CN103328002A - 血球凝集素多肽以及与其相关的试剂和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于分析聚糖与结合其的相互作用搭配物之间的相互作用的系统。本发明还提供结合于伞形拓扑聚糖的HA多肽以及与其相关的试剂和方法。
Description
相关申请案的交叉引用
本申请案主张2010年10月4日申请的美国临时申请案第61/389,639号的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
政府支持
本发明是依据由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授与的批准号GM57073和U54GM62116在政府支持下进行。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
背景技术
流感具有流行、传染、复发以及爆发的悠久历史。禽流感(包括H5N1病毒株)是一种高度传染性并潜在致命的病原体，但目前它只有有限的感染人类的能力。然而，在历史上已观察到禽流感病毒积累了改变它的宿主特异性并使它容易感染人类的突变。实际上，上个世纪的主要流感大流行中有两次起源于禽流感病毒，这些禽流感病毒改变了它们的基因组成，从而感染人类。
非常担忧当前的H5N1、H7N7、H9N2以及H2N2禽流感病毒株可能积累了改变它们的宿主特异性并使它们容易感染人类的突变。因此，需要评估HA蛋白在这些病毒株中实际上是否可以转化成可以容易地感染人类的形式，并且另外需要识别具有所述能力的HA变异体。另外需要了解通常允许或禁止感染不同个体(尤其人类)的HA蛋白的特征。还需要用于有效治疗由流感病毒引起的疾病或延迟其发作的疫苗和治疗策略。
发明内容
本发明提供具有特定聚糖结合特征的结合剂。具体来说，本发明提供结合于具有伞形拓扑的唾液酸化聚糖的结合剂。在一些实施例中，根据本发明的结合剂以高亲和力和/或特异性结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，与锥形拓扑聚糖相比，根据本发明的结合剂显示优先结合伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂与血球凝集素竞争结合于血球凝集素受体上的聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂与血球凝集素竞争结合于伞形拓扑聚糖。
本发明还提供与所提供的结合剂有关的诊断和治疗试剂以及方法，包括疫苗。
具体来说，本发明认识到，与参考HA多肽相比，具有已改变的糖基化的HA多肽变异体(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16HA多肽变异体)可显示与人类HA受体的结合增加(或减少)。在一些实施例中，参考多肽为以下任一者的HA多肽：
A/南卡罗莱纳(South Carolina)/1/18(H1)：
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A/布里斯班(Brisbane)/59/07(H1)：
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A/加利福尼亚(California)/04/09(H1)：
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A/莫斯科(Moscow)/10/99(H3)：
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A/珀斯(Perth)/16/09(H3)：
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A/越南(Vietnam)/1203/04(H5)：
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A/埃及(Egypt)/2786-NAMRU3/06(H5)：
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A/纽约(New York)/107/03(H7)：
MNTQILAFIACVLTGVKGDKICLGHHAVANGTKVNTLTERGIEVVNATETVETTNIKKICTQGKRPTDLGQCGLLGTLIGPPQCDQFLEFSSDLIIERREGTDICYPGRFTNEESLRQILRRSGGIGKESMGFTYSGIRTNGATSACTRSGSSFYAEMKWLLSNSDNAAFPQMTKAYRNPRNKPALIIWGVHHSESVSEQTKLYGSGNKLITVRSSKYQQSFTPNPGARRIDFHWLLLDPNDTVTFTFNCAFIAPDRTSFFRGESLGVQSDAPLDSSCRGDCFHSGGTIVSSLPFQNINSRTVGKCPRYVKQKSLLLATGMRNVPEKPKPRGLFGAIAGFIENGWEGLINGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIGKTNQQFELIDNEFNEIEQQIGNVINWTRDAMTEIWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMSKLYERVKKQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDQCMESIRNNTYDHTQYRTESLQNRIQIDPVKLSSGYKCIILWFSFGASCFLLLAIAMGLVFICIKNGNMQCTICI(SEQ ID NO：52)
具体来说，本发明还认识到，与参考HA多肽(包括例如SEQ ID NO：43-52中的任一者的HA多肽)相比，在HA环形区中具有改变的HA多肽变异体(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16HA多肽变异体)可显示与人类HA受体的结合增加(或减少)。
在一些实施例中，本发明认识到，与参考HA多肽相比，具有已改变的糖基化的H5HA多肽变异体可显示与人类HA受体的结合增加(或减少)。在一些实施例中，参考多肽为以下任一者的HA多肽：
A/香港(Hongkong)/486/97
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A/香港/213/03
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A/越南/1203/04
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ IDNO：50)
A/印度尼西亚(Indonesia)/5/05
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTMLYQNPTTYISTGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRNGTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ IDNO：55)
A/埃及/2786-NAMRU3/06
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLIKKDNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQ IDNO：51)
具体来说，本发明还认识到，与参考HA多肽(包括例如SEQ ID NO：50、51以及53-55中任一者的HA多肽)相比，在HA环形区中具有改变的H5HA多肽变异体可显示与人类HA受体的结合增加(或减少)。
附图说明
图1A-1C.野生型HA的示范性序列的比对。序列是从NCBI流感病毒序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)获得。H1_Av(SEQ ID NO：1)。H1_Hu1(SEQ ID NO：2)。H1_Hu2(SEQ ID NO：3)。H2_Av(SEQ ID NO：4)。H2_Hu(SEQID NO：5)。H3_Av(SEQ ID NO：6)。H3_Hu1(SEQ ID NO：7)。H3_Hu2(SEQ ID NO：8)。H4_Av(SEQ ID NO：9)。H5_Av1(SEQ ID NO：10)。H5_Av2(SEQ ID NO：11)。H6_Av(SEQ ID NO：12)。H7_Av(SEQ ID NO：13)。H8_Av(SEQ ID NO：14)。H9_Av(SEQ ID NO：15)。H10_Av(SEQ ID NO：16)。H11_Av(SEQ ID NO：17)。H12_Av(SEQ ID NO：18)。H13_Av(SEQ ID NO：19)。H14_Av(SEQ ID NO：20)。H15_Av(SEQ ID NO：21)。H16_Av(SEQ ID NO：22)。
图2A-B.HA聚糖结合域的序列比对。灰色：与结合于唾液酸有关的保守氨基酸。红色：与结合于Neu5Acα2-3/6Gal基序有关的特定氨基酸。黄色：影响Q226(137，138)和E190(186，228)定位的氨基酸。绿色：与结合于连接于Neu5Acα2-3/6Gal基序的其它单糖(或变体)有关的氨基酸。ASI30、APR34、ADU63、ADS97以及Viet04的序列是从它们各自的晶体结构获得。其它序列是从SwissProt(http://us.expasy.org)获得。缩写：ADA76，A/鸭/亚伯达(Alberta)/35/76(H1N1)(SEQ ID NO：23)；ASI30，A/猪/爱荷华(Iowa)/30(H1N1)(SEQ ID NO：24)；APR34，A/波多黎各(Puerto Rico)/8/34(H1N1)(SEQID NO：25)；ASC18，A/南卡罗莱纳/1/18(H1N1)(SEQ ID NO：26)；AT91，A/德克萨斯(Texas)/36/91(H1N1)(SEQ ID NO：27)；ANY18，A/纽约/1/18(H1N1)(SEQ ID NO：28)；ADU63，A/鸭/乌克兰(Ukraine)/1/63(H3N8)(SEQ ID NO：29)；AAI68，A/爱知/2/68(H3N2)(SEQ ID NO：30)；AM99，A/莫斯科/10/99(H3N2)(SEQ ID NO：31)；ADS97，A/鸭/新加坡(Singapore)/3/97(H5N3)(SEQ ID NO：32)；Viet04，A/越南/1203/2004(H5N1)(SEQ IDNO：33)。
图3.说明H1HA的保守子序列特征的序列比对。图3A呈现与图1A中所呈现相同的比对，除了图3A指示存在其它保守子序列。图3B呈现与图1C中所呈现相同的比对，除了图3A指示存在其它保守子序列。
图4.说明H3HA的保守子序列特征的序列比对。图4A呈现与图1A中所呈现相同的比对，除了图4A指示存在其它保守子序列。图4B呈现与图1C中所呈现相同的比对，除了图4A指示存在其它保守子序列。
图5A-1.说明H5HA的保守子序列特征的序列比对。图5A-1呈现与图1A中所呈现相同的比对，除了图5A-1指示存在其它保守子序列。
图5A-2呈现与图1C中所呈现相同的比对，除了图5A-2指示存在其它保守子序列。
图5B1-B5呈现其它H5HA序列比对。共同序列(SEQ ID NO：34)；AAL59142(SEQID NO：35)；AAZ29963(SEQ ID NO：36)；ABA70758(SEQ ID NO：37)；ABB87042(SEQID NO：38)；ABD 14810(SEQ ID NO：39)；ABD46740(SEQ ID NO：40)；ABD85144(SEQID NO：41)；以及ABE97569(SEQ ID NO：42)。
图5B-6展示其它禽类4(HA)H5N1病毒株。
图6.用于了解聚糖受体特异性的构架。α2-3-和/或α2-6-连接的聚糖可以采用不同拓扑。根据本发明，HA多肽结合于这些拓扑中的某些的能力赋予它介导不同宿主(例如人类)感染的能力。如此图中的图A所示，本发明定义两种尤其相关的拓扑，“锥形”拓扑和“伞形”拓扑。α2-3-和/或α2-6-连接的聚糖可以采用锥形拓扑，并且此锥形拓扑是连接于核心的短寡糖或分支链寡糖所特有的(不过某些长寡糖也可以采用这种拓扑)。伞形拓扑只可以由α2-6-连接的聚糖采用(这可能归因于由α2-6键联中存在的额外C5-C6键提供的构象多样性增加)，并且其主要是由长寡糖或具有长寡糖分支、尤其含有基序Neu5Acα2-6Galβ1-3/4GlcNAc-的分支链聚糖采用。如本文所述，HA多肽结合伞形聚糖拓扑的能力能够使其与人类受体结合和/或具有介导人类感染的能力。此图中的图B明确展示如分别由三糖基序-Neu5Acα2-3Galβ1-3/4GlcNAc和Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc的糖苷扭转角度决定的α2-3和α2-6的拓扑。确定参数(θ)-这些三糖基序中Neu5Ac的C2原子与后续Gal和GlcNAc糖的C1原子之间的角度以表征该拓扑。α2-3和α2-6基序的θ等高线与构象图叠置显示α2-3基序采用100％锥形拓扑，而所抽取的α2-6基序采用锥形与伞形拓扑(图C)。在由α2-3和α2-6抽取的锥形拓扑中，GlcNAc和后续糖沿跨越锥形的区域定位。HA与锥形拓扑的相互作用主要涉及编号位置(基于H3HA编号)处的氨基酸与Neu5Ac和Gal糖的接触。另一方面，在α2-6所独有的伞形拓扑中，GlcNAc和后续糖朝向HA结合位点弯曲(如在HA-α2-6共晶体结构中所观察)。较长α2-6寡糖(例如至少四糖)将偏好这种构象，因为它因GlcNAc与Neu5Ac的乙酰基之间的糖内凡得瓦尔接触(van der Waals contact)而稳定。HA与伞形拓扑的相互作用除涉及与Neu5Ac和Gal糖的接触以外，还涉及编号位置(基于H3HA编号)处的氨基酸与GlcNAc和后续糖的接触。此图中的图C描绘α2-3和α2-6的锥形和伞形拓扑构象抽取。部分(A)-(D)分别展示Neu5Acα2-3Gal、Neu5Acα2-6Gal、Galβ1-3GlcNAc以及Galβ1-4GlcNAc键联的构象(Φ，ψ)图。这些从GlycoMaps DB(http://www.glycosciences.de/modeling/glycomapsdb/)获得的图是使用利用MM3力场的从头计算MD模拟产生。能量分布是从深色开始(表示最高能量)到表示最低能量的浅色用颜色编码。圈住的区域1-5表示针对HA-聚糖共晶体结构中α2-3和α2-6寡糖观测的(Φ，ψ)值。Neu5Acα2-3Gal的反式构象(圈住的区域1)在HA结合袋中占优势，除了此构象(圈住的区域2)在A/爱知/2/68H3N2HA与α2-3的共晶体结构中不占优势。另一方面，Neu5Acα2-6Gal的顺式构象(圈住的区域3)在HA结合袋中占优势。由圈住的区域1和2抽取锥形拓扑，并且由圈住的区域3抽取伞形拓扑。部分(E)-(F)分别展示α2-3和α2-6基序的锥形和伞形拓扑抽取。使用构象图中的较深色区域作为外部边界来计算既定组的(Φ，ψ)值的θ参数(Neu5Ac的C2原子与后续Gal和GlcNAc糖的C1原子之间的角度)。基于能量截止，使用θ＞110°的值表征锥形拓扑并且使用θ＜100°表征伞形拓扑。θ等高线与构象能量图叠置表明α2-3基序采用100％锥形拓扑，因为它在能量方面不宜采用伞形拓扑。另一方面，对α2-6基序进行锥形与伞形拓扑抽取并且此抽取是基于Neu5Acα2-6Gal键联的ω角度(O-C6-C5-H5)分类。
图7.HA残基与锥形和伞形聚糖拓扑的相互作用。对HA-聚糖共晶体的分析揭示Neu5Ac相对于HA结合位点的位置几乎不变。与Neu5Ac的接触涉及高度保守的残基，如F98、S/T136、W153、H183以及L/I194。与其它糖的接触涉及不同残基，这取决于糖键联是α2-3还是α2-6以及聚糖拓扑是锥形还是伞形。举例来说，在锥形拓扑中，主要接触Neu5Ac和Gal糖。E190和Q226在此结合中具有尤其重要的作用。此图还展示可以参与结合于锥形结构的其它位置(例如137、145、186、187、193、222)。在一些情况下，不同残基可以与不同聚糖结构形成不同接触。这些位置中的氨基酸类型可以影响HA多肽与在聚糖结构中具有不同修饰和/或分支模式的受体结合的能力。在伞形拓扑中，形成与Neu5Ac和Gal以外的糖的接触。此图展示可以参与结合于伞形结构的残基(例如137、145、156、159、186、187、189、190、192、193、196、222、225、226)。在一些情况下，不同残基可以与不同聚糖结构形成不同接触。这些位置中的氨基酸类型可以影响HA多肽与在聚糖结构中具有不同修饰和/或分支模式的受体结合的能力。在一些实施例中，位置190处的D残基和/或位置225处的D残基促进与伞形拓扑的结合。
图8.示范性锥形拓扑。此图展示采用锥形拓扑的某些示范性(但不详尽)聚糖结构。
图9.示范性伞形拓扑。(A)可以采用伞形拓扑的某些示范性(但不详尽)N连接和O连接聚糖结构。(B)可以采用伞形拓扑的某些示范性(但不详尽)O连接聚糖结构。
图10A-B.人类支气管上皮细胞和人类结肠上皮细胞的聚糖型态。为进一步研究上呼吸道组织中的聚糖多样性，从HBE(代表性上呼吸道细胞系)中分离N连接聚糖并且使用MALDI-MS分析。通过用唾液酸酶S(α2-3特异性)和唾液酸酶A(裂解和SA)预处理样本来确定α2-6在HBE中的主要表达。具有长分支拓扑的聚糖的主要表达是通过代表性质量峰的TOF-TOF片段化分析来证实。为提供上呼吸道组织中聚糖多样性的参考，获得人类结肠上皮细胞(HT29；代表性肠道细胞系)的N连接聚糖型态。选择此细胞系是因为当前H5N1病毒已显示感染肠道细胞。唾液酸酶A和S预处理对照物显示α2-3聚糖在HT-29细胞中主要表达。此外，长链分支聚糖拓扑并不如关于HBE所观察的那样普遍。因此，H5N1HA的人类适应将涉及将使其能够与人类上呼吸道组织中所表达的不同聚糖(例如伞形聚糖)高亲和力结合的HA突变。
图11.Neu5Acα2-3Gal和Neu5Acα2-6Gal基序的构象图和溶剂可及性。图A展示Neu5Acα2-3Gal键联的构象图。圈住的区域2为在APR34_H1_23、ADU63_H3_23以及ADS97_H5_23共晶体结构中观察到的反式构象。圈住的区域1为在AAI68_H3_23共晶体结构中观察到的构象。图B展示Neu5Acα2-6Gal的构象图，其中在所有HA-α2-6唾液酸化聚糖共晶体结构中均观察到顺式构象(圈住的区域3)。图C展示在相应HA-聚糖共晶体结构中Neu5Acα2-3与α2-6唾液酸化寡糖的溶剂可及表面积(SASA)之间的差异。红色和青色条分别表示α2-6(正值)或α2-3(负值)唾液酸化聚糖中的Neu5Ac与聚糖结合位点更多地接触。图D展示结合于猪和人类H1(H1α2-3)、禽类和人类H3(H3α2-3)的α2-3唾液酸化聚糖中的NeuAc与结合于猪和人类H1(H1α2-6)的α2-6唾液酸化聚糖中的NeuAc的SASA之间的差异。H3α2-3的负值条表明与禽类H3相比人类H3HA与Neu5Acα2-3Gal接触较少。扭转角度-Φ：C2-C1-O-C3(对于Neu5Acα2-3/6键联)；ψ：C1-O-C3-H3(对于Neu5Acα2-3Gal)或C1-O-C6-C5(对于Neu5Acα2-6Gal)；ω：O-C6-C5-H5(对于Neu5Acα2-6Gal)键联。Φ、ψ图是从GlycoMaps DB(http://www.glycosciences.de/modeling/glycomapsdb/)获得，GlycoMaps DB是由马丁富兰克(Martin Frank)博士和克洛斯-维尔姆范德利特(Claus-Wilhelm von der Lieth)博士(德国海姆堡德国癌症研究院(German Cancer ResearchInstitute，Heidelberg，Germany)研发。从高能量到低能量的着色方案分别为从亮红色到亮绿色。
图12A-B.上呼吸道组织切片的凝集素染色。用榴莲凝素(Jacalin)(较浅)和ConA(较深)共染色气管组织揭示榴莲凝素(特异性结合于O连接聚糖)优先结合于气管顶表面上的杯状细胞，而ConA(特异性结合于N连接聚糖)优先结合气管纤毛上皮细胞。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，注意到此发现表明杯状细胞主要表达O连接聚糖而纤毛上皮细胞主要表达N连接聚糖。用榴莲凝素和SNA(深；特异性结合于α2-6)共染色气管显示SNA结合于杯状细胞和纤毛细胞。另一方面，榴莲凝素(较浅)和MAL(较深)(特异性结合于α2-3唾液酸化聚糖)的共染色显示MAL与气管假复层上皮细胞结合极少甚至不结合，但广泛结合所述组织的下层区域。总的说来，凝集素染色数据表明作为N连接与O连接聚糖的一部分的α2-6唾液酸化聚糖分别在气管上皮细胞顶侧的纤毛细胞和杯状细胞中主要表达和广泛分布。
图13：不同遗传进化枝之间的H5N1 HA的RBS比较。A/香港/486/97，遗传进化枝0(HK_486_97_c0)(SEQ ID NO：76)；A/鸭/湖南(Hunan)/795/02，遗传进化枝2.1.1(DK_湖南_795_02_c.2.1.1)(SEQ ID NO：77)；A/香港/213/03，遗传进化枝1(Hk_213_03_c1)(SEQ ID NO：78)；A/越南/1194/04，遗传进化枝1(Viet_1194_04_c1)(SEQ ID NO：79)；A/越南/1203/04，遗传进化枝1(Viet_1203_04_c1)(SEQ ID NO：80)；A/印度尼西亚/5/05，遗传进化枝2.1.3(Ind_5_05_c2.1.3)(SEQ ID NO：81)；A/安徽(Anhui)/1/05，遗传进化枝2.3.4(安徽_1_05_c2.3.4)(SEQ ID NO：82)；A/埃及/2786-NAMRU3/06，遗传进化枝2.2(埃及_2876-N3_06_c2.2)(SEQ ID NO：83)；A/鹅/贵阳(Guiyang)/337/06，遗传进化枝4(Go_Guiy_337_06_c4)(SEQ ID NO：84)；A/埃及/2321-NAMRU3/07，遗传进化枝2.2.1(埃及_2321-N3_07_c2.2.1)(SEQ ID NO：85)；A/埃及/3300-NAMRU3/08，遗传进化枝2.2.1(埃及_3300-N3_08_c.2.2.1)(SEQ ID NO：86)；A/普通喜鹊/香港/5052/07，遗传进化枝2.3.2(Mag_HK_5052_07_c.2.3.2)(SEQ ID NO：87)；A/鸡/越南/NCVD-016/2008，遗传进化枝7(Ck_Viet_NCVD-016_08_c7)(SEQ ID NO：88)。
图14：修改自斯提芬斯(Stevens)等人，2008，分子生物杂志(J.Mol.Biol.)，381：1382-94。Viet0304：A/越南/1203/04。Ind505：A/印度尼西亚/5/05。LS：HA的Q226L和G228S突变RBS。
图15：以剂量依赖性方式在包含代表性禽类和人类受体的聚糖阵列上分析Viet0304-LS和Viet0304-RLS(等效于Ind505-LS)HA。两种突变体均显示极弱α2-6结合(仅在高HA浓度下观察到结合信号)，此与人类适应HA享有的高亲和力α2-6结合相反。
图16：在LS突变的情形下N158处缺乏糖基化的H5N1 HA的剂量依赖性分析。在LS突变的情形下移除N158处的糖基化使人类受体结合亲和力增加到与针对人类适应H1N1和H2N2HA所观察相同的范围(Kd′约20pM)。在仅具有Q226L突变(即不具有LS突变的G228S)的H5HA模板上移除N158处的糖基化显示优先改善人类受体(与禽类受体相比)，但与N158-去糖基化LS突变相比实质上降低人类受体结合亲和力。
图17：比较人类适应H2N2 HA(Alb6_58)与H5N1(Viet1203_04)HA之间的RBS突出特征。H2N2 HA与H5N1 HA相比的四种差异包括：(1)包括缺失的H2N2 HA中的130环的组成，(2)H2N2 HA中的158位置处缺乏糖基化，(3)RBS基部涉及位置137、221、226以及228的氨基酸组成，以及(4)RBS顶部涉及位置188、192以及193的氨基酸组成。
图18：H5HA突变体的RBS与H2N2HA的RBS的比较。A1b6_58_H2N2(SEQ ID NO：89)：A/奥尔巴尼/6/58 H2N2 HA；Viet1203_04_D(SEQ ID NO：90)：A/越南/1203/04 HA的修饰型式；Viet1203_04_D_H2RBS(SEQ ID NO：91)：具有130处的缺失和13个氨基酸取代的Viet1203_04_D突变体；Viet1203_04_D_H2RBSmin(SEQ ID NO：92)：具有130处的缺失和7个取代的Viet1203_04_D突变体；ckEgy_07(SEQ ID NO：93)：130处已具有缺失的A/鸡/埃及/R2/2007 H5N1 HA；ckEgy_07_H2RBS(SEQ ID NO：94)：具有8个取代的ckEgy_07突变体；ckViet_08(SEQ ID NO：95)：在192和193位置处电荷已转变的A/鸡/越南/NCVD-093/2008 H5N1 HA；ckViet_08_H2RBS(SEQ ID NO：96)：具有130处的缺失和6个取代的ckViet_08突变体；ckViet_08H2RBSmin(SEQ ID NO：97)：具有130处的缺失和6个取代的ckViet_08突变体；ckViet_08_H2RBSmin(SEQ ID NO：98)：具有130处的缺失和4个取代的ckViet_08突变体。取代的残基位置呈粗体且突出显示。130环中的缺失以粗体突出显示。158处的糖基化突出显示。
图19：设计成使RBS的分子组成模拟人类适应H2N2 HA的分子组成的H5N1 HA(Viet1203_04_D_H2RBS)突变体的剂量依赖性分析。此突变体显示高度特异性高亲和力结合于人类受体，这是其它人类适应HA所特有的。此突变体对人类受体(6′SLN-LN)的结合亲和力是由约3pM的Kd′定量，其与人类适应H1N1和H2N2HA的结合亲和力在相同范围内。
图20：流行性HA的特征聚糖受体结合性质
来自原型人类适应流行性1918 H1N1(S1)和1958 H2N2(S2)和2009 H1N1(S3)病毒株的HA显示特异性高亲和力结合于人类受体(6′SLN-LN)，且极小甚至实质上较低亲和力结合(相对于人类受体亲和力)于禽类受体(3′SLN-LN)。另一方面，在Viet1203_04 H5N1HA序列中引入标志性LS突变并不转变在流行性HA情况下所见的它对人类受体结合的受体优先性。
图21：来自HA亚型的代表性序列的系统发育树
产生进化枝1和2HA的分支分别标记并着色为红色和蓝色。紧密相关的亚型定位于彼此接近的分支上。
图22：H5HA的RBS内的关键结构特征
图中展示的是呈现Alb6_58HA(灰色)和Viet0304(绿色)的RBS的草图，这些HA具有在这些HA之间为不同的氨基酸侧链。如文本中所述，区分H2和H5RBS的四个特征以红色虚线圆圈突出显示。
图23：代表性H2和H5HA的RBS的序列比对
将来自流行性H2N2病毒株(A/奥尔巴尼/6/58或Alb58)、来自1997-2006的代表性人类分离株(A/香港/486/97或HK_486_97、A/香港/213/03或HK_213_03、A/越南/1203/04或Viet1203_04、A/印度尼西亚/5/05或Ind_5_05、A/埃及/2786-NAMRU3或Egy_2786-N3_06)以及选择用于引入LS突变(ckEgy_07mutv5.3)的H5HA模板(A/鸡/埃及/R2/07或ckEgy_07)的HA序列进行比对。
图24：ckEgy_07和含有LS氨基酸改变的ckEgy_07的聚糖受体结合性质
在包含代表性人类和禽类受体的聚糖阵列平台上进行HA的剂量依赖性直接聚糖结合。A，野生型ckEgy_07 HA显示其它野生型H5N1 HA的典型特异性和高亲和力禽类受体结合特征。B，在此HA上引入LS突变定量地将其特异性转移到人类受体(6′SLN-LN)并且将其禽类受体结合实质上降低到最低程度。C，ckEgy_07LS突变体结合于主要在人类气管组织切片的顶表面上表达的生理人类受体。来自剂量依赖性结合型态以及突变体HA的人类气管组织染色的人类受体特异性和亲和力使得其在其它所需改变的情形下(如PB2)足以使含有此突变HA的H5N1病毒以气溶胶传播。
图25：在LS突变的情形下158位置处的糖基化损失对H5 HA的聚糖受体结合的影响的分析
A，ckEgy_07_LS突变显示类似于其它流行性HA的定量人类受体转变。B，展示修改自先前研究(S3)的A/加利福尼亚/04/2009 H1N1 HA的结合曲线供比较。C，Viet03_04_ALS突变体中的T160A突变去除N158处的糖基化序列子，引起此位点处的糖基化损失。虽然此突变体显示人类受体结合显著改善，但它保留大部分其禽类受体结合，此并不是流行性HA和ckEgy_07_LS突变体(顶图中)的特征。D，在天然地在158处缺乏糖基化的Egy_06 HA序列中引入的LS氨基酸突变还显示与Viet03_04_ALS突变体相同的结合型态。
图26：天然地获得特征2的H5N1 HA序列上的人类适应性氨基酸改变
A/鸡/越南/NCVD-093/2008禽类H5N1 HA已获得190-螺旋中的氨基酸改变，其中通常包含Thr的192位置已经突变为Lys并且通常包含Lys/Arg的193位置已经突变为Met。引入6个氨基酸改变和一个缺失以匹配特征1(130环中的缺失+A130T)和特征3(S137R/S221P/Q226L/S227G/G228S)产生突变HA，其定量地将其优先性转变到人类受体，甚至是在158处的糖基化存在下。然而，在不具有130环缺失的情况下引入糖基化改变的T160A损失以及LS引起与人类和禽类受体结合显著减少(数据未展示)。因此，对于这些H5N1 HA，在LS突变的情形下130环中的缺失与糖基化损失相比是更加关键的改变。
图27：近期禽类H5和人类H5N1分离株中的关键特征的出现
A，绘制HA已获得氨基酸改变以匹配H2HA RBS的特征1和4的禽类和人类H5N1分离株的百分比与病毒株分离年份的函数关系图。具有这些关键特征的分离株的百分比自从其在2007年初次出现后已显著增加。这些分离株序列的系统发育分析显示其属于进化枝2.2.1。B，HA已获得氨基酸改变以匹配H2 HA RBS的特征2的禽类和人类分离株的百分比。仅较小百分比的H5N1分离株已获得此特征。将来自NCBI流感病毒资源的全长非冗余HA序列进行比对，并且计算既定年份中每种特征出现的数目并且以百分比表示。使用总共2277个全长非冗余H5N1序列进行分析。
图28：用于聚糖阵列的聚糖的展开的名称
Neu5Ac：N-乙酰基D-神经氨酸；Gal：D-半乳糖；GlcNAc：N-乙酰基D-葡糖胺。α/β：吡喃糖的异头构型。所有糖均通过间隔子连接于生物素(-Sp-LC-LC-生物素，如http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecored5.shtml中所述)。
具体实施方式
HA序列元件的描述
HA序列元件1
HA序列元件1是近似对应于在天然流感分离株中发现的许多HA蛋白的残基97-185(其中使用H3 HA作为参考指定残基位置)的序列元件。此序列元件具有基本结构：
C(Y/F)P X1 C X2 W X3 W X4 H H P，其中：
X1为约30-45个氨基酸长；
X2为约5-20个氨基酸长；
X3为约25-30个氨基酸长；且
X4为约2个氨基酸长。
在一些实施例中，X1为约35-45或约35-43或约35、36、37、38、38、40、41、42或43个氨基酸长。在一些实施例中，X2为约9-15或约9-14或约9、10、11、12、13或14个氨基酸长。在一些实施例中，X3为约26-28或约26、27或28个氨基酸长。在一些实施例中，X4具有序列(G/A)(I/V)。在一些实施例中，X4具有序列GI；在一些实施例中，X4具有序列GV；在一些实施例中，X4具有序列AI；在一些实施例中，X4具有序列AV。在一些实施例中，HA序列元件1包含二硫键。在一些实施例中，此二硫键桥残基对应于位置97和139(基于本文中所用的标准H3编号系统)。
在一些实施例中，并且尤其在H1多肽中，X1为约43个氨基酸长，和/或X2为约13个氨基酸长，和/或X3为约26个氨基酸长。在一些实施例中，并且尤其在H1多肽中，HA序列元件1具有以下结构：
C Y P X1A T(A/T)(A/S)C X2 W X3 W X4 H H P，其中：
X1A为约27-42或约32-42或约32-40或约26-41或约31-41或约31-39或约31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，并且X2-X4如上文所述。
在一些实施例中，并且尤其在H1多肽中，HA序列元件1具有以下结构：
C Y P X1A T(A/T)(A/S)C X2 W(I/L)(T/V)X3A W X4 H H P，其中：
X1A为约27-42或约32-42或约32-40或约32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，
X3A为约23-28或约24-26或约24、25或26个氨基酸长，并且X2和X4如上文所述。
在一些实施例中，并且尤其在H1多肽中，HA序列元件1包括以下序列：
Q L S S I S S F E K，
其通常在X1内(包括在X1A内)，并且尤其约在X1的残基12处开始(如例如图1-3中所展示)。
在一些实施例中，并且尤其在H3多肽中，X1为约39个氨基酸长，和/或X2为约13个氨基酸长，和/或X3为约26个氨基酸长。
在一些实施例中，并且尤其在H3多肽中，HA序列元件1具有以下结构：
C Y P X1A S(S/N)(A/S)C X2 W X3 W X4 H H P，其中：
X1A为约27-42或约32-42或约32-40或约23-38或约28-38或约28-36或约28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，并且X2-X4如上文所述。
在一些实施例中，并且尤其在H3多肽中，HA序列元件1具有以下结构：
C Y P X1A S(S/N)(A/S)C X2 W L(T/H)X3A W X4 H H P，其中：
X1A为约27-42或约32-42或约32-40或约32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，
X3A为约23-28或约24-26或约24、25或26个氨基酸长，并且X2和X4如上文所述。
在一些实施例中，并且尤其在H3多肽中，HA序列元件1包括以下序列：
(L/I)(V/I)A S S G T L E F，
其通常在X1中(包括在X1A中)，并且尤其约在X1的残基12处开始(如例如图1、2和4中所展示)。
在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，X1为约42个氨基酸长，和/或X2为约13个氨基酸长，和/或X3为约26个氨基酸长。
在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下结构：
C Y P X1A S S A C X2 W X3 W X4 H H P，其中：
X1A为约27-42或约32-42或约32-40或约23-38或约28-38或约28-36或约28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，并且X2-X4如上文所述。
在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下结构：
C Y P X1A S S A C X2 W L I X3A W X4 H H P，其中：
X1A为约27-42或约32-42或约32-40或约32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，并且
X3A为约23-28或约24-26或约24、25或26个氨基酸长，并且X2和X4如上文所述。
在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1是用以下序列延伸(即在对应于残基186-193的位置处)：
N D A A E X X(K/R)
在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1包括以下序列：
Y E E L K H L X S X X N H F E K，
其通常在X1内，并且尤其约在X1的残基6处开始(如例如图1、2和5中所展示)。
HA序列元件2
HA序列元件2为近似对应于在天然流感分离株中发现的许多HA蛋白的残基324-340(再次使用基于H3HA的编号系统)的序列元件。此序列元件具有以下基本结构：
G A I A G F I E
在一些实施例中，HA序列元件2具有以下序列：
P X1 G A I A G F I E，其中：
X1为约4-14个氨基酸长或约8-12个氨基酸长或约12、11、10、9或8个氨基酸长。在一些实施例中，此序列元件提供HA0裂解位点，从而允许产生HA1和HA2。
在一些实施例中，并且尤其在H1多肽中，HA序列元件2具有以下结构：
P S(I/V)Q S R X1A G A I A G F I E，其中：
X1A为约3个氨基酸长；在一些实施例中，X1A为G(L/I)F。
在一些实施例中，并且尤其在H3多肽中，HA序列元件2具有以下结构：
P X K X T R X1A G A I A G F I E，其中：
X1A为约3个氨基酸长；在一些实施例中，X1A为G(L/I)F。
在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件2具有以下结构：
