CN102608085A - 一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用。该方法通过荧光分光光度计测定藻细胞样品的三维荧光，得到藻细胞样品的三维荧光数据；再将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；根据荧光特征谱初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻；再将荧光特征谱进行Fisher判别，从而判定藻细胞样品毒性的大小。本发明成功解决了传统检测方法时间滞后的难题，在我国实属首创。本发明改变传统检测方法时间滞后、被动的窘境，有利于现场检测赤潮藻的鱼毒性。

Description

一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用

技术领域

本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用。

背景技术

近年来，随着沿海经济的高速增长和对外贸易的加强，港口的建设和远洋运输能力不断增强，沿海水域富营养化急剧增加。有毒、有害赤潮呈不断上升的趋势，造成沿海水产养殖的重大经济损失。有毒、有害赤潮的研究亦成为国际赤潮与海洋环境研究领域重要的议题和内容。现场观察发现，1997年10月间发生在广东饶平柘林湾的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)赤潮使该湾养殖的鱼类全部死亡，损失达六千万人民币；2005年5月间发生在湛江港养殖区的同种赤潮，仅引起少数鱼类死亡，在渤海湾发生的同种赤潮对鱼类也没有毒性。上述现象均说明环境因子可能影响着藻类毒素的生成。

鱼毒性赤潮藻溶血毒素毒性很强，传统的检测方法很难快速检测该藻是否具鱼毒性，且测定结果在时间上明显滞后。当毒性实验完成时，赤潮灾害或许已经发生，虽然在某种程度上这些方法可以避免人类中毒，在保障海产品食用安全方面发挥一定作用，但不能化解和减少因赤潮毒素对养殖业带来的巨大经济损失。只有从毒素源头上入手，及时、准确的预报产毒生物的消长情况，才有可能从根本上克服赤潮毒素对人类的威胁、减少因之带来的经济损失。赤潮毒素主要来源于赤潮藻，因此迫切需要建立快速、准确的产毒藻株鉴别技术，以实现赤潮的应急监测。

三维荧光光谱法是近二十年发展起来并趋于成熟的荧光分析技术。该方法具有检测速度快、简单易携、高灵敏度的特点。目前被广泛应用于油种鉴别、水体检测以及中药鉴别等分析领域。目前国内外尚未有人利用三维荧光分析技术来检测鱼毒性赤潮藻溶血毒素活性的大小。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测藻类溶血毒素活性的方法。

本发明的另一目的在于提供所述检测藻类溶血毒素活性的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测藻类溶血毒素活性的方法，包含以下步骤：

(1)通过荧光分光光度计测定藻细胞样品的三维荧光，激发波长为400～600nm，发射波长为650～750nm，得到藻细胞样品的三维荧光数据；

(2)将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；

(3)在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm出现与藻类的溶血活性强弱一致的荧光强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻；若在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm没有出现荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为非鱼毒性赤潮藻；

(4)将步骤(2)得到的荧光特征谱进行Fisher判别，Fisher判别函数方程为：

y₁＝-1.706-105.508x₁+6.273x₂+93.118x₃-4.311x₄+16.307x₅-9.476x₆-0.173x₇+3.866x₈+10.436x₉-6.751x₁₀-6.511x₁₁+94.690x₁₂-104.538x₁₃；

y₂＝0.963-112.478x₁-51.634x₂+62.196x₃+76.226x₄+15.826x₅-8.457x₆+4.273x₇+8.653x₈+5.382x₉+0.038x₁₀+45.365x₁₁-4.937x₁₂-33.386x₁₃；

其中x为自变量值，即步骤(2)测得的特征荧光谱的荧光强度；y为测得的溶血活性数值；

当检测样品时，分别计算y₁和y₂值，取大者为其y，根据以下标准判定藻细胞样品毒性的大小：y＝10～20HU为中毒性；y＜10HU为弱毒性；y＞20HU为强毒性。

步骤(1)中所述的发射波长优选为650～680nm或725～750nm；

步骤(2)所述的三维荧光数据首先通过Matlab6.5软件消除瑞利散射、最大归一化以及Coif2小波分析，再利用SPSS13.0进行Fisher判别，最后通过Origin8.0制图，得到荧光特征谱。

