CN101449164A - 流感病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测包含血凝素和神经氨酸酶组分的流感病毒和/或病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：a)将所述病毒和/或病毒颗粒与支持物结合，该支持物包含至少一种类型的选自天然或合成寡糖的碳水化合物受体，其与糖蛋白(如血型糖蛋白、α1－酸性糖蛋白、α2－巨球蛋白、卵类粘蛋白及其组合)缀合或与其组合，其中碳水化合物受体结合病毒和/或病毒颗粒的血凝素组分；b)使所结合病毒和/或病毒颗粒的神经氨酸酶组分与其带标记的酶底物反应，产生可检测的信号；以及c)检测步骤b)中所产生的信号。
Description
本发明涉及一种快速检测包含血凝素和神经氨酸酶组分的流感病毒和/或病毒颗粒的方法，所述方法包括：通过特定的结合分子将所述病毒和/或病毒颗粒与支持物结合，所述结合分子结合该病毒和/或病毒颗粒的血凝素组分；以及通过将神经氨酸酶组分与其酶底物反应产生可检测的信号来检测所结合的病毒和/或病毒颗粒。本发明还涉及应用本发明的方法来快速检测流感病毒和/或病毒颗粒的检测系统以及根据本发明的检测系统的用途。
所有禽流感(avian influenza，AI)病毒均为正粘病毒科中的A型流感病毒，A型流感病毒的所有已知毒株均感染禽类。基于从中央的病毒核心伸出的血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白，A型流感病毒又分为若干亚型。存在16种H型和多达9种N亚型，由此产生了144种不同的H和N组合的可能性。
禽流感(也称为bird flu、avian flu、A型流感病毒型流感、A型流感或A类流感)是由某类流感病毒引起的流感，该流感病毒以禽类为宿主但是可能感染若干种哺乳动物。
流感大流行即流感病毒的大规模流行，如1918年的西班牙流感。世界卫生组织(WHO)发出警告说，在未来几年中存在流感大流行的危险。其中最有可能发生的是A(H5N1)亚型禽流感。
H5N1是一种已通过抗原性漂移突变为几十种高致病性变体的禽流感病毒，然而目前均属于H5N1禽流感病毒的Z基因型。Z基因型是在2002年从H5N1的早先高致病性基因型通过重配出现的，所述早先H5N1高致病性基因型最早在禽类(中国，1996年)和人类(香港，1997年)中被发现。来自人类感染者的H5N1病毒以及2004和2005年分离的密切相关的禽病毒属于一个基因型，其常被称作Z基因型。
已在人类中证实的禽流感亚型按照已知的死亡人数排序为：导致西班牙流感的H1N1、导致亚洲流感的H2N2、导致香港流感的H3N2、H5N1、H7N7、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7。
为了在能够人际传播的突变的强致病性新流感毒株出现时可以迅速应对，需要快速且可靠的测试方法来确定动物或人是否被该病毒感染。目前用于检测来自环境、动物和患者样品之病毒的实验室方法既费力又耗时。
US-B-6,503,745公开了环戊烷和环戊烯化合物及其在检测流感病毒的方法中的用途。使用胎球蛋白包被的表面来捕获病毒，并用结合神经氨酸酶的带标记化合物来进行检测。
D.E.Noyola等在Journal of Clinical Microbiology，2000，第1161-1165页中报道了用胎球蛋白包被的珠子。胎球蛋白也作为神经氨酸酶的底物，并利用凝集作用来进行检测。
US-A-2003/0129618公开了使用响应于分析物选择性结合聚合材料而在聚合物材料中出现的荧光来检测分析物的方法和组合物。具体来说，该发明允许对膜改性反应(membrane modifying reaction)以及负责此改性的分析物进行荧光检测，并允许筛选作用抑制剂。
所有已知且可取的快速现场方法(on-site approach)均基于病毒表位的抗体的应用或者基于简单的神经氨酸酶(NA)检测。基于侧向流动技术(lateral flow technique)或其它类型测定的抗体方法的主要缺点是抗体试剂不稳定。另外，到目前为止，大多数可用的免疫测定表现出对A型流感而非H5N1的特异性。另外，使用抗体不可避免地导致检测成本的增加。
