜）調製物を産生することがわかった。 ホモジナイザーで菌体を破砕した後（方法１と同様）、ホモジネートを１６,
０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた（SorvallモデルＳＳ３４）。上澄み
液をＰＥＩ（ポリエチレンイミン−０.２％最終）で２０分間、室温にて攪拌し
ながら処理した。得られた白色溶液を１６,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離に
かけ、上澄み液を硫酸アンモニウム（４０％）を用いて４℃で３０分間沈殿させ
た。この溶液を１０,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた。得られたペレ
ットを２５ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７.５、２ｍＭ ＤＴＴ、１０：Ｍ ＺｎＣｌ２
（培養液１リットル当たり１０ｍｌ）中に再懸濁し、再び１６,０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離にかけた。上澄み液を最初に、２５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐ
Ｈ７.５、０.２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０：Ｍ ＺｎＣｌ２で平衡化し
たSuperdex 75 26/60カラムに適用した。ついでピークのフラクションをＳＰ Se
pharose 26/10カラムに適用した。緩衝液ＡおよびＢは方法１と同じである。
【００８４】 ピークのフラクションをAmicon膜上で濃縮した後、２５ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ
７.５、２ｍＭ ＤＴＴ、１０：Ｍ ＺｎＣｌ２、無塩で平衡化したSuperdex 30 1
6/60にタンパク質を適用した。ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの最も純粋な側のフ
ラクションのみを回収し、プールした。 濃縮後（Millipore Ultrafree-5Kカットオフ）、タンパク質を２５ｍＭ ＭＥ
Ｓ緩衝液、ｐＨ６.５、０.５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０：Ｍ ＺｎＣｌ
２中に交換した。このタンパク質調製物は容易に濃縮でき、４℃で４ヶ月貯蔵後
でさえも容易に結晶を産生した（実施例１０に概要を記載するように）。
【００８５】実施例８ −修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのＮＭＲ分光分析 精製したタンパク質（方法１、実施例７を参照）をＮＭＲ緩衝液（２５ｍＭリ
ン酸ナトリウムｐＨ６.５、５０ｍＭ硫酸ナトリウム、２ｍＭ重水素化ＤＴＴ、
および１０％Ｄ２Ｏ）中に交換することにより、修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３
融合プロテアーゼをＮＭＲ分析のために調製した。リードスルー産物を含むプロ
テアーゼ試料もリードスルー産物を含まないプロテアーゼ試料もともに（実施例
７を参照）、実施例８および９の両者でＮＭＲ分光分析のために首尾よく用いる
ことができた。試料濃度は０.２ｍＭ〜３ｍＭの範囲であった。
【００８６】 Varian UNITY PLUS 600 MHz NMR分光分析計でWATERGATE HSQCパルス配列（Mor
iら、(1995), J. Magn. Reson. B108, 94-98; Sklenar, (1995) J. Magn. Res.
A114, 132-135）を用い、二次元１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを得
た。データの回収は、３０℃でＦＩＤ当たり４遷移（transients）および１２８
かまたは２５６の増分、Ｆ２（１Ｈ）およびＦ１（１５Ｎ）についてそれぞれ１
０.０および２.４ｋＨｚのスペクトル幅にて行った。
【００８７】 アポＨＣＶプロテアーゼ（配列番号１８）の二重標識（１３Ｃ−１５Ｎ）調製
物の１.５ｍＭ溶液を調製した。全セットのＮＭＲスペクトルを回収し、アポＨ
ＣＶプロテアーゼの骨格ＮＭＲ共鳴を決定するのに用いた。３Ｄ ＮＭＲ実験に
は、ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡＣＯ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡＣＯＮＨ、ＨＢＨＡＣＯ
ＮＨ、ＨＮＣＡＨＡ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、１５Ｎ−編集（edited）ＮＯＥＳ
Ｙおよび１３Ｃ−編集ＮＯＥＳＹが含まれていた（これら実験の参照文献として
はCloreおよびGronenborn, Meth. Enzymol. 239, 349-363 (1994)を参照）。
【００８８】 １８７の非プロリン残基のうちの１５５および１１のプロリン残基のうちの８
について、骨格ＮＭＲ共鳴が殆どの側鎖割り当て（assignments）とともに得ら
れた。これら割り当てには、触媒三つ組残基Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ８１、およびＳ
ｅｒ１３９およびこれら残基に空間的に近接した残基が含まれており、該タンパ
ク質のアポ形態がプロテアーゼ：インヒビター複合体のＮＭＲ分析のための良好
な試薬であることを示している。
【００８９】実施例９ −修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼとインヒビターとの
複合体のＮＭＲ １５Ｎ−標識ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ（配列番号１８）と
