ES2446249T3 - Inhibición de la interación entre hif-1a y p300/cbp con hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno - Google Patents

Abstract

Un péptido de la Fórmula (I) que tiene una o más α-hélices estables, internamente restringidas:**Fórmula** en donde R1 es un aminoácido, un péptido, -OR4, -CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, R4 es alquilo o arilo; o R1 tiene la fórmula:**Fórmula** en donde A5 es un péptido, un residuo de aminoácido, un grupo acilo, o hidrógeno; y cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo; es un enlace sencillo carbono-carbono o un enlace doble carbono-carbono que puede ser cis o trans; cada n es independientemente 1 o 2; R2 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; m es cualquier entero positivo; A3 es **Fórmula** en donde R9 es una cadena lateral de aminoácido; (i) A1 es Thr; A2 es Ser o Ala; A3 es Tyr o Ala; y A4 comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7, en donde X1 es Asp o Asn,X2 es Val, Cys, o Ala, X3 es Glu o Gln, X4 es Val o Tyr, X5 es Asn o Arg, X6 es Ala, y X7 es Arg o está ausente;o (ii) A1 y A2 son independientemente Glu o Gln; A3 es Leu; y A4comprende la fórmula LRX8LX9, donde L es Leu, R esArg, X8 es Ala o Tyr, y X9 es Asp o Asn; y R3 es un péptido, -OR6, -N(R7)2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R6 es un grupo alquilo o un grupoarilo, y cada R7 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo; yen donde el péptido modula la interacción entre entre C-TAD de HIF-1α y el dominio CH1 de p300/CBP.

Description

Inhibición de la interación entre hif-1a y p300/cbp con hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El papel de las interacciones del Coactivador HIF-1a- en la regulación de la transcripción de VEGF

La interacción entre el dominio 1 rico en cisteína-histidina ("CH1") de la proteína coactivadora p300 (o la proteína de unión homóloga CREB, CBP) y el dominio de transactivación C-terminal ("C-TAD," aa 786-826 de número de acceso NCBI NP 001521) del factor 1a inducible por hipoxia ("HIF-1a") (Freedman y otros, "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1a," Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 99:5367-72 (2002); Dames y otros, "Structural Basis for HIF-1a/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response,"Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)) media la transactivación de genes inducibles por hipoxia (Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006); Semenza, "Targeting HIF-1 for Cancer Therapy," Nat. Rev. Cancer 3:721-32 (2003)). Los genes inducibles por hipoxia son importantes contribuyentes en la angiogénesis y metástasis de cáncer, como se muestra en las Figuras 1A-C (Orourke y otros, "Identification of Hypoxically Inducible mRNAs in HeLa Cells Using Differential-display PCR," Eu. J Biochem. 241 :403-10 (1996); Ivan y otros, "HIFa Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing," Science 292:464-8 (2001)). Bajo normoxia, la subunidad a de HIF-1 se hidroxila sucesivamente en los residuos de prolina 402 y 564 por prolina hidroxilasas, se une a ubiquitina, y después se degrada por el sistema ubiquitina-proteosoma, como se muestra en la Figura 2. Este proceso, mediado por la proteína supresora de tumor von Hippel-Lindau (Kaelin, "Molecular Basis of the VHL Hereditary Cancer Syndrome," Nat. Rev. Cancer 2:673-82 (2002)), es responsable de controlar los niveles de HIF-1a y, como resultado, la respuesta transcripcional a la hipoxia (Maxwell y otros, "The Tumour Suppressor Protein VHL Targets Hypoxia-inducible Factors for Oxygen-dependent Proteolysis," Nature 399:271-5 (1999)). Bajo condiciones hipóxicas, HIF-1a ya no es objeto de la destrucción y se acumula. La heterodimerización con su socio de unión expresado constitutivamente, el translocador nuclear del receptor de aril hidrocarburo ("ARNT") (Wood y otros, "The Role of the aril Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression," J Biol. Chem. 271: 15117-23 (1996)) resulta en la unión a un elemento de respuesta a la hipoxia cognado ("HRE") (Forsythe y otros, "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1," Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)). Un tercer sitio de hidroxilación regulatoria en asparagina 803 se inhibe también bajo condiciones hipóxicas (Lando y otros, "FIH-I is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor," Genes & Develop. 16:1466-71 (2002)), lo que permite el reclutamiento de coactivadores de p300/CBP, que disparan la sobreexpresión de genes inducibles por hipoxia, como se muestra en la Figura 2. Entre estos genes que codifican los péptidos angiogénicos tales como el factor de crecimiento vascular endotelial ("VEGF") y los receptores de VEGF VEGFR-I (Flt-1) y VEGFR-2 (KDR/Flk-1), así como también las proteínas involucradas en el metabolismo energético alterado, tal como los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3, y hexoquinasas 1 y 2 (Forsythe y otros, "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxiainducible Factor 1," Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996); Okino y otros, "Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter," J Biol. Chem. 273:23837-43 (1998)).

Metabolitos fúngicos de epiditiodicetopiperazina como reguladores de la transcripción inducible por hipoxia

Debido a que la interacción del C-TAD de HIF-1a con el coactivador transcripcional p300/CBP es un punto de amplificación significativa en la respuesta transcripcional, su ruptura con los ligandos proteicos diseñados podría ser un medio efectivo de supresión de la glicólisis aeróbica y angiogénesis (es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos) en cánceres (Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006); Ramanathan y otros, "Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements," Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 102:5992-7 (2005); Underiner y otros, "Development of factor de crecimiento vascular endotelial Receptor (VEGFR) Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy," Curr. Med. Chem. 11:73145 (2004)). Aunque la superficie de contacto del C-TAD de HIF-1a con p300/CBP es extensa (3393 Å2) la inhibición de esta interacción proteína-proteína puede no requerir interferencia directa. En lugar de ello, la inducción de un cambio estructural a una de las parejas de unión (p300/CBP) puede ser suficiente para interrumpir el complejo (Kung y otros, "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004)).

Aunque en el pasado se demostró que era difícil la inhibición de las interacciones nucleares proteína-proteína con pequeñas moléculas (Arkin & Wells, "Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions: Progressing Towards the Dream," Nat. Rev. Drug Discov. 3:301-17 (2004)), selecciones recientes de ligandos de proteínas de alta afinidad han resultado en varios logros notables (Kung y otros, "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004); Issaeva y otros, "Small Molecule RITA Binds a p53, Blocks p53-HDM-2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors," Nat. Med. 10: 1321-8 (2004); Lepourcelet y otros, "Small-molecule Antagonists of the

Oncogenic Tcf/�-Catenin Protein Complex," Cancer Cell 5:91-102 (2004); Vassilev y otros, "In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2," Science 303:844-8 (2004); Grasberger y otros, "Discovery and Cocrystal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells," J Med. Chem. 48:909-12 (2005);Ding y otros, "Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors," J Am. Chem. Soc. 127:10130-1 (2005); Berg y otros, "Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embryo Fibroblasts,"Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 99:3830-5 (2002); Publicación Internacional de la patente núm. WO 2006/066775 de De Munari y otros). Dos moléculas pequeñas, caetocina 1 (Hauser y otros, "Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin," Helv. Chirn. Acta 53(5):1061-73 (1970)) (mostradas en la Figura 3A) y quetomina 2 (Waksman & Bugie, "Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties," J. Bacteriol. 48:527-30 (1944)) (mostrado en la Figura 3B), han demostrado inhibir la interacción entre el C-TAD de HIF-1a y p300/CBP y atenuar la transcripción inducible por hipoxia, aunque el mecanismo exacto de esta inhibición no está claro (Kung y otros, "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004)). A pesar de informes iniciales alentadores, se necesita fomentar el diseño de inhibidores de la vía HIF1, porque ambos 1 y 2 han inducido la necrosis coagulativa, anemia, y leucocitosis en animales de experimento. Podría ser deseable identificar otros inhibidores de la vía HIF-1 que carezcan o tengan efectos colaterales disminuidos. Chapman y otros, Organic Letters, 5825-5828 (2006) describe la síntesis en fase sólida asistida por microondas de a-hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno y análogos por metatesis con cierre de anillo. La solicitud de patente japonesa 2008096423 describe un método para determinar cuantitativamente una unión entre un péptido HIF-1aC-terminal marcada con una sustancia fluorescente y una CBP o proteína P300 y un método de selección. La solicitud de patente de Estados Unidos 2006/014675A1 se relaciona con un método para preparar un péptido que tiene una alfa-hélice estable, restringida internamente, hoja beta/giro beta, región helicoidal 310, o helicoidal pi y que estabilizan tales estructuras dentro de una estructura peptídica. Henchey y otros, Current Opinion in Chemical Biolog, 692-697 (2008) revisa estrategias para la estabilización de péptidos en la conformación a-helicoidal. Kung y otros, Nature Medicine, 1335-1340 (2000) da a conocer un método de supresión del crecimiento del tumor a través de la interrupción de la transcripción inducible por hipoxia.

La presente invención se dirige a superar estas y otras deficiencias de la técnica.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un péptido que tiene uno o más a-hélices internamente restringidas, estables, en donde el péptido comprende una secuencia que imita la hélice aA o hélice aB del dominio de transactivación C-terminal del Factor 1a inducible por hipoxia. En una modalidad, el péptido es un péptido de fórmula I:

en donde

es un enlace carbono-carbono sencillo o doble, donde el doble enlace carbono-carbono es cis o trans; cada n es independientemente 1 o 2; m es cero o cualquier entero positivo; R1 es un aminoácido, un péptido, -OR4, -CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R4 es alquilo o arilo;

o R1 tiene la fórmula:

en donde A5 es un péptido, un residuo de aminoácido, un grupo acilo, o hidrógeno; y cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un alquilo, o un grupo arilo; R2 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; R3 es un aminoácido, un péptido, -OR6, -N(R7)2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R6 es un grupo alquilo o un grupo arilo y cada R7 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo;

A1, A2 y A4 son cada uno independientemente:

en donde cada R8 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; y A3 es

10 en donde cada R9 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, en donde

(i) A1 es Thr; A2 es Ser o Ala; A3 es Tyr o Ala; y A4 comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7, en donde X1 es Asp o Asn, X2 es 15 Val, Cys, o Ala, X3 es Glu o Gln, X4 es Val o Tyr, X5 es Asn o Arg, X6 es Ala, y X7 es Arg o está ausente; o

(ii) A1 y A2 son independientemente Glu o Gln; A3 es Leu; y A4comprende la fórmula LRX8LX9, donde L es Leu, R es Arg, X8 es Ala o Tyr, y X9 es Asp o Asn.

