EA011860B1

EA011860B1 - Селективные агонисты рецептора y2 для терапевтического воздействия

Info

Publication number: EA011860B1
Application number: EA200601721A
Authority: EA
Inventors: Ту Шварц
Original assignee: 7ТиЭм ФАРМА А/С
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2009-06-30
Also published as: JP2007531713A; BRPI0507585A; AU2005224026A1; EP2272524A3; EP1807099A2; MXPA06010347A; WO2005089789A2; EP2272524A2; WO2005089789A3; EA200601721A1; CA2559838A1; IL177683A0

Abstract

Раскрываются Y рецепторные агонисты, отличные от PYY 3-36, селективные к Y2 рецептору по сравнению с Y1 и Y4 рецепторами, и их применение для лечения состояний, восприимчивых к активации Y2 рецепторов. В широком смысле Y2-селективный агонист является агонистом, который представляют собой (а) РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик, выбранный из PYY, NPY, миметиков PYY и миметиков NPY, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания и имеют различные модификации относительно природных пептидов, или (б) РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид-миметик, выбранный из РР или РР-миметиков, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Y2-рецепторного распознавания и имеют различные модификации относительно природного пептида, или (с) содержат С-концевую аминокислотную последовательность Y2-рецепторного распознавания, слитую (связанную) по своему N-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к N-концу указанной последовательности, и в случае, когда агонист имеет N-концевую структуру, аналогичную NPY или PYY, она имеет одну или более модификаций, перечисленных в (а), см. выше, и в случае, когда агонист имеет N-концевую структуру, аналогичную РР, она имеет одну или более модификаций, перечисленных в (б).

Description

Данное изобретение относится к пептиду или пептидным соединениям, которые ведут себя как селективные агонисты Υ2 по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, и их применению при лечении состояний, чувствительных к активации Υ2 рецепторов, например при лечении ожирения и избыточного веса, и состояний, при которых они рассматриваются как содействующие факторы, и для стимуляции гиперсекреции.

Предпосылки создания изобретения

Семейство пептидов с РР-складкой.

ΝΡΥ (нейропептид Υ) (человеческая последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:1), ΡΥΥ (пептид ΥΥ) (человеческая последовательность 8ЕО ΙΌ Νο:2) и РР (панкреатический пептид) (человеческая последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 3) являются секретируемыми в природе гомологичными, содержащими последовательность из 36 аминокислот, амидированными по С-концу пептидами, которые характеризуются общей трёхмерной структурой - РР-складкой, поразительно устойчивой даже в разбавленном водном растворе и важной для рецепторного распознавания (узнавания) пептидов.

Первоначально с помощью рентгеновского кристаллографического анализа (РСА) более подробно была охарактеризована рентгеновская структура птичьего РР с разрешением до 0,98 А, и уникальная структура получила своё название от этого пептида (В1ипбе11 е! а1. 1981, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 78: 4175-79; О1оует е! а1. 1984, Еиг. 1. Вюсйет. 142: 379-85). Затем была проанализирована, главным образом, с помощью ЯМР-спектроскопии РР-складчатая структура других членов семейства. Ясно, что как РСА, так и ЯМР-спектроскопические исследования проводят в очень концентрированном или твёрдом состоянии; однако точный анализ методом кругового дихроизма подтверждает, что NΡΥ и РР даже в водном растворе принимает РР-складчатую структуру, необычную для такого малого пептида (ЕиЫепбогГГ е! а1. 1990, 1. Βίο1. Сйет. 265:11706-12). Важно отметить, что анализ протеолитической устойчивости пептидов и их фрагментов и аналогов чётко показывает, что, например, полноразмерный РР1-36 даже в разбавленном водном растворе сохраняет складчатую конфигурацию, которая защищает его от расщепления некоторыми ферментами, которые быстро и легко расщепляют аналоги, не способные принять РР-складчатую структуру вследствие минорных замен (8с11\\'аг1х е! а1. 1990, Аппа1к ΝΥ, Асаб. 8сЕ 611: 35-47).

РР-складчатая структура, общая для №Υ, ΡΥΥ и РР, состоит из:

1) Ν-концевой полипролиноподобной спирали (соответствующей остаткам 1-8 с Рго2, Рго5 и Рго8), за которой следует

2) участок бета-поворота типа Ι (соответствующий остаткам с 9 по 12), далее следуют

3) амфифильная альфа-спираль (остатки 13-30), которая расположена антипараллельно полипролиновой спирали с углом около 152° между осями спиралей, и

4) С-концевой гексапептид (остатки 31-36).

Складчатая структура стабилизирована за счёт гидрофобных взаимодействий между боковыми цепями амфифильной альфа-спирали, которые тесно переплетаются с тремя гидрофобными остатками пролина (8с11\\'аг1х е! а1. 1990). Помимо ключевых остатков в рецепторе, распознающем С-концевой гексапептид, именно ядерные гидрофобные остатки, которые являются консервативными в целом семействе РР-складчатых пептидов, стабилизируют РР-складчатую структуру. На фиг. 1А изображена последовательность №У с остатками, консервативными в ряду NΡΥ, ΡΥΥ и РР, показанными белыми буквами на тёмном фоне. На фиг. 1А также показаны элементы РР-складчатой структуры, описанные выше. С-концевой гексапептид, важный для рецепторного узнавания, является неструктурированным, но РР-складка обеспечивает устойчивый каркас, презентирующий С-концевой гексапептид рецепторам (иллюстрируется на фиг. 1В), которые до некоторой степени зависят или не зависят также от участков Ν-конца пептида. Анализ методом ЯМР-спектроскопии показал, что дальние С- и Ν-концевые участки, например №Υ, являются достаточно подвижными, это означает, что РР-складке постоянно угрожает опасность оказаться с расстегнутой молнией на свободном конце.

является весьма распространённым нейропептидом, обладающим разнообразным действием в различных частях как центральной, так и периферической нервной системы, действующим с помощью различных субтипов рецептора в организме человека: Υ1, Υ2, Υ4 и Υ5. Основными рецепторами являются Υ1 рецептор, который обычно является постсинаптическим рецептором, передающим действие №Υ нейронов, и Υ2 рецептор, который обычно является пресинаптическим, ингибирующим рецептором. Это также имеет место в гипоталамусе, где №Υ нейроны, которые также экспрессируют антагонист/обратный агонист рецептора мелакортина АдКР (агутиродственный пептид), ведут себя как первичные сенсорные нейроны в стимулирующей ветви дугообразного (аркуатного) ядра. Поэтому в этом сенсорном ядре для регуляции аппетита и потребления энергии NΡΥ/АдКΡ нейроны, вместе с ингибирующими РОМС/САКТ нейронами, контролируют гормональный и питательный статус организма, так как эти нейроны являются мишенью как действующих продолжительно регуляторов, таких как лептин и инсулин, так и кратковременных регуляторов, таких как грелин и ΡУΥ (см. ниже). Стимулирующие NΡΥ/АдКΡ нейроны распространяются, например, на паравентрикулярное ядро - также гипоталамуса, где, как полагают, их постсинаптическими нацеленными рецепторами являются Υ1 и Υ5 рецепторы. №Υ является наиболее эффективным из известных соединений, способствующих повышению потреб

- 1 011860 ления пищи, так как грызуны после интрацеребровентрикулярной (1СУ) инъекции ΝΡΥ едят до тех пор, пока они в буквальном смысле не лопнут. АдКР, полученный при использовании ΝΡΥ/АдКР нейронов, ведёт себя как антагонист, главным образом, в отношении рецепторов меланокортинов типа 4 (МС-4) и блокирует действие пептидов из РОМС, в основном аМ8Н, на этот рецептор. Так как МС-4 рецепторный сигнал действует как ингибитор потребления пищи, действие АдКР, точно так же, как действие ΝΡΥ, является стимулирующим сигналом для потребления пищи (т.е. ингибирование ингибирования, угнетение угнетения). На ΝΡΥ/АдКР нейронах обнаружены ингибирующие-пресинаптические Υ2 рецепторы, которые являются мишенью как локально высвобождающегося ΝΡΥ, так и кишечного гормона ΡΥΥ - другого ΡΡ-складчатого пептида.

ΡΥΥ выделяется в процессе еды, пропорционально калорийности пищи, энтероэндокринными клетками в дистальной части тонкого кишечника и толстой кишки, действуя как на периферии на функции ЖКТ, так и в центральной области как сигнал насыщения. Полагают, что периферически ΡΥΥ действует как ингибитор - удар под дых- например, двигательной функции (моторики) верхнего ЖКТ, секреции желудочной кислоты и секреции экзокринных клеток поджелудочной железы. Полагают, что центрально ΡΥΥ действует, главным образом, на пресинаптические ингибирующие Υ2 рецепторы на ΝΡΥ/ΛβΚΡ нейронах в дугообразном (аркуатном) ядре, к которому он поступает из крови (Вайегйат е! а1. 2002, №1игс. 418: 650-4). Пептид выделяется в виде ΡΥΥ1-36, но часть - около 50% - циркулирует в кровотоке в виде ΡΥΥ3-36, который является продуктом расщепления дипептидилпептидазой-ΐν, ферментом, который удаляет дипептид с Ν-конца пептида, при условии, что Ργο или А1а находится в положении два, как во всех трёх ΡΡ-складчатых пептидах: ΡΡ, ΡΥΥ и ΝΡΥ (ЕЬег1еш е! а1. 1989, Ρерйάек, 10: 797-803). Таким образом, ΡΥΥ в кровотоке представляет собой смесь ΡΥΥ1-36, который действует как на Υ1, так и на Υ2 рецепторы (так же как Υ4 и Υ5 с различной аффинностью), и ΡΥΥ3-36, который обладает более низкой аффинностью в отношении рецепторов Υ1, Υ4 и Υ5 рецепторов, чем в отношении Υ2 рецептора.

ΡΡ представляет собой гормон, который выделяется эндокринными клетками в панкреатических островках, почти исключительно регулируемых вагусно холинергическими воздействиями, проявляемыми, главным образом, при потреблении пищи (Зсйуай/, 1983, Оак!гоеи!его1оду, 85: 1411-25). ΡΡ оказывает различное действие на желудочно-кишечный тракт, но оно обычно не наблюдается в изолированных клетках и органах и, очевидно, зависит от отсутствия нарушения вагусной иннервации (Ьс^уай/, 1983, Оак!гоеи!его1оду, 85: 1411-25). В соответствии с этим ΡΡ-рецепторы, называемые Υ4 рецепторами, расположены, главным образом, в стволе мозга с сильной экспрессией в моторных вагусных нейронах, активация которых вызывает периферические эффекты ΡΡ, и в ядрах одиночного пучка (ΝΤ8), активация которых вызывает действие ΡΡ как гормона насыщения (\У1ШесотЬ е! а1. 1990, Ат. 1. ΡΗ\'5ίο1. 259: 0687-91, Баскеи & Кг1к!еикеи, 1997, Вгаш Век. Мо1. Вгаш Век. 48: 1-6). Следует отметить, что ΡΡ в крови имеет доступ к этой области мозга, так как гематоэнцефалический барьер пропускает в этой области, где обнаруживаются различные гормоны с периферии. Недавно были приведены доводы, что влияние ΡΡ на потребление пищи опосредуется действием на нейроны - в особенности ΡΟМС/САВΤ нейроны в дугообразном ядре (Вайегйат е! а1. 2004. АЬк1гас! 3.3. 1и1егпайоиа1 ΝΡΥ 8утрокшт ίη Со1тЬга, ΡογΙι.ι§;·ι1). ΡΡ действует через Υ4 рецепторы, к которым он проявляет аффинность в субнаномолярных концентрациях, в отличие от ΡΥΥ и ΝΡΥ, которые проявляют аффинность к этому рецептору в наномолярных концентрациях (М1сйе1 е! а1. 1998, Ρ1ι;·ιηη;κο1. Веу. 50:143-150). ΡΡ также проявляет заметную аффинность к рецептору Υ5, но она, по-видимому, не имеет физиологического значения для циркуляции ΡΡ как вследствие отсутствия доступа к клеткам в ЦНС, где этот рецептор главным образом экспрессируется, так и вследствие относительно низкой аффинности к ΡΡ.

Рецепторы ΡΡ-складчатых пептидов.

Существует четыре точно установленных типа рецепторов ΡΡ-складчатых пептидов у человека: Υ1, Υ2, Υ4 и Υ5, которые (все) распознают ΝΡΥ1-36 и ΡΥΥ1-36 с аналогичной аффинностью. Одно время высказывалось предположение о типе рецептора Υ3, который мог иметь предпочтение в отношении ΝΡΥ по сравнению с ΡΥΥ, но в настоящее время его не воспринимают как реальный подтип рецепторов (М1сйе1 е! а1. 1998, Ρ1ι;·ιηη;κο1. Веу. 50: 143-150). Был клонирован подтип рецепторов Υ6, однако в организме человека он экспрессируется в усечённой форме, не содержащей ТМ-νΐΙ, а также хвоста рецептора, и, следовательно, по меньшей мере, сам по себе, по-видимому, не может образовывать функциональную рецепторную молекулу.

Υ1 рецепторы.

Исследования по аффинности наводят на мысль, что Υ1 одинаково хорошо связывается как с ΝΡΥ, так и с ΡΥΥ, но, в принципе, не с ΡΡ. Аффинность к Υ1 зависит от идентичности обеих концевых последовательностей ΡΡ-складчатой молекулы (ΝΡΥ/ΡΥΥ), например являются важными остатки Туг1 и Ργο2, и зависит от того, чтобы пептидные концы были представлены (презентированы) правильным образом. На С-конце, где важными являются боковые цепи нескольких остатков, Υ1 рецептор, подобно Υ5 и Υ4 рецептору, но не Υ2 рецептору, допускает некоторые замены в положении 34 (обычно 01и), такие как Ργο (ЕиЫеийогП е! а1. 1990, 1. Вю1. С1ет. 265: 11706-12; 8с11\\'айх е! а1. 1990, Аииа1к ΝΥ Асай. 8сг 61: 35-47). Сообщалось о некоторых исследованиях зависимости структура-функция, касающихся требований Υ1 и Υ2 рецепторов (Веск-8юктдег е! а1. 1994, Еиг. 1. Вюскет. 225: 947-58; Веск-8юктдег аий 1иид, 1995, Вю

- 2 011860 ро1утег8 37: 123-42; 8611 е! а1. 2001, Еиг. 1. ВюсНет. 268: 2828-37).

Υ2 рецепторы.

Исследования аффинности наводят на мысль, что Υ2 одинаково хорошо связывается как с ΝΡΥ, так и с ΡΥΥ, но, в принципе, не с РР. Для рецептора нужен, главным образом, С-конец РР-складчатого пептида (ΝΡΥ/ΡΥΥ). Таким образом, длинные С-концевые фрагменты, например вплоть до ΝΡΥ13-36 (целая альфа-спираль плюс С-концевой гексапептид), распознаются с относительно высокой аффинностью, т.е. в пределах величины, равной десятикратной величине аффинности полноразмерного пептида (811еП<11 е! а1. 1989, ЕЕВ8 Ье!!. 245: 209-14, 8Не1кй е! а1. 1989, 1. Вю1. СНет. 264: 6648-54). Следовательно, различные Ν-концевые делеции, которые приводят к утрате связывания с Υ1 рецептором, позволяют всё ещё до некоторой степени сохранять связывание с Υ2 рецептором. Однако аффинность С-концевых фрагментов снижается примерно в 10 раз по сравнению с ΝΡΥ/ΡΥΥ даже для сравнительно длинных фрагментов. Остаток С1и в положении 34 ΝΡΥ и ΡΥΥ является в высшей степени важным для распознавания (узнавания) лиганда Υ2 рецептором (8с11\\'аг1х е! а1. 1990, АппаН ΝΥ Асай. 8с1. 611: 35-47).

Υ4 рецепторы.

Исследования аффинности указывают, что Υ4 связывает ΡΡ в субнаномолярных концентрациях (субнаномолярная аффинность), соответствующих концентрациям, обнаруживаемым в плазме, тогда как ΝΡΥ и ΡΥΥ распознаются со значительно более низкой аффинностью. Такие исследования наводят на мысль, что Υ4 рецептор в высшей степени зависим от С-конца ΡΡ-складчатых пептидов и что относительно короткие Ν-концевые делеции уменьшают аффинность лигандов. Сообщалось о некоторых исследованиях структура-активность, относящихся к Υ4 рецептору (СеЫей е! а1. 1996, Мо1. Ρйа^тасо1. 50: 112-18; Аа1кег е! а1. 199,7 кернйез 18: 609-12).

Υ5 рецепторы.

Исследования аффинности показывают, что Υ5 одинаково хорошо связывается с ΝΡΥ и ΡΥΥ, но также связывается с ΡΡ с более низкой аффинностью, которая, однако, ниже обычных уровней этого гормона в кровотоке. ΡΥΥ3-36 также хорошо распознаётся рецептором Υ5, однако этот рецептор по большей части (в значительной степени) экспрессируется в ЦНС, где такой пептид не может легко получить доступ к рецептору при введении на периферии.

ΡΡ-складчатые пептиды и их аналоги были предложены для применения при лечении ожирения и связанных с этим заболеваний, включая, например, синдром Прадера-Вилли, на основании действия этих пептидов, продемонстрированного на животных моделях и на человеке, и на основании того факта, что у людей, страдающих ожирением, наблюдаются низкие базальные уровни ΡΥΥ и ΡΡ, а также более слабые реакции этих пептидов на пищу (Нот! 1.1. е! а1. 1983, Ιη!. 1. ОЬез. 7: 529-38; Вайегйат е! а1. 1990, №1иге). В 1993 году сообщалось, что вливание ΡΡ больным с синдромом Прадера-Вилли ΡΡ снижает потребление пищи (Вегпйоп е! а1. 1993, Ρерΐ^йе8, 14: 497-503), и этот эффект был подтверждён вливанием ΡΡ здоровым людям (Ва!!егйат е! а1. 2003, С1т. Епйосгшо1. Ме!аЬ. 88: 3989-92). ΡΡ-складчатые пептиды также были предложены для применения при аналогичном терапевтическом ангиогенезе (2ико\\'5ка е! а1. 2003, Тгепйз Сагйюуазс. Мей. 13: 86-92) и при воспалительном заболевании кишечника (см., например, Международную заявку АО 03/105763).

Однако нативные ΡΡ-складчатые пептиды не являются оптимальными для применения в качестве биофармацевтических веществ. Например, полноразмерные пептиды ΡΥΥ1-36 и ΝΡΥ1-36 реагируют слишком неизбирательно со всеми типами рецепторов Υ и, следовательно, будут вызывать побочные эффекты в сердечно-сосудистой системе и, например, рвоту. Кроме того, природные пептиды не оптимизированы по устойчивости белка, так как их готовят таким образом, чтобы они действовали в течение сравнительно короткого времени в качестве нейропептида или гормона. Природный, более селективный в отношении Υ2 пептид, ΡΥΥ3-36, имеет, например, искажённую тыльную сторону, так что его ΡΡ-складчатая структура ухудшена вследствие элиминирования важного остатка Ριό2 полипролиновой спирали, который в полноразмерном пептиде взаимодействует с Туг27 в амфифильной спиральной области молекулы.

Для лечения состояний, откликающихся на Υ-рецепторную модуляцию, желательно, следовательно, использовать Υ-рецепторные ΡΡ-складчатые пептиды или ΡΡ-складчатые пептиды-миметики, которые являются специфическими в отношении выбранного Υ рецептора, предполагаемого в качестве мишени, и которые устойчиво сохраняют элементы ΡΡ-складчатой структуры, важные для рецепторного связывания. В частности, было бы в высшей степени желательно использовать такие агенты, которые селективны в отношении Υ2 рецептора по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами. Υ2 рецептор является рецептором, который оказывает благотворное действие, например, на потребление пищи и расход энергии при лечении ожирения, метаболического синдрома и т.д., а также именно Υ2 рецептор способствует достижению терапевтического ангиогенеза у пациентов, например, с заболеванием периферических сосудов или с заболеванием коронарных сосудов. Однако агент, который действует как агонист Υ2 рецептора, не очень применим для такого лечения, если он не является селективным к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами. Агонизм к Υ1 рецептору может вызвать серьёзные побочные эффекты в сердечнососудистой системе - повышение кровяного давления, а также в почках - натрийурез. Аналогично желательна селективность к Υ2 по сравнению с Υ4, так как два природных Υ2 и Υ4 агониста, ΡΥΥ и ΡΡ соот

- 3 011860 ветственно, вызывают многие аналогичные эффекты, например, в желудочно-кишечном тракте, некоторые из которых могут быть благотворными, но некоторые из них могут вызывать нежелательные побочные эффекты. Например, как Υ2, так и Υ4 рецепторы промотируют антисекреторные эффекты в тонком и толстом кишечнике соответственно при использовании нейронов и непосредственно через эпителий (Сох е! а1. 2001, Вг. 1. Рйагшасо1. 135: 1505-12). Таким образом, по-видимому, аддитивный или, возможно, даже, синергический антисекреторный эффект получают с помощью комбинированной стимуляции Υ2 и Υ4 рецептора, что может привести к констипации.

Некоторые общие термины, применяемые в описании.

Аффинность: Аффинность пептида к специфическому рецептору выражается, например, величиной 1С₅₀ или величиной Κι или Ка, которая в конкретном неограничивающем примере определяется анализом, например, таким как анализ конкурентного связывания. Значение 1С₅₀ соответствует концентрации пептида, который замещает релевантный для данного рецептора радиоактивный лиганд, применяемый в количестве, значительно меньшем, чем К_б для этого радиоактивного лиганда, на 50%.

Аппетит: Естественная потребность в еде или сильное желание еды. Повышенный аппетит обычно приводит к повышенному пищевому поведению.

Супрессоры аппетита: Соединения, понижающие потребность в еде (желание есть).

Связывание: Специфическое взаимодействие между двумя молекулами, так что две молекулы взаимодействуют. Связывание с рецептором может быть специфическим и селективным, так что связывается преимущественно одна молекула по сравнению с другой молекулой. Специфическое связывание можно определять константой диссоциации (К_б). Эта величина зависит от селективности испытуемого соединения. Например, соединение с К_б ниже 10 нМ обычно считается прекрасным возможным лекарством. Однако соединение с более низкой аффинностью, но селективное в отношении конкретного рецептора также может быть хорошим возможным лекарством.

Индекс массы тела (ИМТ, ВМ1): Математическая формула для измерения массы тела, иногда также называемая индексом Кветеля. ВМ1 рассчитывают как частное от деления массы (в кг) на рост² (в м²). Современными стандартами как для мужчин, так и для женщин, принятыми за нормальные, являются ВМ1 около 20 кг/м². В одном варианте изобретения для определения страдающего ожирением субъекта можно применять ВМ1 выше 25 кг/м². Первая степень ожирения соответствует ВМ1 25 кг/м². Вторая степень ожирения соответствует ВМ1 30-40 кг/м² и третья степень ожирения соответствует ВМ1 выше 40 кг/м² (.1сс.|шсг. 1987, Άίη. 1. С1ш. ΝιιΙγ. 45: 1035-47). Идеальный вес тела различен у разных видов и индивидуумов и зависит от роста, строения тела, строения костей и пола.

Потребление калорий, или потребление в калориях: Число калорий (энергия), потребляемых индивидуумом. В контексте настоящего изобретения этот термин идентичен термину потребление энергии.

Косметическое лечение: Предполагается, что этот термин обозначает лечение не с медицинской целью, но для улучшения качества жизни субъекта, например внешнего вида субъекта. Этот термин включает лечение субъекта, желающего снизить свой вес, не будучи человеком, страдающим избыточным весом или ожирением.

Потребление пищи: Количество пищи, потребляемой индивидуумом.

Потребление пищи можно измерять объёмом или весом. Это выражение включает: ί) потребление пищи как общее количество поглощённой индивидуумом пищи и ίί) потребление пищи как количество белков, жиров, углеводов, холестерина, витаминов, минералов или любых других пищевых компонентов, поглощённых индивидуумом.

Соответственно, выражение потребление пищи в контексте настоящего изобретения аналогично выражению потребление энергии.

Нормальная дневная диета: Среднее потребление пищи индивидуумом данного вида. Нормальную дневную диету можно выражать терминами потребление калорий, потребление белков, потребление углеводов и/или потребление жиров. Нормальная дневная диета человека обычно содержит следующее: от около 2000, около 2400 или около 2800 до значительно большего числа калорий. Кроме того, нормальная дневная диета человека обычно включает примерно 12-45 г белков, около 120-610 г углеводов и около 11-90 г жиров. Низкокалорийная диета составляет примерно не более 85% и предпочтительно не более 70% нормального потребления в калориях человека. У животных потребности в калориях или в пище меняются в зависимости от вида и размера животного. Например, у кошек общее потребление калорий на 1 кг, а также распределение белков, углеводов и жиров в процентах меняется с изменением возраста кошки и репродуктивного состояния.

Ожирение: Состояние, при котором избыточный вес тела может стать причиной повышенного риска для здоровья человека (см. Ваг1о\\' апб Эю!/, Реб1а1пск, 102: Е29, 1998; Ναΐίοηαΐ ПъШШек οί НеаИй, №бопа1 НеаЛ, Ьипд апб В1ооб 1пкШи1е (ПНЬВ1), ОЬек. Век. (кирр1. 2): 51, 8209, 1998). Избыточный телесный жир является результатом дисбаланса между потреблением и расходом энергии. В одном варианте изобретения для оценки ожирения применяют индекс массы тела (ВМ1). В одном варианте изобретения ВМ1 примерно от 22 кг/м² (т.е. примерно на 10% выше нормального значения) и примерно до 30 кг/м²рассматривается как избыточный вес, особенно примерно от 25 до 30 кг/м², тогда как ВМ1 30 кг/м² или выше рассматривается как ожирение.

- 4 011860

Избыточный вес: Вес индивидуума, который выше идеального веса его тела. Индивидуум с избыточным весом может страдать ожирением, но необязательно ожирением. В одном варианте изобретения индивидуумом (человеком), страдающим избыточным весом, является любой индивидуум, желающий снизить свой вес. В другом варианте изобретения индивидуум (человек) с ΒΜΙ примерно от 22 кг/м² (т.е. примерно на 10% выше нормального значения) и примерно до 30 кг/м² рассматривается как человек, страдающий избыточным весом, особенно примерно от 25 до 30 кг/м². Следует отметить, что субъекты, имеющие ΒΜΙ немногим выше нормального значения (например, около 22-25 кг/м²), очень часто желают снизить вес, хотя это возможно только в косметических целях.

Эффективность (активность): Ιη νίΐτο эффективность соединения определяется величиной ЕС₅₀, т.е. концентрацией, которая даёт 50% максимально достижимого эффекта, определяемого релевантным для данного рецептора анализом передачи сигнала.

Субъект: Субъект может быть любым субъектом, включая как человека, так и млекопитающих. Так, субъект может быть человеческим или нечеловеческим приматом, сельскохозяйственным животным, таким как свиньи, крупный рогатый скот, овцы и птицы, спортивным или домашним животным, таким как собаки, кошки, лошади, хомяки, и грызунами.

Терапевтически эффективное количество: Доза, достаточная для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности конкретного состояния или заболевания и/или для ослабления специфических признаков или симптомов конкретного состояния или заболевания. Термин (выражение) включает дозу, достаточную для предупреждения прогрессирования или для того, чтобы вызвать регрессию нарушения, или дозу, способную облегчить признак или симптом нарушения, или дозу, которая позволяет достичь нужного результата. В вариантах изобретения, относящихся к косметическому лечению или к лечению избыточного веса или ожирения, терапевтический эффект рецепторного агониста определяется количеством, достаточным для ингибирования или прекращения увеличения веса тела, или количеством, достаточным для снижения аппетита, или количеством, достаточным для уменьшения потребления энергии или пищи или для повышения расхода энергии. Предполагается, что термин (выражение) косметически эффективное количество обозначает дозу, достаточную для достижения нужного эффекта при лечении субъекта.

