JP2011508785A - デコイインフルエンザ処置 - Google Patents

Abstract

本発明は、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを提供する。本発明は、本発明のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイを利用して、インフルエンザ感染を処置するシステムおよび方法を提供する。本発明は、新規なアンブレラ−トポロジーグリカンデコイを同定するための方法を提供する。本発明は、またアンブレラ−トポロジーグリカンを模倣し、および／またはアンブレラ−トポロジーグリカンとの相互作用についてインフルエンザヘマグルチニンポリペプチドと競合する薬剤を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本願は、２００８年１月３日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，７０３号の優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

本発明は、国立一般医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｇｌｕｅ Ｇｒａｎｔ契約番号Ｕ５４ ＧＭ６２１１６）、および米国国立衛生研究所（契約番号ＧＭ５７０７３）により授与された合衆国政府の支援により成された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。

発明の背景
インフルエンザは、流行病、伝染病、再発、および突発的発生の長い歴史を有している。Ｈ５Ｎ１株を含む鳥インフルエンザは、高度に伝染性かつ潜在的に致死的な病原体であるが、現在のところ、これは、ヒトに感染する限定的な能力しか有していない。しかし、鳥インフルエンザウイルスは、その宿主特異性を変化させ、このウイルスをヒトに容易に感染させることを可能にする変異を蓄積していることが歴史的に観察されている。実際に、前世紀の重大なインフルエンザの流行病のうちの２つは、ヒト感染を可能にするように遺伝子構成を変化させた鳥インフルエンザウイルスが起源であった。

インフルエンザは、医療制度に対する顕著な難問のままである。さらに、現在の鳥インフルエンザ株Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、およびＨ２Ｎ２は、それらの宿主特異性を変化させる変異を蓄積し、それらがヒトに容易に感染することを可能にしている可能性があるという顕著な懸念が存在する。インフルエンザの伝染病および流行病を含む、ヒトにおけるインフルエンザを減少および処置するためのシステムおよび試薬の改善の必要性が存在したままである。

本発明は、インフルエンザ治療剤として有用な薬剤を同定するためのシステム、ならびにこのような薬剤、これらを含む組成物、およびこれらを利用する方法を提供する。とりわけ、本発明は、アンブレラ−トポロジーグリカンを模倣し、および／またはアンブレラ−トポロジーグリカンとの相互作用についてインフルエンザヘマグルチニンポリペプチドと競合する薬剤を提供する。

野生型ＨＡの例示的な配列のアラインメント。配列はＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースから得られた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）。 ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸への結合に関与する保存性アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与する特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置に影響を与えるアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他のモノサッカリド（または修飾）への結合に関与するアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列はそれらのそれぞれの結晶構造から得られた。他の配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得られた。略語：ＡＤＡ７６、Ａ／ｄｕｃｋ（アヒル）／Ａｌｂｅｒｔａ（アルバータ）／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ（ブタ）／Ｉｏｗａ（アイオワ）／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（プエルトリコ）／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（サウスカロライナ）／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ（テキサス）／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ニューヨーク）／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／Ｄｕｃｋ（アヒル）／Ｕｋｒａｉｎｅ（ウクライナ）／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ（モスクワ）／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／Ｄｕｃｋ（アヒル）／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ（ベトナム）／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。 ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸への結合に関与する保存性アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与する特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置に影響を与えるアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他のモノサッカリド（または修飾）への結合に関与するアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列はそれらのそれぞれの結晶構造から得られた。他の配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得られた。略語：ＡＤＡ７６、Ａ／ｄｕｃｋ（アヒル）／Ａｌｂｅｒｔａ（アルバータ）／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ（ブタ）／Ｉｏｗａ（アイオワ）／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（プエルトリコ）／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（サウスカロライナ）／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ（テキサス）／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ニューヨーク）／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／Ｄｕｃｋ（アヒル）／Ｕｋｒａｉｎｅ（ウクライナ）／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ（モスクワ）／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／Ｄｕｃｋ（アヒル）／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ（ベトナム）／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。 ＨＡグリカン結合ドメインの配列アラインメント。灰色：シアル酸への結合に関与する保存性アミノ酸。赤色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフへの結合に関与する特定のアミノ酸。黄色：Ｑ２２６（１３７、１３８）およびＥ１９０（１８６、２２８）の位置に影響を与えるアミノ酸。緑色：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌモチーフに結合した他のモノサッカリド（または修飾）への結合に関与するアミノ酸。ＡＳＩ３０、ＡＰＲ３４、ＡＤＵ６３、ＡＤＳ９７、およびＶｉｅｔ０４の配列はそれらのそれぞれの結晶構造から得られた。他の配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から得られた。略語：ＡＤＡ７６、Ａ／ｄｕｃｋ（アヒル）／Ａｌｂｅｒｔａ（アルバータ）／３５／７６（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＩ３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ（ブタ）／Ｉｏｗａ（アイオワ）／３０（Ｈ１Ｎ１）；ＡＰＲ３４、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（プエルトリコ）／８／３４（Ｈ１Ｎ１）；ＡＳＣ１８、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（サウスカロライナ）／１／１８（Ｈ１Ｎ１）、ＡＴ９１、Ａ／Ｔｅｘａｓ（テキサス）／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；ＡＮＹ１８、Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ニューヨーク）／１／１８（Ｈ１Ｎ１）；ＡＤＵ６３、Ａ／Ｄｕｃｋ（アヒル）／Ｕｋｒａｉｎｅ（ウクライナ）／１／６３（Ｈ３Ｎ８）；ＡＡＩ６８、Ａ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８（Ｈ３Ｎ２）；ＡＭ９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ（モスクワ）／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）；ＡＤＳ９７、Ａ／Ｄｕｃｋ（アヒル）／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）／３／９７（Ｈ５Ｎ３）；Ｖｉｅｔ０４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ（ベトナム）／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）。 Ｈ１ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ３ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 Ｈ５ ＨＡに特徴的な保存性サブ配列を図示する配列アラインメント。 α２−３およびα２−６シアル化（ｓｉａｙｌａｔｅｄ）グリカンのコーン−トポロジー対アンブレラ−トポロジー。α２−３およびα２−６のトポロジーは、それぞれ、トリサッカリドモチーフ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃのグリコシドねじれ角によって支配されている（図７）。パラメーター（θ）、すなわち、これらのトリサッカリドモチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と、次のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃの糖のＣ１原子との間の角度が、トポロジーを特徴付けるために定義された。θの等高線ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンホメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用していること、およびα２−６モチーフがコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングしたことを示す（図７）。α２−３およびα２−６によってサンプリングされるコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよび次の糖は、コーンに広がる領域に沿って配置されている。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるＮｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖とのアミノ酸の接触を主として含む。他方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよび次の糖は、ＨＡ結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察されるような）に向かって曲がっている。より長いα２−６オリゴサッカリド（例えば、少なくともテトラサッカリド）は、ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃのアセチル基間の糖間ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンホメーションが好ましい。アンブレラ様トポロジーとのＨＡ相互作用は、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、番号付けした位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるＧｌｃＮＡｃ糖および次の糖とのアミノ酸の接触を含む。 α２−３およびα２−６シアル化（ｓｉａｙｌａｔｅｄ）グリカンのコーン−トポロジー対アンブレラ−トポロジー。α２−３およびα２−６のトポロジーは、それぞれ、トリサッカリドモチーフ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃのグリコシドねじれ角によって支配されている（図７）。パラメーター（θ）、すなわち、これらのトリサッカリドモチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と、次のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃの糖のＣ１原子との間の角度が、トポロジーを特徴付けるために定義された。θの等高線ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンホメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用していること、およびα２−６モチーフがコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングしたことを示す（図７）。α２−３およびα２−６によってサンプリングされるコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよび次の糖は、コーンに広がる領域に沿って配置されている。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるＮｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖とのアミノ酸の接触を主として含む。他方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよび次の糖は、ＨＡ結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察されるような）に向かって曲がっている。より長いα２−６オリゴサッカリド（例えば、少なくともテトラサッカリド）は、ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃのアセチル基間の糖間ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンホメーションが好ましい。アンブレラ様トポロジーとのＨＡ相互作用は、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、番号付けした位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるＧｌｃＮＡｃ糖および次の糖とのアミノ酸の接触を含む。 α２−３およびα２−６シアル化（ｓｉａｙｌａｔｅｄ）グリカンのコーン−トポロジー対アンブレラ−トポロジー。α２−３およびα２−６のトポロジーは、それぞれ、トリサッカリドモチーフ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃのグリコシドねじれ角によって支配されている（図７）。パラメーター（θ）、すなわち、これらのトリサッカリドモチーフにおけるＮｅｕ５ＡｃのＣ２原子と、次のＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃの糖のＣ１原子との間の角度が、トポロジーを特徴付けるために定義された。θの等高線ならびにα２−３およびα２−６モチーフのコンホメーションマップの重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用していること、およびα２−６モチーフがコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングしたことを示す（図７）。α２−３およびα２−６によってサンプリングされるコーン様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよび次の糖は、コーンに広がる領域に沿って配置されている。ＨＡのコーン様トポロジーとの相互作用は、番号付けした位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるＮｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖とのアミノ酸の接触を主として含む。他方、α２−６に独特であるアンブレラ様トポロジーにおいて、ＧｌｃＮＡｃおよび次の糖は、ＨＡ結合部位（ＨＡ−α２−６共結晶構造において観察されるような）に向かって曲がっている。より長いα２−６オリゴサッカリド（例えば、少なくともテトラサッカリド）は、ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃのアセチル基間の糖間ファンデルワールス接触によって安定化されるので、このコンホメーションが好ましい。アンブレラ様トポロジーとのＨＡ相互作用は、Ｎｅｕ５Ａｃ糖およびＧａｌ糖との接触に加えて、番号付けした位置（Ｈ３ ＨＡの番号付けに基づく）におけるＧｌｃＮＡｃ糖および次の糖とのアミノ酸の接触を含む。 α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンホメーションのサンプリング。（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの結合のコンホメーション（φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られたこれらのマップは、ＭＭ３力場を使用する、最初からのＭＤシミュレーションを使用して、生成された。エネルギー分布は、赤色（最も高いエネルギーを表す）から開始し、最も低いエネルギーを表す緑色まで色分けされている。取り囲んだ領域１〜５は、ＨＡグリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴサッカリドについて観察された（φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンホメーション（取り囲み領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢であり、このコンホメーションがゴーシュであるα２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの共結晶構造を例外とする（取り囲み領域２）。他方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンホメーション（取り囲み領域３）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢である。コーン様トポロジーは、取り囲み領域１および２によってサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは取り囲み領域３によってサンプリングされる。（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。コンホメーションマップにおいて赤色で印を付けた領域は、所定の（φ、Ψ）値のセットについてθパラメーター（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と次のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算するための外側の境界として使用された。エネルギーカットオフに基づいて、θ＞１１０°の値はコーン様トポロジーを特徴付けるために使用され、θ＜１００°はアンブレラ様トポロジーを特徴付けるために使用された。コンホメーションエネルギーマップとのθ等高線の重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用することを示した。なぜなら、アンブレラ様トポロジーを採用することはエネルギー的に好ましくなかったからである。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類された。 α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンホメーションのサンプリング。（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの結合のコンホメーション（φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られたこれらのマップは、ＭＭ３力場を使用する、最初からのＭＤシミュレーションを使用して、生成された。エネルギー分布は、赤色（最も高いエネルギーを表す）から開始し、最も低いエネルギーを表す緑色まで色分けされている。取り囲んだ領域１〜５は、ＨＡグリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴサッカリドについて観察された（φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンホメーション（取り囲み領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢であり、このコンホメーションがゴーシュであるα２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの共結晶構造を例外とする（取り囲み領域２）。他方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンホメーション（取り囲み領域３）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢である。コーン様トポロジーは、取り囲み領域１および２によってサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは取り囲み領域３によってサンプリングされる。（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。コンホメーションマップにおいて赤色で印を付けた領域は、所定の（φ、Ψ）値のセットについてθパラメーター（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と次のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算するための外側の境界として使用された。エネルギーカットオフに基づいて、θ＞１１０°の値はコーン様トポロジーを特徴付けるために使用され、θ＜１００°はアンブレラ様トポロジーを特徴付けるために使用された。コンホメーションエネルギーマップとのθ等高線の重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用することを示した。なぜなら、アンブレラ様トポロジーを採用することはエネルギー的に好ましくなかったからである。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類された。 α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンホメーションのサンプリング。（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの結合のコンホメーション（φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られたこれらのマップは、ＭＭ３力場を使用する、最初からのＭＤシミュレーションを使用して、生成された。エネルギー分布は、赤色（最も高いエネルギーを表す）から開始し、最も低いエネルギーを表す緑色まで色分けされている。取り囲んだ領域１〜５は、ＨＡグリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴサッカリドについて観察された（φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンホメーション（取り囲み領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢であり、このコンホメーションがゴーシュであるα２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの共結晶構造を例外とする（取り囲み領域２）。他方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンホメーション（取り囲み領域３）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢である。コーン様トポロジーは、取り囲み領域１および２によってサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは取り囲み領域３によってサンプリングされる。（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。コンホメーションマップにおいて赤色で印を付けた領域は、所定の（φ、Ψ）値のセットについてθパラメーター（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と次のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算するための外側の境界として使用された。エネルギーカットオフに基づいて、θ＞１１０°の値はコーン様トポロジーを特徴付けるために使用され、θ＜１００°はアンブレラ様トポロジーを特徴付けるために使用された。コンホメーションエネルギーマップとのθ等高線の重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用することを示した。なぜなら、アンブレラ様トポロジーを採用することはエネルギー的に好ましくなかったからである。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類された。 α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンホメーションのサンプリング。（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの結合のコンホメーション（φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られたこれらのマップは、ＭＭ３力場を使用する、最初からのＭＤシミュレーションを使用して、生成された。エネルギー分布は、赤色（最も高いエネルギーを表す）から開始し、最も低いエネルギーを表す緑色まで色分けされている。取り囲んだ領域１〜５は、ＨＡグリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴサッカリドについて観察された（φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンホメーション（取り囲み領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢であり、このコンホメーションがゴーシュであるα２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの共結晶構造を例外とする（取り囲み領域２）。他方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンホメーション（取り囲み領域３）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢である。コーン様トポロジーは、取り囲み領域１および２によってサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは取り囲み領域３によってサンプリングされる。（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。コンホメーションマップにおいて赤色で印を付けた領域は、所定の（φ、Ψ）値のセットについてθパラメーター（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と次のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算するための外側の境界として使用された。エネルギーカットオフに基づいて、θ＞１１０°の値はコーン様トポロジーを特徴付けるために使用され、θ＜１００°はアンブレラ様トポロジーを特徴付けるために使用された。コンホメーションエネルギーマップとのθ等高線の重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用することを示した。なぜなら、アンブレラ様トポロジーを採用することはエネルギー的に好ましくなかったからである。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類された。 α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンホメーションのサンプリング。（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの結合のコンホメーション（φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られたこれらのマップは、ＭＭ３力場を使用する、最初からのＭＤシミュレーションを使用して、生成された。エネルギー分布は、赤色（最も高いエネルギーを表す）から開始し、最も低いエネルギーを表す緑色まで色分けされている。取り囲んだ領域１〜５は、ＨＡグリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴサッカリドについて観察された（φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンホメーション（取り囲み領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢であり、このコンホメーションがゴーシュであるα２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの共結晶構造を例外とする（取り囲み領域２）。他方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンホメーション（取り囲み領域３）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢である。コーン様トポロジーは、取り囲み領域１および２によってサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは取り囲み領域３によってサンプリングされる。（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。コンホメーションマップにおいて赤色で印を付けた領域は、所定の（φ、Ψ）値のセットについてθパラメーター（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と次のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算するための外側の境界として使用された。エネルギーカットオフに基づいて、θ＞１１０°の値はコーン様トポロジーを特徴付けるために使用され、θ＜１００°はアンブレラ様トポロジーを特徴付けるために使用された。コンホメーションエネルギーマップとのθ等高線の重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用することを示した。なぜなら、アンブレラ様トポロジーを採用することはエネルギー的に好ましくなかったからである。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類された。 α２−３およびα２−６によるコーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーのコンホメーションのサンプリング。（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、およびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの結合のコンホメーション（φ、Ψ）マップを示す。ＧｌｙｃｏＭａｐｓ ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｅ／ｍｏｄｅｌｉｎｇ／ｇｌｙｃｏｍａｐｓｄｂ／）から得られたこれらのマップは、ＭＭ３力場を使用する、最初からのＭＤシミュレーションを使用して、生成された。エネルギー分布は、赤色（最も高いエネルギーを表す）から開始し、最も低いエネルギーを表す緑色まで色分けされている。取り囲んだ領域１〜５は、ＨＡグリカン共結晶構造におけるα２−３およびα２−６オリゴサッカリドについて観察された（φ、Ψ）値を表す。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌのトランスコンホメーション（取り囲み領域１）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢であり、このコンホメーションがゴーシュであるα２−３を有するＡ／Ａｉｃｈｉ（愛知）／２／６８ Ｈ３Ｎ２ ＨＡの共結晶構造を例外とする（取り囲み領域２）。他方、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌのシスコンホメーション（取り囲み領域３）は、ＨＡ結合ポケットにおいて優勢である。コーン様トポロジーは、取り囲み領域１および２によってサンプリングされ、アンブレラ様トポロジーは取り囲み領域３によってサンプリングされる。（Ｅ）〜（Ｆ）は、それぞれ、α２−３モチーフおよびα２−６モチーフによるコーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーのサンプリングを示す。コンホメーションマップにおいて赤色で印を付けた領域は、所定の（φ、Ψ）値のセットについてθパラメーター（Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子と次のＧａｌ糖およびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度）を計算するための外側の境界として使用された。エネルギーカットオフに基づいて、θ＞１１０°の値はコーン様トポロジーを特徴付けるために使用され、θ＜１００°はアンブレラ様トポロジーを特徴付けるために使用された。コンホメーションエネルギーマップとのθ等高線の重ね合わせは、α２−３モチーフが１００％コーン様トポロジーを採用することを示した。なぜなら、アンブレラ様トポロジーを採用することはエネルギー的に好ましくなかったからである。他方、α２−６モチーフは、コーン様トポロジーとアンブレラ様トポロジーの両方をサンプリングし、このサンプリングは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のω角（Ｏ−Ｃ６−Ｃ５−Ｈ５）に基づいて分類された。 例示的なコーントポロジー。この図は、コーントポロジーを採用している特定の例示的な（しかし、包括的ではない）グリカン構造を図示する。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 例示的なアンブレラトポロジー。（Ａ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｎ連結およびＯ連結グリカン構造。（Ｂ）アンブレラトポロジーを採用可能である特定の例示的な（しかし、包括的ではない）Ｏ連結グリカン構造。 ＨＡ結合グリカンアレイデータのデータ検索分析。上端には、代表的な複合グリカン構造から抽出されたグリカン特徴の型（ペア、トリプレット、クアドルプレット）の例が示される。これらの特徴の包括的なセットがグリカンアレイ中のグリカンから抽出された。下端には、グリカンアレイを使用して分析された各ＨＡについての複合体分類子規則の図的表現が示される。α２−３ Ａ型は最も広い特異性を表すのに対して、Ｂ型およびＣ型分類子は、トリサッカリドα２−３モチーフの周りの構造のバリエーションによって課せられた制約を表す。α２−６ Ａ型は長いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表すのに対して、Ｂ型は短いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表す。「コア」は、アレイ上単一のα２−６二分岐グリカンの場合における還元末端に結合されたスペーサー、またはトリマンノシルコアのいずれかに対応する。^ａ：結合シグナルは、フコシル化α２−３モチーフについて、これがＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する場合のみ、観察された；^ｂ：結合シグナルは、６’−シアリルラクトースについてのみ観察された；^ｃ：結合シグナルは、短い６’−シアリルラクトサミン（Ｂ型）についてもまた観察された；^ｄ：結合シグナルは、Ｈ５Ｎ１二重変異体のα２−３ Ｂ型よりも有意に低い；^ｅ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する短いα２−６についてのみ観察された；^ｆ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有するα２−３モチーフについて観察されたバックグラウンドのすぐ上である；^＊：Ａ／ベトナム／１２０３／０４の起源はトリであるが、このウイルス株は感染したヒトから単離された。

ＨＡ結合グリカンアレイデータのデータ検索分析。上端には、代表的な複合グリカン構造から抽出されたグリカン特徴の型（ペア、トリプレット、クアドルプレット）の例が示される。これらの特徴の包括的なセットがグリカンアレイ中のグリカンから抽出された。下端には、グリカンアレイを使用して分析された各ＨＡについての複合体分類子規則の図的表現が示される。α２−３ Ａ型は最も広い特異性を表すのに対して、Ｂ型およびＣ型分類子は、トリサッカリドα２−３モチーフの周りの構造のバリエーションによって課せられた制約を表す。α２−６ Ａ型は長いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表すのに対して、Ｂ型は短いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表す。「コア」は、アレイ上単一のα２−６二分岐グリカンの場合における還元末端に結合されたスペーサー、またはトリマンノシルコアのいずれかに対応する。^ａ：結合シグナルは、フコシル化α２−３モチーフについて、これがＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する場合のみ、観察された；^ｂ：結合シグナルは、６’−シアリルラクトースについてのみ観察された；^ｃ：結合シグナルは、短い６’−シアリルラクトサミン（Ｂ型）についてもまた観察された；^ｄ：結合シグナルは、Ｈ５Ｎ１二重変異体のα２−３ Ｂ型よりも有意に低い；^ｅ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する短いα２−６についてのみ観察された；^ｆ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有するα２−３モチーフについて観察されたバックグラウンドのすぐ上である；^＊：Ａ／ベトナム／１２０３／０４の起源はトリであるが、このウイルス株は感染したヒトから単離された。

ＨＡ結合グリカンアレイデータのデータ検索分析。上端には、代表的な複合グリカン構造から抽出されたグリカン特徴の型（ペア、トリプレット、クアドルプレット）の例が示される。これらの特徴の包括的なセットがグリカンアレイ中のグリカンから抽出された。下端には、グリカンアレイを使用して分析された各ＨＡについての複合体分類子規則の図的表現が示される。α２−３ Ａ型は最も広い特異性を表すのに対して、Ｂ型およびＣ型分類子は、トリサッカリドα２−３モチーフの周りの構造のバリエーションによって課せられた制約を表す。α２−６ Ａ型は長いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表すのに対して、Ｂ型は短いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表す。「コア」は、アレイ上単一のα２−６二分岐グリカンの場合における還元末端に結合されたスペーサー、またはトリマンノシルコアのいずれかに対応する。^ａ：結合シグナルは、フコシル化α２−３モチーフについて、これがＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する場合のみ、観察された；^ｂ：結合シグナルは、６’−シアリルラクトースについてのみ観察された；^ｃ：結合シグナルは、短い６’−シアリルラクトサミン（Ｂ型）についてもまた観察された；^ｄ：結合シグナルは、Ｈ５Ｎ１二重変異体のα２−３ Ｂ型よりも有意に低い；^ｅ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する短いα２−６についてのみ観察された；^ｆ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有するα２−３モチーフについて観察されたバックグラウンドのすぐ上である；^＊：Ａ／ベトナム／１２０３／０４の起源はトリであるが、このウイルス株は感染したヒトから単離された。

ＨＡ結合グリカンアレイデータのデータ検索分析。上端には、代表的な複合グリカン構造から抽出されたグリカン特徴の型の例（ペア、トリプレット、クアドルプレット）が示される。これらの特徴の包括的なセットがグリカンアレイ中のグリカンから抽出された。下端には、グリカンアレイを使用して分析された各ＨＡについての複合体分類子規則の図的表現が示される。α２−３ Ａ型は最も広い特異性を表すのに対して、Ｂ型およびＣ型分類子は、トリサッカリドα２−３モチーフの周りの構造のバリエーションによって課せられた制約を表す。α２−６ Ａ型は長いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表すのに対して、Ｂ型は短いα２−６（直鎖状または分枝状）への結合を表す。「コア」は、アレイ上単一のα２−６二分岐グリカンの場合における還元末端に結合されたスペーサー、またはトリマンノシルコアのいずれかに対応する。^ａ：結合シグナルは、フコシル化α２−３モチーフについて、これがＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する場合のみ、観察された；^ｂ：結合シグナルは、６’−シアリルラクトースについてのみ観察された；^ｃ：結合シグナルは、短い６’−シアリルラクトサミン（Ｂ型）についてもまた観察された；^ｄ：結合シグナルは、Ｈ５Ｎ１二重変異体のα２−３ Ｂ型よりも有意に低い；^ｅ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有する短いα２−６についてのみ観察された；^ｆ：結合シグナルは、ＧｌｃＮＡｃ［６Ｓ］を有するα２−３モチーフについて観察されたバックグラウンドのすぐ上である；^＊：Ａ／ベトナム／１２０３／０４の起源はトリであるが、このウイルス株は感染したヒトから単離された。

