CN101261258B - 水产品中无机砷的测定方法 - Google Patents

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Abstract

一种水产品中无机砷的测定方法，水产品中的无机砷用(1+1)的盐酸溶液提取后，通过阴离子交换色谱柱，由流动相将亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸盐As(V)依次洗脱，由于阴离子交换色谱柱对砷酸盐As(V)、亚砷酸盐As(III)、一甲基砷化合物MMA、二甲基砷化合物DMA和砷糖AsS的吸附能力不同，洗脱的溶液经过硼氢化钾还原剂和盐酸发生氢化反应，生成氢化物进入原子化器，与原子荧光联用进行分析测定；该实验条件选择合理，检测数据准确可靠，不受浸提时间和温度影响；本发明既能准确测无机砷iAs，同时也能测定有机砷一甲基砷化合物MMA和二甲基砷化合物DMA，可以应用于水产品中砷的形态测定。

Description

水产品中无机砷的测定方法
技术领域：
本发明属于水产品检测技术，是一种利用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用(HPLC-HGAFS)形态分析技术测定水产品中无机砷的方法。
背景技术：
当前，元素分析化学的一项前沿内容是对元素的不同形态进行定性和定量，而不仅仅是测定元素的总量，这主要是因为同一元素的不同形态可能具有完全不同的化学和毒理性质，砷是其中的一个典型元素。砷的主要形态有：砷酸盐As(V)、亚砷酸盐As(III)、一甲基砷化合物(MMA)、二甲基砷化合物(DMA)、三甲基砷的氧化物(TMAO)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)和砷糖(AsS)等，其中无机砷(iAs)[包括As(V)、As(III)]的毒性很高；而有机砷中仅有MMA和DMA有较小的毒性，其它有机形态大多无毒，所以无机砷的含量基本能够反映有毒砷的含量，这也是测量无机砷的卫生学基础。砷在水产品中的主要存在形式有5种：iAs(剧毒)、DMA(低毒)、MMA(低毒)、AsB(无毒)、AsC(无毒)、AsS(无毒)。
现行的检测方法“氢化物发生法”(GB/T5009.11-2003第一法)和“银盐法”(第二法)，在具体检测结果方面存在较大缺陷。我们研究发现：①氢化物原子荧光法，在测量砷糖(AsS)含量较高的海藻类样品时会出现误报，原因在于在前处理过程中，砷糖(AsS)降解成小分子有机砷--二甲基砷(DMA)，在氢化物原子荧光光度计上有响应值，使得测量结果显著偏高；②银盐法因受装置配套不完善、环境温度、锌粒大小不均匀、手工操作精密度较差的影响，导致平行样间误差较大。
无机砷是水产品质量检验中主要的安全卫生指标，是产品质量标准中重要的限制性指标之一，其含量测定在质量检测中具有重要的意义。2006年关于海藻食品中现国家卫生标准GB19643-2005《藻类制品卫生标准》中的限量指标和对国标GB/T5009.11-2003《食品中总砷和无机砷的检测方法》的争议，已经引起国内各方面广泛重视；目前国际上ISO和CAC标准中尚无测定水产中无机砷的方法标准。
发明内容：
本发明的目的是借助元素形态分析仪，使用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用(HPLC-HGAFS)形态分析技术，对其砷的不同形态进行定性和定量分析，准确测定水产品中有剧毒的无机砷：砷酸盐As(V)、亚砷酸盐As(III)，准确测定其有低毒的MMA和DMA，从而给出更为准确可靠的生物学特性。
本发明是按照以下操作方法完成的：
本发明为高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用(HPLC-HGAFS)形态分析方法，包括：1、选用的仪器及设备，2、配置试剂与标准溶液，3、进行测试步骤，4、实验所用的仪器条件，5、结果计算：
1.仪器及设备：HPLC-HGAFS联用系统；
(1)、HPLC部分，使用LC-10ATVP高压液相泵；配有100μL定量环的7725i六通进样阀；配有相同材质填料保护柱(25mm×2.3mm i.d，12-20μm)的PRP-X1 00(250mm×4.1mm i.d，10μm)阴离子交换柱：
(2)、原子荧光光谱仪；配有激发光源：高性能砷空心阴极灯；形态分析测量软件；(型号HGAFS-9130)；
(3)、水浴恒温振荡器(型号SHA-C)；
(4)、砂芯过滤器(型号SH/T0093)；
(5)、循环式真空泵(型号SHZ-D)；