インヒビターペプチド（Ac-Asp-D-Glu-Leu-Ile-Cha-Cys-OH）（Ingallinellaら
、Biochemistry 37, 8906-8914 (1998)）との間の複合体を、これら２つの成分
（各２００μＭの濃度にて）の１：１複合体を実施例８に記載したＮＭＲ緩衝液
中で生成させることにより生成した。２Ｄ ＨＳＱＣスペクトルを回収した。ア
ポ形態およびペプチドと複合体を形成した可溶性の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ
３融合プロテアーゼ（配列番号１８）のＨＳＱＣスペクトルを図７で重ね合わせ
た。活性部位残基を含む多くの残基が、インヒビターの付加により化学シフト摂
動を蒙った。
【００９０】実施例１０ −修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼとインヒビターと
の複合体の結晶構造 実施例７の方法２により産生した修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテア
ーゼは、Ｘ線結晶学的研究を支えるのによく適している。この実施例では、タン
パク質調製物には１０〜２０％の翻訳リードスルー産物（実施例７を参照）が含
まれていた。これら調製物は、インヒビターとの複合体の結晶を一夜で生成し、
２.１オングストローム分解能までのインヒビターとの該複合体の構造を生成し
た。
【００９１】 ペプチドインヒビターAc-Asp-D-Glu-Leu-Ile-Cha-Cys-OH［ＩＣ５０＝１５ｎ
Ｍ、Ingallinellaら、Biochemistry 37, 8906-8914 (1998)）]と複合体を形成し
た可溶性の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの結晶を、標準hangi
ng-drop蒸気拡散法により室温で成長させた。タンパク質溶液：室温で２時間イ
ンキュベートした０.５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６.５、１０％（ｖ
／ｖ）グリセリン、２ｍＭ ＤＴＴ、および５.６４ｍＭのインヒビター（６×モ
ル過剰）中の２１.６ｍｇ／ｍｌタンパク質。リザーバー溶液：２Ｍ硫酸アンモ
ニウム、０.１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４.６、１％（ｖ／ｖ）ＰＥＧモノエチル
エステル３５０、５ｍＭ塩化亜鉛。小滴はタンパク質とリザーバー溶液との等容
量のアリコートからなっていた。結晶はこれら条件下で一夜で得られた。
【００９２】 結晶をその小滴から取り、グリセリン中で２０％（ｖ／ｖ）としておいた少量
のリザーバー溶液に入れた。これをHamptonピン中にマウントした標準Hamptonフ
ァイバーループ（fiber loop）で抜き取り、直ちにOxford Cryosystems低温装置
からの１００Ｋ窒素流中に導入した。 この結晶から、２オングストローム分解能までのデータをＲ−ＡＸＩＳＩＩ検
出器を備えた回転陽極源（ＣｕＫ（）上で回収した。完全性（completeness）は
２０−２オングストローム分解能からは９４％、外殻（２.０７−２.００オング
ストローム）では６４％であり、Ｒ（symm）は全体および外殻でそれぞれ９.１
％および３９.７％であった。 この結晶からのＸ線回折は空間群Ｐ４１２１２を示し、単位格子パラメータは
ａ＝ｂ＝６７.１、ｃ＝８１.２オングストロームであり、非対称格子当たり１つ
の分子である。
【００９３】 構造の解析は、その座標がプロテインデータバンクに登録されている［１ＪＸ
Ｐ.ｐｄｂ、Protein Sci. 7, 837-847 (1998)に記載］、以前に報告されたＨＣ
Ｖプロテアーゼ：ＮＳ４ａ複合体の構造に基づき、標準分子置換法をＮＳ４ａ−
ＮＳ３融合サーチモデルに適用して行った。２０.０−２.１オングストロームの
分解能およびＦ／((Ｆ)＞１.０からのデータを用いたＸＰＬＯＲによる構造の精
密化は、１９.７％のＲ因子および２７.６％のＲフリーで停止した。本モデルは
、（１）約１２０の水分子を含み、そのうち約２／３は自動ルーチンによって付
加されたものであり、電子密度マップではチェックされていなかった、（２）密
度が鮮明でない０−４および８７−８９のループについてはモデル化残基が欠如
している、そして（３）側鎖のコンホメーションは、幾つかのものが見出された
が、代わりのコンホメーションを含んでいない。
【００９４】 全体のインヒビターの電子密度は明確に判明でき、そのコンホメーションおよ
び該タンパク質上の結合サイトのコンホメーションも明確に定められ、それゆえ
該構造はドラッグデザインの目的に直ちに有用なものになっている。インヒビタ
ーマップの優良性は図８に見てとることができる。該インヒビターは専ら活性部
位のＰ部位に結合し、そのＣ末端側のカルボン酸は古典的セリンプロテアーゼ活
性部位のオキシアニオンホール（oxyanion hole）に対応するポケットに結合す
る。活性部位以外では、亜鉛イオンは９７、９９および１４５のシステインの側
鎖により、および水分子により配位されているが、後者のリガンドについては疑
問である。この水のＢ因子は２オングストローム２まで精密化され、この位置で
の差（difference）マップに大きな残留ピークが存在するので、結晶液の他の成
分が存在すると思われ、本発明者らはそれをクロライドイオンとして精密化した
。 上記実施例は例示のためのものであって、特許請求の範囲を限定するものでは
ない。
【００９５】引用文献
【表２】
【００９６】
【表３】
【００９７】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＣＶプロテアーゼのαヘリックス０（残基１３〜２１）のらせ
ん回転（helical wheel）表示。太字の残基は溶媒に露出される。（上）野生型
αヘリックス０のアミノ酸配列；（左）野生型αヘリックス０；（右）αヘリッ
クス０変異体におけるアミノ酸置換（Ｘ＝Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａ
ｓｐ、またはＡｓｎ）（実験３および４を参照）。
【図２】 修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの構築の図解。
これら図解では、ＮＳ４ａ（残基２１〜３１）をＮＳ３のＮ末端にリンカーを介
して融合させている。「Ｘ」は配列番号３と比しての配列変化を示す。「Ｎ」お
よび「Ｃ」は、それぞれ構築物のＮ末端およびＣ末端を示す。
【図３】 可溶性のＨＣＶプロテアーゼ変異体を得るための細菌選択スキー
ムの図解。この系の詳細な記載は実施例４を参照。（中央）発現プラスミド（Ｈ
ＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼおよび修飾したＴｅｔリプレッサーを
発現）および染色体によりコードされたＴｅｔプロモーター−ＣＡＴ（クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子融合物；（右）ＮＳ３プロテ
アーゼが不溶性の場合（該プロテアーゼの不溶性のために活性はマスキングされ
、クロラムフェニコール感受性の細菌という結果となる）；（左）ＮＳ３プロテ
アーゼが可溶性の場合（プロテアーゼは活性であり、その結果、クロラムフェニ
コール耐性細菌となる）。
【図４】 種々のＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合タンパク質構築物の発現の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。プラスミド含有菌体をＯＤ６００−０.７まで増殖させ
、１０ｍｌの培養液を０.２５ｍＭ ＩＰＴＧで２０℃にて２０時間誘導した。卓
上遠心管（microfuge）中での遠心分離（１５００ｒｆｃ）により菌体を回収し
、菌体ペレットを１ｍｌの２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.５；０.５
Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０：Ｍ ＺｎＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０：
ｇ／ｍｌ ＤＮアーゼ中に浮遊させ、パルスモード、パワー５にて１分間、２回
、超音波処理した。ホモジネートを卓上遠心管中、最大速度（２０８００ｒｆｃ
）にて２０分間、回転沈降させた（spun down）。ホモジネートおよび上澄み液
を１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャスト（pre-cast）ゲル（Bio-Rad）上
で分析した。レーン１、分子量標準。以下の試料が、それぞれホモジネートと上
澄み液とのペアとしてある：レーン２＆３、親の融合（配列番号３）；レーン４
＆５、ヘリックス０−１変異のみ（配列番号１２）；レーン６＆７、最適化リン
カーのみ（配列番号２４）；レーン８＆９、最適化リンカーとヘリックス０−１
変異（配列番号１４）。
【図５】 修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ±最適化リンカ
ーのＮＭＲ分析。１５Ｎ標識した変異体ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテア
ーゼ（すべてヘリックス０−１配列を有し［図１１、配列番号６を参照］、実施
例７に概略を示したようにして精製した）について２Ｄ １Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ
スペクトルが得られた。パネルＡ−非最適化リンカーを有する（実施例４、配列
番号１２を参照）；パネルＢ−最適化リンカーを有する（実施例５、配列番号１
４を参照）；パネルＣ−最適化リンカーと、Ａ４０Ｔ、Ｉ７２Ｔ、Ｐ８６Ｑ、Ｃ
４７Ｓ、Ｃ５２Ｌ、Ｃ１５９Ｓ変異とを有する（実施例６、配列番号１８を参照
）。
【図６】 配列番号１、３、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２
４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。点刻を施した太字は、配列番号１に
比して変異した残基の位置を示す。
【図７】 アポ形およびペプチドインヒビターとの複合体を形成した、最適
化リンカーを有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ（配列番号
１８）の重ね合わせたＮＭＲ １Ｈ−１５Ｎ ＮＨＳＱＣスペクトル（実施例９参
照）。アポ−プロテアーゼ（薄い灰色の線）、ペプチドと複合体を形成したプロ
テアーゼ（濃い黒色の線）。
【図８】 ペプチドインヒビターと複合体を形成した修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ
−ＮＳ３融合プロテアーゼ（配列番号１８）の電子密度マップの一部（実施例１
０参照）。ペプチドインヒビターの２つの残基を示してある：Ｃｙｓ１およびＣ
ｈａ２。
【図９】 親の非融合野生型ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ配列のアミノ酸配
列（配列番号１）および該アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２）。
【図１０】 最初のＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ配列のアミ
ノ酸配列（配列番号３）および該アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号
４）。
【図１１】 野生型ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのαヘリックス０領域のア
ミノ酸配列（配列番号５）、および細菌選択スキームにおいて高レベルのクロラ
ムフェニコールに対して耐性の種々の可溶性修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合