二分岐α２−６シアル化グリカンへのＶｉｅｔ０４＿Ｈ５ ＨＡの結合（コーン−トポロジー）。表面の立体像は、拡張コンホメーション（百日咳毒素共結晶構造から得られた；ＰＤＢ ＩＤ：１ＰＴＯ）におけるＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合を有するＶｉｅｔ０４＿Ｈ５グリカン結合部位を与えた。Ｌｙｓ１９３（橙色）はこのコンホメーションにおけるグリカンとのいかなる接触も有しない。このコンホメーションにおけるグリカンへの結合に潜在的に関与するさらなるアミノ酸には、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２２２、およびＳｅｒ２２７が含まれる。しかし、シス−コンホメーションであるα２−６シアル化オリゴサッカリドへのＨＡ結合において観察される特定の接触は、拡張コンホメーションにおいては存在しない。いかなる特定の理論によっても束縛されることは望まないが、本発明者らは、このことが、拡張コンホメーションが、シス−コンホメーションと同程度に最適にＨＡには結合しない可能性を示唆することに注目している。Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ分枝がＭａｎα１−３Ｍａｎ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＬＧＣ）およびＭａｎα１−６Ｍａｎ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＺＡＧ）に結合されている分枝Ｎ結合グリカンの構造は、この結合のシス−コンホメーションと拡張コンホメーションの両方について、Ｖｉｅｔ０４＿Ｈ５ ＨＡ結合部位におけるＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合に重ね合わせされた。この重ね合わせは、コアのＭａｎα１−６Ｍａｎに結合されたＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ分枝を有する構造が、結合部位との好ましくない立体的な重複を有することを示す（両方のコンホメーションにおいて）。他方、コアのＭａｎα１−３Ｍａｎに結合されたこの分枝を有する構造（トリマンノースコアが紫色で着色されている図の中で示される）は、シス−コンホメーションでＬｙｓ１９３と立体的な重複を有するが、より最適ではないにも関わらず、拡張コンホメーションにおいてＬｙｓ１９３とのいかなる接触も伴わずに結合可能である。 上気道組織切片のレクチン染色。ジャカリン（緑色）およびＣｏｎＡ（赤色）を用いる気管組織の同時染色は、気管の先端面上の杯細胞へのジャカリンの優先的な結合（Ｏ連結グリカンに特異的に結合する）、および繊毛気管上皮細胞へのＣｏｎＡの結合（Ｎ連結グリカンに特異的に結合する）を明らかにする。いかなる特定の理論によっても束縛されることは望まないが、本発明者らは、この知見が、杯細胞がＯ連結グリカンを優先的に発現するのに対して、繊毛上皮細胞がＮ連結グリカンを優先的に発現することを示唆することに注目している。ジャカリンおよびＳＮＡ（赤色；α２−６に特異的に結合する）を用いる気管の同時染色は、杯細胞と繊毛細胞の両方へのＳＮＡの結合を示す。他方、α２−３シアル化グリカンに特異的に結合するジャカリン（緑色）とＭＡＬ（赤色）の同時染色は、多列気管上皮に対してＭＡＬの弱い最小限の結合から結合がないことまでを示すが、組織の根底にある領域に対しては広範な結合を示す。総合して、レクチン染色データは、それぞれ、気道上皮の先端側の繊毛細胞および杯細胞において、Ｎ連結グリカンとＯ連結グリカンの両方の部分として、α２−６シアル化グリカンの優先的な発現および広範な分布を示す。 上気道組織切片のレクチン染色。ジャカリン（緑色）およびＣｏｎＡ（赤色）を用いる気管組織の同時染色は、気管の先端面上の杯細胞へのジャカリンの優先的な結合（Ｏ連結グリカンに特異的に結合する）、および繊毛気管上皮細胞へのＣｏｎＡの結合（Ｎ連結グリカンに特異的に結合する）を明らかにする。いかなる特定の理論によっても束縛されることは望まないが、本発明者らは、この知見が、杯細胞がＯ連結グリカンを優先的に発現するのに対して、繊毛上皮細胞がＮ連結グリカンを優先的に発現することを示唆することに注目している。ジャカリンおよびＳＮＡ（赤色；α２−６に特異的に結合する）を用いる気管の同時染色は、杯細胞と繊毛細胞の両方へのＳＮＡの結合を示す。他方、α２−３シアル化グリカンに特異的に結合するジャカリン（緑色）とＭＡＬ（赤色）の同時染色は、多列気管上皮に対してＭＡＬの弱い最小限の結合から結合がないことまでを示すが、組織の根底にある領域に対しては広範な結合を示す。総合して、レクチン染色データは、それぞれ、気道上皮の先端側の繊毛細胞および杯細胞において、Ｎ連結グリカンとＯ連結グリカンの両方の部分として、α２−６シアル化グリカンの優先的な発現および広範な分布を示す。 ヒト上気道組織におけるグリカン多様性。（Ａ）ＣｏｎＡ（赤色）／ジャカリン（緑色）およびＳＮＡ−Ｉ（赤色）／ジャカリン（緑色）を用いる気管組織切片の同時染色。ジャカリン結合の局在化領域は、Ｏ連結グリカンを発現する杯細胞に対応し、Ｃｏｎ Ａ結合の領域は、気道上皮の先端側のＮ連結グリカンを発現する繊毛細胞に対応する（白色矢印）。杯細胞（黄色のジャカリンを用いる同時染色）と繊毛細胞の両方へのＳＮＡ−Ｉの広範な結合は、それぞれ、先端側のＯ連結およびＮ連結α２−６の優先的な発現を示す。繊毛上皮がＮ連結α２−６を優先的に発現するならば、ヒド気管支上皮（ＨＢＥ）細胞から単離されたＮ連結グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析が実施された。ＨＢＥ細胞は、ヒト適合したＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスのこれらの細胞への広範な結合に基づいて、代表的な上気道繊毛上皮細胞として選ばれた。（Ｂ）ＨＢＥ細胞のＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロフィールは、質量ピークを満足する（±３．５ダルトン以内）可能なシアル化グリカン構造の図的表現を使用して示される（明確な結合の割り当てを伴わない）。ＨＢＥは、α２−６シアル化グリカンを優先的に発現する（α２−３と比較して）。（Ｃ）シアル酸の数から分枝パターンを逆重畳積分するための、（Ｂ）において観察されたＮ連結グリカンの、シアリダーゼＡを使用する脱シアル化、および引き続く、２−ＡＢラベリング。（Ｂ）および（Ｃ）におけるシアンで強調したピークは、ＴＯＦＴＯＦ ＭＳを使用してさらに分析した。（Ｄ）ｍ／ｚ２１４８における代表的なピークのＭＳ−ＭＳプロフィールは、ｍ／ｚ５４８および７１３におけるフラグメントイオンおよびそれらの対応するカウンターイオン（赤色で示す）を示し、これらは、複数の短いラクトサミン分枝にわたる長いオリゴサッカリド分枝（複数のラクトサミン反復を有する）を支持する。ｍ／ｚ２６６０のＭＳ−ＭＳプロフィールは長いオリゴサッカリド分枝を支持する。 ヒト上気道組織におけるグリカン多様性。（Ａ）ＣｏｎＡ（赤色）／ジャカリン（緑色）およびＳＮＡ−Ｉ（赤色）／ジャカリン（緑色）を用いる気管組織切片の同時染色。ジャカリン結合の局在化領域は、Ｏ連結グリカンを発現する杯細胞に対応し、Ｃｏｎ Ａ結合の領域は、気道上皮の先端側のＮ連結グリカンを発現する繊毛細胞に対応する（白色矢印）。杯細胞（黄色のジャカリンを用いる同時染色）と繊毛細胞の両方へのＳＮＡ−Ｉの広範な結合は、それぞれ、先端側のＯ連結およびＮ連結α２−６の優先的な発現を示す。繊毛上皮がＮ連結α２−６を優先的に発現するならば、ヒド気管支上皮（ＨＢＥ）細胞から単離されたＮ連結グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析が実施された。ＨＢＥ細胞は、ヒト適合したＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスのこれらの細胞への広範な結合に基づいて、代表的な上気道繊毛上皮細胞として選ばれた。（Ｂ）ＨＢＥ細胞のＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロフィールは、質量ピークを満足する（±３．５ダルトン以内）可能なシアル化グリカン構造の図的表現を使用して示される（明確な結合の割り当てを伴わない）。ＨＢＥは、α２−６シアル化グリカンを優先的に発現する（α２−３と比較して）。（Ｃ）シアル酸の数から分枝パターンを逆重畳積分するための、（Ｂ）において観察されたＮ連結グリカンの、シアリダーゼＡを使用する脱シアル化、および引き続く、２−ＡＢラベリング。（Ｂ）および（Ｃ）におけるシアンで強調したピークは、ＴＯＦＴＯＦ ＭＳを使用してさらに分析した。（Ｄ）ｍ／ｚ２１４８における代表的なピークのＭＳ−ＭＳプロフィールは、ｍ／ｚ５４８および７１３におけるフラグメントイオンおよびそれらの対応するカウンターイオン（赤色で示す）を示し、これらは、複数の短いラクトサミン分枝にわたる長いオリゴサッカリド分枝（複数のラクトサミン反復を有する）を支持する。ｍ／ｚ２６６０のＭＳ−ＭＳプロフィールは長いオリゴサッカリド分枝を支持する。 ヒト上気道組織におけるグリカン多様性。（Ａ）ＣｏｎＡ（赤色）／ジャカリン（緑色）およびＳＮＡ−Ｉ（赤色）／ジャカリン（緑色）を用いる気管組織切片の同時染色。ジャカリン結合の局在化領域は、Ｏ連結グリカンを発現する杯細胞に対応し、Ｃｏｎ Ａ結合の領域は、気道上皮の先端側のＮ連結グリカンを発現する繊毛細胞に対応する（白色矢印）。杯細胞（黄色のジャカリンを用いる同時染色）と繊毛細胞の両方へのＳＮＡ−Ｉの広範な結合は、それぞれ、先端側のＯ連結およびＮ連結α２−６の優先的な発現を示す。繊毛上皮がＮ連結α２−６を優先的に発現するならば、ヒド気管支上皮（ＨＢＥ）細胞から単離されたＮ連結グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析が実施された。ＨＢＥ細胞は、ヒト適合したＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスのこれらの細胞への広範な結合に基づいて、代表的な上気道繊毛上皮細胞として選ばれた。（Ｂ）ＨＢＥ細胞のＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロフィールは、質量ピークを満足する（±３．５ダルトン以内）可能なシアル化グリカン構造の図的表現を使用して示される（明確な結合の割り当てを伴わない）。ＨＢＥは、α２−６シアル化グリカンを優先的に発現する（α２−３と比較して）。（Ｃ）シアル酸の数から分枝パターンを逆重畳積分するための、（Ｂ）において観察されたＮ連結グリカンの、シアリダーゼＡを使用する脱シアル化、および引き続く、２−ＡＢラベリング。（Ｂ）および（Ｃ）におけるシアンで強調したピークは、ＴＯＦＴＯＦ ＭＳを使用してさらに分析した。（Ｄ）ｍ／ｚ２１４８における代表的なピークのＭＳ−ＭＳプロフィールは、ｍ／ｚ５４８および７１３におけるフラグメントイオンおよびそれらの対応するカウンターイオン（赤色で示す）を示し、これらは、複数の短いラクトサミン分枝にわたる長いオリゴサッカリド分枝（複数のラクトサミン反復を有する）を支持する。ｍ／ｚ２６６０のＭＳ−ＭＳプロフィールは長いオリゴサッカリド分枝を支持する。 ヒト上気道組織におけるグリカン多様性。（Ａ）ＣｏｎＡ（赤色）／ジャカリン（緑色）およびＳＮＡ−Ｉ（赤色）／ジャカリン（緑色）を用いる気管組織切片の同時染色。ジャカリン結合の局在化領域は、Ｏ連結グリカンを発現する杯細胞に対応し、Ｃｏｎ Ａ結合の領域は、気道上皮の先端側のＮ連結グリカンを発現する繊毛細胞に対応する（白色矢印）。杯細胞（黄色のジャカリンを用いる同時染色）と繊毛細胞の両方へのＳＮＡ−Ｉの広範な結合は、それぞれ、先端側のＯ連結およびＮ連結α２−６の優先的な発現を示す。繊毛上皮がＮ連結α２−６を優先的に発現するならば、ヒド気管支上皮（ＨＢＥ）細胞から単離されたＮ連結グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析が実施された。ＨＢＥ細胞は、ヒト適合したＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスのこれらの細胞への広範な結合に基づいて、代表的な上気道繊毛上皮細胞として選ばれた。（Ｂ）ＨＢＥ細胞のＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロフィールは、質量ピークを満足する（±３．５ダルトン以内）可能なシアル化グリカン構造の図的表現を使用して示される（明確な結合の割り当てを伴わない）。ＨＢＥは、α２−６シアル化グリカンを優先的に発現する（α２−３と比較して）。（Ｃ）シアル酸の数から分枝パターンを逆重畳積分するための、（Ｂ）において観察されたＮ連結グリカンの、シアリダーゼＡを使用する脱シアル化、および引き続く、２−ＡＢラベリング。（Ｂ）および（Ｃ）におけるシアンで強調したピークは、ＴＯＦＴＯＦ ＭＳを使用してさらに分析した。（Ｄ）ｍ／ｚ２１４８における代表的なピークのＭＳ−ＭＳプロフィールは、ｍ／ｚ５４８および７１３におけるフラグメントイオンおよびそれらの対応するカウンターイオン（赤色で示す）を示し、これらは、複数の短いラクトサミン分枝にわたる長いオリゴサッカリド分枝（複数のラクトサミン反復を有する）を支持する。ｍ／ｚ２６６０のＭＳ−ＭＳプロフィールは長いオリゴサッカリド分枝を支持する。 上気道および下気道の組織切片に対する組換えＨ１、Ｈ３ ＷＴ ＨＡの用量応答結合。ＨＡ結合は、ヨウ化プロピジウム染色（赤色）に対して緑色で示される。気管組織の先端側は、長い分枝トポロジーを有するα２−６グリカンを優先的に発現する。他方、肺胞組織は、α２−３グリカンを優先的に発現する。Ｈ１ ＨＡは、気管の先端表面に顕著に結合し、その結合は、４０μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまでの希釈に伴って、次第に減少する。Ｈ１ ＨＡはまた、最高濃度においてのみ、肺胞組織にある程度の弱い結合を示す。Ｈ３ ＨＡの結合パターンは、Ｈ１ ＨＡのそれとは異なっている。例えば、Ｈ３ ＨＡは、４０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌにおける気管と肺胞の両方の組織切片への顕著な結合を示す。しかし、１０μｇ／ｍｌの濃度において、Ｈ３ ＨＡは、気管組織の先端側に主として結合を示し、肺胞組織にはほとんど結合を示さないか、または全く結合を示さない。全体的には、これらの組織結合データは、気管組織の先端側への高親和性結合の重要性を強調する。さらに、これらのデータは、α２−６シアル化グリカンについての高い特異性（Ｈ１ ＨＡによって実証されるような）は、ヒトの感染を媒介するために絶対的に必要とされてはいないことを明らかにする。なぜなら、Ｈ３ ＨＡは、α２−３シアル化グリカンについてのある程度の親和性を示すからである。 ヒト適合されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３ ＨＡの用量依存性直接的結合。ヒト適合されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３ ＨＡの特徴的な結合パターンは、４０μｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌまでのＨＡ希釈の範囲にわたって、飽和レベルであるそれらの結合である。Ｈ１ ＨＡ（ＳＣ１８）の狭い特異性は、その限定的な気管組織結合と相関している（図１４）。他方、Ｈ３ ＨＡ（Ｍｏｓ９９）が多様なシアル化グリカンに結合する能力は、Ｈ１ ＨＡのそれと比較した場合に、気管組織切片へのより広範なその結合と一致する（図１４）。 Ｈ５Ｎ１ウイルスの用量依存性直接的グリカン結合。ヒト適合されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３ ＨＡの用量依存性結合プロフィールとは対照的に、Ｖｉｅｔ０３０４およびＨＫ４８６ Ｈ５Ｎ１ウイルスは、α２−３には高い親和性で結合し（１２８ＨＡＵから下方に３２ＨＡＵまでシグナルを飽和する）、長いα２−６オリゴサッカリドには最小限の親和性で結合する。従って、本発明は、生理学的なＮ連結、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質の一部として、硫酸化／フコシル化置換（右側に示す）を有するトリサッカリドモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−が、トリウイルスの理想的な標的であろうという認識を包含する。 Ｈ５Ｎ１ウイルスの用量依存性直接的グリカン結合。ヒト適合されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３ ＨＡの用量依存性結合プロフィールとは対照的に、Ｖｉｅｔ０３０４およびＨＫ４８６ Ｈ５Ｎ１ウイルスは、α２−３には高い親和性で結合し（１２８ＨＡＵから下方に３２ＨＡＵまでシグナルを飽和する）、長いα２−６オリゴサッカリドには最小限の親和性で結合する。従って、本発明は、生理学的なＮ連結、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質の一部として、硫酸化／フコシル化置換（右側に示す）を有するトリサッカリドモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−が、トリウイルスの理想的な標的であろうという認識を包含する。 Ｈ５Ｎ１ウイルスの用量依存性直接的グリカン結合。ヒト適合されたＨ１、Ｈ２、およびＨ３ ＨＡの用量依存性結合プロフィールとは対照的に、Ｖｉｅｔ０３０４およびＨＫ４８６ Ｈ５Ｎ１ウイルスは、α２−３には高い親和性で結合し（１２８ＨＡＵから下方に３２ＨＡＵまでシグナルを飽和する）、長いα２−６オリゴサッカリドには最小限の親和性で結合する。従って、本発明は、生理学的なＮ連結、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質の一部として、硫酸化／フコシル化置換（右側に示す）を有するトリサッカリドモチーフＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−が、トリウイルスの理想的な標的であろうという認識を包含する。 α２−３およびα２−６とのＳＣ１８ ＨＡ、ＮＹ１８ ＨＡ、およびＡＶ１８ ＨＡの分子的相互作用。ＨＡ上のグリカン結合部位は、グリカン結合に関与するアミノ酸とともに示され、これには、高度に保存性であるＮｅｕ５Ａｃアンカー（Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｔｈｒ１５５、およびＬｅｕ１９４）が含まれる。Ｔｙｒ９５およびＨｉｓ１８３は明確化のために示されていない。アミノ酸の位置は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡに基づいて番号付けされている。（Ａ）アンブレラ様トポロジーにおける長いα２−６とのＳＣ１８ ＨＡの相互作用が示される。Ｌｙｓ２２２、Ａｓｐ２２５、およびＧｌｎ２２６は塩基領域との接触を提供し、Ａｓｐ１９０、Ｇｌｎ１９２、およびＳｅｒ１９３は、拡張領域との接触を提供する。（Ｂ）長いα２−６とのＮＹ１８ ＨＡの相互作用は、塩基領域とのＡｓｐ２２５の接触の損失を示す（（Ａ）におけるＳＣ１８ ＨＡの場合において観察されるように）。（Ｃ）コーン様トポロジーにおけるα２−３とのＡＶ１８ ＨＡの相互作用は、コーン様トポロジーとのＨＡの相互作用が、長いα２−６のアンブレラ様トポロジーのそれとは対照的に、塩基におけるＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの糖のみとの接触を含むことを示す。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６は、これらの糖との最適な接触を提供するように配置される。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０の側鎖コンホメーションは、ＡＰＲ３４ ＨＡ−α２−３共結晶構造中のＧｌｕ１９０のそれに基づいて割り当てられた。（Ｄ）ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの間の鍵となるアミノ酸の位置の違いが、それらをＡＳＩ３０ ＨＡおよびＡＰＲ３４ ＨＡと比較して示される。 α２−３およびα２−６とのＳＣ１８ ＨＡ、ＮＹ１８ ＨＡ、およびＡＶ１８ ＨＡの分子的相互作用。ＨＡ上のグリカン結合部位は、グリカン結合に関与するアミノ酸とともに示され、これには、高度に保存性であるＮｅｕ５Ａｃアンカー（Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｔｈｒ１５５、およびＬｅｕ１９４）が含まれる。Ｔｙｒ９５およびＨｉｓ１８３は明確化のために示されていない。アミノ酸の位置は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡに基づいて番号付けされている。（Ａ）アンブレラ様トポロジーにおける長いα２−６とのＳＣ１８ ＨＡの相互作用が示される。Ｌｙｓ２２２、Ａｓｐ２２５、およびＧｌｎ２２６は塩基領域との接触を提供し、Ａｓｐ１９０、Ｇｌｎ１９２、およびＳｅｒ１９３は、拡張領域との接触を提供する。（Ｂ）長いα２−６とのＮＹ１８ ＨＡの相互作用は、塩基領域とのＡｓｐ２２５の接触の損失を示す（（Ａ）におけるＳＣ１８ ＨＡの場合において観察されるように）。（Ｃ）コーン様トポロジーにおけるα２−３とのＡＶ１８ ＨＡの相互作用は、コーン様トポロジーとのＨＡの相互作用が、長いα２−６のアンブレラ様トポロジーのそれとは対照的に、塩基におけるＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの糖のみとの接触を含むことを示す。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６は、これらの糖との最適な接触を提供するように配置される。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０の側鎖コンホメーションは、ＡＰＲ３４ ＨＡ−α２−３共結晶構造中のＧｌｕ１９０のそれに基づいて割り当てられた。（Ｄ）ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの間の鍵となるアミノ酸の位置の違いが、それらをＡＳＩ３０ ＨＡおよびＡＰＲ３４ ＨＡと比較して示される。 α２−３およびα２−６とのＳＣ１８ ＨＡ、ＮＹ１８ ＨＡ、およびＡＶ１８ ＨＡの分子的相互作用。ＨＡ上のグリカン結合部位は、グリカン結合に関与するアミノ酸とともに示され、これには、高度に保存性であるＮｅｕ５Ａｃアンカー（Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｔｈｒ１５５、およびＬｅｕ１９４）が含まれる。Ｔｙｒ９５およびＨｉｓ１８３は明確化のために示されていない。アミノ酸の位置は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡに基づいて番号付けされている。（Ａ）アンブレラ様トポロジーにおける長いα２−６とのＳＣ１８ ＨＡの相互作用が示される。Ｌｙｓ２２２、Ａｓｐ２２５、およびＧｌｎ２２６は塩基領域との接触を提供し、Ａｓｐ１９０、Ｇｌｎ１９２、およびＳｅｒ１９３は、拡張領域との接触を提供する。（Ｂ）長いα２−６とのＮＹ１８ ＨＡの相互作用は、塩基領域とのＡｓｐ２２５の接触の損失を示す（（Ａ）におけるＳＣ１８ ＨＡの場合において観察されるように）。（Ｃ）コーン様トポロジーにおけるα２−３とのＡＶ１８ ＨＡの相互作用は、コーン様トポロジーとのＨＡの相互作用が、長いα２−６のアンブレラ様トポロジーのそれとは対照的に、塩基におけるＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの糖のみとの接触を含むことを示す。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６は、これらの糖との最適な接触を提供するように配置される。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０の側鎖コンホメーションは、ＡＰＲ３４ ＨＡ−α２−３共結晶構造中のＧｌｕ１９０のそれに基づいて割り当てられた。（Ｄ）ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの間の鍵となるアミノ酸の位置の違いが、それらをＡＳＩ３０ ＨＡおよびＡＰＲ３４ ＨＡと比較して示される。 α２−３およびα２−６とのＳＣ１８ ＨＡ、ＮＹ１８ ＨＡ、およびＡＶ１８ ＨＡの分子的相互作用。ＨＡ上のグリカン結合部位は、グリカン結合に関与するアミノ酸とともに示され、これには、高度に保存性であるＮｅｕ５Ａｃアンカー（Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｔｈｒ１５５、およびＬｅｕ１９４）が含まれる。Ｔｙｒ９５およびＨｉｓ１８３は明確化のために示されていない。アミノ酸の位置は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡに基づいて番号付けされている。（Ａ）アンブレラ様トポロジーにおける長いα２−６とのＳＣ１８ ＨＡの相互作用が示される。Ｌｙｓ２２２、Ａｓｐ２２５、およびＧｌｎ２２６は塩基領域との接触を提供し、Ａｓｐ１９０、Ｇｌｎ１９２、およびＳｅｒ１９３は、拡張領域との接触を提供する。（Ｂ）長いα２−６とのＮＹ１８ ＨＡの相互作用は、塩基領域とのＡｓｐ２２５の接触の損失を示す（（Ａ）におけるＳＣ１８ ＨＡの場合において観察されるように）。（Ｃ）コーン様トポロジーにおけるα２−３とのＡＶ１８ ＨＡの相互作用は、コーン様トポロジーとのＨＡの相互作用が、長いα２−６のアンブレラ様トポロジーのそれとは対照的に、塩基におけるＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの糖のみとの接触を含むことを示す。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６は、これらの糖との最適な接触を提供するように配置される。ＡＶ１８におけるＧｌｕ１９０の側鎖コンホメーションは、ＡＰＲ３４ ＨＡ−α２−３共結晶構造中のＧｌｕ１９０のそれに基づいて割り当てられた。（Ｄ）ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの間の鍵となるアミノ酸の位置の違いが、それらをＡＳＩ３０ ＨＡおよびＡＰＲ３４ ＨＡと比較して示される。 多価ＨＡ−グリカン相互作用を捕捉するための結合アッセイ。図に示すのは、連続結合アッセイと、一次抗体（ｐＡｂ）および標識された二次抗体（ｓＡｂ）とのＨＡ単位の事前の複合体生成の間の結合シグナルの比較である。多価ＨＡ−グリカン相互作用を研究するために、代表的なビオチン化α２−３およびα２−６（短いおよび長い）グリカンを含むストレプトアビジンプレートアレイが使用された。ストレプトアビジンコートされた高結合能（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ）３８４ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、各ウェルの全容量まで、ビオチン化グリカン（３’ＳＬＮ、６’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、６’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ）を負荷した。このプレートアレイのウェル中のグリカンの空間配置は、ＨＡ単位の中の３つのＨＡモノマーの１つのみへの結合に有利に働く。グリカンの間隔およびＨＡ単位のサイズは、ＨＡ単位、一次抗体、および二次抗体の連続適用を含むＥＬＩＳＡ型結合アッセイにおける単一のグリカンへのＨＡ単位結合を制限する。連続アッセイの条件は、１：１：１の比率でのＨＡ：ｐＡｂ：ｓＡｂの形成に有利に働く。標識されたｓＡｂの豊富さにも関わらず（ＨＡ単位あたり１）、４０μｇ／ｍｌの高ＨＡ濃度においてでさえ観察された最小結合シグナルは、ＨＡ単位への単一のグリカンの低親和性結合を支持する（シアン円）。逆に、一次抗体および二次抗体とのＨＡ単位の事前の複合体化は（ＨＡ：一次抗体：二次抗体＝４：２：１の比率）、４ＨＡ単位の特定の空間的配置を容易にする。従って、この事前複合体化単位は、多価を介してグリカン結合親和性に対して、複数ＨＡ単位の相対的空間配置の効果の研究を可能にした。この空間配置は、事前複合体化ＨＡ単位あたり４結合事象が存在する場合（各事象はシアン円によって示される）、６’ＳＬＮ−ＬＮへの結合の８倍の増加によって示されるように、多価を介してグリカン結合シグナルを増強する。結合シグナルは、ＨＲＰ活性に基づいて決定された。すべてのアッセイは３連で実施された。グリカンについての説明：３’ＳＬＮ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；６’ＳＬＮ（短α２−６）：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；３’ＳＬＮ−ＬＮ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；６’ＳＬＮ−ＬＮ（長α２−６）：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ：Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ。 図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
図１９〜２１は、Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量依存性直接的結合である。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を４：２：１の比率で含むストック溶液を調製し、２０分間氷上でインキュベートした。適切な量の事前複合体化ストックＨＡを、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡを用いて２５０μｌに希釈した。５０μｌの事前複合体化ＨＡを、グリカンコートした各々のウェルに加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行った。結合親和性を定量するために、以下のモデルに基づいて、結合パラメーターＫ_ｄ’を定義し、計算した。典型的な型のＨｉｌｌ式を使用して多価結合を表現する：

これは、線形化に際し、次のようになる：

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された。典型的には、ｎ≧１は正の協同性を示し、ここで、１つのＨＡ単位の結合は事前複合体における他のＨＡ単位の結合を増強する。他方、ｎ≦１は負の協同性を示し、ここで、事前複合体中の１つのＨＡ単位の結合は、他のサブユニットの結合に対する負の効果を有する。見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、主として、異なるグリカンに対する異なるＨＡの相対的な結合親和性を定量するために使用され、従って、その絶対値は、親和性を比較する状況において取り込まれるべきである。上記のモデルにおける仮定は、プレートの各ウェル中のグリカンがＨＡを超えて存在することである。この仮定を満たすために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲についての結合シグナルは、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用された。すべての効率的にヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡは、高い親和性で長いα２−６グリカン（６’ＳＬＮ−ＬＮ）に結合する。ヒト適合したＳＣ１８およびＴＸ９１ Ｈ１Ｎ１ウイルスは、フェレットモデルにおいて効率的に伝染する。ヒト適合したＭｏｓ９９ Ｈ３Ｎ２ウイルスはワクチン株である。ＮＹ１８（ＳＣ１８の単一Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体、非効率的に伝染するウイルス）からのＨＡは、高濃度で、他の効率的にヒト適合したＨＡに比較し得るα２−６結合を示すが、これは、劇的により低い、長いα２−６の結合親和性を有する。逆に、ＡＶ１８（ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体、伝染しないウイルス）からのＨＡは、α２−３への高結合親和性の逆転した傾向を示す。
ヒト気管切片へのＳＣ１８およびＮＹ１８のＨＡの結合。気管上皮の先端側は、すべての切片において白色矢印で示される。ＳＣ１８ ＨＡの結合パターンは、先端側上の特定の領域周辺に局在している。ＮＹ１８ ＨＡは、十分に分布した先端結合パターンを示す（ＰＩは赤色に対して、ＨＡは緑色である）。ＮＹ１８ ＨＡは、ＭＡＬ−ＩＩ染色パターンによって決定されるように、α２−３グリカンを発現する上皮の内部領域上での有意な染色を示す。 ジャカリンを用いるＳＣ１８およびＮＹ１８のＨＡのヒト気管同時染色。気管上皮の先端側は、すべての切片において白色矢印で示される。ＳＣ１８およびＮＹ１８の識別できる先端結合パターンは（図２２）、ＨＡ（赤色）を、杯細胞のマーカーであるジャカリン（緑色）を用いて同時染色することによってさらに精緻化する。先端側の代表的な領域は、明確化のために拡大されている。ジャカリン（黄色）を用いるＳＣ１８ ＨＡの顕著な同時染色は、ＳＣ１８ ＨＡが上皮の先端側上の杯細胞に優先的に結合することを示す。ＮＹ１８ ＨＡの結合パターンは、ジャカリンのそれと最小限の重複を有し、このことは、これが気管組織の先端側上では杯細胞に結合しないことを示す。

ＨＡ配列エレメントの説明
ＨＡ配列エレメント１
ＨＡ配列エレメント１は、天然のインフルエンザ単離物において見い出される多くのＨＡタンパク質の残基９７−１８５（ここで、残基の位置は、Ｈ３ ＨＡを参照として使用して割り当てられる）にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは以下の基本構造を有する：
Ｃ（Ｙ／Ｆ）Ｐ Ｘ_１ Ｃ Ｘ_２ Ｗ Ｘ_３ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１は約３０〜約４５アミノ酸長であり；
Ｘ_２は約５〜約２０アミノ酸長であり；
Ｘ_３は約２５〜約３０アミノ酸長であり；および
Ｘ_４は約２アミノ酸長である。

ある実施形態において、Ｘ_１は、約３５〜約４５、または約３５〜約４３、または約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、または約４３アミノ酸長である。ある実施形態において、Ｘ_２は、約９〜約１５、または約９〜約１４、または約９、約１０、約１１、約１２、約１３、または約１４アミノ酸長である。ある実施形態において、Ｘ_３は、約２６〜約２８、または約２６、約２７、または約２８アミノ酸長である。ある実施形態において、Ｘ_４は配列（Ｇ／Ａ）（Ｉ／Ｖ）を有する。ある実施形態において、Ｘ_４は配列ＧＩを有する；ある実施形態において、Ｘ_４は配列ＧＶを有する；ある実施形態において、Ｘ_４は配列ＡＩを有する；ある実施形態において、Ｘ_４は配列ＡＶを有する。ある実施形態において、ＨＡ配列エレメント１はジスルフィド結合を含む。ある実施形態において、このジスルフィド結合は、９７位および１３９位（本明細書で利用される標準的なＨ３番号付け系に基づく）に対応する残基を架橋する。

ある実施形態において、かつ特にＨ１ポリペプチドにおいて、Ｘ_１は約４３アミノ酸長、および／またはＸ_２は約１３アミノ酸長、および／またはＸ_３は約２６アミノ酸長である。

ある実施形態において、かつ特にＨ１ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
Ｃ Ｙ Ｐ Ｘ_１Ａ Ｔ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）Ｃ Ｘ_２ Ｗ Ｘ_３ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１Ａは約２７〜約４２、または約３２〜約４２、または約３２〜約４０、または約２６〜約４１、または約３１〜約４１、または約３１〜約３９、または約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０アミノ酸長であり、かつＸ_２−Ｘ_４は上記と同様である。

ある実施形態において、かつ特にＨ１ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
Ｃ Ｙ Ｐ Ｘ_１Ａ Ｔ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）Ｃ Ｘ_２ Ｗ（Ｉ／Ｌ）（Ｔ／Ｖ）Ｘ_３Ａ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１Ａは約２７〜約４２、または約３２〜約４２、または約３２〜約４０、または約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０アミノ酸長であり、
Ｘ_３Ａは約２３〜約２８、または約２４〜約２６、または約２４、約２５、または約２６アミノ酸長、かつＸ_２およびＸ_４は上記と同様である。

ある実施形態において、かつ特にＨ１ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の配列を有する：
Ｑ Ｌ Ｓ Ｓ Ｉ Ｓ Ｓ Ｆ Ｅ Ｋ、
典型的には、Ｘ_１の範囲内、（Ｘ_１Ａの範囲内を含む）、とりわけ、Ｘ_１のおよそ残基１２で開始する（例えば、図１〜３に図示されるように）。

ある実施形態において、かつ特にＨ３ポリペプチドにおいて、Ｘ_１は約３９アミノ酸長、および／またはＸ_２は約１３アミノ酸長、および／またはＸ_３は約２６アミノ酸長である。

ある実施形態において、かつ特にＨ３ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
Ｃ Ｙ Ｐ Ｘ_１Ａ Ｓ（Ｓ／Ｎ）（Ａ／Ｓ）Ｃ Ｘ_２ Ｗ Ｘ_３ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１Ａは約２７〜約４２、または約３２〜約４２、または約３２〜約４０、または約２３〜約３８、または約２８〜約３８、または約２８〜約３６、または約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０アミノ酸長であり、かつＸ_２−Ｘ_４は上記と同様である。

ある実施形態において、かつ特にＨ３ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
Ｃ Ｙ Ｐ Ｘ_１Ａ Ｓ（Ｓ／Ｎ）（Ａ／Ｓ）Ｃ Ｘ_２ Ｗ Ｌ（Ｔ／Ｈ）Ｘ_３Ａ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１Ａは約２７〜約４２、または約３２〜約４２、または約３２〜約４０、または約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０アミノ酸長であり、
Ｘ_３Ａは約２３〜約２８、または約２４〜約２６、または約２４、約２５、または約２６アミノ酸長であり、かつＸ_２およびＸ_４は上記と同様である。

ある実施形態において、かつ特にＨ３ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の配列を有する：
（Ｌ／Ｉ）（Ｖ／Ｉ）Ａ Ｓ Ｓ Ｇ Ｔ Ｌ Ｅ Ｆ、
典型的には、Ｘ_１の範囲内、（Ｘ_１Ａの範囲内を含む）、とりわけ、Ｘ_１のおよそ残基１２で開始する（例えば、図１、２、および４に図示されるように）。

ある実施形態において、かつ特にＨ５ポリペプチドにおいて、Ｘ_１は約４２アミノ酸長、および／またはＸ_２は約１３アミノ酸長、および／またはＸ_３は約２６アミノ酸長である。

ある実施形態において、かつ特にＨ５ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
Ｃ Ｙ Ｐ Ｘ_１Ａ Ｓ Ｓ Ａ Ｃ Ｘ_２ Ｗ Ｘ_３ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１Ａは約２７〜約４２、または約３２〜約４２、または約３２〜約４０、または約２３〜約３８、または約２８〜約３８、または約２８〜約３６、または約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０アミノ酸長であり、かつＸ_２−Ｘ_４は同様である。

ある実施形態において、かつ特にＨ５ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の構造を有する：
Ｃ Ｙ Ｐ Ｘ_１Ａ Ｓ Ｓ Ａ Ｃ Ｘ_２ Ｗ Ｌ Ｉ Ｘ_３Ａ Ｗ Ｘ_４ Ｈ Ｈ Ｐ、ここで：
Ｘ_１Ａは約２７〜約４２、または約３２〜約４２、または約３２〜約４０、または約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０アミノ酸長であり、かつ
Ｘ_３Ａは約２３〜約２８、または約２４〜約２６、または約２４、約２５、または約２６アミノ酸長であり、かつＸ_２およびＸ_４は上記と同様である。

ある実施形態において、かつ特にＨ５ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の配列によって拡張される（すなわち、残基１８６−１９３に対応する位置において）：
Ｎ Ｄ Ａ Ａ Ｅ Ｘ Ｘ（Ｋ／Ｒ）。

ある実施形態において、かつ特にＨ５ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント１は以下の配列を有する：
Ｙ Ｅ Ｅ Ｌ Ｋ Ｈ Ｌ Ｘ Ｓ Ｘ Ｘ Ｎ Ｈ Ｆ Ｅ Ｋ、
典型的には、Ｘ_１の範囲内、とりわけ、Ｘ_１のおよそ残基６で開始する（例えば、図１、２、および５に図示されるように）。

ＨＡ配列エレメント２
ＨＡ配列エレメント２は、天然のインフルエンザ単離物において見い出される多くのＨＡタンパク質の残基３２４−３４０（Ｈ３ ＨＡに基づく番号付け系を再度使用する）にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは以下の基本構造を有する：
Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｇ Ｆ Ｉ Ｅ。

ある実施形態において、ＨＡ配列エレメント２は以下の配列を有する：
Ｐ Ｘ_１Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｇ Ｆ Ｉ Ｅ、ここで：
Ｘ_１は約４〜約１４アミノ酸長、または約８〜約１２アミノ酸長、または約１２、約１１、約１０、約９、または約８アミノ酸長である。ある実施形態において、この配列エレメントはＨＡ０切断部位を提供し、これは、ＨＡ１およびＨＡ２の産生を可能にする。

ある実施形態において、かつ特にＨ１ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント２は以下の構造を有する：
Ｐ Ｓ （Ｉ／Ｖ）Ｑ Ｓ Ｒ Ｘ_１Ａ Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｇ Ｆ Ｉ Ｅ、ここで：
Ｘ_１Ａは約３アミノ酸長であり；ある実施形態において、Ｘ_１ＡはＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。

ある実施形態において、かつ特にＨ３ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント２は以下の構造を有する：
Ｐ Ｘ Ｋ Ｘ Ｔ Ｒ Ｘ_１Ａ Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｇ Ｆ Ｉ Ｅ、ここで：
Ｘ_１Ａは約３アミノ酸長であり；ある実施形態において、Ｘ_１ＡはＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。

ある実施形態において、かつ特にＨ５ポリペプチドにおいて、ＨＡ配列エレメント２は以下の構造を有する：
Ｐ Ｑ Ｒ Ｘ Ｘ Ｘ Ｒ Ｘ Ｘ Ｒ Ｘ_１Ａ Ｇ Ａ Ｉ Ａ Ｇ Ｆ Ｉ Ｅ、ここで：
Ｘ_１Ａは約３アミノ酸長であり；ある実施形態において、Ｘ_１ＡはＧ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。

定義
親和性：当該分野において公知であるように、「親和性」とは、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する堅固さの尺度である。親和性は異なる方法で測定することが可能である。

約：本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、言及される参照値と同様である値をいう。特定の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、他に言及されないかまたは状況から他に明白でない限り、両方の方向で（その値よりも大きいかまたは小さい）、言及された値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内にある一定範囲の値をいう（そのような数値は、可能性がある値の１００％を超えるようなものを除く）。

生物学的に活性である：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性である」という語句が、生物系、特に生命体において活性を有する任意の薬剤の特徴をいう。例えば、生物に投与されたときに、その生物に対して生物学的な効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分が、典型的には、「生物学的に活性である」部分と呼ばれる。

特徴的な部分：本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリペプチドの「特徴的な部分」という語句は、共にタンパク質またはポリペプチドに特徴的である、アミノ酸の連続するストレッチ、またはアミノ酸の連続するストレッチのコレクションを含むものである。このような連続するストレッチの各々は、少なくとも２つのアミノ酸を含む。さらに、当業者は、典型的には、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個またはそれ以上のアミノ酸が、タンパク質に特徴的であるために必要とされることを認識している。一般的に、特徴的な部分は、上記に特定された配列同一性に加えて、関連するインタクトなタンパク質と少なくとも１つの機能的な特徴を共有する。

特徴的な配列：「特徴的な配列」は、ポリペプチドまたは核酸のファミリーのすべてのメンバーにおいて見い出される配列であり、それゆえに、ファミリーのメンバーを規定するために、当業者によって使用可能である。

