EA011861B1

EA011861B1 - Селективные агонисты рецепторов y2/y4 для терапевтического воздействия

Info

Publication number: EA011861B1
Application number: EA200601722A
Authority: EA
Inventors: Ту Шварц
Original assignee: 7ТиЭм ФАРМА А/С
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2009-06-30
Also published as: EP1786458A2; MXPA06010346A; US20080261871A1; AU2005224027B2; JP2007531714A; IL177682A0; GB0618812D0; GB2427550A; GB2427550B; BRPI0508861A; AU2005224027A1; CA2560166A1; WO2005089790A2; WO2005089790A3; EA200601722A1

Abstract

Y-Рецепторные агонисты, селективные к Y2 и Y4 рецепторам по сравнению с Y1 рецептором, пригодные для лечения, например, ожирения, представляют собой (a) PP-складчатые пептиды или РР-складчатые пептиды-миметики, которые содержат (i) C-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания, представленную -X-Thr-Arg-X-Arg-Tyr-C(=O)NRR, где Rи Rнезависимо обозначают водород или C-Cалкил, X обозначает Val, Ile, Leu или Ala, a Xобозначает Gln или Asn, или её консервативно замещённый вариант, в котором Thr замещён на His или Asn, и/или Tyr замещён на Trp или Phe; и/или Arg замещён на Lys, и (ii) N-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания, представленную как HN-X-Pro-X-(Glu или Asp)-, где Xотсутствует или обозначает аминокислотный остаток, a Xобозначает Leu или Ser, или консервативные замены Leu или Ser, или (б) указанный агонист содержит С-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания по определению в (i), см. выше, и указанную последовательность Y-рецепторного распознавания, связанную с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к N-концу указанной гексапептидной последовательности, причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации с помощью ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно, N-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания по определению в (ii), см. выше.

Description

Данное изобретение относится к пептидам или пептидным соединениям, которые ведут себя как селективные агонисты Υ2 и Υ4 относительно Υ1 рецепторов, и их применению при лечении состояний, чувствительных к активации Υ2 и/или Υ4 рецепторов, например при лечении ожирения и избыточного веса, и состояний, при которых они рассматриваются как содействующие факторы, и для регуляции/понижения секреции ЖКТ.

Предпосылки создания изобретения

Семейство пептидов с РР-складкой.

ΝΡΥ (нейропептид Υ) (человеческая последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 1), ΡΥΥ (пептид ΥΥ) (человеческая последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 2) и ΡΡ (панкреатический пептид) являются секретируемыми в природе гомологичными, содержащими последовательность из 36 аминокислот, амидированными по С-концу пептидами, которые характеризуются общей трёхмерной структурой (РР-складкой), поразительно устойчивой даже в разбавленном водном растворе и являющейся важной для рецепторного распознавания.

Первоначально с помощью рентгеновского кристаллографического анализа (РСА) более подробно была охарактеризована рентгеновская структура птичьего ΡΡ с разрешением до 0,98 А, и уникальная структура получила своё название от этого пептида (В1ипбе11 е! а1., 1981, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 78: 4175-79; С1оуег е! а1., 1984, Еиг. 1. Вюсйеш. 142: 379-85). Затем РР-складчатая структура других членов семейства была проанализирована, главным образом, с помощью ЯМР-спектроскопии. Как РСА, так и ЯМР-спектроскопии осуществляют, несомненно, в концентрированном или твёрдом состоянии; однако точный анализ методом кругового дихроизма подтверждает, что ΝΡΥ и ΡΡ даже в водном растворе принимают РР-складчатую структуру, необычную для такого малого пептида (ЕиЫепбогГГ е! а1., 1990, 1. Вю1. Сйеш. 265:11706-12). Важно отметить, что анализ протеолитической устойчивости пептидов и их фрагментов и аналогов чётко показывает, что, например, полноразмерный РР1-36 в разбавленном водном растворе сохраняет складчатую конфигурацию, которая защищает его от разрушения под действием некоторых ферментов, которые быстро и легко разрушают аналоги, не способные принять РР-складчатую структуру вследствие минорных замен (8с11\\'аг1х е! а1., 1990, Аппа1к ΝΥ Асаб. 8сЕ 611: 35-47).

РР-складчатая структура, общая для ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР, состоит из: 1) Ν-концевой полипролиноподобной спирали (соответствующей остаткам 1-8 с Рго2, Рго5 и Рго8), за которой следует 2) участок бетаповорота типа I (соответствующий остаткам с 9 по 12), далее следуют 3) амфифильная альфа-спираль (остатки 13-30), которая расположена антипараллельно полипролиновой спирали с углом около 152° между осями спиралей, и 4) С-концевой гексапептид (остатки 31-36). Складчатая структура стабилизирована за счёт взаимодействий между боковыми цепями амфифильной альфа-спирали, которые тесно переплетаются с тремя гидрофобными остатками пролина (8с11\\'аг1х е! а1., 1990). Помимо ключевых остатков в рецепторе, распознающем С-концевой гексапептид, именно ядерные гидрофобные остатки, которые являются консервативными в целом семействе РР-складчатых пептидов, стабилизируют РР-складчатую структуру. На фиг. 1А изображена последовательность №У с остатками, консервативными в ряду №У, РУУ и РР, показанными белыми буквами на тёмном фоне. На фиг. 1А также показаны элементы РР-складчатой структуры, описанные выше. Полагают, что С-концевой гексапептид, важный для рецепторного узнавания, является неструктурированным, но РР-складка обеспечивает устойчивый каркас, который презентирует С-концевой гексапептид рецепторам (иллюстрируется на фиг. 1В), которые до некоторой степени зависят или не зависят также от участков Ν-конца пептида. Анализ методом ЯМР-спектроскопии также показал, что дальние С- и Ν-концевые участки, например №Υ, являются скорее подвижными, это означает, что РР-складке постоянно угрожает опасность расстегнуть молнию на свободном конце.

№Υ является весьма распространённым нейропептидом, обладающим разнообразным действием в различных частях как центральной, так и периферической нервной системы, действующий с помощью различных субтипов рецептора в организме людей: Υ1, Υ2, Υ4 и Υ5. Основными №Υ рецепторами являются Υ1 рецептор, который обычно является постсинаптическим рецептором, передающим действие NΡΥ нейронов, и Υ2 рецептор, который обычно является пресинаптическим, ингибирующим рецептором. Это действительно имеет место в гипоталамусе, где NΡΥ нейроны, которые также экспрессируют антагонист/обратный агонист рецептора мелакортина АдКР (агути-родственный пептид), ведут себя как первичные сенсорные нейроны в стимулирующей ветвь дугообразного (аркуатного) ядра. Поэтому в этом сенсорном ядре для регуляции аппетита и потребления энергии ^Υ/Λ^ΚΡ нейроны, вместе с ингибирующими РОМС/САКТ нейронами, контролируют гормональный и питательный статус организма, так как эти нейроны являются мишенью как действующих продолжительно регуляторов, таких как лептин и инсулин, так и кратковременных регуляторов, таких как грелин и ΡΥΥ (см. ниже). Стимулирующие NΡΥ/АдΚΡ нейроны распространяются, например, на паравентрикулярное ядро - также гипоталамуса - где, как полагают, их постсинаптическими нацеленными рецепторами являются Υ1 и Υ5 рецепторы. NΡΥ является наиболее эффективным из известных соединений, способствующих повышению потребления пищи, так грызуны после интрацеребровентрикулярной (1СУ) инъекции №Υ едят до тех пор, пока они в буквальном смысле не лопнут. АдКР, полученный при использовании ^Υ/Λ^ΚΡ нейронов, ведёт себя как антагонист, главным образом, в отношении рецепторов меланокортинов типа 4 (МС-4) и блоки

- 1 011861 рует действие пептидов из РОМС, в основном аМЗН, на этот рецептор. Так как МС4 рецепторный сигнал действует как ингибитор потребления пищи, действие ЛдКР точно так же, как действие ΝΡΥ, является стимулирующим сигналом для потребления пищи (т.е. ингибирование ингибирования, угнетение угнетения). На ΝΡΥ/ЛдКР нейронах обнаружены ингибирующие пресинаптические Υ2 рецепторы, которые являются мишенью как локально высвобождающегося ΝΡΥ, так и кишечного гормона ΡΥΥ - другого РР-складчатого пептида.

ΡΥΥ выделяется в процессе еды пропорционально калорийности пищи энтероэндокринными клетками в дистальной части тонкого кишечника и ободочной кишки, действуя как на периферии на функцию ЖКТ, так и в центральной области как сигнал насыщения. Полагают, что периферически ΡΥΥ действует как ингибитор (удар под дых), например, двигательной функции верхнего ЖКТ, секреции желудочной кислоты и секреции экзокринных клеток поджелудочной железы. Полагают, что центрально ΡΥΥ действует, главным образом, на пресинаптические ингибирующие Υ2 рецепторы на ΝΡΥ/ЛдКР нейронах в дугообразном (аркуатном) ядре, к которому он поступает из крови (Вайегйат с1 а1., 2002, №1Шгс. 418: 650-4). Пептид выделяется в виде ΡΥΥ1-36, но часть (около 50%) циркулирует в кровотоке в виде ΡΥΥ3-36, который является продуктом разложения дипептидилпептидазы-ΐν, фермента, который удаляет дипептид с Ν-конца пептида при условии, что Ργο или А1а находятся в положении два, как во всех трёх РР-складчатых пептидах ΡΡ, ΡΥΥ и ΝΡΥ (ЕЬейеш е1 а1., 1989, Ρер!^бек, 10: 797-803). Таким образом, ΡΥΥ в кровотоке представляет собой смесь ΡΥΥ1-36, который действует как на Υ1, так и на Υ2 рецепторы (так же как Υ4 и Υ5 с различной аффинностью), и ΡΥΥ3-36, который обладает более низкой аффинностью в отношении рецепторов Υ1, Υ4 и Υ5 рецепторов, чем в отношении Υ2 рецептора.

ΡΡ представляет собой гормон, который выделяется эндокринными клетками в панкреатических островках, хотя регулируется исключительно вагусно холинергическими влияниями, выявляемыми, главным образом, при потреблении пищи (Зсйетай/, 1983, 6ак!гоеп!его1оду 85: 1411-25). ΡΡ оказывает различное действие на желудочно-кишечный тракт, но оно обычно не наблюдается в изолированных клетках и органах и, очевидно, зависит от отсутствия нарушения вагусной иннервации (Зсйетай/, 1983, 6ак!гоеп!его1оду 85: 1411-25). В соответствии с этим ΡΡ рецепторы, называемые Υ4 рецепторами, расположены, главным образом, в области пострема в стволе мозга с сильной экспрессией в моторных вагусных нейронах, активация которых вызывает периферические эффекты ΡΡ, и в ядрах одиночного пучка (ΝΤ8), активация которых вызывает действие ΡΡ как гормона насыщения (\У1ШесотЬ е! а1., 1990, Ат. 1. Ροδιοί. 259: 6687-91, Багкеп & Кг1к!епкеп 1997 Вгаш Век. Мо1. Вгаш Век. 48: 1-6). Следует отметить, что ΡΡ в крови имеет доступ к этой области мозга, так как гематоэнцефалический барьер пропускает в этой области, где обнаруживаются различные гормоны с периферии.

Недавно были приведены доводы, что влияние ΡΡ на потребление пищи частично опосредуется действием на нейроны - в особенности ΡОМС/САВΤ нейроны в дугообразном ядре (Вайегйат е! а1., 2004, АЬк!гас! 3.3 1п!етабопа1 ΝΡΥ Зутрокшт ίη Со1тЬга, ΡοΠυβηΙ). ΡΡ действует через Υ4 рецепторы, к которым он обладает аффинностью в субнаномолярных концентрациях, в отличие от ΡΥΥ и ΝΡΥ, которые проявляют аффинность к этому рецептору в наномолярных концентрациях (М1сйе1 е! а1., 1998, ΡΙκ-ιγтасо1. Веу. 50:143-150). ΡΡ также проявляет заметную аффинность к рецептору Υ5, но она, по-видимому, не имеет физиологического значения для циркуляции ΡΡ вследствие как отсутствия доступа к клеткам в ЦНС, где этот рецептор главным образом экспрессируется, и вследствие относительно низкой аффинности к ΡΡ.

Рецепторы ΡΡ-складчатых пептидов

Существует четыре точно установленных типа рецепторов РР-складчатых пептидов у человека: Υ1, Υ2, Υ4 и Υ5, которые распознают ΝΡΥ1-36 и ΡΥΥ1-36 с аналогичной аффинностью. Было высказано предположение о типе рецептора Υ3, который мог иметь предпочтение в отношении ΝΡΥ по сравнению с ΡΥΥ, но в настоящее время его не принимают как реальный подтип рецепторов (М1сйе1 е! а1., 1998, Ρ1κ·ιπικκο1. Веу. 50:143-150). Был клонирован подтип рецепторов Υ6, который в организме человека экспрессируется в усечённой форме, не содержащей ТМ-νΐΙ, а также в виде хвоста рецептора, и, следовательно, по меньшей мере, сам по себе, по-видимому, не может образовывать функциональную рецепторную молекулу.

Υ1 гесер!огк.

Исследования по аффинности наводят на мысль, что Υ1 одинаково хорошо связывается как с ΝΡΥ, так и с ΡΥΥ, но, в принципе, не с ΡΡ. Аффинность к Υ1 зависит от идентичности обеих концевых последовательностей РР-складчатой молекулы (ΝΡΥ/ΡΥΥ), например являются важными остатки Туг1 и Ργο2, и зависит от того, чтобы пептидные концы были представлены правильным образом. На С-конце, где важными являются боковые цепи некоторых остатков, Υ1 рецептор подобно Υ5 и Υ4 рецептору, но не Υ2 рецептору, допускает некоторые замены в положении 34 (обычно 61п), такие как Ργο (РиЫепбогГГ е! а1., 1990, 1. Вю1. Сйет. 265: 11706-12; ЗсйетаПх е! а1. 1990, Аппа1к ΝΥ Асаб. 8сг 61: 35-47). Сообщалось о некоторых исследованиях зависимости структура-функция, касающихся требований Υ1 и Υ2 рецепторов (Веск Зккшдег е! а1., 1994, Еиг. 1. Вюсйет. 225: 947-58; Веск Зюкшдег апб 1ипд, 1995, Вюро1утегк 37: 123-42; Зо11 е! а1., 2001, Еиг. 1. Вюсйет. 268: 2828-37).

- 2 011861

Υ2 рецепторы.

Исследования аффинности наводят на мысль, что Υ2 одинаково хорошо связывается как с ΝΡΥ, так и с ΡΥΥ, но, в принципе, не с РР. Для рецептора нужен, главным образом, С-конец ΡΡ-складчатого пептида (ΝΡΥ/ΡΥΥ). Таким образом, длинные С-концевые фрагменты, например вплоть до ΝΡΥ13-36 (целая альфа-спираль плюс С-концевой гексапептид), распознаются с относительно высокой аффинностью, т.е. в пределах десятикратной величины аффинности полноразмерного пептида (8йе1кй е! а1., 1989, РЕВ8 Ьей. 245: 209-14, 81κί1<1ι е! а1., 1989, 1. Вю1. Сйеш. 264: 6648-54). Следовательно, различные Ν-концевые делеции, которые приводят к утрате связывания с Υ1 рецептором, позволяют всё ещё до некоторой степени сохранять связывание с Υ2 рецептором. Однако аффинность С-концевых фрагментов снижается, примерно, в 10 раз по сравнению с ΝΡΥ/ΡΥΥ даже для сравнительно длинных фрагментов. Остаток О1и в положении 34 ΝΡΥ и ΡΥΥ является в высшей степени важным для распознавания лиганда Υ2 рецептором (8с11\\'аг1х е! а1., 1990, Апиак ΝΥ Асаб. 8с1. 611: 35-47).

Υ4 рецепторы.

Исследования аффинности указывают, что Υ4 связывает ΡΡ в субнаномолярных концентрациях (субнаномолярная аффинность), соответствующих концентрациям, обнаруживаемым в плазме, тогда как ΝΡΥ и ΡΥΥ распознаются со значительно более низкой аффинностью. Такие исследования наводят на мысль, что Υ4 рецептор в высшей степени зависим от С-конца ΡΡ-складчатых пептидов и что относительно короткие Ν-концевые делеции уменьшают аффинность лигандов. Сообщалось о некоторых исследованиях структура-активность, относящихся к Υ4 рецептору (ОеЫей е! а1., 1996, Мо1. Ρйа^тасο1. 50: 112-18; \\а1кег е! а1., 1997, Ρеρ!^беκ 18: 609-12).

Υ5 рецепторы.

Исследования аффинности показывают, что Υ5 одинаково хорошо связывается с ΝΡΥ и ΡΥΥ, но также связывается с ΡΡ с более низкой аффинностью, которая, однако, ниже обычных уровней этого гормона в кровотоке. ΡΥΥ3-36 также хорошо распознаётся рецептором Υ5, однако этот рецептор по большей степени экспрессируется в ЦНС, где такой пептид не может легко получить доступ к рецептору при введении на периферии.

ΡΡ-складчатые пептиды и их аналоги были предложены для применения при лечении ожирения и связанных с этим заболеваний, включая, например, синдром Прадера-Вилли, на основании действия этих пептидов, продемонстрированного на животных моделях и на человеке, и на основании того факта, что у людей с избыточным весом (ожирением) наблюдаются низкие базальные уровни ΡΥΥ и ΡΡ, а также более слабые реакции этих пептидов на пищу (Нок! 1.1. е! а1., 1983, Ιη!. 1. ОЬек. 7: 529-38; Вайетйаш е! а1., 1990, №1Шге). Первоначально было показано, что вливание ΡΡ больным с синдромом Прадера-Вилли ΡΡ снижает потребление пищи (Веткой е! а1., 1993, Ρеρ!^беκ, 14: 497-503), и этот эффект был подтверждён вливанием ΡΡ здоровым людям (Вайетйаш е! а1., 2003, С1ш. Епбосгшок Ме!аЬ. 88: 3989-92). РР-складчатые пептиды также были предложены для применения при аналогичном терапевтическом ангиогенезе (2икотека е! а1., 2003, Тгепбк Сатбюуакс. Меб. 13: 86-92) и при воспалительном заболевании кишечника (см., например, Международную заявку \УО 03/105763).

Однако нативные РР-складчатые пептиды не являются оптимальными для применения в качестве биофармацевтических веществ. Например, полноразмерные пептиды ΡΥΥ1-36 и ΝΡΥ1-36 реагируют слишком неизбирательно со всеми типами рецепторов Υ и, следовательно, будут вызывать побочные эффекты в сердечно-сосудистой системе и, например, рвоту, кроме того, природные пептиды не оптимизированы по устойчивости белка, так как их готовят таким образом, чтобы они действовали в течение сравнительно короткого времени в качестве нейропептида или гормона. Природный, более селективный в отношении Υ2 пептид, ΡΥΥ3-36, имеет, например, искажённую тыльную сторону, так что его РР-складчатая структура ухудшена вследствие элиминирования важного остатка Ρ^ο2 полипролиновой спирали, который в полноразмерном пептиде взаимодействует с Туг27 в амфифильной спиральной области молекулы.

Для лечения состояний, откликающихся на Υ-рецепторную модуляцию, желательно, следовательно, использовать Υ-рецепторные РР-складчатые пептиды или РР-складчатые пептиды-миметики, специфические в отношении выбранного Υ рецептора, предполагаемого в качестве мишени, и которые устойчиво сохраняют элементы ΡΡ-складчатой структуры, важные для рецепторного связывания. В частности, было бы в высшей степени желательно использовать такие агенты, которые селективны в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов по сравнению с Υ1 рецептором. При некоторых состояниях, таких как ожирение и секреторная диарея, применение агониста как Υ2, так и Υ4 является благотворным. Поэтому одно соединение, обладающее обоими этими свойствами - агонизм Υ2 и Υ4 - было бы в высшей степени выгодным. Однако для клинических показателей важно, чтобы такое соединение было не только заметным агонистом рецептора Υ1, так как стимуляция Υ1 рецептора ведёт к нежелательным побочным эффектам, таким как вредное воздействие на сердечно-сосудистую систему (например, повышение артериального давления) и на почки (например, натрийурез). Существуют природные соединения, которые являются селективными агонистами Υ2 рецептора в противоположность Υ2 рецептору, такие как ΡΥΥ3-36, и которые предлагаются, например, для лечения ожирения. Имеются также соединения, которые являются селективными агонистами Υ4 рецептора по сравнению с Υ1 рецептором, такие как природный пептид ΡΡ, которые так

- 3 011861 же предлагаются для лечения ожирения. Имеются также соединения, которые, например, являются комбинированными агонистами Υ1 и Υ2 рецепторов, такие как природные пептиды ΡΥΥ и ΝΡΥ. Однако не сообщалось ни об одном известном соединении, которое было бы эффективным агонистом как Υ2, так и Υ4 рецептора. Более того, ранее не предлагалось использовать комбинированный Υ2 и Υ4 агонист с селективностью к Υ1 рецептору для терапевтического применения.

Некоторые общие термины, применяемые в описании

Аффинность: Аффинность пептида к специфическому рецептору выражается, например, величиной 1С₅о, или величиной К₁, или К_б, которая в конкретном неограничивающем примере определяется анализом, например, таким как анализ конкурентного связывания. Значение 1С₅₀ соответствует концентрации пептида, который замещает (релевантный для данного рецептора) радиоактивный лиганд, применяемый в количестве, значительно меньшем, чем К_б для этого радиоактивного лиганда, на 50%.

Аппетит: Естественная потребность в еде или сильное желание еды. Повышенный аппетит обычно приводит к повышенному пищевому поведению.

Супрессоры аппетита: Соединения, понижающие потребность в еде.

Связывание: Специфическое взаимодействие между двумя молекулами такое, что две молекулы взаимодействуют. Связывание с рецептором может быть специфическим и селективным, так что преимущественно связывается одна молекула по сравнению с другой молекулой. Специфическое связывание можно определять константой диссоциации К_б. Эта величина зависит от селективности испытуемого соединения. Например, соединение с К_б ниже 10 нМ обычно считается прекрасным возможным лекарством. Однако соединение с низкой аффинностью, но селективное в отношении конкретного рецептора, также может быть хорошим возможным лекарством.

Индекс массы тела (ИМТ, ΒΜΙ): Математическая формула для измерения массы тела, иногда также называемая индексом Кветеля. ΒΜΙ рассчитывают как частное от деления массы (кг) на рост (м). Современными стандартами как для мужчин, так и для женщин, принятыми за нормальные, являются ΒΜΙ около 20 кг/м². В одном варианте изобретения для определения страдающего ожирением субъекта можно применять ΒΜΙ выше 25 кг/м². Первая степень ожирения соответствует ΒΜΙ 25 кг/м². Вторая степень ожирения соответствует ΒΜΙ 30-40 кг/м² и третья степень ожирения соответствует ΒΜΙ выше 40 кг/м²Исс.|шсг. 1987, Αίη. 1. Сйи. ΝιιΙγ. 45: 1035-47). Идеальный вес тела различен у разных видов и индивидуумов и зависит от роста, строения тела, строения костей и пола.

Потребление калорий, потребление в калориях: Число калорий (энергия), потребляемых индивидуумом. В контексте настоящего изобретения этот термин идентичен термину потребление энергии.

Косметическое лечение: Предполагается, что этот термин обозначает лечение не с медицинской целью, но для улучшения качества жизни субъекта, например внешнего вида субъекта. Этот термин включает лечение субъекта, желающего снизить свой вес, не будучи человеком, страдающим избыточным весом или ожирением.

Потребление пищи: Количество пищи, потребляемой индивидуумом. Потребление пищи можно измерять объёмом или весом. Это выражение включает: ί) потребление пищи как общее количество поглощённой индивидуумом пищи; и ιί) потребление пищи как количество белков, жиров, углеводов, холестерина, витаминов, минералов или любых других пищевых компонентов, поглощённых индивидуумом. Соответственно, выражение потребление пищи в контексте настоящего изобретения аналогично выражению потребление энергии.

Нормальная дневная диета: Среднее потребление пищи индивидуумом данного вида. Нормальную дневную диету можно выражать терминами потребление калорий, потребление белков, потребление углеводов и/или потребление жиров. Нормальная дневная диета человека обычно содержит следующее: от около 2000, около 2400 или около 2800 до значительно большего числа калорий. Кроме того, нормальная дневная диета человека обычно включает примерно 12-45 г белка, около 120-610 г углеводов и около 11-90 г жиров. Низкокалорийная диета составляет, примерно, не более 85% и предпочтительно не более 70% нормального потребления в калориях человека. У животных потребности в калориях или в пище меняются в зависимости от вида и размера животного. Например, у кошек общее потребление калорий на кг, а также распределение белков, жиров и углеводов в процентах меняется с изменением возраста кошки и репродуктивного состояния.