特异性针对流感病毒的NA检测的主要缺点是必须使用本领域中所用的昂贵底物试剂，该试剂需要被部分甲基化。
本发明通过提供如权利要求中所限定的一种用于快速检测流感病毒和/或病毒颗粒的方法、应用所述方法的检测系统以及所述检测系统的用途而解决了这些问题。
说明书中将使用以下缩写：3’SLN＝Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc；HA＝血凝素；HAR＝血细胞凝集反应；LOD＝检出限；NA＝神经氨酸酶；TCID＝组织培养感染量；TN缓冲液＝含有0.1M NaCl的0.02Mtris-HCl(pH7.2)。
根据本发明，应用了一种快速检测流感病毒和/或病毒颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)将病毒和/或病毒颗粒与支持物结合，该支持物包含至少一种类型的选自天然或合成寡糖的碳水化合物受体，其与糖蛋白(如血型糖蛋白、α1-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、卵类粘蛋白及其组合)缀合或与其组合，其中碳水化合物受体结合所述病毒和/或病毒颗粒的血凝素组分；
b)使所结合的病毒和/或病毒颗粒的神经氨酸酶组分与其带标记的酶底物反应，从而产生可检测的信号；以及
c)检测步骤b)中所产生的信号。
特别地，检测包括所有已知禽流感(AI)亚型的流感病毒和/或病毒颗粒。
在本发明的另一实施方案中，所述流感病毒和/或病毒颗粒包括某一亚型或一组亚型。本方法适于检测包括高致病性变体的流感病毒和/或病毒颗粒。
特别地，可以使用层析纸或膜形式的支持物实施本发明。这样的材料是本领域技术人员所熟知的。根据本发明，可以将所述碳水化合物受体如上所述地共价连接或物理吸附到所述支持物。
特别地，本发明应用包含α2-3Gal基序的碳水化合物受体。根据本发明的一个实施方案(点印迹法)，通过将含有病毒和/或病毒颗粒的样品以点的形式加至支持物上来实现病毒和/或病毒颗粒的结合。根据本发明，通过以所谓侧流方法的形式沿着所述支持物浸入含有病毒和/或病毒颗粒的样品来实现病毒和/或病毒颗粒的结合。在本发明的另一实施方案中，将神经氨酸酶组分的带标记酶底物沉淀在所结合病毒和/或病毒颗粒的位置。
在本发明的又一实施方案中，用发色基团标记酶底物，与神经氨酸酶的反应诱导所述酶底物的颜色变化。酶底物可以使用下述N-乙酰基神经氨酸的发色衍生物特别是5-溴-4-氯-3-吲哚-α-N-乙酰基神经氨酸，等等。作为替代的，当使用合适的荧光分子作为标记时，与神经氨酸酶的反应诱导特定的荧光信号。
可利用本发明的快速检测流感病毒和/或病毒颗粒的检测系统有利地实施本发明。该系统包括使用本发明的方法快速检测流感病毒和/或病毒颗粒的检测系统，所述系统包括：
a)包含至少一种类型的选自天然或合成寡糖的碳水化合物受体的支持物，其与糖蛋白(如血型糖蛋白、α1-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、卵类粘蛋白及其组合)缀合或与其组合，其中所述碳水化合物受体结合该病毒和/或病毒颗粒的血凝素组分；
b)与神经氨酸酶组分反应的带标记的酶底物，从而产生可检测的信号。
特别地，将支持物封入带有窗口的塑料盛放器(holder)中，用以读取样品和阳性对照的测试结果。特别地，所述支持物包含至少两种不同量的所述特异性结合物(binder)用于半定量估计样品中的病毒含量。在另一实施方案中，所述支持物包含至少两种具有不同亚型特异性的特异性受体用于同时检测分属不同亚型的病毒。在揭示出具有目标特异性的病毒和/或病毒颗粒存在后，本发明的检测系统作为样品容器和传送装置(transport unit)用于确认性测试(如逆转录聚合酶链式反应)。
根据本发明，还要求保护检测系统用于检测动物和/或人的样品(如拭样、粪便和血液)中、环境样品中的流感病毒和/或病毒颗粒的用途和/或作为出现高致病性病毒亚型的早期预警系统的用途。