En otra modalidad, el péptido se selecciona del grupo que consiste en:

20 5 y

10 en donde m y n son independientemente 1 o 2; y X es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo.

En una modalidad, m y n son 1. En otra modalidad, m es 1 y n es 2. En otra modalidad, m es 2 y n es 1. En aún otra modalidad, m y n son 2.

15 En algunas modalidades, un péptido de la invención imita al péptido al menos en los residuos 796-804 o residuos 816-823 del dominio de transactivación C-terminal del Factor 1a inducible por hipoxia.

En otro aspecto, la invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un péptido de la invención 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente se describe un método para reducir la transcripción de un gen en una célula, en donde la transcripción del gen está mediada por la interacción del Factor 1a inducible por hipoxia con la proteína de unión a CREB y/o p300, dicho método comprende poner en contacto la célula con un péptido de conformidad con la reivindicación 1 bajo condiciones

25 efectivas para reducir la transcripción del gen. En algunas modalidades, el gen se selecciona del grupo que consiste en adenilato quinasa 3, aldolasa A, aldolasa C, enolasa 1, transportador de glucosa 1, transportador de glucosa 3, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa 1, hexoquinasa 2, factor de crecimiento tipo insulina 2, proteína de unión a IGF 1, proteína de unión a IGF 3, lactato dehidrogenasa A, fosfoglicerato quinasa 1, piruvato quinasa M, p21, factor de crecimiento transformante 3, ceruloplasmina, eritropoyetina, transferrina, receptor de transferrina, receptor a1B

30 adrenérgico, adrenomedulina, endotelina-1, hemo oxigenasa 1, oxido nítrico sintasa 2, inhibidor 1 del activador de plasminógeno, factor de crecimiento vascular endotelial, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor FLT-1, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor KDR/Flk-1, y p35srg.

En la presente se describe un método para tratar o prevenir en un sujeto que lo necesita un trastorno mediado por la

35 interacción del Factor 1a inducible por hipoxia con la proteína de unión a CREB y/o p300, dicho método comprende administrar a un sujeto un péptido de la invención bajo condiciones efectivas para tratar o prevenir el trastorno. En algunas modalidades, el trastorno se selecciona del grupo que consiste en isquemia de la retina, hipertensión pulmonar, retraso del crecimiento intrauterino, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, y cáncer

40 En la presente se describe un método para reducir o prevenir la angiogénesis en un tejido, dicho método comprende poner en contacto el tejido con un péptido de la invención en condiciones efectivas para reducir o prevenir la angiogénesis en el tejido. En algunas modalidades, el método se realiza in vivo. En otras modalidades, el tejido es un tumor.

45 En la presente se describe un método para inducir apoptosis en una célula, dicho método comprende poner en contacto la célula con un péptido de la invención en condiciones efectivas para inducir la apoptosis de la célula. La invención también

proporciona un método para disminuir la supervivencia y/o proliferación de una célula, dicho método comprende poner en contacto la célula con un péptido de la invención en condiciones efectivas para disminuir la supervivencia y/o proliferación de la célula. En algunas modalidades, la célula es cancerosa o está contenida en la vasculatura endotelial de un tejido que contiene células cancerosas. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para identificar un ligando potencial de la proteína de unión a CREB y/o p300, dicho método comprende: proporcionar un péptido de la invención, poner en contacto el péptido con un agente de ensayo, y detectar si el agente de ensayo se une selectivamente al péptido, en donde un agente de ensayo que se une selectivamente al péptido se identifica como un ligando potencial de la proteína de unión a CREB y/o p300

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las características novedosas de la invención se muestran con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que muestra las modalidades ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1A es un diagrama esquemático que ilustra la estructura del complejo del dominio de transactivación C-terminal ("C-TAD") del Factor 1a inducible por hipoxia ("HIF-1a") con dominio rico en cisteína-histidina1 ("CH1") de la proteína coactivadora p300 (o la proteína de unión homóloga CREB, CBP) (Lepourcelet y otros, "Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/ -Catenin Protein Complex," Cancer Cell 5:91-102 (2004); Vassilev y otros, "In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2," Science 303:844-8 (2004). La Figura 1B ilustra el mapa del dominio de HIF-1a que muestra la región básica hélice-giro-hélice ("bHLH"), PAS, el dominio de transactivación N-terminal ("N-TAD"), y el C-TAD. La secuencia C-TAD de HIF-1a humana (sec. con núm. de ident.: 1) se muestra en la Figura 1C, junto con la ubicación de las hélices aA y aB.

La Figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra la vía de HIF-1a. ARNT representa el translocador nuclear del receptor de aril hidrocarburo; VHL representa el supresor tumoral de von Hippel-Lindau; HRE representa el elemento de respuesta a la hipoxia; y VEGF representa el factor de crecimiento vascular endotelial.

Las Figuras 3A-B son diagramas esquemáticos que muestran las estructuras de caetocina 1 (aislada de Chaetomium globosum) (Figura 3A) y quetomina 2 (aislada de Chaetomium codiodes) (Figura 3B).

La Figura 4 es un diagrama esquemático que ilustra la nucleación de a-hélices cortas por sustitución de un N-terminal i y enlace de hidrógeno i+4 (C=O--H-N) con un enlace covalente (C=X-Y-N). Estas a-hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno ("HBS") contienen un enlace carbono-carbono derivado de una reacción de metatesis de cierre de anillo ("RCM").

Las Figuras 5A-C son ilustraciones esquemáticas de la estructura de una a-hélice HBS. La Figura 5A muestra la estructura derivada de RMN de una a-hélice HBS. La Figura 5B muestra un mapa de densidad de electrones de resolución 1.1 Å derivado de la cristalografía de rayos X de una a-hélice HBS con el modelo molecular refinado. La Figura 5C muestra el modelo molecular de una a-hélice HBS a partir de datos cristalográficos. Las líneas estrechas representan i putativo e i+4 enlaces de hidrógeno.

Las Figuras 6A-B se relacionan con la hélice HBS 22. La Figura 6A representa su estructura química. La Figura 6B muestra los espectros de dicroismo circular de la hélice HBS 22 y el péptido de control 25 en 10 mM de tampón fosfato a pH 7.4.

La Figura 7 es un gráfico de la inhibición dependiente del tiempo de los niveles del gen de VEGF con varios péptidos medido por qRT-PCR en tiempo real.

La Figura 8 es un gráfico de la densidad celular de los cultivos tratados con: medio de cultivo celular sólo ("Control"), medio al 0.1% ("Vehículo"), quetomina 2, hélice HBS 22, o el péptido control lineal 25.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Diseño de los compuesto a-helicoidales de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a a-hélices de sustitutos de enlaces de hidrógeno ("HBS") que modulan la interacción entre el C-TAD de HIF-1a y el dominio CH1 de p300/CBP.

Los péptidos compuestos por menos de 15 residuos de aminoácidos generalmente no forman estructuras a-helicoidales en condiciones fisiológicas una vez removidos del entorno de la proteína, y requieren restricciones artificiales para adoptar la conformación a-helicoidal. HIF-1a exhibe dos regiones a-helicoidales cortas compuestas de ocho residuos de aminoácidos cada una. La interfase HIF-I a/coactivador se direccionó con a-hélices derivadas de sustitutos de enlaces de hidrógeno ("HBS") con el objetivo de producir de forma reproducible estructuras helicoidales estables a partir de secuencias cortas de péptidos, como se muestra en la Figura 4 (Wang y otros, "Evaluation of Biologically Relevant Short a-Helices Stabilized by a Main-chain hidrógeno-bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006). Aunque otros enfoques para el diseño de miméticos de hélice se han descrito en la literatura, frecuentemente estos métodos requieren "correas y tirantes" para estabilizar la conformación. El enfoque HBS únicamente permite la síntesis de a-hélices con todas las caras disponibles para el reconocimiento molecular, ya que la funcionalidad de la cadena lateral no se utiliza para bloquear la conformación.

El enfoque de diseño de hélice HBS se centra en la teoría de la transición hélice-bobina, lo que sugiere que la organización energéticamente exigente de tres aminoácidos consecutivos en la orientación helicoidal limita inherentemente la estabilidad de a-hélices cortas (Lifson & Roig, "On the Theory of Helix-Coil Transitions in Polypeptides," J. Chem. Phys. 34:1963-74 (1961); Zimm & Bragg, "Theory of the Phase Transition Between Helix and Random Coil in Polypeptide Chains," J. Chem. Phys. 31 :526-35 (1959). De acuerdo con esta teoría, las a-hélices compuestas frecuentemente de pocos aminoácidos se espera que sean esencialmente inestables debido a una baja probabilidad de nucleación. El enfoque HBS ofrece un giro a preorganizado para superar la barrera intrínseca de la nucleación y para iniciar la formación de la hélice. En una a-hélice, un enlace de hidrógeno entre el C=O del iésimo residuo de aminoácido y el NH del iésimo+4residuo de aminoácido estabiliza y nuclea la estructura helicoidal, como se muestra en la Figura 4. Para imitar el enlace de hidrógeno C=O--H-N tan cerca como sea posible, y para preorganizar el giro a, se utiliza un enlace covalente del tipo C=X-Y-N, donde X y Y son parte de los residuos i y el i+4, respectivamente. Este método se concibe para que sea ampliamente aplicable para preparar cualquier a hélice estructuralmente restringida. Pueden usarse métodos similares para preparar restringidos estructuralmente

En una modalidad, el enlace covalente entre los residuos i y el i+4 es un enlace carbono-carbono derivado de una reacción de metatesis de cierre de anillo (Chapman y otros, "A Highly Stable Short a-Helix Constrained by a Main-chain hidrógenobond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 126:12252-3 (2004); Dimartino y otros, "Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived a-Helices," Org. Lett. 7:2389-92 (2005).

La estructura de la solución derivada de NMR y la estructura de cristal de alta resolución de las a-hélices de HBS ilustran de manera inequívoca el potencial de este enfoque, como se muestra en la Figura 5 (Wang y otros, "Evaluation of Biologically Relevant Short a-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006); Liu y otros, "Atomic Structure of a Short Alpha-helix Stabilized by a Main Chain Hydrogen bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 130:4334-7 (2008), las cuales se incorporan por este medio como referencia en su totalidad). Dos características del enfoque HBS hacen que sea especialmente atractivo para el diseño de reguladores transcripcionales alostéricos: (1) la colocación interna de la reticulación, lo que permite el diseño de a-hélices sin bloquear las superficies expuestas de disolvente y preservando de ese modo cadenas laterales para el reconocimiento molecular, y (2) la capacidad de restringir péptidos muy cortos con menos de 10 residuos de aminoácidos en a-hélices altamente estables (Wang y otros, "Evaluation of Biologically Relevant Short a-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 128:924856 (2006); Wang y otros, "Nucleation and Stability of Hydrogen-bond Surrogate-based a-Helices," Org. Biomol. Chem. 4:4074-81 (2006).

