EA012071B1 - Селективные агонисты рецептора y4 для терапевтического воздействия - Google Patents

Abstract

Y4 рецепторные агонисты, селективные к Y4 рецептору по сравнению с Y1 и Y2 рецепторами, применимы для лечения состояний, восприимчивых к активации Y4 рецепторов. Агонисты, селективные к Y4, представляют собой: (а) РР-складчатые пептиды или РР-складчатые пептиды-миметики, С- и N-концевые аминокислотные последовательности которых имеют признаки по данному описанию, или (б) содержат ковалентную внутримолекулярную связь, или (в) содержат две ковалентно связанные С-концевые аминокислотные последовательности Y4 рецепторного распознавания, каждая из которых содержит последние четыре остатка С-концевой последовательности рецепторного распознавания агонистов типа (а).

Description

Данное изобретение относится к пептиду или пептидным соединениям, которые ведут себя как селективные агонисты Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами, и их применению при лечении состояний, чувствительных к активации Υ4 рецепторов, например, при лечении ожирения и избыточного веса, и состояний, при которых они рассматриваются как содействующие факторы, диареи и интестинальной гиперсекреции.

Предпосылки создания изобретения

Семейство пептидов с РР-складкой -ΝΡΥ (нейропептид Υ) (человеческая последовательность 8Еф ΙΌ. Νο:1), ΡΥΥ (пептид ΥΥ) (человеческая последовательность 8Εφ ΙΌ. Νο:2) и РР (панкреатический пептид) (человеческая последовательность 8Εφ ΙΌ. Νο:3) являются секретируемыми в природе гомологичными, содержащими последовательность из 36 аминокислот, амидированными по С-концу пептидами, которые характеризуются общей трёхмерной структурой - РР-складкой, поразительно устойчивой даже в разбавленном водном растворе и важной для рецепторного распознавания (узнавания) пептидов.

Первоначально с помощью рентгеновского кристаллографического анализа (РСА) более подробно была охарактеризована рентгеновская структура птичьего РР с разрешением до 0,98 А, и уникальная структура получила своё название от этого пептида (В1ипбе11 с1 а1. 1981 Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 78: 4175-79; С1оуег с1 а1. 1984, Еиг. 1. Вюсйеш. 142: 379-85). Затем РР-складчатая структура других членов семейства была проанализирована, главным образом, с помощью ЯМР-спектроскопии. Очевидно, что как РСА, так и ЯМР-спектроскопические исследования проводят в концентрированном или твёрдом состоянии; однако, точный анализ методом кругового дихроизма подтверждает, что ΝΡΥ и РР даже в водном растворе принимает РР-складчатую структуру, необычную для такого малого пептида (ЕиЫепбогГГ е1 а1. 1990 1. Βίο1. Сйеш. 265:11706-12). Важно отметить, что анализ протеолитической устойчивости пептидов и их фрагментов и аналогов чётко показывает, что, например, полноразмерный РР1-36 в разбавленном водном растворе сохраняет складчатую конфигурацию, которая защищает его от расщепления некоторыми ферментами, которые быстро и легко расщепляют аналоги, не способные принять РРскладчатую структуру вследствие минорных замен (8с11\\'айх е1 а1. 1990 Аппак ΝΥ Асаб. 8сЕ 611: 35-47).

РР-складчатая структура, общая для ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР, состоит из 1) Ν-концевой полипролиноподобной спирали (соответствующей остаткам 1-8 с Рго2, Рго5 и Рго8), за которой следует 2) участок бетаповорота типа I (соответствующий остаткам с 9 по 12), далее следуют 3) амфифильная альфа-спираль (остатки 13-30), которая расположена антипараллельно полипролиновой спирали с углом около 152° между осями спиралей, и 4) С-концевой гексапептид (остатки 31-36). Складчатая структура стабилизирована за счёт гидрофобных взаимодействий между боковыми цепями амфифильной альфа-спирали, которые тесно переплетаются с тремя гидрофобными остатками пролина (8с11\\'айх е1 а1. 1990). Помимо ключевых остатков в рецепторе, распознающем С-концевой гексапептид, именно ядерные гидрофобные остатки, которые являются консервативными в целом семействе РР-складчатых пептидов, стабилизируют РРскладчатую структуру. На фиг. 1А изображена последовательность ΝΡΥ с остатками, консервативными в ряду ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР, показанными белыми буквами на тёмном фоне.

На фиг. 1А также показаны элементы РР-складчатой структуры, описанные выше. С-концевой гексапептид, важный для рецепторного узнавания, является неструктурированным, но РР-складка обеспечивает устойчивый каркас, презентирующий С-концевой гексапептид рецепторам (иллюстрируется на фиг. 1В), которые до некоторой степени зависят или не зависят также от участков Ν-конца пептида. Анализ методом ЯМР-спектроскопии также показал, что дальние С- и Ν-концевые участки, например, ΝΡΥ, являются скорее подвижными, это означает, что РР-складке постоянно угрожает опасность оказаться с расстегнутой молнией на свободном конце.

ΝΡΥ является весьма распространённым нейропептидом, обладающим разнообразным действием в различных частях как центральной, так и периферической нервной системы, действующий с помощью различных субтипов рецептора в организме человека: Υ1, Υ2, Υ4 и Υ5. Основными ΝΡΥ рецепторами являются Υ1 рецептор, который обычно является постсинаптическим рецептором, передающим действие ΝΡΥ нейронов, и Υ2 рецептор, который обычно является пресинаптическим, ингибирующим рецептором. Это также имеет место в гипоталамусе, где ΝΡΥ нейроны, которые также экспрессируют антагонист/обратный агонист рецептора мелакортина АдКР (агути-родственный пептид), ведут себя как первичные сенсорные нейроны в стимулирующей ветви дугообразного (аркуатного) ядра. Поэтому в этом сенсорном ядре для регуляции аппетита и потребления энергии ΝΕΥ/ЛдВР нейроны, вместе с ингибирующими РОМС/САКТ нейронами, контролируют гормональный и питательный статус организма, так как эти нейроны являются мишенью как действующих продолжительно регуляторов, таких как лептин и инсулин, так и кратковременных регуляторов, таких как грелин и ΓΥΥ (см. ниже). Стимулирующие NΡΥ/АдКΡ нейроны распространяются, например, на паравентрикулярное ядро - также гипоталамуса где, как полагают, их постсинаптическими нацеленными рецепторами являются Υ1 и Υ5 рецепторы. ΝΓΥ является наиболее эффективным из известных соединений, способствующих повышению потребления пищи, так грызуны после интрацеребровентрикулярной (1СУ) инъекции ΝΓΥ едят до тех пор, пока они в буквальном смысле не лопнут. АдКР, полученный при использовании №А/АдКР нейронов, ведёт себя как антагонист, главным образом, в отношении рецепторов меланокортинов типа 4 (МС-4) и блоки

- 1 012071 рует действие пептидов из РОМС, в основном, аМ8Н, на этот рецептор. Так как МС4 рецепторный сигнал действует как ингибитор потребления пищи, действие АдКР, точно так же, как действие ΝΡΥ, является стимулирующим сигналом для потребления пищи (т.е. ингибирование ингибирования, угнетение угнетения). На ΝΡΥ/АдКР нейронах обнаружены ингибирующие - пресинаптические - Υ2 рецепторы, которые являются мишенью как локально высвобождающегося ΝΡΥ, так и кишечного гормона ΡΥΥдругого РР-складчатого пептида.

ΡΥΥ выделяется в процессе еды - пропорционально калорийности пищи-энтероэндокринными клетками в дистальной части тонкого кишечника и толстой кишки, действуя как на периферии на функции ЖКТ, так и в центральной области как сигнал насыщения. Полагают, что периферически ΡΥΥ действует как ингибитор - удар под дых, например, двигательной функции (моторики) верхнего ЖКТ, секреции желудочной кислоты и секреции экзокринных клеток поджелудочной железы. Полагают, что центрально ΡΥΥ действует, главным образом, на пресинаптические ингибирующие Υ2 рецепторы на ΝΡΥ/АдКР нейронах в дугообразном (аркуатном) ядре, к которому он поступает из крови (Вайетйат е! а1. 2002 №1Шге 418: 650-4). Пептид выделяется в виде ΡΥΥ1-36, но часть, около 50%, циркулирует в кровотоке в виде ΡΥΥ3-36, который является продуктом расщепления дипептидилпептидазой-ΐν, ферментом, который удаляет дипептид с Ν-конца пептида, при условии, что Рго или А1а находится в положении два, как во всех трёх РР-складчатых пептидах -РР, ΡΥΥ и ΝΡΥ (ЕЬет1еш е! а1. 1989 Рерййек 10: 797-803). Таким образом, ΡΥΥ в кровотоке представляет собой смесь ΡΥΥ1-36, который действует как на Υ1, так и на Υ2 рецепторы (так же как Υ4 и Υ5 с различной аффинностью), и ΡΥΥ3-36, который обладает более низкой аффинностью в отношении рецепторов Υ1, Υ4 и Υ5 рецепторов, чем в отношении Υ2 рецептора.

РР представляет собой гормон, который выделяется эндокринными клетками в панкреатических островках, хотя регулируется исключительно вагусно холинергическими влияниями, проявляемыми, главным образом, при потреблении пищи (5>ο1ι\ν;·ΐΓΐζ 1983 6ак!гоеЩего1оду 85: 1411-25). РР оказывает различное действие на желудочно-кишечный тракт, но оно обычно не наблюдается в изолированных клетках и органах, и, очевидно, зависит от отсутствия нарушения вагусной иннервации (5>ο1ι\ν;·ΐΓΐζ 1983 6ак!гоеп!его1оду 85: 1411-25). В соответствии с этим РР рецепторы, называемые Υ4 рецепторами, расположены, главным образом, в области пострема в стволе мозга с сильной экспрессией в моторных вагусных нейронах, активация которых вызывает периферические эффекты РР, и в ядрах одиночного пучка (ΝΤ8), активация которых вызывает действие РР как гормона насыщения (^ййееотЬ е! а1. 1990 Ат. 1. Ρ^μΙ. 259: 6687-91, Ьаткеп & 1<пк!епкеп 1997 Втат Век. Мо1. Вташ Кек. 48: 1-6). Следует отметить, что РР в крови имеет доступ к этой области мозга, так как гематоэнцефалический барьер пропускает в этой области, где обнаруживаются различные гормоны с периферии.

Недавно были приведены доводы, что влияние РР на потребление пищи частично посредуется действием на нейроны - в особенности ΡΟМС/САКΤ нейроны в дугообразном ядре (Вайетйат е! а!. 2004 АЬкйас! 3.3 1Щегпа!юпа1 ΝΡΥ Зутрокшт ίη Со1тЬга, Ρо^ιида1). РР действует через Υ4 рецепторы, к которым он обладает аффинностью в субнаномолярных концентрациях, в отличие от ΡΥΥ и ΝΡΥ, которые проявляют аффинность к этому рецептору в наномолярных концентрациях (М1ейе1 е! а1. 1998 Ρйа^тасо1. Кеу. 50:143-150). РР также проявляет заметную аффинность к рецептору 5, но она, по-видимому, не имеет физиологического значения для циркуляции РР как вследствие отсутствия доступа к клеткам в ЦНС, где этот рецептор главным образом экспрессируется, так и вследствие относительно низкой аффинности к ΡΡ.

Рецепторы РР-складчатых пептидов

Существует четыре точно установленных типа рецепторов РР-складчатых пептидов у человека: Υ1, Υ2, Υ4 и Υ5, которые (все) распознают ΝΡΥ1-36 и ΡΥΥ1-36 с аналогичной аффинностью. Одно время высказывалось предположение о типе рецептора Υ3, который мог иметь предпочтение в отношении ΝΡΥ по сравнению с ΡΥΥ, но в настоящее время его не воспринимают как реальный подтип рецепторов (М1е11е1 е! а1. 1998 Ρйа^тасо1. Кеу. 50:143-150). Был клонирован подтип рецепторов Υ6, который в организме человека экспрессируется в усечённой форме, не содержащей ΤΜ-νΐΙ, а также в виде хвоста рецептора, и, следовательно, по меньшей мере, сам по себе, по-видимому, не может образовывать функциональную рецепторную молекулу.

Υ1 рецепторы - исследования по аффинности наводят на мысль, что Υ1 одинаково хорошо связывается как с ΝΡΥ, так и с ΡΥΥ, но, в принципе, не с ΡΡ. Аффинность к Υ1 зависит от идентичности обеих концевых последовательностей РР-складчатой молекулы (ΝΡΥ/ΡΥΥ)- например, являются важными остатки Туг1 и Ριό2- и зависит от того, чтобы пептидные концы были представлены (презентированы) правильным образом. На С-конце, где важными являются боковые цепи нескольких остатков, Υ1 рецептор, подобно Υ5 и Υ4 рецептору, но не Υ2 рецептору, допускает некоторые замены в положении 34 (обычно 61п) - такие как Ριό (РиЫепйогГГ е! а1. 1990 1. Вю1. Сйет. 265: 11706-12; 5>ο1ι\ν;·ΐΓΐζ е! а1. 1990 Аппа1к ΝΥ Асай. 8с1. 61: 35-47). Сообщалось о некоторых исследованиях зависимости структура-функция, касающихся требований Υ1 и Υ2 рецепторов (Веск-8юктдег е! а1. 1994 Еиг. 1. Вюсйет. 225: 947-58; Веск- 8юктдег апй 1ипд 1995 Вюро1утетк 37: 123-42; 8611 е! а1. 2001 Еиг. 1. Вюсйет. 268: 2828-37).

Υ2 рецепторы - исследования аффинности наводят на мысль, что Υ2 одинаково хорошо связывается как с ΝΡΥ, так и с ΡΥΥ, но, в принципе, не с ΡΡ. Для рецептора нужен, главным образом, С-конец РР

- 2 012071 складчатого пептида (ΝΡΥ/ΡΥΥ). Таким образом, длинные С-концевые фрагменты, например, вплоть до ΝΡΥ13-36 (целая альфа-спираль плюс С-концевой гексапептид), распознаются с относительно высокой аффинностью, т.е. в пределах величины, равной десятикратной величине аффинности полноразмерного пептида (811еб<11 е! а1. 1989 ТЕВ8 Ьей. 245: 209-14, 811еб<11 е! а1. 1989 1. ΒίοΙ. Сйет. 264: 6648-54). Следовательно, различные Ν-концевые делеции, которые приводят к утрате связывания с Υ1 рецептором, позволяют всё ещё до некоторой степени сохранять связывание с Υ2 рецептором. Однако аффинность Сконцевых фрагментов снижается, примерно, в 10 раз по сравнению с ΝΡΥ/ΡΥΥ даже для сравнительно длинных фрагментов. Остаток О1и в положении 34 ΝΡΥ и ΡΥΥ является в высшей степени важным для распознавания (узнавания) лиганда Υ2 рецептором (8ο1ι\ν;·ιΠζ е! а1. 1990 Лииак ΝΥ Асаб. δοί. 611: 35-47).

Υ4 рецепторы - исследования аффинности указывают, что Υ4 связывает РР в субнаномолярных концентрациях (субнаномолярная аффинность), соответствующих концентрациям, обнаруживаемым в плазме, тогда как ΝΡΥ и ΡΥΥ распознаются со значительно более низкой аффинностью. Такие исследования наводят на мысль, что Υ4 рецептор в высшей степени зависим от С-конца РР-складчатых пептидов и что относительно короткие Ν-концевые делеции уменьшают аффинность лигандов. Сообщалось о некоторых исследованиях структура- активность, относящихся к Υ4 рецептору (ОеЫей е! а1. 1996 Мо1. Ρйа^тасο1. 50: 112- 18; \Уа1кег е! а1. 1997 Ρеρ!^бе5 18: 609-12).

Υ5 рецепторы - исследования аффинности показывают, что Υ5 одинаково хорошо связывается с ΝΡΥ и ΡΥΥ, но также связывается с РР с более низкой аффинностью, которая, однако, ниже обычных уровней этого гормона в кровотоке. ΡΥΥ3-36 также хорошо распознаётся рецептором Υ5, однако, этот рецептор по большей части (в значительной степени) экспрессируется в ЦНС, где такой пептид не может легко получить доступ к рецептору при введении на периферии.

РР-складчатые пептиды и их аналоги были предложены для применения при лечении ожирения и связанных с этим заболеваний, включая, например, синдром Прадера-Вилли, на основании действия этих пептидов, продемонстрированного на животных моделях и на человеке, и на основании того факта, что у людей, страдающих ожирением, наблюдаются низкие базальные уровни РР и ΡΥΥ, а также более слабые реакции этих пептидов на пищу (Ηοίδ! Л е! а1. 1983 Ιη!. 1. 0Ье§. 7: 529-38; Вайегйат е! а1. 1990 №1Шге). С середины семидесятых известно, что РР может влиять на потребление пищи у грызунов. В 1993 году сообщалось, что вливание РР больным с синдромом Прадера-Вилли РР снижает потребление пищи (Вет!8οη е! а1. 1993 Ρеρί^бе8 14: 497-503). Недавно этот эффект был подтверждён вливанием РР здоровым людям, у которых наблюдалось продолжительное подавление аппетита и пониженное потребление пищи в течение 24 ч (Вайегйат е! а1. 2003, Сйп. Епбоегто1. Ме!аЬ. 88: 3989-92).

Однако нативные РР-складчатые пептиды не являются оптимальными для применения в качестве биофармацевтических веществ, например, они чувствительны к расщеплению различными протеазами, такими как ΌΡΡ-ΐν. Таким образом, природные пептиды не оптимизированы по устойчивости белков, так как их готовят таким образом, чтобы они действовали в течение сравнительно короткого времени в качестве нейропептида или гормона.

Для лечения состояний, откликающихся на Υ4-рецепторную модуляцию, таких как ожирения и интестинальная гиперсекреция, желательно, следовательно, использовать РР-складчатые пептиды или РРскладчатые пептиды-миметики, которые ведут себя как агонисты и являются специфическими в отношении Υ4 рецептора, предполагаемого в качестве мишени, и которые устойчиво сохраняют элементы РРскладчатой структуры, важные для рецепторного связывания. В частности, было бы в высшей степени желательно использовать такие агенты, которые селективны в отношении Υ4 рецепторов по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами. Это особенно важно, так как ожидается, что активация Υ1 рецептора теоретически может оказать нежелательное побочное воздействие на сердечно-сосудистую систему и на почки, например сужение кровеносных сосудов и натрийурез. Кроме того, активация Υ2 может также вызвать побочные эффекты. Хотя всё ещё неясно, каков в действительности эффективный ангиогенный профиль Υ рецептора, агонисты Υ2, такие как ΝΡΥ3-36, могут, по-видимому, индуцировать реваскуляризацию, например, на моделях ишемии задних конечностей, т.е. при введении в высоких дозах с постоянной экспозицией, как например, при высвобождении из нерегулируемых гранул (2ико\\ъка е! а1. 2003 Тгепбз Сагбюуаке. Меб. 13: 86-92). Ангиогенная реакция на ΝΡΥ у животных, нокаутированных по Υ2 рецептору, понижена; однако в действительности реакция на этот широкого спектра Υ рецепторный агонист ΝΡΥ не исчезает, и как Υ2, так и Υ5 рецепторы позитивно регулируются в ишемических (суженных) сосудах (Ьее е! а1. 1. С1ш. 1пуе§!. 2003, 111: 1853-62). Тем не менее РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик может, за счёт активации Υ2 рецептора, вызвать побочные эффекты, такие как ухудшение ретинопатии, например, у больных диабетом, и может, теоретически, способствовать неоваскуляризации, ассоциированной с ростом некоторых раковых опухолей. Таким образом, применение эффективных и селективных агонистов к Υ4 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами было бы полезно при заболеваниях и состояниях, чувствительных к активации Υ4 рецептора.

Некоторые общие термины, применяемые в описании

Аффинность:

Аффинность пептида к специфическому рецептору выражается, например, величиной 1С₅₀ или величиной Κι или К_б, которая в конкретном неограничивающем примере определяется анализом, например,

- 3 012071 таким как анализ конкурентного связывания. Значение 1С₅₀ соответствует концентрации пептида, который замещает релевантный для данного рецептора радиоактивный лиганд, применяемый в количестве, значительно меньшем, чем К_б для этого радиоактивного лиганда, на 50%.

Аппетит:

Естественная потребность в еде или сильное желание еды. Повышенный аппетит обычно приводит к повышенному пищевому поведению.

Супрессоры аппетита:

Соединения, понижающие потребность в еде (желание есть).

Связывание:

Специфическое взаимодействие между двумя молекулами, так что две молекулы взаимодействуют. Связывание с рецептором может быть специфическим и селективным, так что связывается преимущественно одна молекула по сравнению с другой молекулой. Специфическое связывание можно определять константой диссоциации (К_б). Эта величина зависит от селективности испытуемого соединения. Например, соединение с Κ,ι ниже 10 нМ обычно считается прекрасным возможным лекарством. Однако соединение с более низкой аффинностью, но селективное в отношении конкретного рецептора, также может быть хорошим возможным лекарством.

Индекс массы тела (ИМТ, ΒΜΙ):

Математическая формула для измерения массы тела, иногда также называемая индексом Кветеля. ΒΜΙ рассчитывают как частное от деления массы (в кг) на рост (в метрах)². Современными стандартами как для мужчин, так и для женщин, принятыми за нормальные, являются ΒΜΙ около 20 кг/м². В одном варианте изобретения для определения страдающего ожирением субъекта можно применять ΒΜΙ выше 25 кг/м². Первая степень ожирения соответствует ΒΜΙ 25 кг/м². Вторая степень ожирения соответствует ΒΜΙ 30- 40 кг/м² и третья степень ожирения соответствует ΒΜΙ выше 40 кг/м² (1сс.|шсг 1987 Αίη. 1. С1ш. ΝιιΙγ. 45:1035-47). Идеальный вес тела различен у разных видов и индивидуумов и зависит от роста, строения тела, строения костей и пола.

Потребление калорий, потребление в калориях:

Число калорий (энергия), потребляемых индивидуумом. В контексте настоящего изобретения этот термин идентичен термину потребление энергии.

Косметическое лечение:

Предполагается, что этот термин обозначает лечение не с медицинской целью, но для улучшения качества жизни субъекта, например, внешнего вида субъекта. Этот термин включает лечение субъекта, желающего снизить свой вес, не будучи человеком, страдающим избыточным весом или ожирением.

Потребление пищи:

Количество пищи, потребляемой индивидуумом.

Потребление пищи можно измерять объёмом или весом. Это выражение включает ί) потребление пищи как общее количество поглощённой индивидуумом пищи; и и) потребление пищи как количество белков, жиров, углеводов, холестерина, витаминов, минералов или любых других пищевых компонентов, поглощённых индивидуумом. Соответственно, выражение потребление пищи в контексте настоящего изобретения аналогично выражению потребление энергии.

Нормальная дневная диета:

Среднее потребление пищи индивидуумом данного вида. Нормальную дневную диету можно выражать терминами потребление калорий, потребление белков, потребление углеводов и/или потребление жиров. Нормальная дневная диета человека обычно содержит следующее: от около 2000, около 2400 или около 2800 до значительно большего числа калорий. Кроме того, нормальная дневная диета человека обычно включает примерно 12-45 г белка, около 120-610 г углеводов и около 11-90 г жиров. Низкокалорийная диета составляет, примерно, не более 85% и, предпочтительно, не более 70% нормального потребления в калориях человека. У животных потребности в калориях или в пище меняются в зависимости от вида и размера животного. Например, у кошек общее потребление калорий на кг, а также распределение белков, углеводов и жиров в процентах меняется с изменением возраста кошки и репродуктивного состояния.

Ожирение:

Состояние, при котором избыточный вес тела может стать причиной повышенного риска для здоровья человека (см. Β;πΊο\ν апб Э|с1х. Реб1а1пс5 102:Е29, 1998; Νηΐίοηηΐ ΙηκΙίΙυΙοκ οί НсаНН, Νηΐίοηηΐ Неай, Ьипд апб Β1οο6 [п8111и1е (ΝΗΕΒΙ), 0Ьек. Век. (кирр1. 2):51 82098, 1998). Избыточный телесный жир является результатом дисбаланса между потреблением и расходом энергии. В одном варианте изобретения для оценки ожирения применяют индекс массы тела (ΒΜΙ). В одном варианте изобретения ΒΜΙ, примерно, от 22 кг/м² (т.е. примерно на 10% выше нормального значения) и, примерно, до 30 кг/м² рассматривается как избыточный вес, особенно примерно от 25 до 30 кг/м², тогда как ΒΜΙ 30 кг/м² или выше рассматривается как ожирение.

Избыточный вес:

Вес индивидуума, который выше идеального веса его тела. Индивидуум с избыточным весом может страдать ожирением, но необязательно ожирением. В одном варианте изобретения индивидуумом (чело

- 4 012071 веком), страдающим избыточным весом, является любой индивидуум, желающий снизить свой вес. В другом варианте изобретения индивидуум (человек) с ΒΜΙ, примерно, от 22 кг/м² (т.е., примерно, на 10% выше нормального значения) и, примерно, до 30 кг/м² рассматривается как человек, страдающий избыточным весом, особенно, примерно, от 25 до 30 кг/м². Следует отметить, что субъекты, имеющие ΒΜΙ немногим выше нормального значения (например, около 22-25 кг/м²), очень часто желают снизить вес, хотя только в косметических целях.

Эффективность (активность):

Ιη νίίτο эффективность соединения определяется величиной ЕС₅₀, т.е. концентрацией, которая даёт 50% максимально достижимого эффекта, определяемого релевантным для данного рецептора анализом передачи сигнала.

Субъект:

Субъект может быть любым субъектом, включая как человека, так и млекопитающих. Так, субъект может быть человеческим или нечеловеческим приматом, сельскохозяйственным животным, таким как свиньи, крупный рогатый скот, овцы и птицы, спортивным или домашним животным, таким как собаки, кошки, лошади, хомяки, и грызунами.

Терапевтически эффективное количество:

Доза, достаточная для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности конкретного состояния или заболевания и/или для ослабления специфических признаков или симптомов конкретного состояния или заболевания. Термин (выражение) включает дозу, достаточную для предупреждения прогрессирования или для того, чтобы вызвать регрессию нарушения, или дозу, способную облегчить признак или симптом нарушения, или дозу, которая позволяет достичь нужного результата. В вариантах изобретения, относящихся к косметическому лечению или к лечению избыточного веса или ожирения, терапевтический эффект рецепторного агониста определяется количеством, достаточным для ингибирования или прекращения увеличения веса тела, или количеством, достаточным для снижения аппетита, или количеством, достаточным для уменьшения потребления энергии или пищи или для повышения расхода энергии. Предполагается, что выражение (термин) косметически эффективное количество обозначает дозу, достаточную для достижения нужного эффекта при лечении субъекта.

Подробное описание изобретения

В своём самом широком аспекте настоящее изобретение охватывает применение Υ4 рецепторного агониста, селективного в отношении Υ4 рецептора по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами, для получения композиции для лечения состояний, откликающихся на активацию Υ4 рецепторов, причём:

(а) указанный агонист является РР-складчатым пептидом или РР-складчатым пептидом-миметиком, который содержит:

(ί) С-концевую аминокислотную последовательность Υ4 рецепторного распознавания (узнавания), представленную как Х-Тйг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ПК¹К², где К¹ и К², независимо, обозначают водород или С₁-С₆алкил, X обозначает Уа1, 11е Ьеи или А1а, а X³ обозначает остаток, отличный от С1п, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТНг замещён на Ηίκ или Акп, и/или Туг замещён на Тгр или РНе: и/или Агд замещён на Ьук, и (ίί) Ν-концевую аминокислотную последовательность Υ рецепторного распознавания (узнавания), представленную как Η₂Ν-Χ¹-Ργο-Χ²-(Ο1π или Акр)-, где X отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X² обозначает Ьеи, 11е или 8ег, или их консервативные замены, или (б) указанный агонист содержит

С-концевую аминокислотную последовательность Υ4 рецепторного распознавания (узнавания) по определению в (1), см. выше, указанная последовательность слита с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанной гексапептидной последовательности, указанный поворот заключён в спиральной конфигурации с помощью ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно, Ν-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания (узнавания) по определению в (ίί), см. выше; или (в) указанный агонист содержит две ковалентно связанные С-концевые аминокислотные последовательности Υ4-рецепторного распознавания (узнавания), каждая из которых содержит по меньшей мере четыре остатка последовательности по определению в (1), см. выше.

