CN102410983B - 一种组培苗氮素利用率的无菌动态检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种组培苗氮素利用率的无菌动态检测方法，先构建水分损失模型并计算出培养基厚度，用近红外光谱仪同时多点采集建模样品和试验样品中的培养基的漫反射光谱信息获得建模样品的模型，然后对试验样品进行预测获取试验样品培养基中多点的氮素含量；再用某点的氮素含量和该某点距组培苗基径垂直距离进行线性拟合得到氮含量与垂直距离的方程式，通过圆柱体积分公式计算出试验样品培养基的总氮量；在对试验样品培养基中多点的氮素含量检测的同期利用图像处理法检测试验样品组培苗生物量；最后根据公式计算出试验样品中组培苗的氮素利用率；无需提取培养基中的氮素便可动态、无菌、无损测定植物组织培养过程中培养基氮素的变化。

Description

一种组培苗氮素利用率的无菌动态检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于光谱分析法和图像处理法的无菌动态检测组培苗氮素利用率的方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

植物组织培养中，氮素起到促进植物生长的重要作用，缺氮直接影响植物的氨基酸、蛋白质、核酸等物质的生物合成，导致植物光合作用能力和最终产量降低，它的消耗量会影响培养物的生长速度和生长量，因此，如果能对培养过程中组培苗的氮素利用率进行动态检测，就对方便研究培养物生理性能、判断培养物的最佳接种期、探讨组培苗的生长规律、提高产量、指导工厂化的苗木生产具有重要的意义，是调控组培的环境因子、改良培养基配方的重要依据。

传统的氮素的测定方法都需要对培养基中氮素提取后才能进行测定，这样不仅使培养基遭到破坏，也同时破坏了植物生长的无菌环境。由于植物组织培养是在无菌、半封闭环境中进行的，即组培苗被接入玻璃锥形瓶的培养基中长期保持无菌状态。所以组培苗的氮素消耗和生长状况必须要无损、无菌检测才可以保证组培苗的正常生长，这就造成了对培养基中的氮素含量进行检测时必须保证封装好的样品不能进行任何的前处理。

利用光谱方法可测定分析不同环境中的氮素，例如，利用遥感监测小麦长势估测土壤氮素累积情况、利用鲜叶光谱信息估测氮素营养状况、利用近红外技术对牛粪碳、氮含量进行研究等。近红外光谱技术是一种高效快速的现代分析技术，其最大的特点就是快速、无损和无菌，样品无需或只需很少的预处理，分析速度快，无需化学试剂，堪称为绿色检测技术，在多个领域得到了日益广泛的应用。随着非破坏和非接触式的图像分析技术的发展以及在生物学和农学方面的广泛应用，已使用图像分析方法来对组织培养试管苗进行无菌检测，采用多参照内标法图像处理技术可以在达到监测标准的前提下对不同生长期不同体型的组培苗进行无菌监测。而先利用近红外光谱分析法对植物组织培养的半固态培养基中的氮素含量进行测定，进而结合生物量检测对组培苗的氮素利用率进行测定的技术方案还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为克服目前组培苗氮素在测定时需提取培养基中氮素，导致培养基以及植物生长无菌环境遭破坏的不足，提供一种基于近红外光谱分析法和图像处理法的组培苗氮素利用率的无菌动态检测方法，以便能无菌、无损、动态检测植物组织培养物的氮素利用率。

本发明为实现上述目的，采用的技术方案是包括以下步骤：（1）备好转接有组培苗培养基的建模样品和试验样品，同时备好空白培养基，所述培养基均为半径r、高H的圆柱体，每隔一定时间，对所述空白培养基进行水分损失检测，以t时间的空白培养基体积V _t  和时间 t 进行线性拟合，构建水分损失模型；（2）利用水分损失模型，计算出组培苗培养时间 t时的培养基厚度H=V _t /pr²。（3）用便携式近红外光谱仪同时多点采集建模样品和试验样品中的培养基的漫反射光谱信息，利用常规近红外光谱分析法获得建模样品的模型，选取预测精度最高的建模样品的模型作为预测模型对试验样品进行预测，获取试验样品培养基中多点的氮素含量；（4）用试验样品培养基中某点的氮素含量y和该某点距组培苗基径垂直距离x进行线性拟合，得到氮含量y与该某点距组培苗基径垂直距离x的方程式，再通过圆柱体积分公式Y=                                                