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un péptido que tiene uno o más alfa hélices internamente restringidas, estables donde el péptido incluye una secuencia que imita una porción de un dominio helicoidal de HIF-1a. En una modalidad, el dominio helicoidal HIF-1a es la hélice aA o la hélice aB del dominio de transactivación C-terminal de HIF1a. Por ejemplo, el péptido imita al menos los residuos 796-804 o residuos 816-823 del dominio de transactivación Cterminal HIF-1a.

Los péptidos adecuados de la invención incluyen los péptidos de la Fórmula I:

en donde

es un enlace carbono-carbono sencillo o doble, donde el doble enlace carbono-carbono es cis o trans; cada n es independientemente 1 o 2; y m es cero o cualquier entero positivo. Por ejemplo, m puede ser cualquier entero de 3 a 16, o 3 a 40. R1 puede ser un aminoácido, un péptido,-OR4,-CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R4 es alquilo o arilo. Alternativamente, R1 es una porción de la Fórmula:

en donde A5 es un residuo de aminoácido, un grupo acilo, o hidrógeno; y cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un alquilo, o un grupo arilo. R2 puede ser hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo

10 alquilo, o un grupo arilo. R3 puede ser un aminoácido, un péptido, -OR6, -N(R7)2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R6 es un grupo alquilo o un grupo arilo y cada R7 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo. A1, A2 y A4 son cada uno independientemente:

en donde cada R8 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; y A3 es:

en donde cada R9 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo.

Los aminoácidos útiles en la práctica de la invención incluyen ácidos naturales y no naturales, aminoácidos disustituidos, beta-aminoácidos, gamma aminoácidos, y otros, y los residuos referidos en la presente descripción incluyen residuos 25 obtenidos a partir de tales aminoácidos. En una modalidad, la cadena lateral de aminoácidos referida a los compuestos de la invención, tales como la Fórmula I, son cadenas laterales de aminoácidos naturales.

"Grupo alquilo" como se usa en la presente es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada. También se incluyen dentro de la definición de alquilo los grupos heteroalquilo, en donde el heteroátomo puede ser nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre y 30 silicio. Los grupos alquilo incluyen, pero sin limitarse a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, y butilo. Los grupos alquilo incluyen, por ejemplo, alquilos de C1-C6.

"Grupo acilo" como se usa en la presente incluye grupos acilo de cadena lineal o ramificada, tales como metanoilo, etanoilo, propanoilo, benzoilo, y propenoilo.

"Grupo arilo" como se usa en la presente incluye anillos arilo aromáticos tales como fenilo, anillos heterocíclicos aromáticos tales como piridina, furano, tiofeno, pirrol, indol y purina, y anillos heterocíclicos con nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo.

En la definición de grupo alquilo, acilo, y arilo se incluyen los grupo alquilo, acilo, y arilo sustituidos. Los grupos de 40 sustitución adecuados incluyen pero sin limitarse a, grupos halógenos, aminas, hidroxilo, ácidos carboxílicos, grupos nitro, carbonilo, y otros grupos alquilo, acilo, y arilo.

Los péptidos que imitan la hélice aA del dominio de transactivación C-terminal de HIF-1a incluyen, sin limitarse a, los de la fórmula I donde A1 es Thr; A2 es Ser o Ala; A3 es Tyr o Ala; y A4 comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7, en donde X1 es Asp 45 o Asn, X2 es Val, Cys, o Ala, X3 es Glu o Gln, X4 es Val o Tyr, X5 es Asn o Arg, X6 es Ala, y es X7 es Arg o está ausente. Como se entenderá por el experto en la técnica, A4 puede seleccionarse del grupo de Asn-Ala-Gln-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:2), Asn-Ala-Gln-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:3), Asn-Ala-Gln-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:4), Asn-Ala-Gln-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:5), Asn-Ala-Gln-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:6), Asn

Ala-Gln-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:7), Asn-Ala-Gln-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:8), Asn-Ala-Gln-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:9), Asn-Ala-Glu-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.: 10), Asn-Ala-Glu-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:11), Asn-Ala-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:12), Asn-Ala-Glu-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:13), Asn-Ala-Glu-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.: 14), Asn-Ala-Glu-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.: 15), Asn-Ala-Glu-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:16), Asn-Ala-Glu-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:17), Asn-Cys-Gln-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:18), Asn-Cys-Gln-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.: 19), Asn-Cys-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:20), Asn-Cys-Gln-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:21), Asn-Cys-Gln-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:22), Asn-Cys-Gln-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:23), Asn-Cys-Gln-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:24), Asn-Cys-Gln-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:25), Asn-Cys-Glu-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:26), Asn-Cys-Glu-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:27), Asn-Cys-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:28), Asn-Cys-Glu-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:29), Asn-Cys-Glu-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:30), Asn-Cys-Glu-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:31), Asn-Cys-Glu-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:32), Asn-Cys-Glu-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:33), Asn-Val-Gln-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:34), Asn-Val-Gln-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:35), Asn-Val-Gln-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:36), Asn-Val-Gln-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:37), Asn-Val-Gln-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:38), Asn-Val-Gln-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:39), Asn-Val-Gln-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:40), Asn-Val-Gln-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:41), Asn-Val-Glu-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:42), Asn-Val-Glu-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:43), Asn-Val-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:44), Asn-Val-Glu-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:45), Asn-Val-Glu-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:46), Asn-Val-Glu-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:47), Asn-Val-Glu-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:48), Asn-Val-Glu-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:49), Asp-Ala-Gln-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:50), Asp-Ala-Gln-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:51), Asp-Ala-Gln-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:52), Asp-Ala-Gln-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:53), Asp-Ala-Gln-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:54), Asp-Ala-Gln-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:55), Asp-Ala-Gln-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:56), Asp-Ala-Gln-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:57), Asp-Ala-Glu-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:58), Asp-Ala-Glu-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:59), Asp-Ala-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:60), Asp-Ala-Glu-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:61), Asp-Ala-Glu-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:62), Asp-Ala-Glu-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:63), Asp-Ala-Glu-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:64), Asp-Ala-Glu-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:65), Asp-Cys-Gln-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:66), Asp-Cys-Gln-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:67), Asp-Cys-Gln-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:68), Asp-Cys-Gln-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:69), Asp-Cys-Gln-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:70), Asp-Cys-Gln-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:71), Asp-Cys-Gln-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:72), Asp-Cys-Gln-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:73), Asp-Cys-Glu-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:74), Asp-Cys-Glu-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:75), Asp-Cys-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:76), Asp-Cys-Glu-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:77), Asp-Cys-Glu-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:78), Asp-Cys-Glu-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:79), Asp-Cys-Glu-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:80), Asp-Cys-Glu-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:81), Asp-Val-Gln-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:82), Asp-Val-Gln-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:83), Asp-Val-Gln-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:84), Asp-Val-Gln-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:85), Asp-Val-Gln-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:86), Asp-Val-Gln-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:87), Asp-Val-Gln-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:88), Asp-Val-Gln-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:89), Asp-Val-Glu-Tyr-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:90), Asp-Val-Glu-Tyr-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:91), Asp-Val-Glu-Tyr-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:92), Asp-Val-Glu-Tyr-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:93), Asp-Val-Glu-Val-Arg-Ala (sec. con núm. de ident.:94), Asp-Val-Glu-Val-Arg-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:95), Asp-Val-Glu-Val-Asn-Ala (sec. con núm. de ident.:96), y Asp-Val-Glu-Val-Asn-Ala-Arg (sec. con núm. de ident.:97). Los péptidos ilustrativos incluyen:

y

10 En los péptidos mostrados de manera directa anteriormente, m y n son independientemente 1 o 2. Por ejemplo, cada uno de m y n puede ser 1. Alternativamente, m es 1 y n es 2. En otra modalidad, m es 2 y n es 1. En aún otra modalidad, m y n son

2.

15 Generalmente, los péptidos adecuados de la presente invención incluyen aquellos que incluyen la fórmula:

20 donde es un enlace carbono-carbono sencillo o doble; es un enlace sencillo y es cis o trans cuando

es un enlace doble; cada n es independientemente 1 o 2; m es cualquier entero; R1 es un aminoácido, péptido, -OR4, -CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, hidrógeno, o un grupo que tiene una fórmula

en donde A5 es un péptido, un residuo de aminoácidos, un grupo acilo, o hidrógeno; y cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un alquilo, o un grupo arilo;

30 R2 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; AA1 y AA2 son independientemente una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; y A4 es como se definió anteriormente para la Fórmula I.

En una modalidad, R1 es hidrógeno. En otra modalidad, R1 es

donde A5 es un péptido conectado a través de un enlace peptídico. En una modalidad, el enlace representado por es un enlace sencillo. En otra modalidad, el enlace representado 10 por es un enlace doble.

En otras modalidades, los métodos de la presente invención pueden usarse para preparar péptidos que tienen a-hélices internamente restringidas muy estabilizadas. La restricción se puede colocar en cualquier lugar dentro del péptido, no sólo en el extremo N-terminal. Por ejemplo, un compuesto preparado de acuerdo con los métodos de la presente invención

15 puede tener la fórmula

Limitada en el media

En la fórmula anterior, cada R es independientemente cualquier cadena lateral de aminoácido

20 Los péptidos producidos de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden, por ejemplo, ser inferiores a 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, o menos de 10 residuos de aminoácidos. En una modalidad, los péptidos de la invención son menores que 50 aminoácidos de longitud.