Специфическая терминология, относящаяся к изобретению

Агонисты, к которым относится настоящее изобретение, являются селективными в отношении Υ4 рецептора по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами. В контексте настоящего изобретения это условие выполняется, если величина 1С₅₀ агониста по меньшей мере в 10 раз ниже в отношении Υ4 рецептора, чем в отношении Υ1 и Υ2 рецепторов, при определении методами анализа аффинности по данному описанию. В целом, что касается эффективности (активности), величина ЕС₅₀ агонистов по данному изобретению также по меньшей мере в 10 раз ниже для Υ4 рецептора, чем в отношении Υ1 и Υ2 рецепторов, как определено анализом активности по данному описанию. Некоторые из предпочтительных агонистов по данному изобретению имеют величины аффинности и эффективности, по меньшей мере в 100 раз выше в

- 5 012071 отношении Υ4 рецепторов, чем в отношении Υ1 и Υ2 рецепторов. Некоторые из предпочтительных агонистов по данному изобретению имеют величины аффинности и эффективности по меньшей мере в 1000 раз выше в отношении Υ4 рецепторов, чем в отношении Υ1 и Υ2 рецепторов.

Для целей данного описания РР-складчатый пептид представляет собой молекулу, имеющую 3-Ό структуру птичьего РР, определённую методом РСА (В1ипбе11 е! а1. 1981 Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 78: 4175-79 ; О1оуег е! а1. 1984, Еиг. 1. Вюсйет. 142: 379-85), имеет домены, соответствующие доменам, и практически выравниваемые как и в доменах Ν-концевой полипролиноподобной спирали, области бетаповорота типа I, амфифильной альфа-спирали и С-концевого гексапептида указанного ΝΡΥ, ΡΥΥ и/или РР (фиг. 1). Таким образом, описание различных доменов РР-складчатых пептидов, применяемых в данном изобретении, относится к оригинальной рентгеновской структуре птичьего РР (В1ипбе11 е! а1. 1981 Ргос. N111. Асаб. 8с1. И8А 78: 4175-79 ; О1оуег е1 а1. 1984, Еиг. 1. Вюсйет. 142: 379-85; 8с11\\ш1х е1 а1. 1990).

РР-складчатый пептид-миметик по настоящему описанию обозначает молекулу, имеющую 3-Ό структуру, которая, при картировании на оригинальной 3-Ό структуре птичьего РР, по меньшей мере, имеет домены, соответствующие доменам, и практически выравниваемые как и в доменах последнего поворота амфифильной альфа-спирали и С-концевого гексапептида РР. РР-складчатые пептидымиметики могут также при вышеуказанном картировании иметь домены, соответствующие одному или более остальных поворотов амфифильной альфа-спирали, Ν-концевой полипролиноподобной спирали и области бета-поворота типа I. Пептид-миметик необязательно состоит исключительно из последовательности альфа-аминокислот, связанных классическими пептидными связями. Одна или более связей в такой последовательности может быть замещена пептидомиметическими связями, такими как обратная амидная и восстановленная пептидная связи, так что пептид-миметик можно рассматривать как псевдопептидную последовательность. Такие замены связей могут придать устойчивость к расщеплению эндопептидазами и улучшить фармакодинамические свойства молекулы.

Такие сравнения 3-Ό структуры, как упомянутые в вышеприведённых определениях РРскладчатого пептида и РР-складчатого пептида-миметика, можно делать, конструируя модели молекул сравнения на основании координат их атомов, определяемых, например, методом РСА, или с помощью одной или более компьютерных программ, выпускаемых для визуализации прогнозируемой на основании структурной формулы 3-Ό структуры молекулы, например Маейго Мобейпд Епупоптеп! от 8сйгобшдег 1пс, 1500 8. ^. Е1г§1 Ауепие, 8ш1е 1180 Рогбапб, ОК. 97201; ИъщЫ II Мобейпд ЕпуиоптепГ', версия 4,0, от Ассе1гу§ Шс. 8ап 01едо; и 8ΥΒΥΕ® 7.0 от Тпрок Шс., 1699 8ои111 Нап1еу Кб., 81. Ьош8, М188ошг, 63144, И8А. Следует отметить, что 3-Ό структура РР-складчатого пептида или РР-складчатого пептида- миметика по настоящему изобретению необязательно должна точно соответствовать, и обычно не соответствует точно, 3-Ό структуре природного ΝΡΥ, ΡΡΥ или РР. Наблюдаемая 3-Ό структура РРскладчатого пептида или РР-складчатого пептида-миметика в значительной степени зависит от применяемых экспериментальных условий, и в особенности малые пептиды могут казаться более или менее развёрнутыми в определённых условиях. Однако достаточно, чтобы РР-складчатый пептид или РРскладчатый пептид-миметик имел домены, соответствующие описанным выше доменам РР-складки и чтобы он имел структурные элементы для того, чтобы принять общую форму, аналогичную форме нативного пептида, в котором С-концевая и, при наличии, Ν-концевая последовательности были нормально ориентированы.

Агонисты, к которым относится данное изобретение, имеют С-концевую последовательность Υ4рецепторного распознавания (распознавания Υ4 рецептором). Эта последовательность, обычно протяжённостью около 5-7 остатков и, в особенности, гексапептидная последовательность, расположенная на С-конце агониста, которая, в случае её присутствия в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде-миметике, связывается с Υ4 рецептором и активирует рецептор за счёт только лишь этого связывающего взаимодействия, или в результате такого связывающего действия и связывания с Υ4 рецептором Νконцевой последовательности Υ4-рецепторного распознавания, имеющейся в агонисте. Ν-концевая последовательность Υ4-рецепторного распознавания (распознавания Υ4 рецептором) представляет собой последовательность, обычно содержащую около 3-5 остатков, главным образом, 4 остатка, расположенную на Ν-конце агониста, которая, в случае её присутствия в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде-миметике, связывается с Υ4 рецептором и активирует рецептор за счёт комбинации такого связывающего действия и связывания с Υ4 рецептором С-концевой последовательности Υ4- рецепторного распознавания, имеющейся в агонисте. Классические С- и Ν-концевые последовательности Υ4рецепторного распознавания представляют собой последовательности, обнаруживаемые в природном РР пептиде, но как станет очевидно из данного описания, эти классические последовательности можно модифицировать для того, чтобы сохранить распознавание Υ4, но уменьшить распознавание Υ1 и Υ2. Сили Ν-концевая последовательность, присутствующая в любом конкретном агонисте, представляет собой последовательность Υ4 рецепторного распознавания, если рассматриваемый РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик взаимодействует с рецептором в анализах аффинности и/или активности по данному описанию, когда эта последовательность присутствует, но не тогда (или в незначительной степени), когда эта последовательность удалена (делегирована).

- 6 012071

В данном описании выражение, такое как остаток, соответствующий положению 8ег3 ΝΡΥ является ссылкой на аминокислотный остаток агониста, который, при картировании 3-Ό структуры агониста на 3-Ό структуру ΝΡΥ, отображается (картируется) наиболее близко к остатку 8ег3 ΝΡΥ. Аналогично, выражение, такое как остаток, соответствующий положению Рго34 ΡΡ является ссылкой на положение аминокислотного остатка агониста, который при картировании 3-Ό структуры агониста на 3-Ό структуру РР, отображается (картируется) наиболее близко к остатку Ργο34 ΡΡ. Действительная нумерация конкретного остатка в конкретном пептиде может отличаться от этой нумерации, например, вследствие делеций относительно природных пептидов.

В целом, РР-складчатые агонисты или РР-складчатые агонисты-миметики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, обычно имеют пептидный каркас или частично пептидный каркас, по меньшей мере, имеют С-концевую аминокислотную последовательность и, обычно Ν-концевую аминокислотную последовательность, хотя остальная часть каркаса может представлять собой непептидный линкерный радикал, например, линейную или разветвлённую алкиленовую цепь. Аминокислоты, присутствующие на пептидном(ых) участке(ах) агонистов, обычно являются природными, особенно в С- и Ν-концевых последовательностях, которые взаимодействуют с Υ4 рецептором, но также могут присутствовать неприродные альфа-аминокислоты, которые защищают РР-складку, но не предупреждают Υ4 рецепторное связывание.

Если агонист по настоящему изобретению содержит С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности, то С-концы могут быть амидированы и/или Ν-концы могут быть ацилированы с целью придать резистентность к карбокси- и/или аминопептидазам. На самом деле С-концы нативных ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР пептидов являются амидированными, так что С-концевая аминокислота агониста по изобретению может быть также амидированной.

В данном описании ссылки на аминокислоты даются в виде их обычных названий или в виде сокращений, например, валин (Уа1), лейцин (Ьеи), изолейцин (11е), метионин (Ме1), фенилаланин (Ρίκ). аспарагин (Акп), глутаминовая кислота (С1и), глутамин (С1и), гистидин (Ηίκ), лизин (Ьук), аргинин (Агд), аспарагиновая кислота (Акр), глицин (С1у), аланин (А1а), серии (8ег), треонин (ТЬг), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Сук) и пролин (Ργο). Когда называется обычное название или аббревиатура без указания стереоизомерной формы, следует понимать, что речь идёт об Ь-форме рассматриваемой кислоты. Когда подразумевается Ό-форма, она специально указывается в названии аминокислоты. Иногда, когда этого требует контекст, Ь-форма скорее описывается, нежели подразумевается.

Термин консервативная замена по данному описанию обозначает, что одна или более аминокислот замещены на другой, биологически сходный остаток. Примеры включают замену на аминокислотные остатки со сходными характеристиками, например малые аминокислоты, кислые аминокислоты, полярные аминокислоты, основные аминокислоты, гидрофобные аминокислоты и ароматические аминокислоты. Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают консервативные аминокислотные замены, представленные в приведённой ниже таблице, и аналогичные замены исходного остатка неприродными альфа-аминокислотами с аналогичными характеристиками. Например, в предпочтительном варианте изобретения остатки Ме1 замещаются на норлейцин (№е), биоизостер Ме1, который, в отличие от Ме1, трудно окисляется. Другим примером консервативной замены на остаток, обычно не присутствующий в эндогенных пептидах и белках млекопитающих, является консервативная замена Агд или Ьук, например, на орнитин, канаванин, аминоэтилцистеин или другую основную аминокислоту. Более подробные сведения о фенотипически молчащих заменах в пептидах и белках даны, например, в Во\\эе е1 а1. 8с1еисе 247, 1306-1310, 1990.

[ Исходный остаток | Консервативная замена

А1а

Агд

Азп

Азр

61п

ΘΙυ

Н(8

Не

Ьеи

Ьуз

Ме(

РКе

Зег

ТЬг

Тгр

Туг

Уа1

£1у

Ьуз

(31л, ΗΪ5, ТГ1Г

С1и

Αδη, Ι-ίίδ

Азр

Азп, Θίη

Ьеи, Уа1

Пе> Уа1

Агд

Ьеи, Не

Туг> Тгр, Ηίε

ТНг, Аэп

Зег, Аэп, ΘΙη

Туг, РЬе, Н!з

Тгр, РЬе, Ηί®

Не, Ьеи

- 7 012071

Если не указано иначе в контексте, в котором он встречается, термин замещённый в применении к любому фрагменту по данному описанию означает имеющий до четырёх совместимых заместителей, каждый из которых, независимо, может представлять собой, например, (С1-С₆)алкил, (С1-С₆)алкокси, гидрокси, гидрокси(С₁-С₆)алкил, меркапто, меркапто(С₁-С₆)алкил, (С₁-С₆)алкилтио, галоген (включая фтор, бром и хлор), трифторметил, трифторметокси, нитро, нитрил (-СЫ), оксо, фенил, -СООН, - СООИ^А. -СОИ'. -8О2Е^а, -СОМЕ. УО;ХН_;. -СОХНИ'. -^О_;ХНИ'. -СОХИ'И. -§О₂ЫК^аК^в, -ΝΗ2, -ХНИ'. -ХИ'И. -ОСОХН;. -ОСОХНИ'. -ОСОХИ'И. -ХНСОИ'. -ХНСООИ'. -ХИСОО1'. -ХН8О2ОЕ^а, -ХЕ^в8О2ОН, -ХНСОХН_;. -ХИ'СОХН_;. - ХНСОХНИ-ХИ'СОХНИ. -ХНСОХИ'И или -ХИ'СОХИ'И. где И^А и И. независимо, обозначают (С₁-С₆)алкильную группу. Возможный (необязательный) заместитель может представлять собой одну из приведённых выше замещающих групп.

Если контекст не диктует иначе, ссылки по данному описанию на №У, ΡΥΥ и РР пептиды и их последовательности относятся к человеческим формам этих пептидов и их последовательностям. Однако часто №Υ, ΡΥΥ и РР пептиды других млекопитающих образуют РР-складчатые пептиды-миметики человеческих №Υ, ΡΥΥ и РР или консервативно замещённых человеческих №Υ, ΡΥΥ и РР, когда эти термины применяются в данном описании.

Агонисты, рассматриваемые в настоящем изобретении, содержат остаток, отличный от С1и, и, предпочтительно, отличный от Азп, в положении, соответствующем Ργο34 ΡΡ в их С-концевой последовательности Υ4-рецепторного распознавания. Устранение этих остатков помогает обеспечить пониженную аффинность к Υ2 рецепторам.

Помимо этого, Х-концевая аминокислотная последовательность Υ-рецепторного распознавания, в случае её присутствия в агонистах по изобретению, представлена последовательностью (С1и или Азр)-, где X¹ отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X² обозначает Ьеи, 11е или 8ег или их консервативную замену. Эти требования помогают гарантировать аффинность Х концевой последовательности Υ4-рецепторного распознавания и обеспечить селективность относительно Υ1 и Υ2 рецепторов.

Агонисты типа (а) для применения по данному изобретению

Обычно агонисты типа (а) являются РР-складчатыми аналогами ΡΡ, №У или ΡΥΥ, или РРскладчатыми миметиками ΡΡ, №Υ или ΡΥΥ, имеющими модификации для того, чтобы сохранить или придать активность к Υ4 рецептору, но значительно снизить активность к Υ1 и Υ2 рецеторам. Такие РРскладчатые аналоги и миметики включают пептиды, имеющие полный комплемент характеристик РРскладчатых пептидов (Х-концевую полипролиноподобную спираль, бета-поворот, амфифильную альфаспираль и С-концевой гексапептид), пептидные аналоги, в которых часть каркаса (например, остатки бета-поворота и прилегающие остатки) замещены на непептидную спейсерную цепь, и усечённые (процессированные) пептиды, содержащие С-концевой гексапептид и последний поворот амфифильной альфа-спирали, но не содержащие целую полипролиноподобную спираль или её часть и/или весь бетаповорот или его часть.

Агонисты типа (Ь) для применения по данному изобретению

Обычно агонисты типа (Ь) можно рассматривать как аналоги РР-складчатых пептидов или РРскладчатые миметики типа (а), минимальные структурные признаки которых (С-концевой гексапептид и последний поворот альфа-спирали) стабилизированы с помощью определённой внутримолекулярной ковалентной связи.

Агонисты этого типа характеризуются внутримолекулярной связью, которая либо не имеет эквивалента в нативных №Υ, ΡΥΥ или РР пептидах, либо соответствует нековалентному взаимодействию, или замещает нековалентное взаимодействие с ковалентной связью, например, ковалентный дисульфидный мостик между Суз2 и Э-Суз27 в [Суз2, ^-Суз27]ΡΡ (8Е0 ГО №: 4) имитирует нековалентное гидрофобное взаимодействие между боковыми цепями Ργο2 и Туг27, наблюдаемое в рентгеновской структуре птичьего ΡΡ. Установлено, что такая связь может служить для стабилизации обязательных элементов РРскладчатой структуры, в частности, подвижной С-концевой последовательности Υ4-распознавания и последнего поворота альфа-спирали, и/или презентации Х-конца. В полноразмерных или близких к полноразмерным пептидах такая связь может стабилизировать нативную РР-складчатую структуру как таковую. Это выгодно по двум причинам: во-первых, она стабилизирует С-концевой участок амфифильной альфа-спирали и, тем самым, презентирование С-концевой аминокислотной последовательности Υ4 распознавания оптимальным образом, что вызывает высокую активность к Υ4 рецептору; во-вторых, за счёт стабилизации целой РР-складки как таковой пептид становится менее чувствительным к протеолитическому расщеплению, так как для таких ферментов часто требуется, чтобы целевые последовательности находились в относительно нескрученной форме (δοΙιναΠζ. е! а1. 1990). Внутримолекулярная связь может также способствовать Υ4-селективным агонистам, которые трудно модифицируются сравнительно со структурой нативных пептидов, например, агонистам, у которых отсутствует один или более доменов, или участков доменов, имеющихся в нативных пептидах.

Одна группа такого типа (Ь) имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания в Х-концевом участке агониста, соответствующем доменом полипролина РР

- 8 012071 складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену. Сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь, например дисульфидная или лактамная связь, может простираться от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из четырёх Ν-концевых остатков.

В особенно предпочтительной подгруппе агонисты этого типа состоят из РР-скрученных пептидов со сдерживающей спиральный поворот внутримолекулярной связью, которая тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания в Ν-концевой части домена полипролина. Такая связь может находиться между остатками в положениях 5 и 20 или 8 и 16, или, в особенности, между ΌСуз в положении 27 и Суз в положении 2. Ό-форма Суз предпочтительна в положении 27, так как она оптимально ориентирует тиольную боковую цепь с образованием дисульфидного мостика с нормальной Ь-формой Суз, введённого в положение 2, чтобы вся молекула целиком приняла и имитировала РРскладчатую структуру. В другой группе агонистов типа (Ь) сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь соединяет остатки в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например, лактамная связь, образующаяся между остатками Ьуз и С1и в спиральном повороте, или между остатком в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-распознавания и остатком в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например, лактамный мостик между Вуз и С1и в [Ьуз28,С1и32]РР25-36 (8Ер ГО Νο: 5) или [61и28,Ьуз32]РР25-36 (8ЕО ГО Νο: 6).

Агонисты типа (с) для применения по изобретению

Агонисты типа (с), к которым относится данное изобретение, можно рассматривать как димеры, по меньшей мере, последних 4 остатков С-концевых последовательностей Υ4-рецепторного распознавания, присутствующих в агонистах типа (а) и (Ь), например, димеры концевой гексапептидной последовательности или последних 5 или 4 остатков. Так, хотя С-концевая аминокислотная последовательность Υ4рецепторного распознавания, сама по себе, например, в виде гексапептида, проявляет довольно низкую аффинность к рецептору Υ4 и агонисты типа (а) и (Ь) имеют другие структурные элементы, делающие их высокоаффинными и высокоактивными лигандами, можно достичь нужной аффинности и активности, соединяя две таких С-концевых последовательности Υ4-рецепторного распознавания в димер. Возможно, причиной неожиданно высокой аффинности таких конструкций является то, что Υ4 рецептор, как многие, если не все другие 7ТМ рецепторы семейства типа А, обнаруживаются и функционируют в виде димеров в клеточной мембране (Воиу1ет, 2001, Ναι Всу Ыеигозск 2: 274-86). Поэтому, хотя аффинность к Υ4 рецептору единичной С-концевой аминокислотной последовательности Υ4- рецепторного распознавания как таковой довольно низкая, связывание одного промотора димерной формы таких последовательностей приводит в результате к очень высокой локальной концентрации другой С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания, что вызывает высокую аффинность димерного лиганда к димерному рецептору. В литературе димерные конструкции аналогов С-концевой части Ν6Υ получали в качестве антагонистов к Υ1 рецептору (Паше1з е! а1. 1995 Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 92: 9067-71). Неожиданно позже оказалось, что такие конструкции являются агонистами к Υ4 рецептору (Рагкег е! а1. 1998 Еиг. 1. Ркатшасок 349: 97-105).

Две последовательности агонистов типа (с) могут связываться, например, мостиковой связью между по меньшей мере одной парой остатков, ограниченных по меньшей мере 4 остатками на С-конце каждой из двух последовательностей. Например, две ковалентно связанные последовательности могут содержать последние 5 или последние 6 остатков С-концевой последовательности по определению выше. В одном варианте изобретения сшивание происходит за счёт пары мостиковых связей между двумя парами остатков, ограниченных по меньшей мере 4 (например, 5 или 6) остатками на С-конце каждой из двух последовательностей. Метод сшивания (связывания межмолекулярными связями) включает образование дисульфидного мостика между цистеиновыми остатками, или амидной связи между 3-аминогруппой остатка 2,3-(амино)пропионовой кислоты в одной последовательности и карбоксильной группой боковой цепи остатка в другой цепи, или сшивание за счёт мостика -(СН₂)1_-6-, образованного бис-аминокислотой ΗΘΘΟΟΗ(ΝΗ2ΧΟΗ2)|_-6ΟΗ(ΝΗ2)ΟΟΟΗ|. концы которой образуют остаток каждой соответствующей последовательности.

Примером агониста типа (с), связанного единичным дисульфидным мостиком, является:

8-Су5-ТЪг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОЫН₂ е-Суэ-ТЬг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОННг (8ЕО Ю. Νο:7)

Однако две С-концевые аминокислотные последовательности Υ4-рецепторного распознавания необязательно должны быть одинаковыми. Так, другим примером агониста типа (с), связанного единичным дисульфидным мостиком, является

5-Су8-ТЪг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОЫН_г

5-Суе-ТКг-Агд-Н1з-Агд-Туг-СОЫН₂ (ЗЕО Ιϋ. Νο:8)

Другим примером гетеродимерного агониста Υ4 типа (с) является 8-Су8-Р4-(К'-гексадеканоил)-гамма-глутамоил]-Ьу5-111г-Аг8-Ееи-Аге-Туг-СОМН2 К-Суз-Г,еи-Т11г-Агё-Геи- Ат§-Туг-СОМН₂ ($Ер Ю. Νο: 29).

- 9 012071

В данном пептиде остаток Бук введён в положение 31 в один из пептидных элементов как сайт присоединения - в данном случае- мотива связывания сывороточного альбумина.

С-концевые последовательности У4-рецепторного распознавания (Агонисты типа (а), (Ь) и (с))

Будучи Υ4 селективными, все три типа агониста, рассматриваемого в настоящем изобретении, имеют С-концевую последовательность Υ4-рецепторного распознавания, что может быть подтверждено анализами аффинности и активности по данному описанию. Одна группа предпочтительных С-концевых последовательностей Υ4-рецепторного распознавания, присутствующая в (а), (Ь) или (с) агонистах по изобретению, представлена как -Х-Тйг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)МК.¹К², где Х и X³ имеют значение по определению выше, а В¹ и К², каждый, обозначают водород. Предпочтительно также, чтобы остаток X³ не обозначал Акп, а Бук, Агд, Акр или О1и, предпочтительно, следует избегать в качестве X³ остатков. В настоящее время предпочтительно, чтобы X обозначал Рго, но X может также представлять собой Ηίκ, или неприродный аналог Рго, выбранный из 4-гидроксипролина, азетидин-2-карбоновой кислоты, азетидин3-карбоновой кислоты, азапролина и 1-аминоциклобутанкарбоновой кислоты. В С-концевой последовательности Υ4-рецепторного распознавания одним предпочтительным остатком X является Ьей.

В агонистах, которые рассматривает данное изобретение, С-концевая последовательность из 6 остатков, определяемых и обсуждаемых выше, может представлять собой конечные остатки С-концевого гексапептида, представленные как -Х^А-Х-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NК.¹К², где остаток Х^А не является основным или кислым, а последовательность ^^14^18^^18^4-64=0^^¹^² определяется и обсуждается выше. В этом случае не основный и не кислый аминокислотный остаток Х^А может представлять собой, например, Ьей, Ме1.

Кроме того, С-концевая гексапептидная последовательность в предыдущем абзаце может, сама по себе, являться конечными остатками С-концевого ундекапептида, представленного как ^^)4^^^1Х^А-Х-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NК¹К², где последовательность -Х^А-Х-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NК¹К² обсуждается в предыдущем абзаце, X^е обозначает Агд или Бук, а XΒ обозначает 11е, Ьей или Уа1. Примеры таких ундекапептидных последовательностей включают -Агд-Туг-11е-Акп-(Ъеи или Ме1)-Беи-Тйт-Агд(Рго или Н1к)-Агд-Туг-С(=0)ХН₂.

Другим примером С-концевой ундекапептидной последовательности, которая может присутствовать в агонистах по данному изобретению, является ^^4^^^1^^-04^18^^18^4С(=О)ХК¹В², где определение последовательности -Х^А-X-Тй^-А^д-X³-А^д-Ту^-С(=О)NК.¹К² дано выше, XС обозначает Ηίκ, Акп или 01п, а X^е обозначает 11е, Ьей или Уа1. Примером такой последовательности является -Н1к-Туг-(11е или Беи)-Акп-Беи-(Уа1/11е)-Тйг-Агд-(Рго или Н1к)-Атд-Тут-С(=0)ХН₂.

В одной группе РР-складчатых агонистов-миметиков, рассматриваемых в данном изобретении, типа (а) и (Ь), С-концевая последовательность, содержащая аминокислотную последовательность Υ4рецепторного распознавания, может быть слита по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанного эпитопа, и Ν-концевую аминокислотную последовательность по меньшей мере из двух аминокислот, причём указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности соединены пептидными связями с линкерным радикалом, который может представлять собой линейный или разветвлённый алкиленовый радикал, необязательно содержащий одну или более двойных или тройных связей. Например, пептидные связи линкерного радикала могут быть образованы, соответственно, карбоксильной группой и аминогруппой аминокислоты формулы ΝΗ^ΟΗ^^Ο^, где п имеет значение от 2 до 12, главным образом 6, 7, 8, 9 или 10. Так, агонист может являться аналогом ΝΓΥ. РРΥ или РР, который содержит описанный мостик Сук-Сук, но при этом его аминокислотные остатки, соответствующие 5-24 нативного пептида, замещены на аминокарбоновую кислоту с углеродной цепью, содержащей 6-10 атомов углерода, выбранную их группы, состоящей из 6-аминогексановой кислоты (ипсилонаминокапроновой кислоты), 7-аминогептановой кислоты, 8-аминооктановой кислоты, 9-аминононановой кислоты и аминодекановой кислоты. В конкретных вариантах изобретения предпочтительны 8аминооктановые кислоты (в данном описании иногда сокращённо называемые Аос). Примером такого агониста является [Сук2,Аос5- 24, О-Сук27 ]РР (8Е0 ΙΌ №: 9).

Ν-концевые последовательности ¥4-рецепторного распознавания (Агонисты типа (а) и (Ь))

В Ν-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агонистов по изобретению типа (а) и (Ь) в настоящее время предпочтительно, чтобы остаток X¹ представлял собой А1а или отсутствовал. Кроме того, в Ν-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агониста в настоящее время предпочтительно, чтобы остаток X² обозначал Ьей, 11е или 8ет.

Конкретными примерами таких Ν-концевых последовательностей являются Η₂N-А1а-Р^о-^еи-С1и- и ШХ-Рго-Беи-СЙ!-.

Агонисты типа (а) и (Ь), селективные к Υ4, к которым относится данное изобретение, можно ацилировать по их Ν-концу для того, чтобы придать резистентность к аминопептидазной активности. Например, ацилировать можно с помощью ацильного соединения с углеродной цепью, содержащей 2-24 углеродных атома, и конкретным примером является ацетилирование по Ν-концу.