步骤(4)所述的Fisher判别优选通过SPSS13.0进行；

所述检测藻类溶血毒素活性的方法在海洋赤潮水体毒性检测中应用；

所述的藻类优选为鱼毒性赤潮藻，更优选为海洋卡盾藻、卵圆卡盾藻或米氏凯伦藻中的至少一种。

本发明的原理：藻类溶血毒素主要成分为糖脂类和多不饱和脂肪酸类，而这些物质的合成直接与光合作用有关，叶绿素荧光可以全面反映光合作用全过程，本发明以光合作用为中心点，把糖脂类的合成与藻类的叶绿素荧光变化联系起来。通过藻类活体荧光特征的识别，可以判定糖脂类物质的变化，从而确定该藻类细胞的溶血活性大小。本发明首先通过传统的洋地黄皂甙溶血活性测定方法分别测定不同溶血性的鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻的溶血毒素，再将之与鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻的三维荧光进行分析，最终确定三维荧光数据的处理过程，从而与传统的洋地黄皂甙溶血活性测定方法得到的数据对应。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明成功解决了传统检测方法时间滞后的难题，在我国实属首创。本发明改变传统检测方法时间滞后、被动的窘境，现场的操作性强，化解和减少因赤潮毒素对养殖业带来的巨大的经济损失，促进海产品安全体系的建立。

附图说明

图1是鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻的Fisher判别图。

图2是鱼毒性赤潮藻溶血活性高低的Fisher判别图。

图3是卵圆卡盾藻小波分解后的荧光特征谱图；

其中，a表示培养液中铁浓度为1×10^-5mol/L；b表示培养液中铁浓度为0.5×10^-8mol/L；c表示培养液中铁浓度为1×10^-7mol/L；d表示培养液中铁浓度为2×10^-5mol/L。

图4是海洋卡盾藻(香港株)小波分解后的荧光特征谱图；

其中，a表示培养液中铁浓度为1×10^-5mol/L；b表示培养液中铁浓度为0.5×10^-8mol/L；c表示培养液中铁浓度为1×10^-7mol/L；d表示培养液中铁浓度为2×10^-5mol/L。

图5是海洋卡盾藻(日本株)小波分解后的荧光特征谱图；

其中，a表示培养液中铁浓度为1×10^-5mol/L；b表示培养液中铁浓度为0.5×10^-8mol/L；c表示培养液中铁浓度为1×10^-7mol/L；d表示培养液中铁浓度为2×10^-5mol/L。

图6是米氏凯伦藻小波分解后的荧光特征谱图；

其中，a表示培养液中铁浓度为1×10^-5mol/L；b表示培养液中铁浓度为0.5×10^-8mol/L；c表示培养液中铁浓度为1×10^-7mol/L；d表示培养液中铁浓度为2×10^-5mol/L。

图7是东海原甲藻小波分解后的荧光特征谱图；

其中，a表示培养液中铁浓度为1×10^-5mol/L；b表示培养液中铁浓度为0.5×10^-8mol/L；c表示培养液中铁浓度为1×10^-7mol/L；d表示培养液中铁浓度为2×10^-5mol/L。

图8是锥状斯氏藻小波分解后的荧光特征谱图；

其中，a表示培养液中铁浓度为1×10^-5mol/L；b表示培养液中铁浓度为0.5×10^-8mol/L；c表示培养液中铁浓度为1×10^-7mol/L；d表示培养液中铁浓度为2×10^-5mol/L。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)分别培养海洋卡盾藻香港株(已在“海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离”公开)、海洋卡盾藻日本株(已在“海洋卡盾藻日本株过氧化氢产生的影响因素”公开)、卵圆卡盾藻(已在“五种赤潮藻单克隆抗体的制备”公开)、米氏凯伦藻(已在“米氏凯伦藻溶血毒素的溶血反应特征”公开)、东海原甲藻(已在“混合培养条件下几种赤潮藻对无机氮源的竞争生长研究”公开)和锥状斯氏藻(已在“多氯联苯对2种微藻的急性毒性研究”公开)。以上藻类均来自暨南大学赤潮与水环境研究中心。

