CN103063634A - 虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法 - Google Patents

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王安利
冼健安
苗玉涛
潘训彬
李彬
郭慧
张胜鹏
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Abstract

本发明公开了虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，该包括以下步骤：制备虾血细胞悬液；荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育；利用流式细胞仪测定虾总血细胞或不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。本发明的方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成操作损伤，准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速，可同时分析不同类型细胞的一氧化氮含量，为虾类血细胞一氧化氮含量的测定提供了方法依据。

Description

虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法。
背景技术
虾类是我国水产养殖结构调整、农民增产增收、国家出口创汇的重要农产品。但是，近年来，虾类的养殖频繁出现大面积发病和死亡，造成严重的经济损失。虾类免疫学研究可了解虾类机体的免疫反应特征，从而为虾类的营养免疫和疾病防治奠定理论基础和科学依据。
近年来，多种虾类的一氧化氮合酶基因序列相继被克隆得到，研究认为一氧化氮在虾类的免疫防御中也起着重要的抗菌杀菌的作用。目前，测定一氧化氮含量的最常用的方法是应用Griess试剂测定亚硝酸盐和硝酸盐的含量，从而推算一氧化氮的含量。该方法具有以下明显的缺点和不足：1、机体内并不是所有的亚硝酸盐和硝酸盐都来源于一氧化氮的转化，重复性较差；2、该方法测定的是组织水平的总体含量，不能反映单个细胞水平的含量；3、该方法难以分析不同类型细胞的一氧化氮含量。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速测定虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，该方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成损伤，具有准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速的特点，可同时分析不同类型血细胞的一氧化氮含量。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
（1）制备虾血细胞悬液；
（2）荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育；
（3）利用流式细胞仪测定虾总血细胞或不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
步骤（1）所述的制备虾血细胞悬液是将虾体表水分擦干，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，再用预冷的抗凝剂调整细胞浓度后得到虾血细胞悬液；
所述的抗凝剂由以下方法制备得到：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌后得到。
所述的虾血细胞悬液，其中血细胞浓度的数量级优选106cells/ml。
步骤（2）所述的加入荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育，是往取血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的DAF-FM DA，室温下避光孵育60min，用200目筛网过滤；
步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾总血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光（FSC）、侧向角散射光（SSC）和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，同时在FL1-H直方图中获取血细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光（FSC）、侧向角散射光（SSC）和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上分别圈定不同类型的血细胞（透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞），建立三个FL1-H直方图，同时在三个FL1-H直方图中分别获取透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
本发明的原理是：DAF-FM DA与细胞共孵育后能自由穿过细胞膜，进入细胞后被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM，DAF-FM仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈的绿色荧光，因此细胞内的DAF-FM绿色荧光强度与一氧化氮含量成正比，利用流式细胞仪测定细胞的DAF-FM平均荧光强度即可反映细胞的一氧化氮含量。在FSC-H/SSC-H散点图中圈定不同类型的细胞，还可分析不同类型细胞的一氧化氮含量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成操作损伤，准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速，可同时分析不同类型细胞的一氧化氮含量，为虾类血细胞一氧化氮含量的测定提供了方法依据。
附图说明
图1是实施例1中斑节对虾血细胞FSC-H/SSC-H散点图。
图2是实施例1中斑节对虾总血细胞FL1-H直方图。
图3是实施例1中斑节对虾透明细胞FL1-H直方图。
图4是实施例1中斑节对虾小颗粒细胞FL1-H直方图。
图5是实施例1中斑节对虾大颗粒细胞FL1-H直方图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
使用流式细胞术检测方法测定斑节对虾不同类型血细胞一氧化氮含量，包括以下步骤：
（1）配制适用于斑节对虾的抗凝剂：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌，冷却后置于4°C冰箱保存备用。
（2）制备对虾的血细胞悬液：取出对虾，用棉球擦干体表水分，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，用预冷的抗凝剂调整细胞浓度约为106cells/mL，共取对虾15尾，每尾虾的血细胞悬液作为一个单独样品进行测定。
（3）荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育：每尾虾的血细胞悬液分别取200μl，加入终浓度为10μmol/L的DAF-FM DA（购自Sigma公司），避光室温孵育60min后，用200目筛网过滤。
（4）利用流式细胞仪测定斑节对虾不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度：所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur，进行上样，调整并确定仪器基本参数，前向角散射光（FSC）电压E00，放大器1.6，数据采用Line线性形式，侧向角散射光（SSC）电压350，数据采用Log对数形式，FL1电压为510，数据采用Log对数形式，先在FSC-H/SSC-H散点图上圈定不同类型的血细胞（透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞分别记为R1、R2和R3，图1），再建立四个FL1-H直方图，分别获取总血细胞、透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞的DAF-FM绿色荧光（图2-5），每个样品读取细胞数10000个，用CellQuestPro软件分析不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
计算结果如下所示：
实施例2
使用流式细胞术检测方法测定脂多糖处理后的斑节对虾离体血细胞一氧化氮含量，包括以下步骤：
（1）配制适用于斑节对虾的抗凝剂：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌，冷却后置于4°C冰箱保存备用。
（2）制备对虾的血细胞悬液：取出对虾，用棉球擦干体表水分，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，放入无菌离心管中，取足够的血淋巴后，将其混合，用预冷的抗凝剂调整细胞浓度约为106cells/mL。
（3）脂多糖（LPS）处理血细胞：脂多糖（LPS）（Escherichia coli055:B5，购自Sigma）溶解于抗凝剂中，浓度为1μg/μl，取3管血细胞悬液，每管4ml，1管血细胞悬液为对照组，另2管血细胞悬液中分别加入终浓度为5和10μg/ml的LPS，在室温下避光孵育60min后为LPS处理组。
（4）荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育：对照组和LPS处理组的血细胞悬液分别取200μl，加入终浓度为10μmol/L的DAF-FM DA（Sigma），避光室温孵育60min后，用200目筛网过滤。
（5）利用流式细胞仪测定脂多糖处理后斑节对虾血细胞DAF-FM平均荧光强度：所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur，进行对照组上样，调整并确定仪器基本参数，前向角散射光（FSC）电压E00，放大器1.6，数据采用Line线性形式，侧向角散射光（SSC）电压350，数据采用Log对数形式，FL1电压为510，数据采用Log对数形式，先在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，再在FL1-H直方图获取血细胞的DAF-FM绿色荧光，分别对对照组和LPS处理组的样品进行上样，每个样品读取细胞数10000个，用CellQuest Pro软件分析血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
计算结果如下所示：
Figure BDA00002651952700051
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备虾血细胞悬液；
（2）荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育；
（3）利用流式细胞仪测定虾总血细胞或不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
2.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的制备虾血细胞悬液是将虾体表水分擦干，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，再用预冷的抗凝剂调整细胞浓度后得到虾血细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：所述的抗凝剂由以下方法制备得到：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌后得到。
4.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：所述的虾血细胞悬液，其中血细胞浓度的数量级为106cells/ml。
5.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的加入荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育，是往取血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的DAF-FM DA，室温下避光孵育60min，用200目筛网过滤。
6.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾总血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光、侧向角散射光和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，同时在FL1-H直方图中获取血细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
7.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光、侧向角散射光和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上分别圈定不同类型的血细胞，建立若干个FL1-H直方图，同时在不同的FL1-H直方图中分别获取不同类型的血细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。
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