Подробное описание изобретения

В своём самом широком аспекте настоящее изобретение охватывает применение Υ-рецепторного агониста, отличного от ΡΥΥ3-36, селективного в отношении Υ2 рецептора по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, для получения композиции для активации Υ2 рецепторов, причём:

(а) указанный агонист является ΡΡ-складчатым пептидом или ΡΡ-складчатым пептидом-миметиком, выбранным из ΡΥΥ, ΝΡΥ, ΡΥΥ миметиков и ΝΡΥ миметиков, который не содержит остатка тирозина, соответствующего Туг1 в ΝΡΥ, и/или не содержит остатка пролина, соответствующего Ρτο2 в ΝΡΥ, и/или не содержит остатка серина, аспарагина, глутамина, треонина, лейцина, изолейцина, валина, метионина, триптофана, тирозина или фенилаланина, соответствующего 8ет3 в ΝΡΥ, содержит остаток, отличный от лейцина, в положении, соответствующем Ьеи24 в ΝΡΥ, и/или содержит остаток, отличный от аргинина, в положении, соответствующем Агд25 в ΝΡΥ, и/или содержит остаток, отличный от гистидина, в положении, соответствующем Нк26 в ΝΡΥ, и/или содержит остаток, отличный от изолейцина, в положении, соответствующем 11е28 в ΝΡΥ, и/или содержит остаток, отличный от аспарагина, в положении, соответствующем Азп29 в ΝΡΥ, и/или содержит остаток, отличный от лейцина или метионина, в положении, соответствующем Ьеи30 в ΝΡΥ; или (б) указанный агонист является ΡΡ-складчатым пептидом или ΡΡ-складчатым пептидом-миметиком, выбранным из ΡΡ и ΡΡ-миметиков, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания и не содержат пролина в положении, соответствующем Ρτο2 в ΡΡ, и/или не содержат лейцина в положении, соответствующем Ьеи3 в ΡΡ, и/или не содержат глутаминовой кислоты в положении, соответствующем С1и3 в ΡΡ; или (в) указанный агонист (ί) содержит С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания (узнавания), связанную по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанной последовательности Υ2-рецепторного распознавания, причём указанный поворот ограничен спиральной конфигурацией за счёт ковалентной внутримолекулярной связи, и (ίί) в случае, когда агонист имеет Ν-концевую структуру, аналогичную ΝΡΥ или ΡΥΥ, он содержит одну или более модификаций, перечисленных в (а), см. выше, и в случае, когда агонист имеет Ν-концевую структуру, аналогичную ΡΡ, он содержит одну или более модификаций, перечисленных в (б), см. выше.

Специфическая терминология, относящаяся к изобретению.

Агонисты, к которым относится настоящее изобретение, являются селективными в отношении Υ2 рецептора по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами. В контексте настоящего изобретения это условие выполняется, если величина 1С₅₀ агониста по меньшей мере в 10 раз ниже в отношении Υ2 рецептора, чем в отношении Υ1 и Υ4 рецепторов, при определении методами анализа аффинности по данному описанию.

- 5 011860

В целом, что касается эффективности (активности), значения ЕС₅₀ агонистов по данному изобретению также по меньшей мере в 10 раз ниже для Υ2 рецептора, чем в отношении Υ1 и Υ4 рецепторов, как определено анализом активности по данному описанию. Многие из предпочтительных агонистов по данному изобретению имеют величины аффинности и эффективности по меньшей мере в 100 раз выше в отношении Υ2 рецепторов, чем в отношении Υ1 и Υ4 рецепторов, эта разница выше разницы, полученной в случае природного пептида ΡΥΥ3-36. Некоторые из предпочтительных агонистов по данному изобретению имеют величины аффинности и эффективности по меньшей мере в 1000 раз выше в отношении Υ2 рецепторов, чем в отношении Υ1 и Υ4 рецепторов.

Для целей данного описания ΡΡ-складчатый пептид представляет собой молекулу, имеющую 3-Ό структуру, которая, будучи картирована на оригинальную 3-Ό структуру птичьего ΡΡ, определённую методом ΡСΑ (В1ипйе11 е! а1. 1981, Ρτοε. Ыа11. Асай. 8с1. И8А, 78: 4175-79; С1оуег е! а1. 1984, Еиг. 1. Βίοскет. 142: 379-85), имеет домены, соответствующие доменам и практически выравниваемые, как и в доменах Ν-концевой полипролиноподобной спирали, области бета-поворота типа I, амфифильной альфаспирали и С-концевого гексапептида указанного ΝΡΥ, ΡΥΥ и/или ΡΡ (фиг. 1). Таким образом, описание различных доменов ΡΡ-складчатых пептидов, применяемых в данном изобретении, относится к оригинальной рентгеновской структуре птичьего ΡΡ (В1ипйе11 е! а1. 1981, Бгос. Асай. 8с1. И8А, 78: 417579; С1оует е! а1. 1984, Еиг. 1. Вюскет. 142: 379-85; 8ск\таг1/ е! а1. 1990).

ΡΡ-складчатый пептид-миметик по настоящему описанию обозначает молекулу, имеющую 3-Ό структуру, которая при картировании на оригинальную 3-Ό структуру птичьего ΡΡ, по меньшей мере, имеет домены, соответствующие доменам и практически выравниваемые, как и в доменах последнего поворота амфифильной альфа-спирали и С-концевого гексапептида ΡΡ. ΡΡ-складчатые пептидымиметики могут также при вышеуказанном картировании иметь домены, соответствующие одному или более остальных поворотов амфифильной альфа-спирали, Ν-концевой полипролиноподобной спирали и области бета-поворота типа I. Пептид-миметик необязательно состоит исключительно из последовательности альфа-аминокислот, связанных классическими пептидными связями. Одна или более связей в такой последовательности может быть замещена пептидомиметическими связями, такими как обратная амидная и восстановленная пептидная связи, так что пептид-миметик можно рассматривать как псевдопептидную последовательность. Такие замены связей могут придать устойчивость к расщеплению эндопептидазами и улучшить фармакодинамические свойства молекулы.

Такие сравнения 3-Ό структуры, как упомянутые в вышеприведённых определениях ΡΡ-складчатого пептида и ΡΡ-складчатого пептида-миметика, можно делать, конструируя модели молекул сравнения на основании координат их атомов, определяемых, например, методом ΡСА или с помощью одной или более компьютерных программ, выпускаемых для визуализации прогнозируемой на основании структурной формулы 3-Ό структуры молекулы, например Маезйо Мойекпд Епупоптеп! от 8сктойшдет 1пс., 1500, 8. V. Ρίτβ! Ауепие, 8ш!е 1180 ΡοΠΕπιΦ ОК 97201; 'Тпыдк! II Мойекпц Епукоптеп!, версия 4.0, от Ассе1гуз Шс. 8ап О1едо; и 8ΥΒΥΕ® 7.0 от Тпроз Шс., 1699 8оиШ Нап1еу Кй., 8!. Ьошз, М188оип, 63144, И8А. Следует отметить, что 3-Ό структура ΡΡ-складчатого пептида или ΡΡ-складчатого пептида-миметика по настоящему изобретению необязательно должна точно соответствовать и обычно не соответствует точно 3-Ό структуре природного ΝΡΥ, ΡΡΥ или ΡΡ. Наблюдаемая 3-Ό структура ΡΡ-складчатого пептида или ΡΡ-складчатого пептида-миметика меняется в зависимости от применяемых экспериментальных условий, и в особенности малые пептиды могут казаться более или менее развёрнутыми в определённых условиях. Однако достаточно, чтобы ΡΡ-складчатый пептид или ΡΡ-складчатый пептид-миметик имел домены, соответствующие описанным выше доменам ΡΡ-складки, и чтобы он имел структурные элементы для того, чтобы принять общую форму, аналогичную форме нативного пептида, в котором С-концевая и, при наличии, Ν-концевая последовательности были нормально ориентированы.

В агонистах, к которым относится данное изобретение, С-концевая последовательность Υ2-рецепторного распознавания (распознавания Υ2 рецептором) представляет собой последовательность обычно протяжённостью около 5-7 остатков и в особенности гексапептидную последовательность, расположенную на С-конце агониста, которая в случае её присутствия в ΡΡ-складчатом пептиде или ΡΡ-складчатом пептиде-миметике связывается с Υ2 рецептором и активирует рецептор за счёт этого связывающего взаимодействия. Классические С-концевые последовательности Υ2-рецепторного распознавания представляют собой последовательности, обнаруживаемые в природном ΝΡΥ или ΡΥΥ пептиде, но, как станет очевидно из данного описания, эти классические последовательности можно модифицировать для того, чтобы сохранить распознавание Υ2, но уменьшить распознавание Υ1. С-концевая последовательность, присутствующая в любом конкретном агонисте, представляет собой последовательность Υ2-рецепторного распознавания, если рассматриваемый ΡΡ-складчатый пептид или ΡΡ-складчатый пептид-миметик взаимодействует с Υ2 рецептором в анализах аффинности и/или активности по данному описанию, когда эта последовательность присутствует, но не тогда (или в незначительной степени), когда эта последовательность удалена (делетирована).

В данном описании выражение, такое как остаток, соответствующий положению 8ег3 ΝΡΥ, является ссылкой на аминокислотный остаток агониста, который при картировании 3-Ό структуры агониста на 3-Ό структуру ΝΡΥ отображается (картируется) наиболее близко к остатку 8ег3 ΝΡΥ. Аналогично,

- 6 011860 выражение, такое как положение, соответствующее положению С1и4 РР, является ссылкой на положение аминокислотного остатка в агонисте, который при картировании 3-Ό структуры агониста на 3-Ό структуру РР отображается (картируется) наиболее близко к остатку С1и4 РР. Действительная нумерация конкретного остатка в конкретном пептиде может отличаться от этой нумерации, например, вследствие делеций относительно природных пептидов.

В целом, РР-складчатые агонисты или РР-складчатые агонисты-миметики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, обычно имеют пептидный каркас или частично пептидный каркас, по меньшей мере, имеют С-концевую аминокислотную последовательность и часто Ν-концевую аминокислотную последовательность, хотя остальная часть каркаса может представлять собой непептидный линкерный радикал, например линейную или разветвлённую алкиленовую цепь. Аминокислоты, присутствующие на пептидном(ых) участке(ах) агонистов, обычно являются природными, особенно в С- и Ν-концевых последовательностях, которые взаимодействуют с Υ2 рецептором, но также могут присутствовать неприродные альфа-аминокислоты, которые защищают РР-складку, но не предупреждают Υ2-рецепторное связывание.

Если агонисты по настоящему изобретению содержат С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности, то С-концы могут быть амидированы и/или Ν-концы могут быть ацилированы с целью придать резистентность к карбокси- и/или аминопептидазам. На самом деле С-концы нативных ΝΡΥ, РΥΥ и РР пептидов являются амидированными, так что С-концевая аминокислота агониста по изобретению может быть также амидированной.

В данном описании ссылки на аминокислоты даются в виде их обычных названий или в виде сокращений, например валин (Уа1), лейцин (Ьеи), изолейцин (11е), метионин (Ме!), фенилаланин (РЬе), аспарагин (Акп), глутаминовая кислота (С1и), глутамин (С1п), гистидин (Ηίκ), лизин (Ьук), аргинин (Агд), аспарагиновая кислота (Акр), глицин (С1у), аланин (А1а), серин (8ег), треонин (ТЬг), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Сук) и пролин (Рго). Когда называется обычное название или аббревиатура без указания стереоизомерной формы, следует понимать, что речь идёт об Ь-форме рассматриваемой кислоты. Когда подразумевается Ό-форма, она специально указывается в названии аминокислоты. Иногда, когда этого требует контекст, Ь-форма скорее описывается, нежели подразумевается.

Термин консервативная замена по данному описанию обозначает, что одна или более аминокислот замещены на другой, биологически сходный остаток. Примеры включают замену на аминокислотные остатки со сходными характеристиками, например малые аминокислоты, кислые аминокислоты, полярные аминокислоты, основные аминокислоты, гидрофобные аминокислоты и ароматические аминокислоты. Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают консервативные аминокислотные замены, представленные в приведённой ниже таблице, и аналогичные замены исходного остатка неприродными альфа-аминокислотами с аналогичными характеристиками. Например, в предпочтительном варианте изобретения остатки Ме! замещаются на норлейцин (ΝΚ), биоизостер Ме!, но который, в отличие от Ме!, трудно окисляется. Другим примером консервативной замены на остаток, обычно не присутствующий в эндогенных пептидах и белках млекопитающих, является консервативная замена Агд или Ьук, например, на орнитин, канаванин, аминоэтилцистеин или другую основную аминокислоту. Более подробные сведения о фенотипически молчащих заменах в пептидах и белках даны, например, в Во\\зе е! а1. 8е1епее, 247, 1306-1310, 1990.

Исходный остаток

РЬе	Туг, Тгр, Ыз
Зег	ТЬг, Азп
ТГ1Г	Зег, Азп, <3[п
Тгр	Туг, РЬе, Ηίβ
Туг	Тгр, РЬе, ΗΪ5
Уа1	Не, Ьеи

Если не указано иначе в контексте, в котором он встречается, термин замещённый в применении к любому фрагменту по данному описанию означает имеющий до четырёх совместимых заместителей, каждый из которых, независимо, может представлять собой, например, (С1-С6)алкил, (С1-С6)алкокси,

- 7 011860 гидрокси, гидрокси(С1-С₆)алкил, меркапто, меркапто(С₁-С₆)алкил, (С₁-С₆)алкилтио, галоген (включая фтор, бром и хлор), трифторметил, трифторметокси, нитро, нитрил (-СЫ), оксо, фенил, -СООН, -СООК^А, -СОК^А, -8О2К^А, -СОХИ. -§Ο2ΝΗ₂, -СОХНИ⁷. -8Ο2ΝΗΚ^α, -СОХИ'ИХ -8Ο2ΝΚ^αΚ^β, -ΝΗ2, -ΝΗΚ^α, -ΝΚ^αΚ^β, -ОСОХН;. -ΟСΟХΗИ^А. -ОССА К ΊΑ -ЛЖОВА ^СООК^ -МЙ^ВСООК^А, -ΝΗ^^ΚΑ ΑΠΑΟΟΙΙ, -ΝΗ№ΝΗ2, -ΝΚ^α№ΝΗ₂, -ΝΗСΟΝΗΚ^В, -ΝΚ^α№ΝΗΚ^β, -ΝΗ^ΝΚΚ¹³ или где К^А и К^В, независимо, обозначают (С₁-С₆)алкильную группу. Возможный (необязательный) заместитель может представлять собой одну из приведённых выше замещающих групп.

Если контекст не диктует иначе, ссылки по данному описанию на ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР пептиды и их последовательности относятся к человеческим формам этих пептидов и их последовательностям. Однако часто ΝΡΥ, ΡΥΥ и РР пептиды других млекопитающих образуют РР-складчатые пептиды-миметики человеческих ΝΡΥ, ΡΥΥ и ΡΡ или консервативно замещённых человеческих ΝΡΥ, ΡΥΥ и ΡΡ, когда эти термины применяются в данном описании.

Агонисты типа (а) для применения по данному изобретению

Обычно агонисты типа (а) являются РР-складчатыми аналогами ΝΤΥ или ΡΥΥ или РР-складчатыми миметиками №У или ΡΥΥ, имеющими модификации для того, чтобы значительно снизить активность к Υ1 рецептору. Такие РР-складчатые аналоги и миметики включают пептиды, имеющие полный комплемент характеристик РР-складчатых пептидов (Ν-концевую полипролиноподобную спираль, бетаповорот, амфифильную альфа-спираль и С-концевой гексапептид), пептидные аналоги, в которых часть каркаса (например, остатки бета-поворота и прилегающие остатки) замещена на непептидную спейсерную цепь, и усечённые (процессированные) пептиды, содержащие С-концевой гексапептид и последний поворот амфифильной альфа-спирали, но не содержащие целую полипролиноподобную спираль или её часть и/или весь бета-поворот или его часть.

Одна группа Υ2-селективных агонистов типа (а), см. выше, к которому относится изобретение, содержит остаток, отличный от Туг, Тгр или РЬе в положении, соответствующем Туг1 в ΝΡΥ, и/или остаток, отличный от Рго, в положении, соответствующем Рго2 №Υ, и/или остаток, отличный от Не, Ьеи, Уа1, РЬе, Тгр, Туг, Бег, Тйг и Аки, в положении, соответствующем 8ег3 в ΝΡΥ, и/или остаток, отличный от лизина или аргинина, в положении, соответствующем Ьук4 №Υ.

Особенно предпочтительная подгруппа агонистов этого типа состоит из пептидов, имеющих последовательность, идентичную последовательности человеческого ΝΓΥ, за исключением того, что остаток, отличный от Туг, Тгр или РЬе, находится в положении 1, и/или остаток, отличный от Рго, находится в положении 2, и/или остаток, отличный от 11е, Ьеи, Уа1, РЬе, Тгр, Туг и Акп, находится в положении 3, и/или остаток, отличный от лизина или аргинина, находится в положении 4. Хотя предпочтительна существенная идентичность между такими агонистами и нативными последовательностями (помимо любых описанных изменений в положениях 1-4), может быть допустима консервативная замена других остатков нативной последовательности, особенно удалённая от С-концевой гексапептидной последовательности.

Агонисты типа (Ь) для применения по данному изобретению

Обычно агонисты типа (Ь) представляют собой РР-складчатые аналоги РР или РР-складчатые миметики РР, которые содержат модификации с целью значительно понизить их активность к Υ4 рецепторам и повысить их активность к Υ2 рецепторам. Как и в случае агонистов типа (а), этот класс включает пептиды, имеющие полный комплемент характеристик РР-складчатых пептидов (Ν-концевую полипролиноподобную спираль, бета-поворот, амфифильную альфа-спираль и С-концевой гексапептид), пептидные аналоги, в которых часть каркаса (например, остатки бета-поворота и прилегающие остатки) замещена на непептидную спейсерную цепь, и усечённые (процессированные) пептиды, содержащие С-концевой гексапептид и последний поворот амфифильной альфа-спирали, но не содержащие целую полипролиноподобную спираль или её часть и/или весь бета-поворот или его часть.

Предпочтительная группа Υ2-селективных агонистов типа (Ь), см. выше, к которым относится данное изобретение, содержит С1п или структурно сходный остаток в положении 34 и остаток, отличный от Рго, Тут, РЬе и Тгр, в положении, соответствующем Рго2 в РР, и/или остаток, отличный от 11е, Ьеи, Ме! и Уа1, в положении, соответствующем Ьеи3 в РР, и/или остаток, отличный от С1и или Акп, в положении, соответствующем С1и4 в РР.

Особенно предпочтительная подгруппа агонистов этого типа состоит из пептидов, имеющих последовательность, идентичную последовательности человеческого РР, за исключением того, что в положении 34 имеется остаток С1п, и остаток, отличный от Рго, Туг, РЬе и Тгр, в положении 2, и/или остаток, отличный от 11е, Ьеи, Ме! и Уа1, в положении 3, и/или остаток, отличный от С1и или Акп, в положении 4. Хотя предпочтительна существенная идентичность между такими агонистами и нативными последовательностями (помимо любых описанных изменений в положениях 2-4), может быть допустима консервативная замена других остатков нативной последовательности, особенно удалённая от С-концевой гексапептидной последовательности.

- 8 011860

Агонисты типа (с) для применения по изобретению

Как правило, агонисты типа (с) можно рассматривать как РР-складчатые пептидные аналоги или РР-складчатые миметики, у которых минимальные структурные признаки РР-складки (С-концевой гексапептид и последний поворот альфа-спирали) стабилизированы определённой внутримолекулярной ковалентной связью.

Агонисты этого типа характеризуются внутримолекулярной связью, которая либо не имеет эквивалента в нативных ПРУ, РУУ или РР пептидах, либо соответствует нековалентному взаимодействию, либо замещает нековалентное взаимодействие с ковалентной связью, например ковалентный дисульфидный мостик между Сук2 и Э-Сук27 в |Сук2,Э-Сук27|РУУ (8ЕО ΙΌ Νο: 13) имитирует нековалентное гидрофобное взаимодействие между боковыми цепями Рго2 и Туг27, наблюдаемое в рентгеновской структуре птичьего РР. Установлено, что такая связь может служить для стабилизации обязательных элементов РР-складчатой структуры, в частности подвижной С-концевой последовательности У2-распознавания и последнего поворота альфа-спирали, и/или презентации Ν-конца. В полноразмерных или близких к полноразмерным пептидах такая связь может стабилизировать нативную РР-складчатую структуру, как таковую. Это выгодно по двум причинам: во-первых, она стабилизирует С-концевой участок амфифильной альфа-спирали и, тем самым, презентирование С-концевой аминокислотной последовательности ¥2-распознавания оптимальным образом, что вызывает высокую активность к Υ2 рецептору; во-вторых, за счёт стабилизации целой РР-складки, как таковой, пептид становится менее чувствительным к протеолитическому расщеплению, так как для таких ферментов часто требуется, чтобы их целевые последовательности находились в относительно нескрученной форме (8ο1ι\ν;·ιΠζ с1 а1. 1990). Внутримолекулярная связь может также способствовать Υ2-селективным агонистам, которые трудно модифицируются сравнительно со структурой нативных пептидов, например агонистам, у которых отсутствует один или более доменов, или участков доменов, имеющихся в нативных пептидах.

Одна группа агонистов такого типа (с) имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания в Ν-концевом участке агониста, соответствующем домену полипролина РР-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену. В случае, когда такие агонисты имеют Ν-концевую структуру, аналогичную Ν-концевой структуре ΝΤΥ или РΥΥ, например имеющую Ν-концевой домен, который картируется на последние несколько остатков NРΥ или РΥΥ, агонисты не должны содержать остаток тирозина, соответствующего Туг1 ΝΤΥ, и/или не содержат остаток пролина, соответствующий Рго2 в №Υ, и/или не содержат остатка серина, аспарагина, глутамина, треонина, лейцина, изолейцина, валина, метионина, триптофана, тирозина или фенилаланина, соответствующего 8ет3 №Υ, и/или не содержат остатка лизина или аргинина, соответствующего Ьук4 ΝΤΥ. В случае, когда такие агонисты имеют Ν-концевую структуру, аналогичную Ν-концевой структуре РР, например имеющую Ν-концевой домен, который картируется на последние несколько остатков РР, агонисты не содержат остаток пролина в положении, соответствующем Рго2 в РР, и/или не содержат остаток лейцина в положении, соответствующем Ьеи3 в РР, и/или не содержат остаток глутаминовой кислоты в положении, соответствующем О1и4 РР. Сдерживающая (ограничивающая) спиральный поворот внутримолекулярная связь, например дисульфидная или лактамная связь, в вышеприведённых случаях может простираться от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из четырёх Ν-концевых остатков.

В особенно предпочтительной подгруппе агонисты этого типа состоят из пептидов, имеющих последовательность, идентичную последовательности человеческого РΥΥ, за исключением того, что сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания в Ν-концевой части домена полипролина. Такая связь может находиться между остатками в положениях 5 и 20 или 8 и 16 или, в особенности, между положениями 2 и 27, например дисульфидная связь между Ό-Сук в положении 27 и Сук в положении 2. Ό-форма Сук предпочтительна в положении 27, так как она оптимально ориентирует тиольную боковую цепь с образованием дисульфидного мостика с нормальной Ь-формой Сук, введённого в положение 2, чтобы вся молекула целиком приняла и имитировала РР-складчатую структуру. Следует отметить, что хотя полноразмерные РР-складчатые пептиды, содержащие стабилизирующую внутримолекулярную связь, могут иметь дальний Ν-концевой участок молекулы, которая в принципе требуется для Υ1-рецепторного распознавания, аналоги по настоящему изобретению не ведут себя как агонисты Υ1 рецептора или только лишь с низкой активностью, как описано выше.

Причиной этого является либо то, что внутримолекулярная связь, как таковая, включает остатки, которые обычно требуются для Υ1 распознавания, например Рго2 и Туг27, либо в случаях, когда связь находится в положении, удалённом от эпитопов распознавания Υ1, замены в пептиде делают сознательно, чтобы гарантировать селективность к Υ2 по сравнению с Υ1. Хотя предпочтительна существенная идентичность между такими агонистами и нативной последовательностью РΥΥ (помимо любых изменений, вызванных созданной внутримолекулярной связью), в таких аналогах может быть допустима консервативная замена других остатков нативной последовательности, особенно удалённая от С-концевой гексапептидной последовательности.

- 9 011860

В другой группе агонистов типа (с) сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь соединяет остатки в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например лактамная связь, образующаяся между остатками Ьуз и С1и в спиральном повороте или между остатком в С-концевой аминокислотной последовательности Υ2-распознавания и остатком в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например лактамный мостик между Ьуз28 и С1и32 в [Ьуз28, Ο1ι.ι32|ΡΥΥ25-36 (8Е0 ΙΌ Νο: 19, фиг. 2В). Одна подгруппа агонистов этого типа имеет последовательность, идентичную последовательности человеческого ΡΥΥ, за исключением того, что она является усечённой по Ν-концу, например по остатку 27, и, конечно, за исключением любых изменений, необходимых при создании внутримолекулярной связи.

Аспекты агонистов типа (а), (Ь) и (с), применяемых по данному изобретению

С-конец.

Будучи селективными к Υ2, все три типа агониста, к которому относится данное изобретение, содержат С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания (распознавания Υ2 рецептором (рецептора)). Методом проб и ошибок в анализах аффинности и активности по данному описанию можно легко определить, действительно ли конкретная С-концевая испытуемая последовательность узнаёт Υ2 рецептор. Одна группа предпочтительных С-концевых последовательностей Υ2-рецепторного распознавания, присутствующих в агонистах по изобретению, представлена как -Х-Ткг-Агд-Сй-Агд-Туг-СЦО^В'В². где Х не является ни основным, ни кислым остатком, К¹ и К², каждый, обозначают водород или С1-С₆алкил, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТЬг замещён на Нк или Азп, и/или Туг замещён на Тгр или БЬе; и/или Агд замещён на Ьуз. В настоящее время предпочтительно, когда К¹ и К², каждый, обозначают водород.

Одна конкретная С-концевая аминокислотная последовательность Υ2-рецепторного распознавания представляет собой -11е-Тйг-Агд-О1п-Агд-Туг-С(=О)ХН₂, а другая представляет собой -А1а-ТЬг-Агд-О1п-Агд-Туг-С(=О)МН₂.

В одной группе ΡΡ-складчатых агонистов-миметиков, рассматриваемых в данном изобретении, типа (а), (Ь) или (с), С-концевая последовательность, содержащая аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания, может быть слита (связана) по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанного эпитопа, и Ν-концевой аминокислотной последовательностью по меньшей мере из двух аминокислот, причём указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности соединены пептидными связями с линкерным радикалом, который может представлять собой линейный или разветвлённый алкиленовый радикал, необязательно содержащий одну или более двойных или тройных связей. Например, пептидные связи линкерного радикала могут быть образованы, соответственно, карбоксильной группой и аминогруппой аминокислоты формулы НН₂(СН₂)_пСО₂Н, где η имеет значение от 2 до 12, главным образом 6, 7, 8, 9 или 10. Так, агонист может являться аналогом ΝΡΥ, ΡΡΥ или ΡΡ, который содержит описанный мостик Суз-Суз, но при этом его аминокислотные остатки, соответствующие 5-24 нативного пептида, замещены на аминокарбоновую кислоту с углеродной цепью, содержащей 6-10 атомов углерода, выбранную из группы, состоящей из 6-аминогексановой кислоты (ипсилон-аминокапроновой кислоты), 7-аминогептановой кислоты, 8-аминооктановой кислоты,

9-аминононановой кислоты и аминодекановой кислоты. В конкретных вариантах изобретения предпочтительны 8-аминооктановые кислоты (в данном описании иногда сокращённо называемые Λοο). Примером такого агониста является [Суз2,Аοс5-24, Ό-ί’ν327|ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ Νο: 16; фиг. 2А).

Ν-конец.

Все три типа Υ2-селективных агонистов, которые рассматриваются в данном изобретении, можно ацилировать по их Ν-концу для того, чтобы придать резистентность к аминопептидазной активности. Например, ацилирование можно осуществлять с помощью ацилирующей группы, содержащей в цепи 2-24 углеродных атома, и конкретным примером является Ν-концевое ацетилирование.