Ожирение: Состояние, при котором избыточный вес тела может стать причиной повышенного риска для здоровья человека (см. ΒαΗο\ν аиб Эхе!/, Реб1а!пс8 102:Е29, 1998; Ναΐίοηαΐ ΙηδΙίΙηΙοδ о£ НеаИй, Να!юиа1 Неай, Биид аиб Β1οο6 ИъШЩе (ΝΗΕΒΙ), ОЬек. Век. (§ирр1. 2): 51 82098, 1998). Избыточный телесный жир является результатом дисбаланса между потреблением и расходом энергии. В одном варианте изобретения для оценки ожирения применяют индекс массы тела (ΒΜΙ). В одном варианте изобретения ΒΜΙ примерно от 22 кг/м² (т.е. примерно на 10% выше нормального значения) и примерно до 30 кг/м²рассматривается как избыточный вес, особенно примерно от 25 до 30 кг/м², тогда как ΒΜΙ 30 кг/м² или выше рассматривается как ожирение.

Избыточный вес: Вес индивидуума (человека), который выше идеального веса его тела. Человек с избыточным весом может страдать ожирением, но необязательно ожирением. В одном варианте изобретения человеком, страдающим избыточным весом, является любой индивидуум, желающий снизить свой

- 4 011861 вес. В другом варианте изобретения человек с ΒΜΙ примерно от 22 кг/м² (т.е. примерно на 10% выше нормального значения) и примерно до 30 кг/м² рассматривается как человек, страдающий избыточным весом, особенно примерно от 25 до 30 кг/м². Следует отметить, что субъекты, имеющие ΒΜΙ немногим выше нормального значения (например, около 22-25 кг/м²), очень часто желают снизить вес, хотя только в косметических целях.

Эффективность (активность): Ιη νίΐτο эффективность соединения определяется величиной ЕС₅₀, т.е. концентрацией, которая даёт 50% максимально достижимого эффекта, определяемого релевантным для данного рецептора анализом передачи сигнала.

Субъект: Субъект может быть любым субъектом, включая как человека, так и млекопитающих, следовательно, субъект может быть человеческим или нечеловеческим приматом, сельскохозяйственным животным, таким как свиньи, крупный рогатый скот, овцы и птицы, спортивным или домашним животным, таким как собаки, кошки, лошади, хомяки, и грызунами.

Терапевтически эффективное количество: Доза, достаточная для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности состояния или заболевания и/или для ослабления специфических признаков или симптомов конкретного состояния или заболевания. Термин (выражение) включает дозу, достаточную для предупреждения прогрессирования или для того, чтобы вызвать регрессию нарушения, или дозу, способную облегчить признак или симптом нарушения, или дозу, которая позволяет достичь нужного результата. В вариантах изобретения, относящихся к косметическому лечению или к лечению избыточного веса или ожирения, терапевтический эффект рецепторного агониста определяется количеством, достаточным для ингибирования или прекращения увеличения веса тела, или количеством, достаточным для снижения аппетита, или количеством, достаточным для уменьшения потребления энергии или пищи или для повышения расхода энергии. Предполагается, что выражение (термин) косметически эффективное количество обозначает дозу, достаточную для достижения нужного эффекта при лечении субъекта.

Подробное описание изобретения

В своём самом широком аспекте настоящее изобретение охватывает применение Υ-рецепторного агониста, селективного в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов по сравнению с Υ1 рецептором, для получения композиции для лечения состояний, откликающихся на активацию Υ2 и/или Υ4 рецепторов, причём:

(а) указанный агонист является РР-складчатым пептидом или РР-складчатым пептидом-миметиком, который содержит:

(ί) С-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как Х-ТЬг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)НВ¹В², где К.¹ и В², независимо, обозначают водород или С₁-С₆ алкил, X обозначает Уа1, 11е, Ьеи или А1а, а X³ обозначает С1п или Акп, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТЬг замещён на Ηίκ или Акп, и/или Туг замещён на Тгр или РЬе: и/или Агд замещён на Ьук, и (ίί) Ν-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как Η₂Ν-Χ¹-Ργο-Χ²-(Ο1π или Акр)-, где X¹ отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X² обозначает Ьеи или 8ег, или консервативные замены Ьеи или 8ег, или (б) указанный агонист содержит:

С-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания по определению в (ί), см. выше, указанную последовательность Υ-рецепторного распознавания, слитую с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанной гексапептидной последовательности, указанный поворот заключён в спиральной конфигурации с помощью ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно,

Ν-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Υрецепторного распознавания по определению в (ίί), см. выше.

Специфическая терминология, относящаяся к изобретению

Агонисты, к которым относится настоящее изобретение, являются селективными в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов по сравнению с Υ1 рецептором. В контексте настоящего изобретения это условие выполняется, если величина 1С₅₀ агониста по меньшей мере в 10 раз ниже в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов, чем в отношении Υ1 рецептора, при определении методами анализа аффинности по данному описанию. В целом, что касается эффективности (активности), величина ЕС₅₀ агонистов по данному изобретению также по меньшей мере в 10 раз ниже для Υ2 и Υ4 рецепторов, чем в отношении Υ1 рецептора, как определено анализом активности по данному описанию. Некоторые из предпочтительных агонистов по данному изобретению имеют величины аффинности и эффективности по меньшей мере в 100 раз выше в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов, чем в отношении Υ1 рецептора.

Для целей данного описания РР-складчатый пептид представляет собой молекулу, имеющую 3-Ό структуру, которая, будучи картирована в оригинальной 3-Ό структуре птичьего РР, определённой методом РСА (В1ипбе11 е1 а1., 1981, Ргос. Να11. Асаб. 8с1. И8А 78: 4175-79; С1отег е1 а1., 1984, Еиг. 1. Вюсбеш. 142: 379-85), имеет домены, соответствующие доменам Ν-концевой полипролиноподобной спирали, области бета-поворота типа I, амфифильной альфа-спирали и С-концевого гексапептида указанного ΝΓΥ,

- 5 011861

ΡΥΥ и/или РР и практически выравниваемые в них (фиг. 1). Таким образом, описание различных доменов РР-складчатых пептидов, применяемых в данном изобретении, относится к оригинальной рентгеновской структуре птичьего РР (В1ипйе11 е! а1., 1981, Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И8А 78: 4175-79; С1оуег е! а1., 1984, Еиг. 1. ВюсНет. 142: 379- 85; 8с11\\'аг1х е! а1., 1990).

РР-складчатый пептид-миметик по настоящему описанию обозначает молекулу, имеющую 3-Ό структуру, которая, при картировании на оригинальной 3-Ό структуре птичьего РР, по меньшей мере, имеет домены, соответствующие доменам последнего поворота амфифильной альфа-спирали и С-концевого гексапептида РР и практически выравниваемые в них. РР-складчатые пептид-миметики могут также, при вышеуказанном картировании, иметь домены, соответствующие одному или более остальных поворотов амфифильной альфа-спирали, Ν-концевой полипролиноподобной спирали и области бета-поворота типа I. Пептид-миметик необязательно состоит исключительно из последовательности альфа-аминокислот, связанных классическими пептидными связями. Одна или более связей в такой последовательности может быть замещена пептидомиметическими связями, такими как обратная амидная и восстановленная пептидная связи, так что пептид-миметик можно рассматривать как псевдопептидную последовательность. Такие замены связей могут придать устойчивость к расщеплению эндопептидазой и улучшить фармакодинамические свойства молекулы.

Такие сравнения 3-Ό структуры, как упомянутые в выше приведённых определениях РР-складчатого пептида и РР-складчатого пептида-миметика, можно делать, конструируя модели молекул сравнения на основании координат их атомов, определяемых, например, методом РСА, или с помощью одной или более компьютерных программ, выпускаемых для визуализации прогнозируемой на основании структурной формулы 3-Ό структуры молекулы, например МаеЧго Мойе1шд Епуноптеп! от 8сЬгойшдег 1пс, 1500 8. Ига! Ауепие, 8ш!е 1180 Рогйапй, ОК. 97201; Ιπδίβΐιΐ II Мойейпд Епуноптеп!, версия 4.0, от Ассе1гу§ 1пс. 8ап Эгецо и 8ΥΒΥΕ® 7.0 от Тйрок 1пс., 1699 8оШ11 Нап1еу Кй., 8!. Ьоига, Мгакошт, 63144, И8А. Следует отметить, что 3-Ό структура РР-складчатого пептида или РР-складчатого пептида-миметика по настоящему изобретению необязательно должна точно соответствовать, и обычно не соответствует точно, 3-Ό структуре природного №Υ, ΡΡΥ или РР. Наблюдаемая 3-Ό структура РР-складчатого пептида или РР-складчатого пептида-миметика в значительной степени зависит от применяемых экспериментальных условий, и в особенности малые пептиды могут казаться более или менее скрученными в определённых условиях. Однако достаточно, чтобы РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик имел домены, соответствующие РР-складчатым доменам, описанным выше, и чтобы он имел структурные элементы для того, чтобы принять общую определённую форму, аналогичную форме нативного пептида, в котором С-концевая и, при наличии, Ν-концевая последовательности были нормально ориентированы.

Агонисты, к которым относится данное изобретение, имеют С-концевую последовательность Υ-рецепторного распознавания (распознавания Υ рецептором). Эта последовательность, обычно содержащая около 5-7 остатков и, в особенности, гексапептидную последовательность, расположена на С-конце агониста, которая, в случае её присутствия в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде-миметике, связывается с Υ рецептором и активирует рецептор за счёт только лишь этого связывающего взаимодействия, или в результате такого связывающего действия и связывания с Υ рецептором Ν-концевой Υ-рецепторной последовательности, имеющейся в агонисте. Ν-концевая последовательность Υ-рецепторного распознавания (распознавания Υ рецептором) представляет собой последовательность, обычно содержащая около 3-5 остатков, главным образом, 4 остатка, расположенную на Ν-конце агониста, которая, в случае её присутствия в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде-миметике, связывается с Υ рецептором и активирует рецептор за счёт комбинации такого связывающего действия и связывания с Υ рецептором С-концевой Υ-рецепторной последовательности, имеющейся в агонисте. Классические С- и Ν-концевые последовательности Υ-рецепторного распознавания представляют собой последовательности, обнаруживаемые в природных РР, №У и ΡΡΥ пептидах, но как станет очевидно из данного описания, эти классические последовательности можно модифицировать для того, чтобы распознавать Υ2 и Υ4, но уменьшить распознавание Υ1. В данном описании выражение, такое как остаток, соответствующий положению Ν №У', является ссылкой на аминокислотный остаток агониста, который, при картировании 3-Ό структуры агониста на №Υ, отображается (картируется) наиболее близко к остатку Ν №Υ. Действительная нумерация конкретного остатка в специфическом пептиде может отличаться от Ν, например, вследствие делеций в специфическом пептиде относительно природных пептидов.

В целом, РР-складчатые агонисты или РР-складчатые агонисты-миметики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, обычно имеют пептидный каркас или частично пептидный каркас, по меньшей мере, имеют С-концевую аминокислотную последовательность и, обычно, Ν-концевую аминокислотную последовательность, хотя остальная часть каркаса может представлять собой непептидный линкерный радикал, например линейную или разветвлённую алкиленовую цепь. Аминокислоты, присутствующие на пептидном(ых) участке(ах) агонистов, обычно являются природными, особенно в С- и Ν-концевых последовательностях, которые взаимодействуют с Υ2 и Υ4 рецепторах, но также могут присутствовать неприродные альфа-аминокислоты, которые поддерживают РР-складку, но не предупреждают Υ2- и Υ4-рецепторное связывание.

- 6 011861

Если агонист по настоящему изобретению содержит С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности, то С-концы могут быть амидированы и/или Ν-концы могут быть ацилированы с целью придать резистентность карбокси- и/или аминопептидазам. На самом деле С-конец нативных ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР пептидов амидирован, так что С-концевая аминокислота агониста по изобретению также амидирована.

В данном описании ссылки на аминокислоты даются в виде их обычных названий или в виде сокращений, например валин (Уа1), лейцин (Ьеи), изолейцин (11е), метионин (Ме'!), фенилаланин (РЬе), аспарагин (Лзп), глутаминовая кислота (О1и), глутамин (О1п), гистидин (Η13), лизин (Ьуз), аргинин (Агд), аспарагиновая кислота (Азр), глицин (О1у), аланин (А1а), серин (8ег), треонин (ТЬг), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Суз) и пролин (Рго). Когда называется обычное название или аббревиатура без указания стереоизомерной формы, следует понимать, что речь идёт об Ь-форме рассматриваемой кислоты. Когда подразумевается Ό-форма, она специально указывается в названии аминокислоты. Иногда, когда этого требует контекст, I .-форма скорее описывается, нежели подразумевается.

Термин консервативная замена по данному описанию обозначает, что одна или более аминокислот замещены на другой, биологически сходный остаток. Примеры включают замену на аминокислотные остатки со сходными характеристиками, например малые аминокислоты, кислые аминокислоты, полярные аминокислоты, основные аминокислоты, гидрофобные аминокислоты и ароматические аминокислоты. Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают консервативные аминокислотные замены, представленные в приведённой ниже таблице, и аналогичные замены исходного остатка неприродными альфа-аминокислотами с аналогичными характеристиками. Например, в предпочтительном варианте изобретения остатки Ме! замещаются на норлейцин (Ме), биоизостер Ме!, который, в отличие от Ме!, трудно окисляется. Другим примером консервативной замены на остаток, обычно не присутствующий в эндогенных пептидах и белках млекопитающих, является консервативная замена Агд или Ьуз, например, на орнитин, канаванин, аминоэтилцистеин, или другая основная аминокислота. Более подробные сведения о фенотипически молчащих заменах в пептидах и белках даны, например, в Бомте е! а1. 8с1епсе, 247, 1306-1310, 1990.

Исходный остаток	Консервативная замена
А1а	О1у
Агд	Ьуз
Азп	С1п, Н18, ТЬг
Азр	Сг1и
С1п	Азп, Н1з
О1и	Азр
Н1з	Азп, С1п
Не	Ьеи, Уа1
Ьеи	Пе, Уа1
Ьуз	Агд
Ме!	Ьеи, Пе
РЬе	Туг, Тгр, Н18
Зег	ТЬг, Азп
ТЬг	Зег, Азп, С1п
Тгр	Туг, РЬе, Н18
Туг	Тгр, РЬе, Н18
Уа1	Пе, Ьеи

Если не указано иначе в контексте, в котором он встречается, термин замещённый в применении к любому фрагменту по данному описанию означает имеющий до четырёх совместимых заместителей, каждый из которых, независимо, может представлять собой, например, (С1-С6)алкил, (С1-С6)алкокси, гидрокси, гидрокси(С₁-С₆)алкил, меркапто, меркапто(С₁-С₆)алкил, (С₁-С₆)алкилтио, галоген (включая фтор, бром и хлор), трифторметил, трифторметокси, нитро, нитрил (-ίΝ), оксо, фенил, -СООН, -СООК^А, -СОК^А, -У )А/ -СОЯ^, -^2ΝΗ2, -С( )ΝΗ[χ\ -У ΓΝΙΙΙ// -СОИК^АВ^в, -У )Л'[С[Г. -ΝΗ2, -\Н1</ -У1С1Г. -()С( )\1 М/ -()С( -Ν 1С( Ш / -\11С()(Ш / -\1ГС()(Ш/ -\11У Н )1С. -NΚ^в8О2ОΗ, -ΝΗ^Ν^,

-ΝΡΎΌΝΙ 1₂, -\11С( )\1 НЕ/ -\[С'С( )\Ί ΙΙΓ. -\11С( )\[С1Г или -У! СО\У К, где К^А и К^в, независимо, обозначают (С₁-С₆)алкильную группу. Возможный (необязательный) заместитель может представлять собой одну из приведённых выше замещающих групп.

Если контекст не диктует иначе, ссылки по данному описанию на ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР пептиды и их последовательности относятся к человеческим формам этих пептидов и их последовательностям. Однако часто ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР пептиды других млекопитающих составляют РР-складчатые пептиды-миметики человеческих ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР или консервативно замещённых человеческих ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР, когда эти термины применяются в данном описании.

Агонисты типа (а) для применения по данному изобретению

Обычно агонисты типа (а) являются РР-складчатыми аналогами ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР или РРскладчатыми миметиками ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР, имеющими модификации для того, чтобы гарантировать различие (разделение) аффинности и активности в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов по сравнению с Υ1 рецетором. Такие РР-складчатые аналоги и миметики включают пептиды, имеющие полный комплемент ха

- 7 011861 рактеристик РР-складчатых пептидов (Ν-концевую полипролиноподобную спираль, бета-поворот, амфифильную альфа-спираль и С-концевой гексапептид), пептидные аналоги, в которых часть каркаса (например, остатки бета-поворота и прилегающие остатки) замещена на непептидную спейсерную цепь, и усечённые (процессированные) пептиды, содержащие С-концевой гексапептид и последний поворот амфифильной альфа-спирали, но не содержащие целую полипролиноподобную спираль или её часть и/или весь бета-поворот или его часть.

В С-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания агонистом по данному изобретению В¹ и В², каждый независимо, предпочтительно обозначают водород. Предпочтительно также остаток X обозначает Уа1 или 11е. В тех случаях, когда агонист по изобретению является РР последовательностью с модификациями по изобретению на С-конце, остаток X может представлять собой, например, Ьеи, Уа1 или 11е. В тех случаях, когда агонист по изобретению представляет собой ΡΥΥ или ΝΡΥ последовательность с С-концевыми модификациями по данному изобретению, остаток X может являться, например, Уа1 или 11е.

В одном варианте изобретения агонисты, которые рассматривает данное изобретение, содержат Сконцевую последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как -Х^А-Х-Тйг-Агд-Х³Агд-Туг-С(=О)ХВ¹В², где остаток Х^А не является основным или кислым, а последовательность -Х-ТЬгΑΓβ-Χ³-ΑΓβ-ΤνΓ-ί''(=Ο)ΝΒ^ιΒ² определяется выше. В этом случае не основный и не кислый аминокислотный остаток Х^А может представлять собой, например, Ьеи, Ме! или Ме, 11е, Уа1 или А1а.

В другом варианте изобретения агонист содержит С-концевой ундекапептид, представленный как -Х^С-Туг-Х^в-Аки-Х^А-Х-Тйг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХВ¹В², где последовательность -Х^А-Х-Тйг-Агд-Х³-АгдТуг-С(=О)МВ¹В² определяется выше, Х^с обозначает Агд или Ьук, а Х^в обозначает 11е, Ьеи или Уа1. В агонисте такого класса С-концевая ундекапептидная последовательность представляет собой -Агд-Туг-ЬеиАки-(Ъеи или Ме!)-Уа1-Тйг-Агд-61и-Агд-Туг-С(=О)МН₂.

В другом варианте изобретения агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность, представленную как -Х^С-Туг-Х^в-Аки-Х^А-Х-Тйг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХВ¹В², где определение последовательности -Х^А-Х-Тйг-Агд-С1и-Агд-Туг-С(=О)ХВ¹В² дано выше, Х^С обозначает НА Акп или Ст. а Х^в обозначает 11е, Ьеи или Уа1. В агонисте такого класса С-концевая ундекапептидная последовательность представляет собой -Н1к-Туг-(11е или Ьеи)-Аки-Ме!-Ьеи-Тйг-Агд-С1и-Агд-Туг-С(=О)МН₂.

В С-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания агонистов типа (а), которые рассматриваются в настоящем изобретении, остаток Х¹ предпочтительно обозначает А1а, или может отсутствовать, а остаток Х² предпочтительно обозначает Ьеи, 11е или 8ег. Следовательно, одной предпочтительной Ν-концевой последовательностью является Н₂М-А1а-Рго-Ьеи-С1и-. Другой предпочтительной Ν-концевой последовательностью является последовательность Н₂М-Рго-Ьеи-С1и-.

Агонисты типа (Ь) для применения по данному изобретению

Обычно агонисты типа (Ь) можно рассматривать как типа (а) аналоги РР-складчатых пептидов или РР-складчатые миметики, минимальные структурные признаки которых (С-концевая последовательность Υ-рецепторного распознавания и последний поворот альфа-спирали) стабилизированы с помощью определённой внутримолекулярной ковалентной связи.

Типа (Ь) агонисты, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут являться РР-складчатыми миметиками, которые содержат Ν-концевую последовательность Υ-рецепторного распознавания, обсуждавшуюся выше в связи с агонистами типа (а), или они могут быть усечёнными по Ν-концу РР-складчатыми миметиками, которые не содержат Ν-концевой последовательности Υ-рецепторного распознавания типа, описанного для агонистов типа (а) (хотя они могут иметь другие Ν-концевые аминокислотные последовательности). Следовательно, Ν-концевая последовательность распознавания рецептором по определению для агонистов типа (а) не обязательна для класса агониста типа (Ь).

Агонисты этого типа характеризуются внутримолекулярной связью, которая либо не имеет эквивалента в нативных №Υ, ΡΥΥ или РР пептидах, либо соответствует нековалентному взаимодействию, или замещает нековалентное взаимодействие с ковалентной связью, например, ковалентный дисульфидный мостик между Сук2 и Э-Сук27 в [Сук2,П-Сук27,С1и34]РР (8ЕО ΙΌ Νο: 22). Установлено, что такая связь может служить для стабилизации обязательных элементов РР-складчатой структуры, в частности подвижной С-концевой последовательности Υ2-распознавания и последнего поворота альфа-спирали, и/или презентации Ν-конца. В полноразмерных или близких к полноразмерным пептидах такая связь может стабилизировать нативную РР-складчатую структуру как таковую. Это выгодно по двум причинам: вопервых, она стабилизирует С-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, оптимально повышая активность в отношении Υ рецептора; во-вторых, за счёт стабилизации целой РР-складки как таковой пептид становится менее чувствительным к протеолитическому расщеплению, так как для таких ферментов часто требуется, чтобы такие целевые последовательности находились в относительно нескрученной форме (8ο1ι\ν;·ΐΓΐζ е! а1., 1990). Внутримолекулярная связь может также способствовать Υ2/Υ4-селективным агонистам, которые трудно модифицируются сравнительно со структурой нативных пептидов, например агонистам, у которых отсутствует один или более доменов, или участков доменов, имеющихся в нативных пептидах.

- 8 011861

Одна группа такого типа (Ь) имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания с Ν-концевым участком агониста, в соответствии с доменом полипролина РР-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену. Сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь, например дисульфидная или лактамная связь, в вышеприведённых случаях может простираться от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из остатков в полипролиноподобном домене. Если агонист является РР-складчатым миметиком, первые четыре аминокислотных остатка которого картируются на соответствующие Ν-концевые положения РР, ΝΡΥ или ΡΥΥ, сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь, например дисульфидная или лактамная связь, в вышеприведённых случаях может тянуться от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из этих четырёх Ν-концевых остатков, как, например, в [Сук2,П-Сук27,О1п34]РР (81Т) ГО Νο: 22).

В другой группе агонистов типа (Ь) сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь соединяет остатки в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например лактамная связь между остатками Ьук и О1и в спиральном повороте, или остаток в С-концевой аминокислотной последовательности Υ2-распознавания и остаток в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например лактамный мостик между Ьук28 и О1и32 [Ьук28,61и32]РР25-36 (8ЕЦ ГО Νο: 28).