血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)存在于流感病毒的表面。HA诱导病毒与包含唾液酸的细胞受体结合，而NA促使病毒接近靶细胞并有助于病毒从被感染细胞与天然抑制剂释放。[Matrosovich，M.N.，Matrosovich，T.Y.，Gray，T.，Roberts，N.A.，Klenk，H.D.2004：J.Virol.78(22)12665-7]，也就是说，HA进行受体结合，而NA进行受体破坏。HA和NA的协同作用是病毒有效复制的重要条件，而对于不同物种来说，这两种活性之间的关系是不同的。从禽类分离的流感病毒表现出某些独特的特征。所有的禽流感病毒均具有HA，其对于末端为Neu5Acα2-3Gal的碳水化合物链具有最高的亲合力。并且，它们的NA活性高于其它来源的病毒。
在本发明的检测方法和检测系统中，使用了禽类病毒的病毒粒组分(HA和NA)的这些特性。流感病毒将与特定结合分子结合，优选与包含唾液酸化的碳水化合物并与膜偶联的物质结合，然后进行神经氨酸酶底物的反应，优选消化，从而使膜上包含病毒的区域显色。与本领域目前的测试系统相比，本发明的流感病毒检测方法和系统显示出多种优点：使用两种组分(HA和NA)，提高了测定的特异性并允许构建具有所选特异性的检测系统。同时，与基于免疫方法的检测系统不同的是，由于使用病毒的神经氨酸酶本身来显示阳性检测，因此不需要另外的标记酶用于该目的。
全面选择的碳水化合物受体分子类型的不同变体将收集所有流感病毒，而不论其类型和亚型如何，并能够同时特异性检测高致病性变体如H5N1。
无需使用任何复杂设备即可获得本发明检测方法的结果。
本发明的方法可以在0.1～2小时内完成流感病毒的检测。
通过以下非限制性的实施例对本发明进行进一步地解释。
实施例
实施例1：
合成3’SLN三糖的聚丙烯酰胺缀合物用于制备特异性碳水化合物受体分子
将用N-羟基琥珀酰亚胺完全活化的1.7mg(10μmol)聚丙烯酸(MW～1000kDa)的200μl DMSO溶液和4μl二异丙基乙胺加入1.46mg(2μmol)3’SLN-O(CH2)3NH2的200μl DMSO溶液中，将该混合物在37℃保持48h，加入40μl25％氨水溶液或40μl乙醇胺，将该溶液在室温保持18h，然后利用sepharose LH进行凝胶渗透层析，产率约为90％。
实施例2：
通过使用本发明的方法和检测系统来检测尿囊液中的流感病毒
示例-试剂盒：
1. 测试条带
2. 检测缓冲液 1#缓冲液
3. 对比缓冲液 2#缓冲液
4. 清洗缓冲液A 3#缓冲液
5. 清洗缓冲液B 4#缓冲液
6. 染色缓冲液 5#缓冲液
7. 双条带(2行8孔)或96孔板
8. 剪刀或手术刀
9. 钳子
10. 用于清洗条带的板
11. 显影瓶
12. 恒温器(或其替代物)
13. 用于层析步骤的照相机(或用于遮盖包含条带的96孔板的盖子)
材料
条带：来自Whatman，USA的硝酸纤维素、吸附剂(absorbent)和样品垫。
1.分离自新鲜鸡卵的特异性试剂(胎球蛋白，Sigma)。
2. 1#缓冲液：包含3M NaCl和0.5％Tween-20的0.2M tris-HCl(pH7.2)
3. 2#缓冲液：包含0.3M NaCl和0.05％Tween-20的0.02M tris-HCl(pH7.2)
4. 3#缓冲液：包含0.1M NaCl和0.05％Tween-20的0.02M tris-HCl(pH7.2)
5. 4#缓冲液：包含0.1M NaCl的0.02M tris-HCl(pH7.2)(TN缓冲液)
6. 5#缓冲液：TN缓冲液中包含0.01M CaCl2的4mM Neu-X溶液
可以将TN缓冲液替换为另外的合适缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐溶液或盐水。
条带(图1)分为3个区域：浸没区、检测区和吸附区(absorbingzone)。碳水化合物受体分子线(测试线)以及对照线位于检测区中。该条带由膜、吸附剂和样品垫组装而成。将碳水化合物受体分子(1μl的1mg/mL溶液)加样于检测区上，之后使条带干燥并进行清洗。然后，将条带于18-25℃储存在密闭瓶中。
检测
1.样品制备。临分析前将1/10(体积/体积)份的1#缓冲液加至检测物并彻底混匀。这就是1#检测物(P#1)。
2.检测步骤包括多个阶段(表1)。