Агонисты, пригодные для применения по данному изобретению

До настоящего времени основные Υ2-селективные агонисты для применения по настоящему изобретению были описаны в целом и приводились конкретные примеры таких агонистов. Однако такие агонисты, включая специфически идентифицированные агонисты, можно подвергнуть различным модификациям с целью улучшения их фармакокинетики, фармакодинамики и метаболических свойств. Такие модификации могут включать связывание агониста с функциональными группами (также известными как мотивы), известными сами по себе в технике пептидных или белковых фармацевтических веществ. Три конкретные модификации, дающие конкретное преимущество в случае агонистов, которые рассматривает настоящее изобретение, вне зависимости от типа (а), (Ь) или (с), представляют собой присоединение мотивов связывания с сывороточным альбумином, или мотивов связывания гликозаминогликана (ОАО), или ПЭГилирование.

Мотивы связывания сывороточного альбумина

Мотивы связывания сывороточного альбумина (мотивы, связывающие сывороточный альбумин) обычно являются липофильными группами, вводимыми для того, чтобы способствовать продолжительному пребыванию в организме после введения, или по другим причинам, которые могут связываться

- 10 011860 различными известными способами с пептидными или белковыми молекулами, например, ί) ковалентной связью, например, с функциональной группой в боковой цепи аминокислотного остатка; ίί) за счёт функциональной группы, встроенной в пептид или подходящим образом дериватизированный пептид; ίίί) в виде единого участка пептида. Например, в Международной заявке \¥О 96/29344 (№го №гб1кк А/8) и в статьях Р. КиЛгЬак е! а1. 1995, ВюсЬетса1, ί. 312: 725-31 и Ь.В. Кпибкеп е! а1. 2000, 1. Меб. СИет. 43: 1664-69 описан ряд подходящих липофильных модификаций, которые можно использовать для агонистов, рассматриваемых в данном изобретении.

Подходящие липофильные группы включают необязательно замещённые, насыщенные или ненасыщенные, линейные или разветвлённые углеводородные группы, содержащие 10-24 углеводных атома. Такие группы могут образовывать целую боковую цепь или часть боковой цепи в каркасе агониста, например, за счёт простой эфирной, тиоэфирной, амино, сложноэфирной или амидной связи с боковой цепью аминокислотного остатка скелета, или с углеродным атомом скелета или боковой цепи каркаса (скелета) непептидного линкерного радикала в скелете РР-складчатого миметика-агониста. Химический способ присоединения липофильной группы не важен, но приведённые боковые цепи, включая липофильные группы, являются примерами групп, которые могут связываться со скелетным углеродом агониста или его подходящего ответвления и состоят из:

СН₃(СН₂)_пСН(СООН)НН-СО(СН2)2СОМН-, где п обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН2)гСО-КНСН(СООН)(СН₂)2СОГ<Н-_>где г обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН2)<СО-КНСН((СИ2)2СООН)СОЬП1-. где к обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)_тСОТ4Н-, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-ΝΗΟθεΗ((ΟΗ₂)₂ΟΟΟΗ)ΝΗ- СО(СН₂)_рСНз, где р обозначает целое число от 10 до 16, -ΝΗΟΟ(ΟΗ₂)₂ΟΗ(ΟΟΟΗ)ΝΗ-СО(СН₂)_ЧСН₃, где с.| обозначает целое число от 10 до 16,

СН₃(СН₂)_ПСН(СООН)Й1НСО-, где п обозначает целое число от 9 до 15,

ΟΗ₃(ΟΗ₂)_ΡΝΗΟΟ-, где р обозначает целое число от 10 до 18,

-ΟΟΝΗΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)4ΝΗ- СО(СН₂)_П1СН₃, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-СОМНСЖСООНХСТкЕИН- СОСН((СН2)₂СООН)ЫН- СО(СН₂)_РСН₃₁ где р обозначает целое число от 10 до 16,

-ΟΟΝΗΟΗ(ΟΟΟΗ)(ΟΗ₂)₄ΝΗ- СО(СН2)₃СН(СООН)МН-СО(СН₂)_ЧСН₃, где с.| обозначает целое число от 10 до 16, и частично или полностью гидрированный циклопентанофенантреновый скелет.

В одном методе химического синтеза боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой С₁₂, С₁₄, С₁₆ или С₁₈ ацильную группу, например тетрадеканоильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи остатка каркаса агониста.

Как указывалось, модификация агонистов для применения с целью улучшить характеристики связывания с сывороточным белком является методом, который можно применять в целом и, в частности, в случае специфических агонистов, перечисленных выше. Так, например, подходящие модифицированные агонисты включают [Сук2,№(№-тетрадеканоил)-гаммаглутазюил-кук 13,0-0^8271 РУ Υ, [Сук2,№(№-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьук4,О-Сук27]РУГ, ^-(И-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-кук13|РУУ3-36 или [№(№-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил^ук4]РΥΥ3-36.

ОАО-связывание

Как и в случае липофильных мотивов связывания с сывороточным альбумином, обсуждавшихся выше, агонисты, рассматриваемые в данном изобретении, можно модифицировать, вводя мотив ОАО связывания в качестве боковой цепи или участка боковой цепи скелета агониста. Известные ОАО-связывающие мотивы для введения таким способом включают аминокислотные последовательности ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток. Несколько, например три, таких последовательностей можно ввести в виде конкатамерных (линейная цепь) или дендримерных (разветвлённая цепь) повторов. Специфические конкатамерные ОАО мотивы включают А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а и А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а (каждый из которых может, например, соединяться амидной связью, образующейся между С-концом конкатамерного мотива ОАО-связывания и аминогруппой в боковой цепи аминокислоты в каркасе аго- 11 011860 ниста, такой как ипсилон-аминогруппа Ьук13 в агонисте [Сук2,Ьук13, (фиг. 3А) или Ьук13 в агонисте [^уκ13]ΡУУ3-36.

Вместо того, чтобы присоединяться к агонисту в виде боковой цепи, или части боковой цепи каркасного остатка, ОАО мотив может ковалентно связываться с С- или (предпочтительно) с Ν-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал. В этом случае ОАО-связывающий мотив может также содержать аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток, например последовательность [ХВВВХХВХ]_п, где п обозначает число от 1 до 5, В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток. Такие конкатамерные повторы имеют тенденцию образовывать альфа-спирали, когда они связываются с ОАО, и затем, когда они сливаются с С-концевым гексапептидом/последним поворотом альфа-спирали, они могут стабилизировать этот поворот и, тем самым, презентировать комбинированную структуру для Υ2-рецепторного распознавания оптимальным образом. Конкретными примерами агонистов этого типа являются [ХВВВХХВХΧΒΒΒΧΧΒΧ^ΥΥ25-36 или [ХВВВХХВХ-ХВВВХХВХ-XВВВXXВX]ΡΥΥ25-36, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток, в частности А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1аΡУУ25-36 (8ЕО ΙΌ Νο: 21) (фиг. 3В).

Агонисты, селективные к Υ2, к которым относится настоящее изобретение, применимы, среди прочего, для терапевтического ангиогенеза. В частности, для такого применения агонисты предпочтительно содержат мотив, связывающий гликозаминогликан (ОАО), обсуждавшийся выше. Такие мотивы гарантируют, что агонисты связываются с ОАО во внеклеточной матрице и тем самым обеспечивают пролонгированную локальную экспозицию Υ2 рецепторов в этой ткани. Факторы роста, хемокины и т.д. связываются с ОАО за счёт участков основных аминокислот, которые взаимодействуют с кислыми сахарами ОАО. Эти положительно заряженные эпитопы на факторах роста обычно состоят из боковых цепей основных остатков, которые в последовательности необязательно расположены последовательно, но часто находятся в непосредственной близости за счёт элемента вторичной структуры, такого как альфаспираль или поворот, или за счёт общей трёхмерной структуры белка. Описаны некоторые ОАО-связывающие линейные последовательности, обсуждавшиеся выше, например ХВВХВХ и ХВВВХХВХ, где В представляет собой основной остаток (Нйетап е! а1. Вюаккаук, 1998, 20: 156-67). Методом кругового дихроизма было показано, что эти сегменты при связывании с ОАО образуют альфаспирали. Если такие последовательности помещены, например, в конкатамерную или дендримерную конструкцию, где присутствует три таких последовательности, например каждая в виде АКККААКА последовательности, результирующий 24-мерный пептид, например АКККААКА-АКККААКААКККААКА, гарантирует сохранение во внеклеточной матрице, аналогичной высокомолекулярному полилизину, т.е. он не вымывается в течение 4-часового вливания (Закйагоу е! а1. ЕЕВ8 Ьей. 2003, 27: 6-10).

Таким образом, факторы роста и хемокины, естественно, создаются с двумя типами связывающих мотивов: один мотив связывания с рецептором, с помощью которого осуществляется сигнальная трансдукция, и один мотив связывания с ОАО, с помощью которого достигается присоединение и пролонгированная локальная активность. Пептиды, такие как ΡУУ и №Υ, являются нейропептидами и гормонами, которые достаточно быстро вымываются из ткани, а не оптимизируются для пролонгированной активности. Присоединяя ОАО-связывающий мотив к Υ2 селективному агонисту по настоящему изобретению или к классическому известному пептидному агонисту ΡУУ3-36, создают бифункциональную молекулу, аналогичную факторам роста и хемокинам, содержащую как эпитоп, ответственный за связывание с рецептором на РР-складчатом пептидном участке, так и ОАО-связывающий мотив. Пример такого агониста показан на фиг. 3А.

Как обсуждалось выше, в предпочтительном варианте изобретения ОАО-связывающий мотив, например 24-мерная последовательность, описанная выше, помещают в виде Ν-концевого растягивания Υ2-селективного агониста. Это расположение особенно интересно для усечённых по Ν-концу РР-складчатых миметиков-агонистов. Хотя эти агонисты-миметики по данному описанию являются селективными к Υ2, они могут проявлять несколько пониженную аффинность или активность к Υ2 рецептору по сравнению с ΡУУ3-36 или ΡУУ. Такие усечённые РР-складчатые агонисты-миметики можно легче растянуть (удлинить) при использовании конкатамерного ОАО-связывающего мотива, так как при связывании с ОАО образуется альфа-спираль, которая может способствовать стабилизации спирального участка и, тем самым, корректному презентированию С-концевого сегмента. Пример такого агониста показан на фиг. 3В.

Другим подходящим положением для введения ОАО-связывающего мотива, такого как конкатамерная или дендримерная конструкция, РР-складчатых пептидов является положение 14 для №Υ пептидов и их аналогов и положение 13 для ΡУУ и РР пептидов и их аналогов. Однако, как обсуждалось выше, остаток, содержащий ОАО-связывающий мотив, можно ввести в любое положение в агонистах при условии, что это введение согласуется с сохранением РР-складчатой структуры, требуемой в агонистах типа (а), (Ь) и (с), рассматриваемых в данном изобретении, и нужной С-концевой последовательностью

- 12 011860

Υ2-распознавания. Так, САС-связывающий мотив можно в качестве части спейсерной конструкции поместить в аналоги, в которых часть ΡΡ-складки замещена на непептидный спейсер.

ПЭГилирование

При ПЭГилировании полиалкиленоксидный(ые) радикал или радикалы ковалентно связывается(ются) с пептидными или белковыми лекарствами с целью увеличения эффективного периода полужизни в организме после введения и снижения иммуногенности, повышения растворимости и т.д. Термин происходит от названия предпочтительного полиалкиленоксида, применяемого в таких процессах, а именно, образованного из этиленгликоля полиэтиленгликоля, или ПЭГ (ΡΕΟ).

Подходящий радикал ПЭГ может присоединяться к агонисту любым подходящим химическим методом, например, за счёт каркасного аминокислотного остатка агониста. Например, в случае молекулы, подобной ПЭГ, в качестве присоединяющей группы часто применяется ипсилон-аминогруппа лизина или Ν-концевая аминогруппа. Другие присоединяющие (встраивающие) группы включают свободную карбоксильную группу (например, свободную карбоксильную группу С-концевого аминокислотного остатка или остатка аспарагиновой или глутаминовой кислоты), подходящим образом активированные карбонильные группы, меркаптогруппы (например, меркаптогруппы цистеинового остатка), остатки ароматических кислот (например, Ρίκ. Туг, Тгр), гидроксигруппы (например, гидроксигруппы в 8ег, ТНг или ОН-Ьуз), гуанидин (например, Агд), имидазол (например, Ηίδ) и частицы окисленных углеводов.

Если агонист является ПЭГилированным, он обычно содержит 1-5 молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ), например 1, 2 или 3 молекулы ПЭГ. Каждая молекула ПЭГ имеет молекулярную массу примерно от 5 до примерно 100 кДа, например, молекулярная масса составляет около 10-40 кДа, около 12 кДа или предпочтительно не более 20 кДа.

Подходящие молекулы ПЭГ выпускаются фирмами 8Неаг\\'а1ег Ρо1уте^8, 1пс. и Епхоп, 1пс. и их можно выбрать из 88-ΡΕΟ, ΝΡ^ΡΕΟ, альдегид-ПЭГ, тΡΕС-8ΡА, тΡΕС-8СМ, тΡΕС-ВТС, 8^ΡΕ6, трезилированного тΡΕС (патент США 5880255) или оксикарбонил-окси-Ы-дикарбоксиимид-ПЭГ (патент США 5122614).

В особом варианте изобретения вышеупомянутый агонист [Су82,^у813,^Су827]ΡΥΥ можно ПЭГилировать по ипсилон-аминогруппе остатка Ьу813, а агонист [Су82,^Су827]ΡΥΥ можно ПЭГилировать по остатку Ьуз4.

Сывороточный альбумин, САС и ПЭГ

Вне зависимости от того, осуществляется ли модификация агониста за счёт присоединения групп для того, чтобы способствовать связыванию сывороточного альбумина, САС-связыванию или повысить устойчивость с помощью ПЭГилирования, мотив связывания сывороточного альбумина, или мотив САС-связывания, или ПЭГ-радикал может являться боковой цепью или образовывать часть боковой цепи при каркасном углероде агониста, соответствующем любому из следующих положений ΡΥΥ или ΡΡ: 1, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32 или соответствующем любому из следующих положений ΝΡΥ: 1, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.

В особенности, если агонист является агонистом типа (с), мотив связывания сывороточного альбумина, или мотив САС-связывания, или ПЭГ-радикал может также являться боковой цепью или образовывать часть боковой цепи при каркасном углероде агониста, соответствующем любому из следующих положений ΡΥΥ, ΝΡΥ или ΡΡ: 2, 5, 8, 9, 13, 14, 20 и 24.

Конъюгация с биомолекулами большего размера

Как описывается выше, можно присоединять некоторые мотивы в различных положениях в ΡΡ-складчатом пептиде или ΡΡ-складчатом пептиде-миметике, не ослабляя их высокую Υ-рецепторную аффинность (см. примеры). Аналогичным образом селективные к Υ2 рецепторам агонисты можно использовать в качестве химерных (гибридных, слитых) белков, в которых они связаны, например, с альбумином или молекулой другого белка или носителя, что обеспечивает благоприятную фармакокинетику или другие свойства, например пониженное выведение почками. Как известно, в технике существует множество химических модификаций и линкеров, которые можно использовать для такого ковалентного соединения, также как можно использовать множество белков или носителей. Особенно предпочтительно ковалентное присоединение селективного Υ2 пептидного агониста к альбумину и в положениях ΡΡ-складчатой структуры, которые указаны в другом месте данного описания в связи с модификациями с помощью различных мотивов. В предпочтительном варианте данного изобретения терминирующий пептид в С-концевой аминокислотной последовательности Υ2-рецепторного распознавания гибридизован (слит, связан) с С-концом большой биомолекулы, такой как альбумин. Такие гибридные белки можно получать различными полусинтетическими методами, когда пептид можно получать пептидным синтезом по данному описанию, а биомолекулу - методом рекомбинантной ДНК. Гибридный белок можно также получать целиком как рекомбинантную молекулу, экспрессированную, например, в виде молекулы-предшественника, удлинённую за счёт последовательности С1у-Ьу8-Агд, которая, будучи экспрессирована в виде секреторного белка в эукариотических клетках, отщепляется биосинтетическими ферментами и С1у превращается в карбоксамид на С-концевом остатке Туг С-концевой последовательности Υ2-рецепторного распознавания.

- 13 011860

Стабилизация

Как указывается в разных местах в данном описании, многие из селективных Υ2 агонистов по настоящему изобретению стабилизируются различными способами, например Ν-концевым ацилированием, или замещением каркасных участков агониста на непептидный линкер, или внутренней циклизацией за счёт мостиковых связей для стабилизации РР-складчатой структуры. Эта стабилизация в большинстве случаев служит двум целям, причём одной целью является презентирование эпитопов рецепторного распознавания оптимальным образом в отношении Υ2 рецептора за счёт сохранения РР-складки; а второй целью является стабилизация пептида против расщепления, т.е., главным образом, против протеолитического расщепления. Это особенно важно, когда селективные Υ2 агонисты также модифицированы для того, чтобы продлить период полужизни, достичь пролонгированного высвобождения и/или продолжительной экспозиции с тканями за счёт присоединения различных мотивов, обсуждавшихся выше. Обычно пептидные агонисты очень быстро выводятся, главным образом, через почки, и устойчивость белка, как таковая, может быть неважна; однако, когда присутствие пептида в различных жидкостях организма продлевается одним или более способами на много часов, особенно важно, чтобы биологическая активность пептида также оставалась интактной, т. е. чтобы пептид стабилизировался в форме, устойчивой к протеолитическому воздействию, описанному как вообще, так и в отношении специфических примеров селективных Υ2 пептидов-агонистов, например РР-складчатых стабилизированных, циклического |Сук2.Э-Сук27|РУУ и его различных аналогов.

Пептиды, индуцирующие спираль

Ацилирование по Ν-концу агонистов, которые рассматривает данное изобретение, упоминалось как способ стабилизации агониста против действия аминопептидаз. Другая стабилизирующая модификация включает ковалентное присоединение стабилизирующей пептидной последовательности из 4-20 аминокислотных остатков ковалентно на Ν- и/или С-конце, предпочтительно на Ν-конце. Аминокислотные остатки в таком пептиде выбирают из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, ТЬг, Туг, Акп, С1п, Акр, С1и, Ьук, Агд, Н1к, Ме! и т.д. В представляющем особый интерес варианте изобретения присоединяемый Ν-концевой пептид содержит 4, 5 или 6 остатков Ьук, например Ьук-Ьук-Ьук-Ьук-Ьук-Ьук-РУУ25-36 (8ΕΩ ΙΌ Νο: 11). Они могут присоединяться на Ν-конце РР-складчатого пептидного агониста или могут быть помещены на Ν-конце усечённого по Ν-концу РР-складчатого агониста-миметика или укороченного на Ν-конце РР-складчатого агониста-миметика, если спейсерный пептид вводится между новым Ν-концом стабилизирующего пептида. Такие модификации особенно интересны, так как нить (цепь) из остатков Ьук имеет тенденцию образовывать альфа-спиральную структуру и индуцировать её в последующих остатках, что, как обсуждается выше, является выгодным для презентирования рецептору последнего поворота спирали в С-концевой аминокислотной последовательности У2-рецепторного распознавания селективных к Υ2 агонистических пептидов по настоящему изобретению. Общее описание таких удлинений стабилизирующего пептида дано в Международной заявке XVО 99/46283 (2еА1апй РЬагтасеи!1са1к).

Рецепторные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретению, можно получать общеизвестными методами, например синтетическими, полусинтетическими и/или методами рекомбинантной ДНК. Способы включают стандартные методы получения пептидов, такие, например, как синтез в растворе и твердофазный синтез. Руководствуясь учебником и общими знаниями в данной области техники, специалист поймёт, как получать агонисты и их производные и модификации.

- 14 011860

Конкретные агонисты для применения по данному описанию

Конкретные примеры агонистов по изобретению включают в себя следующие:

ΡΥΥ2-36 (8ЕО Ю Νο: 4)

ΝΡΥ2-36 (8Ер ГО Νο: 5) [Ό-Α1η1]ΡΥΥ(8Ε0 ΙΌ Νο:6) [ϋ-ΑΝ2]ΡΥΥ (ЗЕр ΙΟ Νο: 7) [Α1β28]ΡΥΥ (ЗЕр ГО Νο: 8) [А1аЗО]РУУ (8 ЕС) ГО Νο: 9) [А1а31 ]ΡΥΥ (ЗЕр ΙΟΝο: 10)

Ьуя- Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- ΡΥΥ25-36 (8Еф ГО Νο: 11) [Ьуз4,С1п34]РР (8Εζ> ГО Νο: 12) [Суз2ГО- Суз27]РУУ (8Εζ> Ιϋ Νο: 13) [Суз2,О- Суз27]ЦРУ (8Еф ГО Νο: 14) [Суз2,ПеЗ,О- Суз27,Уа131 |ΝΡΥ (8Е() ΙΟ Νο: 15) |Суз2. Аос5- 24,ϋ- Суз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 16) [Суз2, Аос5- 24.0- Суз27]ИРУ (8Е<Э ГО Νο: 17) [Су82,ИеЗ,Аос5- 24,0- Суя27,Уа131]МРУ (ЗЕр ГО Νο: 18) [Ьуз28,С1и32]РУУ25-36 (8ЕС) ΙϋΝο: 19) [С1и28,Ьуя32]РУУ25-36 (8Еф ГО Νο: 20)

А1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а- А1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1аА1а- Агд- Агд- Агд- А1а- А1а- Агд- А1а- ΡΥΥ25-36 (8Е() ГО Νο: 21) [ϋ- А1а2]РУУ2-36 (ЗЕР ГО Νο: 22) [Ьуз4,Ьеи17,С1п34]РР (ЗЕр ΙΟ Νο: 23)

ГЪуз4,Ьеи17,Ьси30,Ст1п34]РР (8ЕС) ΙΟ Νο: 24) [Ьу54,Н1е17_>Ц1е30,С1п34]РР (8Е() ГО Νο: 25) [Ν- (Ν’- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- Ьуз4,М1е17,М1е30,С1п34]РР (ЗЕр ΙΟ Νο: 26)

Ν- ацетил[СуэЗЦ- Суз27]РУУ2-36 (5ЕС) ГО Νο: 27) [Суз2, Ν- (8- (8- гамма- глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)- Ьуз 13,ϋСуя27]РУУ (8Еф ГО Νο: 28) [Суз2, Ν-(Ν’- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьуз13,О- Суз27]РУУ (ЗЕр ΙΕ> Νο: 29) [Суз2Х-{(А1а- Агд- Агд- Агд- А1а-А1а-Агд-А1а)з)- Ьуз13,О- Суз27]РУУ (8ЕС.) 10 (8ЕРЮ Νο:30)

[.Ογ32,Ν- РЕ05000- Ьуз13,О- Суя27]РУУ (8ЕС) ΙΟ Νο: 31)

[.Су52,11еЗ,О- Суз27,Ьеи28,Уа131]ΝΡΥ <ЗЕр Ю Νο: 32) [Суз2,11еЗ,Н1е17,О- Суз27,Н1е28,Уа131рЧРУ (8Еф ГО Νο: 33)

Ν- ацетил- дес- Туг1[Суз2, Аос5- 24,Π- Ογδ27]ΡΥΥ (ЗЕр ГО Νο: 34)

Ν- (Ν'- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- [Суз2, ϋ- Суя27]РУУ (8Е0 ГО Νο: 35) [Суз2, О- Суз27]РУУ2-36 (8Е() ГО Νο: 36) [Суз2, Ν-{Ν’- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гаммаглутамоил- Ьуя13,0- Суз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 37).

и их консервативно замещённые аналоги.

Особенно предпочтительными Υ2-селективными агонистами для применения по настоящему изобретению являются ^82,Ό^827]ΡΥΥ (8 ЕС) ГО №: 13), ^84,0^34^ (8 ЕС) ГО №: 12; фиг. 2В), [Су82,Аοс5-24,^-Су827]ΡΥΥ (8Е0 ГО №: 16) и их аналоги с консервативными заменами.

- 15 011860

Далее описываются конкретные агонисты по изобретению наряду с фармакологическими свойствами их молекул, а также химические свойства и устойчивость пептидов.

ΡΥΥ2-36 (8ЕО Ιϋ Νο: 4)

Этот высокоселективный Υ2-рецепторный агонист типа (а) имеет многие характеристики рецепторного связывания, общие с эндогенным пептидом ΡΥΥ3-36, но проявляет повышенную стабильность по сравнению с ΡΥΥ3-36. Основной эндогенной формой ΡΥΥ в кровотоке является ΡΥΥ3-36 вследствие эффективного и быстрого расщепления дипептидилпептидазой-ΐν (ΌΡΡ-ΐν), при которой удаляются два первых остатка, но образуется более неустойчивый пептид, в котором отсутствует структурно важный остаток Ργο2, как обсуждалось выше.

Профиль рецепторного распознавания.

В ΡΥΥ2-36 отсутствует остаток Туг1, и он обладает слабой аффинностью к Υ1 рецептору, но он связывается с Υ2 рецептором с высокой аффинностью, равной, например, аффинности ΡΥΥ3-36, и будучи пептидом, образованным из ΡΥΥ, распознаётся Υ4 рецептором с низкой аффинностью, сходной с аффинностью ΡΥΥ3-36.

Устойчивость белка.

ΡΥΥ2-36 имеет преимущество перед ΡΥΥ3-36, а именно, он более устойчив и, следовательно, является лучшим биофармацевтическим агентом. Повышенная стабильность белка (устойчивость) основана на следующем:

1) он не является субстратом для ΌΡΡ-ΐν, когда не содержит остатка Ργο или А1а в положении 2;

2) его Ν-концевой остаток Ργο предотвращает расщепление огромным большинством других аминопептидаз, включая, например, аминопептидазу Ν;

3) сохранение важного Ργο2 обеспечивает более устойчивую ΡΡ-складку, чем в ΡΥΥ3-36, так как важное взаимодействие между Ργο2 и последними спиральными поворотами антипараллельной альфаспирали, т.е. в особенности Туг27, всё ещё имеется в ΡΥΥ2-36.

[Ο-Α1λ1]ΡΥΥ(8Ε(2 ГО Νο:6)

Этот высокоселективный Υ2-рецепторный агонист типа (а) является новым пептидом, который имеет многие характеристики рецепторного связывания, общие с эндогенным пептидом ΡΥΥ3-36, но обладает повышенной стабильностью пептида по сравнению с ΡΥΥ3-36.

Профиль рецепторного распознавания.

В [^-А1а1]ΡΥΥ отсутствует боковая цепь остатка Туг1, и он обладает пониженной аффинностью к Υ1 рецептору, но он связывается с Υ2 рецептором с высокой аффинностью, равной, например, аффинности ΡΥΥ3-36, и, будучи пептидом, образованным из ΡΥΥ, распознаётся Υ4 рецептором с низкой аффинностью, сходной с аффинностью ΡΥΥ3-36.

Устойчивость белка.

[^-А1а1]ΡΥΥ имеет преимущество перед ΡΥΥ3-36, а именно, он более устойчив и, следовательно, является лучшим биофармацевтическим агентом. Повышенная стабильность (устойчивость) основана на том, что его Ό-форма его Ν-концевого остатка А1а предотвращает расщепление огромным большинством аминопептидаз, включая, например, ΌΡΡ-ΐν и аминопептидазу Ν. Кроме того, как и в ΡΥΥ2-36, сохранение важного Ργο2 обеспечивает более устойчивую ΡΡ-складку, чем в ΡΥΥ3-36, так как важное взаимодействие между Ργο2 и последними спиральными поворотами антипараллельной альфа-спирали, т.е. в особенности Туг27, всё ещё имеется в [^-А1а1]ΡΥΥ.

|Ο-ΑΙη2]ΡΥΥ (8Е(? ГО Νο: 7) [О- ΑΌ2]ΡΥΥ2- 36 (8Е<2 ΙΟ Νο: 22)

Эти высокоселективные Υ2-рецепторные агонисты типа (а) являются новыми пептидами, в которые для достижения Υ2 селективности введена(ы) замена(ы) в Ν-концевом полипролиновом сегменте ΡΥΥ.

Профиль рецепторного распознавания.