①培养基的制备：先将自然海水用0.45μm微孔滤膜过滤，收集1.2L滤液于2L锥形瓶中，121℃、15psi下灭菌25min，冷却到室温，然后加入f/2培养液改良配方(如表1所示)，根据下表得到的培养基铁离子浓度为1×10^-5mol/L。由于铁离子的浓度影响藻的溶血活性，因此，再分别制备得到铁离子浓度为0.5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L和2×10^-5mol/L的培养基。使用不同铁离子浓度的培养基分别培养藻类。

表1  f/2培养基

表2  f/2微量元素储备液

表3  f/2维生素储备液

②培养条件：取对数生长末期的藻类，用0.1mL浮游植物计数框进行藻细胞计数并计算细胞浓度，接种在步骤①得到的培养基中，初始浓度为约2000个细胞/ml，置于人工气候箱中培养18天，培养温度25℃，光照强度为500μmol m^-2s^-1，光暗循环为L∶D＝12∶12。

(2)提取溶血毒素以及测定：取不同培养阶段【对数期(培养第8～12天)、稳定期(培养第13～14天)以及衰亡期】的藻细胞，按如下方法抽提溶血毒素：藻液经3000×g离心10min后收集藻细胞(尽量吸干水分)，用甲醇(甲醇用量为藻液体积的1/1000)重新悬浮藻细胞，冰浴条件下超声波细胞破碎(破碎条件：开2s，关1s，共10min，超声频率20KHz)获得藻细胞破碎液。将细胞破碎液通过循环水式多用途真空泵和旋转蒸发仪，真空干燥成固体状后溶解于适量的甲醇中(甲醇体积用量为藻液体积的1/1000)，然后10000g离心10min，上清即为甲醇提取的粗溶血毒素溶液，4℃下贮存备用。

采用的洋地黄皂甙(digitonin)溶血活性测定方法。洋地黄皂甙作为溶血毒素的标准物测定藻细胞中的溶血毒素活性。配制5.2μg/ml的标准洋地黄皂甙水溶液，如表4所示，向8个试管中加入柠檬酸等渗盐溶液(氯化钠1.706g，柠檬酸钠4.336g，葡萄糖9.036g用蒸馏水溶解，柠檬酸调pH至7.0，定容至500ml)、体积百分比0.5％的兔血红细胞溶液以及洋地黄皂甙水溶液，使6个试管中的洋地黄皂甙的浓度分别为0.52，0.78，1.04，1.3，1.56，1.82μg/ml。

表4溶血活性标准曲线梯度配制表

将各5mL实验体系于37℃水浴30min后，2000×g离心5min，上清液用Shimadzu UV-1206型分光光度计在波长540nm处测定其吸光度值，即溶血透光度。每个浓度3个平行，以甲醇溶液为负对照，以全溶血溶液为正对照。以洋地黄皂甙水溶液的终浓度为横坐标，以其溶血百分数为纵坐标作图，得到标准曲线。1个溶血单位(1HU)是指在5ml上述实验体系中(含溶血毒素、兔血红细胞溶液和等渗盐溶液的混合溶液)使兔血红细胞溶解50％所需溶血毒素的剂量浓度。

向离心管中加入4ml体积百分比0.5％的兔血红细胞溶液、0.75ml柠檬酸等渗盐缓冲液，然后加入甲醇提取的粗溶血毒素溶液0.25ml至5ml实验体系，于37℃水浴30min，离心取上清液用Shimadzu UV-1206型分光光度计检测其吸光度值OD540nm。每个浓度3个平行，以甲醇溶液为负对照，以全溶血溶液为正对照。根据洋地黄皂甙的标准曲线，换算其溶血百分数。该溶血毒素的溶血活性按照每个藻细胞的溶血活性(HU/cell)和每升培养液的溶血活性(HU/L)计算。

