JP2000506395A

JP2000506395A - 界面活性剤を含まないｃ型肝炎プロテアーゼ

Info

Publication number: JP2000506395A
Application number: JP10515836A
Authority: JP
Inventors: サルダーナ，ビノド・ブイ; ブルー，ジエフリー・テイー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-23
Publication date: 2000-05-30
Also published as: WO1998013482A1; CA2265512A1; EP0931141A2; AU4590297A

Abstract

(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のプロテアーゼを、界面活性剤を用いずに精製する。このプロテアーゼは抗ＨＣＶ薬をスクリーニングする手段として、またＨＣＶ感染に起因する疾患を診断する手段としても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】界面活性剤を含まないＣ型肝炎プロテアーゼ発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は世界中の献血者の０．５〜８．０％に見出される。この感染は６０％より高率の感染者において慢性となるので、Ｃ型肝炎は公衆衛生上及び経済上重大な問題である。慢性Ｃ型肝炎の患者の扱いは複雑であり、この疾患はしばしば症状が微弱にしか現われず、かつゆっくり進行するか、感染から２０年後には患者の２０％が肝硬変を発症し、そのうちの１０％は肝細胞癌を発症する。前記癌は肝移植の重要な指標でもある。ヨーロッパ及び日本には、Ｂ型肝炎患者やＨＩＶ感染者よりも慢性Ｃ型肝炎患者の方が多数存在する。既存の抗ウイルス薬は、優れた応答を引き出し得るとはいえ少数の患者にしか有効でない。ＨＣＶに対処する場合の重要な一標的に、ＨＣＶによってコードされるプロテアーゼである非構造タンパク質３が有る。ヒトＣ型肝炎ウイルスに関連するこのＮＳ３プロテアーゼは、高濃度の界面活性剤が存在しないと不安定なタンパク質である。ＮＳ３プロテアーゼを生化学的、動力学的及び生物物理学的分析に十分な量、並びに抗ウイルス物質スクリーニングアッセイに十分な量まで安定化するには、イオン性または非イオン性界面活性剤を精製と分析との両方において用いなければならない。界面活性剤で処理したＮＳ３タンパク質を用いて発見された従来の抗ウイルス物質は有用でない。更に、大量の界面活性剤が存在することは、生化学的、動力学的及び生物物理学的分析の結果の正確な解釈において重大な難点となる。場合によっては（例えば沈降、タンパク質結晶化などの時）、界面活性剤の存在は生化学的、動力学的及び生物物理学的分析を妨ける。従来技術による方法ではＮＳ３の精製に界面活性剤及びグリセロールを用いた。本発明者は界面活性剤を用いないＮＳ３精製方法を発見したが、この方法では５〜約２０％、好ましくは７〜１２％のグリセロールを用い、高い安定性及び活性を達成できる。得られる酵素はこのプロテアーゼに関して知られている触媒活性を上回る触媒活性を示し、即ち酵素の形態次第で従来技術による調製物の１０〜５００倍の活性を有する。本発明の方法により精製すれば、ＮＳ３プロテアーゼは確実に高安定性となり、その結果前記プロテアーゼには界面活性剤不在下でも動力学的、生化学的及び生物物理学的分析を施せるようになる。従来技術による方法では、酵素学的、生化学的及び生物物理学的研究に用いる、界面活性剤を含まない安定なＮＳ３は得られない。大腸菌中にクローン化したプラスミドから適正に発現させ、かつ調製すれば、ＮＳ３プロテアーゼは界面活性剤を全く存在させなくてもミリグラム単位で得られる。得られる酵素はきわめて可溶性で、かつ長期間（４℃で数週間から数カ月間、−８０℃で１２カ月を越えて）安定であり、また高い触媒活性を示す。界面活性剤を不含ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを用いるアッセイは、抗ＨＣＶ薬をスクリーニングする手段として、またＨＣＶ感染に起因する疾患を診断する手段としても有用である。抗ＨＣＶ薬の効力は、ナノモル以下濃度からマイクロモル濃度までであり得る。発明の概要界面活性剤を含まないＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３プロテアーゼを調製し、このタンパク質の阻害剤を求めるスクリーニングアッセイを構築する。界面活性剤不含ＮＳ３プロテアーゼは、抗ＨＣＶ薬をスクリ−ニングする手段として、またＨＣＶ感染に起因する疾患を診断する手段としても有用である。発明の詳細な説明略号とその定義：ＨＣＶＣ型肝炎ウイルスＩＰＴＧイソプロピル−Ｄ（−）チオガラクトピラノシドＮＳ３Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質３ＰＭＳＦフェニルメチルスルホニルフルオリドＥＤＴＡエチレンジアミノ−四酢酸ＤＴＴジチオトレイトールｒ．ｐ．ｍ．毎分回転数ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルＳＤＳドデシル硫酸ナトリウムＮＳ非構造（性）ＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィー本発明はその一構成において、界面活性剤を含まないＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを提供する。