P Q R X X X R X X R X1A G A I A G F I E，其中：
X1A为约3个氨基酸长；在一些实施例中，X1A为G(L/I)F。
定义
亲和力：如所属领域中已知，“亲和力”为特定配体(例如HA多肽)与它的搭配物(例如与HA受体)结合的紧密度的量度。亲和力可以用不同方式测量。
结合：应了解如本文所用的术语“结合”通常是指试剂之间的非共价缔合。在本文中的许多实施例中，结合是关于特定聚糖(例如伞形拓扑聚糖或锥形拓扑聚糖)而阐述。所属领域的技术人员将了解，可以评估在多种情形中的任一种下的所述结合。在一些实施例中，评估游离聚糖的结合。在一些实施例中，评估与载剂连接(例如共价连接)的聚糖的结合。在一些所述实施例中，载剂为多肽。在一些实施例中，评估与HA受体连接的聚糖的结合。在所述实施例中，可以参考受体结合或聚糖结合。
结合剂：一般来说，术语“结合剂”在本文中用于指结合于如本文所述的聚糖(例如伞形拓扑聚糖)的任何实体。结合剂可以是任何化学类型。在一些实施例中，结合剂为多肽(包括例如抗体或抗体片段)；在一些所述实施例中，结合剂为HA多肽和/或其变异体和/或其特征部分；在一些实施例中，结合剂为氨基酸序列不包括HA特征序列的多肽(即“非HA多肽”)。在一些实施例中，结合剂为小分子。在一些实施例中，结合剂为核酸。在一些实施例中，结合剂为适体。在一些实施例中，结合剂为聚合物；在一些实施例中，结合剂为非聚合物。在一些实施例中，结合剂为碳水化合物。在一些实施例中，结合剂为凝集素。在一些实施例中，如本文所述的结合剂结合于具有伞形拓扑的唾液酸化聚糖。在一些实施例中，结合剂以高亲和力和/或特异性结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，与锥形拓扑聚糖相比，结合剂显示优先结合伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，结合剂与血球凝集素竞争结合于血球凝集素受体上的聚糖。在一些实施例中，结合剂与血球凝集素竞争结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，本文中所提供的结合剂为伞形拓扑阻断剂。在一些实施例中，本文中所提供的结合剂为伞形拓扑特异性阻断剂。在一些实施例中，结合剂结合于伞形拓扑聚糖模拟物。
生物活性：如本文所用，短语“生物活性”是指在生物系统中并且尤其是在有机体中具有活性的任何试剂的特征。举例来说，认为当投与有机体时对此有机体具有生物作用的试剂具有生物活性。在一些实施例中，当蛋白质或多肽具有生物活性时，共有此蛋白质或多肽的至少一种生物活性的蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物活性”部分
特征部分：如本文中所用，短语蛋白质或多肽的“特征部分”为含有连续一段氨基酸或连续多段氨基酸一起作为蛋白质或多肽的特征的部分。每一所述连续段通常将含有至少两个氨基酸。此外，所属领域的技术人员将了解，作为蛋白质的特征，通常需要至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或20个以上的氨基酸。一般来说，特征部分是除以上所规定的序列一致性外与相关完整蛋白质共有至少一种功能特征的部分。
特征序列：“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现并且因此可以由所属领域的技术人员用来定义家族成员的序列。
锥形拓扑：短语“锥形拓扑”在本文中用于指由某些聚糖并且具体来说是由HA受体上的聚糖采用的三维排列。如图6中所展示，α2-3唾液酸化聚糖或α2-6唾液酸化聚糖可以采用锥形拓扑，并且此锥形拓扑为短寡核苷酸链所特有，不过一些长寡核苷酸也可以采用这种构象。锥形拓扑的特征为Neu5Acα2-3Gal键联的糖苷扭转角度，该Neu5Acα2-3Gal键联抽取由约-60、约60或约180的Φ(C1-C2-O-C3/C6)值和-60到60的ψ(C2-O-C3/C6-H3/C5)样本所提供的具有极小能量构象的三个区域(图11)。图8呈现采用锥形拓扑的聚糖的某些代表性(但不详尽)实例。
对应于：如本文所用，术语“对应于”常用于指定HA多肽中氨基酸残基的位置/身份。所属领域的技术人员将了解，出于简单化的目的，本文中(如例如图1-5中所展示)使用标准编号系统(基于野生型H3HA)，因此，举例来说，“对应于”位置190处的残基的氨基酸无需实际上为特定氨基酸链中的第190位氨基酸，而是对应于在野生型H3HA中位置190处发现的残基；所属领域的技术人员易于了解如何识别对应氨基酸。
分隔度(degree of separation removed)：如本文所用，一定“分隔度”的氨基酸为对聚糖结合具有间接影响的HA氨基酸。举例来说，一分隔度的氨基酸可以：(1)与直接结合氨基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与宿主细胞HA受体所缔合的聚糖相互作用的能力；所述一分隔度的氨基酸可以或可以不直接结合于聚糖本身。二分隔度的氨基酸(1)与一分隔度的氨基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影响一分隔度的氨基酸与直接结合氨基酸相互作用的能力等。
直接结合氨基酸：如本文所用，短语“直接结合氨基酸”是指与一个或一个以上与宿主细胞HA受体缔合的聚糖直接相互作用的HA多肽氨基酸。
工程化：如本文所用，术语“工程化”描述氨基酸序列已经被人类选择的多肽。举例来说，工程化HA多肽具有与在天然流感分离株中发现的HA多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化HA多肽具有与NCBI数据库中所包括的HA多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
H1多肽：当本文中使用术语“H1多肽”时，其为氨基酸序列包括至少一个作为H1的特征并且使H1与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元件可以通过比对(如图1-3中所展示的那些比对)来确定，并且包括例如本文中关于HA序列元件的H1特异性实施例所述的那些序列元件。
H3多肽：当本文中使用术语“H3多肽”时，其为氨基酸序列包括至少一个作为H3的特征并且使H3与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元件可以通过比对(如图1、2和4中所展示的那些比对)确定，并且包括例如本文中关于HA序列元件的H3特异性实施例所述的那些序列元件。
H5多肽：当本文中使用术语“H5多肽”时，其为氨基酸序列包括至少一个作为H5的特征并且使H5与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽。代表性所述序列元件可通过比对(如图1、2和5中所展示的那些比对)确定，并且包括例如本文中关于HA序列元件的H5特异性实施例所述的那些序列元件。
HX多肽：当本文中使用术语“HX多肽”时，其为氨基酸序列包括至少一个作为HX的特征并且使HX与其它HA亚型相区别的序列元件的HA多肽，其中“X”是指HA亚型的编号(例如其中当“X”＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16时，分别地，“HX”＝H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16)。
血球凝集素(HA)多肽：如本文所用，术语“血球凝集素多肽”(或“HA多肽”)是指氨基酸序列包括至少一个HA特征序列的多肽。所属领域中已知多种来自流感分离株的HA序列；实际上，国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)保存有一个到本申请案申请时为止包括9796个HA序列的数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/flu.html)。所属领域的技术人员通过参考这一数据库，可以容易地识别通常作为HA多肽和/或作为特定HA多肽(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16多肽)或作为介导特定宿主(例如禽类、骆驼、犬、猫、麝猫、环境、马、人类、豹、貂、小鼠、海豹、石貂、猪、虎、鲸等)感染的HA的特征的序列。举例来说，在一些实施例中，HA多肽包括在流感病毒的天然分离株中发现的HA蛋白的约残基97与约185、约324与约340、约96与约100和/或约130与约230之间存在的一个或一个以上特征序列元件。在一些实施例中，HA多肽具有包含如本文中所定义的HA序列元件1和2中的至少一者的氨基酸序列。在一些实施例中，HA多肽具有包含HA序列元件1和2的氨基酸序列，在一些实施例中，所述序列元件彼此相隔约100到约200或约125到约175或约125到约160或约125到约150或约129到约139或约129、约130、约131、约132、约133、约134、约135、约136、约137、约138或约139个氨基酸。在一些实施例中，HA多肽具有包括在区域96-100和/或130-230内参与聚糖结合的位置处的残基的氨基酸序列。举例来说，许多HA多肽包括一个或一个以上以下残基：Tyr98、Ser/Thr136、Trp153、His183以及Leu/Ile194。在一些实施例中，HA多肽包括这些残基中的至少2、3、4或全部5个。
经分离：如本文所用，术语“经分离”是指试剂或实体(i)已经与至少一些最初产生(无论在自然界还是实验环境中)时其所缔合的组分分开；或(ii)由人类手工产生。经分离的试剂或实体可以与至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或90％以上的其最初所缔合的其它组分分开。在一些实施例中，经分离的试剂为超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％纯。
键联特异性阻断剂(LSBA)：如本文所用，术语“键联特异性阻断剂”是指结合于具有α2-6唾液酸化聚糖的HA受体的试剂。在一些实施例中，LSBA选择性地结合于具有α2-6唾液酸化聚糖的HA受体，其中亲和力是具有α2-3唾液酸化聚糖的HA受体的至少约40％、50％或75％。在一些实施例中，LSBA选择性地结合于具有α2-6唾液酸化聚糖的HA受体，其中亲和力是具有α2-3唾液酸化聚糖的HA受体的至少约2、4、5或10倍。在一些实施例中，LSBA对α2-6唾液酸化聚糖的亲和力是它对α2-3唾液酸化聚糖的亲和力的至少50％、100％、150％或200％。在一些实施例中，LSBA可以与血球凝集素竞争结合于HA受体。举例来说，LSBA可以基于键联特征(例如α2-6唾液酸化聚糖或α2-3唾液酸化聚糖)选择性地抑制流感病毒粒子(例如人类或禽流感病毒)与HA受体的结合。在一些实施例中，LSBA为多肽。在一些所述实施例中，LSBA多肽具有与天然存在的多肽的氨基酸序列实质上一致或实质上同源的氨基酸序列。在一些实施例中，LSBA多肽为HA多肽。在一些实施例中，LSBA多肽为天然存在的HA多肽或其片段。在一些实施例中，LSBA多肽具有与HA多肽的氨基酸序列无关的氨基酸序列。在一些实施例中，LSBA多肽为抗体或其片段。在一些实施例中，LSBA多肽为凝集素(例如SNA-1)。在一些实施例中，LSBA不为多肽。在一些实施例中，LSBA为小分子。在一些实施例中，LSBA为核酸。
长寡糖：出于本发明的目的，如果寡糖包括至少一个具有至少四个糖残基的直链，那么通常认为它为“长”的。
非天然氨基酸：短语“非天然氨基酸”是指具有氨基酸化学结构(即：
)并且因此能够参与至少两个肽键但R基团与自然界中所发现不同的实体。在一些实施例中，非天然氨基酸也可以具有不为氢的第二R基团和/或可以在胺基或羧酸部分上具有一个或一个以上其它取代。
多肽：一般来说，“多肽”为一串至少两个彼此通过肽键连接的氨基酸。在一些实施例中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，其各自借助于至少一个肽键与其它氨基酸连接。所属领域的技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或仍能够任选地整合到多肽链中的其它实体。
纯：如本文所用，如果试剂或实体实质上不含其它组分，那么它为“纯”的。举例来说，通常认为含有超过约90％特定试剂或实体的制剂为纯制剂。在一些实施例中，试剂或实体为至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯。
短寡糖：出于本发明的目的，如果寡糖在任何直链中具有小于4个或肯定小于3个残基，那么通常认为它为“短”的。
特异性：如所属领域中已知，“特异性”为特定配体(例如HA多肽)区别它的结合搭配物(例如人类HA受体，并且尤其是人类上呼吸道HA受体)与其它潜在的结合搭配物(例如禽类HA受体)的能力的量度。
实质同源性：短语“实质同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的技术人员将了解，如果两个序列在对应位置中含有同源残基，那么通常认为它们是“实质上同源的”。同源残基可以是一致残基。或者，同源残基可以是适当地具有类似结构和/或功能特征的非一致残基。举例来说，如所属领域的技术人员众所周知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或分类为具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸取代相同类型的另一种氨基酸常可以被认为是“同源”取代。典型氨基酸分类概述如下：
如所属领域中众所周知，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空隙BLAST以及PSI-BLAST。示范性所述程序描述于阿尔丘尔(Altschul)等人，基础局部比对检索工具(Basic local alignment search tool)，分子生物杂志，215(3)：403-410，1990；阿尔丘尔等人，酶学方法(Methods in Enzymology)；阿尔丘尔等人，“空隙BLAST和PSI-BLAST：新型蛋白质数据库检索程序的产生(Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs)”，核酸研究(NucleicAcids Res.)，25：3389-3402，1997；巴谢瓦尼斯(Baxevanis)等人，生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南(Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins)，威利出版社(Wiley)，1998；以及密申纳(Misener)等人(编)，生物信息学方法和方案(Bioinformatics Methods and Protocols)(分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)，第132卷)，胡马纳出版社(Humana Press)，1999；所有前述文献均以引用的方式并入本文中。除识别同源序列以外，上述程序通常还指示同源程度。在一些实施例中，如果两个序列中在相关段残基上至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的对应残基为同源的，那么认为它们为实质上同源的。在一些实施例中，相关段为整个序列。在一些实施例中，相关段为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或500个以上的残基。
实质一致性：短语“实质一致性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的技术人员将了解，如果两个序列在对应位置中含有一致残基，那么通常认为它们是“实质上一致的”。如所属领域中众所周知，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空隙BLAST以及PSI-BLAST。示范性所述程序描述于阿尔丘尔等人，基础局部比对检索工具，分子生物杂志，215(3)：403-410，1990；阿尔丘尔等人，酶学方法；阿尔丘尔等人，“空隙BLAST和PSI-BLAST：新型蛋白质数据库检索程序的产生”，核酸研究，25：3389-3402，1997；巴谢瓦尼斯等人，生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南，威利出版社，1998；以及密申纳等人(编)，生物信息学方法和方案(分子生物学方法，第132卷)，胡马纳出版社，1999；所有前述文献均以引用的方式并入本文中。除识别一致序列以外，上述程序通常还指示一致程度。在一些实施例中，如果两个序列中在相关段残基上至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的对应残基为一致的，那么认为它们为实质上一致的。在一些实施例中，相关段为整个序列。在一些实施例中，相关段为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或500个以上的残基。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指引发所需生物或药理学效应的任何试剂。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于减轻疾病、病症或病状的一种或一种以上症状或方面、延缓其发作、降低其严重程度或发病率或预防其的任何方法。出于本发明的目的，可在症状发作之前、期间和/或之后施以治疗。
伞形拓扑：短语“伞形拓扑”在本文中用于指由某些聚糖并且具体来说是由HA受体上的聚糖采用的三维排列。本发明认识到，与伞形拓扑聚糖结合为介导人类宿主感染的HA蛋白的特征。如图6中所展示，伞形拓扑通常仅由α2-6唾液酸化聚糖采用，并且是长(例如大于四糖)寡糖所特有的。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为展现实质上类似于图6(右图)中所呈现的结构的三维结构的聚糖。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为图6(右图)中所示的通过氨基酸残基接触HA多肽的聚糖。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为图6(右图)中所示的能够接触和/或特异性结合于氨基酸结合袋的聚糖。在一些实施例中，聚糖结构拓扑是基于参数θ来分类，此参数θ定义为Sia的C2、Gal的C1以及GlcNAc的C1之间的角度。θ＜100°的值表示由α2-3和链α2-6聚糖采用的锥形拓扑。θ＞110°的值表示伞形拓扑，如由链α2-6聚糖采用的拓扑(图6)。伞形拓扑的一个实例是由约-60的Neu5Acα2-6Gal键联的Φ角提供(参见例如图11)。图9呈现可以采用伞形拓扑的聚糖的某些代表性(但不详尽)实例。图9中所呈现的长α2-6基序包括发现作为生物N连接聚糖、O连接聚糖以及糖脂的一部分的在非还原性末端连接于长链(例如至少三糖)的Neu5Acα2-6。框内插入物展示发现作为以高亲和力结合于HA的生物聚糖的一部分的伞形拓扑长α2-6聚糖部分的实例。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖(例如在一位点处)包含比例大于短α2-6(例如单乳糖胺)分支的长(例如多个乳糖胺单元)α2-6寡糖分支。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖(例如在一位点处)包含的长α2-6寡糖分支是短α2-6(例如单乳糖胺)分支的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或大于约50倍。在一些实施例中，HA与伞形拓扑聚糖和/或聚糖诱饵相互作用的独特特征为HA与在非还原性末端处包含唾液酸(SA)和/或SA类似物的聚糖接触。在一些实施例中，寡糖的链长为至少三糖(不包括SA或SA类似物)。在一些实施例中，图6右侧图中所示的编号残基的组合涉及与伞形拓扑的接触。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为具有以下形式的寡糖：
Neu5Acα2-6Sug 1-Sug2-Sug3
其中：
(a)Neu5Ac α2-6通常(但未必)处于非还原性末端；
(b)Sug1：
(i)为呈α或β构型(常常对于N连接和O连接延伸为β构型，而在O连接于糖蛋白的GalNAcα-情况下为α构型)的己糖(常常为Gal或Glc)或己糖胺(GlcNAc或GalNAc)；
(ii)除Neu5Acα2-6以外没有糖连接于Sug1的任何非还原性位置(除了当Sug1为O连接于糖蛋白的GalNAcα-时)；和/或
(iii)如硫酸盐、磷酸盐、胍、胺、N-乙酰基等非糖部分可以连接于Sug1的非还原性位置(通常为位置6)(例如以改善与HA的接触)；
(c)Sug2和/或Sug3：
(i)为呈α或β构型(常常为β)的己糖(常常为Gal或Glc)或己糖胺(GlcNAc或GalNAc)；和/或
(ii)糖(如Fuc)或如硫酸盐、磷酸盐、胍、胺、N-乙酰基等非糖部分可以连接于Sug2、Sug3和/或Sug4的非还原性位置；
(d)寡糖中任两个糖之间的键联与Neu5Acα2-6键联的间隔可以为1-2、1-3、1-4和/或1-6(通常为1-3或1-4)；和/或
(e)Neu5Acα2-6与O连接于糖蛋白的GalNAcα连接并且其它糖连接于GalNAcα的非还原性末端的结构，例如
(i)Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα-
(ii)Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα-
伞形拓扑阻断剂(UTBA)：如本文所用，术语“伞形拓扑阻断剂”是指结合于具有伞形拓扑聚糖的HA受体的试剂。在一些实施例中，UTBA结合于在人类上气管中发现的具有伞形拓扑聚糖的HA受体。UBTA可以结合于伞形拓扑聚糖和/或锥形拓扑聚糖。在一些实施例中，UTBA以其对锥形拓扑聚糖的亲和力的50％、100％、150％或200％选择性地结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，UTBA以其对锥形拓扑聚糖的亲和力的50％-150％选择性地结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，UTBA以与对锥形拓扑聚糖大约相同的亲和力结合于伞形拓扑聚糖。举例来说，在一些实施例中，UTBA以其结合锥形拓扑聚糖(例如3′SLN-LN)亲和力的约50％-200％、50％-150％或约相同的亲和力结合伞形拓扑聚糖(例如6′SLN-LN)。在一些实施例中，UTBA基于HA受体的聚糖拓扑(例如伞形或锥形)选择性地抑制流感病毒粒子(例如人类或禽流感病毒)与所述受体的结合。在一些实施例中，UTBA为多肽。在一些所述实施例中，UTBA多肽具有与天然存在的多肽的氨基酸序列实质上一致或实质上同源的氨基酸序列。在一些实施例中，UTBA多肽为HA多肽。在一些实施例中，UTBA多肽为天然存在的HA多肽或其片段。在一些实施例中，UTBA多肽具有与HA多肽的氨基酸序列无关的氨基酸序列。在一些实施例中，UTBA多肽为抗体或其片段。在一些实施例中，UTBA多肽为凝集素(例如SNA-1)。在一些实施例中，UTBA不为多肽。在一些实施例中，UTBA为小分子。在一些实施例中，UTBA为核酸。
伞形拓扑聚糖模拟物：“伞形拓扑聚糖模拟物”为除伞形拓扑聚糖以外，结合于如本文所述的结合剂的试剂。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖模拟物为结合于HA多肽的试剂。在一些所述实施例中，伞形拓扑聚糖模拟物为与选自由以下残基组成的群组的HA多肽残基相互作用的试剂：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227、228以及其组合。在一些所述实施例中，伞形拓扑聚糖模拟物为与选自由以下残基组成的群组的HA多肽残基相互作用的试剂：130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及其组合。在一些所述实施例中，伞形拓扑聚糖模拟物为与选自由以下残基组成的群组的HA多肽残基相互作用的试剂：160、192、193以及其组合。应注意上文所陈述的氨基酸位置是基于H3HA编号。在一些实施例中，HA拓扑聚糖模拟物为与伞形拓扑聚糖竞争与HA多肽相互作用的试剂。
伞形拓扑特异性阻断剂(UTSBA)：如本文所用，术语“伞形拓扑特异性阻断剂”是指结合于在人类上气管中发现的具有伞形拓扑聚糖的HA受体的试剂。UTSBA选择性地结合伞形拓扑聚糖HA。举例来说，UTSBA以其结合于锥形拓扑聚糖(例如3′SLN-LN)亲和力的约至少2倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的亲和力结合伞形拓扑聚糖(例如6′SLN-LN)。通常，UTSBA对伞形拓扑聚糖的亲和力大于1nM。通常，UTSBA对锥形拓扑聚糖的亲和力较小，至少在伞形拓扑聚糖对人类适应HA(如SC18、Mos99、Tx91等)和α2-6结合植物凝集素(如SNA-I)的结合亲和力的2到3个数量级内。如由剂量依赖性直接结合分析(图19和20)所测量的UTSBA的结合亲和力通常将为至少1nM。通常，UTSBA对锥形拓扑聚糖的亲和力比锥形拓扑聚糖对禽类HA(如Viet0405、Av18等)的结合亲和力小至多1到3个数量级。在一些实施例中，UTSBA基于聚糖拓扑(例如伞形或锥形)选择性地抑制流感病毒粒子(例如人类或禽流感病毒)与HA受体(例如H1、H2或H3或人类适应H5、H7或H9)的结合。在一些实施例中，UTSBA为多肽。在一些所述实施例中，UTSBA多肽具有与天然存在的多肽的氨基酸序列实质上一致或实质上同源的氨基酸序列。在一些实施例中，UTSBA多肽为HA多肽。在一些实施例中，UTSBA多肽为天然存在的HA多肽或其片段。在一些实施例中，UTSBA多肽具有与HA多肽的氨基酸序列无关的氨基酸序列。在一些实施例中，UTSBA多肽为抗体或其片段。在一些实施例中，UTSBA多肽为凝集素(例如SNA-1)。在一些实施例中，UTSBA不为多肽。在一些实施例中，UTSBA为小分子。在一些实施例中，UTSBA为核酸。
疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种”是指投与一种打算例如对致病因子产生免疫反应的组合物。出于本发明的目的，可以在暴露于致病因子之前、期间和/或之后施以疫苗接种，并且在一些实施例中，可以在暴露于所述因子之前、期间和/或之后立即施以疫苗接种。在一些实施例中，疫苗接种包括间隔适当时间，多次投与疫苗接种组合物。
变异体：如本文所用，术语“变异体”为描述相关特定多肽(例如HA多肽)与序列用于比较的“亲本”多肽之间的关系的相对术语。如果除特定位置处的少量序列改变以外相关多肽具有与亲本的氨基酸序列一致的氨基酸序列，那么认为此相关多肽为亲本多肽的“变异体”。通常，与亲本相比，变异体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被取代。在一些实施例中，与亲本相比，变异体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个被取代的残基。变异体常具有极小数目(例如少于5、4、3、2或1个)的被取代功能残基(即参与特定生物活性的残基)。此外，与亲本相比，变异体通常具有不超过5、4、3、2或1个添加或缺失，并且常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常均少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6，并且通常少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施例中，亲本多肽为在自然界中发现的多肽。举例来说，亲本HA多肽可以为在流感病毒的天然(例如野生型)分离株中发现的多肽(例如野生型HA)。
载体：如本文所用，“载体”是指一种核酸分子，它能够转运已连接的另一核酸。在一些实施例中，载体能够在如真核或原核细胞等宿主细胞中进行染色体外复制和/或表达与它们连接的核酸。能够引导可操作性连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。
野生型：如所属领域中所了解，短语“野生型”通常是指如在自然界中发现的蛋白质或核酸的正常形式。举例来说，野生型HA多肽在天然流感病毒分离株中发现。多种不同的野生型HA序列可见于NCBI流感病毒序列数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html中。
某些实施例的详细描述
本发明提供结合于伞形拓扑聚糖的结合剂(例如HA多肽、HA多肽变异体、LSBA、UTBA、UTSBA等)。在一些实施例中，本发明提供与在特定目标物种的HA受体上发现的伞形拓扑聚糖结合的结合剂。举例来说，在一些实施例中，本发明提供与在人类HA受体(例如在人类上皮细胞上发现的HA受体)上发现的伞形拓扑聚糖结合的结合剂，并且尤其是与在上呼吸道中的人类HA受体上发现的伞形拓扑聚糖结合的结合剂。
本发明提供与在人类上呼吸道中的细胞上发现的HA受体结合的结合剂，并且具体来说提供以指定亲和力和/或特异性与所述受体(和/或其聚糖，尤其是其伞形聚糖)结合的结合剂。
在一些实施例中，根据本发明的结合剂为或包含HA多肽序列。在一些实施例中，根据本发明的结合剂包含在一个或一个以上选自由以下残基组成的群组的残基处不同于天然存在的亲本HA多肽序列的HA多肽序列：130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及其组合。在一些实施例中，根据本发明的结合剂包含在一个或一个以上选自由以下残基组成的群组的残基处不同于天然存在的亲本HA多肽序列的HA多肽序列：160、192、193以及其组合。
本发明认识到，获得结合伞形拓扑聚糖(例如长α2-6唾液酸化聚糖)的能力并且尤其是以高亲和力结合的能力可以赋予HA多肽变异体感染人类的能力(其中其亲本HA多肽不能)。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，本发明人提出与伞形拓扑聚糖结合极为重要，并且尤其提出可不需要损失与其它聚糖类型的结合。
本发明进一步提供与根据本发明的结合剂(例如HA多肽、HA多肽变异体、UTBA、UTSBA等)相关的多种试剂和方法，包括例如用于识别其的系统、用于制备其的策略、
与其结合的抗体以及与其相关的多种诊断和治疗方法。以下呈现本发明的这些方面和其它方面的某些实施例的进一步描述。
血球凝集素(HA)
流感病毒为RNA病毒，其特征为脂膜包膜含有嵌入病毒颗粒膜内的两个糖蛋白，血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。存在16种已知的HA亚型和9种NA亚型，并且不同流感病毒株是基于病毒株的HA和NA亚型的数目来命名。基于氨基酸序列一致性和晶体结构的比较，已将HA亚型划分成两个主要群组和四个较小的进化枝。不同HA亚型未必共有高度的氨基酸序列一致性，但不同HA亚型的整体3D结构彼此类似，具有可以用于达成分类目的的若干细微差异。举例来说，膜远端子域相对于中心α-螺旋的特定取向为一种通常用于判定HA亚型的结构特征(拉塞尔(Russell)等人，2004，病毒学(Virology)，325：287；其以引用的方式并入本文中)。
HA以称为H1-H16的16种亚型之一的同源三聚体形式存在于膜中。迄今为止，这些亚型中仅三种(H1、H2以及H3)已适应于人类感染。已适应于感染人类的HA(例如来自流行性H1N1(1918)和H3N2(1967-68)流感亚型的HA)的一种已报导的特征为与优先结合于α2-3唾液酸化聚糖的其禽类祖细胞相比，其能够优先结合于α2-6唾液酸化聚糖(斯科尔(Skehel)和怀利(Wiley)，2000，生物化学年度评论(Annu Rev Biochem)，69：531；罗格(Rogers)和波尔逊(Paulson)，1983，病毒学，127：361；罗格等人，1983，自然(Nature)，304：76；苏特(Sauter)等人，1992，生物化学(Biochemistry)，31：9609；康诺(Connor)等人，1994，病毒学，205：17；塔姆佩(Tumpey)等人，2005，科学(Science)，310：77；所有这些文献均以引用的方式并入本文中)。然而，本发明认识到，感染人类宿主的能力与结合于具有特定键联的聚糖的相关性较小，并且与结合于具有特定拓扑的聚糖的相关性较大。因此，本发明证实介导人类感染的HA与伞形拓扑聚糖结合，常显示伞形拓扑聚糖优先于锥形拓扑聚糖(即使锥形拓扑聚糖可能为α2-6唾液酸化聚糖)。
与唾液酸化寡糖(具有α2-3与α2-6键联)结合的来自H1(人类和猪)、H3(禽类)以及H5(禽类)亚型的HA的若干晶体结构为可得的，并且可在分子水平上了解HA与这些聚糖的不同相互作用中所涉及的特定氨基酸(艾森(Eisen)等人，1997，病毒学，232：19；哈(Ha)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，98：11181；哈等人，2003，病毒学，309：209；盖博林(Gamblin)等人，2004，科学，303：1838；斯提芬斯(Stevens)等人，2004，科学，303：1866；拉塞尔等人，2006，糖偶联物杂志(Glycoconj J)，23：85；斯提芬斯等人，2006，科学，312：404；所有这些文献均以引用的方式并入本文中)。
举例来说，单独或与α2-3或α2-6唾液酸化寡糖结合的H5(A/鸭/新加坡/3/97)的晶体结构识别直接与所结合的聚糖相互作用的某些氨基酸，以及一或一以上分隔度的氨基酸(斯提芬斯等人，2001，美国国家科学院院刊，98：11181；其以引用的方式并入本文中)。在一些情况下，这些残基的构象在结合状态与未结合状态下是不同的。举例来说，Glu190、Lys193以及Gln226都参与直接结合相互作用并且在结合状态与未结合状态下具有不同的构象。在Glu190近端的Asn186的构象在结合状态与未结合状态下也显著不同。
结合剂
如上文所提到，本发明发现，结合于伞形拓扑聚糖与介导特定宿主(包括例如人类)感染的能力有关。因此，本发明提供结合于伞形聚糖(和/或伞形拓扑聚糖模拟物)的结合剂(例如HA多肽、HA多肽变异体、LSBA、UTBA、UTSBA等)。在一些实施例中，根据本发明的结合剂以高亲和力结合于伞形聚糖(和/或伞形拓扑聚糖模拟物)。在一些实施例中，根据本发明的结合剂常以高亲和力和/或特异性结合于多种不同伞形拓扑聚糖。
在一些实施例中，根据本发明的结合剂以高亲和力结合于伞形拓扑聚糖(例如长α2-6唾液酸化聚糖，如Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-)。举例来说，在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于伞形拓扑聚糖的亲和力与对介导人类感染的野生型HA(例如H1N1HA或H3N2HA)所观察到的亲和力相当。在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于伞形聚糖的亲和力是在可比较的条件下对介导人类感染的野生型HA所观察到的亲和力的至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于伞形聚糖的亲和力大于在可比较的条件下对介导人类感染的野生型HA所观察到的亲和力。
在一些实施例中，在一定浓度范围内评估根据本发明的结合剂的结合亲和力。这种策略比单一浓度分析提供显著更多的信息，尤其是在多价结合分析中。举例来说，在一些实施例中，在至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或10倍以上的浓度范围内评估根据本发明的结合剂的结合亲和力。
在一些实施例中，如果根据本发明的结合剂在多价聚糖阵列结合分析(如本文所述的那些分析)中显示饱和信号，那么其显示高亲和力。在一些实施例中，如果根据本发明的结合剂在所述研究中显示高于约400000或400000以上(例如高于约500000、约600000、约700000、约800000等)的信号，那么其显示高亲和力。在一些实施例中，如本文所述的结合剂在至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或5倍以上的浓度范围内，并且在一些实施例中在大至10倍或10倍以上的浓度范围内显示饱和结合于伞形聚糖。
此外，在一些实施例中，根据本发明的结合剂与伞形拓扑聚糖(和/或伞形拓扑聚糖模拟物)结合比其与锥形拓扑聚糖结合得强。在一些实施例中，相较于锥形聚糖，根据本发明的结合剂对伞形聚糖显示约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2的相对亲和力。
在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于α2-6唾液酸化聚糖；在一些实施例中，根据本发明的结合剂优先结合于α2-6唾液酸化聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于多种不同的α2-6唾液酸化聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂不能结合于α2-3唾液酸化聚糖，而在一些实施例中根据本发明的结合剂能够结合于α2-3唾液酸化聚糖。