コーン−トポロジー：「コーン−トポロジー」という語句は、特定のグリカン、特に、ＨＡ受容体上のグリカンによって採用される三次元配置をいうために本明細書で使用される。図６（左側のパネル）に図示されるように、コーン−トポロジーは、α２−３シアル化グリカンまたはα２−６シアル化グリカンによって採用可能であり、短いオリゴヌクレオチド鎖に典型的であるが、ある長いオリゴヌクレオチドもまた、このコンホメーションを採用することができる。コーン−トポロジーは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合のグリコシドのねじれ角によって特徴付けられ、この結合は、約−６０、約６０、または約１８０のφ（Ｃ_１−Ｃ_２−Ｏ−Ｃ_３／Ｃ_６）値によって与えられる最小エネルギーコンホメーションの３つの領域をサンプリングし、Ψ（Ｃ_２−Ｏ−Ｃ_３／Ｃ_６−Ｈ_３／Ｃ_５）は−６０〜６０をサンプリングする（図７）。図８は、コーン−トポロジーを採用するグリカンの特定の代表的な（しかし、包括的ではない）例を提示する。

「に対応する」：本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、しばしば、ＨＡポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置／同一性を指定するために使用される。当業者は、単純化の目的のために、標準的な番号付け系（野生型Ｈ３ ＨＡに基づく）が本発明で利用され（例えば、図１〜５に図示されるように）、その結果、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸は、実際に特定のアミノ酸鎖における１９０番目のアミノ酸である必要はないが、むしろ、野生型Ｈ３ ＨＡの１９０位に見い出される残基に対応することを認識している；当業者は、対応するアミノ酸をいかにして同定するかを容易に認識する。

分離距離の程度：本明細書で使用される場合、一定の「分離距離の程度」であるアミノ酸は、グリカン結合に間接的な効果を有するＨＡアミノ酸である。例えば、分離距離の程度が１度のアミノ酸は、（１）直接結合しているアミノ酸と相互作用するか；および／または（２）他のやり方で、直接結合しているアミノ酸が、宿主細胞ＨＡ受容体と結合しているグリカンと相互作用する能力に影響を与えるかのいずれかであり得る；このような分離距離の程度が１度のアミノ酸は、グリカンそれ自体に直接的に結合してもよく、直接結合しなくてもよい。分離距離の程度が２度のアミノ酸は、（１）分離距離の程度が１度のアミノ酸と相互作用するか；および／または（２）他のやり方で、分離距離の程度が１度のアミノ酸が、直接結合しているアミノ酸と相互作用する能力に影響を与えるかのいずれかであり得る、以下同様である。

直接結合しているアミノ酸：本明細書で使用される場合、「直接結合しているアミノ酸」という語句は、宿主細胞ＨＡ受容体と結合している１つ以上のグリカンと直接的に相互作用するＨＡポリペプチドのアミノ酸をいう。

操作された：「操作された」という用語は、本明細書で使用される場合、そのアミノ酸配列が人によって選択されているポリペプチドを説明する。例えば、操作されたＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ単離物において見い出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、操作されたＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベースに含まれるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。

Ｈ１ポリペプチド：「Ｈ１ポリペプチド」とは、この用語が本明細書で使用される場合、そのアミノ酸配列が、Ｈ１に特徴的でありかつＨ１を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なこのような配列エレメントは、アラインメント、例えば、図１〜３に図示されるものなどによって決定可能であり、これには、例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ１特異的な実施形態に関して本明細書に記載されるものが含まれる。

Ｈ３ポリペプチド：「Ｈ３ポリペプチド」とは、この用語が本明細書で使用される場合、そのアミノ酸配列が、Ｈ３に特徴的でありかつＨ３を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なこのような配列エレメントは、アラインメント、例えば、図１、２、および４に図示されるものなどによって決定可能であり、これには、例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ３特異的な実施形態に関して本明細書に記載されるものが含まれる。

Ｈ５ポリペプチド：「Ｈ５ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、そのアミノ酸配列が、Ｈ５に特徴的でありかつＨ５を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも１つの配列エレメントを含むＨＡポリペプチドである。代表的なこのような配列エレメントは、アラインメント、例えば、図１、２、および５に図示されるものなどによって決定可能であり、これには、例えば、ＨＡ配列エレメントのＨ５特異的な実施形態に関して本明細書に記載されるものが含まれる。

ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ヘマグルチニンポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）という用語は、そのアミノ酸配列がＨＡに特徴的な少なくとも１つの配列を含むポリペプチドをいう。インフルエンザ単離物からの広範な種々のＨＡ配列が当該分野において公知であり；確かに、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）はデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ｆｌｕ．ｈｔｍｌ）を維持しており、これは、本願の出願の時点で、９７９６個のＨＡ配列を含んでいた。当業者は、このデータベースを参照して、一般的にＨＡポリペプチドに特徴的である配列、および／もしくは特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のポリペプチド）に特徴的である配列、または特定の宿主、例えば、鳥類、ラクダ、イヌ、ネコ、ハクビシン、環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ストーンマーチン（ｓｔｏｎｅ ｍａｒｔｉｎ）、ブタ、トラ、クジラなどの感染を媒介するＨＡに特徴的である配列を容易に同定することができる。例えば、ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物において見い出されるＨＡタンパク質のおよそ残基９７と１８５の間、３２４と３４０の間、９６と１００の間、および／または１３０と２３０の間で見い出される１つ以上の特徴的な配列エレメントを含む。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、本明細書に定義されるようなＨＡ配列エレメント１および２の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、ＨＡ配列エレメント１および２を含むアミノ酸配列を有し、ある実施形態において、これらの配列は、約１００〜約２００、または約１２５〜約１７５、または約１２５〜約１６０、または約１２５〜約１５０、または約１２９〜約１３９、または約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、または約１３９アミノ酸、互いから離れている。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、グリカン結合に関与する領域９６−１００位および／または１３０−２３０位の中の位置の残基を含むアミノ酸配列を有する。例えば、多くのＨＡポリペプチドは、以下の残基：Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、およびＬｅｕ／Ｉｌｅ１９４の１つ以上を含む。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、これらの残基の少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つすべてを含む。本明細書で使用される場合、「ＨＡポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する（すなわち、少なくとも２アミノ酸以上を含むアミノ酸鎖）。

単離された：「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）最初に産生されたときに（天然であるかまたは実験的設定であるかに関わらず）、それが付随していた成分の少なくともいくつかから分離されているか；または（ｉｉ）人の手によって製造されたかのいずれかである、因子または実体をいう。単離された因子または実体は、それらが最初に付随していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離されてもよい。ある実施形態において、単離された因子は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より純度が高い。

長いオリゴサッカリド：本開示の目的のために、オリゴサッカリドが少なくとも４個のサッカリド残基を有する少なくとも１つの直鎖を含む場合に、オリゴサッカリドは、典型的には「長い」と見なされる。

非天然アミノ酸：「非天然アミノ酸」という語句は、アミノ酸（すなわち：

）の化学構造を有し、それゆえに、少なくとも２つのペプチド結合に関与可能であるが、天然に見い出されるものとは異なるＲ基を有する実体をいう。ある実施形態において、非天然アミノ酸は、水素ではない第２のＲ基もまた有してもよく、および／またはアミノ部分もしくはカルボン酸部分に１つ以上の他の置換基を有してもよい。

ポリペプチド：「ポリペプチド」は、一般的に言えば、ペプチド結合によって互いに結合されている少なくとも２つのアミノ酸のストリングである。ある実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも３〜５個のアミノ酸を含んでもよく、その各々が、少なくとも１つのペプチド結合によって他と結合されている。当業者は、ポリペプチドが、時折、「非天然」アミノ酸または他の実体であるが、それにも関わらず、任意にポリペプチド鎖に組込みが可能であるものを含むことを認識している。

純粋：本明細書で使用される場合、因子または実体は、それが実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。例えば、特定の因子または実体の約９０％より多くを含む調製物は、典型的には、純粋な調製物であると見なされる。ある実施形態において、因子または実体は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。

短いオリゴサッカリド：本開示の目的のために、オリゴサッカリドが、任意の直鎖中に４個よりも少ない、または確かに３個よりも少ない残基を有する場合に、オリゴサッカリドは、典型的には「短い」と見なされる。

特異性：当該分野において公知であるように、「特異性」は、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）が、その結合パートナー（例えば、ヒトＨＡ受容体、特に、ヒト上気道ＨＡ受容体）を、他の潜在的な結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）から区別する能力の尺度である。

被験体：本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」という用語は、例えば、実験的、診断的、予防的、および／または治療的な目的のために、本発明の組成物が投与され得る任意の生物をいう。典型的な被験体には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳動物；昆虫；ぜん虫（ｗｏｒｍ）など）が含まれる。

実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体のまたはほぼ全体の範囲または程度を示す定性的な状態をいう。生物学的分野における当業者は、生物学的および化学的な現象が、もしあるとしても、完了まで行き、および／もしくは完了まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することがまれであることを理解している。それゆえに、「実質的」という用語は、多くの生物学的なおよび化学的な現象において固有である完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。

罹患している：インフルエンザ感染に「罹患している」個体は、インフルエンザ感染の１つ以上の徴候で診断されているか、またはその徴候を示す。

感受性がある：インフルエンザ感染に「感受性がある」個体は、インフルエンザ感染と診断されていないか、および／またはインフルエンザ感染の徴候を示していないかもしれない。ある実施形態において、インフルエンザ感染に感受性がある個体は、インフルエンザ感染を発症する。ある実施形態において、インフルエンザ感染に感受性がある個体は、インフルエンザ感染を発症しない。

治療剤：本明細書で使用される場合、「治療剤」という語句は、被験体に投与された場合に、所望の生物学的または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤をいう。

治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、インフルエンザ感染に罹患しているか、またはインフルエンザ感染に感受性である被験体に投与された場合に、インフルエンザ感染および／またはその徴候を処置し、診断し、予防し、および／またはその発症を遅延させるために十分である本発明のグリカンデコイの量を意味する。

処置：本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」は、特定の疾患、障害、および／もしくは状態（例えば、インフルエンザ感染）の１つ以上の徴候もしくは特徴を部分的もしくは完全に軽減し、改善し、緩和し、阻害し、予防し、その発症を遅延させ、その徴候もしくは特徴の重篤度を減少させ、および／またはその徴候もしくは特徴の発生率を減少させるために使用される任意の方法をいう。処置は、疾患に付随する病理を発症するリスクを減少させる目的のために、その疾患の徴候を示さないか、および／またはその疾患の初期の徴候のみを示す被験体に投与されてもよい。

アンブレラ−トポロジー：「アンブレラ−トポロジー」という語句は、特定のグリカンによって、特に、ＨＡ受容体上の特定のグリカンによって採用される三次元配置をいうために本明細書で使用される。本発明は、アンブレラ−トポロジーグリカンへの結合が、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡタンパク質の特徴であるという認識を包含する。図６（右のパネル）に図示されるように、アンブレラ−トポロジーは、典型的には、α２−６シアル化グリカンによってのみ採用され、長い（例えば、テトラサッカリドよりも長い）オリゴサッカリドに典型的である。アンブレラ−トポロジーの１つの例は、−６０周辺のＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合のφ角によって与えられる（例えば、図７を参照のこと）。図９は、特定の代表的な（しかし、包括的でない）グリカンの例が、アンブレラ−トポロジーを採用できることを提示する。アンブレラ−トポロジーグリカンは、アンブレラ−トポロジーグリカンを有するＨＡ受容体へのインフルエンザウイルスの結合を阻害するためのデコイとして使用可能である。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、以下の型のオリゴサッカリドである：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
ここで：
（ａ）Ｎｅｕ５Ａｃ α２−６は、典型的には（しかし、本質的にではなく）、非還元末端にあり；
（ｂ）Ｓｕｇ１は：
（ｉ）αまたはβ配座の（頻繁には、ＮおよびＯ連結拡張についてはβであり、糖タンパク質へのＯ連結であるＧａｌＮＡｃα−の場合にはαである）ヘキソース（頻繁には、ＧａｌまたはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）であり；
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖は、Ｓｕｇ１の非還元位置のいずれにも結合されておらず（Ｓｕｇ１が、糖タンパク質にＯ連結されているＧａｌＮＡｃα−である場合を除く）；および／または
（ｉｉｉ）硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどのような非糖部分が、Ｓｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合可能であり（例えば、ＨＡとの接触を改善する）；
（ｃ）Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３は：
（ｉ）αまたはβ配座の（頻繁にはβである）ヘキソース（頻繁には、ＧａｌまたはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）であり；ならびに／あるいは
（ｉｉ）糖（Ｆｕｃなど）または硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどのような非糖部分が、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／またはＳｕｇ４の非還元位置に結合可能であり；
（ｄ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合を除いたオリゴサッカリドにおける任意の２つの糖の間の結合は、１−２、１−３、１−４、および／または１−６（典型的には、１−３または１−４）であり得；ならびに／あるいは
（ｅ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が連結された構造が、糖タンパク質にＯ連結されているＧａｌＮＡｃαであり、さらなる糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端、例えば、
（ｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
に連結されている。

ワクチン接種：本明細書で使用される場合、「ワクチン接種」という用語は、例えば、疾患を引き起こす因子に対する免疫応答を生成することが意図される組成物の投与をいう。本発明の目的のために、ワクチン接種は、疾患を引き起こす因子への曝露の前、その間、および／またはその後に投与可能であり、特定の実施形態において、因子への曝露の前、その間、またはその直後に投与可能である。ある実施形態において、ワクチン接種には、適切に時間間隔をあけた、ワクチン接種組成物の複数回投与が含まれる。

改変体：本明細書で使用される場合、「改変体」という用語は、目的の特定のＨＡポリペプチドと、その配列が比較される「親の」ＨＡポリペプチドとの間の関連性を説明する相対的用語である。目的のＨＡポリペプチドが、親のアミノ酸配列と同一であるが特定の位置において少ない数の配列の変化があるアミノ酸配列を有する場合、その目的のＨＡポリペプチドは親のＨＡポリペプチドの「改変体」であると見なされる。典型的には、改変体における２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％より少ない残基が、親と比較した場合に置換されている。ある実施形態において、改変体は、親と比較した場合に、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個の置換された残基を有する。しばしば、改変体は、非常に少ない数の（例えば、５個、４個、３個、２個、または１個よりも少ない）置換された官能基の残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有する。さらに、改変体は、典型的には、５個、４個、３個、２個、または１個を超えない付加または欠失を有し、親と比較した場合に、しばしば、付加または欠失を有しない。さらに、任意の付加または欠失は、典型的には、約２５個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個の残基よりも少なく、一般的には、約５個、約４個、約３個、または約２個の残基よりも少ない。ある実施形態において、親のＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物（例えば、野生型ＨＡ）において見い出されるものである。

ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、それが連結された別の核酸を輸送可能である核酸分子をいう。ある実施形態において、ベクターは、それらが真核細胞または原核細胞などの宿主細胞に連結された核酸の染色体外複製および／または発現が可能である。作動可能に連結された遺伝子の発現の方向付けが可能であるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

野生型：当該分野において理解されているように、「野生型」という語句は、一般的には、天然に見い出されるような、タンパク質または核酸の通常の型をいう。例えば、野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物において見い出される。種々の異なる野生型ＨＡ配列が、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌにおいて見い出され得る。

発明の特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、インフルエンザＨＡポリペプチドと、アンブレラ−トポロジーグリカンとの間の相互作用がインフルエンザ感染を媒介するという認識を包含する。本発明は、アンブレラ−トポロジーグリカンを模倣する薬剤が「受容体デコイ」として作用できること、そしてインフルエンザ感染の処置における治療剤として有用であり得るという認識をさらに包含する。

とりわけ、本発明は、アンブレラ−トポロジーグリカンを模倣し、かつ被験体におけるＨＡポリペプチドとＨＡ受容体の間の相互作用と競合する薬剤を同定するためのシステムを提供する。本発明はさらに、種々の薬剤、およびそれらを含む組成物、ならびにインフルエンザ感染の処置のための治療ストラテジーを提供する。本発明は、ＨＡ−受容体相互作用を特徴付けるためのシステム（例えば、検出アッセイ）、およびＨＡ−受容体相互作用に影響を与える薬剤を提供する。

ＨＡ受容体
ＨＡは、糖タンパク質受容体に結合することによって、細胞の表面と相互作用する。ＨＡ受容体へのＨＡの結合は、ＨＡ受容体上のＮ連結グリカンによって優先的に媒介される。詳細には、インフルエンザウイルス粒子の表面上のＨＡは、細胞宿主の表面上のＨＡ受容体に結合されるシアル化グリカンを認識する。認識および結合の後で、宿主細胞は、ウイルス粒子（ｃｅｌｌ）を飲み込み、このウイルスは、より多くのウイルス粒子を複製および産生し、隣の細胞に分配されることが可能である。例示的なＨＡ−グリカン相互作用のいくつかの結晶構造が同定され、表１に提示される。

ＨＡ受容体は、受容体のＨＡ−結合部位の近傍で、α２−３またはα２−６のいずれかのシアル化グリカンによって修飾され、受容体結合グリカンの連結の型は、受容体のＨＡ−結合部位のコンホメーションに影響を与え、従って、異なるＨＡに対する受容体の特異性に影響を与え得る。

例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは狭い。本発明によれば、このポケットは、α２−３結合であるかまたはα２−６結合であるかに関わらず、α２−３シアル化グリカンのトランスコンホメーション、および／またはコーン−トポロジーグリカンに結合する。

トリ組織におけるＨＡ受容体、およびヒト深部肺および胃腸（ＧＩ）管組織におけるＨＡ受容体もまた、α２−３シアル化グリカン結合によって特徴付けられ、さらに（本発明に従って）、α２−３シアル化グリカンおよび／またはα２−６シアル化グリカンを含むグリカンによって特徴付けられ、これは、コーントポロジーを優先的に採用する。このようなコーントポロジーグリカンを有するＨＡ受容体は、本明細書ではＣＴＨＡｒと呼ばれ得る。

対照的に、上気道の気管支および気管におけるヒトＨＡ受容体は、α２−６シアル化グリカンによって修飾される。α２−３モチーフとは異なり、α２−６モチーフは、Ｃ_６−Ｃ_５結合に起因するコンホメーションのさらなる自由度を有する（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，２３：８５；参照により本明細書に援用される）。このようなα２−６シアル化グリカンに結合するＨＡは、このコンホメーションの自由度から生じる構造の多様性に適合するためにより開かれた結合ポケットを有する。さらに、本発明によると、ＨＡは、アンブレラ−トポロジーでグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン）に結合する必要がある可能性があり、特に、ヒト上気道組織の感染を効率的に媒介するために、強力な親和性および／または特異性でこのようなアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する必要がある可能性がある。このようなアンブレラ−トポロジーグリカンを有するＨＡ受容体は、本明細書ではＵＴＨＡｒと呼ばれてもよい。

これらの空間的に制限されたグリコシル化プロフィールの結果として、ヒトは、多くの野生型トリＨＡ（例えば、トリＨ５）を含むウイルスによって、通常は感染しない。詳細には、ウイルスに遭遇する可能性が最も高いヒト呼吸管の部分（すなわち、気管および気管支）は、コーン−トポロジーグリカン（例えば、α２−３シアル化グリカン、および／または短いグリカン）を有する受容体を欠いており、野生型トリＨＡは、典型的には、主としてまたは独占的に、コーン−トポロジーグリカン（例えば、α２−３シアル化グリカン、および／または短いグリカン）に付随する受容体に結合し、ヒトはまれにしかトリウイルスに感染状態にならない。アンブレラ−トポロジーグリカン（例えば、長いα２−６シアル化グリカン）を有する深部肺および／または胃腸管の受容体にウイルスがアクセス可能である、ウイルスとの十分に密接な接触にあるという場合のみ、ヒトは感染状態になる。

アンブレラ−トポロジーグリカン
２００７年８月１４日に出願された同時係属出願、シリアル番号１１／８９３，１７１（その全体の内容は付録Ａとして本明細書に添付される）に記載されているように、本発明者らは、インフルエンザウイルスによる哺乳動物（例えば、ヒト）被験体の感染は、ウイルスＨＡポリペプチドと、被験体におけるＨＡ受容体上のアンブレラ−トポロジーグリカンとの間の相互作用によって媒介されることを実証した。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン調製物は、短いα２−６（例えば、単一のラクトサミン）分枝よりも多い割合の、長い（例えば、複数のラクトサミン単位）α２−６オリゴサッカリド分枝を含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、短いα２−６（例えば、単一のラクトサミン）分枝よりも、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、または約５０倍より多くの長いα２−６オリゴサッカリド分枝を含む。図９は、例示的な、しかし、包括的ではない、長いα２−６モチーフのリストを提示する。図９において提示される長いα２−６モチーフは、生物学的なＮ連結グリカン、Ｏ連結グリカン、および糖脂質の一部として見い出される長い鎖（例えば、少なくともトリサッカリド）に非還元末端で連結されたＮｅｕ５Ａｃα２−６を含む。四角で囲った挿入部は、ＨＡと高い親和性で結合する生物学的グリカンの一部として見い出されるアンブレラ−トポロジーの長いα２−６グリカン部分の例を示す。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、図６（右のパネル）に提示されている構造のような三次元構造を示すグリカンである。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、図６（右のパネル）に提示されている構造と実質的に同様な三次元構造を示すグリカンである。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、図６（右のパネル）に示されているアミノ酸残基を介してＨＡポリペプチドと接触するグリカンである。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、図６（右のパネル）に示されているアミノ酸結合ポケットに接触するか、および／または特異的に結合することができるグリカンである。

ある実施形態において、グリカン構造トポロジーは、ＳｉａのＣ_２、ＧａｌのＣ_１、およびＧｌｃＮＡｃのＣ_１の間の角度として定義されるパラメーターθに基づいて分類される。θ＜１００°の値は、α２−３および短いα２−６グリカンによって採用されるコーン様トポロジーを表す。θ＞１１０°の値は、長いα２−６グリカンによって採用されるトポロジーのようなアンブレラ様トポロジーを表す（図６）。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンおよび／またはグリカンデコイとのＨＡ相互作用の独特な特徴は、非還元末端におけるシアル酸（ＳＡ）および／またはＳＡアナログを含むグリカンとのＨＡ接触である。ある実施形態において、オリゴサッカリドの鎖の長さは、少なくともトリサッカリドである（ＳＡまたはＳＡアナログを除く）。ある実施形態において、図６の右側のパネルに示される番号付けした残基の組み合わせは、アンブレラ様トポロジーとの接触に関与する。

ある実施形態において、シアル酸アナログは、Ｔｙｒ９８、Ｓｅｒ１３６、Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｔｈｒ１５５、Ｖａｌ１５５、Ｓｅｒ１５５、Ｈｉｓ１８３、およびＬｅｕ１９４が含まれるがこれらに限定されない、ＨＡ中の任意の高度に保存性のシアル酸アンカリングアミノ酸の１つ以上と相互作用する。これらの相互作用は、上記のアミノ酸の１つ以上との非共有結合的相互作用（例えば、イオン性、ファンデルワールス、疎水性など）または共有結合的相互作用を含んでもよい。例示的なシアル酸アナログは表２に示される。これらのシアル酸アナログのいくつかを含むグリカンへのＨＡの結合は報告されている（Ｋｅｌｍら、１９９２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：１４６；参照により本明細書に援用される）。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、哺乳動物上気道上皮細胞上で優先的に見い出されるグリカンである。発明者への注記：筆者がこの段落を読み直したときに、これはやや不明瞭であるように思える；筆者は自分が明確であると考えた変更を提案したが、しかし、発明者の再検討を評価する。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ヒト上気道上皮細胞上で優先的に見い出されるグリカンである。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、他の細胞上よりも、ヒト上気道細胞上で見い出される可能性が、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、または約５０倍より高いグリカンである。

特定の実施形態において、アンブレラ様トポロジーグリカンの構造的な特徴は、以下の規則に従って定義できる：
以下の型のオリゴサッカリド：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−Ｓｕｇ４−
ここで：
１．Ｎｅｕ５Ａｃ α２−６は、常にまたはほぼ常に、非還元末端にあり；
２．Ｓｕｇ１は：
ａ．αまたはβ配座（頻繁にはβ）のヘキソース（頻繁にはＧａｌまたはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）であり；
ｂ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖は、Ｓｕｇ１のいずれの非還元末端にも結合されるべきではなく；および／または
ｃ．硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどのような非糖部分は、Ｓｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合されて、ＨＡとの接触を改善することができ；
３．Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／またはＳｕｇ４は：
ａ．αまたはβ配座（頻繁にはβ）のヘキソース（頻繁にはＧａｌまたはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）であり；および／または
ｂ．糖（Ｆｕｃなど）または硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどのような非糖部分は、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／またはＳｕｇ４の非還元位置に結合でき；
４．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合を除いたオリゴサッカリドにおける任意の２つの糖の間の結合は、１−２、１−３、１−４、および／または１−６（典型的には１−３または１−４）であり得；ならびに／あるいは
５．Ｏ連結コアＧａｌＮＡｃに結合された６’ＳＬＮなどの、Ｓｕｇ４を伴わない構造

は、アンブレラ様トポロジーグリカンデコイの構造およびＨＡ接触の制約（図６）を潜在的に満足できた。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは以下の構造型：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３を有し、
ここで：
（ａ）Ｎｅｕ５Ａｃ α２−６は、典型的には（しかし、本質的にではなく）、非還元末端にあり；
（ｂ）Ｓｕｇ１は：
（ｉ）αまたはβ配座（頻繁には、ＮおよびＯ連結拡張についてはβ、糖タンパク質へのＯ連結であるＧａｌＮＡｃα−の場合においてはα）のヘキソース（頻繁にはＧａｌまたはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）であり；
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖は、Ｓｕｇ１のいずれの非還元位置にも結合されるべきではなく（Ｓｕｇ１が糖タンパク質へのＯ連結であるＧａｌＮＡｃα−である場合を除く）；および／または
（ｉｉｉ）硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどのような非糖部分は、Ｓｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合でき（例えば、ＨＡとの接触を改善する）；
（ｃ）Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３は：
（ｉ）αまたはβ配座（頻繁にはβ）のヘキソース（頻繁にはＧａｌまたはＧｌｃ）またはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）であり；および／または
（ｉｉ）糖（Ｆｕｃなど）または硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどのような非糖部分は、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、および／またはＳｕｇ４の非還元位置に結合でき；
（ｄ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合を除いたオリゴサッカリドにおける任意の２つの糖の間の結合は、１−２、１−３、１−４、および／または１−６（典型的には１−３または１−４）であり得；ならびに／あるいは
（ｅ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ連結されている連結ＧａｌＮＡｃαであり、さらなる糖が、ＧａｌＮＡｃαの非還元末端に連結されており、例えば、
（ｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−である。

上記の構造的な特徴を含む生理学的なＮ連結、Ｏ連結グリカンおよび糖脂質において共通して見い出されるオリゴサッカリドモチーフの例は、図９に示される。図９に提示されるアンブレラ−トポロジーグリカンは例示であり、包括的ではない。アンブレラ−トポロジーグリカン部分は、本明細書に記載されるアンブレラ−トポロジーグリカン部分の特徴のいずれかまたはすべてと矛盾しない任意のグリカン部分であり得る。

ある実施形態において、グリカンデコイは、上記の構造的な特徴を含む全体の複合体の生理学的なＮ連結、Ｏ連結グリカン（および糖タンパク質）および糖脂質を含んでもよい。ある実施形態において、デコイの三次元構造トポロジーは、図１０に示されるパラメーターθを使用して分類される。ある実施形態において、アンブレラ様トポロジーグリカンデコイと相互作用するＨＡのグリカン結合部位の残基の位置は、図６および１７に示される。例えば、特定の実施形態において、アンブレラ様トポロジーグリカンは、１３０ループ領域（１３０−１３９位）、１４０ループ領域（１４０−１４６位）、１５０ループ領域（１５３−１６０位）、１９０ループ−ヘリックス領域（１８３−１９６位）、および２２０ループ領域（２１９−２２８位）におけるＨＡアミノ酸と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれから構成される。例えば、特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１３１、１３３、１３６、１３７、１４３、１４４、１４５、１５３、１５５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９６、２２２、２２５、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１５６、１５９、１８９、１９２、１９３、１９６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１８６、１８７、１８９、１９０、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１３７、１４５、１９０、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１９０、２２２、２２５、２２６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１３６、１５３、１５５、１９４、およびこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１９０および２２６と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸２２２、２２５、および２２６と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１９０、１９２、１９３、および２２５と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１８６、１９３、および２２２と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。上記に言及したアミノ酸の位置はＨ３ ＨＡの番号付けに基づいていることに注意のこと。

ＨＡ−グリカン共結晶の分析は、ＨＡ結合部位に相対的なＮｅｕ５Ａｃの位置がほぼ不変であることを明らかにする。Ｎｅｕ５Ａｃとの接触は、Ｙ９８、Ｓ／Ｔ１３６、Ｗ１５３、Ｈ１８３、およびＬ／Ｉ１９４などの高度に保存性の残基を含む。他の糖との接触は、糖結合がα２−３であるかまたはα２−６であるか、およびグリカントポロジーがコーンであるかまたはアンブレラであるかに依存して、異なる残基を含む。例えば、コーントポロジーにおいて、主要な接触は、Ｎｅｕ５Ａｃ糖と、およびＧａｌ糖とである。Ｅ１９０およびＱ２２６は、この結合において特に重要な役割を果たす。他の位置（例えば、１３７、１４５、１８６、１８７、１９３、２２２）は、コーン構造への結合に関与し得る。ある場合において、異なる残基が、異なるグリカン構造との異なる接触を行い得る。これらの位置におけるアミノ酸の型は、グリカン構造中に異なる修飾および／または分枝パターンを有する受容体にＨＡポリペプチドが結合する能力に影響を与え得る。アンブレラトポロジーにおいて、接触は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの向こう側の糖となされる。ある実施形態において、１つ以上の位置（例えば、１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６）におけるアミノ酸残基が、アンブレラ構造への結合に関与し得る。ある場合において、異なる残基は、異なるグリカン構造との異なる接触を行い得る。これらの位置におけるアミノ酸の型は、グリカン構造中に異なる修飾および／または分枝パターンを有する受容体に、ＨＡポリペプチドが結合する能力に影響を与え得る。ある実施形態において、１９０位のＤ残基および／または２２５位のＤ残基は、アンブレラトポロジーへの結合に寄与する。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、アンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む任意の物質である。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、アンブレラ−トポロジーグリカン部分であるか、またはそれを含む（すなわち、任意の他の部分が付随しないアンブレラ−トポロジーグリカン部分）。ある実施形態において、キャリア部分は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、小分子、細胞、ウイルスなどを含むがこれらに限定されない、任意の型の物質を含んでもよい。ある実施形態において、キャリア分子に対するアンブレラグリカンの比率は（重量または数ベースで）、アンブレラトポロジーグリカンを有するヒトＨＡ受容体分子、例えば、天然に存在するヒトＨＡ受容体におけるグリカン対タンパク質の比率よりも大きい。例えば、キャリア分子は、アンブレラトポロジーグリカンを有する天然に存在するＨＡ受容体分子、例えば、天然に存在するヒトＨＡ受容体よりも、より多くのアンブレラグリカンを有し得る。ある実施形態において、キャリア分子に対するアンブレラグリカンの比率は（重量または数ベースで）、アンブレラトポロジーグリカンを有するヒトＨＡ受容体分子、例えば、天然に存在するヒトＨＡ受容体におけるグリカン対タンパク質の比率よりも小さい。１つの実施形態において、キャリア分子は１つより多くのアンブレラを提示し、そして提示されるようなグリカンは、アンブレラトポロジーグリカンを有する天然に存在するヒトＨＡ受容体上で見い出されるのと同様に、互いから間隔が離れている。他の実施形態において、グリカンは、アンブレラトポロジーグリカンを有する天然に存在するヒトＨＡ受容体上でのそれらの提示と比較して、より多く、またはより少なく、間隔が離れている。好ましい実施形態において、デコイは、少なくとも１アミノ酸残基が天然に存在するヒトＨＡと異なるＨＡポリペプチド上のアンブレラグリカンを含む。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ペプチドまたはポリペプチド部分および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡ受容体および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡ受容体の特徴的な部分および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ヒト上気道組織（例えば、気管および／または気管支）に由来しおよび／またはそこから得られたＨＡ受容体、ならびに少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ヒト上気道組織（例えば、気管および／または気管支）に由来しおよび／またはそこから得られたＨＡ受容体の特徴的な部分、ならびに少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。

アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ
ある実施形態において、「アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ」とは、ＨＡポリペプチドに結合するために十分な構造的な類似性をアンブレラ−トポロジーグリカンと共有している任意の物質をいう。ある実施形態において、「アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ」とは、ＨＡとアンブレラ−トポロジーグリカンとの相互作用を競合除外することが可能である任意の物質をいう。ある実施形態において、「アンブレラ様トポロジーグリカンデコイ」は、アンブレラ−トポロジーグリカンと相互作用可能であるＨＡのグリカン結合部位における残基のいずれかまたはすべて（個々の残基の任意の組み合わせを含む）と接触可能である任意の物質であり得る（例えば、図６および９を参照のこと）。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物であるかまたはそれを含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、グリカンであるかまたはグリカンを含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、アンブレラ−トポロジーグリカン部分であるかまたはそれを含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分（すなわち、任意の他の部分が付随しないアンブレラ−トポロジーグリカン部分）であるかまたはそれを含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン部分は、図６および９に示される構造のいずれかであるかそれと実質的に同様である構造を有する。