(6)、酸度计(型号DELTA320)；
(7)、数控超声清洗器(型号KQ-600DE)；
(8)、水系微孔滤膜(0.45μm)；
(9)、氩气(纯度≥99.99％)：
2、配置试剂与标准溶液；
(1)、试剂；
a、①盐酸溶液(50％)：量取250mL浓盐酸，慢慢加入250mL水中，混匀；②盐酸溶液(7％)：量取280mL盐酸，慢慢加入3720mL水中，混匀：
b、氢氧化钾溶液(5g/L)：称取氢氧化钾5g溶于水中，并稀释至1000mL：
c、硼氢化钾溶液(15g/L)；称取硼氢化钾15g溶于1000mL氢氧化钾溶液(5g/L)中：
d、HPLC流动相为15mmol/L(NH4)2HPO4溶液，pH用10％甲酸调节至6，使用之前需经过0.45μm滤膜过滤并超声脱气：
所有的试剂均是分析纯或是优级纯，整个实验都使用超纯水；玻璃仪器使用前需经15％硝酸浸泡24h；
(2)、砷的混合标准溶液：
CH3AsO(ONa)2·6H2O(MMA)和Na2HAsO4·7H2OAs(v)从Sigma-Aldrich购得，(CH3)2AsO2H(DMA)从Acros购得，1000μg/mL的As(III)标准储备溶液从国家标准物质中心购得；
a、通过溶解相应量的MMA、DMA、As(V)得到100ppb/mL的各单标溶液；将As(III)也稀释至100ppb/mL(四种标液可在4℃冰箱存放备用)；
b、混合砷标准溶液稀释配制(临用时现配)：
将以上四种标液逐级稀释至100ng/mL混合标准溶液，再根据下表1配制：
表1
序号 浓度ng/mL 定容体积/mL 加入水体积/mL   加入10％HCl体积/mL   加入100ng/mL四种砷形态混合标准溶液的体积/mL
  1   5   10   7.0   2.5   0.5
  2   20   10   4.5   2.5   2.0
  3   50   10   2.5   2.5   5.0
  4   75   10   /   2.5   7.5
3、进行测试步骤：
取经粉碎过40目筛的水产品干样0.300g-3.000g于50mL具塞刻度试管中，加盐酸(50％)的溶液20mL混匀，或称取鲜样(需捣碎匀浆)2.000g-5.000g于50mL具塞刻度试管中，并用盐酸(50％)溶液定容至25mL，混匀；至70℃水浴摇床1h，使试样充分浸提；取出冷却定容至25ml，脱脂棉过滤；取0.2mL上清液加入10ml管中；加入3.4mLH2O；0.4mLH2O2混匀后在70℃度水浴放置20min，使As(III)氧化成As(V)；取出后用0.45微米的水系微孔滤膜过滤，上机测定无机砷值：
4、实验所用的仪器条件：
(1)、液相色谱条件(HPLC)：流动相15mmol/L(NH4)2HPO4(pH6.0)，流速1mL/min；进样体积100μL；辅阴极46mA；蠕动泵转速65rpm；
(2)、氢化物发生条件(HG)：还原剂成分：1.5％KBH4+0.5％KOH，流速：6.0mL/min；载流成分：7％HCl，流速：6.0mL/min；
(3)、原子荧光光谱条件(AFS)：灯高性能砷空心阴极灯，193.7nm；负高压285V；灯电流100mA；载气氩气，400mL/min；屏蔽气氩气，600mL/min；
5、结果计算：
(1)、定性：开机后按上述条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液；在上述液相色谱和原子荧光条件下用进样针吸取0.3-0.5mL，采用手动进样器进行测定，用峰高或峰面积外标法定量；在上述色谱条件下亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)依次保留时间约为2.599min、3.221min、5.075min、8.994min：
(2)、定量：待测样品中亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5％之内即认为该待测定物质；
结果计算与表述
用数据处理软件中的外标法，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，用外标校正，即可得到待测溶液中的亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)的浓度，按式(1)计算可得试样中待测物的含量：
X＝C×V×F/m×1000...............................................(1)
式中：
X-样品中待测物的含量，mg/kg；
C-待测液中无机砷的浓度，ng/mL；
m-称样量，g；