В [^-А1а2]ΡΥΥ2-36 отсутствует Туг1 и отсутствует также боковая цепь Ργο2, тогда как в [Э-А^^АА отсутствует только важная боковая цепь Ργο2, и, следовательно, оба агониста связываются с низкой аффинностью, аналогичной аффинности ΡΥΥ3-36, с Υ1 рецептором, но с высокой аффинностью связываются с Υ2 рецептором. Как показано в табл. 1, аффинность 10^1:12 |ΡΥΥ составляет 0,93 нМ к Υ2 рецептору, в отличие от 483 нМ к Υ1 и 31 нМ к Υ4 рецептору; как показано в табл. 2, активность [^-А1а2]ΡΥΥ равна 1,4 к Υ2 рецептору, в отличие 127 нМ к Υ1 рецептору и 591 нМ к Υ4 рецептору.

Устойчивость белка.

[^-А1а2]ΡΥΥ и [^-А1а2]ΡΥΥ2-36 имеют преимущество перед ΡΥΥ3-36, а именно, они более устойчивы и, следовательно, являются лучшими биофармацевтическими агентами. Повышенная стабильность (устойчивость) основана на том, что его Ό-форма его Ν-концевого остатка А1а в [^-А1а2]ΡΥΥ2-36 предотвращает расщепление огромным большинством аминопептидаз, включая, например, ΌΡΡ-ΐν и аминопептидазу Ν, и тем, что замена Ργο2 в [^-А1а2]ΡΥΥ служит той же цели.

]Α1328]ΡΥΥ (8Е<2 ΙΟ Νο: 8)

Этот высокоселективный Υ2-рецепторный агонист типа (а), в который для обеспечения селективности к Υ2 по сравнению с Υ1 введена модификация в домене альфа-спирали. [А1а28]ΡΥΥ является новым пептидом.

- 16 011860

Профиль рецепторного распознавания.

В [А1а28]РУУ отсутствует боковая цепь остатка Ьеи28, и его аффинность к Υ1 рецептору понижена в 300 раз по сравнению с ΡΥΥ; важно отметить, что сохраняется высокая аффинность к Υ2 и низкая аффинность к Υ4 рецептору. Следовательно, |А1а28|РУУ имеет лучшее селективное окно (интервал селективности) между Υ2 и Υ1, чем, например, ΡΥΥ3-36.

Устойчивость белка.

|Α1α28|ΡΥΥ содержит устойчивую РР-складку, аналогичную ΡΥΥ. Поэтому, чтобы улучшить его свойства как биофармацевтического препарата и предотвратить, например, расщепление аминопептидазами, можно получить ацетилированную по Ν-концу форму, обсуждавшуюся выше, или замену А1а28 можно комбинировать, например, с заменами Э-А1а1 или Э-А1а2. которые также дополнительно улучшают (увеличивают) окно распознавания между Υ2 и Υ1.

ΙΑΕι30]ΡΥΥ (8Е(? ΙΟ Νο: 9)

Этот другой селективный Υ2-рецепторный агонист типа (а), в который для обеспечения селективности к Υ2 по сравнению с Υ1 введена модификация в домене альфа-спирали. |Α1α30|ΡΥΥ является новым пептидом.

Профиль рецепторного распознавания.

В |Α1α30|ΡΥΥ отсутствует боковая цепь остатка Ьеи30, и его аффинность к Υ1 рецептору понижена в 100 раз по сравнению с ΡΥΥ; важно отметить, что сохраняется высокая аффинность к Υ2 и низкая аффинность к Υ4 рецептору. Следовательно, |Α1α30|ΡΥΥ имеет селективное окно (интервал селективности) между Υ2 и Υ1, аналогичное селективному окну, например ΡΥΥ3-36.

Устойчивость белка.

[Α1а30]ΡУУ содержит устойчивую ΡΡ-складку, аналогичную ΡΥΥ. Поэтому, чтобы улучшить его свойства как биофармацевтического препарата и предотвратить, например, расщепление аминопептидазами, можно получить ацетилированную по Ν-концу форму, обсуждавшуюся выше, или замену А1а30 можно комбинировать, например, с заменами Э-А1а1 или Э-А1а2, которые также дополнительно улучшают (увеличивают) окно распознавания между Υ2 и Υ1.

ΙΑΙ3311ΡΥΥ (8Е(? ГО Νο: 10)

Этот другой высокоселективный Υ2-рецепторный агонист типа (а), являющийся новым пептидом, в который для обеспечения селективности к Υ2 по сравнению с Υ1 введена модификация в С-концевой аминокислотной последовательности Υ2 распознавания, как таковой.

Профиль рецепторного распознавания.

В ^Μ^ΡΥΥ отсутствует боковая цепь остатка Уа130, и его аффинность к Υ1 рецептору понижена в 1500 раз по сравнению с ΡΥΥ. Его аффинность к Υ2 рецептору понижена в 3-4 раза, а его низкая аффинность к Υ4 рецептору сохраняется. Следовательно, [Α1а31]ΡУУ имеет значительно повышенное селективное окно (интервал селективности) между Υ2 и Υ1, чем, например, ΡΥΥ3-36.

Устойчивость белка.

[Α1а31]ΡУУ содержит устойчивую ΡΡ-складку, аналогичную ΡΥΥ. Поэтому, чтобы улучшить его свойства как биофармацевтического препарата и предотвратить, например, расщепление аминопептидазами, можно получить ацетилированную по Ν-концу форму, обсуждавшуюся выше, или замену А1а31 можно комбинировать, например, с заменами Э-А1а1 или Э-А1а2, которые также дополнительно улучшают (увеличивают) окно распознавания между Υ2 и Υ1.

[ЬуМ,С1п34]РР (8Е<2 Π) Νο: 12)

Этот пептид представляет собой высокоселективный к Υ2 агонист типа (Ь), т.е. основной ΡΡ-складчатый пептид представляет собой ΡΡ с С-концевой аминокислотной последовательностью Υ2-рецепторного распознавания, которая обеспечивает высокую аффинность к Υ2 и Υ4 рецептору плюс низкую аффинность к Υ1 рецептору. Для того чтобы достичь селективности к Υ2 по сравнению с Υ4, сделана замена в положении 4 в Ν-концевом полипролиновом домене ΡΡ, что нарушает распознавание Υ4. Как обсуждалось выше, селективности к Υ2 по сравнению с Υ4 можно также добиться с помощью других замен. [^у84,С1η34]ΡΡ обладает дополнительным интересным свойством: он проявляет относительно высокую аффинность также к Υ5 рецептору по сравнению с другими селективными к Υ2 лигандами, а также ΡΡ-складчатыми пептидами в целом. Таким образом, [^у84,С1η34]ΡΡ и его аналоги, например, такие, которые представлены ниже, можно рассматривать как комбинированные Υ2-Υ5 селективные агонисты.

Профиль рецепторного распознавания (узнавания).

[^у84,С1η34]ΡΡ проявляет ίη νίίτο активность (см. табл. 2) к Υ2 рецептору, очень близкую активности ΡΥΥ3-36. В отношении Υ1 рецептора |Ъу84,Ο1η34|ΡΡ имеет разницу (окно) ЕС₅₀ между активностями к Υ2 и Υ1 рецепторов более чем в 100 раз, которая сходна с ΡΥΥ3-36. Аналогично, окно селективности [^у84,С1η34]ΡΡ к Υ4 рецептору составляет почти 100 раз. Следовательно, |Су84,С1п34|ΡΡ является высокоселективным агонистом к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1, Υ4, созданном на каркасе ΡΡ. Интересно отметить, что [^у84,С1η34]ΡΡ обладает очень высокой активностью к Υ5 рецептору, в отличие, например, от ΡΥΥ3-36. Активность [^у84,С1η34]ΡΡ к Υ5 рецептору даже ещё выше, чем активность наиболее активных эндогенных лигандов ΡΥΥ и ΝΡΥ.

- 17 011860

Устойчивость белка.

[Ьу84,С1и34]РР содержит устойчивую РР-складку, аналогичную РР. Чтобы улучшить его свойства как биофармацевтического препарата и предотвратить, например, расщепление аминопептидазами, можно получить ацетилированную по Ν-концу форму, обсуждавшуюся выше, или замены можно комбинировать, например, с заменами Э-А1а1 или Э-А1а2, которые также дополнительно улучшают (увеличивают) окно распознавания между Υ2 и Υ1.

[Ьу84,Ьеи17,С!п34]₽Р (8Εζ> ΙΟ Νο: 23), [Ьу84,Ьеи17,Ьеи30,С1п34]РР (8Е(? Ш Νο: 24), [Туя4,Ме17,Ме30,С1п34]РР (8ЕЦ Ιϋ Νο: 25)

Это новые высокоселективные к Υ2 агонисты типа (Ь), т.е. основной РР-складчатый пептид представляет собой РР с С-концевой аминокислотной последовательностью Υ2-рецепторного распознавания, которая обеспечивает высокую аффинность к Υ2 и Υ4 рецептору плюс низкую аффинность к Υ1 рецептору. Что касается [Ьу84,С1и34]РР, чтобы получить селективность к Υ2 по сравнению с Υ4, сделана замена в положении 4 в Ν-концевом полипролиновом домене РР, что нарушает распознавание Υ4. Аналогично [Ьу84,С1и34]РР, эти пептиды обладают дополнительным интересным свойством, они проявляют относительно высокую аффинность также к Υ5 рецептору по сравнению с другими селективными к Υ2 лигандами, а также РР-складчатыми пептидами в целом. Важно, что в [Ьу84,Ьеи17,С1п34]РР, [Ьу84,Ьеи17,Ьеи30,61п34]РР и в [Ьу84,Ше17,№е30,61п34]РР один или оба остатка Ме! в положении 17 и 30 замещены либо на Ьеи, либо на норлейцин (Ше). который не может окисляться. Таким образом, эти три пептида представляют собой группу Υ2 селективных пептидов, в которых окисление остатков Ме! предотвращено с помощью замены на неокисляющийся остаток.

Устойчивость белка [Ьу84,Ьеи17,61п34]РР.

[Ьу84,Ьеи17,Ьеи30,61п34]РР и 7^^30,611'134^ обладают общей устойчивостью, аналогичной устойчивости [Ьу84,С1п34]РР, однако эти пептиды не восприимчивы к окислению одного или более остатков Ме!, что при некоторых обстоятельствах является преимуществом биофармацевтического препарата.

[Су«2, Аос5- 24.П- Су«27^РУ (8ЕЦ I» Νο: 17)

Этот пептид, который в данном описании также называется ί^-ΝΒΥ, представляет собой высокоселективный к Υ2 агонист типа (с), т. е. пептид, содержащий С-концевую аминокислотную последовательностью Υ2-рецепторного распознавания, слитую (гибридизованную) по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, состоящим в данном случае из ΝΕΥ25-30, который принимает спиральную конфигурацию (ограничен этой конфигурацией) за счёт внутримолекулярной ковалентной связи, расположенной в данном случае между Су§2, введённым в сегмент NРΥ1-4, соответствующий домену Ν-концевой полипролиновой спирали, и Э-Су827, введённым в домен альфа-спирали. В С-2 NРΥ последовательность из остатков 5-24 NРΥ замещают на 8-аминооктановую кислоту (Кгкепаикку е! а1. 1989, ΒΝΛΞ 86: 4377-81, Сох & Кг8!епаи8ку,1991, Рерйбек 12: 323-27). [Су§2,Аос524.Э-Су527|НРТ является высокоселективным агонистом, имеющим дополнительное преимущество по сравнению, например, с РΥΥ3-36, так как он намного меньше - только 16 остатков - и всё ещё очень устойчив.

Показано ш νίνο, что соответствующий [Айx5-24,гамма-^1и2-ер8-^у830]NРΥ, в котором имеется лактамный мостик между С1и в положении 2 и Ьу§ в положении 30 РР-складчатого усечённого NРΥ наряду со спейсером аминогексановой кислоты между остатками 4 и 25, в отличие от ΝΕΥ, не вызывает повышения давления у крыс, т.е. при испытаниях ш νίνο у него отсутствует классический Υ1 рецепторный эффект (Веск-81скшдег е! а1. 1992, Еиг. 1. Вюсйеш. 206: 957-64).

Устойчивость белка.

Это циклический пептид.

[Су$2, Аос5- 24,0- Су.ч27|Р¥У (8Е(2 ΙΠ Νο: 16)

Этот пептид, который в данном описании может также называться С2-РΥΥ, является новым, высокоселективным Υ2 агонистом типа (с), т.е. пептидом, содержащим С-концевую аминокислотную последовательностью Υ2-рецепторного распознавания, слитую (гибридизованную) по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, состоящим в данном случае из ΝΕΥ25-30, который принимает спиральную конфигурацию (ограничен этой конфигурацией) за счёт внутримолекулярной ковалентной связи, расположенной в данном случае между Су§2, введённым в сегмент РРΥ1-4, соответствующий домену Ν-концевой полипролиновой спирали, и Э-Су827, введённым в домен альфаспирали. В С-2 РРΥ последовательность из остатков 5-24 РРΥ замещена на 8-аминооктановую кислоту. С-2 РΥΥ отличается от С-2 ΝΙΎ в положениях 3 (11е вместо 8ег), 28 (Ьеи вместо 11е) и 31 (Уа1 вместо 11е), делающих С-2 РΥΥ истинным миметиком С- и Ν-концов РΥΥ, но находящимся в форме, которая заставляет значительно меньший по размеру пептид (16 остатков вместо 36) быть селективным к Υ2 агонистом. Важно, что С2-3ΥΥ обладает более высокой активностью к Υ2 рецептору, чем С2-NРΥ.

С2-РУУ активирует Υ2 рецептор (табл. 2, см. ниже) с величиной ЕС₅₀, что примерно в 10 раз выше, чем РУУ3-36, однако в отличие от РУУ3-36, который стимулирует Υ1 рецептор с величиной ЕС₅₀ 74 нМ,

- 18 011860

С2-РΥΥ не стимулирует Υ1 рецептор даже при концентрации 1 мкМ. Важно, что С2-РΥΥ также не стимулирует ни Υ4, ни Υ5 рецептор даже при концентрации 1 мкМ. Последнее наблюдение является особенно удивительным, так как это самая низкая активность, наблюдаемая для аналога РР-складчатого пептида. Таким образом, С2 РУУ является агонистом Υ2 в концентрациях менее 10 нмоль, чья селективность относительно Υ1 рецептора в 10 раз лучше, чем у РУΥ3-36, и который является высокоселективным относительно Υ4 и даже Υ5 рецептора.

Устойчивость белка.

С-2 Ν₽Υ является циклическим пептидом, который, благодаря своему дизайну по сравнению с природной РР-складкой, имитирует конец этой структуры в виде структуры, ограниченной благодаря внешнему дисульфидному мостику.

Ν- ацетил- дес- Туг1[Су$2, Аос5- 24,1)- Су®27]РУУ (8Εζ) ГО Νο: 34), [Су$2,ПеЗ,Аос5- 24,1)- (3.07,УаЕЧ]\РУ (8Е<} ГО Νο: 18)

Эти пептиды являются новыми высокоселективными Υ2 агонистами типа (с), т.е. пептидами, содержащими С-концевую аминокислотную последовательностью Υ2-рецепторного распознавания, слитую (гибридизованную) по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, состоящим в данном случае либо из РУУ25-30, либо из №Υ25-30, который принимает спиральную конфигурацию (ограничен этой конфигурацией) за счёт внутримолекулярной ковалентной связи, расположенной в данном случае между Сук2, введённым либо в сегмент РРΥ1-4, либо в сегмент №Υ1-4, соответствующий домену Ν-концевой полипролиновой спирали, и О-Сук27, введённым в домен альфаспирали. В РР-складчатых миметиках последовательность из остатков 5-24 РРΥ замещена на остаток 8аминооктановой кислоты. Эти пептиды представляют собой группу таких пептидов, примерами которых являются: Ас-дес-Ту^1[Сук2,Аοс5-24,^-Сук27]РУΥ (соответствует [Сук2,Аοс5-24,^-Сук27]РУΥ, в котором Туг1 замещён по Ν-концу блокирующей ацетильной группой) и [Сук2,11е3,Аос5-24,ПСук27,Vа131]NРΥ (соответствует [Сук2,Аос5-24,^-Сук27]NРΥ, в котором два остатка замещены с целью сделать его более подобным РУУ). С помощью таких модификаций создаётся группа Υ2 селективных пептидов, из которой можно выбрать пептиды, особенно пригодные для клинического применения.

[Сук2,0- Сук27]Р¥У (8Е<2 ГО Νο: 13)

Этот пептид является высокоселективным Υ2 агонистом типа (с), который также был создан для более высокой устойчивости белка. По аналогии с конструкциями С-2 Ν₽Υ и С-2 РУУ между Сук в положении 2 и Ό-Сук в положении 27 вводят внутримолекулярный дисульфидный мостик, который, однако, вводят в полноразмерную молекулу РУУ для стабилизации РР-складчатой структуры. Таким образом, [Сук2,^-Сук27]РУУ представляет здесь группу селективных Υ2 агонистических пептидов со стабилизирующей внутримолекулярной связью между Ν-концевой поли-Рго последовательностью и амфифильным спиральным сегментом. У других членов этой группы дисульфидный мостик может быть образован между остатками в других положениях, или может быть ковалентная внутримолекулярная связь другого типа, например лактамный мостик между гамма-карбоксильной группой остатка С1и2 и ипсилон-аминогруппой остатка Ьук30, например в [61и2-^ук30]РУΥ. [Сук2,^-Сук27]РУΥ, является активным, например, также будучи ацетилированным по Ν-концу, эта модификация предупреждает в дальнейшем расщепление пептида аминопептидазами. [Сук2,^-Сук27]РУУ является новым соединением.

Профиль рецепторного распознавания.

[Сук2,^-Сук27]РУУ стимулирует Υ2 рецептор (см. табл. 2) с активностью (ЕС₅₀=0,33 нМ), аналогичной активности РУУ3-36, тогда как Υ1 рецептор стимулирует с активностью более 1 мкМ, т.е. он более чем в 20 раз менее активен к Υ1 рецептору, чем РУУ3-36. Величина ЕС₅₀ [Сук2,^-Сук27]РΥΥ к Υ4 рецептору составляет более 1 мкМ. Таким образом, [Сук2,^-Сук27]РУΥ является селективным к Υ2 агонистом в концентрациях менее десяти наномолей, чей индекс селективности относительно Υ1 рецептора составляет около 10 000, что в 50-100 раз лучше, чем у РУУ3-36.

Устойчивость белка.

Благодаря стабилизации РР-складки за счёт внутримолекулярного дисульфидного мостика [Сук2,^-Сук27]РУУ более стабилен, чем РУУ3-36, в котором удалён остаток Рго2, важный участок чувствительного к гидрофобным воздействиям сегмента, который стабилизировал РР-складку, и даже более стабилен, чем сам РУУ1-36. Дисульфидный мостик в основном предупреждает расстёгивание молнии РР-складки, и РР-складка удерживает пептид в конформации, в которой эндопептидазе затруднён доступ к пептиду. Замена Рго2 на Сук имеет дополнительное преимущество, так как она делает пептид полностью резистентным к расщеплению дипептидилпептидазой-ΐν, для которой РУУ1-36 без этого является очень хорошим субстратом. Эта повышенная устойчивость ещё дополнительно повышена в ацетилированном по Ν-концу варианте [Сук2,^-Сук27]РУУ.

Ιη у1уо рецепторная селективность.

В исследовании с повышением дозы [Сук2,^-Сук27]РУУ вводят внутривенным вливанием собакам после анестезии в виде последовательных инфузий в течение 30 мин в дозах 0,3, 1, 3, 10, 30 и 100 мкг/кг. Плазматические уровни [Сук2,^-Сук27]РУУ определяют радиоиммуноанализом, обнаруживается линейная зависимость от дозы. При наивысшей дозе у собак получают уровни в плазме 32 нМ.

- 19 011860

Тем не менее, не наблюдается никакого зависящего от дозы действия ни на кровяное давление, ни на частоту сердечных сокращений. Общеизвестно, что ΡУУ и ΝΓΥ, агонисты как Υ1, так и Υ2 рецепторов, при значительно более низких уровнях в плазме повышают кровяное давление. Таким образом, эти эксперименты показывают, что [Сук2,^-Сук27]ΡУУ т у1уо также является высокоселективным пептидом, лишённым какой-либо измеримой активности к Υ1 рецептору.

1п у1уо влияние на скорый приём пищи.

Либо ΡУУ3-36, либо [Сук2,^-Сук27]ΡУУ, либо физиологический раствор вводят в виде подкожных инъекций группам из 8 мышей в дозах 3 или 30 мкг (ΡУУ3-36) или 10 и 100 мкг ([Сук2,^-Сук27]ΡУУ) на животное после 16-часового перерыва в еде. На фиг. 4 показано суммарное потребление пищи мышами. ΡУУ3-36 в дозе 30 мкг ингибирует потребление пищи в течение первых 2 ч, но эффект постепенно исчезает в течение следующих 2-6 ч. [Сук2,^-Сук27]ΡУУ оказывает более ярко выраженное и продолжительное действие на потребление пищи у мышей, чем ΡУУ3-36. Так, даже в дозе 10 мкг наблюдают более эффективное подавление потребления пищи, и этот эффект длится в течение более 8 ч. Фиг. 4. Таким образом, [Сук2,^-Сук27]ΡУУ, равный ΡΥΥ3-36 по активности к Υ2 рецептору, как определено анализами сигнальной трансдукции ш νίΙΐΌ, очевидно, является более активным и, возможно, связан с повышенной устойчивостью белка, что присуще стабилизированному дисульфидным мостиком пептиду [Сук2,ЭСук27]ΡУУ.

[Су«2, Ν- (№- тетрадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьу$13,В- Γ'γί>27]ΡΥΎ (8Ер ГО

Νο: 38) [Су$2, Ν-(Ν*- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Еу<:13,П- Су827|РУУ (8Е()

ΙΒ Νο: 29) [Сук2, Ν- (8- (8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)Ьу813,В- Су527]РУУ (8Εζ) ГО Νο: 28)

Эти пептиды являются типичными членами семейства пептидов, представляющих собой высокоселективные к Υ2 агонисты, которые стабилизированы с помощью химических реакций белков за счёт дисульфидного мостика (для предупреждения расщепления эндопептидазами) и которые могут быть ацетилированы по Ν-концу для предупреждения расщепления аминопептидазами (пептид является естественно амидированным по С-концу, что предупреждает расщепление карбоксипептидазами) и алкилилированы по ипсилон-аминогруппе Ьук, введённого в положение 13 (в петле РР-складки, далеко от сайта распознавания рецептора), через гамма-глутаминовокислый спейсер длинноцепной жирной кислотой, который при циркуляции предохраняет (гарантирует) связывание модифицированного пептида с альбумином и тем самым обеспечивает продолжительное действие пептида.

Аналогичное свойство, т.е. связывание с альбумином, может быть достигнуто с помощью алкилирования другими длинноцепными жирными кислотами с различной длиной цепи и различной степенью насыщенности (КигхйаК Р. е! а1. ВюсЬет. 1. 1995, 312: 725-31). Ясно также, что алкилирование пептида длинноцепной жирной кислотой можно осуществлять посредством модификации других введённых аминокислот или модифицированных аминокислот, таких как Сук, или что альбуминсвязывающий фрагмент может быть составной частью неприродного аминокислотного остатка, содержащегося в пептиде. Алкилированная аминокислота в данном примере находится в положении 13 ΡΥΥ, но она может находиться в пептиде в любом положении, которое не ослабляет рецепторного распознавания пептида, которое предпочтительно находится в положениях 1-30 (ср. общее описание, см. выше).

Профиль рецепторного распознавания.

Как показано в табл. 1 и 2, введение остатка Ьук в положение 13 в [Сук2,^-Сук27]ΡУУ и присоединение длинной алкильной цепи к ипсилон-аминогруппе Ьук13 не изменяет высокой аффинности этого циклического пептида к Υ2 рецептору, а именно: 1С₅₀=0,79 нМ и ЕС₅₀=0,48 для [Сук2,^-Сук27]ΡУУ; 1С₅₀=0,60 нМ и ЕС₅₀=1,9 для [Сук2,^ук13,^-Сук27]ΡУУ; и 1С₅₀=0,90 нМ и ЕС₅₀=0,68 для [Сув2,К-(8-(8гамма-глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)-^ук13,^-Сук27]ΡУУ.

Ν- (Ν'- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- [Су82, В- Су527]Р¥¥ (8Εζ> II) Νο: 35)

Этот пептид является типичным членом семейства пептидов, представляющих собой высокоселективные к Υ2 агонисты, которые стабилизированы с помощью химических реакций белков за счёт дисульфидного мостика (для предупреждения расщепления эндопептидазами) и которые ацетилированы по Ν-концу для предупреждения расщепления аминопептидазами (пептид является естественно амидированным по С-концу, что предупреждает расщепление карбоксипептидазами) и алкилилированы по альфа-аминогруппе Туг1 длинноцепной жирной кислотой, что, помимо защиты от действия аминопептидаз, также в кровотоке сохраняет связывание модифицированного пептида с альбумином и, тем самым, обеспечивает длительное действие пептида.

[Су^Л'-ЦМа- Агд- Агд- Агд- А1а-А1а-Агц-А1а)₃)- ЬуНЗ.В- Су«27]РУУ (8Е0 II) Νο: 30)

Этот пептид представляет группу Υ2 селективных пептидов, модифицированных с помощью САСсвязывающего мотива с целью получить ш у1уо связывание с САС в тканях, а именно, чтобы получить

- 20 011860 пролонгированную локальную экспозицию Υ2 рецептора (и Υ5 рецептора, если пептид относится к группе пептидов с комбинированной Υ2 и Υ5 селективностью) в целевой ткани и/или пролонгированное высвобождение вследствие пролонгированного удерживания в сайте (месте) введения в организм, например, подкожной инъекцией. В данном конкретном случае ОАО-связывающий мотив - линейная тримерная форма последовательности А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а - соединяется с ипсилонаминогруппой Ьуз, введённого в положение 13 в основной пептид [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ (см. фиг. 3А). Синтез этого пептида для анализа кэпированного на Ν-конце ОАО-связывающего мотива группой флуоресцена описан ниже.

Профиль рецепторного распознавания.

Как обсуждается выше, введение Ьуз13 не меняет высокой аффинности и активности к Υ2 рецептору стабилизированного циклического пептида [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ или его высокой селективности к Υ2 рецептору относительно Υ1 и Υ4 рецепторов (табл. 1 и 2). Важно, что присоединение содержащего 24 остатка ОАО-связывающего мотива [А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а]₃ к ипсилон-аминогруппе Ьуз13 не влияет на высокую Υ2-рецепторную аффинность (ΙΟ₅₀=0,21 нМ) или активность (ЕС₅₀=0,37 нМ) или его высокую селективность к Υ2 рецептору (см. табл. 1 и 2).

Связывание с гепарином.

Как показано на фиг. 5, меченый флуоресцеином вариант [Суз2,Ы-{(А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-АгдА1а)₃}-^уз13,^-Суз27]ΡΥΥ почти полностью адсорбируется на Н1Тгар колонке с гепарин-сефарозой, и он начинает элюироваться, когда матрицу экспонируют с 2- или 3-молярным количеством ЫаС1, это показывает, что пептид, модифицированный ОАО-мотивом, проявляет очень высокую аффинность к ОАО, представленных в данном случае гепарином. Следует отметить, ранее было продемонстрировано, что пептидный мотив такого типа, который связывается с гепарином с такой аффинностью, гарантирует ш νίνο удерживание во внеклеточной матрице аналогично высокомолекулярному полилизину, а именно, не вымывается в течение 4-часового периода перфузии (Ьакйагоу е! а1. ЕЕВ8, Ьей. 2003, 27: 6-10). Таким образом, [Суз2,N-{(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)₃}-^уз13,^-Суз27]ΡΥΥ представляет группу Υ2 селективных пептидов, декорированных высокоаффинными ОАО-связывающими мотивами, и, тем самым достигается продолжительная локальная экспозиция рецептора в целевой ткани, например после внутриартериальной инъекции, например, в коронарную или бедренную артерию.