在一些实施例中，根据本发明的结合剂与在人类上呼吸道上皮细胞上发现的受体结合。在一些实施例中，根据本发明的结合剂与支气管和/或气管中的HA受体结合。在一些实施例中，根据本发明的结合剂不能结合深肺中的受体，而在一些实施例中，根据本发明的结合剂能够结合深肺中的受体。
在一些实施例中，根据本发明的结合剂与至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或95％以上的在人类上呼吸道组织(例如上皮细胞)中的HA受体上发现的聚糖结合。
在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于图9中所展示的一种或一种以上聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于图9中所展示的多种聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂以高亲和力和/或特异性结合于图9中所展示的聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂与其结合于图8中所展示的聚糖相比优先结合于图9中所展示的聚糖。在一些实施例中，根据本发明的结合剂结合于具有以下形式的寡糖：
Neu5Acα2-6Sug 1-Sug2-Sug3
其中：
1.Neu5Ac α2-6总是或几乎总是处于非还原性末端；
2.Sug1：
a.为呈α或β构型(常常对于N连接和O连接延伸为β构型，而在O连接于糖蛋白的GalNAcα-情况下为α构型)的己糖(常常为Gal或Glc)或己糖胺(GlcNAc或GalNAc)；
b.除Neu5Acα2-6以外应没有糖连接于Sug1的任何非还原性位置(除了当Sug1为O连接于糖蛋白的GalNAcα-时)；和/或
c.如硫酸盐、磷酸盐、胍、胺、N-乙酰基等非糖部分可以连接于Sug1的非还原性位置(通常为位置6)以改善与HA的接触；
3.Sug2和/或Sug3：
a.为呈α或β构型(常常为β)的己糖(常常为Gal或Glc)或己糖胺(GlcNAc或GalNAc)；和/或
b.糖(如Fuc)或如硫酸盐、磷酸盐、胍、胺、N-乙酰基等非糖部分可以连接于Sug2、Sug3和/或Sug4的非还原性位置；
4.寡糖中任两个糖之间的键联与Neu5Acα2-6键联的间隔可以为1-2、1-3、1-4和/或1-6(通常为1-3或1-4)；和/或
5.Neu5Acα2-6与O连接于糖蛋白的GalNAcα连接并且其它糖连接于GalNAcα的非还原性末端的结构，例如
i.Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα-
ii Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα-
本发明提供具有指定结合特异性的结合剂，并且还提供关于伞形聚糖具有指定结合特征的结合剂。
下文更详细地描述本发明所提供的某些特定结合剂。
HA多肽
在一些实施例中，根据本发明的结合剂为HA多肽。举例来说，本发明提供具有指定结合特异性的经分离HA多肽，并且还提供关于伞形聚糖具有指定结合特征的工程化HA多肽。
在一些实施例中，所提供的具有指定结合特征的HA多肽为H1多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H2多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H3多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H4多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H5多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H6多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H7多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H8多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H9多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H10多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H11多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H12多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H13多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H14多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H15多肽。在一些实施例中，具有指定结合特征的根据本发明的HA多肽为H16多肽。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽不包括来自以下任何病毒株的H1蛋白：A/南卡罗莱纳/1/1918；A/波多黎各/8/1934；A/台湾(Taiwan)/1/1986；A/德克萨斯/36/1991；A/北京(Beijing)/262/1995；A/约翰内斯堡(Johannesburg)/92/1996；A/新喀里多尼亚(NewCaledonia)/20/1999；A/所罗门群岛(Solomon Islands)/3/2006。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽不为来自1957-58的亚洲流感传染病的任何病毒株的H2蛋白。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽不包括来自以下任何病毒株的H2蛋白：A/日本(Japan)/305+/1957；A/新加坡/1/1957；A/台湾/1/1964；A/台湾/1/1967。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽不包括来自以下任何病毒株的H3蛋白：A/爱知/2/1968；A/菲律宾(Philippines)/2/1982；A/密西西比(Mississippi)/1/1985；A/列宁格勒(Leningrad)/360/1986；A/四川(Sichuan)/2/1987；A/上海(Shanghai)/11/1987；A/北京/353/1989；A/山东(Shandong)/9/1993；A/约翰内斯堡/33/1994；A/南昌(Nanchang)/813/1995；A/悉尼(Sydney)/5/1997；A/莫斯科/10/1999；A/巴拿马(Panama)/2007/1999；A/怀俄明(Wyoming)/3/2003；A/俄克拉何马(Oklahoma)/323/2003；A/加利福尼亚(California)/7/2004；A/威斯康星(Wisconsin)/65/2005。
变异HA多肽
在一些实施例中，所提供的HA多肽为亲本HA多肽的变异体，因为它的氨基酸序列除少量特定序列改变以外与亲本HA的氨基酸序列一致。在一些实施例中，亲本HA为在流感病毒的天然分离株中发现的HA多肽(例如野生型HA多肽)。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体与其相应亲本HA多肽相比具有不同的聚糖结合特征。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对伞形聚糖(例如与锥形聚糖相比)具有较大的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，所述HA多肽变异体为工程化变异体。
在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对伞形聚糖具有较大的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对锥形拓扑聚糖具有降低的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对伞形聚糖具有较大的亲和力和/或特异性而对锥形拓扑聚糖具有降低的亲和力和/或特异性。
在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对α2-6聚糖具有较大的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对α2-3聚糖具有降低的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对α2-6和α2-3聚糖具有较大的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对α2-6聚糖具有较大的亲和力和/或特异性而对α2-3聚糖具有降低的亲和力和/或特异性。
在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对伞形拓扑聚糖和α2-3聚糖具有较大的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对伞形拓扑聚糖具有较大的亲和力和/或特异性而对α2-3聚糖具有降低的亲和力和/或特异性。
在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对α2-6聚糖和锥形拓扑聚糖具有较大的亲和力和/或特异性。在一些实施例中，根据本发明的HA变异多肽与其同源亲本HA多肽相比对α2-6聚糖具有较大的亲和力和/或特异性而对锥形拓扑聚糖具有降低的亲和力和/或特异性。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体含有一个或一个以上与在不同HA亚型中发现的HA序列一致的序列改变。举一个特定实例来说，在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体含有一个或一个以上使H5HA多肽变异体更加类似于H2HA多肽的序列改变。举另一个特定实例来说，在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体含有一个或一个以上使H5HA多肽变异体更加类似于H1HA多肽的序列改变。
本发明尤其认识到，与参考HA多肽相比，具有改变的糖基化的HA多肽变异体(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16HA多肽变异体)可以对人类HA受体显示2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或大于10,000倍的亲和力。本发明尤其还认识到，与参考HA多肽(例如SEQ ID NO：43-55中的任一者的HA多肽)相比，在HA环形区中具有改变的HA多肽变异体(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16HA多肽变异体)可以对人类HA受体显示2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或大于10,000倍的亲和力。
本发明尤其认识到，与参考HA多肽相比，具有改变的糖基化的HA多肽变异体(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16HA多肽变异体)可以对人类HA受体显示2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或大于10,000倍的特异性。本发明尤其还认识到，与参考HA多肽(例如SEQ ID NO：43-55中的任一者的HA多肽)相比，在HA环形区中具有改变的HA多肽变异体(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16HA多肽变异体)可以对人类HA受体显示2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或大于10,000倍的特异性。
在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/南卡罗莱纳/1/18(H1N1)(SEQ ID NO：43)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/布里斯班/59/07(SEQ ID NO：44)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/加利福尼亚/04/09(SEQ ID NO：45)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/奥尔巴尼/6/58(H2N2)(SEQ ID NO：46)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/爱知/1/68(SEQ ID NO：47)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/莫斯科/10/99(SEQ ID NO：48)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/珀斯/16/09(SEQ ID NO：49)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/越南/1203/04(SEQ ID NO：50)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/埃及/2786-NAMRU3/06(SEQ ID NO：51)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/纽约/107/03(SEQ ID NO：52)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/香港/486/97(SEQ ID NO：53)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/香港/213/03(SEQ ID NO：54)的HA。在一些实施例中，参考HA多肽为来自A/印度尼西亚/5/05(SEQ ID NO：55)的HA。
在一些实施例中，具有改变的聚糖结合特征的HA多肽变异体在聚糖结合位点内或影响聚糖结合位点的残基中具有一个或一个以上序列改变。在一些实施例中，所述取代为直接与所结合的聚糖相互作用的氨基酸的取代；在一些实施例中，所述取代为离与所结合聚糖相互作用的氨基酸有一分隔度的氨基酸的取代，因为一分隔度的氨基酸(1)与直接结合的氨基酸相互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不直接与聚糖本身相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，并且也直接与聚糖本身相互作用。根据本发明的HA多肽变异体含有一个或一个以上直接结合氨基酸、一个或一个以上第一分隔度氨基酸、一个或一个以上第二分隔度氨基酸或这些氨基酸的任何组合的取代。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体可以含有一个或一个以上具有甚至更高分隔度的氨基酸的取代。
在一些实施例中，具有改变的聚糖结合特征的HA多肽变异体在与Neu5Ac和Gal以外的糖接触的残基中具有序列改变(参见例如图7)。
在一些实施例中，HA多肽变异体与野生型亲本HA相比具有至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体与同源野生型亲本HA相比具有至少两个、三个、四个、五个或五个以上的氨基酸取代；在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体具有两个、三个或四个氨基酸取代。在一些实施例中，所有所述氨基酸取代均位于聚糖结合位点内。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体含有一个或一个以上如美国专利公开案第2009/0269342号和第2010/0004195号中任一者以及2010年7月2日申请的名为“用于诊断和/或治疗流感感染的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORDIAGNOSING AND/OR TREATING INFLUENZA INFECTION)”的美国专利申请案第12/829931号(均以引用的方式并入本文中)中所述的氨基酸取代。
在一些实施例中，HA多肽变异体在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体，尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA(例如H5)在选自由以下残基组成的群组的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体，尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA(例如H5)在任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37个选自由以下残基组成的群组的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有减少或消除在对应于氨基酸位置158的位点处的糖基化的序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有影响和/或改变与对应于氨基酸位置158的位点连接的聚糖的身份和/或结构的序列取代。在一些实施例中，这种序列取代为在对应于位置158的位点处的突变，例如Asn158Xaa，其中Xaa为除Asn以外的任何氨基酸。在一些实施例中，这种序列取代为在对应于位置160的位点处的突变，例如Thr160Xaa，其中Xaa为除Asn以外的任何氨基酸。在一些实施例中，这种序列取代包含突变Thr160Ala。在一些实施例中，减少、消除、影响或改变在对应于氨基酸位置158的位点处的糖基化的序列取代可以使非H2HA多肽(例如H5HA多肽)更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。在一些实施例中，在对应于位置160的位点处的突变(例如Thr160Xaa，如Thr160Ala)可以使非H2HA多肽(例如H5HA多肽)更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226、228以及160中的一者或一者以上的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226、228以及160的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226和160的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基228和160的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226和228的位置处具有序列取代。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226、228以及158中的一者或一者以上的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226、228以及158的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226和158的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基228和158的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基226和228的位置处具有序列取代。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有序列取代，这些序列取代包括HA多肽的一个或一个以上环形区中的缺失。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有序列取代，这些序列取代包括在对应于HA多肽的128-137环形区的位点处的缺失。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有序列取代，这些序列取代包括在一个或一个以上对应于HA多肽中残基128、129、130、131、132、133、134、135、136和/或137的氨基酸位置处的缺失。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有序列取代，这些序列取代包括在对应于HA多肽的128-134环形区的位点处的缺失。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有序列取代，这些序列取代包括在一个或一个以上对应于HA多肽中残基128、129、130、131、132、133和/或134的氨基酸位置处的缺失。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有序列取代，这些序列取代包括对应于残基130的氨基酸的缺失。在一些实施例中，所述环形区取代可以使非H2HA多肽(例如H5HA多肽)更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。在一些实施例中，对应于残基130的氨基酸的缺失可以使非H2HA多肽(例如H5HA多肽)更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14者的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13者的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、135、188、192、221以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有序列取代：131、132、135、188、192、221以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、135、188、192以及221。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5或6者的位置处具有序列取代：131、132、135、188、192以及221。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：133、137、155、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有序列取代：133、137、155、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：133、137、155、193、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有序列取代：133、137、155、193、226、227以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基130、192以及193中的一者或一者以上的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于残基130、192、193中任1、2或3者的位置处具有序列取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)残基192和193中的一者或两者的位置处具有序列取代。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16者的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15者的位置处具有序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5或6者的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132、133以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132、133以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132以及133。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132以及133。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：227、131、132、133以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4或5者的位置处具有序列取代：227、131、132、133以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：227、131、132以及133。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3或4者的位置处具有序列取代：227、131、132以及133。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8或9者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226以及228。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221以及227。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221以及227。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于以下残基中任1、2、3、4、5或6者的位置处具有序列取代：131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：131、132、133、221以及227。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA(例如H5HA)在对应于(1)130以及(2)以下残基中任1、2、3、4或5者的位置处具有序列取代：131、132、133、221以及227。
在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自位于与聚糖直接结合的受体区域内的氨基酸的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、136、153、155、183以及194。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自与直接结合聚糖的受体区域相邻定位的氨基酸的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)(a)残基98和195，(b)残基98、138、186、187、195以及228)或(c)残基138、186、187以及228。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体并且尤其是H5变异体具有以下氨基酸取代中的一者或一者以上：Ser132Thr、Ala133Thr、Ser133Thr、Ser137Ala、Ser137Arg、Ile155Thr、Lys156Glu、Asn158Xaa(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)、Thr160Ala、Asn186Pro、Asp187Ser、Asp187Thr、Ala188Glu、Ala188Asp、Ala189Gln、Ala189Lys、Ala189Thr、Glu190Asp、Glu190Thr、Thr192Arg/Lys、Lys193Arg、Lys193Asn、Lys193His、Lys193Ser、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ser221Pro、Gly225Asp、Gln226Ile、Gln226Leu、Gln226Val、Ser227Ala、Gly228Ser。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基192的位置处具有氨基酸取代，其转变所述位置的电荷。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基193的位置处具有氨基酸取代，其改变所述位置的电荷。举例来说，在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基192的位置处具有Thr或疏水性残基(例如Val或Ile)，而HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有亲水性残基。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有亲水性残基。另举一个实例，在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基192的位置处具有Thr或疏水性残基(例如Val或Ile)，而HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有碱性残基(例如Lys或Arg)。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有碱性残基(例如Lys或Arg)。再举一个实例，在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基193的位置处具有碱性残基(例如Lys或Arg)，而HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基193的位置处具有中性或酸性残基。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基193的位置处具有中性或酸性残基。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)(例如人类适应变异体)在对应于残基193的位置处具有Thr、Ala、Met或Val。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)的人类适应与位置188处的残基的性质有关。在H5HA中，残基188时常为Ala，其与192处的Thr或疏水性残基接触。相比之下，在H2HA中，残基188时常为Glu或Asp，其与192处的Arg或Lys接触。因此，在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在位置188处具有Glu。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在位置188处具有Asp。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有Ala188Glu取代。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有Ala188Asp取代。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)具有在对应于残基188的位置处的Ala以及在对应于残基192的位置处的Thr。在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)具有在对应于残基188的位置处的Ala以及在对应于残基192的位置处的疏水性残基。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Glu以及在对应于残基192的位置处的Arg。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Asp以及在对应于残基192的位置处的Arg。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Glu以及在对应于残基192的位置处的Lys。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Asp以及在对应于残基192的位置处的Lys。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的Thr以及在对应于残基193的位置处的Lys。在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的疏水性残基以及在对应于残基193的位置处的Lys。在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的Thr以及在对应于残基193的位置处的Arg。在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的疏水性残基以及在对应于残基193的位置处的Arg。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基131的位置处具有Ala。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基131的位置处具有Thr。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基132的位置处具有Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基132的位置处具有Thr。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基133的位置处具有Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基133的位置处具有Thr。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基131、132和/或133的任何位置处包括Ala、Thr和/或Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基131、132和/或133的任何位置处包括Ala、Thr和/或Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于131、132以及133的所有位置处包括Thr。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基135的位置处具有Val。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基135的位置处具有除Val以外的任何氨基酸。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基137的位置处具有Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基137的位置处具有Arg。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基155的位置处具有Ile。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基155的位置处具有Thr。在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基155的位置处包括Thr。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基155的位置处包括Thr。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基221的位置处具有Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基221的位置处具有Pro。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基221的位置处包括Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基221的位置处包括Pro。在不希望受任何一种特定理论束缚的情况下，Pro221可能影响与H2HA的RBS有关的220环的构象。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基226的位置处具有Gln。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基226的位置处具有Leu。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基227的位置处具有Ser。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基227的位置处具有Gly。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)在对应于残基228的位置处具有Gly。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)在对应于残基228的位置处具有Ser。
