CN105548429B - 一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：将水产饲料作为检测样品，进行干燥、粉碎、萃取、离心后，提取上层清液过滤制得待测样品；将待测样品配制成浓度为50～200μg/L的待测液后，使用高效液相色谱‑冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测。本发明方法建立了高效液相色谱‑冷蒸汽发生原子荧光系统测定水产饲料样品中砷形态的检测方法，水产饲料样品经干燥、粉碎、萃取等步骤处理后，直接注入高效液相色谱‑冷蒸汽发生原子荧光系统进行分析，该方法不仅简单、快速，而且绿色、环境友好、准确、灵敏、抗干扰能力突出，尤其适用于淡水鱼饲料样品中痕量砷的形态分析。
Description
技术领域
本发明是一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，具体涉及水产饲料中无机砷和有机砷形态的分析和检测技术，属于水产饲料的检测技术领域。
背景技术
自1980年国际癌症机构将砷确定为致癌因子以来，到目前为止，砷已成为人们广泛关注的污染物之一。我们知道，砷是自然界广泛存在的一种元素，在地壳中自然丰度列位20（大约是 3 mg/kg），在海水中列位 14，人体中列位 12。水环境中的砷主要来源于土壤沉积物，地表径流，火山活动产生的岩浆，以及含砷海洋生物的堆积。土壤中的砷主要来源于在农业和医药业大量长期使用的含砷杀虫剂、除草剂中以及矿物开采等滞留于土壤中。此外砷的化合物还存在于防腐剂、玻璃仪器制造、催化剂、食品添加剂和兽药等中。食物或水中微量的无机砷进入生物体之后，能与带巯基（SH）的酶生成稳定的螯合物，产生酶活性阻碍，使得很多的酶活性降低或消失，严重干扰细胞的生物功能、结构和正常代谢，从而引发了很多病变。
自然界中砷的主要化合物有亚砷酸盐 As(Ⅲ)，砷酸盐 As(Ⅴ)，一甲基砷酸 MMA，二甲基砷酸 DMA，砷甜菜碱 AsB 和砷胆碱AsC。然而，砷的毒性与其形态密切相关，一般而言，无机砷的毒性远大于有机砷。As(Ⅲ)的毒性比 As(Ⅴ)的毒性高10倍，比一甲基砷酸MMA和二甲基砷酸 DMA高 70 倍。而 AsB 和 AsC 等大分子的有机砷化合物则基本无毒[54]。因此，砷的形态分析研究有着重要的现实意义。
现有专利文献CN101261258B（水产品中无机砷的测定方法，2011.02.18）揭示了一种使用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用对水产品如海藻类样品中砷的形态分析和研究，能准确测定水产品种有剧毒的无机砷：砷酸盐As(Ⅴ)、亚硝酸盐As(Ⅲ)，准确测定其有低毒的MMA和DMA，从而给出更为准确可靠的生物学特性。该专利文献公开了As(Ⅴ)的最低检测限为2.2ng/ml，As(Ⅲ)的最低检测限为0.6 ng/ml，MMA的最低检测限为0.9 ng/ml，DMA的最低检测限为1.0 ng/ml。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，本方法建立了高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统测定水产饲料样品中砷形态的检测方法，水产饲料样品经干燥、粉碎、萃取等步骤处理后，直接注入高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行分析，该方法不仅简单、快速，而且绿色、环境友好、准确、灵敏、抗干扰能力突出，尤其适用于淡水鱼饲料样品中痕量砷的形态分析。
本发明通过下述技术方案实现：一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，进行干燥、粉碎、萃取、离心后，提取上层清液过滤制得待测样品；
B、将待测样品配制成浓度为50～120μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：50～150μL，
流动相：10～20mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：0.8～1.2mL/min，
载气：Ar，
还原剂：质量体积比为1.5～2.5% 的KBH4和0.2～0.5%的NaOH，
载流液：体积比为5～10% 的HCl。
本发明适用于谈水鱼饲料样品中痕量砷的形态分析，能同时检测出饲料样品中三价砷As(III)、二甲基砷DMA、一甲基砷MMA和五价砷As(V)的含量，其中，As(III)的检出限可达到0.02 mg/ kg，DMA的检出限可达到0.16mg/ kg，MMA的检出限可达到0.32 mg/ kg，As(V)的检出限可达到0.16mg/ kg。
在步骤B中，所述高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统的检测条件还满足：空心阴极灯灯电流控制在80～120mA，光电倍增管负高压控制在260～300V，上述参数的控制能保证荧光信号具有最大的信噪比，提高检测限度。
