JP2003523757A - 合成ペプチドライブラリーによるｔリンパ球の抗原特異的刺激方法 - Google Patents

合成ペプチドライブラリーによるｔリンパ球の抗原特異的刺激方法

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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Abstract

(57)【要約】 本発明は、次の工程：（ａ）抗原の全アミノ酸配列を、部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質断片に細分する工程；（ｂ）これらタンパク質断片を含有するペプチドライブラリーを合成する工程；（ｃ）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸濁液と、該ペプチドライブラリーのすべてのタンパク質断とを、１回の培養操作でインキュベーションする工程、を含む、合成ペプチドライブラリーによるＴリンパ球の抗原特異的刺激の方法に関する。本方法は、哺乳類（特にヒト）のＴリンパ球の免疫刺激のために、ならびに哺乳類（特にヒト）がその免疫系によって以前に特定のタンパク質に対して応答していたかどうか、およびこの応答の強さを確認するための診断用に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、以下の工程： （ａ）抗原の全アミノ酸配列を、部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質断片
に細分する工程； （ｂ）これらタンパク質断片を含有するペプチドライブラリーを合成する工程； （ｃ）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸濁液と、該ペプ
チドライブラリーのすべてのタンパク質断とを、１回の培養操作でインキュベー
ションする工程 を含む、合成ペプチドライブラリーによるＴリンパ球の抗原特異的刺激の方法に
関する。 本方法は、哺乳類（特にヒト）のＴリンパ球の免疫刺激、ならびに哺乳類（特
にヒト）がその免疫系によって以前に特定のタンパク質に対して応答していたか
どうか、そして応答していた場合はその応答がどの程度の強さであるかを確認す
るための診断の両方に用いることができる。
【０００２】 発明の背景 タンパク質抗原に対するＣＤ８＋Ｔリンパ球の免疫応答は、既知の方法を用い
多額の費用をかけてはじめて検出することができる。この免疫応答は、細胞上の
ＭＨＣクラスＩ分子において、これら抗原由来のエピトープが提示されることに
依存しており、露出によって誘導された細胞毒性応答を測定することにより測定
することができる。この実験手順は慣用的で１〜数週間を要するが、この実験で
は、適当な培養細胞にて、抗原でＣＤ８＋Ｔリンパ球を刺激した後、細胞毒性試
験において、この抗原由来のペプチドを導入した、あるいは抗原もしくはその一
部でトランスフェクトした適当な標的細胞とインキュベーションしなければなら
ない。ＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答の誘導は、標的細胞の破壊の程度から測定され
るが、これには適切な対照が必要であり、多大な実験と時間が費やされる。
【０００３】 タンパク質抗原に対するＣＤ４＋Ｔリンパ球の免疫応答の検出は、複雑さは幾
分少ない。タンパク質抗原に対するＣＤ４＋Ｔリンパ球の応答は、細胞上のＭＨ
ＣクラスＩＩ分子におけるこれら抗原由来のペプチドの提示に依存しており、抗
原存在下での、あるいはこの抗原に対する暴露による、このような細胞の増殖に
よって（例えばトリチウム化したチミジンの取り込みによって）測定することが
できる。この実験の手順は慣用的であり、数日から１週間あるいはそれ以上を要
する。タンパク質抗原に対するＣＤ４＋Ｔリンパ球の存在は、既知の方法でさら
に測定することができ、そのような方法では、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸
濁液を対応するタンパク質とインキュベーションした後、細胞内のサイトカイン
の存在によるＣＤ４＋Ｔリンパ球の誘導をフローサイトメトリーによって検出す
る。
【０００４】 個々のエピトープに対するＣＤ８＋Ｔリンパ球応答またはＣＤ４＋Ｔリンパ球
応答の存在は、既知の方法においてさらに測定することができ、そのような方法
では、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸濁液をこのタン
パク質由来のペプチドとインキュベーションした後、フローサイトメトリーによ