Агонисты типа (а) и (Ь)

В одной группе РР-складчатых агонистов-миметиков, рассматриваемых в данном изобретении, типа (а) и (Ь), в которых агонист содержит как С-концевую, так и Ν-концевую последовательность Υ-рецепторного распознавания, С-концевая последовательность может быть слита по своему Ν-концу с доменом амфифильной аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфаспиральный поворот, прилегающий к Ν-концу С-концевой гексапептидной последовательности, причём указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности соединены линкерным радикалом, который может представлять собой линейный или разветвлённый алкиленовый радикал, необязательно содержащий одну или более двойных или тройных связей. Например, С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности могут соединяться пептидными связями, соответственно, с карбоксильной или аминогруппами аминокислоты формулы НН₂(СН₂)_пСО₂Н, где η имеет значение от 2 до 12, главным образом 6, 7, 8, 9 или 10. Так, агонист может являться РР-складчатым миметиком №Υ, ΡΡΥ или РР, который содержит вышеуказанные С-концевую и Ν-концевую последовательности Υ-рецепторного распознавания с описанным мостиком Сук-Сук, но при этом его аминокислотные остатки, соответствующие 5-24 нативного пептида, замещены на аминокарбоновую кислоту с углеродной цепью, содержащей 6-10 атомов углерода, выбранную их группы, состоящей из 6-аминогексановой кислоты (ипсилон-аминокапроновой кислоты), 7-аминогептановой кислоты, 8-аминооктановой кислоты, 9-аминононановой кислоты и аминодекановой кислоты. В конкретных вариантах изобретения предпочтительны 8-аминооктановые кислоты (в данном описании иногда сокращённо называемые Аос). Примером такого агониста является [Сук2,Аос5-24,П-Сук27,О1п34]РР (8ЕС) ГО Νο: 23).

Некоторые агонисты тех типов, к которым относится настоящее изобретение, можно рассматривать либо 1) как аналоги №У или ΡΥΥ пептидов, в которых остатки, имеющиеся в некоторых важных положениях в РР, но не в соответствующих положениях или ΡУУ, замещены на остатки, соответствующие РР остаткам, или на природные или неприродные остатки, сходные по структуре (консервативная замена) остаткам, соответствующим РР остаткам, или 2) как аналоги РР, в котором остатки в некоторых важных положениях или ΡУУ, но не в соответствующих положениях РР, замещены на остатки, соответствующие или ΡУУ остаткам, или на природные или неприродные остатки, сходные по структуре остаткам, соответствующим или ΡΥΥ остаткам. Как описано выше и как показано на фиг. 1, Υ рецепторы распознают остатки, локализованные на общих С- и Ν-концах пептидов, представленных РР-складчатыми пептидами или РР-складчатыми миметиками. Обычно РР пептиды не распознаются Υ2 рецептором вследствие присутствия остатков, главным образом, на С-конце РР, несовместимых с высокоаффинным связыванием и активностью пептида на Υ2 рецепторе. Однако заменой одного или более остатков в молекуле РР или РР-складчатого миметика РР на соответствующий остаток или ΡУУ можно повысить аффинность пептида на Υ2 рецепторе без потери аффинности и активности на Υ4 рецепторе, или только в сравнительно малой степени уменьшив аффинность и активность на Υ4 рецепторе.

В представленной ниже таблице показаны остатки, отличающиеся в Ν- и С-концевых последовательностях РР, и ΡУУ, т.е. остатки в положениях 1, 3, 4, 26, 28, 30, 31 и 34. Заданную общую Υ2 и

Υ4 высокую аффинность можно получить с помощью вышеописанной гомологичной замены в одном или более этих положений. Однако предпочтительной заменой в РР для достижения высокой аффинности и активности на Υ2 рецепторе при сохранении аффинности и активности на Υ2 рецепторе является замена Рго34 на О1п или на неприродный остаток с аналогичными физико-химическими свойствами. Поэтому [О1п34]РР является в высшей степени предпочтительным пептидом, так же как РР аналоги или миметики, в которых О1п34 совмещается с заменой одного или более не-NΡΥ/Не-ΡУУ остатка в РР на соответствующий остаток, или остаток с аналогичными физико-химическими свойствами, или неприродную аминокислоту с аналогичными свойствами.

- 9 011861

Следует, однако, отметить, что разрешённые гомологичные замены по настоящему изобретению представляют собой такие замены, которые приводят к агонистам по данному описанию, так как не все возможные замены, предлагаемые в таблице, обеспечивают заданные свойства пептида. Например, введение Рго в положение 34 в ΡΥΥ или ΝΡΥ уменьшает аффинность пептидов в отношении Υ2 рецептора слишком заметно для того, чтобы этот аналог применялся в настоящем изобретении, хотя эта замена обеспечивает высокую аффинность в отношении Υ4 рецептора.___________________

Положение	1	3	4	26	28	30	31	34
РР	А1а	1_еи	ΘΙυ	Агд	Не	Ме!	Ьеи	Рго
ΝΡΥ	Туг	Зег	Цуэ	ΗΪ5	Не	Ьеи	Не	ΘΙη
ΡΥΥ	Туг	Не	^У5	ΗΪ8	Геи	(_еи	Уа1	ΘΙη

Специфические агонисты для применения по данному изобретению

Ниже представлены конкретные примеры агонистов для применения по данному изобретению [С1п34] РР (ЗЕр ГО Νο: 4) [Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьу813,С1п34]РР (8ЕС) ГО Νο: 34) [Ν- (А1а-Аг§- Аг§- Аг§- А1а- А1а-Аг§-А1а)₃- Еу818,О1п34]РР (8Е$ ГО Νο: 35) [Ν- РЕ05000- Ьу₅13,О1п34]РР (8Е0 ГО Νο: 36) [11е31,О1п34]РР (8Ер ГО Νο: 5) [Уа131,Ст1п341РР (8РП ГО Νο: 6) [Ьеи30,С1п34]РР (8Ες ГО Νο: 7) [Ν1ε30,Ο1η34]ΡΡ (8Е(2 ГО Νο: 8) [Ьеи28,О1п34]РР (8Е(^ ГО Νο: 9) [Ηϊ826,011134]РР (8Е(2 ΙΟ Νο: 10) [11еЗ,О1п34]РР (8Ер ГО Νο: 11) [А1а1,01и4,Аг§26,(Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Ер ΙΟΝο: 12) [ΑΗ1,Ο1ιι4,Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Εγδ13,Ατ§26,Ν1ε30]ΡΥΥ (8Е(^ ГО Νο: 37) [А1а1, 01ιι4,Ν- (А1а-Аг§- Аг§- Аг§- А1а- А1а-Ат§- А1а)₃- Εγδ13,Ατ§26,Ν1ε30]ΡΥΥ (8Е(^ ГО Νο:38) [ΑΗ1,Ο1ιι4,Ν- РЕС5000- Εγδ13,ΑΓ§26,Ν1ε30]ΡΥΥ (8Е<2 ГО Νο: 39) [А1а1,01и4,Аг§26(Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е0 ГО Νο: 13) [Α1η1,01ιι4]ΡΥΥ (8Е(3 ГО Νο: 14) и [А1а1,01и4]ИРУ (8Е(^ ГО Νο: 15) [Аг§26, (Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е(^ ГО Νο: 16) и [Аг§26, (Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е0 ГО Νο: 17) [01и4, (Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е<2 ГО Νο: 18) и [С1и4, (Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е0 ГО Νο: 19) [Ο1η4,Αγ§26]ΡΥΥ (8Е0 ΙϋΝο: 20) и [Ο1ιι4,Αγ§26]ΝΡΥ (8Е0 Π)Νο: 21) [Ονώ,ϋ- Суз27,О1п34]РР (8Е0 ГО Νο: 22) [Суз2,Аос5- 24,ϋ- Суз27,О1п34]РР (8Е0 ГО Νο:23) [Су82,Ь_У813,О- Су827,О1п34]РР (8Е0 ΙΟΝο: 30) [Суз2, Ν- (8- (8- гамма-глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)- Еуз13, ОСу827,С1п34]РР (8Е0 ГО Νο:31).

[Суз2Л- {(А1а-Аг§- Ат§- Аг§- А1а- А1а-Аг§- А1а)₃}- Ьуз13,О- Суз27,О1п34]РР <

(8Е0 ГО Νο: 32) [Суз2, Ν-{№- (21- амино-4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма-глутамоилЬуз13,О- Су827,О1п34]РР (8Е(^ ГО Νο: 33)

- 10 011861 и их аналоги с консервативными заменами.

Особенно предпочтительными У2/У4-селективным агонистами для применения по настоящему изобретению являются [О1п34]РР (8ЕР ΙΌ Νο: 4) и [А1а1,О1и4,Аг§26,(Ме130 или Ν1β30)]ΡΥΥ N14) ГО N0: 12) или их аналоги с консервативными заменами.

Агонисты, пригодные для применения по данному изобретению

До настоящего времени основные Υ2/Υ4-селективные агонисты для применения по настоящему изобретению были описаны в целом и приводились конкретные примеры таких агонистов. Однако такие агонисты, включая специфически идентифицированные агонисты, можно подвергнуть различным модификациям с целью улучшения их фармакокинетических, фармакодинамических и метаболических свойств. Такие модификации могут включать связывание агониста с функциональными группами (также известными как мотивы), известными сами по себе в технике пептидных или белковых фармацевтических веществ. Три конкретные модификации, дающие конкретное преимущество в случае агонистов, которые рассматривает настоящее изобретение, вне зависимости от типа (а) или (Ь), представляют собой элемент с мотивами связывания с сывороточным альбумином, или мотив связывания гликозаминогликана (ОАО), или ПЭГилирование.

Мотивы связывания сывороточного альбумина

Мотивы связывания сывороточного альбумина (мотивы, связывающие сывороточный альбумин) обычно являются липофильными группами, вводимыми для того, чтобы способствовать продолжительному пребыванию в организме после введения, или по другим причинам, которые могут связываться различными известными способами с пептидными или белковыми молекулами, например, 1) ковалентной связью, например, с помощью функциональной группы в боковой цепи аминокислотного остатка, п) за счёт функциональной группы, встроенной в пептид или подходящим образом дериватизированный пептид, ίίί) в виде единого участка пептида. Например, в Международной заявке АО 96/29344 (Νονο ΝοιτΙίΑ А/8) и в статьях Р. КшТгйаН е! а1., 1995, Вюсйеш1са1 I. 312: 725-31 и Ь.В. Кпибзеп е! а1., 2000, I. Меб. СНет. 43: 1664-69, описан ряд липофильных модификаций, которые можно использовать для агонистов, которые рассматриваются в данном изобретении.

Подходящие липофильные группы включают необязательно замещённые, насыщенные или ненасыщенные, линейные или разветвлённые углеводородные группы, содержащие 10-24 углеводных атома. Такие группы могут образовывать целую боковую цепь или часть боковой цепи в каркасе агониста, например, за счёт простой эфирной, тиоэфирной, сложноэфирной или амидной связи с боковой цепью аминокислотного остатка скелета, или с углеродным атомом скелета или боковой цепи каркаса (скелета) непептидного линкерного радикала в скелете РР-складчатого миметика-агониста. Химический способ присоединения липофильной группы не важен, но приведённые боковые цепи, включая липофильные группы, являются примерами групп, которые могут связываться со скелетным углеродом агониста или его подходящего ответвления и состоят из

ΟΗ₃(ΟΗ₂)_ηΟΗ(ΟΟΟΗ)ΝΗ- СО(СН₂)₂СОХН-, где п обозначает целое число от 9 до 15,

СНз(СН₂),.СО- ΝΗΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)₂ΟΟΝΉ-, где г обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)₅С0-ΝΉΟΗ((ΟΗ₂)₂ΟΟΟΗ)ΟΟΝΗ-, где 8 обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)_тСОЖ-, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-ЖСОСН((СН₂)₂СООН)Ж- СО(СН₂)рСНз, где р обозначает целое число от 10 до 16,

-ΝΗΟΟ(ΟΗ₂)₂ΟΗ(ΟΟΟΗ)ΝΉ- СО(СН₂)_чСНз, где с] обозначает целое число от 10 до 16,

СН₃(СН₂)_пСН(СООН)ННСО->

где п обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)_РМНСО-, где р обозначает целое число от 10 до 18,

-ΟΟΝΗΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)₄ΝΗ- СО(СН₂)_тСН₃, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-СОЖСН(СООН)(СН₂)₄Ж- СОСН((СН₂)₂СООН)КН- СО(СН₂)_рСН₃, где р обозначает целое число от 10 до 16,

-ΟΟΝΉΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)₄ΝΗ- СО(СН₂)₂СН(СООН)НН-СО(СН₂)_чСНз, где с] обозначает целое число от 10 до 16, и частично или полностью гидрированного циклопентанофенантренового скелета.

- 11 011861

В одном методе химического синтеза боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой С12, С₁₄, С16 или С₁₈ ацильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи остатка каркаса агониста.

Как указывалось, модификация агонистов для применения с целью улучшить характеристики связывания с сывороточным белком является методом, который можно применять в целом и, в частности, в случае специфических агонистов, перечисленных выше. Так, например, [Ьу811,О1п34]РР и его аналоги с консервативными заменами могут быть модифицированы вышеописанным способом, например тетрадеканоилацетилированием Ьу811, или [Ьу813,О1п34]РР может модифицироваться с образованием [М-(М'-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьу813,С1и34]РР, а |Л1а1.С1и4.Бу513.Лг§26.Н1с30|РУУ может модифицироваться с образованием [А1а1,С1и4,М-(М'-гексадеканоил)-гамма-глутамоилЬу813,Агд26,М1е30]Р¥У.

ОАО-связывание

Как и в случае мотивов липофильного связывания с сывороткой, обсуждавшегося выше, агонисты, рассматриваемые в данном изобретении, можно модифицировать, вводя мотив ОАО связывания в качестве боковой цепи, или участка боковой цепи скелета агониста. Известные ОАО-связывающие мотивы для введения таким способом включают аминокислотные последовательности ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любую аминокислоту.

Несколько, например три, таких последовательностей можно ввести с образованием конкатамерных (линейная цепь) или дендримерных (боковая цепь) мотивов. Специфические конкатамерные ОАО мотивы включают А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а и А1а-Агд-Агд-Агд-А1аА1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а (каждый из которых может, например, соединяться амидной связью, образующейся между С-концом конкатамерного мотива ОАО-связывания и аминогруппой в боковой цепи аминокислоты в каркасе агониста, такой как ипсилонаминогруппа Ьу518 в агонисте [Ьу518,О1п34]РР (8ЕО Ш N0: 24), с образованием [Ы-(А1а-Агд-Агд-АгдА1а-А1а-Агд-А1а)з-Ьу518,О1и34]РР, или Ьу813 в агонисте [А1а1,О1и4,Ьу813,Агд26,№е30]Р¥У с образованием [А1а1,О1и4,№(А1а-Ахд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а)з-Ьу813 ,Агд26,Ме30]РУУ.

Вместо того, чтобы присоединяться к агонисту в виде боковой цепи, или части боковой цепи каркасного остатка, ОАО мотив может ковалентно связываться с С- или (предпочтительно) с Ν-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал. В этом случае ОАО-связывающий мотив может также содержать аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а Х обозначает любой аминокислотный остаток, например последовательность [ХВВВХХВХ]_П, где η обозначает число от 1 до 5, В обозначает основной аминокислотный остаток, а Х обозначает любой аминокислотный остаток, в частности А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1аАгд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-[О1п34]РР (8ЕО Ш Νο: 26).

Υ2/Υ4 селективные агонисты, к которым относится настоящее изобретение, применимы, среди прочего, для терапевтического ангиогенеза. В частности, для такого применения агонисты предпочтительно содержат мотив, связывающий гликозаминогликан (ОАО), обсуждавшийся выше. Такие мотивы гарантируют, что агонисты связываются с ОАО во внеклеточной матрице, и тем самым обеспечивают пролонгированную локальную экспозицию Υ рецепторов в этой ткани. Факторы роста, хемокины и т.д. связываются с ОАО за счёт участков основных аминокислот, которые взаимодействуют с кислыми сахарами ОАО. Эти положительно заряженные эпитопы на факторах роста обычно состоят из боковых цепей основных остатков, которые в последовательности необязательно расположены последовательно, но часто находятся в непосредственной близости за счёт элемента вторичной структуры, такого как альфаспираль или поворот, или за счёт общей трёхмерной структуры белка. Описаны некоторые ОАОсвязывающие линейные последовательности, обсуждавшиеся выше, например ХВВХВХ и ХВВВХХВХ, где В представляет собой основной остаток (Нйешап е! а1. Вюаккаук, 1998, 20: 156-67). Методом кругового дихроизма было показано, что эти сегменты при связывании с ОАО образуют альфа-спирали. Если такие последовательности помещены, например, в конкатамерную или дендримерную конструкцию, где присутствуют три таких последовательности, например каждая в виде АКККААКА последовательности, результирующий 24-мерный пептид, например АКККААКА-АКККААКА-АКККААКА, гарантирует сохранение во внеклеточной матрице, аналогичной высокомолекулярному полилизину, т.е. он не вымывается в течение 4-часового вливания (8акйагоу е! а1. ЕЕВ8 Ьей., 2003, 27: 6-10).

Таким образом, факторы роста и хемокины естественно создаются с двумя типами связывающих мотивов: один мотив связывания рецептора, с помощью которого осуществляется сигнальная трансдукция, и один мотив связывания с ОАО, с помощью которого достигается присоединение и пролонгированная локальная активность. Пептиды, такие как Ν₽Υ и РР, являются нейропептидами и гормонами, которые достаточно быстро вымываются из ткани, а не оптимизируются для пролонгированной активности. Присоединяя ОАО-связывающий мотив к Υ2/Υ4 селективному агонисту по настоящему изобретению создают бифункциональную молекулу, аналогичную факторам роста и хемокинам, содержащую как эпитоп, ответственный за связывание с рецептором на РР-складчатом пептидном участке, так и ОАОсвязывающий мотив. Кроме того, за счёт включения ОАО-связывающего мотива модифицированный пептид имеет свойство дольше оставаться в ткани при инъекции, например, подкожно или внутримы

- 12 011861 шечно или трансдермально, или аналогичным образом доставляться в ткань как таковой. Поэтому САСмодифицированный пептид также входит в состав препарата пролонгированного действия, который может быть в высшей степени предпочтительным для медленного высвобождения в кровоток и пролонгированного способа действия.

Другим подходящим положением для введения САС-связывающего мотива, такого как конкатамерная или дендримерная конструкция, РР-складчатых пептидов является положение 14 для ΝΓΥ пептидов и их аналогов, и положение 13 для РΥΥ и РР пептидов. Как для пептидов типа NРΥ, РΥΥ, так и для пептидов типа РР другими предпочтительными положениями являются положения 11 и 18. Однако, как обсуждалось выше, остаток, содержащий САС-связывающий мотив, можно ввести в любое положение в агонистах при условии, что это введение согласуется с сохранением РР-складчатой структуры, требуемой в агонистах типа (а), (Ь) и (с), рассматриваемых в данном изобретении, и нужной С-концевой последовательностью Υ2-распознавания. Так, САС-связывающий мотив можно в качестве части спейсерной конструкции поместить в аналоги, в которых часть РР-складки замещена на непептидный спейсер.

ПЭГилирование

При ПЭГилировании полиалкиленоксидный радикал или радикалы ковалентно связан/связаны с пептидными или белковыми лекарствами с целью увеличения эффективного периода полужизни в организме после введения. Термин происходит от названия предпочтительного полиалкиленоксида, применяемого в таких процессах, а именно образованного из этиленгликоля полиэтиленгликоля, или ПЭГ (РЕС).

Подходящий радикал ПЭГ может присоединяться к агонисту любым подходящим химическим методом, например, за счёт каркасного аминокислотного остатка агониста. Например, в случае молекулы, подобной ПЭГ, в качестве присоединяющей группы часто применяется ипсилон - аминогруппа лизина или Ν-концевая аминогруппа. Другие присоединяющие (встраивающие) группы включают свободную карбоксильную группу (например, свободная карбоксильная группа С-концевого аминокислотного остатка или остатка аспарагиновой или глутаминовой кислоты), подходящим образом активированные карбонильные группы, меркаптогруппы (например, меркаптогруппы цистеинового остатка), остатки ароматических кислот (например, РЬе, Туг, Тгр), гидроксигруппы (например, гидроксигруппы в 8ег, ТЬг или ОН-Ьук), гуанидин (например, Агд), имидазол (например, Ηίκ) и частицы окисленных углеводов.

Если агонист является ПЭГилированным, он обычно содержит 1-5 молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ), например 1, 2 или 3 молекулы ПЭГ. Каждая молекула ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 5 до примерно 100 кДа, например молекулярная масса составляет около 10-40 кДа, около 12 кДа или предпочтительно не более 20 кДа.

Подходящие молекулы ПЭГ выпускаются фирмами 8Ьеаг\\'а1ег Ро1утегк, 1пс. и Εηζοη, 1пс. и их можно выбрать из 88-РЕС, №С-РЕС, альдегид-ПЭГ, тРЕС-8РА, тРЕС-8СМ, тРЕС-ВТС, 8С-РЕС, трезилированный тРЕС (патент США 5880255), или оксикарбонил-окси-Ы-дикарбоксиимид-ПЭГ (патент США 5122614).

В особом варианте изобретения вышеупомянутый агонист [Ьук13,С1п34]РР можно ПЭГилировать по Ьук13 с образованием [N-РΕС5000-^уκ13,С1η34]РР (8ЕО ΙΌ Νο: 40) или [А1а1,С1и4,Ьук18,Агд26, (Ме!30 или N1е30)]РΥΥ (8ЕО ΙΌ Νο: 25) можно ПЭГилировать по Ьук18.

Сывороточный альбумин, САС и ПЭГ

Вне зависимости от того, осуществляется ли модификация агониста за счёт присоединения групп для того, чтобы способствовать связыванию сывороточного альбумина, САС-связыванию или повысить устойчивость с помощью ПЭГилирования, мотив связывания сывороточного альбумина, или мотив САС-связывания, или ПЭГ радикал может являться боковой цепью или образовывать часть боковой цепи при каркасном углероде агониста, соответствующем любому из следующих положений РΥΥ или РР: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32, соответствующем любому из следующих положений ΝΤΥ: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32. Конъюгация с биомолекулами большего размера

Как описывается выше, можно присоединять некоторые мотивы в различных положениях в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде-миметике, не ослабляя их высокую Υ-рецепторную аффинность (см. примеры). Аналогичным образом комбинированные селективные в отношении Υ2-Υ4 рецепторов агонисты можно использовать в качестве химерных (гибридных, слитых) белков, в которых они связаны, например, с альбумином или молекулой другого белка или носителя, что обеспечивает благоприятную фармакокинетику или другие свойства, например пониженное выведение почками. Как известно в технике, существует множество химических модификаций и линкеров, которые можно использовать для такого ковалентного соединения, так же как можно использовать множество белков или носителей. Особенно предпочтительно ковалентное присоединение селективного Υ2-Υ4 пептидного агониста к альбумину и в одном из положений РР-складчатой структуры, которое указано в другом месте данного описания в связи с модификациями с помощью различных мотивов. Такие гибридные белки можно получать различными полусинтетическими методами, когда пептид можно получать пептидным синтезом по данному описанию, а биомолекулу - методом рекомбинантной ДНК. Гибридный белок можно также получать целиком как рекомбинантную молекулу, экспрессированную, например, в виде молекулы

- 13 011861 предшественника, удлинённую за счёт последовательности С1у-Ьук-Агд, которая, будучи экспрессирована в виде секреторного белка в эукариотических клетках, отщепляется биосинтетическими ферментами, и С1у превращается в карбоксамид на С-концевом остатке Туг С-концевой последовательности Υ2-рецепторного распознавания.

Стабилизация

Как указывается в разных местах в данном описании, многие из селективных Υ2-Υ4 агонистов по настоящему изобретению стабилизируются различными способами, например Ν-концевым ацилированием или замещением каркасных участков агониста на непептидный линкер, или внутренней циклизацией за счёт мостиковых связей для стабилизации РР-складчатой структуры. Эта стабилизация в большинстве случаев служит двум целям, причём одной целью является презентировать эпитопы рецепторного распознавания оптимальным образом в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов за счёт сохранения РР-складки; а второй целью является стабилизация пептида против расщепления, т. е. главным образом против протеолитического расщепления. Это особенно важно, когда селективные Υ2-Υ4 агонисты также модифицированы для того, чтобы продлить период полужизни, достичь пролонгированного высвобождения и/или продолжительной экспозиции с тканями, за счёт присоединения различных мотивов, обсуждавшихся выше.

Обычно пептидные агонисты очень быстро выводятся, главным образом, через почки, и устойчивость белка как таковая может быть неважна; однако, когда присутствие пептида в различных жидкостях организма продлевается одним или более способами на несколько часов, особенно важно, чтобы биологическая активность пептида также оставалась интактной, т. е. чтобы пептид стабилизировался в форме, устойчивой к протеолитическому воздействию, описанному как вообще, так и в отношении специфических примеров селективных Υ2-Υ4 пептидов-агонистов, например ΡΡ-складчатых стабилизированных, циклических [Сук2,О-Сук27]РР и их различных аналогов. Так, в предпочтительных вариантах изобретения объединенные Υ2-Υ4 селективные агонисты как стабилизированы структурно, с помощью структурных изменений, некоторые из них конкретно указаны в представленных ниже примерах, так и декорированы различными мотивами и/или слиты с биомолекулами и/или приготовлены фармацевтическими методами, которыми добиваются продолжительного высвобождения и т. д., для пролонгированной экспозиции с рецептором.

