CN116421633B - 一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法，涉及生物技术领域，流感病毒重组复合体纳米颗粒为基于生物正交修饰的流感病毒重组复合体纳米颗粒，具体制备方法为将流感病毒和乳酸氧化酶分别与2‑亚氨基硫烷盐酸盐试剂和磺基琥珀酰亚胺4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸盐反应，使二者分别被修饰上巯基与马来酰亚胺基团，随后将二者进行生物正交反应连接得到流感病毒复合体，然后将所得流感病毒复合体进行生物矿化，得到纳米颗粒。本发明制备的流感病毒提高了癌细胞的免疫原性与佐剂性，降低肿瘤复发率，增强肿瘤免疫治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
肿瘤免疫疗法旨在增强宿主免疫系统自然防御能力以预防甚至消除恶性细胞，彻底改变了癌症治疗理念。其中过继细胞转移(ACT)和免疫检查点抑制剂(ICIs)已经发展并在临床实践中显示出应用前景。然而，由于肿瘤的异质性，其治疗效果各不相同，只有很少癌症患者可以从中受益。尽管过去几年在抑制肿瘤生长等方面取得了进展，但是高突变型与高浸润型肿瘤患者在诊断后的肿瘤治疗无显著效果。因此，为了提高抗肿瘤免疫反应，迫切需要开发有效且安全的肿瘤疗法。
溶瘤病毒的出现为癌症治疗提供了新策略，它利用基因修饰的病毒进行治疗，通过刺激免疫系统活化抗原提呈细胞以增强全身抗肿瘤免疫力。常见的溶瘤病毒包括腺病毒，痘病毒和单纯疱疹病毒等，其中腺病毒作为载体包装有治疗基因，痘病毒和单纯疱疹病毒通过其病原体相关分子模式(PAMPs)与模式识别受体(PRR)结合开启抗原提呈细胞(APCs)相关信号通路引起免疫反应。然而，由于肿瘤微环境的复杂性和动态性，溶瘤病毒疗法仅在少部分肿瘤治疗中取得了效果，并且由于其具有基因改造程序复杂与强耐药性导致的免疫反应率低等缺陷，阻止了其进一步发展。以溶瘤病毒疗法为例的肿瘤免疫治疗绝大部分以宿主免疫系统为治疗重点，这会导致全身免疫反应被过度激活从而出现器官功能衰竭等副作用，并且依然没有改变肿瘤细胞免疫原性低的特点。因此，设计针对肿瘤细胞的免疫治疗策略以提高病毒疗法治疗效率至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法，本发明将修饰上巯基的流感病毒(WSN)和修饰上马来酰亚胺基团的乳酸氧化酶(LOD)进行生物正交反应连接得到流感病毒复合体，然后将所得流感病毒复合体进行生物矿化，得到流感病毒重组复合体纳米颗粒[(WSN-LOD)@CaCO3]，降低了肿瘤复发率，增强了肿瘤免疫治疗效果。
为了实现上述目的，本发明提供了一种流感病毒重组复合体纳米颗粒，所述流感病毒重组复合体纳米颗粒为基于生物正交修饰的流感病毒重组复合体纳米颗粒，所述基于生物正交修饰的流感病毒重组复合体纳米颗粒包括流感病毒和乳酸氧化酶。
本发明提供了一种流感病毒重组复合体纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.将WSN与2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂在含有EDTA的缓冲液中混合均匀，反应一段时间；
S2.将乳酸氧化酶与磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐在含有EDTA的缓冲液中混合均匀，反应一段时间；
S3.将步骤S1和步骤S2的混合溶液分别转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中，透析一段时间；
S4.将步骤S3获得的样品混合搅拌一段时间，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD；
S5.配置CaCl2溶液，将配置好的CaCl2溶液逐滴加入步骤S4所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌一段时间；
S6.配置Na2CO3溶液，将配置好的Na2CO3溶液逐滴加入到步骤S5所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌一段时间；
S7.搅拌完成后离心，清洗，继续离心，然后重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
优选的，所述步骤S1中2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂的浓度为3-5mg/mL。
优选的，所述步骤S2中乳酸氧化酶的浓度为0.05-5mg/mL，磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐的浓度为3-5mg/mL。
优选的，所述步骤S5中CaCl2溶液的浓度为25-100mM。
优选的，所述步骤S6中Na2CO3溶液的浓度为12.5-100mM。
优选的，所述步骤S7中清洗和重悬所用溶液为双蒸水。
因此，本发明采用上述的一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法，流感病毒可以诱发线粒体失调介导的细胞综合应激反应进而引发肿瘤细胞免疫原性死亡，增加癌细胞的免疫原性与佐剂性，招募和激活CD8+T细胞等抗原提呈细胞；乳酸氧化酶将肿瘤微环境中的乳酸转化为丙酮酸与过氧化氢，协同免疫激活；CaCO3纳米涂层技术进行包裹，使它们具有肿瘤区域微酸响应释放的功能，克服了溶瘤病毒等纳米病毒给药引发全身毒性或多脏器功能衰竭的缺点，提高了生物安全性。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中利用激光粒度分析仪测量制备得到的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LO D)@CaCO3的直径结果图；
图2为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中通过荧光光谱仪检测流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3的包装效率结果图；
图3为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中PBS招募CD8+T细胞表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况；