って、細胞内のサイトカインの存在によるＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球の
誘導が検出される。これは、ペプチドが、細胞内プロセシングを回避して、細胞
のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子上へ、外側から直接入り込むとい
う事実を利用したものである。この方法では、適切なペプチドのグループ分けに
よって、刺激ペプチドを同定し、エピトープを決定することができる。この方法
に用いるグループ分けは、可能なすべてのエピトープを、いくつかの、そして多
くの場合は多数の操作に割り当てて、このタンパク質に由来する個々のペプチド
がＴリンパ球応答を誘導することができるかどうかを確認することができ、そし
て個々のグループにおいて存在するどのペプチドがそのような刺激を誘導したか
を確認することができるようにする（この方法は、F. Kern et al., Journal of
Virology, October 1999, p. 8179-8184およびWO 99/36568に記載されている)
。
【０００５】 しかしながら、このグループ分けでは、タンパク質に対するＴリンパ球応答が
存在するかどうかを、対応する対照を用いた１回の測定で系統的に測定すること
はできず、そのタンパク質に対する応答がどの程度強いのか（全ＣＤ８＋または
ＣＤ４＋Ｔリンパ球に対する反応性リンパ球の割合）も結局のところ分からない
。これを行うために、エピトープの同定のためのこの方法における常套的なグル
ープ分けは、用いたペプチドの数に依存した数回の刺激および測定操作を必要と
するであろう。文献に記載された適応例は、エピトープの厳格な同定を目的とし
ており、そのため、あるペプチドグループの刺激活性を確認するために、できる
だけ少ない数の個々のペプチドが試験されるように選択されたサイズを有するペ
プチドのグループが用いられている。しかし、グループの選択したサイズが小さ
くなればなるほど、より多くのグループを試験しなければならい。したがって、
この方法では、最も望ましい改良として、（ペプチドの数自体が平方数でない限
り）ペプチドの数の次に大きい平方数の平方根の２倍の数のグループが選択され
る。
【０００６】 これは、ヒトサイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質によって例示するこ
とができる。タンパク質全体のアミノ酸配列（５６１アミノ酸）をカバーし、隣
り合ったペプチドとそれぞれ９アミノ酸で重複している１３８個のペプチドをそ
の全長に対して合成した。１３８は平方数ではない。１３８の次に大きい平方数
は１４４（１２×１２）である。したがって、各ペプチドが２つの異なるグルー
プに確実に存在するように、ペプチドを２×１２、即ち２４、のグループに分配
した。結果が陽性（刺激）のグループを組み合わせることで刺激性のペプチドを
直接結論付けることができる（２つのグループだけが陽性の結果を示す場合）、
あるいは２つ以上のペプチドのグループが陽性の刺激の結果をもたらした場合は
、個々に試験することができる少数の候補ペプチドにまで絞り込むことができる
。このグループ分けの原理は、F. Kern et al., Journal of Virology, October
1999, p. 8179-8184に詳細に記載されている。対応するネガティブコントロー
ルを用いた１回の操作によって、あるタンパク質がＣＤ８＋Ｔリンパ球に対する
刺激作用を有するかどうか、即ちこのタンパク質のアミノ酸配列がＣＤ８＋Ｔリ
ンパ球によって認識されるエピトープを含んでいるかどうかを知る可能性につい
てはこれまで記載されていない。
【０００７】 発明の記載 本発明の目的は、既知の配列を有するタンパク質抗原をＣＤ８＋およびＣＤ４
＋Ｔリンパ球の免疫刺激のために如何に用いるかについての可能性を提供するこ
とであり、細胞の抗原プロセシングを必要とせず、個々の抗原決定基（エピトー
プ）を同定する必要がない。その断片に重複をいくつか有する、抗原の個々の断
片の特別なペプチドライブラリーを、Ｔリンパ球とインキュベーションすること
により、十分な免疫刺激を達成することができることがここに見い出された。こ
の免疫刺激はフローサイトメトリーにより検出することができる。即ち、ある生
物（ヒトまたは動物）が、実際に起こったある暴露（同様に十分に狙いを定めた
免疫化）の後に、免疫化抗原に対するＴリンパ球応答を樹立し得るかどうかを確
認することができる。このＴリンパ球の反応性は、時間経過について試験するこ