V-测定液体总体积，mL；
F-稀释倍数。
本发明与已有技术对比其特点是：
1、该实验条件选择合理，检测数据准确可靠，水产品中的无机砷用提取液提取后，通过阴离子交换色谱柱，由流动相将亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)依次洗脱，由于阴离子交换色谱柱对砷酸盐As(V)、亚砷酸盐As(III)、一甲基砷化合物(MMA)、二甲基砷化合物(DMA)和砷糖(AsS)的吸附能力不同，洗脱的溶液经过硼氢化钾还原剂和盐酸发生氢化反应，生成氢化物进入原子化器，与原子荧光联用进行分析测定。
2、本发明不受浸提时间和温度影响；选择用(50％)的盐酸溶液浸提能使大分子量砷糖(AsS)完全分解，这样不会对无机砷的积峰造成干扰；可以使砷提取完全。
3、本发明既能准确测无机砷(iAs)，同时也能测定有机砷(一甲基砷化合物(MMA)、二甲基砷化合物(DMA))。
附图说明：
图1：As形态标准分离谱图：
亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)的依次出峰顺序、保留时间和浓度梯度。
图2：海带试样在60℃水浴中浸提时间与砷形态变化图：
由该谱图可知：①试样经50％HCl提取后As形态发生了明显的改变，随着浸提时间的增加，砷糖(AsS1)降解转化为小分子有机砷--二甲基砷(DMA)的浓度远远高于无机砷(iAs)的浓度，甚至达到了几十倍的程度。②无机砷的峰形非常稳定，证明有机砷不会随浸提时间的增加而降解为无机砷。
图3：海带样品加As(III)标液氧化前后的梯度叠加谱图：
由谱图可知：未加H2O2氧化处理的试样在AS3+的保留时间有峰出现；加入H2O2氧化处理的试样在AS3+的保留时间未有峰出现，而在As5+的保留时间峰值增大，这说明As(III)被H2O2氧化成As(V)，这样就可以避开和一未知有机砷(AsS1)的出峰接近造成相互干扰。
图4、海带试样在70℃水浴中浸提时间与砷形态变化图：
它再次说明①试样经50％HCl提取后As形态发生了明显的改变，随着浸提时间的增加，砷糖(AsS1)降解转化为小分子有机砷--二甲基砷(DMA)的浓度远远高于无机砷(iAs)的浓度，甚至达到了几十倍的程度。②无机砷的峰形非常稳定，证明有机砷不会随浸提时间的增加而降解为无机砷。
具体实施方式：
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容：
水产品品种繁多，如贝类、鱼类、甲壳类、头足类以及各种藻类等；在其生长过程中对砷的富集作用和机理各不相同，其体内砷的含量和存在形式也相差很大，这给存在于不同生物体内和藻类中砷的测定提出了更高的要求，尤以藻类为甚。因此，我们选择水产品中最有代表性且争议最大的藻类作为验证的实施例。
本发明为高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用(HPLC-HGAFS)形态分析方法，包括：1、选用的仪器及设备，2、配置试剂与标准溶液，3、进行测试步骤，4、实验所用的仪器条件，5、结果计算。
实施例1：海带中无机砷的测定：
1.选用的仪器及设备：HPLC-HGAFS联用系统：
(1)、HPLC部分，使用LC-10ATVP高压液相泵；配有100μL定量环的7725i六通进样阀(Rheodyne，Cotati，CA，USA)；配有相同材质填料保护柱(25mm×2.3mm i.d，12-20μm)的PRP-X100(250mm×4.1mm i.d，10μm)阴离子交换柱(Hamilton，Reno，NV)；
(2)、AFS-9130原子荧光光谱仪；配有激发光源：高性能砷空心阴极灯；形态分析测量软件(北京吉天仪器有限公司)；
(3)、水浴恒温振荡器(上海和欣仪器仪表有限公司，型号SHA-C)；
(4)、砂芯过滤器(砂芯过滤装置、型号SH/T0093)；
(5)、循环式真空泵(循环式真空泵、型号SHZ-D)；
(6)、酸度计(梅特勒-托力多仪器上海有限公司，型号DELTA320)；
(7)、数控超声清洗器(昆山市超声仪器有些公司，型号KQ-600DE)；
(8)、水系微孔滤膜(0.45μm)；
(9)、氩气(纯度≥99.99％)。
2、配置试剂与标准溶液；
(1)、试剂；
a、①、盐酸溶液(50％)：量取250mL浓盐酸，慢慢加入250mL水中，混匀；②、盐酸溶液(7％)：量取280mL盐酸，慢慢加入3720mL水中，混匀。
b、氢氧化钾溶液(5g/L)：称取氢氧化钾5g溶于水中，并稀释至1000mL。
c、硼氢化钾溶液(15g/L)；称取硼氢化钾15g溶于1000mL氢氧化钾溶液(5g/L)中。