プロテアーゼのαヘリックス０領域（それぞれ、ヘリックス０−１、ヘリックス
０−３、ヘリックス０−７、ヘリックス０−８、およびヘリックス０−１０）の
アミノ酸配列（配列番号６〜１１）（実施例４参照）。
【図１２】 αヘリックス０変異体配列ヘリックス０−１を有する修飾ＨＣ
Ｖ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号１２）および
該アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号１３）。
【図１３】 αヘリックス０変異体配列ヘリックス０−１および最適化リン
カー配列を有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのアミノ酸配
列（配列番号１４）および該アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号１５
）。
【図１４】 αヘリックス０変異体配列ヘリックス０−１、最適化リンカー
配列および表面変異を有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼの
アミノ酸配列（配列番号１６）および該アミノ酸配列をコードする核酸配列（配
列番号１７）。
【図１５】 αヘリックス０変異体配列ヘリックス０−１、最適化リンカー
配列、表面変異およびシステイン変異を有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融
合プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）および該アミノ酸配列をコード
する核酸配列（配列番号１９）。
【図１６】 αヘリックス０変異体配列ヘリックス０−７、最適化リンカー
配列、表面変異およびシステイン変異を有する修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融
合プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）および該アミノ酸配列をコード
する核酸配列（配列番号２１）。
【図１７】 αヘリックス０変異体配列ヘリックス０−７、最適化リンカー
配列、表面変異、システイン変異およびＣ１６Ｔ変異を有する修飾ＨＣＶ ＮＳ
４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号２２）および該アミノ
酸配列をコードする核酸配列（配列番号２３）。
【図１８】 野生型αヘリックス０配列および最適化リンカー配列を有する
修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号２４
）および該アミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２５）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:93 //(Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティーブン・ウェインハイマー アメリカ合衆国06472コネチカット州ノー スフォード、フット・ヒル・ロード30番 (72)発明者 ヤクン・ジャン アメリカ合衆国18966ペンシルベニア州ホ ランド、パドック・ウェイ29番 (72)発明者 バレンティナ・ゴールドファーブ アメリカ合衆国08823ニュージャージー州 フランクリン・パーク、エドワード・ドラ イブ26番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA05 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 4B050 CC04 DD01 FF09 FF12 FF17 LL01 4B065 AA26X AA96Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ中の疎水性αヘリックス０アミ
    ノ酸残基の親水性アミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む修飾ＨＣＶ Ｎ
    Ｓ３プロテアーゼ。
  2. 【請求項２】 該疎水性αヘリックス０アミノ酸残基が、Ｌｅｕ１３、Ｌｅ
    ｕ１４、Ｉｌｅ１７、Ｉｌｅ１８、およびＬｅｕ２１よりなる群から選ばれたも
    のである、請求項１に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  3. 【請求項３】 該ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼが配列番号１に示すＨＣＶ Ｎ
    Ｓ３のアミノ酸配列のおよそ残基１〜１８１を含む、請求項１に記載の修飾ＨＣ
    Ｖ ＮＳ３プロテアーゼ。
  4. 【請求項４】 αヘリックス０中のものでない疎水性アミノ酸残基の親水性
    アミノ酸残基への少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１に記載の修飾Ｈ
    ＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  5. 【請求項５】 非亜鉛結合性システイン残基の非システインアミノ酸残基へ
    の少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プ
    ロテアーゼ。
  6. 【請求項６】 Ｌｅｕ１３のＧｌｕへの置換、Ｌｅｕ１４のＧｌｕへの置換
    、Ｉｌｅ１７のＧｌｎへの置換、Ｉｌｅ１８のＧｌｕへの置換、およびＬｅｕ２ １ のＧｌｎへの置換よりなる群から選ばれた少なくとも１つの置換を含む、請求
    項２に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  7. 【請求項７】 Ｌｅｕ１３のＧｌｕへの置換、Ｌｅｕ１４のＧｌｎへの置換