とができる。本発明のさらなる目的は、アミノ酸配列が知られているタンパク質
抗原を、短時間のうちに且つ比較的費用をかけずに、Ｔリンパ球刺激性タンパク
質抗原として同定することができる方法を提供することである。これは、エピト
ープの同定のためにタンパク質を選択する前に、Ｔリンパ球刺激性抗原決定基が
このタンパク質に少しでも存在しているのかどうかを試験する可能性をさらに提
供するものである。
【０００８】 即ち、本発明は、 （１）合成ペプチドライブラリーによる、Ｔリンパ球の抗原特異的刺激の方法で
あって、以下の工程： （ａ）抗原の全アミノ酸配列を、部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質断
片に細分する工程であって、該タンパク質断片が最短で９アミノ酸残基 （以下
、「ＡＡ」とも略記される）を有し、隣接したまたは隣り合ったタンパク質断片
がそれらの部分的なアミノ酸配列で重複している、工程； （ｂ）（ａ）において定義されるタンパク質断片を含有するペプチドライブラ
リーを合成する工程； （ｃ）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸濁液を、（ｂ
）で得られたペプチドライブラリーのすべてのタンパク質断片と、１回の培養操
作でインキュベーションする工程 を含む方法； （２）哺乳類（特にヒト）のＴリンパ球のイン・ビボおよびイン・ビトロ免疫刺
激に適合した、方法（１）の好ましい態様； （３）上記（２）で定義された方法によって得られる刺激されたＴリンパ球； （４）哺乳類のＴリンパ球のイン・ビボ免疫刺激のための医薬の製造のための、
上記（１）で定義されたペプチドライブラリーの使用；および （５）上記（１）で定義された１またはそれ以上のペプチドライブラリーを含有
する、哺乳類のＴリンパ球のイン・ビトロおよびイン・ビボ免疫刺激のための組
成物 に関する。
【０００９】 発明の詳細な記載 本発明の方法における「抗原」は、ペプチド基本構造を有する抗原である（即
ち、タンパク質、タンパク質の一部またはポリペプチドなど）。上で定義された
方法の工程（ａ）における抗原は、それに対してＴリンパ球刺激がされる抗原ま
たはそれに対してそのような刺激がすでに起こっているかどうかが試験される抗
原（即ち、タンパク質、タンパク質の一部またはポリペプチドなど）である。
【００１０】 本発明における「タンパク質またはペプチド」は、本質的な須の特徴として少
なくとも９個のアミノ酸残基を有する。
【００１１】 本願の意味するところの「ペプチドライブラリー」とは、ペプチドの複合的な
混合物であって、それら全体でタンパク質抗原または部分的な抗原の完全な配列
をカバーし、この配列に沿って一連のペプチドが順次重複しているものである。
【００１２】 したがって、本発明の態様（１）の方法において、特に抗原のアミノ酸配列が
分からない場合は、その抗原の全アミノ酸配列を上述の工程（ａ）の前に決定す
る必要があるかもしれない。
【００１３】 その抗原の配列が如何にして決定されたかは問題ではない。つまり、新規のタ
ンパク質についてはまず最初に配列を解析することができ、既知のタンパク質に
ついては配列をデータベースから読み取ってもよい。唯一重要なことは、そのタ
ンパク質またはタンパク質の一部が決定されているということである。
【００１４】 本発明の方法（１）の好ましい態様では、タンパク質断片は、最短で１５アミ
ノ酸残基および／または最長で３５アミノ酸残基、好ましくは２５アミノ酸残基
を有する。さらに、隣り合ったタンパク質断片の間で、８アミノ酸残基、好まし
くは１１アミノ酸残基の重複が存在していることが好ましい。さらに、合成タン
パク質断片は、それらのＮ末端およびＣ末端の一端または両端において、最長７
個の天然または人工のアミノ酸残基および／または保護基で伸張されていてもよ
い。これらの天然または人工のアミノ酸残基の伸張は重複していない配列である
。
【００１５】 タンパク質断片のＮ末端での適当な保護基は、１〜１０個の炭素原子を有する
、アルキル、アリール、アルキルアリール、アラルキル、アルキルカルボニルま
たはアリールカルボニル、１〜７個の炭素原子を有するアシル基などである。Ｎ
末端に好ましい保護基は、ナフトイル、ナフチルアセチル、ナフチルプロピオニ
ルおよびベンゾイル基である。タンパク質断片のＣ末端に適当な保護基は、１〜
１０個の炭素原子を有するアルコキシまたはアリールオキシ基かまたはアミノ基
である。さらなる保護基は、Houben-Weyl (1974), Georg Thieme Verlag, 第４
版に記載されている。上記文献における保護基の記載は、参考として本明細書に
含まれる。