25 Las a-hélices HBS de la presente invención pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante la sustitución de una cadena principal N-terminal i y enlace de hidrógeno i+4 con un enlace carbono-carbono a través de una reacción de metatesis de cierre de anillo, como se muestra en la Figura 2 (patente de Estados Unidos núm. 7,202,332 de Arora y otros; Chapman & Arora, "Optimized Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate Helices: Surprising Effects of Microwave Heating on the Activity of Grubbs Catalysts," Org. Lett. 8:5825-8 (2006); Chapman y otros, "A Highly Stable Short a-Helix Constrained by a Main-chain

30 Hydrogen-bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 126:12252-3 (2004); Dimartino y otros, "Solid-phase Synthesis of Hydrogenbond Surrogate-derived a-Helices," Org. Lett. 7:2389-92 (2005). El sustituto del enlace de hidrógeno preorganiza un giro a y estabiliza la secuencia peptídica en una conformación a-helicoidal. Las a-hélices HBS demostraron que adoptan conformaciones estables a-helicoidales a partir de una variedad de cortas secuencias peptídicas (Wang y otros, "Evaluation of Biologically Relevant Short a-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 128:9248

35 56 (2006). También se ha demostrado que estas a-hélices artificiales pueden capturar a su receptor de proteína esperado con alta afinidad (Wang y otros, "Enhanced Metabolic Stability and Protein-binding Properties of Artificial a Helices Derived from a Hydrogen-bond Surrogate: Application to Bcl-xL," Angew. Chem. Int'l Ed. Engl. 44:6525-9 (2005),originalmente publicado en Angew. Chem. 117:6683-7 (2005). Por ejemplo, preparar un compuesto de la invención implica proporcionar un compuesto precursor del péptido y promover la formación de enlace carbono- carbono que resulte en una alfa-hélice

40 internamente restringida, estable.

En una modalidad, el precursor tiene la fórmula: El compuesto de la fórmula anterior puede hacerse reaccionar en condiciones efectivas para promover la formación de un

5 enlace carbono-carbono. Una reacción de este tipo puede ser, por ejemplo, metatesis. La tolerancia del grupo funcional excepcional mostrado por los catalizadores de metatesis de olefinas para la introducción fácil de restricciones carbonocarbono no nativos en la preparación de peptidomiméticos sugiere que X e Y pueden ser dos átomos de carbono conectados a través de una reacción de metatesis de olefinas, como se muestra en el Esquema 2 (Hoveyda y otros, "Ru Complexes Bearing Bidentate Carbenes: From Innocent Curiosity to Uniquely Effective Catalysts for Olefin Metathesis," Org.

10 Biomolec. Chem. 2:8-23 (2004); Trnka y otros, "The Development of L2X2Tu = CHR Olefin Metathesis Catalysts: An Organometallic Success Story," Accounts Chem. Res. 34:18-29 (2001).

Este aspecto de la presente invención puede, por ejemplo, implicar una reacción de metatesis de olefinas de cierre del anillo. Una reacción de metatesis de olefinas acopla dos dobles enlaces (olefinas) para dar dos nuevos enlaces dobles (una

15 de ellas es típicamente gas de etileno). Una metatesis de olefinas de cierre del anillo utiliza una reacción de metatesis de olefina para formar un macrociclo. En esta reacción, dos enlaces dobles dentro de una cadena están conectados. La reacción puede llevarse a cabo con un catalizador de metatesis, por ejemplo de la fórmula

o

En otras modalidades, el catalizador de metatesis es de la fórmula

La reacción de metatesis se puede realizar, por ejemplo, a una temperatura entre aproximadamente 25°C y 110°C, y con mayor preferencia, a una temperatura de aproximadamente 50°C.

La reacción de metatesis se puede realizar con un disolvente orgánico, tal como diclorometano, dicloroetano, tricloroetano, o 30 tolueno.

Las reacciones descritas en este documento pueden llevarse a cabo, por ejemplo, sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen partículas, hebras, precipitados, geles, láminas, tubos, esferas, recipientes, capilares, almohadillas, rebanadas, películas, placas, portaobjetos, discos, membranas, etc. Estos soportes sólidos pueden ser hechos 35 de una amplia variedad de materiales, incluyendo polímeros, plásticos, cerámica, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos, membranas, o compuestos de los mismos. El sustrato es preferentemente plano, pero puede tomar una variedad de configuraciones de superficie alternativas. Por ejemplo, el sustrato puede contener regiones elevadas o deprimidas en las que tiene lugar la síntesis. El sustrato y su superficie forman preferiblemente un

soporte rígido sobre la cual se lleva a cabo las reacciones descritas en la presente. Otros materiales de sustrato serán fácilmente evidentes para los de experiencia ordinaria en la técnica tras la revisión de esta descripción.

La reacción de metatesis ejecutada puede producir inicialmente un compuesto en el que el enlace carbono-carbono recién formado es un doble enlace. Este doble enlace se puede convertir posteriormente a un enlace sencillo por métodos de hidrogenación conocidos en la técnica.

La presente invención abarca además una composición farmacéutica que incluye un péptido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como resultará evidente para un experto en la técnica, la administración puede ser realizada mediante el uso de métodos generalmente conocidos. La administración puede realizarse por vía de administración sistémica al sujeto o a través de administración dirigida a las células afectadas. Las rutas ilustrativas de administración incluyen, sin limitación, por inoculación intratraqueal, aspiración, instilación de las vías respiratorias, aplicación de aerosol, nebulización, instilación intranasal, instilación oral o nasogástrica, inyección intraperitoneal, inyección intravascular, por vía tópica, transdérmica, parenteral, subcutánea, inyección intravenosa, inyección intraarterial (tal como a través de la arteria pulmonar), inyección intramuscular, instilación intrapleural, por vía intraventricular, por vía intralesional, por aplicación a las membranas mucosas (tales como las de la nariz, garganta, bronquios, los genitales, y/o el ano), o implantación de un vehículo de liberación sostenida.

El péptido de la presente invención se administra a un mamífero como una formulación farmacéutica que incluye el agente terapéutico y cualquiera de los adyuvantes, vehículos, excipientes, y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, y puede estar en forma sólida o líquida, tales como tabletas, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, o emulsiones. Las composiciones contienen preferentemente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 99 por ciento en peso, con mayor preferencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 60 por ciento en peso de agente terapéutico junto con los adyuvantes, vehículos y/o excipientes. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es aquella con la que se obtiene una unidad de dosificación adecuada.

Los agentes se pueden administrar oralmente, por ejemplo, con un diluente inerte, o con un portador comestible asimilable,

o pueden estar encerrados en cápsulas de cubierta dura o blanda, o pueden estar comprendidos en tabletas, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, estos compuestos activos se pueden incorporar con excipientes y se usan en forma de tabletas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, y similares. Tales composiciones y preparaciones contendrán al menos 0.1% del agente. El porcentaje del agente en estas composiciones puede, por supuesto, variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2% hasta aproximadamente 60% del peso de la unidad. La cantidad del agente es tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada.

Las tabletas, cápsulas, y similares pueden contener también un aglutinante tal como la goma tragacanto, acacia, almidón de maíz, o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agentes desintegrador tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un edulcorante tal como sacarosa, lactosa, o sacarina. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, ésta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite graso.

Varios materiales diferentes pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas se pueden recubrir con goma laca, azúcar, o ambas. Un jarabe puede contener, además del(os) ingrediente(s) activo(s), sacarosa como un edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante, y aromatizantes tales como aroma de cereza o naranja.

Los péptidos de la invención pueden además administrarse por vía parenteral. Las soluciones o suspensiones de los péptidos pueden prepararse en agua adecuadamente mezcladas con un surfactante tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones se pueden preparar también en glicerol, polietilenglicol líquido, y mezclas de éstos en aceites. Los aceites ilustrativos son aquellos de origen animal, vegetal, sintético o de petróleo, por ejemplo, aceite de maní, aceite de soya, o aceite mineral. En general, el agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, y los glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, son los portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen las dispersiones o soluciones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida hasta el punto que sea fácilmente inyectable. Debería ser estable bajo las condiciones de fabricación

y almacenamiento y debería preservarse contra la acción de contaminación de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio de dispersión o solvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propileno glicol, y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de éstos, y aceites vegetales.

Los péptidos de acuerdo con este aspecto de la presente invención pueden administrarse además directamente a las vías respiratorias en forma de un aerosol. Para uso como aerosoles, los compuestos de la presente invención en solución o suspensión se pueden empacar en un contenedor de aerosol presurizado junto con propulsores adecuados, por ejemplo, propulsores de hidrocarburo como propano, butano, o isobutano con adyuvantes convencionales. Los materiales de la presente invención se pueden administrar también en una forma no presurizada, tal como en un nebulizador o atomizador.

Los péptidos de la presente invención pueden administrarse directamente a un tejido objetivo, por ejemplo, tejido que es susceptible de infección por el virus. Adicionalmente y/o alternativamente, el agente puede administrarse a un área no específica junto con uno o más agentes que facilitan la migración del agente (y/o la captación por) un tejido, órgano, o célula objetivo. Mientras que el tejido objetivo puede ser cualquier tejido sujeto a la infección por el virus, los tejidos objetivo preferidos en el caso de la inhibición de la infección por VIH-1 incluyen las membranas mucosas de la boca, los genitales y el recto. Como será evidente para un experto normal en la técnica, que el agente terapéutico sea modificado en sí para facilitar su transporte a (y la captación por) el tejido, órgano o célula deseado.

Los dispositivos de administración ejemplares incluyen, sin limitación, nebulizadores, atomizadores, liposomas, parches transdérmicos, implantes, composiciones de depósito de proteínas inyectables o implantable, y jeringas. Otros sistemas de administración que son conocidos para los expertos en la técnica también pueden emplearse para lograr el suministro deseado del agente terapéutico a los órganos, tejidos o células deseadas in vivo para efectuar este aspecto de la presente invención.

Cualquier método adecuado para la administración de los péptidos se puede usar para la práctica de este aspecto de la presente invención. Típicamente, los péptidos se pueden administrar a un paciente en un vehículo que suministra los péptidos a la célula, tejido, u órgano objetivo.

Un enfoque para el suministro de péptidos en las células implica el uso de liposomas. Generalmente, esto implica proporcionar un liposoma que incluye agente(s) para ser suministrado(s), y después poner en contacto la célula, tejido, u órgano objetivo con los liposomas en condiciones efectivas para el suministro del agente en la célula, tejido, u órgano.

Los liposomas son vesículas compuestas de una o más bicapas lipídicas ordenadas concéntricamente que encapsulan una fase acuosa. Ellos normalmente no permean, pero pueden llegar a ser permeables si se produce un agujero o poro en la membrana, si la membrana se disuelve o se degrada, o si la temperatura de la membrana se aumenta a la temperatura de transición de fase. Los métodos actuales de administración de fármacos a través de liposomas requieren que el portador de liposomas finalmente se haga permeable y libere el fármaco encapsulado en el sitio objetivo. Esto se puede lograr, por ejemplo, de una manera pasiva, donde la bicapa del liposoma se degrada con el tiempo a través de la acción de diversos agentes en el cuerpo. Cada composición de liposoma tendrá una vida media característica en la circulación o en otros sitios en el cuerpo y, por lo tanto, mediante el control de la vida media de la composición de liposomas, la velocidad a la que se degrada la bicapa puede ser algo regulado.