在一些实施例中，HA多肽(例如H5HA多肽)分别在对应于残基226、227以及228的位置处包括Gln、Ser以及Gly残基。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)分别在对应于残基226、227以及228的位置处包括Leu、Gly以及Ser。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体并且尤其是H5变异体在指定位置(这些位置的编号与H3HA的编号对应)处具有以下氨基酸中的一者或一者以上：
●Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp、Gln226Leu
●Glu190Asp、Lys193Ser、Gln226Leu、Gly228Ser
●Ala189Gln、Lys193Ser、Thr160Ala
●Ala189Gln、Lys193Ser、Gln226Leu、Gly228Ser
●Asp187Ser/Thr、Ala189Gln、Lys193Ser、Gln226Leu、Gly228Ser
●Ala189Lys、Lys193Asn、Gln226Leu、Gly228Ser
●Asp187Ser/Thr、Ala189Lys、Lys193Asn、Gln226Leu、Gly228Ser
●Lys156Glu、Ala189Lys、Lys193Asn、Gln226Leu、Gly228Ser
●Lys193His、Gln226Leu/Ile/Val、Gly228Ser
●Lys193Arg、Gln226Leu/Ile/Val、Gly228Ser
●Ala189Lys、Lys193Asn、Gly225Asp
●Lys156Glu、Ala189Lys、Lys193Asn、Gly225Asp
●Ser137Ala、Lys156Glu、Ala189Lys、Lys193Asn、Gly225Asp
●Glu190Thr、Lys193Ser、Gly225Asp
●Asp187Thr、Ala189Thr、Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp
●Asn186Pro、Asp187Thr、Ala189Thr、Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp
●Asn186Pro、Asp187Thr、Ala189Thr、Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp、Ser227Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser、Thr160Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser、Thr160Ala
●Gly228Ser、Thr160Ala
●Gln226Leu、Thr160Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser
●Thr160Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser、Asn158Xaa(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●Gly228Ser、Asn158Xaa
●Gln226Leu、Asn158Xaa
●Gln226Leu、Gly228Ser
●Asn158Xaa
●Δ130(其中“Δ130”表示对应于位置130的氨基酸的缺失)加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、132、135、188、192以及221
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：133、137、155、193、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、188、192、193、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、188、192、193、226以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221以及227
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：131、132、133、221以及227
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：137、188、192、193、226以及228
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：137、188、192、193、226、227、228、131、132以及133
●Δ130加上对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合：227、131、132以及133
●Gln226Leu、Gly228Ser、Thr160Ala、Δ130
●Gln226Leu、Gly228Ser、Δ130
●Gln226Leu、Thr160Ala、Δ130
●Gly228Ser、Thr160Ala、Δ130
●Gln226Leu、Δ130
●Gly228Ser、Δ130
●Thr160Ala、Δ130
●Δ130
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Ser227Gly、Gly228Ser
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Gly228Ser
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Asn159Asp(或Thr160Ala或两者)、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Ser227Gly、Gly228Ser
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Asn159Asp(或Thr160Ala或两者)、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Gly228Ser
●Δ130、Ser137Arg、Ala188Glu、Thr192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val、Gln226Leu、Gly228Ser
●Δ130、Ser137Arg、Ala188Glu、Thr192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val、Gln226Leu、Gly228Ser、Xaa131Ser/Thr、Xaa132Ser/Thr、Xaa133Ser/Thr、Ser221Pro、Ser227Gly(其中Xaa＝任何氨基酸)
●Δ130、Xaa131Ser/Thr、Xaa132Ser/Thr、Xaa133Ser/Thr、Ser221Pro、Ser227Gly(其中Xaa＝任何氨基酸)
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)
●Δ130、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)
●Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
●Δ130、Ala188Glu
●Δ130、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
在一些实施例中，本发明提供氨基酸序列包括如以下所述的元件的HA多肽(例如HA多肽变异体、工程化HA多肽和/或工程化HA多肽变异体)：
●X190、X193、X225以及X226
●X190、X193、X226以及X228
●X189、X193、X160
●X189、X193、X226、X228
●X187、X189、X193、X226、X228
●X189、X193、X226、X228
●X187、X189、X193、X226、X228
●X156、X189、X193、X226、X228
●X193、X226、X228
●X193、X226、X228
●X189、X193、X225
●X156、X189、X193、X225
●X137、X156、X189、X193、X225
●X190、X193、X225
●X187、X189、X190、X193、X225
●X186、X187、X189、X190、X193、X225
●X186、X187、X189、X190、X193、X225、X227
●X226、X228、X160
●X226、X228、X160
●X228、X160
●X226、X160
●X226、X228
●X160
●X226、X228、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X228、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X226、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X226、X228
●X158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X133、X135、X137、X155、X188、X192、X193、X221、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X135、X188、X192以及X221
●X130加上以下的任何可能组合：X133、X137、X155、X193、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X133、X135、X137、X155、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)、X160、X188、X192、X193、X221、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X137、X188、X192、X193、X226、X228、X131、X132、X133、X221以及X227
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X133、X221以及X227
●X130加上以下的任何可能组合：X137、X188、X192、X193、X226以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X137、X188、X192、X193、X226、X227、X228、X131、X132以及X133
●X130加上以下的任何可能组合：X227、X131、X132以及X133
●X226、X228、X160、X130
●X226、X228、X130
●X226、X160、X130
●X228、X160、X130
●X226、X130
●X228、X130
●X160、X130
●X130
●X130、X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X227、X228
●X130、X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X228
●X130、X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X227、X228
●X130、X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X228
●X130、X137、X188、X192、X193、X226、X228
●X130、X137、X188、X192、X193、X226、X228、X131、X132、X133、X221、X227
●X130、X131、X132、X133、X221、X227
●X130、X192
●X130、X193
●X130、X192、X193
●X130、X188
●X130、X192、X188
●X130、X193、X188
●X130、X192、X193、X188
其中X＝任何氨基酸(除非上文中另外有规定)，和/或X＝缺少的氨基酸。这些位置的编号与H3HA的编号对应。
在一些实施例中，X130为位置130处的缺失。在一些实施例中，X160为Ala。在一些实施例中，X158为除Asn以外的任何氨基酸。
在一些所述实施例中，H5HA多肽变异体与野生型H5HA相比具有至少一个其它取代，使得变异体对伞形聚糖的亲和力和/或特异性增加。
在一些所述实施例中，HA多肽与野生型HA相比具有至少一个其它取代，使得变异体对伞形聚糖的亲和力和/或特异性增加。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226、S228以及A160的序列。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226和A160的序列。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括S228和A160的序列。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括A160的序列。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226、S228以及X158(其中X＝除Asn以外的任何氨基酸)的序列。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226和X158的序列。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括S228和X158的序列。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括X158的序列。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228、A160以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、A160以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221、227以及228。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、S228、A160以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221以及227。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、A160以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221、226、227以及228。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221以及227以及228。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、S228以及在对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226以及227。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228、X158(其中X＝除Asn以外的任何氨基酸)以及对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、X158以及对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221、227以及228。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、S228、X158以及对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228以及对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221以及227。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、X158(其中X＝除Asn以外的任何氨基酸)以及对应于以下残基的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)与亲本HA并且尤其是亲本野生型HA相比具有开放结合位点。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)结合于以下α2-6唾液酸化聚糖：
以及其组合。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于具有以下结构的聚糖：
以及其组合；和/或和/或
和/或
以及其组合。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)结合于
和/或
在一些实施例中结合于
在一些实施例中结合于
并且在一些实施例中结合于
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于图9中所描绘的至少一些聚糖(例如α2-6唾液酸化聚糖)。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)结合于图9中所描绘的多个聚糖。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽(例如H5HA多肽)与至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％约95％或95％以上的在人类上呼吸道组织(例如上皮细胞)中的HA受体上发现的聚糖结合。
在一个方面中，本发明尤其认识到，高亲和力结合于单独伞形拓扑聚糖可能不足以赋予对人类的有效传播/感染性。本发明了解到，结合于锥形拓扑聚糖减少也可能是重要的。在一些实施例中，高亲和力结合于伞形拓扑聚糖以及结合于锥形拓扑聚糖的亲和力降低可与赋予对人类的有效传播/感染性有关。在一些实施例中，高亲和力结合于伞形拓扑聚糖足以赋予对人类的有效传播/感染性。在一些实施例中，高亲和力结合于伞形拓扑聚糖足以赋予对人类的有效传播/感染性，即使结合于锥形拓扑聚糖的亲和力不降低(例如不变、增加等)。
在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加以及结合于锥形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性降低可能与相对于参考多肽(例如HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强有关。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加足以相对于参考多肽(例如HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加足以相对于参考多肽(例如HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强，即使结合于锥形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性不降低(例如不变、增加等)。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加足以相对于参考多肽(例如HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强，即使结合于锥形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性等于和/或大于结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性。
HA多肽的部分或片段
本发明进一步提供根据本发明的HA多肽的特征部分(其可以为或可以不为结合剂)以及编码它们的核酸。一般来说，特征部分为含有连续一段氨基酸或连续多段氨基酸一起作为HA多肽的特征的部分。每一所述连续段通常将含有至少两个氨基酸。此外，所属领域的技术人员将了解，作为H5HA多肽的特征，通常需要至少5、至少10、至少15、至少20或20个以上的氨基酸。一般来说，特征部分为除以上所规定的序列一致性外还与相关完整HA多肽共有至少一个功能特征的部分。在一些实施例中，根据本发明的HA多肽的特征部分与相关全长HA多肽共有聚糖结合特征。
非HA多肽
在一些实施例中，根据本发明提供的结合剂为氨基酸序列不包括特征HA序列的多肽。所述多肽在本文中称为“非HA多肽”。在一些实施例中，非HA多肽具有预先选择的氨基酸序列(例如通过合理设计，包括例如与参考序列相比引入战略氨基酸改变[例如添加、缺失和/或取代])。在一些实施例中，非HA多肽具有随机确定并且例如基于本文中所定义的所需结合特征识别的氨基酸序列。
抗体
在一些实施例中，根据本发明提供的结合剂为抗体(例如结合于伞形拓扑聚糖和/或伞形拓扑聚糖模拟物的抗体)。适合于本发明的抗体包括免疫特异性结合于任何伞形拓扑聚糖表位的抗体或抗体片段。如本文所用，术语“抗体”打算包括对指定蛋白质或肽或其片段具有特异反应性的免疫球蛋白以及其片段。合适的抗体包括(但不限于)人类抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人类化抗体、偶联抗体(即偶联或融合于其它蛋白质、放射性同位素标记、细胞毒素的抗体)、小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)、单链抗体、骆驼抗体以及抗体片段。如本文所用，术语“抗体”还包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、单域抗体(例如鲨鱼单域抗体(例如IgNAR或其片段))、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要这些抗体片段展现所需生物活性即可。用于本文中的抗体多肽可以为任何类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。
如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2以及Fv片段；三功能抗体；四功能抗体；直链抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“抗体片段”还包括像抗体一样通过与特定抗原结合以形成复合物来起作用的任何合成或基因工程化蛋白。举例来说，抗体片段包括经分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、轻链和重链可变区域通过肽连接子连接的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”)以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
可以使用所属领域中众所周知的方法来产生抗体。举例来说，用于产生抗体的方案由哈洛(Harlow)和兰尼(Lane)，1988，抗体：实验手册(Antibodies.A Laboratory Manual)描述；该文献以引用的方式并入本文中。通常，可以在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、骆驼、美洲驼、鲨鱼或其它适当宿主中产生抗体。或者，可以在产生IgY分子的鸡中制成抗体(谢德(Schade)等人，1996，ALTEX 13(5)：80-85；以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，适合于本发明的抗体为低于人类的灵长类动物抗体。举例来说，用于在狒狒中产生治疗适用抗体的一般技术可见于例如以下文献中：戈登伯格(Goldenberg)等人，国际专利公开案第WO 91/11465号，1991；以及洛斯曼(Losman)等人，1990，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)46：310(均以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体(米尔斯坦(Milstein)和奎洛(Cuello)，1983，自然305(5934)：537-40；以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，也可以通过重组方法制成单克隆抗体(美国专利第4,166,452号，1979；以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，适合于本发明的抗体可以包括人类化或人类抗体。非人类抗体的人类化形式为含有来源于非人类Ig的最小序列的嵌合Ig、Ig链或片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或Ab的其它抗原结合子序列)。人类化抗体通常具有一个或一个以上从非人类来源引入的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进”残基，其通常是从“引进”可变域获得。人类化是通过用啮齿动物互补决定区(CDR)或CDR序列取代人类抗体的相应序列来实现(莱克曼(Riechmann)等人，1988，自然332(6162)：323-7；韦荷恩(Verhoeyen)等人，1988，科学239(4847)：1534-6；均以引用的方式并入本文中)。所述“人类化”抗体为嵌合Ab(美国专利第4,816,567号，1989；以引用的方式并入本文中)，其中实质上小于完整人类可变域已由来自非人类物种的相应序列取代。在一些实施例中，人类化抗体通常为一些CDR残基以及可能一些FR残基由来自啮齿动物Ab中的类似位点的残基取代的人类抗体。人类化抗体包括具有所需特异性、亲和力以及能力的人类Ig(接收者抗体)，其中来自接收方的CDR的残基由来自如小鼠、大鼠或兔等非人类物种(供体抗体)的CDR的残基代替。在一些情况下，相应非人类残基代替人类Ig的Fv构架残基。人类化抗体可以包含在接收者抗体与引进的CDR或构架序列中均不存在的残基。一般来说，人类化抗体包含至少一个并且通常两个可变域的实质上全部，其中大部分(如果不是所有)CDR区与非人类Ig的CDR区对应，并且大部分(如果不是所有)FR区为人类Ig共同序列的FR区。人类化抗体最佳还包含至少一部分Ig恒定区(Fc)，通常为人类Ig的Ig恒定区(莱克曼等人，1988，自然332(6162)：323-7；韦荷恩等人，1988，科学239(4847)：1534-6；均以引用的方式并入本文中)。
也可以使用多种技术制备人类抗体，这些技术包括噬菌体展示库(霍根布姆(Hoogenboom)等人，1991，分子免疫学(Mol Immunol.)28(9)：1027-37；马克司(Marks)等人，1991，分子生物学杂志(J Mol Biol.)222(3)：581-97；均以引用的方式并入本文中)以及制备人类单克隆抗体(雷斯菲尔德(Reisfeld)和赛尔(Sell)，1985，癌症调查(CancerSurv.)4(1)：271-90；以引用的方式并入本文中)。类似地，可以通过将人类Ig基因引入内源性Ig基因已部分或完全失活的转基因动物中来合成人类抗体。攻击后，观察到人类抗体产生，其在所有方面均与在人类中所见非常类似，包括基因重排、组合以及抗体库(费雪威尔德(Fishwild)等人，1996，国家生物技术(Nat Biotechnol.)14(7)：845-51；隆伯格(Lonberg)等人，1994，自然368(6474)：856-9；隆伯格和胡萨尔(Huszar)，1995，国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)13(1)：65-93；马克司等人，1992，生物技术(纽约州)(Biotechnology(N Y).)10(7)：779-83；均以引用的方式并入本文中)。
凝集素
在一些实施例中，根据本发明提供的结合剂为凝集素。凝集素为糖结合蛋白质，其可以结合于可溶性碳水化合物或作为糖偶联物(例如糖肽或糖脂)的一部分的碳水化合物部分。凝集素通常通过识别特定糖部分来凝集某些动物细胞和/或使糖偶联物沉淀。举例来说，SNA-1为一种对α2-6唾液酸具有高亲和力的凝集素。作为另一实例，宽鳞多孔菌凝集素(PSL1a和PSL1b)对结合含有天冬酰胺连接糖蛋白的Neu5Acα2，6Galβ1，4Glc/GlcNAc三糖序列的唾液酸化糖偶联物具有高亲和力。可以充当结合剂的非限制性示范性凝集素包括SNA-1、SNA-1′、PSL1a、PSL1b以及由其衍生的多肽。
以下提供示范性凝集素的氨基酸序列：
西洋接骨木凝集素1(基因银行寄存编号U27122)：
MRLVAKLLYLAVLAICGLGIHGALTHPRVTPPVYPSVSFNLTGADTYEPFLRALQEKVILGNHTAFDLPVLNPESQVSDSNRFVLVPLTNPSGDTVTLAIDVVNLYVVAFSSNGKSYFFSGSTAVQRDNLFVDTTQEELNFTGNYTSLERQVGFGRVYIPLGPKSLDQAISSLRTYTLTAGDTKPLARGLLVVIQMVSEAARFRYIELRIRTSITDASEFTPDLLMLSMENNWSSMSSEIQQAQPGGIFAGVVQLRDERNNSIEVTNFRRLFELTYIAVLLYGCAPVTSSSYSNNAIDAQIIKMPVFRGGEYEKVCSVVEVTRRISGWDGLCVDVRYGHYIDGNPVQLRPCGNECNQLWTFRTDGTIRWLGKCLTASSSVMIYDCNTVPPEATKWVVSIDGTITNPHSGLVLTAPQAAEGTALSLENNIHAARQGWTVGDVEPLVTFIVGYKQMCLRENGENNFVWLEDCVLNRVQQEWALYGDGTIRVNSNRSLCVTSEDHEPSDLIVILKCEGSGNQRWVFNTNGTISNPNAKLLMDVAQRDVSLRKIILYRPTGNPNQQWITTTHPA(SEQ ID NO：56)
西洋接骨木凝集素1′(基因银行寄存编号U66191)：
MKVVATILYLVVLAICGLGIHGAHPTHSAPPTVYPSVSFNLTEANSNEYRHFLQELRGKVILGSHRAFDLPVLNPESKVSDSDRFVLVRLTNPSRKKVTLAIDVVTFYVVAFAQNDRSYFFSGSSEVQRENLFVDTTQEDLNFKGDYTSLEHQVGFGRVYIPLGPKSLAQSISSLSTYKSSAGDNKRLARSLLVVIQMVSEAARFRYIQLRIQASITDAKEFTPDLLMLSMENKWSSMSSEIQQAQPGGAFAQVVKLLDQRNHPIDVTNFRRLFQLTSVAVLLHGCPTVTKMPAYIIKMPVFNGGEDEERCSVVEEVTRRIGGRDGFCAEVKNGDEKDGTPVQLSSCGEQSNQQWTFSTDGTIQSLGKCLTTSSSVMIYNCKVVPPESTKWVVSIDGTITNPRSGLVLTAPKAAEGTLVSLEKNVHAARQGWIVGNVEPLVTFIVGYEQMCLETNPGNNDVSLGDCSVKSASKVDQKWALYGDGTIRVNNDRSLCVTSEGKSSNEPIIILKCLGWANQRWVFNTDGTISNPDSKLVMHVDQNDVPLRKIILSHPSGTSNQQWIASTHPA(SEQ ID NO：57)
宽鳞多孔菌凝集素1a(通用蛋白质资源(UniProt)Q75WT9)
MSFQGHGIYYIASAYVANTRLALSEDSSANKSPDVIISSDAVDPLNNLWLIEPVGEADTYTVRNAFAGSYMDLAGHAATDGTAIIGYRPTGGDNQKWIISQINDVWKIKSKETGTFVTLLNGDGGGTGTVVGWQNITNNTSQNWTFQKLSQTGANVHATLLACPALRQDFKSYLSDGLYLVLTRDQISSIWQASGLGSTPWRSEIFDCDDFATVFKGAVAKWGNENFKANGFALLCGLMFGSKSSGAHAYNWFVERGNFSTVTFFEPQNGTYSANAWDYKAYFGLF(SEQ ID NO：58)
宽鳞多孔菌凝集素1b(通用蛋白质资源Q75WT8)
MSFEGHGIYHIPHAHVANIRMALANRGSGQNGTPVIAWDSNNDAFDHMWLVEPTGEADTYTIHNVSTGTYMDVTASAVADNTPIIGYQRTGNDNQKWIIRQVQTDGGDRPWKIQCKATGTFATLYSGGGSGTAIVGWRLVNSNGNQDWVFQKLSQTSVNVHATLLACGATVGQDFKNYLYDGLYLVLPRDRISAIWKASGLGETARRDGIYDSDEFAMTFKSAAATWGKENFKADGFAILCGMMFGTKASTNRHAYNWVVERGSFSTVTFFEPQNGTYSDDAWGYKAYFGLF(SEQ ID NO：59)
适体
在一些实施例中，根据本发明提供的结合剂为适体。适体为由核酸(例如RNA、DNA)构成的与特定分子标靶(例如伞形拓扑聚糖)紧密结合的大分子。特定适体可用直链核苷酸序列来描述并且长度通常为约15到约60个核苷酸。在不希望受任何理论束缚的情况下，预期适体中的核苷酸链形成分子内相互作用，使分子折叠成复杂的三维形状，并且此三维形状使适体紧密结合于其标靶分子的表面。鉴于在所有可能的核苷酸序列世界内存在的分子形状极其多样，故可以针对广泛范围的分子标靶(包括蛋白质和小分子)获得适体。除高特异性以外，适体对其标靶还具有极高亲和力(例如对蛋白质的亲和力在皮摩尔到低毫微摩尔范围内)。适体具有化学稳定性并且可以煮沸或冷冻而不损失活性。因为它们为合成分子，所以可进行多种修饰，所述修饰可以优化它们在特定应用中的功能。举例来说，可以修饰适体以显著降低其用于活体内应用时在血液中被酶降解的敏感性。另外，可以修饰适体以改变其生物分布或血浆滞留时间。
可以通过所属领域中已知的方法来选择可结合伞形拓扑聚糖(和/或伞形拓扑聚糖模拟物)的适体。举例来说，可以使用SELEX(配体指数级富集的系统进化(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment))方法来选择适体(图尔克(Tuerk)和戈德(Gold)，1990，科学249：505-510；以引用的方式并入本文中)。在SELEX方法中，产生大的核酸分子库(例如1015个不同的分子)和/或用标靶分子(例如具有伞形拓扑聚糖表位的伞形拓扑聚糖)筛选。使标靶分子与核苷酸序列库一起培育一段时间。接着，可以使用所属领域中已知的若干方法将适体标靶分子与混合物中的未结合分子物理分离，这些未结合分子可以弃去。接着，可以使对标靶分子具有最高亲和力的适体从标靶分子纯化并且以酶促方式扩增以产生实质上富集了可以结合标靶分子的适体的新的分子库。接着，可以使用富集库来引发新一轮选择、分开以及扩增。在5-15轮这种反复选择、分开以及扩增过程后，所述库减少到与标靶分子紧密结合的少量适体。接着，可以分离混合物中的个别分子，确定其核苷酸序列，并且测量和比较它们关于结合亲和力和特异性的性质。接着，可以进一步提纯经分离的适体以消除无助于标靶结合和/或适体结构的任何核苷酸，进而产生截短到核心结合域的适体。关于适体技术之评论，参见贾亚塞纳(Jayasena)，1999，临床化学(Clin.Chem.)45：1628-50；其全部教示内容以引用的方式并入本文中。
多肽的产生
可以通过任何可用手段来产生根据本发明的多肽(例如HA多肽和/或非HA多肽)和/或其特征部分或其编码核酸。
举例来说，可以通过使用经工程化以表达根据本发明的多肽编码核酸的宿主细胞系统来产生根据本发明的多肽(或其特征部分)。
可以使用任何系统来产生多肽(或特征部分)，如蛋、杆状病毒、植物、酵母、马丁-达比犬肾脏细胞(Madin-Darby Canine Kidney cell，MDCK)或Vero(非洲绿猴肾脏)细胞。或者或另外，可以使用重组技术，如通过使用表达载体，在细胞中表达多肽(或特征部分)(萨布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning.A LaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(CSHL Press)，1989；以引用的方式并入本文中)。
或者或另外，可以通过合成手段产生根据本发明的多肽(或其特征部分)。
或者或另外，可以在完整病毒情形下产生根据本发明的多肽(或其特征部分)并且尤其是HA多肽，无论所述病毒是否另外为野生型、已减毒、已杀死等。也可以在病毒样粒子情形下产生根据本发明的多肽(例如HA多肽)或其特征部分。