【００１６】 さらに、培養操作における、ペプチドライブラリーの個々のタンパク質断片の
濃度（終濃度）は、少なくとも１ｎｇ／ｍL、好ましくは約０.１〜約１０μｇ／
ｍLであることが望ましい。培養液中約１μg／ｍLの濃度が特に好ましい。
【００１７】 さらに、インキュベーション溶液（即ち培養液）は、１またはそれ以上の補助
刺激特性を有する化合物、例えば補助刺激抗体（例えば、抗ＣＤ２８または抗Ｃ
Ｄ４９ｄ）または補助刺激特性を有するその他の分子（例えば、刺激性ＣＴＬＡ
４−Ｉｇ）、をさらに含有することが好ましい。これらの化合物は、好ましくは
、０.１〜１０μｇ／ｍLの終濃度で培養液に含まれる。
【００１８】 合成ペプチドライブラリーによるＴリンパ球の抗原特異的刺激のための本発明
の方法（１）の特に好ましい態様は、以下の工程を含む： （ａ1）タンパク質またはタンパク質の一部である、抗原の全アミノ酸配列を
決定する工程； （ａ2）全アミノ酸配列を部分的アミノ酸配列を有するタンパク質断片に細分
する工程であって、該タンパク質断片は最短で９（好ましくは１５）アミノ酸残
基、場合により最長で２５アミノ酸残基を有し、隣接した（adjacent）または隣
り合った（neighboring）タンパク質断片がそれらの部分的なアミノ酸配列で重
複しており、８アミノ酸残基の重複、特に１１アミノ酸残基の重複が好ましい、
工程； （ｂ）（ａ2）において定義される、場合によりＮ末端およびＣ末端の一端ま
たは両端が最長７個の天然または人工のアミノ酸および／または保護基で伸張さ
れた、タンパク質断片を含むペプチドライブラリーを合成する工程； （ｃ）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸濁液を、該ペ
プチドライブラリーのすべてのタンパク質断片と、１回の培養操作でインキュベ
ーションする工程。
【００１９】 好ましくは、１回の培養操作でのすべてのタンパク質断片の刺激性または非刺
激性混合物を同定するための本発明の方法の使用であって、次の工程： （ｄ） （ｉ）該タンパク質断片によって誘導されＴリンパ球において合成された、細
胞内に存在するかまたは細胞膜に結合している、少なくとも１つのＴ細胞サイト
カイン；および／または （ｉｉ）該タンパク質断片によって誘導されＴリンパ球において合成された、
細胞内に存在するかまたは細胞膜に結合している、少なくとも１つの活性化マー
カー を同定、好ましくはフローサイトメトリー法により同定する工程 をさらに加えたものである。
【００２０】 本発明の方法（１）はまた、抗原にＴリンパ球刺激性抗原決定基が存在してい
るかどうかを確認するのに適している。
【００２１】 本発明の方法はさらに、診断、特に、哺乳類（特にヒト）がその免疫系によっ
て以前に特定のタンパク質に応答したかどうか、そしてそのような応答がどの程
度強いのかを確認するための診断、に適している。
【００２２】 本発明の好ましい態様（２）によれば、本方法は、イン・ビトロおよびイン・
ビボでの適用の両方について、哺乳類（特にヒト）のＴリンパ球の免疫刺激に適
している。この方法はさらに、刺激されたＴリンパ球の増殖を包含してもよい。
【００２３】 本発明の方法の上述の態様は、いくつかの異なる合成ペプチドライブラリー（
異なる抗原由来の）を、１回の培養操作で一緒に、あるいは別々の培養操作にお
いて用いるように設計することもできる。
【００２４】 本願が意味するところのＴリンパ球を含有する懸濁液は、ＭＨＣ結合ペプチド
を提示することができる細胞を含有することによって特徴付けられる。即ち、そ
の提示細胞は、抗原提示細胞に加え、Ｔリンパ球であってもよい。
【００２５】 本発明の方法の利点は、少なくとも１つのＴ細胞または活性化マーカーの同定
が個々の細胞のレベルで行われるという事実である。したがって、応答した細胞
の表現型を正確に確認することが可能である。サイトカインおよび表面マーカー
は、Abul K. Abbas et al. (1997), Cellular and Molecular Immunology, Phil
adelphia, 第３版, ISBN 0-7216-4024-9に詳細に記載されている。
【００２６】 ＭＨＣクラスＩ抗原分子（ＭＨＣ＝主要組織適合複合体）に結合するタンパク
質断片は通常９アミノ酸の長さを有し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するタンパ
ク質断片は、それよりも若干長く、長さにも自由度がある。
【００２７】 本発明の方法（１）および（２）の利点は、短いインキュベーション時間にも
かかわらず、例えば６時間後に、タンパク質断片が、Ｔ細胞刺激の明白な同定を
可能にするのに十分に細胞表面に存在するＭＨＣ分子によって取り込まれるとい