ある実施形態において、グリカンデコイは、「アンブレラ−トポロジーグリカン」という標題の上記の節に記載された構造的な特徴のいずれかまたはすべてによって規定される、全体の複合体の生理学的Ｎ連結および／またはＯ連結グリカン、糖タンパク質、および／または糖脂質を含んでもよい。ある実施形態において、デコイの三次元構造トポロジーは、図１０に示されるパラメーターθを使用して分類される。ある実施形態において、アンブレラ様トポロジーグリカンデコイと相互作用するＨＡのグリカン結合部位の残基の位置は、図６および１７に示される。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、小分子であるか小分子を含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ペプチド（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質など）であるか、またはそれを含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、脂質であるかまたは脂質を含む。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、核酸であるかまたは核酸を含む。

アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、アンブレラ−トポロジーグリカンへの結合に関与するかまたはそれが可能であるＨＡアミノ酸残基と相互作用が可能である任意の物質であり得る。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１３６、１３７、１４５、１５３、１５５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９６、２２２、２２５、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１５６、１５９、１８９、１９２、１９３、１９６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１８６、１８７、１８９、１９０、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１３７、１４５、１９０、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１９０、２２２、２２５、２２６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、ＨＡアミノ酸１３６、１５３、１５５、１９４、およびこれらの組み合わせと相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１９０および２２６と相互作用可能である任意の物質であるかまたはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸２２２、２２５、および２２６と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１９０、１９２、１９３、および２２５と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡアミノ酸１８６、１９３、および２２２と相互作用可能である任意の物質であるか、またはそれを含む。上記に言及したアミノ酸の位置はＨ３ ＨＡの番号付けに基づいていることに注意のこと。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、キャリア部分と物理的に結合しているアンブレラ−トポロジーグリカン模倣物（例えば、グリカン、ペプチド、小分子など）であるか、またはそれを含む。ある実施形態において、キャリアは、複数の個々のグリカン模倣物を有する。任意の特定の理論によって束縛されることは望まないが、本発明者らは、グリカンとそれらの結合パートナー（例えば、ＨＡポリペプチド）の間の複数の接触点が、特異的かつ／または安定な相互作用のために、容易にされまたは必要とさえされ得ることを提案する。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、キャリアと共有結合的に結合される。ある実施形態において、共有結合的結合は直接的である（例えば、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、直接的にキャリアに結合される）。ある実施形態において、共有結合的結合は間接的である（例えば、リンカーによって媒介される）。特定の実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカー（例えば、酵素活性、化学的切断、熱誘導性切断、ｐＨ誘導性切断、光誘導性切断などによって切断可能なリンカー）である。特定の実施形態において、リンカーは非切断性リンカーである。特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質またはペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子などを含む。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、キャリアと非共有結合的に結合される。ある実施形態において、非共有結合的な相互作用には、静電相互作用、親和性相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、双極子−双極子相互作用、およびこれらの組み合わせが含まれる。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、キャリアの表面と結合される。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、キャリアの内部表面（例えば、粒子、細胞などの内部表面）と結合される。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン模倣物は、キャリアの中にカプセル化される（例えば、粒子の内部の中に、細胞の細胞質中に、ポリマー性マトリックス中になど）。

ある実施形態において、キャリア部分は、ペプチド（ポリペプチド、タンパク質、抗体などを含む）、炭水化物（例えば、モノ−、ジ−、またはポリサッカリド、グリカンなど）、脂質、核酸、ポリマー、小分子、デンドリマー（アンブレラ−トポロジーグリカンを含むスターバーストデンドリマー）、細胞、ウイルス、粒子（例えば、微粒子、ナノ粒子、ピコ粒子、ポリマー粒子、量子ドット、金属粒子、骨由来の粒子、セラミック由来の粒子、リポソーム、ミセルなど）などを含むがこれらに限定されない、任意の型の物質を含んでもよい。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ペプチドまたはポリペプチドキャリア、および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡ受容体、および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ＨＡ受容体の特徴的な部分、および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、哺乳動物（例えば、ヒト）上気道組織（例えば、気管および／または気管支）に由来するかおよび／またはそこから得られたＨＡ受容体、ならびに少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、ヒト上気道組織（例えば、気管および／または気管支）に由来するかおよび／またはそこから得られたＨＡ受容体のフラグメント（例えば、特徴的な部分）、ならびに少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。ある実施形態において、ＨＡ受容体フラグメントは、ヒトまたは他の動物（例えば、フェレット）の上気道細胞からの膜糖タンパク質のプロテアーゼ処理によって得られる。上気道細胞の例には、気管または気管支の領域からの繊毛気管上皮、気管支上皮、杯細胞、非繊毛上皮細胞、およびこれらの組み合わせが含まれる。

ある実施形態において、ペプチドキャリア部分は、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。特定の実施形態において、ペプチドは、約１００アミノ酸よりも少ないタンパク質である。ある実施形態において、ペプチドは、約５〜約１００、約５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３５、約５〜約３０、約５〜約２５、または約２０〜約２５アミノ酸長の範囲である。ある実施形態において、ペプチド配列は、タンパク質の配列に基づき得る。ある実施形態において、ペプチド配列は、アミノ酸のランダムな配置であり得る。ランダム配列を含むペプチドのパネル、および／またはペプチドの最大限に多様なパネルを提供するために一貫して変化させた配列からのペプチドが使用されてもよい。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、次にＮまたはＯ連結アンブレラ−トポロジーグリカンを有する糖ペプチド（例えば、ＨＡ受容体、ムチン、フェチュイン、ＩｇＧなど）キャリアを含む。特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、グリカンがコアポリペプチド（例えば、ウシ血清アルブミン）への還元的アミノ化を介してポリペプチドバックボーンに連結されている、新たな糖タンパク質キャリアを含む。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸などの人工的なポリペプチドバックボーンを有するキャリアを含む。ある特定の実施形態において、１つ以上の（およびある実施形態において、各）グルタミン酸は、αカルボキシル基を介して結合体化されたアンブレラ−トポロジーグリカンを有し得る。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、核酸キャリアおよび少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。核酸キャリアには、
ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むウイルスフラグメント；ＤＮＡおよび／またはＲＮＡキメラ；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子フラグメント；一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、スーパーコイルＤＮＡおよび／または三重ヘリックスＤＮＡを含む種々の構造型のＤＮＡ；Ｚ−ＤＮＡ；機能的核酸（例えば、ＲＮＡｉを誘導する実体、リボザイムなど）などが含まれるがこれらに限定されない。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、小分子キャリアおよび少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。一般的に、「小分子」は、約５キロダルトン（Ｋｄ）サイズ未満の有機分子であることが当該分野において理解される。ある実施形態において、小分子は、約４Ｋｄ、３Ｋｄ、約２Ｋｄ、または約１Ｋｄ未満である。ある実施形態において、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。ある実施形態において、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。ある実施形態において、小分子は非ポリマー性である。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、脂質キャリアおよび少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。ある実施形態において、本発明に従って使用され得る例示的な脂質には、オイル、脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、必須脂肪酸、シス脂肪酸、トランス脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ホルモン、ステロイド（例えば、コレステロール、胆汁酸）、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびリポタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。

ある実施形態において、脂質は、１つ以上の脂肪酸基またはその塩を含み得る。ある実施形態において、脂肪酸基は、消化可能な長鎖（例えば、Ｃ_８−Ｃ_５０）の置換または非置換炭化水素を含み得る。ある実施形態において、脂肪酸基は、Ｃ_１０−Ｃ_２０脂肪酸またはその塩であり得る。ある実施形態において、脂肪酸基は、Ｃ_１５−Ｃ_２０脂肪酸またはその塩であり得る。ある実施形態において、脂肪酸基は、Ｃ_１５−Ｃ_２５脂肪酸またはその塩であり得る。ある実施形態において、脂肪酸基は不飽和であり得る。ある実施形態において、脂肪酸基はモノ不飽和であり得る。ある実施形態において、脂肪酸基はポリ不飽和であり得る。ある実施形態において、不飽和脂肪酸基の二重結合はシスコンホメーションであり得る。ある実施形態において、不飽和脂肪酸の二重結合は、トランスコンホメーションであり得る。

ある実施形態において、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、またはリグノセリン酸の１種以上であり得る。ある実施形態において、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノール酸、γ−リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはエルカ酸の１種以上であり得る。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、炭水化物キャリアおよび少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。ある実施形態において、炭水化物は天然または合成であり得る。炭水化物はまた、誘導体化された天然の炭水化物であってもよい。特定の実施形態において、炭水化物は、単糖または複合糖類であってもよい。特定の実施形態において、炭水化物は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、およびリボースを含むがこれらに限定されないモノサッカリドである。特定の実施形態において、炭水化物は、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、およびセロビオースを含むがこれらに限定されないジサッカリドである。特定の実施形態において、炭水化物は、セルロース、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストロース、デキストラン、グリコーゲン、キサンタンガム、ジェランガム、デンプン、およびプルランを含むがこれらに限定されないポリサッカリドである。特定の実施形態において、炭水化物は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルトール（ｍａｌｉｔｏｌ）、およびラクチトールを含むがこれらに限定されない糖アルコールである。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、粒子キャリアおよび少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。ある実施形態において、キャリアは、微粒子、ナノ粒子、ピコ粒子、ポリマー粒子、量子ドット、金属粒子、骨由来の粒子、セラミック由来の粒子、リポソーム、ミセルなどを含むがこれらに限定されない粒子であり得る。ある実施形態において、粒子は生物分解性かつ生体適合性である。一般的に、生体適合性物質は細胞に対して毒性ではない。ある実施形態において、物質は、その細胞への添加が細胞死の特定の閾値に満たない場合（例えば、細胞死が７５％未満、５０％未満、２５％未満、または１０％未満）、生体適合性であると見なされる。ある実施形態において、物質は、その細胞への添加が副作用を誘導しない場合に、生体適合性であると見なされる。一般的に、生物分解性物質は、治療に関連する時間の期間（例えば、数週間、数ヶ月、または数年間）の過程で、生理学的条件下で分解を受けるものである。ある実施形態において、生物分解性物質は、細胞機構によって分解可能である物質である。ある実施形態において、生物分解性物質は、化学的プロセスによって分解可能な物質である。

一般的に、本発明に従う粒子は、５００ミクロン（μｍ）未満の最大寸法（例えば、直径）を有する任意の実体である。ある実施形態において、本発明の粒子は、１００μｍ未満の最大寸法を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、１０μｍ未満の最大寸法を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子は、３００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、２５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、２００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、１５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。例えば、５０ｎｍ以下の最大寸法を有するより小さな粒子が、本発明のある実施形態において使用される。ある実施形態において、本発明の粒子は、５ｎｍと１μｍの間の範囲の最大寸法を有する。ある実施形態において、本発明の粒子は、２５ｎｍと２００ｎｍの間の範囲の最大寸法を有する。

特定の実施形態において、粒子は、約１μｍから約５００μｍの間、約１μｍから約２００μｍの間、約１μｍから約１０６μｍの間、約１μｍから約１００μｍの間、約１μｍから約５０μｍの間、約１μｍから約５３μｍの間、約５μｍから約５３μｍの間、約５μｍから約５０μｍの間、約５３μｍから約１０６μｍの間、約１μｍから約５μｍの間、約１μｍから約２０μｍの間、約２０μｍから約５３μｍの間、約５３μｍから約７５μｍの間、約７５μｍから約１０６μｍの間、または約３０μｍの平均幾何学的直径を有し得る。

特定の実施形態において、粒子は、約１μｍから約２５０μｍの間、約１μｍから約１００μｍの間、約１μｍから約５０μｍの間、約５μｍから約２００μｍの間、約１０μｍから約５００μｍの間、約１０μｍから約２５０μｍの間、約１０μｍから約１００μｍの間、約１００μｍから約２００μｍの間、約１００μｍから約１５０μｍの間、約５３μｍから約１０６μｍの間、約１μｍから約５μｍの間、約１μｍから約２０μｍの間、約２０μｍから約５３μｍの間、約５３μｍから約７５μｍの間、または約７５μｍから約１０６μｍの間の幾何学的サイズ分布を有し得る。

空気力学的直径は、空気などの粘性流体中の粒子の物理的特性である。一般的に、粒子は、測定することが困難であり得る実際の幾何学的直径を有する不規則な形状を有する。空気力学的直径は、粒子があたかも空気力学的直径に等しい単位密度および直径を有する完全な球であるかのような、粒子の空気力学的な挙動の表現である。このようなモデルは、同じ終端沈降速度を有する。空気力学的直径は、粒子状汚染物質および吸入した薬物に適用されて、気道のどこにこのような粒子が沈着するかを予測することができる。ある実施形態において、肺送達のための薬物粒子は、幾何学的直径の代わりにまたはそれに加えて、空気力学的直径によって特徴付けることができる。薬物が定着する速度は、空気力学的直径、ｄ_ａに比例する：
ｄ_ａ＝（ρ／Ｘ）^１／２×ｄ_ｇ
ここで、ρ＝密度、Ｘ＝形状因子である。球状の種についてはＸ＝１である。空気力学的直径は、問題の粒子と同じ重力沈降速度を有する、単位密度（１ｇ／ｍｌ）の球の直径である。空気力学的直径は以下として与えられる：
ｄｐａ＝ｄｐｓ×ｓｑｒｔ（粒子の密度）
ここで、ｄｐｓ＝ストークス直径である。特定の実施形態において、粒子は、約１μｍと約５μｍの間、約１μｍと約３５μｍの間、約５μｍと約３５μｍの間、約１μｍと約３５μｍの間、約３５μｍと約７０μｍの間、約１μｍと約７５μｍの間、約３５μｍと約７５μｍの間、約１μｍと約５０μｍの間、または約５μｍの平均空気力学的直径を有し得る。

バルク密度は粒子材料の特性である。一般的に、バルク密度は、粒子が占める体積によって除算した粒子の集団の重量をいうために使用される。典型的には、この体積は、粒子間の空間ならびに個々の粒子の孔の内部の空間が含まれる。バルク密度は材料の固有の特性ではないが、その材料がどのように取り扱われるかに依存して変化し得る。例えば、円筒に注がれた穀類は、特定のバルク密度を有する；円筒が乱された場合、穀物粒子は、共により近接して移動および定着し、より高いバルク密度を生じる。この理由のために、粉末のバルク密度は、通常は、「自由に定着」と「タップ」密度の両方として報告されており、そこでは、タップ密度とは、充填化プロセス後の粉末のバルク密度をいう。典型的には、充填化プロセスは、粒子の集団を保持する容器の振動を含み得る。特定の実施形態において、粒子は、約０．０１ｇ／ｃｍ^３と約０．４ｇ／ｃｍ^３の間、０．４ｇ／ｃｍ^３よりも上、または０．４ｇ／ｃｍ^３未満のタップ密度範囲を有し得る。

ある実施形態において、粒子は約１０００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約７５０ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約５００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約４５０ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約４００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約３５０ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約３００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約２７５ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約２５０ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約２２５ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約２００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約１７５ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約１５０ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約１２５ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約１００ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約７５ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約５０ｎｍの直径を有する。ある実施形態において、粒子は約２５ｎｍの直径を有する。

特定の実施形態において、粒子は、腎排泄限界よりも大きなサイズである（例えば、６ｎｍよりも大きな直径を有する粒子）。特定の実施形態において、粒子は、５ｎｍよりも大きい、１０ｎｍよりも大きい、１５ｎｍよりも大きい、２０ｎｍよりも大きい、５０ｎｍよりも大きい、１００ｎｍよりも大きい、２５０ｎｍよりも大きい、５００ｎｍよりも大きい、１０００ｎｍよりも大きい、またはそれ以上の直径を有する。特定の実施形態において、粒子は、肝臓による血流からの粒子のクリアランスを回避するために十分に小さい（例えば、１０００ｎｍ未満の直径を有する粒子）。特定の実施形態において、粒子は、１５００ｎｍ未満、１０００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、またはそれ以下の直径を有する。一般的に、粒子サイズを含む粒子の生理化学的特徴は、腎排泄および／または肝臓クリアランスを減少させることによって、粒子が血漿中でより長く循環することを可能にするように選択することができる。ある実施形態において、粒子は、５ｎｍ〜１５００ｎｍ、５ｎｍ〜１０００ｎｍ、５ｎｍ〜７５０ｎｍ、５ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜２５０ｎｍ、または５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の直径を有する。ある実施形態において、粒子は、１０ｎｍ〜１５００ｎｍ、１５ｎｍ〜１５００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５００ｎｍ、１００ｎｍ〜１５００ｎｍ、２５０ｎｍ〜１５００ｎｍ、５００ｎｍ〜１５００ｎｍ、または１０００ｎｍ〜１５００ｎｍの範囲の直径を有する。

各粒子が同様の特性を有するように、サイズ、形状、および／または組成に関して比較的均一である粒子の集団を使用することがしばしば所望される。例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の粒子が、平均直径または最大寸法の５％、１０％、または２０％以内におさまる直径または最大寸法を有し得る。ある実施形態において、粒子の集団は、サイズ、形状、および／または組成に関して不均一であり得る。

ゼータ電位は、粒子の表面電位の尺度である。ある実施形態において、粒子は、−５０ｍＶから＋５０ｍＶの間の範囲のゼータ電位を有する。ある実施形態において、粒子は、−２５ｍＶから＋２５ｍＶの間の範囲のゼータ電位を有する。ある実施形態において、粒子は、−１０ｍＶから＋１０ｍＶの間の範囲のゼータ電位を有する。ある実施形態において、粒子は、−５ｍＶから＋５ｍＶの間の範囲のゼータ電位を有する。ある実施形態において、粒子は、実質的に負のゼータ電位を有する。ある実施形態において、粒子は、実質的に正のゼータ電位を有する。ある実施形態において、粒子は、実質的に中性のゼータ電位を有する（すなわち、約０ｍＶ）。

粒子は、球、偏球、円筒、卵形、楕円鉢、シェル、立方体、直平行六面体、円錐、錐体、棒状物（例えば、円筒、または正方形もしくは長方形の断面を有する長い構造）、テトラポッド（４つの足状付属物を有する粒子）、三角形、プリズムなどを含む、種々の異なる形状を有し得る。

ある実施形態において、粒子は微粒子（例えば、ミクロスフェア）である。一般的に、「微粒子」とは、１０００μｍ未満の直径を有する任意の粒子をいう。ある実施形態において、粒子はナノ粒子（例えば、ナノスフェア）である。一般的に、「ナノ粒子」とは、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子をいう。ある実施形態において、粒子はピコ粒子（例えば、ピコスフェア）である。一般的に、「ピコ粒子」とは、１ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子をいう。ある実施形態において、粒子はリポソームである。ある実施形態において、粒子はミセルである。

粒子は、中身が詰まっているかまたは中空であり得、１つ以上の層を含み得る（例えば、ナノシェル、ナノリングなど）。粒子は、コア／シェル構造を有し得、ここで、コアおよびシェルは、異なる材料から作られ得る。粒子は、勾配または均質な合金を含み得る。粒子は、２つ以上の材料から作られた複合粒子であり得、その材料の１つ、１つより多く、またはすべてが、磁気特性、電気的に検出可能な特性、および／または光学的に検出可能な特性を有する。

ある実施形態において、粒子は、１種以上の分散媒体、界面活性剤、放出遅延成分、または他の薬学的に受容可能な賦形剤を任意に含んでもよい。ある実施形態において、粒子は、１種以上の可塑剤または添加剤を任意に含んでもよい。

ある特定の実施形態において、本発明のアンブレラ−トポロジーデコイにおいて利用される特定のキャリアは、ＨＡ受容体フラグメント、ムチン、フェチュイン、ＩｇＧ、ウシ血清アルブミン、γポリグルタミン酸、ポリアクリルアミド、キトサン、金ナノ粒子（すなわち、アンブレラ−トポロジーグリカンで官能基する）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

特定の実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、細胞またはウイルスキャリア、および少なくとも１つのアンブレラ−トポロジーグリカン部分を含む。例えば、アンブレラ−トポロジーグリカン部分は、細胞またはウイルスの表面と結合し得る（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に結合する）。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカン部分は、細胞またはウイルスの中にカプセル化され得る。

本発明は、このようなアンブレラ−トポロジーグリカンを模倣する因子が、デコイとして作用できかつＨＡポリペプチドとそれらの受容体の間の相互作用と競合するという認識を包含する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について内因性グリカンと競合する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について内因性アンブレラ型グリカンと競合する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について上気道グリカンと競合する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合についてアンブレラ型上気道グリカンと競合する。

ある実施形態において、グリカン模倣物はＨＡポリペプチドに結合するが、ＨＡポリペプチドへの結合について内因性グリカンと競合しない。

ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、１つ以上のＨＡポリペプチドに結合および／または付随することが可能である三次元構造によって特徴付けられる。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、キャリアに付随した個々のグリカン部分の多価配座を含む。例えば、グリカンデコイは、グリカンデコイが１つ以上のＨＡポリペプチドに結合および／または付随することを可能にする配座または方向で、キャリアに付随する（上記のように、共有結合的または非共有結合的に）、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、１０００個、またはそれ以上の個々のグリカン部分を含み得る。ある実施形態において、個々のグリカン部分の多価配座を含むアンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、野生型ＨＡ受容体のＨＡポリペプチド結合部位と類似し、および／またはこれを模倣する。ある実施形態において、個々のグリカン部分の多価配座を含むアンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、その天然の状況にある（例えば、種々の肺組織中にある）野生型ＨＡ受容体のＨＡポリペプチド結合部位と類似し、および／またはこれを模倣する。

ＨＡポリペプチドは、「ヘマグルチニン（ＨＡ）」という標題の節において、以下にさらに詳細に説明される。

ヘマグルチニン（ＨＡ）
インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子の膜に埋め込まれた２つの糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む脂質膜エンベロープによって特徴付けられるＲＮＡウイルスである。１６種の既知のＨＡサブタイプおよび９種のＮＡサブタイプが存在しており、異なるインフルエンザ株は、その株のＨＡおよびＮＡサブタイプの数字に基づいて名付けられている。アミノ酸配列同一性の比較および結晶構造の比較に基づいて、ＨＡサブタイプは、２つの主要な群および４つのより小さな分岐群に分けられてきた。異なるＨＡサブタイプは、強力なアミノ酸配列同一性を必ずしも共有していないが、異なるＨＡサブタイプの全体的な三次元構造は互いに類似しており、分類目的で使用することができるいくつかのわずかな違いを伴う。例えば、中心のαヘリックスに関する膜末端のサブドメインの特定の配向は、ＨＡサブタイプを決定するために一般的に使用される１つの構造的な特徴である（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５：２８７；参照により本明細書に援用される）。

ＨＡは、Ｈ１−Ｈ１６と名付けられた１６種のサブタイプの１種のホモトリマーとして膜中に存在する。これらのサブタイプの３種のみ（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）がこれまでにヒト感染のために適応している。ヒトに感染するように適応したＨＡ（例えば、流行性のＨ１Ｎ１（１９１８）およびＨ３Ｎ２（１９６７−６８）インフルエンザサブタイプのＨＡ）の１つの報告された特徴は、α２−３シアル化グリカンに優先的に結合するトリ祖先ウイルスと比較して、α２−６シアル化グリカンに優先的に結合するそれらの能力である（ＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ、２０００、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：５３１；ＲｏｇｅｒｓおよびＰａｕｌｓｏｎ、１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２７：３６１；Ｒｏｇｅｒｓら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０４：７６；Ｓａｕｔｅｒら、１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：９６０９；Ｃｏｎｎｏｒら、１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０５：１７；ならびにＴｕｍｐｅｙら、２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０：７７；これらのすべては参照により本明細書に援用される）。しかし、本発明は、ヒト宿主に感染する能力は、特定の連結のグリカンへの結合とはより少なく相関し、特定のトポロジーのグリカンへの結合とはより多く相関するという認識を包含する。従って、本発明は、ヒトの感染を媒介するＨＡがアンブレラ−トポロジーグリカンに結合し、しばしば、コーン−トポロジーグリカンよりも、アンブレラ−トポロジーグリカンについての優先度を示す（たとえコーン−トポロジーグリカンα２−６シアル化グリカンであり得るとしても）ことを実証する。

（α２−３結合とα２−６結合の両方の）シアル化オリゴサッカリドに結合したＨ１（ヒトおよびブタ）、Ｈ３（トリ）、およびＨ５（トリ）からのＨＡのいくつかの結晶構造が利用可能であり、これらのグリカンとのＨＡの独特な相互作用に関与している特定のアミノ酸についての分子的洞察を提供する（Ｅｉｓｅｎら、１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３２：１９；Ｈａら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９８：１１１８１；Ｈａら、２００３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０９：２０９；Ｇａｍｂｌｉｎら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８３８；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８６６；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，２３：８５；およびＳｔｅｖｅｎｓら、２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１２：４０４；これらのすべては参照により本明細書に援用される）。

例えば、単独のまたはα２−３もしくはα２−６シアル化オリゴサッカリドに結合したＨ５（Ａ／アヒル／シンガポール／３／９７）の結晶構造は、結合したグリカンと直接的に相互作用する特定のアミノ酸、およびまた、１以上の分離除去の程度であるアミノ酸を同定する（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９８：１１１８１；参照により本明細書に援用される）。ある場合において、これらの残基のコンホメーションは、結合状態対非結合状態で異なる。例えば、Ｇｌｕ１９０、Ｌｙｓ１９３、およびＧｌｎ２２６は、すべて直接的結合相互作用に関与し、結合状態対非結合状態で異なるコンホメーションを有する。Ｇｌｕ１９０の近位であるＡｓｎ１８６のコンホメーションもまた、結合状態対非結合状態で有意に異なる。

ＨＡポリペプチドの結合特性
特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、高い親和性でアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する。特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、しばしば、高い親和性および／または特異性で、複数の異なるアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する。本発明に従うと、ＨＡポリペプチドは、ヒト上気道上皮組織における受容体と結合可能であるペプチドを含む。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、高い親和性を有するアンブレラ−トポロジーグリカン（例えば、長いα２−６シアル化グリカン、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−など）に結合する。例えば、ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１ ＨＡまたはＨ３Ｎ２ ＨＡ）について観察されるものに匹敵する親和性を有するアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて匹敵する条件下で観察されるものの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である親和性を有するアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて匹敵する条件下で観察されるものよりも高い親和性でアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する。

特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドの結合親和性は、さまざまな濃度にわたって評価される。このようなストラテジーは、単純な濃度分析を行うよりも、特に、多価結合アッセイにおいて、顕著により多くの情報を提供する。ある実施形態において、例えば、ＨＡポリペプチドの結合親和性は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上にわたる濃度範囲にわたって評価される。

特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、それらが本明細書に記載されるものなどの多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて飽和シグナルを示す場合に、高い親和性を示す。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、それらがこのような研究において約４０００００以上（例えば、約５０００００、６０００００、７０００００、８０００００より上など）のシグナルを示す場合に、高い親和性を示す。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍以上の濃度範囲にわたって、またはある実施形態において、１０倍以上まで大きな濃度範囲にわたって、アンブレラ−トポロジーグリカンへの飽和結合を示す。

さらに、ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、それらがコーン−トポロジーグリカンに結合するよりも、より強力にアンブレラ−トポロジーグリカンに結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、または２である、コーン−トポロジーグリカンに対するアンブレラ−トポロジーグリカンの相対親和性を示す。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドはα２−６シアル化グリカンに結合する；ある実施形態において、ＨＡポリペプチドはα２−６シアル化グリカンに優先的に結合する。特定の実施形態においては、ＨＡポリペプチドは複数の異なるα２−６シアル化グリカンに結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、α２−３シアル化グリカンに結合不可能であり、他の実施形態において、ＨＡポリペプチドはα２−３シアル化グリカンに結合可能である。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、ヒト上気道上皮細胞上で見い出される受容体に結合する。特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、気管支および／または気管中のＨＡ受容体に結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、深部肺中の受容体に結合不可能であり、他の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、深部肺中の受容体に結合可能である。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）中のＨＡ受容体上で見い出されるグリカンの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上に結合する。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、図６（右のパネル）および９に図示された１つ以上のグリカンに結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、図６（右のパネル）および９に図示された複数のグリカンに結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、図６（右のパネル）および９に図示されたグリカンに、高い親和性および／または特異性で結合する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、図６（左のパネル）および８に図示されたそれらのグリカンへの結合と比較して、図６（右のパネル）および９に図示されたグリカンに優先的に結合する。

本発明は、指定された結合特異性を有する単離されたＨＡポリペプチドを提供し、アンブレラ−トポロジーグリカンに関して指定された結合特性を有する操作されたＨＡポリペプチドを提供する。

ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ２ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ３ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ４ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ５ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ６ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ７ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ８ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ９ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１０ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１１ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１２ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１３ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１４ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１５ポリペプチドである。ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１６ポリペプチドである。

ある実施形態において、指定された結合特性を有するＨＡポリペプチドはＨ１ポリペプチドではなく、Ｈ２ポリペプチドではなく、および／またはＨ３ポリペプチドではない。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、以下の株のいずれかからのＨ１タンパク質を含まない：Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（サウスカロライナ）／１／１９１８；Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（プエルトリコ）／８／１９３４；Ａ／台湾／１／１９８６；Ａ／Ｔｅｘａｓ（テキサス）／３６／１９９１；Ａ／ペキン／２６２／１９９５；Ａ／ヨハネスブルク／９２／１９９６；Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９；Ａ／ソロモン諸島／３／２００６。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、１９５７−５８のアジアのインフルエンザ流行の株のいずれかからのＨ２タンパク質を含まない。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、以下の株のいずれかからのＨ２タンパク質を含まない：Ａ／日本／３０５＋／１９５７；Ａ／シンガポール／１／１９５７；Ａ／台湾／１／１９６４；Ａ／台湾／１／１９６７。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、以下の株のいずれかからのＨ３タンパク質を含まない：Ａ／愛知／２／１９６８；Ａ／フィリピン／２／１９８２；Ａ／ミシシッピー／１／１９８５；Ａ／レニングラード／３６０／１９８６；Ａ／スーチョワン／２／１９８７；Ａ／シャンハイ／１１／１９８７；Ａ／ペキン／３５３／１９８９；Ａ／シャントン／９／１９９３；Ａ／ヨハネスブルク／３３／１９９４；Ａ／ナンチャン／８１３／１９９５；Ａ／シドニー／５／１９９７；Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ（モスクワ）／１０／１９９９；Ａ／パナマ／２００７／１９９９；Ａ／ワイオミング／３／２００３；Ａ／オクラホマ／３２３／２００３；Ａ／カリフォルニア／７／２００４；Ａ／ウィスコンシン／６５／２００５。

改変体ＨＡポリペプチド
特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、そのアミノ酸配列が親のＨＡの配列と同一であるが、特定の配列の変更については同一ではないという点で、親のＨＡポリペプチドの改変体である。ある実施形態において、親のＨＡは、インフルエンザウイルスの天然の単離物において見い出されるＨＡポリペプチド（例えば、野生型ＨＡポリペプチド）である。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、それらの対応する親のＨＡポリペプチドとは異なるグリカン結合特性を有する。ある実施形態において、ＨＡ改変体ポリペプチドは、それらの同族の親のＨＡポリペプチドよりも、アンブレラ−トポロジーグリカンについて（例えば、コーン−トポロジーグリカンと比較した場合に）より高い親和性および／または特異性を有する。特定の実施形態において、このようなＨＡポリペプチド改変体は操作された改変体である。

ある実施形態において、グリカン結合特性の変化を伴うＨＡポリペプチド改変体は、グリカン結合部位の中の残基またはグリカン結合部位に影響を与える残基における配列の変化を有する。ある実施形態において、このような置換は、結合したグリカンと直接的に相互作用するアミノ酸の置換であり；他の実施形態において、このような置換は、以下の点で、結合したグリカンと相互作用するものからの分離距離の程度が１度のアミノ酸である−分離距離の程度が１度のアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用し；（２）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、しかし、グリカンそれ自体とは直接的に相互作用しない；または（３）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与え、かつグリカンそれ自体とも直接的に相互作用するかのいずれかである。ＨＡポリペプチド改変体は、１つ以上の直接結合アミノ酸、１つ以上の分離距離の程度が１度のアミノ酸、１つ以上の分離距離の程度が２度のアミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせの置換を含む。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、より高い程度の分離さえ伴う、１つ以上のアミノ酸の置換を含んでもよい。

ある実施形態において、グリカン結合特性の変化を伴うＨＡポリペプチド改変体は、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌの向こう側の糖と接触する残基における配列の変化を有する（例えば、図６を参照のこと）。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、野生型である親のＨＡと比較して、少なくとも１個のアミノ酸置換を有する。特定の実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、同族の野生型である親のＨＡと比較して、少なくとも２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有する；ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、２個、３個、または４個のアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、すべてのこのようなアミノ酸置換はグリカン結合部位の中に位置している。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、残基１３７、１４５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９６、２２２、２２５、２２６、および２２８の１つ以上に対応する位置における配列置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、残基１５６、１５９、１８９、１９２、１９３、および１９６の１つ以上に対応する位置；ならびに／または残基１８６、１８７、１８９、および１９０の１つ以上に対応する位置；ならびに／または残基１９０、２２２、２２５、および２２６の１つ以上に対応する位置；ならびに／または残基１３７、１４５、１９０、２２６、および２２８の１つ以上に対応する位置における配列置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、残基１９０、２２５、２２６、および２２８の１つ以上に対応する位置における配列置換を有する。