在一些实施例中，可以从流感病毒分离和/或纯化HA多肽(或其特征部分)。举例来说，病毒可以在蛋(如含胚鸡蛋)中生长，在这种情况下所收获的材料通常为尿囊液。或者或另外，可以由使用组织培养使病毒生长的任何方法来获得流感病毒。适用于使病毒生长的细胞基质包括例如狗肾脏细胞(如MDCK或来自MDCK的克隆的细胞)、MDCK样细胞、猴肾脏细胞(如AGMK细胞，包括Vero细胞)、呈连续细胞系培养的上皮细胞、293T细胞、BK-21细胞、CV-1细胞或适合于产生用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型，其易于从商业来源(例如马里兰州罗克维尔美国模式培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD))获得。合适的细胞基质还包括人类细胞，如MRC-5细胞。合适的细胞不限于细胞系；例如也包括如鸡胚成纤维细胞的初级细胞。
另外，所属领域的技术人员将了解，可以通过在允许迅速筛选和/或选择能够结合于伞形拓扑聚糖的多肽的条件下培养产生多肽(无论单独还是作为复合物的一部分，包括作为病毒粒子或病毒的一部分)的细胞或有机体来产生、鉴别、分离和/或制备如本文所述的多肽和尤其变异HA多肽。仅举一个实例，在一些实施例中，在揭露和/或有利于那些与伞形拓扑聚糖结合(例如以特定特异性和/或亲和力)的变异体的条件下产生和/或研究多种多肽(例如HA变异多肽)可为适用的。在一些实施例中，由自然界进化产生所述多种多肽(例如HA变异多肽)。在一些实施例中，由工程化产生所述多种多肽(例如HA变异多肽)。在一些实施例中，由工程化与自然进化的组合产生所述多种多肽(例如HA变异多肽)。
HA受体
HA通过结合于糖蛋白受体与细胞表面相互作用。HA与HA受体的结合主要是由HA受体上的N连接聚糖介导。具体来说，流感病毒粒子表面上的HA识别与细胞宿主表面上的HA受体缔合的唾液酸化聚糖。在识别和结合后，宿主细胞吞没病毒细胞，并且病毒能够复制并产生更多的有待分布到相邻细胞中的病毒粒子。已鉴别示范性HA-聚糖相互作用的一些晶体结构并且呈现于表1中：
表1.HA-聚糖复合物的晶体结构
HA-α2-6唾液酸化聚糖复合物是通过将约痕量的ADU63_H3和ADS97_H5和Viet04_H5的HA1亚单元叠加于ASI30_H1_26和APR34_H1_26(H1)上而产生。虽然已公开人类A/爱知/2/68(H3N2)与α2-6唾液酸化聚糖的结构复合物(艾森(Eisen)等人，1997，病毒学，232：19；以引用的方式并入本文中)，但在蛋白质数据库(Protein Data Bank)中无法获得其坐标。使用SARF2(http://123d.ncifcrf.gov/sarf2.html)程序来获得用于叠加的不同HA1亚单元的结构比对。
HA受体是由靠近受体的HA结合位点的α2-3或α2-6唾液酸化聚糖修饰，并且受体结合的聚糖的键联类型可以影响受体的HA结合位点的构象，因此影响受体对不同HA的特异性。
举例来说，禽类HA的聚糖结合袋狭窄。根据本发明，此袋结合于α2-3唾液酸化聚糖的反式构象和/或无论α2-3还是α2-6连接的锥形拓扑聚糖。
禽类组织以及人类深肺和胃肠(GI)道组织中的HA受体的特征为α2-3唾液酸化聚糖键联，并且此外(根据本发明)特征为包括α2-3唾液酸化和/或α2-6唾液酸化聚糖的主要采用锥形拓扑的聚糖。具有所述锥形拓扑聚糖的HA受体在本文中可以称为CTHAr。
相比之下，上呼吸道中的支气管和气管中的人类HA受体是由α2-6唾液酸化聚糖修饰。与α2-3基序不同，α2-6基序由于C6-C5键而具有额外的构象自由度(拉塞尔等人，2006，糖偶联物杂志23：85；以引用的方式并入本文中)。结合于所述α2-6唾液酸化聚糖的HA具有更开放的结合袋以容纳由此构象自由所引起的结构多样性。此外，根据本发明，HA可能需要结合于呈伞形拓扑的聚糖(例如α2-6唾液酸化聚糖)且尤其可能需要以强亲和力和/或特异性结合于所述伞形拓扑聚糖，以便有效介导人类上呼吸道组织的感染。具有伞形拓扑聚糖的HA受体在本文中可称为UTHAr。
归因于这些空间受限的糖基化型态，人类通常不会感染含有许多野生型禽类HA(例如禽类H5)的病毒。具体来说，由于最可能碰到病毒的人类呼吸道部分(即气管和支气管)缺乏具有锥形聚糖(例如α2-3唾液酸化聚糖和/或短聚糖)的受体，并且野生型禽类HA通常主要或仅结合于与锥形聚糖(例如α2-3唾液酸化聚糖和/或短聚糖)缔合的受体，故人类很少感染禽类病毒。只有在与病毒充分紧密接触以致其可以进入深肺和/或胃肠道中时，具有伞形聚糖(例如长α2-6唾液酸化聚糖)的受体才使人类受到感染。
聚糖阵列
为迅速扩充当前有关已知的特定聚糖-聚糖结合蛋白(GBP)相互作用的知识，功能糖组学联盟(Consortium for Functional Glycomics，CFG；www.functionalglycomics.org)(一个国际合作研究发起组织)已开发出包含若干聚糖结构的聚糖阵列，其已能够针对新颖聚糖配体特异性高通量筛选GBP。聚糖阵列包含单价和多价聚糖基序(即连接于聚丙烯酰胺主链)，并且各阵列包含具有低(10μM)和高(100μM)浓度以及各浓度有六个点的264个聚糖(参见http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh5.shtml)。
所述阵列主要包含捕集N连接和O连接聚糖的生理学多样性的合成聚糖。除合成聚糖以外，衍生自不同哺乳动物糖蛋白的N连接聚糖混合物也呈现于所述阵列上。
如本文所用，聚糖“阵列”是指一组任选地固定于固体支撑物上的一个或一个以上聚糖。在一些实施例中，“阵列”为在两个或两个以上在空间上实体分隔的位置处以有组织的排列或模式存在的多个聚糖。通常，聚糖阵列将具有至少4、至少8、至少16、至少24、至少48、至少96或数百或数千离散位置。一般来说，根据本发明的聚糖阵列可以具有多种格式中的任一种。所属领域中已知适用于生物分子的多种不同阵列格式。举例来说，大量蛋白质和/或核酸阵列为众所周知的。所属领域的技术人员将立即了解到适合于本发明的聚糖阵列的标准阵列格式。
在一些实施例中，根据本发明的聚糖阵列是以“微阵列”格式存在。微阵列通常可具有相隔约50μ到约200μ或200μ以下的样本位置以及在毫微摩尔到微摩尔范围内或毫微克到皮克范围内的固定样本。所属领域中已知的阵列格式包括例如各离散样本位置具有例如10μ规模的那些阵列格式。
在一些实施例中，根据本发明的聚糖阵列包含多个在空间上固定于支撑物上的聚糖。本发明提供排列于支撑物上的聚糖分子。如本文所用，“支撑物”是指适用于排列聚糖分子的任何材料。如所属领域的技术人员将了解，可以使用多种材料中的任一种。仅举几个实例，可以用于本发明中的支撑物材料包括疏水性膜，例如硝化纤维素、PVDF或尼龙膜。所述膜为所属领域中众所周知的并且可以从例如英国赫默尔亨普斯特德的伯乐公司(Bio-Rad，Hemel Hempstead，UK)获得。
在一些实施例中，上面排列聚糖的支撑物可以包含金属氧化物。合适的金属氧化物包括(但不限于)氧化钛、氧化钽以及氧化铝。所述材料的实例可以从英国多塞特普尔凡西路BH12 4QH的西格马-奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd，Fancy Road，Poole，Dorset.BH12 4QH UK)获得。
在一些实施例中，这种支撑物为或包含金属氧化物凝胶。认为金属氧化物凝胶在既定宏观区域内提供大的表面积以帮助固定含有碳水化合物的分子。
根据本发明可以使用的其它或替代性支撑材料包括凝胶，例如硅胶或氧化铝凝胶。所述材料的实例可以从例如德国达姆施塔特的默克集团(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)获得。
在一些实施例中，聚糖阵列固定于可在正常使用期间抵抗尺寸或形状变化的支撑物上。举例来说，支撑物可以为涂布有适用于排列聚糖的组分材料的载玻片。另外，一些复合材料可以合意地为支撑物提供坚固性。
如本文中所证实，根据本发明的阵列适用于鉴别和/或表征不同HA多肽以及其结合特征。在一些实施例中，在所述阵列上对根据本发明的HA多肽进行测试，评估其与伞形拓扑聚糖(例如与α2-6唾液酸化聚糖，并且尤其是与以伞形拓扑形式排列的长α2-6唾液酸化聚糖)结合的能力。
实际上，本发明提供α2-6唾液酸化聚糖以及任选地α2-3唾液酸化聚糖的阵列，其可以用于表征HA多肽结合能力和/或用作检测例如人类结合HA多肽的诊断物。在一些实施例中，根据本发明的阵列含有呈伞形拓扑的聚糖(例如α2-6唾液酸化聚糖，并且尤其是长α2-6唾液酸化聚糖)。如所属领域的技术人员将清楚的，所述阵列适用于表征或检测任何HA多肽，除由研究人员设计和/或制备的那些HA多肽以外其还包括例如在天然流感分离株中发现的那些HA多肽。
在一些实施例中，所述阵列包括表示在人类HA受体并且尤其在人类上呼吸道HA受体上发现的聚糖(例如伞形聚糖，其常为α2-6唾液酸化聚糖，尤其为长α2-6唾液酸化聚糖)的约10％、约15％、约20％、约25％、约30％约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％约95％或95％以上的聚糖。在一些实施例中，根据本发明的阵列包括一些或所有图10中所描绘的聚糖结构。在一些实施例中，阵列包括至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或95％以上的这些所描绘的聚糖。
本发明提供使用聚糖阵列鉴别或表征HA蛋白的方法。举例来说，在一些实施例中，所述方法包含以下步骤：(1)提供含有HA多肽的样本，(2)使样本与包含的聚糖阵列接触，以及(3)检测HA多肽与阵列上的一个或一个以上聚糖的结合。
将与根据本发明的聚糖阵列接触的含有HA多肽的样本的合适来源包括(但不限于)病理样本，如血液、血清/血浆、周边血液单核细胞/周边血液淋巴细胞(PBMC/PBL)、唾液、尿、粪便、喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓流体、子宫颈刮片、脓样本、食物基质以及来自身体多个部分(如脑、脾以及肝)的组织。或者或另外，含有HA多肽的样本的其它合适来源包括(但不限于)环境样本，如土壤、水以及植物群。其它样本包括例如由研究人员设计和/或制备的工程化HA多肽的实验室样本。也可以应用其它未列出的样本。
所属领域中已知适合于分析HA多肽与根据本发明的聚糖阵列结合的多种检测系统。举例来说，HA多肽可以在与阵列接触之前或之后可检测地标记(直接或间接)；接着，可以通过检测定位的标记来检测结合。在一些实施例中，可以使用扫描装置来检验阵列上的特定位置。
或者或另外，可以使用例如量热、荧光或放射性检测系统或其它标记方法或其它不需要标记的方法来测量与排列聚糖的结合。一般来说，荧光检测通常涉及用荧光分子直接探测阵列并且监测荧光信号。或者或另外，可以用已标记(例如用生物素)供间接荧光检测的分子探测阵列(在这种情况下，通过测试荧光标记的抗生蛋白链菌素的结合)。或者或另外，可以使用荧光猝灭方法，其中排列的聚糖经荧光标记并且用测试分子(其可以用或可以不用不同荧光团标记)来探测。在所述实施例中，与阵列的结合用以压制由排列的聚糖发出的荧光，因此通过荧光发射的损失来检测结合。或者或另外，可以用已在放射性物质存在下生长，从而产生放射性标记探针的活组织样本来探测排列的聚糖。在所述实施例中，可以通过测量放射性发射来检测结合。
所述方法适用于确定HA多肽与根据本发明的聚糖阵列结合的事实和/或结合的程度。在一些实施例中，所述方法可以进一步用于鉴别和/或表征干扰或以其它方式改变聚糖-HA多肽相互作用的试剂。
下文描述的方法尤其可用于例如鉴别被认为能够与碳水化合物相互作用的分子实际上是否可以确实如此，或鉴别分子是否出乎意料地具有与碳水化合物相互作用的能力。
本发明还提供使用根据本发明的阵列来例如检测测试样本中的特定试剂的方法。举例来说，所述方法可包含以下步骤：(1)使聚糖阵列与测试样本(例如与被认为含有HA多肽的样本)接触；并且(2)检测测试样本中任何试剂与阵列的结合。
另外，可以使用与根据本发明的阵列的结合来例如测定结合剂与聚糖之间的相互作用动力学。举例来说，用于测定相互作用动力学的根据本发明的方法可包括以下步骤：(1)使聚糖阵列与所测试的分子接触；以及(2)测量结合剂与排列的聚糖之间的相互作用动力学。
可以通过例如上文详述的比色或荧光信号的实时改变来测量结合剂与根据本发明的阵列中的任何聚糖的相互作用动力学。所述方法尤其可用于例如测定特定结合剂是否能够以比不同结合剂与特定碳水化合物相互作用高的结合程度与相同碳水化合物相互作用。
当然，应了解，可以在阵列格式本身中不存在的聚糖样本或来源上评估根据本发明的HA多肽对聚糖的结合。举例来说，可以使根据本发明的HA多肽与组织样本和/或细胞系结合以评估它们的聚糖结合特征。适当的细胞系包括例如多种哺乳动物细胞系中的任一种，尤其是表达含有伞形拓扑聚糖(例如其中至少一些可以为α2-6唾液酸化聚糖，并且尤其是长α2-6唾液酸化聚糖)的HA受体的那些细胞系。在一些实施例中，使用的细胞系表达具有伞形拓扑的个别聚糖。在一些实施例中，使用的细胞系表达多种聚糖。在一些实施例中，细胞系是从临床分离株中获得；在一些中，维持或操纵其以具有所需聚糖分布和/或流行性。在一些实施例中，组织样本和/或细胞系表达哺乳动物上呼吸道上皮细胞的聚糖特征。
核酸
在一些实施例中，本发明提供编码HA多肽或HA多肽的特征或生物活性部分的核酸。在一些实施例中，本发明提供与编码HA多肽或HA多肽的特征或生物活性部分的核酸互补的核酸。
在一些实施例中，本发明提供与编码HA多肽或HA多肽的特征或生物活性部分的核酸杂交的核酸分子。所述核酸可例如用作引物或探针。仅举几个实例，所述核酸可用作聚合酶链反应(PCR)中的引物、用于杂交(包括原位杂交)的探针和/或用于反转录-PCR(RT-PCR)的引物。
在一些实施例中，核酸可以为DNA或RNA，并且可以为单股或双股的。在一些实施例中，根据本发明的核酸可以包括一种或一种以上非天然核苷酸；在一些实施例中，根据本发明的核酸仅包括天然核苷酸。
针对多肽的抗体
本发明提供针对根据本发明的结合剂多肽(例如HA多肽)的抗体。这些抗体可以为单克隆或多克隆的并且可以通过所属领域的技术人员已知的多种技术中的任一种来制备(例如参见哈洛和兰尼，1988，抗体：实验手册，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)；以引用的方式并入本文中)。举例来说，可以通过包括产生单克隆抗体的细胞培养技术或通过将抗体基因转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中以允许产生重组抗体来产生抗体。
在动物模型中测试结合剂
本发明提供在动物宿主中测试根据本发明的结合剂(例如HA多肽、LSBA、USBA、UTSBA等)的方法。如本文所用，“动物宿主”包括适合于流感研究的任何动物模型。举例来说，适合于本发明的动物宿主可以为任何哺乳动物宿主，包括灵长类动物、雪貂、猫、狗、牛、马、啮齿动物，如小鼠、仓鼠、兔以及大鼠。在一些实施例中，用于本发明的动物宿主为雪貂。具体来说，在一些实施例中，动物宿主在投与根据本发明的结合剂(任选地在根据本发明的组合物中)之前未曝露于或感染病毒。在一些实施例中，动物宿主在投与根据本发明的结合剂之前或同时接种、感染或以其它方式曝露于病毒。用于本发明实践中的动物宿主可以通过所属领域中已知的任何方法接种、感染或以其它方式曝露于病毒。在一些实施例中，动物宿主可以经鼻内接种、感染或曝露于病毒。
在一些实施例中，合适的动物宿主可以具有与在人类呼吸道中发现的分布类似的伞形对比锥形拓扑聚糖和/或α2-6聚糖对比α2-3聚糖的分布。举例来说，预期当雪貂用作由人类中流感病毒引起的疾病模型时，其作为动物宿主可能比小鼠更具代表性(塔姆佩等人，2007，科学315：655-59；以引用的方式并入本文中)。在不希望受任何理论束缚的情况下，本发明提出，雪貂呼吸道中的聚糖分布与人类呼吸道中的聚糖分布的相似性可能高于小鼠与人类的相似性。
可以使用未经处理和/或已接种的动物来进行多种研究中的任一种。举例来说，如所属领域中已知，所述动物模型可以用于病毒传播研究。预期在病毒传播研究中使用雪貂可以充当人类中病毒传播的可靠预报因子。举例来说，所属领域中已知病毒性流感从接种动物(例如雪貂)空气传播到未经处理的动物中(塔姆佩等人，2007，科学315：655-59；以引用的方式并入本文中)。可以使用病毒传播研究来测试根据本发明的结合剂多肽(例如HA多肽)。举例来说，可以在病毒传播研究之前、期间或之后向合适的动物宿主投与根据本发明的结合剂，以测定所述结合剂在阻断动物宿主中的病毒结合和/或感染方面的功效。使用从动物宿主中病毒传播研究收集到信息，可以预测结合剂在阻断人类宿主中的病毒结合和/或感染方面的功效。
医药组合物
在一些实施例中，本发明提供包括根据本发明的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTBSA等)和/或相关实体的医药组合物。举例来说，在一些实施例中，根据本发明的医药组合物中包括结合剂多肽(例如HA多肽)、编码所述多肽的核酸、所述多肽或核酸的特征或生物活性片段、与所述多肽或片段结合和/或竞争的抗体、与所述多肽或与结合于其的聚糖相互作用或竞争的小分子等。
本发明涵盖通过投与根据本发明的所述医药组合物治疗流感感染。在一些实施例中，向罹患或易患流感感染的个体投与根据本发明的医药组合物。在一些实施例中，如果个体展示一种或一种以上通常与流感感染有关的症状，那么认为所述个体罹患流感感染。在一些实施例中，已知或相信个体已曝露于流感病毒。在一些实施例中，如果已知或相信个体已曝露于流感病毒，那么认为所述个体易患流感感染。在一些实施例中，如果个体已与已知或怀疑已感染流感病毒的其它个体接触和/或如果所述个体正或已处于已知或认为流感感染流行的场所，那么已知或相信所述个体已曝露于流感病毒。
在一些实施例中，在投与根据本发明的医药组合物之前、期间或之后测试罹患或易患流感感染的个体中针对根据本发明的结合剂的抗体。在一些实施例中，不向具有所述抗体的个体投与包含根据本发明的结合剂的医药组合物。在一些实施例中，基于所述抗体的检测(或其缺乏)来选择医药组合物和/或结合剂的适当剂量。
在一些实施例中，对进行治疗的特定个体、进行投与的特定结合剂或组合物和/或进行投与的特定剂量或方案的选择是例如以书写、印刷或电子存储形式记住。
可以在一种或一种以上流感感染症状出现之前或之后投与根据本发明的组合物。
本发明涵盖通过投与本文所述的化合物来治疗流感感染。在一些实施例中，根据本发明治疗流感感染是通过投与疫苗来实现。迄今为止，虽然已在流感疫苗开发中取得显著成就，但仍有进一步改善的空间。本发明提供疫苗，其包含根据本发明的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTBSA等)并且尤其包含结合于伞形聚糖(例如α2-6连接伞形聚糖，如长α2-6唾液酸化聚糖)的结合剂。
仅举一个实例，尝试在人类中产生对H5N1病毒株具有特异性的疫苗通常不成功，此至少部分归因于H5HA的低免疫原性。在一项研究中，针对H5N1病毒株的疫苗显示产生1∶40的抗体效价，此效价并不高到足以确保避免受到感染。此外，产生甚至不高的1∶40抗体效价所需的剂量(两剂90μg已纯化的杀死病毒或抗原)是常见季节性流感病毒疫苗的情况下常用剂量的12倍(曲阿诺(Treanor)等人，2006，新英格兰医学杂志(N Eng JMed)，354：1343；以引用的方式并入本文中)。其它研究已类似地显示当前的H5疫苗并不具有高免疫原性(布瑞森(Bresson)等人，2006，柳叶刀(Lancet)，367：1657；以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，使用一种或一种以上欲允许使用较低剂量的H5 HA蛋白和/或实现较高免疫原性的策略调配根据本发明的疫苗(参见例如爱斯瑞克(Enserink)，2005，科学，309：996；以引用的方式并入本文中)。举例来说，在一些实施例中，改善多价(例如通过使用树枝状聚合物)；在一些实施例中，使用一种或一种以上佐剂等。
在一些实施例中，本发明提供疫苗并且向人类个体投与这些疫苗。在一些实施例中，疫苗为包含以下一者或一者以上的组合物：(1)失活病毒，(2)活的减毒流感病毒，例如复制缺陷病毒，(3)根据本发明的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTBSA等)，(4)编码结合剂多肽(例如HA多肽)或其特征或生物活性部分的核酸，(5)编码根据本发明的结合剂多肽(例如HA多肽)或其特征或生物活性部分的DNA载体，和/或(6)表达系统，例如表达一种或一种以上欲用作抗原的流感蛋白的细胞。
因此，在一些实施例中，本发明提供失活流感疫苗。在一些实施例中，失活流感疫苗包含三种类型抗原制备中的一种：失活全病毒、用清洁剂或其它试剂将经纯化的病毒粒子破碎以溶解脂质包膜的亚病毒粒子(“裂解”疫苗)或经纯化的HA多肽(“亚单位”疫苗)。在一些实施例中，可以通过用甲醛、β-丙内酯、醚、含有清洁剂(如
)的醚、溴化十六基三甲铵(CTAB)和特立通N101(Triton N101)、脱氧胆酸钠以及磷酸三(正丁)酯处理使病毒失活。失活可以发生在净化尿囊液(来自蛋中产生的病毒)之后或之前；通过离心分离并且纯化病毒粒子(尼克尔森(Nicholson)等人编，1998，流感教科书(Textbook of Influenza)，马萨诸塞州摩顿布莱克威尔科学出版社(Blackwell Science，Malden，MA)；以引用的方式并入本文中)。为评估疫苗的效能，可以使用单向放射免疫扩散(SRD)测试(斯切尔德(Schild)等人，1975，世界卫生组织简报(Bull.World HealthOrgan.)，52：43-50及223-31；莫斯托(Mostow)等人，1975，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，2：531；均以引用的方式并入本文中)。
本发明还提供活的减毒流感疫苗并且用于减毒的方法为所属领域中众所周知的。在一些实施例中，通过使用反向遗传学(如定点突变诱发)来达成减毒。
在一些实施例中，用于疫苗的流感病毒在蛋中(例如在含胚鸡蛋中)生长，在此情况下所收获的材料为尿囊液。或者或另外，可以由使用组织培养使病毒生长的任何方法来获得流感病毒。适用于使病毒生长的细胞基质包括例如狗肾脏细胞(如MDCK或来自MDCK的克隆的细胞)、、MDCK样细胞、猴肾脏细胞(如AGMK细胞，包括Vero细胞)、呈连续细胞系培养的上皮细胞、293T细胞、BK-21细胞、CV-1细胞或适合于产生用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型(包括上气管上皮细胞)，其易于从商业来源(例如马里兰州罗克维尔美国模式培养物保藏中心)获得。合适的细胞基质还包括人类细胞，如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如也包括如鸡胚成纤维细胞的初级细胞。
在一些实施例中，根据本发明的疫苗进一步包含一种或一种以上佐剂。举例来说，可以使用铝盐(拜勒(Baylor)等人，2002，疫苗(Vaccine)，20：S18；以引用的方式并入本文中)和单磷酰脂A(MPL；里比(Ribi)等人，1986，细菌内毒素免疫学和免疫药理学(Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins)，纽约普莱南出版公司(Plenum Publ.Corp.，NY)第407页；以引用的方式并入本文中)作为人类疫苗中的佐剂。或者或另外，目前正在测试在人类疫苗中用作佐剂的新化合物，如MF59(凯龙公司(Chiron Corp.)，http://www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html)、CPG7909(库柏(Cooper)等人，2004，疫苗，22：3136；以引用的方式并入本文中)以及皂角苷，如QS21(弗奇克安(Ghochikyan)等人，2006，疫苗，24：2275；以引用的方式并入本文中)。
另外，所属领域中已知一些佐剂提高流感疫苗的免疫原性，如聚[二(羧根基苯氧基)磷腈](PCCP；派恩(Payne)等人，1998，疫苗，16：92；以引用的方式并入本文中)、干扰素-γ(曹(Cao)等人，1992，疫苗，10：238；以引用的方式并入本文中)、嵌段共聚物P1205(CRL1005；卡茨(Katz)等人，2000，疫苗，18：2177；以引用的方式并入本文中)、介白素-2(IL-2；姆乌克(Mbwuike)等人，1990，疫苗，8：347；以引用的方式并入本文中)以及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA；克如特(Kreuter)等人，1981，医药科学杂志(J.Pharm.Sci.)，70：367；以引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，根据本发明的组合物(例如结合剂的组合物)不包括佐剂(例如所提供的组合物基本上不含佐剂)。在一些实施例中，根据本发明的组合物不包括矾佐剂(例如所提供的组合物基本上不含矾)。
除疫苗以外，本发明还提供适用于治疗病毒性感染的其它治疗组合物。在一些实施例中，通过投与干扰HA多肽的表达或活性的试剂来实现治疗。
在一些实施例中，本发明提供包含抗体或与所提供的多肽有关的其它试剂的医药组合物。举例来说，本发明提供含有以下物质的组合物：含有特定HA多肽(例如结合于伞形聚糖的HA多肽)的抗体识别病毒粒子、核酸(如与HA序列互补的核酸序列，其可以用于RNAi)、竞争结合于HA受体的聚糖、竞争聚糖-HA多肽相互作用的小分子或糖模拟物或其任何组合。在一些实施例中，使用大量具有不同结构的不同试剂。在一些实施例中，治疗组合物包含一种或一种以上多价试剂。在一些实施例中，治疗包含在曝露或疑似曝露之后不久紧急投与。
在一些实施例中，任何本文所述的疫苗均提供针对不同种类流感病毒的广泛交叉保护。举例来说，在一些实施例中，本文所述的疫苗提供针对禽类与人类适应H5病毒的交叉保护。在一些实施例中，任何本文所述的疫苗均提供针对任何H5流感病毒株或变异体的交叉保护。在一些实施例中，任何本文所述的疫苗均提供针对任何H2流感病毒株或变异体的交叉保护。在一些实施例中，任何本文所述的疫苗均提供针对任何H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16流感病毒株或变异体的交叉保护。
一般来说，医药组合物将包括治疗剂以及一种或一种以上非活性试剂，如无菌生物相容性载剂，包括(但不限于)无菌水、生理盐水、缓冲生理盐水或右旋糖溶液。或者或另外，组合物可以含有多种添加剂中的任一种，如稳定剂、缓冲剂、赋形剂(例如糖、氨基酸等)或防腐剂。
在一些实施例中，根据本发明的医药组合物中存在的治疗剂将由一种或一种以上如本文所述的结合剂组成。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物含有结合于伞形拓扑聚糖(和/或伞形拓扑聚糖模拟物)的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)。在一些所述实施例中，根据本发明的组合物实质上不含不结合于伞形拓扑聚糖的相关试剂(例如其它HA多肽等)。在一些所述实施例中，根据本发明的医药组合物含有不超过50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的结合于除伞形拓扑聚糖以外的HA受体聚糖的试剂。
在一些实施例中，医药组合物将包括囊封、封闭或束缚在脂质小泡、生物可用和/或生物相容性和/或可生物降解基质或其它微粒内的治疗剂。
在一些实施例中，所提供的医药组合物将包括未聚集的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)。举例来说，在一些实施例中，少于1％、2％、5％、10％、20％或30％(以干重或数量计)的结合剂以聚集物形式存在。
在一些实施例中，所提供的医药组合物将包括未变性的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)。举例来说，在一些实施例中，少于1％、2％、5％、10％、20％或30％(以干重或数量计)的所投UTSBA为变性的。
在一些实施例中，所提供的医药组合物将包括未失活的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)。举例来说，在一些实施例中，少于1％、2％、5％、10％、20％或30％(以干重或数量计)的所投UTSBA为失活的。
在一些实施例中，调配根据本发明的医药组合物以降低所提供结合剂的免疫原性。举例来说，在一些实施例中，所提供的结合剂与遮蔽其免疫原性的试剂(如聚乙二醇和/或羧甲基纤维素)缔合(例如结合)。在一些实施例中，所提供的结合剂具有降低免疫原性的其它糖基化。
本发明的医药组合物可以单独或与一种或一种以上包括(但不限于)疫苗和/或抗体的其它治疗剂组合投与。“与……组合”并不欲暗示所述试剂必须同时投与或调配用于一起递送，不过这些递送方法在本发明的范围内。一般来说，每种试剂将以针对此试剂所确定的剂量和时程来投与。另外，本发明涵盖将根据本发明的医药组合物与可以改善其生物可用性、降低或改变其代谢、抑制其排泄或改变其在体内的分布的试剂组合递送。虽然本发明的医药组合物可以用于治疗有需要的任何个体(例如任何动物)，但它们最优选地用于治疗人类。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物和/或结合剂是与一种或一种以上抗病毒剂(例如奥司他韦(Oseltamivir)扎那米韦(Zanamavir)等)和/或唾液酸酶组合投与。
本发明的医药组合物可以通过多种途径投与，包括经口、静脉内、肌肉内、动脉内、皮下、心室内、经皮、皮内、经直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏、乳膏或滴剂)、经粘膜、经鼻、经颊、经肠、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或以经口喷雾、经鼻喷雾和/或气溶胶形式。一般来说，最适当的投药途径将取决于多种因素，包括药剂的性质(例如它在胃肠道环境中的稳定性)、患者的情况(例如患者是否能够耐受经口投药)等。
目前，最经常使用经口或经鼻喷雾或气溶胶途径(例如通过吸入)将治疗剂直接递送到肺部和呼吸道系统中。然而，考虑到药物递送科学可能取得进展，本发明涵盖通过任何适当的途径递送根据本发明的医药组合物。
在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂包含多个粒子。在一些实施例中，所述制剂的平均粒径为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12或约13微米。在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂调配成干粉末。在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂例如通过包括湿润剂而调配成湿粉末。在一些实施例中，湿润剂是选自由水、生理盐水或具有生理pH值的其它液体组成的群组。
在一些实施例中，根据本发明的组合物是以滴剂形式投与鼻腔或口腔中。在一些实施例中，一剂可以包含多滴(例如1-100、1-50、1-20、1-10、1-5等)。
在一些实施例中，根据本发明的组合物是使用递送计量剂量的组合物(例如结合剂)的装置来投与。
适用于递送本文所述的皮内医药组合物的装置包括短针装置，如描述于美国专利第4,886,499号、美国专利第5,190,521号、美国专利第5,328,483号、美国专利第5,527,288号、美国专利第4,270,537号、美国专利第5,015,235号、美国专利第5,141,496号、美国专利第5,417,662号(均以引用的方式并入本文中)中的那些短针装置。也可以通过限制针有效穿透到表皮中的长度的装置(如描述于WO99/34850(以引用的方式并入本文中)中的那些装置)以及其功能相等物来投与皮内组合物。同样合适的是通过刺入角质层并且产生到达真皮的射流的液体射流注射器或针将液体疫苗递送到真皮的射流注射装置。射流注射装置描述于例如美国专利第5,480,381号、美国专利第5,599,302号、美国专利第5,334,144号、美国专利第5,993,412号、美国专利第5,649,912号、美国专利第5,569,189号、美国专利第5,704,911号、美国专利第5,383,851号、美国专利第5,893,397号、美国专利第5,466,220号、美国专利第5,339,163号、美国专利第5,312,335号、美国专利第5,503,627号、美国专利第5,064,413号、美国专利第5,520,639号、美国专利第4,596,556号、美国专利第4,790,824号、美国专利第4,941,880号、美国专利第4,940,460号、WO97/37705以及WO 97/13537(均以引用的方式并入本文中)中。同样合适的是使用压缩气体加速疫苗以粉末形式穿过皮肤外层到达真皮的弹道式粉末/粒子递送装置。另外，在皮内投药的经典曼托方法(classical mantoux method)中可以使用常规注射器。
医药试剂的调配和制造中的一般考虑因素可见于例如雷明顿医药科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第19版，宾夕法尼亚州伊斯顿麦克出版公司(Mack PublishingCo.，Easton，PA)，1995；以引用的方式并入本文中。
根据本发明的医药组合物可以呈适于达成所需结果的任何剂量来投与。在一些实施例中，所需结果为一种或一种以上流感感染症状的强度、严重性和/或频率降低和/或发作延迟。
在一些实施例中，调配根据本发明的医药组合物以投与有效地与流感HA竞争结合于伞形拓扑聚糖的剂量的结合剂。在一些实施例中，在投与一剂或一剂以上的根据本发明的组合物后，所述流感HA的结合与它在所述投药不存在情况下的程度相比有所降低。在一些实施例中，调配根据本发明的医药组合物以投与有效地使至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的存在于接收组合物的个体中(例如个体的呼吸道中)的HA结合位点(例如含有伞形拓扑聚糖的HA结合位点)饱和的剂量的结合剂。
在一些实施例中，调配根据本发明的医药组合物以递送在0.0001到1000mg/kg范围内的单位剂量的结合剂。
在一些实施例中，根据本发明的医药组合物是以多个剂量投与。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物是以每天多个剂量投与。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物是根据连续给药方案来投与，使得个体不经历在治疗性给药期之间插入的少于治疗性给药的时期。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物是根据间歇给药方案来投与，使得个体经历至少一个在两个治疗性给药期之间插入的少于治疗性给药的时期。
诊断剂/试剂盒
本发明提供用于检测病理样本中的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)并且尤其用于检测具有特定聚糖结合特征(例如结合于伞形聚糖、α2-6唾液酸化聚糖、长α2-6唾液酸化聚糖等)的结合剂的试剂盒，所述病理样本包括(但不限于)血液、血清/血浆、周边血液单核细胞/周边血液淋巴细胞(PBMC/PBL)、唾液、尿、粪便、喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓流体、子宫颈刮片、脓样本、食物基质以及来自身体多个部分(如脑、脾以及肝)的组织。本发明还提供用于检测环境样本中的相关结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)的试剂盒，所述环境样本包括(但不限于)土壤、水以及植物群。也可以应用其它未列出的样本。
在一些实施例中，本发明提供用于检测如本文所述的HA多肽的试剂盒，其检测所述多肽是否为结合剂。
在一些实施例中，根据本发明的试剂盒可以包括一种或一种以上特异性检测具有特定聚糖结合特征的结合剂(例如HA多肽、LSBA、UTBA、UTSBA等)的试剂。所述检测试剂可以包括例如特异性识别某些结合剂(例如结合于伞形聚糖和/或α2-6唾液酸化聚糖和/或长α2-6唾液酸化聚糖的结合剂)的抗体，其可以用于通过ELISA、免疫荧光法和/或免疫印迹法特异性检测所述结合剂。
结合于HA多肽的抗体也可以用于病毒中和测试，其中用对相关HA多肽具有特异性的抗体处理样本，并且测试它相对于未经处理的样本感染所培养细胞的能力。如果此样本中的病毒含有所述HA多肽，那么抗体将中和病毒并且阻止它感染所培养的细胞。或者或另外，所述抗体也可以用于HA抑制测试，其中将HA蛋白与既定样本分离，用对特定HA多肽或HA多肽组具有特异性的抗体处理，并且测试它相对于未经处理的样本凝集红血球的能力。如果样本中的病毒含有所述HA多肽，那么抗体将中和HA多肽的活性并且阻止它凝集红血球(哈洛和兰尼，1988，抗体：实验手册，冷泉港实验室出版社；www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html；www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html)。在一些实施例中，所述试剂可以包括核酸，其特异性结合于编码特定HA多肽的核苷酸并且可以用于通过RT-PCR或原位杂交特异性检测所述HA多肽(www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html；www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html)。在一些实施例中，在检测前，将已与样本分离的核酸扩增。在一些实施例中，诊断试剂可以被可检测地标记。