溶血活性的计算方程为：

$\mathrm{HU}=\frac{\frac{A_w-A_b}{A_c}\×100-b}{a\×{\mathrm{EC}}_{50}}\×40\×n$

HU------溶血活性，单位为(HU/L)；

A_w--------样品溶血后所测得的吸光值；

A_b--------空白对照的吸光值；

A_c--------全溶血的吸光值；

EC₅₀-----当溶血百分比为50％时的洋地黄皂苷浓度；

a---------标准曲线的斜率；

b---------标准曲线的截距；

n---------稀释倍数。

同一个样品三个平行样检测时，相对标准偏差为10％。

(3)藻细胞的荧光测定：

扫描仪器为F4600荧光分光光度计(日立公司Hitachi)，在测藻细胞溶血毒素的同时，检测藻类的三维荧光(分析条件：激发和发射狭缝为10nm，扫描速度30000nm/s；激发波长的扫描范围为400～600nm，扫描间隔为5nm；发射波长的扫描范围为650～750nm扫描间隔为5nm)。为抑制噪音干扰，每个样平行测定三次，取平均值作为该样品的荧光光谱。

数据分析利用Matlab6.5，Spss13.0及Origin8.0。首先将仪器扫描所得的三维荧光光谱转换成TXT文件数据格式，每个三维光谱由一个21行11列的二维矩阵表示。根据Delaunay三角形方法，通过Matlab6.5软件消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射。将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱。结果显示卵圆卡盾藻的荧光光谱强度变化主要集中在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm(如图3所示，横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度，其中1～40数据点代表发射波长650～750nm，41～79数据点代表激发波长400～600nm)；海洋卡盾藻香港株的荧光光谱强度变化主要集中在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm(如图4所示，横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度，其中1～40数据点代表发射波长650～750nm，41～79数据点代表激发波长400～600nm)；海洋卡盾藻日本株的荧光光谱变化主要集中在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm(如图5所示)；米氏凯伦藻的荧光光谱变化主要集中在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm(图6)；而对照组东海原甲藻，锥状斯氏藻则在上述波长范围内荧光强度无明显变化(图7和8)。由于铁离子是影响藻类溶血毒性活性的重要因子，本发明通过调整培养基中的铁离子浓度，培养鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻，发现前者的荧光特征谱在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm变化明显，而后者无明显变化。因此，从荧光特征谱进行区分鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻是可靠的。

(4)通过上述步骤(3)得到的荧光谱特征值，利用FISHER判别分析法把鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻区分出来(图1，横坐标为判别函数1，纵坐标为判别函数2)，具体计算方法如下：

首先，根据表5的典则判别函数系数得到如下的函数公式：

表5 典型判别式函数系数

非标准化系数

y₁＝-6.35-247.752x₁+71.871x₂+139.297x₃+44.211x₄+11.678x₅+7.322x₆-19.408x₇-52.18x₈；

y₂＝-4.733+155.171x₁-35.695x₂-138.431x₃+60.28x₄+111.27x₅-70.966x₆-46.78x₇-20.617x₈；

y₃＝-2.821-42.363x₁+19.397x₂-56.882x₃-0.605x₄-31.363x₅-3.167x₆+41.253x₇-5.513x₈

y₄＝-8.025-2.072x₁+26.978x₂-34.63x₃+13.372x₄+4.338x₅-2.756x₆-15.027x₇+64.350x₈

y₅＝-15.188+138.214x₁-4.066x₂-142.722x₃-21.099x₄-26.746x₅+23.284x₆+16.867x₇-15.295x₈；

以上五个函数式计算的是各观测值在各个维度上的坐标，通过这五个函数式计算出单个样品观测值的具体空间位置。表6为各类别藻类重心在空间中的坐标位置(e中的1、2、3、4、5、6指的是组别质心处的函数系数个数，函数1、2、3、4、5与上述5个函数相对应，这里的函数系数决定了每个得到的y值到组别质心处的距离)。这样，只要计算出各观测值的具体坐标位置后，再计算出它们分别离各重心的距离，从图1可知，鱼毒性赤潮藻集中在一起。

表6组别质心处的函数

在组别均值处评估的非标准化典型判别式函数

(5)根据藻类的三维荧光数据判断藻细胞溶血性活性大小：步骤(2)测得的溶血毒素值分为三个范围，分别是：＞10HU、10HU～20HU和＜20HU。根据步骤(3)得到的各范围的荧光特征值，利用判别分析法区分溶血毒素的溶血活性大小(图2)。具体操作过程如下：根据表7的典则判别函数系数得到如下的函数公式：