En contraste con la liberación pasiva de fármaco, la liberación activa del fármaco implica el uso de un agente para inducir un cambio de permeabilidad en la vesícula del liposoma. Las membranas de los liposomas pueden ser construidas de manera que se desestabilizen cuando el entorno se vuelve acídico cerca de la membrana del liposoma (ver, por ejemplo, Wang & Huang, "pH-Sensitive Immunoliposomes Mediate Target-cell-specific Delivery and Controlled Expression of a Foreign Gene in Mouse," Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 84:7851-5 (1987)). Cuando los liposomas se toman por endocitosis por una célula objetivo, por ejemplo, se pueden encaminar a endosomas acídicos que desestabilizarán el liposoma y resultará en la liberación del fármaco.

Alternativamente, la membrana del liposoma puede ser modificada químicamente de tal manera que una enzima se coloca como un recubrimiento sobre la membrana, cuya enzima desestabiliza lentamente el liposoma. Dado que el control de la liberación del fármaco depende de la concentración de la enzima inicialmente colocada en la membrana, no hay forma real efectiva para modular o alterar la liberación del fármaco para alcanzar la administración de fármacos "a pedido". El mismo problema existe para los liposomas sensibles al pH en que tan pronto como la vesícula del liposoma entra en contacto con una célula objetivo, se engullirá y una caída en el pH dará lugar a la liberación del fármaco.

Este sistema de administración de liposomas también se puede hacer para acumular en un órgano, tejido, o célula objetivo a través del direccionamiento activo (por ejemplo, mediante la incorporación de un anticuerpo u hormona en la superficie del vehículo liposomal). Esto se puede lograr de acuerdo con métodos conocidos.

Los diferentes tipos de liposomas se pueden preparar de acuerdo con Bangham y otros, "Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids," J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965); patente de los Estados Unidos núm. 5,653,996 de Hsu; patente de los Estados Unidos núm. 5,643,599 de Lee y otros; patente de los Estados Unidos núm. 5,885,613 de Holland y otros; patente de los Estados Unidos núm. 5,631,237 de Dzau & Kaneda; y patente de los Estados Unidos núm. 5,059,421 de Loughrey y otros.

Estos liposomas se pueden producir de tal manera que contengan, además de los agentes terapéuticos de la presente invención, otros agentes terapéuticos, tales como agentes antiinflamatorios, que después podrían liberarse en el sitio objetivo (por ejemplo, Wolff y otros, "The Use of Monoclonal Anti-Thyl IgG1 for the Targeting of Liposomes to AKR-A Cells in Vitro and in Vivo," Biochim. Biophys. Acta 802:259-73 (1984)).

Un enfoque alternativo para la entrega de proteínas o agentes de polipéptidos (por ejemplo, péptidos de la presente invención) implica la conjugación de la proteína o polipéptido deseado a un polímero que se estabiliza para evitar la degradación enzimática de la proteína o polipéptido conjugado. Las proteínas conjugadas o polipéptidos de este tipo se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 5,681,811 de Ekwuribe.

Aún otro enfoque para el suministro de proteínas o agentes de polipéptidos implica la preparación de proteínas quiméricas de acuerdo con la patente de los Estados Unidos núm. 5,817,789 de Heartlein y otros.La proteína quimérica puede incluir un dominio de ligando y el agente de polipéptido (por ejemplo, la a-hélice artificial de la presente invención). El dominio de ligando es específico para receptores situados en una célula objetivo. Por tanto, cuando la proteína quimérica se suministra por vía intravenosa o de otra manera introducida en la sangre o la linfa, la proteína quimérica se adsorberá a la célula objetivo, y la célula objetivo internalizará la proteína quimérica

La administración puede llevarse a cabo tan frecuente como se requiera y con una duración que es adecuada para proporcionar un tratamiento efectivo contra la infección viral. Por ejemplo, la administración puede llevarse a cabo con una formulación de dosificación de liberación sostenida sola o con múltiples dosis diarias. La administración puede llevarse a cabo antes de, simultáneamente con, y/o después de la exposición del sujeto al virus.

La cantidad a ser administrada, por supuesto, variará dependiendo del régimen de tratamiento. Generalmente, un agente se administra para lograr una cantidad efectiva para una reducción en la infectividad del virus (es decir, una cantidad terapéuticamente efectiva). Por lo tanto, una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser una cantidad que es capaz de prevenir al menos parcialmente la transmisión del virus al sujeto, o la propagación del virus en el sujeto. La dosis requerida para obtener una cantidad efectiva puede variar dependiendo del agente, la formulación, el virus, y el individuo al que se administra el agente.

La determinación de cantidades efectivas también puede implicar ensayos in vitro en los que dosis variables de agente se administran a células en cultivo y la concentración de agente efectiva para inhibir la infectividad se determina con el fin de calcular la concentración requerida in vivo. Las cantidades efectivas también pueden basarse en estudios in vivo con animales. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada empíricamente por los expertos en la técnica.

En la presente se describe un método de inhibir la interacción HIF 1a-p300/CBP usando los péptidos de la presente invención. En una forma esto se relaciona con un método de reducir la transcripción de un gen en una célula, donde la transcripción del gen está mediada por la interacción de HIF-1a con la proteína de unión a CREB y/o p300. Este método implica poner en contacto la célula con un péptido de la presente invención bajo condiciones efectivas para causar la captación nuclear del péptido, donde el péptido interrumpe la interacción de HIF-1a y p300/CBP y así reduce la transcripción del gen. Los genes cuya transcripción es mediada por la interacción de HIF-1a con CBP y/o p300 incluyen adenilato quinasa 3, aldolasa A, aldolasa C, enolasa 1, transportador de glucosa 1, transportador de glucosa 3, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa 1, hexoquinasa 2, factor de crecimiento tipo insulina 2, proteína de unión a IGF 1, proteína de unión a IGF 3, lactato dehidrogenasa A, fosfoglicerato quinasa 1, piruvato quinasa M, p21, factor de crecimiento transformante 3, ceruloplasmia, eritropoyetina, transferrina, receptor de tranferrina, receptor adrenérgico alB, adrenomedulina, endotelina-1, hemo oxigenasa 1, oxido nítrico sintasa 2, inhibidor 1 del activador de plasminógeno, factor de crecimiento vascular endotelial, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor FLT-1, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor KDR/Flk-1, y p35srg. Algunos de los usos para inhibir la transcripción de estos genes se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Ejemplo de trastornos.

Gen

Enfermedad a tratar/prevenir

Enolasa 1

Encefalopatía de Hashimoto, asma severa

Gen

Enfermedad a tratar/prevenir

Transportador de glucosa 1

Glicólisis aeróbica (efecto Warburg)

Transportador de glucosa 3

Glicólisis aeróbica (efecto Warburg)

Hexoquinasa 1

Glicólisis aeróbica (efecto Warburg)

Hexoquinasa 2

Glicólisis aeróbica (efecto Warburg)

Factor de crecimiento tipo insulina 2

Desarrollo y función anormal de órganos (cerebro, hígado)

Proteína de unión a IGF 1

Desarrollo y función anormal de órganos (cerebro, hígado)

Proteína de unión a IGF 3

Desarrollo y función anormal de órganos (cerebro, hígado)

Lactato dehidrogenasa A

Infarto de miocardio

Ceruloplasmina

Linfoma, inflamación aguda y crónica, artritis reumatoide

Eritropoyetina

Transporte anormal de oxígeno

Transferrina

Captación anormal del hierro/metabolismo

Receptor de transferrina

Captación anormal del hierro/metabolismo

Adrenomedulina

Feocromocitoma

Endotelina-1

Vasoconstricción anormal

Hemo oxigenasa 1

Transporte anormal de oxígeno

Óxido nítrico sintasa 2

Tono vasomotor anormal

Factor de crecimiento vascular endotelial

Angiogénesis (tumores, que incluyen cáncer)

Receptor del factor de crecimiento vascular endotelial FLT-1

Angiogénesis (tumores, que incluyen cáncer)

Receptor del factor de crecimiento vascular endotelial KDR/Flk-1

Angiogénesis (tumores, que incluyen cáncer)

En la presente se describe un método para tratar o prevenir en un sujeto que lo necesita un trastorno mediado por la interacción de HIF-1a con CBP y/o p300. Este método implica la administración de un péptido de la presente invención al 5 sujeto bajo condiciones efectivas para tratar o prevenir el trastorno.

Los trastornos que se pueden tratar o prevenir incluyen, por ejemplo, isquemia retiniana (Zhu y otros, "Long-term Tolerance to Retinal Ischemia by Repetitive Hypoxic Preconditioning: Role of HIF-1a and Heme Oxygenase-1," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48: 1735-43 (2007); Ding y otros, "Retinal Disease in Mice. Lacking Hypoxia-inducible Transcription Factor-2a," Invest. 10 Ophthalmol. Vis. Sci. 46:1010-6 (2005), hipertensión pulmonar (Simon y otros, "Hypoxia-induced Signaling in the Cardiovascular System," Annu. Rev. Physiol. 70:51-71 (2008); Eul y otros, "Impact of HIF-1a and HIF-2a on Proliferatiou and Migration of Human Pulmonary Artery Fibroblasts in Hypoxia," FASEB J. 20:163-5 (2006), cada uno de estos se incorpora por este medio como referencia en su totalidad), retardo del crecimiento uterino (Caramelo y otros, "Respuesta a la Hipoxia. Un Mecanismo Sistemico Basado en el Control de la Expresion Genica [Response to Hypoxia. A Systemic Mechanism 15 Based on the Control of Gene Expression]," Medicina B. Aires 66: 155-154 (2006); Tazuke y otros, "Hypoxia Stimulates Insulin-like Growth Factor Binding Protein I (IGFBP-1) Gene Expression in HepG2 Cells: A Possible Model for IGFBP-1 Expression in Fetal Hypoxia," Proc. Nat'l Acad Sci. USA 95:10188-93 (1998)), retinopatía diabética (Ritter y otros, "Myeloid Progenitors Differentiate into Microglia and Promote Vascular Repair in a Model of Ischemic Retinopathy," J. Clin Invest. 116:3266-76 (2006); Wilkinson-Berka y otros, "The Role of Growth Hormone, Insulin-like Growth Factor and Somatostatin in 20 Diabetic Retinopathy," Curr. Med Chem. 13:3307-17 (2006); Vinores y otros, "Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development,"