在步骤B中，所述载气的流量控制在300～500mL/ min。上述参数的控制能保证氩氢火焰的稳定性，提高荧光测试强度。
在步骤B中，所述还原剂的流速控制在2.0～2.5mL/ min。上述参数的控制能提高氢化物发生效率，提高测试稳定性。
在步骤B中，所述载流液的流速控制在3.0～5.0mL/ min。上述参数的控制能提高氢化物发生效率，提高测试稳定性。
在步骤A中，所述检测样品在50～70℃下，干燥24～48h后，用粉碎机制成200～300目的粉末。干燥的作用是去除样品的水分，防止As形态之间的相互转化，粉碎的作用是能使得样品更加均匀，检测结果更具代表性。
在步骤A中，所述的萃取过程包括：使用超纯水作为萃取剂，将检测样品粉末置于超声仪中提取20～60min后，获得萃取样品。本发明使用超纯水作为萃取剂，其萃取效果最佳，且绿色。
所述超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为（25～50）：1。上述比例的控制能更好的使样品中的As形态从固相萃取至水相，提高As的富集效果，提高检测灵敏度。
在步骤A中，所述的离心过程包括：使用高速离心机，在8000～12000rpm的转速下离心5～15min。离心能加快固相与液相的分离要求，缩短样品处理时间。
在步骤A中，所述的过滤过程包括：提取离心后检测样品的上层清液，用0.22～0.45μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在2～5℃下避光保存待测样品。过滤能除去样品中的杂质，提高检测灵敏度，避光保存能防止As形态在保存过程中出现形态之间的转化，提高检测结果的准确性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明方法是同时检测水产饲料中无机砷“As(III)、As(V)”和有机砷“DMA、MMA”的分析方法，由饲料样品的预处理步骤和高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统的检测构成一个完整、连续的检测分析方法，该方法适用于淡水鱼、虾、蟹等水产饲料中砷的形态分析，弥补了现有淡水饲养环境中饲料产品对生物体病变影响的研究缺陷，并为现有的淡水饲养提出了可行性的指导。
（2）本发明方法可实现水产饲料中砷的检出限满足：As(III)达到0.02 mg/ kg，DMA达到0.16mg/ kg，MMA达到0.32 mg/ kg，As(V)达到0.16mg/ kg。
（3）本发明方法中，饲料样品的预处理过程为提高本方法的准确度和灵敏度提供了重要的前提保障，预处理过程中各步骤相互配合，在正确选择合理参数的情况下，才能使得饲料样品中的As形态的富集效果更好，避免As形态的转变，具有重现性好、灵敏度高、线性范围大，萃取效率高，方法绿色，环境友好等效果，同时，为高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统的测定做好准备。
（4）本发明方法使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统与饲料样品的预处理过程相配合，能更好的实现饲料样品中的As形态的分离，出峰时间短，检测快速，最短检测时间可达13min。
附图说明
图1不同萃取剂对水产饲料样品中砷形态的回收率影响示意图。
图2为不同萃取方式对水产饲料样品中砷形态的回收率影响示意图。
图3为本发明方法加标1.0 μg水产饲料中砷形态分析谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，进行干燥、粉碎、萃取、离心后，提取上层清液过滤制得待测样品；
B、将待测样品配制成浓度为50μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：50μL，
流动相：10mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：0.8mL/min，
载气：Ar，
还原剂：质量体积比为1.5% 的KBH4和0.2%的NaOH，
载流液：体积比为5% 的HCl。
实施例2：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，进行干燥、粉碎、萃取、离心后，提取上层清液过滤制得待测样品；
B、将待测样品配制成浓度为200μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：150μL，
流动相：20mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：1.2mL/min，
载气：Ar，
还原剂：质量体积比为2.5% 的KBH4和0.5%的NaOH，
载流液：体积比为10% 的HCl。
实施例3：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例1的基础上提出了：在步骤B中，高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统的检测条件还满足：空心阴极灯灯电流控制在80mA，光电倍增管负高压控制在260V。