第一步，将条带的样品垫置于80-100μl P#1中。通过毛细作用力的作用，液体从样品中向上浸透并经过检测区进入吸附区，在检测区病毒颗粒与碳水化合物受体分子结合。该步骤的持续时间取决于样品的粘度，但不应超过15分钟。将2#缓冲液加入板中同一孔中(或者可以将所述条带转移至充满2#缓冲液的另一孔中)。10分钟后，将条带从孔中取出。
第二步，将条带的浸没部分切下(使用剪刀)。在小心地除去(例如，借助钳子)条带的吸附区部分后，用3#缓冲液清洗检测区，继而用4#缓冲液清洗。随后，将吸附区也切除。
第三步。将剩余的检测区置于包含5#缓冲液的瓶中。将该瓶密封，并使之于37-40℃的暗处静置。样品中流感病毒的存在以碳水化合物受体分子区域的深蓝色着色形式检测出来。该步骤的持续时间取决于样品中病毒的浓度，可以从20分钟至60分钟，然后可以利用血细胞凝集反应(HAR效价约为2)对病毒进行检测。通常，这些样品的TCID/ml值约为105。对于病毒含量低10倍和100倍的检测物(104-103TCID/ml)来说，着色可能在几小时后出现。该步骤后，将条带从溶液中取出，然后用肉眼评估反应结果。
检测区中的神经氨酸酶对照线用于评估测定的有效性。对照区域的深蓝色着色必须出现。
以如下方式对结果进行解释：
1)如果观察到均匀着色的线，则认为结果呈阳性，也就是说，检测物包含所述病毒；颜色强度应与对照线的强度相当。
2)如果观察到着色较弱的线，则样品中所含有病毒的浓度不足以进行确定的检测，应当将条带与5#缓冲液接触的时间延长至过夜或者可以再重复测试一次。
3)没有着色线意味着样品中不含有病毒或者其浓度低于最低检出水平。
4)阳性对照线没有着色要么意味着实验操作有误，要么意味着对照线中的NA已被破坏。在这种情形中，建议使用新的测试试剂盒重新测试样品。
表2中给出了有关测试灵敏度的数据。
表1：本发明检测方法的示意图
实施例3：
使用本发明的检测系统来检测鸡粪便中的流感病毒
在该实施例中，使用如实施例2中同样的材料和方法。
1.制备健康鸡的粪便悬液(每10ml缓冲液中含有2g干物质)中含病毒检测物的系列稀释物。已证实，粪便不影响所述测试中流感病毒检测的灵敏度和特异性。
2.将1/10(体积/体积)份的A/duck/Alberta/76病毒(HAR效价1:10)加入到新鲜的鸡粪中，并将该混合物匀浆。将2#缓冲液加入上述匀浆物(1:1(体积/体积))后，取出所得悬液的等分试样用于测定。2小时后，测试区中出现深蓝色着色。若将鸡粪在测试步骤开始前加入表1中的样品，未观察到对测试结果的显著影响。
实施例4：
使用本发明的检测系统来检测死鸡肺组织中的流感病毒
在该实施例中，使用如实施例2中同样的材料和方法。
使用silin缓冲液来提取死于流感病毒H5N1感染的鸡的肺组织并分析(收集：Crimea/January 2006)。可以看出，可以在所分析的鸡尸体肺中可靠地检测流感病毒。
表2：按照本发明测试系统检测的含病毒样品中禽流感病毒的检测限度(limit of detection，LOD)
a-这是疫苗株，其具有来自A/Vietnam/1194/04病原体病毒的HA和NA基因，以及来自A/Puerto Rico/2/34的所有内部蛋白基因。病毒获得自莫斯科脊髓灰质炎和病毒性脑炎研究所(Institute of Poliomyelitis andViral Evncephalitis，Moscow Region)和圣彼得堡流感研究所(Instituteof Influenza，St.Petersburg)。
Claims (19)
1.一种快速检测包含血凝素和神经氨酸酶组分的流感病毒和/或病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将病毒和/或病毒颗粒与支持物结合，该支持物包含至少一种类型的选自天然或合成寡糖的碳水化合物受体，其与糖蛋白缀合或与其组合，其中碳水化合物受体结合所述病毒和/或病毒颗粒的血凝素组分，所述糖蛋白例如血型糖蛋白、α1-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、卵类粘蛋白及其组合；
b)使所结合病毒和/或病毒颗粒的神经氨酸酶组分与其带标记的酶底物反应，产生可检测的信号；以及