本发明还提供含有根据本发明用于产生流感病毒和疫苗的试剂的试剂盒。试剂盒的内含物包括(但不限于)含有编码相关HA多肽(或特征或生物学活性部分)的HA核苷酸(或特征或生物学活性部分)的表达质粒。或者或另外，试剂盒可以含有表达相关HA多肽(或特征或生物学活性部分)的表达质粒。也可以包括不含病毒基因的表达质粒，以使得用户能够将来自任何相关流感病毒的HA核苷酸并入。试剂盒还可以包括哺乳动物细胞系，包括(但不限于)Vero和MDCK细胞系。在一些实施例中，诊断试剂可以被可检测地标记。
在一些实施例中，根据本发明使用的试剂盒可以包括参考样本、用于加工样本、进行测试的说明书、用于解释结果的说明书、进行测试所必需的缓冲剂和/或其它试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含一组抗体。
在本发明的一些实施例中，可以使用如上文所论述的聚糖阵列作为诊断剂和/或试剂盒。
在一些实施例中，使用根据本发明的聚糖阵列和/或试剂盒进行剂量反应研究，以评估HA多肽与伞形聚糖在多个剂量(例如如本文所述)下的结合。所述研究提供的对所测试HA多肽的结合特征的了解尤其有价值，并且所述研究尤其适用于评估特异性结合。这种类型的剂量反应结合研究发现有许多有用的应用。仅举一个实例，它们可以帮助追踪相关系列的HA多肽变异体中的结合特征的进化，无论所述系列是通过天然进化、有意工程化还是这两种的组合产生。
在一些实施例中，使用根据本发明的聚糖阵列和/或试剂盒来诱导、鉴别和/或选择具有所需结合特征的结合剂(例如HA多肽和/或HA多肽变异体)。举例来说，在一些实施例中，使用根据本发明的聚糖阵列和/或试剂盒来对一群多肽结合剂(例如HA多肽)施加进化(例如筛选和/或选择)压力。
本发明提供用于投与根据本发明的医药组合物的试剂盒。举例来说，在一些实施例中，本发明提供一种包含至少一个剂量的结合剂的试剂盒。在一些实施例中，本发明提供一种包含初始单位剂量和后续单位剂量的结合剂的试剂盒。在一些所述实施例中，初始单位剂量大于后续单位剂量或其中两种剂量相等。
在一些实施例中，根据本发明的试剂盒(尤其用于投与根据本发明的医药组合物的那些试剂盒)包含至少一个递送装置组件，例如吸入器。在一些所述实施例中，本发明提供一种包含至少一个递送装置组件(例如吸入器)以及一剂结合剂的试剂盒。
在一些实施例中，所提供的试剂盒包含使用说明书。
例证
实例1：鉴别广谱人类结合HA多肽的分子决定因素
引言
H5N1禽流感病毒(“鸟流感(bird flu)”或“禽流感(avian flu)”)为高度感染性和致命性的病原体。自从1996年以来，在三大洲已发生若干次H5N1爆发，杀死了数百万家禽。所述病毒自从出现以来，也已显示出它能够感染人类，并且死亡率超过60％。虽然人类实际上对H5N1病毒没有免疫性，但此病毒尚未适应于人类宿主，从而能够在人类之间有效地感染并且传播。此病毒将获得突变以允许它在人类群体中获得立足点。
血球凝集素(HA)(A型流感病毒的表面糖蛋白)负责引发病毒进入宿主细胞。HA结合于唾液酸化聚糖受体(以α2→3或α2→6连接唾液酸终止的复合聚糖)。H5N1 HA优先结合于以α2→3连接唾液酸终止的聚糖受体。本发明人已证实，对于人类适应A型流感病毒来说人类宿主中的聚糖受体为在HA的聚糖受体结合位点(RBS)中采用特征性伞形拓扑的α2→6唾液酸化聚糖(此后称为人类受体)(钱德拉塞卡兰(Chandrasekharan)等人，2008，自然生物技术(Nat Biotech)，26：107；以引用的方式并入本文中)。本发明人也已显示高亲和力结合于这些人类聚糖受体为人类适应HA的特征，并且与人类适应H1N1和H3N2病毒的有效空气传播性有关(钱德拉塞卡兰等人，2008，自然生物技术(Nat Biotech)，26：107；斯里尼瓦桑(Srinivasan)等人，2008，美国国家科学院院刊(PNAS)，105：2800；均以引用的方式并入本文中)。在本研究中，本发明人已提供一种HA在RBS中具有允许H5N1病毒以高亲和力结合于人类受体的序列取代的H5N1病毒。
实验设计
流感HA为同源三聚蛋白，其中单体含有552个氨基酸。每一单体由两个二硫化物连接的部分HA1和HA2构成。HA1包含聚糖受体结合位点(RBS)，而HA2参与病毒与细胞膜的融合。RBS袋涉及HA位置95、131、133、136、137、138、145、153、155、156、158、159、183、186、187、189、190、192、193、194、195、196、219、222、224、225、226、227、228(使用H3编号)。
本发明人已进行了对H5N1与代表性人类受体之间分子接触的详细分析，并且已将这些接触与人类适应流行性H1N1、H2N2以及H3N2HA与人类受体之间的那些接触进行比较。通过这种方法，本发明人已确定了用于产生H5N1 HA的突变形式的策略。已在H5N1HA的若干遗传进化枝中引入突变Q226L和G228S(或LS)。这些突变是基于分别在已引起人类适应的H2N2和H3N2HA的226和228位置处的特征性氨基酸取代。
已在H5N1 HA的不同遗传进化枝的RBS的情形下引入这些突变(图13)。先前研究(例如斯提芬斯(Stevens)等人，2008，分子生物杂志，381：1382-94；以及斯提芬斯等人，2006，科学，312：404；均以引用的方式并入本文中)已在聚糖阵列平台上分析了不同H5N1病毒株中包含LS突变的重组HA与全病毒，并且已显示这些病毒株中有一些已获得与α2→6唾液酸化聚糖的结合(图14)。然而，这些研究的目的是筛选在高蛋白浓度或病毒效价下的结合以确定有多少α2→3或α2→6聚糖显示结合信号。
相比之下，本发明人对来自若干H5N1病毒株的在RBS中携带LS突变的重组HA进行了剂量依赖性分析(图15)。本发明的数据表明这些突变中无一者显示人类适应HA所享有的对人类受体的特征性高结合亲和力。本发明结果还与RBS中仅携带LS突变的H5N1病毒的低效传播有关。然而，这些突变中无一者显示高亲和力人类受体结合。因此，需要其它策略来确定H5N1 HA的突变形式。
消除糖基化的突变
因此，本发明人将128、133、145、159、193处(下文中的粗体并且带下划线的残基)的5个氨基酸取代引入Viet_1203_04_c1(作为进化枝1病毒株的A/越南/1203/04)HA中，以便使它的RBS与较近期的遗传进化枝(其包括如A/印度尼西亚/5/05的病毒株)的RBS类似。
本发明人认识到氨基酸位置N158处的糖基化可能干扰H5N1 HA的RBS中人类受体的伞形拓扑。因此，本发明人的第一策略涉及产生包含Q228L和/或G228S取代以及消除N158处的糖基化的额外T160A突变的H5N1 HA的突变形式。
此糖基化位点在所有遗传进化枝中为不保守的。如果在N158处不存在糖基化改善人类受体与具有LS突变的H5N1 HA的结合，那么单独LS突变可能足以达成属于天然缺少此糖基化位点的遗传进化枝(c2.2、c2.2.1等；参见图13)的病毒的人类适应。这些进化枝的模板序列选择为埃及_2876-N306c2.2(属于进化枝2.2的A/埃及/2786-N3/06)。鉴于在H2HA中，Q226L突变足以实质上提高亲和力，本发明人也已确定携带单独Q226L突变(在158位置处去糖基化的情形下)的突变形式以检验人类受体结合亲和力提高的程度。
上述突变的剂量依赖性分析(图16)显示通过在LS突变情形下产生Thr-160→Ala突变来去除Asn-158处的糖基化实质上改善与人类受体的结合。对于Viet1203_04_D上的T160A/Q226L/G228S突变体以及埃及_2876-N306c2.2HA上的LS突变均观察到此情况。本发明人进一步证实单独Q226L突变(在无G228S的情况下)不足以在去除N158处的糖基化的情形下提供高人类受体结合亲和力。然而，本发明认识到，在一些特定病毒株的情形下，单独Q226处的突变(例如Q226L)可能足以在去除N158处的糖基化的情形下提供高人类受体结合亲和力。本发明还认识到，在一些特定病毒株的情形下，单独G228处的突变(例如G228S)可能足以在去除N158处的糖基化的情形下提供高人类受体结合亲和力。本发明还认识到，在一些特定病毒株的情形下，可能需要Q226与G228处的突变(例如Q226L与G228S)以在去除N158处的糖基化的情形下提供高人类受体结合亲和力。
另外，本发明人发现上述突变体与禽类受体(尤其与3′SLN-LN-LN和3′SLN-LN)的结合也相当高，这不是人类适应HA所特有的。举例来说，即使在显示人类与禽类受体结合的原型流行性H2N2 HA(A/奥尔巴尼/6/58)的情况下，人类受体结合亲和力也比禽类受体结合亲和力高数个数量级。
环形区中的氨基酸缺失
本发明人已设计H5N1 HA的突变形式，以使得它的RBS与人类受体之间的分子接触密切模拟人类适应H2N2 HA与人类受体之间的接触。基于本发明人先前在理解H2N2HA的RBS的分子组成以及它如何控制聚糖受体特异性方面的工作，本发明人首先对H5N1 HA的RBS与来自1957-58流行性病毒株(A/奥尔巴尼/6/58或Alb6_58)的原型人类适应H2N2 HA的RBS进行了详细分子比较(图17)。为使H5HA与Alb6_58 HA之间的RBS的分子组成的差异减到最小，本发明人在Viet1203_04_D模板(“Viet1203_04_D_H2RBS”；SEQ ID NO：61)上产生突变体，其包含在131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228处的13个氨基酸取代以及130处的缺失。本研究首次聚焦于H5N1 HA RBS中的突变的设计和测试，所述突变代表基于H2与H5HA之间的全面比较的缺失与取代的组合。缺失是在位置130处形成。虽然H2N2HA在158位置处不具有糖基化，但在突变HA中保留N158糖基化位点(Viet1203_04_D的)。因此，本发明认识到，除上述突变以外，消除158位点处的糖基化的突变可能甚至进一步增强人类结合。本发明人还设计了这种突变体的另一型式(“Viet1203_04_D_H2RBSmin”；SEQ ID NO：63)，其具有较少的基于保守取代的突变。
本发明人还从可能在RBS的分子组成方面天然地更接近于Alb6_58 H2N2 HA的其它H5N1病毒株搜寻HA序列。本发明人鉴别了两组示范性模板：(1)位置192和193处的电荷性质发生转变(A/鸡/越南/NCVD-093/2008或ckViet_08)以及(2)在130环中具有缺失(A/鸡/埃及/R2/2007或ckEgy_07)。设计在这些新H5N1 HA模板上的上述位置中具有较少突变的其它突变形式，使得H5N1 HA RBS模拟人类适应H2N2 HA RBS。
测试了使用剂量依赖性聚糖阵列的突变人类受体结合亲和力。Viet1203_04_D_H2RBS突变体显示与人类受体高特异性高亲和力结合，这是人类适应H1N1和H2N2HA的特征(图19)。本发明认识到，可以设计其它突变以了解以下各者之间的关系：(1)130环组成和缺失，(2)192和193位置处的带电残基的转变以及(3)158位置处的糖基化，以及这种关系如何控制突变H5N1 HA的人类受体结合亲和力。
所用H5N1模板的示范性序列以及根据上述原理和实例2中阐述的原理设计的示范
性突变多肽
示范性H5N1模板与根据上述原理和实例2中阐述的原理设计的示范性突变H5HA多肽的比对呈现于图18和下文中：
Viet1203_04_D：粗体、带下划线的残基表示取代位点
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在以下序列中，斜体字和突出显示表示形成突变的区域，并且粗体字和下划线表示突变的残基。
Viet1203_04_D_H2RBS：
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDH_
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Viet1203_04_D_H2RBS_N158deglyc
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Viet1203_04_D_H2RBSmin)：缺失+7个突变
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHASSGVS
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Viet1203_04_D(T160A/Q226L/G228S)突变：
MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKPSFFRNVVWLIKKNN
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埃及_2876-N3_06_c2.2：用较大字体表示不具有158处的糖基化
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLIKKYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQID NO：65)
具有LS突变的埃及_2876-N3_06_c2.2HA：用较大字体表示不具有158处的糖基化
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具有单一Q226L突变的埃及_2876-N3_06_c2.2HA：用较大字体表示不具有158处的糖基化
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具有T160A/Q226L双重突变的Viet1203_04_D：
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ckViet_08：已具有如在H2N2中观察到的Lys192和Met193电荷组合(用较大字体表示)的野生型HA
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ckViet_08_H2RBS：缺失+6个突变
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TS
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ckViet_08_H2RBS：缺失+5个突变
MEKIVLLLAIIGLVKSDQICVGYHANNSTEQVDTIMEKNITVTHAQDILEKTHNGKLCNLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVSEWSYIVEKASPANGLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIKIIPKSYWSNH
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ckViet_08_H2RBSmin：缺失+4个突变
MEKIVLLLAIIGLVKSDQICVGYHANNSTEQVDTIMEKNITVTHAQDILEKTHNGKLCNLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVSEWSYIVEKASPANGLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIKIIPKSYWSNH
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ckEgy_07：已具有130环中的缺失
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKDNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTQISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGERRRKRRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQ IDNO：73)
ckEgy_07_LS：ckEgy_07上的LS突变
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKDNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTQISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNG
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ckEgy_07_H2RBS：8个突变
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICICYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHTASGVSRACPYQGRSSFFRNVVWLTKKDNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDEAEQRALYQNPTTQISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGLGSRMEFFWTILKSNDAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGERRRKRRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI(SEQ IDNO：75)
讨论
已尝试若干实验研究来鉴别H5HA的人类受体特异性的决定因素。然而，这些研究聚焦于RBS位点处氨基酸的直接替代，而没有考虑相邻位置的影响。另外，现有研究甚至并不考虑插入或缺失作为宿主特异性的可能决定因素。基于结构的研究也尚不足以鉴别H5HA的决定因素，主要是因为使用电脑模拟分析并不能准确评估缺失的结构影响。相比之下，本发明人首次认识到序列比对方法对工程化具有新颖性质的蛋白的重要性并且已使用序列比对方法来工程化具有新颖性质的蛋白。本发明认识到，可以使用类似方法来鉴别近年来已显示感染人类的潜能的其它HA亚型(H7、H9等)的宿主特异性的决定因素。
材料与方法
野生型HA多肽与具有不同拓扑的聚糖的剂量反应直接结合
直接结合分析通常使用聚糖阵列，其中确定的聚糖结构(例如单价或多价)呈现于支撑物(例如载玻片或孔板)上，常使用聚合物主链。在所谓的“依序”分析中，使三聚HA多肽与阵列结合，并且接着例如使用经标记(例如用FITC或辣根过氧化酶)的一次和二次抗体检测。在“多价”分析中，首先将三聚HA与一次和二次抗体(通常以4∶2∶1HA∶一次∶二次比率)复合，使得每一预复合HA存在12个聚糖结合位点，并且接着使其与阵列接触。通常在一系列HA浓度上进行结合分析，以获得关于对阵列中的不同聚糖的相对亲和力的信息。
举例来说，用具有不同聚糖(如3′SLN、6′SLN、3′SLN-LN、6′SLN-LN以及3′SLN-LN-LN，其中LN表示Galβ14GlcNAc，3′表示Neu5Ac α2-3，并且6′表示Neu5Ac α2-6)的阵列进行直接结合研究。具体来说，将生物素化聚糖(50μl，120pmol/ml)与抗生蛋白链菌素涂布的事先用PBS冲洗三次的高结合容量384孔板一起培育过夜(在PBS中，在4℃下)。接着用PBS将所述板洗涤三次以去除过量聚糖，并且不经进一步加工就使用。
将适当量的His标记HA蛋白、一次抗体(小鼠抗6×His标签)以及二次抗体(HRP偶联山羊抗小鼠IgG)以4∶2∶1HA∶一次∶二次的比率在冰上培育15分钟。接着，使用于PBS中的1％BSA将混合物(即预复合HA)补充到最终体积250μl。接着，将50μl预复合HA添加到384孔板中聚糖涂布的孔中，并且在室温下培育2小时。随后用含有0.05％TWEEN-20的PBS将所述孔洗涤三次，并且接着用PBS洗涤三次。使用安普莱克司红过氧化酶试剂盒(Amplex Red Peroxidase Kit)(加利福尼亚州英杰(Invitrogen，CA))根据制造商的说明来评估HRP活性。研究HA预复合物的连续稀释液。包括适当阴性(非唾液酸化聚糖)和背景(无聚糖或无HA)对照物，并且所有分析重复进行三次。
实例2：示范性人类结合H5HA多肽变异体
在一些实施例中，HA多肽为H5多肽。在一些所述实施例中，根据本发明的H5多肽显示结合(例如高亲和力和/或特异性结合)于伞形聚糖。在一些所述实施例中，根据本发明的H5多肽显示可比较(与伞形拓扑结合)地高亲和力结合于锥形拓扑聚糖，或结合于锥形拓扑聚糖减少(例如相对于伞形拓扑聚糖亲和力和/或特异性较低)。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于在人类上呼吸道上皮细胞上发现的受体。此外，根据本发明的H5HA多肽结合于多个不同的α2-6唾液酸化聚糖。在一些实施例中，H5HA多肽结合于伞形聚糖。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于支气管和/或气管中的HA受体。在一些实施例中，H5HA多肽不能结合深肺中的受体，而在一些实施例中，H5HA多肽能够结合深肺中的受体。在一些实施例中，H5HA多肽不能结合于α2-3唾液酸化聚糖，而在一些实施例中，H5HA多肽能够结合于α2-3唾液酸化聚糖。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽为亲本H5HA(例如在天然流感分离株中发现的H5HA)的变异体。举例来说，在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽与野生型H5HA相比具有在聚糖结合位点内或影响聚糖结合位点的至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，所述取代为直接与所结合聚糖相互作用的氨基酸的取代；在一些实施例中，所述取代为离与所结合聚糖相互作用的氨基酸有一分隔度的氨基酸的取代，因为一分隔度的氨基酸(1)与直接结合的氨基酸相互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不直接与聚糖本身相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，并且也直接与聚糖本身相互作用。根据本发明的H5HA多肽含有一个或一个以上直接结合氨基酸、一个或一个以上第一分隔度氨基酸、一个或一个以上第二分隔度氨基酸或这些的任何组合的取代。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽可以含有一个或一个以上具有甚至更高分隔度的氨基酸的取代。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体与野生型H5HA相比具有至少两个、三个、四个、五个或五个以上的氨基酸取代；在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体具有两个、三个或四个氨基酸取代。在一些实施例中，所有所述氨基酸取代均位于聚糖结合位点内。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽变异体含有一个或一个以上如美国专利公开案第2009/0269342号和第2010/0004195号中任一者以及2010年7月2日申请的名为“用于诊断和/或治疗流感感染的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORDIAGNOSING AND/OR TREATING INFLUENZA INFECTION)”的美国专利申请案第12/829931号(均以引用的方式并入本文中)中所述的氨基酸取代。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有序列取代：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在选自由以下残基组成的群组的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37个选自由以下残基组成的群组的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代：95、98、128、130、131、132、133、135、136、137、138、145、153、155、156、158、159、160、183、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、219、221、222、224、225、226、227以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于位置158的位点处具有减少或消除糖基化的序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有影响和/或改变与对应于位置158的位点连接的聚糖的身份和/或结构的序列取代。在一些实施例中，这种序列取代为在对应于位置158的位点处的突变，例如Asn158Xaa，其中Xaa为除Asn以外的任何氨基酸。在一些实施例中，这种序列取代为在对应于位置160的位点处的突变，例如Thr160Xaa，其中Xaa为除Asn以外的任何氨基酸。在一些实施例中，这种序列取代包含突变Thr160Ala。在一些实施例中，减少、消除、影响或改变对应于位置158的位点处的糖基化的序列取代可以使H5HA多肽更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。在一些实施例中，在对应于位置160的位点处的突变(例如Thr160Xaa，如Thr160Ala)可以使H5HA多肽更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226、228以及160中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226、228以及160的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226和160的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基228和160的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226和228的位置处具有一个或一个以上序列取代。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226、228以及158中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226、228以及158的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226和158的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基228和158的位置处具有一个或一个以上序列取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在对应于残基226和228的位置处具有一个或一个以上序列取代。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有一个或一个以上序列取代，所述序列取代包括在HA多肽的一个或一个以上环形区中的缺失。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有一个或一个以上序列取代，所述序列取代包括在对应于HA多肽的128-137环形区的位点处的缺失。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有一个或一个以上序列取代，所述序列取代包括在HA多肽的对应于以下残基的一个或一个以上氨基酸位置处的缺失：128、129、130、131、132、133、134、135、136和/或137。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有一个或一个以上序列取代，所述序列取代包括在对应于HA多肽的128-134环形区的位点处的缺失。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有一个或一个以上序列取代，所述序列取代包括在HA多肽的对应于以下残基的一个或一个以上氨基酸位置处的缺失：128、129、130、131、132、133和/或134。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有一个或一个以上序列取代，所述序列取代包括对应于残基130的氨基酸的缺失。在一些实施例中，所述环形区取代可以使H5HA多肽更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。在一些实施例中，对应于残基130的氨基酸的缺失可以使H5HA多肽更加类似于(例如在结构与功能上)H2HA多肽。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、135、188、192、221以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、135、188、192、221以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、135、188、192以及221。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5或6者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、135、188、192以及221。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：133、137、155、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有一个或一个以上序列取代：133、137、155、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：133、137、155、193、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有一个或一个以上序列取代：133、137、155、193、226、227以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：130、192以及193。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2或3者的位置处具有一个或一个以上序列取代：130、192、193。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)残基192和193中的一者或两者的位置处具有一个或一个以上序列取代。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6或7者的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5或6者的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132、133以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132、133以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132以及133。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、227、228、131、132以及133。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：227、131、132、133以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4或5者的位置处具有一个或一个以上序列取代：227、131、132、133以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：227、131、132以及133。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3或4者的位置处具有一个或一个以上序列取代：227、131、132以及133。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、227以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8或9者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、188、192、193、226以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、228以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226以及228。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226以及228。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221以及227。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11者的位置处具有一个或一个以上序列取代：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221以及227。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于以下残基中的任1、2、3、4、5或6者的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、221、227以及130。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的一者或一者以上的位置处具有一个或一个以上序列取代：131、132、133、221以及227。在一些实施例中，HA多肽变异体(例如H5HA多肽变异体)相对于野生型亲本HA在对应于(1)130以及(2)以下残基中的任1、2、3、4或5者的位置处具有序列取代：131、132、133、221以及227。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在选自位于与聚糖直接结合的受体区域中的氨基酸的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)残基98、136、153、155、183以及194。在一些实施例中，H5HA多肽变异体相对于野生型亲本H5HA在选自与直接结合聚糖的受体区域相邻定位的氨基酸的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代，所述残基包括(但不限于)：(a)残基98和195，(b)残基98、138、186、187、195以及228，或(c)残基138、186、187以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自离与所结合聚糖相互作用的那些氨基酸有一分隔度的氨基酸的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代，因为一分隔度的氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不直接与聚糖本身相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，并且也直接与聚糖本身相互作用，所述残基包括(但不限于)残基98、138、186、187、195以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自离与所结合聚糖相互作用的那些氨基酸有一分隔度的氨基酸的残基处有一个或一个以上氨基酸取代，因为一分隔度的氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不直接与聚糖本身相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，并且也直接与聚糖本身相互作用，所述残基包括(但不限于)残基138、186、187以及228。
在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自离与所结合聚糖相互作用的那些氨基酸有一分隔度的氨基酸的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代，因为一分隔度的氨基酸(1)与直接结合氨基酸相互作用；(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，但不直接与聚糖本身相互作用；或(3)以其它方式影响直接结合氨基酸与聚糖相互作用的能力，并且也直接与聚糖本身相互作用，所述残基包括(但不限于)残基98和195。
在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在残基159处具有氨基酸取代。