本発明はその別の構成において、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物を検出するスクリーニングアッセイを提供する。本発明はその更に別の構成において、請求項２に記載のスクリーニングアッセイによって測定される、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物も提供する。本発明はその更に別の構成において、活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いずに精製する方法も提供する。本発明は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼ、もしくはＮＳ３としても知られるＣ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質３であって界面活性剤を含まない安定なものを開示する。このＮＳ３プロテアーゼは、抗ＨＣＶ薬をスクリーニングする手段として、またＨＣＶ感染に起因する疾患を診断する手段としても有用である。ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの一用途に、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物を検出するスクリーニングアッセイが有る。このアッセイは、（a）アッセイするべき１種以上の化合物を所定量用意するステップ、（b）前記化合物をＨＣＶＮＳ３プロテアーゼアッセイにおいて、界面活性剤を含まないＨＣＶＮＳ３プロテアーゼと共にインキュベートするステップ、（c）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ基質開裂アッセイにおいて前記プロテアーゼの阻害を確認するステップを含む操作を有する。ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを実質的に阻害する化合物も本発明に包含される。本発明は、活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いず、かつ５〜約２０％のグリセロールを用いて精製する方法にも係わり、この方法は（a）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを発現させる細胞を所定量用意するステップ、（b）前記細胞を破壊して、界面活性剤を含有しない緩衝液を媒質とする懸濁液を製造するステップ、（c）前記懸濁液を遠心して微粒子物質を除去するステップ、（d）ステップ(c)で得られた土清についてイオン交換クロマトグラフィーの一つ以上の操作ステップを、溶離緩衝液が界面活性剤を含有しないという条件下に実施するステップ、（e）界面活性剤を含有しない緩衝液中に活性なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを得るステップを含む。活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いず、かつ７〜約１２％のグリセロールを用いて精製する本発明の方法の一具体例は、（a）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを発現させる細胞を所定量用意するステップ、（b）前記細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）で破壊して、界面活性剤を含有しない緩衝液中の懸濁液を製造し、その際前記緩衝液のｐＨを約６．５〜約７．５とするステップ、（c）前記懸濁液を約５０００〜約８０００ｒ．ｐ．ｍ．で約１５分間遠心して微粒子物質を除去するステップ、（d）ステップ(c)で得られた上清に対してカチオン交換クロマトグラフイーの一つ以上の操作ステップを、溶離緩衝液が塩濃度勾配またはｐＨ勾配下に、かつ界面活性剤を含有しないという条件下に実施するステップ、（e）界面活性剤を含有しない緩衝液中に活性なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを得るステップ、を含む。Ｃ型肝炎ウイルスの、ＮＳ３プロテアーゼとしても知られる非構造タンパク質３は活性形態において、酵素としてかまたは補因子との複合体として存在し得る。本発明者は、前記複合体が酵素単独より約１０００倍高活性であることを発見した。本発明の酵素はそれ自体で、界面活性剤を用いて精製された従来技術による調製物より約１０倍高活性である。本発明のスクリーニングアッセイにはあらゆる活性形態が包含される。組み換え発現系におけるＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの発現外来遺伝子を発現させる細胞の調製は今や、比較的単純な技術である。前記細胞は宿主として機能し、その例には大腸菌、枯草菌、酵母、真菌、植物細胞や動物細胞などが有る。このような宿主細胞の多くに用いられる発現ベクターが単離及び特性解明されており、本発明ではそのようなベクターを、所望の外来ＤＮＡ挿入部分を有するベクターを通常の組み換えＤＮＡ技術によって構築する際に出発物質として用いる。ＤＮＡ挿入部分の発現に用いる宿主細胞から天然には得られないＤＮＡはいずれも外来である。外来ＤＮＡ挿入部分は染色休外性遺伝体のプラスミド上で発現するか、または該挿入部分の全体もしくは一部が宿主細胞の染色体に組み込まれた後に発現し得、または２個以上の分子形態の組み合わせとして事実上宿主細胞内に存在し得る。