特定の実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特に、Ｈ５ポリペプチド改変体は、残基９８、１３６、１３８、１５３、１５５、１５９、１８３、１８６、１８７、１９０、１９３、１９４、１９５、２２２、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群より選択される残基において、野生型である親のＨＡ（例えば、Ｈ５）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基（残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、１９０、１９３、１９４、２２２、２２５、２２６、２２７、および２２８を含むがこれらに限定されない）において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５、および２２８を含むがこれらに限定されない、グリカンを直接結合する受容体の領域に隣接するアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基１３８、１８６、１８７、１９０、１９３、２２２、２２５、２２６、２２７、および２２８からなる群より選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。他の実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基１９０、１９３、２２２、２２５、２２６、２２７、および２２８を含むがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基１３８、１８６、１８７、および２２８を含むがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。

さらなる実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、１９４、および１９５からなる群より選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基９８、１３６、１５３、１５５、１８３、および１９４を含むがこれらに限定されない、グリカンに直接結合する受容体の領域に位置するアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基９８および１９５を含むがこれらに限定されない、グリカンを直接結合する受容体の領域に隣接するアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。

特定の実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、以下の点で、結合したグリカンと相互作用するものからの分離距離の程度が１度のアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。分離距離の程度が１度のアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用し；（２）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、しかし、グリカンそれ自体とは直接的に相互作用しない；または（３）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与え、かつグリカンそれ自体とも直接的に相互作用するかのいずれかである。上記残基には残基９８、１３８、１８６、１８７、１９５、および２２８が含まれるがこれらに限定されない。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、以下の点で、結合したグリカンと相互作用するものからの分離距離の程度が１度のアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。分離距離の程度が１度のアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用し；（２）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、しかし、グリカンそれ自体とは直接的に相互作用しない；または（３）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与え、かつグリカンそれ自体とも直接的に相互作用するかのいずれかである。上記残基には残基１３８、１８６、１８７、および２２８が含まれるがこれらに限定されない。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、以下の点で、結合したグリカンと相互作用するものからの分離距離の程度が１度のアミノ酸から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。分離距離の程度が１度のアミノ酸は、（１）直接結合するアミノ酸と相互作用し；（２）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与えるが、しかし、グリカンそれ自体とは直接的に相互作用しない；または（３）他のやり方で、直接結合するアミノ酸がグリカンと相互作用する能力に影響を与え、かつグリカンそれ自体とも直接的に相互作用するかのいずれかである。上記残基には残基９８および１９５が含まれるがこれらに限定されない。

特定の実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、残基１５９において、野生型である親のＨＡと比較して、アミノ酸置換を有する。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、１９０、１９３、２２５、および２２６から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５ポリペプチド改変体は、１９０、１９３、２２６、および２２８から選択される残基において、野生型である親のＨＡと比較して、１つ以上のアミノ酸置換を有する。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５改変体は、以下のアミノ酸置換の１つ以上を有する：Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｇｌｎ２２６Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２２６Ｖａｌ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体、および特にＨ５改変体は、アミノ酸置換の以下のセットの１つ以上を有する：
Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ ａｎｄ Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ；
Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ ａｎｄ Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｓｐ１８７Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｇｌｎ２２６Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｙ２２８Ｓｅｒ；
Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｓｅｒ１３７Ａｌａ、Ｌｙｓ１５６Ｇｌｕ、Ａｌａ１８９Ｌｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ｇｌｕ１９０Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ；
Ａｓｎ１８６Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８７Ｔｈｒ、Ａｌａ１８９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ、Ｓｅｒ２２７Ａｌａ。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、改変体のアンブレラ−トポロジーグリカンへの親和性および／または特異性が増加するように、野生型ＨＡと比較して、少なくとも１つのさらなる置換を有する。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド（ＨＡポリペプチド改変体を含む）は、Ｄ１９０、Ｄ２２５、Ｌ２２６、および／またはＳ２２８を含む配列を有する。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、Ｄ１９０およびＤ２２５を含む配列を有する；ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、Ｌ２２６およびＳ２２８を含む配列を有する。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド改変体は、親のＨＡ結合部位、特に、親の野生型ＨＡと比較して、開かれた結合部位を有する。

ＨＡポリペプチドの部分またはフラグメント
本発明は、ＨＡポリペプチドの特徴的な部分およびそれらをコードする核酸をさらに提供する。一般的に、特徴的な部分は、アミノ酸の連続するストレッチ、または共にＨＡポリペプチドに特徴的であるアミノ酸配列の連続するストレッチのコレクションを含むものである。各々のこのような連続するストレッチは、一般的に、少なくとも２アミノ酸を含む。さらに、当業者は、典型的には、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上のアミノ酸が、Ｈ５ ＨＡポリペプチドに特徴的であるために必要とされることを理解している。一般的に、特徴的な部分は、上記に特定される配列同一性に加えて、関連するインタクトなＨＡポリペプチドと、少なくとも１つの機能的な特徴を共有している。ある実施形態において、ＨＡポリペプチドの発明に関わる特徴的な部分は、関連する全長ＨＡポリペプチドと、グリカン結合特性を共有している。

本明細書に提供されるＨＡポリペプチドの特定の例および説明のいくつかは具体的にＨ５ ＨＡに指向されているが、当業者は、本発明がＨ５ ＨＡに限定されず、しかし、本発明は任意のＨＡ遺伝子型、サブタイプ、改変体、部分、フラグメントなどに一般的に適用可能であることを容易に認識する。

グリカンデコイの同定
ある実施形態において、本発明は、グリカンデコイを同定するためのシステムおよび方法を提供する。一般的に、このようなシステムおよび方法は、ＨＡポリペプチドを、１種以上の候補物質と接触させる工程を包含し、この候補物質は、アンブレラ−トポロジーグリカン（本明細書では「候補デコイ」と称する）を模倣し、ならびに、因子がＨＡポリペプチドに結合し、および／またはＨＡポリペプチドとＨＡ受容体（またはＨＡ受容体上で見い出されるアンブレラ−トポロジーグリカン）の間の相互作用と競合する能力を決定する。

ある実施形態において、グリカンデコイは、ＨＡポリペプチドに結合するグリカン模倣物である。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について、内因性グリカンと競合する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について、内因性アンブレラ型グリカンと競合する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について、上気道グリカンと競合する。ある実施形態において、グリカン模倣物は、ＨＡポリペプチドへの結合について、アンブレラ−トポロジー上気道グリカンと競合する。

ある実施形態において、ペプチド模倣物はＨＡポリペプチドに結合するが、しかし、ＨＡポリペプチドへの結合について、内因性グリカンと競合しない。

ある実施形態において、候補デコイは、溶液中で遊離状態であり、基材に固定され、ならびに／または細胞の中および／もしくは細胞の表面上で発現されてもよい。候補デコイおよび／またはＨＡポリペプチドは標識されてもよく、それによって、結合の検出を可能にする。候補デコイは、頻繁には、標識された種であり、標識工程が結合に干渉し、および／または結合を増強する可能性を減少させる。競合結合形式が実施されてもよく、ここでは、１種の物質が標識され、結合に対する効果を決定するために、結合した標識に対する遊離の標識の量を測定し得る。

ある実施形態において、結合アッセイには、例えば、候補デコイをＨＡポリペプチドに曝露する工程、および候補デコイとＨＡポリペプチドの間の結合を検出する工程が含まれる。結合アッセイは、インビトロで（例えば、実質的に言及された成分のみを含む候補チューブ中；無細胞抽出物中；および／または実質的に精製された成分中）で実施されてもよい。代替的にまたは加えて、結合アッセイは、インサイトおよび／またはインビボで（例えば、細胞、組織、器官、および／または生物の中で；以下でさらに詳述される）実施されてもよい。

特定の実施形態において、少なくとも１種のＨＡポリペプチドが少なくとも１種の候補デコイと接触され、効果が検出される。ある実施形態において、例えば、ＨＡポリペプチドが候補デコイと接触され、２種の実体間の結合がモニターされる。ある実施形態において、アッセイは、ＨＡポリペプチドの特徴的な部分（アンブレラ−トポロジーグリカンを接触するＨＡポリペプチドの領域を含むがこれに限定されない）と、候補デコイを接触させる工程を含み得る。候補デコイへのＨＡポリペプチドの結合が検出される。ＨＡポリペプチドのフラグメント、部分、ホモログ、改変体、および／または誘導体は、これらがアンブレラ−トポロジーグリカン結合活性を含むならば、利用されてもよい
ある実施形態において、アッセイは、候補デコイ（例えば、グリカンアレイなどの固体支持体上に固定化されており、「グリカンアレイ」という標題の節において以下にさらに詳細に記載される）および非固定化ＨＡポリペプチドを提供する工程を含み得る。候補デコイおよびＨＡポリペプチドが互いに結合する程度が決定される。または、ＨＡポリペプチドが固定化され、候補デコイが固定化されなくてもよい。このようなアッセイは、ＨＡポリペプチドならびに／またはそのフラグメント、部分、ホモログ、改変体、および／もしくは誘導体に結合可能である候補デコイを同定するために使用されてもよい。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドを認識する抗体（例えば、α−ＨＡ抗体）が固体支持体（例えば、プロテインＡビーズ）に固定化される。抗体はＨＡポリペプチドと接触され、これが固定化抗体と結合する。次いで、得られた複合体は、候補デコイ（精製タンパク質、細胞抽出物、コンビナトリアルライブラリーなど）との接触に供される。ＨＡポリペプチドが候補デコイと相互作用する場合、候補デコイは、固体支持体に間接的に固定化される。固体支持体上の候補デコイの存在は、当該分野で公知である任意の標準的な技術によってアッセイ可能である（ウェスタンブロッティング、質量分析法などが含まれるがこれらに限定されない）。この型のアッセイは、当該分野では「免疫沈降」アッセイとして知られている。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチドは、固体支持体（例えば、アガロースビーズ）に固定化される。特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、細菌、酵母、昆虫細胞、および／もしくは高等真核細胞株中でＧＳＴ−融合タンパク質として発現され、ならびに／またはグルタチオン−アガロースビーズを使用して、粗細胞抽出物から精製する。対照として、ＧＳＴ融合タンパク質ではない候補デコイの、グルタチオン−アガロースビーズへの結合は、ＨＡポリペプチドの非存在下で決定される。候補デコイの固定化ＨＡポリペプチドへの結合が決定される。この型のアッセイは、「ＧＳＴプルダウン」アッセイとして当該分野で公知である。代替的にまたは加えて、候補物質は固定化されてもよく、ＨＡポリペプチドは固定化されなくてもよい。

１つの成分、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースおよび／またはヒスチジンタグ化成分を固定化するために、異なるアフィニティー精製システムを使用してこの型のアッセイを実施することが可能である。

候補デコイへのＨＡポリペプチドの結合は、当該分野で周知である種々の方法によって決定され得る。例えば、非固定化成分は標識されてもよい（例えば、放射性標識、エピトープタグ、酵素−抗体結合体などを用いる）。代替的にまたはさらに、結合は、免疫学的検出技術によって決定されてもよい。例えば、反応混液は、ウェスタンブロッティングに供せられ、非固定化成分を検出する抗体を用いて、ブロットがプロービングされてもよい。代替的にまたはさらに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が結合についてアッセイするために利用されてもよい。

ある実施形態において、本発明のスクリーニング方法は以下の工程を含む：（１）候補物質を入手する工程；（２）候補デコイを、ＨＡポリペプチド（および／またはその特徴的部分）およびＨＡポリペプチドに結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカンと接触させる工程；ならびに（３）候補デコイの存在下および／または非存在下で、ＨＡポリペプチドと既知のアンブレラ−トポロジーグリカンとの間の結合の阻害を検出する工程。

ある実施形態において、本発明のスクリーニング方法は以下の工程を含む：（１）候補物質を入手する工程；ならびに（２）候補デコイを、あらかじめ形成されたＨＡポリペプチド（および／またはその特徴的部分）−アンブレラ−トポロジーグリカン複合体と接触させる工程；ならびに（３）候補物質が、ＨＡポリペプチド（および／またはその特徴的部分）−アンブレラ−トポロジーグリカン複合体に影響を与えるか否かを決定する工程。

ある実施形態において、本発明のスクリーニング方法は以下の工程を含む：（１）候補物質を入手する工程；（２）候補デコイを、ＨＡポリペプチド（および／またはその特徴的部分）およびＨＡポリペプチドに特異的に結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカンと接触させる工程；ならびに（３）候補デコイが、ＨＡポリペプチド（および／またはその特徴的部分）と既知のアンブレラ−トポロジーグリカンとの間の結合相互作用と競合し得るか否かを検出する工程。

ある実施形態において、ＨＡポリペプチド、およびＨＡポリペプチドに特異的に結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカンへの候補デコイの投与が、ＨＡポリペプチドと既知のアンブレラ−トポロジーグリカンの間の結合の減少を生じる場合に、候補デコイはアンブレラ−トポロジーグリカンデコイであると決定される。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド、およびＨＡポリペプチドに特異的に結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカンへの候補デコイの投与が、ＨＡポリペプチドと既知のアンブレラ−トポロジーグリカンの間の結合の少なくとも２倍の減少を生じる場合に、候補デコイはアンブレラ−トポロジーグリカンデコイであると決定される。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド、およびＨＡポリペプチドに特異的に結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカンへの候補デコイの投与が、ＨＡポリペプチドと既知のアンブレラ−トポロジーグリカンの間の結合の少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍、または１０，０００倍より多くの減少を生じる場合に、候補デコイはアンブレラ−トポロジーグリカンデコイであると決定される。ある実施形態において、ＨＡポリペプチド、およびＨＡポリペプチドに特異的に結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカンへの候補デコイの投与が、ＨＡポリペプチドと既知のアンブレラ−トポロジーグリカンの間の結合の少なくとも２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、５００％、１０００％、または１０００％より多くの減少を生じる場合に、候補デコイはＨＡポリペプチドであると決定される。

ある実施形態において、本発明は、候補デコイが細胞（例えば、ＨＡポリペプチドを発現するか、またはＨＡポリペプチドに結合している細胞）と接触される、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイについてスクリーニングするための方法を提供する。次いで、細胞は、ＨＡポリペプチドが１種以上の候補アンブレラ−トポロジーグリカンデコイと相互作用する能力についてアッセイすることができる。

特定の実施形態において、細胞は、ＨＡポリペプチドと候補デコイの間の結合について直接的にアッセイされ得る。免疫組織化学技術、共焦点技術、および／または結合を評価するための他の技術が当業者に公知である。この目的のために具体的に操作される細胞を含む、種々の細胞系統がこのようなスクリーニングアッセイのために利用され得る。スクリーニングアッセイにおいて使用される細胞の例には、哺乳動物細胞、真菌細胞、細菌細胞、またはウイルス細胞が含まれる。細胞は、成長因子で刺激された細胞などの刺激された細胞であり得る。当業者は、ＨＡポリペプチドが候補デコイに結合する能力を測定するために、本明細書に開示される発明が広範な種々のインサイトアッセイを意図していることを理解している。

アッセイに依存して、細胞および／または組織の培養が必要とされ得る。細胞は多数の異なる生理学的アッセイのいずれかを使用して試験されてもよい。代替的にまたは加えて、分子分析が実施されてもよく、これには、タンパク質発現をモニターするためおよび／またはタンパク質−タンパク質相互作用を試験するためのウェスタンブロッティング；他の化学修飾をモニターするための質量分析法などが含まれるがこれらに限定されない。

本発明は、ＨＡに結合し、それゆえに、インフルエンザ感染に関与している可能性がある物質を同定するための方法を提供する。ＨＡポリペプチドに結合する物質を同定する１つのインサイト方法は、ツーハイブリッド系アッセイである（Ｆｉｅｌｄｓら、１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６；およびＣｏｌａｓら、１９９８，ＴＩＢＴＥＣＨ，１６：３５５；これらの両方は参照により本明細書に援用される）。このアッセイにおいて、酵母細胞は、本発明に従う試験物質（例えば、ＨＡポリペプチド、ＨＡポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはその特徴的部分）ならびにＧａｌ４および／またはＬｅｘＡなどの転写因子のＤＮＡ結合ドメインを含む第１の融合タンパク質を発現する。細胞はさらにレポーター遺伝子を含み、そのプロモーターは、対応するＤＮＡ結合ドメインの結合部位を含む。活性化ドメイン（例えば、Ｇａｌ４および／または単純ヘルペスウイルス ＶＰ１６由来）に融合された候補デコイを含む第２の融合タンパク質を発現するベクターで細胞を形質転換することによって、候補デコイがＨＡポリペプチドと相互作用する場合には、レポーター遺伝子の発現は増加され得る。このようにして、新規なグリカンデコイを迅速に同定することが可能である。

本発明は、固相に結合したＨＡポリペプチドを含めること、および１種以上の候補デコイとのそれらの相互作用を検出することを含むアッセイを提供する。従って、ＨＡポリペプチドは、放射活性標識、蛍光標識、および／または発光標識などの検出可能なマーカーを含み得る。さらに、候補デコイは、間接的な検出を可能にする物質と共益させることができる（例えば、発色物質を使用する酵素を利用することによる、および／または検出可能な抗体を結合することによる）。候補デコイとの相互作用の結果としてのＨＡポリペプチドのコンホメーションの変化は、例えば、検出可能なマーカーの発光の変化によって検出され得る。代替的にまたは加えて、固相結合タンパク質複合体は、質量分析法によって分析され得る。

ある実施形態において、本明細書に記載される任意の結合アッセイが、さまざまな濃度のＨＡポリペプチドおよび／または候補デコイを使用して実施され得る。ある実施形態において、本明細書に記載される結合アッセイは、候補デコイおよび既知のアンブレラ−トポロジーグリカンの濃度範囲にわたって、候補デコイが既知のアンブレラ−トポロジーグリカンと競合する能力を評価するために使用される（例えば、候補デコイ：既知のアンブレラ−トポロジーグリカン比率は、約１：１０００未満、約１：１０００、約１：１００、約１：５０、約１：２０、約１：１０、約１：５、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約５：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、および／または約１０００：１より大きな値）。ある実施形態において、本明細書に記載される結合アッセイは、ＨＡポリペプチドの濃度範囲（例えば、約１００μｇ／ｍｌより高濃度、約１００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約１．７５μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約１．２５μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ、および／または約０．０１μｇ／ｍｌ未満）にわたって、候補デコイが既知のアンブレラ−トポロジーグリカンと競合する能力を評価するために使用される。

ある実施形態において、本明細書に記載される任意の結合研究は、高スループット様式で実施できる。高スループットアッセイを使用して、１日で数千個までの候補デコイをスクリーニングすることが可能である。ある実施形態において、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択した候補デコイに対して別々のアッセイを実行するために使用でき、または、濃度および／またはインキュベーション時間が観察されるべきである場合、すべての５〜１０ウェルが単一の候補デコイを試験できる。従って、単一の標準マイクロタイタープレートは、９６種までの候補デコイをアッセイできる；もし１５３６ウェルプレートが使用されるならば、単一のプレートは１５３６種までの候補デコイをアッセイできる；等々である。１日あたり多くのプレートをアッセイすることが可能であり；アッセイは、約６，０００、約２０，０００、約５０，０００、または約１００，０００を超える異なる候補デコイまでのアッセイスクリーニングが、本発明に従う高スループットシステムを使用して可能である。

グリカンアレイ
既知の特異的グリカン−グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）相互作用の現在の知見を迅速に拡張するために、国際協同研究イニシアチブである機能的グリコミクスのコンソーシアム（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）（ＣＦＧ；ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）が、新規なグリカンリガンド特異性のためにＧＢＰの高スループットスクリーニングを可能にしたいくつかのグリカン構造を含むグリカンアレイを開発した。グリカンアレイは、一価と多価の両方のグリカンモチーフを含み（すなわち、ポリアクリルアミドバックボーンに結合され）、各アレイは、低濃度（１０μＭ）および高濃度（１００μＭ）の２６４グリカンを含み、各濃度について６個のスポットである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ５．ｓｈｔｍｌを参照のこと）。

グリカンアレイは、Ｎ連結およびＯ連結のグリカンの生理学的な多様性を捕捉する合成グリカンを優先的に含む。合成グリカンに加えて、異なる哺乳動物糖タンパク質に由来するＮ連結グリカン混液もまた、アレイ上に提示され得る。

本明細書で使用される場合、グリカン「アレイ」とは、任意に固体支持体上に固定化されている１つ以上のグリカンのセットをいう。ある実施形態において、「アレイ」は、空間中で物理的に分離されている２つ以上の位置における組織化された配置またはパターンとして存在するグリカンのコレクションである。典型的には、グリカンアレイは、少なくとも４個、８個、１６個、２４個、４８個、９６個、または数百個、または数千個の別個の位置を有する。一般的に、グリカンアレイは、種々の形式のいずれかを有し得る。生体分子に適用可能である種々の異なるアレイ形式は、当該分野において公知である。例えば、膨大な数のタンパク質アレイおよび／または核酸アレイが周知である。当業者は、本発明のグリカンアレイのために適切である標準アレイ形式を直ちに理解する。

ある実施形態において、グリカンアレイは「マイクロアレイ」形式で存在する。マイクロアレイは、典型的には、５０μｍ〜２００μｍまたはそれ以下で分けられたサンプル位置であり、かつナノからマイクロモル濃度の範囲、またはナノからピコグラムの範囲の固定化サンプルを有し得る。当該分野において公知であるアレイ形式には、例えば、各別個のサンプル位置が、例えば、１０μｍのスケールを有するものが含まれる。

ある実施形態において、グリカンアレイは、支持体上に空間的に固定化された複数のグリカンを含む。本明細書で使用される場合、「支持体」とは、グリカン分子を整列させるために使用することが適切である任意の材料をいう。当業者によって理解されるように、任意の広範な種々の材料が利用されてもよい。ごく少数の例を挙げると、本発明において有用であり得る支持体材料には、疎水性メンブレン、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロンメンブレンが含まれる。このようなメンブレンは当該分野において周知であり、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫから入手することができる。

ある実施形態において、グリカンがその上で整列される支持体は金属酸化物を含んでもよい。適切な金属酸化物には、酸化チタン、酸化タンタル、および酸化アルミニウムが含まれるがこれらに限定されない。このような材料の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ，Ｆａｎｃｙ Ｒｏａｄ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ．ＢＨ１２ ４ＱＨ ＵＫから入手されてもよい。

ある実施形態において、このような支持体は、金属酸化物ゲルであるか、または金属酸化物ゲルを含む。金属酸化物ゲルは、所定の肉眼的領域内に大きな表面積を提供して、炭水化物含有分子の固定化を補助すると見なされている。

加えてまたは代替的に、本発明に従って使用され得る支持体材料には、ゲル、例えば、シリカゲルまたは酸化アルミニウムゲルが含まれる。このような材料の例は、例えば、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手されてもよい。

ある実施形態において、グリカンアレイは、通常の使用の間に、サイズおよび形状の変化に耐え得る支持体上に固定化される。例えば、支持体は、使用されてグリカンを整列させるために適切である成分材料でコートされたガラススライドであり得る。ある複合材料もまた、支持体に強固さを望ましく提供することができる。

本明細書で実証されるように、グリカンアレイは、ＨＡ−受容体相互作用および／またはＨＡ−受容体相互作用に影響を与える因子（例えば、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ）の特徴付けのために有用である。特定の実施形態において、ＨＡポリペプチドは、アンブレラ−トポロジーグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、および特に、アンブレラ−トポロジーで配列された長いα２−６シアル化グリカン）に結合し、および／またはアンブレラ−トポロジーグリカンデコイと相互作用するそれらの能力を評価するために、このようなアレイ上で試験される。

確かに、本発明は、ＨＡポリペプチド結合相互作用を特徴付けるため、および／またはアンブレラ−トポロジーグリカンデコイを特徴付けるために使用できる、α２−６シアル化グリカン、および任意にα２−３シアル化グリカンのアレイを提供する。ある実施形態において、アレイは、アンブレラ−トポロジーにあるグリカン（例えば、α２−６シアル化グリカン、および特に、長いα２−６シアル化グリカン）を含む。当業者にとっては明確であるように、このようなアレイは、任意のＨＡポリペプチドとの相互作用を特徴付けまたは検出するために有用であり、このＨＡポリペプチドには、例えば、研究者によって設計および／または調製されたものに加えて、天然のインフルエンザ単離物において見い出されるものが含まれる。

ある実施形態において、このようなアレイは、ヒトＨＡ受容体上で、特に、ヒト上気道ＨＡ受容体上で見い出されるグリカン（例えば、アンブレラ−トポロジーグリカン、これは、しばしば、α２−６シアル化グリカン、特に、長いα２−６シアル化グリカンである）の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上に代表的なものである。ある実施形態において、アレイは、図９および１３に描かれたグリカン構造のいくつかまたはすべてを含む。ある実施形態において、アレイは、これらの描かれたグリカンの少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を含む。

本発明は、グリカンアレイを使用して、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを同定または特徴付けするための方法を提供する。ある実施形態において、例えば、このような方法は、（１）少なくとも１種のＨＡポリペプチドを含むサンプルを提供する工程、（２）候補アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを含むグリカンアレイと、サンプルを接触させる工程、および（３）アレイ上の１種以上の候補デコイへのＨＡポリペプチドの結合を検出する工程を含む。

ある実施形態において、例えば、本発明は、以下の工程を包含する、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを同定または特徴付けするための方法を提供する：（１）各々が少なくとも１種のＨＡポリペプチドの異なる希釈を含む複数のサンプルを提供する工程、（２）候補アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを含むグリカンアレイと、複数のサンプルを接触させる工程、および（３）アレイ上の１種以上の候補デコイへの異なる希釈のＨＡポリペプチドの結合を検出する工程。

ある実施形態において、例えば、本発明は、以下の工程を包含する、グリカンアレイを使用して、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを同定または特徴付けするための方法を提供する：（１）少なくとも１種のＨＡポリペプチドを含むサンプルを提供する工程、（２）少なくとも１種の候補アンブレラ−トポロジーグリカンデコイの複数の希釈を含むグリカンアレイと、サンプルを接触させる工程、および（３）アレイ上の１種以上の複数の候補デコイの希釈へのＨＡポリペプチドの結合を検出する工程。

ある実施形態において、例えば、本発明は、以下の工程を包含する、グリカンアレイを使用して、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを同定または特徴付けするための方法を提供する：（１）各々が少なくとも１種のＨＡポリペプチドの異なる希釈を含む、複数のサンプルを提供する工程、（２）少なくとも１種の候補アンブレラ−トポロジーグリカンデコイの複数の希釈を含むグリカンアレイと、複数のサンプルを接触させる工程、および（３）アレイ上の１種以上の複数の候補デコイの希釈への、異なる希釈のＨＡポリペプチドの結合を検出する工程。

ある実施形態において、上記のような方法は、候補デコイおよび既知のアンブレラ−トポロジーグリカンの濃度範囲にわたって、候補デコイが既知のアンブレラ−トポロジーグリカンと競合する能力を評価するために使用される（例えば、候補デコイ：既知のアンブレラ−トポロジーグリカン比率は、約１：１０００未満、約１：１０００、約１：１００、約１：５０、約１：２０、約１：１０、約１：５、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約５：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、および／または約１０００：１より大きな値）。ある実施形態において、上記のような方法は、ＨＡポリペプチドの濃度範囲（例えば、約１００μｇ／ｍｌより高濃度、約１００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約１．７５μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約１．２５μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌ、および／または約０．０１μｇ／ｍｌ未満）にわたって、候補デコイが既知のアンブレラ−トポロジーグリカンと競合する能力を評価するために使用される。

本発明に従うグリカンアレイと接触されるＨＡポリペプチドを含むサンプルの適切な供給源には、病理学的サンプル、例えば、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、真皮病変スワブ、脳脊髄液、子宮頸部スミア、膿サンプル、食品マトリックス、ならびに身体の種々の部分からの組織、例えば、脳、脾臓、および肝臓が含まれるがこれらに限定されない。代替的にまたは加えて、ＨＡポリペプチドを含むサンプルの他の適切な供給源には、土壌、水、およびフローラなどの環境サンプルが含まれるがこれらに限定されない。さらに他のサンプルには、実験室サンプル、例えば、研究者によって設計および／または調製された操作されたＨＡポリペプチドのサンプルが含まれる。列挙されていない他のサンプルもまた適用され得る。

グリカンアレイ結合するＨＡポリペプチドをアッセイするために適切な広範な種々の検出系が当該分野において公知である。例えば、ＨＡポリペプチドは、アレイと接触させる前またはその後に検出可能に標識可能であり（直接的または間接的に）；次いで、結合は、局在化した標識の検出により検出可能である。ある実施形態において、スキャン装置は、アレイ上の特定の位置を調べるために利用可能である。

代替的にまたは加えて、整列したグリカンへの結合は、例えば、比色分析（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）、蛍光、もしくは放射能の検出系、または他の標識方法、または標識を必要としない他の方法を使用して測定可能である。一般的に、蛍光検出は、典型的には、蛍光分子でアレイを直接にプロービングすること、および蛍光シグナルをモニターすることを含む。代替的にまたは加えて、アレイは、間接的な蛍光検出のために（この場合は、蛍光標識されたストレプトアビジンの結合について試験することによって）タグ化された（例えば、ビオチンで）分子を用いてプロービング可能である。代替的にまたは加えて、整列されたグリカンが蛍光標識され、試験分子がプロービングされる蛍光クエンチング法が利用可能である（これは、異なる蛍光団で標識されてもよく、標識されなくてもよい）。このような実施形態において、アレイへの結合は、整列されたグリカンから発光される蛍光を抑圧するように作用し、それゆえに、結合は蛍光発光の損失によって検出される。代替的にまたは加えて、整列されるグリカンは、放射活性物質の存在下で増殖した生組織サンプルでプロービング可能であり、放射活性標識したプローブを生じる。このような実施形態における結合は、放射活性発光を測定することによって検出可能である。

このような方法は、ＨＡポリペプチドによるグリカンアレイへの結合の事実および／または結合の程度を決定するために有用である。本発明のある実施形態において、このような方法は、グリカン−ＨＡポリペプチド相互作用に干渉するか、さもなくば変化させる因子を同定および／または特徴付けするためにさらに使用可能である。

以下に記載される方法は、例えば、ＨＡポリペプチドと相互作用可能であると考えられているグリカン（例えば、推定のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ）が実際にそうすることができるかを同定する際に、またはデコイが予想に反してＨＡポリペプチドとの相互作用する能力を有するか否かを同定するために、特定の用途があり得る。

ある実施形態において、グリカンアレイへの結合は、例えば、ＨＡポリペプチドとグリカンの間の相互作用の反応速度論を決定するために利用され得る。例えば、相互作用の反応速度論を決定するための方法は、（１）試験されるＨＡポリペプチドとグリカンアレイを接触させる工程；および（２）ＨＡポリペプチドと整列されたグリカンの間の相互作用の反応速度論を測定する工程を含み得る。

アレイにおける任意のグリカンとの結合因子の相互作用の反応速度論は、上記に詳述されるように、例えば、比色分析または蛍光のシグナルのリアルタイム変化によって測定可能である。このような方法は、例えば、特定の結合因子が、同じグリカンおよび／またはグリカンのセットと相互作用する異なる結合因子よりも、高度な結合で特定の炭水化物を相互作用可能であるか否かを決定する際に、特定の用途があり得る。

当然、ＨＡポリペプチドによるグリカン結合は、アレイ形式それ自体の中には存在しない、グリカンのサンプルまたは供給源に対して評価できることが理解される。例えば、ＨＡポリペプチドは、それらのグリカン結合特性を評価するために、組織サンプルおよび／または細胞系統に結合可能である。適切な細胞系統には、例えば、種々の哺乳動物細胞系統のいずれか、特に、アンブレラ−トポロジーグリカン（例えば、その少なくともいくつかはα２−６シアル化グリカン、および特に、長いα２−６シアル化グリカンであり得る）を含むＨＡ受容体を発現するものが含まれる。ある実施形態において、利用される細胞系統は、アンブレラ−トポロジーを有する個々のグリカンを発現する。ある実施形態において、利用される細胞系統は多様なグリカンを発現する。ある実施形態において、細胞系統は臨床的単離物から得られる；ある実施形態において、これらは、所望のグリカン部分および／または有病率を有するように維持または操作されている。ある実施形態において、組織サンプルおよび／または細胞系統は、哺乳動物上気道上皮細胞に特徴的なグリカンを発現する。

薬学的組成物
本発明は、インフルエンザ感染の処置において使用されるアンブレラ−トポロジーグリカンデコイを提供する。ある実施形態において、本発明は、グリカンデコイおよび少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明は、インフルエンザ感染に罹患しているか、および／またはそれに感受性がある被験体への投与のために適切に製剤化された、治療有効量の本発明のグリカンデコイを含む薬学的組成物を提供する。このような薬学的組成物は、１種以上のさらなる治療活性物質を任意に含み得る。