d、HPLC流动相为15mmol/L(NH4)2HPO4溶液，pH用10％甲酸调节至6，使用之前需经过0.45μm滤膜过滤并超声脱气。
所有的试剂均是分析纯或是优级纯，整个实验都使用超纯水；玻璃仪器使用前需经15％硝酸浸泡24h。
(2)、砷的混标标准溶液：
CH3AsO(ONa)2·6H2O(MMA)和Na2HAsO4·7H2OAs(V)从Sigma-Aldrich购得，(CH3)2AsO2H(DMA)从Acros购得，1000μg/mL的As(III)标准储备溶液从国家标准物质中心购得；
a、通过溶解相应量的MMA、DMA、As(V)得到100ng/ml的各单标溶液；
将As(III)也稀释至100ng/mL(四种标液可在4℃冰箱存放备用)；
b、混合砷标准溶液稀释配制(临用时现配)：
将以上四种标液逐级稀释至100ng/mL混合标准溶液，再根据下表1配制：
表1
序号 浓度/ppb 定容体积/mL 加入水体积/mL   加入10％HCl体积/mL   加入100ng/mL四种砷形态混合标准溶液的体积/mL
  1   5   10   7.0   2.5   0.5
  2   20   10   4.5   2.5   2.0
  3   50   10   2.5   2.5   5.0
  4   75   10   /   2.5   7.5
3、进行测试步骤：
取经粉碎过40目筛的干海带样品2.0000g左右于50mL具塞刻度试管中，加盐酸溶液(50％)20mL混匀，置70℃水浴恒温振荡器中1h，使试样充分浸提(见附图4)。取出冷却定容至25ml，脱脂棉过滤。取0.2mL上清液与10ml管中，加入3.4mLH2O，0.4mLH2O2混匀后置70℃度水浴20min，使As(III)被氧化成As(V)，(见附图3)。取出后用0.45微米的水系微孔滤膜过滤，取100μL上机测定无机砷值。
4、实验所用的仪器条件；
(1)、液相色谱条件(HPLC)：流动相15mmol/L(NH4)2HPO4(pH6.0)，流速1mL/min；进样体积100μL；辅阴极46mA；蠕动泵转速65rpm；
(2)、氢化物发生条件(HG)：还原剂成分：1.5％KBH4+0.5％KOH，流速：6.0mL/min；载流成分：7％HCl，流速：6.0mL/min；
(3)、原子荧光光谱条件(AFS)：灯高性能砷空心阴极灯，193.7nm；
负高压285V；灯电流100mA；载气氩气，400mL/min；屏蔽气氩气，600mL/min。
5、结果计算：
(1)、定性：开机后按上述条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液。在上述液相色谱和原子荧光条件下用进样针吸取0.3-0.5mL，采用手动进样器进行测定，用峰高或峰面积外标法定量。
在上述色谱条件下亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)依次保留时间约为2.599min、3.221min、5.075min、8.994min。标准溶液的图谱见附图1；配制(见表1)、混合砷标准溶液稀释配制；
(2)、定量：待测样品中亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5％之内即认为该待测定物质。
结果计算与表述：
用数据处理软件中的外标法，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，用外标校正，即可得到待测溶液中的亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)的浓度，按式(1)计算可得试样中待测物的含量：
X＝C×V×F/m×1000..............................(1)
式中：
X-样品中待测物的含量，mg/kg；
C-待测液中无机砷的浓度，ng/mL；
m-称样量，g；
V-测定液体总体积，mL；
F-稀释倍数。
6、结果与讨论：
表2、仪器的分析性能
  As(III)   DMA   MMA   As(V)
  线性范围(ng/ml)   1--100   1.0--100   0.7--100   2.0--100
  现行相关系数   ＞0.999
  最低检出限(ng/ml)   0.6   1.0   0.9   2.2
  RSD(％)   ＜5％
由表2可知：该仪器的分析性能完全符合测定四种砷形态要求；
表3、海带加标回收率的测定结果：
  测定元素   本底测定值ng/mL   加标浓度ng/mL   测定值ng/mL   回收率％   含量mg/Kg