c)检测步骤b)中所产生的信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流感病毒和/或病毒颗粒包括所有已知的禽流感(AI)亚型。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述流感病毒和/或病毒颗粒包括某一亚型或一组亚型。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述流感病毒和/或病毒颗粒包括高致病性变体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述支持物是层析纸或膜。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物受体共价连接或物理吸附到所述支持物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述碳水化合物受体包含α2-3Gal基序。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过将含有病毒和/或病毒颗粒的样品以点的形式加到所述支持物上(点印迹法)来实现所述病毒和/或病毒颗粒的所述结合。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过沿着所述支持物浸入含有病毒和/或病毒颗粒的样品(侧流法)来实现所述病毒和/或病毒颗粒的所述结合。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述神经氨酸酶组分的所述带标记酶底物沉淀在所结合病毒和/或病毒颗粒的位置。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中用发色基团标记所述酶底物，与所述神经氨酸酶的反应诱导了所述酶底物的颜色变化。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述酶底物是N-乙酰基神经氨酸的发色衍生物，特别是5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-N-乙酰基神经氨酸。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中与所述神经氨酸酶的反应诱导特定的荧光信号。
14.使用权利要求1至13中任一项的方法来快速检测流感病毒和/或病毒颗粒的检测系统，所述系统包括：
a)包含至少一种类型的选自天然或合成寡糖的碳水化合物受体的支持物，其与糖蛋白缀合或与其组合，其中碳水化合物受体结合所述病毒和/或病毒颗粒的血凝素组分，所述糖蛋白例如血型糖蛋白、α1-酸性糖蛋白、α2-巨球蛋白、卵类粘蛋白及其组合；
b)与神经氨酸酶组分反应的带标记酶底物，从而产生可检测的信号。
15.根据权利要求14所述的检测系统，其中所述支持物被封入带有窗口的塑料盛放器中，以读取样品和阳性对照的测试结果。
16.根据权利要求14和/或15所述的检测系统，其中所述支持物包含至少两种不同量的所述特异性结合物用于半定量估计样品中的病毒含量。
17.根据权利要求14和/或16所述的检测系统，其中所述支持物包含至少两种具有不同亚型特异性的特异性受体用于同时检测分属不同亚型的病毒。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的检测系统，其中在揭示了具有目标特异性的病毒和/或病毒颗粒存在后，所述系统作为样品容器和传送装置以用于确认性测试如逆转录聚合酶链式反应。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的检测系统用于检测动物和/或人的样品中、环境样品中的流感病毒和/或病毒颗粒的用途和/或作为出现高致病性病毒亚型的早期预警系统的用途，所述动物和/或人的样品例如拭样、粪便和血液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1131436 Country of ref document: HK |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090603 |
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