いくつかの実施形態に従って、インフルエンザ感染を処置する方法が提供される。ある実施形態において、本発明の方法は、本発明の少なくとも１種のグリカンデコイを含む薬学的組成物を、その必要がある被験体に投与する工程を含む。本発明のグリカンデコイは、インフルエンザ感染の徴候を処置するために使用される他の医薬とともに投与されてもよい。ある実施形態において、この組成物はヒトに投与される。

ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、複数の個々のアンブレラ−トポロジーグリカン模倣物を含む。ある実施形態において、このような個々のアンブレラ−トポロジーグリカン模倣物はこれらに対応する比率で提供され、ここでは、このようなアンブレラ−トポロジーグリカンが本来はＨＡ受容体上で、および特にヒト呼吸管（例えば、ヒト上気道）で見い出される。例えば、ヒト気管支上皮細胞は、典型的には、図１２および１３に図示されたようなグリカン分布を示し；ある実施形態において、本発明のグリカンデコイ組成物は、このような分布に対して適切な比率である個々のグリカン模倣物を含む。ある実施形態において、この組成物はアンブレラ−トポロジーグリカンで富化され、例えば、組成物中のアンブレラ−トポロジーグリカン：コーントポロジーグリカンの比率は、ヒト呼吸管（例えば、ヒト上気道）において見い出されるものよりも大きい。ある実施形態において、アンブレラ−トポロジーグリカンは、組成物中のグリカンの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％（数または重量）である。

ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、アンブレラ−トポロジーグリカン以外のグリカンを模倣する因子を実質的に含まない。例えば、ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、コーン−トポロジーグリカンを模倣する因子を実質的に含まない。

本発明は、インフルエンザ感染の処置のために活性成分として少なくとも１種のグリカンを含む薬学的組成物の調製および／または使用を包含する。このような薬学的組成物は、被験体への投与のために適切な型で、活性成分単独からなってもよく、または薬学的組成物は活性成分、ならびに１種以上の薬学的に受容可能な賦形剤、１種以上のさらなる成分、および／もしくはこれらの組み合わせを含んでもよい。活性成分は、当該分野において周知であるように、例えば、生理学的に受容可能であるカチオンおよび／またはアニオンと組み合わせた、生理学的に受容可能なエステルおよび／または塩の型である薬学的組成物中に存在し得る。

本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、主として、ヒトへの投与のために適切である薬学的組成物に向けられているが、このような組成物は、一般的に、すべての種類の動物への投与のために適切であることが当業者によって理解される。組成物を種々の動物への投与のために適切にするために、ヒトへの投与のために適切である薬学的組成物の改変は十分に理解されており、通常の技能を有する獣医学薬理学者は、もしあれば、単なる通常の実験を伴って、このような改変を設計および／または実施できる。本発明の薬学的組成物の投与が意図される患者には以下が含まれるがこれらに限定されない：ヒトおよび他の霊長類；商業的に関連がある哺乳動物を含む哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、および／もしくはイヌ；ならびに／またはニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業的に関連がある鳥類を含む鳥類。

本明細書に記載されるような薬学的組成物は、薬剤学の分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般的に、このような調製方法は、１種以上の賦形剤、および／または１種以上の他の付属成分と活性成分を一緒にする工程、次いで、必要な場合および／または所望される場合、製品を単回用量または複数用量に成型および／またはパッケージングする工程を含む。

本発明の薬学的組成物は、単回単位用量、および／または複数の単回単位用量として、調製、包装、および／またはバルク販売されてもよい。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般的に、被験体に投与される活性成分の投薬量、および／またはこのような投薬量の便利な画分、例えば、このような投薬量の半分または３分の１などに等しい。

本発明の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に受容可能な賦形剤、および／またはさらなる成分の相対量は、処置される被験体の同一性、サイズ、および／または状態に依存して、さらに、組成物が投与される経路に依存して、変化する。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）までの間の活性成分を含み得る。

本発明の薬学的製剤は、さらに薬学的に受容可能な賦形剤を含み得、これは、本明細書で使用される場合、所望される特定の剤型に適するように、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、濃厚剤もしくは乳化剤、保存料、固体結合剤、潤滑剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６）は、薬学的組成物を製剤化する際に使用される種々の賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示している。例えば、所望されない生物学的効果を生じるか、またはさもなくば薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって、任意の従来的な賦形剤が、物質またはその誘導体と適合可能でない場合を除き、その使用は、本発明の範囲内にあることが意図される。

ある実施形態において、薬学的に受容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％純粋である。ある実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用または獣医学的な使用のために認可されている。ある実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可されている。ある実施形態において、賦形剤は医薬品グレードである。ある実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（ＵＳＰ）、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）（ＥＰ）、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、および／または国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たしている。

薬学的組成物の製造において使用される薬学的に受容可能な賦形剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：不活性希釈剤、分散剤および／もしくは造粒剤、表面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存料、緩衝剤、潤滑剤、ならびに／またはオイル。このような賦形剤は、本発明の製剤中に任意に含まれ得る。ココアバターおよび坐剤ワックス、着色料、コーティング剤、甘味料、香料、および矯味矯臭剤などの賦形剤は、製剤者の判断に従って組成物中に存在することができる。

例示的な希釈剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カリウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末砂糖など、およびこれらの組み合わせ。

例示的な造粒剤および／または分散剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クレイ、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品。天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、シリケート、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポピドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（グリコール酸デンプンナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカメロース）、メチルセルロース、プレゼラチン化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、アルミニウムシリケートマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ）、ラウリル硫酸ナトリウム、４級アンモニウム化合物など、およびこれらの組み合わせ。

例示的な表面活性剤および／または乳化剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド性クレイ（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶＥＥＧＵＭ［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラゲナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびＳＯＬＵＴＯＬ）、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ １８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、および／またはこれらの組み合わせ。

例示的な結合剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：デンプン（例えば、コーンスターチおよびデンプン糊）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールゴム（ｐａｎｗａｒ ｇｕｍ）、ガッチゴム（ｇｈａｔｔｉ ｇｕｍ）、イサポール・ハスク（ｉｓａｐｏｌ ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ）、およびカラマツアラボガラクタン（ｌａｒｃｈ ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸；ポリエチレンオキサイド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコールなど；およびこれらの組み合わせ。

例示的な保存料としては、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物性保存料、抗真菌性保存料、アルコール保存料、酸性保存料、および他の保存料が挙げられ得る。例示的な抗酸化剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、アコルビルパルミテート（ａｃｏｒｂｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、およびエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗微生物性保存料としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリマイド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗真菌性保存料としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアルコール保存料としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、およびフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な酸性保存料としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の保存料としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリマイド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ^ＴＭ、ＫＡＴＨＯＮ、およびＥＵＸＹＬが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、保存料は抗酸化剤である。他の実施形態において、保存料はキレート剤である。

例示的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、カルシウムヒドロキサイドホスフェート、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、グリセリルベハネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｂｅｈａｎａｔｅ）、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な油としては、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ種子油、ルリヂサ油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェー油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター、ココナッツ油、タラ肝油、コーヒー油、コーン油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、リツェアクベバ油、マカダミアナッツ油、アオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ種子油、カボチャ種子油、菜種油、米糠油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サザンカ油、サボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバル油、クルミ油、および小麦胚芽油が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な油としては、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコーン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイル、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

経口および非経口投与のための液体剤型としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤型は、当該分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの組み合わせを含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、矯味矯臭剤、および香料を含み得る。非経口投与のための特定の実施形態において、活性成分は、可溶化剤、例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマーおよびこれらの組み合わせと混合される。

注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の技術に従って、製剤化されてもよい。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の、滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョン（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および塩化ナトリウム等張液がある。さらに、滅菌固定油が、溶媒または懸濁化媒体として通常使用されている。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の滅菌固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製において使用される。

注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または、使用前に滅菌剤を、滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態に取り込むことによって、滅菌され得る。

薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋内注射からの薬物の吸収を遅延させることがしばしば望ましい。これは、水溶性が乏しい結晶性材料またはアモルファス材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは次には、結晶サイズおよび結晶形態に依存する可能性がある。あるいは、非経口投与される薬物形態の吸収の遅延は、油ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁することによって達成される。

直腸投与または膣投与のための組成物は、典型的には、本発明の活性成分を、好適な非刺激性賦形剤、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスとを混合することによって調製され得る坐剤であり、これらの賦形剤は、周囲温度で固体であるが体温では液体であり、従って、直腸腔および膣腔において融解して活性成分を放出する。

経口投与のための固体剤型としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤型において、活性成分は、以下と混合される：少なくとも１種の不活性な薬学的に受容可能な賦形剤、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または（ａ）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、スクロース、およびアカシアなど、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ、ならびに／あるいは（ｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤型は緩衝剤を含み得る。

同様の型の固体組成物が、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟質および硬質ゼラチンカプセル剤において充填剤として利用され得る。錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤型は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび製剤分野において周知である他のコーティングを用いて調製され得る。これらは、任意で乳白剤を含有してもよく、かつそれらが腸管の特定の部分においてのみまたはそこにおいて優先的に、任意に、遅延様式で、活性成分を放出する組成のものであり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。同様のタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する軟質および硬質ゼラチンカプセル剤において充填剤として使用され得る。
活性成分は、上述のような１種以上の賦形剤を用いるマイクロカプセル化型であり得る。錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤型は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティング、放出制御コーティング、および製剤分野において周知である他のコーティングを用いて調製され得る。このような固体剤型において、活性成分は、少なくとも１種の不活性希釈剤、例えば、スクロース、ラクトース、またはデンプンと混合され得る。このような剤型は、通常の実務であるように、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、錠剤滑沢剤および他の錠剤助剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースを含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤型は緩衝剤を含み得る。これらは、任意で乳白剤を含有してもよく、かつそれらが腸管の特定の部分においてのみまたはそこにおいて優先的に、任意に、遅延様式で、活性成分を放出する組成のものであり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、高分子物質およびワックスが挙げられる。

本発明の組成物の局所投与および／または経皮投与のための剤型は、軟膏剤、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、散剤、溶液、スプレー、吸入剤、および／またはパッチを含み得る。一般的に、活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に受容可能な賦形剤および／または任意の必要とされる保存剤および／または必要とされ得る緩衝剤と混合される。さらに、本発明は、経皮パッチの使用を意図し、これは、身体への活性成分の制御送達を提供するという付加的な利点をしばしば有する。このような剤型は、例えば、適切な媒体に活性成分を溶解および／または分散することによって、調製され得る。代替的にまたは加えて、速度は、速度制御メンブレンを提供することによって、ならびに／またはポリマーマトリクスおよび／もしくはゲルに活性成分を分散することのいずれかによって、制御され得る。

本明細書に記載される皮内用薬学的組成物の送達における使用のために適切なデバイスとしては、短い針のデバイス、例えば、米国特許第４，８８６，４９９号；第５，１９０，５２１号；第５，３２８，４８３号；第５，５２７，２８８号；第４，２７０，５３７号；第５，０１５，２３５号；第５，１４１，４９６号；および第５，４１７，６６２号に記載されるものが挙げられる。皮内用組成物は、皮膚中への針の有効な貫入長を制限するデバイス、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／３４８５０に記載のもの、およびその機能的な等価物によって投与され得る。液体ジェット式注射器を介して、および／または角質層を貫通しかつ真皮に達するジェットを生じる針を介して、液体ワクチンを真皮へ送達するジェット式注射デバイスが適切である。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；第５，５９９，３０２号；第５，３３４，１４４号；第５，９９３，４１２号；第５，６４９，９１２号；第５，５６９，１８９号；第５，７０４，９１１号；第５，３８３，８５１号；第５，８９３，３９７号；第５，４６６，２２０号；第５，３３９，１６３号；第５，３１２，３３５号；第５，５０３，６２７号；第５，０６４，４１３号；第５，５２０，６３９号；第４，５９６，５５６号；第４，７９０，８２４号；第４，９４１，８８０号；第４，９４０，４６０号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ ９７／３７７０５およびＷＯ ９７／１３５３７に記載されている。圧縮ガスを使用して粉末型のワクチンを皮膚の外層を通って真皮まで加速する射撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）粉末／粒子送達デバイスが適切である。代替的にまたは加えて、従来的な注射器が、皮内投与の古典的なマントー法（ｍａｎｔｏｕｘ ｍｅｔｈｏｄ）において使用され得る。

局所投与のために適切な製剤には、液体および／または半液体調製物、例えば、リニメント、ローション、水中油型および／または油中水型エマルジョン、例えば、クリーム、軟膏および／またはペースト、および／または液剤、および／または懸濁剤が挙げられるが、これらに限定されない。局所的に投与可能な製剤は、例えば、約１．０％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中における活性成分の溶解限界と同程度まで高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載される１種以上の賦形剤および／またはさらなる成分をさらに含み得る。

本発明の薬学的組成物は、頬側口腔を介しての肺投与のために適切な製剤中で、調製、包装、および／または販売され得る。このような製剤は、活性成分を含みかつ約０．５μｍ〜約７μｍ、または約１μｍ〜約６μｍの範囲内にある直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、好都合に、噴射剤の流れが粉末を分散するように指向され得る乾燥粉末リザーバを備えるデバイスを使用し、ならびに／または、密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および／もしくは懸濁された活性成分を含むデバイスのような自己噴射溶媒／粉末分散容器（ｓｅｌｆ ｐｒｏｐｅｌｌｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ／ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を使用する、投与のための乾燥粉末型である。このような粉末は、重量で少なくとも９８％の粒子が０．５μｍを超える直径を有し、かつ数で少なくとも９５％の粒子が７μｍ未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、重量で少なくとも９５％の粒子が１μｍを超える直径を有し、かつ数で少なくとも９０％の粒子が６μｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微細粉末希釈剤を含み得、好都合には単位剤形で提供される。

低沸点噴射剤は、一般的に、大気圧で６５°Ｆより下の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般的に、噴射剤は、組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してもよく、活性成分は、組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成してもよい。噴射剤は、さらに、液体非イオン性界面活性剤および／もしくは固体アニオン性界面活性剤、ならびに／または固体希釈剤（これは、活性成分を含む粒子と同一のオーダーの粒度を有し得る）などのさらなる成分を含み得る。

肺送達のために製剤化された本発明の薬学的組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の型で活性成分を提供し得る。このような製剤は、任意に、滅菌性である、活性成分を含む水性および／もしくは希薄アルコール溶液ならびに／または懸濁液として、調製、包装、および／または販売され得、好都合には、任意の噴霧化および／または微粒化装置を使用して投与され得る。このような製剤は、さらに、サッカリンナトリウムなどの矯味矯臭剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／またはヒドロキシ安息香酸メチルなどの保存剤を含むがこれらに限定されない、１種以上のさらなる成分を含み得る。この投与の経路によって提供される液滴は、約０．１μｍ〜約２００μｍの範囲の平均直径を有し得る。

肺送達のために有用であると本明細書に記載される製剤は、本発明の薬学的組成物の鼻内送達のために有用である。鼻内投与のために適切である別の製剤は、活性成分を含みかつ約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗い粉末である。このような製剤は、嗅剤が摂取される様式で、すなわち、鼻孔の近くに保持された粉末の容器から鼻腔を通る迅速な吸入によって、投与される。

経鼻投与のために適切である製剤は、例えば、０．１％（ｗ／ｗ）程度の少ない量〜１００％（ｗ／ｗ）程度の多い量までの活性成分を含み得、かつ本明細書に記載される１種以上の賦形剤および／またはさらなる成分を含み得る。本発明の薬学的組成物は、頬側投与のために適切な製剤中で、調製、包装、および／または販売され得る。このような製剤は、例えば、従来の方法を使用して作製される錠剤および／またはロゼンジの型であり得、かつ、例えば、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得、残りは、口腔内で溶解可能なおよび／または分解可能な組成物、および、任意で、本明細書に記載される１種以上の賦形剤および／またはさらなる成分を含む。あるいは、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む粉末、ならびに／またはエアロゾル溶液および／もしくは噴霧溶液および／もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末製剤、エアロゾル製剤、および／またはエアロゾル製剤は、分散されると、約０．１μｍ〜約２００μｍの範囲の平均粒子および／または液滴サイズを有し得、かつさらに本明細書に記載される１種以上の賦形剤および／またはさらなる成分を含み得る。

本発明の薬学的組成物は、点眼投与のために適切である製剤中で、調製、包装、および／または販売され得る。このような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／または懸濁液を含む、例えば、点眼剤の型形態であり得る。このような点眼剤は、さらに、本明細書に記載される緩衝剤、塩、および／または１種以上の賦形剤および／またはさらなる成分を含み得る。他の有用である眼科的投与可能な製剤としては、微結晶型および／またはリポソーム調製物で活性成分を含むものが挙げられる。点耳剤および／または点眼剤は、本発明の範囲内にあることが意図される。

医薬品の製剤化および／または製造における一般的な考慮すべき事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照としてここに援用される）において見出すことができる。

インフルエンザ感染を処置するための方法
本発明は、インフルエンザ感染を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、このような方法は、１種以上の本発明のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイをその必要がある被験体に投与する工程を包含する。ある実施形態において、グリカンデコイは、ＨＡ（例えば、インフルエンザウイルスの表面上に発現されたＨＡ）がアンブレラ−トポロジーグリカン（例えば、ヒト上気道上皮組織、例えば、気管および気管支）に結合する能力を阻害する。

ある実施形態において、本発明は、少なくとも１種のグリカンデコイおよび少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。他の局面において、グリカンデコイを含む薬学的組成物は、細胞、例えば、インフルエンザ感染に罹患しているか、および／またはそれに対して感受性である患者における細胞に投与される。ある実施形態において、本発明のグリカンデコイは、インフルエンザ感染の処置のために使用される。特定の実施形態において、本発明のグリカンデコイは、インフルエンザウイルス粒子（例えば、ＨＡポリペプチドを含む）がＨＡ受容体（例えば、アンブレラ−トポロジーグリカンを含む）に結合する能力を阻害するために使用される。

ある実施形態において、本発明のグリカンデコイは、以下の徴候の１つ以上の処置において使用される：発熱、のどの痛み、筋肉痛、激しい頭痛、咳、虚弱、全体的な不快感、肺炎、悪心、および／または嘔吐。特定の実施形態において、これらの徴候は、インフルエンザ感染によって引き起こされる。

ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、インフルエンザ感染に罹患しているかまたはそれに感受性である被験体に投与される。ある実施形態において、被験体がインフルエンザ感染に一般的に付随する１つ以上の徴候を示している場合に、その被験体はインフルエンザ感染に罹患していると見なされる。ある実施形態において、被験体は、インフルエンザウイルスに曝露されていたことが知られているか、またはそう信じられている。ある実施形態において、被験体がインフルエンザウイルスに曝露されていたことが知られているか、またはそう信じられている場合に、その被験体はインフルエンザ感染に対して感受性であると見なされる。ある実施形態において、被験体がインフルエンザウイルスに感染したことが知られているかもしくはそのように疑われている他の個体と接触していた場合、および／または被験体がインフルエンザ感染が流行していることが知られているかもしくはそう考えられている場所にいるかもしくは居た場合に、その被験体はインフルエンザウイルスに曝露されていたことが知られているか、またはそう信じられている。

ある実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、インフルエンザ感染を処置する方法を提供する：（１）インフルエンザ感染の徴候を示す患者を提供する工程、および（２）治療量の１種以上のグリカンデコイを患者に投与する工程。ある実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、インフルエンザ感染を処置する方法を提供する：（１）インフルエンザ感染に罹患している患者を提供する工程、および（２）治療量の１種以上のグリカンデコイを患者に投与する工程。ある実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、インフルエンザ感染を処置する方法を提供する：（１）インフルエンザ感染に感受性である患者を提供する工程、および（２）治療量の１種以上のグリカンデコイを患者に投与する工程。

ある実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、インフルエンザ感染を処置する方法を提供する：（１）インフルエンザ感染の徴候を示すか、インフルエンザ感染に罹患しているか、および／またはインフルエンザ感染に対して感受性である患者を提供する工程、ならびに（２）ヒト上気道組織において、アンブレラ−トポロジーグリカンとのＨＡポリペプチド（例えば、インフルエンザウイルス粒子と結合したＨＡポリペプチド）の結合を競合除外する物質を投与する工程。

ある実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、インフルエンザ感染の発症を予防および／または遅延させる方法を提供する：（１）インフルエンザ感染に対して感受性である患者を提供する工程、ならびに（２）治療量の１種以上のグリカンデコイを患者に投与する工程。

ある実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、インフルエンザ感染の発症を予防および／または遅延させる方法を提供する：（１）インフルエンザ感染に対して感受性である患者を提供する工程、ならびに（２）ヒト上気道組織において、アンブレラ−トポロジーグリカンとのＨＡポリペプチド（例えば、インフルエンザウイルス粒子と結合したＨＡポリペプチド）の結合を競合除外する物質を投与する工程。

投与
本発明のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイは、インフルエンザ感染の処置において有用である。従って、１種以上の本発明のグリカンデコイを含む薬学的組成物は、インフルエンザ感染に罹患しているか、それに対して感受性であるか、および／またはその徴候を示す１例以上の個体に投与されてもよい。それゆえに、本発明は、ＨＡポリペプチド（例えば、インフルエンザウイルス粒子と結合したＨＡポリペプチド）とアンブレラ−トポロジーグリカン（例えば、ヒト上気道上皮組織のグリカン）の間の結合を阻害する方法、ならびに被験体におけるインフルエンザ感染を処置する方法を包含する。

ある実施形態において、グリカンデコイを含む治療有効量の薬学的組成物は、インフルエンザ感染の診断の前、それと同時に、および／またはその後に、被験体および／または生物に到達される。ある実施形態において、治療有効量の薬学的組成物は、インフルエンザ感染の徴候の発症の前、それと同時に、および／またはその後に、患者および／または生物に到達される。ある実施形態において、薬学的組成物の量は、インフルエンザ感染の１つ以上の徴候または特徴を処置し、軽減し、改善し、緩和し、その発症を遅延させ、その進行を阻害し、その重篤度を減少させ、および／またはその発生を減少させるために十分である。

本発明の方法に従う薬学的組成物は、処置のために有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および全体的な状態、感染の重篤度、特定の組成、その投与様式、その活性様式などに依存して、被験体から被験体で変化する。本発明の組成物は、典型的には、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、単位剤型で製剤化される。しかし、本発明の組成物の全体の毎日の使用法は、正しい医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。任意の特定の被験体または生物のための特定の治療有効用量レベルは、処置される障害および障害の重篤度；利用される特定の活性成分の活性；利用される特定の組成物；被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事；投与時間、投与経路、および利用される特定の活性成分の排出速度；処置期間；利用される特定の活性成分と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医薬分野において周知である同様の因子などを含む、種々の因子に依存する。

本発明の薬学的組成物は任意の経路によって投与され得る。ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、以下を含む種々の経路によって投与される：経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、非経口、皮下、脳室内、経皮、皮内（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏、クリーム、ゲル、および／またはドロップによる）、経皮、粘膜、鼻、頬側、腸、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入による；および／または、口腔スプレー、鼻腔スプレー、および／またはエアロゾルによる。ある実施形態において、本発明の組成物は静脈内投与される。ある実施形態において、本発明の組成物は経口投与される。ある実施例において、本発明の組成物は、ポンプを使用して送達できる（例えば、外部ポンプまたは被験体の体内に移植されるポンプ、例えば、機械ポンプおよび／または浸透圧ポンプ）。

一般的には、最も適切な投与の経路は、組成物の性質（胃腸管の環境中でのその安定性）、被験体の状態（被験体が経口投与に耐えることが可能か否か）などを含む種々の因子に依存する。

特定の実施形態において、組成物は、所望の治療効果を得るために、１日１回以上、１日あたり、被験体の体重あたり、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与され得る。所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、３日に１回、毎週、２週ごと、３週ごと、または４週ごとに、送達され得る。ある実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の回数の投与）を使用して送達され得る。

本発明の治療剤および薬学的組成物は、組み合わせ治療において利用することができることが理解される。ある実施形態において、本発明は、本発明の組成物を含む「治療カクテル」を包含する。組み合わせレジメンにおいて利用するための治療（治療剤または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療剤および／または手順の適合性、ならびに達成される所望の治療効果を考慮に入れる。利用される複数の治療は、同じ目的のために所望の効果を達成し得ることが理解される。例えば、グリカンデコイは、インフルエンザ感染の徴候を治療するために使用される別の薬剤とともに投与されてもよい。ある実施形態において、利用される複数の治療は、異なる効果を達成してもよい（例えば、任意の有害な副作用の制御）。

本発明の薬学的組成物は、単独で、または１種以上の他の治療剤と組み合わせるかのいずれかで投与され得る。「組み合わせる」により、薬剤が同時に投与されなければならないこと、および／または同時送達のために製剤化されなければならないことを意味すると意図されるものではないが、これらの送達方法は本発明の範囲内にある。組成物は、１種以上の他の所望の治療または医学的手順と同時に、その前に、またはその後に、投与することができる。一般的に、各薬剤は、その薬剤に関して決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与される。さらに、本発明は、本発明の薬学的組成物のバイオアベイラビリティーを改善し、本発明の薬学的組成物の代謝を低下および／もしくは改変し、本発明の薬学的組成物の排出を抑制し、ならびに／または本発明の薬学的組成物の体内での分布を改変し得る薬剤と組み合わせる、本発明の薬学的組成物の送達を包含する。

組み合わせレジメンにおいて利用するための特定の治療（治療剤および／または手順）の組み合わせは、所望の治療剤および／もしくは手順の適合性、ならびに／または達成される所望の治療効果を考慮に入れている。利用される治療が同じ障害のための所望の効果を達成してもよく（例えば、本発明の薬剤は、インフルエンザ感染を処置するために使用される別の治療剤と同時に投与されてもよい）、および／またはこれらは異なる効果を達成してもよい（例えば、有害な副作用の制御）ことが理解される。ある実施形態において、本発明の組成物は、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可された第２の治療剤とともに投与される。

組み合わせて利用される治療的に活性な薬剤は、単一の組成物中で一緒に投与されてもよく、または異なる組成物中で別々に投与されてもよいことがさらに理解される。

ある実施形態において、本発明のグリカンデコイは、１種以上の他のグリカンデコイと組み合わせて投与されてもよい。

一般的に、組み合わせて使用される薬剤は、それらが個別に利用されるレベルを超えないレベルで使用されることが予測される。ある実施形態において、組み合わせて利用されるレベルは、個別に使用されるレベルよりも低い。

本発明の薬学的組成物は、単独で、および／またはインフルエンザ感染を処置するために使用される別の治療剤とともに投与されてもよい。ある実施形態において、このような薬剤はＨＡポリペプチドの発現または活性を阻害する。特定の実施形態において、このような薬剤には、抗体、例えば、特定のＨＡポリペプチド（例えば、アンブレラ−トポロジーグリカンに結合するＨＡポリペプチド）を含むウイルス粒子を認識する抗体が含まれる。特定の実施形態において、このような薬剤には核酸（例えば、ＲＮＡｉのために使用できる、ＨＡ配列に相補的な核酸配列）が含まれる。ある実施形態において、このような薬剤にはタミフル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））が含まれる。

ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、単独で、ならびに／またはインフルエンザ感染を予防するため、および／もしくはその発症を遅延させるために使用される別の治療剤とともに投与されてもよい。ある実施形態において、このような薬剤にはインフルエンザワクチンが含まれる。特定の実施形態において、インフルエンザワクチンは以下の１つ以上を含む組成物である：（１）不活化ウイルス、（２）弱毒化生インフルエンザウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（３）ＨＡポリペプチドまたはその特徴的もしくは生物学的に活性な部分、（４）ＨＡポリペプチドまたはその特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸、（５）ＨＡポリペプチドまたはその特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードするＤＮＡベクター、および／あるいは（６）発現系、例えば、抗原として使用される１種以上のインフルエンザタンパク質を発現する細胞。

特定の実施形態において、不活化インフルエンザワクチンは、３種類の型の抗原調製物：不活化全ウイルス、精製ウイルス粒子が洗剤もしくは他の試薬で破壊されて脂質エンベロープを可溶化しているサブビリオン（「分裂」ワクチン）、または精製ＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）のうちの１種を含む。特定の実施形態において、ウイルスは、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０）を伴うエーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、およびＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウム、およびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートを用いる処理によって不活化することができる。不活化は、尿膜腔液（ウイルスは卵の中でここから産生する）の清澄化後またはその前に行うことができる；ビリオンは、遠心分離によって単離および精製される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｌｄｅｎ，ＭＡ，１９９８）。ワクチンの効力を評価するために、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）を使用できる（Ｓｃｈｉｌｄら、１９７５，Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．，５２：４３−５０ ＆ ２２３−３１；およびＭｏｓｔｏｗら、１９７５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：５３１；これらの両方が参照として本発明に援用される）。ある実施形態において、本発明の薬学的組成物は、弱毒化生インフルエンザワクチンとともに投与されてもよい。ある実施形態において、ワクチンは１種以上のアジュバントを含む。

当業者は、上記に提示した例が限定を意味するわけではないことを理解している。上記の例に提示される原則は、インフルエンザ感染の処置のために任意の組み合わせ治療に一般的に適用することができる。

診断剤／キット
本発明は、１種以上の本発明のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイを含む種々のキットを提供する。例えば、本発明は、少なくとも１種のグリカンデコイおよび使用のための説明書を含むキットを提供する。キットは、複数の異なるグリカンデコイを含んでもよい。キットは、任意の組み合わせで、多数のさらなる成分または試薬のいずれかを含んでもよい。種々の組み合わせのすべてが例示的に示されるわけではないが、しかし、各々の組み合わせは本発明の範囲の中に含まれる。

ある実施形態において、本発明のキットにおいて利用される新規なグリカンデコイは、実験室で化学合成されてもよい。代替的にまたは加えて、新規なグリカンデコイは、血液、血清／血漿、末梢血単核細胞／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、真皮病変スワブ、脳脊髄液、子宮頸部スミア、膿サンプル、食品マトリックス、ならびに身体の種々の部分、例えば、脳、脾臓、および肝臓からの組織が含まれるがこれらに限定されない病理学的サンプルから単離されてもよい。ある実施形態において、新規なグリカンデコイは、土壌、水、およびフローラなどが含まれるがこれらに限定されない環境サンプルから単離されてもよい。列挙されていない他のサンプルもまた適用可能であり得る。

本発明の特定の実施形態に従って、キットは、例えば、（ｉ）アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ；（ｉｉ）インフルエンザ感染に罹患しているか、それに対する感受性があるか、および／またはその徴候を示す被験体にグリカンデコイを投与するための説明書を含み得る。

本発明の特定の実施形態に従って、グリカンデコイを同定するためのキットは、例えば、以下を含み得る：（ｉ）ＨＡポリペプチド；（ｉｉ）少なくとも１種の候補グリカンデコイ、例えば、複数の候補グリカンデコイを含むグリカンアレイ；（ｉｉｉ）陽性対照（例えば、ＨＡポリペプチドに結合することが知られているアンブレラ−トポロジーグリカン）；（ｉｖ）陰性対照（例えば、コーン−トポロジーグリカン）；（ｖ）ＨＡポリペプチドが候補デコイに結合可能であるか、または候補デコイがＨＡポリペプチドと陽性対照の間の結合を競合除外可能であるかを決定するための説明書。

キットは、典型的には、本発明のグリカンデコイの使用のための説明書を含む。説明書は、例えば、グリカンデコイの同定、その必要がある被験体へのグリカンデコイの投与などのためのプロトコールおよび／または条件を含み得る。キットは、一般的に、個々の成分および試薬のいくつかまたはすべてが別々に収納されるように、１つ以上の容器または箱を備えている。キットはまた、商業販売のために比較的密接に閉じこめた状態で個々の容器を同封するための手段、例えば、説明書、発泡スチロールなどの包装材料などが同封され得るプラスチックボックスも含んでもよい。識別子、例えば、バーコード、高周波識別（ＲＦＩＤ）タグなどが、キットの中もしくは上に、またはキットに含まれる１つ以上の容器もしくは箱の中に存在してもよい。識別子は、例えば、品質管理、在庫管理、追跡、ワークステーション間の移動などの目的のためにキットを独自に同定するために使用することができる。

特定の実施形態において、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットが、複数用量で（例えば、本明細書に記載されるように）、アンブレラ−トポロジーグリカンおよび／またはグリカンデコイ（例えば、候補アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ）へのＨＡポリペプチドの結合を評価するために使用されて、用量応答研究を実施する。このような研究は、試験されるＨＡポリペプチドの結合特性についての特に価値のある洞察を与え、特異的結合を評価するために特に有用である。この型の用量応答結合研究は、多くの有用な応用を見い出す。１つのみの例を与えるために、これらの研究は、ＨＡポリペプチド改変体の関連したシリーズの結合特性の進化を追跡する際に有用であり得、このことは、これらのシリーズが、天然の進化、意図的な操作、またはこれらの２つの組み合わせを通して生成されるかに関わらない。

以下に続く代表的な実施例は、本発明の例証を補助することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、そのように制限すると解釈されるべきではない。確かに、本明細書に示されかつ記載されていたものに加えて、本発明の種々の改変、およびその多くのさらなる実施形態は、以下に続く実施例および本明細書に引用される科学文献および特許文献への参照を含む、本文書の全体の内容から、当業者には明らかになる。当該分野の状態を例証することを補助するために、これらの引用文献の内容が、参照により本明細書に援用されることがさらに理解されるべきである。