Ν- ацетил[Су82,1>- Ογ527]ΡΥΥ2- 36 (8ЕЦ П> Νο: 27) и [Су«2,0- Су827]РУУ2- 36 (8ЕЦ ГО Νο: 36)

Пептид [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ2-36 является высокоселективным Υ2 агонистом типа (с), который также создан с целью высокой устойчивости белка. По аналогии с [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ между Суз в положении 2 и Ό-Суз в положении 27 вводится внутримолекулярный дисульфидный мостик, однако здесь он вводится в ΡΥΥ2-36, чтобы стабилизировать ΡΡ-складчатую структуру. Туг1 либо отсутствует, либо заменён ацетилированием по Ν-концу. [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ2-36 и его ацетилированную по Ν-концу форму можно модифицировать с помощью различных мотивов, например, введением сайта присоединения, такого как Ьуз13 или другого остатка в другом положении, как указано в другом месте данного описания, представленных для других Υ2-селективных пептидов, в положениях, которые сохраняют их селективность к Υ2, при этом добавляя положительные свойства, обсуждавшиеся выше. [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ2-36 и его ацетилированная по Ν-концу форма являются новыми соединениями.

N-ацетил[Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ2-36 проявляет свойства Υ1, Υ2 Υ4 рецепторного распознавания, очень близкие свойствам [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ.

1Су82,11еЗ,О- Су527,Уа131ШРУ (8ЕО ΙΟ Νο: 32) [Су82Д1еЗ,О- Су827,£еи28,Уа131 ]ΝΡΥ (8Е<2 ΙΟ Νο: 33) [Су$2, ПеЗ, Ме17.О- Суз27,Ме2К ν₃131]ΝΡΥ (8ЕО ΙΟ Νο: 34)

Все эти пептиды являются высокоселективными Υ2 агонистами типа (с), в которых по аналогии с [Суз2,^-Суз27]ΡΥΥ между Суз в положении 2 и Ό-Суз в положении 27 введён внутримолекулярный дисульфидный мостик, однако здесь он введён в ΝΡΥ, и различные аминокислотные остатки пептидов замещены на С- и Ν-концах с целью сделать пептид более похожим на ΡΥΥ, но сохранить общую ΡΡскладку ΝΡΥ. В некоторых аналогах остатки Ме! замещены на остатки Ьеи или ΝΚ для того, чтобы избежать возможного окисления пептида.

[Ьу«28_>С1и32]Р¥У25- 36 (8ЕО ΙΟ Νο: 19)

Этот циклический додекапептидный аналог ΡΥΥ, стабилизированный внутримолекулярным лактамным мостиком, является высокоселективным Υ2 агонистом типа (с), который состоит только из 12 остатков вместо 34, как в ΡΥΥ3-36, в котором между остатком в домене альфа-спирали и остатком в С-концевой аминокислотной последовательности Υ2 распознавания. Ьеи28 в ΡΥΥ (положение 4 в настоящем додекапептиде) замещён на остаток Ьуз, и ТЬг32 (положение 8 настоящего додекапептида) замещён на остаток О1и, а амино- и карбоксильная группы в боковых цепях этих остатков соединяются, образуя лактамный мостик. Описано, что близкий аналог ΝΡΥ является селективным Υ2 агонистом с активностью, аналогичной ΝΡΥ (К1з! е! а1. 1996, ЕЕВ8 Ьей. 394: 169 173).

- 21 011860

Профиль рецепторного распознавания.

[Ьук28,С1и32]РУУ25-36 проявляет активность к Υ2 рецептору, аналогичную активности РУУ3-36, но он, по правде говоря, не распознаётся Υ1 рецептором и из-за основной РΥΥ структуры не распознаётся также Υ4 рецептором.

Устойчивость белка.

[^ук28,С1и32]РУΥ25-36 является циклическим, структурно упорядоченным пептидом, который, благодаря своему дизайну, имитирует концевой участок молекулы РΥΥ, а именно, имеет напряжённую структуру из-за стабилизирующего спираль внутримолекулярного лактамного мостика.

[1_ук]6- ΡΥΥ25- 36 (8Е(? ΙΟ Νο: 11)

Этот аналог РΥΥ является высокоселективным агонистом Υ2 типа (с), который модифицирован за счёт слияния по своему Ν-концу с последовательностью, индуцирующей альфа-спираль, состоящей из шести остатков Ьук. Благодаря индуцирующим спираль свойствам этих остатков и общей предрасположенности домена альфа-спирали РΥΥ, в данном случае остатков 25-30, к тому, чтобы принять структуру альфа-спирали, индуцирующая спираль последовательность презентирует РΥΥ25-36 оптимальным образом для Υ2-рецепторного распознавания.

Профиль рецепторного распознавания.

-[^ук]₆-РΥΥ25-36 проявляет высокую аффинность к Υ2 рецептору (1С₅₀=4,1 нМ) и слабо распознаётся Υ1 рецептором (1С₅₀=520 нМ) и Υ4 рецептором (1С₅₀=213 нМ).

Устойчивость белка.

-|^ук|₆-РУУ25-36 проявляет сильную склонность к образованию спиральной структуры, что делает его более устойчивым, чем пептиды такого размера в целом.

Клинические показания.

Υ2-специфические агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, важны для лечения состояний, откликающихся на активацию Υ2 рецепторов. Такие состояния включают состояния, для которых показаны регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм или индукция ангиогенеза. Для применения в каждом таком случае агонист может включать модификацию или мотив, которые придают устойчивость к пептидазам, свойства связывания с сывороточным белком или ПЭГ илирование для того, чтобы продлить период полужизни в сыворотке и/или в ткани. Главным образом, для индукции ангиогенеза агонист может содержать САС-связывающий мотив для продления периода полужизни в тканях и экспозиции с Υ рецептором.

Заболевания или состояния, при которых показана индукция ангиогенеза, включают заболевание периферических сосудов, заболевание коронарных сосудов, инфаркт миокарда, удар, состояния, при которых всё вышеперечисленное рассматривается как способствующий фактор, заживление ран и восстановление тканей.

Заболевания или состояния, при которых показана регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм, включают ожирение и избыточный вес и состояния, при которых ожирение и избыточный вес рассматриваются как способствующие факторы, такие как булимия, нейрогенная булимия, синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (ИТООМ), гипергликемия, устойчивость к инсулину, нарушенная толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензия, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемия, гиперлипидемия, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.

1. Ожирение и избыточный вес.

Было показано, что РΥΥ3-36 снижает аппетит, потребление пищи и вес тела у различных грызунов при периферическом введении (ВайегЬат е! а1. 2002, 418: 595-7; СЬаШк е! а1. ВВКС Νον. 2003,

311: 915-9), а также для снижения аппетита у человека также при периферическом введении (Ва!!егЬат е! а1 2002). Данные на животных, включая исследования нокаутированных по рецептору животных, чётко показывают, что это действие РУΥ3-36 опосредуется Υ2 рецепторами и и РОМС нейронами в дугообразном ядре. Интересно, что этот эффект является продолжительным и наблюдается в течение 24 ч после, например, единичной интраперитонеальной инъекции РΥΥ3-36. Такое продолжительное воздействие на аппетит и т.д. хорошо известно также после 1СУ (интрацеребровентрикулярной) инъекции, особенно АдКР. Уровни РУΥ и пищевая реакция на РΥΥ часто ниже у субъектов, страдающих ожирением, и находятся в обратной корреляции с их ВМ1 (индекс массы тела). Важно отметить, что субъект, страдающий ожирением, не резистентен к действию РУΥ, так как инфузия РУΥ3-36 в течение 90 мин снижает потребление пищи у субъектов, страдающих ожирением, аналогичным образом в течение длительного времени (ВайегЬат е! а1. 2003, ИЕХМ, 349: 941-48).

Следовательно, Υ2 селективные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, пригодны для применения для субъекта, такого как млекопитающее, включая человека, чтобы регулировать потребление энергии. Соответственно, изобретение относится к способам изменения потребления

- 22 011860 энергии, потребления пищи, аппетита и расхода энергии. В данном описании раскрывается способ уменьшения потребления энергии или пищи путём введения субъекту косметически или терапевтически эффективного количества такого агониста. В одном варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к снижению количества или общего веса, или общего объёма пищи. В другом варианте изобретения это может вызывать снижение потребления компонента пищи, например снижение приёма липидов, углеводов, холестерина или белков. В любых способах по данному описанию могут вводиться предпочтительные соединения, которые подробно обсуждаются в данном описании. В дополнительном варианте изобретения раскрывается способ снижения аппетита путём введения терапевтически эффективного количества такого агониста. Аппетит можно измерять (определять) любыми способами, известными специалисту в данной области техники.

Например, пониженный аппетит можно определять с помощью физиологической оценки. В таком варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к изменению чувства голода, насыщения и/или сытости. Голод можно оценивать любыми способами, известными специалисту в данной области техники. В одном варианте изобретения голод оценивают с помощью физиологических анализов, таких как оценка чувства голода и сенсорного восприятия, используя, например, анкету.

В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию изменения энергетического метаболизма у субъекта. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества такого агониста, тем самым изменяется расход энергии. Энергия сжигается в физиологических процессах. Организм может непосредственно изменять расход энергии, модулируя эффективность этих процессов или изменяя количество или природу протекающих процессов. Например, в процессе пищеварения энергия в организме затрачивается при прохождении через пищеварительный тракт и усвоении пищи, и в клетках, при этом эффективность клеточного метаболизма может меняться, выделяя больше или меньше тепла. В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию любых и всех манипуляций дугообразной цепи, описанных в данном изобретении, которые согласованно изменяют потребление пищи и соответственно изменяют расход энергии. Расход энергии является результатом клеточного метаболизма, белкового синтеза, интенсивности обмена веществ и усвоения калорий. Таким образом, в данном варианте изобретения периферическое введение вызывает повышенный расход энергии и пониженную эффективность усвоения калорий. В одном варианте изобретения терапевтически эффективное количество рецепторного агониста по изобретению вводят субъекту, тем самым повышая расход энергии.

В некоторых вариантах изобретения как при терапевтическом, так и при косметическом применении Υ2 селективный агонист можно использовать для контроля веса и лечения, снижения или предупреждения ожирения, в частности для достижения одного или более из нижеприведённых результатов: предупреждение и снижение увеличения массы тела; индукция и промотирование потери веса и уменьшение ожирения, определяемого с помощью индекса массы тела. Как указано выше, изобретение также относится к применению Υ2 селективного агониста для регуляции одного или более чувств: аппетита, сытости или голода, в частности одного или более из нижеперечисленного: уменьшения, подавления и ингибирования аппетита; индукции, увеличения, повышения и промотирования сытости и ощущения насыщения и уменьшения, ингибирования и подавления голода и ощущения голода. Это раскрытие относится далее к применению Υ2 селективного агониста для поддержания одного или более из нижеперечисленного: заданного веса тела, заданного индекса массы тела, желаемого внешнего вида и хорошего здоровья.

В другом, или альтернативном, аспекте данное изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения пониженного энергетического метаболизма, нарушений питания, нарушения аппетита, избыточного веса, ожирения, булимии, нейрогенной булимии, синдрома X (метаболического синдрома) или связанных с этим осложнений или рисков, включая диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (ΝΙΌΌΜ), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, застойную сердечную недостаточность, удар, инфаркт миокарда, тромбоэмболические заболевания, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки, причём способ заключается во введении субъекту, такому как млекопитающее, включая человека, эффективной дозы одного или более Υ2-селективных агонистов по данному описанию.

2. Терапевтический ангиогенез.

Ряд ίη νίΐΓΟ исследований влияния на рост клеток сосудов гладких мышц, гипертрофию вентрикулярных кардиомиоцитов, а также на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток наводят на мысль, что ΝΡΥ может действовать как ангиогенный фактор (2ико\\'5ка-Сго)ек е! а1. 1998, С1гс. Ке§. 83: 187-95). Важно отметить, что исследования ίη νίνο как на мышиной модели корнеальных микрокарманов, так и анализ хорионаллантоисной мембраны (САМ) цыплят подтвердили, что ΝΡΥ является мощным ангиогенным фактором, который приводит к возникновению васкулярных структур, подобных сосудистому дереву, с проявляющейся вазодилатацией, как наблюдалось в ином случае только для фактора роста фибробластов-2 (РСР-2), а не на примере ангиогенных структур сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР, УЕСР) (Екйгапб е! а1. 2003, ΡΝΑ8, 100: 6033-38). При развитии эмбрионов цыплят

- 23 011860

ΝΡΥ индуцировал прорастание сосудов из ранее имевшихся кровеносных сосудов. Действие ΝΡΥ не наблюдается у животных, нокаутированных по Υ2 рецептору, это указывает, что Υ2 рецептор отвечает за ангиогенный эффект ΝΡΥ (Екйгапй е! а1. 2003). Это замечание подтверждается также наблюдениями, показывающими, что Υ2 рецептор является высокоактивированным (позитивно регулируется) в ишемических сосудах, и фермент, который генерирует эндогенный, селективный Υ2 лиганд ΡΥΥ3-36, дипептидилпептидазу-ΐν, также является высокоактивированным.

При различных сердечно-сосудистых заболеваниях, например, таких как атеросклероз, считается, что в периферических сосудах, а также в коронарных сосудах индукция ангиогенеза является благотворной. Также считают, что индукция ангиогенеза благотворна для обеспечения реперфузии после инфаркта микарда. Полагают, что особенно ЕСЕ-2 является эффективным агентом для индукции ангиогенеза у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Однако подобно большинству ангиогенных факторов ЕСЕ-2 является фактором роста и может также стимулировать рост опухолей, вызывая ангиогенез. Как представлено выше, ΝΡΥ, действующий через Υ2 рецепторы, индуцирует неоваскуляризацию типа, аналогичного неоваскуляризации, индуцируемой ЕСЕ-2, однако ΝΡΥ является нейропептидом, а не классическим фактором роста и не вызывает осложнений в виде индукции роста опухоли. Таким образом, Υ2 агонист является агентом, пригодным для терапевтического ангиогенеза. Однако особенно важно для такого применения то, что агонист не проявляет Υ1-рецепторного агонизма, так как это оказывало бы нежелательное действие на сердечно-сосудистую систему. Это означает, что пептиды, которые рассматриваются в данном изобретении, являются Υ2 селективными рецепторными агонистами или являются особенно подходящими терапевтическими агентами также с учётом того, что они вызывают ангиогенез. Они особенно применимы после модификации с присоединением САС-связывающего мотива, обсуждавшегося выше.

Дальнейшее уточнение. Действие ЕСЕ-2, как действие большинства классических факторов, частично опосредуется или регулируется с помощью их связывания с гликозаминогликаном (САС) во внеклеточной матрице. Это связывание с САС гарантирует, что ангиогенный фактор действует в соответствующем пространстве и времени и что он не скоро вымывается из ткани. Для применения в терапевтическом ангиогенезе малых пептидов и пептидов-миметиков, таких как описанные в настоящем изобретении, это особенно важно. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения пептиды включают один или более САС-связывающих мотивов, которые гарантируют, что они присоединятся к САС во внеклеточной матрице с целью индуцировать оптимальный ангиогенез после введения. Это можно осуществлять, например, внутривенным или внутриартериальным введением или, например, можно вводить непосредственно в коронарные артерии, чтобы индуцировать ангиогенез в сердце при болезни коронарной артерии и/или после острого инфаркта миокарда. Аналогично, такое соединение можно вводить внутриартериальной инъекцией в бедренную артерию для лечения болезни периферических сосудов. Его можно также, например, применять для топического, местного введения в кожные поражения, чтобы стимулировать более быстрое заживление ран. Продолжительной экспозиции с Υ рецептором, эффективной для индукции ангиогенеза, можно также добиться, используя пептид по настоящему изобретению, модифицированный мотивом, связывающим сывороточный альбумин.

Таким образом, в предпочтительном варианте изобретения Υ2 селективные агонисты содержат САС-связывающий мотив, который вводят в положение, где он не снижает устойчивости пептида или не снижает активности и селективности пептида. Особый вариант изобретения относится к ΡΥΥ3-36, содержащему один или более САС-связывающих мотивов.

В другом варианте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество Υ2 и/или Υ4 селективных агонистов, включающих САС-связывающий мотив в комбинации с гепарином в терапевтически эффективном носителе.

Соответственно, в одном варианте данное изобретение относится к применению модифицирующих изменений Υ2 селективного рецепторного агониста в системе ангиогенеза, особенно для индукции ангиогенеза, такого как ангиогенез, ассоциированный заболеваниями или состояниями, например, такими как сердечно-сосудистые заболевания, включая болезнь периферических сосудов с такими симптомами, как перемежающаяся хромота, болезнь коронарных артерий и инфаркт миокарда; процессы репарации тканей, включая заживление ран на коже, воспалительные состояния, включая воспалительные состояния в желудочно-кишечном тракте, такие, например, как язвы, колит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и т. д.

Особый вариант изобретения включает применение рецепторного агониста для индукции ангиогенеза в сердце, или в кровеносных сосудах, или в тканях, таких как ткани слизистой оболочки, включая слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, и кожа.

3. Заживление ран.

Сообщалось, что у животных, у которых Υ2 рецептор селективно выделяется (элиминирует) за счёт делеции его гена, заживление ран замедляется, и что ухудшается ассоциированная с этим неоваскуляризация (ЕкМгапй е! а1. 2003, ΡNА8, 100: 6033-38). Поэтому селективные Υ2 агонисты по настоящему изобретению применимы для улучшения заживления ран. Для этого пептиды можно вводить различными способами, включая парентеральное введение. Однако предпочтительным способом применения являет

- 24 011860 ся топическое введение, например в виде раствора, дисперсии, порошков, плиток, крема, мази, лосьона, геля, гидрогеля, трансдермальной системы доставки, включая пластыри, пэтчи и т.д. Для топического применения их можно использовать в обычной форме (как таковые). Однако в предпочтительном варианте изобретения пептиды модифицируют с помощью одного или более ОАО-связывающих мотивов по данному описанию для того, чтобы гарантировать продолжительное местное действие пептида с помощью связывания с ОАО в ткани.

4. Воспалительное заболевание кишечника.

Ранее было описано применение ΡΥΥ для предупреждения и/или лечения воспалительного заболевания кишечника; см. Международную заявку 03/105763 на имя Ату1т Рйагтасеибса1к, 1пс. Следовательно, агонисты по данному изобретению являются также эффективными для лечения или предупреждения воспалительного заболевания кишечника. Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению агонистов по данному описанию для такой медицинской цели. В представляющем интерес варианте изобретения пептиды содержат один или более ОАО-связывающих мотивов, ср. выше.

5. Остеопороз.

В нескольких работах, посвящённых изучению животных, нокаутированных по Υ2, показано очень большое влияние на образование трабекулярной кости (например, 8ашкЬшу е! а1. Μο1. Се11. Βίο1. 2003, 23: 5225-33). Υ2 рецептор также участвует в образовании кости, ср. Ва1бοск е! а1. 2002, 1. С1ш. 1пуек!. 109: 915-21. Поэтому Υ2-селективные агонисты по настоящему изобретению применимы для лечения остеопороза. Полагают, что особенно применимы для лечения остеопороза или родственных заболеваний пептиды, содержащие один или более ОАО-связывающих мотивов.

В подгруппе популяции Υ2 агонисты могут не оказывать предполагаемого действия вследствие генетических изменений, таких как полиморфизм в гене Υ2 рецептора. Утрата функциональных мутаций в этих рецепторах связана, по-видимому, с ожирением. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения осуществляют анализ Υ2 рецепторного гена субъекта, которого нужно лечить, чтобы проверить эти гены на полиморфизм/мутации и идентифицировать такой полиморфизм. На основании такого анализа можно проводить оптимальное лечение субъектов. Например, только субъекты с нормальным генотипом или с полиморфизмом, который не влияет на функцию Υ2 агонистов, можно лечить с применением таких агонистов. Другая возможность - повысить дозу Υ2 агониста, вводимую субъектам, экспрессирующим ослабленный рецептор, чтобы гарантировать оптимальное действие лекарства. В случае, когда ожирение субъекта вызвано недостаточностью функции Υ2 рецептора, можно утверждать, что лечение, например, большими дозами Υ2 агониста является формой заместительной терапии при условии, что, по меньшей мере, некоторая релевантная рецепторная функция всё ещё сохраняется, например, у гетерозиготных пациентов.

В одном варианте изобретения перед началом постоянного лечения Υ2 агонистом, чтобы быть уверенными, что эти соединения оказывают предполагаемое действие на субъекта, подлежащего лечению, можно провести срочный тест. Таким способом гарантируется, что лечение агонистами Υ2 проходят только чувствительные к этим соединениям субъекты.

Применение Υ2 селективных агонистов в комбинации с Υ4 агонистами и другими агентами

Рассматриваемая одновременно Международная патентная заявка, поданная в один день с заявкой на данное изобретение, раскрывает Υ4-селективные агонисты и их применение для лечения. В приложении к описаниию вкратце суммируются структурные признаки, требующиеся для Υ2 агониста по заявке на изобртение, и даются конкретные примеры Υ4 селективных агонистов. Как коротко обсуждается ниже, Υ2-агонисты по данному изобретению можно применять при лечении вместе с Υ4-специфическими агонистами.

Применяя комбинированное лечение двумя соединениями, соответственно селективным Υ2 агонистом и селективным Υ4 агонистом, можно свободно, т.е. независимо друг от друга, изменять дозу каждого из этих соединений, чтобы достичь максимального целебного эффекта. То есть, например, возможно применение субмаксимальной дозы селективного к Υ2 соединения для того, чтобы, возможно, вызвать лишь минимальные побочные эффекты, например, за счёт Υ2 рецепторов периферической сердечнососудистой системы, или тошноту, при одновременном введении максимальной или даже сверхмаксимальной дозы агониста Υ4 для того, чтобы обеспечить очень сильное действие у всех субъектов за счёт Υ4 рецепторного пути, который имеет более широкое терапевтическое окно. Сопутствующая частичная - стимуляция Υ2-рецепторного пути гарантирует более мощное воздействие на регуляцию аппетита и расход энергии, чем стимуляция одного Υ4 агониста. Например, Υ2 агонист может оказывать более явно выраженное действие на опорожнение желудка, чем Υ4 агонист. А сопутствующая стимуляция Υ4 рецептора позволяет применять более низкую и более безопасную дозу Υ2 агониста, которая была бы неэффективна при индивидуальном применении.

В тех случаях, когда для достижения комбинированной стимуляции Υ4 и Υ2 рецепторов используют два индивидуальных соединения, схему введения доз можно корректировать, как указано выше. Соответственно, в конкретных вариантах изобретения комбинацию Υ2 агониста и Υ4 агониста вводят таким образом, чтобы соотношение дозы агониста Υ2 и агониста Υ4 составляло примерно от 0,1:10 до примерно 10:0,1, а именно, от примерно от 0,1:1 до примерно 1:0,1, примерно от 0,2:1 до примерно 1:0,2,

- 25 011860 примерно от 0,3:1 до примерно 1:0,3, примерно от 0,4:1 до примерно 1:0,4, примерно от 0,5:1 до примерно 1:0,5, например 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 и т.д. Как упоминалось выше, представляет интерес комбинация Υ2 и Υ4 агониста, где такое соотношение между количествами Υ2 и Υ4, при котором максимальный эффект достигается при минимальных (если вообще таковые имеют место) побочных эффектах. Соответственно, предусматривается, чтобы концентрация Υ2 агониста в такой комбинации была меньше, чем концентрация Υ4 агониста. Упоминавшиеся выше концентрации и соотношения относятся к молярным концентрациям и к молярным соотношениям соответственно.

Таким образом, в предпочтительном варианте изобретения для лечения ожирения селективный Υ2 агонист вводят в сочетании с селективным Υ4 агонистом.

Соединения можно вводить одинаковым способом или различными способами. Способ введения, в принципе, может быть любым упомянутым в данном описании способом, причём парентеральный и топический способы представляют наибольший интерес. Соответственно, в одном варианте изобретения оба агониста, агонисты Υ2 и Υ4, вводят, например, топическим способом, таким как назальный или подкожная инъекция, а в другом варианте изобретения агонист Υ2 вводят назально, а агонист Υ4 вводят подкожной инъекцией или наоборот. Другие подходящие комбинации или способы применения входят в объём настоящего изобретения.

Агонисты Υ2 и Υ4, применяемые в комбинированном лечении, могут находиться в одной и той же фармацевтической композиции (например, в виде смеси в фармацевтической композиции) или они могут находиться в раздельных фармацевтических композициях для одновременного, последовательного или индивидуализированного применения с конкретными инструкциями по применению. Соответственно, такие композиции могут быть представлены в виде набора, содержащего Υ2 агонист и Υ4 агонист в одной и той же упаковке или в различных отдельных упаковках и, необязательно, с инструкциями по применению.

Селективные к Υ2 агонисты по изобретению можно комбинировать при лечении ожирения, диабета и родственных заболеваний с различными другими лекарствами, имеющими целью аппетит и расход энергии, эти лекарства включают, но без ограничения, лекарства, такие как ингибиторы липаз ЖКТ, ингибиторы обратного захвата нейромедиаторов, антагонисты каннабиноидных рецепторов и обратные агонисты, а также другие типы нейромедиатора, включая, но без ограничения, 5НТ рецепторы, и/или гормона, включая, но без ограничения, агонисты или антагонисты ΟΌΡ-1, МС4, МС3-рецепторов. Так как селективные Υ2 агонисты направлены на гомеостатический регуляторный механизм для связи между ЖКТ и ЦНС, т. е. на Υ2 рецепторы обычно нацелен опосредующий насыщение кишечный гормон ΡΥΥ, особенно полезно совмещать лечение комбинированными Υ2 селективными агонистами с лечением лекарством, направленным на важнейший гедонический механизм регуляции аппетита и расхода энергии, таким как СВ1 рецепторы, например, являющиеся частью системы поощрения.

Поэтому применение Υ2 агонистов при лечении ожирения и родственных заболеваний в комбинации с СВ1 антагонистом является предпочтительным вариантом настоящего изобретения.

Дозировки

Терапевтически эффективное количество Υ2 рецепторного агониста по данному изобретению зависит от конкретного применяемого агониста, возраста, веса и состояния субъекта, проходящего лечение, тяжести и типа состояния или заболевания, которое нужно лечить, способа введения и эффективности применяемой композиции.

Например, терапевтически эффективное количество Υ2 рецепторного агониста может меняться примерно от 0,1 мкг на 1 кг массы тела примерно до 1 г на 1 кг массы тела, например, от 1 до примерно 5 мкг на 1 кг массы тела или от около 5 мкг до около 1 мг на 1 кг массы тела. В другом варианте изобретения рецепторный агонист вводят субъекту в количестве 0,5-135 пмоль на 1 кг массы тела или 72 пмоль на 1 кг массы тела.

В одном конкретном неограничивающем примере примерно 5-50 нмоль вводят в виде подкожной инъекции, например, около 2-20 нмоль или около 1,0 нмоль. Точную дозу специалист в данной области техники легко определит исходя из активности конкретного применяемого соединения (такого как агонист рецептора), возраста, веса, пола и физиологического состояния субъекта. Доза агониста может быть молярным эквивалентом терапевтически эффективной дозы ΡΥΥ3-36.

Это количество можно разделить на одну или несколько доз для применения ежедневно, через день, еженедельно, через каждые две недели, ежемесячно или с любой другой подходящей частотой. Обычно приём осуществляют один или два раза в день.

Способы применения

Агонист Υ2 рецептора, а также косметические или фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить любым способом, включая энтеральный (например, оральное введение) или парентеральный способ. В конкретном варианте изобретения предпочтительным является парентеральный способ, включающий внутривенную, внутрисуставную, интраперитонеальную (внутрибрюшинную), подкожную, внутримышечную, надчревную инъекцию и инфузию, а также сублингвальный (подъязычный), трансдермальный (чрескожный), топический, трансмукозный, включая назальный, способ или ингаляция, например лёгочная ингаляция. В конкретных вариантах изобретения предпочтительным являет

- 26 011860 ся подкожный и/или назальный способ применения.

Агонисты рецепторов можно вводить, как таковые, в подходящем носителе или их можно вводить в виде подходящей фармацевтической или косметической композиции. Такие композиции также входят в объём настоящего изобретения. Ниже описаны подходящие фармацевтические композиции. Специалист в данной области техники знает, что такая композиция может быть также пригодна для косметического применения, или он знает, как скорректировать композицию, чтобы сделать её косметической, используя подходящие косметически приемлемые эксципиенты.

Фармацевтические композиции

Агонисты рецепторов (рецепторные агонисты, также называемые соединения) по данному изобретению для применения в медицине или косметике обычно бывают в виде фармацевтической композиции, содержащей конкретное соединение или его производное совместно с одним или более физиологически или фармацевтически приемлемым эксципиентом.