J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006); Caldwell y otros, "Vascular Endothelial Growth Factor and Diabetic Retinopathy: Role of Oxidative Stress," Curr. Drug Targets 6:511-24 (2005)), degeneración macular relacionada con la edad (Inoue y otros,

"Expression of Hypoxia-inducible Factor 1a and 2a in Choroidal Neovascular Membranes Associated with Age-related Macular Degeneration," Br. J Ophthalmol. 91:1720-1 (2007); Zuluaga y otros, "Synergies ofVEGF Inhibition and Photodynamic Therapy in the Treatment of Age-related Macular Degeneration," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 48:1767-72 (2007); Provis, "Development of the Primate Retinal Vasculature," Prog. Retin Eye Res. 20:799-821 (2001)), edema macular 5 diabético (V inores y otros, "Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development," J Cell. Physiol. 206:749-58 (2006); Forooghian & Das, "Anti-angiogenic Effects of Ribonucleic Acid Interference Targeting Vascular Endothelial Growth Factor and Hypoxiainducible Factor-1a," Am. J Ophthalmol. 144:761-8 (2007)), y cáncer (Marignol y otros, "Hypoxia in Prostate Cancer: A Powerful Shield Against Tumour Destruction?" Cancer Treat. Rev. 34:313-27 (2008); Galanis y otros, "Reactive Oxygen

10 Species and HIF-I Signalling in Cancer," Cancer Lett. 266: 12-20 (2008); Ushio-Fukai & Nakamura, "Reactive Oxygen Species and Angiogenesis: NADPH Oxidase as Target for Cancer Therapy," Cancer Lett. 266:37-52 (2008); Adamski y otros, "The Cellular Adaptations to Hypoxia as Novel Therapeutic Targets in Childhood Cancer," Cancer Treat. Rev. 34:23146 (2008); Toffoli & Michiels, "Intermittent Hypoxia Is a Key Regulator of Cancer Cell and Endothelial Cell Interplay in Tumours," FEBS J. 275:2991-3002 (2008))).

15 En la presente se describe un método para reducir o prevenir la angiogénesis en un tejido. Este método implica poner en contacto el tejido con un péptido de la presente invención en condiciones efectivas para reducir o prevenir la angiogénesis en el tejido. Otra forma se refiere a un método de inducir la apoptosis de una célula. Este método implica poner en contacto la célula con un péptido de la presente invención en condiciones efectivas para inducir la apoptosis de la célula. Otra forma

20 se refiere a un método de disminuir la supervivencia y/o la proliferación de una célula. Este método implica poner en contacto la célula con un péptido de la presente invención en condiciones efectivas para disminuir la supervivencia y/o proliferación de la célula. Poner en contacto (incluyendo administrar) de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede llevarse a cabo usando métodos que serán evidentes para el experto en la técnica y como se describió anteriormente, y se puede realizar in vitro o in vivo.

25 Algunos ejemplos de células, tejidos y/u órganos objetivo para las modalidades descritas anteriormente se muestran en la Tabla 2.

Efecto deseado

Ejemplo de Objetivo(s)

Inhibir transcripción de:

Enolasa 1

Hígado, cerebro, riñón, bazo, tejido adiposo, pulmón

Transportador de glucosa 1

Tumor, incl. cáncer

Transportador de glucosa 3

Tumor, incl. cáncer

Hexoquinasa 1

Tumor, incl. cáncer

Hexoquinasa 2

Tumor, incl. cáncer

Factor de crecimiento tipo insulina 2

cerebro, hígado

Proteína de unión a IGF 1

cerebro, hígado

Proteína de unión a IGF 3

cerebro, hígado

Lactato dehidrogenasa A

Corazón

Ceruloplasmina

Linfocitos/tejido linfático, tejido inflamado, tejido artrítico reumatoide

Eritropoyetina

Hígado, riñón

Transferrina

Hígado

Adrenomedulina

Feocromocitoma

Endotelina-1

Endotelio

Óxido nítrico sintasa 2

Vasos, células/tejido cardiovascular

Factor de crecimiento vascular endotelial

Células/tejido tumorales, incl. cáncer

Receptor del factor de crecimiento

Células/tejido tumorales, incl. cáncer

Efecto deseado

Ejemplo de Objetivo(s)

Inhibir transcripción de:

vascular endotelial FLT-1

Receptor del factor de crecimiento vascular endotelial KDR/Flk-1

Células/tejido tumorales, incl. cáncer

Tratar o prevenir:

Isquemia retiniana

Retina (ojo)

Hipertensión pulmonar

Pulmones

Retardo del crecimiento uterino

Útero

Retinopatía diabética

Retina (ojo)

Degeneración macular relacionada con la edad

Retina (ojo)

Edema macular diabético

Retina (ojo)

Angiogénesis

Células/tejido tumorales, incl. cáncer

Disminución de supervivencia y/o proliferación de célula

Células cancerosas, células contenidas en la vasculatura endotelial de un tejido que contiene células cancerosas

En la presente se describe un método de identificar un agente que potencialmente inhibe la interacción de HIF-1a con CBP y/o p300. Este método implica proporcionar un péptido de la presente invención, poner en contacto el péptido con un agente de ensayo, y detectar si el agente de ensayo se une selectivamente al péptido, en donde un agente de ensayo que se une selectivamente al péptido se identifica como un inhibidor potencial de interacción entre HIF-Ia con CBP y/o p300.

Este método puede llevarse a cabo en una variedad de formas, que serán evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, la afinidad del agente de ensayo por el péptido de la presente invención puede medirse usando análisis por calorimetría isotérmica de titulación, tal como se describe en el Ejemplo 4 (Wiseman y otros, "Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Using a New Titration Calorimeter," Anal. Biochem. 179: 131-7 (1989); Freire y otros, "Isothermal Titration Calorimetry," Anal. Chem. 62:A950-A959 (1990); Chervenak & Toone, "Calorimetric Analysis of the Binding of Lectins with Overlapping Carbohydrate-binding Ligand Specificities," Biochemistry 34:5685-95 (1995); Aki y otros, "Competitive Binding of Drugs to the Multiple Binding Sites on Human Serum Albumin. A Calorimetric Study," J Thermal Anal. Calorim. 57:361-70 (1999); Graziano y otros, "Linkage of Proton Binding to the Thermal Unfolding of Sso7d from the Hyperthermophilic Archaebacterium Sulfolobus solfataricus," Int'l J Biol. Macromolecules 26:45-53 (1999): Pluschke & Mutz, "Use of Isothennal Titration Calorimetry in the Development of Molecularly Defined Vaccines," J. Thermal Anal. Calorim. 57:377-88 (1999); Corbell y otros, "A Comparison of Biological and Calorimetric Analyses of Multivalent Glycodendrimer Ligands for Concanavalin A," Tetrahedron-Asymmetry 11 :95-111 (2000) ). En una modalidad, un agente de ensayo se identifica como un inhibidor potencial de interacción entre HIF-1a con CBP y/o p300 si la constante de disociación (Kd) para el agente de ensayo y el péptido de la invención es de 50 µM o menor. En otra modalidad, la Kd es 200 nM o menor. En aún otra modalidad, la Kd es 100 nM o menor.

Los agentes de ensayo identificados como potenciales inhibidores de la interacción HIF-1a-p300/CREB pueden ser sometidos a ensayos adicionales para confirmar su capacidad para inhibir la interacción entre HIF-1a con CBP y/o p300.

La presente invención puede ilustrarse adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Análisis de la Actividad del Promotor con Ensayos de Luciferasa.

Las células MDA-MB-231-HRE-Luc se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco de alta glucosa ("DMEM") suplementado con suero bovino fetal al 10% y 0.4 g/L de geneticina (G418 sulfato, RPI Corporation). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (BD Falcon) a una densidad de 6 x 104células/pocillo utilizando 1 mL de una suspensión

6.5 x 104 célula/mL. Después de la unión, las células se trataron con 1 mL de medio fresco que contenía hélices HBS o quetomina en concentraciones que varían de10 nM a 1 µM. Las células se incubaron durante 6 horas a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. La hipoxia se indujo mediante la adición de mesilato de desferoxamina (DFO,

Sigma) a una concentración final de 300 µM, y las células se incubaron durante 18 horas adicionales.Los lisados de células enteras fueron aislados por lavado de las células dos veces con PBS enfriado con hielo y después la adición de 150 µL de reactivo de lisis del cultivo celular ("CCLR," Promega). El lisado se recogió, se centrifugó a 13,000 rpm a 4°C, se dividió en alícuotas, y se almacenó a -80°C. Los ensayos de lu ciferasa se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega) usando un Luminómetro Turner TD-20e. Las mediciones relativas de la intensidad de luz se normalizaron mediante la realización de un ensayo de Bradford para determinar el contenido de proteína del lisado usado en el ensayo de luciferasa. En resumen, se añadieron 50 µL de mezcla de reactivo de ensayo de luciferasa/lisado celular a 200 µL de reactivo de Bradford y 750 µL de agua Millipore en una cubeta de 1.5 mL. Los estándares de proteína fueron creados en el intervalo de 1 µg/mL a 10 µg/mL con la cantidad apropiada de una solución de 1 mg/mL de BSA . Se midió la absorbancia a 595 nm usando un espectrofotómetro DU-800. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado con las barras de error calculados como error estándar de la media.

Ejemplo 2 -Análisis de la expresión génica con qRT-PCR.