    、Ｉｌｅ１７のＧｌｎへの置換、Ｉｌｅ１８のＬｙｓへの置換、およびＬｅｕ２ １ のＨｉｓへの置換よりなる群から選ばれた少なくとも１つの置換を含む、請求
    項２に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  8. 【請求項８】 Ｌｅｕ１３のＧｌｕへの置換、Ｌｅｕ１４のＧｌｕへの置換
    、Ｉｌｅ１７のＧｌｎへの置換、Ｉｌｅ１８のＧｌｎへの置換、およびＬｅｕ２ １ のＧｌｕへの置換よりなる群から選ばれた少なくとも１つの置換を含む、請求
    項２に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  9. 【請求項９】 Ｌｅｕ１３のＡｓｎへの置換、Ｌｅｕ１４のＧｌｎへの置換
    、Ｉｌｅ１７のＧｌｕへの置換、Ｉｌｅ１８のＬｙｓへの置換、およびＬｅｕ２ １ のＧｌｕへの置換よりなる群から選ばれた少なくとも１つの置換を含む、請求
    項２に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  10. 【請求項１０】 Ｌｅｕ１３のＧｌｕへの置換、Ｌｅｕ１４のＧｌｎへの置
    換、Ｉｌｅ１７のＡｓｐへの置換、Ｉｌｅ１８のＧｌｕへの置換、およびＬｅｕ ２１ のＧｌｕへの置換よりなる群から選ばれた少なくとも１つの置換を含む、請
    求項２に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  11. 【請求項１１】 Ｌｅｕ１３のＧｌｕへの置換、Ｌｅｕ１４のＧｌｕへの置
    換、Ｉｌｅ１７のＧｌｕへの置換、Ｉｌｅ１８のＧｌｎへの置換、およびＬｅｕ ２１ のＧｌｕへの置換よりなる群から選ばれた少なくとも１つの置換を含む、請
    求項２に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  12. 【請求項１２】 Ｌｅｕ１３、Ｌｅｕ１４、Ｉｌｅ１７、Ｉｌｅ１８、およ
    びＬｅｕ２１が親水性アミノ酸残基に置換されている、請求項２に記載の修飾Ｈ
    ＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ。
  13. 【請求項１３】 ＨＣＶ ＮＳ４ａもしくは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａに融合した
    請求項１に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを含む、修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ
    −ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  14. 【請求項１４】 該ＨＣＶ ＮＳ４ａが配列番号２６に示す完全長ＨＣＶ Ｎ
    Ｓ４ａのおよそ残基２１〜３１を含む、請求項１３に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ４
    ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  15. 【請求項１５】 該修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａを形成すべく変化させたＨＣＶ Ｎ
    Ｓ４ａが配列番号２６に示す完全長ＨＣＶ ＮＳ４ａのおよそ残基２１〜３１を
    含む、請求項１３に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  16. 【請求項１６】 さらにリンカーを含む、請求項１３に記載の修飾ＨＣＶ
    ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  17. 【請求項１７】 該リンカーが最適化リンカー配列を含む、請求項１６に記
    載の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  18. 【請求項１８】 該ＨＣＶ ＮＳ４ａまたは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａが該修飾Ｈ
    ＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのアミノ末端に連結している、請求項１３に記載の修
    飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  19. 【請求項１９】 該最適化リンカー配列がＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ
    であり、該配列中のＳｅｒはＨＣＶ ＮＳ４ａの残基Ｓｅｒ３２に対応し、Ｔｈ
    ｒはＨＣＶ ＮＳ３の残基Ｔｈｒ４に対応するものである、請求項１７に記載の
    修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  20. 【請求項２０】 該修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａが疎水性アミノ酸残基の親水性ア
    ミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む、請求項１３に記載の修飾ＨＣＶ
    ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  21. 【請求項２１】 ＮＳ４ａの残基３０が親水性アミノ酸残基に置換されてい
    る、請求項２０に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  22. 【請求項２２】 該親水性アミノ酸残基がＡｓｎである、請求項２１に記載
    の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  23. 【請求項２３】 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１