图4为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中CaCO3招募CD8+T细胞表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况；
图5为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中WSN@CaCO3纳米颗粒招募CD8+T细胞表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况；
图6为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中LOD@CaCO3纳米颗粒招募CD8+T细胞表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况；
图7为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3招募CD8+T细胞表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况；
图8为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法中流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3干扰素的产生；
图9为本发明一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法实施例中小鼠肿瘤体积曲线图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
实施例1
准备工作：WSN的扩增培养
在37℃，5％二氧化碳的条件下对MDCK(犬肾)细胞进行培养，培养基为含体积比为10％胎牛血清和1％青链霉素双抗溶液(以下简称双抗，其中青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为O.lmg/ml)的DMEM培养基，选择T75细胞培养瓶中肿瘤细胞的细胞密度长到95％以上时弃掉培养基，用DMEM清洗细胞培养瓶三次，将残留的血清洗掉，加入10mL无血清DMEM培养基后，加入1mL实验室存储的WSN毒株，1小时后更换为15mL含有2％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，连续培养5天，观察到MDCK细胞有明显病变之后，收集上清，3000rpm离心10分钟，收集分装上清，在-80℃条件下保存。
制备过程
1)将WSN与3mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂(Traut's Reagent)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
2)将0.5mg/mL乳酸氧化酶与3mg/mL磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(Sulfo-SMCC)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
3)将步骤1)和步骤2)所得溶液转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中在4℃环境下，透析一段时间。
4)将步骤3)获得的样品在4℃条件下混合搅拌1小时，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD。
5)在4℃条件下进行，配置好浓度为50mM的CaCl2溶液，将配置好的CaCl2溶液逐滴加入步骤4)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌一段时间。
6)在4℃条件下进行，配置好浓度为50mM的Na2CO3溶液，逐滴加入到步骤5)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌1小时。
7)搅拌完成后离心，后用双蒸水清洗一遍，继续离心，用双蒸水重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
实施例2
1)将WSN与5mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂(Traut's Reagent)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
2)将0.5mg/mL乳酸氧化酶与5mg/mL磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(Sulfo-SMCC)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
3)将步骤1)和步骤2)的溶液转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中在4℃环境下，透析12小时。
4)将步骤3)获得的样品在4℃条件下混合搅拌1小时，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD。
5)在4℃条件下进行，配置好浓度为50mM的CaCl2溶液，将配置好的CaCl2溶液逐滴加入步骤4)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌30分钟。
6)在4℃条件下进行，配置好浓度为50mM的Na2CO3溶液，逐滴加入到步骤5)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌1小时；
7)搅拌完成后离心，后用双蒸水清洗一遍，继续离心，用双蒸水重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
实施例3
1)将WSN与3mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂(Traut's Reagent)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
2)将0.5mg/mL乳酸氧化酶与3mg/mL磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(Sulfo-SMCC)在含有4mM EDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