Se usó qRT-PCR en tiempo real para determinar el efecto de las hélices HBS en el nivel de expresión de los genes VEGF y GLUT1 en células HeLa y MCF-7, tanto en condiciones no-nóxicas e hipóxicas. Para el análisis de VEGF, el cebador directo 5'AGG CCA GCA CAT AGG AGA GA-3' (sec. con núm. de ident.: 114) y cebador reverso 5'TTT CCC TTT CCT CGA ACT GA-3'(sec. con núm. de ident.:115) se usaron para amplificar un fragmento de 104-pb de la región 3' traducida del gen. Para el análisis de GLUT1 (SLC2A1), se usaron las siguientes secuencias para producir un producto de 179 pb: secuencia directa 5'-TAG AAA CAT GGT TTT GAA ATG C-3'(sec. con núm. de ident.:116), secuencia reversa 5'-GGT AAC AGG GAT CAA ACA GAT T-3'(sec. con núm. de ident.:117). Los niveles de expresión de -glucuronidasa se usaron como controles endógenos, ya que se mantienen sin cambios en las condiciones experimentales. El cebador directo 5'-CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT T-3' (sec. con núm. de ident.:118) y el cebador reverso 5'-CCG AGT GAA GAT CCC CTT TTT A-3'(sec. con núm. de ident.:119) se usaron para este gen. El ciclo de temperatura y detección de la emisión verde SYBR se realizaron con un instrumento de PCR en tiempo real ABI 7300. Los datos fueron analizados con el sistema de detección de secuencias ABI, versión 1.2. El análisis estadístico se realizó con los datos de seis experimentos independientes. El experimento se realizó con mezcla maestra de RT-PCR verde SYBR de Applied Biosystems.

Ejemplo 3 -Determinación de los valores de proteína con ELISA.

Las células MCF-7 se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos (BD Falcon) a una densidad de 1.1x105 células/pocillo usando 1 mL de una uspensión 1.1x105 células/mL. Después de la unión, las células se aspiraron y se trataron con 1 ml de medios que contienen esporidesminas o quetomina que varían en concentración de 10 nM a 1 µM como se describe en el Ejemplo 1. Después de un período de incubación de 6 horas a 37°C y 5% de CO 2 la hipoxia se indujo por incremento de cultivos con DFO 300 nM e incubación durante 18 horas. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo de células, se centrifugó a 10,000 rpm y 4°C, y se dividieron en a lícuotas a 200 µL en placa de 96 pocillos para el ensayo de ELISA (R&D Systems), que se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las mediciones de absorbancia se tomaron a 450 nm usando un lector de microplacas Bio-Tek µQuant. El lisado de células enteras se aisló al mismo tiempo por lavado de las células tratadas dos veces con PBS enfriado con hielo y después la adición de 150 µL por pocillo de reactivo de lisis de cultivo celular (Promega). Se recogieron los lisados, se centrifugaron a 13,000 rpm a 4°C, y se almace naron a -80°C. En paralelo con el ELISA, los niveles totales de proteína entera en lisado celular se determinaron mediante ensayo de Bradford para normalizar las concentraciones de VEGF medidas en los sobrenadantes. Este proceso fue para comprobar que la inhibición de VEGF es específica para el bloqueo de HIF-1a mediado por la transcripción y no debido a una interrupción global de la maquinaria transcripcional Las muestras y los patrones se prepararon con 40 µL de reactivo de Bradford (Bio-Rad) y 160 µL de una mezcla de proteína/agua, y se midió la absorbancia a 595 nm usando un lector de microplacas Bio-Tek µQuant.

Ejemplo 4 -Diseño, síntesis y evaluación de hélices HBS que modulan la transcripción de VEGF en cultivo celular.

El dominio CH1 de p300/CBP tiene una geometría triangular, como se muestra en la Figura 1A, y sirve como un andamio para el plegado del C-TAD de HIF-1a. La hélice aA del C-TAD de HIF-1a, mostrada en la Figura 1A y Figura 1C, es crítica para la interacción entre el dominio de CH1 y HIF-1a, debido a la mutación de sus residuos o hidroxilación de Asn803 es conocido para interrumpir este complejo e inhibir la transcripción mediada por HIF-1a (Freedman y otros, "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1a,"Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002); Dames y otros, "Structural Basis for Hif-1a/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002). El desarrollo de hélices HBS como inhibidores potenciales de la transcripción de VEGF fue iniciada por imitación de la región de hélice aA de HIF-1. Esta hélice consiste en ocho residuos, SYDCEVNAP (sec. con núm. de ident.: 120), y exhibe tres residuos, Asp-Cys-Glu, críticos para la unión con p300/CBP. Varios péptidos lineales y sus análogos de a-hélice HBS fueron diseñados para calibrar el potencial de estas moléculas para inhibir la transcripción de VEGF en cultivo celular. La Tabla 3 lista los compuestos representativos diseñados y probados como parte de estos estudios. Cada péptido sin

restricciones y la hélice HBS se sintetizó usando los procedimientos descritos en (Dimartino y otros, "Solid-phase Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate-derived a-Helices," Org. Lett. 7:2389-92 (2005); Chapman & Arora, "Optimized Synthesis of Hydrogen-bond Surrogate Helices: Surprising Effects of Microwave Heating on the Activity of Grubbs Catalysts," Org. Lett. 8:5825-8 (2006)). El porcentaje de helicidad de cada péptido se determinó usando espectroscopía de dicroísmo circular en 5 10 mM de solución salina tamponada con fosfato como se describe en (Wang y otros, "Evaluation of Biologically Relevant Short a-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond Surrogate," J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)). La afinidad de cada péptido para p300 fue medido por análisis por calorimetría isotérmica de titulación (Wiseman y otros, "Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Using a New Titration Calorimeter," Anal. Biochem. 179:131-7 (1989); Freire y otros, "Isothermal Titration Calorimetry," Anal. Chem. 62:A950-A959 (1990); Chervenak & Toone, 10 "Calorimetric Analysis of the Binding of Lectins with Overlapping Carhohydrate-binding Ligand Specificities," Biochemistry 34:5685-95 (1995); Aki y otros, "Competitive Binding of Drugs to the Multiple Binding Sites on Human Serum Albumin. A Calorimetric Study," J Thermal Anal. Calorim. 57:36170 (1999); Graziano y otros, "Linkage of Proton Binding to the Thermal Unfolding of Sso7d from the Hyperthermophilic Archaebacterium Sulfolobus solfataricus," Int'l J. Biol. Macromolecules 26:4553 (1999); Pluschke & Mutz, "Use of Isothermal Titration Calorimetry in the Development of Molecularly Defined Vaccines,"J 15 Thermal Anal. Calorim. 57:377-88 (1999); Corbell y otros, "A Comparison of Biological and Calorimetric Analyses ofMultivalent Glycodendrimer Ligands for Concanavalin A," Tetrahedron-Asymmetry 11:95-111 (2000)). La capacidad de cada péptido para regular de forma negativa la transcripción de VEGF en cultivo celular se evaluó mediante calorimetría isotérmica y RT-PCR cuantitativa, como se describió anteriormente. La citotoxicidad de cada péptido se determinó mediante el monitoreo del crecimiento celular y la duplicación de la población en la presencia de péptidos individuales en 20 concentración 1 µM. La Tabla 3 resume los resultados obtenidos para la primera generación de hélices HBs y derivados de

péptidos, y compara estos valores con los observados con quetomina 2.

Tabla 3. Péptidos de primera generación

Compuesto

Secuenciaa % Helicidadb Kd nM' (ITC) % de inhibición de la transcripción en el cultivo celulard Citotóxico para las células?c

20

44% 540 ± 40 0 ± 5 (Luc) no determinado

21

16% 690 ± 60 0 ± 5 (Luc) no determinado

22

53% 420 ± 35 45 ± 8 (Luc & RT-PCR) No

23

AcTSYDCEVNA-NH2 (sec. con núm. de ident.:124) 14% 1350 ± 50 10 ± 5 (Luc) no determinado

24

AcTAYDCEVNA-NH2 (sec. con núm. de ident.:125) 15% 1220 ± 80 15 ± 5 (Luc) no determinado

25

AcGTAADCEYNAR-NH2 (sec. con núm. de ident.:126) 15% 825 ± 50 8 ± 3 (Luc & RT-PCR) No

2

---- ---- 120 nM 50 ± 5 Sí

aX denota un residuo de ácido pentenoico en el macrociclo HBS. bObtenido de los estudios de dicroísmo circular. cDel análisis por calorimetría isotérmica de titulación.d% Inhibición evaluado por estudios de qRT-PCR o ensayos de luciferasa con péptido 1 µM o quetomina 200 nM, como se detalla en los Ejemplos 1 y 2.

El péptido HBS 20 es una imitación directa de hélice aA de HIF-1 pero con el residuo de serina-797 sustituido con alanina. Esta mutación se incluyó para simplificar la metodología sintética, como la inspección de la estructura HIF-1/p300 sugirió que la serina-797 no juega un papel importante en la interfase (Freedman y otros, "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1a," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002); Dames y otros, "Structural Basis for Hif-1a CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response," Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 99:5271-6 (2002)).

Se confirmó que esta sustitución no perturba la unión de p300, mediante la síntesis y caracterización de péptidos lineales 23 y 24 (Tabla 3). El péptido HBS 20 es significativamente más helicoidal que su análogo correspondiente sin restricciones, el péptido 24, y se une a p300 con una afinidad de 540 nM. El péptido HBS 21 contiene un residuo de valina en lugar de cisteína-800. La valina se incorporó sobre la base de la hipótesis de que la cisteína-800 dirige un bolsillo hidrofóbico en p300 y la sustitución de este residuo con un residuo más hidrofóbico podría conducir a una mayor unión (Gu y otros, "Molecular Mechanism of Hypoxia-inducible Factor 1a-p300 Interaction," J. Biol. Chem. 276:3550-4 (2001)). El péptido HBS 21 se une a p300 con una afinidad ligeramente inferior que el compuesto original, el péptido HBS 20, lo que sugiere que la valina puede no ser óptima el residuo en la posición típicamente ocupada por cisteína. Aunque las hélices HBS 20 y 21 y los péptidos sin restricciones 23 y 24 se unen a p300 con afinidades significativas, cada uno de estos péptidos fallaron en la inhibición de la transcripción de VEGF en cultivo celular.