Конкретные агонисты для применения по изобретению

Ниже представлены конкретные примеры агонистов для применения по изобретению:

- 10 012071 [Су52,ПСув27]- РР (8Εζ) ГО. Νο:4). [ЬуБ28_;С1и32]РР25- 36 (8Е<2 ГО. Νο:5). [С1и28,Ьуз32]РР25- 36 (5Ер ГО. Νο:6). [Суз2_;Аос5- 24,Осу£271- РР (8ЕО ГО. Νο:9). РР2-36 (8Е(2 Ш. Νο: 10).

[Ηϊε34]- РР (8Ες ГО. Νο: 11).

[А1а1,Рго34]- ΡΥΥ (8Εζ) Ιϋ. Νο:12). [А1а2,Рго34]- ΡΥΥ (8Εζ) ГО. Νο:13). [О1и4,Рго34]- ΡΥΥ (5ЕЦ ГО. Νο:Ι4).

[Аг§26,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕЦ ГО. Νο;15). [11е28,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΟ. Νο:16).

[Ме130,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕЦ ГО. Νο: 17). [А1а1,СИи4,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕЦ ГО Νο: 25). [Ν1β17]ΡΡ (8Ή(4 ΙΌ. Νο:32).

[Ν1β30]ΡΡ (8ΕΓ) ГО. Νο:33). [Ν1ε17,Ν1ε30]ΡΡ (8ЕЦ ГО. Νο:34).

[ΝΙβ17]ΡΡ2- 36 (8ΕΟ ГО. Νο:37).

[ΝΗ30]ΡΡ2-36 (8Εζ) ΙΌ. Νο:38).

[Ν1β17,ΗΪ834]- РР (8ЕЦ ГО. Νο:41).

[Ν1ε30,Ηΐε34]- РР (БЕС) ГО. Νο:42). [Ν1617,Ν1ε30,Ηίε34]- РР (8Ер ГО. Νθ:43).

[А1а30,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΟ. Νο:46). [Ьеи34]- РР (8ЕЦ Ю. Νο:51).

[Не34]- РР (8ΕΟ Ш. Νο:52).

[Рйе34]- ΡΡ (8Εζ) ГО. Νο:53).

[Ьу513]РР2- 36 (8Ε<3 ГО Νο: 54)

- 11 012071

Б-Суа-ТПг-Апд-Рго-Агд-Туг-СОЫНг

8-Суб-ТЬг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОЫНг(ЗЕО (ϋ. Νο:7).

8<у5-1еи-ТЪг-Агд-Рга-Агй-Туг-С0МН₂

3-Сув-Сеи-Тйг-Агд-Рго-Агд-Туг-С0МН₂ (ЗЕО Ю. Νο:18).

$-Су5<еи-ТНг-Агв-Н!б-Агд-Туг-СОМН_г

3“Суе4ли-Т1тг-Агд-Н(5-Агд-Туг-С0ЫН₂ (8ЕО10. Ν0.Ί9).

5-Су5-1еи-Ткг-Агд-кеи-Агд-Туг-С0ЫН₂

5-Су5-1еи-ТЬг-Агд-кеи-Агв*Туг-С0ЫН₂ (ЗЕО Ю. Νο: 49).

З-Суз-Ьеи-ТЪг-Агд-Пе-Агд-Туг-СОЫНг

З-Суз-ЬеЦ'ТЪг-Ав-Ив-Агд-Туг-СОМНа (ЗЕО Ю. Νο: 50).

Ν- Ацетил- РР (8Е<) ГО. Νο:30).

Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- РР (8ЕГ) ГО Νο: 31).

μ·4-( ιν - гексадеканоил)- гамма- глутамоил - ьув^Г'иезищг (лыу 1Ь> гчо: оо).

[Ν-(Ν’- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил - Ьуз13]РР2-36 (8ЕС) Ш Νο: 39).

[Ν-(Ν- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Буз13,Н1534]-РР (8Εζ) ГО Νο: 44).

[Ν-(Ν’- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил - Бу513,А1а30.Рго34]-Р¥У (ЗЕО ГО

Νο: 47).

[Суз2,М- (Ν’- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Г.уя13.ПСук27]- РР (8ЕГ) ГО Νο:

48).

[Ν- (8- (8-гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)- [Ьуз13]РР2- 36 (5Е<2 ГО Νο: 55)

8-Су5-[Ы-Щ’-гексадеканоил)-гамма-глутамоил]-Еу5-Т11г-Аг8-Ьеи-Агё-Туг-СОНН2

З-Суз-Ьеи-ТЬг-Агв-Беи-Агй-Туг-СОННг (8ЕЦ ГО. Νο: 29).

[Ν-{(Α13- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а)3}- Еуз13]РР (8ЕО ГО Νο: 36) [Ν-{(Α13- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а)3}- Ьуз13]РР2-36 (8Е0 ГО Νο: 40) [Ν-{(ΑΙδ- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а)3}- Еуз13,Н1534]РР (ЗЕО ГО Νο: 45) и их аналоги с консервативными заменами.

Особенно предпочтительными У4-селективными агонистами для применения по настоящему изобретению являются РР2-36, [Ηίδ34]-ΡΡ (8Е0 ГО Νο: 10) или [Су82,ПСу827]-РР (8Е0 ГО. Νο:4) и их аналоги с консервативными заменами.

Агонисты, пригодные для применения по данному изобретению

До настоящего времени основные У4-селективные агонисты для применения по настоящему изобретению были описаны в целом и приводились конкретные примеры таких агонистов. Однако такие агонисты, включая специфически идентифицированные агонисты, можно подвергнуть различным модификациям с целью улучшения их фармакокинетических, фармакодинамических и метаболических свойств. Такие модификации могут включать связывание агониста с функциональными группами (также известными как мотивы), известными сами по себе в технике пептидных или белковых фармацевтических веществ. Три конкретные модификации, дающие конкретное преимущество в случае агонистов, которые рассматривает настоящее изобретение, вне зависимости от типа (а), (Ь) или (с), представляют собой мотивы связывания с сывороточным альбумином, или мотивы связывания гликозаминогликана (ОАО), или ПЭГилирование.

Также, хотя РР исключён из употребления по данному изобретению, применение РР с такими модификациями не исключается.

Мотивы связывания с сывороточным альбумином

Мотивы связывания с сывороточным альбумином (мотивы, связывающие сывороточный альбумин) обычно являются липофильными группами, вводимыми для того, чтобы способствовать продолжитель

- 12 012071 ному пребыванию в организме после введения, или по другим причинам, которые могут связываться различными известными способами с пептидными или белковыми молекулами, например, 1) ковалентной связью, например, с помощью функциональной группы в боковой цепи аминокислотного остатка, и) за счёт функциональной группы, встроенной в пептид или в подходящим образом дериватизированный пептид, ш) в виде единого участка пептида. Например, в Международной заявке XVО 96/29344 (Νονο Ыогбщк Л/8) и в статьях Р. КиГОйаН с1 а1. 1995 Вюсйет1са1 1. 312: 725-31 описан ряд подходящих липофильных модификаций, которые можно использовать для агонистов, которые рассматриваются в данном изобретении.

Подходящие липофильные группы включают необязательно замещённые, насыщенные или ненасыщенные, линейные или разветвлённые углеводородные группы, содержащие 10-24 углеводных атома. Такие группы могут образовывать целую боковую цепь или часть боковой цепи в каркасе агониста, например, за счёт простой эфирной, тиоэфирной, амино-, сложноэфирной или амидной связи с боковой цепью аминокислотного остатка скелета, или с углеродным атомом скелета или боковой цепи каркаса (скелета) непептидного линкерного радикала в скелете РР-складчатого миметика-агониста. Химический способ присоединения липофильной группы не важен, но приведённые боковые цепи, включающие липофильные группы, являются примерами групп, которые могут связываться со скелетным углеродом агониста или его подходящего ответвления:

СНз(СН₂)пСН(СООН)МН- СО(СН₂)₂СОКН-, где η обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)_ГСО- ХНСН(СООНХСН₂)₂СОКН-, где г обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂),СО- МНСН((СН₂)₂СООН)СОМН-, где в обозначает целое число от 9 до 15,

СП АСН₂)_1ПСОХ1ЬХ, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-№1СОСН((СН₂)₂СООН)ХН- СО(СН₂)_РСН₃, где р обозначает целое число от 10 до 16, -КНСО(СН₂)₂СН(СООН)Ш- СО(СН₂)_ЯСН₃, где я обозначает целое число от 10 до 16, СНз(СН₂)_лСН(СООН)А1НСО-, где η обозначает целое число от 9 до 15,

СНз(СН₂)_рК1НСО-, где р обозначает целое число от 10 до 18, -СО>Я1СГГ('СООП)(СТ{₂)₄№1- СО(СН₂)_тСНз, где т обозначает целое число от 8 до 18, -СОШСН(СООН)(СН₂)₄ИН- СОСН((СН₂)₂СООН)ИН- СО(СН₂)рСНз, где р обозначает целое число от 10 до 16,

-СОМНСН(СООН)(СН₂)4ИН- СО(СН₂)₂СН(СООН)МН-СО(СН₂)_ЧСН₃, где я обозначает целое число от 10 до 16, и

частично или полностью гидрированный циклопентанофенантреновый скелет.

В одном методе химического синтеза боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой С₁₂, С₁₄, С₁₆ или С1₈ацильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи каркасного остатка агониста.

Как указывалось, модификация агонистов с для применения с целью улучшить характеристики связывания с сывороточным белком является методом, который можно применять в целом и, в частности, в случае специфических агонистов, перечисленных выше. Модифицированные вышеописанным способом агонисты включают агонист [тетрадеканоил-А1а1]-РР (8ЕЦ ΙΌ Νο: 20) или [тетрадеканоил-А1а1, Ηί§34]РР (НЕС) ΙΌ Νο: 21).

САС-связывание

Как и в случае липофильных мотивов связывания с сывороткой, обсуждавшегося выше, агонисты, рассматриваемые в данном изобретении, можно модифицировать, вводя мотив ОАО связывания в качестве боковой цепи, или участка боковой цепи скелета агониста. Известные ОАО-связывающие мотивы для введения таким способом включают аминокислотные последовательности ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток. Несколько, например, три таких последовательности можно ввести с образованием конкатамерных (линейная цепь) или дендримерных (разветвлённая цепь) мотивов. Специфические конкатамерные ОАО мотивы включают А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а и А1а-АгдАгд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а (каждый из которых может, например, соединяться амидной связью, образующейся между С-концом конкатамерного мотива ОАО-связывания и аминогруппой в боковой цепи аминокислоты в каркасе агониста, такой как ипсилон-аминогруппа [Еу818,Н1834]-РР (8ЕЦ ГО Νο: 22) или [Ьу518]РР (8ЕЦ ГО Νο: 23).

Вместо того, чтобы присоединяться к агонисту в виде боковой цепи, или части боковой цепи каркасного остатка, ОАО мотив может ковалентно связываться с С- или (предпочтительно) с Ν-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал. В этом случае ОАО-связывающий мотив

- 13 012071 может также содержать аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток, например, последовательность [ХВВВХХВХ]_П, где η обозначает число от 1 до 5, В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток. Такие конкатамерные повторы имеют тенденцию образовывать альфа-спирали, когда они связываются с ОАО, и, соответственно, когда они связываются с С-концевым гексапептидом/последним альфа-спиральным поворотом, они могут стабилизировать этот поворот и, тем самым, презентировать объединённую структуру оптимальным образом для У4-рецепторного распознавания. Конкретными примерами агонистов такого типа являются [ХВВВХХВХ-ХВВВХХВХ]РР или [ХВВВХХВХ-ХВВВХХВХ-ХВВВХХВХ]РР, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток, в частности, А1а-АгдАгд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-РР (8ЕО ΙΌ Νο: 24).

Υ4 селективные агонисты, к которым относится настоящее изобретение, применимы, среди прочего, при тех показаниях, когда желательна пролонгированная экспозиция, для терапевтического ангиогенеза. В частности, при таких показаниях агонисты, предпочтительно, содержат мотив, связывающий гликозаминогликан (ОАО), обсуждавшийся выше. Такие мотивы гарантируют, что агонисты связываются с ОАО во внеклеточной матрице, и тем самым обеспечивают пролонгированную локальную экспозицию Υ рецепторов в этой ткани. Факторы роста, хемокины и т.д. связываются с ОАО за счёт участков основных аминокислот, которые взаимодействуют с кислыми сахарами ОАО. Эти положительно заряженные эпитопы на факторах роста обычно состоят из боковых цепей основных остатков, которые в последовательности необязательно расположены последовательно (друг за другом), но часто находятся в непосредственной близости за счёт элемента вторичной структуры, такого как α-спираль или поворот, или за счёт общей трёхмерной структуры белка. Описаны некоторые ОАО-связывающие линейные последовательности, обсуждавшиеся выше, например, ХВВХВХ и ХВВВХХВХ где В представляет собой основной остаток (Нйешап е! а1. Вюаккаук 1998, 20: 156-67). Методом кругового дихроизма было показано, что эти сегменты при связывании с ОАО образуют α-спирали. Если такие последовательности помещены, например, в конкатамерную или дендримерную конструкцию, где присутствует три таких последовательности, например, каждая в виде АКККААКА последовательности, результирующий 24-мерный пептид, например, АКККААКА-АКККААКА-АКККААКА-гарантирует сохранение во внеклеточной матрице, аналогичной высокомолекулярному полилизину, т.е. он не вымывается в течение 4-часового вливания (8акйагоу е! а1. ЕЕВ8 Ьей 2003, 27:6-10).

Таким образом, факторы роста и хемокины естественно (в природе) создаются с двумя типами связывающих мотивов: один мотив связывания рецептора, с помощью которого осуществляется сигнальная трансдукция, и один мотив связывания с ОАО, с помощью которого достигается присоединение и пролонгированная локальная активность. Пептиды, такие как ΝΡΥ и РР, являются нейропептидами и гормонами, которые достаточно быстро вымываются из ткани, а не оптимизируются для пролонгированной активности. Присоединяя ОАО-связывающий мотив к Υ4 селективному агонисту по настоящему изобретению или к классическому известному пептидному агонисту ΡΥΥ3-36, создают бифункциональную молекулу, аналогичную факторам роста и хемокинам, содержащую как эпитоп, ответственный за связывание с рецептором на РР-складчатом пептидном участке, так и ОАО-связывающий мотив.

Как уже обсуждалось выше, в предпочтительном варианте изобретения ОАО-связывающий мотив, например, приведённую выше 24-мерную последовательность, помещают в виде Ν-концевого расширения Υ4-селективного агониста. Это местоположение особенно интересно для усечённых по Ν-концу РРскладчатых миметиков-агонистов. Хотя они представлены в данном описании как Υ4- селективные, они могут проявлять немного пониженную аффинность или активность к Υ4 рецептору по сравнению с нативным РР. Таких усечённые РР-складчатых агонистов-миметиков может быть выгодно удлинять с помощью ОАО-связывающего мотива, так как при связывании с ОАО он образует α-спираль, которая может способствовать стабилизации спирального участка и, тем самым, презентировать дальний Сконцевой сегмент корректным образом.

Другим подходящим положением для введения ОАО-связывающего мотива, такого как основная конкатамерная или дендримерная конструкция- РР-складчатых пептидов является положение 14 для ΝΡΥ пептидов и их аналогов, и положение 13 для ΡΥΥ и РР пептидов. Однако, как обсуждалось выше, остаток, содержащий ОАО-связывающий мотив, можно ввести в любое положение в агонистах при условии, что это введение согласуется с сохранением РР-складчатой структуры, требуемой в агонистах типа (а) и (Ь), рассматриваемых в данном изобретении, и нужной С-концевой последовательностью Υ2распознавания. Так, ОАО-связывающий мотив в качестве части спейсерной конструкции можно поместить в аналоги, в которых часть РР-складки замещена на непептидный спейсер.

ПЭГилирование

При ПЭГилировании полиалкиленоксидный радикал или радикалы ковалентно связывае(ю)тся с пептидными или белковыми лекарствами с целью увеличения эффективного периода полужизни в организме после введения. Термин происходит от названия предпочтительного полиалкиленоксида, приме

- 14 012071 няемого в таких процессах, а именно, образованного из этиленгликоля полиэтиленгликоля, или ПЭГ (РЕС).

Подходящий радикал ПЭГ может присоединяться к агонисту любым подходящим химическим методом, например, за счёт каркасного аминокислотного остатка агониста. Например, в случае молекулы, подобной ПЭГ, в качестве присоединяющей группы часто применяется ипсилон-аминогруппа лизина или Ν-концевая аминогруппа. Другие присоединяющие (встраивающие) группы включают свободную карбоксильную группу (например, свободная карбоксильная группа С-концевого аминокислотного остатка или остатка аспарагиновой или глутаминовой кислоты), подходящим образом активированные карбонильные группы, меркаптогруппы (например, меркаптогруппы цистеинового остатка), остатки ароматических кислот (например, Рйе, Туг, Тгр), гидроксигруппы (например, гидроксигруппы в 8ег, ТЬг или ОН-Ьук), гуанидин (например, Агд), имидазол (например, Ηίκ) и фрагменты окисленных углеводов.

Если агонист является ПЭГилированным, он обычно содержит 1-5 молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ), например, 1, 2 или 3 молекулы ПЭГ. Каждая молекула ПЭГ может иметь молекулярную массу, примерно от 5 кДа (килоДальтон), примерно, до 100 кДа, например, молекулярная масса составляет около 10-40 кДа, около 12 кДа или, предпочтительно не более 20 кДа.

Подходящие молекулы ПЭГ выпускаются фирмами 811еагна1ег Ро1утегк, Шс. и Εηζοη, Шс., и их можно выбрать из 88-РЕС, ИРС-РЕС, альдегид-ПЭГ, тРЕС-8РА, тРΕС-8СΜ, тРЕС-БТС, 8С-РЕС, трезилированный тРЕС (Патент США 5880255), или оксикарбонил-окси-И-дикарбоксиимид-ПЭГ (Патент США 5122614).

Сывороточный альбумин, САС и ПЭГ

Вне зависимости от того, осуществляется ли модификация агониста за счёт присоединения групп для того, чтобы способствовать связыванию сывороточного альбумина, САС-связыванию, или чтобы повысить устойчивость с помощью ПЭГилирования, мотив связывания сывороточного альбумина, или мотив САС-связывания, или ПЭГ радикал может являться боковой цепью или образовывать часть боковой цепи при каркасном углероде агониста, соответствующем любому из следующих положений РУУ или РР: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32, или соответствующем любому из следующих положений ИРУ: 1, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.

В частности, если агонист является агонистом типа (Ь), мотив связывания с сывороточным альбумином, или САС-связывающий мотив, или ПЭГ радикал может также представлять собой боковую цепь или часть боковой цепи при каркасном углеродном атоме, соответствующем любому из следующих положений РУУ, ИРУ или РР:2, 5, 8, 9, 13, 14, 20 и 24.

Конъюгация с биомолекулами большего размера

Как описывается выше, можно присоединять некоторые мотивы в различных положениях в РРскладчатом пептиде или РР-складчатом пептиде-миметике, не ослабляя их высокую Υ-рецепторную аффинность (см. примеры). Аналогичным образом селективные в отношении Υ4 рецептора агонисты можно использовать в качестве химерных (гибридных, слитых) белков, в которых они связаны, например, с альбумином или молекулой другого белка или носителя, что обеспечивает благоприятную фармакокинетику или другие свойства, например пониженное выведение почками. Как известно в технике, существует множество химических модификаций и линкеров, которые можно использовать для такого ковалентного связывания, так же как можно использовать множество белков или носителей. Особенно предпочтительно ковалентное присоединение селективного Υ4 пептидного агониста к альбумину и в одном из положений РР-складчатой структуры, которое указано в другом месте данного описания в связи с модификациями с помощью различных мотивов. Такие гибридные белки можно получать различными полусинтетическими методами, когда пептид можно получать пептидным синтезом по данному описанию, а биомолекулу - методом рекомбинантной ДНК. Гибридный белок можно также получать целиком как рекомбинантную молекулу, экспрессированную, например, в виде молекулы-предшественника, удлинённую за счёт последовательности С1у-Ьу5-Агд, которая, будучи экспрессирована в виде секреторного белка в эукариотических клетках, отщепляется биосинтетическими ферментами и С1у превращается в карбоксамид на С-концевом остатке Туг С-концевой последовательности Υ4-рецепторного распознавания.

Стабилизация

Как указывается в разных местах в данном описании, многие из селективных Υ4 агонистов по настоящему изобретению стабилизируются различными способами, например, Ν-концевым ацилированием или замещением каркасных участков агониста на непептидный линкер, или внутренней циклизацией за счёт мостиковых связей для стабилизации РР-складчатой структуры. Эта стабилизация в большинстве случаев служит двум целям, причём одной целью является презентировать эпитопы рецепторного распознавания оптимальным образом в отношении Υ4 рецепторов за счёт сохранения РР-складки; а второй целью является стабилизация пептида против расщепления, т.е., главным образом, против протеолитического расщепления. Это особенно важно, когда селективные Υ4 агонисты также модифицированы для того, чтобы продлить период полужизни, достичь пролонгированного высвобождения и/или продолжительной экспозиции с тканями, за счёт присоединения различных мотивов, обсуждавшихся выше.

- 15 012071

Обычно пептидные агонисты очень быстро выводятся, главным образом, через почки, и устойчивость белка как таковая может быть неважна; однако, когда присутствие пептида в различных жидкостях организма продлевается одним или более способами на несколько часов, особенно важно, чтобы биологическая активность пептида также оставалась интактной, т.е. чтобы пептид стабилизировался в форме, устойчивой к протеолитическому воздействию, описанному как вообще, так и в отношении специфических примеров селективных Υ4 пептидных агонистов, например, РР-складчатых стабилизированных, циклических |Су52.О-Су527|РР и их различных аналогов. Так, в предпочтительных вариантах изобретения Υ4-селективные агонисты как стабилизированы структурно, с помощью структурных изменений, некоторые из них конкретно указаны в представленных ниже примерах, так и декорированы различными мотивами и/или слиты с биомолекулами и/или приготовлены фармацевтическими методами, которыми добиваются продолжительного высвобождения и т.д., для пролонгированной экспозиции с рецептором.

Пептиды, индуцирующие спираль

Ацилирование по Ν-концу агонистов, которые рассматривает данное изобретение, упоминалось как способ стабилизации агониста против действия аминопептидаз. Другая стабилизирующая модификация включает ковалентное связывание стабилизирующей пептидной последовательности из 4-20 аминокислотных остатков ковалентно на Ν- и/или С-конце, предпочтительно на Ν-конце. Аминокислотные остатки в таком пептиде выбирают из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, Тйг, Туг, Аки, О1и, Акр, О1и, Бук, Агд, Н1к, Ме1 и т.д. В представляющем интерес варианте изобретения присоединяемый Ν-концевой пептид содержит 4, 5 или 6 остатков Бук, например, Бук-Бук-Бук-Бук-Бук-Бук-РР или Бук-Бук-Бук-Бук-БукБук-[Н1к34]РР. Они могут присоединяться на Ν-конце РР-складчатого пептидного агониста или они могут быть помещены на Ν-конце усечённого по Ν-концу РР-складчатого агониста-миметика, или укороченного на Ν-конце РР-складчатого агониста-миметика, если спейсерный пептид вводится между новым Ν-концом стабилизирующего пептида. Такие модификации особенно интересны, так как нить из остатков Бук имеет тенденцию образовывать альфа-спиральную структуру и побуждать к этому последующие остатки, что, как обсуждалось выше, является выгодным для презентирования последнего спирального поворота и С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания селективных Υ4 пептидных агонистов по настоящему изобретению. Общее описание таких удлинений (расширений) стабилизирующего пептида дано в Международной заявке \¥О 99/46283 (2еа1аиб Рйагтасеийса1к), которая вводится в данное описание в качестве ссылки.

Рецепторные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, можно получать общеизвестными методами, например синтетическими, полусинтетическими и/или методами рекомбинантной ДНК. Способы включают стандартные методы получения пептидов, такие, например, как синтез в растворе и твердофазный синтез. Руководствуясь учебником и общими знаниями в данной области техники, специалист в этой области поймёт, как получать агонисты и их производные и модификации.

Далее описаны конкретные агонисты по изобретению наряду с их молекулярными фармакологическими свойствами, а также химическими свойствами и описанием устойчивости пептидов.

Ν- Ацетил- РР (8Εζ) ГО. Νο:30), Ν- (Ν'- гекса деканои л)- гамма- глутамоил₽Р (8ЕЦ ГО Νο: 31), [Ν1ε17]ΡΡ (8Е<> ГО. Νο:32), [МеЗО]РР (8Еф ГО. Νο:33), [Ν1ε17,Ν1β30]ΡΡ (8Е() ГО. Νο:34), [Ν-( Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил - Ьу813,Ме30]РР (8ЕЦ ГО Νο: 35), [Ν- {(А1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- АгдА1а)3}- Еу$13]РР (8Е<2 ГО Νο: 36)

Эти пептиды иллюстрируют применимые варианты или аналоги эндогенного Υ4 агониста РР. ΝАцетил-РР и №(№-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-РР являются аналогами РР, который модифицируют по альфа-аминогруппе, вводя защиту против протеолитического расщепления аминопептидазами. В случае [№(№-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-Бук13,Ше30]РР мотив (№-гексадеканоил)-гамма-глутамоил в то же время составляет мотив связывания сывороточного альбумина, который гарантирует пролонгированный эффективный период полужизни (Т1/2). [Ше17]РР, [Ме30]РР, [Ν^17, Ше30]РР представляют собой аналоги, в которых остатки Ме1 в РР2-36, замещены на неокисляющийся в данном случае неприродный остаток норлейцина (ΝΚ). Вследствие большого структурного сходства между Ме1 и Ме эта замена не изменяет высокой Υ4 рецепторной аффинности и селективности. [№(Ц'-тетрадеканоил)-гаммаглутамоил-Бук13]-РР и [№{(А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а)3}-Бук13]РР представляют собой аналоги РР, в которых мотивы соединяются в таком порядке, чтобы осуществлялось связывание с сывороточным альбумином и т.д. и тем самым пролонгированный эффективный период полужизни (Т1/2), и связывание с ОАО и тем самым замедление высвобождения из места инъекции и/или продолжительная локальная Υ4-рецепторная экспозиция вследствие пролонгированного присутствия в ткани - в обоих случаях мотивы присоединяются к остатку Бук, введённому в положение 17.

Благодаря тому, что остаток Бук, и тем самым также различные мотивы, вводится в структуре далеко от места распознавания пептидов Υ рецепторами, эти модификации не влияют на высокую Υ4 аффинность и селективность основного пептида. Как представлено в другом месте данного описания, другой

- 16 012071 полезной заменой могло бы быть, например, ПЭГилирование. Эти аналоги РР являются представителями одной группы - в данном случае такой, где сохраняется основная РР структура, за исключением тех случаев, когда вводятся сайт(ы) присоединения различных мотивов - из многих различных групп агонистов по данному описанию, высокоселективных к Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2, из которых можно выбирать соединения для лечения заболеваний, откликающихся на Υ4 агонист, таких как ожирение, секреторная диарея, воспалительное заболевание кишечника и т.д. Все эти соединения являются новыми.

РР2- 36 (8ЕО ГО Νο: 10)

Этот пептид является пептидом типа (а), который представляет РР аналоги с Ν-концевой аминокислотной последовательностью Υ4 рецепторного распознавания, в котором отсутствует остаток номер 1. РР2-36 является высокоселективным агонистом с повышенной, по сравнению с РР1-36, устойчивостью. Обычно РР является субстратом для расщепления с помощью ΌΡΡ-ΐν, так как он содержит Рго в положении 2. Таким образом после удаления первого остатка из РР образуется пептид, в котором РР структура не подвергается риску, так как между остатком 1 (А1а1) и антипараллельной спиралью не возникает никаких взаимодействий (за этим следит Рго2) и так как РР2-36, более не пептид дикого типа, является субстратом для ΌΡΡ-ΐν. Важно, что Υ4 рецептор не зависит от присутствия остатка в положении 1, в отличие от рецептора Υ1, который зависит от присутствия остатка в положении 1. Так, РР2-36 является как более устойчивым пептидом, так и селективным Υ4-рецепторным агонистом с улучшенным интервалом селективности относительно Υ1.