实施例4：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例2的基础上提出了：在步骤B中，高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统的检测条件还满足：空心阴极灯灯电流控制在120mA，光电倍增管负高压控制在300V。
实施例5：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例3的基础上提出了：在步骤B中，载气的流量控制在300mL/ min，还原剂的流速控制在2.0mL/ min，载流液的流速控制在3.0mL/ min。
实施例6：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例4的基础上提出了：在步骤B中，载气的流量控制在500mL/ min，还原剂的流速控制在2.5mL/ min，载流液的流速控制在5.0mL/ min。
实施例7：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例5的基础上提出了：在步骤A中，检测样品在50℃下，干燥24h后，用粉碎机制成200目的粉末，然后进行萃取，萃取过程包括：使用超纯水作为萃取剂，将检测样品粉末置于超声仪中提取20min后，获得萃取样品。
实施例8：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例6的基础上提出了：在步骤A中，检测样品在70℃下，干燥48h后，用粉碎机制成300目的粉末，然后进行萃取，萃取过程包括：使用超纯水作为萃取剂，将检测样品粉末置于超声仪中提取60min后，获得萃取样品。
实施例9：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例7的基础上提出了：超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为25：1。
实施例10：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例8的基础上提出了：超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为50：1。
实施例11：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例9的基础上提出了：在步骤A中，离心过程包括：使用高速离心机，在8000rpm的转速下离心5min，过滤过程包括：提取离心后检测样品的上层清液，用0.22μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在2℃下避光保存待测样品。
实施例12：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，该检测方法在实施例10的基础上提出了：在步骤A中，离心过程包括：使用高速离心机，在12000rpm的转速下离心15min，过滤过程包括：提取离心后检测样品的上层清液，用0.45μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在5℃下避光保存待测样品。
实施例13：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，检测样品在60℃下，干燥36h后，用粉碎机制成250目的粉末，然后使用超纯水作为萃取剂进行萃取，将检测样品粉末置于超声仪中提取30min后，获得萃取样品，使用高速离心机，将萃取样品在10000rpm的转速下离心10min，然后提取离心后检测样品的上层清液，用0.4μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在3℃下避光保存待测样品，其中，超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为30：1。
B、将待测样品配制成浓度为100μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：100μL，
流动相：15mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：1.0mL/min，
载气：Ar，流量控制在400mL/ min，
还原剂：质量体积比为2% 的KBH4和0.5%的NaOH，流速控制在2.3mL/ min，
载流液：体积比为7% 的HCl，流速控制在4.0mL/ min。
空心阴极灯灯电流控制在110mA，
光电倍增管负高压控制在280V。