う事実にある。
【００２８】 本発明の方法では、Ｔリンパ球を含有する懸濁液を、全血、末梢白血球細胞（
ＰＷＢＣ）、脾臓細胞、胸腺細胞、骨髄、脳脊髄液、リンパ節細胞などから得る
ことができる。
【００２９】 本発明の方法では、Ｔリンパ球のプロセシングを必要としないという点が特に
有益である。即ち、Ｔリンパ球を豊富化する必要がなく、さらに、他の細胞を除
去または破壊する必要がない。即ち、本発明の方法は、慣用的なやり方でより簡
単に行うことができる。
【００３０】 Ｔリンパ球を含有する懸濁液が、処置する患者、他のドナーまたは動物から得
られる、合成ペプチドライブラリーを用いるＴリンパ球の抗原特異的刺激のため
の本発明の方法は好ましい。Ｔリンパ球を含有する懸濁液が患者から得られる場
合、同定は、例えば、ウイルスのどのタンパク質がＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリ
ンパ球応答を誘導し得るかを確認するために使用することができる。次いで、こ
の反応性を試験するために用いるペプチドライブラリーを、同じまたは他の患者
のさらなるＴリンパ球の刺激のために選択的に使用することができる。このよう
にして誘導され刺激された細胞を、イン・ビボまたはエクス・ビボで増殖させ、
次いで患者に再び輸注することができる。
【００３１】 本発明の方法は、動物薬において用いることもできる。Ｔリンパ球を含有する
懸濁液の供給源として、幅広い動物種や一群の動物の患者およびドナーを用いる
ことが可能である。
【００３２】 抗原がタンパク質またはタンパク質の一部であり、微生物、非顕微的微生物、
ドナーまたは患者の細胞、培養細胞、および／または組織に由来する、合成ペプ
チドライブラリーを用いたＴリンパ球の抗原特異的刺激のための本発明の方法は
有用である。微生物としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および
寄生虫が挙げられる。非顕微的微生物としては、例えば、すべての多細胞真核生
物が挙げられる。この供給源は、アレルギーに影響を及ぼすのにまさに重要であ
る。動物および植物も含まれる。細胞、培養細胞または１またはそれ以上の層ま
たは細胞型からなる組織全体も使用することができる。
【００３３】 フローサイトメーターによりその刺激が検出される、合成ペプチドライブラリ
ーによるＴリンパ球の抗原特異的刺激のための本発明の方法は好ましい。サイト
カインまたは表面マーカーなどの細胞または細胞の表面に存在するマーカーが、
蛍光色素を有している特定の検出因子（例えば抗体）と接触するという原理は必
須である。液体の流れに照準を合わせた細胞表面上の蛍光色素のレーザー光によ
る励起によって、フローサイトメーターは、放射された散乱光と蛍光シグナルを
記録し、これは細胞の刺激またはその後の解析を可能にする。そのような技術は
、Howard M. Shapiro (1995), Practical Flow Cytometry, New York, 第３版,
ISBN 0-471-30376-3に詳細に記載されている。細胞内のサイトカインの検出は、
ILL. Picker et al. (1995), Blood, Vol. 86, p. 1408に記載されている。
【００３４】 合成ペプチドライブラリーによるＴリンパ球の抗原特異的刺激のための本発明
の方法の利点は、Ｔリンパ球の免疫刺激のための試薬を、非常に短時間のうちに
そして慣用の方法と比較して非常に少ない費用で利用可能にすることができると
いう点である。個々の刺激エピトープを同定する必要がないという点も更なる利
点である。
【００３５】 １回の操作（１本の試験管または１個のウェルまたは１本のフラスコなど）に
おいて、ドナー／患者のＴリンパ球（ＣＤ８および／またはＣＤ４）を、タンパ
ク質（いくつかのペプチドライブラリーを使用する場合は複数のタンパク質）の
すべての可能な抗原決定基によって、それを具体的に知る必要なしに同時に刺激
することができる。例えば、骨髄移植を受けた患者のＴリンパ球は、ペプチドの
混合物のようなものと予めインキュベーションしたＨＬＡ型が同一の樹状細胞と
インキュベーションすることができ、これらのＴリンパ球を、この特定のＨＬＡ
型に関連する（結合する）すべてのエピトープによって、これらのエピトープを
知る必要もその方法によって分かる必要もなく刺激することができるであろう。
唯一重要な点は、それらエピトープがＴリンパ球を刺激し、選択されたタンパク
質に属しているという点である。これらの細胞は養子免疫療法の範囲内で患者に
再び輸注することができる。
【００３６】 刺激されるＴリンパ球の好ましい供給源は、抗原に対する免疫学的な一次応答