3)将步骤1)和步骤2)溶液转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中在4℃环境下，透析12小时。
4)将步骤3)获得的样品在4℃条件下混合搅拌1小时，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD。
5)在4℃条件下进行，配置好浓度为100mM的CaCl2溶液，将配置好的氯化钙溶液逐滴加入上述反应体系中，滴加完毕继续搅拌30分钟。
6)在4℃条件下进行，配置好浓度为100mM的Na2CO3溶液，逐滴加入到步骤5)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌1小时；
7)搅拌完成后离心，后用双蒸水清洗一遍，继续离心，用双蒸水重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
实施例4
1)将WSN与4mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂(Traut's Reagent)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
2)将4mg/mL乳酸氧化酶与4mg/mL磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(Sulfo-SMCC)在含有4mM EDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
3)将步骤1)和步骤2)溶液转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中在4℃环境下，透析12小时。
4)将步骤3)获得的样品在4℃条件下混合搅拌1小时，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD。
5)在4℃条件下进行，配置好浓度为25mM的CaCl2溶液，将配置好的氯化钙溶液逐滴加入上述反应体系中，滴加完毕继续搅拌30分钟。
6)在4℃条件下进行，配置好浓度为12.5mM的Na2CO3溶液，逐滴加入到步骤5)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌1小时；
7)搅拌完成后离心，后用双蒸水清洗一遍，继续离心，用双蒸水重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
实施例5
1)将WSN与3mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂(Traut's Reagent)在含有4mMEDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
2)将0.05mg/mL乳酸氧化酶与3mg/mL磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(Sulfo-SMCC)在含有4mM EDTA,PH＝8.0的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时。
3)将步骤1)和步骤2)溶液转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中在4℃环境下，透析一段时间。
4)将步骤3)获得的样品在4℃条件下混合搅拌1小时，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD。
5)在4℃条件下进行，配置好浓度为25mM的CaCl2溶液，将配置好的氯化钙溶液逐滴加入步骤4)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌30分钟。
6)在4℃条件下进行，配置好浓度为12.5mM的Na2CO3溶液，逐滴加入到步骤5)所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌1小时；
7)搅拌完成后离心，后用双蒸水清洗一遍，继续离心，用双蒸水重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
一、实施例3制备得到的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaC O3的激光粒度分析仪结果如图1所示，其中横坐标为(WSN-LOD)@CaCO3纳米颗粒的水动力直径(单位nm)，纵坐标为相应水动力直径大小的粒子所占的百分比，从图1可以看出流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3在直径90nm-285nm间呈正态分布。
二、通过荧光光谱仪检测实例3得到的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3的包装效率。
向0.5mg/mL FITC-COOH溶液加入10mg/mL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)室温反应10分钟，然后加入10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应10分钟，随后将反应液与1mLWSN室温反应30分钟，4℃条件下透析12小时去除未连接的FITC，得到WSN-FITC。取WSN-FITC与LOD进行连接，修饰上CaCO3纳米涂层，得到FITC标记的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。取1mL置于比色皿中使用荧光光度计(FS5荧光光谱仪，爱丁堡仪器有限公司，爱丁堡，英国)测量荧光发射光谱。如图2所示，其中横坐标为发射光谱的波长，FITC的激发波长是460nm-550nm,发射光波长为520nm-530nm，纵坐标为光电子值，可以观察到WSN-LOD-FITC被包装的效率为80％。
三、流式细胞仪检测实施例3得到的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3对肿瘤内CD8+T细胞的募集情况。