所望の外来ＤＮＡの発現に用いる宿主細胞及び発現べクターの選択は主として、宿主細胞の入手しやすさ及び栄養条件の厳しさの程度、宿主細胞が発現べクターの複製を補佐するかどうか、及び当業者に容易に理解できる他の要因によって左右される。組み換え原核生物発現系に関する技術は古くからの通常技術である。典型的な宿主細胞は大胞菌である。この技術は、Ｒ．Ｗｕ（編），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８，１９７９及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等，“Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｔｙＭａｎｕａｌ，”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２などの論文に解説されている。本発明で用いる外来ＤＮＡ挿入部分は本発明のＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ（またはその安定な機能性突然変異体）をコードするＤＮＡ配列を含み、この配列には前記のようなコーディング能力を有するいずれかの合成配列もしくはクローン化配列、またはそれらの組み合わせが含まれる。例えば、完全に組み換えられたＤＮＡ配列によってコード及び発現されるＨＣＶペプチドは本発明に包含される。組み換えＨＣＶ作製のための真核生物発現系を構築するのに有用なベクターは、ＨＣＶまたはその変異体をコードするＤＮＡ配列を、該配列に作用性に連結したプロモーター及び／またはオペレーターなどの適当な転写活性化ＤＮＡ配列と共に含む。その他の典型的な構成要素に、適当なリボソーム結台部位、終結コドン、エンハンサー、ターミネーター、またはレプリコン要素が含まれ得る。これらの付加的な構成要素は、制限エンドヌクレアーゼ消化及び連結などの通常のスプライシング技術によってベクターの１個以上の適当な部位に挿入することができる。組み換え真核生物発現系の一種である酵母発現系には通常Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、組み換えタンパク質発現用に特に選出した種として用いる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び類似酵母はＧＡＰ４９１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２及びα接合因子を非限定的に含めた、酵母発現系の構築に有用である良く知られたプロモーターを有する。ＨＣＭＶ発現のための組み換え酵母発現系を構築するのに有用な酵母ベクターには、シャトルベクター、コスミド、キメラプラスミド、及び２μ環状プラスミドに由来する配列を有する酵母ベクターが非限定的に含まれる。上記のようなベクターにＨＣＶをコードする適当なＤＮＡ配列を挿入し、このようにして得られた改変ベクターを適当な宿主細胞に形質転換または他の手段によって移入すれば、原則としてＨＣＶのための有用な組み換え酵母発現系が得られる。或る好ましい発現系には、ポリヒドリンプロモーターまたはｐ１０プロモーターの制御下にバキュロウイルスを用いる。この発現技術の背景説明としては、例えばＤ．Ｒ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等“ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，”Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２を参照されたい。上記発現系では、所期の遺伝子を保持する組み換えバキュロウイルスを単離する。バキュロウイルス系は２種以上のタンパク質の同時発現に特に有用である。本発明の接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を得るべく組み換えＨＣＶを作製する別の手段に、組み換え哺乳動物発現系が有る。宿主哺乳動物細胞は通常、細胞培養において効率的にクローン化されているいずれかの細胞とし得る。組み換え哺乳動物発現系の構築に有用な宿主哺乳動物細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＧＨ３、ＣＯＳ、マウスＣ１２７またはマウスＬ細胞が非限定的に含まれる。哺乳動物発現ベクターはウイルスベクターか、ＳＶ４０、ＢＰＶもしくは他のウイルスレプリコンを有し得るプラスミドベクターか、または動物細胞のためのレプリコンを有しないベクターに基づき得る。哺乳動物発現ベクターについては、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ（編），“ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，”Ｖｏｌｓ．Ｉ及びII，ＩＲＬ，１９８５の諸論文で詳細に検討されている。組み換えＨＣＶはアデニル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、ミリストイル化、アミノ末端もしくはカルボキシル末端または両末端の延長または短縮といった、有機合成された同じぺプチドには無い望ましい付加的構造変更を有し得る。付加的な構造変更は、組み換え発現系を適宜選択することにより場合に応じて選択したり、優先させたりすることができる。他方、組み換えＨＣＶの配列は有機合成の原理及び手法で延長可能である。