以下の実施例は、本発明の実務に、その種々の実施形態およびその等価物で適用され得る、重要なさらなる情報、例証、および手引きを含んでいる。しかし、これらの実施例は、本発明を限定しないことが理解される。現在公知であり、および／またはさらに開発される本発明のバリエーションは、本明細書に記載され、および本明細書以後、特許請求されているように、本発明の範囲内に含まれる。

実施例１：Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５ ＨＡの、α２−３およびα２−６シアル化グリカンへの結合特異性についての枠組み
Ｈ１（ＰＤＢ ＩＤ：１ＲＤ８、１ＲＵ７、１ＲＵＹ、１ＲＶ０、１ＲＶＴ、１ＲＶＸ、１ＲＶＺ）、Ｈ３（ＰＤＢ ＩＤ：１ＭＱＬ、１ＭＱＭ、１ＭＱＮ）、およびＨ５（１ＪＳＮ、１ＪＳＯ、２ＦＫ０）からのＨＡならびにそれらのα２−３および／またはα２−６シアル化オリゴサッカリドとの複合体の結晶構造は、特異的ＨＡ−グリカン相互作用に関与する残基への分子的な洞察を提供した。これらのＨＡ−グリカン共結晶構造の分析は、Ｎｅｕ５Ａｃ糖（ＳＡ）の配向がＨＡグリカン結合部位に対して固定されていることを示した。異なるＨＡサブタイプにわたって高度に保存性であるアミノ酸のセット（Ｈ３ ＨＡに基づいて番号付けされたＴｙｒ９８、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ１９４を含む）は、ＳＡを固着することに関与している。従って、α２−３またはα２−６に対するＨＡの特異性は、グリコシドの酸素原子およびＳＡの向こうの糖とのＨＡグリカン結合部位の相互作用によって支配されている。

Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合のコンホメーションは、ＧａｌおよびＧａｌの向こうの糖（還元末端かつ直鎖状と分岐状の両方のα２−３）が、空間の「コーン様」領域を占め、かつこの結合におけるグリコシドのねじれ角によって支配されているようなものである；それゆえに、本発明者らは、これを「コーン様グリカントポロジー」と定義する（図６および７）。コーン様トポロジーにおいて、グリカンとのＨＡ相互作用は、主として、三糖（すなわち、トリサッカリド）α２−３モチーフ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−）におけるＮｅｕ５ＡｃおよびＧａｌ糖との接触を含み、この観察は、共結晶構造によって裏付けされる。アミノ酸Ｇｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６（図６）に加えて、α２−３モチーフとの接触ならびにこのモチーフの硫酸化およびフコシル化などの置換は、鍵となるアミノ酸の位置を含むようである（図６）。これらの位置におけるアミノ酸の変動性は、多様なα２−３シアル化グリカンへのＨＡの示差的な結合特異性を潜在的に説明可能である（以下を参照のこと）。Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ結合に対してと同様に、Ｃ６−Ｃ５結合の存在は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ結合の場合において、さらなるグリカンコンホメーションの柔軟性を提供する（図７）。この柔軟性は、コーン様トポロジー、ならびに、「アンブレラ」におけるような空間のより幅広い領域の両方を採用するα２−６モチーフをもたらし、従って、本発明者らはこれを「アンブレラ様グリカントポロジー」と定義する（図６および７）。従って、アンブレラ様トポロジーは、コーン様トポロジーよりも、ＨＡ表面上のより幅広い領域に広がる。コーン様トポロジーとは対照的に、トリサッカリドの向こうのオリゴサッカリドの長さおよび分枝の程度は、アンブレラ様トポロジーにおけるＨＡ結合接触に影響を与える。それゆえに、本発明は、アンブレラ様トポロジーとの相互作用に関与するアミノ酸（鍵となる番号付けされた位置は図６に示される）はヒト適合されたＨ１およびＨ３ ＨＡにわたって保存されていないという認識を包含する。ＨＡサブタイプに依存して、これらの位置におけるアミノ酸の組み合わせは、長いα２−６との相互作用に関与し、この観察は、α２−６オリゴサッカリドとのＨ１およびＨ３の共結晶構造によって裏付けされる。従って、コーン様トポロジーは、α２−３グリカンならびに短いα２−６グリカン、例えば、単一のラクトサミン分枝に特徴的である（図８）。他方、アンブレラ様トポロジーはα２−６に独特であり、典型的には、複数の繰り返しラクトサミン単位を有する長いグリカンによって採用される（図９）。

ＨＡ−グリカン共結晶構造の問い合わせは、ヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡがそれらの推測されるトリ対応物から変異し、アンブレラ様トポロジーにおけるα２−６とのさらなる接触を得たという事実を強調する。トランスコンホメーションおよびシスコンホメーション（それぞれ、α２−３結合およびα２−６結合によって採用される）に基づいてＨＡ−グリカン相互作用を定義することは、不十分である。なぜなら、この定義は、ヒト組織において観察される多様なシアル化グリカンの構造的な特徴およびコンホメーションの柔軟性を十分に補足していないからである。しかし、ＨＡ結合の「コーン様」および「アンブレラ様」の分類は、シアル化グリカンの構造の多様性およびコンホメーションの多数性を十分に捕捉している。意義深いことに、この分類は、トリＨＡのα２−３結合およびα２−６結合を、ヒト適合されたＨ１およびＨ３のＨＡのα２−６結合と区別することが可能である。

コーン様トポロジーおよびアンブレラ様トポロジーへのＨＡ結合の特徴は、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５ ＨＡについて利用可能である広範なグリカンアレイデータを分析するための新規なデータ検索アプローチを使用して、さらに裏付けられた。データ検索分析は、アレイ上のグリカンから抽出したグリカンの特徴（表３および図１０）と、これらのグリカンへのＨＡ結合の間の相関を提供した。これらの相関は、上記の構造の制約を確認する規則または分類子として与えられる（表４および図１０）。

分類子の規則は、図１０および表４において定義される特徴に基づいて得られ、これらは、グリカンマイクロアレイ上のグリカンへの、異なるＨＡおよび変異体の結合を支配する。

これらの観察と一致して、別個のα２−３分類子（図１０）は、トリサッカリドα２−３モチーフ周辺のバリエーションが主としてＨ１、Ｈ３、およびＨ５ ＨＡの示差的なα２−３結合に影響を与えることを示した。グリカンアレイ上で分析された異なるトリＨＡの中で、Ｈ５ ＨＡが、硫酸化およびフコシル化α２−３を含むα２−３への最も多様な結合を示す。トリＨ５ ＨＡにおける高度に保存性のＡｓｎ１８６、Ｌｙｓ１９３、およびＬｙｓ２２２は、トリサッカリドα２−３モチーフにおける異なる硫酸およびフコース置換への最適な接触を提供するように配置されている。他方、長さ依存的なα２−６分類子（図１０）は、アンブレラ様トポロジーにおけるα２−６へのＨＡ結合におけるオリゴサッカリドの長さの役割を支持する。ヒト適合されたＨ１およびＨ３ ＨＡに共通であるα２−６分類子は、長いα２−６に結合するそれらの能力の増加と一致している。しかし、野生型（ＷＴ）および変異型のＨ５Ｎ１ ＨＡのグリカン結合は、長いα２−６分類子によっては支持されていないが、これは、α２−３と短いα２−６の両方の分類子によって支持されている（図１０）。二分岐の短いα２−６グリカンとのＨ５Ｎ１ ＨＡの間の相互作用は図１１に図示されている。従って、本発明は、現在のトリウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、およびＨ９Ｎ１）が、アンブレラ様トポロジーにおけるα２−６グリカンとの最適な接触を行うために、ＨＡ変異を獲得する必要があるという認識を包含する（図６および９に図示される）。

実施例２：Ｈ５Ｎ１ウイルスのヒト適合に導くＨＡ変異
以下において、Ｈ５ ＨＡは、アンブレラ様トポロジーを採用する長いα２−６との最適な接触を提供できる変異の同定を説明するための例証的な実例として使用される。Ｈ１、Ｈ２、およびＨ５ ＨＡは同じ構造の分岐群に属するので、これらは、ほぼ同一のバックボーン構造およびループトポロジーを有する。この分類に基づいて、長いα２−６グリカンとの「Ｈ１様」または「Ｈ２様」接触を提供するＨ５ ＨＡの変異が定義される。

Ｈ１様変異
Ｈ１ ＨＡ−α２−６グリカン共結晶構造の分析は、ＨＡ接触が２つの領域−Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−モチーフとの接触を含む基本領域、および−ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−モチーフとの接触を含む拡張領域に分割可能であることを示した。高度に保存性であるＳＡアンカー（上記）に加えて、基本接触に関与するＨＡ残基は、Ｌｙｓ２２２、Ａｓｐ２２５、およびＧｌｎ２２６である。拡張接触に関与するＨＡ残基は、Ａｓｐ１９０、Ｇｌｎ１９２、およびＳｅｒ１９３である。Ｈ１およびＨ５ ＨＡのグリカン結合部位の重ね合わせは、Ｈ５ ＨＡが、基本領域と相互作用するように配置されているＬｙｓ２２２およびＧｌｎ２２６などの数個の残基をすでに有していたことを示す。Ｌｙｓ１９３（Ｈ５ ＨＡ中）は、Ｓｅｒ１９３（Ｈ１ ＨＡ中）と比較した場合に、拡張領域との好ましくない立体的接触を潜在的に有し得る。この観察と一致して、Ｈ５ ＨＡ二重変異体Ｇｌｕ１９０Ａｓｐ／Ｇｌｙ２２５Ａｓｐ（これは、Ｈ１ ＨＡにおいて観察されるように、Ａｓｐ１９０およびＡｓｐ２２５を有する）は、Ｌｙｓ１９３からの立体障害の可能性に起因して、グリカンアレイ中のα２−６グリカンについてのいかなる結合シグナルも示さない。従って、本発明は、１９０位、１９２位、１９３位、および２２５位における変異の組み合わせが、長いα２−６との最適な「Ｈ１様」接触を提供するという認識を包含する。

Ｈ２様変異
Ｈ２ ＨＡとのＨ５ ＨＡの高い配列類似性が与えられるならば、これは、ヒト受容体の特異性についてＨ５ ＨＡ変異を規定するための別の見通しを提供する。現在まで、Ｈ２ ＨＡの結晶構造は存在しない。トリＨ２ ＨＡ配列およびヒト適合されたＨ２ ＨＡ配列の予備的比較は、トリＨ２ ＨＡ配列からヒトＨ２ ＨＡ配列への２つの主要なアミノ酸の変化（Ｇｌｎ２２６ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８Ｓｅｒ）を示す。従って、本発明は、上記の残基位置における他の変異とまとめたこれらの変異の組み合わせが、長いα２−６との最適な「Ｈ２様」接触を提供するという認識を包含する。

実施例３：ヒト上気道組織におけるグリカンの多様性
ヒト上気道上皮が、インフルエンザＡウイルスのヒト感染およびヒト−ヒト伝染のための主要な標的であるので、本発明者らは、異なる型のシアル化グリカンがこれらの組織中で何であるかを同定することに着手した。このアプローチは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ（ＴＯＦ−ＴＯＦ）分析を使用する、代表的なヒト細胞系統のグリカンプロファイリングを用いて、異なる組織切片のレクチン染色を乗り越えることであった。上気道組織で優先的に発現されたα２−６グリカンの多様性を詳細に調べるために、代表的なヒト気管切片を、植物レクチンのパネルで同時染色した。Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ凝集素（ＳＮＡ−Ｉ）は、α２−６グリカンに特異的に結合する原型のレクチンである。ジャカリンおよびコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）は、Ｏ−連結（−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−および−ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα−）グリカンおよびＮ−連結（トリマンノシルコア）グリカンにおける特異的モチーフにそれぞれ結合する。レクチン結合研究は、上気道組織におけるα２−３およびα２−６の分布の多様性を示した。染色研究は、気管上皮の先端側上のＮ連結グリカン（繊毛細胞）とＯ連結グリカン（杯細胞中）の両方の部分としてのα２−６シアル化グリカンの優先的な分布を示す（図１２および１３）。他方、気管組織の内部領域は、Ｎ連結グリカン上に分布しているα２−３から優先的に構成されている。

ＭＡＬＤＩ−ＭＳグリカンプロファイリング分析は、ヒト上気道上のα２−６シアル化グリカンの優先的な発現と同様に、実質的な多様性（図１３）を示した。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＴＯＦを使用する代表的な質量ピークのフラグメント化は、短いオリゴサッカリド分枝と比較して、複数のラクトサミン反復を有する、より長いオリゴサッカリド分枝が広範に分布しているグリカントポロジーを支持する（図１３）。

図１２および１３Ａのデータは、以下の方法によって生成した。ホルマリン固定およびパラフィン包埋したヒト気道組織切片は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入した。組織切片を脱パラフィンおよび再水和の後、ストレプトアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して内因性ビオチンをブロックした。次いで、切片を、ＦＩＴＣ標識ジャカリン（Ｏ−連結グリカンに特異的）、ビオチン化コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ、α連結マンノース残基に特異的、これは、Ｎ連結グリカンを構成するコアオリゴサッカリド構造の一部である）、ビオチン化Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチン（ＭＡＬ、ＳＡα２，３−Ｇａｌに特異的）、およびビオチン化Ｓａｍｂｕｃｃｕｓ ｎｉｇｒａ凝集素（ＳＮＡ、ＳＡα２，６−Ｇａｌに特異的）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）とともに３時間インキュベートした。ＴＢＳＴ（１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）での洗浄後、切片は、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５４６ストレプトアビジン（０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。スライドはＴＢＳＴで洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡）下で観察した。すべてのインキュベーションは室温で実施した。

図１３のデータは以下の方法を使用して生成した。ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ−；Ｇｒｕｅｎｅｒｔ，Ｄ．Ｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）は、ヒト適合Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ウイルスのこれらの細胞への広範な結合に基づいて、代表的な上気道繊毛細胞として選択した。これらの細胞（〜７０×１０^６）は、＞９０％コンフルエントになったとき、１００ ｍＭ クエン酸生理食塩水緩衝液を用いて収集し、細胞膜は、プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いる処理および均質化後に単離した。細胞膜画分はＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、反応混液は３７℃で一晩インキュベートした。反応混液は１０分間煮沸して酵素を不活性化し、脱グリコシル化ペプチドおよびタンパク質は、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して除去した。グリカンは、グラファイト化炭素固相抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を使用して、さらに脱塩し、中性画分（２５％ アセトニトリル画分）および酸性画分（０．０５％ トリフルオロ酢酸を含む５０％ アセトニトリル）まで精製した。酸性画分は、ソフトイオン化条件（加速電圧２２ｋＶ、グリッド電圧９３％、ガイドワイヤ０．３％、および１５０ｎｓの抽出遅延時間）を用いて、それぞれ、ポジティブモードおよびネガティブモードで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した。ピークは、非ナトリウムイオン付加（ｎｏｎ−ｓｏｄｉａｔｅｄ）種として較正した。α２−６シアル化グリカンの優先的な発現は、シアリダーゼＡおよびＳを使用して、サンプルの前処理によって確認した。単離されたグリカンは、引き続いて、最終容量１００ｍｌの５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ ６．０中の０．１ＵのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ（シアリダーゼＡ、非特異的）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅシアリダーゼ（シアリダーゼＳ、α２−３シアル化グリカンに特異的）とともに、３７℃で２４時間インキュベートした。中性画分および酸性画分は、それぞれ、ポジティブモードおよびネガティブモードで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した。シアリダーゼＡ処理されたグリカンは、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）で誘導体化し、凍結乾燥した。ＭＳ／ＭＳ質量スペクトルは、ＡＢ ４７００ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアによって制御された、遅延抽出およびＵＶレーザー（３５５ｎｍ）を備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ ＴＯＦ／ＴＯＦプロテオミクス分析装置上で獲得した。アセトニトリル／水混液（６０：４０、ｖ／ｖ）中で調製された５ｍｇ／ｍｌ α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸溶液 １μｌを、標準１９２ウェルステンレス鋼ＭＡＬＤＩサンプルプレート上で播種し、空気乾燥させた。続いて、１μｌの２−ＡＢ標識グリカンサンプルをマトリックス上にスポットし、乾燥させた。典型的には、１０００〜５０００ショット／スペクトルを、ＭＳ／ＭＳスペクトルのポジティブリフレクターモードで収集した。１−６×１０^−６Ｔｏｒｒのチャンバー圧力および２ｋＶの加速電圧を用いるＣＩＤモード（衝突ガスとして空気を用いる）はグリカンフラグメント化のために使用し、内部ペプチド標準を較正のために使用した。

実施例４：ヒト肺組織へのＨ１およびＨ３ ＨＡの用量応答結合
気管組織の先端側は、長い分枝トポロジーを有するα２−６グリカンを優先的に発現する。他方、肺胞組織はα２−３グリカンを優先的に発現する。顕著な特徴を有する流行病ＳＣ１８およびヒトワクチン株Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ（モスクワ）／１０／９９ Ｈ３Ｎ２（Ｍｏｓ９９）からのＨＡは、典型的な代表としてのヒト適合Ｈ１およびＨ３の候補として選択した。Ｈ１ ＨＡは、気管の先端表面上の局在化領域に有意に結合し、その結合は、４０μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまでの希釈に伴って次第に減少する（図１４）。Ｈ１ ＨＡはまた、最高濃度においてのみ、肺胞組織へのある程度の弱い結合を示す。Ｈ３ ＨＡの結合パターンは、Ｈ１ ＨＡのそれとは異なっており、Ｈ３ ＨＡでは、気管と肺胞の両方の組織切片への有意な結合を４０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌにおいて示す（図１４）。しかし、１０μｇ／ｍｌの濃度において、ＨＡは、主として気管組織の先端側に結合を示し、肺胞組織に対しては、ほとんど結合を示さないか、または全く結合を示さない。さらに、Ｈ３ ＨＡの先端側結合は、Ｈ１ ＨＡの局在化した結合とは対照的に、十分に分布している。まとめると、組織結合データは、気管組織の先端側へのＨ１およびＨ３ ＨＡの高親和性結合を指摘するが、一方、Ｈ３ ＨＡは、α２−３に親和性を示し（相対的にα２−６よりも低い）、Ｈ１ ＨＡはα２−６に特異性が高い。

図１４のデータは、以下の方法を使用して生成した。ホルマリン固定およびパラフィン包埋したヒトの肺および気道の組織切片は、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ，ＩｎｃおよびＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌからそれぞれ購入した。組織切片を脱パラフィンし、再水和し、そして非特異的結合を妨害するためにＰＢＳ中の１％ ＢＳＡと３０分間インキュベートした。Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ ＨＡを、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ、Ａｂｃａｍ）および二次抗体（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、それぞれ、４：２：１の比率で、氷上で２０分間、事前複合体化した。形成した複合体は、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳ中）中で、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度まで希釈した。次いで、組織切片を、室温で３時間、ＨＡ抗体複合体とインキュベートした。切片は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中１：１００）で対比染色し、広範に洗浄し、次いで共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡）下で観察した。

実施例５：異なるトポロジーのグリカンへの野生型ＨＡポリペプチドの用量応答直接結合
本明細書に記載されるように、本発明は、本明細書では「アンブレラ」トポロジーと呼ばれる特定のトポロジーを有するグリカンへのＨＡポリペプチドによる結合が、ＨＡポリペプチドがヒト宿主の感染を媒介する能力と相関しているという認識を包含する。本実施例は、異なる宿主の感染を媒介する異なるＨＡポリペプチドを用いる直接結合研究の結果を記載し、ヒト感染とアンブレラ様トポロジーグリカン結合の間の相関を例証する。

直接結合アッセイは、典型的には、規定されたグリカン構造（例えば、一価または多価）が、しばしば、ポリマーバックボーンを使用して、支持体（例えば、ガラススライドまたはウェルプレート）上に提示されるグリカンアレイを利用する。いわゆる「順次」アッセイにおいて、三量体ＨＡポリペプチドはアレイに結合され、次いで、例えば、標識された（例えば、ＦＩＴＣまたは西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる）一次抗体または二次抗体を使用して検出される。「多価」アッセイにおいて、三量体ＨＡは、最初に一次抗体および二次抗体とともに複合体化され（典型的には、４：２：１のＨＡ：一次抗体：二次抗体の比率）、その結果、事前複合体ＨＡあたり１２個のグリカン結合部位が存在し、次いで、アレイと接触される。結合アッセイは、典型的には、一定の範囲のＨＡ濃度にわたって実行され、その結果、アレイ中の異なるグリカンの相対的な親和性に関する情報が得られる。

例えば、直接結合研究は、３’ＳＬＮ、６’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、６’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮなどの異なるグリカンを有するアレイを用いて実施され、ここで、ＬＮはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを表し、３’はＮｅｕ５Ａｃα２−３を表し、そして６’はＮｅｕ５Ａｃα２−６を表す。詳細には、ビオチン化グリカン（１２０ｐｍｏｌ／ｍｌを５０μｌ）は、事前にＰＢＳで３回すすいだ、ストレプトアビジンコートした高結合能（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ）３８４ウェルプレートと一晩インキュベートした（ＰＢＳ中、４℃にて）。次いで、プレートは、ＰＢＳで３回洗浄して過度のグリカンを除去し、さらなる処理なしで使用した。

ビオチン−アビジングリカンアレイプレートを使用する用量依存性直接結合アッセイの開発の初期段階の間、異なる濃度のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ）をインキュベートして、４：２：１ ＨＡ：一次抗体：二次抗体の比率を達成した。しかし、このアッセイにおいて、低ＨＡ濃度で結合シグナルを検出することは困難であった。なぜなら、結合反応速度論は、これらの濃度（２．５μｇ／ｍｌより下）におけるＨＡ事前複合体の形成を制限するからである。相対的な結合親和性を正確に定量するために、事前複合体の結合は、より低い濃度範囲（０．０５μｇ／ｍｌ〜５ｇ／ｍｌ）において測定した。この問題に取り組むに当たって、結合アッセイは、引き続いて、最高のＨＡ濃度、次にストックの段階希釈における事前複合体の調製によって改変した。手短に述べると、次いで、混合物（すなわち、事前複合体化ＨＡ）は、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡを有する２５０μｌの最終容量まで作製した。次いで、５０μｌの事前複合体化ＨＡを、３８４ウェルプレートのグリカンコートしたウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。続いて、０．０５％ ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳでウェルを３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。直接結合研究はまた、代表的なＨ５Ｎ１ウイルスについても、ＨＡ結合特異性をヒト適合ＨＡのそれと比較するために行った。ウイルスストック（ＣＤＣより）を、１０日齢孵化雌鳥卵の尿膜腔の中で、３７℃にて増殖させた。尿膜腔液をインキュベーションの２４時間後に収集し、４℃、３日間のＢ−プロピオラクトン（ＢＰＬ；１／１，０００）を用いる処理によって不活化した。グリカンコートしたウェルへのウイルス結合は、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中での希釈および４℃で一晩のインキュベーションの後で、各ウェルに適切な量のウイルスを加えることによって、記載されるように実施した（Ｙａｍａｄａら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４４４：３７８；参照により本明細書に援用される）。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳおよびＰＢＳを用いる過度のウイルスのすすぎ後、ウェルは、ウイルスに対する抗体（Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ（ホンコン）／２１３／０３ Ｈ５Ｎ１に対して惹起されたフェレット−α−インフルエンザＡ）とともに、４℃で５時間、インキュベートした。抗体の広範な洗浄後、プレートは、ＨＲＰ結合ヤギ−α−フェレット抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とともに、４℃で２時間インキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳおよびＰＢＳを用いる広範な洗浄後、すべての場合において、ＨＲＰ活性は、製造業者の説明書に従って、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して見積もった。ＨＡ事前複合体の段階希釈を研究した。適切な陰性対照（非シリアル化グリカン）およびバックグラウンド対照（グリカンなしまたはＨＡなし）を含め、すべてのアッセイは３連で行った。結果は図１５および１６に提示される。

本発明は、既知のヒト適合Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３ ＨＡの結合パターンの１つの特性は、４０μｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌまでの希釈範囲にわたる、飽和レベルでの長いα２−６（６’ＳＬＮ−ＬＮ）へのそれらの結合である（図１５）という認識を包含する。Ｈ１ ＨＡは、長いα２−６への結合について高度に特異的であるが、Ｈ２およびＨ３ ＨＡもまた、高い親和性で短いα２−６（６’ＳＬＮ）に結合し、そしてα２−６と比較して、より低い親和性で長いα２−３に結合する（図１５）。Ｈ１およびＨ３ ＨＡの直接結合用量応答は、組織結合パターンと一致している。さらに、長いα２−６へのＨ１およびＨ３ ＨＡの高親和性結合は、長い分枝トポロジーを有するα２−６グリカンを発現する気管組織の先端側へのそれらの広範な結合と相関する。この相関は、ヒト適合したＨ１およびＨ３ ＨＡの上気道組織向性に、価値のある洞察を提供する。Ｈ２およびＨ３ ＨＡのα２−３結合はさらに、グリカン結合の優先度のスイッチ（すなわち、α２−３に結合する能力の喪失）は、ＨＡのヒト適合のための必須の決定要因ではないことを示唆する。重要なことに、Ｔｘ９１は、これもまた長いα２−６へのＨＡ結合を示す混合α２−６／α２−３結合ウイルスであり（図１０）、効率的に伝染することが可能である。他方、ＮＹ１８は、長いα２−６へのＨＡ結合特異性を有しない別の混合α２−３／α２−６結合ウイルスであり（図１０）、効率的には伝染しない（伝染性と相関するＨＡ結合特異性の詳細は、以下の実施例６においてさらに精緻に作製される）。従って、本発明は、これらのウイルスの効率的なヒト適合が、それゆえに、特異的α２−３またはα２−６結合を超えた、特徴的なアンブレラ様トポロジーのシアル化グリカンへのＨＡ結合に相関するという認識を包含する。他方、試験されたＨ５Ｎ１ウイルスは、反対のグリカン結合傾向を示し、ここで、これらは、α２−６への比較的低いこれらの親和性と比較して（有意なシグナルは１２８ＨＡＵにおいてのみ見られる；図１６）、α２−３に低い親和性で結合する（４０μｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌまで下る飽和シグナル）。任意の特定の理論によって束縛されることは望まないが、α２−６を優先的に発現する組織へのＨ５Ｎ１感染の開始の観察は、おそらく、高ウイルス負荷におけるα２−６結合によって説明することができる（図１６において示される＞１２８ＨＡＵ）。

実施例６：独特な構造トポロジーを有するα２−６シアル化グリカンへの、１９１８ Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ流行病ウイルスヘマグルチニン結合親和性は、ウイルス伝染のための決定因子である
インフルエンザウイルスのヒト感染は、ヒト上気道組織の上皮細胞表面上のα２−６シアル化グリカン（α２−６）受容体へのウイルス表面ヘマグルチニン（ＨＡ）の結合を含む。ＨＡのグリカン結合優先度と伝染効率の間の関連性は、高度に病原性かつ悪性の１９１８ Ｈ１Ｎ１ウイルスを使用してフェレットモデルにおいて実証されてきた（Ｔｕｍｐｅｙら、２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５：６５５；参照により本明細書に援用される）。この研究において、α２−６結合優先度を有する１９１８ Ｈ１Ｎ１流行病ウイルス（Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（サウスカロライナ）／１／１９１８（ＳＣ１８））が効率的に伝染する間、単一のアミノ酸ＨＡ変異（ＳＣ１８＋１変異）が、伝染が非効率的である、混合α２−３シアル化グリカン（α２−３）／α２−６結合ウイルス（ＮＹ１８）を生じたことが実証された。さらに、グリカン結合優先度をα２−６からα２−３に切り換える、付加的なＨＡ変異（ＮＹ１８＋１変異）は、フェレットにおける伝染が不可能であるウイルス（ＡＶ１８）を生じた。混合α２−３／α２−６結合を示すＡ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ニューヨーク）／１／１８（ＮＹ１８）Ｈ１Ｎ１ウイルスは伝染が非効率的であったが；驚くべきことに、Ａ／Ｔｅｘａｓ（テキサス）／３６／９１（Ｔｘ９１；これもまた、混合α２−３／α２−６結合Ｈ１Ｎ１ウイルスである）は効率的に伝染可能であった。単一のアミノ酸ＨＡ変異の結果としてのウイルス伝染のこれらの違いは、次には、効率的なヒト適合についてのみならず（実施例１〜５に議論したように）、効率的な伝染についてもまた、グリカントポロジーの状況におけるＨＡ−グリカン特異性に関する重要な疑問を惹起する。以前の実施例に立脚して、結合親和性を定量的に測定し、かつ特異性を樹立することが可能である用量依存性グリカン結合アッセイを開発した。以下は、典型的なグリカンアレイアッセイが、ＳＣ１８とＮＹ１８の間の長いα２−６結合の定性的な違いを示さないが、同じものの用量依存性アッセイが、長いα２−６への結合親和性の間の有意な定量的な違いを示すことを実証している。さらに、これらの違いは、ヒト上気道組織に存在する生理学的なグリカンへのＳＣ１８およびＮＹ１８ ＨＡの個別の結合パターンにおいても同様に反映されている。まとめると、本発明者らは、ＳＣ１８ウイルスとＮＹ１８ウイルスの間の伝染の違いが、特徴的なアンブレラ様トポロジーを有する長いα２−６グリカンへのそれらの定量的な結合親和性と相関することを実証した。

材料および方法
ＨＡのクローニング、バキュロウイルス合成、発現、および精製
可溶型のＨＡはバキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を使用して発現した。ＳＣ１８（Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ（サウスカロライナ）／１／１９１８；ＳＣ１８）バキュロウイルス（ｐＡｃＧＰ６７−ＳＣ１８−ＨＡプラスミドから生成；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８６６；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：８５７；これらの両方とも参照により本明細書に組み入れられる）はＤｒ．Ｊａｍｅｓ Ｓｔｅｖｅｎｓから恵与された。ｐＡｃＧｐ６７−ＮＹ１８−ＨＡおよびｐＡｃＧｐ６７−ＡＶ１８−ＨＡプラスミドは、それぞれ、［Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ］および［Ａｓｐ１９０Ｇｌｕ、Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ］変異により、ｐＡｃＧＰ６７−ＳＣ１８−ＨＡから生成した。変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実行した。変異誘発のために使用されるプライマーは、ウェブベースのプログラム、ＰｒｉｍｅｒＸ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｉｍｅｒｘ／）を使用して設計し、ＩＤＴ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。ＮＹ１８およびＡＶ１８バキュロウイルスは、製造業者の説明書に従って、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ｐＡｃＧＰ６７−ＮＹ１８−ＨＡおよびｐＡｃＧＰ６７−ＡＶ１８−ＨＡ構築物から作製した。バキュロウイルスは、ＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｍａｘ−ＸＰ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中で培養したＳｆ９細胞（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の３００ｍｌ懸濁培養に感染させるために使用した。これらの培養物を、感染の徴候についてモニターし、感染４〜５日後に収集した。ＢＥＶＳは三量体ＨＡを産生し、これはグリカンへの多価結合を生じる。可溶型のＨＡは、以前に記載されたプロトコール（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８６６；参照により本明細書に援用される）を使用して、感染細胞の上清から精製した。手短に述べると、上清は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−７０遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して濃縮し、三量体ＨＡは、濃縮細胞上清から、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を充填したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用して回収した。ＨＡを含んだ溶出画分をプールし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）で一晩透析した。次いで、透析サンプルに対して、Ｍｏｎｏ−Ｑ ＨＲ１０／１０カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用するイオン交換クロマトグラフィーを実施した。ＨＡを含む画分は一緒にプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００ Ｋ ＮＭＷＬメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用する限外濾過に供した。次いで、タンパク質は濃縮し、ＰＢＳ中で再構築した。精製タンパク質は、Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して定量した。

Ｈ１Ｎ１ ＨＡの用量応答直接結合
多価ＨＡ−グリカン相互作用を研究するために、代表的なビオチン化α２−３およびα２−６（短型および長型）を含むストレプトアビジンプレートアレイを使用した。このプレートアレイのウェル中のグリカンの空間配置は、ＨＡ単位中の３つのＨＡモノマーのうちの１つのみに結合する傾向がある。グリカンの間隔およびＨＡ単位サイズは、ＨＡ単位、一次抗体、および二次抗体の連続適用を含んだＥＬＩＳＡ型結合アッセイにおける単一のグリカンへのＨＡ単位の結合を制限する（以下を参照のこと）。逆に、一次抗体および二次抗体とのＨＡ単位の事前複合体（以下を参照のこと）（ＨＡ：一次抗体：二次抗体＝４：２：１比率）は４ＨＡ単位の特定の空間配置を容易にする。従って、この事前複合体単位は、多価性を介して、グリカン結合親和性に対する複数のＨＡ単位の相対的な空間的位置決めの効果の研究を可能にした（図１８を参照のこと）。