Соединения можно вводить животному, включая млекопитающих, таких как, например, человек, любым подходящим способом введения, например, таким как оральный, трансбуккальный, назальный, окулярный, лёгочный, топический, трансдермальный, вагинальный, ректальный, парентеральный (включая, наряду с другими, подкожный, внутримышечный и внутривенный, ср. выше) способ, в дозе, которая эффективна для индивидуальных целей. Специалист в данной области техники знает, как выбрать подходящий способ введения. Как указывалось выше, предпочтительным является парентеральное введение. В конкретном варианте изобретения рецепторные агонисты вводят подкожно и/или назально. Общеизвестно в уровне техники, что подкожные инъекции может легко сделать себе сам пациент.

Композицию, пригодную для конкретного способа применения, индивидуально для каждого пациента легко определит практикующий врач. Различные фармацевтически приемлемые носители и их состав описаны в обычных монографиях о препаратах, например в Кешшдои'к РЬагшасеи11са1 8с1епсек Ьу Е.^. Майш.

Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по изобретению, может быть в виде твёрдой, полутвёрдой или жидкой композиции. Для парентерального применения композиция обычно находится в жидком виде, или в полутвёрдом, или твёрдом виде для имплантации.

Жидкие композиции, которые представляют собой стерильные растворы или дисперсии, могут применяться, например, для внутривенной, внутримышечной, внутриоболочечной, эпидуральной, интраперитонеальной или подкожной инъекции или инфузии. Соединения можно также приготовить в виде стерильной твёрдой композиции, которую можно растворять или диспергировать до или во время введения, например, в стерильной воде, физиологическом растворе или другой подходящей стерильной среде для инъекций.

Композиция в жидком виде может представлять собой раствор, эмульсию, включая наноэмульсии, суспензию, дисперсию, липосомную композицию, смесь, спрей или аэрозоль (два последних типа являются особенно релевантными для назального применения).

Подходящие среды для растворов или дисперсий обычно бывают на водной основе или на основе фармацевтически приемлемых растворителей, например, таких как масло (например, кунжутное или арахисовое масло) или органический растворитель, например, такой как пропанол или изопропанол. Кроме того, композиция по изобретению может содержать дополнительные фармацевтически приемлемые эксципиенты, например, такие как агенты, корректирующие рН, осмотически активные агенты, например, для того, чтобы довести изотоничность композиции до физиологически приемлемых уровней, агенты коррекции вязкости, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты и т. д. Предпочтительной средой является вода.

Композиции для назального применения могут также содержать подходящие нераздражающие носители, например, такие как полиэтиленгликоли, гликофурол, и т.д., а также энхансеры всасывания, хорошо известные специалисту в данной области техники (например, со ссылкой на ВетшдЮп'к РЬагшасеи!1са1 8с1епсе).

Для парентерального применения в одном варианте изобретения агонист рецептора можно вообще готовить смешением агониста рецептора заданной степени чистоты в виде стандартной лекарственной формы для инъекций (в виде раствора, суспензии или эмульсии) с фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, т.е. таким, который не является токсическим для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и который совместим с другими ингредиентами композиции.

Обычно препараты готовят с помощью однородного и тщательного смешения (контактирования) рецепторного агониста с жидкими носителями, или с тонкоизмельчёнными твёрдыми носителями, или с теми и другими. Затем, при необходимости, продукту придают форму нужного препарата. Предпочтительно носитель представляет собой парентеральный носитель, более предпочтительно раствор, изотонический с кровью реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Также применимы по данному описанию неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат, а также липосомы. Благодаря амфифильной природе пептидов по данному описанию подходящие формы также включают мицеллярные препараты, липосомы и другие типы препаратов, содержащие один или более соответствующих липидов, таких, например, как

- 27 011860 фосфолипиды и т.п.

Предпочтительно они суспендируются в водном носителе, например в изотоническом буферном растворе при рН около 3,0-8,0, предпочтительно при рН около 3,5-7,4, 3,5-6,0 или около 3,5-5,0. Применимые буферные вещества включают ацетатный, цитратный, фосфатный, боратный, карбонатный буферы, например, такие как цитрат натрия-лимонная кислота или фосфат натрия-фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота.

Композиции также могут быть предназначены для контролируемой или пролонгированной доставки рецепторного агониста после введения, чтобы создать схему с менее частым введением. Обычно подходящей считается схема приёма лекарственного вещества 1-2 раза в сутки, но в объём настоящего изобретения также входят другие схемы применения, такие, например, как более частое и менее частое введение. Для осуществления пролонгированной доставки рецепторного агониста можно применять подходящий носитель, включающий, например, липиды или масла, чтобы образовать депо в месте введения, из которого рецепторный агонист медленно высвобождается в систему кровообращения, или можно использовать имплантат. Подходящие с этой точки зрения композиции включают липосомы и биоразрушаемые частицы, в которые включён рецепторный агонист.

В таких случаях, когда нужны твёрдые композиции, эти композиции могут быть в виде таблеток, таких как обычные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, формованные таблетки или подъязычные таблетки, в виде пеллет, порошков, гранул, гранулятов, материала в виде макрочастиц, твёрдых дисперсий или твёрдых растворов.

Полутвёрдая форма композиции может представлять собой жевательную резинку, мазь, крем, линимент, пасту, гель или гидрогель.

Другие подходящие лекарственные формы фармацевтических композиций по изобретению могут представлять собой вагитории, суппозитории, пластыри, накладки (пэтчи), таблетки, капсулы, саше, пастилки, устройства и т. д.

Лекарственная форма может быть предназначена для неограниченного (свободного) или контролируемого высвобождения, например, за счёт того, что таблетки могут иметь соответствующие покрытия.

Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.

Содержание соединения по изобретению в фармацевтической композиции по изобретению составляет, например, около 0,1-100% вес./вес. фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции можно готовить любым способом, хорошо известным специалисту в области приготовления фармацевтических препаратов.

В фармацевтических композициях соединения обычно объединяются с фармацевтическим эксципиентом, т. е. терапевтически инертным веществом или носителем.

Носитель может иметь весьма разнообразные формы в зависимости от заданной лекарственной формы и способа применения.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут представлять собой, например, наполнители, связующие, вещества, способствующие расщеплению, разбавители, вещества, способствующие проглатыванию, растворители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, стабилизаторы, энхансеры, красители, вещества, придающие вкус и запах, агенты коррекции рН, замедлители, увлажняющие средства, поверхностно-активные агенты, консерванты, антиоксиданты и т. д. Подробности можно найти в фармацевтических справочниках, например, таких как РеттЦопЗ Ρ1ι;·ιηη;·ΐίχιιΙίο;·ι1 8с1епсе или Ρ1ι;·ιηη;·ΐίχιιΙίο;·ι1 Ехс1р1еп1 НапбЬоок.

В нижеприведённых примерах описано получение и активность некоторых конкретных агонистов по изобретению.

Синтезы Сокращения

Ртос: флуоренил- 9- метоксикарбонил

ДМФА (ЦМР) диметилформамид

РЪ£ 2,2,4,6,7- пентаметилдигидробензофуран- 5- сульфонил

Тг1 трифенилметил

Вос или 1Вос бутоксикарбонил

Эбе 1- (4,4- диметил- 2,6- диоксоциклогексилиден)этил

- 28 011860

нети	1Н- бензотриазолия 1- [#ис(диметиламино)метилен]- 5- хлор-,
	гексафторфосфат (1-),3- оксид
ТФК (ТРА)	трифторуксусная кислота
ΜΑΒϋΙ	матриксная лазерно- десорбционная масс- спектрометрия с
	ионизацией пробы
ΝΗ8	Ν- гидроксисукцинимид

Пептидные агонисты по данному изобретению можно синтезировать твердофазным пептидным синтезом, применяя либо автоматический синтезатор пептидов, либо обычный лабораторный синтез. Твёрдым носителем может являться, например, полимер хлортритила (С1) или полимер Ванга (^апд), каждый из которых можно легко приобрести. Активные группы этих полимеров легко реагируют с карбоксильной группой Ν-Ртос аминокислоты, при этом связывая её с полимером ковалентной связью. Связанный с полимером амин можно депротекционировать экспозицией с пиперидином. Затем вторую Ν-защищённую аминокислоту можно присоединить к элементу полимер-аминокислота. Эти стадии повторяют до тех пор, пока не получат нужную последовательность. По окончании синтеза связанный с полимером защищённый пептид можно депротекционировать и отщепить от смолы под действием трифторуксусной кислоты (ТФК, ТРА). Ниже даны примеры реагентов, облегчающих присоединение новых аминокислот к связанной с полимером аминокислотной цепи: тетраметилурония гексафторфосфат (НАТи), О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-Ц^№,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НВТи), О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-Ц^№,№-тетраметилурония гексафторборат (ТВТИ),

1Н-гидроксибензотриазол (НОВ1).

Также предпочтительнее бывает пептидный синтез в растворе, нежели твердофазный пептидный синтез.

Модификация боковых амино- и карбоксильных групп аминокислоты пептидной цепи, например, введением САС-связывающего или другого мотива, описанного выше, является простым способом селективной защиты и депротекции других реакционноспособных групп боковых цепей, не участвующих в реакции.

Пептиды по данному описанию получают твердофазным синтезом на полимере РАБ Ред-Р8 (амидная смола Аррйеб Вю8с1епсе, \Уагппд1оп. ик СЕ№13401) с применением реакций с защитной группы Ртос с 5х избытком реагента. Все реакции связывания осуществляют в присутствии НСТИ, растворитель ДМФА. Снятие Ртос проводят 20%-ным раствором пиперидина в ДМФА в течение 10-15 мин. Однако эти пептиды можно также синтезировать различными другими стандартными методами пептидного синтеза, такими как химические реакции с защитной группой 1ВОС и реакции в растворе вместо твердофазного синтеза, и т. д. Синтез иллюстрируется приведённым ниже описанием, но подобными методами можно получать другие пептиды по данному описанию.

Синтез [Суз2^уз13,В- Суз27]Р¥У и его аналогов

Ниже описаны синтез циклического Υ2 селективного пептида |Όγ82,Εγ813,Ό^γ827]ΡΥΥ (8ЕЦ Ш №: 39) и синтез аналогов либо с САС-связывающим мотивом, мотивом связывания с сывороточным белком, либо с фрагментом полиэтиленгликоля, присоединёнными по ипсилон-аминогруппе Буз13.

Как правило, защитной группой в боковой цепи является Ртос, за исключением

Аг§ = Ртос Агд(РЫ)- ОН

Азп, О1п = Ртос Азп(ТгХ)- ОН

ТБг, Зег, Аар, 61и, Тут = трет- бутил

Буз = Ртос Буз(ХВос)- ОН

А1а- Зег 22- 23 = Ртос А1а8ег псевдопролин

В случае [Су82,^у813,^-Су827]ΡΥΥ следующие специальные защитные группы используют для того, чтобы добиться селективного снятия защиты (селективной депротекции):

Туг 1 = ХВос Туг(ХВи)-ОН

Еуз 13 = Ртос Буз(ТгХ)- ОН

Суз27 = Ртос ОБуз(ТК)- ОН

Пептид синтезируют твердофазным синтезом на полимере РАБ Ред-Р8 (смола, которая при расщеплении образует биологически важную карбоксиаламидную (карбоксамидную) группу) с применением реакций с Ртос с 5-кратным молярным избытком реагента. Все реакции связывания осуществляют в присутствии НСТИ с ДМФА в качестве растворителя. Снятие Ртос после каждой стадии присоединения проводят 20%-ным раствором пиперидина в ДМФА в течение 10-15 мин. Присоединение проверяют после каждой стадии количественным анализом с нингидрином. В некоторых случаях можно применять

- 29 011860 двойное связывание (двойную конденсацию).

После синтеза полноразмерных пептидов защитную группу в ипсилон-аминогруппе Ьуз13 селективно снимают, обрабатывая 2% раствором гидразина в ДМФА в течение 15-20 мин, при этом пептид всё ещё остаётся связанным с полимером.

Затем смолу делят на различные партии для получения недериватизированного пептида, а также трёх пептидов, модифицированных с помощью различных мотивов.

1. [Суз2,^уз13,^-Суз27]ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ Ио: 39) - материнский пептид - отщепляют от полимера и депротекционируют обработкой смесью 95% трифторуксусной кислоты; 2,5% воды; 2,5% трипропилсилана в течение 2-3 ч.

Внутримолекулярный стабилизирующий дисульфидный мостик между и Суз2О-Суз27 образуется в процессе окисления на воздухе при растворении пептида с концентрацией <1 мг/мл в ацетате аммония, рН 8,5-9,0 и перемешивании в течение 24-48 ч до тех пор, пока не исчезнут свободные тиолы, определяемые реактивом Эллмана.

Пептид очищают обращённо-фазовой ВЭЖХ: колонка Vуйас 300 А, 250x10 мм, элюент (буфер А=0,05% ТФК в воде; буфер В=60% МеС№ 40% воды: 0,05% ТФК) в градиенте 30-80% буфера В в течение 20 мин, 2 мл/мин. Определяют ΟΌ при 215 нм и элюент, содержащий конкретный пептид, собирают и лиофилизируют.

Структуру пептида подтверждают масс-спектрометрией, аминокислотным анализом и в ряде случаев также анализом аминокислотной последовательности.

2. [Суз2,N-(8-(8-гамма-Глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)-^уз13,^-Суз27]ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ Но: 28).

Для того чтобы присоединить мотив связывания сывороточного альбумина, 8-(8-гамма-глутамоиламинооктаноиламино)октаноильную группу связывают со свободной ипсилонаминогруппой остатка Ьуз 13 после удаления защитной Эйе группы, пептидным синтезом, с помощью защищённой аминооктановой кислоты, а затем дважды с помощью защищённой гамма-глутаминовой кислоты, в то время как пептид всё ещё остаётся связанным со смолой.

Пептид, модифицированный с применением мотива, депротекционируют, циклизуют и очищают, как описано выше для материнского пептида.

3. Флуоресцеин-[Суз2,N-{(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)з}-^уз13,^-Суз27]ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ Ко: 30).

Для того чтобы присоединить САС-связывающий мотив, мотив строят постадийно пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Ьуз13, после удаления Эйе группы, на пептиде [Суз2,^уз13,^-Суз27]ΡΥΥ, всё ещё связанном с полимером, используя стандартный метод с Етос, как в целом описано выше: САС-связывающая последовательность, присоединённая таким образом, представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1аАгд-А1а. Флуоресцеиновую метку присоединяют для ш М11го и ш νίνο для аналитических целей в виде его 5,6 изомера - ΝΗ8 эфира, 10х избыток в течение 72 ч - к Ν-концу окончательной САС-связывающей последовательности.

Пептид, модифицированный с помощью САС-связывающего мотива, отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают, как описано выше для материнского пептида.

4. [Суз2,N-{N'-(21-Амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}-гамма-глутамоил-^уз13-^Суз27]ΡΥΥ (81 Б) ΙΌ Νο: 37).

Для того чтобы присоединить фрагмент полиэтиленгликоля к Υ2 селективному пептиду, защищённую 21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозановую кислоту связывают пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Ьуз13, после удаления Эйе группы, на пептиде [Суз2,Ьуз13,ПСуз27]ΡΥΥ, всё ещё связанном с полимером, а затем присоединяют защищённую гамма-глутаминовую кислоту.

ПЭГилированный пептид отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают, как описано выше для материнского пептида.

Используя вышеописанные методы, синтезируют в качестве примеров следующие агонисты по изобретению:

- 30 011860

ΡΥΥ2-36 (КЕО ГО Νο: 4)

ΝΡΥ2-36 (5Ε<2 ГО Νο: 5) [ϋ-Α1:ιΙ]ΡΥΥ('8ΕΟ Ш Νο:6) [Ο-Α1<ί2 |ΡΥΥ (5ЕС) ГО Νο: 7) [ΑΕ128]ΡΥΥ (8Ε0 ГО Νο: 8) [Α1η30]ΡΥΥ (8Ε0 ГО Νο: 9) [А1а31]РУУ (5Ε0 ΙΟ Νο: 10)

Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- ΡΥΥ25- 36 (8Е0 ΙΟ Νο: 11) [Ьу«4,О1п34]РР (5Е0 ГО Νο: 12) [СузЗ.О- Суз27]РУУ (8ЕО ГО Νο: 13) [Суз2.П- Суз27]№У 1.8ЕС1 ГО Νο: 14) [Суз2Д1еЗ,О- Суз27,Уа131]ЦРУ (5Е<2 ГО Νο: 15) [Суз2, Аос5- 24,0- Суз27]РУУ (КЕО ГО Νο: 16) [Суз2, Аое5- 24ТО- Ογί27]ΝΡΥ (Жр ГО Νο: 17) [Сув2,ПеЗ,Аос5- 24,0- Суз27,Уа131]ЫРУ (ЗЕО ГО Νο: 18) [Ьуз28,С1и32]РУУ25- 36 (8Е0 ГО Νο: 19) [О1и28,Ьуз32]РУУ25- 36 (8Е0 ГО Νο: 20)

А1а- Аг§- Аг£- Аг§- А1а- А1а- Агд- А1а- А1а- Аг§- Агу- Аге- А1а- А1а- Агу- А1аА1а- Аг§- Агё- Аг§- А1а- А1а- Ат§- А1а- ΡΥΥ25- 36 (8Εζ> ГО Νο: 21) [О- А1а2]РУУ2-36 (8Е0 ГО Νο: 22) [Ьуз4,Ьеи17,С11п34]РР (ЖО ГО Νο: 23) [Ьуз4,Ьеи17,Ьеи30,С1п34]РР (ЖО ГО Νο: 24) [Ьуз4,К1е17,М1е30,О1п34]РР (ЖО ГО Νο: 25) [Ν- (Ν’- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- Ьуз4,Ме17,1Ч1е30,О1п34]РР (8Е0 ΙΟ Νο: 26)

Ν- .тцетпл[Суз2.О- Суз27|Р¥У2- 36 (8Е0 ГО Νο: 27) [Суз2, Ν-(Ν’- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьуз13Х>- Суз27|РУУ (8Е() ГО Νο: 29) (Су 32.Ν- РЕ05000- Ьуз 13,0- Суз27]РУУ (8Е0 ГО Νο: 31)

1Суз2.1кЗ.О- Суз27,Ьеи28,Уа131 ]ΝΡΥ (8Е0 ГО Νο: 32) [Су82,11еЗ,1Ч1е17,О- Суз27,К1е28.Уа131]Л1'У (ЖО ΠΟΝο: 33)

Ν- ацетил-дес- Туг1[Суз2, Аос5- 24,0- Суз27]РУУ ('ЖО ГО Νο: 34)

Ν- (Ν'- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- [Суз2. О- Су$27]РУТ (ЖО ГО Νο: 35)

Химический анализ пептидов

Для иллюстрация применяемых способов и полученных результатов ниже представлены аналитические данные некоторых пептидов по изобретению, синтезированных вышеуказанными методами.

Данные

Пептид 8Ер П)	Молекуляр ная ι ι формула I	Теоретическая величина πτ/ζ	Полученная масса Μ/ζ	Кг мин	Чис- тота	Метод ВЭЖХ
6	С192 Н293 N55 057	4283.8	857.8 (М+5Н]	'858.3 ΪΜ+5Η]	15.4	'95.2	'А
13	С1ее Н2В7 N55 056 52	4253. В		4252.4	15.5	98.3	^с
36	С190 Н294 N56 056 32	4298		4297.0	12.5	99.9	А
30	С319Н509 N116 037 32	7332		7369.6	11.8	60.0	А
гв	С211 Н331 N59 061 32	4707		4712.7	12.6	90.0	А
37	С209 Н328 №8 066 82	47Θ1		4747.1	12.3	85.0
15	С97 Н158 N32 )22 32	2204.7		2204.5	17.1	97. е	С
11 \| С10ВН1ВВ Ν2Β 023 ί	2386.9	5977 [М+4Н)	598.1 [М+4Н]	20.9	91.9	В

- 31 011860

Аналитическая ВЭЖХ, метод А.

Колонка = Ууйас С18 Рер(Ие-Рго1е:п (для пептидов- белков), 250 х 4.6 мм

Буфер А = 0.05% ТФК в воде

Буфер В = 0.05% ТФК в 100% МеСЧ

Градиент = 0% В - 60% В за 20 мин

Скорость потока = 1.00 мл/мин

Длина волны = 215 нм

Масс-спектроскопия=МАТП1-ТОЕ с гентизиновой или α-цианогидрогсикоричной кислотой в каче стве матрицы

Аналитическая ВЭЖХ, метод В. Колонка

Буфер А

Буфер В

Градиент

Скорость потока

Длина волны = НурегзП Οϋ8- 2, 250 х 4.6 мм = 0.1% ТФК в 100% МеСЧ = 0.1% ТФК в 100% воде = 24% А - 35% А за 25 мин = 1.00 мл/мин = 220 нм

Масс-спектроскопия - Ε8Ι [скорость газа в распылителе: 1,5 л/мин; СОЬ - 20,0 В; СОЬ температура: 250°С; Температура блока: 200°С; напряжение (смещение) в датчике: 4.5 кВ; детектор: 1,5 кВ; Т. поток: 0,2 мл/мин; В конц.: 50% Н20/50% САК]

Аналитическая ВЭЖХ, метод С.

Колонка = Уубас С18 218ТР54, 250 х 4.6 мм

Буфер А Буфер В	= 20 мл МеСМ и 2 мл ТФК в воде (общий объём 2000 мл) = 2 мл ТФК в 100% воде (общий объём 2000 мл)
Градиент Скорость потока	= 25% В - 75% В за 27 мин = 1.00 мл/мин

Длина волны = 215 нм

Вводимый объём = 10 мкл

Биологические анализы и результаты

I. 1п νί!το анализы для определения аффинности и активности пептидов.

Анализ аффинности к человеческому Υ2 рецептору

Аффинность тестируемых соединений к человеческому Υ2 рецептору определяют анализом конкурентного связывания, используя 125Ι-ΓΥΥ связывание в клетках СО8-7, транзиторно трансфецированных человеческим Υ2 рецептором стандартным методом трансфекции с фосфатом кальция.

Трансфецированные СО8-7 клетки переносят в культуральные планшеты через день после трансфекции при плотности 40х10³ клеток на лунку, добиваясь 5-8% связывания радиоактивного лиганда. Через 2 дня после трансфекции проводят эксперименты по конкурентному связыванию в течение 3 ч при 4°С, используя 25 пМ 125Ι-₽ΥΥ (АтегкЬат, ЬйИе СЬа11оп!, иК). Анализы связывания проводят в 0,5 мл 50 мМ буфера Нерек, рН 7,4, дополненного 1 мМ СаС1₂, 5 мМ МдС1₂ и 0,1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина и 100 мкг/мл бацитрацина. Неспецифическое связывание определяют как связывание в присутствии 1 мкМ немеченого РУΥ. Клетки дважды отмывают в 0,5 мл охлаждённого льдом буфера и добавляют 0,5-1 мл буфера для лизиса (8 М мочевина, 2% ΝΈ40 в 3 М уксусной кислоте) и гаммасчётчиком считают связанную радиоактивность. Определения делают в двойном повторе. В этих условиях достигают связывания с радиоактивным лигандом в стационарном состоянии (равновесного связывания). Величины ЕС₅₀ рассчитывают, используя программу работы со стандартными фармакологическими данными, Рпкт 3.0 (дгарЬРай 8ой^аге, 8ап Эгедо, И8А).

Анализ аффинности к человеческому Υ4 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ4 клетки СО8-7, в конкурентном анализе используют 1251-РР и для определения неспецифического связывания используют РР.

Анализ аффинности к человеческому Υ1 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ1 клетки СО8-7 и переносят в культуральные планшеты при плотности 1,5х10⁶ клеток на лунку. В конкурентном анализе используют 125I-NРΥ и для определения неспецифического связывания используют NРΥ.

- 32 011860

Анализ аффинности к человеческому Υ5 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ5 клетки СО8-7 и переносят в культуральные планшеты при плотности 5х10⁵ клеток на лунку. В конкурентном анализе используют 125ΐ-ΝΡΥ и для определения неспецифического связывания используют ΝΡΥ.

Результаты тестирования ΝΡΥ, ΡΥΥ, ΡΥΥ3-36, ΡΡ и некоторых агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах аффинности даны в табл. 1.

Таблица 1

Агонист		Υ2		Υ1			Υ4		Υ5
	1С50 нМ	8ЕМ	I	1С50 нМ	8ЕМ	¹	1С50 нМ	8ЕМ	н	1С50 нМ	8ЕМ		и
ΝΡΥ	0.30	0.07	4	2.3	0.3	4	26.3	5.4		4	0.43	0.05		4
ΡΥΥ	0.22	0.02	2	16	1	2	29.9	8.0		2	1.2	0		2
ΡΥΥ(3-36)	0.20	0.03	10	>1000		1 2	343	42		4	22	5		2
РР	>1000		4	>1000		1	0.49	0.04		8	76			1

ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 5	0.39	0.09	3			0	96	21		3				0
ЗЕО Ю ΝΟ: 16	0.87	0.18	3	>1000		1	267	60		3	>1000			2
ЗЕО ГО ΝΟ: 13	0.79	0.18	3	>1000		2	657	29		3	116	50		2
ЗЕО Ю ΝΟ: 36	0.60		1	>1000		1	300			1	36			1
ЗЕО Ю ΝΟ: 28	0.90	0.32	2	>1000		2	324	145		2	69	15		2
ЗЕО ГО N0: 37	0-72	0.16	2	>1000		2	574	74		2	115	32		2
ЗЕО ГО N0: 30	0.21	0.01	2	>1000		2	201	51		2	12	у		2
ЗЕО ГО N0: 7	0.93		1	483		1	31			1	8.1			1
ЗЕО 10 N0:11	4.1		1	520		1	213			1	429			1
ЗЕО ГО N0: 12	0.21	0.06	2	>1000		2	6.0			1	0.87	0.13		2

Анализ активности к человеческому Υ2 рецептору

Активность тестируемых соединений к человеческому Υ2 рецептору определяют в экспериментах доза-эффект в клетках СО8-7, транзиторно трансфецированных человеческим Υ2 рецептором, а также смешанным С белком, 0ςί5, который гарантирует, что Υ2 рецептор связывается через Сс.| путь, ведущий к повышению метаболизма инозитолфосфатов (инозитфосфатов).

Метаболизм фосфатидилинозитола.

Через 1 день после трансфекции клетки СО8-7 инкубируют в течение 24 ч, используя 5 мкКи [3Н]-миоинозитола (Атегкйат, РТ6-271) в 1 мл среды, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 0,01 мг/мл гентамицина на лунку. Клетки дважды отмывают в буфере, 20 мМ ΗΕΡΕ8, рН 7,4, дополненном 140 мМ №С1, 5 мМ КС1, 1 мМ Мд8О₄, 1 мМ СаС1₂, 10 мМ глюкозы, 0,05% (вес./об.) бычьей сыворотки; и инкубируют в 0,5 мл буфера, дополненного 10 мМ ЫС1, при 37°С в течение 30 мин. После стимуляции различными концентрациями пептида в течение 45 мин при 37°С клетки экстрагируют 10% ледяной (охлаждённой льдом) перхлорной кислотой с последующей инкубацией на льду в течение 30 мин. Полученные супернатанты нейтрализуют КОН в буфере ΗΕΡΕ8 и полученный [3Н]-инозитолфосфат очищают на анионообменной смоле Вю-Вай АС 1-Х8 и считают бета-счётчиком. Определения делают в двойном повторе. Величины ЕС₅₀ рассчитывают, используя программу для работы со стандартными фармакологическими данными, Гикт 3.0 (дгарЬГай 8ойуаге, 8аи П1едо, И8А).

Анализ активности к человеческому Υ4 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ4 клетки СО8-7.

Анализ активности к человеческому Υ1 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ1 клетки СО8-7.

Анализ активности к человеческому Υ5 рецептору

Используется такой же протокол, как для анализа активности к Υ2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Υ5 клетки СО8-7.

Результаты тестирования ΝΡΥ, ΡΥΥ, ΡΥΥ3-36, ΡΡ и четырёх агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах активности даны в табл. 2.