流式细胞仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。本发明用流式细胞仪检测得到的(WSN-LOD)@CaCO3纳米颗粒对天然T细胞的激活的原理为：用荧光标记抗体，抗体特异性地结合细胞上对应的抗原，表达该抗原的细胞被标记上荧光，抗原表达多的细胞荧光强度强，从而间接反应了流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3具有募集CD8+T细胞向肿瘤转移的功能。相应的也就反应了该流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3在肿瘤治疗方面的作用。
1)取不同治疗组与对照组小鼠的肿瘤，利用手术剪使其破裂成碎块，用0.25％的胶原酶处理30分钟，通过物理方法碾碎肿瘤组织块，获得小鼠肿瘤组织细胞悬液。
2)将步骤1)所得的细胞悬液，1000rpm离心5分钟，用1mLPBS缓冲液重悬漂洗(反复三次)，然后用1％BSA缓冲液在4℃条件下封闭30分钟，用1％BSA缓冲液1：100稀释抗CD3-FITC(浓度为5ug/ml)抗体和抗CD8a-PE抗体(浓度为2ug/mL)各100uL在4℃条件下染色30分钟。
3)之后用在4℃条件下预冷的100uL的PBS缓冲液洗三次(方法同上)，用流式细胞仪检测细胞的荧光，设定为检测前10000个细胞，结果如图3-7所示。
4)图3-7分别反应了PBS、CaCO3、WSN@CaCO3纳米颗粒、LOD@CaCO3纳米颗粒和流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3招募CD8+T细胞表达的抗原与抗体结合后产生的荧光情况，饼状图总的数值占比越大证明肿瘤组织中CD8+T细胞含量越高。
四、ELASA检测实施例3得到的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3刺激巨噬细胞产生干扰素，结果如图8所示。
1)取对数期生长的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)，调整细胞悬液浓度，在6孔板上铺板。置于37℃,5％C02培养箱使细胞贴壁，培养24小时。
2)分别加入含PBS、WSN、WSN+LOD、CaCO3、WSN@CaCO3纳米颗粒、LOD@CaCO3纳米颗粒和流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3的新鲜培养基，继续培养24小时。
3)收集培养基上清液检测细胞因子，离心lO分钟去除上清沉淀。
4)先用稀释好的抗体孵育细胞1.5小时，洗板后继续用辣根过氧化物酶孵育30分钟。
5)洗板后添加显色液进行显色，显色结束加入终止液，在酶标仪450nm检测吸光度。
五、记录监测不同药物处理组的小鼠的肿瘤体积，计算方式为长(mm)*宽(mm)*1/2宽(mm)。图9的横坐标为生长天数，纵坐标为肿瘤生长体积，可以看出流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3抑制了肿瘤的生长。
因此，本发明采用上述的一种流感病毒重组复合体纳米颗粒及其制备方法，将流感病毒(WSN)和乳酸氧化酶(LOD)分别与2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂和磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐反应，使二者分别被修饰上巯基与马来酰亚胺基团，随后将二者进行生物正交反应连接得到流感病毒复合体，接下来将所得流感病毒复合体与Ca2+和CO3 2-进行生物矿化，得到流感病毒重组复合体纳米颗粒[(WSN-LOD)@CaCO3]，可以诱发线粒体失调介导的细胞综合应激反应进而引发肿瘤细胞免疫原性死亡，增加癌细胞的免疫原性与佐剂性，招募和激活CD8+T细胞等抗原提呈细胞；乳酸氧化酶将肿瘤微环境中的乳酸转化为丙酮酸与过氧化氢，协同免疫激活；CaCO3纳米涂层技术进行包裹，使它们具有肿瘤区域微酸响应释放的功能，克服了溶瘤病毒等纳米病毒给药引发全身毒性或多脏器功能衰竭的缺点，提高了生物安全性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种流感病毒重组复合体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将流感病毒WSN与3-5mg/mL的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂在含有EDTA的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时；
S2.将0.05-5mg/mL的乳酸氧化酶LOD与3-5mg/mL的磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐在含有4mMEDTA的缓冲液中混合均匀，在4℃条件下反应1小时；
S3.将步骤S1和步骤S2的混合溶液分别转移至透析袋中,放置在PBS缓冲液中，在4℃环境下，透析12小时；
S4.将步骤S3获得的样品在4℃条件下混合搅拌1小时，进行生物正交反应连接得到WSN-LOD；
S5.配置CaCl2溶液，将配置好的CaCl2溶液逐滴加入步骤S4所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌30分钟，在4℃条件下进行；
S6.配置Na2CO3溶液，将配置好的Na2CO3溶液逐滴加入到步骤S5所得反应体系中，滴加完毕继续搅拌1小时，在4℃条件下进行；
S7.搅拌完成后离心，清洗，继续离心，然后重悬，最终得到流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
2.根据权利要求1所述的一种流感病毒重组复合体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中CaCl2溶液的浓度为25-100mM。
3.根据权利要求2所述的一种流感病毒重组复合体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中Na2CO3溶液的浓度为12.5-100mM。
4.根据权利要求3所述的一种流感病毒重组复合体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤S7中清洗和重悬所用溶液为双蒸水。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的流感病毒重组复合体纳米颗粒的制备方法制备得到的流感病毒重组复合体纳米颗粒(WSN-LOD)@CaCO3。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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