    ８、配列番号２０、および配列番号２２よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を
    含む、請求項１３に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
  24. 【請求項２４】 請求項１に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼをコー
    ドするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  25. 【請求項２５】 請求項１３に記載の修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３プロテ
    アーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  26. 【請求項２６】 配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１
    ９、配列番号２１、および配列番号２３よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を
    含む、請求項２５に記載の核酸分子。
  27. 【請求項２７】 該核酸分子がＡＴＣＣ培養受託番号２０７０４０の細胞に
    含まれるプラスミドの全部または一部を含む、請求項２５に記載の核酸分子。
  28. 【請求項２８】 該核酸分子がＡＴＣＣ培養受託番号２０７０４１の細胞に
    含まれるプラスミドの全部または一部を含む、請求項２５に記載の核酸分子。
  29. 【請求項２９】 請求項２４、２５または２６に記載のヌクレオチド配列に
    相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  30. 【請求項３０】 請求項２４、２５、２６または２９に記載の核酸分子を含
    むベクター。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
  32. 【請求項３２】 ＡＴＣＣ培養受託番号２０７０４０によって定められる細
    胞。
  33. 【請求項３３】 ＡＴＣＣ培養受託番号２０７０４１によって定められる細
    胞。
  34. 【請求項３４】 （ａ）修飾ＮＳ３プロテアーゼが産生されるように適当な
    条件下で請求項１に記載の宿主細胞を培養し、ついで （ｂ）かくして産生された修飾ＮＳ３プロテアーゼを回収する ことを含む、修飾ＮＳ３プロテアーゼの製造方法。
  35. 【請求項３５】 （ａ）修飾ＮＳ４ａ−ＮＳ３プロテアーゼが産生されるよ
    うに適当な条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養し、ついで （ｂ）かくして産生された修飾ＮＳ４ａ−ＮＳ３プロテアーゼを回収する ことを含む、修飾ＮＳ４ａ−ＮＳ３プロテアーゼの製造方法。
  36. 【請求項３６】 界面活性剤の不在下で３０ｍｇ／ｍｌを超える溶解度を有
    する、修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼまたは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合
    プロテアーゼ。
  37. 【請求項３７】 ＮＭＲ分光分析に使用できる修飾ＨＣＶ ＮＳ３プロテア
    ーゼまたは修飾ＨＣＶ ＮＳ４ａ−ＮＳ３融合プロテアーゼ。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016199898A1 (ja) * 2015-06-10 2016-12-15 公立大学法人 富山県立大学 活性型変異酵素の製造方法および新規活性型変異酵素、並びに可溶性化変異タンパク質の製造方法
JP2018513390A (ja) * 2015-03-27 2018-05-24 オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッドＯｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｃｖ ｎｓ４ａ／改変されたｎｓ３ポリペプチド及びその使用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050074465A1 (en) * 1999-11-24 2005-04-07 Michael Houghton HCV fusion proteins with modified NS3 domains
US6986892B1 (en) 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
US7491808B2 (en) * 2000-06-15 2009-02-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV non-structural protein mutants and uses thereof
WO2003064406A1 (en) * 2002-01-07 2003-08-07 Sequoia Pharmaceuticals Resistance-repellent retroviral protease inhibitors
KR20050086843A (ko) * 2002-11-26 2005-08-30 트리펩 아베 증강인자 성분으로서의 ｃ형 간염 바이러스 비구조 단백질4ａ(ｎｓ4ａ)
US7871625B2 (en) * 2004-08-27 2011-01-18 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV multiple epitope fusion antigens with modified proteolytic cleavage sites and uses thereof