计算出试验样品培养基的总氮量Y，h为试验样品培养基的组培苗接种深度；（5）自组培苗转接到试验样品的当天开始，在对试验样品培养基中多点的氮素含量检测的同期利用图像处理法检测试验样品组培苗生物量M；（6）根据公式

计算出试验样品中组培苗在0-t_n时间段的氮素利用率

，公式中的t_n为测定试验样品培养基中总氮量和试验样品组培苗生物量的时间，

为 0-t_n时间段试验样品组培苗的氮素利用率，

为 t_n时间测定的试验样品组培苗的生物量，

为试验样品组培苗接种当天测定的组培苗初始生物量，为试验样品组培苗接种当天测定的培养基中初始总氮量，

为 t_n时间测定的试验样品培养基中总氮量。

本发明的优点如下：

1）本方法无需提取培养基中的氮素，较常规氮素测定方法快速、简便。

2）本方法可批量测定培养基中氮素含量，可以动态、无菌、无损测定植物组织培养过程中培养基氮素的变化。

3）本方法可以动态检测培养期中组培苗氮素利用率变化。

附图说明

图1是空白培养基体积随培养时间的变化图。

具体实施方式

先备好转接有组培苗培养基的建模样品和试验样品，同时备好空白培养基。建模样品、试验样品的培养基以及空白培养基这三个培养基均为半径r、高H的圆柱体形状的半固态培养基，每隔一定时间，对空白培养基进行水分损失检测，以t时的空白培养基体积V _t  和时间t 进行线性拟合，构建水分损失模型；利用水分损失模型，算出组培苗培养时间 t时的培养基厚度H；H=V _t /pr²。用便携式近红外光谱仪同时多点采集建模样品和试验样品中的培养基的漫反射光谱信息，根据漫反射光谱信息，利用常规近红外光谱分析法获得建模样品的模型，选取预测精度最高的建模样品的模型作为预测模型对试验样品进行预测，获取试验样品培养基中多点的氮素含量。然后用试验样品培养基中某点的氮素含量y和该某点距组培苗基径垂直距离x进行线性拟合，得到氮含量y与该某点距组培苗基径垂直距离x的方程式，再通过公式Y=

计算出试验样品培养基的总氮量Y，h为试验样品培养基的组培苗接种深度。在自组培苗转接到试验样品的当天开始，在对试验样品培养基中多点的氮素含量检测的同期利用图像处理法检测试验样品组培苗生物量M；根据公式计算出试验样品中组培苗在0-t_n时间段的氮素利用率

，公式中的t_n为测定试验样品培养基中总氮量和试验样品组培苗生物量的时间，为 0-t_n时间段试验样品组培苗的氮素利用率，

为 t_n时间测定的试验样品组培苗的生物量，

为试验样品组培苗接种当天测定的组培苗初始生物量，

为试验样品组培苗接种当天测定的培养基中初始总氮量，

为 t_n时间测定的试验样品培养基中总氮量。

以下提供本发明的实施例。

实施例

试验样品分别为3～4代的继代诸葛菜、茅苍术、油菜组培苗的培养基，组培苗分别接在3个氮素水平的培养基中，培养30天，不同种类组培苗培养基中初始氮素浓度水平如下表1所示：

表1 不同种类组培苗培养基中初试氮素浓度水平

以t时的空白培养基体积V _t  和时间 t 进行线性拟合，得到水分损失模型. 参见图1，空白培养基体积和培养时间拟合方程为V _t  =50.005-0.2707t，样品数n=9；其中V _t  为 t 时间空白培养基的体积（ml）；t为组培苗培养时间（d）。

再用便携式光谱仪同时多点采集建模样品和试验样品中的培养基的漫反射光谱信息，利用常规近红外光谱分析法获得预测模型。建立预测模型的方法为常规方法，简介如下：将建模样品分为校正集和预测集。利用校正集样品的光谱数据建立校正模型包括以下步骤：采集校正集样品的光谱信息，提取特征波长优选光谱数据，采用平滑和一阶微分处理后，采用偏最小二乘法（PLS）构建样品中氮素浓度和光谱数据的数学模型。用预测集样品的光谱数据带入到校正模型进行预测，分析预测结果，选取预测精度达到要求的校正模型作为预测模型对试验样品进行预测，指的是对预测集中的氮素含量实际值与预测值的相关系数及预测均方根误差进行比较，当预测集中相关系数、均方根误差满足预测要求时，即可用该校正模型对试验样品进行预测。以上述满足预测要求的模型作为预测模型对试验样品各点处氮素含量进行预测，试验样品每点的光谱信息带入预测模型获取试验样品各点处氮素含量，分别用不同点的光谱信息带入预测模型获取试验样品培养基中多点的氮素含量。