实施例14：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，检测样品在65℃下，干燥33h后，用粉碎机制成300目的粉末，然后使用超纯水作为萃取剂进行萃取，将检测样品粉末置于超声仪中提取30min后，获得萃取样品，使用高速离心机，将萃取样品在10000rpm的转速下离心12min，然后提取离心后检测样品的上层清液，用0.36μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在4℃下避光保存待测样品，其中，超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为40：1。
B、将待测样品配制成浓度为80μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：120μL，
流动相：15mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：1.0mL/min，
载气：Ar，流量控制在400mL/ min，
还原剂：质量体积比为2% 的KBH4和0.5%的NaOH，流速控制在2.2mL/ min，
载流液：体积比为7% 的HCl，流速控制在3.6mL/ min。
空心阴极灯灯电流控制在100mA，
光电倍增管负高压控制在285V。
实施例15：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，检测样品在60℃下，干燥24h后，用粉碎机制成300目的粉末，然后使用超纯水作为萃取剂进行萃取，将检测样品粉末置于超声仪中提取30min后，获得萃取样品，使用高速离心机，将萃取样品在10000rpm的转速下离心5min，然后提取离心后检测样品的上层清液，用0.22μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在4℃下避光保存待测样品，其中，超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为28：1。
B、将待测样品配制成浓度为100μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：100μL，
流动相：15mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：1.0mL/min，
载气：Ar，流量控制在400mL/ min，
还原剂：质量体积比为2% 的KBH4和0.5%的NaOH，流速控制在2.2mL/ min，
载流液：体积比为7% 的HCl，流速控制在4.0mL/ min。
空心阴极灯灯电流控制在100mA，
光电倍增管负高压控制在285V。
实施例16：
一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，检测样品在60℃下，干燥24h后，用粉碎机制成300目的粉末，然后使用超纯水作为萃取剂进行萃取，将检测样品粉末置于超声仪中提取30min后，获得萃取样品，使用高速离心机，将萃取样品在10000rpm的转速下离心5min，然后提取离心后检测样品的上层清液，用0.22μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在4℃下避光保存待测样品，其中，超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为25：1。
B、将待测样品配制成浓度为80μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：100μL，
流动相：15mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：1.0mL/min，
载气：Ar，流量控制在400mL/ min，
还原剂：质量体积比为2.0% 的KBH4和0.2%的NaOH，流速控制在2.0mL/ min，
载流液：体积比为7% 的HCl，流速控制在4.5mL/ min。
空心阴极灯灯电流控制在110mA，
光电倍增管负高压控制在280V。
为确定本发明检测方法的可靠性和准确性，围绕萃取剂、萃取方式、萃取时间、高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光（HPLC-CVAFS）的测定过程还做了如下论证试验：
1）萃取剂的种类对水产饲料中As(III)、DMA、MMA和As(V)萃取效果的影响，分别测定水、（1+1）甲醇、磷酸氢二铵三种萃取剂对萃取回收率的影响。每组实验平行测定3次。
其他实验参数：萃取剂的体积均为5 mL；磷酸氢二铵的量15 mmol/L；震荡萃取速率为3000 rpm，15 min；离心条件10000 rpm，5min；样品加标1.0μg。结果如图1所示。
实验结果表明，以上三种萃取剂均能萃取水产饲料样品中的As(III)、DMA、MMA和As(V)。其中，当水作为萃取剂时，其萃取效果最佳，且绿色。因此，本方法选用水（超纯水）为最佳萃取剂。
2）选择漩涡辅助震荡萃取和微波辅助萃取与超声波辅助萃取进行比较，测定不同萃取方式对萃取效果的影响。每组实验平行测定3次。