を既に樹立したかまたはその抗原に対する免疫応答などが暴露によって誘導され
たドナー（ヒトまたは動物）である。これは、例えば、感染の範囲またはさらに
は免疫化の範囲においても起こり得る。この刺激は自己免疫反応でもうまくいく
。
【００３７】 さらなる利点は、ドナーのＭＨＣの型を知る必要がないという点である。さら
なる利点は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両Ｔリンパ球の刺激を、同時に且つ１回
の操作で試験することができるという点である。
【００３８】 本発明の態様（３）に従う刺激されたＴリンパ球は、イン・ビトロでの刺激に
よって好ましく得られる。この刺激されたＴリンパ球は患者に輸注することがで
きる。
【００３９】 本発明の態様（４）に従う医薬は、慣用の添加剤や助剤に加え、補助刺激特性
を有する、上で定義された化合物などの免疫反応性を有する化合物をさらに含有
していてもよい。本医薬はまた、上で定義されたペプチドライブラリーのいくつ
かを含有していてもよい。
【００４０】 態様（５）に従う組成物は、ペプチドライブラリーが刺激する抗原にそれぞれ
適合している医薬組成物（即ち、ヒトまたは動物のイン・ビボでの処置のための
）または診断用組成物もしくはいわゆるキット（即ち、主にイン・ビトロでの適
用のための）であっていよい。本組成物の更なる成分としては、態様（４）につ
いて上に記載したものと同じものを適用する。
【００４１】 以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
【００４２】 実施例 静脈穿刺により得た２人の患者の末梢血から単核細胞を調製した。患者はヒト
サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対する抗体を有していた。標準的な方法に
よって調製した細胞を、至適条件下で、ＨＣＭＶタンパク質である６５ｋＤａの
低マトリックスリンタンパク質（lower matrix phoshoprotein）（ｐｐ６５）お
よび５５ｋＤａの前初期タンパク質１（immediate early protein 1）（ＩＥ１
）に対するペプチドライブラリーと６時間インキュベーションした。これは、Ke
rn et al., Eur. J. Immunol. 30: 1676-1682 (2000)に記載された方法にしたが
って行い、以下の工程を含む： １． Ficoll調製（標準的プロトコル）後、ＰＢＭＣ（ＲＰＭＩ１６４０中２．
５×１０6／ｍL、２ｍＭグルタチオン添加）の再懸濁。 ２. この懸濁液４００μLをインキュベーション容器（Falcon No.2054の滅菌チ
ューブ、５ｍL）内で１００μLのペプチド溶液（ＲＰＭＩ１６４０中に各ペプチ
ド１０μgを含有する、２ｍＭグルタチオン添加）と混合した。 ３. Ｈ2Ｏ飽和、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃でのインキュベーション（標準的
なインキュベーター）。 ４. ２時間後、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清およびさらにグルタミン（２ｍ
Ｍ）および１０μｇのBrefeldin A（ＢＦＡ、混合物中の終濃度は１０μｇ／ｍL
であった）を加えた５００μLのＲＰＭＩ１６４０を加えた。混合物中のウシ胎
児血清の終濃度は１０％（ｖ／ｖ）である。各ペプチドの終濃度は１μｇ／ｍL
である。ＢＦＡは細胞内の合成されたサイトカインを維持するのに供し、細胞内
サイトカインの検出に効果がある。混合物の最終容量は１ｍLである。 ５. いくつかの条件下でさらに４時間インキュベーションした後（即ち、合計
のインキュベーション時間６時間）、氷冷ＰＢＳ緩衝液を添加することによって
インキュベーションを止めた。 ６. 遠心（８分、４００Ｇ）した後、傾斜し、標準的なプロトコル（２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ／ＰＢＳ溶液を用いた試験管壁からの剥離、固定化、透明化、モノクロー
ナル抗体による染色を含む）にしたがって試料を処理した。 ７. フローサイトメーター（例えば、FacCalibur型の４色蛍光フローサイトメ
ーター（Becton Dickinson））による解析。
【００４３】 ＩＥ−１およびｐｐ６５の配列は、欧州生物情報学研究所のＳＷＩＳＳ−ＰＲ
ＯＴデータベースに、P13202(配列番号１を参照)およびP06725(配列番号２を参
照）の番号で寄託されている。さらに、両タンパク質の配列は、M.S. Chee, A.T