精製界面活性剤を用いない本発明の精製方法では、組み換え体であるとないとを問わず実質的にいずれのＮＳ３プロテアーゼ源も使用に適する。好ましいＮＳ３プロテアーゼ源は組み換え体であり、最も好ましいのは大腸菌を用いた発現系である。発現系の場合、組み換え体であろうとなかろうと、まずＮＳ３を可溶性画分中に単離しなければならない。ＨＣＶプロテアーゼを発現させる細胞を緩衝液中で破壊し、それによって緩衝液を媒質とする懸濁液を製造する。細胞の破壊は、フレンチプレス、マイクロフルイダイザー、音波処理器等での処理や、リゾチームの誘導発現による自己消化を非限定的に含めた、良く知られた様々な技術のうちのいずれかで行なう。好ましい細胞破壊技術の一つが、マイクロフルイダイザーでの処理である。界面活性剤を用いない精製方法の全体を通じて、いずれの緩衝液のｐＨも約６．５〜約７．５に維持することが重要である。次のステップでは細胞破片の懸濁液の初期分画を行なう。懸濁液を処理して可溶性画分を粒状物質から分離するか、または可溶性タンパク質を不溶性タンパク質から実質的に分離する他の操作を実施する。適当な技術には、約５０００〜約８０００ｒ．ｐ．ｍ．で約１５分間実施する遠心、濾過、または例えば（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄を用いる塩沈澱が非限定的に含まれる。これらの初期分画操作は良く知られており、また多くの変更を加えられると理解される。ＮＳ３の初期分画に加えられる適当な変更は十分に当分野の技術の範囲内である。好ましい初期分画法は遠心である。細胞破片の懸濁液の初期分画によって上清と、沈澱物もしくは不溶性ペレットとが得られる。上清を更に処理する。得られた上清にイオン交換クロマトグラフィーの一つ以上の操作ステップ、及び場合によってはゲル濾過を施し、それによって実質的に純粋なＮＳ３を、界面活性剤を含有しない緩衝液中に得る。好ましいイオン交換体には、ポリスチレンを基体とするカチオン交換体、デキストランを基体とするカチオン交換体、アガロースを基体とするカチオン交換体、セルロースを基体とするカチオン交換体、またはヘパリンが非限定的に含まれる。カチオン交換体のカチオン交換基は典型的には強酸または弱酸性側鎖残基である。イオン交換体を塩濃度勾配及び／またはｐＨ勾配下に洗浄してＮＳ３プロテアーゼを特異的に溶離する。好ましい溶離条件は塩濃度勾配である。上記イオン交換クロマトグラフィーは、実質的に純粋なＮＳ３プロテアーゼが得られるまで繰り返したり変更したりできる。典型的には、カチオン交換クロマトグラフィーを２回行なう。好ましい貯蔵条件には、本発明の酵素を−８０℃において２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０％のリセロール、１０ｍＭのＤＴＴ及び約３００ｍＭの塩化ナトリウム中に〜１５μＭまたはそれ以上の濃度で存在させることが含まれる。実施例１ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの発現分子生物学分野の当業者に知られた方法を用いて、ＢＫ株ＨＣＶポリペプチドのアミノ酸１０２７〜１２０６をコードするプラスミドＤＮＡを、Ｔ７ファージの遺伝子１０タンパク質の最初のＡＴＧと読み取り枠を構成するＴ７−７ベクターの下流にクローン化し、それによってプラスミドｐＴ７−７（ＮＳ３₁₀₂₇ _〜12 ₀₆ ）を得た。本明細書に参考として含まれる１９９５年８月３１日付公開の国際特許出願公開第９５／２２９８５号を参照されたい。プラスミドｐＴ７−７で大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３ｐｌｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、熱ショック技術を用いてトランスフェクトした。細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で３７℃で増殖させ、６００ｎｍにおける光学密度が０．４〜０．６となったところで温度を２５℃に低下させ、４００μＭのＩＰＴＧでＮＳ３の発現を誘導した。細胞を更に２時間増殖させ、その後遠心によって回収し、溶菌まで−８０℃で貯蔵した。実施例２界面活性剤不在下でのＨＣＶＮＳ３プロテアーゼの精製１０Ｌ培養物から得た細胞を４℃において１００ｍｌの溶菌緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁させ、３０分間２０ｍＭのＭｇＣｌ₂中で０．０２ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ（IIＳ型；ＢｏｖｉｎｅＰａｎｃｒｅａｓＳｉｇｍａ）で処理した。懸濁液にＰＭＳＦ（１ｍＭ）を添加し、直ちに細胞を６ｂａｒの圧力で６回マイクロフルイダイザーに通すことにより破壊した。溶解物を１００００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心し、上清を回収して、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ中で予め平衡させたカチオン交換カラム（Ｈｉ−ＬｏａｄＳＰ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラム）に流量２．５ｍｌ／分で上方から導入した。カラムからＮＳ３プロテアーゼを、濃度勾配０Ｍ→１ＭのＮａＣｌ塩中に溶離した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＮＳ３プロテアーゼを含有する画分を貯溜し、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ緩衝液を含有する緩衝液で８〜１０倍に稀釈してから、タンデム接続された２個の４×５ｍｍヘパリンカラムに流量３ｍｌ／分で上方から導入した。