Профиль рецепторного распознавания РР2-36 связывается с Υ4 рецептором с аффинностью 1С₅₀ = 0,64 нМ, сходную с аффинностью РР, 1С₅₀ = 0.41 нМ. Аффинность РР2-36 к Υ1 и Υ2 рецепторам составляет > 1000 нМ (табл. 1). РР2-36 ведёт себя как агонист Υ4 рецептора с активностью 0.64 нМ (ЕС₅₀ = 0.85 нМ), измеряемой в анализе с обменом инозитфосфатов, осуществляемым в трансфецированных клетках СО8-7, как описано в экспериментальной части (табл. 2). Как РР2-36, так и РР являются лигандами с низкой активностью к Υ2 рецептору, т.е. с величиной > 1000 нМ. Однако к Υ1 рецептору РР2-36 проявляет активность в 3-4 раза ниже активности РР, величина ЕС₅₀ равна 297 по сравнению с 83 нМ (табл. 2). Таким образом, РР2-36 является высокоселективным агонистом Υ4 с разницей между ним и Υ1 и Υ2 рецепторами > 300 раз, как определено функциональным ίη νίίτο анализом.

Устойчивость белка - РР2-36 имеет преимущество перед РР1-36, а именно, он более устойчив и, следовательно, является лучшим биофармацевтическим агентом, так как он не является субстратом для ΌΡΡίν - как РР, благодаря присутствию остатка Рго в положении 2- и так как новый Ν-концевой остаток Рго в РР32-36 предотвращает расщепление большинством других аминопептидаз. Эти свойства устойчивости особенно полезны в том случае, когда продолжительного пребывания пептида в жидкостях организма достигают различными способами, такими как модификации пептида как такового с использованием мотивов, или различными фармацевтическими методами, такими как препараты пролонгированного действия.

Ιη νΐνθ действие на скорый приём пищи

Либо физиологический раствор, либо РР2-36 в виде единичных подкожных инъекций группам из 8 мышей в дозах 1 и 10 мкг на животное после 16-часового перерыва в еде. На фиг. 2 показано суммарное потребление пищи мышами в течение 8 ч. Селективный Υ4-рецепторный агонист, РР2-36, ингибирует потребление пищи в течение первых 20 мин после начала еды, примерно на 50% по сравнению с пищей, которую проглатывают животные из группы, получающей физиологический раствор. 50% супрессивное действие на потребление пищи наблюдается также, когда его определяют в течение первого полного часа. Действие 1 мкг и 10 мкг РР2-36 довольно схоже. Супрессивное действие РР2-36 сохраняется в течение полных 8 ч после единичной подкожной инъекции (фиг. 2). Таким образом, РР2-36, высокоселективный к Υ4 рецептору по сравнению с Υ2 и Υ1 рецепторами, является эффективным супрессором потребления пищи у мышей, что ранее было продемонстрировано для РР (Акака^а е! а1. Рерйбек 1999, 20; 14458; Акака^а е! а1. Сак1гоеп1его1оду 2003,124: 1325-36). Ранее было показано, что этот эффект РР также наблюдается у здоровых людей (Вабегйат е! а1. 2003 Сбп. Епбосппо1. Ме1аЬ. 88: 3989-92), так же как у пациентов, страдающих вызванным болезнью ожирением (ВегЩкоп е! а1 1993 Рерббек 14: 497-503).

[Ме17]РР2- 36 (8ЕЦ ГО. Νο:37), [Ν1ε30]ΡΡ2-36 (8ЕЦ ГО. Νο:38), [Ν-(Ν'тетрадеканоил)- гамма- глутамоил - Ьу513]РР2-36 (8Е<? ГО Νο: 39), [Ν{(А1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а)3}- Ьуз13]РР2-36 (8Е(/ ГО Νο: 40)

Эти пептиды иллюстрируют применимые варианты или аналоги одного из примеров высокоселективных Υ4 рецепторных агонистов типа (а) РР2-36. |П1е17]РР2-36 и |П1е30]РР2-36 представляют собой аналоги, в которых остатки Ме! в РР2-36 замещены на неокисляющийся в данном случае неприродный остаток норлейцина (ΝΚ). Вследствие большого структурного сходства между Ме! и ΝΕ эта замена не меняет высокой Υ4 рецепторной аффинности и селективности. |Л-(№-тетрадеканоил)-гамма-глутамоилЬук13]-РР2-36 и |Н-{(А1а-Аг8-Агд-Аг8-А1а-А1а-Агд-А1а)3;-ЕукЕ3|РР2-36 представляют собой аналоги РР2-36, в которых мотивы соединяются в таком порядке, чтобы осуществлялось связывание с сывороточным альбумином и т.д. и тем самым пролонгированный эффективный период полужизни (Т1/2), и

- 17 012071 связывание с САС и тем самым замедленное высвобождение из места инъекции и/или продолжительная локальная У4-рецепторная экспозиция вследствие пролонгированного присутствия в ткани - в обоих случаях мотивы присоединяются к остатку Ьу8, введённому в положение 17. Благодаря тому, что остаток Ьу§ - и тем самым также различные мотивы - вводится в структуре далеко от места распознавания пептидов Υ рецепторами, эти модификации не влияют на высокую Υ4 аффинность и селективность основного пептида. Как представлено в другом месте данного описания, другой полезной заменой могло бы быть, например, ПЭГилирование. Эти аналоги РР2-36 являются представителями одной группы из многих различных групп агонистов по данному описанию, высокоселективных к Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2, из которых можно выбирать соединения для лечения заболеваний, откликающихся на Υ4 агонист, таких как ожирение, секреторная диарея, воспалительное заболевание кишечника и т.д. Все эти соединения являются новыми.

[Ηί$34]-РР (8Е(? ГО. Νο: 11), [Ъеи34]-РР (8ЕО ГО. Νο:51), [Не34]-РР (8Е(?

ГО. Νο:52), [РЬе341- РР (8ЕО ГО. Νο:53).

Эти пептиды представляют собой группу высокоселективных Υ4 рецепторных агониста, являющихся РР аналогами, имеющими замены в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4 рецепторного распознавания, в этих предпочтительных случаях - единственную замену в положении 34, который обычно является остатком Рго. Замещённые в положении 34 аналоги РР составляют одну из многих различных групп агонистов по данному описанию, высокоселективных к Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2, из которых можно выбирать соединения для лечения заболеваний, откликающихся на Υ4 агонист, таких как ожирение, секреторная диарея, воспалительное заболевание кишечника и т.д. Все эти соединения являются новыми.

Профиль рецепторного распознавания

Как показано в табл. 1, замена природного Рго34 на другой остаток, что видно на примере [Нк34]РР2-36, не ослабляет аффинности к Υ4 рецептору, так как [Нк34]РР2-36 связывается с Υ4 рецептором с высокой аффинностью (1С₅₀ = 0,48 нМ), сходную с аффинностью РР, (1С₅₀ = 0,41 нМ). Важно, что аффинность [Нк34]РР к Υ1 и Υ2 рецепторам не является измеримой величиной (1С₅₀ > 1000 нМ). Таким образом, он является высокоселективным лигандом к Υ4 рецептору в отличие от Υ1 и Υ2 рецепторов. [Нк34]РР ведёт себя как агонист к Υ4 рецептору с активностью 1,2 нМ (ЕС₅₀), которая очень близка активности РР (ЕС₅₀ = 0,64 нМ), измеряемой в анализе с обменом инозитфосфатов (табл. 2). Как и РР, [Нк34]-РР проявляет низкую активность к Υ2 рецептору, т.е. величина ЕС₅₀ > 1000 нМ. Однако, к Υ1 рецептору [Нк34]-РР проявляет активность намного более низкую, чем активность РР, а именно, значения ЕС₅₀ > 1000 нМ для [Нк34]-РР по сравнению с 83 нМ для РР (табл. 2). Таким образом, [Нк34]-РР высокоселективным Υ4 агонистом с разницей между ним и Υ1 и Υ2 рецепторами > 1000 раз, как определено функциональным ίη νίΐτο анализом.

Устойчивость белка - Устойчивость белка [Нк34]-РР аналогична устойчивости РР. [Ме17,Н1834]- РР (8ЕЦ 1В. Νο:41), [Ν1ε30,ΗΪ534]- РР (8Е(? ГО. Νο:42), [Ν1β17,Ν1ε30,ΗΪ534]- РР (8Е<> Ιΰ. Νο:43), [Ν-(Ν’- тетрадеканоил)- гаммаглутамоил- Ьуз13,Н|!>34]-РР (8ЕЦ ГО Νο: 44), [Ν- {(А1а- Аг£- Аг§- Аг«- А1аА1а- Ат§- А1а)3}- Ьу813,Нк34]РР (8Е(? ГО Νο: 45)

Эти пептиды иллюстрируют применимые варианты или аналоги одного из примеров высокоселективных Υ4 рецепторных агонистов типа (а), характеризующегося заменой в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4 распознавания, в данном случае - в положении 34, и в данном конкретном случае это [Нк34]-РР. [Ы1е17, Нк34]-Р, |Н1е30.Н|534|-РР и |Н1е17.Н1е30.Н|534|-РР представляют собой аналоги, в которых один или оба остатка Ме1 в [Нк34]-РР замещены на неокисляющийся в данном случае неприродный остаток норлейцина (Ы1е). Вследствие большого структурного сходства между Ме1 и ΝΚ эта замена не меняет высокой Υ4 рецепторной аффинности и селективности. [М-(М'-тетрадеканоил)-гаммаглутамоил-Ьу813Нк34]-РР и [Ы-{(А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а)3}-Ьу813-Нк34]РР представляют собой аналоги [Нк34]-РР, в которых мотивы соединяются в таком порядке, чтобы осуществлялось связывание с сывороточным альбумином и т.д. и тем самым пролонгированный эффективный период полужизни (Т1/2), и связывание с САС и тем самым замедленное высвобождение из места инъекции и/или продолжительная локальная экспозиция с Υ4-рецептором вследствие пролонгированного присутствия в ткани - в обоих случаях мотивы присоединяются к остатку Ьук, введённому в положение 17. Благодаря тому, что остаток Ьук, и тем самым также различные мотивы, вводится в структуре далеко от места распознавания пептидов Υ рецепторами, эти модификации не влияют на высокую Υ4 аффинность и селективность основного пептида. Как представлено в другом месте данного описания, другой полезной заменой могло бы быть, например, ПЭГилирование.

Эти аналоги [Нк34]-РР являются представителями одной группы из многих различных групп агонистов по данному описанию, высокоселективных к Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2, из которых можно выбирать соединения для лечения заболеваний, откликающихся на Υ4 агонист, таких как ожирение, секреторная диарея, воспалительное заболевание кишечника и т. д. Все эти соединения являются новыми.

- 18 012071 [А1а1,Рго34]- ΡΥΥ (8Е(? ΙΒ, Νο:12), [А1а2,Рго34]- ΡΥΥ (8ΕΟ ΙΒ. Νο:13), [01114,Ργο34]- ΡΥΥ (8Εφ ΙΒ. Νο:14), [А1а1,С1и4,Рго34]- ΡΥΥ (8Ε(} ΙΒ Νο: 25).

Эти пептиды являются селективными агонистами типа (а) к Υ4 рецептору, представляющие собой аналоги ΡΥΥ, в которых С-концевая аминокислотная последовательность Υ4 распознавания вводится с помощью замены Рго34 на С-конце ΡΥΥ и в которых селективность к Υ1 рецептору повышена за счёт замен(ы) в Ν-концевой аминокислотной последовательности распознавания Υ-рецептором, т.е. либо за счёт замены А1а1 вместо Туг, замены А1а2 вместо Рго или замены 61и4 вместо Ьу8. В [А1а1,61и4,Рго34]ΡΥΥ сделаны две замены в Ν-концевом сегменте. [Ту^1,Ρ^о34]-ΡΥΥ представляет собой другой пептид, который также повышает селективность пептида к Υ1 рецептору. Эти аналоги [Ρ^о34]-ΡΥΥ являются членами одной группы из многих различных групп агонистов по данному описанию, высокоселективных к Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2, из которых можно выбирать соединения для лечения заболеваний, откликающихся на Υ4 агонист, таких как ожирение, секреторная диарея, воспалительное заболевание кишечника и т. д. Все эти соединения являются новыми.

Профиль рецепторного распознавания

В качестве примеров, [А1а1,Рго34]-РУГ связывается с высокой аффинностью с Υ4 рецептором (IС₅₀ = 4,4 нМ), в отличие от Υ2 рецептора (Ю50 > 1000 нМ) и Υ1 рецептора (ТС₅₀ = 176 нМ). Таким образом, замены А1а1 и Рго34 в ΡΥΥ повышают аффинность к Υ4 рецептору с 30 до 4,4 нМ и понижают аффинность к Υ1 рецептору с 16 до 176 нМ, а к Υ2 рецептору с 0,22 нМ до > 1000 нМ. Профиль рецепторного распознавания, например, |С1и4.Ρ^о34|-ΡΥΥ очень похож, например, аффинность к Υ4 равна 2,4 нМ, а к Υ1 99 нМ (табл. 1).

[Аг£26,Рго34]- ΡΥΥ (8Εζ) Ю. Νο:15), [11е28,Рго34]- ΡΥΥ (8 Ер ГО. Νο:16), [МеГ30,Рго34[- ΡΥΥ (8ЕВ ГО. Νο: 17)

Эти пептиды также являются селективными агонистами типа (а) к Υ4 рецептору, представляющие собой аналоги ΡΥΥ, в которых С-концевая аминокислотная последовательность Υ4 распознавания вводится с помощью замены Рго34 на С-конце ΡΥΥ и в которых селективность к Υ1 рецептору повышена за счёт единичной замены в С-концевого сегмента последовательности ΡΥΥ, т.е. либо за счёт замены Агд26 вместо Н18, замены Пе2 вместо Ьей или замены Ме130 вместо Ьей. Эти аналоги [Ρ^о34]-ΡΥΥ являются членами одной группы из многих различных групп агонистов по данному описанию, высокоселективных к Υ4 по сравнению с Υ1 и Υ2, из которых можно выбирать соединения для лечения заболеваний, откликающихся на Υ4 агонист, таких как ожирение, секреторная диарея, воспалительное заболевание кишечника и т. д. Все эти соединения являются новыми.

Профиль рецепторного распознавания

В качестве примеров, [Агд26,Рго34]-РУГ связывается с высокой аффинностью с Υ4 рецептором ДС₅₀ = 0,43 нМ), в отличие от Υ2 рецептора ДС₅₀ = 177 нМ) и Υ1 рецептора ДС₅₀ = 15 нМ) (табл. 1). Профиль рецепторного распознавания, например, [А1а30,Рго34]-РУГ очень похож, но с ещё большей разницей селективности в отношении Υ1 рецептора, так как его аффинность к Υ4 рецептору равна 0.99 нМ, а к Υ1 173 нМ и к Υ2 рецептору > 1000 нМ. Соответствующие данные для третьего примера, [Ме130,Рго34]-РУГ, представлены в табл. 1.

[Сук2,В- Су®27]РР (8Ε<4 ΙΒ. Νο:4).

Этот пептид представляет собой высокоселективный к Υ4 агонист типа (Ь), который создан как с целью рецепторной селективности, так и с целью высокой устойчивости. [Су82,О-Су827]РР представляет группу селективных к Υ4 агонистов, в которых линкер, в данном случае внутримолекулярный дисульфидный мостик, вводится, в данном конкретном случае, между Сук, введённьм вместо Рго в положение 2, и Ό-Сук, введённым вместо Туг в положение 27 в молекуле полноразмерного РР с целью стабилизировать РР-складчатую структуру. [Су82,ПСук27]РР также защищён от расщепления под действием ОРР-РУ, так как он более не содержит остаток Рго в положении 2. Этот пептид является активным с модификацией- ацетилированным Ν-концом, который дополнительно предупреждает расщепление пептида аминопептидазами. Как свободный пептид, так и, например, ацетилированный вариант являются новыми соединениями.

Профиль рецепторного распознавания (узнавания) [Су82,П-Сук27]РР связывается с Υ4 рецептором с аффинностью, выраженной однозначным числом наномолей, Κ\₀ = 8,2 нМ. Он является высокоселективным к Υ4 рецептору, так как аффинность связывания [Су82,П-Сук27]РР на Υ1 и Υ2 рецепторах > 1000 нМ. [Су82,П-Сук27]РР ведёт себя как агонист Υ4 рецептора с активностью 4,6 нМ (ЕС₅₀) только в 7 раз более низкой, чем активность РР (ЕС₅₀ = 0,64 нМ), как определено в анализе с обменом инозитфосфатов, осуществляемым в трансфецированных клетках СО8-7 (табл. 2). [Су82,П-Сук27]РР является лигандом с низкой активностью к Υ2 рецептору, т.е. с величиной ЕС₅₀ > 1000 нМ. Важно, что в отличие от РР, активность [Су82,О-Су827]РР очень низка к Υ рецептору, т.е. величина ЕС₅₀ для РР составляет 83 нМ и неизмеримо низка для [Су82,О-Су827]РР (табл. 2). Таким образом, [Су82,О-Су827]РР является высокоселективным агонистом Υ4 с улучшенной (повышенной) разницей селективности к Υ1 и Υ2 рецептору.

Устойчивость белка - [Су82,О-Су827]РР имеет преимущество по сравнению с РР, а именно, он бо

- 19 012071 лее устойчив и, следовательно, является лучшим биофармацевтическим агентом, так как он не является субстратом для ΌΡΡ-ΐν и так как его РР-складка стабилизировала внутримолекулярным дисульфидным мостиком. Эти свойства устойчивости особенно полезны в том случае, когда продолжительного пребывания пептида в жидкостях организма достигают различными способами, такими как модификации пептида как такового с использованием мотивов, или различными фармацевтическими методами, такими как препараты пролонгированного действия.

(Су$2,Х- (Ν'- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Еуз13Д)Су<>27]- РР (8Е(? 10

Νο: 48).

Этот пептид является представителем группы высокоселективных агонистов Υ4 рецептора типа (Ь), который создан как с целью рецепторной селективности, так и с целью высокой устойчивости с помощью внутримолекулярного линкера, как описано выше, и модифицирован присоединением связывающего мотива, в данном случае, например, мотива связывания с сывороточным альбумином, присоединённого к введённому в |Ον52.Ω-Ον527|ΡΡ остатку Ьук13. Он проявляет свойства Υ-рецепторного связывания, аналогичные свойствам |ί\52Ό-ί\527|ΡΡ благодаря положению сайта присоединения.

[Су52,Аос5- 24Д)Су$27]- РР (8Ер ГО. Νο:9).

[Сук2,Аос5-24,П-Сук27]-РР является селективным Υ4 агонистом типа (Ь), эти агонисты представляют собой усечённые по центру стабилизированные дисульфидом РР пептиды-миметики, селективные к Υ4 рецептору, их преимущество перед РР заключается в том, что они намного меньше - только 16 остатков по сравнению с 36 остатками - и являются устойчивыми. [Сук2,Аос5-24,П-Сук27]- РР является новым соединением.

Профиль рецепторного распознавания (узнавания) - [Суκ2,Аοс5-24,^-Суκ27]-ΡΡ связывается с аффинностью 286 нМ с Υ4 рецептором и с неизмеримой аффинностью - с Υ1 и Υ2 рецепторами (табл. 1).

[Ьу828,С1и32]РР25- 36 (8Е() ГО. Νο:5) и [011128,1^32] РР25- 36 (8Е(? ГО. Νο:6).

Эти агонисты типа (Ь), селективные к Υ4 рецептору, которые представляют собой циклические аналоги РР, стабилизированные внутримолекулярным лактимным мостиком. В данных примерах 11е28 в РР (положение 4 в настоящем додекапептиде) заменяется на остаток Ьук или 01и, а Тйг32 (положение 8 в настоящем додекапептиде) заменяется на остаток 01и или Ьук и амино- и карбоксильная группы в боковых цепях этих остатков в положения 28 и 32 соединяются за счёт лактамизации. Эти пептиды являются новыми соединениями.

5-Су8-ТЪг-Аг0-Рго-Агд-Туг-СОМН₂

3~Суз-ТЬг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОЫН₂ (5Е0 Π) Νο: 7)

3<:уз-Гви-Тйг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОМН₂

3-Суе-Гои-тг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОМН₂ (5Е0 ГО Νο; 18)

3-СуЕ-Ъеи-ТЬг-Агд-Рго-Агд-Туг<ОЫН_г

З-СуаД.еи-ТНг-Агд-Шз-Агд-ТуГ'СОМНг (8Е<2 ГО Ыо: 26)

-Суб-Ьеи-ТЬг-АгдЛ-еи-Агд-Туг-СО^ Н₂

3-Су5-Ееи-Тйг-Агд-1-еи-Агд-Туг-СОЫН₂ (5Е<2 ГО. Νο: 49),

3-Суз-Ьеи-ТЬг-Агд-11&-Агд-ТугСОЫН₂

5-Суз-Ъеи-ТЬг-Агд-Пе-Агд-Тут-СОЫН₂ (ЗЕО ГО. Νο: 50).

Эти агонисты типа (с), селективные к Υ4 рецептору, представляют собой димерные конструкции, в которых две С-концевых аминокислотных последовательности Υ4-рецепторного распознавания соединяются в данном случае дисульфидным мостиком между двумя остатками Сук. Преимущество этих соединений заключается в том, что они малы, но являются высокоактивными селективными Υ4рецепторными лигандами. Они являются новыми соединениями.

Профиль рецепторного распознавания (узнавания)

В качестве примеров, гомодимер [ΟΓΚΡΚΥ- амид]х2 (8Е0 ΙΌ. Ыо:18) связывается с аффинностью 29 нМ с Υ4 рецептором и с неизмеримой аффинностью - с Υ1 и Υ2 рецепторами (табл. 1), тогда как более длинный гомодимер [С^ТΚΡΚΥ-амид]x2 (8Е0 ΙΌ. Ыо:26) связывается даже с более высокой аффинностью с Υ4 рецептором (1С₅₀ = 1,3 нМ) и опять-таки с неизмеримой аффинностью с рецепторами Υ1 и Υ2 (табл. 1). Таким образом, эти соединения типа (с) имеют большую разницу селективности (окно) между высокой аффинностью Υ4 связывания и низкой аффинностью Υ1 и Υ2 - рецепторного связывания - т.е. > 1000-кратная разница для гомодимера [СЕТ^КА-амид^ по данному описанию.

Суз-[К-(М'-гексадеканоил)-гамма-гдутамонл]-Ьу5-'П1г-Аг8-Ьеи-Агя-Туг-СОМН2 Суз-Ьеи-ТЪг-Аге-Ьеи-Аге-Тут-СОМНг (£>ЕЦ Ю. Νο: 29).

- 20 012071

Этот пептид из группы селективных к Υ4 рецептору соединений типа (с), представляет собой димерную конструкцию, в которой две С-концевых аминокислотных последовательности Υ4-рецепторного распознавания соединяются в данном случае дисульфидньгм мостиком между двумя остатками Сук и декорированные связывающим мотивом - в данном случае мотивом связывания сывороточного альбумина, соединённого с заменой Ьук вместо Ьеи в положении 31. Таким образом, несмотря на малый размер основного пептида, соединения этого типа, селктивные к Υ4, не быстро элиминируют в почках и, следовательно, имеют продолжительный период полужизни Т1/2. Сайт присоединения связывающего мотива расположен близко от дисульфидного линкера, где он оказывает минимальное воздействие на Υ4-рецепторное распознавание, что показано на примере высокой аффинности связывания более короткого [СΤΚΡΚУ-амид]x2, см. выше, в котором отсутствует этот остаток в положении 31.

Клинические показания

Υ4-специфические агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, важны для лечения состояний, откликающихся на активацию Υ4 рецепторов. Такие состояния включают состояния, для которых показаны регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм. Для применения в каждом таком случае агонист может включать модификацию или мотив, которые придают устойчивость к пептидазам, свойства связывания с сывороточным белком, или ПЭГилирование или САСсвязывающий мотив для того, чтобы продлить период полужизни в сыворотке и/или в ткани.

Заболевания или состояния, при которых показана регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм, включают ожирение и избыточный вес и состояния, при которых ожирение и избыточный вес рассматриваются как способствующие факторы, такие как булимия, нейрогенная булимия, синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (МОЭМ), гипергликемия, устойчивость к инсулину, нарушенная толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензия, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемия, гиперлипидемия, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.

Υ4 селективные агонисты также важны для лечения диареи или кишечной гиперсекреции, и для лечения тошноты и рвоты, или в качестве агентов против тошноты и противорвотных агентов, или для совместного применения с лекарствами, склонными вызывать тошноту и/или рвоту.

1. Ожирение и избыточный вес

Уже в семидесятые годы было высказано предположение, что РР может участвовать в регуляции потребления пищи. Полученные в последних исследованиях на животных многочисленные данные показывают, что РР является мощным и эффективным анорексигенным пептидом при периферическом введении (Акака^а е1 а1. Ρеρйάек 1999, 20; 1445- 8; КаЬиига е1 а1. Ρеρΐ^άек 2002, 23: 323-9; Акака^а е1 а1. Сак1гоеп1его1оду 2003,124: 1325-36). Так как РР не оказывает влияния на аппетит, потребление пищи и т.д. у нокаутированных по Υ4 животных, весьма вероятно, что РР действует с помощью Υ4 рецептора, снижая аппетит и потребление пищи (Вайетйат е1 а1. 2004, тезисы 83.3 £тот 1п1егпа1юпа1 ΝΡΥ кутрокшт ίη Со1тЬга ΡογΙι^ι1). РР также оказывает влияние на потребление пищи у животных, ожирение у которых вызвано диетой. РР рецепторы обнаружены в основном в стволе мозга в области пострема и в двигательных нейронах блуждающего нерва, где гематоэнцефалический барьер неэффективен и где гормоны из кровотока, такие как РР, могут получить доступ к нейронам. Весьма вероятно поэтому, что Υ4 рецепторы в ΝΤ8 в стволе мозга являются основной мишенью, через которую действует РР, подавляя аппетит и потребление пищи. Однако последние результаты также указывают на возможность того, что РР могут также действовать с помощью Υ рецепторов в дугообразном ядре, возможно, на РОМС, а, возможно, также на ЖУ/ЛдКВ нейронах (Вайетйат е1 а1. Со1тЬга ΝΡΥ теейпд аЬк!гас( 83.3). Низкие уровни РР обнаружены у субъектов, страдающих ожирением, особенно у субъектов с синдромом Прадера-Вилли (Ζίρ£ е1 а1. 1.С.ЕМ.1981, 52: 1264-6, Нот е1 а1 1983, Ιηί. I. ОЬек. 7: 529-38; С1акег е1 а1 Ногт. \1е1аЬ. 1988, 20: 288-92), а высокие уровни РР обнаружены у пациентов с нейрогенной анорексией. Важно отметить, что инфузия РР человеку понижает аппетит и потребление пищи в течение до 24 ч (Вайетйат е1 а1. 1СЕМ 2003, 88: 3989-92). Таким образом, действие РР на потребление пищи наблюдают после того, как уровни РР в кровотоке вернулись к нормальным значениям. Такое продолжительное действие на аппетит и т. д. хорошо известно также для других соединений, например, также при инъекции 1СУ, особенно Ад^. Важно отметить, что показано, что инфузия РР снижает потребление пищи у больных с синдромом Прадера-Вилли, страдающих вызванным болезнью ожирением (Вепйкоп е1 а1 1993 Ρеρйάек 14: 497-503).