在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自以下的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代：190、193、225以及226。在一些实施例中，HA多肽变异体并且尤其是H5多肽变异体相对于野生型亲本HA在选自以下的残基处具有一个或一个以上氨基酸取代：190、193、226以及228。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体具有以下氨基酸取代中的一者或一者以上：Ser132Thr、Ala133Thr、Ser133Thr、Ser137Ala、Ser137Arg、Ile155Thr、Lys156Glu、Asn158Xaa(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)、Thr160Ala、Asn186Pro、Asp187Ser、Asp187Thr、Ala188Glu、Ala188Asp、Ala189Gln、Ala189Lys、Ala189Thr、Glu190Asp、Glu190Thr、Thr192Arg/Lys、Lys193Arg、Lys 193Asn、Lys193His、Lys193Ser、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ser221Pro、Gly225Asp、Gln226Ile、Gln226Leu、Gln226Val、Ser227Ala、Gly228Ser。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体在对应于残基192的位置处具有氨基酸取代，其转变所述位置的电荷。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体在对应于残基193的位置处具有氨基酸取代，其转变所述位置处的电荷。举例来说，在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽在对应于残基192的位置处具有Thr或疏水性残基(例如Val或Ile)，而H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有亲水性残基。在一些实施例中，H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有亲水性残基。举另一实例，在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽在对应于残基192的位置处具有Thr或疏水性残基(例如Val或Ile)，而H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有碱性残基(例如Lys或Arg)。在一些实施例中，H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基192的位置处具有碱性残基(例如Lys或Arg)。举另一实例，在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽在对应于残基193的位置处具有碱性残基(例如Lys或Arg)，而H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基193的位置处具有中性或酸性残基。在一些实施例中，H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基193的位置处具有中性或酸性残基。在一些实施例中，H5HA多肽变异体(例如人类适应变异体)在对应于残基193的位置处具有Thr、Ala、Met或Val。
在一些实施例中，H5HA多肽的人类适应与位置188处的残基的性质有关。在H5HA中，残基188时常为Ala，其与192处的Thr或疏水性残基接触。相比之下，在H2HA中，残基188时常为Glu或Asp，其与192处的Arg或Lys接触。因此，在一些实施例中，H5HA多肽变异体在位置188处具有Glu。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在位置188处具有Asp。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有Ala188Glu取代。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有Ala188Asp取代。
在一些实施例中，H5HA多肽具有在对应于残基188的位置处的Ala以及在对应于残基192的位置处的Thr。在一些实施例中，H5HA多肽具有在对应于残基188的位置处的Ala以及在对应于残基192的位置处的疏水性残基。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Glu以及在对应于残基192的位置处的Arg。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Asp以及在对应于残基192的位置处的Arg。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Glu以及在对应于残基192的位置处的Lys。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Asp以及在对应于残基192的位置处的Lys。
在一些实施例中，H5HA多肽具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的Thr以及在对应于残基193的位置处的Lys。在一些实施例中，H5HA多肽具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的疏水性残基以及在对应于残基193的位置处的Lys。在一些实施例中，H5HA多肽具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的Thr以及在对应于残基193的位置处的Arg。在一些实施例中，H5HA多肽具有在对应于残基188的位置处的Ala、在对应于残基192的位置处的疏水性残基以及在对应于残基193的位置处的Arg。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Arg以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Glu、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。在一些实施例中，H5HA多肽变异体具有在对应于残基188的位置处的Asp、在对应于残基192的位置处的Lys以及在对应于残基193的位置处的Thr、Ala、Met或Val。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基131的位置处具有Ala。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基131的位置处具有Thr。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基132的位置处具有Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基132的位置处具有Thr。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基133的位置处具有Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基133的位置处具有Thr。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基131、132和/或133的任何位置处包括Ala、Thr和/或Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基131、132和/或133的任何位置处包括Ala、Thr和/或Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基131、132以及133的所有位置处包括Thr。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基135的位置处具有Val。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基135的位置处具有除Val以外的任何氨基酸。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基137的位置处具有Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基137的位置处具有Arg。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基155的位置处具有Ile。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基155的位置处具有Thr。在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基155的位置处包括Thr。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基155的位置处包括Thr。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基221的位置处具有Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基221的位置处具有Pro。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基221的位置处包括Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基221的位置处包括Pro。在不希望受任何一种特定理论束缚的情况下，Pro221可能影响与H2HA的RBS有关的220环的构象。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基226的位置处具有Gln。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基226的位置处具有Leu。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基227的位置处具有Ser。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基227的位置处具有Gly。
在一些实施例中，H5HA多肽在对应于残基228的位置处具有Gly。在一些实施例中，H5HA多肽变异体在对应于残基228的位置处具有Ser。
在一些实施例中，H5HA多肽分别在位置226、227以及228处包括Gln、Ser以及Gly残基。在一些实施例中，H5HA多肽变异体分别在位置226、227以及228处包括Leu、Gly以及Ser。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体在指定位置处具有以下氨基酸中的一者或一者以上：
●Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp、Gln226Leu
●Glu190Asp、Lys193Ser、Gln226Leu、Gly228Ser
●Ala189Gln、Lys193Ser、Thr160Ala
●Ala189Gln、Lys193Ser、Gln226Leu、Gly228Ser
●Asp187Ser/Thr、Ala189Gln、Lys193Ser、Gln226Leu、Gly228Ser
●Ala189Lys、Lys193Asn、Gln226Leu、Gly228Ser
●Asp187Ser/Thr、Ala189Lys、Lys193Asn、Gln226Leu、Gly228Ser
●Lys156Glu、Ala189Lys、Lys193Asn、Gln226Leu、Gly228Ser
●Lys193His、Gln226Leu/Ile/Val、Gly228Ser
●Lys 193Arg、Gln226Leu/Ile/Val、Gly228Ser
●Ala189Lys、Lys193Asn、Gly225Asp
●Lys156Glu、Ala189Lys、Lys193Asn、Gly225Asp
●Ser137Ala、Lys156Glu、Ala189Lys、Lys193Asn、Gly225Asp
●Glu190Thr、Lys193Ser、Gly225Asp
●Asp187Thr、Ala189Thr、Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp
●Asn186Pro、Asp187Thr、Ala189Thr、Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp
●Asn186Pro、Asp187Thr、Ala189Thr、Glu190Asp、Lys193Ser、Gly225Asp、Ser227Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser、Thr160Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser、Thr160Ala
●Gly228Ser、Thr160Ala
●Gln226Leu、Thr160Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser
●Thr160Ala
●Gln226Leu、Gly228Ser、Asn158Xaa(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●Gly228Ser、Asn158Xaa
●Gln226Leu、Asn158Xaa
●Gln226Leu、Gly228Ser
●Asn158Xaa
●Δ130(其中“Δ130”表示对应于位置130的氨基酸处的缺失)加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、132、135、188、192以及221
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：133、137、155、193、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、188、192、193、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、188、192、193、226以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、133、137、155、159、160、188、192、193、226以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：137、188、192、193、226、228、131、132、133、221以及227
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：131、132、133、221以及227
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：137、188、192、193、226以及228
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：137、188、192、193、226、227、228、131、132以及133
●Δ130加上对应于以下的位置处的突变的任何可能组合：227、131、132以及133
●Gln226Leu、Gly228Ser、Thr160Ala、Δ130
●Gln226Leu、Gly228Ser、Δ130
●Gln226Leu、Thr160Ala、Δ130
●Gly228Ser、Thr160Ala、Δ130
●Gln226Leu、Δ130
●Gly228Ser、Δ130
●Thr160Ala、Δ130
●Δ130
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Ser227Gly、Gly228Ser
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Gly228Ser
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Asn159Asp(或Thr160Ala或两者)、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Ser227Gly、Gly228Ser
●Δ130、Ala131Thr、Leu133Thr、Ser137Arg、Ile155Thr、Asn159Asp(或Thr160Ala或两者)、Ala188Glu、Thr/Ile192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Ala、Gln226Leu、Gly228Ser
●Δ130、Ser137Arg、Ala188Glu、Thr192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val、Gln226Leu、Gly228Ser
●Δ130、Ser137Arg、Ala188Glu、Thr192Arg/Lys、Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val、Gln226Leu、Gly228Ser、Xaa131Ser/Thr、Xaa132Ser/Thr、Xaa133Ser/Thr、Ser221Pro、Ser227Gly(其中Xaa＝任何氨基酸)
●Δ130、Xaa131Ser/Thr、Xaa132Ser/Thr、Xaa133Ser/Thr、Ser221Pro、Ser227Gly(其中Xaa＝任何氨基酸)
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)
●Δ130、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)
●Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
●Δ130、Ala188Glu
●Δ130、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Xaa193Xaa′(其中Xaa＝碱性残基，例如Lys或Arg，并且Xaa′＝中性或酸性残基)、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Xaa′(其中Xaa＝任何疏水性氨基酸，并且Xaa′＝任何亲水性氨基酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
●Δ130、Xaa192Lys/Arg(其中Xaa＝任何疏水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
在一些实施例中，本发明提供H5HA多肽(例如H5HA多肽变异体、工程化H5HA多肽和/或工程化H5HA多肽变异体)，它们的氨基酸序列包括如下文所阐述的元件(这些位置的编号与H3HA的编号对应)：
●X190、X193、X225以及X226
●X190、X193、X226以及X228
●X189、X193、X160
●X189、X193、X226、X228
●X187、X189、X193、X226、X228
●X189、X193、X226、X228
●X187、X189、X193、X226、X228
●X156、X189、X193、X226、X228
●X193、X226、X228
●X193、X226、X228
●X189、X193、X225
●X156、X189、X193、X225
●X137、X156、X189、X193、X225
●X190、X193、X225
●X187、X189、X190、X193、X225
●X186、X187、X189、X190、X193、X225
●X186、X187、X189、X190、X193、X225、X227
●X226、X228、X160
●X226、X228、X160
●X228、X160
●X226、X160
●X226、X228
●X160
●X226、X228、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X228、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X226、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X226、X228
●X158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X133、X135、X137、X155、X188、X192、X193、X221、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X135、X188、X192以及X221
●X130加上以下的任何可能组合：X133、X137、X155、X193、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X133、X135、X137、X155、Xaa158(其中Xaa＝除Asn以外的任何氨基酸)、X160、X188、X192、X193、X221、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X227以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X137、X188、X192、X193、X226、X228、X131、X132、X133、X221以及X227
●X130加上以下的任何可能组合：X131、X132、X133、X221以及X227
●X130加上以下的任何可能组合：X137、X188、X192、X193、X226以及X228
●X130加上以下的任何可能组合：X137、X188、X192、X193、X226、X227、X228、X131、X132以及X133
●X130加上以下的任何可能组合：X227、X131、X132以及X133
●X226、X228、X160、X130
●X226、X228、X130
●X226、X160、X130
●X228、X160、X130
●X226、X130
●X228、X130
●X160、X130
●X130
●X130、X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X227、X228
●X130、X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X228
●X130、X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X227、X228
●X130、X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X228
●X130、X137、X188、X192、X193、X226、X228
●X130、X137、X188、X192、X193、X226、X228、X131、X132、X133、X221、X227
●X130、X131、X132、X133、X221、X227
●X130、X192
●X130、X193
●X130、X192、X193
●X130、X188
●X130、X192、X188
●X130、X193、X188
●X130、X192、X193、X188
其中X＝任何氨基酸(除非上文中另外有规定)，和/或X＝缺少的氨基酸。这些位置的编号与H3HA的编号对应。
在一些实施例中，X130为对应于位置130的位点处的缺失。在一些实施例中，X160为Ala。在一些实施例中，X158为除Asn以外的任何氨基酸。
在一些所述实施例中，H5HA多肽变异体与野生型H5HA相比具有至少一个其它取代，使得变异体对伞形聚糖的亲和力和/或特异性增加。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226、S228以及A160的序列。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226和A160的序列。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括S228和A160的序列。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括A160的序列。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226、S228以及X158(其中X＝除Asn以外的任何氨基酸)的序列。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括L226和X158的序列。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括S228和X158的序列。在一些实施例中，根据本发明H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括X158的序列。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228、A160以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、A160以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221、227以及228。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、S228、A160以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221以及227。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、A160以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221、226、227以及228。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221以及227以及228。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、S228以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226以及227。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228、X158(其中X＝除Asn以外的任何氨基酸)以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、X158以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221、227以及228。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、S228、X158以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221以及227。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、L226、S228以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221以及227。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)具有包括Δ130、X158(其中X＝除Asn以外的任何氨基酸)以及在对应于以下的位置处的突变的任何可能组合的序列：131、132、133、135、137、155、160、188、192、193、221、226、227以及228。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽变异体与亲本H5HA并且尤其与亲本野生型H5HA相比具有开放结合位点。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于以下α2-6唾液酸化聚糖：
以及其组合。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于具有以下结构的聚糖：
以及其组合；和/或
和/或
和/或
以及其组合。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于
在一些实施例中结合于在一些实施例中结合于
并且在一些实施例中结合于
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于图9中所描绘的至少一些聚糖(例如α2-6唾液酸化聚糖)。在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽结合于图9中所描绘的多个聚糖。
在一些实施例中，根据本发明的H5HA多肽与至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％约95％或95％以上的在人类上呼吸道组织(例如上皮细胞)中的HA受体上发现的聚糖结合。
在一些实施例中，H5HA多肽(包括H5HA多肽变异体)为在SEQ ID NO：50、51、53-55以及60-75中所阐述的那些H5HA多肽中的任一者。
在一个方面中，本发明尤其认识到，高亲和力结合于单独伞形拓扑聚糖可能不足以赋予对人类的有效传播/感染性。本发明了解，结合于锥形拓扑聚糖减少也可能使重要的。在一些实施例中，高亲和力结合于伞形拓扑聚糖以及结合于锥形拓扑聚糖的亲和力降低可与赋予对人类的有效传播/感染性有关。在一些实施例中，高亲和力结合于伞形拓扑聚糖足以赋予对人类的有效传播/感染性。在一些实施例中，高亲和力结合于伞形拓扑聚糖足以赋予对人类的有效传播/感染性，即使结合于锥形拓扑聚糖的亲和力未降低(例如不变、增加等)。
在一些实施例中，H5HA多肽变异体结合于伞形拓扑聚糖结合的亲和力和/或特异性增加以及结合于锥形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性降低可能与相对于参考多肽(例如H5HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)对人类的传播/感染性增加或增强有关。在一些实施例中，H5HA多肽变异体结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加足以相对于参考多肽(例如H5HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强。在一些实施例中，H5HA多肽变异体结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加足以相对于参考多肽(例如H5HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强，即使结合于锥形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性不降低(例如不变、增加等)。在一些实施例中，H5HA多肽变异体结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性增加足以相对于参考多肽(例如H5HA多肽变异体的同源亲本HA多肽)使对人类的传播/感染性增加或增强，即使结合于锥形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性等于和/或大于结合于伞形拓扑聚糖的亲和力和/或特异性。
实例3：人类上呼吸道组织中的聚糖多样性
凝集素结合研究显示在上呼吸道组织中α2-3和α2-6的分布具有多样性。染色研究表明α2-6唾液酸化聚糖作为N连接(纤毛细胞)和O连接聚糖(在杯状细胞中)的一部分主要分布在气管上皮细胞顶侧上(图12)。另一方面，气管组织的内部区域主要包含分布于N连接聚糖上的α2-3。
MALDI-MS聚糖型态分析显示在人类上气管上α2-6唾液酸化聚糖具有实质多样性(图10)以及显著表达。使用MALDI TOF-TOF裂解代表性质量峰证实具有多个乳糖胺重复的较长寡糖分支与短寡糖分支相比广泛地分布的聚糖拓扑(图10)。为提供关于上气管中聚糖的分布和拓扑的多样性的参考，对来自人类结肠上皮细胞(HT29)的N连接聚糖进行MALDI-MS分析。近期H5N1病毒主要感染肠道，并且因此，选择这些细胞作为代表性肠道细胞。HT29细胞的聚糖型态显著不同于HBE的聚糖特征，其中α2-3的主要分布和长寡糖分支聚糖拓扑并不像所观察得那样(图10)。
通过以下方法产生图12的数据。福尔马林(formalin)固定并且石蜡包埋的人类气管组织切片是购自美国生物公司(US Biological)。将组织切片去石蜡并且复水后，使用抗生蛋白链菌素/生物素阻断试剂盒(载体实验室(Vector Labs))阻断内源性生物素。接着将切片与FITC标记的榴莲凝素(对O连接聚糖具有特异性)、生物素化刀豆凝集素A(ConA，对α连接甘露糖残基具有特异性，所述甘露糖残基为构成N连接聚糖的核心寡糖结构的一部分)、生物素化朝鲜槐凝集素(MAL，对SAα2，3-gal具有特异性)以及生物素化西洋接骨木凝集素(SNA，对SAα2，6-gal具有特异性)(载体实验室；10μg/ml于含0.5％吐温-20的PBS中)一起培育3小时。在用TBST(含1％吐温-20的Tris缓冲生理盐水)洗涤后，将切片与阿莱克萨荧光剂(Alexa fluor)546抗生蛋白链菌素(2μg/ml于含0.5％吐温-20的PBS中)一起培育1小时。将载片用TBST洗涤并且在共焦显微镜(蔡司LSM510激光扫描共焦显微镜法(Zeiss LSM510laser scanning confocal microscopy))下观察。所有培育均是在室温(RT)下进行。
使用以下方法产生图10中的数据。当细胞＞90％汇合时用100mM柠檬酸盐生理盐水缓冲液收集细胞(约70×106个)，并且在用蛋白酶抑制剂(卡尔生物化学公司(Calbiochem))处理和均质化后分离细胞膜。用PNGaseF(纽英伦生物实验室(New EnglandBiolabs))处理细胞膜碎片并且将反应混合物在37℃下培育过夜。将反应混合物煮沸10分钟以使酶失活，并使用赛普-帕克C18SPE滤筒(Sep-Pak C18SPE cartridge)(沃特世(Waters))去除去糖基化的肽和蛋白质。将聚糖进一步脱盐并使用石墨化碳固相萃取柱(苏佩克(Supelco))纯化为中性(25％乙腈洗脱份)和酸性(含有0.05％三氟乙酸的50％乙腈)洗脱份。通过MALDI-TOF MS，使用软电离条件(加速电压22kV，栅极电压93％，导线0.3％，以及萃取延迟时间150毫微秒)，分别以正离子和负离子模式分析酸性洗脱份。将峰值校准为非加钠种类(non-sodiated species)。通过使用唾液酸酶A和S预处理样本来确定α2-6唾液酸化聚糖的主要表达。随后，在37℃下，将经分离的聚糖与含0.1U产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶(唾液酸酶A，非特异性)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)唾液酸酶(唾液酸酶S，对α2-3唾液酸化聚糖具有特异性)的最终体积为100mL的50mM磷酸钠(pH 6.0)一起培育24小时。通过MALDI-TOF MS，分别以正离子和负离子模式分析中性和酸性洗脱份。
实例4：H5HA多肽变异体与人类肺组织的结合
提供福尔马林固定并且石蜡包埋的人类组织肺和气管切片(例如分别购自美国生物基质公司(US Biomax，Inc.)和美国生物公司)的结合。将组织切片去石蜡，复水并且使用含1％BSA的PBS培育30分钟，以阻止非特异性结合。使H5HA分别以4∶2∶1的比率与一次抗体(小鼠抗6×His标签)和二次抗体(阿莱克萨荧光剂488山羊抗小鼠)在冰上预复合20分钟。将所形成的复合物在1％BSA-PBS中稀释到40、20或10μg/ml的最终HA浓度。接着将组织切片与HA-抗体复合物在室温下一起培育3小时。将切片用碘化丙啶(英杰；1∶100于TBST中)复染，充分洗涤并且接着在共焦显微镜(蔡司LSM510激光扫描共焦显微镜法)下观察。
预复合的H5HA还与如榴莲凝素的其它凝集素(用于非纤毛粘液细胞(如杯状细胞)的标记物)一起使用，以将组织切片共染色，以获得关于HA是否染色组织上皮中的纤毛和/或非纤毛细胞的额外信息。
实例5：测试动物宿主中的H5HA多肽
如本文所述，本发明认识到，使用动物宿主(例如雪貂)来研究病毒的传播可以提供人类病毒传播的可靠指示物。类似地，本发明认识到，使用经根据本发明的结合剂(例如HA多肽)处理的动物宿主(例如雪貂)来研究病毒的传播可以提供所述根据本发明的结合剂用于预防或治疗人类宿主中的病毒的功效的可靠指示物。