Пептиды, индуцирующие спираль

Ацилирование по Ν-концу агонистов, которые рассматривает данное изобретение, упоминалось как способ стабилизации агониста против действия аминопептидаз. Другая стабилизирующая модификация включает ковалентное присоединение стабилизирующей пептидной последовательности из 4-20 аминокислотных остатков ковалентно на Ν- и/или С-конце, предпочтительно на Ν-конце. Аминокислотные остатки в таком пептиде выбирают из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, ТЬг, Туг, Аки, С1и, Акр, С1и, Ьук, Агд, Ηίκ, Μеΐ и т.д. В интересном варианте изобретения присоединяемый Ν-концевой пептид содержит 4, 5 или 6 остатков Ьук, например Тук-Тук-Тук-Тук-Тук-Ьук-[61и34РР] (8ЕО ΙΌ Νο: 29). Они могут присоединяться на Ν-конце РР-складчатого пептидного агониста или они могут быть помещены на Ν-конце усечённого по Ν-концу РР-складчатого агониста-миметика, или укороченного на Ν-конце РР-складчатого агониста-миметика, если спейсерный пептид вводится между новым Ν-концом стабилизирующего пептида. Общее описание таких удлинений (расширений) стабилизирующего пептида дано в Международной заявке \¥О 99/46283 (2еа1аиб Рйагтасеийса1к), которая вводится в данное описание в качестве ссылки.

Рецепторные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, можно получать общеизвестными методами, например синтетическими, полусинтетическими и/или методами рекомбинантной ДНК. Способы включают стандартные методы получения пептидов, такие, например, как синтез в растворе и твердофазный синтез. Руководствуясь учебником и общими знаниями в данной области техники, специалист в этой области поймёт, как получать агонисты и их производные и модификации.

Далее описаны конкретные агонисты по изобретению наряду с их молекулярными фармакологическими свойствами, а также химическими свойствами и описанием устойчивости пептидов.

[Пе31,61и34]РР (8ЕО ΙΌ Νο: 5)

Этот пептид является аналогом РР, созданным с целью достижения высокой аффинности к Υ2 рецептору путём введения Не в положение 31 и С1и в положение 34, соответствующих остаткам, обнаруженным в этих положениях в №У (ЕиЫеибогГГ е! а1. 1БС 1990, 265: 11706-12).

Профиль рецепторного распознавания.

[Пе31,С1и34]РР имеет выражаемую однозначным числом наномолярную активность к человеческому Υ4 рецептору (Κ₅₀=1,2 нМ), сходную с аффинностью РР (ТС₅₀=0,5 нМ), а аффинность [Пе31,61и34]РР к Υ2 рецептору 54 нМ, а ΙΟ₅₀ в отношении Υ1 рецептора составляет более 1000 нМ и, соответственно, [Не31,61и34]РР является селективным Υ2-Υ4 агонистом по сравнению с Υ1 рецептором (табл. 1). Величины аффинности к Υ рецепторам сообщались ранее, в то время был доступен только Υ4 рецептор крысы, где было показано, что аффинность [Пе31,61и34]РР равна около 50 нМ к Υ4 рецептору крысы, что примерно в 100 раз ниже аффинности РР (ЕиЫеибогГГ е! а1. ШС 1990, 265: 11706-12, 8с11\\'аг1х е! а1. NУΑС, 1990, 611: 35-47). Что касается активности, [Не31,61и34]РР проявляет ш νίίτο активность в случае

- 14 011861

Υ4 рецептора 0,91 нМ (величина ЕС50), в отношении Υ2 рецептора ЕС50 6,5 нМ и в отношении Υ1 рецептора величина ЕС₅₀ составляет 48 нМ (табл. 2). Таким образом, по сравнению с ранее опубликованными данными по аффинности (ЕиЫепбогГГ е! а1. 1ВС 1990, 265: 11706-12, 8с11\\'аг!х е! а1. NΥАС, 1990, 611: 3547) удивительным является то, что [11е31,С1п34]РР на самом деле является агонистом с активностью, выражаемой однозначным числом, как против Υ2, так и против Υ4 рецептора, в отличие от выражаемой двузначным числом активности в отношении Υ1 рецептора. Устойчивость белка аналогична устойчивости РР1-36.

[Уа131,61п34]РР (8Ер ГО 6)

Так же как и [11е31,С1п34]РР (8Е0 ГО №: 5), этот пептид является РР аналогом, созданным с целью достижения высокой аффинности к Υ2 рецептору, но при сохранении высокой аффинности к Υ4 рецептору, однако в данном случае путём введения Уа1 в положение 31, соответствующего остатку, находящемуся в ΡУУ в этом положении, и, опять же, С1п в положение 34, соответствующего остатку, обнаруженному в этом положении в ΝΓΥ и ΡУУ. Это новое соединение.

Профиль рецепторного распознавания.

Аффинность [Уа131,61п34]РР к Υ4 рецептору составляет 0,93 нМ, а к Υ2рецептору - 69 нМ, тогда как аффинность к Υ1 рецептору не удаётся измерить даже при концентрациях >1000 нМ (табл. 1). Таким образом, [Уа131,С1п34]РР является Υ2-Υ4 селективным лигандом. Что касается ίη νίΐΐΌ активности, [Уа131,61п34]РР имеет величину ЕС₅₀ 1,0 нМ в отношении Υ4 рецептора и 9,9 нМ в отношении Υ2 рецептора, тогда как его активность в отношении Υ1 рецептора составляет 99 нМ (табл. 2).

Устойчивость белка аналогична устойчивости РР1-36.

[61п34]РР (8ЕО ГО №: 4)

Так же как [11е31,61п34]РР (8Е0 ГО №: 5) и [Уа131,61п34]РР (8Е0 ГО №: 6), этот пептид является РР аналогом, созданным с целью достижения высокой аффинности к Υ2 рецептору, однако в данном случае, за счёт введения одного лишь С1п в положение 34, соответствующего остатку, обнаруженному в этом положении как в ΝΓΥ, так и в ΡУУ. Вследствие того, что положение 34 не является важным для распознавания РР Υ4 рецептором, пептид проявляет двойственную высокую аффинность к Υ2 и к Υ4 рецепторам. В бычьем РР С1п вводят в положение 34, и обнаружено, что его аффинность к Υ4 рецептору очень сходна с аффинностью самого бычьего РР, но этот пептид не испытывался в отношении Υ2 рецептора (СеЫег! е! а1., 1996, Мо1 Рйагшасо1. 1996 50: 112-8). В настоящем изобретении сделана замена Рго на С1п в человеческом РР1-36 и показано, что |С1п34|РР неожиданно имеет высокую аффинность к Υ2 рецептору, сходную с аффинностью №Υ и ΡУУ, и что он не связывается с Υ1 рецептором. Таким образом, [С1п34]РР (т.е. [С1п34]человеческий РР1-36) является новым соединением, селективным к Υ2 и Υ4 рецептору в отличие от Υ рецептора.

Профиль рецепторного распознавания.

Аффинность связывания [61п34]РР с Υ4 рецептором равна 1,2 нМ, а с Υ2 рецептором - 9,0 нМ, тогда как аффинность к Υ1 рецептору не удаётся измерить даже при концентрациях >1000 нМ (табл. 1). Что касается ίη νίίΐΌ активности, [С1п34]РР имеет величину ЕС₅₀ 1,1 нМ в отношении Υ4 рецептора и 3,0 нМ в отношении Υ2 рецептора, тогда как его активность в отношении Υ1 рецептора составляет 388 нМ (табл. 2).

Ιη νί\Ό селективность рецептора.

В исследовании с эскалацией дозы [С1п34]РР вводили внутривенным вливанием анестезированным собакам с последующей 30-минутной инфузией в дозах 0,3, 1, 3, 10, 30 и 100 мкг/кг. Уровни [С1п34]РР в плазме измеряют радиоиммунным анализом, который показывает линейную зависимость от дозы. При наивысших дозах уровни в плазме 100 нМ получают у собак. Тем не менее, никакого зависящего от дозы действия ни на кровяное давление, ни на частоту сердечных сокращений не наблюдают. Хорошо известно, что NΡΥ и ΡУУ, которые являются агонистами как к Υ1, так и к Υ2 рецепторам, при значительно более низких уровнях в плазме повышают кровяное давление. Таким образом, эти эксперименты показывают, что [С1п34]РР также ίη νί\Ό является высокоселективным пептидом в отсутствие измеримой Υ1-рецепторной активности.

Ιη νί\Ό действие на срочный приём пищи у мышей - ΡУУ3-36, [С1п34]РР или физиологический солевой раствор вводят в виде подкожных инъекций группам из 8 мышей в дозах 3 или 30 мкг (ΡУУ3-36) или 1 и 10 мкг ([С1п34]РР) каждому животному после 16 ч в отсутствие пищи. На фиг. 2 показано аккумулированное потребление пищи у мышей. ΡУУ3-36 в дозе 30 мкг ингибирует потребление пище в течение первых двух часов, но действие постепенно ослабевает в последующие 2-6 ч. [С1п34]РР проявляет более выраженный и продолжительный ингибирующий эффект в отношении потребления пищи у мышей, чем ΡУУ3-36. Так, даже в дозе 1 мкг наблюдается более эффективное ингибирование потребления пищи и этот эффект длится более 8 ч (фиг. 2). Таким образом, [С1п34]РР, который в 10 раз менее активен в отношении Υ2 рецептора, как определено ίη νί!ΐΌ анализами (значения ЕС₅₀ 3,0 по сравнению с 0,24 для ΡУУ3-36, табл. 2), тем не менее, очевидно, более активен и оказывает более продолжительное действие на срочный приём пищи у мышей, предположительно, благодаря его действию также в качестве Υ4 агониста.

- 15 011861 [Ο1η34]ΡΡ может по аналогии с другими представленными в данном описании примерами пептидов модифицироваться далее для различных фармакокинетических или других целей, при этом сохраняя общую Υ2-Υ4 селективность по сравнению с Υ1. Например, остатки Ме! в положении 17 и/или 30 можно заместить, например, на Ьеи или И1е, один или более Ьук или других предрасположенных к присоединению остатков можно ввести в различные положения для введения различных мотивов и т. д. При этом можно получить группу селективных Υ2-Υ4 пептидных агонистов, из которых можно выбрать соединения в качестве лекарств для лечения ожирения и т.д., представленные в другом месте данного описания.

^π30,61η34]ΡΡ (8ЕЬ) ΙΌ Ыо: 7), [№30,61η34]ΡΡ (8ЕЬ) ΙΌ Ыо: 8), ^π28,61η34]ΡΡ (8ЕЬ) ΙΌ Ыо: 9), [Ηίκ26,61η34]ΡΡ (8ЕЬ) ΙΌ Ыо: 10)

Так же как |Не31,61η34|ΡΡ (8ЕО ΙΌ №: 5) и [Vа131,61η34]ΡΡ (8ЕО ΙΌ №: 6), эти пептиды являются аналогами ΡΡ, созданными с целью высокой аффинности к Υ2 рецептору, однако в этих случаях замена Ριό34 на С1п совмещается с заменой других №-ΝΡΥ/№-ΡΥΥ остатков в С-концевой последовательности ΡΡ: Ме!30 на Ьеи (как в ΝΡΥ и ΡΥΥ), или Пе28 на Ьеи (как в ΡΥΥ, ΝΡΥ имеет Не, как ΡΡ), или Агд26 на Ηίκ (как в ΝΡΥ и ΡΥΥ). Например, замена Ме!30 на Ьеи или Ы1е имеет то преимущество, что она исключает возможность окисления природного остатка Ме!. ^π30,61η34]ΡΡ, [Ν^30,61η34]ΡΡ, ^π28,61η34]ΡΡ и [Ηίκ26,61η34]ΡΡ представляют собой новые соединения.

[Ι^3,61η34]ΡΡ (8ЕЬ) ΙΌ Ыо: 11) [Ι^3,Ο1η34]ΡΡ представляет собой пептиды, модифицированные как на С, так и на Ν-конце каркаса ΡΡ с целью получить объединённую (общую) Υ2-Υ4 селективность относительно Υ1. Так же как, например, [Ι^31,Ο1η34]ΡΡ и |Vа131.С1η34|ΡΡ. этот пептид является аналогом ΡΡ, созданным с целью получения высокой аффинности к Υ2 рецептору, однако в этом случае замена Ριό34 на С1п совмещается с заменой других №-ΝΡΥ/^-ΡΥΥ остатков в Ν-концевой последовательности ΡΡ: Ьеи3 на Не (как в ΡΥΥ - в ΝΡΥ это 8ег). [Ι^3,61η34]ΡΡ является новым соединением.

[Α1а1,61и4,Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ (8ЕЬ) ΙΌ Но: 12)

Этот пептид представляет в данном описании группу аналогов ΡΥΥ и ΝΡΥ, в которых один или более не-ΡΡ остатков на Ν- и/или С-конце (концах) заменяе(ю)тся остатком(ами), имеющимися в ΡΡ, с целью получения заданной общей Υ2-Υ4 селективности относительно Υ1. [Α1а1,61и4,Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ создан с целью получения высокой аффинности к Υ4 рецептору за счёт введения в целом четырёх ΡΡ-подобных остатков в С- и Ν-концевые последовательности. Остаток Ριό не вводится в положение 34, так как это оказывает большое влияние на аффинность пептидов к Υ2 рецептору, хотя и повышает аффинность пептидов к Υ4 рецептору. [Α1а1,61и4,Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ является новым соединением.

Профиль рецепторного распознавания.

[Α1а1,^1и4,Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ проявляет высокую активность в отношении стимулирования человеческого Υ2 рецептора (ЕС₅₀=1,0 нМ) и человеческого Υ4 рецептора (ЕС₅₀=1,4 нМ), тогда как его активность в отношении человеческого Υ1 составляет лишь 87 нМ (табл. 2).

Устойчивость белка аналогична устойчивости ΡΥΥ1-36.

[Α1а1,^1и4,Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ можно по аналогии с другими представленными в данном описании примерами пептидов модифицировать далее для различных фармакокинетических или других целей, при этом сохраняя общую Υ2-Υ4 селективность по сравнению с Υ1. Например, остатки Ме! в положении 17 и/или 30 можно заместить, например, на Ьеи или Ме, один или более Ьук или других, предрасположенных к присоединению, остатков можно ввести в различные положения для введения различных мотивов и т.д. При этом можно получить группу селективных Υ2-Υ4 пептидных агонистов, из которых можно выбрать соединения в качестве лекарств для лечения ожирения и т.д., представленные в другом месте данного описания.

[ΑΜ,ΟΜΙΡΥΥ (8ЕЬ) ΙΌ Цо: 14), [Αγ§26^!30]ΡΥΥ (8ЕЬ) ΙΌ Цо: 16), [61π4^!30]ΡΥΥ (8ЕЬ) ΙΌ №: 18), [61π4,Αγ§26]ΡΥΥ (8ЕЬ) ΙΌ Ко: 20)

Эти новые пептиды, наряду с [Α1а1,^1и4,Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ, представляют собой группу пептидных агонистов на основе ΡΥΥ или ΝΡΥ, в которых на С- и/или на Ν-концах заменены остатки, чтобы получить селективность к Υ2 плюс Υ4 рецепторам в отличие от Υ1 рецептора. Тем самым, и вместе с другими пептидами на основе ΡΡ, получены многообразные пептиды, из которых можно выбрать пептиды с оптимальным сочетанием высокой активности в отношении Υ2 и Υ4 с меняющейся активностью в отношении Υ1 с целью использования в качестве лекарств против ожирения и т. д.

Профили рецепторного распознавания.

В качестве примеров в табл. 1 показано, что аффинность [Α^д26,Ме!30]ΡΥΥ к Υ2 и Υ4 рецепторам составляет 0,13 и 2,3 нМ, соответственно, в отличие от аффинности к Υ1 рецептору, равной 65 нМ. Другой пример, аффинность ΡΥΥ к Υ1 рецептору снижается с 16 до 367 нМ при замене С1и вместо Ьук в положении 4 и Агд вместо Ηίκ в положении 26 в [^1и4,Α^д26]ΡΥΥ, в то же время за счёт этих замен повышается аффинность к Υ4 с 30 нМ (для ΡΥΥ) до 3,3 нМ для [61и4,Α^д26]ΡΥΥ, таким образом создаётся окно селективности более чем в 100 раз (табл. 1).

- 16 011861 [Сук2,Э-Сук27,С1п34]РР (81X) ΙΌ Νο: 22)

Здесь данный аналог РР представляет группу Υ2-Υ4 селективных агонистов, в которых повышенная устойчивость белка [Сук2,Э-Сук27]РР пептида сочетается с двойной селективностью в отношении Υ2 и Υ4 в сравнении с Υ1-рецепторной селективностью пептида [С1п34]РР. Это новое соединение. На основании рассмотрения вышеприведённых пептидов ясно, что этот пептид можно модифицировать далее для различных фармакокинетических или других целей, при этом сохраняя общую Υ2-Υ4 селективность по сравнению с Υ1. Например, остатки Ме! в положении 17 и/или 30 можно заместить, например, на Ьеи или №е, один или более Ьук или других, предрасположенных к присоединению, остатков можно ввести в различные положения для введения различных мотивов и т.д. При этом можно получить группу селективных Υ2-Υ4 пептидных агонистов, из которых можно выбрать соединения в качестве лекарств для лечения ожирения и т.д., представленные в другом месте данного описания.

^82^-24^-^827,0^4^ (81 Б) ΙΌ Νο: 23)

В данном РР аналоге двойная рецепторная специфичность [С1п34]РР встроена в малый подходящий аналог РР типа [Сук2,Аοс-24,^-Сук27]ΡΡ. Это новое соединение.

Клинические показания

Υ2/У4-специфические агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, важны для лечения состояний, откликающихся на активацию Υ2 и/или Υ4 рецепторов. Такие состояния включают состояния, для которых показаны регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм, контроль интестинальной секреции или индукция ангиогенеза. Для применения в каждом таком случае агонист может включать модификацию или мотив, которые придают устойчивость к пептидазам, свойства связывания с сывороточным белком, или ПЭГилирование для того, чтобы продлить период полужизни в сыворотке и/или в ткани. Главным образом, для индукции ангиогенеза агонист может содержать САСсвязывающий мотив для продления периода полужизни в тканях и экспозиции с Υ рецептором.

Заболевания или состояния, при которых показана регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм, включают ожирение и избыточный вес и состояния, при которых ожирение и избыточный вес рассматриваются как способствующие факторы, такие как булимия, нейрогенная булимия, Синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (ΝΙΌΌΜ), гипергликемия, устойчивость к инсулину, нарушенная толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензия, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемия, гиперлипидемия, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.

Заболевания или состояния, при которых показана регуляция интестинальной секреции, включают различные формы диареи или кишечную гиперсекрецию.

Заболевания или состояния, при которых показана индукция ангиогенеза, включают заболевание периферических сосудов, заболевание коронарных сосудов, инфаркт миокарда, удар, состояния, при которых всё вышеперечисленное рассматривается как способствующий фактор, заживление ран и восстановление тканей.

1. Ожирение и избыточный вес.

Было показано, что ΡУУ3-36 снижает аппетит, потребление пищи и вес тела у различных у различных грызунов при периферическом введении (Вайетйат е! а1. №11иге 2002, 418: 595-7; ΟΙιαΠίκ е! а1. ВВКС Νον. 2003, 311: 915-9), а также для снижения аппетита у человека также при периферическом введении (Вайетйат е! а1., 2002). Данные на животных, включая исследования нокаутированных по рецептору животных, чётко показывает, что это действие ΡУУ3-36 опосредуется с помощью Υ2 рецепторов и ^Υ/ΑβΡΕ и РОМС нейронов в дугообразном ядре. Сообщалось, что уровни ΡУУ и пищевая реакция на ΡУУ часто ниже у субъектов, страдающих ожирением, и находятся в обратной корреляции с их ΒΜΙ (индексом массы тела). Важно отметить, что субъект, страдающий ожирением, не резистентен к действию ΡУУ, так как инфузия ΡΥΥ3-36 в течение 90 мин снижает потребление пищи у субъектов, страдающих ожирением, аналогичным образом в течение длительного времени (Вайетйат е! а1., 2003, ΝΉΙΜ 349: 94148).

Накопленные в последних исследованиях на животных многочисленные данные показывают, что РР является мощным и эффективным анорексигенным пептидом при периферическом введении репрйета11у (Акака^а е! а1. Рерйбек 1999, 20; 1445-8; Ка!киига е! а1. Рерйбек 2002, 23: 323-9; Акака^а е! а1. Сак!гоейегоЦду 2003,124: 1325-36). Так как РР не оказывает влияния на аппетит, потребление пищи и т.д. у нокаутированных по Υ4 животных, весьма вероятно, что РР действует с помощью Υ4 рецептора, снижая аппетит и потребление пищи (Вайетйат е! а1., 2004, тезисы 83.3 Гют [п1егпа1юпа1 №Υ кутрοк^ит ш С^тЬта Ρο^ίида1). РР также оказывает влияние на потребление пищи у животных, чьё ожирение вызвано диетой. РР рецепторы обнаружены в основном в стволе мозга в двигательных нейронах блуждающего нерва и в ядрах одиночного пучка (ΝΤ8), каждый из которых является поверхностью, где гематоэнцефалический барьер неэффективен и где гормоны кровотока, такие как РР, могут получить доступ к нейронам. Весьма вероятно, что Υ4 рецепторы в ΝΤ8 в стволе мозга являются основной мишенью, через кото

- 17 011861 рую действует ΡΡ, подавляя аппетит и потребление пищи. Однако последние результаты также указывают на возможность того, что ΡΡ могут действовать с помощью Υ рецептора в дугообразном ядре, возможно, на ΡОМС, а, возможно, также на ΝΡΥ/АдВГ нейронах (Вайегйат е! а1. Со1тЬга ΝΡΥ теейпд аЬкйас! 83.3). Низкие уровни ΡΡ обнаружены у субъектов, страдающих ожирением, особенно у субъектов с синдромом Прадера-Вилли (ΖίρΓ е! гб. ТС.Е.М. 1981, 52: 1264-6, Но1к! е! а1., 1983, 1п!. I. ОЬек. 7: 529-38; 61акег е! а1. Ногт. Ме!аЬ. 1988, 20: 288-92), а высокие уровни ΡΡ обнаружены у пациентов с нейрогенной анорексией. Важно отметить, что инфузия ΡΡ человеку понижает аппетит и потребление пищи в течение до 24 ч (Ва!!егйат е! а1. 1СЕМ 2003, 88: 3989-92). Таким образом, действие ΡΡ на потребление пищи наблюдают после того, как уровни ΡΡ в кровотоке вернулись к нормальным значениям. Такое продолжительное действие на аппетит и т.д. хорошо известно также после инъекции ΙΟν, особенно АдВ₽.

Важно отметить, что также показано, что инфузия ΡΡ снижает потребление пищи у больных с синдромом Прадера-Вилли, страдающих вызванным болезнью ожирением (Вегп!коп е! а1., 1993, Ρеρΐ^бек 14: 497-503).

Вследствие того, что действие ΡΥΥ с помощью Υ2 рецепторов - ингибирование стимулирующих ΝΡΥ/ΛβΡΡ нейронов - возможно, главным образом, в дугообразном ядре, а действие ΡΡ с помощью Υ4 рецепторов, по-видимому стимуляция ингибирующих ΡОМС нейронов, главным образом, в области пострема и в ΝΤ8 в стволе мозга, но также в дугообразном ядре (Вайегйат е! а1., 2004, 1п!ета!юпа1 ΝΡΥ кутрокшт, Со1тЬга аЬкйас! 83.3), общий эффект Υ2 агониста и Υ4 агониста является аддитивным или даже синергическим эффектом, т.е. более эффективное действие достигается при совместном лечении, чем при лечении каждым из них по отдельности.

Известно, что сам по себе ΡΥΥ при периферическом введении является сильным рвотным средством, на самом деле, ΡΥΥ был открыт - во второй раз - в 1989 г. как биологически активный компонент в хроматографической фракции интестинального экстракта, вызывающий рвоту у собак (Нагбшд апб МсЭопа1б, 1989, Ρеρ!^бек 10: 21-24).