US7625724B2 (en) * 2005-08-25 2009-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System MAVS in the prevention and treatment of viral diseases
CN113330520A (zh) 2018-12-04 2021-08-31 华盛顿大学 用于控制蛋白质功能和相互作用的试剂和方法
EP3947432A4 (en) 2019-03-29 2023-01-18 Trustees of Boston University CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) MODULATION
WO2021009692A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Medimmune Limited Tripartite systems for protein dimerization and methods of use
US11572565B2 (en) 2020-07-21 2023-02-07 Trustees Of Boston University Inducible control of gene expression

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE270326T1 (de) 1990-04-04 2004-07-15 Chiron Corp Protease von hepatitis-c-virus
IT1272179B (it) 1994-02-23 1997-06-16 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodologia per riprodurre in vitro l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 del virus hcv.
US5843752A (en) 1995-05-12 1998-12-01 Schering Corporation Soluble active hepatitis C virus protease
IT1277914B1 (it) 1995-08-22 1997-11-12 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per produrre - in forma pura e in quantita' elevate - polipeptidi con l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 di hcv, e
US6153579A (en) 1996-09-12 2000-11-28 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Crystallizable compositions comprising a hepatitis C virus NS3 protease domain/NS4A complex
IT1285158B1 (it) 1996-09-17 1998-06-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Polipeptidi solubili con l'attivita' di serino-proteasi di ns3 del virus dell'epatite c, e procedimento per la loro preparazione e il

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018513390A (ja) * 2015-03-27 2018-05-24 オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッドＯｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｃｖ ｎｓ４ａ／改変されたｎｓ３ポリペプチド及びその使用
JP2020129001A (ja) * 2015-03-27 2020-08-27 オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッドＯｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｃｖ ｎｓ４ａ／改変されたｎｓ３ポリペプチド及びその使用
WO2016199898A1 (ja) * 2015-06-10 2016-12-15 公立大学法人 富山県立大学 活性型変異酵素の製造方法および新規活性型変異酵素、並びに可溶性化変異タンパク質の製造方法
US10730909B2 (en) 2015-06-10 2020-08-04 Toyama Prefectual University Method of producing an active-form mutant enzyme
JP2020188807A (ja) * 2015-06-10 2020-11-26 公立大学法人 富山県立大学 活性型変異酵素の製造方法および新規活性型変異酵素、並びに可溶性化変異タンパク質の製造方法
US11312747B2 (en) 2015-06-10 2022-04-26 Toyama Prefectural University Method of producing an active-form mutant enzyme
JP7076150B2 (ja) 2015-06-10 2022-05-27 公立大学法人 富山県立大学 活性型変異酵素の製造方法および新規活性型変異酵素、並びに可溶性化変異タンパク質の製造方法

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