  AS(III)   0.00   50   46.9   93.8   0
  DMA   13.754   50   57.50   87.3   3.8
  MMA   0.00   50   50.28   100.6   0
  As(V)   2.2255   50   51.16   97.9   0.54
由表3可知：我们加标的四种砷形态的回收率在87.3％--100.6％，回收效果非常理想。
为确保实验数据的准确可靠我们采取的措施有：①、样品粉碎过40目筛这样可使样品均匀，浸提完全(见表3)；②、对海带我们选用(50％)的盐酸溶液浸提它能使大分子量砷糖(AsS)完全分解，这样不会对无机砷的积峰造成干扰；可以使无机砷提取完全(见附图3和表3)；③、取0.2mL上清液与10ml管中，加3.4mLH2O，0.4mLH2O2混匀后置70℃度水浴20min，取0.2mL上清液是为了降低酸度保护色谱柱；加入0.4mLH2O2是使As(III)氧化成As(V)，因为在As(III)出峰时间附近有一个有机砷峰，这样可以避免干扰(见附图3和附图4)。
实施例2：对虾中无机砷的测定：
称取试样(需捣碎匀浆)3.0000g于50mL具塞刻度试管中，并加入10％盐酸溶液20mL，混匀。置70℃水浴恒温振荡器中1h，使试样充分浸提。取出冷却定容至25ml，脱脂棉过滤。取2mL上清液与10ml管中，加入1.6mLH2O，0.4mLH2O2混匀后置70℃度水浴20min，取出后用0.45微米的水系微孔滤膜过滤，上机测定无机砷值。其它条件均与海带的相同，其对虾加标回收率的测定结果(见表4)。
表4、对虾加标回收率的测定结果(以鲜基计)
  测定元素   本底测定值ng/mL   加标浓度ng/mL   测定值ng/mL   回收率％
  AS(III)   0.00   100   95.87   95.9
  DMA   11.6   100   95.87   84.2
  MMA     3.202     100     93.22     90.0
  As(V)     9.727     100     97.66     87.9
由表4可知：我们加标的四种砷形态的回收率在84.2％--95.9％，回收效果非常理想。
对对虾的前处理，我改用10％盐酸溶液浸提，是因为它的大分子量砷糖(AsS)较低，用10％的盐酸溶液浸提足可以使砷提取完全(见表4)。
综上所述，由表2可知：该仪器的分析性能完全符合测定四种砷形态要求，由表3和表4可知：我们加标的四种砷形态的回收率在84.2％--100.6％，回收效果非常理想。这得益于我们选用的仪器及仪器条件、试剂浓度、试样的前处理非常合理到位。该方法的亮点：水产品中的无机砷用提取液提取后，通过阴离子交换色谱柱，由于阴离子交换色谱柱对砷酸盐As(V)、亚砷酸盐As(III)、一甲基砷化合物(MMA)、二甲基砷化合物(DMA)和砷糖(AsS)的吸附能力不同，流动相将亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物(DMA)、一甲基砷化合物(MMA)、砷酸盐As(V)依次洗脱，洗脱的溶液经过硼氢化钾还原剂和盐酸发生氢化反应，生成氢化物进入原子化器，与原子荧光联用进行分析测定。
因此要想准确的测定水产品中的无机砷，必须使用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用(HPLC-HGAFS)形态分析方法。这种方法除了能准确测定中水产品的无机砷，还能准确测定其中的MMA和DMA，从而给出更为完整的生物学特性，特别是当前海藻中的无机砷(iAs)测量已引起多方纠纷的情况下，采用更为清晰、准确的HPLC-HGAFS联用形态分析法是最佳首选。我们目前正承担我国农业行业标准-海藻产品中无机砷的测定方法的制定，以填补国际上ISO和CAC标准中尚无测定水产中无机砷的方法标准这一空白。

Claims (1)

1.一种水产品中无机砷的测定方法，其特征在于它的方法为高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱HPLC-HGAFS联用形态分析方法，包括：(1)、选用的仪器及设备，(2)、配置试剂与标准溶液，(3)、进行测试步骤，(4)、实验所用的仪器条件，(5)、结果计算；
(1)、仪器及设备：HPLC-HGAFS联用系统：
1)、HPLC部分，使用LC-10ATVP高压液相泵；配有100μL定量环的7725i六通进样阀；配有相同材质填料保护柱25mm×2.3mm i.d，12-20μm的PRP-X100，250mm×4.1mm i.d，10μm阴离子交换柱；