Был сделан вывод, что ΡΥΥ является наиболее мощным идентифицированным пептидом в кровотоке, вызывающим рвоту, и что этот эффект опосредуется с помощью области пострема, известной тем, что она имеет негерметичный гематоэнцефалический барьер. Также сообщалось, что ΡΥΥ3-36 может вызывать тошноту при периферическом введении людям (Ыак!есй ргекк ге1еаке 29'¹' оГ 1ипе 2004). С физиологической точки зрения кажется логичным, что ΡΥΥ, и биологически активные продукты его превращения, который обычно сначала секретируется в больших количествах в процессе приёма большого количества пищи, или когда происходит демпинг (сбрасывание) пищи в нижние отделы кишечника в результате различных хирургических вмешательств, способен вызывать рвоту, чтобы избавить субъекта от ситуации явного переедания. Интересно, что в статье было отмечено, что ΡΡ в сходных дозах не вызывает рвоты у этих собак (Нагбшд апб МсЭопа1б, 1989). ΡΡ действует с помощью Υ4 рецепторов, также расположенных в области пострема ствола мозга, но не вызывает рвоту. Большие дозы комбинированных Υ2-Υ4 пептидных агонистов, таких как [61η34]ΡΡ, можно вводить животным, таким как обезьяны циномолгус (супо), достигая уровня в плазме 12-13 нМ, не наблюдая никакой рвоты у животных и никаких побочных эффектов со стороны ЖКТ. Это является неожиданным, так как |Ο1π34|ΡΡ имеет относительно высокую активность в отношении Υ2 рецептора, к которому ΡΥΥ3-36 является полностью селективным. Так, неожиданно, комбинированный Υ2-Υ4 селективный агонист не вызывает рвоты в той же степени, в какой селективный Υ2 агонист - соединение ΡΥΥ3-36 - вызывает. Очевидно, Υ4-рецепторная активация, предположительно, в области пострема, предупреждает рвотное действие Υ2 активации того же соединения. Это свойство комбинированного Υ2-Υ4 селективного агониста является очень благоприятным для лечения ожирения и связанных с ним состояний.

Следовательно, Υ2/Υ4 селективные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, пригодны для применения для субъекта, такого как млекопитающее, включая человека, чтобы регулировать потребление энергии. Соответственно, изобретение относится к способам изменения потребления энергии, потребления пищи, аппетита и расхода энергии. В данном описании раскрывается способ уменьшения потребления энергии или пищи путём введения субъекту косметически или терапевтически эффективного количества такого агониста. В одном варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к снижению количества, или общего веса, или общего объёма, или калорийности (содержания калорий) пищи. В другом варианте изобретения это может вызывать снижение потребление компонента пищи, например снижение приёма липидов, углеводов, холестерина или белков. В некоторых других способах по данному описанию могут вводиться предпочтительные соединения, которые подробно обсуждаются в данном описании. В дополнительном варианте изобретения раскрывается способ снижения аппетита путём введения терапевтически эффективного количества такого агониста. Аппетит можно измерять (определять) любыми способами, известными специалисту в данной области техники.

Например, пониженный аппетит можно определять с помощью физиологической оценки. В таком варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к изменению чувства голода, насыщения и/или сытости. Голод можно оценивать любыми способами, известными специалисту в данной области техники. В одном варианте изобретения голод оценивают с помощью физиологических анализов, таких как оценка чувства голода и сенсорного восприятия, используя, например, анкету.

- 18 011861

В другом варианте изобретения раскрывается способ снижения моторики верхних отделов ЖКТ, например замедление опорожнения желудка. Способ включает введение терапевтически эффективного количества такого агониста субъекту, тем самым снижается моторика ЖКТ. Общеизвестно, что соединения, которые замедляют опорожнение желудка, также оказывают благотворное действие при снижении потребления пищи, так как субъект чувствует насыщение или сытость. Известно, что как ΡУУ3-36, прототип Υ2 агониста, так и РР, прототип Υ4 агонистов, замедляют опорожнение желудка. Комбинированный Υ2-Υ4 агонист оказывает аддитивное или даже синергическое действие при ингибировании моторики верхних отделов ЖКТ.

В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию изменения энергетического метаболизма у субъекта. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества такого агониста, тем самым изменяется расход энергии. Энергия сжигается в физиологических процессах. Организм может непосредственно изменять расход энергии, модулируя эффективность этих процессов или изменяя количество или природу протекающих процессов. Например, в процессе пищеварения повышается энергия в организме при прохождении через пищеварительный тракт и усвоении пищи, и в клетках, при этом эффективность клеточного метаболизма может меняться, выделяя больше или меньше тепла. В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию любых и всех манипуляциях дугообразной цепи, описанных в данной заявке, которые согласованно изменяют потребление пищи и соответственно изменяют расход энергии. Расход энергии является результатом клеточного метаболизма, белкового синтеза, интенсивности обмена веществ и усвоения калорий. Таким образом, периферическое введение приводит к повышенному расходу энергии и пониженной эффективности усвоения калорий. В одном варианте изобретения терапевтически эффективное количество рецепторного агониста по изобретению вводят субъекту, тем самым повышая расход энергии.

В некоторых вариантах изобретения как при терапевтическом, так и при косметическом применении Υ2/Υ4 селективный агонист можно использовать для контроля веса и лечения, снижения или предупреждения ожирения, в частности для достижения одного или более из нижеприведённых результатов: предупреждение и снижение увеличения массы тела; индукция и промотирование потери веса; уменьшение ожирения, определяемого с помощью индекса массы тела. Как указано выше, изобретение также относится к применению Υ2/Υ4 селективного агониста для регуляции одного или более чувств: аппетита, сытости или голода, в частности одного или более из нижеперечисленного: индукции, увеличения, повышения и промотирования сытости и ощущения насыщения; уменьшения, ингибирования и подавления голода и ощущения голода. Это раскрытие относится далее к применению Υ2/Υ4 селективного агониста для поддержания одного или более из нижеперечисленного: заданного веса тела, заданного индекса массы тела, желаемого внешнего вида и хорошего здоровья.

В другом, или альтернативном, аспекте данное изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения пониженного энергетического метаболизма, нарушений питания, нарушения аппетита, избыточного веса, ожирения, булимии, нейрогенной булимии, Синдрома X (метаболического синдрома), или связанных с этим осложнений или рисков, включая диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (МОЭМ), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, застойную сердечную недостаточность, удар, инфаркт миокарда, тромбоэмболические заболевания, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки, причём способ заключается во введении субъекту, такому как млекопитающее, включая человека, эффективной дозы одного или более Υ2/Υ4 селективных агонистов по данному описанию.

2. Кишечная гиперсекреция.

Известно, что как NΡΥ, так и ΡΥΥ оказывают антисекреторное действие как на тонкий, так и на толстый кишечник. С помощью исследований, проведённых на выделенных тканях человеческой толстой кишки, было продемонстрировано, что это действие опосредуется как Υ1, так и Υ2 рецепторами, а с помощью ТТХ было показано, что основная часть Υ2 компонента опосредуется с помощью нейронного компонента (Сох & ТоидЬ 2001 Вг. I. РЬагтасо1. 135: 1505-12). РР также оказывает сильное антисекреторное действие, и оно, очевидно, опосредуется Υ4 рецепторами, расположенными на эпителиальных клетках, а не по нейронным механизмам (Сох & ТоидН 2001). Таким образом, вследствие аналогичного эффекта, но опосредуемого другими механизмами, комбинированный Υ2-Υ4 агонист оказывает аддитивное или даже синергическое антисекреторное действие на ЖКТ. Было показано ш у1уо, что периферическое введение ΡУУ может вызвать продолжительную реакцию на кишечную секрецию, индуцированную вазоактивным кишечным полипептидом у людей с илеостомией (Р1ау£огй е! а1., 1990, Ьапсе!, 335: 1555-57). Был сделан вывод, что ΡУУ пептид может быть терапевтическим агентом против диареи, однако, например, натрийуретический и гипертензивный эффекты комбинированного Υ1 и Υ2 агониста препятствуют этому. Комбинированные селективные Υ2-Υ4 агонисты по настоящему изобретению особенно применимы для лечения или защиты против гиперсекреции ЖКТ, включая различные формы диареи, вне зависимости от того, вызваны они непосредственно гиперсекрецией или нет. Одно особенно интересное показание представляет собой гиперсекрецию у пациентов с илеостомией, которые часто теряют

- 19 011861 большие количества жидкости.

2.1. Терапевтический ангиогенез.

Ряд 1и У1!го исследований влияния на рост клеток сосудов гладких мышц, гипертрофию вентрикулярных кардиомиоцитов, а также на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток наводят на мысль, что №У может действовать как ангиогенный фактор (2ико\Укка-Сго)ек е! а1., 1998, Спс. Век. 83: 187-95). Важно отметить, что исследования ш у1уо как на мышиной модели корнеальных микрокарманов, так и анализ хорион-аллантоисной мембраны (САМ) цыплят подтвердили, что NΡΥ является мощным ангиогенным фактором, который приводит к возникновению васкулярных структур, подобных сосудистому дереву, с проявляющейся вазодилатацией, как наблюдалось в ином случае только для фактора роста фибробластов-2 (ЕСЕ-2), а не на примере ангиогенных структур сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР, УЕСЕ) (Екк!гаиб е! а1., 2003, РХАА 100: 6033-38). При развитии эмбрионов цыплят NΡΥ индуцировал прорастание сосудов из ранее имевшихся кровеносных сосудов. Действие №Υ не наблюдается у животных, нокаутированных по Υ2 рецептору, это указывает, что Υ2 рецептор отвечает за ангиогенный эффект №Υ (Екк!гаиб е! а1., 2003). Это замечание подтверждается также наблюдениями, показывающими, что Υ2 рецептор является высокоактивированным в ишемических сосудах, и фермент, который генерирует эндогенный, селективный Υ2 лиганд ΡУУ3-36, дипептидилпептидазу-1У, также является высокоактивированным. Пептиды по настоящему изобретению, все, представляют собой Υ2 агонисты, имеющие, по меньшей мере, дополнительное свойство - являться также Υ4 агонистами и быть селективными, в то же время они являются слабыми агонистами Υ1. Таким образом, свойство этих пептидов быть Υ2 агонистами делает их пригодными в качестве терапевтических ангиогенных агентов, а Υ4 агонизм оказывает благотворное действие на снижение или избавление от нежелательной стимуляции тошноты или рвоты, как известно, ассоциируемых с высокими уровнями Υ2 агонистов в плазме.

При различных сердечно-сосудистых заболеваниях, например, таких как атеросклероз, считается, что в периферических сосудах, а также в коронарных сосудах индукция ангиогенеза является благотворной. Также считают, что индукция благотворна для обеспечения реперфузии после инфаркта микарда. Полагают, что ЕСЕ-2 является эффективным агентом для индукции ангиогенеза у пациентов с сердечнососудистыми заболеваниями. Однако, подобно большинству ангиогенных факторов, ЕСЕ-2 является фактором роста и может также стимулировать рост опухолей, вызывая ангиогенез. Как представлено выше, NΡΥ, действующий через Υ2 рецепторы, индуцирует неоваскуляризацию типа, аналогичного неоваскуляризации, индуцируемой ЕСЕ-2, однако №Υ является нейропептидом, а не классическим фактором роста и не вызывает осложнений в виде индукции роста опухоли, таким образом, Υ2 агонист является агентом, пригодным для терапевтического ангиогенеза. Однако особенно важно для такого применения то, что агонист не проявляет Υ1-рецепторного агонизма, так как это оказывало бы нежелательное действие на сердечно-сосудистую систему. Это означает, что пептиды, которые рассматриваются в данном изобретении, являющиеся Υ2 селективными рецепторными агонистами, являются особенно подходящими терапевтическими агентами с учётом того, что они вызывают ангиогенез. Они особенно применимы после модификации с присоединением САС-связывающего мотива, обсуждавшегося выше.

Дальнейшее уточнение: действие ЕСЕ-2, как действие большинства классических факторов, частично опосредуется или регулируется с помощью их связывания с гликозаминогликаном (САС) во внеклеточной матрице. Это связывание с САС гарантирует, что ангиогенный фактор действует в соответствующем пространстве и времени и что он не скоро вымывается из ткани. Для применения в терапевтическом ангиогенезе малых пептидов и пептидов-миметиков, таких как описанные в настоящем изобретении, это особенно важно. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения пептиды включают один или более САС-связывающих мотивов, которые гарантируют, что они присоединятся к САС во внеклеточной матрице, с целью индуцировать оптимальный ангиогенез после введения. Это можно осуществлять, например, внутривенным или внутриартериальным введением, или, например, можно вводить непосредственно в коронарные артерии, чтобы индуцировать ангиогенез в сердце при болезни коронарной артерии и/или после острого инфаркта миокарда. Аналогично, такое соединение можно вводить внутриартериальной инъекцией в бедренную артерию для лечения болезни периферических сосудов. Его можно также, например, применять для топического, местного введения в кожные поражения, чтобы стимулировать более быстрое заживление ран. Продолжительной экспозиции с Υ рецептором, эффективной для индукции ангиогенеза, можно также добиться, используя пептид по настоящему изобретению, модифицированный мотивом, связывающим сывороточный альбумин.

Таким образом, в предпочтительном варианте изобретения Υ2/Υ4 селективные агонисты содержат САС-связывающий мотив, который вводят в положение, где он не снижает устойчивости пептида или не снижает активности и селективности пептида. Соответственно, в одном варианте данное изобретение относится к применению модифицирующих изменений Υ2/Υ4-рецепторного агониста в системе ангио генеза, особенно, для индукции ангиогенеза, такого как ангиогенез, ассоциированный заболеваниями или состояниями, например, такими как сердечно-сосудистые заболевания, включая болезнь периферических сосудов и инфаркт миокарда; процессы репарации тканей, включая заживление ран на коже, воспалительные состояния, включая воспалительные состояния в желудочно-кишечном тракте, такие, например, как язвы, колит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и т. д.

- 20 011861

Специфический вариант изобретения включает применение рецепторного агониста для индукции ангиогенеза в сердце или в кровеносных сосудах, или в тканях, таких как ткань слизистой оболочки, включая слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта и кожу.

3. Заживление ран.

Сообщалось, что у животных, у которых Υ2 рецептор селективно выделяется (элиминирует) за счёт делеции его гена, заживление ран замедляется, и что ухудшается ассоциированная с этим неоваскуляризация (Екк!тапб е! а1., 2003, РНАЗ, 100: 6033-38).

Поэтому селективные Υ2-Υ4 агонисты по настоящему изобретению применимы для улучшения заживления ран за счёт их свойства - быть агонистами Υ2. Для этого пептиды можно вводить различными способами, включая парентеральное введение. Однако предпочтительным способом применения является топическое введение, например, в виде раствора, дисперсии, порошков, плиток, крема, мази, лосьона, геля, гидрогеля, трансдермальной системы доставки, включая пластыри и т. д. Для топического применения их можно использовать в обычной форме. Однако в предпочтительном варианте изобретения пептиды модифицируют с помощью одного или более САС-связывающих мотивов по данному описанию для того, чтобы гарантировать продолжительное местное действие пептида с помощью связывания САС в ткани.

4. Воспалительное заболевание кишечника.

Ранее было описано применение РΥΥ для предупреждения и/или лечения воспалительного заболевания кишечника; см. международную заявку 03/105763, принадлежащую Ату11п РЬагтасеибса1к, Шс., вводимую в данное описание в качестве ссылки. Следовательно, агонисты по данному изобретению являются также эффективными для лечения или предупреждения воспалительного заболевания кишечника. Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению агонистов по данному описанию для такой медицинской цели. В представляющем интерес варианте изобретения пептиды содержат один или более САС-связывающих мотивов, см. выше.

Дополнительные комментарии относительно применения Υ2/Υ4 агонистов для лечения или предупреждения ожирения и родственных заболеваний

В процессе еды широкий спектр желудочно-кишечных гормонов и нейромедиаторных систем активируется тщательно согласованно, последовательно или с наложением. Кроме того, компоненты пищи влияют не только на секрецию ЖК гормонов и активность различных путей афферентных нейронов, но эти компоненты пищи, после всасывания, также непосредственно влияют на различные гормоны и центры в ЦНС. Поэтому регуляция потребления пищи и расхода энергии представляет собой в высшей степени сложный и многоаспектный процесс. С этой точки зрения удивительным является, что некоторые гормоны, такие как агонисты Υ2, могут на самом деле заметно влиять на систему при введении таким образом, который приводит, например, только к 3-4-кратным уровням в плазме, которые достигаются в процессе еды.

Частью проблемы является то, что применение таких соединений - комбинированных Υ2-Υ4 агонистов - вызывает оптимальный эффект, если соединения дают натощак в описанных эффективных дозах. Если Υ2-Υ4 агонисты дают в ситуации, когда различные гормональные и нейронные системы активны вследствие присутствия компонентов пищи в ЖКТ или ожидания пищи, эффекта не наблюдается или наблюдаемый эффект значительно меньше. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения комбинированный Υ2-Υ4 агонист вводят натощак в эффективной дозе либо подкожно, назально, либо другими способами, указанными в другом месте данного описания. В данном контексте термин натощак означает, что субъект не принимал никакой пищи или питья в течение, по меньшей мере, последних 2 ч перед введением комбинированного Υ2-Υ4-рецепторного агониста, например, по меньшей мере, в течение последних 3 ч, по меньшей мере, в течение последних 4 ч, по меньшей мере, в течение последних 5 ч, по меньшей мере, в течение последних 6 ч, по меньшей мере, в течение последних 7 ч, по меньшей мере, в течение последних 8 ч, по меньшей мере, в течение последних 9 ч, по меньшей мере, в течение последних 10 ч, по меньшей мере, в течение последних 11 ч, по меньшей мере, в течение последних 12 ч перед введением дозы.

В подгруппе популяции комбинированный Υ2-Υ4 агонисты могут не оказывать предполагаемого действия вследствие генетических изменений, таких как полиморфизм в гене Υ4 рецептора. Утрата функциональных мутаций в этих рецепторах связана, по-видимому, с ожирением. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения осуществляют анализ Υ4-рецепторного гена субъекта, которого нужно лечить, чтобы проверить эти гены на полиморфизм/мутации и идентифицировать такой полиморфизм. На основании такого анализа можно проводить оптимальное лечение субъектов. Например, только субъекты с нормальным генотипом или с полиморфизмом, который не влияет на функцию Υ4 агонистов, включая комбинированные Υ2-Υ4 агонисты, можно лечить с применением таких агонистов. Другая возможность - повысить дозу комбинированного Υ2-Υ4 агониста, вводимую субъектам с ослабленным рецептором, чтобы гарантировать оптимальное действие лекарства. В случае, когда ожирение субъекта вызвано недостаточностью функции Υ4 рецептора, можно утверждать, что лечение, например большими дозами, комбинированного Υ2-Υ4 агониста является формой заместительной терапии при условии, что релевантная рецепторная функция всё ещё сохраняется, например, у гетерозиготных пациентов. В ситуа

- 21 011861 ции, когда невозможно или по финансовым причинам не удаётся провести такой генетический анализ, применение селективного комбинированного Υ2-Υ4 агониста особенно подходит, так как он вследствие его двойного действия на две различные мишени будет эффективен даже в тех случаях, когда одна из мишеней не функциональна или имеет пониженную функциональность из-за генетического полиморфизма.

Перед началом постоянного лечения, чтобы быть уверенными, что лечение проходят только чувствительные к нему субъекты, можно провести тщательный тест для того, чтобы гарантировать, что эти соединения оказывают предполагаемое действие на субъекта, которого нужно лечить.

Селективные Υ2-Υ4 агонисты по изобретению можно комбинировать при лечении ожирения, диабета и родственных заболеваний с различными другими лекарствами, имеющими целью аппетит и расход энергии, эти лекарства включают, но без ограничения, лекарства, такие как ингибиторы липаз ЖКТ, ингибиторы обратного захвата нейромедиаторов, антагонисты каннабиноидных рецепторов и обратные агонисты, а также другие типы нейромедиатора, включая, но без ограничения, 5Н рецепторы, и/или гормона, включая, но без ограничения, агонисты или антагонисты СЬР-1, МС4, МСЗ-рецепторов. Так как селективные Υ2-Υ4 агонисты направлены на гомеостатический регуляторный механизм для связи между ЖКТ и ЦНС, т.е. на Υ2 и Υ4 рецепторы обычно нацелен опосредующий насыщение гормон ΡΥΥ из кишечника и РР из поджелудочной железы, особенно полезно совмещать лечение комбинированными Υ2Υ4 селективными агонистами с лечением лекарством, направленным на важнейший гедонический механизм аппетита и расхода энергии, таким как СВ1 рецепторы, например, являющиеся частью системы поощрения. Поэтому применение селективных Υ2-Υ4 агонистов при лечении ожирения и родственных заболеваний в комбинации с СВ1 антагонистом является предпочтительным вариантом настоящего изобретения.

Дозировки

Терапевтически эффективное количество Υ2/Υ4-рецепторного агониста по данному изобретению зависит от конкретного применяемого агониста, возраста, веса и состояния субъекта, проходящего лечение, тяжести и типа состояния или заболевания, которое нужно лечить, способа введения и эффективности применяемой композиции. Например, терапевтически эффективное количество Υ2/Υ4-рецепторного агониста может меняться, примерно, от 0,1 мкг на кг массы тела, примерно, до 1 г на кг массы тела, например от около 5 мкг до около 1 мг на кг массы тела. В другом варианте изобретения рецепторный агонист вводят субъекту в количестве 0,5-135 пикомолей (пмоль) на кг массы тела или 72 пмоля на кг массы тела. В одном конкретном неограничивающем примере приблизительно 5-50 нмоль вводят в виде подкожной инъекции, например, около 2-20 нмоль или около 1,0 нмоль. Точную дозу специалист в данной области техники легко определит, исходя из активности конкретного применяемого соединения (такого как агонист рецептора), возраста, веса, пола и физиологического состояния субъекта. Доза агониста может быть молярным эквивалентом терапевтически эффективной дозы ΡΥΥ3-36. Это количество можно разделить на одну или несколько доз для применения ежедневно, через день, еженедельно, через каждые две недели, ежемесячно или с любой другой подходящей частотой. Обычно приём осуществляют один или два раза в день.

Способы применения

Агонист можно вводить любым способом, включая энтеральный (например, оральное введение) или парентеральный способ. В конкретном варианте изобретения предпочтительным является парентеральный способ, он включает внутривенную, внутрисуставную, интраперитонеальную (внутрибрюшинную), подкожную, внутримышечную, надчревную инъекцию и инфузию, а также сублингвальный (подъязычный), трансдермальный (чрескожный), топический, трансмукозный, включая назальный, способ, или ингаляция, например лёгочная ингаляция. В конкретных вариантах изобретения предпочтительным является подкожный и/или назальный способ применения.

Агонисты рецепторов можно вводить как таковые в подходящем носителе, или их можно вводить в виде подходящей фармацевтической или косметической композиции. Такие композиции также входят в объём настоящего изобретения. Ниже описаны подходящие фармацевтические композиции. Специалист в данной области техники знает, что такая композиция может быть также пригодна для косметического применения, или он знает, как скорректировать композицию, чтобы сделать ее косметической, используя подходящие косметически приемлемые эксципиенты.

Фармацевтические композиции

Агонисты рецепторов (рецепторные агонисты, также называемые соединения) по данному изобретению для применения в медицине или косметике обычно бывают в виде фармацевтической композиции, содержащей конкретное соединение или его производное совместно с одним или более физиологически или фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Соединения можно вводить животному, включая млекопитающих, таких как, например, человек, любым подходящим способом введения, например, таким как оральный, трансбуккальный, назальный, окулярный, лёгочный, топический, трансдермальный, вагинальный, ректальный, парентеральный (включая, наряду с другими, подкожный, внутримышечный и внутривенный, см. выше) способ, в дозе, которая эффективна для индивидуальных целей. Специалист в данной области техники знает, как выбрать под

- 22 011861 ходящий способ введения. Как указывалось выше, предпочтительным является парентеральное введение. В конкретном варианте изобретения рецепторный агонист вводят подкожно и/или назально. Общеизвестно в уровне техники, что подкожные инъекции может делать себе сам пациент.

Композицию, пригодную для конкретного способа применения, индивидуально для каждого пациента легко определит практикующий врач. Различные фармацевтически приемлемые носители и их состав описаны в обычных монографиях о препаратах, например в РеттдЮп'х РНагтасеийса1 8аепсе5 Ьу Е.А. Майш.

Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по изобретению, может быть в виде твёрдой, полутвёрдой или жидкой композиции. Для парентерального применения композиция обычно находится в жидком виде или в виде полутвёрдом или твёрдом виде для имплантации.

Жидкие композиции, которые представляют собой стерильные растворы или дисперсии, могут применяться, например, для внутривенной, внутримышечной, внутриоболочечной, эпидуральной, интраперитонеальной или подкожной инъекции или инфузии. Соединения можно также приготовить в виде стерильной твёрдой композиции, которую можно растворять или диспергировать до или во время введения, например, в стерильной воде, физиологическом растворе или другой подходящей стерильной среде для инъекций.

Композиции в жидком виде может представлять собой раствор, эмульсию, включая наноэмульсии, суспензию, дисперсию, липосомную композицию, смесь, спрей или аэрозоль (два последних типа являются особенно релевантными для назального применения).

Подходящие среды для растворов или дисперсий обычно бывают на водной основе или на основе фармацевтически приемлемых растворителей, например, таких как масло (например, кунжутное или арахисовое масло) или органический растворитель, например, такой как пропанол или изопропанол. Кроме того, композиция по изобретению содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты, например, такие как агенты, корректирующие рН, осмотически активные агенты, например, для того, чтобы довести изотоничность композиции до физиологически приемлемых уровней, агенты коррекции вязкости, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты и т.д. Предпочтительной средой является вода.

Композиции для назального применения могут также содержать нераздражающие носители, например, такие как полиэтиленгликоли, гликофурол, и т.д., а также энхансеры всасывания, хорошо известные специалисту в данной области техники (например, со ссылкой на РеттдЮп'х РйагтасеиБса1 8с1епсе).

Для парентерального применения в одном варианте изобретения агонист рецептора можно вообще готовить смешением агониста рецептора заданной степени чистоты в виде стандартной лекарственной формы для инъекций (в виде раствора, суспензии или эмульсии) с фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, т.е. таким, который не является токсическим для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и который совместим с другими ингредиентами композиции.

Обычно препараты готовят с помощью однородного и тщательного смешения (контактирования) рецепторного агониста с жидкими носителями, или с тонкоизмельчёнными твёрдыми носителями, или с теми и другими.

Затем, при необходимости, продукту придают форму нужного препарата. Предпочтительно носитель представляет собой парентеральный носитель, более предпочтительно раствор, изотонический с кровью реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Также применимы по данному описанию неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат, а также липосомы. Благодаря амфифильной природе пептидов по данному описанию подходящие формы также включают мицеллярные препараты, липосомы и другие типы препаратов, содержащие один или более соответствующих липидов, таких, например, как фосфолипиды и т. п.

Предпочтительно они суспендируются в водном носителе, например в изотоническом буферном растворе при рН около 3,0-8,0, предпочтительно при рН около 3,5-7,4, 3,5-6,0 или около 3,5-5. Применимые буферные вещества включают ацетатный, цитратный, фосфатный, боратный, карбонатный буферы, например, такие как цитрат натрия-лимонная кислота или фосфат натрия-фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота.

Композиции также могут быть предназначены для контролируемой или пролонгированной доставки рецепторного агониста после введения, чтобы создать схему с менее частым введением. Обычно подходящей считается схема приёма лекарственного вещества 1-2 раза в сутки, но в объём настоящего изобретения также входят другие схемы применения, такие, например, как более частое и более редкое введение. Для осуществления пролонгированной доставки рецепторного агониста можно применять подходящий носитель, включающий, например, липиды или масла, чтобы образовать депо в месте введения, из которого рецепторный агонист медленно высвобождается в систему кровообращения, или можно использовать имплантат. Подходящие с этой точки зрения композиции включают липосомы и биоразрушаемые частицы, в которые включён рецепторный агонист.

- 23 011861

В таких ситуациях, когда нужны твёрдые композиции, эти композиции могут быть в виде таблеток, таких как обычные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, формованные таблетки, в виде пеллет, порошков, гранул, гранулятов, материала в виде макрочастиц, твёрдых дисперсий или твёрдых растворов.

Полутвёрдая форма композиции может представлять собой жевательную резинку, мазь, крем, линимент, пасту, гель или гидрогель.

Другие подходящие лекарственные формы фармацевтических композиций по изобретению могут представлять собой вагитории, суппозитории, пластыри, накладки, таблетки, капсулы, саше, пастилки, устройства и т. д.

Лекарственная форма может быть предназначена для неограниченного (свободного) или контролируемого высвобождения, например, за счёт того, что таблетки могут иметь соответствующие покрытия.

Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.

Содержание соединения по изобретению в фармацевтической композиции по изобретению составляет, например, около 0,1-100% вес./вес. фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции можно готовить любым способом, хорошо известным специалисту в области приготовления фармацевтических препаратов.

В фармацевтических композициях соединения обычно объединяются с фармацевтическим эксципиентом, т. е. терапевтически инертным веществом или носителем.

Носитель может иметь весьма разнообразные формы в зависимости от заданной лекарственной формы и способа применения.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут представлять собой, например, наполнители, связующие, вещества, способствующие расщеплению, разбавители, вещества, способствующие проглатыванию, растворители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, стабилизаторы, энхансеры, вещества, придающие вкус и запах, агенты коррекции рН, замедлители, увлажняющие средства, поверхностноактивные агенты, консерванты, антиоксиданты и т. д. Подробности можно найти в фармацевтических справочниках, например, таких как Кет1пд!оп'§ Рйагтасеи!1са1 8с1епсе или Рйагтасеийса1 Ехс1р1еп! НапйЬоок.

Синтез

Пептидные агонисты по данному изобретению можно синтезировать твердофазным пептидным синтезом, применяя либо автоматический синтезатор пептидов, либо обычный лабораторный синтез. Твёрдым носителем может являться, например, полимер хлортритила (С1) или Ванга (^апд), каждый из которых можно легко приобрести. Активные группы этих полимеров легко реагируют с карбоксильной группой Ν-Ртос аминокислоты, при этом связывая её с полимером ковалентной связью. Связанный с полимером амин можно депротекционировать экспозицией с пиперидином. Затем вторую Ν-аминокислоту можно присоединить к элементу полимер-аминокислота. Эти стадии повторяют до тех пор, пока не получат нужную последовательность. По окончании синтеза связанный с полимером защищенный пептид можно депротекционировать и отщепить от смолы под действием трифторуксусной кислоты (ТФК, ТРА). Ниже даны примеры реагентов, облегчающих присоединение новых аминокислот к связанной с полимером аминокислотной цепи: тетраметилурония гексафторфосфат (НАТи), О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НВТи), О-(1Н-бензотриазол-1ил)-^^№,№-тетраметилурония гексафторборат (ТВТи), 1Н-гидроксибензотриазол (НОВ!).

Также предпочтительнее бывает пептидный синтез в растворе, нежели твердофазный пептидный синтез.

Модификация боковых амино- и карбоксильных групп аминокислоты пептидной цепи, например, введением ОАО-связывающего или другого мотива, описанного выше, является простым способом введения и снятия (депротекции) защиты других реакционноспособных групп боковых цепей, не участвующих в реакции.

- 24 011861

Пример.

Для иллюстрации способов, применяемых в синтезе агонистов по изобретению, описано получение последовательности [О1п34]РР.

Схема синтеза

Химические реактивы.

Используют следующие исходные материалы и растворители. Исходные материалы

Ртос- Ктк- Теп!аОе1- гезт (полимер)

Ртос- А1а- ОН.Н₂О

Ртос- Аг§(РЫ)- ОН

Ртос- А8п(ТП)- ОН

Ртос- Азр(О!Ви)- ОН

Ртос- О1п(ТН)- ОН

Ртос- О1и(О!Ви)- ОН

Ртос- С1у- ОН

Ртос- Не- ОН.

Ртос- Ьеи- ОН

Ртос- Ме!- ОН

Ртос- Рю- ОН

Ртос- ТЬг(!Ви)- ОН

Ртос- ТугДВи)- ОН

Ртос- Уа1- ОН

Растворители и реагенты, применяемые в синтезе и для очистки Уксусная кислота

Растворитель

Уксусный ангидрид

Реагент

Аммония ацетат

Реагент

Аммония йодид

Реагент

Диизопропилкарбодиимид (ТЛС)

Диметил формамид (ДМФА, ОМР)

Дитиотреитол (ϋΤΤ)

Реагент

Растворитель

Реагент

Этанол

1- Гидроксибензотриазол (НОВ!)

Изопропанол

Ν- Метилморфолин (ΝΜΜ)

Пиперидин

Трифторуксусная кислота (ТФК, ТРА)

Растворитель

Реагент

Растворитель

Реагент

Растворитель

Нужный продукт собирают с помощью Ртос-8РР8 на полимере Ртос-К1пк-Теп!аОе1-ге§т. Аминокислоты с защитными группами в боковой цепи суть следующие: Агд(РЪР), А§п(Тг1), А§р(О!Ви), О1п(Тг!), О1и(О!Ви), ТЬг(!Ви) и Туг(!Ви).

- 25 011861

Взаимодействие (связывание) осуществляют в ДМФА, изменяя эквиваленты аминокислот, с применением ϋΙί'' и ΗΟΒ1 для активации. После каждой конденсации (связывания) следует кэпирование уксусным ангидридом и ΝΜΜ. Мониторинг каждой конденсации (связывания) осуществляют с применением теста Кайзера/с нингидрином или хлоранилом. Между каждыми циклами связывания группу Гтос удаляют пиперидином в ДМФА.

Защищённый пептид-полимер отщепляют от носителя с помощью ТФК и нейтрализуют в водном растворе ацетата аммония, получают сырой продукт. После обработки полимер отфильтровывают.

Сырой продукт очищают препаративной ВЭЖХ, используя материал для обращенно-фазовой хроматографии на основе силикагеля или полистирола. Раствор пептида концентрируют упариванием и фильтруют перед выделением лиофилизацией.

Структура подтверждена масс-спектрометрией с диссоциацией, индуцированной столкновениями/масс-спектрометрии (СШ Μ8/Μ8), аминокислотным анализом, Γί'.'-Μ8 и хиральной чистотой. Чистоту проверяют с помощью ВЭЖХ и хиральной чистоты.

Химический анализ пептидов.

Для иллюстрация применяемых способов и полученных результатов ниже представлены аналитические данные пептидов по изобретению, синтезированные вышеуказанными методами.

Данные

Пептид	Молекулярная формула	МУ/	Теоретическая величина т/ζ	Полученная масса Μ/ζ	Κΐ мин	Чис- тота	Метод ВЭЖХ
[О1п34]РР	Ο185Η288Ν 5405552	4212.8		4212	20.8	94.8	С
Не31,61п34]РР	Ο185Η288Ν 5405552	4212.8		4211.6	20.5	97.1	С
[Уа131,О1п34]РР	Ο184Η286Ν 5405552	4198.8		4197.2	25.0	96.3	С
Ьеи30,С1п34]РР	Ο186Ν289Ν 530568	4195.8	840.2 [М+5Н]	840.0 [М+5Н]	19.7	96.5	В
Ηί526,ΟΙη34]ΡΡ	Ο185Η282Ν 5205682	4194.8	839.9 [М+5Н]	839.9 [М+5Н]	19.1	95.0	В
[А1а1,С1и4,Агд26, Μθί30]ΡΥΥ	Ο186Η288Ν 540598	4256.8	710.4 [М+6Н]	710.4 [М+6Н]	19.4	96.4	В
[Агд26,Ме130]РУУ	Ο193Η298Ν 5605781	4346.9	870.7 [М+5Н]	870.7 [М+5Н]	20.2	91.3	В
С!и4,Агд26]РУУ	Ο193Η295Ν 55059	4329.8	867.5 [М+5Н]	867.5 [М+5Н]	17.4	95.3	В

Аналитическая ВЭЖХ, метод А

Колонка = Уубас С18 Рерйбе-Ргсйет (для пептидов- белков), 250 х 4.6 мм

Буфер А = 0.05% ТФК в воде

Буфер В = 0.05% ТФК в 100% МеСХ

Градиент = 0% В - 60% В за 20 мин

Скорость потока =1.00 мл/мин

Длина волны =215 нм

Масс-спектроскопия = ΜΑ^^I-ТΟΓ с гентизиновой или альфа-цианогидроксикоричной кислотой в качестве матрицы

Аналитическая ВЭЖХ, метод В

Колонка = Нурегзй Οϋδ- 2, 250 х 4.6 мм

Буфер А =0.1 % ТФК в 100% МеСИ

Буфер В =0.1 % ТФК в 100% воде

Градиент = 24% А - 35% А за 25 мин

Скорость потока = 1.00 мл/мин

Длина волны = 220 нм

Масс-спектроскопия = Ε8Ι [скорость газа в распылителе: 1,5 л/мин; СОР - 20,0 В; СОР темп.: 250°С; Темп. блока: 200°С; напряжение (смещение) в датчике: +4,5 кВ; Детектор: 1,5 кВ; Т. поток: 0,2 мл/мин; В конц.: 50% Н20/50% САХ.]

- 26 011861

Аналитическая ВЭЖХ, метод С

Колонка	= Ууйас С18 218ТР54, 250 х 4.6 мм
Буфер А	= 20 мл ΜβΟΝ и 2 мл ТФК в воде (общий объём 2000 мл)
Буфер В	= 2 мл ТФК в 100% воде (общий объём 2000 мл)
Градиент	= 25% В - 75% В за 27 мин
Скорость потока	= 1.00 мл/мин

Длина волны = 215 нм

Для дальнейшей иллюстрации синтетических методов, которые можно применять для получения Υ2/Υ4 селективных агонистов, которые рассматриваются в настоящем изобретении, только в качестве примера, представлены нижеприведённые протоколы:

Синтез [Сук2,Ьук13,О-Сук27,С1п34]РР (8ЕР И) Νο: 30) и его аналогов.

Ниже описывается синтез циклического Υ2 селективного пептида [Сук2,Ьук13,О-Сук27,С1п34]РР (8Е(,) П) Νο: 30) и синтез его аналогов с САС-связывающим мотивом, мотивом, связывающим сывороточный белок или фрагментом полиэтиленгликоля, присоединёнными к ипсилон-аминогруппе Ьук13.

Как правило, защитной группой в боковой цепи является Γтοс, за исключением:

Агу = Ртос Аг§(РЬ£)- ОН

Азп, Ст = Ртос Азп(Тг!)- ОН

ΤΙίτ, бег, Азр, С1и, Туг = 1Ви1у1 (трет- бутил)

Ьуз = Ртос ЬузДВос)- ОН

А1а-8ег 22-23 = Ртос А1а8ег псевдопролин

В случае [Сук2,Ьук13,О-Сук27,С1п34]РР для того, чтобы добиться селективной депротекции, используют следующие защитные группы:

Ьуз 13 = Ртос Ьуз(В(1е)- ОН

Суз 27 = Ртос ВЬуз(Тй)- ОН

Пептид синтезируют твердофазным синтезом на полимере РАЬ Ред-Р8 (полимер, который при отщеплении образует биологически важную карбоксиамидную группу) с применением Ρтοс защиты с 5-кратным молярным избытком реагента. Конденсацию осуществляют с помощью НСТи в ДМФА в качестве реагента. Снятие Ρтοс после каждой стадии конъюгации осуществляют 20% раствором пиперидина в ДМФА в течение 10-15 мин. Присоединение проверяют на каждой стадии количественным анализом с нингидрином. В некоторых случаях можно осуществлять двойное связывание (присоединение).

После синтеза полноразмерных пептидов защитную группу в ипсилон-аминогруппе Ьук 13 селективно снимают обработкой 2% раствором гидразина в ДМФА в течение 15-20 мин, в то же время пептид ещё остаётся связанным с полимером.

Затем полимер делят на три различных части для получения недериватизированного пептида, а также пептидов, модифицированных тремя различными мотивами:

1. [Сук2,Ьук13,О-Сук27,С1п34]РР (8Ер И) Νο: 30).

Материнский пептид отщепляют от полимера и депротекционируют обработкой смесью 95% трифторуксусной кислоты, 2,5% воды, 2,5% трипропилсилана в течение 2-3 ч.

Внутримолекулярный стабилизирующий дисульфидный мостик между Сук2 и 1)-С’\^;к27 получают окислением на воздухе, растворяя пептид с концентрацией <1 мг/мл в ацетате аммония рН 8,5-9 при перемешивании в течение 24-28 ч до тех пор, пока не исчезнут свободные тиолы, определяемые реактивом Эллмана.

Пептид очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ: колонка Уубас 300 А, 250 ммх10 мм, элюент (буфер А=0,05% ТФК в воде; буфер В=60% ΜβΟΝ: 40% воды: 0,05% ТФК) в градиенте 30-80% буфера В в течение 20 мин, 2 мл/мин. Определяют О1) при 215 нм и элюент, содержащий конкретный пептид, собирают и лиофилизируют.

Структуру пептида подтверждают масс-спектрометрией, аминокислотным анализом и, при необходимости, также анализом аминокислотной последовательности.

2. [Сук2,№(8-(8-гамма-глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)-Ьук13,В-Сук27,С1п34]РР (8ЕР И) Νο: 31).

Для того чтобы присоединить мотив связывания сывороточного альбумина, 8-(8-гаммаглутамоиламинооктаноиламино)октаноильную группу связывают со свободной ипсилон-аминогруппой остатка Ьук 13 после удаления защитной Обе группы, пептидным синтезом, с помощью защищённой аминооктановой кислоты, а затем дважды с помощью защищённой гамма-глутаминовой кислоты, в то время как пептид всё ещё остаётся связанным со смолой.

- 27 011861

Пептид, модифицированный с применением мотива, депротекционируют, циклизуют и очищают, как описано выше для материнского пептида.

3. Флуоресцеин-[Сук2,N-{(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)з}-^ук13,^-Сук27,Ο1η34]ΡΡ (ЗЕР II) Νο: 32).

Для того чтобы присоединить ОАО-связывающий мотив, мотив строят постадийно пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Ьук 13, после удаления Обе группы, на пептиде [Сук2,^ук13,^-Сук27,Ο1η34]ΡΡ, всё ещё связанном с полимером, используя стандартный метод с Ртос, как в целом описано выше: 6А6-связывающая последовательность, полученная таким образом, представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1аА1а-Агд-А1а. Флуоресцеиновую метку присоединяют для ίίί νι!ΐΌ и т νίνο для аналитических целей в виде его 5,6 изомера - ΝΙΙ8 эфира, 10х избыток в течение 72 ч - к Ν-концу окончательной 6А6-связывающей последовательности.

Пептид, модифицированный с помощью 6А6-связывающего мотива, отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают, как описано выше для материнского пептида.

4. | С у к2, Ν -{Ν'-(21 -амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}-гамма-глутамоил-Ьук13,ПСу^О^^ (ЗЕр II) Νο: 33).

Для того чтобы присоединить фрагмент полиэтиленгликоля к Υ2-Υ4 селективному пептиду, защищённую 21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозановую кислоту связывают пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Ьук 13, после удаления Обе группы, на пептиде [Сук2,^ук13,^-Сук27,Ο1η34]ΡΡ, всё ещё связанном с полимером, а затем присоединяют защищённую гамма-глутаминовую кислоту.

ПЭГилированный пептид отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают, как описано выше для материнского пептида.

Используя описанные выше методы, синтезируют следующие агонисты по изобретению, приведённые в качестве примеров:

[Ν- (Ν’- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Еуз13,О1п34]РР (8Εζ) ГО Νο: 34) [Ν-(Α1η-Αγ§- Аг§- Аг§- А1а- А1а-Аг§- А1а)₃- Ьу818,О1п34]РР (8Ες ГО Νο: 35) [Ν- РЕС5000- Ьу813,С1п34]РР (8Ες ГО Νο: 36) [11е31,О1п34]РР (8Е(} ГО Νο: 5) [Уа131,О1п34]РР (8Е(} ГО Νο: 6) [Ьеи30,О1п34]РР (8Ες ГО Νο: 7) [Ν1ε30,Ο1η34]ΡΡ (8Е(^ ГО Νο: 8) [Ьеи28.С1п34]РР (8Е(^ ГО Νο: 9) [Ηΐδ26,Ο1η34]ΡΡ (8Е0 ГО Νο: 10) [11еЗ,С1п34]РР (8Е<2 ГО Νο: 11) [А1а1,(Э1и4,Аг§26,(Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е() ГО Νο: 12) [А1а1,О1и4,№- (Ν’- гексадеканоил)-гамма-глутамоил- Ьу813,Аг§261Ы1е30]РУУ (8Εζ) ГО Νο:37) [А1а1,О1и4,Ы- (А1а-Аг§- Аге- Аг§- А1а- А1а-Аг§- А1а)₃- Ьу813,Аг£26Д\ГО30]РУУ (8Ες Π)Νο: 38) [А1а1,01114,Ν-ΡΕ05ООО- Εγ813,Ατ§26,Ν1ε30]ΡΥΥ (8Е(^ ΙϋΝο: 39) [А1а1,С1и4,Аг§26(Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Ες ГО Νο: 13) [А1а1,С1и4]РУУ (8Е() ГО Νο: 14) и [А1а1 ,Ο1ιι4]ΝΡΥ (8Е(} ГО Νο: 15) [Аг§26, (Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΎ (8Εζ) ГО Νο: 16) и [Аг§26, (Ме130 или

Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е(^ ГО Νο: 17) [О1и4, (Μεΐ30 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е() ГО N0:18) и [О1и4, (Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Εζ) ГО Νο: 19) [О1и4,Аг§2б]РУУ (8Е(} ГО Νο: 20) и [Ο1ιι4,Ατ§26]ΝΡΥ (8Е() ГО Νο: 21) [Суз2ГО- Суз27,О1п34]РР (8Е() ΙΟΝο: 22) [Суз2,Аос5-24ГО- Суз27,О1п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 23)

- 28 011861

Биологические анализы и результаты

I. Ιη νίΐΐΌ анализы для определения аффинности и активности пептидов.

Анализ аффинности к человеческому Υ2 рецептору.

Аффинность тестируемых соединений к человеческому Υ2 рецептору определяют анализом конкурентного связывания, используя 125Ι-ΡΥΥ связывание в клетках СО8-7, транзиторно трансфецированных человеческим Υ2 рецептором трансфекцией с фосфатом кальция.

Трансфецированные СО8-7 клетки переносят в культуральные планшеты через день после трансфекции при плотности 40х10³ клеток на лунку, добиваясь 5-8% связывания радиоактивного лиганда. Через два дня после трансфекции проводят эксперименты по конкурентному связыванию в течение 3 ч при 4°С, используя 25 пМ 125Ι-ΡΥΥ (АтегзЬат, ЬЬ11е СЬаИоп!, ϋΚ). Анализы связывания проводят в 0,5 мл 50 мМ буфера 11ерез, ρΗ 7,4, дополненного 1 мМ СаС1₂, 5 мМ МдС1₂ и 0,1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина и 100 мкг/мл бацитрацина. Неспецифическое связывание определяют как связывание в присутствии 1 мкМ немеченого ΡΥΥ. Клетки дважды отмывают в 0,5 мл охлаждённого льдом буфера и добавляют 0,5-1 мл буфера для лизиса (8 М мочевина, 2% ΝΡ40 в 3 М уксусной кислоте) и гаммасчётчиком считают связанную радиоактивность. Определения делают в двойном повторе. Связывания в стационарном (равновесном) состоянии достигают в этих условиях. Величины ЕС₅₀ рассчитывают, используя программу работы со стандартными фармакологическими данными, Рпзт 3.0 (дгарЬРад 8о1Ааге, 8ап П1едо, И8А).

Анализ аффинности к человеческому Υ4 рецептору.

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ4 клетки СО8-7, в конкурентном анализе используют 125Ι-ΡΡ, и для определения неспецифического связывания используют РР.

Анализ аффинности к человеческому Υ1 рецептору.

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ1 клетки СОУ-7 и переносят в культуральные планшеты при плотности 1,5 х10⁶ (?) клеток на лунку, в конкурентном анализе используют 125Ι-ΝΡΥ и для определения неспецифического связывания используют ΝΡΥ.

Результаты тестирования ΝΡΥ, ΡΥΥ, ΡΥΥ3-36, РР и [О1п45]РР, [Ие31,О1п34]РР, [Уа131,О1п34]РР, [А^β26,Меΐ30]ΡΥΥ, [^1и4,А^β26]ΡΥΥ агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах аффинности даны в табл. 1.