Следовательно, Υ4 селективные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, пригодны для применения для субъекта, такого как млекопитающее, включая человека, чтобы регулировать потребление энергии. Соответственно, изобретение относится к способам изменения потребления энергии, потребления пищи, аппетита и расхода энергии. В данном описании раскрывается способ уменьшения потребления энергии или пищи путём введения субъекту косметически или терапевтически эффективного количества такого агониста. В одном варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к снижению количества, или общего веса, или общего объёма, или калорийности (содержа

- 21 012071 ния калорий) пищи. В другом варианте изобретения это может вызывать снижение потребление компонента пищи, например, снижение приёма липидов, углеводов, холестерина или белков. В некоторых других способах по данному описанию могут вводиться предпочтительные соединения, которые подробно обсуждаются в данном описании. В дополнительном варианте изобретения раскрывается способ снижения аппетита путём введения терапевтически эффективного количества такого агониста. Аппетит можно измерять (определять) любыми способами, известньми специалисту в данной области техники.

Например, пониженный аппетит можно определять с помощью физиологической оценки. В таком варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к изменению чувства голода, насыщения и/или сытости. Голод можно оценивать любыми способами, известными специалисту в данной области техники. В одном варианте изобретения голод оценивают с помощью физиологических анализов, таких как оценка чувства голода и сенсорного восприятия, используя, например, анкету.

В другом варианте изобретения раскрывается способ снижения моторики верхних отделов ЖКТ, например, замедление опорожнения желудка. Известно, что РР, прототип Υ4 агонистов, замедляет опорожнение желудка. Способ включает введение терапевтически эффективного количества такого Υ4 селективного агониста субъекту, тем самым снижается моторика ЖКТ. Общеизвестно, что соединения, которые замедляют опорожнение желудка, также оказывают благотворное действие при снижении потребления пищи, так как субъект чувствует насыщение или сытость.

В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию изменения энергетического метаболизма у субъекта. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества такого агониста, тем самым изменяется расход энергии. Энергия сжигается в физиологических процессах. Организм может непосредственно изменять расход энергии, модулируя эффективность этих процессов или изменяя количество или природу протекающих процессов. Например, в процессе пищеварения повышается энергия в организме при прохождении через пищеварительный тракт и усвоении пищи, и в клетках, при этом эффективность клеточного метаболизма может меняться, выделяя больше или меньше тепла. В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию любых и всех манипуляциях дугообразной цепи, описанных в данной заявке, которые согласованно изменяют потребление пищи и соответственно изменяют расход энергии. Расход энергии является результатом клеточного метаболизма, белкового синтеза, интенсивности обмена веществ и усвоения калорий. Так, в одном варианте изобретения периферическое введение приводит к повышенному расходу энергии и пониженной эффективности усвоения калорий. В одном варианте изобретения терапевтически эффективное количество рецепторного агониста по изобретению вводят субъекту, тем самым повышая расход энергии.

В некоторых вариантах изобретения как при терапевтическом, так и при косметическом применении Υ4 селективный агонист можно использовать для контроля веса и лечения, снижения или предупреждения ожирения, в частности, для достижения одного или более из нижеприведённых результатов: предупреждение и снижение увеличения массы тела; индукция и промотирование потери веса; и уменьшение ожирения, определяемого с помощью индекса массы тела. Как указано выше, изобретение также относится к применению Υ4 селективного агониста для регуляции любого одного или более чувств: аппетита, сытости или голода, в частности, одного или более из нижеперечисленного: индукции, увеличения, повышения и промотирования сытости и ощущения насыщения; и уменьшения, ингибирования и подавления голода и ощущения голода. Это раскрытие относится далее к применению Υ4 селективного агониста для поддержания одного или более из нижеперечисленного: заданного веса тела, заданного индекса массы тела, желаемого внешнего вида и хорошего здоровья.

В другом, или альтернативном, аспекте данное изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения пониженного энергетического метаболизма, нарушений питания, нарушения аппетита, избыточного веса, ожирения, булимии, нейрогенной булимии, Синдрома X (метаболического синдрома), или связанных с этим осложнений или рисков, включая диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (ΝΙΌΌΜ), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, застойную сердечную недостаточность, удар, инфаркт миокарда, тромбоэмболические заболевания, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки, причём способ заключается во введении субъекту, такому как млекопитающее, включая человека, эффективной дозы одного или более Υ4 селективных агонистов по данному описанию.

2. Кишечная гиперсекреция

Известно, что РР оказывает сильное антисекреторное действие как на тонкий, так и на толстый кишечник. С помощью исследований, проведённых на выделенных тканях человеческой толстой кишки, было продемонстрировано, что оно, очевидно, опосредуется Υ4 рецепторами, расположенными на эпителиальных клетках (Сох & Тоидй 2001 Вг. 1 Ρйа^тасо1. 135: 1505-12). Было показано ίη у1уо, что периферическое введение ΡΥΥ-другого РР-складчатого пептида, активирующего Υ1 и Υ2 рецепторы, может вызвать продолжительное снижение кишечную секрецию, индуцированное вазоактивным кишечным полипептидом у людей с илеостомией ^ауГогй е! а1. 1990 Ьапсе!: 335: 1555-57). Был сделан вывод, что ΡΥΥ пептид может быть терапевтическим агентом против диареи. Однако, например, натрийуретический

- 22 012071 и гипертензивный эффекты комбинированных агонистов Υ1 и Υ2, ΝΓΥ и РΥΥ, препятствуют этому. Такие побочные эффекты не релевантны для селективных Υ4 рецепторных агонистов по настоящему изобретению. Таким образом, селективные Υ4 агонисты по настоящему изобретению особенно применимы для лечения или защиты против гиперсекреции ЖКТ, включая различные формы диареи, вне зависимости от того, вызваны они непосредственно гиперсекрецией, так как подавление кишечной секреции либо устраняет причину диареи, либо устраняет симптомы. Одно особенно интересное показание представляет собой гиперсекрецию у пациентов с илеостомией, которые часто теряют большие количества жидкости. Селективные Υ4 агонисты по настоящему изобретению особенно применимы для лечения или защиты против гиперсекреции, обусловленной илеостомией тонкого кишечника.

3. Тошнота и рвота

Известно, что многие пептиды и другие типы соединений, которые предлагались в качестве агентов для регуляции аппетита, такие, например, как антагонисты РΥΥ и СВ1, являются рвотными средствами. Например, на самом деле, РΥΥ был открыт - во второй раз - в 1989 г. как биологически активный компонент в интестинальном экстракте, вызывающем рвоту у собак (Иагбюд апб МсЭопа1б 1989 Рерббек 10: 21-24). Был сделан вывод, что РΥΥ является наиболее мощным идентифицированным пептидом в кровотоке, вызывающим рвоту, и что этот эффект опосредуется с помощью области пострема, известной тем, что она имеет негерметичный гематоэнцефалический барьер. Также сообщалось, что РΥΥ3-36 может вызывать тошноту при периферическом введении людям (ИайесЬ ргекк ге1еаке 29¹¹' оГ .Типе 2004). Интересно, что в статье было отмечено, что РР в сходных дозах не вызывает рвоты у этих собак (Иагбюд апб МсЭопа1б 1989).

Таким образом, РР, который действует с помощью Υ4 рецепторов, также расположенных в области пострема ствола мозга, но не вызывает рвоту. Большие дозы комбинированного Υ2-Υ4 пептидного агониста с аналогичной РΥΥ ш νίΙΐΌ активностью к Υ2 рецепторам можно вводить животным, таким как обезьяны циномолгус (супо), достигая очень высоких уровней в плазме 12-13000 нМ, не наблюдая никакой рвоты у животных и никаких побочных эффектов со стороны ЖКТ. Это отсутствие тошноты является неожиданным, так как РΥΥ3-36, который имеет сходную активность в отношении Υ2 рецептора, вызывает тошноту у человека и, возможно, у животных, при введении в значительно более низких дозах. Таким образом, неожиданно комбинированный Υ2-Υ4 селективный агонист не вызывает рвоты в той же степени, в какой селективный Υ2 агонист - соединение РΥΥ3-36 - вызывает. Очевидно, Υ4-рецепторная активация, предположительно, в области пострема, предупреждает рвотное действие Υ2 активации, в данном случае действие оказываемое тем же соединением на Υ2 рецепторы. Таким образом, Υ4селективные соединения по настоящему изобретению особенно полезны для лечения или предупреждения тошноты и рвоты. Эти тошнота и рвота обусловлены лечением, например, другим подавляющим аппетит агентом, например агонистом типа агониста Υ2, СВ1 антагонистом/обратным агонистом или другими типами агентов, подавляющих аппетит, которые часто вызывают тошноту и рвоту. Следует отметить, что эффект подавления аппетита соединений, селективных к Υ4, весьма вероятно, является аддитивным или даже синергическим в одно и то же время.

Так, при совместном введении Υ4 селективного агониста по настоящему изобретению вместе с другим агентом, подавляющим аппетит, или агентом против ожирения другого типа, достигаются две цели: 1) существенный (целебный) эффект достижения полностью или частично аддитивного действия против ожирения, 2) существенный (целебный) эффект Υ4 селективного соединения, устраняющий или уменьшающий вызывающее рвоту действие другого агента против ожирения.

4. Воспалительное заболевание кишечника

Секреция и функция природного лиганда Υ4 рецептора, РР, чётко коррелирует с активностью автономной нервной системы (8с11\уаг1х 1983, Сак1гоеШего1оду 85: 1411-25). Так например, флуктуации уровней РР в плазме тесно коррелируют с флуктуациями моторики ЖКТ, а секреция - с секрецией гормона/нейротрансмиттера (нейромедиатора) мотилина. Известно, что РР действует через посредство активации парасимпатической нервной системы и центров регуляции центрального отрезка блуждающего нерва, таких как двигательные нейроны блуждающего нерва в стволе мозга, и тем самым регулирует активность в эфферентных (центробежных) волокнах блуждающего нерва в направлении к ЖКТ. Так как полагают, что воспалительное заболевание кишечника обусловлено дисфункцией, главным образом, нарушением моторики и функции ЖКТ, вызывающими боль и т.д., и нарушением их контроля через посредство автономной нервной системы, применение агонистов, селективных к Υ4, при лечении воспалительного заболевания кишечника является предпочтительным вариантом настоящего изобретения.

Дополнительные комментарии к применению Υ4 агонистов для лечения или предупреждения ожирения и родственных заболеваний

В процессе еды широкий спектр желудочно-кишечных гормонов и нейромедиаторных систем активируется тщательно согласованно, последовательно или с наложением. Кроме того, компоненты пищи влияют не только на секрецию ЖК гормонов и активность различных путей афферентных нейронов, но эти компоненты пищи, после всасывания, также непосредственно влияют на различные гормоны и центры в ЦНС. Поэтому регуляция потребления пищи и расхода энергии представляет собой в высшей степени сложный и многоаспектный процесс. С этой точки зрения удивительным является, что некоторые

- 23 012071 гормоны, такие как РР, могут на самом деле заметно влиять на систему при введении таким образом, который приводит, например, только к 3-4^х-кратным уровням в плазме, которые достигаются в процессе еды.

Применение таких соединений - Υ4-селективных агонистов - очевидно, в основном вызывает ожидаемый эффект, если соединения дают натощак в описанных эффективных дозах. Если Υ4 агонисты дают в ситуации, когда различные гормональные и нейронные системы активны вследствие присутствия компонентов пищи в ЖКТ или ожидания пищи, эффекта не наблюдается или наблюдаемый эффект значительно меньше. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения селективный Υ4 агонист вводят натощак в эффективной дозе либо подкожно, назально, либо другими способами, указанными в другом месте данного описания. В данном контексте термин натощак означает, что субъект не принимал никакой пищи или питья в течение, по меньшей мере, последних 2 ч перед введением комбинированного Υ4 рецепторного агониста, например, по меньшей мере, в течение последних 3 ч, по меньшей мере, в течение последних 4 ч, по меньшей мере, в течение последних 5 ч, по меньшей мере, в течение последних 6 ч, по меньшей мере, в течение последних 7 ч, по меньшей мере, в течение последних 8 ч, по меньшей мере, в течение последних 9 ч, по меньшей мере, в течение последних 10 ч, по меньшей мере, в течение последних 11 ч, по меньшей мере, в течение последних 12 ч перед введением дозы.

В подгруппе популяции Υ4 агонисты могут не оказывать предполагаемого действия вследствие генетических изменений, таких как полиморфизм в гене Υ4 рецептора. Утрата функциональных мутаций в этих рецепторах связана, по-видимому, с ожирением. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения осуществляют анализ Υ4 рецепторного гена субъекта, которого нужно лечить, чтобы проверить эти гены на полиморфизм/мутации и идентифицировать такой полиморфизм. На основании такого анализа можно проводить оптимальное лечение субъектов. Например, только субъекты с нормальным: генотипом или с полиморфизмом, который не влияет на функцию Υ4 агонистов, можно лечить с применением таких агонистов. Другая возможность -повысить дозу Υ4 агониста, вводимую субъектам, экспрессирующим ослабленный рецептор, чтобы гарантировать оптимальное действие лекарства. В случае, когда ожирение субъекта вызвано недостаточностью функции Υ4 рецептора, можно утверждать, что лечение, например, большими дозами -Υ4 агониста, является формой заместительной терапии, при условии, что, по меньшей мере, релевантная рецепторная функция всё ещё сохраняется, например, у гетерозиготных пациентов.

В одном варианте изобретения, когда вводят агонист Υ4, перед началом постоянного лечения, чтобы быть уверенными, что эти соединения оказывают предполагаемое действие на субъекта, которого нужно лечить, можно провести срочный анализ (тест). Эти меры гарантируют, что лечение с помощью агонистов Υ4 проходят только чувствительные к этим соединениям субъекты.

Применение У4-селективных агонистов в комбинации с У2-селективными агонистами и другими агентами

Рассматриваемая одновременно наша международная патентная заявка, поданная в один день с данной заявкой, раскрывает Υ2-селективные агонисты и их применение для лечения. В приложении к этой заявке вкратце суммируются структурные признаки, требующиеся для Υ2 агониста по той заявке, и даются конкретные примеры Υ2 селективных агонистов. Как коротко обсуждается ниже, Υ4-агонисты по данной заявке можно применять при лечении вместе с Υ2-специфическими агонистами.

Применяя комбинированное лечение с помощью двух соединений, соответственно, селективного Υ4 агониста и селективного Υ2 агониста, можно в свободно изменять дозу каждого из этих соединений, т.е. независимо друг от друга, чтобы достичь максимального целебного эффекта. То-есть, например, возможно применение субмаксимальной дозы селективного к Υ2 соединения для того, чтобы, возможно, вызвать лишь минимальные побочные эффекты, например, за счёт Υ2 рецепторов периферической сердечно-сосудистой системы, или тошноту, при одновременном введении максимальной или даже сверхмаксимальной дозы агониста Υ4 для того, чтобы обеспечить очень сильное действие у всех субъектов за счёт Υ4 рецепторного пути, который имеет более широкое терапевтическое окно. Сопутствующая частичная стимуляция Υ2-рецепторного пути гарантирует более мощное воздействие на регуляцию аппетита и расход энергии, чем стимуляция одного Υ4 агониста. Например, Υ2 агонист может оказывать более явно выраженное действие на опорожнение желудка, чем Υ4 агонист. И сопутствующая стимуляция Υ4 рецептора позволяет применять более низкую и более безопасную дозу Υ2 агониста, которая была бы неэффективна при индивидуальном применении.

В тех случаях, когда для достижения комбинированной стимуляции Υ4 и Υ2 рецепторов используют два индивидуальных соединения, схему введения доз можно корректировать как указано выше. В конкретных вариантах изобретения комбинацию Υ2 агониста и Υ4 агониста вводят таким образом, чтобы соотношение дозы агониста Υ2 и агониста Υ4 составляло примерно от 0,1: 10 до, примерно 10: 0,1, а именно, от примерно 0,1: 1 до примерно 1: 0,1, примерно от 0,2: 1 до примерно 1: 0,2, примерно от 0,3: 1 до примерно 1: 0,3, примерно от 0,4: 1 до примерно 1: 0,4, примерно от 0,5: 1 до примерно 1: 0,5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 и т.д. Как упоминалось выше, представляет интерес комбинация Υ2 и Υ4 агониста, где такое соотношение между количествами Υ2 и Υ4, при котором максимальный эффект достигается при минимальных (если вообще таковые имеют место) побочных эффектах. Соответственно, предусматрива

- 24 012071 ется, чтобы концентрация Υ2 агониста в такой комбинации была меньше, чем концентрация Υ4 агониста. Упоминавшиеся выше концентрации и соотношения относятся к молярным концентрациям и к молярным соотношениям, соответственно.

Таким образом, в предпочтительном варианте изобретения для лечения ожирения селективный Υ4 агонист вводят в сочетании с селективным Υ2 агонистом.

Соединения можно вводить одинаковым способом или различными способами. Способ введения, в принципе, может быть любым упомянутым в данном описании способом, причём парентеральный и топический способы представляют наибольший интерес. Соответственно, в одном варианте изобретения оба агониста, агонист Υ4 и агонист Υ2, вводят, например, топическим способом, таким как назальный или подкожная инъекция, а в другом варианте изобретения агонист Υ4 вводят назально, а агонист Υ2 вводят подкожной инъекцией или наоборот. Другие подходящие комбинации или способы применения входят в объём настоящего изобретения.

Агонисты Υ4 и Υ2, применяемые в комбинированном лечении, могут находиться в одной и той же фармацевтической композиции (например, в виде смеси в фармацевтической композиции) или они могут находиться в раздельных фармацевтических композициях для одновременного, последовательного или индивидуализированного применения с конкретными инструкциями по применению. Соответственно, такие композиции могут быть представлены в виде набора, содержащего Υ4 агонист и Υ2 агонист в одной и той же упаковке или в различных отдельных упаковках и, необязательно, с инструкциями по применению.

Специфические Υ4 агонисты по изобретению можно комбинировать при лечении ожирения, диабета и родственных заболеваний с различными другими лекарствами, имеющими целью аппетит и расход энергии, эти лекарства включают, но без ограничения, лекарства, такие как ингибиторы липаз ЖКТ, ингибиторы обратного захвата нейромедиаторов, антагонисты каннабиноидных рецепторов и обратные агонисты, а также другие типы нейромедиатора, включая, но без ограничения, 5НТ рецепторы- и/или гормона, включая, но без ограничения, агонисты или антагонисты СЬР-1, МС4, МС3-рецепторов. Так как селективные Υ4 агонисты направлены на гомеостатический регуляторный механизм для связи между ЖКТ и ЦНС, т.е. на Υ4 рецепторы обычно нацелен опосредующий насыщение гормон РР из поджелудочной железы, особенно полезно совмещать лечение Υ4 селективным агонистом с лечением лекарством, направленным на важнейший гедонический механизм регуляции аппетита и расхода энергии, таким как СВ1 рецепторы, например, являющиеся частью системы поощрения. Поэтому применение Υ4 агонистов при лечении ожирения и родственных заболеваний в комбинации с СВ1 антагонистом является предпочтительным вариантом настоящего изобретения.

Дозировки

Терапевтически эффективное количество Υ4 рецепторного агониста по данному изобретению зависит от конкретного применяемого агониста, возраста, веса и состояния субъекта, проходящего лечение, тяжести и типа состояния или заболевания, которое нужно лечить, способа введения и эффективности применяемой композиции.

Например, терапевтически эффективное количество Υ4 рецепторного агониста может меняться, примерно, от 0,01 мкг на килограмм (кг) массы тела, примерно, до 1 г на кг массы тела, например, от около 1 мкг до около 5 мг на кг массы тела, или от около 5 мкг до около 1 мг на кг массы тела. В другом варианте изобретения рецепторный агонист вводят субъекту в количестве 0,5-135 пикомолей (пмоль) на кг массы тела, или 72 пмоля на кг массы тела.

В одном конкретном неограничивающем примере примерно 5-50 нмолей вводят в виде подкожной инъекции, например, около 2-20 нмолей, или около 1,0 нмоля. Точную дозу специалист в данной области техники легко определит исходя из активности конкретного применяемого соединения (такого как агонист рецептора), возраста, веса, пола и физиологического состояния субъекта. Доза агониста может быть молярным эквивалентом терапевтически эффективной дозы РΥΥ3-36.

Эти количества можно разделить на одну или несколько доз для применения ежедневно, через день, еженедельно, через каждые две недели, ежемесячно или с любой другой подходящей частотой. Обычно приём осуществляют один или два раза в день.

Способы применения

Агонист Υ4 рецептора, как в виде косметической, так и в виде фармацевтической композиции по изобретению, можно вводить любым способом, включая энтеральный (например, оральное введение) или парентеральный способ. В конкретном варианте изобретения предпочтительным является парентеральный способ, он включает внутривенную, внутрисуставную, интраперитонеальную (внутрибрюшинную), подкожную, внутримышечную, надчревную инъекцию и инфузию, а также сублингвальный (подъязычный), трансдермальный (чрескожный), топический, трансмукозный, включая назальный, способ, или ингаляция, например лёгочная ингаляция. В конкретных вариантах изобретения предпочтительным является подкожный и/или назальный способ применения.

При центральном (интрацеребровентрикулярном) введении природный Υ4-селективный пептид РР может, как и Ν₽Υ и РΥΥ при 1СУ введении, стимулировать приём пищи (возможно, окрашивают, чтобы активировать, центральные рецепторы, которых обычно не достигают гормоны кровотока или пе

- 25 012071 риферически вводимые пептидные соединения). Поэтому в тех случаях, когда следует избегать повышенного потребления пищи, предпочтительно периферическое введение Υ4 селективных агонистов по изобретению.

Агонисты рецепторов можно как таковые, диспергированные в подходящем носителе, или их можно вводить в виде подходящей фармацевтической или косметической композиции. Такие композиции также входят в объём настоящего изобретения. Ниже описаны подходящие фармацевтические композиции. Специалист в данной области техники знает, что такая композиция может быть также пригодна для косметического применения, или он знает, как скорректировать композицию, чтобы сделать её косметической, используя подходящие косметически приемлемые эксципиенты.

Фармацевтические композиции

Агонисты рецепторов (рецепторные агонисты, также называемые соединения) по данному изобретению для применения в медицине или косметике обычно бывают в виде фармацевтической композиции, содержащей конкретное соединение или его производное совместно с одним или более физиологически или фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Соединения можно вводить животному, включая млекопитающих, таких как, например, человек, любым подходящим способом введения, например, таким как оральный, трансбуккальный, назальный, окулярный, лёгочный, топический, трансдермальный, вагинальный, ректальный, парентеральный (включая, наряду с другими, подкожный, внутримышечный и внутривенный, ср. выше) способ, в дозе, которая эффективна для индивидуальных целей. Специалист в данной области техники знает, как выбрать подходящий способ введения. Как указывалось выше, предпочтительным является парентеральное введение. В конкретном варианте изобретения рецепторные агонисты вводят подкожно и/или назально. Общеизвестно в уровне техники, что подкожные инъекции может делать себе сам пациент.

Композицию, пригодную для конкретного способа применения, индивидуально для каждого пациента легко определит практикующий врач. Различные фармацевтически приемлемые носители и их состав описаны в обычных монографиях о препаратах, например, в ИештдЮп'з Ρ1ιαηη;·ΐίχιΠίο;·ι1 8с1епсез Ьу Е.^. Майш.

Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по изобретению, может быть в виде твёрдой, полутвёрдой или жидкой композиции. Для парентерального применения композиция обычно находится в жидком виде или в полутвёрдом или твёрдом виде для имплантации.

Жидкие композиции, которые представляют собой стерильные растворы или дисперсии, могут применяться, например, для внутривенной, внутримышечной, внутриоболочечной, эпидуральной, интраперитонеальной или подкожной инъекции или инфузии. Соединения можно также приготовить в виде стерильной твёрдой композиции, которую можно растворять или диспергировать до или во время введения, например, в стерильной воде, физиологическом растворе или другой подходящей стерильной среде для инъекций.

Композиции в жидком виде могут представлять собой раствор, эмульсию, включая наноэмульсии, суспензию, дисперсию, липосомную композицию, смесь, спрей или аэрозоль (два последних типа являются особенно релевантными для назального применения).

Подходящие среды для растворов или дисперсий обычно бывают на водной основе или на основе фармацевтически приемлемых растворителей, например, таких как масло (например, кунжутное или арахисовое масло) или органический растворитель, например, такой как пропанол или изопропанол. Кроме того, композиция по изобретению может содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, например, такие как агенты, корректирующие рН, осмотически активные агенты, например, для того, чтобы довести изотоничность композиции до физиологически приемлемых уровней, агенты коррекции вязкости, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты и т.д. Предпочтительной средой является вода.

Композиции для назального применения могут также содержать подходящие нераздражающие носители, например, такие как полиэтиленгликоли, гликофурол, и т.д., а также энхансеры всасывания, хорошо известные специалисту в данной области техники (например, со ссылкой на ИештдЮп'з Ρΐιαηηαсеийса1 8с1епсе).

Для парентерального применения в одном варианте изобретения агонист рецептора можно вообще готовить смешением агониста рецептора заданной степени чистоты в виде стандартной лекарственной формы для инъекций (в виде раствора, суспензии или эмульсии) с фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, т.е. таким, который не является токсическим для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях: и который совместим с другими ингредиентами композиции.

Обычно препараты готовят с помощью однородного и тщательного смешения (контактирования) рецепторного агониста с жидкими носителями, или с тонкоизмельчёнными твёрдыми носителями, или с теми и другими. Затем, при необходимости, продукту придают форму нужного препарата. Предпочтительно, носитель представляет собой парентеральный носитель, более предпочтительно, раствор, изотонический с кровью реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический солевой раствор и раствор декстрозы. Также применимы по данному описанию неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат, а также липосомы. Благодаря амфифильной природе пептидов по данному

- 26 012071 описанию подходящие формы также включают мицеллярные препараты, липосомы и другие типы препаратов, содержащие один или более соответствующих липидов, таких, например, как фосфолипиды и т. п.

Предпочтительно, они суспендируются в водном носителе, например, в изотоническом буферном растворе при рН около 3,0-8,0, предпочтительно при рН около 3,5-7,4, 3,5-6,0 или около 3,5-5. Применимые буферные вещества включают ацетатный, цитратный, фосфатный, боратный, карбонатный буферы, например, такие как цитрат натрия-лимонная кислота или фосфат натрия-фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота.

Композиции также могут быть предназначены для контролируемой или пролонгированной доставки рецепторного агониста после введения, чтобы создать схему с менее частым введением. Обычно подходящей считается схема приёма лекарственного вещества 1-2 раза в сутки, но в объём настоящего изобретения также входят другие схемы применения, такие, например, как более частое и менее частое введение. Для осуществления пролонгированной доставки рецепторного агониста можно применять подходящий носитель, включающий, например, липиды или масла, чтобы образовать депо в месте введения, из которого рецепторный агонист медленно высвобождается в систему кровообращения, или можно использовать имплантат. Подходящие с этой точки зрения композиции включают липосомы и биоразрушаемые частицы, в которые включён рецепторный агонист.

В таких ситуациях, когда нужны твёрдые композиции, эти композиции могут быть в виде таблеток, таких как обычные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, формованные таблетки или подъязычные таблетки, в виде пеллет, порошков, гранул, гранулятов, материала в виде макрочастиц, твёрдых дисперсий или твёрдых растворов.

Полутвёрдая форма композиции может представлять собой жевательную резинку, мазь, крем, линимент, пасту, гель или гидрогель.

Другие подходящие лекарственные формы фармацевтических композиций по изобретению могут представлять собой вагитории, суппозитории, пластыри, накладки, таблетки, капсулы, саше, пастилки, устройства и т. д.

Лекарственная форма может быть предназначена для неограниченного (свободного) или контролируемого высвобождения, например, за счёт того, что таблетки могут иметь соответствующие покрытия.

Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.

Содержание соединения по изобретению в фармацевтической композиции по изобретению составляет, например, около 0,1-100% вес./вес. фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции можно готовить любым способом, хорошо известным специалисту в области приготовления фармацевтических препаратов.