其他实验参数：萃取剂为水，5 mL；超声波辅助萃取时间20 min；微波辅助萃取，105℃，60 min；漩涡辅助震荡萃取条件，3000 rpm，15 min；离心条件10000 rpm，5 min；样品加标1.0 μg。结果如图2所示。
实验结果表明，以上三种萃取方式均能萃取水产饲料样品中的As(III)、DMA、MMA和As(V)。其中，以超声波辅助萃取效果最佳。因此，本发明检测方法选用超声波辅助萃取为最佳萃取方式。
3）不同萃取时间对水产饲料中砷形态萃取效果影响，通过实验分别考察不同萃取时间（1、5、10、20、30、60 min）对萃取效果的影响。每组实验平行测定3次。
其他实验参数：萃取剂为水，5 mL；离心条件10000 rpm，5min；样品加标1.0μg。结果表明，当萃取时间从1 min增加到20 min时，萃取效率随之升高；当萃取时间超过20 min时，萃取效率无明显变化。因此，本发明方法选择超声波辅助萃取时间为30 min为最佳。
4）HPLC-CVAFS测定方法的评价。
HPLC-CVAFS测定As(III)、DMA、MMA和As(V)的性能指标如表1所示。
表1 HPLC-CVAFS测定砷形态性能指标
在上述表1中，an=6、b峰面积、c浓度（μg /L）。
在优化条件下，任意选取上述实施例16所述的检测方法对通威股份某种水产饲料样品的加标样品中As(III)、DMA、MMA和As(V)进行分析，谱图如图3所示，加标量为1.0 μg。结果表明，各形态砷之间出峰时间间隔明显，无干扰效应，证明本方法的分离度好，无内源性杂质干扰，且出峰时间短，检测快速。
上述方法的主要性能指标见表2。以信噪比为3（S/N=3）计算方法检出限（LODs）。
表2 超声波辅助震荡-HPLC-CVAFS测定水产饲料中砷形态的性能参数
采用6个平行样品及高、中、低三个浓度水平的加标样品，考察方法的重现性和回收率，结果见表3。
表3超声波辅助萃取-HPLC-CVAFS法测定水产饲料中砷形态的精密度和准确度
在上述表1中，a 6个平行样品重复测定，b样品加标1.0μg ，c样品加标0.5 μg，d样品加标0.1μg。
由此可见，本方法重现性好、灵敏度高、线性范围较大，同时也证明了本方法不仅萃取效率高，并且方法绿色，环境友好。
任意选取上述实施例15所述的检测方法，对不同品种的水产饲料样品（如：样品I：池塘养殖鱼用配合饲料、样品II ：南美白对虾配合饲料、样品III：大闸蟹配合饲料）进行分析，结果见表4，结构表明，水产饲料样品中均未检出As(III)、DMA、MMA和As(V)。不同浓度水平的加标回收率效果令人满意。
表4 实际水产饲料样品中砷形态分析结果（n=3）
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、将水产饲料作为检测样品，进行干燥、粉碎、萃取、离心后，提取上层清液过滤制得待测样品；
B、将待测样品配制成浓度为50～200μg/L的待测液后，使用高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统进行检测，其检测条件满足：
进样量：50～150μL，
流动相：10～20mmol/L磷酸氢二铵，
流动相流速：0.8～1.2mL/min，
载气：Ar，
还原剂：质量体积比为1.5～2.5% 的KBH4和0.2～0.5%的NaOH，
载流液：体积比为5～10% 的HCl，
在步骤A中，所述检测样品在50～70℃下，干燥24～48h后，用粉碎机制成200～300目的粉末，
在步骤A中，所述的萃取过程包括：使用超纯水作为萃取剂，将检测样品粉末置于超声仪中提取20～60min后，获得萃取样品，所述超纯水的使用量与检测样品粉末的质量比为（25～50）：1，
在步骤A中，所述的离心过程包括：使用高速离心机，在8000～12000rpm的转速下离心5～15min，
在步骤A中，所述的过滤过程包括：提取离心后检测样品的上层清液，用0.22～0.45μm玻璃纤维膜过滤，滤液转移至密闭瓶内，在2～5℃下避光保存待测样品。
2.根据权利要求1所述的一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，其特征在于：在步骤B中，所述高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光系统的检测条件还满足：空心阴极灯灯电流控制在80～120mA，光电倍增管负高压控制在260～300V。
3.根据权利要求1所述的一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，其特征在于：在步骤B中，所述载气的流量控制在300～500mL/ min。
4.根据权利要求1所述的一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，其特征在于：在步骤B中，所述还原剂的流速控制在2.0～2.5mL/ min。
5.根据权利要求1所述的一种水产饲料中同时测定有机砷和无机砷的方法，其特征在于：在步骤B中，所述载流液的流速控制在3.0～5.0mL/ min。
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