Таблица 1

Агонист	Υ2	Υ4	Υ1
	1С50 пт	ЗЕМ	η	1С50 пт	ЗЕМ	η	1С50 пт	ЗЕМ	п
ΝΡΥ	0.30	0.07	4	26	5.	4	2.3	0.3	4
ΡΥΥ	0.22	0.02	2	30	8.0	2	16	1	2
ΡΥΥ(3-36)	0.20	0.03	10	343	42	4	>1000		2
РР	>1000		4	0.41	0.05	11	>1000		1

[<31п34]-РР	9.0	1.8	3	1.2	0.1	4	>1000		2
Пе31,С1п34]-РР	54	22	3	1.1	0.1	3	>1000		2
[Уа131,С1п34]-РР	69	20	3	0.93	0.16	3	>1000		2
[Агд26,Ме130]РУУ	0.13		1	2.3		1	65		1
[С1и4,Агд26]РУУ				3.3		1	367		1

Анализ активности к человеческому Υ2 рецептору.

Активность тестируемых соединений к человеческому Υ2 рецептору измеряют (определяют) в экспериментах доза-эффект в клетках СОУ-7, транзиторно трансфецированных человеческим Υ2 рецептором, а также смешанным О белком, Оф5, который гарантирует, что Υ2 рецептор связывается через Оц путь, ведущий к повышению метаболизма инозитолфосфатов.

Метаболизм фосфатидилинозитола. Через день после трансфекции клетки СОУ-7 инкубируют в течение 24 ч, используя 5 мкКи ^^миоинозитола (АтегзЬат, РТ6-271) в 1 мл среды, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 0,01 мг/мл гентамицина на лунку. Клетки дважды отмывают в буфере, 20 мМ ΗΕΡΕ8, ρΗ 7,4, дополненном 140 мМ КаС1, 5 мМ КС1, 1 мМ М§8О₄, 1 мМ СаС1₂, 10 мМ глюкозы, 0,05% (вес./об.) бычьей сыворотки; и инкубируют в 0,5 мл буфера, дополненного 10 мМ ЫС1 при 37°С в течение 30 мин. После стимуляции при различных концентрациях пептида в течение 45 мин при 37°С клетки экстрагируют 10% ледяной перхлорной кислотой с последующей инкубацией на льду в течение 30 мин. Полученные супернатанты нейтрализуют Κ(Η в буфере ΗΕΡΕ8 и полученный ОЩинозитолфосфат очищают на анионообменной смоле Вю-Кад АО1-Х8 и считают бетасчётчиком. Определения делают в двойном повторе. Величины ЕС₅₀ рассчитывают, используя программу для работы со стандартными фармакологическими данными. Рпзт 3.0 (дгарЬРад 8о£маге, 8ап П1едо, И8А).

- 29 011861

Анализ активности к человеческому Υ4 рецептору.

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ4 клетки СОВ-7.

Анализ активности к человеческому Υ1 рецептору.

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ1 клетки СОВ-7.

Результаты тестирования Ν₽Υ, РУУ, РУУ3-36, РР и [С1п45]РР, [Пе31,О1п34]РР, [Уа131,О1п34]РР (ВЕр ЕЙ Νο: 6), [А1а1,О1и4,А^д26,Μеί30]РУУ, [Ьеи30,С1п34]РР (ВЕр ΙΌ Νο: 7) и [Н1к26,С1п34]РР (ВЕР ЕЙ Νο: 10) агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах активности даны в табл. 2.

Таблица 2

Агонист	Υ2	Υ4	Υ1
	ЕС50 пт	ЗЕМ	N	ЕС50 пт	ЗЕМ	п	ЕС50 пт	ЗЕМ	п
ΝΡΥ	1.5	0.5	11	167	56	7	1.7	0.4	11
ΡΥΥ	0.23	0.06	8	34	5	6	0.6	0.1	5
ΡΥΥ(3-36)	0.36	0.07	16	>1000		8	74	5	7
РР			8	0.64	0.07	17	83	13	5

[С1п34]-РР	3.5	0.7	5	1.2	0.1	5	388	95	3
Не31,О1п34]-РР	6.5	2.0	2	0.91	0.04	3	48	9	3
[Уа131,С1п34]-РР	9.9	3.2	2	1.0	0.04	2	99	14	3
[1 еи30,С1п34]РР	8.6	0.7	3	4.5	0.4	3	102	7	4
[Ηίε26,ΟΙπ341ΡΡ	6.1	1.1	3	9.2	0.3	3	130	23	4
[А1а1,(31и4,Агй26,Ме(30]РУУ	1.0	0.2	3	1.4	0.2	3	87	16	3

ΙΙ. !п νίίΓο анализы для определения устойчивости белков.

Важным показателем для многих пептидов по изобретению является устойчивость белков, в особенности устойчивость, например, к расщеплению ферментами, так как эти пептиды создаются так, чтобы иметь повышенную устойчивость по сравнению, например, с РУУ3-36, или даже повышенную устойчивость по сравнению с полноразмерными РУУ и РР.

Устойчивость РР-складки определяют как устойчивость пептидов к расщеплению эндопептидазами, которые расщепляют, например, в области петли, которая является относительно гибкой (как описано в О'Наге, М. & Вс1тагШ, Т.^. 1990. !п Педгаба1юп οί Вюас!гсе ВиЬк!апсек: РЬукюЬду апб Ра^рЬу^ο1ομν. б. Неплккеп, еб. СКС Ргекк, Βοса ΙΚηΙοιι, Е1). В качестве модельного фермента используют эндопротеиназу Акр-Ν (Р1егсе). Этот фермент расщепляет на Ν-концевой стороне остатков Акр, например между остатками 9 и 10 (Акр) РР. Пептиды инкубируют с эффективной дозой эндопептидазы Акр-Ν, как указано производителем в 0,01 М Тпк/НС1 буфере, рН 7,5 при комнатной температуре и образцы извлекают через 24 ч. Образцы анализируют методом ВЭЖХ и затем проводят последовательную деградацию (отщепление) во времени. Пептиды сравнивают по стабильности с РУУ, РУУ3-36 и РР.

Устойчивость к аминопептидазам определяют, как описано выше для эндопептидаз, но вместо них используют аминопептидазу Ν и дипептидилпептидазу Ιν. Некоторые из пептидов специально предназначены для того, чтобы быть устойчивыми к этим аминопептидазам, например РУУ2-36, ацилированные по Ν-концу, пептидные производные и пептидные дериваты, алкилированные фрагментом, связывающим альбумин, на Ν-конце. Пептиды сравнивают по стабильности (устойчивости) с РУУ, РУУ3-36 и РР.

ΙΙΙ. !п νίίτο анализы для определения связывания с гликозаминогликанами (САСВ).

Способность тестируемых соединений связываться с ОАОВ проверяют ш νίίτο анализом с применением иммобилизованного гепарина, т.е. гепарин-агарозы, в качестве аффинной матрицы. Применяют либо колонку Н1Тгар с гепарин-сефарозой (АтегкЬат РЬагтаОа Вю1есЬ, иррка1а, В^ебеп), либо колонки с гепарином для ВЭЖХ, элюируют в 50-мин. линейном градиенте 0-0,5 М \аС1 в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,3), содержащем 2 мМ ОТТ и 1 мМ МдЕОТА при скорости потока 1 мл/мин. Для регенерации колонку промывают 1 М \аС1 в буфере А в течение 51-55 мин.

Ιν. !п νίνο исследование действия пептидов на аппетит, потребление пищи и массу тела.

Действие селективных к Υ2/Υ4, по сравнению с Υ1, агонистов, на быстрое потребление пищи у мышей.

Берут мышей линии ббу весом 34-37 г в возрасте 8-9 недель (баран ВЕС, ВЬ^ζииοка, барап). Мышей индивидуально помещают в регулируемую среду (22°С, влажность 55%) с 12-часовым световым циклом день-ночь с включением света в 7 часов утра. Пищу и воду дают неограниченно, за исключением времени непосредственно перед экспериментами (см. ниже). Мыши привыкают к подкожным инъекциям в течение недели перед началом экспериментов. Мышей в экспериментах используют по одному разу. Непосредственно перед применением пептиды разводят в физиологическом солевом растворе и вводят в виде подкожной инъекции в объёме 100 мкл. Результаты представлены как среднее +/-ВЕ. Для оценки разницы между группами применяют дисперсионный анализ, а затем тест Бонферрони.

Мышей отлучают от пищи, но оставляют свободный доступ к воде за 16 ч до данного теста и эксперименты начинают в 10 часов утра на следующий день. Используют стандартную диету (СЕЕА барап,

- 30 011861

1пс., Токуо, ,1арап) и потребление пищи измеряют, вычитая вес несъеденной пищи из начальной предварительно взвешенной пищи после введения и проверки потерь пищи. Восемь животных в каждой группе получают физиологический раствор, 3 мкг ΡΥΥ3-36, 30 мкг ΡΥΥ3-36, 10 мкг тестируемого соединения или 100 мкг тестируемого соединения.

Результаты для [С1п34]РР (названного на фигуре ТМ30333) в качестве испытуемого соединения даны на фиг. 2.

Последовательности

ΝΡΥ (8ЕО Π) Νο: 1)

НгХ-Туг—Рго-8ег-Ьу5-Рго-А5р-А8п-Рго-Ст1у-Сг1и-А5р-А1а-Рго-А1а-Сг1и-А8р-Ме1-А1аАг§-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Аг§-Н18-Туг-11е-А5п-Ьеи-11е-Т11г-Аг§-С1п-Аг§-Туг-СОНН2

ΡΥΥ (8Е0 Ιϋ Νο: 2) Н2ХТуг-Рго-11е-Ьу8-Рго-Сг1и-А1а-Рго-С1у-Сг1и-А8р-А1а-8ег-Рго-С1и-(31и-Ееи-А8п-Аг§Туг-Тут-А1а-8ег-Ьеи-Аг§-Н18-Туг-Ьеи-А811-Ьеи-Уа1-Т11г-Аг§-С1п-Аг§-Туг-СО1кН2

РР (8Е<2 ГО ΝΟ: 3)

Н₂Х-А1а-Рго-Беи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-А5п-А1а-ТЬг-Рго-С1и-Ст1п-Ме1-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-Азр-Беи-Аг§-Аг§-Туг-11е-Азп-Ме1-Беи-Т11г-Аг§-Рго-Аг§-Туг-СОХН2 [С1п34| РР (8Εζ) ГО Νο: 4)

Н₂К-А1а-Рго-Беи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-А8п-А1а-Т11г-Рго-О1и-С1п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-Азр-Ьеи-Ах§-Аг§-Туг-11е-Азп-Ме1-Ьеи-Т11г-Аг§-С1п-Аг§-Туг-С(ЖН2 [11е31,С1п34]РР (8Е(^ ГО Νο: 5) Н₂Н-А1а-Рго-Беи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-А8п-А1а-Т11г-Рго-01и-(31п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-Авр-Беи-Аг§-Аг§-Туг-11е-Азп-Ме1-11е-Т11г-Аг§-О1п-Аг§-Туг-СС)КН2 [Уа131,С1п34]РР (8ЕО ГО Νο: 6)

Н₂Х-А1а-Рго-Беи-О1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А5р-Азп-А1а-Т11Г-Рго-С1и-Сг1п-Ме1-А1аС111-Туг-А1а-А1а-Азр-Беи-Аг§-Ат§-Туг-11е-А8п-Ме1-Уа1-Т11г-Аг§-Сг1п-Аг§-Туг-СС)КН₂ [Беи30,С1п34]РР (8Е(^ ГО Νο: 7)

Н₂Х-А1а-Рго-Беи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-Азп-А1а-Т11г-Рго-Ст1и-Сг1п-Ме1-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Беи-Аг§-Аг§-Туг-11е-Азп-Беи-Ееи-Т11г-Аг§-О1п-Аг§-Туг-С(ЖН2 [Ме30,С1п34]РР (8Е(? ГО Νο: 8)

Н₂Х-А1а-Рго-Беи-01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-Азр-Азп-А1а-Т1т1Г-Рго-01и-01п-Ме1-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-Азр-Беи-Аг§-Аг§-Туг-11е-Азп-№е-Беи-Т1к-Ат§-О1п-Аг§-Туг-СС)ЫН₂ [Беи28,С1п34]РР (8Εζ) ГО Νο: 9) Н2М-А1а-Рго-Беи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-А8п-А1а-Т11г-Рго-О1и-С1п-Ме1-А1аСг1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Беи-Аг§-Аг§-Туг-Беи-А8п-Ме1-Беи-Т11г-Аг§-Сг1п-Аг§-Туг-СО]МН2 [Н1826,С1п34]РР (δΕζ) ГО Νο: 10)

Н₂Х-А1а-Рго-Беи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-О1у-Азр-Азп-А1а-Т11г-Рго-О1и-О1п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Беи-Аг§-Н18-Туг-Пе-А8п-Ме1-Беи-Т11г-Аг§-О1п-Аг§-Туг-С(ЖБ[2 [11еЗ,С1п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 11 )

Н₂№А1а-Рго-11е-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-А8п-А1а-ТЬг-Рго-Сг1и-Сг1п-Ме1-А1а-С1пТуг-А1а-А1а-А8р-Беи-Агё-Аг§-Туг-11е-А8п-Ме1-Беи-ТЬг-Аг§-С1п-Аг§-Туг-СО1МН2 [А1а1,С1и4,Аг§26,(Ме130 или Ν1β30)]ΡΥΥ (8Εζ) ГО Νο: 12) Н₂М-А1а-Рго-11е-С1и-Рго-О1и-А1а-Рго-О1у-Сг1и-А8р-А1а-8ег-Рго-(л1и-Сг1и-Беи-А5п-Аг§Туг-Туг-А1а-8ег-Беи-Аг§-Аг§-Туг-Беи-А8п-(Ме1 ог М1е)-Уа1-Т11г-Аг§-С1п-Аг§-Тугсоян₂

- 31 011861 [А1а1,С1и4,Аг§26,(Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Ер ГО Νο: 13)

Н₂К-А1а-Рго-8ег-01и-Рго-Азр-Азп-Рго-Сг1у-01и-Азр-А1а-Рго-А1а-Сг1и-А8р-Ме1-А1аАгд-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Аг§-Аг§-Туг-11е-А8п-(Ме1 ог Ы1е)-11е-Тйг-Аг§-С]п-Аг§-Туг· ссжн₂ [А1а1,С1и4]РУУ (8Е0 ГО Νο: 14)

Н₂К-А1а-Рго-11е-С1и-Рго-01и-А1а-Рго-Сг1у-Сг1и-А8р-А1а-8ег-Рго-01и-Сг1и-Ьеи-А8п-Аг§Туг-Туг-А1а-8ег-Ьеи-Аг£-Н18-Туг-Ьеи-А8п-Ьеи-Уа1-Т11г-Агд-О1п-Агд-Туг-СОКН2 [Α131,Ο1ιι4]ΝΡΥ (8Е0 ГО Νο: 15)

Н₂К-А1а-Рго-8ег-01и-Рго-Азр-Азп-Рго-61у-01и-Азр-А1а-Рго-А1а-(л1и-А8р-Ме1-А]аАг§-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Аг£-Н18-Туг-11е-Азп-Ьеи-11е-Т11Г-Аг£-О1п-Агд-Туг-СОКН₂ [Аг§26, (Ме130 ог Ν I еЗ О)] ΡΥΥ (8Е9 ίί) Νο: 16)

Н2Н-Туг-Рго-11е-Ьуз-Рго-О1и-А1а-Рго-О1у-О1и-А8р-А1а-8ег-Рго-О1и-О1и-Ьеи-А8п-Аг§Туг-Туг-А1а-8ег-Ьеи-Аг§-Аг§-Туг-Ьеи-Азп-(Ме1 ог Ме)-Уа1-Ткг-Аг§-С1п-Аг§-ТугСС)КН₂ [Аг§26, (Ме130 ог Ν1ε30)]ΝΡΥ (8ЕО ГО Νο: 17)

НгИ-Туг—Рго-8ег-Ьу8-Рго-А8р-А8п-Рго-Сг1у-Сг1и-А8р-А1а-Рго-А1а-Сг1и-А8р-Ме1:-А1аАг§-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Аг£-Агд-Туг-11е-А8п-(Ме1 ог М1е)-Пе-Тйг-Аг§-Сг1п-Аг§-Туг6ΌΝΗ₂ [С1и4, (Ме130 ог Ν1ε30)]ΡΥΥ (δίρ ГО Νο: 18) Н₂К-Туг-Рго-11е-О1и-Рго-(31и-А1а-Рго-О1у-О1и-А8р-А1а-8ег-Рго-Сг1и-Сг1и-Ьеи-А8П-Аг§Туг-Туг-А1а-8ег-Ьеи-Аг£-Н18-Туг-Ьеи-Азп-(Ме1 ог Ν1ε)-ν а1-Тйг-Аг§-Сг1п-Аг§-ТугС’(ЖН₂ [Сг1и4, (Ме130 ог Ν1ε30)]ΝΡΥ (8ЕО ГО Νο: 19)

Н2М-Туг-Рго-5ег-Ст1и-Рго-Азр-А8п-Рго-С1у-Сг1и-А8р-А1а-Рго-А1а-О1и-А8р-Ме1-А1аАг£-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Аг§-Н1з-Туг-11е-А8п-(Ме1 ог Я1е)-11е-Т11г-Аг§-Сг1п-Аг§-ТугСОМН₂ [61ιι4,Αγ§26]ΡΥΥ (8Е(? ГО Νο: 20)

Н₂А^т-Туг-Рго-Пе-Ст]и-Рго-Сг1и-А1а-Рго-С1у-С1и-Азр-А1а-8ег-Рго-Сг1и-С}1и-Ьеи-А8п-Аг£Туг-Туг-А1а-8ег-Ьеи-Аг§-Аг§-Туг-Ьеи-А8п-Ьеи-Уа1-ТЬг-Агд-О1п-Аг§-Туг-СОКН2 [Ο1π4,Αγ§26]ΝΡΥ (8Е(? ГО Νο: 21)

Н₂К-Туг-Рго-8ег-01и-Рго-А8р-А8П-Рго-С1у-01и-А8р-А1а-Рго-А1а-С1и-А8р-Ме1-А1аАг£-Туг-Туг-5ег-А1а-Ьеи-Аг£-Аг£-Туг-11е-А8п-Ееи-11е-Т11г-Аг§-Сг1п-Аг§-Туг-ССЖН2 [Суз2,В-Су827,С1п34]РР (8 Ер ГО Νο: 22)

Н₂К-А1а- Суз -Ьеи -СТй^го-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-Азп-А1а-Т11г-Рго-О1и-О1п-Ме1:-А1аСт1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ьеи-Хт§А\.Г£-(О-Су8)—Пе-Азп-МекЬеи-Тйг-Агд-СИп-Агд-ТугССЖН₂ [Су82,Аос5-24,О-Су»27,С1п34]РР (8Е<3 Π) Νο: 23)

8---------------------------- 8

- 32 011861

Н2К-А1а-Су5-Ьеи-О1и-Аос5-24-Аг£-Аг£-(О-Су8)-11е-А5п-МеТЬеи-Тйг-Аг£-Сг1п-А1дΤγΓ-ΟΟΝΗ₂ [Ьу818,С1п34]РР (8Е() ГО Νο: 24)

Н2М-А1а-Рго-Ьеи-Ст1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-А8п-А1а-Т11г-Рго-Сг1и-С1п-Ме1-Ьу8С1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ьеи-Аг§-Аг§-Туг41е-А8П-Ме1-Ьеи-Тйг-Агд-Сг1п-Агд-Туг-СОНН2 [А1а1 ,(Ии4,Ьу811 ,Аг§26,(Ме130 ог Ν1β30)]ΡΥΥ (8Εζ) ГО Νο: 25)

Н₂Н-А1а-Рго41е-О1и-Рго-61и-А1а-Рго-О1у-О1и-Ьу8-А1а-8ег-Рго-С1и-Сг1и-Ееи-А5п-Аг§Т уг-Туг-А1а-8ег-Ьеи-Агд-Агд-Туг-Ьеи-Азп-(Ме1 ог Νΐε)-V а1-ТЬг- Агд-СНп- Агд-Т угССЖ'Н₂

А1а-Аг§-Аг§-Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а-А1а-Аг§-Аг§-Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а-А1а-Аг§-Аг§Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а-[С1п34]РР (8Εζ) ГО Νο:26)

Н2М-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Аг§·

Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а-А1а-Рго-Ьеи-Сг1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-(д1у-А8р-А8п-А1а-Т11г-Рго-О1иО1п-Ме!-А1а-О1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ьеи-Аг@-Агд-Туг-11е-А8п-Ме!-Ееи-Тйг-Аг§-(л1п-АгдТуг-СОЫН₂ [А1а1 ,С1и45Ьу818, Аг§26, (Ме130 ог Ν1ε30)]ΡΥΥ (81'9 ГО Νο: 27)

Н2^А1а-Рго-11е-01и-Рго-С1и-А1а-Рго-01у-01и-А8р-А1а-8ег-Рго-Сг1и-Ст1и-Ьеи-Еу8-АгдТуг-Туг-А1а-8ег-Ееи-Агд-Агд-Туг-Ьеи-Азп-(Ме! ог М1е)-Уа1-Т11г-Агд-Сг1п-Агд-ТугСОЫН₂ [Еу828,О1и32]РР25-36 (8Е0 ГО Νο: 28)

ЕЕМ-Агд-Туг-Еуз-Азп-МейЕеи-СИи-Агд-Рго-Агд-Туг-ССЖНг

Еу8-Еу8-Ьу8-Ьу8-Еу8-Еу8-[О1п34РР} (81р ГО Νο: 29).

Η2Ν- Еу8-Еу8-Ьу5-Ьу8-Еу5-Ьу8-А1а-Рго-Ееи-О1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-О1у-А8р-А5п-А1аТйг-Рго-СЖ1-СЛп-Ме1-А1а-61п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аге-Аг2-Туг41е-Лзп-Ме!--Ееи-Е1!ГАгд-Сг1п-Агд-Туг-С0НН₂ [Су82,Ьу 8 1-Сув27,С1п34]РР (8Е0 ГО Νο: 30).

Н2Ж-А1а-Су8-ЕеиАо1ц-р_Го-Уа1-Туг-Рго-О1у-А8р-А8п-А1а-Еу8-Рго-О1и-О1п-Ме!-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-А8р-ЕегьДгд-Агд-В-Суз-11е-А8П-Ме1-Ееи-ТЬг-Агд-О1п-Аг§-ТугСОЫН₂ I [Су82^-(8-(8-гамма-глутамоиламино-октамоиламино)-октаноил)-Ьу813,О Суз27,С1п34]РР (8Е() ГО Νο: 31).

Н₂ЯСН(СООН)СН₂СН₂СОНН(СН2)7СОА’Н(СН₂)7СОЖ

Н2К-А1а-Су8-ГВи4д1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-А8р-Азп-А1а-Еу8-Рго-Сг1и-Сг1п-Ме1-А1а·

О1п-Туг-А1а-А1а-Азр4С^ьДгд-Агд-О-Су5-11е-Азп-Ме1-Ееи-Т11г-Агд-Сг1п-Агд-Тугссжн₂ I

- 33 011861 [Су82^-{(А1а-Агд-Агд-Аг§-А1а-А1а-Агд-А1а)з}-Ьу813,В-Су827,С1п34]РР (8Е<2 Ю Νο: 32).

А1а-Аг§-Аг§-Аг§-А1а-А1а-Агд-А1а)зСОНН

Н2Н-А1а-(^у8-Ье1>01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-А8р-А8П-А1а-Ьу5-Рго-С1и-(л1п-Ме1-А1а61п-Туг-А1а-А1а-АзрЙ7ещАгд-Агд-П-Су5-11е-Азп-Ме!-Ьеи-Т1и-Агд-О1п-Агд-Тугсоун₂ ¹ [Су«2, К-{№-(21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}гамма-глутамоил1-Ьу813,В-Су827,С1п34]РР (8Εζ) Π) Νο: 33).