В фармацевтических композициях соединения обычно объединяются с фармацевтическим эксципиентом, т. е. терапевтически инертным веществом или носителем.

Носитель может иметь весьма разнообразные формы в зависимости от заданной лекарственной формы и способа применения.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут представлять собой, например, наполнители, связующие, вещества, способствующие расщеплению, разбавители, вещества, способствующие проглатыванию, растворители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, стабилизаторы, энхансеры, вещества, придающие вкус и запах, агенты коррекции рН, замедлители, увлажняющие средства, поверхностноактивные агенты, консерванты, антиоксиданты и т. д. Подробности можно найти в фармацевтических справочниках, например, таких как КеттдЮп'5 Рйагтасеибса1 8с1епсе или Рйагтасеибса1 Ехс1р1еп1 НапбЬоок.

В нижеприведённых примерах описано получение и активность некоторых конкретных агонистов по изобретению.

Синтезы

Пептидные агонисты по данному изобретению можно синтезировать твердофазным пептидным синтезом, применяя либо автоматический синтезатор пептидов, либо обычный лабораторный синтез. Твёрдым носителем может являться, например, полимер хлортритила (С1) или полимер Ванга (^апд), каждый из которых можно легко приобрести. Активные группы этих полимеров легко реагируют с карбоксильной группой Ν-Етос аминокислоты, при этом связывая её с полимером ковалентной связью. Связанный с полимером амин можно депротекционировать экспозицией с пиперидином. Затем вторую Ν-защищённую аминокислоту можно присоединить к элементу полимер-аминокислота. Эти стадии повторяют до тех пор, пока не получат нужную последовательность. По окончании синтеза связанный с полимером защищенный пептид можно депротекционировать и отщепить от смолы под действием трифторуксусной кислоты (ТФК, ТЕА). Ниже даны примеры реагентов, облегчающих присоединение новых аминокислот к связанной с полимером аминокислотной цепи: тетраметилурония гексафторфосфат (НАТО), О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-Ы^,№,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НВТИ), О-(1Нбензотриазол-1-ил)-Ы,^№,№-тетраметилурония гексафторборат (ТВТИ), 1Н-гидроксибензотриазол (НОВ!).

- 27 012071

Также предпочтительнее бывает пептидный синтез в растворе, нежели твердофазный пептидный синтез.

Модификация боковых амино- и карбоксильных групп аминокислоты пептидной цепи, например, введением САС-связывающего или другого мотива, описанного выше, является простым способом введения и снятия защиты (депротекции) других реакционноспособных групп боковых цепей, не участвующих в реакции.

Пептиды по данному описанию получают твердофазным синтезом на полимере ΡΛΕ Ρед-Ρ8 (амидная смола Аррйей Вю8с1епсе, \Уагппд!оп. ик 6ΕΝ913401) с применением реакций с защитной группы Ртос с 5х избытком реагента. Все реакции связывания осуществляют в присутствии НСТИ, растворитель ДМФА. Снятие Ртос проводят 20%-ным раствором пиперидина в ДМФА в течение 10-15 мин. Однако эти пептиды можно также синтезировать различными другими стандартными методами пептидного синтеза, такими как химические реакции с защитной группой ®ОС и реакции в растворе вместо твердофазного синтеза, и т.д. Синтез иллюстрируется приведённым ниже описанием, но подобными методами можно получать другие пептиды по данному описанию:

Синтез |Суя2,О- Суя27]РР

Как правило, в качестве защитной группы в боковой цепи является Ртос, за исключением:

Аг§ = Ртос Аг§(РЫ)- ОН

Аки, О1п = Ртос Азп(Тг1)- ОН

ТЬг, Зег, Акр, О1и, Туг = трет- бутил

А1а- Зег 22- 23 = Ртос А1а8ег псевдопролин

В случае [Сук2,О-Сук27 ΡΡ] следующие специальные защитные группы используют для того, чтобы добиться селективного снятия защиты (депротекции):

Суз27 = Ртос ОЬуз(Тг1)- ОН

Пептид синтезируют твердофазным синтезом на полимере ΡА^ Ρед-Ρ8 (смола, которая при расщеплении образует биологически важную карбоксиаламидную (карбоксамидную) группу) с применением реакций с Ртос с 5-кратным молярным избытком реагента. Все реакции связывания осуществляют в присутствии НСТИ, растворитель ДМФА. Снятие Ртос проводят 20%-ным раствором пиперидина в ДМФА в течение 10-15 мин. Присоединение проверяют после каждой стадии количественным анализом с нингидрином. В некоторых случая можно применять двойное связывание (двойную конденсацию).

Затем смолу делят на различные партии для получения пептида.

Для дополнительной иллюстрации синтетических методов, которые можно использовать для получения Υ4 селективных агонистов по данному изобретению, на примерах представлены следующие протоколы:

Синтез [Ьу$13]РР2- 36 (ЗЕф ГО Νο: 54) и его аналогов

Далее описывается синтез Υ4 селективного пептида [^ук13]ΡΡ2-36 и синтез его аналогов с САСсвязывающим мотивом, мотивом, связывающим сывороточный белок или фрагментом полиэтиленгликоля, присоединёнными к ипсилон-аминогруппе Ьук13.

Как правило, защитной группой в боковой цепи является Ртос, за исключением:

Агд = Ртос Агд(РЫ)- ОН

Акп, СИп = Ртос Азп(ТтТ)- ОН

Т11Г, 8ег. Азр, О1и, Туг = трет- бутил

А1а-8ег 22- 23 =* Ртос А1а8ег псевдопролин

В случае [^ук13]ΡΡ2-36 для того, чтобы добиться селективной депротекции, используют следующие защитные группы:

Ьуз 13 = Ртос Ьуз(Ойе)- ОН

Пептид синтезируют твердофазным синтезом на полимере ΡА^ Ρед-Ρ8 (полимер, который при отщеплении образует биологически важную карбоксамидную группу) с применением Ртос защиты с 5кратным молярным избытком реагента. Конденсацию осуществляют с помощью НСТИ в ДМФА в качестве реагента. Снятие Ртос после каждой стадии конъюгации осуществляют 20%-ным раствором пиперидина в ДМФА в течение 10-15 мин. Присоединение проверяют на каждой стадии количественным анализом с нингидрином. В некоторых случаях можно осуществлять двойное связывание (присоединение).

После синтеза полноразмерного пептида защитную группу в ипсилон-аминогруппе Ьук13 селективно снимают обработкой 2%-ным раствором гидразина в ДМФА в течение 15-20 мин, в то же время пептид ещё остаётся связанным с полимером.

Затем полимер делят на различные части для получения недериватизированного пептида, а также пептидов, модифицированных тремя различными мотивами:

1. [^ук13]ΡΡ2-36 - материнский пептид - отщепляют от полимера и депротекционируют обработкой смесью 95% трифторуксусной кислоты: 2,5% воды: 2,5% трипропилсилана в течение 2-3 ч.

- 28 012071

Пептид очищают обращено-фазовой ВЭЖХ: колонка Уубас 300 А, 250 мм х 10 мм, элюент (буфер А = 0,05% ТФК в воде; буфер В = 60% МеСN : 40% воды : 0,05% ТФК) в градиенте 30-80% буфера В в течение 20 мин, 2 мл/мин. Определяют ΟΌ при 215 нм и элюент, содержащий конкретный пептид, собирают и лиофилизируют.

Структуру пептида подтверждают масс-спектрометрией, аминокислотным анализом и, при необходимости, также анализом аминокислотной последовательности.

2. [N-(8-(8-гамма-глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)-[^ук13]РР2-36 (8ЕЦ ΙΌ №: 55).

Для того, чтобы присоединить мотив связывания сывороточного альбумина, 8-(8-гаммаглутамоиламинооктаноиламино)октаноильную группу связывают со свободной ипсилон-аминогруппой остатка Ьук13 после удаления защитной Обе группы, пептидным синтезом, с помощью защищённой аминооктановой кислоты а затем дважды - с помощью защищённой гамма-глутаминовой кислоты, в то время как пептид всё ещё остаётся связанным со смолой.

Пептид, модифицированный с применением мотива, депротекционируют, циклизуют и очищают как описано выше для материнского пептида.

3. Флуоресцеин-[N-{(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)з}-^ук13]РР2-36 (8ЕЦ ΙΌ №: 39)

Для того чтобы присоединить САС-связывающий мотив, мотив строят постадийно пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Ьук13, после удаления Обе группы, на пептиде, всё ещё связанном с полимером, используя стандартный метод с Етос, как в целом описано выше: САСсвязывающая последовательность, присоединённая таким образом, представляет собой А1а-Агд-Агд-АгдА1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а. Флуоресцеиновую метку присоединяют для ш νίΙΐΌ и ш у1уо для аналитических целей в виде его 5,6 изомера - ΝΗ8 эфира, 10х избыток в течение 72 ч - к Ν-концу окончательной САС-связывающей последовательности.

Пептид, модифицированный с помощью САС-связывающего мотива, отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают как описано выше для материнского пептида.

4. [N-{N'-(21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}-гамма-глутамоил-^ук13]РР2-36 (8ЕЦ ΙΌ №: 40)

Для того чтобы присоединить фрагмент полиэтиленгликоля к Υ4 селективному пептиду, защищённую 21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозановую кислоту связывают пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Ьук13, после удаления Обе группы, на пептиде, всё ещё связанном с полимером, а затем присоединяют защищённую гамма-глутаминовую кислоту.

ПЭГилированный пептид отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают как описано выше для материнского пептида.

Структура	Молекулярная формула	М\У	Теоретическая величина т/х	Полученная масса М/г	К1 МИИ	Чистота	Аналитич. метод
РР2-36	Ο182Η282Ν5 205352	4110.7		4109.2	18.1	96.2	С
[ΗΙ&341-ΡΡ	Ο186Η286Ν5 405552	4222.1	704.7 [М+6Н]	704.6 [М+6Н}	14.7	95.6	В
[Рго34]-РУУ	С195Н294 N54 057	4306.7		4279.6 [М+Н]	13.5	91.6	А
[А1а1 ,Ργο34]-ΡΥΥ	С189Н290 N54 056	4214.7		4138.3 [М+Н]	13.1	95.0	А
[ΑΙθ30,Ργο34]-ΡΥΥ	С192 Н238 N54 057	4264.7		4239.0 [М+Н]	13.7	90.0	А
[Θ1ο4,Ργο34]ΡΥΥ	С194 Н290 N54 058	4306.7		4281.8	13.2	100	А

[Αγ926,Ργο34]ΡΥΥ	С194 Н298 N54 057	4298.8	4300.1	13.4	98.9	А
[ΙΙθ28.Ρ(ό34]ΡΥΥ	С195 Н294 N54 057	4306.8	4281.2	13.6	97.0	А
Μβί30,ΡΓη34]ΡΥΥ	Ο194Η292Ν5 4 057 5	4324.8	4298.5	13.2	96.9	А
]Су52,0-Суе27]- РР	Ο177Η279Ν5 305354	4125.8	4124.4	17.9	98.7	С
[ΟίΤΚΡΡΥаггис1е]х2 (8ЕО ГО Νο: 18)	С80Н130Н28 020 52	1868.2	1812.1	10.0	99.3	А
[СТВРКУатйе]х2 (5ЕО ГО Νο: 7)	С68Н108№6 018 52	1641.9	1584.9	8.9	100	А

- 29 012071

Аналитическая ВЭЖХ, метод А Колонка = Уубас С18 Рер11бе-Рго(ет (для пептидов- белков), 250 х 4.6 мм = 0.05% ТФК в воде = 0.05% ТФК в 100% МеСИ = 0% В - 60% В за 20 мин = 1.00 мл/мин = 215 нм

Буфер А

Буфер В

Градиент

Скорость потока

Длина волны

Масс- спектроскопия = ΜΑΓΟΙкислотой в качестве матрицы

Аналитическая ВЭЖХ, метод В

ТОГ с гентизиновой или а- цианогидрогсикоричной

Колонка

Градиент

Скорость потока

Длина волны

Масс-спектроскопия = Ε8I [скорость газа в распылителе: 1,5 л/мин; СОЬ - 20,0 В; СЭБ темп.: 250°С; Темп. блока: 200°С; напряжение (смещёние) в датчике: +4,5 кВ; Детектор: 1,5 кВ; Т. поток: 0,2 мл/мин; В конц.: 50% Н20/50% САИ.]

Аналитическая ВЭЖХ, метод С

Колонка

Буфер А

Буфер В

Градиент

Скорость потока

Длина волны

Объём инжекции = Хубае С18 218ТР54, 250 х 4.6 мм = 20 мл МеСИ и 2 мл ТФК в воде (общий объём 2000 мл) = 2 мл ТФК в воде (общий объём 2000 мл) = 25% В - 75% В за 27 мин = 1.00 мл/мин = 215 нм = 10 мкл

Биологические анализы и результаты

Ι. ΙΝ У1ТК.О анализы для определения аффинности и активности пептидов

Анализ аффинности к человеческому Υ2 рецептору

Аффинность тестируемых соединений к человеческому Υ2 рецептору определяют анализом конкурентного связывания, используя связывание 125Ι-ΓΥΥ в клетках СО8-7, транзиторно трансфецированных человеческим Υ2 рецептором стандартным методом трансфекции путём преципитации фосфатом кальция.

Трансфецированные СО8-7 клетки переносят в культуральные планшеты через день после трансфекции при плотности 40 х 10 клеток на лунку, добиваясь 5-8% связывания радиоактивного лиганда. Через два дня после трансфекции проводят эксперименты по конкурентному связыванию в течение 3 ч при 4°С, используя 25 пМ 125Ι-ΓΥΥ (Атегкйат, Ый1е Сйа1ί'οηΐ, иК). Анализы связывания проводят в 0,5 мл 50 мМ буфера Нерек, рН 7,4, дополненного 1 мМ СаС1₂, 5 мМ ΜдС1₂ и 0,1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина и 100 мкг/мл бацитрацина. Неспецифическое связывание определяют как связывание в присутствии 1 мкМ немеченого РΥΥ. Клетки дважды отмывают в 0,5 мл охлаждённого льдом буфера и добавляют 0,5-1 мл буфера для лизиса (8 М мочевина, 2% ИР40 в 3 М уксусной кислоте) и гаммасчётчиком считают связанную радиоактивность. Определения делают в двойном повторе. Связывания в стационарном (равновесном) состоянии достигают в этих условиях. Величины ЕС₅₀ рассчитывают, используя программу работы со стандартными фармакологическими данными, Рпкт 3.0 (дгарйРаб 8οίVа^е, 8ап ^^едο, и8А).

Анализ аффинности к человеческому Υ4 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ4 клетки СО8-7, в конкурентном анализе используют 125ГРР, и для определения неспецифического связывания используют РР.

Анализ аффинности к человеческому Υ1 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ1 клетки СО8-7 и переносят в культуральные

- 30 012071 планшеты при плотности 1,5 х 10⁶ клеток на лунку, в конкурентном анализе используют 125Ι-ΝΓΥ. и для определения неспецифического связывания используют Ν6Υ.

Анализ аффинности к человеческому Υ5 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ5 клетки СО8-7 и переносят в культуральные планшеты при плотности 5 х 10⁵ клеток на лунку. В конкурентном анализе используют 125Ι-ΝΓΥ, и для определения неспецифического связывания используют ΝΓΥ.

Результаты тестирования ΝΈΥ, РΥΥ, РΥΥ3-36, РР и трёх агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах аффинности даны в табл. 1:

Таблица 1

Агонист	Υ2 |	Υ1 |	Υ4
	1С50 Νγπ	8ΕΜ	η	ГС50 ΠΓΠ	8ΕΜ	η	1С50 ПГП	8ΕΜ	π
ΝΡΥ	0.30	0.07	4	2.3	0.3	4	26	5	4
ΡΥΥ	0.22	0.02	2	16	1	2	30	8	2
ΡΥΥ(3-36)	0.20	0,03	1 0	>1000		2	343	42	4
РР	>1000		4	>1000		1	0.41	0.05	11
РР2-26	>1000		3	>1000		2	0.64	0.04	4
[Суз2,О-Суз27]РР	>1000		3	>1000		2	8.2	1.1	4
[Суз2,Аос5-24,ОСуз27]РР	>1000		4	>1000		2	286	30	4
[Ηίε34]ΡΡ	>1000		2	>1000		2	0.48	0.03	2
(ΑΙ31,Ργο34]ΡΥΥ	>1000		2	176		1	4.4	1.6	2
[6Ιϋ4,ΡΓθ34]ΡΥΥ	>1000		2	99	23	2	2.4	1.2	2
(Агд26,Рга34]РУУ	177	9	2	15		1	0.43	0.09	2
[Μθί30,ΡΓθ34]ΡΥΥ	969	18	2	88	27	2	2.3	1.0	2
(ΑΙ330,Ργο34]ΡΥΥ	>1000		1	173		1	0.99		1
ΪΟΤΑΡΡΥ-	>1000		1	>1000		1	29		1
амид]х2 |[			I			I
[СЬТРРРУ- ΐ амид 1x2 ||	>1000		Ί	>1000		Ί	1.3		1

Анализ человеческой Υ2 рецепторной активности

Активность тестируемых соединений к человеческому Υ2 рецептору измеряют определяют в экспериментах доза-эффект в клетках СО8-7, транзиторно трансфецированных человеческим Υ2 рецептором, а также смешанным С белком, Οςί5, который гарантирует, что Υ2 рецептор связывается через Од путь, ведущий к повышению метаболизма инозит(ол)фосфатов.

Метаболизм фосфатидилинозитола

Через день после трансфекции клетки СО8-7 инкубируют в течение 24 ч, используя 5 мкКи [3Η]миоинозитола (Атегкйат, РТ6-271) в 1 мл среды, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 0,01 мг/мл гентамицина на лунку. Клетки дважды отмывают в буфере, 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, дополненном 140 мМ ЫаС1, 5 мМ КС1, 1 мМ Мд8О₄, 1 мМ СаС1₂, 10 мМ глюкозы, 0,05% (вес./об.) бычьей сыворотки; и инкубируют в 0,5 мл буфера, дополненного 10 мМ ЫС1, при 37°С в течение 30 мин. После стимуляции с помощью различных концентраций пептида в течение 45 мин при 37°С клетки экстрагируют 10% ледяной перхлорной кислотой с последующей инкубацией на льду в течение 30 мин. Полученные супернатанты нейтрализуют КОН в буфере НЕРЕ8 и полученный [3Н]-инозит(ол)фосфат очищают на анионообменной смоле Вю-Кай АС1-Х8 и считают с помощью бета-счётчика. Определения делают в двойном повторе. Величины ЕС50 рассчитывают, используя программу для работы со стандартными фармакологическими данными, Рпкт 3,0 (дгарНРай 8оРгаге, 8ап И1едо, И8А).

Анализ человеческой Υ4 рецепторной активности

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ4 клетки СО8-7.

Анализ человеческой Υ1 рецепторной активности

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ1 клетки СО8-7.

Анализ человеческой Υ5 рецепторной активности

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ5 клетки СО8-7.

Результаты тестирования ΝΓΥ, 6ΥΥ, РΥΥ3-36, РР и четырёх агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах активности даны в табл. 2:

- 31 012071

Таблица 2

Агонист	Υ2	Υ1	Υ4
	ЕС50 пт	8ЕМ	п	ЕС50 пт	ЗЕМ	п	ЕС50 пт	ЗЕМ	η
ΝΡΥ	1.5	0.5	11	1.7	0.4	11	167	56	7
ΡΥΥ	0.23	0.06	8	0.6	0.1	5	34	5	6
ΡΥΥ(3-36)	0.36	0.07	16	74	5	7	>1000		8
РР	>1000		8	83	13	5	0.64	0.07	17
РР 2-36	>1000		4	297	45	3	0.88	0.12	5
[Суз2,О-Суз27]РР	>1000		5	>1000		3	4.6	0.6	5
[Н1я34]-РР	>1000		4	>1000		4	1.2	0.0	4

II. ΙΝ νίΤΚΟ анализы для определения устойчивости белков

Важным показателем для многих пептидов по изобретению является устойчивость белков, в особенности устойчивость, например, к расщеплению ферментами, так как эти пептиды создаются так, чтобы иметь повышенную устойчивость по сравнению, например, с РΥΥ3-36, или даже повышенную устойчивость по сравнению с полноразмерньши РΥΥ и РР.

Устойчивость РР-складки определяют как устойчивость пептидов к расщеплению эндопептидазами, которые расщепляют, например, в области петли, которая является относительно гибкой (как описано в О'Наге, М. & Зсйетай/, Т.^. 1990 в Иедгабабоп о£ Вюасбуе 8иЬк1апсек: Рйукю1оду апб Ра(ЬорЬук1о1оду. I. Неппккеп, еб. СЯС Ргекк, Воса К.а1оп, Р1). В качестве модельного фермента используют эндопротеиназу Акр-Ν (Р1егсе). Этот фермент расщепляет на Ν-концевой стороне остатков Акр, например, между остатками 9 и 10 (Акр) РР. Пептиды инкубируют с эффективной дозой эндопептидазы Акр- Ν как указано производителем в 0,01 М Тпк/НС1 буфере, рН 7,5 при комнатной температуре и образцы извлекают через 24 ч. Образцы анализируют методом ВЭЖХ и затем проводят последовательное расщепление во времени. Пептиды сравнивают по стабильности с РΥΥ, РΥΥ3-36 и РР.

Устойчивость к аминопептидазам определяют как описано выше для эндопептидаз, но вместо них используют аминопептидазу Ν и дипептидилпептидазу IV. Некоторые из пептидов специально предназначены для того, чтобы быть устойчивыми к этим аминопептидазам, например РΥΥ2-36, ацилированные по Ν-концу пептидные производные и пептидные дериваты, алкилированные фрагментом, связывающим альбумин, на Ν-конце. Пептиды сравнивают по стабильности (устойчивости) с РΥΥ, РΥΥ3-36 и РР.

III. ΙΝ ЩТКО анализ для определения связывания с гликозаминогликанами (САС8)

Способность тестируемых соединений связываться с САС8 проверяют ίπ νίΙΐΌ анализом с применением иммобилизованного гепарина, т. е. гепарин-агарозы, в качестве аффинной матрицы. Применяют либо колонку Н1Тгар с гепарин-сефарозой (Атегкйат Рйагташа Вю1есй, Иррка1а, 8^ебеп), либо колонки с гепарином для ВЭЖХ, которые элюируют в 50-мин линейном градиенте 0-0,5 М №1С1 в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,3), содержащем 2 мМ ОТТ и 1 мМ МдЕИТА при скорости потока 1 мл/мин. Для регенерации колонку промывают 1 М №1С1 в буфере А в течение 51-55 мин.

IV. ΓΝ ννΟ исследование действия пептидов на аппетит, потребление пищи и массу тела

Действие селективных к Υ4 агонистов, на скорый приём пищи у мышей

Берут мышей линии ббу весом 34-37 г в возрасте 8-9 недель (1арап 8ЬС, ЗЫ/ииока, 1арап). Мышей индивидуально помещают в регулируемую среду (22°С, влажность 55%) с 12-часовым световым циклом день-ночь с включением света в 7 ч утра. Пищу и воду дают неограниченно, за исключением времени непосредственно перед экспериментами (см. ниже). Мышей акклиматизируют к подкожным инъекциям в течение недели перед началом экспериментов. Мышей в экспериментах используют по одному разу. Непосредственно перед применением пептиды разводят в физиологическом солевом растворе и вводят в виде подкожной инъекции в объёме 100 мкл. Результаты представлены как среднее +/- 8Е. Для оценки разницы между группами применяют дисперсионный анализ, а затем тест Бонферрони.

Мышей отлучают от пищи, но оставляют свободный доступ к воде за 16 ч до данного теста и эксперименты начинают в 10 ч утра на следующий день. Используют стандартную диету (СЬЕА 1арап, Шс., Току о, 1арап) и потребление пищи измеряют, вычитая вес несъеденной пищи из начальной предварительно взвешенной пищи после введения и проверки потерь пищи. Восемь животных в каждой группе получают физиологический раствор, 1 мкг РР2-36 или 10 мкг РР2-36 тестируемого соединения.

Результаты для РР2-36 (8ес.| ГО) в качестве испытуемого соединения даны на фиг. 2.

- 32 012071

Последовательности

ΝΡΥ (8ЕО ГО Νο: 1)

Н2М-Туг-Рго-8ег-Еу8-Рго-А5р-А8п-Рго-Сг1у-01и-А5р-А1а-Рго-А1а-01и-А5р-Мй-А1аАт§-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Аг§-Н18-Туг-11е-А8п-Ееи-Пе-Тйг-Аг£-Сг11ъАг£-Туг-СОМН2

ΡΥΥ (8Е0 II) Νο: 2)

Н2Н-Туг-Рго-Пе-Еуз-Рго-01и-А1а-Рго-01у-0!и-Азр-А1а-8ег-Рго-Сг1и-01и-Ееи-А8п-Аг§- ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг£-Н18-Туг-Ееи-Азп-Ееи-Уа1-Т11г-Аг£-(31п-Аг§-Туг-СО1Ш2

РР (8ЕЦ ГО ΝΟ: 3)

ΗίΝ-ΑΙα-ΡΓΟ-Εεο-ΟΙη-ΡΓΟ-ναΙ-ΤγΓ-ΡΓΟ-ΟΙγ-Αβρ-Αδη-ΑΙα-ΤΙιτ-ΡΓΟ-ΟΙυ-ΟΙη-ΜεΙ-ΑΙαС1п-Туг-А1а-А1а-Азр-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-11е-А8п-Ме1-Ьеи-Т11г-Аг8-Рго-Аг8-Туг-СОНН2 [Суз2Д}Суз27]-РР 8Еф ГО. Νο:4)

Н2?\’-Л1а-СуяХеХ7(Ук1.-РгоЛ'а1-Туг-Р1-о-<'1Е'-Лзр'А5П-А1а-Т1и--Рго-Сг1и-О1п-Ме<-А1а01п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ее!>Аг^-Аг§-(0-<ру8)-Пе-Азп-МеЕЕеи-Т11г-Аг§-Рго-Аг§-Туг- ΕΌΝΗ;

' 8 [Ьу$28,С1и32]РР25-36 (8ЕО ГО. Νο:5)

Н₂М-А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-Азр-Азп-А1а-Т11г-Рго-01и-0!п-Ме1-А1аС11п-Туг-А1а-А1а-Авр-Беи-Аг£-Аг£-Туг-Еуз-А5п-МеЕ-Ееи-01и-Аг§-Рго-Аг£-Туг-СОНН₂ [С1и28,Еуз32]РР25-36 (8ЕЦ ΙΟ. Νο:6).

Н2Н-А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-О1у-Азр-Азп-А1а-Т11г-Рго-О1и-С1п-МеХ-А1аСг1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг£-Аг£-Туг-С}1и-А5п-Ме1-Ееи-Еу5-Аг£-Рго-Аг£-Туг-СОНН2 ^-Εν^-ΤΗι'-ΑΓρ-ΡΓυ-Αιρ-Τνι-ΕΟΜΕ

Б-Суз-ТЬг-Агд-Рго-Аге-Туг-СОМЦ (8Е(2 ГО. Νο:7) ^-Су8-Ткг-Аг§-Рго-Аг«-Туг-<0\Н2

8-Суз-ТЬг-Аг_ё-НЬ-Аг_§-Туг-СС^Н2 (8 ЕС) ГО. Νο:8) [Суз2,Аос5-24,Осу«271-РР (8ЕЦ ΙΟ. Νο:9).

РР2-36 (8Е<2 ΙΟ. Νο:10).

Н2Н-Рго-Ееи-01и-Рго-''/а1-Туг-Рго-01у-Аяр-Азп-А1а-ТЬг-Рго-Сг1и-01п-Ме1-А1а-01пТуг-А1а-А1а-Азр-Ееи-Аг§-Аг@-Туг-11е-А8п-Ме1-Ееи-Ткг-Аг§-Рго-Аг2-Туг-СОМН2

ΙΗ18341-ΡΡ (8Е0 ГО. Νο:11).