病毒传播分析
在存在或不存在根据本发明的结合剂的情况下使用病毒传播分析，以确定合适动物模型中的病毒传播。举例来说，将动物宿主(例如雪貂)圈养于相邻笼子中，防止动物之间直接和间接接触。然而，这些圈养条件允许流感病毒通过空气扩散。通过所属领域中已知的方法(例如鼻内、肌肉内或本文所述的任何投与模式)以有效量的病毒接种第一部分动物(“接种动物”)。接着，可以在一天、两天、三天或三天以上后将未处理的动物引入与接种动物相邻的笼子中。
可以在接种或传播后一天、两天、三天或三天以上的任何时间杀死研究中所用的动物来进行分析。适用于病毒传播研究的分析可尤其包括(但不限于)测定感染性病毒效价(例如通过经鼻洗涤)、观察动物的体症(例如嗜睡、食欲不振、流鼻涕、打喷嚏、发高烧和/或死亡)、呼吸道组织的免疫组织化学分析。
上文所描述的病毒传播分析也可以并有在病毒接种或传播之前、期间或之后用本文所述的根据本发明的结合剂处理动物宿主。接着使用本文所述的分析方法来确定结合剂在阻断病毒传播和/或感染动物宿主中的功效。
血清学研究
在雪貂中在第0天时肌肉内投与结合剂和/或包含结合剂的疫苗组合物，随后在第21天时投与加强剂量。在第0天、第14天、第21天以及第35天从每一动物中采出血液。在体外检验所收集的血清抑制病毒凝集并且中和病毒感染的能力。
血球凝集抑制(HAI)分析
在96孔v型底板(康宁公司(Corning))中进行HAI滴定。将血清连续稀释2倍并且添加到总体积为200μl的4凝集剂量的A型流感病毒中。接着，添加25μl的2％(体积/体积)红血球溶液。将血清、病毒以及红血球缓缓混合并且在培育30分钟之后将分析读出。效价记录为抑制4个凝集剂量病毒的最高抗体稀释度的倒数。
体外中和分析
将血清的连续稀释液与病毒混合并在室温下培育30分钟，并且接着在37℃下与MDCK细胞一起培育1小时。接着用不含血清的培养基将细胞洗涤两次，并接着添加含有或不含胰蛋白酶的新鲜培养基。通过细胞病理效应对病毒生长进行评分。数据表示为引起中和的血清最高稀释度的稀释度倒数。
病毒激发分析
用同源和异源野生型以及突变H5N1病毒株经鼻内激发免疫接种的雪貂。在激发后第1天、第3天以及第5天从雪貂获得鼻洗涤液。在MDCK细胞中滴定病毒以确定呼吸道中的病毒脱落。
实例5：近期H5N1血球凝集素分离株中两氨基酸改变足以转变它优先选择人类受
体
引言
高度病原性H5N1受到全球关注，自从2003年以来，其已在人类中引发若干次局部爆发(休曼(Heumann)等人，2010，细胞研究(Cell Res)，20：51；管(Guan)等人，2009，科学技术评论(Rev Sci Tech)，28：39；均以引用的方式并入本文中)。现存的H5N1病毒株不能气溶胶传播，而主要是通过直接接触感染动物来传播。然而，与感染有关的发病率和死亡率高(约60％)并且已知流感亚型(包括H5N1)能够通过突变或基因重配获得表型性状，表明H5N1病毒株可以获得气溶胶传播性(严(Yen)等人，2009，微生物学与免疫学的当前课题(Curr Top Microbiol Immunol)，333：3；以引用的方式并入本文中)。与这种病毒引起重度感染的潜能结合，人类群体不具有预先存在的对H5N1的免疫性的事实表明一旦这种病毒株出现，则可能在将来出现传染或流行(苏巴拉奥(Subbarao)等人，2007，公共科学图书馆·病原学(PLoS pathogens)，3：e40；以引用的方式并入本文中)。
反向遗传学系统的使用已表明，在11种基因产物中，获得血球凝集素(HA)和聚合酶(PB2)中的某些氨基酸改变对于人类气溶胶传播来说是至关重要的(胡芬(Hoeven)等人，2009，美国国家科学院院刊(Pro Natl Acad Sci USA)，106：3366；以引用的方式并入本文中)。因此，阐明遗传改变在这些蛋白质中的功能效应对鉴别表型改变的潜能尤其重要。在PB2情况下，位置627处赖氨酸到谷氨酸盐的关键改变对于获得气溶胶传播性来说是关键的(胡芬等人，2009，美国国家科学院院刊，106：3366；以引用的方式并入本文中)。然而，鉴于HA的生物作用，即结合于聚糖受体，引起病毒粒子融合以及感染，故认为引起人类适应的特异性突变具有亚型特异性和病毒株特异性(斯提芬斯等人，2006，自然微生物学评论(Nat Rev Microbiol)，4：857；拉塞尔等人，2006，糖偶联物杂志，23：85；均以引用的方式并入本文中)。
先前研究已鉴别出HA受体为以特定聚糖结构(例如“伞形拓扑”或“锥形拓扑”α2→3或α2→6连接唾液酸)终止的聚糖。禽类适应H5N1 HA优先结合于以锥形拓扑聚糖终止的聚糖受体，这些聚糖受体中许多都具有α2→3连接唾液酸(禽类受体)(斯提芬斯等人，2006，分子生物学杂志，355：1143；冈巴彦等人，2006，病毒学，344：432；均以引用的方式并入本文中)。已证实人类适应H1N1、H2N2以及H3N2病毒株的HA从锥形拓扑(例如许多α2→3)转变为优先结合于伞形拓扑(例如许多α2→6唾液酸化聚糖)(人类受体)并且特征性高亲和力结合于人类受体，表明与这些人类适应病毒的空气传播性相关(帕巴斯(Pappas)等人，2010，公共科学图书馆·综合(PLoS One)，5：e11158；塔姆佩等人，2007，科学，315：655；均以引用的方式并入本文中)。使用此构架，近期研究已鉴别出将引起当前流行的H2N2、H7N7以及H9N2病毒株的人类适应的数组突变(维斯瓦纳坦(Viswanathan)等人，2010，公共科学图书馆·综合，5：e13768；贝尔瑟(Belser)等人，2008，美国国家科学院院刊，105：7558；索雷尔(Sorrell)等人，2009，美国国家科学院院刊，106：7565；均以引用的方式并入本文中)。这些研究证实转化所需的突变可以基于所研究的亚型以及甚至特定病毒株而不同。使H5N1病毒株突变以包括H2/H3的标志性改变(Q226L和G228S或LS)和/或H1(E190D、G225D或DD)突变的先前研究(梅因斯(Maines)等人，2011，病毒学，413：139；斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382；斯提芬斯等人，2006，科学，312：404；均以引用的方式并入本文中)已显示这些突变体中无一者定量地‘转变’为作为人类适应‘流行性’病毒株HA的特征的人类受体特异性和亲和力(图20)。尝试在A/越南/1203/04(Viet03_04)序列上引入标志性LS残基未能得到所述转变。本发明人已确定适宜容纳标志性LS残基所需的关键结构特征。本发明人也已确定何种结构特征是促进受体特异性转变为能够以高亲和力结合于人类受体所需的。
实验设计
流感HA为同源三聚蛋白，其中单体含有552个氨基酸。每一单体由两个二硫化物连接的部分HA1和HA2构成。HA1包含聚糖受体结合位点(RBS)，而HA2参与病毒与细胞膜的融合。RBS袋涉及HA位置95、131、133、136、137、138、145、153、155、156、158、159、183、186、187、189、190、192、193、194、195、196、219、222、224、225、226、227、228(使用H3编号)。
为确定结构特征以及将容纳LS残基的恰当H5HA序列，本发明人进行了RBS H2与H5HA的详细结构比较，因为H5HA在系统发育上最接近H2HA(图21)。对于此研究，选择具有来自早先人类分离株(A/越南/1203/04或Viet03_04)的代表性H5N1HA的原型流行性H2(A/奥尔巴尼/6/58或Alb6_58)HA。在已进行比较分析的情况下，本研究鉴别出使H5HA的RBS与H2HA的RBS区别开的四个不同特征(图22)。第一，H2HA的130环的组成不同于H5HA，其包括位于H5HA中位置130(H3编号)处的缺失。第二，位于与除人类受体的末端Neu5Acα2-6Gal-基序以外的糖残基相互作用的RBS‘顶部’或‘190-螺旋’处(如在位置188、192以及193中)的氨基酸组成存在差异。第三，在与人类受体的Neu5Acα2-6Gal-基序相互作用的RBS‘基部’(如在包括LS改变的位置137、221、226以及228中)处的氨基酸组成存在差异。第四，在H5HA中的位置158处的糖基化位点在H2HA中不存在。此位点处的糖基化可能潜在地干扰除结合于RBS的人类受体的末端Neu5Acα2-6Gal-基序以外的糖残基(斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382；王(Wang)等人，2010，病毒学杂志(Journal of Virology)，84：6570；均以引用的方式并入本文中)。本发明的发现涵盖对H2和H5HA的RBS的此详细比较，其表明了超出先前所观察到的更具特征性的LS改变的特定氨基酸差异。本发明人试图鉴别出将促进在LS突变情形下H2 HA RBS的结构特征匹配的适当H5HA序列。
分析至今所有H5N1序列(禽类与人类分离株)，使发明人得到另外的三个观察结果：1)来自许多近期禽类和人类分离株(2007年以后)的H5HA已经获得匹配第一特征的130环中的缺失；2)已在‘190-螺旋’中观察到匹配特征2的关键氨基酸改变；以及3)在许多H5HA序列中也观察到在158位置处的糖基化损失(特征4)。在HA RBS的关键结构特征的情形下，本发明人确定同时在同一HA中130环中的缺失以及糖基化损失(特征1与4)在H5HA的进化中是关键的。然而，本发明认识到，糖基化损失伴随着130环残基的缺失发生，而反之则不然。本发明观察到，当前特异性H5HA病毒株已显著不同于早期的人类分离株(如Viet03_04)，而且也已获得匹配流行性H2 HA RBS所必需的关键结构特征。
因此，本发明人评估具有特征1和4的病毒株是否将为适宜容纳标志性LS残基的恰当H5HA序列。为进行实验，选择病毒株A/鸡/埃及/R2/2007(或ckEgy_07)作为天然地获得特征1和4的代表性H5HA(图23)。在此H5HA序列上引入仅LS突变(ckEgy_07_LS)显示转变以及高亲和力结合于人类受体(并且对禽类受体的亲和力相对较差)，从而类似于人类适应‘流行性’HA的聚糖结合特征(图24A、B以及图25)。其它发现证实此突变H5HA结合于人类气管上皮的顶表面上的人类受体(图24C)，其类似于流行性HA沾染此组织(维斯瓦纳坦等人，2010，公共科学图书馆·综合，5：e13768；梅因斯等人，2009，科学，325：484；均以引用的方式并入本文中)。
早些时候，有别人努力在早期人类分离株(如Viet03_04)上引入单独LS改变，但并未引起转变并着重说明了解可以容纳LS突变的H5HA RBS的结构特征的需要。鉴于(ckEgy_07_LS)也天然地获得特征4，本发明人评估单独此特征(即糖基化损失)(通过T160A突变达成)与LS一起是否转变Viet03_04的聚糖受体结合优先性(图25)。与Viet03_04野生型HA相比，此突变病毒株的剂量依赖性直接聚糖结合显示人类受体结合，而且还保留它的高亲和力禽类受体结合，这不是流行性人类适应HA的特征(图25)。在天然地获得特征4的另一病毒株(A/埃及/2786-NAMRU3/06或Egy_06)上引入单独LS改变确证了此观察结果。最后，与此结构构架一致，在天然地获得特征2(图22C)的代表性H5HA(A/鸡/越南/NCVD-093/08或ckViet_08)上的突变赋予人类受体结合亲和力，而且也保留高亲和力禽类受体结合(图26)。
讨论
本发明人首次确定了为适宜容纳标志性LS残基所需的某些结构特征。另外，本发明人的结果令人了解到，某些当前流行的H5HA仅需要两氨基酸改变(标志性LS)即可使H5HA的优先性转变到人类受体，从而引起它们的人类适应。使用来自本发明的信息，本发明人合理地选择适当的H5HA序列(虽然来自总H5N1HA的代表性一小批)，其能够通过仅并入LS改变来转变受体特异性。这些当前H5HA的一种特征性质为它们已天然地进化获得特征1、2以及4(图27)。虽然NCBI数据库中的2277个非冗余H5N1HA序列中仅6％已获得特征1和4，然而，其代表在2009年和2010年分离的H5N1病毒株的约45％。H5N1HA的其它系统发育分析揭示天然获得的特征1和4属于进化枝2.2.1。迄今为止，特征1的出现似乎为进化枝2.2.1所独有，然而特征4的存在不限于2.2.1。严格来说，进化枝2.2.1病毒株已显著不同于早期人类分离株(如Viet03_04)并且与这些先前病毒株相比更接近于人类适应。所有属于进化枝2.2.1的已报导的人类H5N1分离株均来自埃及和以色列(Israel)。因此，重要的是监测进化枝2.2.1病毒株的进化。
在位置129处具有带正电荷残基的示范性H5N1病毒株(特征2)
来自进化枝2.3.4的ABJ96761/204-204禽类中国2005；来自进化枝2.3.4的ABJ96763/204-204禽类中国2005；来自进化枝2.3.4的ABJ96764/204-204禽类中国2006；来自进化枝2.3.4的ACN39415/204-204禽类中国2007；来自进化枝7的ACO07037/204-204禽类越南2008；来自进化枝2.2.1的ADG28677/204-204禽类埃及2009；来自进化枝2.2.1的ADI58758/204-204禽类以色列2010；来自进化枝2.2.1的ADM85869/204-204禽类埃及2010；以及来自进化枝2.2.1的ADG28684/204-204禽类埃及2010。
均属于进化枝2.2.1的在相同HA上具有130处的缺失(以及158处的糖基化损失)(特征1)的示范性H5N1病毒株。包括(但不限于)：
ABP96845人类埃及2007
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>ABP96854人类埃及2007
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>ABM92273埃及2007
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>ACT15310人类埃及2009
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>ACT15312人类埃及2009
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>ACT15314人类埃及2009
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>ACT15316人类埃及2009
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>ACT15318人类埃及2009
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>ACT15320人类埃及2009
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>ACT15326人类埃及2009
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>ACT15330人类埃及2009
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>ACT15334人类埃及2009
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>ACT15340人类埃及2009
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>ACT15342人类埃及2009
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>ACT15343人类埃及2009
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>ACT15345人类埃及2009
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>ACT15349人类埃及2009
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>ACT15353人类埃及2009
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>ACT15357人类埃及2009
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>ABW37433禽类埃及2007
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>ABW37434禽类埃及2007
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>ABW37435禽类埃及2007
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>ABW37436禽类埃及2007
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>ACR56233禽类埃及2008
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>ACR56248/1552禽类埃及2008
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>ACR56246禽类埃及2008
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>AEA92628禽类埃及2008
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>ACR56247禽类埃及2008
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>ACX31965禽类埃及2009
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>ADD21378/1565禽类埃及2009
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>ACX31969禽类埃及2009
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>ACX31970禽类埃及2009
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>ACX31978禽类埃及2009
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>ACX31989禽类埃及2009
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>ACX31993禽类埃及2009
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>ADD21354/1565禽类埃及2009
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>ADD21355/1565禽类埃及2009
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>ADD21361/1565禽类埃及2009
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>ADD21376/1559禽类埃及2009
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>ADD21379/1565禽类埃及2009
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>ADD21380/1565禽类埃及2009
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>ADD21371/1565禽类埃及2009
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>ACX31997/1553禽类埃及2009
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>ADD21359/1565禽类埃及2009
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>ADD21382/1565禽类埃及2009
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>ADB77952/1561禽类埃及2009
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>ADB85109禽类埃及2009
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>ADM85844禽类埃及2009
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>ADM85845禽类埃及2009
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>ADM85847禽类埃及2010
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>ADM85852禽类埃及2010
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>ADM85854禽类埃及2010
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>ADM85855禽类埃及2010
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>ADM85856/1557禽类埃及2010
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>ADM85861禽类埃及2010
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>ADM85862禽类埃及2010
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>ADM85863禽类埃及2010
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>ADM85868禽类埃及2010
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>ADM85870禽类埃及2010
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>ADM85871禽类埃及2010
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>ADM85873/1558禽类埃及2010
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>ADM85884禽类埃及2010
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>ADM85881禽类埃及2010
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>ADM85883禽类埃及2010
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>ADQ53454禽类以色列2010
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>AEN68621禽类以色列2011
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材料与方法
HA的克隆、杆状病毒合成、表达以及纯化
为进行昆虫细胞表达，对H5野生型和突变HA序列进行密码子优化并且在DNA2.0(加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park，CA))上合成。接着，将合成的基因亚克隆到pAcGP67A质粒中，并且使用巴库洛戈德系统(Baculogold system)(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences，San Jose，CA)根据制造商的说明产生杆状病毒。接着使用重组杆状病毒感染于BD巴库洛戈德Max-XP SFM(BD Baculogold Max-XP SFM)(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)中培养的Sf9细胞悬浮培养物。监测感染并且在感染后3-4天收获条件培养基。使用镍亲和色谱法(HisTrap HP柱，新泽西州皮斯卡塔韦通用电气医疗集团(GE Healthcare，Piscataway，NJ))将来自所收获的条件培养基的可溶性HA纯化。将含有HA的洗脱份汇集，浓缩并且使用100K MWCO旋转柱(马萨诸塞州比勒利卡密理博公司(Millipore，Billerica，MA))缓冲交换到1×PBS pH 8.0(吉卜可(Gibco))中。使用BCA方法(皮尔斯(Pierce))定量已纯化的蛋白。
重组HA与人类气管组织切片的结合
将涂有石蜡的人类气管(美国生物公司)组织切片去石蜡，复水并且使用含1％BSA的PBS培育30分钟，以阻止非特异性结合。使HA与一次抗体(小鼠抗6×His标签，阿布凯姆(Abcam))和二次抗体(阿莱克萨荧光剂488山羊抗小鼠，英杰)分别以4∶2∶1的摩尔比在冰上预复合20分钟。通过在1％BSA-PBS中稀释预复合HA，在不同HA浓度下进行组织结合。接着将组织切片与HA-抗体复合物在室温下一起培育3小时。用碘化丙啶(英杰；1∶100于TBST中)复染组织切片。安装组织切片并且接着使用共焦显微镜(蔡司LSM510激光扫描共焦显微镜)成像。
野生型与突变HA的剂量依赖性直接结合
为研究多价HA-聚糖相互作用，如先前所述使用包含代表性生物素化α2→3和α2→6唾液酸化聚糖的抗生蛋白链菌素板阵列。3′SLN、3′SLN-LN、3′SLN-LN-LN为代表性禽类受体。6′SLN和6′SLN-LN为代表性人类受体。LN对应于乳糖胺(Galβ1-4GlcNAc)，而3′SLN和6′SLN分别对应于连接于LN的Neu5Acα2-3和Neu5Acα2-6(图28)。从功能糖组学联盟通过其资源申请项目获得生物素化聚糖。通过将孔在4℃下与50μl的2.4μM生物素化聚糖一起培育过夜来将抗生蛋白链菌素涂布的高结合容量384孔板(皮尔斯)的每一孔装到满容量。通过用PBS大量洗涤去除过量聚糖。三聚HA单元包含三个HA单体(并且因此三个RBS，每一单体一个RBS)。生物素化聚糖在抗生蛋白链菌素板阵列的孔中的空间排列有利于与三聚HA单元中的三个HA单体中的仅一者结合。因此，为特别提高HA-聚糖相互作用的多价性，将重组HA蛋白与一级和二次抗体以摩尔比4∶2∶1(HA∶一级∶二级)预复合。4个三聚HA单元在所有HA的预复合物中的一致排列允许在其聚糖结合亲和力之间进行比较。储备溶液含有适当量的组氨酸标记HA蛋白、一次抗体(来自阿布凯姆的小鼠抗6×His标签IgG)以及二次抗体(来自圣克鲁兹生物技术公司(Santacruz Biotechnology)的HRP偶联山羊抗小鼠IgG)，比率为4∶2∶1，并且在冰上培育20分钟。使用含1％BSA的PBS将适当量的预复合储备HA稀释到250μl。将50μl此预复合HA添加到每一个聚糖涂布孔中并且在室温下培育3小时，随后进行使用PBS和PBST(1×PBS+0.05％吐温-20)的洗涤步骤。基于HRP活性使用安普莱克司红过氧化酶分析试剂盒(加利福尼亚州英杰)根据制造商的说明测定结合信号。
相等物
所属领域的技术人员最多使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述的本发明的实施例的许多相等物。本发明的范围不打算限于上述具体实施方式，而是如以下权利要求书中所述。
Claims (33)
1.一种医药组合物，其包含：
包含H5HA多肽的结合剂，所述H5HA多肽具有在一个或一个以上选自由以下残基组成的群组的残基处不同于参考H5HA多肽序列的氨基酸序列：130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及其组合。
2.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述结合剂竞争伞形拓扑聚糖与HA多肽之间的聚糖HA多肽相互作用。
3.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的长度在19-55个氨基酸范围内。
4.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的氨基酸序列包括一部分，所述部分长度为至少19个氨基酸，并且显示与选自由SEQ ID NO：50、51、53、54或55组成的群组的H5HA多肽的相应部分至少95％总序列一致性。
5.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的氨基酸序列显示在对应于氨基酸1到55的区域内与选自由SEQ ID NO：50、51、53、54或55组成的群组的参考H5HA至少95％一致性，但与所述参考HA的不同之处在于一个或一个以上选自由残基130、192、193以及其组合组成的群组的残基。
6.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的氨基酸序列显示在对应于氨基酸1到55的区域内与选自由SEQ ID NO：50、51、53、54或55组成的群组的参考H5HA至少95％一致性，但与所述参考HA的不同之处在于一个或一个以上选自由残基128-137以及其组合组成的群组的残基。
7.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的氨基酸序列显示在对应于氨基酸1到55的区域内与选自由SEQ ID NO：50、51、53、54或55组成的群组的参考H5HA至少95％一致性，但与所述参考HA的不同之处在于存在氨基酸残基130的缺失。
8.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的氨基酸序列显示在对应于氨基酸1到55的区域内与选自由SEQ ID NO：50、51、53、54或55组成的群组的参考H5HA至少95％一致性，但与所述参考HA的不同之处在于一个或一个以上选自由残基160、226、228以及其组合组成的群组的残基。
9.根据权利要求1所述的医药组合物，其中所述H5HA多肽的氨基酸序列显示在对应于氨基酸1到55的区域内与选自由SEQ ID NO：50、51、53、54或55组成的群组的参考H5 HA至少95％一致性，但与所述参考HA的不同之处在于一个或一个以上选自由残基158、226、228以及其组合组成的群组的残基。
10.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述伞形拓扑聚糖包含长α2-6唾液酸化聚糖。
11.根据权利要求10所述的医药组合物，其中所述长α2-6唾液酸化聚糖选自由以下组成的群组：Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAc、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GalNAc、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GalNAc、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα2-6Neu5Ac、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GalNAcβ1-6GlcNAcβ1-3Galα2-3Neu5Ac、NeuAcα2-6Galβ1-4GalNAcβ1-3/6GlcNAcβ1-3/6Galα2-3/6Neu5Ac、Neu5Ac α2-6Galβ1-3GalNAcβ1-4Galα1-3Galβ1-4Glc、Neu5Acα2-6Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc、Neu5Acα2-6Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc以及Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。
12.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述结合剂以一亲和力结合于伞形拓扑聚糖，所述亲和力为针对介导人类感染的野生型HA在可比较的条件下所观察到的亲和力的至少50％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
13.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述结合剂与其结合于锥形拓扑聚糖相比更强地结合于伞形拓扑聚糖。
14.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述结合剂对伞形拓扑聚糖显示相对于锥形拓扑聚糖至少2倍的相亲和力。
15.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述结合剂对伞形拓扑聚糖显示相对于锥形拓扑聚糖至少5倍的亲和力。
16.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述结合剂对伞形拓扑聚糖显示相对于锥形拓扑聚糖至少10倍的亲和力。
17.根据权利要求2所述的医药组合物，其中所述相互作用是在HA多肽与人类上呼吸道上皮细胞、支气管、气管或深肺上发现的受体之间发生。
18.一种疫苗组合物，其包含：
竞争伞形拓扑聚糖与HA多肽之间的聚糖HA多肽相互作用的结合剂，
其中所述疫苗广泛地抵御任何H5流感病毒。
19.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述H5流感病毒为人类适应H5病毒或禽类适应H5病毒。
20.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中所述H5适应病毒包含在一个或一个以上选自由以下残基组成的群组的残基处不同于参考H5HA多肽序列的H5HA多肽序列：130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及其组合。
21.一种抑制H5流感病毒结合于个体中具有伞形拓扑的血球凝集素受体，或将结合具有伞形拓扑的血球凝集素受体的流感病毒感染个体的风险降到最低，或治疗个体的方法，所述方法包含：
鉴别易患或罹患流感病毒感染的个体，
选择竞争伞形拓扑聚糖与HA多肽之间的聚糖HA多肽相互作用的结合剂；以及
投与有效量的所述结合剂，以使得所述病毒与具有伞形拓扑聚糖的血球凝集素受体的结合减少，所述风险降到最低或患者得到治疗。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述结合剂包含在一个或一个以上选自由以下残基组成的群组的残基处来自参考H5HA多肽序列的H5HA多肽序列：130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228以及其组合。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述选择步骤包括基于结合剂能够结合具有伞形拓扑聚糖的血球凝集素受体来选择所述结合剂。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述结合剂为LSBA。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述结合剂为UTBA。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述结合剂为UTSBA。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述UTSBA是在曝露于所述病毒之前投与所述个体。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述UTSBA是在曝露于所述病毒之后投与所述个体。
29.根据权利要求21所述的方法，其中投与量足以使所述个体的含有伞形拓扑聚糖的HA受体饱和。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述UTSBA是通过吸入来投与。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述UTSBA选自由抗体、凝集素、适体以及非HA多肽组成的群组。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述UTSBA是与第二治疗剂的投与组合投与。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二治疗剂为抗病毒剂。
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