Н₂Н(СН₂СН₂О)₆СН₂СН₂СОМН

Н₂№А1а-С^у8-ЕегГАЩиЩго-Уа1-Туг-Рго-О1у-А8р-А8п-А1а-Е^8-Рго-О1и-С1п-Ме1:-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-А8р-1?еп-Агд-Агд-О-.Су5-11е-А8п-Ме!-Ееи-Т11г-Агд-Ст1п-Агд-Тугсоун₂ I

Р*1-(№-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-Еу813,СЛп34]РР (8Εζ) ГО Νο: 34)

СН₃(СН₂)]4СОННСН(СООН)СН₂СН₂СОМН

Н₂Н-А1а-Су8-Ееи-01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-А8п-А1а-Ьуз-Рго-Сг1и-С1п-Ме!-Л1аСг1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Агд-Агд-О-Су8-11е-А8п-Ме1-Ееи-ТЬг-Агд-С1п-Аг§-Тугссжн₂ [п-(та-/\г§-₂лг«-2\г§-/\1а-/\1а-2\г§-та)л-1эу81л,^гшл^]гг гмк лэ)

А1а-Аг§-Аг§-Аг§-А1а-А1а-Агд-А1а)₃СОНН

Н₂М-А1а-Су8-Ьеи-Ст1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-Сг1у-А8р-А8п-А1а-Е^8-Рго-С1и-О1п-Ме1-А1а61п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ьеи~Аг£-Аг£-П-Су8-11е-А8П-Ме(-Ьеи-1Ъг-Агд-Сг1п-Аг£-ТугСС)МН₂ [Ν-ΡΕ05000-Ε₅ 813,01η34]ΡΡ (8Е0 ГО Νο: 36)

ΝΗ-ΡΕ05000 ι

Н₂№А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-А8п-А1а-Ьу8-Рго-Сг1и-Сг1п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Агд-Аг§-Туг-11е-А8п-Ме!-Ееи-ТЬг-Аг§-Ст1п-Агд-Туг-СОНН2 [А1а1,С1и4ф(-(№-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-Еу813,Аг§26,Ме30]РУ¥ (8Е(^ II) Νο: 37)

СН₃(СН₂)1₄СОМНСН(СООН)СН₂СН₂СОКН

Н₂Н-А1а-Рго-11е-С1и-Рго-С-1и-А1а-Рго-01у-С1и-А8р-А1а-ь1у8-Рго-01и-(3-1и-Ееи-А8п-Аг§Туг-Туг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Агд-Туг-Ееи-А8п-Ме-Уа1-ТЬг-Агд-О1п-Агд-Туг-СОНН₂ [А1а1,С;1и4^-(А1а-Аг§-Агд-Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а)з-Еу813,Аг§26,Ме30]Р¥У (8Е(2

Ю Νο: 38)

А1а-Аг§-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а)₃СОМН

Н₂Н-А1а-Рго-11е-О1и-Рго-61и-А1а-Рго-Сг1у-Сг1и-А8р-А1а-Е^8-Рго-Сг1и-О1и-Ееи-А8п-Лг2;Туг-Туг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-Ееи-А8п-№е-Уа1-Т11г-Аг§-Сг1п-Агд-Туг-С(ЖН₂ [А1а1,С1и4^-РЕС5000-Еу813,Аг§26,Ме30]РУУ (8Е0 ГО Νο: 39)

ΝΉ-ΡΕΘ5000

Н₂Ы-А1а-Рго-Пе-Сг1и-Рго-О1и-А1а-Рго-С1у-Сг1и-А8р-А1а-Е^8-Рго-С1и-(л1и-Ееи-А8п-Аг§Туг-Туг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Аг£-Туг-Ьеи-А8п-Ме-Уа1-Ткг-Агд-С1п-Агд-Туг-СОКН2 ^-РЕС5000-Ьу813,С1п34]РР (8Е0 Π) Νο: 40)

ΝΗ-ΡΕΘ5000

Н₂М-А1а-Су8-Ьеи-Сг1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-61у-А8р-А8П-А1а-Еу8-Рго-01и-Сг1п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг§-Агд-В-Су8-11е-А8П-Ме1-Ееи-ТЬг-Агд-Сг1п-Агд-Тугοονή₂

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение Υ-рецепторного агониста, селективного в отношении Υ2 и Υ4 рецепторов по сравнению с Υ1 рецептором, для получения композиции для лечения состояний, восприимчивых к активации Υ2 и/или Υ4 рецепторов, причём:

(а) указанный агонист является РР-складчатым пептидом или РР-складчатым пептидом-миметиком, который содержит:

(ί) С-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как Х-Т11г-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О^К.^|К.^:. где В¹ и В², независимо, обозначают водород или С1-С₆ алкил, X обозначает Уа1, 11е, Ьеи или А1а, а X³ обозначает О1п или Аки, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТНг замещён на Н18 или Акп, и/или Туг замещён на Тгр или РНе, и/или Агд замещён на Ьук, и (ίί) Ν-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как Н^-Х'-Рго-ХДСШ или Акр)-, где X¹ отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X² обозначает Ьеи или 8ег или консервативные замены Ьеи или 8ег, или (б) указанный агонист содержит:

С-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания по определению, данному в (ί), указанную последовательность Υ-рецепторного распознавания, связанную с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанной гексапептидной последовательности, причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации за счёт ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно,

Ν-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания по определению, данному в (ίί).
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания агониста каждый из В¹ и В² обозначает водород.
3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания агониста остаток X обозначает Уа1 или 11е.
4. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как -X^А-X-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NВ¹В², где остаток Х^А является некислым и неосновным, а последовательность -X-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NВ¹В² имеет значение по определению в любом из пп.1-3.
5. Применение по п.4, отличающееся тем, что в С-концевой последовательности Υ-рецепторного распознавания агониста указанный некислый и неосновной аминокислотный остаток представляет собой Ьеи, Ме!, 11е, Уа1 или А1а.
6. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевой ундекапептид, представленный как -X^с-Ту^-X^в-Аκи-Х^А-X-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NВ¹В², где последовательность имеет значение по определению в п.4 или 5, X'' обозначает Агд или Ьук, а X¹⁵ обозначает 11е, Ьеи или Уа1.
7. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность, представленную как -X -Туг^ -Аки^ -Λ^д-Ту^-С(=О)NВ В , где по- следовательность -Х^А-X-ТЬ^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NВ¹В² имеет значение по определению в п.4 или 5, X' обозначает Н1к, Акп или О1п, а X⁵ обозначает 11е, Ьеи или Уа1.
8. Применение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания X³ обозначает О1п.
9. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность -Агд-Туг-Ьен-Акп-Щеи или Меΐ)-Vа1-ТЬ^-А^д-С1и-А^д-Ту^-С(=0)NΗ₂.
10. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность -Н1к-Туг-(11е или ^еи)-Аки-Меΐ-^еи-ТЬ^-А^д-С1и-А^д-Ту^-С(=0)NΗ₂.
11. Применение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что в Ν-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания остаток X¹, в случае его присутствия, обозначает А1а или он отсутствует.
12. Применение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что в Ν-концевой аминокислотной последовательности Υ-рецепторного распознавания остаток X², в случае его присутствия, обозначает Ьеи, 11е или 8ег.
13. Применение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что Ν-концевая последовательность представляет собой Н₂^Л1а-Рго-Ьеи-С1и- или Н^-Рго-Ьеи-бЫ-.
14. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь) с Ν-концевой последовательностью Υ-рецепторного распознавания и имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания на Ν-концевом участке агониста, соответствующем домену полипролина РР-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.

- 35 011861
15. Применение по п.14, отличающееся тем, что в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой дисульфидную или лактамную связь.
16. Применение по п.15, отличающееся тем, что ковалентная внутримолекулярная связь в агонисте является дисульфидной связью, образующейся между остатком Б- или Ό-Сук в альфа-спирали и остатком Сук, расположенным в Ν-концевой части агониста, соответствующей домену полипролина ΡΡ-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
17. Применение по любому из пп.1-12, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь), и в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой лактамную связь, образованную между остатками Бук и О1и в указанном спиральном повороте или между остатком Бук или О1и в указанном спиральном повороте и остатком О1и или Бук в С-концевой последовательности Υ-рецепторного распознавания.
18. Применение по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что агонист содержит как С-концевую, так и Ν-концевую последовательность Υ-рецепторного распознавания, причём С-концевая последовательность по своему Ν-концу связана с аминокислотной последовательностью амфифильного домена, содержащего по меньшей мере один поворот альфа-спирали, прилегающий к Ν-концу указанного эпитопа, причём указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности связаны пептидными связями, соответственно, с карбоксильными и аминогруппами аминокислоты формулы ΝΗ₂^Η₂)^Ο₂Η, где η обозначает целое число от 2 до 12.
19. Применение по п.18, отличающееся тем, что η обозначает 6, 7, 8, 9 или 10.
20. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист выбирают из [011134] РР (8ЕР ГО Νο: 4) [Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Буз13,О1п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 34) [Ν- (А1а-Агд- Агд- Агд- А1а- А1а-Агд-А1а)₃- Буз18,О1п34]РР (8Ες ГО Νο: 35) [Ν- РЕ05000- Еуз13,О1п34]РР (8Е(^ ГО Νο: 36) [ПеЗ 1,О1пЗ4]РР (8Е(^ ГО Νο: 5) [Уа131,О1п34]РР (8Εζ) ГО Νο: 6) [Беи30,О1и34]РР (8Ες ГО Νο: 7) [Ν1β30,ΟΙη34]ΡΡ (8Ες ГО Νο: 8) [Беи28,О1п34]РР (8Е(} ГО Νο: 9) [Ηίδ26,Ο1η34]ΡΡ (8Ες ГО Νο: 10) [11еЗ,О1п34]РР (8Е0 ГО Νο: 11) [А1а1,О1и4,Атд26,(Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Ер ГО Νο: 12) ' [ΑΝ1,Ο1ιι4,Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Бу813,Агд26,Ме30]РУУ (8Ες ГО Νο: 37) [А1а1, Ο1ιι4,Ν- (А1а-Агд- Агд- Агд- А1а- А1а-Агд- А1а)₃- Еу813,Агд26,Ме30ртУ (8Εζ) ГО Νο: 38) [Α1α1,Ο1ιι4,Ν- РЕС5000- Εу813,Α^д26,N1е30]ΡΥΥ (8Ες ГО Νο: 39) [А1а1,О1и4,Агд26(Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е(^ ГО Νο: 13) [ΑΝ1,Ο1υ4]ΡΥΥ (8Ες ГО Νο: 14) и [Α1η1,Ο1ιι4]ΝΡΥ (8Ες ГО Νο: 15) [Агд26, (Ме130 или Ν1β30)]ΡΥΥ (8Е(^ ГО Νο: 16) и [Агд26, (Ме130 или Ν1β30)]ΝΡΥ (8Εζ) ГО Νο: 17) [О1и4, (Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Ες ГО Νο: 18) и [О1и4, (Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Ε0Π)Νο: 19) [Ο1ιι4,Ατ§26]ΡΥΥ (8Еф ГО N0:20) и [Ο1ιι4,Αγ_§26]ΝΡΥ (8Е0 Π)Νο: 21) [Суз2,Б- Су827,О1п34]РР (8Е0 Ю Νο: 22) [Суз2,Аос5- 24,Б- Су₅27,О1п34]РР (8Е0 1Б Νο: 23) [Су82,Еуз13,Б- Суз27,О1п34]РР (8Е(^ 1Б Νο: 30) [Суз2, Ν- (8- (8- гамма- глутамоиламиноэктаноиламино)октаноил)- Буз13, БСуз27,О1п34]РР (8Е0 1Б Νο: 31) [Суз2,А- {(А1а-Агд- Агд- Агд- А1а- А1а-Агд- А1а)₃}- Буз13,Б- Суз27,С1п34]РР (8Е01Б Νο:32) [Суз2, Ν-{Ν’- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма- глутамоилБуз13,Б- Суз27,О1п34]РР (8Е0 1Б Νο: 33) и их консервативно замещённых аналогов.

- 36 011861
21. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой [О1п34]РР (8ЕР ГО Νο: 4), или [А1а1,О1и4,Аг§26,(Ме130 или Ме30)]РУУ (8ЕР ГО Νο: 12), или их аналог с консервативной заменой.
22. Применение по любому из пп.1-21, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему \-концу с целью придать резистентность к аминопептидазной активности.
23. Применение по п.22, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему Ν-концу, причём углеродная цепь ацилирующей группы содержит 2-24 углеродных атома.
24. Применение по п.22, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему \-концу.
25. Применение по любому из пп.1-24, отличающееся тем, что агонист содержит мотив связывания с сывороточным альбумином, или мотив связывания с гликозаминогликаном (ОАО), или мотив, индуцирующий спираль, или является ПЭГилированным.
26. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания с сывороточным альбумином представляет собой липофильную группу.
27. Применение по п.26, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа содержит необязательно замещённую, насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвлённую углеводородную группу, включающую 10-24 углеродных атома.
28. Применение по п.25 или 26, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа представляет собой боковую цепь или часть боковой цепи каркаса агониста.
29. Применение по п.28, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, связана с остатком в каркасе молекулы простой эфирной, тиоэфирной, амино, сложноэфирной или амидной связью.
30. Применение по п.29, отличающееся тем, что в агонисте боковую цепь, содержащую липофильную группу, выбирают из группы, состоящей из

СН₃(СН₂)пСН(СООНЖН- СО(СН₂)₂СОТ4Н-, где п обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂),СО- ΝΗΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)₂ΟΟΝΗ-, где г обозначает целое число от 9 до 15,

ΟΗ₃(ΟΗ₂)₅00-ΝΉΟΗ((ΟΗ₂)₂ΟΟΟΗ)ΟΟΝΗ-, где 8 обозначает целое число от 9 до 15,

СНз(СН₂)_П1СОЖ-, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-ЖСОСН((СН₂)₂СООН)Ж- СО(СН₂)рСНз, где р обозначает целое число от 10 до 16,

-ΝΗΟΟ(ΟΗ₂)₂ΟΗ(ΟΟΟΗ)ΝΗ- СО(СН₂)_чСНз, где с] обозначает целое число от 10 до 16,

СНз(СН₂)пСН(СООН)КНСО-, где п обозначает целое число от 9 до 15,

ΟΗ₃(ΟΗ₂)_ΡΝΗΟΟ-, где р обозначает целое число от 10 до 18,

-ΟΟΝΗΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)₄ΝΉ- СО(СН₂)_тСН₃, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-СОЖСН(СООН)(СН₂)₄Ж- СОСН((СН₂)₂СООН)КН- СО(СН₂)_рСН₃, где р обозначает целое число от 10 до 16,

-ΟΟΝΗΟΗ(ϋΟΟΗ)((7Η₂)₄ΝΗ- 00(ϋΗ2)₂€Η(ε00Η)ΝΗ-00(0Η₂)_ςϋΗ3, где с] обозначает целое число от 10 до 16, и частично или полностью гидрированнового циклопентанофенантренового скелета.
31. Применение по п.28, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой С₁₂, С₁₄, С₁₆ или С₁₈ ацильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи каркасного остатка агониста.
32. Применение по п.28, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой тетрадеканоильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи каркасного остатка агониста.
33. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой ЬузП-тетрадеканоил [Ьу811,О1п34]РР, [№(Жгексадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьу813,О1п34]РР (8ЕР ГО Νο: 34), |ΛΙα1,ΟΙιι4,Ν(Жгексадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьу813,Агд26Ме30]РУУ (8ЕР ГО Νο: 37) или [Су82,№(8-(8-гаммаглутамоиламинооктаноиламино)октаноил)-Ьу813,П-Су827,О1п34]РР (8ЕР ГО Νο: 31) или его консервативно замещённый аналог.
34. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте ОАО-связывающий мотив представляет собой аминокислотную последовательность, которая является боковой цепью или частью боковой цепи

- 37 011861 каркаса агониста.
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а Х обозначает любой аминокислотный остаток.
36. Применение по п.34 или 35, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив является конкатамерным или дендримерным.
37. Применение по любому из пп.34-36, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного мотива САС-связывания и эпсилонаминогруппой остатка Ьук 18 в [Ьук18,С1п34]РР (8Е0 ΙΌ Νο: 24) или Ьук11 в агонисте [А1а1,С1и4,Ьук11,Агд26,(Ме!30 или Ν^^ΥΥ (8ЕС) ΙΌ Νθ: 25).
38. Применение по пп.34-36, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного мотива САС-связывания и эпсилон-аминогруппой остатка Ьук 18 в [Ьук18,С1п34]РР (8Е0 ΙΌ Νο: 24) или Ьук11 в агонисте [А1а1,С1и4,Ьук11,Агд26,(Ме!30 или Ν^^ΥΥ (8ЕС) ΙΌ Νο: 25).
39. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив ковалентно связан с С- или Ν-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал.
40. Применение по п.39, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с Ν-концом агониста.
41. Применение по п.39 или 40, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а Х обозначает любой аминокислотный остаток.
42. Применение по п.39 или 40, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность [ХВВВХХВХ]_п, где п обозначает число от 1 до 5, В обозначает основной аминокислотный остаток, а Х обозначает любой аминокислотный остаток.
43. Применение по п.39, отличающееся тем, что пептид представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1аА1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-[С1п34]РР (8ЕО ΙΌ Νο: 26), [А1а1,С1и4,N-(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)з-^ук13,А^д26,N1е30]ΡУУ (8 ЕС) ΙΌ Νο: 38) или [Сук2,N-{(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)з}-^ук13,^-Сук27,С1п34]ΡΡ (8ЕС) ΙΌ Νο: 32).
44. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте ПЭГ (РЕС) обозначает полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид с молекулярной массой не более 20 кДа.
45. Применение по п.25, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Ьук11,С1п34]РР, ПЭГилированный по остатку Ьук11, или [А1а1,С1и4,Ьук18,Агд26,(Ме!30 или N1е30)]ΡУУ, ПЭГилированный по остатку Ьук18, или [А1а1,С1и4,N-ΡЕС5000-^ук13,А^д26,N1е30]ΡΥΥ (8ЕС) ΙΌ Νο: 39), или ^82,Ν-{Ν'(21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}-гамма-глутамоил-Ьук13,П-Сук27,С1п34]РР (8ЕО ΙΌ Νο: 33).
46. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с С- или Ν-концом агониста.
47. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с Ν-концом агониста.
48. Применение по п.46 или 47, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4-20 аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, ТЬг, Туг, Акп, С1п, Акр, С1и, Ьук, Агд, Н1к, Ме!, Огп, и аминокислотных остатков формулы -НН-С(К¹)(К²)-СО-, где К¹ обозначает необязательно замещённый С1-С6алкил, фенил или фенилметил или К¹ и К² вместе с атомом С, с которым они связаны, образуют циклопентильное, циклогексильное или циклогептильное кольцо.
49. Применение по п.46 или 47, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4, 5 или 6 остатков Ьук.
50. Применение по п.46 или 47, отличающееся тем, что агонист представляет собой Ьук-Ьук-ЬукЬук-Ьук-Ьук-Ьук-[С1п34]-РР.
51. Применение по любому из пп.26-35, 42 или 43, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания сывороточного альбумина, или САС-связывающий мотив, или ПЭГ радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного углерода, соответствующего любому из нижеприведённых положений ΡУУ или РР: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32 или соответствующего любому из нижеприведённых положений №Υ: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.
52. Применение по п.51, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (с), а мотив связывания сывороточного альбумина, или САС-связывающий мотив, или ПЭГ радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного углеродного атома, соответствующего любому из приведённых ниже положений ΡΥΥ, №Υ или РР: 2, 5, 8, 9, 13, 14, 20 и 24.
53. Применение по п.51, отличающееся тем, что агонист имеет значение по определению в п.12, а мотив связывания сывороточного альбумина, или САС-связывающий мотив, или ПЭГ радикал является

- 38 011861 боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного линкерного радикала -(СН₂)_П-.
54. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 и Υ4 рецепторам по сравнению с Υ1 рецептором, выбранный из [Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьуз13,О1п34]РР (8Е<2 ГО Νο: 34) [Ν- (А1а-Аг§- Аг£- Аг_ё- А1а- А1а-Аг§-А1а)₃- Ьу518,О1п34]РР (8Е<2 ГО Νο: 35) [Ν- РЕС5000- Ьу813,О1п34]РР (8Ες ГО Νο: 36) [Уа131,О1п34]РР (8Е<2 ГО Νο: 6) [Ьеи30,О1п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 7) [Ν1ε30,Ο1η34]ΡΡ (8Е(} ГО Νο: 8) [Ьеи28,О1п34]РР (8ЕО ГО Νο: 9) [Ηίδ26,σΐη34]ΡΡ (8Е<2 ГО Νο: 10) [11еЗ,С1п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 11) [А1а1,61и4,Аг§26,(Ме130 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е0 ГО Νο: 12) [А1а1,61и4Д4- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьуб13,Аг§26,Ме30]РУУ (8Ε(2ΓΟΝο:37) [А1а1, Ο1ιι4,Ν- (А1а-Аг§- Аг§- Аг§- А1а- А1а-Аг§- А1а)₃- Ьу813,Аг£26,Ме30]РУУ (8Ер ГО Νο: 38) [А1а1,01и4,Ν- РЕС5000- Ьу813,Аг§26,Ме30]РУУ (8Εζ) ГО Νο: 39) [А1а1,61и4,Аг_ё26(Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е(2 ГО Νο: 13) [А1а1,О1и4]РУУ (8Е(} ГО Νο: 14) и [Α1α1,Ο1υ4]ΝΡΥ (8Е(2 ГО Νο: 15) [Аг_ё26, (Μεί30 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е(} ГО Νο: 16) и [Аг§26, (Ме130 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е(2 ГО Νο: 17) [О1и4, (Ме(30 или Ν1ε30)]ΡΥΥ (8Е0 ГО Νο: 18) и [С1и4, (Μεί30 или Ν1ε30)]ΝΡΥ (8Е(2 ГО Νο: 19) [О1и4,Аг§26]РУУ (8Е0 ГО Νο:20) и [Ο1ιι4,Αγ§26]ΝΡΥ (8ΕΩ ГО Νο:21) [Су82ГО- Су827,О1п34]РР (8Е(} ГО Νο:22) [Суз2,Аос5- 24,ϋ- Суз27,О1п34]РР (8Е0 ГО Νο: 23) [Су82,Ьуз13,О- Су$27,О1п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 30) [Су$2, Ν- (8- (8- гамма- глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)- Ьуз 13, ЭСу827,61п34]РР (8Е(2 ГО Νο: 31) [Су82,И- {(А1а-Аг§- Аг§- Аг§- А1а- А1а-Аг§- А1а)₃}- Ьуз 13,ϋ- Суз27,О1п34]РР (8Εζ) ГО Νο: 32) [Суз2, Ν-{Ν’- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма- глутамоилЬу813Ю- Су827,О1п34]РР (8Е0ГО Νο:33) и их консервативно замещённых аналогов.
55. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 и Υ4 рецепторам по сравнению с Υ1 рецептором, представляющий собой [А1а1,С1и4,Аг§26,(Ме130 или Ν^30)]ΡΥΥ или его аналог с консервативной заменой.
56. Способ лечения состояний, восприимчивых к активации Υ2 и/или Υ4 рецепторов, заключающийся во введении нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества Υ2 и Υ4 селективного рецепторного агониста по любому из пп.54 или 55.
57. Применение по любому из пп.1-53, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показаны регуляция потребления энергии или энергетического метаболизма, контроль интестинальной секреции, снижение моторики желудочно-кишечного тракта или индукция ангиогенеза.
58. Применение по п.57, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что Υ2 и Υ4 селективный рецепторный агонист содержит САС-связывающий мотив.
59. Применение по п.57, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что Υ2 и Υ4 селективный рецепторный агонист содержит мотив связывания с сывороткой.

- 39 011861
60. Применение по п.57, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что Υ2 селективный рецепторный агонист является ПЭГилированным.
61. Применение по любому из пп.57-60, отличающееся тем, что лечение проводят с целью замедления опорожнения желудка.
62. Применение по п.57, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой ожирение или избыточный вес, состояние, при котором ожирение или избыточный вес рассматривается как способствующий фактор.
63. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой булимию, нейрогенную булимию, синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (ΝΙΌΌΜ), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезнь желчного пузыря, остеоартрит, остановку дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.
64. Применение по п.62 или 63, отличающееся тем, что агонист вводят пациенту натощак.
65. Применение по п.57, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой диарею или кишечную гиперсекрецию.
66. Применение по любому из пп.56-65, отличающееся тем, что агонист вводят пациенту парентерально, включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, назальное, трансдермальное или трансбуккальное введение.
67. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более Υ2 и Υ4 селективных рецепторных агонистов по определению в любом из пп.54 или 55 вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
68. Косметическая композиция, содержащая один или более Υ2 и Υ4 селективных агонистов по п.54 или 55 вместе с косметически приемлемым эксципиентом.