表7

非标准化系数

两个Fisher判别函数分别为：

y₁＝-1.706-105.508x₁+6.273x₂+93.118x₃-4.311x₄+16.307x₅-9.476x₆-0.173x₇+3.866x₈+10.436x₉-6.751x₁₀-6.511x₁₁+94.690x₁₂-104.538x₁₃

y₂＝0.963-112.478x₁-51.634x₂+62.196x₃+76.226x₄+15.826x₅-8.457x₆+4.273x₇+8.653x₈+5.382x₉+0.038x₁₀+45.365x₁₁-4.937x₁₂-33.386x₁₃

得到的y1和y2值的单位为HU。

表8组别质心处的函数

在组别均值处评估的非标准化典型判别式函数

以上两个函数式计算的是各观测值在各个维度上的坐标，通过这两个函数式计算出各样品观测值的具体空间位置。表8为各类别藻类重心在空间中的坐标位置(e中的1、2、3分别是指的是组别质心处的函数系数个数，函数1、2与上述2个函数相对应，这里的函数系数决定了每个得到的y值到组质心处的距离)只要计算出各观测值的具体坐标位置后，再计算出它们分别离各重心的距离，从图2可知，溶血毒素的溶血活性＞20HU基本位于函数1数值-1左边，溶血活性为10～20HU基本位于函数1数值范围-1～+1之间。

将各样品的自变量值(荧光特征图谱数据)代入上述判别函数，得到函数值。比较函数值y1和y2，取值大者作为判断该样品类别的依据(表9)。

表9分类结果^b

b.已对初始分组案例中的83.3％个进行了正确分类。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)通过荧光分光光度计测定藻细胞样品的三维荧光，激发波长为400～600nm，发射波长为650～750nm，得到藻细胞样品的三维荧光数据；

(2)将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；

(3)在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm出现与藻类的溶血活性强弱一致的荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻；若在波长λEm＝650～700nm，波长λEm＝725～750nm，波长λEx＝400～425nm没有出现荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为非鱼毒性赤潮藻；

(4)将步骤(2)得到的荧光特征谱进行Fisher判别，Fisher判别函数方程为：

y₁＝-1.706-105.508x₁+6.273x₂+93.118x₃-4.311x₄+16.307x₅-9.476x₆-0.173x₇+3.866x₈+10.436x₉-6.751x₁₀-6.511x₁₁+94.690x₁₂-104.538x₁₃；

y₂＝0.963-112.478x₁-51.634x₂+62.196x₃+76.226x₄+15.826x₅-8.457x₆+4.273x₇+8.653x₈+5.382x₉+0.038x₁₀+45.365x₁₁-4.937x₁₂-33.386x₁₃；

其中x为自变量值，即步骤(2)测得的特征荧光谱的荧光强度；y为测得的溶血活性数值；

当检测样品时，分别计算y₁和y₂值，取大者为其y，根据以下标准判定藻细胞样品毒性的大小：y＝10～20HU为中毒性；y＜10HU为弱毒性；y＞20HU为强毒性。

2.根据权利要求1所述的检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的发射波长为650～680nm或725～750nm。

3.根据权利要求1所述的检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于：步骤(2)所述的三维荧光数据首先通过Matlab6.5软件消除瑞利散射、最大归一化以及Coif2小波分析，再通过SPSS13.0进行Fisher判别，最后通过Origin8.0制图，得到荧光特征谱。

4.根据权利要求1所述的检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于：步骤(4)所述的Fisher判别通过SPSS13.0进行。

5.权利要求1～4任一项所述的检测藻类溶血毒素活性的方法在赤潮水体鱼毒性的检测中应用。

6.根据权利要求5所述的检测藻类溶血毒素活性的方法在赤潮水体鱼毒性的检测中应用，其特征在于：所述的藻类为鱼毒性赤潮藻。

7.根据权利要求6所述的检测藻类溶血毒素活性的方法在赤潮水体鱼毒性的检测中应用，其特征在于：所述的鱼毒性赤潮藻为海洋卡盾藻、卵圆卡盾藻或米氏凯伦藻中的至少一种。

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