濃度勾配を有するＮａＣｌで上記酵素を溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びペプチド開裂アッセイで分析した。純粋なＮＳ３プロテアーゼを９５％より高率で含有する酵素画分を貯溜し、４℃で溶離緩衝液中に貯蔵した。精製酵素の収量は大腸菌細胞培養物１Ｌ当たり１〜２ｍｇであった。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ４７０Ａ型気相配列決定装置を用いて、Ｎ末端配列をエドマン分解法により解析した。プロテアーゼ濃度を定量的アミノ酸分析によって確認した。実施例３ＨＣＶＮＳ３基質開裂アッセイＮＳ４Ａ／４Ｂ開裂部位に似せたペプチド［７−メトキシクマリン−４−アセチル−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ−（ε−ＮＨＣＯＣＨ₃）及びアセチル−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ−（ε−ＮＨＣＯＣＨ₃）］をＥｎｚｙｍｅＳｙｓｔｅｍｓＰｒｏｄｕｃｔｓ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）から購入した。該ペプチドの純度は９５％を上回っていた。アセチル−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ−（ε−ＮＨＣＯＣＨ₃）ペプチドはそのＣ末端にリシンを付加することによって高濃度可溶性とされており、また７−メトキシクマリン−４−アセチル−ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＰＹＫ−（ε−ＮＨＣＯＣＨ₃）ペプチドのＮ末端には生成物の検出を促進するべくクマリン発螢光分子（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）が導入されていた。ＮＳ４Ｂ／５Ａ基質の７−メトキシクマリン−４−アセチル−ＥＤＡＳＴＰＣＳＧＳ−Ｎｐｈ−Ｌ（Ｎｐｈ＝パラ−ニトロフェニルアラニン）はＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購人した。配列ＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＲＫＫを有する４ＡペプチドもＥｎｚｙｍｅＳｙｓｔｅｍｓＰｒｏｄｕｃｔｓの市販合成品とした。様々な量のグリセロール、好ましくは０〜５０％のグリセロールの存在下に１００μＬの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）反応緩衝液、１０ｍＭＤＴＴ中で２５℃においてペプチド開裂アッセイを行なった。１００μｌの５％リン酸で反応を停止させ、混合物を４．６×５０ｍｍＶｙｄａｃＣ−１８カラム上での逆相ＨＰＬＣによって分析した。開裂生成物を、０．１％リン酸／アセトニトリル濃度勾配を用いて分離し、反応生成物を代表する真正ペプチドと保持時間を比較することによって同定した。ＮＳ４Ａ／４Ｂの開裂は予測どおり、切断されやすいＣｙｓ−Ａｌａ結合において生起した。生成物のＵＶ吸光度を２２０ｎｍで監視し、また３２８ｎｍ及び３９３ｎｍにそれぞれ設定した励起波長及び発光波長を用いて螢光検出を行なった。このアッセイで用いた酵素濃度は、所望の反応条件に応じて２ｎＭから１０００ｎＭまで非限定的に変更した。例えば、４Ａペプチドが存在する時は酵素濃度を２〜０ＯｎＭとし、前記ペプチド不在の時は３００〜１０００ｎＭとした。補因子として４Ａペプチドを用いるアッセイでは、反応開始前に酵素を４Ａペプチドと共に約０〜１０℃の温度で５〜１０分間、次いで濃度を１０〜５０倍に高めて室温で３〜１０分間予備インキュベートした。酵素を４Ａペプチドと共に予備インキュベートする場合、既に４Ａペプチドを含有する溶液に酵素を添加した。用いた４Ａペプチド及び基質の濃度はそれぞれ非限定的に７５ｎＭから５０μ Ｍ及び０．１〜２５０μＭとした。いずれの基質も、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭのＤＴＴ及び１０％のグリセロールに溶解させた。反応は典型的には、初期反応速度及び生成物の有効検出度に応じて２．５〜１５分間継続させた。初速度（加水分解量が基質総量の５％に達しない時点の速度）対基質濃度の関係をミカエリスーメンテンの式に当て嵌めることによって、定常状態の反応速度論パラメーター（ｋ_cat及びＫ_M）を求めた。初速度及び定常状態条件は、行なったいずれの反応アッセイでも厳密に維持されていた。本明細書ではここまで、本発明の原理を、解説のための実施例を提示しながら教示したが、本発明の実施は本明細書中に開示した操作及びプロトコルの、以下の請求の範囲各項とその均等物から逸脱しない普通の変更、適合、変形、削除または付加を総て包含すると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項【提出日】１９９８年３月９日（１９９８．３．９）【補正内容】請求の範囲１．界面活性剤を含まない安定なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ。２．ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物を検出するスクリーニングアッセイであって、（a）アッセイするべき１種以上の化合物を所定量用意するステップ、（b）前記化合物をＨＣＶＮＳ３プロテアーゼアッセイにおいて、請求項１に記載のＨＣＶＮＳ３プロテアーゼと共にインキュベートするステップ、（c）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼアッセイにおいて前記プロテアーゼの阻害を確認するステップを含む操作を有するアッセイ。３．活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いずに精製する方法であって、（a）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを発現させる細胞を所定量用意するステップ、（b）前記細胞を破壊して、界面活性剤を含有しない緩衝液を媒質とする懸濁液を製造するステップ、（c）前記懸濁液を遠心して微粒子物質を除去するステップ、（d）ステップ(c)で得られた上清についてイオン交換クロマトグラフイーの一つ以上の操作ステツップを、溶離緩衝液が界面活性剤を含有しないという条件下に実施するステップ、（e）界面活性剤を含有しない緩衝液中に活性なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを得るステップを含む方法。４．活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いずに精製する方法であって、（a）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを発現させる細胞を所定量用意するステップ、（b）前記細胞をマイクロフルイダイザーで破壊して、界面活性剤を含有しない緩衝液を媒質とする懸濁液を製造し、その際前記緩衝液のｐＨを約６．５〜約７．５とするステップ、（c）前記懸濁液を約５０００〜約８０００ｒ．ｐ．ｍ．で約１５分間遠心して微粒子物質を除去するステップ、（d）ステップ(c)で得られた上清についてカチオン交換クロマトグラフィーの一つ以上の操作ステップを、溶離緩衝液が塩濃度勾配またはｐＨ勾配を有し、かつ界面活性剤を含有しないという条件下に実施するステップ、（e）界面活性剤を含有しない緩衝液中に活性なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを得るステップを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ブルー，ジエフリー・テイーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．界面活性剤を含まない安定なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ。２．ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物を検出するスクリーニングアッセイであって、（a）アッセイするべき１種以上の化合物を所定量用意するステップ、（b）前記化合物をＨＣＶＮＳ３プロテアーゼアッセイにおいて、請求項１に記載のＨＣＶＮＳ３プロテアーゼと共にインキュベートするステップ、（c）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼアッセイにおいて前記プロテアーゼの阻害を確認するステップを含む操作を有するアッセイ。３．請求項２に記載のスクリーニングアッセイによって測定される、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物。４．活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いずに精製する方法であって、（a）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを発現させる細胞を所定量用意するステップ、（b）前記細胞を破壊して、界面活性剤を含有しない緩衝液を媒質とする懸濁液を製造するステップ、（c）前記懸濁液を遠心して微粒子物質を除去するステップ、（d）ステップ(c)で得られた上清についてイオン交換クロマトグラフィーの一つ以上の操作ステップを、溶離緩衝液が界面活性剤を含有しないという条件下に実施するステップ、（e）界面活性剤を含有しない緩衝液中に活性なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを得るステップを含む方法。５．活性なＮＣＶＮＳ３プロテアーゼを、界面活性剤を用いずに精製する方法であって、（a）ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを発現させる細胞を所定量用意するステップ、（b）前記細胞をマイクロフルイダイザーで破壊して、界面活性剤を含有しない緩衝液を媒質とする懸濁液を製造し、その際前記緩衝液のｐＨを約６．５〜約７．５とするステップ、（c）前記懸濁液を約５０００〜約８０００ｒ．ｐ．ｍ．で約１５分間遠心して微粒子物質を除去するステップ、（d）ステップ(c)で得られた上清についてカチオン交換クロマトグラフィーの一つ以土の操作ステップを、溶離緩衝液が塩濃度勾配またはｐＨ勾配を有し、かつ界面活性剤を含有しないという条件下に実施するステップ、（e）界面活性剤を含有しない緩衝液中に活性なＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを得るステップを含む方法。