ストレプトアビジンコートされた高結合能（Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ）３８４ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、このウェルを５０μｌの２．４μＭビオチン化グリカンとともに４℃で一晩インキュベートすることによって、各ウェルの全容量まで負荷した。ビオチン化グリカン（３’ＳＬＮ、６’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、６’ＳＬＮ−ＬＮ、および３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ）は、機能的グリコミクスのコンソーシアム（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）から、彼らのリソースリクエストプログラムを通して入手した。ＬＮはラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に対応し、３’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮは、それぞれ、ＬＮに連結されたＮｅｕ５Ａｃα２−３およびＮｅｕ５Ａｃα２−６に対応する。過度のグリカンは、ＰＢＳを用いる広範な洗浄を通して除去し、次いで、プレートはさらなる処理なしで使用した。ＥＬＩＳＡ型連続結合のために、グリカンコートしたウェルは、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中４０μｇ／ｍｌの濃度で（グリカンアレイ実験において使用される典型的な高濃度）、ＨＡとともに２時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、次にＰＢＳで広範に洗浄した。これに続いて、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度の一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）との室温で３時間のインキュベーションを行い、上記の洗浄工程を反復した。ウェルは、最後に、二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ）２μｇ／ｍｌ溶液とともに、室温で１時間インキュベートした。用量依存性事前複合体化ＨＡ実験の場合において、適切な量のＨｉｓタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（マウス抗６×ＨｉｓタグＩｇＧ）、および二次抗体（ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））は、４：２：１の比率で、氷上で２０分間インキュベートした。事前複合体化ＨＡは、ＰＢＳ緩衝液中１％ ＢＳＡで、２５０μｌの最終容量まで調製し、この溶液の５０μｌを、３８４ウェルプレートのグリカンコートされたウェルの各々に加え、室温で２時間インキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで、続いてＰＢＳによって広範に洗浄した。結合シグナルは、製造業者の説明書に従って、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、ＨＲＰ活性に基づいて決定した。陰性対照を含め、そしてすべてのアッセイは３連で行った。

結合親和性を定量するために（上記の事前複合体化アッセイのために）、以下のモデルに基づいて結合パラメーターＫ_ｄ’が定義され、計算される。Ｈｉｌｌ方程式の典型的な型は多価結合を表すために使用される：

これは、線形化の際には、以下のようになる

ここで、ｙ−ＨＡ単位におけるグリカン結合部位の飽和度；［ＨＡ］−ＨＡの濃度（Ｍ）；ｎ−協同性因子；Ｋ_ｄ’−多価ＨＡ−グリカン相互作用についての見かけの結合定数。ｙの値は、すべてのＨＡ単位に対して１００％占有率を表す飽和結合シグナルに、結合シグナルを標準化することによって計算される。ｎおよびＫ_ｄ’は線形化Ｈｉｌｌモデルに基づいて計算された（表５に示される）。上記のモデルにおいて、プレートの各ウェル中のグリカンは過剰のＨＡの中にあることが前提とされている。この前提を満足するために、０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度範囲の結合シグナルを、ｎおよびＫ_ｄ’を計算するために使用した。

ヒト上気道組織へのＨ１ ＨＡの結合
ホルマリン固定およびパラフィン包埋した通常ヒト気道組織切片は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入した。組織切片を脱パラフィンし、再水和し、そして室温で３０分間、ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで事前にブロックした。ＨＡ抗体事前複合体は、組換えＳＣ１８およびＮＹ１８タンパク質を、一次抗体（マウス抗６×Ｈｉｓタグ、Ａｂｃａｍ）および二次抗体（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、それぞれ、４：２：１の比率で、氷上で２０分間、インキュベートすることによって生成した。次いで、形成した複合体は、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中で、異なる最終ＨＡ濃度まで希釈した。組織結合研究は、組織切片を、室温で３時間、希釈ＨＡ抗体複合体とインキュベートすることによって実施した。細胞核を可視化するために、切片は、ヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＢＳＴ中１：１００）で、室温で２０分間対比染色した。同時染色アッセイのために、組織を脱パラフィンし、再水和し、そしてＦＩＴＣ標識ジャカリン（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ；０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中１０μｇ／ｍｌ）およびＨＡ抗体事前複合体（二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ヤギ抗マウス抗体を使用して上記のように生成し、ＰＢＳＴ中に希釈）とともに、室温で３時間同時インキュベートした。次いで、切片を洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡下で観察した。

結果
α２−３およびα２−６とのＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの分子的相互作用
ＨＡ−グリカン共結晶構造の分析に基づいて、ＨＡ−グリカン相互作用は、コーン様およびアンブレラ様のグリカントポロジーに基づいて特徴付けされる（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎら、２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，印刷中）。ＳＣ１８ ＨＡのｘ線結晶構造は解析されたが（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８６６；およびＧａｍｂｌｉｎら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８３８；これらの両方は参照により本明細書に援用される）、しかし、シアル化グリカンとのこのＨＡの共結晶構造は解析されていないままである。ＮＹ１８およびＡＶ１８ ＨＡの構造は、単一のＡｓｐ２２５Ｇｌｙ（ＮＹ１８ ＨＡ用）およびさらなるＮＹ１８＋Ａｓｐ１９０Ｇｌｕ変異（ＡＶ１８用）をインシリコで作製することによって得た。関連するＡ／Ｓｗｉｎｅ（ブタ）／Ｉｏｗａ（アイオワ）／１５／３０（ＡＳＩ３０）およびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（プエルトリコ）／８／３４（ＡＰＲ３４）Ｈ１Ｎ１ ＨＡのα２−３およびα２−６グリカンとの共結晶構造（Ｇａｍｂｌｉｎら、２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１８３８；参照により本明細書に援用される）は、ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８の間の、α２−３およびα２−６オリゴサッカリドとの分子的相互作用の研究を可能にした。

アンブレラ様トポロジーは、より長いα２−６オリゴサッカリド（例えば、テトラサッカリドおよびより長いサッカリド）によって好ましい。ＡＰＲ３４およびＡＳＩ３０ ＨＡ−α２−６共結晶構造において使用されるＬＳＴｃペンタサッカリド（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）はこの長いα２−６を表す。これらの共結晶構造およびＳＣ１８ ＨＡの重ね合わせは、長いα２−６オリゴサッカリドとの接触が２つの領域に分けられることを実証した。基本領域はＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−モチーフとの接触を含み、拡張領域は−ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−モチーフとの接触を含む。高度に保存性であるアミノ酸のセット（Ｔｙｒ９５、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ１３６、Ｔｒｐ１５３、Ｈｉｓ１８３、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ１９４）は、Ｎｅｕ５Ａｃを固着する際に関与する（図１７）。ＳＣ１８およびＡＰＲ３４ ＨＡにおけるバックボーンカルボニル酸素とＡｓｐ２２５の側鎖の両方が基本領域中のＧａｌと相互作用するように配置されているが、ＡＳＩ３０におけるＧｌｙ２２５のカルボニル酸素のみがこのＧａｌと相互作用する（図１７）。高度に保存性であるＬｙｓ２２２およびＧｌｎ２２６もまた、基本領域と相互作用するように配置されている。拡張領域との接触に関与するアミノ酸には、Ａｓｐ１９０（ＳＣ１８およびＡＳＩ３０ ＨＡ中）、Ｇｌｎ１９２、およびＳｅｒ１９３（ＡＰＲ３４ ＨＡ中のＡｓｎ１９３）が含まれる。ＮＹ１８ ＨＡ（すなわち、ＳＣ１８のＡｓｐ２２５Ｇｌｙ変異体）は、ほぼ同一であるグリカン結合部位をＡＳＩ３０ ＨＡのそれと共有し、それゆえに、Ａｓｐ２２５の側鎖によって提供される、基本領域におけるＧａｌとの余分の接触を欠いている。対照的に、ＡＶ１８（すなわち、ＳＣ１８のＡｓｐ１９０Ｇｌｕ／Ａｓｐ２２５Ｇｌｙ二重変異体）は、Ａｓｐ２２５とＡｓｐ１９０の両方によって提供される、基本領域および拡張領域への接触を欠いている。ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの中では、ＳＣ１８ ＨＡは、アンブレラ様トポロジーにおける長いα２−６との最高の接触を提供し、ＮＹ１８ ＨＡが続く。

アンブレラ様トポロジーとは異なり、コーン様トポロジーは、α２−３とα２−６の両方によって採用できる（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）などの短いトリサッカリド単位によって優先的に）。アンブレラ様トポロジーに伴って見い出されるＨＡ接触の２つの明確な領域とは異なり、コーン様トポロジーとの接触は、主として、ＨＡ−α２−３共結晶構造において観察されるようなトリサッカリドＮｅｕ５Ａｃα２−３／６Ｇａｌβ１−３／４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）モチーフ周辺に集中する置換を含む。詳細には、種々のトリＨＡにわたって高度に保存されているＧｌｕ１９０およびＧｌｎ２２６は、コーン様トポロジーとの最適な接触を行うことに関与している（図１７）。この観察は、ＡＳＩ３０ ＨＡ−α２−３共結晶構造におけるＮｅｕ５Ａｃの向こう側の不規則な糖によってさらに裏付けられる。なぜなら、このＨＡにおける１９０位のＧｌｕの代わりのＡｓｐは、α２−３との接触を欠いているからである。両方がこれらのアミノ酸を含んでいるＡＶ１８およびＡＰＲ３４の重ね合わせは、ＡＶ１８ ＨＡがコーン様グリカントポロジーとの最適な接触を生じることを示す。ＳＣ１８とＮＹ１８の両方のＨＡはＧｌｕ１９０残基を欠いており、従って、コーン様グリカントポロジーとのそれらの接触は、ＡＶ１８ ＨＡと比較した場合には、より最適ではない。

代表的なα２−３およびα２−６オリゴサッカリドへの用量依存性直接ＨＡ結合
新規なグリカンアレイプラットフォームが、ＨＡ−グリカン相互作用を研究するために開発された（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：８５７；およびＫｕｍａｒｉら、２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４：４２；これらの両方は参照により本明細書に援用される）。これらのアレイは、種々の野生型および変異体のＨＡの、α２−６に対するα２−３の結合特異性に重要な洞察を提供してきた。これらのグリカンアレイ研究において、飽和ＨＡ濃度を使用する単回アッセイの中での高いおよび低いグリカンアレイへの結合シグナルは、所定のＨＡについてのグリカン結合の優先度を決定する。任意のグリカン結合タンパク質（例えば、レクチン）上での単一の結合部位についてのグリカン結合親和性は低いこと（例えば、高いμＭ〜ｍＭ範囲）が一般的に受け入れられている。各ＨＡ単位は三量体タンパク質であるので、単位当たりに３つのグリカン結合部位が存在する（ＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ、２０００，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：５３１；参照により本明細書に援用される）。加えて、複数のＨＡ単位がウイルス表面で集合する。ＨＡ単位の中のグリカン結合部位およびウイルス表面を横切る複数のＨＡ単位の空間配置は、多価ＨＡ−グリカン相互作用において重要な役割を果たし得る。本発明は、グリカンと比較したＨＡ単位の濃度が結果的にＨＡ−グリカン結合特異性を支配し得るという認識を包含する。

ＨＡ単位およびグリカンの特定の空間配置のためのＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡのグリカン結合特異性の違いを理解するために、プレートアレイに対する体系的な直接ＨＡ結合研究を実施した（方法を参照のこと）。最小結合シグナルは、連続的ＥＬＩＳＡ型結合アッセイにおけるＳＣ１８ ＨＡについて観察した（図１８）。グリカンの間隔およびＨＡ単位サイズがこのアッセイにおいて単一のグリカンのみにＨＡ結合を制限することを認めたとしても、結合シグナルは、単一のグリカンへのＨＡ単位の予測される弱い親和性と一致する。ＳＣ１８ ＨＡを用いる事前複合体化アッセイ−４ＨＡ単位が空間的にロックされている−は、その代わりに、長いα２−６グリカンへの結合の少なくとも８倍の増加を生じた（図１８）。この結合シグナルの増加は、複数のＨＡ単位の空間的配置がグリカン結合を増強する際に果たす役割を強調する。

事前複合体化したＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの段階希釈による用量依存性直接結合アッセイは、それらの相対的なグリカン結合親和性を確立するために実施した（図１９）。協同性因子ｎおよび見かけの結合定数Ｋ_ｄ’は、結合データをモデル化するために使用した線形化Ｈｉｌｌ方程式に基づいて計算した（方法ならびに図２０および２１を参照のこと）（表５）。

表５は、代表的な長いα２−３およびα２−６グリカンへのＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８ ＨＡの相対的な結合親和性を示す。パラメーターｎおよびＫ_ｄ’は、方法において記載されるように決定し、図２０および２１に詳述した。これらのパラメーターは、ＨＡの相対的な結合親和性を定量するように得られ、従って、それらの絶対値がこの状況において観察されるべきである。

すべてのグリカン結合データについてのＲ平方値＞０．９５は、線形化Ｈｉｌｌモデルへの良好なフィットを示す。ｎ≧１の値は、複数のＨＡ単位の空間配置および単一のグリカンへのＨＡ単位の結合の結果としてのＨＡ−グリカン相互作用の正の協同性を反映する。ＳＣ１８ ＨＡは、単一の長いα２−６グリカンへの高い結合親和性を示したが（Ｋ_ｄ’＝５．５ｐＭ）、ＡＶ１８ ＨＡは、α２−６結合がほとんどなく、α２−３結合親和性が高い（Ｋ_ｄ’＝５ｐＭ）という逆の傾向を示した。他方、ＮＹ１８ ＨＡの長いα２−６結合は、飽和ＨＡ濃度においてＳＣ１８ ＨＡのそれとほぼ同一であったが（図１９）、長いα２−６への相対的な結合親和性（Ｋ_ｄ’＝６ｎｍ）は、ＳＣ１８ ＨＡのそれよりも有意に低かった。これらの観察は、α２−３およびα２−６オリゴサッカリドとのＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８の分子的相互作用の違いと相関する。

ヒト上気道組織へのＳＣ１８およびＮＹ１８の結合
本発明は、ＳＣ１８およびＮＹ１８ ＨＡのα２−６およびα２−３の結合親和性の違いが、それらを、ヒト上気道組織に存在する多様な生理学的グリカンへのＨＡ結合を研究するための理想的なレクチン様プローブにさせるという認識を包含する。ヒト気管切片は、生理学的グリカンへのＳＣ１８およびＮＹ１８ ＨＡの結合パターンを探索するために使用した。ＳＣ１８とＮＹ１８の両方が気管の先端側に結合するが（図２２）、２つのＨＡの組織結合のパターンおよび分布は異なっている。気管の先端側へのＳＣ１８結合は、十分に分布したＮＹ１８の結合と比較した場合に、より制限されているように見える。ＮＹ１８ ＨＡはまた、気管の内部領域（α２−３グリカンを発現することが知られている）への結合を示し、α２−３グリカンへのその直接的結合と一致している（図１９）。ＳＣ１８およびＮＹ１８ ＨＡの先端結合の違いをさらに研究するために、これらのＨＡおよびジャカリン（杯細胞のマーカー）を使用して、気管組織の同時染色を実施した。この同時染色は、ＳＣ１８ ＨＡが優先的に杯細胞に結合する一方、ＮＹ１８ ＨＡはこれらの細胞への最小限の結合を示すことを実証した（図２３）。

考察
多くの独特なオリゴサッカリドモチーフを含むグリカンアレイは、野生型および変異型Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５ ＨＡのグリカン結合を研究するために用いられてきた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：８５７；Ｋｕｍａｒｉら、２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４：４２；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１２：４０４；これらのすべては参照により本明細書に援用される）。これらの進歩にも関わらず、ヒト適合に導くグリカン受容体特異性の解釈は、困難なままで残っている。この理由は、多くの部分、この分野における、グリカン−タンパク質相互作用が比較的弱くかつ非特異的であるという一般的な概念に起因している。結果的に、ＨＡのグリカン結合の特異性は、非常に高濃度のタンパク質を使用して、多くが確立されてきた。高いＨＡ濃度は、非結合物に対する結合物を確立するために有用であり得るが、しかし、本発明は、ＨＡの相対的なグリカン結合親和性を確立するために、適切な定量的測定を規定する際の制限が存在しているという認識を包含する。１つの例として、高濃度において、典型的に使用される一次結合反応速度論の仮定（ＨＡ：グリカン比率に関連する）は満足されない。ＨＡ間の相対的なグリカン結合親和性を正確に定量するために、本発明は、それが「適切な」ＨＡ濃度範囲にあることが所望されているという認識を包含する。本発明は、いくつかのパラメーター（例えば、複数のＨＡ単位の空間配置、表面グリカン密度、およびＨＡ対グリカンの比率）が、所定のグリカンアレイアッセイのために「適切な」ＨＡ濃度範囲を決定する場合に、考慮に入れられるべきであるという認識を包含する。グリカンアレイに対して高いＨＡ濃度を使用する現在のアプローチは、これらの懸念の領域を説明しない。本研究において、用量依存性グリカン結合アッセイを用いる、タンデムでのグリカン（間隔はビオチン−アビジン系によって課せられる）およびＨＡ（ＨＡ単位の事前複合体化によって課せられる）の特異的空間配置が、これらの困難を克服することが可能であった。本研究において結合親和性パラメーター（ｎおよびＫ_ｄ’）を決定するために使用される濃度範囲は、生理学的条件で予測されるような、グリカンがＨＡよりも過度にあるようなものである。本発明は、本研究において記載されているアプローチが、一般的にタンパク質−グリカン相互作用を研究するために利用される任意のグリカンアレイプラットフォームに容易に拡張できるという認識を包含する。

高濃度または飽和濃度のＨＡは、ＳＣ１８とＮＹ１８の間で、長いα２−６グリカンへの結合シグナルの違いを示さない。ＳＣ１８とＮＹ１８の間での唯一の違いは、ＮＹ１８ ＨＡでのα２−３グリカンへのさらなる結合である。ＳＣ１８、ＮＹ１８、およびＡＶ１８のα２−３結合が伝播性との逆比例を示すので、いかなる１つの理論に束縛されることも望まないが、これらのデータからの可能性のある結論は、α２−３結合特異性の損失が伝播性のための１つの要因であるということである。しかし、Ａ／Ｔｅｘａｓ（テキサス）／３６／９１（ＴＸ９１；すなわち、ＮＹ１８に類似している、混合α２−６／α２−３結合ウイルス）は、フェレットにおいて容易に伝染した。ＴＸ９１およびＡ／Ｍｏｓｃｏｗ（モスクワ）／１０／９９ Ｈ３Ｎ２（Ｍｏｓ９９；すなわち、混合α２−６／α２−３結合ヒト適合Ｈ３ ＨＡ）の用量依存性直接的結合は、ＳＣ１８およびＮＹ１８のそれと比較した場合、長いα２−６グリカンへの高親和性結合が、ＳＣ１８、Ｔｘ９１、およびＭｏｓ９９についての共通の特徴であり、ＮＹ１８の特徴ではないことを示す（図１９）。長いα２−６グリカンへの特異性のこの共通の特徴は、α２−３グリカンへの特異性とは独立している。従って、本発明は、上気道組織において広範に発現されている長いα２−６グリカンへの高親和性結合が、ＨＡヒト適合についてのみならず、一般的にインフルエンザウイルス伝染についてもまた、決定基であるという認識を包含する。

ヒト上気道組織に存在する多様な生理学的グリカンへのＳＣ１８およびＮＹ１８の示差的結合は、これらの直接的結合研究をさらに裏付ける。本発明は、杯細胞へのＳＣ１８の狭い結合が、ヒト適合ウイルスの細胞向性への将来の研究の口火になるはずであるという認識を包含する。この観察は、Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈら（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、１０１：４６２０；参照により本明細書に援用される）と一致しており、ここでは、彼らは、ヒト適合したＨ１およびＨ３ウイルス株が非繊毛細胞に優先的に感染し、トリウイルスが繊毛細胞に優先的に感染することを実証した。彼らはまた、ウイルスの細胞向性のこのような違いが、ヒト−ヒト伝染のそれらの効率の違いを説明し得ることを示唆した。

等価物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識しており、または慣用的に過ぎない実験を使用して確認できる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されていないが、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。

当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識しており、または慣用的に過ぎない実験を使用して確認できる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されていないが、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。

特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の意味が示されている場合、またはさもなくば文脈から明らかである場合を除いて、１つまたは１つ以上を意味し得る。従って、例えば、「ナノ粒子（ａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」との言及は、複数のこのようなナノ粒子を含み、「細胞」との言及は、当業者に公知である１個以上の細胞への言及を含む、等である。ある群の１つ以上のメンバー間で「または」を含む特許請求の範囲または説明は、反対の意味が示されている場合、またはさもなくば文脈から明らかである場合を除いて、群のメンバーの１つ、１つ以上、またはすべてが所定の生成物もしくはプロセスの中に存在するか、その中で使用されるか、またはさもなくばそれに関連する場合に、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所定の生成物もしくはプロセスの中に存在するか、その中で使用されるか、またはさもなくばそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群の１つ以上、またはすべてのメンバーが所定の生成物もしくはプロセスの中に存在するか、その中で使用されるか、またはさもなくばそれに関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、列挙される請求項の１つ以上から、１つ以上の限定、要素、節、説明的な用語などが別の請求項へ導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、および並べ換えを包含することが理解される。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同一の基礎の請求項に依存する任意の他の請求項において見い出される１つ以上の限定を含むように改変することができる。さらに、特許請求の範囲が組成物を列挙する場合、本明細書に開示される目的のいずれかのために、その組成物を使用する方法が含まれること、および本明細書に開示される作製方法のいずれかまたは当該分野において公知の他の方法に従ってその組成物を作製する方法が含まれることが、そうでないように記載される場合を除いて、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかである場合を除いて、理解される。

要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式で提示される場合、この要素の各サブグループもまた開示されること、および任意の要素が群から除去され得ることが理解される。一般的に、本発明、または本発明の局面が、特定の要素、特徴などを含むように言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の局面は、このような要素、特徴などからなるか、またはこれらから本質的になることが理解されるべきである。単純化の目的のために、これらの実施形態は、本明細書において言葉通りには具体的に示されていない。「含む」という用語は、オープンであるように意図され、追加の要素または工程を含むことを許容することが注記される。

範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、そうではないように記載されているか、またはそうでなければ文脈および当業者の理解から明らかである場合を除いて、範囲として表現される値は、文脈が明確に他を指示している場合を除いて、その範囲の下限値の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態において言及される範囲内の任意の特定の値または部分的範囲を想定できることが理解される。

さらに、先行技術の範囲に含まれる本発明の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の１項以上から明確に排除され得ることが理解される。このような実施形態は当業者に公知であるとみなされるので、これらは、排除が本明細書において明確に記載されていないとしても、排除され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意のグリカンデコイ、任意のグリカン模倣物、任意のグリカン部分、任意のＨＡポリペプチド、任意のアミノ酸位置、任意のインフルエンザ株、新規なグリカンデコイを同定する任意の方法、任意の薬学的組成物、任意の投与方法など）は、先行技術の存在に関連するか否かに関わらず、任意の理由で、１つ以上の請求項から排除できる。

上記および本明細書本文にわたって議論された刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のどのような記載も、本発明者らが先行技術の開示によってこのような開示を予見する資格があるとの認定としては解釈されない。

当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識しており、または慣用的に過ぎない実験を使用して確認できる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されていないが、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。

Claims (70)

1. アンブレラ−トポロジーグリカンデコイを、インフルエンザ感染に罹患しているか、インフルエンザ感染の徴候を示すか、またはインフルエンザ感染に対して感受性を有する被験体に投与し、その結果、該被験体において、デコイがインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、かつＨＡとＨＡ受容体との間の相互作用を競合除外する工程を含む、
   方法。
2. 前記アンブレラ−トポロジーグリカンデコイがグリカン部分を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記アンブレラ−トポロジーグリカンデコイがキャリアに結合したグリカン部分を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記キャリアがグリカンである、請求項３に記載の方法。
5. 前記キャリアがペプチドである、請求項３に記載の方法。
6. 前記キャリアがＨＡ受容体ペプチドである、請求項３に記載の方法。
7. 前記キャリアが核酸、脂質、細胞、ウイルス、および粒子からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
8. 前記投与する工程が静脈内注射によって実施される、請求項１に記載の方法。
9. 前記投与する工程が筋肉内注射によって実施される、請求項１に記載の方法。
10. 前記投与する工程が経口投与によって実施される、請求項１に記載の方法。
11. 以下の工程による、インフルエンザ感染の処置において有用である薬剤を同定する方法：
    インフルエンザＨＡを提供する工程；
    アンブレラ−トポロジーグリカンを模倣する少なくとも１種の候補デコイを含む、候補アンブレラ−トポロジーデコイのコレクションを提供する工程；および
    ＨＡと相互作用し、かつアンブレラ−トポロジーグリカンとのその相互作用と競合する候補デコイが同定されるように、ＨＡを複数からの候補デコイと接触させる工程。
12. インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、かつＨＡとＨＡ受容体との間の相互作用を競合除外する、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
13. インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、かつＨＡとＨＡ受容体との間の相互作用を競合除外する、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ；および
    薬学的に受容可能な賦形剤
    を含む、薬学的組成物。
14. 構造：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−Ｓｕｇ４−を有し、以下の条件のうち１つ以上が満たされる、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン：
    ａ．Ｎｅｕ５Ａｃ α２−６が該グリカンの非還元末端にある；
    ｂ．Ｓｕｇ１、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、またはＳｕｇ４がαまたはβ配座のヘキソースまたはヘキソサミンである；
    ｃ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖はＳｕｇ１の非還元位置のいずれにも結合していない；
    ｄ．非糖部分がＳｕｇ１、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、またはＳｕｇ４の非還元位置に結合している；
    ｅ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合を除いたオリゴサッカリド中の任意の２つの糖の間の結合は１−２、１−３、１−４、および／または１−６である；ならびに
    ｆ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−部分が、アンブレラ様トポロジーグリカンの構造的な制約またはヘマグルチニン接触の制約を満たしている。
15. ヘマグルチニンのアミノ酸１３１、１３３、１３６、１３７、１４３、１４４、１４５、１５３、１５５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９６、２２２、２２５、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
16. ヘマグルチニンのアミノ酸１５６、１５９、１８９、１９２、１９３、１９６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
17. ヘマグルチニンのアミノ酸１８６、１８７、１８９、１９０、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
18. ヘマグルチニンのアミノ酸１３７、１４５、１９０、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
19. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０、２２２、２２５、２２６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
20. ヘマグルチニンのアミノ酸１３６、１５３、１５５、１９４、およびこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
21. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０および２２６と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
22. ヘマグルチニンのアミノ酸２２２、２２５、および２２６と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
23. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０、１９２、１９３、および２２５と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
24. ヘマグルチニンのアミノ酸１８６、１９３、および２２２と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
25. １３０−ループ領域（１３０〜１３９位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
26. １４０−ループ領域（１４０〜１４６位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
27. １５０−ループ領域（１５３〜１６０位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
28. １９０−ループ−ヘリックス領域（１８３〜１９６位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
29. ２２０−ループ領域（２１９〜２２８位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
30. シアル酸アナログを含む、請求項１４〜２９のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン。
31. 構造：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−Ｓｕｇ４−を有し、以下の条件のうち１つ以上が満たされる、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分：
    ａ．Ｎｅｕ５Ａｃ α２−６がグリカンの非還元末端にある；
    ｂ．Ｓｕｇ１、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、またはＳｕｇ４がαまたはβ配座のヘキソースまたはヘキソサミンである；
    ｃ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖はＳｕｇ１の非還元位置のいずれにも結合していない；
    ｄ．非糖部分がＳｕｇ１、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、またはＳｕｇ４の非還元位置に結合している；
    ｅ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合を除いたオリゴサッカリド中の任意の２つの糖の間の結合は１−２、１−３、１−４、および／または１−６である；ならびに
    ｆ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−部分が、アンブレラ様トポロジーグリカンの構造的な制約またはヘマグルチニン接触の制約を満たしている。
32. ヘマグルチニンのアミノ酸１３１、１３３、１３６、１３７、１４３、１４４、１４５、１５３、１５５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９６、２２２、２２５、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
33. ヘマグルチニンのアミノ酸１５６、１５９、１８９、１９２、１９３、１９６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
34. ヘマグルチニンのアミノ酸１８６、１８７、１８９、１９０、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
35. ヘマグルチニンのアミノ酸１３７、１４５、１９０、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
36. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０、２２２、２２５、２２６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
37. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０および２２６と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
38. ヘマグルチニンのアミノ酸２２２、２２５、および２２６と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
39. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０、１９２、１９３、および２２５と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
40. ヘマグルチニンのアミノ酸１８６、１９３、および２２２と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
41. １３０−ループ領域（１３０〜１３９位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
42. １４０−ループ領域（１４０〜１４６位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
43. １５０−ループ領域（１５３〜１６０位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
44. １９０−ループ−ヘリックス領域（１８３〜１９６位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
45. ２２０−ループ領域（２１９〜２２８位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
46. シアル酸アナログを含む、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカン部分。
47. アンブレラ−トポロジーグリカン部分に結合したキャリアを含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイであって、該アンブレラ−トポロジーグリカン部分が、構造：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−Ｓｕｇ４−を有し、以下の条件のうち１つ以上が満たされる、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ：
    ａ．Ｎｅｕ５Ａｃ α２−６が該グリカンの非還元末端にある；
    ｂ．Ｓｕｇ１、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、またはＳｕｇ４がαまたはβ配座のヘキソースまたはヘキソサミンである；
    ｃ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖はＳｕｇ１の非還元位置のいずれにも結合していない；
    ｄ．非糖部分がＳｕｇ１、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３、またはＳｕｇ４の非還元位置に結合している；
    ｅ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６結合を除いたオリゴサッカリド中の任意の２つの糖の間の結合は１−２、１−３、１−４、および／または１−６である；ならびに
    ｆ．Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３−部分が、アンブレラ様トポロジーグリカンの構造的な制約またはヘマグルチニン接触の制約を満たしている。
48. アンブレラ−トポロジーグリカン部分に結合したキャリアを含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
49. ヘマグルチニンのアミノ酸１３１、１３３、１３６、１３７、１４３、１４４、１４５、１５３、１５５、１５６、１５９、１８６、１８７、１８９、１９０、１９２、１９３、１９４、１９６、２２２、２２５、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
50. ヘマグルチニンのアミノ酸１５６、１５９、１８９、１９２、１９３、１９６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
51. ヘマグルチニンのアミノ酸１８６、１８７、１８９、１９０、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
52. ヘマグルチニンのアミノ酸１３７、１４５、１９０、２２６、２２８、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
53. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０、２２２、２２５、２２６、および／またはこれらの組み合わせと相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
54. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０および２２６と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
55. 前記アンブレラ−トポロジーグリカン部分がヘマグルチニンのアミノ酸２２２、２２５、および２２６と相互作用可能である任意の物質である、請求項３８に記載のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
56. ヘマグルチニンのアミノ酸１９０、１９２、１９３、および２２５と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
57. ヘマグルチニンのアミノ酸１８６、１９３、および２２２と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
58. １３０−ループ領域（１３０〜１３９位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
59. １４０−ループ領域（１４０〜１４６位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
60. １５０−ループ領域（１５３〜１６０位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
61. １９０−ループ−ヘリックス領域（１８３〜１９６位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
62. ２２０−ループ領域（２１９〜２２８位）における１つ以上のヘマグルチニンアミノ酸と相互作用する物質を含む、単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
63. シアル酸アナログを含む、請求項４７〜６２のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
64. 前記キャリアがグリカンである、請求項４８〜６３のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
65. 前記キャリアがペプチドである、請求項４８〜６３のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
66. 前記キャリアがＨＡ受容体ペプチドである、請求項４８〜６３のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
67. 前記キャリアが核酸、脂質、細胞、ウイルス、および粒子からなる群より選択される、請求項４８〜６３のいずれか１項に記載の単離されたアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ。
68. 請求項４７〜６７のいずれか１項に記載のアンブレラ−トポロジーグリカンデコイ；および
    薬学的に受容可能な賦形剤
    を含む、薬学的組成物。
69. インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、かつＨＡとＨＡ受容体との間の相互作用を競合除外する、アンブレラ−トポロジーグリカンデコイ；および
    薬学的に受容可能な賦形剤
    を含む、薬学的組成物。
70. アンブレラトポロジーグリカン（ＵＴＨＡｒ）を有するヘマグルチニン受容体へのインフルエンザウイルスの結合を被験体において阻害するか、ＵＴＨＡｒに結合するインフルエンザウイルスによる、被験体の感染のリスクを最小化するか、被験体を処置するか、感染を阻害するか、疾患の発症もしくは進行を阻害するか、またはウイルスの伝播もしくは蔓延を阻害するかのいずれかの方法であって：
    任意に、例えば、ＵＴＨＡｒを保護する必要性、またはＵＴＨＡｒに結合するインフルエンザウイルスによる感染のリスクがあることのいずれかに基づいて、被験体を同定する工程；
    任意に、ＨＡ、例えば、ＵＴＨＡｒに結合するＨＡに結合可能であるグリカンデコイに基づいて、グリカンデコイを選択する工程；
    任意に、グリカンデコイを提供する工程；
    有効量のグリカンデコイを該被験体に投与し、それによって、ＵＴＨＡｒへのインフルエンザウイルスの結合を該被験体において阻害するか、ＵＴＨＡｒに結合するインフルエンザウイルスによる、該被験体の感染のリスクを最小化するか、該被験体を処置するか、感染を阻害するか、疾患の発症もしくは進行を阻害するか、またはウイルスの伝播もしくは蔓延を阻害する工程
    を含む、方法。