. Bankier, S. Becks et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154: 125-169
(1990)に記載されている。
【００４４】 ５５ｋＤの前初期タンパク質１を示すペプチドライブラリーは、次のペプチド
との間にそれぞれ９個の重複を有する長さ１５アミノ酸のペプチドから構成し（
図１参照）、６５ｋＤの低マトリックスリンタンパク質を示すペプチドライブラ
リーは、次のペプチドとの間にそれぞれ１１個の重複を有する長さ１５アミノ酸
のペプチドから構成した（図２参照）。
【００４５】 異なる２人の人において、ペプチドライブラリーとのインキュベーションはＴ
細胞におけるＩＦＮ−γの産生をもたらし（図３の「欄Ｉ」および「欄ＩＩ」）
、これは、個々の細胞のレベルでフローサイトメーターでの測定（J.L. Picker
et al. (1995), Blood, Vol. 86, p. 1408-1419）によって検出されたか、そう
でなければ検出可能な刺激はなかった。Ｉの人は、ＩＥ−１に対しＣＤ８＋Ｔリ
ンパ球応答を示したが、ｐｐ６５に対しては応答しなかった。一方、ＩＩの人は
、両方のタンパク質に対してＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を示した。無関係なペプチ
ドとのインキュベーションでは、この効果は生じなかった（対照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 全プールＨＣＭＶ ＩＥ−１（実験室株ＡＤ１６９）のためのペ
プチド。出発タンパク質、ＶＩＥ１−ＨＣＭＶＡ ５５ｋＤａ前初期タンパク質
１（ＩＥ１）、ヒトサイトメガロウイルス（ＡＤ１６９株）の配列は、Ｓｗｉｓ
ｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１３２０２から公知であり、配列番号１に示されている。
【図２】 全プールＨＣＭＶ ｐｐ６５（実験室株ＡＤ１６９）のためのペ
プチド。出発タンパク質、ｐｐ６５−ＨＣＭＶＡ ６５ｋＤａ低マトリックスリ
ンタンパク質（ｐｐ６５）、ヒトサイトメガロウイルス（ＡＤ１６９株）の配列
は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０６７２５から公知であり、配列番号２に示され
ている。
【図３】 記載したペプチドライブラリーを用いた刺激後のＣＤ８＋Ｔリン
パ球における細胞内インターフェロンγの検出。インターフェロンγに加えて、
マーカーＣＤ６９を活性化マーカーとして使用した。表示はＣＤ３＋／ＣＤ８＋
の事象に限定し、平均の蛍光強度で示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニコーレ・ファウルハーバー ドイツ連邦共和国デー−47509ロイルト、 ファザネンシュトラーセ15番 (72)発明者 インゴルフ−パスカル・ズレル ドイツ連邦共和国デー−10315ベルリン、 マリー−キュリー−アレー16番 (72)発明者 イーラム・カタムザス ドイツ連邦共和国デー−10405ベルリン、 クリストブルガー・シュトラーセ41番 Ｆターム(参考） 4B063 QA18 QQ08 QQ61 QQ79 QR41 QR48 QR77 QX02 4B065 AA94X BB19 CA24 4C087 AA01 AA03 BB43 CA04 NA20 ZB09

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 合成ペプチドライブラリーによる、Ｔリンパ球の抗原特異的
    刺激の方法であって、以下の工程： （ａ）抗原の全アミノ酸配列を、部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質断
    片に細分する工程であって、該タンパク質断片は最短で９アミノ酸残基を有し、
    隣接するまたは隣り合ったタンパク質断片がそれらの部分的なアミノ酸配列で重
    複している、工程； （ｂ）（ａ）で定義されるタンパク質断片を含有するペプチドライブラリーを
    合成する工程； （ｃ）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を含有する懸濁液と、該ペ
    プチドライブラリーのすべてのタンパク質断片とを、１回の培養操作でインキュ
    ベーションする工程 を含む方法。
  2. 【請求項２】 前記タンパク質断片が、最短で１５アミノ酸残基および／ま