- 33 011860

Таблица 2

Агонист	Υ2	Υ1	Υ4	Υ5
	ЕС50 нМ	5ЕМ	н	ЕС50 нМ	5Е М	и	ЕС50 нМ	5ЕМ	н	ЕС50 I 8ЕМ нМ \|	н
ΝΡΥ	1.5	1.5	11	1.7	0.4	11	112	10	6	8.9	2.2	1 1
ΡΥΥ	0.23	0.06	8	0.6	1.11	5	36	6	5	8.5	1.1	ь
ΡΥΥ(3-36)	0.36	0.07	16	74	5	7	>1000		7	82	V	*>
РР	>1000		В	ВЗ	13	5	0.64	0.07	и	30	/	*>

ΝΡΥ(2-36)	0.42	0.01	2				>1000		1
ЗЕО Ю ΝΟ: 16	3.7	12	5	>1000		1	>1000		4	>1000		2
ЗЕО Ю ΝΟ: 13	0.46	0.16	5	>1000		1	>1000		5	19В	44	4
ЗЕО Ю ΝΟ: 36	1.9	1.6	2	>1000		2	>1000		2	888	*>иь	2
ЗЕО Ю МО: 28	0.68	0.16	3	>1000		3	>1000		3	124	12	3
ЗЕО Ю ΝΟ: 37	0.97	0.10	3	>1000		3	>1000		3	376	93	3
ЗЕО Ю ΝΟ: 30	0.37	0.02	3	>1000		3	>1000		3	477	У8	3
ЗЕО Ю ΝΟ: 7	1.4	0.9	3	127	49	3	.591	312 ¹	3	105	47	3
ЗЕО ΙΟ N0:11	213	15	2	>1000		1	>1000		1	>1000		1
ЗЕО Ю ΝΟ: 12	0.17	0-01	4	38	10	5	64	6	4	3.8	1.0	ь

II. 1п νΐΐΐΌ анализа для определения устойчивости белков.

Важным показателем для многих пептидов по изобретению является устойчивость белков, в особенности устойчивость, например, к расщеплению ферментами, так как эти пептиды создаются так, чтобы иметь повышенную устойчивость по сравнению, например, с РΥΥ3-36 или даже повышенную устойчивость по сравнению с полноразмерными РΥΥ и РР.

Устойчивость РР-складки определяют как устойчивость пептидов к расщеплению эндопептидазами, которые расщепляют, например, в области петли, которая является относительно гибкой (как описано в О'Наге, М. & ЗсйетаЛ/, Τ/Ψ. 1990. 1п Оедгабайоп о£ ВюасШ'е 8иЬк!апсек: Рйукю1оду апб РаШорйукБ о1оду. I. Неппккеп, еб. СВС Ргекк, Воса Ва!оп, РЬ). В качестве модельного фермента используют эндопротеиназу Акр-Ν (Р1егсе). Этот фермент расщепляет на Ν-концевой стороне остатков Акр, например между остатками 9 и 10 (Акр) в РР. Пептиды инкубируют с эффективной дозой эндопептидазы Акр-Ν, как указано производителем, в 0,01 М Тпк/НС1 буфере, рН 7,5 при комнатной температуре и образцы извлекают через различные промежутки времени в течение 24 ч. Образцы анализируют методом ВЭЖХ и затем проводят последовательную деградацию (отщепление) во времени. Пептиды сравнивают по стабильности с РΥΥ, РΥΥ3-36 и РР.

Устойчивость к аминопептидазам определяют, как описано выше для эндопептидаз, но вместо них используют аминопептидазу N и дипептидилпептидазу IV. Некоторые из пептидов специально предназначены для того, чтобы быть устойчивыми к этим аминопептидазам, например РΥΥ2-36, ацилированные по Ν-концу пептидные производные и пептидные дериваты, алкилированные фрагментом, связывающим альбумин, на Ν-конце. Пептиды сравнивают по стабильности (устойчивости) с РΥΥ, РΥΥ3-36 и РР.

III. 1п νίΙΐΌ анализ для определения связывания с гликозаминогликанами (ОАО8).

Способность тестируемых соединений связываться с ОАО8 проверяют ш νίΙΐΌ анализом с применением иммобилизованного гепарина, например, либо применяют колонку Н1Тгар с гепарин-сефарозой (Атегкйат РйагтаОа Вю1есй, ИрркА1а, 8^ебеп), либо колонку с гепарином для ВЭЖХ, которую элюируют 50 мин в линейном градиенте 0-0,5 М №1С1 в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,3), содержащем 2 мМ ΌΤΤ и 1 мМ МдЕЭТА при скорости потока 1 мл/мин. Для регенерации колонку промывают 1 М №С1 в буфере А в течение 51-55 мин. Для предварительных аналитических целей можно использовать ступенчатый градиент №С1.

IV. Ш νί\Ό исследование действия пептидов на аппетит, потребление пищи и массу тела.

Действие селективных к Υ2, по сравнению с Υ1 и Υ4, агонистов на скорое потребление пищи у мышей.

Берут мышей линии ббу весом 34-37 г в возрасте 8-9 недель (1арап 8ЬС, 8Ы7ииока, 1арап). Мышей индивидуально помещают в регулируемую среду (22°С, влажность 55%) с 12-часовым световым циклом день-ночь с включением света в 7 ч утра. Пищу и воду дают неограниченно, за исключением времени непосредственно перед экспериментами (см. ниже). Мыши привыкают к подкожным инъекциям в течение недели перед началом экспериментов. Мышей в экспериментах используют по одному разу. Непосредственно перед применением пептиды разводят в физиологическом солевом растворе и вводят в виде подкожной инъекции в объёме 100 мкл. Результаты представлены как среднее +/-8Е. Для оценки разницы между группами применяют дисперсионный анализ, а затем тест Бонферрони.

Мышей отлучают от пищи, но оставляют свободный доступ к воде за 16 ч до данного теста и эксперименты начинают в 10 ч утра на следующий день. Используют стандартную диету (СЬЕА 1арап, Шс., Токуо, 1арап) и потребление пищи измеряют, вычитая вес несъеденной пищи из начальной предварительно взвешенной пищи после введения и проверки потерь пищи. Восемь животных в каждой группе получают физиологический раствор, 3 мкг РΥΥ3-36, 30 мкг РΥΥ3-36, 10 мкг тестируемого соединения или 100 мкг тестируемого соединения.

Результаты для [Сук2,^-Сук27]РΥΥ (8ЕО ГО №: 13) в качестве испытуемого соединения даны на фиг. 4.

- 34 011860

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

ΝΡΥ (8Е0 ΙΟ Νο: 1)

Н2Н-Туг-Рго-8ер-Еу8-Рго~А8р-А5п-Рго-61у-61и-А8р-А1а-Рго-А1а-С1и-А8р-МеЕА1аАг£-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Агд-Н18-Туг-11е-А8п-Теи-11е-ТЬг-Аг§-С1п-Аг£-Туг-СОЫН2

ΡΥΥ (8Е0 ΙΟ Νο: 2)

Н2ТСТуг-Рго-Ме-Ту5-Рго-С1и-А1а-Рго-Сг1у-О1и-А5р-А1а-8ег-Рго-О1и-61и-Теи-А5п-Аг§-Туг·

Туг-А1а-8ег-Ьеи-Агд-Н18-Тут-Ьеи-А5п-Теи-Уа1-ТЙг-Ат§-О1п-Аг§-Туг-СО>1Н2

РР (8 Г. О Ю ΝΟ: 3)

Н>М-А]а-Рго-Тси-61и-Рго-Уа1-Т\т-Рг<-)-Ст1у-А':р-Азп-А]а-Тйг-Рго-Ст1и-Сг1п-Ме1-А1аС1п-Туг-А1а-А1а-А£р-Тси-,Агд-.Аге-Т>т-11с-А5п-Ме1-Теи-ТЬг-Аге-Рго-Аг§-Туг-СОКН2

ΡΥΥ2-36 (8Е(2 Ю Νο: 4)

Н2М-Рго-11е-Ьуз-Рго-С1и-А1а-Рго-С1у-С1и-А8р-А1а-8ег-Рго-С1и-С1и-Ьеи-А8п-Агд-Туг-ТугА1а-8сг-Ьси-Ага-Н15-Т}т-Теи-А511-Теи-Уа1-Т1нчАг§-С1п-Аг8-Туг-СС)СН2

ΝΡΥ2-36 (8ЕЧ) П> Νο: 5)

Н2М-Рго-5ег-Ьу8-Рго-А8р-А5п-Рго-61у-О1и-А8р-А1а-Рго-А1а-Ст1и-А8р-Ме1-А1а-АгдТуг-Туг-8ег-А1а-Ьеи-Агд-Н18-Туг-11е-А£п-Ьеи-11е-Т11г-Аг§-С1п-Агд-Тут-СОНН2 [О-АЬЦРУУ (8Е<2 Ю Νο: 6)

Н2Ч-В-А1а-Рго-11е-Ту8-Рго-С1и-Л1а-Р1'о-(л1у-С1и-А5р-Л1а-8ег-Рго-С1и'С1и-Теи-А8п-АгдТуг-Туг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Н18-Туг-Теи-А8п-Ееи-Уа1-Ткг-Агд-О1п-Агд-Туг-СОМН2 (ЕА1а2]Р¥У (8Ер Ю Νο: 7)

Н₂М-Туг-О-А1а-11е-Ьу8-Рго-Ст1и-А1а-Рго-С1у-Сг1и-А5р-А1а-8ег-Рго-Сг1и-С31и-Ьеи-А8п-АгдТ уг-Т уг- Ак-Зег-Ьеи-Агд-Ейб-Т уг-Ьеи- Азп-Ьеи-V аТТЬг-Агд-СЯп-Агд-Т уг-СОКЕЕ [ΑΙ»28]ΡΥΥ (8Е<2 ΙΟ Νο: 8)

Н2М-Туг-Рго-11е-Ту8-Рго-С1и-А1а-Рго-Сг1у-С1и-А8р-А1а-8ег-Рго-С1и-(31и-Ьеи-А5П-Аг2-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг£-Н18-Туг-А1а-А5п-Ьеи-Уа1-Т11г-Аг£-С111-Аг£-Туг-СО>1Н2 [А1аЗО]РУУ (8Е0 ГО Νο: 9)

Н2Н-Туг-Рго-11е-Ьу8-Рго-С1и-А1а-Рго-Ст1у-Сг1и-А8р-А1а-8ег-Рго-СгГи-Сг1и-Ьеи-А8п-Агд-ТугТут-А1а-8егЧ.еи-уХгд-Е115-Т\т-Ееи-Лкп-[А1а]-¥'а1-ТЬг-Лгд-С1п-Ат1г-Т\т-СОНН2 [Α1β31]ΡΥΥ (8ЕО ΙΟ Νο: 10)

Н2№Тут-Рго-11е-Еу5-Рго-С1и-А1а-Рго-01у-С1и-Акр-А1а-8сг-Рго-(Т1и-Сг1и-1.еи-А5п-Аг2-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Агд-Н18-Туг-Теи-А8п-Ьеи-[А1а]-ТЬг-Агд-С1п-Агд-Туг-СОНН2

Еу8-Еу5-Еу5-Еу8-Еу5-Ьу8-Р¥У25-36 (АЕф ГО Νο: 11)

Еуя-Еу8-Еуз-Еуз-Еу£-Еу5-Агд-Н|з-Туг-Ееи-А5п-Ееи-\Ч1-Т11г-Аг§-(31г1-Агд-Туг-СОА[Н2 [Ьу84,С1п34]РР (5Е(2 ΙΟ Νο: 12)

Н2М-А1а-Рго-Ееи-Ту8-Рго-УаЕТуг-Рго-61у-А8р-А8п-А1а-Т11г-Рго-О1и-Сг1п-МеЕА1аС1'п-Туг-А1а-А1а-А5р-Ееи-Агд-Агд-Т^,уг-11е-А5Г1-Ме(-Т.е11-'ТЪг-Агд-С1п-Агд-Туг-С0?ТГЕ

- 35 011860 |€уз2.Е-Суз27|Р¥У (8Е<) ГО Νο: 13)

П2Н-Туг-(/уз-11е-Р/А’-₽го_-О1и-А1а-Рго-С1у-61и-Лзр-.А1а-8е1--Рго-Сг1и-О1и-Ееи-А8п-Аг2-'Гуг·

Туг-Л1а-5е1-Ееи-/Аг§-Н1з-(Т>-Суз)-Реи-Л8п-Ьеи-\'а1-ТЬт-Лг§-Ст]!1-Аг2-Туг-СО№Ч2 [Ό} 82,Ο-ϋγ827]ΝΡΥ (8Е(? ГО Νο: 14)

8\ |Суз2 41еЗ 4)-Суз27,Уа131|\Р¥ (8Е0 ГО Νο: 15) ⁵

Н2К-Туг-дуз-Пе-ЕуЖго-А£р-Азп-Рго-С1у-01и-Азр-А1а-Рго-А1а-01и-А£р-Ме1-А1а·

Агр’-Туг-Туг-8ег-.'\1а-Ееи-Лтд.-Н|к-(О-_|Суз)-[1е-Азп-Ееи-Уа1-Т11г-Лгр'-С1п-Лгд-Туг- СОУН?

[Суз2, Аос5-24,О-Су827]Р¥У (8Е<> ГО Νο: 16)

Туг-СОКНз

8ΕΟΙΤΕΝ€Ε8 (Соп(2):

[Су $2, Аос5Д4.1)-Су-,2'|МЭ (8ЕО ГО Νο: 17)

II

Н2Н-Туг-Су8-8ег-Ьу8-Аос5-24-Агд-Н18-(0-Суз)-11е-Азп-Ьеи-11е-ТЪг-Агд-01п-Аг8-ТугΟΟΝΗί [Су«2,11еЗ Лпс5-24,1)-( уч27Л а131]ХР¥ /ЯГ.<} ГО Νο: 18)

8 ¹I

Н2Я-Туг-Суз-Пе-Еуз-Аос5-24-Агд-Н15-(0-Суз)-11е-Азп-Ееи-Уа1-ТЬг-Агд-Сг1п-Агд-Туг· СОТНЕ [Еуз28,С1и32]Р¥У’25-36 (8Е(? ГО Νο: 19)

Алд-Н^з-Туг-Ьуз-Азп-Ееи-'УаЕСфьАгд-Шп-Ате-Туг-СОЕНз

СО [С1и28,Ьу«32]Р¥¥25-36 (8ЕО ГО Νο: 20)

Атд-Ейз-Туг-СНи-Азп-Ееи-УаЕЕуз-Агд-бк-Агд-Туг-СОМНг

СО

- 36 011860

А1а-Аге-Аге-Аг2-А1а-А1а-Аге-А1а-А1а-Аг2-Аг2-Аг2-А!а-А1а-Аг2-А1а-А1а-АгЕ-Аге- АгвА1а-А1а-А1^-А1а-Р¥У25-36 (8ЕО Ш Νο: 21)

А1а-Аг§-Аг£-Аг£-А1а-А1а-Аг£-А1а-А1а-Аг£-Аг§-Аг£-А1а-А1а-Аг£-А1а-А1а-Аг2-Аг§-Аг8А1а-А1а-Лтг-А1а-Аг5-Н18-Тут-Еси-Азп-Еси-\’а1-ГКг-Аг§-(';1п-Агв-'Гуг-С(ЖН2 [Ο-Α1α2]ΡΥΥ2-36 (8Е<2 И) Νο: 22)

Н₂М-В-А1а-11е-Еуз-Рго-01и-А1а-Рто-0]у-Сг1и-А5р-А1а-8ег-Рго-(71и-0]и-Ееи-А8п-Аг§-ТугТуг-А1а-8ег-Ееи-Аг§-Н15-Туг-Ьеи-А8п-Ееи-Уа1-ТЬг-Аг§-С1п-Агз-Туг-СОКН2 [Ьу84,Ьеи17,С1п34]РР (8Е() ΙΟ Νο: 23)

Н2^А1а-Рго-Ееи-Еу5-Рго-Уа1-Туг-Рго-(т1у-Азр-Аяп-А1а-Т11г-Рго-(';1и-С|1п-Ееи-А1аС[п-Туг-А1а-А1а-А:ф-[.си-Аг^-Аг^-Туг-11е-Аяп-Ме1-Ееи-ТЪг-Аг£-О1п-Аг2-Туг-СОШЕ’ [Ьу«4,Ьеи17,Ьеи30,С1п34]РР (8Е(? П> Νο: 24)

Н2К-А1а-Рго-Ееи-Еу.ч-Рго-Уа]-Туг-Рго-С11у-Лар-Ляп-А1а-ТИг-Рго-<1111-С1п-Ееи-Л1аС1п-Туг-Л1а-Л1а-Л5р-Ее1.1-/'и-д-Аг2-Туг-11е-А5п-Еси-Ееи-Т(1т-Аго,-(_г1п-Агд-'Гуг-С(ЖН2 |Еу84,Ме17.Хк-30,С1п34]РР (8Е(? ГО Νο: 25)

Н2М-А1а-Рго-Ееи-Еуз-Рго-Уа1-Туг-Рго-С1у-А8р-А5п-А1а-Т11г-Рго-01и-01п-Ме-А1а-01п-ТугА1а-А1а-Азр-Ееи-А1§-Аг§-Туг-11е-А5п-Н1е-Ьеи-ТЬг-Аг£-СНп-Аг£-Туг-СОНН2 [М-(№-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьу$4,№е17,Ме30,(Лп34]РР (8Ер ГО Νο: 26)

МНСОСН₂СН₂СН(СООН)МНСО(СН₂)₁₂СНз

ΕΕΝ-ΛΙ а-Рго- Ьеи-Еуя-Рго-Vа1-Ту г-Рго-СНу А яр-А зп-₂М а-ТЕг-Рго-Сб и-( Ηη-Ν1 с-А1а-О1п-ТугА1а-А1а-А5р-Ееи-Аг£-Аг£-Туг-11е-А5п-1Ч1е-Ееи-Т11г-Аг§-С1п-Аг£-Туг-СОЫН2

Х-ацсТИ ||Сг<А-1КуО7]Р¥¥2-36 (8Е() ГО Νο: 27) \

СНзСОИН-Су5-8ег-Еу§Ч?го-А8р-А8п-Рго-01у-01и-А8р-А1а-Ргс>-А1а-01и-А5р-Ме1-А1а-Аг£·

Т уг-Т уг-8ег- А1а-Ееи- Агесохн₂ •Су5Н1е-А8п-Ееи-11е-ТЪг-Аг£-О1п-Аг§-Туг[Суз2, Ν-(8-(8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)-Ьу813,В· <?уО7|Р¥¥ (8ЕО ГО N6: 28)

Н2ПСН(СООН)СН2СН₂СОПН(СН2)7СОНН(СН2)₇СОМН

Н₂М-ТуГ“Суз-8ег-Еуз^₽10-А8р-А511“Рго-СНу-61и-Авр-А1а-Еу5-А1а-Сг1и-Азр-Ме1-А1а-Аг£·

Туг-Ту1'-8ег-А1а-Ееи-/А1^,Е-1^:Т18-<р-Су5)-11е-А5п-Ееи-11е-Т11г-Лг8-(т111-Агц-Туг- ΕΟΝΗ₂ [Суз2, Ν-(Ν’- гексадеканоил)- гамма- глутамоил -Ьуз13,В-Су<>27]Р¥¥ (8ЕО ГО Νο: 29)

СН₃(СН2)14СОННСН(СООН)СН₂СНгСОНН

Н₂М-Туг-Су8-8ег-Еу>Его-А8р-Азп-Рго-01у-С1и-А8р-А1а-Еу8-А1а-(31и-А8р-Ме1-А1а-АгдТуг-Туг-8ег-А1а-Ееи-Аг§-Ны^ГО-Су8уПе-А8п-Ееи-Пе-ТЬг-Аг2-О1п-Аг8-Тугсомн₂ ' [Суз2Л-{(А1а-Аг§-Аг£-Аге-А1а-А1а-Аг§-А1а)з}-Ьу813,В-Су827]Р¥¥ (8ЕОΙΒ Νο: 30)

- 37 011860

οονη₂ [Су82,К-РЕС5000-Ьу513,0-Су527]Р¥У (8Е() ΙΟ Νο: 31)

ΡΕ65000-ΟΟΝ

СОЫН₂ [Су$2,11еЗ,О-Су827,Ьеи28,Уа131]НРУ (8Ер Ю Νο: 32)

Н₂К-Туг-С^541еЦЗ^?5'Его-А5р-А5п-Рго-Сг1у-С}1и-А5р-А1а-Рго-А1а-61и-А5р-Ме!-А1аАгд-Туг-Туг-8ег-А1а-Ьеи^Аг£4115-(О-Су8)-Ьеи-А8п-Ьеи-''/а1-Ткг-Агд-О1п-Агд-Туг- €ΌΝΗ₂ 8 [Су«2,1к'3,ХкП,О-Су.527,Ме2«,ν»131]ΝΡΥ (8Е0 ГО Νο: 33)

Н₂К-Туг-Суз-11е-1уъ4^о-АЕр-А£П-Рго-СИу-61и-Азр-А1а-Рго-А1а-С1и-А8р-1<Г[е-А1аАгд-Туг-Туг-Зег-Ак-ЕещАг^^зЦВ-СузЭ-Ме-Азп-Ееи-УаЬТйг-Агд-Ой-Агд-Туг- СОКН?

Х-аиетил-дес-Туг1 (Суз2, Аос5-24 8 _/827]ΡΥΥ (ХЕ() ГО Νο: 34)

8

СНЗСОйШ-Суз-Пе-Ьу8-Аос5-24-Аг2-Н13-(Р-Су8)-Ееи-А5п-Ееи-Уа1-Т11г-Аг£-61п-Агд-Тугεόνη₂ [Суз2,11еЗ,Аос5-24,О-Су827,\'а131 ]ΝΡΥ (8Е<) Ю Νο: 35)

8

II

Н2Н-Туг-Суз-11е-Еу5-Аос5-24-Аг£-Н1з-(0-Су5)-11е-А5п-Ееи-Уа1-ТШ-Агд-<Нп-Агв-ТугСОЫН₂

Ν-(Ν’- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил -|Суз2,0-Суз27]РАА’ (8Е() ΙΟ Νο: 35)

СН₃(СН₂)1₂СОМНСН(СООН)СН₂СН₂СОЯН-Ту

61и-А5р-А1а-8ег-Рго-С1и-Ст11ьЬеи-А5п-Аг£-ТугБеи-А511-Ееи-Уа1-Т1л-Агц-О1п-Агд-1уг-СОКН2

[Суз2,О-Суз27]РУУ2-36 (8Е0 ГО Νο: 36)

- 38 011860

Н2М-Туг-Су5-11е-Ьу8-Рго-01и-А1а-Рго-01у-01и-А8р-А1а-8ег-Рто-01и-С]и-Ьеи-А8п-Агз-ТугТуг-А1а-8ег-Ьеи-Аг2-Н15-(О-Су^)-Ьеи-А5п-Ьеи-Уа1-Т11г-Аг§-О1п-Аг8-Туг-СОМН2 [Суз2, Ν-(Ν’-(21-8μηηο-4,7,10,13,16,19- гексаоксагснэйкозаноил)}- гаммаглутамоил -ЬуЛ3.1)-Суч27]Р5¥ (8ЕО ГО Νο: 37)

Η_?Νί СН₂СН₂О)бСН₂СН₂СОХНСН(СООН)СН₂СН₂СОКН

НгН-Туг-Суз-Пе-Ьуй^о-СПи-Ак-Рго-б^-бШ-Акр-Ак-ЬуЭ^го-СкьСЮ-Теи-Акп-АгдТуг-Туг-А1а-8ег-Ьеи-?л§4^5-(Е)|-Су8)-Ьеи-А5п-Ьеи-Уа1-Ткг-Аг§-С1п-Аг§-Туг-СОКН₂ [Су«2, Ν-(Ν'- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил -Еук13,1)-Суз27|Р¥¥ (8ЕЦ ГО Νο: 38) ^^О1з(СН2)12С0МНСН(С00Н)СН₂СН2С0^Н Н₂Н-Ту|-Су::-Т1с-Т.ук4?.го-Ст1и-А1а-Рго-01у-С1и-Азр-А1а-Еуз-Рго-01и-Ьеи-А8п-А1аАг§-Туг-Туг-А1а-8ег-Ье1>А^^18-(О-Су5)-1>и-А8п-Ьеи-Уа1-'П1г-Аг§-Сг1п-Агё-Туг-СОЕ'Ш2 [Су82,Ьу513,В-Су827]Р¥¥ (8Е0 ГО Νο: 39) к

Н2Н-Туг-СуХЦе-Еуз-Рго-61и-А1а-Рго-С1у-С1и-А5р-А1а-Ьу5-Ргсь<31и-О1и-Ее11-А5пАг§- Туг-Туг-А1а-8ег-Ье1ЕАг8-Е|15-(О-Су5)-Ьеи-А5п-Ьеи-Уа1-Т11г-Аг§-О1п-Аг8

ПРИЛОЖЕНИЕ

Одновременно рассматриваемая Международная патентная заявка авторов данного изобретения, озаглавленная Υ4 Селективные рецепторные агонисты для терапевтического воздействия, описывает применение Υ4 селективных агонистов для различных терапевтических и косметических целей, например для лечения ожирения и избыточного веса, и состояний, при которых ожирение и избыточный вес рассматриваются как способствующие факторы, такие как диарея и кишечная гиперсекреция.

Υ4-рецепторный агонист (агонист Υ4 рецептора) по этой заявке представляет собой агонист, который:

(а) является ΡΡ-складчатым пептидом или ΡΡ-складчатым пептидом-миметиком, который содержит:

(ί) С-концевую аминокислотную последовательность Υ4-рецепторного распознавания, представленную как Х-ТЬт-Атд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХК¹К², где К¹ и К², независимо, обозначают водород или С1-С₆алкил; X обозначает Уа1, 11е, Ьеи или А1а; а X обозначает остаток, отличный от 01η, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТНг замещён на Н1к или Акп, и/или Туг замещён на Тгр или Ρίκ;, и/или Агд замещён на Ьук, и (ίί) Ν-концевую аминокислотную последовательность Υ-рецепторного распознавания, представленную как Η₂Ν-Χ¹-Ργο-Χ²-(Ο1π или Акр)-, где X¹ отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X² обозначает Ьеи, 11е или 8ег, или их консервативную замену; или (б) содержит С-концевую аминокислотную последовательность Υ4 рецепторного распознавания по определению в (ί), см. выше, причём указанная последовательность связана с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанной гексапептидной последовательности, причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации (ограничен спиральной конфигурацией) за счёт ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно, Ν-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания по определению в (ίί), см. выше; или (в) содержит две ковалентно связанные С-концевые аминокислотные последовательности Υ4-рецепторного распознавания (узнавания), каждая из которых содержит последние четыре остатка последовательности по определению в (ί), см. выше. Одна группа предпочтительных С-концевых аминокислотных последовательностей распознавания Υ4 рецептора, присутствующих в агонистах типа (а), (Ь) и (с) по изобретению, представлена последовательностью Х-ТНт-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХК¹К², где X и X³имеют значение по определению выше, а К¹ и К², каждый, обозначают водород. Предпочтительно также, чтобы остаток X не обозначал Акп, и предпочтительно избегать остатки Ьук, Агд, Акр или 01и в качестве остатков X³. В настоящее время предпочтительно, чтобы X обозначал Ρτο, но X может также представлять собой Н1к или неприродный аналог Ρτο, выбранный из 4-гидроксипролина, азетидин-2-карбоновой

- 39 011860 кислоты, азетидин-3-карбоновой кислоты, азапролина и 1-аминоциклобутанкарбоновой кислоты. В С-концевой последовательности Υ4-рецепторного распознавания одним предпочтительным остатком X является Ьеи.

С-концевая последовательность Υ4 распознавания из 6 остатков может представлять собой конечные остатки С-концевого гексапептида, представленного как -Х^А -Х-ТЬг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХК¹К², где остаток Х^А не является основным или кислым. В таких случаях указанный не основной и не кислый аминокислотный остаток Х^А может представлять собой, например, Ьеи или Ме!.