Н2Н-А1а-Рго-Ьеи-Ст1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-Сг1у-А5р-А8п-А1а-ТЪг-Рго-Сг1и-С1п-МеЕА1а- 33 012071

О1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг£-Аг£-Туг-11е-Аш-МекЬеи-Т11г-Аг<’-Н15-А18-Туг-СОЫН₂ [А1а1,Рго34]-РУУ (8Е<2 ΙΟ. Νο:12).

Н₂Н-А1а-Рго-Пе-Ьу8-Рго-Сг1и-А1а-Рго-С1у-С1и-А8р-А1а-5ег-Рго-Сг1и-Сг1и-Ьеи-А5п-Агб;-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг8-Н13-Туг-Ьеи-АЕП-Ееи-Уа1-Т11г-Ат§-Рго-Аг8-Туг-СОЫН₂ [А1а2,Рго34[-РУ¥ (8Εζ> ГО. Νο:13).

Н₂А^т-Туг-А1а-11е-Еу5-Рго-Ст1и-А1а-Рго-О1у-С1и-А5р-А1а-8ег-Рго-С1и-(}1и-Ееи-Азп-Аг8-ТугТ_\т-А1а-.Чсг-1.си-Агй-Н1я-Т\т-Ьеи-А8п-1.сиЛ''а!-ТЬг-Аг^-Рго-Аг2-Т;_ут-СОМЪЕ [61и4,Ργο34]-ΡΥΥ (8Е0 ГО. Νο:14).

Н₂А-Т}Т-Рго-Пе-СИи-Рго-С|1и-А1а-Рго-С1у-С1и-Алр-А1а-8ег-Рго-61и-С|1и-Ее11-Лап-Агу-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Н1£-Туг-Ееи-Аап-Ееи-Уа1-Т11г-А1§-Рго-Аг§-Туг-СОМН₂ [Αγ«26,Ργο34]-ΡΥΥ (8Εζ> ГО. Νο:15).

Н₂М-Тут-Рго-Пе-Еу5-Рго-Сг111-А1а-Рго-Сг1у-С11и-А5р-А1а-8ег-Рго-Сг1и-Сг1и-Ееи-Ая1-Ап’-ТугТут-А1а-8ег-Ееи-Атс-.Аг₂-Т ут-Ееи-Азп-Ееи- V аЕТкг-Агд-Рго-Аг^-Т уг-СОМН₂ [Ι1ε28,ΡΓθ34]-ΡΥΥ (8Е<) ГО. Νο:16).

Н₂М-Туг-Рго-11е-Еуз-Рго-Сг]и-А]а-Рго-С1у-01и-Азр-А1а-8ег-Рго-01и-Сг1и-Ееи-А5Г1-Ап’-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Н18-Туг-11е-А5п-Ееи-'У'а1-ТЪг-Аг£-Рго-Аг£-Туг-СОКН₂ [Ме130,Рго34]-РУУ (8Е<) ГО. Νο:17).

Н₂Г)-Туг-Рго-Пе-Еуз-Рго-С1и-А1а-Рго-С1у-С;1и-А5р-А1а-8ег-Рго-О1и-Сг1и-Ееи-Азп-Аг£-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Ат§-Н13-Туг-Ееи-А5п-Ме1-Уа1-ТЬг-Аг8-Рго-Аг8-Туг-СОМН₂ ^-Су8-Ееи-ТЬг-Аг§-Рго-Аг§-Туг-СО>1Н₂

8-Су8-Ееи-ТЬг-Аг£-Рго-Аг£-Туг-С(ЖН2 (8Е0 ГО. Νο:18).

^-Су8-Ееи-ТЬг-Аг2-Н15-Аг§-Туг-СОМ1₂

8-С '8-Есч1-Пи’- Аг“-11Е-Аг-Туг-< О\1Ь (8Εζ) ГО. Νο:19).

[тетрадеканоил-А1а1]-РР (8Е<2 П> Νο:20)

СН;(СН₂)[₂СОЬН-А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Тут-Рго-Сг1у-А8р-А8п-А]а-Т11г.-Рго-С;1и61п-Ме1-А1а-С1п-Т уг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг§- Аг§-Т уг-11е-Аап-МеТТеи-ТЪг-Лтд-Рго-Аг§-Т угСОЫН₂ [тетрадеканоил-А1а1,Н1534|-РР (8Е<3 Ю Νο:21)

СН₂(СН₂)1₂СОМН-А1а-Рго-Ееи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-Азп-А1а-Тйг-Рто-61иС1п-Ме1-А1а-Стй1-Ту1'-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг£’-Аг£-Туг-11е-А8п-Ме1-Ееи-Т11г-Аг£-Н18-А1§-Туг· СО14Н₂ [Еу818,Н1834]-РР (8Εζ> ГО Νο:22)

Н2М-А1а-Рго-Ееи-01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-А8р-А8п-А1а-Тйг-Рго-61и-61п-Ме1-ЕузС1п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-11е-А5П-Ме£-Еси-ТЬг-Аг£(-Н18-Ат§-Туг-СОНН2 {Еу®18]РР (8ЕО ГО Νο:23).

Н₂М-А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Тут-Рго-Ст1у-Азр-А8п-А1а-ТЬг-Рго-(д1и-Сг1п-Ме1-ЕузС1п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-Пе-Азп-Ме1-Ееи-ТЪг-Аг§-Рго-Аг£-Туг-СОКН₂

- 34 012071

А!а-Лгя-Аг§-А1-А1а-Л1а-Лг£-А1а-А1г1-Агл;-Агд-Аго-А1а-А1а-А.Г5-А1а-А1а-А^г‘д-Агй- Αη>· А1а-А!а-Аг§-А1а-РР (8Εζ> ГО Νο:24).

Н₂Х-А1а-Аг2-Аг§-Аг£-А1а-А1а-А18-А1а-А1а-Агё-Аг8-Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а-А1а-А1£-Аг4;Агй-А1а-А1а-Аг§-А1а-А1а-Рго-Ееи-О1и-Рго-Уа!-Туг-Рго-61у-Азр-А5П-А1а-Т1и-Рго-О1и-С1пМе1-А1а-О1п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ееи-Аг§-Аг8-Туг-Пе-А8п-Ме(-Ьеи-ТЬг-Аг§'Рго-Аг§-ТугСОЬПН₂ [А1а1,С1и4,Рго34]-Р¥У (8Е<2 ГО Νο: 25)

Н₂Н-А1а-Рго-11е-01и-Рто-01и-А1а-Рго-01у-С}1и-А5р-А1а-8ег-Рго-61и-<а1и-Ееи-А5п-Аге-Т5тТ}т-А1а-8ег-Ьеи-Ал;-Н)5-Тут-Т.е11-Ат-Теи-\''а1-ТЬг-Агд-Рто-А.г2-Т>т-(’О\112 ^-Су5-Ьеи-ТЬг-Аг{’-Рго-Аг§-Туг-СО№1₂

8-Су$-Ьеи-ТЬг-Аге-НЬ-Аг8-Туг-С<ЖН₂ (8Е<Э ГО Νο: 26)

Еуз-Еуз-Еуз-Еуз-Ьуз-Ьуз-РР (8Е9 ГО Νο: 27)

ЕЕЕЕЕуз-Еуз-Еуз-Еуз-Еуз-Еуз А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-Азп-А1аТ11г-Рго-С1и-С1п-Ме1-А1а-Сг1п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ееи-Аг8-Агд-Туг-11е-А5п-Ме1-Ьеи-Т11Г-Аг8'

Рго-Лгу-Т уг-СОМН;

1ук-1 .у я-Еуя-Г-.у я-Х.уз-Ι .ул-) Ηί«Λ4| Р Р (8Е() ГО Νο: 28)

Н^Ь'-Еуз-Еуз-куз-Еуа-Еуз-Еуа А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-УаЕТуг-Рго-Сг1у-Азр-Азп-А1а~

ТЬг-Рго-61и-С1п-Ме1-А1а-01п-Туг-А1а-А1а-Азр-Ееи-Аг§-Агд-Туг-11е-Азп-МеРЕеи-ТЬг-Аг§Н15-Аг§-Туг-СОКН₂ ^-Суз-^-СХ'-гексадеканоилГгамма-глутамоилрЕуз-ТЬг-Аг^-Ееи-Аг^-ТугСОКЕЕ

8-Су5-Ееи-Тйг-Аг8-Ъеи-Аге-Туг-ССтН₂ (8Е9 ГО. Νο: 29).

МНСОСН_аСН_гСН(СООН)ЯНСО(СН₂)₁₄СН₃

8-Суз-1у5-ТЬг-Агд-Ееи-Аг§-ТугСОКН₂

I

8-Су5-Ееи-ТЬг-Аг§-Ееи-Аг£-Туг-СОНН₂

Ν-Ацетнл-РР (8Е<? ГО. Νο:30).

СН₃СОКН-А1а-Рго-Ееи-С1ц-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-А5р-Азп-А1а-Т11Г-РгО'СЬ-01п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-Азр-Ееи-Аг§-Аг§'Туг-11е-А5П-Ме1-Ееи-Т11г-Аг§-Рго-Аг§-Туг- С<)\Н₂ .8-(.8'-гексадеканоил)'Гамма-глу7амои.'!-РР (8Е<2 ГО Νο: 31).

СН₃(СН₂)₁₄СОЕШСН(СООН)СН2СН2СОШ-А1а-Рго-Ееи-О1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-О1у-А5рАзп-А1а-Т11г-Рго-(л1и-С1п-Ме1-А1а-С111-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-11е-Азп- МебЬеи· Т!и-Л.ге-Рго-.У'§-Туг-СОЕЗЕ· [Ν1ε17]ΡΡ (8Εζ) ГО. Νο:32).

Н₂К-А]а-1^о-Ееи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-61у-А5р-А$п-А1а-ТЬг-Рго-С1и-6Ь-1Ле-А1а-С1п-ТугА1а-А1а-А5р-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-11е-А5П-Ме(-Ееи-Т11г-Аг§-Рго-Аг§-Туг-СОКН2

- 35 012071 [Ν1β30]ΡΡ (8Е(? ГО. Νο:33).

Η₂Ν· А1а-Рго-Ьеи-СИи-Рго-Уа1-Туг-Рго-<31у’АЕр-А5п-А!а-ТЬг-Рго-С1и-(31п-Ме1-А1а(т1п-Тут-А1а-А1а-Акр-Ееи-Агд-Агд-Тут-Пе-А5п-\4е-Еец-Т11г-Агд-Рго-Ахд-Туг-СС|Х1Н?

[Ν1β17,Ν1ε30]ΡΡ (8Е<2 ГО. Νο:34).

Н2№А1а-Рго-Ееи-01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С!1у-А5р-А8П-А1а-Т11г-Рго-С1и'01П'М1е-А1а-01п-Туг·

Л1а-Л1а-Лзр-Ьеи-/'и'с-.Аге-Тут-11е-А8п-Х1е-Еси-Т1-<г-Агц-Рго-Агр-Тут-СОХН2 [N-(N4 ексаде1ганои.1)-гамма-глутамоил-Ьу513,№еЗ()]РР (8Е0 Ιϋ Νο: 35).

сн₃(сн₂)₁₄соннсн(соон)сн₂сн₂со:

Н₂К-А1а-Рго-Ьеи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-А5р-А5п-А1а-Еу5-Рго-С1и-01п-Ме1-А1а(Лп-Туг-А1а-А1а-А5р-Ьеи-Аг8-Аг8-Туг-11е-Азп-Х1е-Ееи-Т!п-Аг§-Рго-Аг§-Туг-СОМН2 [К-{(А1а-Аг§-Аг§-Аг8-А1а-А1а-Агё-А!а)3}-Ьу513]РР (8Еф ГО Νο: 36)

А1а-Агд-Агд-А1§-А1а-А1а-Агд-А1а)зСО1<Н

Н₂Ч-А1а-Рго-Ьеи-С1и-Рго-Уа!-Тур-Рго-01у-Азр-А8п-А1а-Еу5-Рго-С1и-С1п-Ме1-А1а'

С1п-Тут-А1а-А1а-А8р-Ьеи-Аг§-Аг£-Туг-Пе-А5п-МеГЕеи-ТЬг-Аг§-Рг<>Аг§-Туг-СО14Н2 [Ν1β17|ΡΡ2-36 (8Е<2 ГО. Νο:37).

Н₂К-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа!-Туг-Рго-С1у-Аар-А8п-А1а-Т11г-Рго-С1и-С1п-№е-А1а-С111-Туг-А1а·

АI а-Аяр-Еси-Агд-Агд-Т уг-Пе- Азп-Мοί-1.си-Пзг-Лгд-Рго-Лгд-Т ут-СОКН.

[Ме30]₽Р2-36 (8Е<2 ГО. Νο:38).

Н₂М-Рго-Ьеи-С11и-Рго-Уа1-Туг-Рго-61у-Аар-А8п-А1а-ТЬг-Рго-С1и-61п-Ме(-А1а-<31пТуг-А1а-А1а-А5р-Ьеи-Агд-Агд-Туг-Пе-Аап-ЬПе-Ееи-ТИг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОМНг

П'Ц№-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-Еу513]РР2-36 (8Ер ГО Νο: 39).

СН₃(СН₂)₁₃СОННСН(СООН)СН₂СН,СОКН

Н₂К-Рго-Ьеи-<31и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А5р-А5п-А1а-Ьуб-Рго-С1и-01п-Ме(-А1а-С1пТуг-А1а-А1а-А$р-Ееи-Аг§-Агд-Туг-11е-А8П-Ме1-Ееи-Ткг-Агд-Рго-Аг§-Туг-СОНН₂ (№{(А1а-Агд-Аг§-Агй-А1а-А1а-Агд-А1а)3}-Ьуз13]РР2-36 (8Е<2 ГО Νο: 40)

А1а-Агд-Агё-Агд~А1а-А1а-Агд-А1а)зСОЬ1Н

Н₂Н-Рго-Еси-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А5р-А5п-А1а-1_у5-Рго-СгЬ-<л1п-Ме1-А1а-С1пТуг-А1а-А!а-А5р-Ееи-Агд-Агд-Тут-Пе-А8п-Ме1-Ееи-Ткг-Адд-Рго-Агд-Туг-СОМН2 [Ν1β17,Ηί834]-ΡΡ (8Εζ) ГО. Νο;41).

Н2Н-А1а-Рго-Ееи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-О!у-А5р-А5п-А1а-Т11г-Рго-С1и-С1п-Ме-А1а-С1п-Туг· А1а- А1а- Азр-1 .ей-А гд- Агд-Т уг-Ие-Азп-МеЕ-Ьеи-ТИг-Агд-Жз-Агд-Т уг-СОБН₂ [№е30,НЬ34]-РР (8Е<2 ГО. Νο:42).

Н2М-А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А5р-А8П-А1а-Т11г-Рго-Сг1и-(31п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ееи-Агд-Агд-Туг-Пе-А5п-Н1е-Ееи-ТЬг-Агд-Н18-Агд-Туг-СО14Н2

- 36 012071 |Мк-17,МеЗО,Н|зЗ-1|-РР (8ЕЧ ГО. Νο:43).

Н2К-А1а-Рго-Ьеи-01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-01у-Азр-А5п-А1а-ТЬг-Рго-01и-01п-К1е-А1а-01п-ТугА1а-А1а-Азр-Ьеи-Аг£-Аг£-Туг-11е-А8п-Ы1е-Ееи-Т11г-Агц-Н18-Аг§-Туг-СОМН2

Р9-(1Ч'-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-Еу813,Н1з34]-РР (8 ЕС) ГО Νο: 44).

СН₃(СН₂)1₂СОМНСН(СООН)СН₂СН₂СОМН

Н₂Ы-А1а-Рго-Ееи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-Сг1у-Азр-Азп-А1а-Еуз-Рго-С1и-О1п-Ме1-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ьеи-Аг8-Аг8-Туг-11е-А5П-Ме1-Ееи-ТЬг-Аг8-Рго-Аг8-Туг-СОКН₂ [К-{(А1а-Аг_ё-Аг_е-Аг§-А1а-А1а-Аг_ё-А1а)3}-Еу813,Н1834]РР (8Е<2 ГО Νο: 45) (А1а-Аг§-Аг§-Аг§-А1а-А1а-Аг§-А1а)ЗСО14Н

Н₂М-А1а-Рго-Ьеи-01и-Рго-Уа1-Туг-Рго-<31у-А5р-А5п-А1а-Ьуз-Рго-01и-С1п-Ме1-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг@-Аг^-Туг-11е-А8п-Ме1-Ееи-ТЬг-Аг§-Рго-Аг§-Туг-СОЙН₂ [А1а30.Рго34|-Р¥У (8Ер ГО. Νο:46).

Н2Н-Туг-Рго-11е-Еу5-Рго-01и-А1а-Рго-01у-01и-А8р-А1а-5ег-Рго-01и-01и-Ееи-Азп-Аг8-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг8-Н1з-Туг-Ееи-Азп-А1а-Уа1-ТЬг-Аг8-Рго-Агд-Туг-СОМН₂

[.\-ф:'-тетрадека11опл)-гамма-глутамонл-Еу513.А1а30,Р|-о34|-Р¥¥ (8Е<) ГО Νο: 47).

СН₃(СН₂)1₂СОКНСН(СООН)СН₂СН₂СО>1Н

Н₂Ы-Туг-Рго-11е-Еуз-Рго-01и-А1а-Рго-С1у-С1и-Азр-А1а-Еуз-Рго-01и-01и-Ееи-Азп-Аг£- Туг

Туг-А1а-8ег-Ееи-Ат£-Н18-Туг-Ееи-А8п-А1а-Уа1-ТЬг-Аг§-Рго-Аг§-Туг-СОМН₂ [Су$249-(й'-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-Еу813Д)Су527]-РР (8ЕС) ГО Νο: 48).

СНз(СН₂)1₂СОМНСН(СООН)СН₂СН₂СОЬ1Н

Н₂М-А1а-С^у5-Ееи-611>£го-Уа1-Туг-Рго-С1у-А5р-А8п-А!а-Еу5-Рго-01и-С1п-МеЕА1аС1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ье1ьА1^А1^-(О-Су8)-11е-Азп-Ме1-Ееи-ТНг-Аг8-Рго-Аг8-Туг- (.'ОМЬ

8-Суз-1,еи-ТНг-Агд-1,еи-Аг£-Туг-СОМ12

I

8-Су8-Ееи-ТЬг-Аг§-Ьеи-Аг8-Туг-СОМН2 (8ЕО ГО. Νο: 49).

8-Су8-Ееи-ТЬг-Аге-Пе-Аг§-Туг-СОХН₂

I 8-Суз-Ъеи-1Ъг-Аг£-11е-Аг_е-Туг-СОКН₂ (8Ер ГО. Νο: 50).

[Ьеи34]-РР (8ЕС) ГО. Νο:51).

Н2Й-А1а-Рго-Ееи-О1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-О1у-А8р-А8п-А1а-Ткг-Рго-О1и-О1п-Ме1-А1аО1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг8-Агв-Туг-11е-А8п-Ме1-Ееи-ТЬг-Аг@-Ееи-Аг§-Туг-СОНН₂ [11е34]-РР (8Е<) Ю. Νο:52).

Н₂Ы-А1а-Рго-Ееи-С1и-Рго-Уа1-Туг-Рго-Сг1у-А8р-Азп-А1а-ТЬг-Рго-01и-<л1п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-А8р-Ееи-Аг§-Аг§-Туг-11е-Азп-Ме1-Ееи-Т11г-Аг8-11е-Агв-Туг-СОЫН₂ [РЬе34]-РР (8Е9 ГО. Νο:53). Н₂Ы-А1а-Рто-Ееи-СНи-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-Азр-А811-А1а-Ткг-Рго-Ст1и-01п-Ме1-А1аС]п-Туг-А1а-Ай-Л5р-Ееи-Агг-Агц-Туг-11е-Азп-\кЕЕс1гТ11г-А1а4Чи-Агс-Туг-СО’^ч.¹Н_? [Ьу513]РР2-36 (8Е<2 ГО Νο: 54) Н₂й-РгО-Ееи-Сг1и-РгО-Уа1-ТуЕ-РгС)-С1у-А8р-А8п-А1а-Еу8-РгО-Сг1и-С1п-МеУА1а-61п-ТугА1а-А1а-А5р-Ееи-Аг§-Аг£-Туг-11е-Азп-Ме(-Ееи-Т11г-Аг§-Рго-Аг8-Туг-СОМН₂ [№(8-(8-гамма-глутамоиламино-окганоиламино)-октаноил)- [Ьуз! 3]РР2-36 (8 Ер ГО Νο: 55)

Н₂ЫСН(СООН)СН2СН2СОЫН(СН2)7СОКН(СН₂)7СОМН

Н2Н-Рго-Ееи-61и-Рго-Уа1-Туг-Рго-61у-А8р-А8п-А1а-Еу8-Рго-01и-С1п-Ме(-А1а-С1пТуг-А1а-А1а-Азр-Ееи-Аг§-Аг£-Туг-11е-А5п-Ме1-Ееи-ТЪг-Аг§-Рго-Аг§-Тут-СОМН2

Приложение

Наша одновременно рассматриваемая Международная патентная заявка, озаглавленная Υ2 Селективные рецепторные агонисты для терапевтического воздействия, описывает применение Υ2 селективных агонистов для различных терапевтических и косметических целей, например, для лечения ожирения и избыточного веса, и состояний, при которых ожирение и избыточный вес рассматриваются как способствующие факторы.

Υ2 рецепторный агонист (агонист Υ2 рецептора) по этой заявке представляет собой агонист, который (а) представляет собой РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик, выбранный из ΡΥΥ, NΡΥ, миметиков ΡΥΥ и миметиков NΡΥ, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания и не содержат остатка тирозина, соответствующего Туг1 в

- 37 012071

Ν₽Υ, и/или не содержат остатка пролина, соответствующего Рго2 в ΝΓΥ, и/или не содержат остатка серина, аспарагина, глутамина, треонина, лейцина, изолейцина, Валина, метионина, триптофана, тирозина или фенилаланина соответствующего 8ег3 в NΡΥ, и/или не содержат остатка лизина или аргинина, соответствующего Ьу84 в NΡΥ и/или не содержат остатка, отличного от лейцина, в положении, соответствующем Ьеи24 в ΝΓΥ, и/или не содержат остатка, отличного от аргинина, в положении, соответствующем Агд25 в ΝΓΥ, и/или не содержат остатка, отличного от гистидина, в положении, соответствующем Н1826 в ΝΓΥ, и/или не содержат остатка, отличного от изолейцина, в положении, соответствующем Пе28 в ΝΓΥ и/или не содержат остатка, отличного от аспарагина, в положении, соответствующем А8п29 в ΝΓΥ, и/или не содержат остатка, отличного от лейцина или метионина, в положении, соответствующем Ьеи30 в ΝΓΥ; или (б) представляет собой РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик, выбранный из РР и РР-миметиков, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Υ2рецепторного распознавания и не содержат пролина, соответствующего Рго2 в РР, и/или не содержат изолейцина, соответствующего Пе3 в РР, и/или не содержат глутаминовой кислоты, соответствующего 61и4 РР, или (в) (ί) содержит С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания, слитую по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, включающим по меньшей мере один поворот альфа-спирали, прилегающий к Ν-концу указанной последовательности Υ2-рецепторного распознавания, причём указанный поворот сдерживается в спиральной конфигурации ковалентной внутримолекулярной связью, и (и), в случае, когда агонист имеет Ν-концевую структуру, аналогичную ΝΓΥ или ΡΥΥ, имеет одну или более модификаций, перечисленных выше, в п. (а), и в случае, когда агонист имеет Ν-концевую структуру, аналогичную РР, имеет одну или более модификаций, перечисленных выше, в п. (б).

В целом, агонисты типа (а) по данной заявке представляют собой РР-складчатые аналоги NΡΥ или ΡΥΥ, или РР-складчатые миметики ΝΓΥ или ΡΥΥ, содержащие модификации с целью значительно понизить их активности к Υ1 рецепторам, включая соединения, которые содержат остаток, отличный от Туг, Тгр или Рйе в положении, соответствующем Туг1 в ΝΓΥ, и/или остаток, отличный от Йе, Ьей, Уа1, Рйе, Тгр, Тут, 8ег, Тйг и А8п, в положении, соответствующем 8ег3 в ΝΓΥ, и/или остаток, отличный от лизина или аргинина в положении, соответствующем Ьу84 в ΝΓΥ. Такие агонисты включают пептиды, имеющие последовательность, идентичную последовательности человеческого ΝΓΥ, за исключением того, что в положении 1 находится остаток, отличный от Туг, Тгр или Рйе, и/или в положении 2 находится иной остаток, нежели Рго, и/или в положении 3 находится иной остаток, нежели Ьей, Уа1, Рйе, Тгр, Туг, 8ег, Тйг и А8п, и/или в положении 4 находится иной остаток, нежели лизин или аргинин.

В целом, агонисты типа (Ь) по данной заявке представляют собой РР-складчатые аналоги РР, или РР-складчатые миметики РР, содержащие модификации с целью значительно понизить их активности к Υ4 рецепторам и повысить их активность к Υ2 рецепторам. Они включают агонисты, имеющие С1п или аналогичный по структуре остаток в положении 34 и остаток, отличный от Рго, Туг, Рйе и Тгр в положении, соответствующем Рго2 в РР, и/или остаток, отличный от Йе, Ьей, Ме1 и Уа1, в положении, соответствующем Пе3 в РР, и остаток, отличный от С1и или А8р, в положении, соответствующем С1и4 в РР. Одна подгруппа агонистов этого типа состоит из пептидов, имеющих последовательность, идентичную последовательности человеческого РР, за исключением того, что в положении 34 находится остаток С1п, и/или в положении 2 находится иной остаток, нежели Рго, Туг, Рйе и Тгр, и/или в положении 3 находится остаток иной, нежели Ьей, Ме1 и Уа1, и/или в положении 4 находится иной остаток, нежели С1и или А8р.

Агонисты типа (с) по этой заявке характеризуются внутримолекулярной связью, которая либо не имеет эквивалента в нативных пептидах Ν₽Υ, ΓΥΥ или РР, либо соответствует нековалентному взаимодействию, либо замещает нековалентное взаимодействие с ковалентной связью, и включают соединения с последовательностью, идентичной последовательности человеческого РУГ, за исключением того, что внутримолекулярная связь, ограничивающая спиральный поворот, тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания в Ν-концевой части полипролинового домена. Такая связь может быть между остатками в положениях 5 и 20 или 8 и 16 и, особенно, в положениях 2 и 27, например, дисульфидная связь между О-Су8 в положении 27 и Су8 в положении 2. В другом наборе агонистов типа (с) внутримолекулярная связь, ограничивающая спиральный поворот, соединяет остатки в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например, лактамная связь между остатками Ьу8 и С1и в спиральном повороте, или между остатком в С-концевой аминокислотной последовательности Υ2распознавания и остатком в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали.

Будучи Υ2-селективными, все три типа агониста, рассматриваемые в этой заявке, имеют Сконцевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания. Один набор Сконцевых аминокислотных последовательностей Υ2-рецепторного распознавания, присутствующих в агонистах по изобретению, представлен последовательностью -Х-Тй^-А^д-Ту^-С(=О)NК¹К², где X не является ни основным, ни кислым остатком, К¹ и К², независимо, обозначают водород или С₁-С₆ алкил, или является её консервативно замещённым вариантом, в котором Тйг замещён на Н18 или А8п, и/или Туг замещён на Тгр или Рйе; и/или Агд замещён на Ьу8. Как К¹, так и К² может обозначать водород. Одна

- 38 012071 конкретная С-концевая аминокислотная последовательность Υ2-рецепторного распознавания представляет собой -11е-ТНг-Агд-С1п-Агд-Туг-С(=О)ХН₂, а другая -А1а-ТНг-Агд-С1п-Агд-Туг-С(=О)ХН₂.