然后，对生长有组培苗的培养基进行无菌氮素含量的检测，用试验样品培养基中某点的氮素含量和某点距组培苗基径垂直距离进行线性拟合，得到氮含量分布模型，再计算培养基的总氮量。

初始试验组培瓶整体培养基厚度 H为2.5cm，培养基半径 r为 2.523cm, 故视整体培养基为半径r=2.523 cm  高H=2.5 cm的圆柱体，试验样品组培苗接种时，将其置于组培瓶的中心位置，接种深度h=0.5 cm。以培养期 15 天时样品编号7的油菜为例说明，从培养瓶底部获取多点光谱信息，利用常规近红外光谱分析法获得的模型进行预测，试验样品每点的光谱信息带入预测模型获取试验样品各点处氮素含量，分别用不同点的光谱信息带入预测模型获取试验样品培养基中多点的氮素含量。用测点的氮素含量y和测点距组培苗基径垂直距离x建立进行线性拟合，得到氮含量分布模型为y=0.1184x+0.323,样品数n=9。根据培养基体积V _t  和培养时间t拟合方程为V _t  =50.005-0.2707t，培养时间t =15d 时，培养基体积V ₁₅  =45.93 ml，故此时的培养基的厚度H=V ₁₅ /pr²=2.297 cm，根据圆柱体积分公式：Y=

，其中，h=0.297cm；y=0.1184x+0.323；R=2.523cm；H=2.297cm，进行积分，得到培养期15天时样品油菜7培养基中总氮量为19.68mg。根据此方法即可得到各培养期中培养基总氮量，结果见下表 2：

表 2 生长不同类型组培苗的培养基中总氮量[mg]随培养时间[d]的变化

培养基氮素存在浓度梯度，根系附近氮素浓度低于周边浓度。伴随着培养基中养分不断被根系吸收，根际有效养分的浓度降低并在水平、垂直方向出现养分浓度的梯度差，根系吸收养分要求根际养分既有一定的供应强度，又能持续的供应，根基培养基中养分浓度分布与原培养基有明显差异，它主要受控于跟吸收速度与养分迁移速度的综合影响，反之，根际养分的供应强度又直接影响植物的营养状况，故测定结果与植物生长生理特性是一致的。

未接入组培苗的培养基氮素初始值为42.05mg，接入组培苗后当天所检测总氮量为42.55 ± 0.05mg (Mean±SE, n=9)，与未接组培苗前总氮量相对一致，表明接上组培苗对培养基氮素的检测并没有产生很大影响。表2显示的是不同样品在培养期间培养基中总氮量变化情况；组培苗接入前后总氮量差异较小，相关系数（R）为0.9785，预测平均误差（AREP）4.61%，表明接上组培苗对培养基氮素的检测并没有产生很大影响，同时也表明可以用近红外光谱分析法对组培过程中培养基中氮素含量进行无损检测。在培养期0-5天时，组培苗2、3、4、8培养基中总氮量呈现增大现象，5-15天，各组培苗培养基中总氮量呈现相对较大程度的下降趋势，15-30天，培养基总氮量随培养时间的增加相对均匀地降低，在组织培养30天时所测定的培养基中总氮量已经远远低于初始氮素含量，总体可以看出各类组培苗的培养基中总氮量变化均相对一致。组培苗对氮素的吸收速率和时间的相关性还是比较大的，即组培苗对氮素的吸收总体来讲是比较均匀的，并没有出现特别大的起伏，这和植物的生长规律是相符合的，间接反映了利用近红外光谱分析法可以动态、无菌、无损检测组培苗氮素的消耗。

组培苗在接苗时，基部组织会受到切伤，含有氮素的伤流液也一定程度地增加了培养基中的总氮量，故部分组培苗培养基中总氮量出现在短时间内较高于初始值的现象，随后，伴随着氮素利用增加和组织伤流液的减少，培养基中总氮量逐渐降低，在组织培养30天时所测定的培养基中总氮量已经远远低于初始氮素含量。植物种类不同，其根系的类型不同，故它们从培养基中吸收氮素的效率也有一定总氮量差异。