Кроме того, С-концевая гексапептидная последовательность в предыдущем абзаце может, сама по себе, являться конечными остатками С-концевого ундекапептида, представленного как -Х^С-Туг-Х^В-АкпХ^А-Х-ТЬг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХК¹К², где последовательность -Х^А-Х-ТЬг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХК¹К²обсуждается в предыдущем абзаце, Х^С обозначает Агд или Ьук, а Х^В обозначает 11е, Ьеи или Уа1. Примеры таких ундекапептидных последовательностей включают -Агд-Туг-11е-Акп-(Ьеи или Ме!)-Ьеи-ТЬг -Агд(Рго или Н1к)-Агд-Туг-С(=О)ХН₂.

Другим примером С-концевой ундекапептидной последовательности является -Х^С-Туг-Х^В-Акп-Х^АХ-ТЬг-Агд-Х³-Агд-Туг-С(=О)ХК¹К², где Х^С обозначает Н1к, Акп или С1п, а Х обозначает 11е, Ьеи или Уа1. Примером такой последовательности является -Н1к-Туг-(11е или Ьеи)-Акп-Ьеи-(Уа1/11е)-ТЬг-Агд-(Рго или Н1к)-Агд-Туг-С(=О)ЫН2.

В одной группе РР-складчатых агонистов-миметиков типа (а) или (Ь) С-концевая последовательность, содержащая аминокислотную последовательность Υ4-рецепторного распознавания, может быть слита по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанного эпитопа, и Ν-концевую аминокислотную последовательность по меньшей мере из двух аминокислот, причём указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности соединены пептидными связями с линкерным радикалом, который может представлять собой линейный или разветвлённый алкиленовый радикал, необязательно содержащий одну или более двойных или тройных связей. Например, пептидные связи линкерного радикала могут быть образованы, соответственно, карбоксильной группой и аминогруппой аминокислоты формулы ХН₂(СН₂)_пСО₂Н, где п имеет значение от 2 до 12, главным образом 6, 7, 8, 9 или 10. Так, агонист может являться аналогом ΝΈΥ, РРΥ или РР, который содержит описанный мостик Сук-Сук, но при этом его аминокислотные остатки, соответствующие 5-24 нативного пептида, замещены на аминокарбоновую кислоту с углеродной цепью, содержащей 6-10 атомов углерода, выбранную их группы, состоящей из 6-аминогексановой кислоты (ипсилон-аминокапроновой кислоты), 7-аминогептановой кислоты, 8-аминооктановой кислоты, 9-аминононановой кислоты и аминодекановой кислоты. В конкретных вариантах изобретения предпочтительны 8-аминооктановые кислоты (в данном описании иногда сокращённо называемые Аос). Примером такого агониста является [Сук2,Аос5-24,ПСук27]РР (8ЕС ГО №: 9).

В Ν-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агонистов типа (а) и (Ь) остаток Х¹ представляет собой А1а или отсутствует. Кроме того, в Ν-концевой аминокислотной последовательности Υ4-рецепторного распознавания агониста остаток Х² обозначает Ьеи, 11е или 8ег.

Конкретными примерами таких Ν-концевых последовательностей являются Н₂Х-Л1а-Рго-Ьеи-С1и- и Н^-Рго-Ьеи-СШ-.

Ниже представлены конкретные примеры селективных Υ4 агонистов по одновременно рассматриваемой Международной патентной заявке:

РР2-36 [Н1834]- РР [А1а1,Рго34]- ΡΥΥ [А1а2,Рга34]- ΡΥΥ [С1и4,Рго34]- ΡΥΥ [А1а1,С1и4,Рго34]- ΡΥΥ [Аг§2б,Рго34]- ΡΥΥ [11е28,Рго34]- ΡΥΥ [Ме(30,Рго34]- ΡΥΥ

- 40 011860 [Су₃2Д)Суз27]- РР [Суз2,Аос5- 24,Осуз27]- РР [Ьу828,О1и32]РР25- 36 [С1и28,Ьуз32]РР25- 36

5-Суе-ТЬг-Агд-Рго-А гд-Туг-С0ЫН₂

3-Суз-ТГ|г-Агд-Рго-Агд-Туг-СОЛН₂

З-Сув-Ьеи-ТКг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОЫН₂

3-Суз-1еи-Тпг-Агд-Рго-Агд-Туг-СОМН₂

5-Суз-1еи-ТЫ--Агд-Н13-Агд-Туг-СОНН₂

5-Суз-1еи-ТИг-Агд-Н13-Агд-Туг-СО НН₂ и их аналоги с консервативными заменами.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение Υ-рецепторного агониста, отличного от ΡΥΥ3-36, селективного к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, для получения композиции для лечения состояний, восприимчивых к активации Υ2 рецепторов, причем:

(а) указанный агонист является ΡΡ-складчатым пептидом или ΡΡ-складчатым пептидом-миметиком, выбранным из ΡΥΥ, ΝΡΥ, миметиков ΡΥΥ и миметиков ΝΡΥ, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания и не содержат остатка тирозина, соответствующего Туг1 в ΝΡΥ, и/или не содержат остатка пролина, соответствующего Ργο2 в ΝΡΥ, и/или не содержат остатка серина, аспарагина, глутамина, треонина, лейцина, изолейцина, валина, метионина, триптофана, тирозина или фенилаланина, соответствующего 8ег3 в ΝΡΥ, не содержат остатка лизина или аргинина, соответствующего Ьуз4 в ΝΡΥ, и/или содержат остаток, отличный от лейцина, в положении, соответствующем Ьеи24 в ΝΡΥ, и/или содержат остаток, отличный от аргинина, в положении, соответствующем Агд25 в ΝΡΥ, и/или содержат остаток, отличный от гистидина, в положении, соответствующем Н1з26 в ΝΡΥ, и/или содержат остаток, отличный от изолейцина, в положении, соответствующем Пе28 в ΝΡΥ, и/или содержат остаток, отличный от аспарагина, в положении, соответствующем Азп29 в ΝΡΥ, и/или содержат остаток, отличный от лейцина или метионина, в положении, соответствующем Ьеи30 в ΝΡΥ; или (б) указанный агонист представляет собой ΡΡ-складчатый пептид или ΡΡ-складчатый пептидмиметик, выбранный из ΡΡ и ΡΡ-миметиков, которые содержат С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания и не содержат пролина, соответствующего Ρτο2 в ΡΡ, и/или не содержат изолейцина, соответствующего Ьеи3 в ΡΡ, и/или не содержат глутаминовой кислоты, соответствующей О1и4 ΡΡ; или (в) указанный агонист (ί) содержит С-концевую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания, слитую по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, включающим по меньшей мере один поворот альфа-спирали, прилегающий к Ν-концу указанной последовательности Υ2-рецепторного распознавания, причём указанный поворот сдерживается в спиральной конфигурации ковалентной внутримолекулярной связью, и (и) в случае, когда агонист имеет Ν-концевую структуру, аналогичную ΝΡΥ или ΡΥΥ, он содержит одну или более модификаций, перечисленных выше в (а), и в случае, когда агонист имеет Ν-концевую структуру, аналогичную ΡΡ, он содержит одну или более модификаций, перечисленных выше в (б).
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (а) и содержит остаток, отличный от Туг, Тгр или Ρίκ, в положении, соответствующем Туг1 в ΝΡΥ, и/или остаток, отличный от Ργο, в положении, соответствующем Ρτο2 ΝΡΥ, и/или остаток, отличный от Не, Ьеи, Уа1, Ρίκ, Тгр, Туг, 8ег, ТЬг и Азп, в положении, соответствующем 8ег3 в ΝΡΥ, и/или остаток, отличный от лизина или аргинина, в положении, соответствующем Ьуз4 ΝΡΥ.
3. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь) и содержит остаток, отличный от Ργο, Туг, Ρίκ и Тгр, в положении, соответствующем Ρτο2 в ΡΡ, и/или остаток, отличный от Не, Ьеи, Ме! и Уа1, в положении, соответствующем Ьеи3 в ΡΡ, и/или остаток, отличный от О1и или Азп, в положении, соответствующем О1и4 в ΡΡ.
4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (с) и имеет ΡΡ-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания на Ν-концевом

- 41 011860 участке агониста, соответствующем домену полипролина ΡΡ-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
5. Применение по п.4, отличающееся тем, что ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из четырёх Ν-концевых остатков.
6. Применение по п.4 или 5, отличающееся тем, что в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой дисульфидную или лактамную связь.
7. Применение по п.6, отличающееся тем, что в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой лактамную связь, образованную между остатками Ьуз и С1и в указанном спиральном повороте или между остатком Ьуз или С1и в указанном спиральном повороте и остатком С1и или Ьуз в С-концевой последовательности Υ2-распознавания.
8. Применение по п.6, отличающееся тем, что ковалентная внутримолекулярная связь в агонисте является дисульфидной связью, образующейся между остатком Ь- или Ό-Суз в альфа-спирали и остатком Суз, расположенным на Ν-концевом участке агониста, соответствующем домену полипролина ΡΡ-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
9. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что в агонисте С-концевая аминокислотная последовательность Υ2-рецепторного распознавания представляет собой -Х-ТНг-Агд-С1п-Агд-Туг^=Ο)ΝΚ¹Κ², где X не является ни основным, ни кислым остатком, В¹ и В², каждый независимо, обозначают водород или С1-С₆алкил, или её консервативно замещённый вариант, в котором ТНг замещён на Н1з или Азп, и/или Туг замещён на Тгр или Ρίκ, и/или Агд замещён на Ьуз.
10. Применение по п.9, отличающееся тем, что в агонисте С-концевая аминокислотная последовательность Υ2-рецепторного распознавания представляет собой -I1е-Тй^-А^д-С1η-А^д-Ту^-С(=Ο)NΗ₂.
11. Применение по п.9, отличающееся тем, что в агонисте С-концевая аминокислотная последовательность Υ2-рецепторного распознавания представляет собой -А1а-Тй^-А^д-С1η-А^д-Ту^-С(=Ο)NΗ₂.
12. Применение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что агонист имеет С-концевую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность Υ2-рецепторного распознавания, слитую по своему Ν-концу с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к Ν-концу указанного эпитопа, и Ν-концевую аминокислотную последовательность по меньшей мере из двух аминокислот, причём указанные С- и Ν-концевые аминокислотные последовательности соединены пептидными связями, соответственно, с карбоксильной группой и с аминогруппой аминокислоты формулы ΝΗ^ΟΗ^^Ο^, где п обозначает число от 2 до 12.
13. Применение по п.12, отличающееся тем, что в агонисте п обозначает 6, 7, 8, 9 или 10.
14. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист выбирают из

ΡΥΥ2-36 (8Е<2 ГО Νο: 4)

ΝΡΥ2-36 (δΕ() ГО Νο: 5) [Л-А1а1 ]ΡΥΥ(δΕΟ ГО Νο:6) |О-А1а2 |ΡΥΥ (ЗЕО ГО Νο: 7) [Λ1:ι28]ΡΥΥ (δΕΟ ГО Νο: 8) [А1аЗО]РУ¥ (δΕζ> ГО Νο: 9) [А1а31 ]ΡΥΥ (ЗЕО ΙΩ Νο: 10) [Ьуз4,С1п34]РР (8Ε<2 ГО Νο: 12) [Суз2,Е>- Суз27]Р¥У (ЗЕС> ГО Νο: 13) [Суз2Д)- 0’γκ27]ΝΡΥ (ЗЕГ) ΙΩ Νο: 14) [Суз2,11еЗ,О- €γϊ27,ν₃13Ι]ΝΡΥ ι'3Ε() ГО Νο: 15) [Суз2, Аос5- 24,ϋ- Ογ527]ΝΡΥ (ЗЕО ГО Νο: 17) [Суз2,11еЗ,Аос5- 24,ϋ- Суз27,Уа131]ЯР¥ (ЗЕО 1Ω Νο: 18) |Γνΐ28.61υ32]ΡΥΥ25- 36 (8Ε0 ГО Νο: 19) [О1и28,Ьу£32]РУУ25- 36 (δ Ер Ю Νο: 20) [Ω- А1а2 |ΡΥΥ2- 36 (δΕ<2 ГО Νο: 22) [Еуз4,Ьеи17,О1п34]РР (ЗЕО ГО Νο: 23) [Еуз4,Ьеи17,Ьеи30,О1п34]РР (ЗЕО ГО Νο: 24) [Еуз4,Ме17,Ме30,<31п34]РР (δΕΟ ГО Νο: 25)

1Суз2,11еЗ,1>- Суз27,Ьеи28,Уа131]МР¥ (ЗЕО ГО Νο: 32) [Ογ82,Πβ3,Ν1β17φ>- Суз27,№е28,Уа131]№¥ (ЗЕО ГО Νο: 33) [Суз2, Ω- Ογδ27]ΡΥΥ2- 36 (8Ер ΙΩ Νο: 36)

- 42 011860 и их консервативно замещённых аналогов.
15. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Сук2,^-Сук27]РУΥ (8ΕΩ ΙΌ Чо: 13) или его консервативно замещённый аналог.
16. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Ьук4,С1п34]РР (8ΕΩ ΙΌ №: 12) или его консервативно замещённый аналог.
17. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Сук2,Аос5-24,ОСук27]РУΥ (8ΕΩ ΙΌ №: 16) или его консервативно замещённый аналог.
18. Применение по пп.1-17, отличающееся тем, что агонист является ацилированным по своему Ν-концу для придания резистентности к аминопептидазной активности.
19. Применение по п.18, отличающееся тем, что агонист представляет собой агонист, ацилированный по своему Ν-концу ацилирующей группой с углеродной цепью, содержащей 2-24 углеродных атома, например N-(N'-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-[Сук2,^-Сук27]РУΥ (8ΕΩ ΙΌ №: 35).
20. Применение по п.18, отличающееся тем, что агонист является ацетилированным по своему

Ν-концу, например N-ацетил-дес-Ту^1[Сук2,Аοс5-24,^-Сук27]РУΥ (8ΕΩ ΙΌ №: 34) или Νацетил[Сук2,^-Сук27]РΥΥ2-36 (8ΕΟ ΙΌ Ыо: 27).
21. Применение по любому из пп.1-20, отличающееся тем, что агонист представляет собой РУΥ3-36 или агонист по любому из этих пунктов содержит мотив связывания с сывороточным альбумином, или мотив связывания с гликозаминогликаном (САС), или мотив, индуцирующий спираль, или является ПЭГилированным.
22. Применение по п.21, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания с сывороточным альбумином представляет собой липофильную группу.
23. Применение по п.22, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа содержит необязательно замещённую, насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвлённую углеводородную группу, включающую 10-24 углеродных атомов.
24. Применение по п.22 или 23, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа представляет собой боковую цепь или часть боковой цепи остова агониста.
25. Применение по п.24, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, связана с остатком в остове молекулы простой эфирной, тиоэфирной, амино, сложноэфирной или амидной связью.
26. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте боковую цепь, содержащую липофильную группу, выбирают из группы, состоящей из

СН₃(СН₂)„СН(СООН)МН-СО(СН₂)₂СОЧН-₅ где п обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)_ГСО- ЧНСН(СООН)(СН₂)₂СОЧН·, где г обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)₅СО-ЧНСН((СН2)2СООН)СОЧН-, где к обозначает целое число от 9 до 15,

СН₃(СН₂)_тСОЧН-, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-ШСОСН((СН₂)2СООН)ЧН- СО(СН₂)рСНз, где р обозначает целое число от 10 до 16,

-МНСО(СН₂)2СН(СООН)ЧН-СО(СН₂)_АСН_3з где с.| обозначает целое число от 10 до 16,

СН₃(СН₂)_пСН(СООН)ЧНСО-, где п обозначает целое число от 9 до 15, сн,(ау_гкнсо-.

где р обозначает целое число от 10 до 18,

-СОННСН(СООН)(СН₂)₄ЧН- СО(СН,)_тСНз, где т обозначает целое число от 8 до 18,

-СОЧНСН(СООН)(СН₂)₄№1- СОСН((СН₂)₂СООН)ЧН- СО(СН₂)_рСНз, где р обозначает целое число от 10 до 16, -СОЧНСН(СООН)(СН₂)₄№-СО(СН₂)₂СН(СООН)ЧН-СО(СН₂)_чСН₃, где с.| обозначает целое число от 10 до 16, и частично или полностью гидрированнового циклопентанофенантренового остова.
27. Применение по п.24, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой С₁₂, С₁₄, С₁₆ или С₁₈ ацильную группу, ацилирующую аминогруппу, присутствующую в боковой цепи остовного остатка агониста.
28. Применение по п.24, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой тетрадеканоильную группу, ацилирующую аминогруппу, присутствующую в боковой цепи остовного остатка агониста.

- 43 011860
29. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой ^у813-тетрадеканоил-[Су82,^у813,^-Су827]ΡΥΥ, ^у84-тетрадеканоил-[Су82,^-Су827]ΡΥΥ, Щ-(№-тетрадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьу84,№е17,№е30,С1п34]РР (8ЕЦ ГО Νο: 26), [Су82,N-(8-(8-гамма-глутамоиламинооктаноиламино)октаноил)-^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8ЕО ГО Νο: 28), [Су§2, N-(N'-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8ЕЦ ГО Νο: 29) или их консервативно замещённый аналог.
30. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой Ьу813-тетрадеканоил|Яу813|РММ3-36, или ^у84-тетрадеканоил-[^у813]ΡΥΥ3-36, или их консервативно замещённый аналог.
31. Применение по п.21, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив представляет собой аминокислотную последовательность, которая является боковой цепью или частью боковой цепи остова агониста.
32. Применение по п.31, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
33. Применение по п.31 или 32, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив является конкатамерным или дендримерным.
34. Применение по любому из пп.31-33, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного САС-связывающего мотива и ипсилонаминогруппой Ьу§13 в [Су82,^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8ЕЦ ГО Νο: 39).
35. Применение по пп.31-33, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного САС-связывающего мотива и ипсилон-аминогруппой Ьу§13 в [Су82,^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8ЕЦ ГО Νο: 39).
36. Применение по пп.31-33, отличающееся тем, что САС-связывающий мотив представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного САС-связывающего мотива и ипсилон-аминогруппой Ьу§13 в [^у813]ΡΥΥ3-36.
37. Применение по п.21, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив связан ковалентной связью с С- или Ν-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал.
38. Применение по п.37, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив связан ковалентной связью либо непосредственно, либо через линкерный радикал с Ν-концом агониста.
39. Применение по п.37 или 38, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
40. Применение по п.37 или 38, отличающееся тем, что в агонисте САС-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность [ХВВВХХВХ]_п, где п обозначает число от 1 до 5, В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
41. Применение по п.37, отличающееся тем, что агонист представляет собой [XВВВXXВXXВВВXXВX]ΡΥΥ25-36 или [ХВВВХХВХХВВВХХВХХВВВХХВХ]ΡΥΥ25-36, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
42. Применение по п.37, отличающееся тем, что пептид представляет собой А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-А1а-А1а-Агд-Агд-Агд-А1а-А1а-Агд-

А1а-ΡΥΥ25-36 (8ЕО ГО Νο:21) или [Су82,N-{(А1а-А^д-А^д-А^д-А1а-А1а-А^д-А1а)з}-^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8ЕО ГО Νο: 30).
43. Применение по п.21, отличающееся тем, что в агонисте ПЭГ (РЕС) обозначает полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид с молекулярной массой не более примерно 20 кДа.
44. Применение по п.20 или 41, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Су82,^-Су827]ΡΥΥ, ПЭГилированный по Ьу§4, или [Су82,^у813,^-Су827]ΡΥΥ, ПЭГилированный по Ьу813, или [Су82,N-ΡЕС5000-^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8 ЕС) ГО Νο: 31), или [Су82/Ы-{№(21-амино4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}-гамма-глутамоил-^у813,^-Су827]ΡΥΥ (8ЕЦ ГО Νο: 37).
45. Применение по п.21, отличающееся тем, в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с С- или Ν-концом агониста.
46. Применение по п.21, отличающееся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал с Ν-концом агониста.
47. Применение по п.45 или 46, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4-20 аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ет, Тйт, Туг, Акп, С1п, Акр, С1и, Ьук, Агд, Н15, МеС Огп и аминокислотных остатков формулы -ХН-С(Я^!)(Я²)-СО-, где Я¹ обозначает водород, а Я² обозначает необязательно замещённый С1 -С₆алкил, фенил или фенилметил, или Я¹ и Я² вместе с атомом С, с которым они связаны, образуют циклопентильное, циклогексильное или цикло

- 44 011860 гептильное кольцо.
48. Применение по п.45 или 46, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4, 5 или 6 остатков Ьуз.
49. Применение по п.45 или 46, отличающееся тем, что агонист представляет собой Ьуз-Ьуз-Ьуз^уз-^уз-^уз-ΡΥΥ25-36 (8ГО ГО №: 11).
50. Применение по любому из пп.22-36, 43 или 44, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания с сывороточным альбумином, или 0А0-связывающий мотив, или ПЭГ -радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного углерода, соответствующего любому из нижеприведённых положений ΡΥΥ или ΡΡ: 1, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32 или соответствующего любому из нижеприведённых положений ΝΡΥ: 1, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.
51. Применение по п.50, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (с), а мотив связывания сывороточного альбумина, или 0А0-связывающий мотив, или ПЭГ-радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного углеродного атома, соответствующего любому из приведённых ниже положений ΡΥΥ, ΝΡΥ или ΡΡ: 2, 5, 8, 9, 13, 14, 20 и 24.
52. Применение по п.50, отличающееся тем, что агонист имеет значение, определенное в п.12, а мотив связывания сывороточного альбумина, или 0А0-связывающий мотив, или ПЭГ-радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного линкерного радикала -(СН2)п-.
53. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, как определено в любом из пп.16-52.
54. ΡΥΥ3-36, модифицированный, как определено в любом из пп.16-52.
55. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, выбранный из группы, состоящей из

- 45 011860

ΡΥΥ2-36 (ЗЕр ГО Νο: 4)

ΝΡΥ2-36 (ЗЕр ГО Νο: 5) [ϋ-ΑΕ1]ΡΥΥ(5Ες> ГО Νο:6) [О-А1а2]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 7) [ΛΟ28]ΡΥΥ (81ΞΟ ГО Νο: 8) [Л1а30 )ΡΥΥ (ЗЕр ГО Νο: 9) [А1а31 ]ΡΥΥ (ЗЕр ГО Νο: 10)

Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- Ьуз- ΡΥΎ25- 36 (ЗЕр ГО Νο: 11) [Ьуз4,С1п34]РР (ЗЕР ГО Νο: 12) [Су.ч2,О-Суз27]Р¥¥ (ЗЕр ТО Ко: 13) [Суз2,О- Суз27]ИРУ (ЗЕр ГО Νο: 14) [Суз2,11еЗ,О- Су=27,Уа131]КРУ (ЗЕр Ю Νο: 15) [Суз2, Аос5- 24,Ь- Суз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 16) [Сур, Аос5- 24.0- Суз27]ЫРУ (8Е<2 ГО Νο: 17) [Суз2Д1еЗ,Аос5- 24,О- Суз27,Уа131 ]ΝΡΥ (ЗЕр ГО Νο: 18) [Ьуз28,О1и32]РУУ25-36 (ЗЕр ГО Νο: 19) [О1и28,Ьуз32]РУУ25-36 (ЗЕр ГО Νο: 20)

А1а- Аг§- Λτίζ- Ага- А1а- А1а- Аг§- А1а- А1а- Аг§- Ага- Агц- А1а- А1а- Агв- А1аА1а- Аг_£- Аг®- Аг®- А1а- А1а- Ат§- А1а- ΡΥΥ25- 36 (ЗЕр ГО Νο: 21) [ϋ- А1а2]РУ¥2-36 (ЗЕр ГО Νο: 22) [Ьуз4,Ьеи17,С1п34]РР (ЗЕр ГО Νο: 23) [Ьуз4,Ьеи17,Ьеи30,О1п34]РР (ЗЕр Ш Νο: 24) [Еут.4,К1е17,К^т1е30,О1п34]РР ('ЗЕр ГО Νο: 25) [Ν- (Ν’- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- Ьуз4,Ме17,И1е30,С1п34]РР ι (ЗЕр ГО Νο: 26)

Ν- анетил[Суз2,О- Суз27]РУУ2-36 (ЗЕр ГО Νο: 27) [Суз2, Ν- (8- (8- гамма- глутамоиламино-октаноиламино)октаноил)- Ьуз13ЦСуз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 28) [Суз2, Ν-(Ν’- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Ьуз 13.0- Суз27|Р¥У (ЗЕр ГО Νο: 29) [Суз2,И-{(А1а- Аг§- Аг§- Аг£- А1а-А1а-Аг§-А1а)₃}- Ьуз13,0- Суз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 30)

1Суз2Л- РЕС5000- Ьуз13,О- Суз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 31)

1С'ув2,ПеЗ,О- Суз27,Ьеи28,Уа131]ИРУ (ЗЕР ГО Νο: 32) [Суз2,11еЗ,И1е17,О- Суз27,Ме28,Уа131]ИРУ (ЗЕр ГО Νο: 33)

Ν- ацетил- дес- Тут1[Суз2, Аос5- 24,Ц- Суз27]РУУ (ЗЕр ГО Νο: 34)

Ν- (Ν'- тетрадеканоил)-гамма- глутамоил- [Суз2, ϋ- Суз27]РУ¥ (ЗЕр ГО Νο: 35) |Суз2. О- Суз27]РУУ2- 36 (ЗЕР ГО Νο: 36) [Суз2, Ν-{Ν’- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гаммаглутамоил- Ьуз13,О- Суз27]РУУ (ЗЕр Ш Νο: 37).

и их консервативно замещённых аналогов.
56. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, представляющий собой [Ογ82,Ό-Ογ827]ΡΥΥ (ΞΕβ ΙΌ Νο: 13) или его аналог с консервативной заменой.
57. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, представляющий собой [Ьу84,С1и34]РР (ΞΕβ ΙΌ Νο: 12) или его аналог с консервативной заменой.
58. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, представляющий собой |ί\52.Αοο5-24Ό-ί\327|ΡΥΥ (ΞΕβ ΙΌ Νο: 16) или его аналог с консервативной заменой.
59. Υ-рецепторный агонист по любому из пп.55-58, модифицированный, как определено в любом из пп.16-52.
60. Υ-рецепторный агонист, селективный к Υ2 рецептору по сравнению с Υ1 и Υ4 рецепторами, представляющий собой Εγ5-Εγ5-Εγ5-Εγ5-Εγ3-Εγ5-ΡΥΥ25-36 (ΞΕβ ΙΌ Νο: 11) или его аналог с консервативной заменой.

- 46 011860
61. Способ лечения состояний, восприимчивых к активации Υ2 рецепторов, заключающийся во введении нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества Υ2 селективного рецепторного агониста по любому из пп.53-60.
62. Применение по любому из пп.1-51, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показаны регуляция потребления энергии или энергетического метаболизма или индукция ангиогенеза.
63. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что агонист, селективный к Υ2 рецептору, содержит САС-связывающий мотив.
64. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что агонист, селективный к Υ2 рецептору, содержит мотив связывания с сывороткой.
65. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что агонист, селективный к Υ2 рецептору, является ПЭГилированным.
66. Применение по любому из пп.62-65, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой заболевание периферических сосудов, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, удар или заболевание, при котором любое из вышеуказанного рассматривается как способствующий фактор, заживление ран или восстановление тканей.
67. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой ожирение или избыточный вес, состояние, при котором ожирение или избыточный вес рассматривается как способствующий фактор.
68. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что агонист, селективный к Υ2 рецептору, содержит мотив связывания с сывороткой (сывороточным альбумином).
69. Применение по п.62, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что агонист, селективный к Υ2 рецептору, является ПЭГилированным.
70. Применение по любому из пп.67-69, отличающееся тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой булимию, нейрогенную булимию, синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (ΝΐΌΌΜ), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно-сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезнь желчного пузыря, остеоартрит, остановку дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.
71. Применение по любому из пп.67-70, отличающееся тем, что агонист вводят пациенту натощак.
72. Применение по любому из пп.61-70, отличающееся тем, что агонист вводят пациенту парентерально, включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, назальное, трансдермальное или трансбуккальное введение.
73. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более селективных Υ2 рецепторных агонистов по любому из пп.53-60 вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
74. Косметическая композиция, содержащая один или более селективных Υ2 рецепторных агонистов по любому из пп.53-60 вместе с косметически приемлемым эксципиентом.