Se especuló que la incapacidad de los péptidos para inhibir la transcripción de VEGF reflejó su incapacidad para atravesar la membrana celular, ya que todos estos péptidos poseen cargas negativas en general a pH fisiológico, y los péptidos penetrantes de células son a menudo ricos en residuos catiónicos(Joliot & Prochiantz, "Transduction Peptides: From Technology to Physiology," Nat. Cell Biol. 6: 189-96 (2004)). Verdine y colaboradores demostraron recientemente que el aumento significativo de la captación celular de hélices de cadena lateral reticuladas se observa mediante la neutralización de cargas negativas y que incluye un conjunto limitado de residuos catiónicos (Bernal y otros, "Reactivation of the p53 Tumor Suppressor Pathway by a Stapled p53 Peptide," J. Am. Chem. Soc. 129:5298 (2007), la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad). Por tanto, la hélice HBS 22, que se deriva de la secuencia parental, pero contiene un residuo de arginina C-terminal, se diseñó y estudió para ensayar si la adición del residuo de arginina aumenta el contenido helicoidal por la estabilización del macrodipolo de la hélice y formación potencial de una interacción iónica i e i+4 entre grupos de cadena lateral de arginina y residuos de ácido glutámico (Shi y otros, "Stabilization of a-Helix Structure by Polar Side-chain Interactions: Complex Salt Bridges, Cation-n Interactions, and C-H...OH-bonds," Peptide Sci. 60:366-80 (2002)). Para simplificar la síntesis de estas hélices artificiales, el residuo de tirosina en el macrociclo se sustituyó por alanina (un residuo que no requiere protección de la cadena lateral). Un residuo de tirosina en cambio se incorporó en la posición 802, que está ocupado por valina en la secuencia de tipo salvaje y no se espera que esté involucrado en interacciones de unión. Se incluyeron residuos de tirosina o triptófano para la determinación de concentraciones de péptidos. El péptido 25 se diseñó como el análogo sin restricciones de la hélice HBS 22.

La hélice HBS 22 se une a p300 con una mejor afinidad que las hélices HBS 20 y 21 y el péptido 25, su péptido sin restricciones correspondiente, potencialmente debido a su mayor contenido helicoidal medido por espectroscopía de dicroísmo circular (ver Tabla 3 y Figura 6). Los espectros de CD de hélices HBS muestran un mínimo doble a 204 y 222 nm, que es característico de a-hélices, y el valor a 222 nm indica que el péptido restringido 22 es aproximadamente 55% helicoidal (Wang y otros, "Evaluation of Biologically Relevant Short a-Helices Stabilized by a Main-chain Hydrogen-bond," J. Am. Chem. Soc. 128:9248-56 (2006)). Como era de esperar, el péptido de control 25 parece ser no estructurado.

Como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 7, la hélice HBS 22 inhibió la transcripción en células HeLa a niveles comparables a los proporcionados por quetomina 2, mientras que el péptido de control lineal 25 tuvo un efecto insignificante.Este resultado posiblemente refleja la inestabilidad proteolítica del péptido sin restricciones, como se espera la estabilización de los péptidos en la conformación a-helicoidal para mejorar su resistencia a las proteasas (Tyndall y otros, "Proteases Universally Recognize Beta Strands in their Active Sites," Chem. Rev. 105:973-99 (2005)). Las mejoras en la estabilidad proteolítica de las a-hélices HBS en comparación con sus contrapartes no restringidas se ha reportado en (Wang y otros, "Enhanced Metabolic Stability and Protein-binding Properties of Artificial a Helices Derived from a Hydrogen-bond Surrogate: Application to Bcl-xL," Angew. Chem. Int'l Ed. 44:65259 (2005)). HBS hélice 22 fue diseñado para alterar la carga total del péptido y para estabilizar la conformación helicoidal.

La quetomina es un inhibidor más potente de la transcripción de VEGF que la hélice HBS 22, como 200 nM de quetomina proporciona niveles apenas similares de inhibición como 1 µM de hélice HBS 22. Sin embargo, la quetomina se sabe que es un reactivo tóxico mientras que la hélice HBS 22 no mostró citotoxicidad aparente en un ensayo de crecimiento celular, como se muestra en la Figura 8. Por tanto, la hélice HBS 22 parece ofrecer una potente inhibición de la transcripción de VEGF y sin la toxicidad aparente asociada con quetomina.

Ejemplo 5 - Síntesis y caracterización de hélices HBS de segunda generación direccionando el dominio CH1 de p300/CBP.

Los resultados expuestos en el Ejemplo 4 sugieren que hélice HBS 22 puede inhibir eficientemente las interacciones de HIF1/p300 en cultivo celular. Estos estudios implican que la presencia de la arginina terminal en la hélice HBS 22 puede ser importante para aumentar los efectos en los estudios de cultivo de células, aunque efectos similares pueden ser obtenidos por sustituciones de secuencia en el péptido 20. Experimentos adicionales se prevén en el que los análogos derivados de 5 los péptidos 20 y 22 son evaluados para desarrollar miméticos optimizados HBS de HIF-1, como se muestra en la Tabla 4. Varios compuestos son preparados para evaluar el papel de la carga en la actividad de estos compuestos en el cultivo celular. El péptido HBS 44 es un análogo del péptido 20 con una arginina terminal capaz de formar un puente de sal i e i+4 con el residuo de ácido glutámico. El análogo 45 consiste en dos residuos cargados positivamente. La sustitución de asparagina con un residuo de arginina en el péptido 44 puede proporcionar otro puente de sal i e i+ 4 (con el residuo de

10 ácido aspártico) y potencialmente estabilizar aún más la conformación helicoidal (Shi y otros, "Stabilization of a Helix Structure by Polar Side-chain Interactions: Complex Salt Bridges, Cation-n Interactions, and C-H...OH-bonds," Peptide Sci. 60:366-80 (2002)). La hélice HBS 46 es un análogo de di-arginina del péptido 22 y se diseñó para construir sobre la hélice HBS más activa. El derivado marcado con fluoresceína 47 se puede preparar para evaluar la distribución celular del péptido22. Otros análogos fluorescentes se pueden preparar según sea necesario.

Tabla 4. Péptidos HBS propuestos y Péptidos Control

Compuesto

Secuencia carga total Comentarios

20

-2 secuencia silvestre; inactiva en el cultivo celular

22

-1 secuencia modificada; activaen el cultivo celular

44

-1 análogo de 20 con arginina terminal

45

0 análogo de 44 con sustitución N a R

46

0 análogo de 22 con sustitución N a R

47

-- marcada con fluoresceína 22 para estudios de captación de célula

48

-2 imitación de hélice HIF-1aß

49-53

péptidos control imitadores de péptidos sin restricción de 44-48

Estas hélices HBS han imitado la hélice aA de HIF-1. Los imitadores de la segunda hélice (aB) en HIF-1 también pueden ser evaluados. Por ejemplo, la hélice HBS 48 representa el imitador directo de la hélice aB. Los análogos de péptidos sin 20 restricciones de cualquier hélice HBS pueden prepararse y evaluarse rutinariamente junto con la hélice HBS.

Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se demostraron y describieron en la presente, será obvio para aquellos con experiencia en la técnica que tales modalidades se proporcionan sólo a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones ocurrirán ahora por aquellos con experiencia en la técnica sin apartarse de la invención. Se debe entender que diversas alternativas a las modalidades de la invención descritas en la presente invención se pueden emplear en la práctica de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que estén cubiertos de ese modo los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un péptido de la Fórmula (I) que tiene una o más a-hélices estables, internamente restringidas:

   en donde R1 es un aminoácido, un péptido, -OR4, -CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, R4 es alquilo o arilo; o R1 tiene la fórmula:

   en donde A5 es un péptido, un residuo de aminoácido, un grupo acilo, o hidrógeno; y 15 cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo;

   es un enlace sencillo carbono-carbono o un enlace doble carbono-carbono que puede ser cis o trans; cada n es independientemente 1 o 2; R2 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; m es cualquier entero positivo; 20 A3 es

   en donde R9 es una cadena lateral de aminoácido;

   (i) A1 es Thr; A2 es Ser o Ala; A3 es Tyr o Ala; y A4 comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7, en donde X1 es Asp o Asn,

   X2 es Val, Cys, o Ala, X3 es Glu o Gln, X4 es Val o Tyr, X5 es Asn o Arg, X6 es Ala, y X7 es Arg o está ausente; o

   (ii) A1 y A2 son independientemente Glu o Gln; A3 es Leu; y A4comprende la fórmula LRX8LX9, donde L es Leu, R es 30 Arg, X8 es Ala o Tyr, y X9 es Asp o Asn; y

   R3 es un péptido, -OR6, -N(R7)2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R6 es un grupo alquilo o un grupo arilo, y cada R7 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo; y en donde el péptido modula la interacción entre entre C-TAD de HIF-1a y el dominio CH1 de p300/CBP.
2. 2. Un péptido como se reivindica en la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en: y

   15 en donde m y n son independientemente 1 o 2; y X is hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo.
3. 3. Un péptido como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, que imita al menos los residuos 796-804 o 20 residuos 816-823 del dominio de transactivación C-terminal del Factor 1a inducible por hipoxia.
4. 4. Una composición farmacéutica que comprende un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

   25 5. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar en la reducción de la transcripción de un gen en una célula, en donde la transcripción del gen es mediada por la interacción del Factor 1a inducible por hipoxia con la proteína de unión a CREB y/o p300.
5. 6. El péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el gen se selecciona del grupo que consiste

   30 en adenilato quinasa 3, aldolasa A, aldolasa C, enolasa 1, transportador de glucosa 1, transportador de glucosa 3, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa 1, hexoquinasa 2, factor de crecimiento tipo insulina 2, proteína de unión a IGF 1, proteína de unión a IGF 3, lactato dehidrogenasa A, fosfoglicerato quinasa 1, piruvato quinasa M, p21, factor de crecimiento transformante 3, ceruloplasmina, eritropoyetina, transferrina, receptor de transferrina, receptor adrenérgico a1B, adrenomedulina, endotelina-1, hemo oxigenasa 1, óxido nítrico sintasa 2, inhibidor 1 del activador de plasminógeno, factor de crecimiento vascular endotelial, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor FLT-1, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor KDR/Flk-1, y p35srg.
6. 7. Un peptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar para tratar o prevenir, en un

   sujeto que lo necesita, un trastorno mediado por interacci6n del Factor 1a inducible por hipoxia con la proteína de unión a CREB y/o p300.

   10 8. Un péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 7, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de isquemia de la retina, hipertensión pulmonar, retardo del crecimiento uterino, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, y cáncer.
7. 9. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar en la reducción o prevención de la 15 angiogénesis en un tejido.

8. 10.

   Un péptido para su uso como se reivindica en la reivindicación 9, para usar in vivo.

9. 11.

   Un péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 9, en donde el tejido es un tumor.

10. 12.

    Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para inducir apoptosis en una célula.

11. 13.

    Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para disminuir la supervivencia y/o proliferación de una célula.

12. 14. Un péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 13, en donde la célula es cancerosa o está contenida en la vasculatura endotelial de un tejido que contiene células cancerosas.
13. 15. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar en la identificación de un ligando potencial 30 de la proteína de unión a CREB y/o p300.
14. 16. Un péptido como se reivindica en la reivindicación 2, en donde m y n son 1, o m es 1 y n es 2, o m es 2 y n e 1, o ambos m yn son 2.