Ν-конец указанного эпитопа и Ν-концевая аминокислотная последовательность по меньшей мере из двух аминокислот, причём указанные С-концевая и Ν-концевая аминокислотные последовательности соединены пептидными связями с линкерным радикалом, который может представлять собой линейный или разветвлённый алкиленовый радикал, необязательно содержащий одну или более двойных или тройных связей. Например, [Сук2,Аос5-24,^-Сук27]ΡУУ.

Ниже даны конкретные примеры Υ2 селективных агонистов, называемых в этой заявке:

ΡΥΥ2-36

ΝΡΥ2-36 (ϋ-Α181]ΡΥΥ [ϋ-Α1ι2]ΡΥΥ [А1а28]РУУ [А1аЗО]РУУ [А1а31]Р¥У {Ьуз4,О1п34]РР [Суз2,О-Суз27]РУУ [Су52,О-Су827]ЛРУ [Су52,11еЗ,О-Су527уа131 ]ΝΡΥ [Суз2, Аос5-24,0-Суз27]КРУ [Суз2, ПеЗ,Аос5-24,В-Суз27,Уа131]ЫРУ [Ьуз28,С1и32]РУУ25-36 [С1и28,Ьуз32]РУУ25-36 [ϋ-Α132]ΡΥΥ2-36 [Ьу54,Ьеи17,61п34]РР [Ьуз4,Ьеи17,Ьеи30,О1п34]РР [Ьуз4,Н1е17,Л1е30,61п34]РР [Суз2,ПеЗ,О-Суз27,Ьеи28уа131]ЫРУ [Суз2,11еЗ,Ме17,О-Суз27,КПе28,Уа131]ΝΡΥ [Сун2, ПеЗ,Аос5-24,Г>-Су827Уа131 ]ΝΡΥ [Суз2,Ьук13,О-Су527]РУУ

Claims (71)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение Υ4 рецепторного агониста, отличного от РР, селективного к Υ4 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами, для получения композиции для лечения состояний, восприимчивых к активации Υ4 рецепторов, причем:

   (а) указанный агонист является РР-складчатым пептидом или РР-складчатым пептидом-миметиком, который содержит:

   (ί) С-концевую аминокислотную последовательность Υ4-рецепторного распознавания, представленную как Х-Тйг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ИК¹К², где Л¹ и Л независимо обозначают водород или С1С₆алкил, X обозначает Уа1, 11е, Ьеи или А1а, а X³ обозначает остаток, отличный от С1п, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТНг замещён на Н1к или Акп, и/или Туг замещён на Тгр или ΡΙ/е; и/или Агд замещён на Ьук, и (и) Ν-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как Η₂Ν-Χ'-Ριό-Χ^:-(Ό1ιι или Акр)-, где X¹ отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X² обозначает Ьеи, 11е или 8ег или их консервативную замену, или (б) указанный агонист содержит С-концевую аминокислотную последовательность Υ4рецепторного распознавания по определению, данному в (1), указанную последовательность, связанную с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанной гексапептидной последовательности, причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации за счёт ковалентной внутримоле

   - 39 012071 кулярной связи, и, необязательно,

   И-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Υ4рецепторного распознавания по определению, данному в (и); или (в) указанный агонист содержит две ковалентно связанные С-концевые аминокислотные последовательности Υ4-рецепторного распознавания, каждая из которых содержит последние четыре остатка последовательности по определению, данному в (ί).
2. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агониста каждый из В¹ и В² обозначает водород.
3. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания остаток X³ не обозначает Акп.
4. 4. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания остаток X³ не обозначает Бук, Агд, Акп или С1и.
5. 5. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания остаток X³ обозначает Рго.
6. 6. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания остаток X³ обозначает Н1к.
7. 7. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания остаток X³ обозначает неприродный аналог Рго, выбранный из 4гидроксипролина, азетидин-2-карбоновой кислоты, азетидин-3-карбоновой кислоты, азапролина и 1аминоциклобутанкарбоновой кислоты.
8. 8. Применение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что в С-концевой последовательности Υ4рецепторного распознавания агониста остаток X представляет собой Беи.
9. 9. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевой гексапептид, представленный как -Х^А-Х-ТЬ^-Α^д-X³-Α^д-Ту^-С(=О)ИВ¹В², где остаток X^Α является не основным и не кислым, а последовательность -Х-ТИг-Агд^-Агд-Туг-С^О^В² определяется по любому из пп.1-8.
10. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что в С-концевой гексапептидной последовательности указанный не основной и не кислый аминокислотный остаток Х^А представляет собой Беи или Μеΐ.
11. 11. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевой ундекапептид, представленный как -X^С-Ту^-X^Β-Αкη-Х^А-Х-ТЬ^-Α^д-X³-Α^д-Ту^-С(=О)ИВ¹В², где последовательность -Х^А-XТЬ^-Α^д-X³-Α^д-Ту^-С(=О)NВ¹В² имеет значение по определению в п.9 или 10, X'' обозначает Агд или Бук, а X^е обозначает Не, Беи или Уа1.
12. 12. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность -Агд-Туг-Пе-Акп-(Беи или Μеΐ)-^еи-ТЬ^-Α^д-(Р^ο или Н1к)-Агд-Туг-С(=О)ИН₂.
13. 13. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность, представленную как -X -Туг^ -Акп^ -Х-ТНг-Агд-К -Агд-Туг-С(=О)ИВ В , где последовательность -Х^А-Х-ТЬ^-Α^д-X³-Α^д-Ту^-С(=О)ИВ¹В² имеет значение по определению в п.9 или 10, X' обозначает Н1к, Акп или С1п, а X^е обозначает Не, Беи или Уа1.
14. 14. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность -Н1к-Туг-(Не или ^еи)-Αкη-^еи-(Уа1/Ηе)-Тй^-Α^д-(Р^ο или Н1к)-Агд-Туг-С(=О)ИН₂.
15. 15. Применение по любому из пп.1-14, отличающееся тем, что в И-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агониста остаток X¹ при его наличии представляет собой А1а, или он отсутствует.
16. 16. Применение по любому из пп.1-15, отличающееся тем, что в И-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агониста остаток X² при его наличии представляет собой Беи, Не или 8ег.
17. 17. Применение по любому из пп.1-14, отличающееся тем, что И-концевая последовательность представляет собой Н₂И-А1а-Рго-Беи-С1и- или Н₂И-Рго-Беи-С1и-.
18. 18. Применение по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь), с И-концевой последовательностью Υ4-рецепторного распознавания и имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания на И-концевом участке агониста, соответствующем домену полипролина РР-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
19. 19. Применение по п.18, отличающееся тем, что в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой дисульфидную или лактамную связь.
20. 20. Применение по п.19, отличающееся тем, что ковалентная внутримолекулярная связь в агонисте является дисульфидной связью, образующейся между остатком Б- или Ό-Сук в альфа-спирали и остатком Сук, расположенным на И-концевом участке агониста, соответствующем домену полипролина РРскладчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
21. 21. Применение по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь), и в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой лактамную связь, образованную между остатками Бук и С1и в указанном спиральном повороте или между остатком Бук или С1и в указанном спиральном повороте и остатком С1и или Бук в С-концевой последо

    - 40 012071 вательности У4-рецепторного распознавания.
22. 22. Применение по любому из пп.1-17, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (а) или (Ь) и содержит как С-концевую гексапептидную последовательность У4-рецепторного распознавания по определению в п.1 или в любом из пп.2-14, так и Ν-концевую последовательность Υ4рецепторного распознавания по определению в п.1 или в любом из пп.15-17, причём указанная Сконцевая гексапептидная последовательность по своему Ν-концу связана с аминокислотной последовательностью амфифильного домена, содержащего по меньшей мере один поворот альфа-спирали, прилегающий к Ν-концу гексапептидной последовательности, и указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности связаны пептидными связями, соответственно, с карбоксильной и аминогруппами аминокислоты формулы ΝΗ₂(ΟΗ₂)_ΜΟΘ₂Η. где η обозначает целое число от 2 до 12.
23. 23. Применение по п.22, отличающееся тем, что η обозначает 6, 7, 8, 9 или 10.
24. 24. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой агонист типа (с), а две последовательности связаны мостиковой связью, по меньшей мере, между одной парой остатков, локализованных на расстоянии по меньшей мере 4 остатков от С-конца каждой из двух последовательностей.
25. 25. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой агонист типа (с), а две последовательности связаны парой мостиковых связей между двумя парами остатков, локализованных на расстоянии по меньшей мере 4 остатков от С-конца каждой из двух последовательностей.
26. 26. Применение по п.24 или 25, отличающееся тем, что мостиковая(ые) связь(и) образована(ы) дисульфидным мостиком между двумя цистеиновыми остатками или амидной связью между 3аминогруппой остатка 2,3-аминопропионовой кислоты в одной последовательности и карбоксильной группой боковой цепи остатка другой цепи, или мостиком -(СН₂)1_-6, образованным бис-аминокислотой НООССН(МН₂)(СН₂)1_-6СН(МН₂)СООН, концы которой образуют остаток в каждой соответствующей последовательности.
27. 27. Применение по любому из пп.24-26, отличающееся тем, что две ковалентно связанные Сконцевые аминокислотные последовательности Υ4-рецепторного распознавания не являются идентичными.
28. 28. Применение по любому из пп.24-27, отличающееся тем, что две ковалентно связанные последовательности содержат, по меньшей мере, последние 5 или последние 6 остатков С-концевой последовательности по любому из пп.1-14.
29. 29. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист выбирают из [Суз2,Е>Су827Ь РР (8Еф ГО. Νο:4).

    [Ьуб28,О1и32]РР25- 36 (5Еф ГО. Νο:5).

    [О1и28,Ьу,32 ]РР25- 36 (8Ер ГО. Νο:6).

    [Су«2,Аос5- 24Д)су827]- РР (8Еф ΙΌ. Νο:9).

    РР2-36 (5Еф ГО. Νο: 10).

    [Н1534]-РР (5Еф ГО. Νο: И).

    - 41 012071 [А1а1 ,Рго34]- ΡΥΥ (5Е0 ГО. Νο:12).

    [А1а2,Рго34]- ΡΥΥ (8Еф ГО. Νο: 13).

    [01и4,Рго34]- ΡΥΥ (8Е0 ГО. Νο:14).

    [Аг^26,Рго34]- ΡΥΥ (£Εζ) ГО. Νο:15).

    [Пе28,Рго34]- ΡΥΥ (8Ε<2 ГО. Νο:16).

    [Ме130,Рго34]- ΡΥΥ (8Εζ) ГО. Νο: 17).

    [А1а1,01ιι4,Ργο34]- ΡΥΥ (8Ε0 ГО Νο: 25).

    [К1е!7]РР (8Εζ) ΙΌ. Νο:32).

    (ΝΙε30]ΡΡ (8Ες> Ю. Νο:33).

    [Νΐεΐ7,Ν1ε30]ΡΡ (5Ε<2 ΙΌ. Νο:34).

    [Ν1ε17]ΡΡ2- 36 68Εζ) Ю. Νο:37).

    [Ν1ε3Ο]ΡΡ2-36 (8Ε0 ΙΌ. Νο:38).

    [Νΐεΐ7,Ηΐδ34]- ΡΡ (8Εζ) ГО. Νο:41).

    [Ме30,Нк34]- РР (8ЕЦ ГО. Νο:42).

    [Νΐεΐ7,ΝΙο30,ΗΪ834]- РР (8Ε0 ГО. Νο:43).

    [А1а30.Рго34|- ΡΥΥ (8Εζ) ГО. Νο:46).

    [Ъеи34]- РР (δΕφ ГО. Νο:51).

    [Не34]- РР (8Ε0 ГО. Νο:52).

    [№е34]- РР (8Ε0 ГО. Νο:53).

    [Ьу$13]ΡΡ2- 36 (ЗЕС2 ГО Νο: 54)

    З-Сув-ТЬг-Аф-Рго-Аф-Туг-СОЫНг

    З-Сув-ТЪг-Агдд’га-Агд-Туг-СОЫНг (8Ε010. Νο:7).

    3-Суэ-|_ви-Тк1г-Агд-Рго-Агд-Туг-СОМН₂

    5-Су&-1ви-ТЬг-Агд-Рго-А1д-Туг-€ОМН_а (8ΕΟ Ю. Νο:18).

    8-Су»4ли-ТПг-Агд-Н18-Агд-Туг-С0МН₃

    5-СувЧ.еи-ТЪг-Агд-Н<4-А1а-Туг-С0МН_г (ЗЕО10. Νο:1Β).

    3-СувАви-ТЬг-А1^1еи-Агд-Туг-ССМНг

    8-Сув-1е1ьТЪг-Агн4ли-Агб-Туг-С0ЫН₂ (8ЕЭ Ю. Νο: 49).

    З-Суэ-кеи-ТЬг-Агд-Ие-Агд-Туг-СОМНг

    5-Су5-1еи-ТНгАгд-11»Агд-Туг-С0МН₂ (ЗЕО10. Νο: 50).

    и их аналогов с консервативными заменами.
30. 30. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой РР2-36 (8Еф ГО Νο: 10), [Нк34]-РР (8Еф ГО Νο: 11) или [Су82,ПСу827]-РР (8Еф ГО Νο:4) и их аналоги с консервативными заменами.
31. 31. Применение по любому из пп.1-23 или 30, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему Ν-концу с целью придать резистентность к аминопептидазной активности.
32. 32. Применение по пп.31, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему Ν-концу ацилирующей группой с углеродной цепью, содержащей 2-24 углеродных атома.
33. 33. Применение по п.32, отличающееся тем, что агонист ацетилирован по своему Ν-концу, в частности, Ν-ацетил-РР (8Εφ ГО Νο: 30).
34. 34. Применение по любому из пп.1-33, отличающееся тем, что агонист содержит мотив связывания с сывороточным альбумином, или мотив связывания с гликозаминогликаном (САС), или мотив, индуцирующий спираль, или является ПЭГилированным.
35. 35. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания с сывороточным альбумином представляет собой липофильную группу.

    - 42 012071
36. 36. Применение по п.35, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа содержит необязательно замещённую, насыщённую или ненасыщённую, линейную или разветвлённую углеводородную группу, включающую 10-24 углеродных атома.
37. 37. Применение по п.35 или 36, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа представляет собой боковую цепь или часть боковой цепи каркаса (скелета) агониста.
38. 38. Применение по п.37, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, связана с остатком в каркасе молекулы простой эфирной, тиоэфирной, амино, сложноэфирной или амидной связью.
39. 39. Применение по п.38, отличающееся тем, что в агонисте боковую цепь, содержащую липофильную группу, выбирают из группы, состоящей из

    СНз(СН₂)_пСН(СООН)МН- СО(СН₂)₂СХ)МН-, где п обозначает целое число от 9 до 15,

    СНз(СН₂)_гСО- ННСН(СООН)(СН2)гСО31Н-, где г обозначает целое число от 9 до 15. и

    СН1(СН₂),СО- ИНСН((СН2ЬСООН)СОЬ1Н-, где к обозначает целое число от 9 до 15.

    СН₃(СН₂)_ГОСОР1Н-, где ш обозначает целое число от 8 до 18,

    -КНСОСН((СН₂)₂СООН)\Н- СО(СН₂)_РСН₃, где р обозначает целое число от 10 до 16, и

    -МНСО(СН₂)₂СН(СООН)Г<Н- СО(СН₂)_ЧСН₃, где ς обозначает целое число от 10 до 16.

    СН₃(СН₂)пСН(СООН)ННСО-, где η обозначает целое число от 9 до 15,

    СН₃(СН2)рМНСО-, где р обозначает целое число от 10 до 18,

    -СОКНСН(СООН)(СН₂)4КН- СО(СН₂)_тСН₃, где т обозначает целое число от 8 до 18,

    СО,МНСН(СООНХСН2)₂АН- СОСН((СН₂)₂СООН)ЧН- СО(СН₂)_рСН₃, где р обозначает целое число от 10 до 16,

    -СОМНСН(СООН)(СН₂)4Ь1Н- СО{СН₂}2СН(СООН>НН-СО(СН₂)_чСНз, где д обозначает целое число от 10 до 16, и частично или полностью гидрированнового циклопентанофенантренового скелета.
40. 40. Применение по п.37, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой С₁₂, С₁₄, С₁₆ или С₁₈ ацильную группу, ацилирующую аминогруппу, присутствующую в боковой цепи каркасного остатка агониста.
41. 41. Применение по п.37, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой тетрадеканоильную группу, ацилирующую аминогруппу, присутствующую в боковой цепи каркасного (скелетного) остатка агониста, например

    Ν- (Ν'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- РР (8Е<2 ГО Νο: 31).

    [Ν-( Ν’- гексадеканоил)- гамма- глутамоил - Ьу® 13,ЭДе30]РР (5Еф ГО Νο: 35).

    [Ν-(Ν'- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил - Ьуз13]РР2-36 (8Еф Ιϋ Νο: 39).

    (Ν-(Ν’- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьуз13,Н1з34]-РР ($Εζ) ГО Νο: 44).

    [Ν-(Ν'- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил - Ьуз13,А1а30,Рго34]-Р¥У (8Εζ) ГО

    Νο: 47).

    [Суз2,№ (Ν'- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьу513ГОСуз27]- РР (3Εζ) ГО Νο:

    48).

    [Ν- (8- (8-гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)- (Ьуз 13]РР2- 36 (5Е(? ΙΟ Νο: 55) или

    8-Суз-[Н-(Н'-гексалеканонл)-гамма-глутамоил)-Ьуз-Ткг-Аге-Ьеи-Агё'Туг-СОЫН₂ З-Суз-Ьеи-ТЬг-Агц-Ьеи-Агб-Туг-ССМЩ (8Е<2 ГО, Νο; 29), или их консервативно замещённый аналог.
42. 42. Применение по п.35, отличающееся тем, что агонист представляет собой [тетрадеканоил-А1а1]РР (8ЕЦ ГО Ыо: 20) или [тетрадеканоил-А1а1, Κ^^ΡΡ (8ЕЦ ΙΌ Ыо: 21) или их консервативно замещён

    - 43 012071 ный аналог.
43. 43. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив представляет собой аминокислотную последовательность, которая является боковой цепью или частью боковой цепи каркаса агониста.
44. 44. Применение по п.43, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
45. 45. Применение по п.43 или 44, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив является конкатамерным или дендримерным.
46. 46. Применение по любому из пп.43-45, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного САС-связывающего мотива и ипсилонаминогруппой ^κ18,Ηίκ34]-ΡΡ (8Ер ГО Ыо: 22) или ^κ18]ΡΡ (8ЕО ГО Ыо: 23).
47. 47. Применение по пп.43-45, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного САС-связывающего мотива и ипсилон-аминогруппой ^κ18,Ηίκ34]-ΡΡ (8Е0 ГО Но: 22) или ^κ18]ΡΡ (8Е0 ГО Но: 23).
48. 48. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив ковалентно связан с С- или Ν-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал.
49. 49. Применение по п.48, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с Ν-концом агониста.
50. 50. Применение по п.48 или 49, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
51. 51. Применение по п.48 или 49, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность [ХВВВХХВХ]_п, где η обозначает число от 1 до 5, В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
52. 52. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте ПЭГ (ГЕС) обозначает полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид с молекулярной массой не более примерно 20 кДа.
53. 53. Применение по п.34, отличающееся тем, что агонист представляет собой РР или [Ηίκ34]ΡΡ (8ЕО ΙΌ №: 11).
54. 54. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с С- или Ν-концом агониста.
55. 55. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с Ν-концом агониста.
56. 56. Применение по п.54 или 55, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит

    4-20 аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, Тйг, Туг, Акп, С1п, Акр, С1и, Ьук, Агд, Ηίκ, Ме!, От, и аминокислотных остатков формулы -ΝΗ-^Κ'χΚ²)-^-, где К¹ обозначает необязательно замещённый С1 -С₆алкил, фенил или фенилметил, или К¹ и К² вместе с атомом С, с которым они связаны, образуют циклопентильное, циклогексильное или циклогептильное кольцо.
57. 57. Применение по п.54 или 55, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4, 5 или 6 остатков Ьук.
58. 58. Применение по п.55, отличающееся тем, что агонист представляет собой Ьук-Ьук-Ьук-Ьук-ЬукЬук-ΡΡ (8ЕО ГО №: 27) или ^уκ-^уκ-^уκ-^уκ-^уκ-^уκ-[Η^κ34]-ΡΡ (8ЕО ГО №: 28).
59. 59. Применение по любому из пп.35-41, 43-45 или 53, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания с сывороточным альбумином, или САС-связывающий мотив, или ПЭГ радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного углерода, соответствующего любому из нижеприведённых положений ΡΥΥ или РР: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32, или соответствующего любому из нижеприведённых положений ΝΡΥ: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.
60. 60. Υ-Рецепторный агонист, селективный к Υ4 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами, выбранный из

    - 44 012071 [Су82,ОСуя27]- РР (5Е<2 ГО. Νο:4). [Ьу828,6!и32]РР25- 36 (8Е(? ГО. Νο:5). (О1и28,Ьу832]РР25- 36 (5ЕЦ ГО. Νο:6). (Су$2,Аос5- 24,|Эсу$27]- РР (8ЕЦ ГО. Νο:9). РР2- 36 (8ЕЦ ГО. Νο: 10).

    [Н1834]- РР (8ЕЦ ГО. Νο: 11).

    [А1а1 ,Рго34]- ΡΥΥ (8Εζ) ГО. Νο:12). [А1а2,Рго34]- ΡΥΥ С5ЕС) ГО. Νο:13). 1О1и4,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕО ГО. Νο:14). [Агд26,Рго34]- ΡΥΥ 18ЕЦ ГО. Νο: 15). [11е28,Рго34]- ΡΥΥ (8ЕЦ ГО. Νο:16>. [Ме130,Рго34]- ΡΥΥ (8Е<> ГО. Νο: 17). [А1а1,6к|4.Рго34]- ΡΥΥ (ЗЕЦ ГО Νο: 25). [Ме17]РР(8Е<2 ГО. Νο:32).

    [МеЗО]РР (8Е<2 ГО. Νο:33). [Ν1ε17,ΝΙβ30]ΡΡ (8ЕС2 ГО. Νο:34).

    [Νΐε 17]РР2- 36 (5Е<2 ГО. Νο:37). [Ν1β30]ΡΡ2-36 18Еф ГО. Νο:38). [Ν1ε17,ΗΪ834]- РР (ЗЕЦ ГО. Νο:41). [Ν1ε3Ο,Ηίκ34]- РР (8Ер ГО, Νο:42), [Ν1ε17,Ν1ε30,Ηΐκ34]- РР (8ЕЦ ГО. Νο:43). [А1а30,Рго34|- ΡΥΥ (8ЕЦ ГО. Νο:46). [Ьеи34]-РР (8ЕЦ ГО. Νο:51).

    [Не34]- РР (8Е<2 ГО. Νο:52). [РЬе34]- РР (8Е9 ГО. Νο:53).

    [Бук 13]РР2- 36 (8ЕЦ ГО Νο: 54)

    - 45 012071

    5-Су8-П1Г-Агд-Рго-Агв-Туг-СОКН₂

    3-Су8-ТЪг-Агд-Рго-Агд-Туг-С0ИН₂ (8ЕО ГО. Νο:7).

    8-Суз-Ееи-ТЬг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОМН1

    3-Сус-Ееи-Т1и-Агд-Г^о-Агд-Туг-СОМН₃ (8Е0 ГО. Νο:18).

    ЗЮу8-йвшТ6г-Аго-Н1в-Агд-Туг-С011Н_г

    3-Су8<еи-Тйг-Аг5-Н1з-Агд-Туг-СОНН_г (3ΕΩ Ю. Νο:10).

    5- Су8-Сви-ТЬг-Агд-1еи-Агд-Туг-С0МН_а

    3-Су®-1_еи-7Ъг-АгдАеи-Аго-Туг-СОНН₂ (8Е010. Νο: 49).

    8-Суа4ли-Т11Г-Аф41егАгд-Ту!Ч1ОМН»

    6- Суэ-Геи-Тйг-Аго-ИетАгп-Туг-СОМНг (ЗЕО Ю. Νο: 50).

    Ν- Ацетил- РР (5Е(2 ГО. Νο:30).

    Ν- (Ν'- гексалеканоил)- гамма- глутамоил- РР (8Е<2 Ю Νο: 31).

    [Ν-( Ν’- гексалеканоил)- гамма- глутамоил - Ьу513Л^т1е30]РР(8ЕО Ю Νο: 35).

    [Ν-(Ν-тетрадеканоил)- гамма- глутамоил-Ьу513]РР2-36 (8Εζ)ГО Νο: 39).

    (Ν-(Ν'- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьу813,Н1534]-РР(8Ер ГО Νο: 44).

    [Ν-(Ν'- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил - Еу$13.А1а30,Р1о34]-РУУ (8Εζ) ГО

    Νο: 47).

    [€νϊ2,Ν- (Ν’- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьу513,Е>Су827]- РР (8Εζ) ГО Νο:

    48).

    [Ν- (8- (8-гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)- [Еу$13]РР2- 36 (8Ер ГО Νο: 55)

    -С γδ-[Ν-(Ν’-гексалеканоил (-гамма-глутамоил)-Ьу5-ТЬг-Аг|г-Ееи-Агд-Туг-СС>НН2 -Сув’Ееи-ТЬг-.лГб-Есо-Агв-Туг-Си^Нг (8Е() П>. Νο: 29).

    [Ν- |(А1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а;3}- Ьу513]РР (8Е0 Ю Νο: 36) [Ν- ((А1а- Агд- Агд- Агд- А1а~ А1а- Агд- А1а)3)- Ьу813]РР2-36 (8ЕС> ГО Νο: 40) [Ν- ((А1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а)3}- Еу43,Нй34]РР (8Е0 ГО Νο: 45) и их аналоги с консервативными заменами.
61. 61. Υ-Рецепторный агонист, селективный к Υ4 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ2 рецепторами, выбранный из РР2-36 (8 ЕС) ГО Νθ: 10) и [Н1834]-РР (8ЕС) ГО Νθ: 11) или [Су82,ПСу827]-РР (8 ЕС) ГО Νο:4), и их консервативно замещённые аналоги.
62. 62. Способ лечения состояний, восприимчивых к активации Υ4 рецепторов, заключающийся во введении нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества Υ4 селективного рецепторного агониста по любому из пп.60-61.
63. 63. Применение по любому из пп.1-59, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показаны регуляция потребления энергии или энергетического метаболизма, контроль кишечной секреции, снижение моторики желудочно-кишечного тракта или замедление опорожнения желудка.
64. 64. Применение по п.63, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой ожирение или избыточный вес, или состояние, при котором ожирение или избыточный вес рассматривается как способствующий фактор.
65. 65. Применение по п.64, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой воспалительное заболевание кишечника, булимию, нейрогенную булимию, синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (МТООМ), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечнососудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, ифаркт миокарда,

    - 46 012071 заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезнь желчного пузыря, остеоартрит, остановку дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.
66. 66. Применение по любому из пп.1-59, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой диарею или кишечную гиперсекрецию.
67. 67. Применение по любому из пп.1-59, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой тошноту или рвоту.
68. 68. Применение по любому из пп.66 или 67, отличающееся тем, что подлежащее лечению состояние тошноты или рвоты является состоянием, которое возникает или ожидается в результате лечения другим фармацевтическим агентом.
69. 69. Применение по любому из пп.63-68, отличающееся тем, что агонист, селективный к Υ4 рецептору, содержит ОАО-связывающий мотив.
70. 70. Применение по любому из пп.63-68, отличающееся тем, что агонист, селективный к Υ4 рецептору, содержит мотив связывания с сывороткой (сывороточным альбумином).
71. 71. Применение по любому из пп.63-68, отличающееся тем, что агонист, селективный к Υ4 рецептору, является ПЭГилированным.