    たは最長で３５アミノ酸残基、好ましくは２５アミノ酸残基を有する、請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 隣り合うタンパク質断片の間で８アミノ酸残基、好ましくは
    １１アミノ酸残基の重複が存在する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 合成したタンパク質断片が、そのＮ末端およびＣ末端の一端
    または両端において、最長で７残基の天然のまたは人工のアミノ酸残基および／
    または保護基で伸張されている、請求項１〜３の１つまたはそれ以上に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 ペプチドライブラリーの個々のタンパク質断片の濃度が、培
    養混合物中、少なくとも１ｎｇ／ｍL、好ましくは０．１〜１０μｇ／ｍLである
    、請求項１〜４の１つまたはそれ以上に記載の方法。
  6. 【請求項６】 補助刺激特性を有する１またはそれ以上の化合物、特に補助
    刺激抗体、をインキュベーション溶液に加える、請求項１〜５の１つまたはそれ
    以上に記載の方法。
  7. 【請求項７】 工程（ａ）の前に抗原の全アミノ酸配列を決定する、請求項
    １〜６の１つまたはそれ以上に記載の方法。
  8. 【請求項８】 １回の培養操作ですべてのタンパク質断片の刺激性または非
    刺激性混合物を同定するのに適合した、好ましくは、以下の工程： （ｄ） （ｉ）該タンパク質断片によって誘導されＴリンパ球において合成された、細
    胞内に存在するかまたは細胞膜に結合している、少なくとも１つのＴ細胞サイト
    カイン；および／または （ｉｉ）該タンパク質断片によって誘導されＴリンパ球において合成された、
    細胞内に存在するかまたは細胞膜に結合している、少なくとも１つの活性化マー
    カー を同定、好ましくはフローサイトメトリー法により同定する工程 をさらに含む、請求項１〜７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 抗原にＴリンパ球を刺激する抗原決定基が存在するかどうか
    の確認が可能な、請求項１〜５の１つまたはそれ以上に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 哺乳類（特にヒト）のＴリンパ球のイン・ビボおよびイン
    ・ビトロ免疫刺激に適合した、請求項１〜７の１またはそれ以上に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 刺激したＴリンパ球を増殖させることをさらに含む、請求
    項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 得られた増殖したＴリンパ球を患者に輸注することをさら
    に含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 診断、特に、哺乳類特にヒトが以前にその免疫系によって
    特定のタンパク質に応答していたかどうか、そして応答していたならばその応答
    がどの程度強いかを確認するための診断、に適した請求項１〜８の１つまたはそ
    れ以上に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 いくつかの異なった合成ペプチドライブラリーの使用を含
    み、これらペプチドライブラリーとＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球
    懸濁液とのインキュベーションが１回の培養操作で同時に行われるか、または別
    々の培養操作において行われる、請求項９〜１３の１つまたはそれ以上に記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１０または１１に記載の方法によって得られる刺激
    されたＴリンパ球。
  16. 【請求項１６】 哺乳類のＴリンパ球のイン・ビボ免疫刺激のための医薬の
    製造のための、請求項１〜５の１つまたはそれ以上において定義されたペプチド
    ライブラリーの使用。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜５の１つまたはそれ以上において定義された１
    またはそれ以上のペプチドライブラリーを含有する、哺乳類のＴリンパ球のイン
    ・ビトロおよびイン・ビボ免疫刺激ための組成物。
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