自组培苗转接到试验样品的当天开始，在对所述培养基中多点的氮素含量检测的同期利用图像处理法检测组培苗生物量 M。利用图像处理法检测组培苗生物量M为常规方法，简介如下：把待测的组培苗加入到不同的已知质量的同类组培苗中间，获得彩色图像。在Photoshop软件中将彩色图像转化为灰度格式，再将灰度格式的图像经过亮度和对比度调整，最后将图像进行反转，使得图像中除组培苗外的其他背景的灰度值达到0，再根据反转图像对各瓶组培苗进行像素点数的统计。把已知质量的5瓶组培苗为内标，以5个内标的质量和对应的像素点进行线性回归，获得线性回归方程。将待测未知样品的像素点代入该方程，可获得组培苗的图像分析质量。

最后，动态测定组培苗的氮素利用率NUE。结合总氮量 Y 的检测和组培苗生物量 M 信息检测，对组培苗的氮素利用率进行计算，

，其中，t_n为测定培养基中总氮量和组培苗生物量的时间，单位为d；

为 0-t_n时间段组培苗的氮素利用率，单位为g/gN；

为 t_n时间测定的组培苗的生物量，单位为g；

为组培苗接种当天测定的组培苗初始生物量，单位为g；

为组培苗接种当天测定的培养基中初始总氮量，单位为mg；

为 t_n时间测定的培养基中总氮量，单位为mg。

组培苗氮素消耗随组培苗生物量的变化而变化，下表3 显示了培养期间组培苗生物量变化情况：

表 3 不同类型组培苗的植物生长量[g]随培养时间[d]的变化

由于接种时组培苗植株大小不均一，故生长速度在不同组培苗种类、不同培养期间呈现变化趋势。因此，可以通过组培苗生物生长量和组培瓶中培养基中氮素含量来确定组培苗的氮素利用率。在接种组培苗时，伤流液量与组织受伤程度存在关系，但组培苗接苗时受伤程度很难判断，切口处伤流液规律变化是相对错综复杂的，故确定组培苗是在特定培养阶段的氮素利用效率，结果如下表4 所示：

表4 不同氮素水平培养组培苗不同培养期的氮素利用率（g/gN）

由表4 可知：各氮素水平下组培苗的氮素利用率存在明显差异，在低氮（0.602 g· L^-1）水平下，诸葛菜、茅苍术、油菜组培苗0-30天氮素利用效率分别为184.3 g/gN、108.3 g/gN 和151.3 g/gN，在高氮（1.125 g· L^-1）水平下，氮素利用效率仅分别为75.4g/gN、51.6g/gN和58.5g/gN，在试验氮素水平范围内，低氮水平下组培苗氮素利用效率均高于其他氮素水平下的利用率，即氮素水平越低氮素利用率越高，这和植物的生长规律还是相符合的，说明检测具有可行性。

Claims (1)

1.一种组培苗氮素利用率的无菌动态检测方法，其特征在于采用如下步骤：

（1）备好转接有组培苗培养基的建模样品和试验样品，同时备好空白培养基，所述培养基均为半径r、高H的圆柱体，每隔一定时间，对所述空白培养基进行水分损失检测，以t时间的空白培养基体积V _t  和时间 t 进行线性拟合，构建水分损失模型；

（2）利用水分损失模型计算出组培苗培养时间 t时的培养基厚                                               

；

（3）用便携式近红外光谱仪同时多点采集建模样品和试验样品中的培养基的漫反射光谱信息，利用常规近红外光谱分析法获得建模样品的模型，选取预测精度最高的建模样品的模型作为预测模型对试验样品进行预测，获取试验样品培养基中多点的氮素含量；

（4）用试验样品培养基中某点的氮素含量y和该某点距组培苗基径垂直距离x进行线性拟合，得到氮含量y与该某点距组培苗基径垂直距离x的方程式，再通过圆柱体积分公式Y= 计算出试验样品培养基的总氮量Y，h为试验样品培养基的组培苗接种深度；

（5）自组培苗转接到试验样品的当天开始，在对试验样品培养基中多点的氮素含量检测的同期利用图像处理法检测试验样品组培苗生物量M；

（6）根据公式

计算出试验样品中组培苗在0-t_n时间段的氮素利用率；t_n为测定试验样品培养基中总氮量和试验样品组培苗生物量的时间，

为 t_n时间测定的试验样品组培苗的生物量，

为试验样品组培苗接种当天测定的组培苗初始生物量，

为试验样品组培苗接种当天测定的培养基中初始总氮量，

为 t_n时间测定的试验样品培养基中总氮量。

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