2)、HGAFS-9130原子荧光光谱仪；配有激发光源：高性能砷空心阴极灯；形态分析测量软件；
3)、SHA-C水浴恒温振荡器；
4)、SH/T0093砂芯过滤器；
5)、SHZ-D循环式真空泵；
6)、DELTA 320酸度计；
7)、KQ-600DE数控超声清洗器；
8)、0.45μm水系微孔滤膜；
9)、氩气：纯度≥99.99％；
(2)、配置试剂与标准溶液：
1)、试剂：
a、①、50％的盐酸溶液：量取250mL浓盐酸，慢慢加入250mL水中，混匀；②、7％的盐酸溶液：量取280mL盐酸，慢慢加入3720mL水中，混匀；
b、5g/L的氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾5g溶于水中，并稀释至1000mL；
c、15g/L的硼氢化钾溶液：取硼氢化钾15g溶于1000m L的5g/L氢氧化钾溶液中；
d、HPLC流动相为15mmol/L(NH4)2HPO4溶液，pH用10％甲酸调节至6，使用之前需经过0.45μm滤膜过滤并超声脱气；
所有的试剂均是分析纯或是优级纯，整个实验都使用超纯水；玻璃仪器使用前需经15％硝酸浸泡24h；
2)、砷的混合标准溶液：
CH3AsO(ONa)2·6H2O和Na2HAsO4·7H2OAs(v)，(CH3)2AsO2H，1000μg/mL的As(III)标准储备溶液；
a、通过溶解相应量的MMA、DMA、As(V)得到100ppb/mL的各单标溶液；将As(III)也稀释至100ppb/mL，以上四种标液可在4℃冰箱存放备用；
b、混合砷标准溶液稀释配制，临用时现配；
将以上四种标液逐级稀释至100ng/mL混合标准溶液，再根据下表1配制：
表1
Figure FSB00000396963100021
(3)、进行测试步骤：
取经粉碎过40目筛的水产品干样0.300g-3.000g于50mL具塞刻度试管中，加50％盐酸的溶液20mL混匀，或取捣碎匀浆鲜样2.000g-5.000g于50mL具塞刻度试管中，并用50％盐酸的溶液定容至25mL，混匀；至70℃水浴摇床1h，使试样充分浸提；取出冷却定容至25ml，脱脂棉过滤；取0.2mL上清液加入10ml管中，加入3.4mLH2O、0.4mLH2O2混匀后在70℃度水浴放置20min，使As(III)氧化成As(V)；取出后用0.45微米的水系微孔滤膜过滤，上机测定无机砷值；
(4)、实验所用的仪器条件：
1)、HPLC液相色谱条件：流动相为pH 6.0的15mmol/L(NH4)2HPO4，流速1mL/min；进样体积100μL；辅阴极46mA；蠕动泵转速65rpm；
2)、HG氢化物发生条件：还原剂成分：1.5％KBH4+0.5％KOH，流速：6.0mL/min；载流成分：7％HCl，流速：6.0mL/min；
3)、AFS原子荧光光谱条件：灯高性能砷空心阴极灯，193.7nm；负高压285V；灯电流100mA；载气氩气，400mL/min；屏蔽气氩气，600mL/min；
(5)、结果计算：
1)、定性：开机后按上述条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液；在上述液相色谱和原子荧光条件下用进样针吸取0.3-0.5mL，采用手动进样器进行测定，用峰高或峰面积外标法定量；在上述色谱条件下亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸盐As(V)依次保留时间约为2.599min、3.221min、5.075min、8.994min；
2)、定量：待测样品中亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸盐As(V)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5％之内即认为该待测定物质；
结果计算与表述：
用数据处理软件中的外标法，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，用外标校正，即可得到待测溶液中的亚砷酸盐As(III)、二甲基砷化合物DMA、一甲基砷化合物MMA、砷酸盐As(V)的浓度，按下面式(1)计算，可得试样中待测物的含量：
X＝C×V×F/m×1000...............(1)
式中：
X-样品中待测物的含量，mg/kg；
C-待测液中无机砷的浓度，ng/ml；
m-称样量，g；
V-测定液体总体积，mL；
F-稀释倍数。
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